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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue immortalisierte menschliche
Epithelzell-Linie
der Kornea sowie ihre Verwendung bei den Verfahren zur Identifizierung
von mutagenen, toxischen oder für
den Stoffwechsel der Zellen der Kornea günstigen Wirkstoffen.
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Seit
vielen Jahren werden Anstrengungen unternommen, um menschliche Zell-Linien
zu entwickeln, die an die Studie der menschlichen Krankheiten, wie
Infektionen, Entzündungen
oder Krebs beispielsweise, angepasst sind. Zu den Zellen, die oft
am Auftreten von Krankheiten beteiligt sind, können die Epithelzellen, die
für die
Umgebung des menschlichen Körpers
empfindlich sind, gezählt
werden.
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Die
Epithelzellen unterscheiden sich von den anderen Zellen des menschlichen
Körpers
durch die Expression von Verbindungen oder Strukturen, die nur in
den Epithelzellen zu finden sind, wie beispielsweise die Zytokeratine
(Moll et al., Cell, 31, 11-24, 1982), die Verbindungen zwischen
den Zellen (Gumbiner et al., Cell, 69, 385-387, 1992) und das Vimentin
(Richard et al., Arch. Dematol. Res., 282, 512-515, 1990).
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Weitere
Verbindungen wurden auch im Allgemeinen in den menschlichen Epithelzellen,
allerdings nicht nur in den Epithelzellen, gefunden, wie die Zytochrome
P450 (Mercurio et al., Biochem. Biophy. Research Communications,
210 Nr. 2, 350-355, 1995; McKinnou et al., Gut, 36, 259-267, 1995),
die Enzyme, die an der Abwehr gegen die Zelloxydation beteiligt
sind (Cu/Zn-Superoxid-Dismutase, Glutathion-Peroxidase, Glutathion-Reduktase
und Katalase; Albers et al., Toxicology and Applied Pharmacology,
109, 507-513, 1991) und/oder an der Detoxikation von Elektrophilen
beteiligt sind (Glutathion-S-Transferasen α, μ oder π: Singh et al. Exp. Eye Res.,
40, 431-437, 1985; Aldehyd-Reduktase: Ellis et al., Biochemical
J., 312, 535-541, 1995).
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Die
Epithelzellen der menschlichen Korona unterscheiden sich auch von
den anderen menschlichen Epithelzellen durch die Expression von
Verbindungen, die nur in den Epithelzellen der Kornea zu finden
sind, wie beispielsweise das Zytokeratin von 64kD und die Glutathion-S-Transferase
hGST 5.8, die in den Augengeweben zu finden sind (hGST 5.8: Singhal
et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 142-150, 1995; 64kD:
Kiritoshi et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 32, 3073-3077, 1991).
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Die
Analyse der Expression gewisser Zytokine und Wachstumsfaktoren in
den Epithelzellen der menschlichen Korona ohne entzündliche
Stimulation wurde bereits von Cubitt et al., Wilson et al., Kennedy
et al. und De-Quan et al. bestimmt (J. Cellular Physiol, 163, 61-79,
1995; J. Clinical Investigation, 95, 82-88, 1995; Invest. Ophta. & Visual Sci.,
33, 1756-1762, 1992; Invest. Ophta. & Visual Sci., 36, 330-340, 1995;
Invest. Ophta. & Visual
Sci., 34, 3199-3210, 1993). Überdies
merkten Rosenbaum et al. an, dass das Zytokinprofil der Zellen der
Kornea ein Mittel sein könnte,
um wirksam das Vorhandensein gewisser Krankheiten der Kornea zu erfassen
(Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 36, 2151-2155, 1995). Das Expressionsprofil
gewisser Zytokine und Wachstumsfaktoren in den Epithelzellen der
Kornea ermöglicht
somit eine Kennzeichnung und Unterscheidung der normalen Epithelzellen
der Kornea von den anderen Zellen und insbesondere von den abnormalen Epithelzellen
der Kornea.
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Überdies
greifen die Methoden des Siebens der für die Augen nicht entzündlichen
Moleküle
auf Versuchstiere zurück.
Um der Tatsache Abhilfe zu schaffen, dass wesentliche Unterschiede
morphologischer und biochemischer Art zwischen den menschlichen
Augen und jenen dieser Tiere bestehen bleiben, schlagen Hainsworth
et al. vor, diese Siebungstests an Kulturen von primären Epithelzellen
der Kornea durchzuführen (J.
Tissue Culture Meth., 13, 45-48, 1991). Leider stellen die Kulturen
von primären
Zellen der Kornea nach einem oder zwei Durchgängen ihre Vervielfachung ein,
wobei jeder Durchgang darin besteht, die Zellen in einem frischen
Medium nach dem Wachstum bis zur Konfluenz zu replizieren. Ferner überleben
diese primären Zellen
kein Gefrieren in flüssigem
Stickstoff.
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Um
diese Nachteile zu beseitigen, wurden menschliche Epithelzell-Linien
der Kornea von Kahn et al. (Investigative Opht. & Visual Sci., 34, 3429-3441, 1993)
und Araki-Sasaki et al. (Investigative Opht. & Visual Sci., 36, 614-621, 1995)
entwickelt. Leider sind diese Linien noch nicht vollkommen zufrieden
stellend.
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Die
von Kahn et al. entwickelten Linien sind nämlich nicht völlig immortalisiert,
da sie gewisse ursprüngliche
Unterscheidungsmerkmale bis zu ungefähr 25 aufeinander folgenden
Kulturdurchgängen
bewahren (siehe Kahn et al.). Diese Linien setzen auch Viren SV40
in dem Kulturmedium frei (siehe Analyse von Araki-Sasaki et al.).
Schließlich
ist nicht bekannt, ob sie tatsächlich
weitere Unterscheidungsmarker, wie beispielsweise die Glutathion-S-Transferase
hGST5.8 und ein geeignetes Profil an Zytokinen und Wachstumsfaktoren sowie
spezifische oder für
eine Entzündungsreaktion
notwendige Marker ausdrücken.
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Ferner
beschreibt
US 5 585 265 (C.
R. Kahn, J. Rhim) menschliche Epithelzell-Linien der Kornea.
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Die
von Araki-Sasaki et al. entwickelten immortalisierten Linien sind
hingegen unfähig,
sich bei Rekonstruktionstests der Kornea in vivo übereinander
zu lagern (siehe Araki-Sasaki et al.), und es ist nicht bekannt, ob
sie gewisse Unterscheidungsmarker, wie beispielsweise die Glutathion-S-Transferase
hGST5.8, und ein geeignetes Profil an Zytokinen und Wachstumsfaktoren
sowie spezifische oder für
eine Entzündungsreaktion notwendige
Marker ausdrücken.
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Aufgabe
der Erfindung ist, eine neue menschliche Epithelzell-Linie der Kornea
bereitzustellen, die genetisch und physiologisch den normalen Epithelzellen
der menschlichen Kornea angenähert
ist, so dass sie wirksam bei Siebungstests von potentiell entzündlichen
Molekülen
eingesetzt werden kann.
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Zu
diesem Zweck betrifft die Erfindung die immortalisierte menschliche
Epithelzell-Linie
der Kornea mit der Anmeldenummer CNCM I-1777.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Feststellung
der mutagenen, toxischen oder günstigen
Wirkung eines Wirkstoffes auf den Stoffwechsel der Zellen der Kornea,
bei dem (1) eine Kultur, die eine erfindungsgemäße Zelllinie umfasst, mit einem
Wirkstoff zur Reaktion gebracht wird, von dem angenommen wird, dass
er ein mutagener, toxischer oder für den Stoffwechsel der Zellen
der menschlichen Kornea günstiger
Wirkstoff ist, und (2) die Auswirkungen des Wirkstoffes auf die
Zelllinie bestimmt werden.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Diagnosekoffer, umfassend die immortalisierten
Epithelzellen der menschlichen Kornea gemäß der Erfindung und Reagenzien,
um eine Stoffwechselantwort der Zellen auf mutagene, toxische oder
günstige
Zellen für
die Zellen zu bestimmen.
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Schließlich betrifft
die Erfindung auch alle Verwendungen der erfindungsgemäßen Zelllinie
bei Verfahren zur Identifizierung von mutagenen, toxischen oder
für den
Stoffwechsel der Zellen der Kornea günstigen Wirkstoffen, sowie
alle Verwendungen dieser Linien als aktiver pharmazeutischer Wirkstoff.
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1:
schematische Darstellung des Plasmids pZIPSVU19, das verwendet wurde,
um den Vektor p1/SV40U19 herzustellen, der dazu bestimmt ist, die
primären
Epithelzellen der menschlichen Kornea zu immortalisieren.
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2:
Prozentsatz der Anhäufung
von [3H] Phosphoinositiden durch primäre Epithelzellen der menschlichen
Kornea und durch die Zellen CNCM in Abhängigkeit von der angewandten
Konzentration an Bradykinin.
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3:
Prozentsatz der Anhäufung
von [3H] Phosphoinositiden durch primäre Epithelzellen der menschlichen
Kornea und durch die Zellen CNCM in Abhängigkeit von der angewandten
Histaminkonzentration.
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4:
Prozentsatz der Anhäufung
von [3H] Phosphoinositiden durch primäre Epithelzellen der menschlichen
Kornea und durch die Zellen CNCM in Abhängigkeit von der angewandten
PAF-Konzentration.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Ausdrücke „normale
Zellen", „primäre Zellen" oder „nicht
immortalisierte Zellen" Epithelzellen
der menschlichen Kornea, die an der Kornea eines gesunden Erwachsenen,
der keine beeinträchtigenden
physiologischen oder genetischen Defizite aufweist, entnommen werden
können
und die während
einer begrenzten Zeit kultiviert werden können, ohne dass sie ihre ursprünglichen
Unterscheidungsmerkmale verlieren.
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Der
Ausdruck „immortalisierte
Zellen" bezeichnet
hingegen Zellen, die einer Genmanipulation mit Hilfe einer DNA-Konstruktion
unterzogen wurden, die sie befähigt,
sich undefiniert zu vervielfachen, d.h. in mehr als 25 Durchgängen, vorzugsweise
mindestens 60 Durchgängen.
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Ebenso
bezeichnet das Wort „Durchgang" das Verfahren, das
darin besteht, einen aliquoten Teil einer Kultur mit Konfluenz oder
Sättigung
einer Zelllinie zu nehmen, ein frisches Medium zu besäen und die
Linie bis zur Konfluenz oder Sättigung
zu kultivieren. Die Zelllinien werden somit herkömmlicherweise durch aufeinander
folgende Durchgänge
in frischen Medien kultiviert. Es ist anzumerken, dass die Zelllinien
ihre ursprünglichen
Unterscheidungsmerkmale nach mehreren aufeinander folgenden Durchgängen verlieren können. Es
ist somit äußerst vorteilhaft, über eine
Linie verfügen
zu können,
deren Merkmale bewahrt bleiben, auch nach zahlreichen Durchgängen, vorzugsweise
mindestens 30 bis 60 Durchgängen.
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Schließlich bezeichnet
der Ausdruck „ursprüngliche
Unterscheidungsmerkmale" sowohl
die Marker, die spezifisch auf den menschlichen Epithelzellen zu
finden sind, als auch die Unterscheidungsmarker, die spezifisch
auf den Epithelzellen der menschlichen Kornea zu finden sind.
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Die
immortalisierte Epithelzell-Linie der menschlichen Kornea gemäß der Erfindung
drückt
keine Tumormarker aus, d.h. weist keine krebserregenden Gene auf,
oder drückt
keine Boten-RNA (RNAm), Proteine und/oder differenzierten Zellstrukturen
aus, die für
die Umwandlung der Zellen in Tumorzellen kennzeichnend sind. Das
Vorhandensein dieser Marker ist durch Hybridisation oder PCR ihrer
DNA mit einer spezifischen Sonde, durch Antikörper und/oder beispielsweise
durch Elektronenmikroskopie festzustellen. Das Vorhandensein eines
Markers in einer Zelle bedeutet nicht, dass die Zelle fähig ist,
einen Krebs nach einigen Monaten an eine Maus ohne Immunabwehr zu übertragen,
sondern zeigt vielmehr einen krebsartig umgewandelten Zustand dieser
Zelle im Vergleich mit den ursprünglichen
Zellen, von denen sie stammen.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist auch frei von Viren, d.h. sie ist unfähig, die Viren zu erzeugen,
die sie ursprünglich
immortalisiert haben, wie dies bei den Linien der Fall ist, die
von Kahn et al. (siehe Einleitung von Araki-Sasaki et al.) entwickelt
wurden.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist fähig,
sich übereinander
zu lagern, d.h. sie ist fähig,
sich in aufeinander folgenden Schichten zu organisieren. Dazu reicht
es auch, die erfindungsgemäße Linie
bis zur Konfluenz in einem Medium ohne Serum, umfassend 1,5 mM CaCl
zu kultivieren, dann visuell zu beobachten, ob sich die Zellen beispielsweise
in Schichten entwickeln.
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Die
erfindungsgemäße Linie
drückt
hingegen spezifische Stoffwechselmarker der normalen menschlichen
Epithelzellen aus, d.h. Marker, die im Allgemeinen in den Epithelzellen
zu finden sind.
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Diese
spezifischen Marker können
eine Boten-RNA (RNAm), ein Protein und/oder eine differenzierte Zellstruktur
sein, die beispielsweise von Epithelzellen der Haut, des Auges,
des Verdauungstrakts oder der Leber stammen können. Die erfindungsgemäßen menschlichen
Epithelzellen drücken
mindestens zwei Marker aus, die in der Gruppe ausgewählt werden,
die von Vimentin, den Zytokeratinen, den Verbindungen zwischen den
Zellen (im Englischen auch „tight
junctions" genannt),
den Zytochromen P450, der Glutathion-S-Transferase (GST), der Cu/Zn-Superoxid-Dismutase
(SOD), der Glutathion-Peroxidase
(GP), der Glutathion-Reduktase (GR), der Katalase (CA) und der Aldehyd-Reduktase (AR) gebildet
ist.
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Es
ist auch anzumerken, dass die erfindungsgemäße Linie Enzyme ausdrücken kann,
die an der Zelloxydation (SOD, GP, GR und CA) und/oder an der Detoxikation
von Elektrophilen (GST, AR) beteiligt sind. Diese Linie ist somit
besonders für
die Studie der Entzündungs-
oder Irritationserscheinungen der menschlichen Kornea geeignet.
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Die
erfindungsgemäße Zelllinie
drückt
auch Stoffwechselunterscheidungsmarker aus, die für die Zellen
der Kornea spezifisch sind, insbesondere für die Epithelzellen der menschlichen
Kornea (siehe Reiners et al., Carcinogenesis, 11, 957-963, 1990).
Diese Unterscheidungsmarker können
eine RNAm, ein Protein oder eine differenzierte Zellstruktur sein.
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Die
erfindungsgemäße Linie
drückt
mindestens 2 Unterscheidungsmarker aus, die in der Gruppe ausgewählt werden,
die von Zytokeratin von 64kD, Glutathion-S-Transferase hGST5.8 und
einem Profil aus Zytokinen und Wachstumsfaktoren gebildet ist, umfassend
die Verbindungen TNFα,
I1-1β, IL-1α, IL-6, IL-8,
GM CSF-β,
IL-ra, TGF-β1,
TGF-β2,
TGFα, EGF,
PDGF-β.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist auch fähig,
mindestens einen spezifischen Marker einer Entzündungsreaktion auszudrücken, d.h.
ein Molekül,
das erfassbar ist, wenn die Zelle auf eine entzündliche Stimulation reagiert,
und/oder ein Molekül
oder eine Struktur, die für
eine Entzündungsreaktion
notwendig sind.
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Die
entzündlichen
Stimulationen können
eingeleitet werden, wenn die erfindungsgemäßen Linien mit einem Mikroorganismus
der Gattung Pseudomonas aeruginosa (Kernacki et al., J. Ocul. Pharmacol.,
10, 281-188, 1994), mit dem Aktivierungsfaktor der Plättchen PAF
(Bazan et al., Exp. Eye Research, 14, 769-775, 1995), mit 12-O-tetradecanoylphorbol
(TPA: tumor promoting agent), mit Histamin (Sharif et al., J. Ocular
Pharmacol., 10, 653-664, 1994), mit Bradykinin (Sharif et al., Neurochem.
Int., 18, 89-96, 1991) oder mit anderen entzündlichen Verbindungen beispielsweise
in Kontakt gebracht werden.
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Die
Kollagenase I ist ein leicht erfassbarer Marker, wenn eine Linie
einer entzündlichen
Stimulation unterworfen ist (Bazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90, 8678-8682, 1993). Weitere Marker können auch erfasst werden, wie
c-fos (siehe Bazan et al.), die Arachidon-Zwischenstoffe 12-HETE
und 12-HETrE (Conners et al., Inves. Ophth. & Visu. Sci., 36, 828-840, 1995) oder
ein neues Profil aus Zytokinen und Wachstumsfaktoren beispielsweise.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist auch fähig,
mindestens einen Marker, der für
eine Entzündungsreaktion
notwendig ist, auszudrücken,
wie beispielsweise den Rezeptor für Bradykinin, den Rezeptor
für Histamin, den
Rezeptor für
PAF und das System zur Transduktion eines Signals durch die Phosphoinositiden
(Phosphoinositide turnover Signal transduction pathway; Sharif et
al., Neurochem. Res., 12, 1313-1320, 1993).
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Die
Erfindung betrifft insbesondere eine erfindungsgemäße immortalisierte
Linie, die unter dem Vertrag von Budapest bei der Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur
Roux, 75724 Paris, am 22. Oktober 1996 angemeldet wurde, wo sie
die Anmeldungsnummer CNCM I-1777 erhalten hat.
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Die
erfindungsgemäße Epithelzell-Linie
bewahrt ihre ursprünglichen
Unterscheidungsmerkmale auch nach zahlreichen Durchgängen, insbesondere
mindestens 25 Durchgängen,
vorzugsweise mindestens 30 bis 100 Durchgängen.
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Um
die erfindungsgemäße Linie
zu erhalten, kann eine Kultur von primären Epithelzellen, die von
der menschlichen Kornea stammen, angelegt, die Kultur mit einem
rekombinanten Virus infiziert werden und können die immortalisierten Zellen
in einem Kulturmedium ohne Serum kultiviert werden. Zu diesem Zweck
verfügt der
Fachmann über
zahlreiche Kulturmedien ohne Serum. Zum Beispiel können die
Medien ohne Serum genannt werden, die von Gibson et al. (Gut, 35,
791-797, 1991), Pfeifer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5123-5127,
1993), Kulkani et al. (Carcinogenesis, 16, Nr. 10, 2515-2521, 1995)
oder in EP9620163.1 und US08/576483 beispielsweise beschrieben wurden.
Ein Medium ohne Serum, das perfekt an die Bedürfnisse dieses Verfahrens angepasst
ist, ist das Medium KGM (Clonetics, US).
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Die
erfindungsgemäße Linie
wurde durch Einsatz der folgenden Schritte erhalten:
- (1) Gewinnung einer Probe von Epithelgeweben aus einer menschlichen
Kornea;
- (2) Aufbereitung dieser Probe im Hinblick auf ihre Kultur in
vitro;
- (3) Aussäen
der Epithelzellen in einem Kulturmedium ohne Serum und auf Kulturplatten,
die einen Überzug umfassen,
der das Anhaften der Zellen und ihr Wachstum erleichtert;
- (4) Austausch des Mediums sooft wie nötig, um das konfluente Wachstum
zu optimieren;
- (5) Infizieren der Zellen mit einem rekombinanten Virus;
- (6) und Kultivieren der immortalisierten Zellen in einem Kulturmedium
ohne Serum.
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Im
Detail betrifft der Schritt 1) den Erhalt von Zellproben der Kornea
normaler Menschen bei chirurgischen Eingriffen. In Schritt 2) kann
die Probe in dem Kulturmedium gewaschen, in Stücke geschnitten, der Epithelteil
von den anderen Geweben durch physikalische und/oder chemische Mittel
getrennt werden. Beispielsweise können die Gewebsstücke in eine
Lösung,
die eine Protease umfasst, während
einer ausreichenden Zeit gelegt werden, um zur Trennung der Zellen
zu gelangen.
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In
Schritt 3) können
die Epithelzellen in einem Kulturmedium ohne Serum ausgesät werden,
wobei die Kulturplatten einen Überzug
aufweisen, der beispielsweise von einer Gelatinlösung zu 0,01-1 % gebildet ist.
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In
Schritt 4) wird das Kulturmedium, das die Epithelzellen enthält, sooft
wie nötig
gewechselt, um ein konfluentes Wachstum zu optimieren. Vorzugsweise
wird das Medium alle zwei Tage getauscht. Nachdem eine Konfluenz
von ungefähr
90 % der verfügbaren
Fläche
erreicht wurde, was im Allgemeinen 10 bis 14 Tagen nach dem Aussäen eintritt,
werden die Zellen durch Behandlungen in einer Proteaselösung getrennt.
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Die
getrennten Zellen werden in Schritt 5) in ein frisches Kulturmedium
transferiert, dann werden die Zellen auf herkömmliche Weise mit einem rekombinanten
Virus infiziert. Zahlreiche Transfektionstechniken stehen dem Fachmann
zur Verfügung.
Zum Beispiel können
die Techniken genannt werden, die in WO96/07750 von Claudia Chen
et al. (Mol. and Cell. Biol., 7, 2745-2751, 1987) oder von Wilson
et al. (Analytical Biochemistry, 226, 212-220, 1995) beschrieben
wurden.
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Vorzugsweise
wird ein rekombinantes Virus SV40 verwendet, umfassend das Antigen
T (Ag-T), einen Replikationsursprung eines inaktivierten Virus und
ein Auswahlgen. Zum Beispiel kann die DNA-Konstruktion pLXSHD+SV40+
verwendet werden, die von Stockshleader et al. beschrieben wurde,
deren Sequenz in der Datenbank GeneBank verfügbar ist (Zugriffsnr. M64753;
Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991).
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Weitere
geeignete Vektoren können
auch leicht vom Fachmann aus im Handel erhältlichen Vektoren, die das
für Ag-T
codierende Gen, ein Auswahlgen und/oder einen Replikationsursprung
eines inaktivierten Virus enthalten, konstruiert werden. Zum Beispiel
kann die Konstruktion p1/SV40U19 hergestellt werden, wobei Bereiche
BamHI an den Enden des Fragments Bgl-Hpa1 von SV40 erzeugt und dieses
Fragment im Bereich BamHI des Plasmids pZIPSVU19 geklont wird, das
in 1 nachstehend und von Jat et al., Mol. Cell. Biol., 9,
1672-1681, 1989 beschrieben ist.
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In
Schritt 6) werden die Epithelzellen in ein frisches Wachstumsmedium
auf Kulturplatten mit dem oben beschriebenen Überzug transferiert.
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Wenn
die neuen und ursprünglichen
Merkmale der erfindungsgemäßen Epithelzell-Linie bekannt sind, kann
ihre Anwendung in immunologischen, pharmakologischen und toxikologischen
Studien vorgesehen werden.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist somit besonders gut dazu angepasst, mutagene, toxische oder
für den Stoffwechsel
der Zellen der Kornea günstige
Wirkstoffe auszusieben, beispielsweise in einem Verfahren, bei dem
(1) ein als mutagen, toxisch oder für den Stoffwechsel der Zellen
der Kornea angesehener Wirkstoff mit einer Kultur, die die erfindungsgemäße Zelllinie
umfasst, zur Reaktion gebracht, kultiviert oder in Kontakt gebracht
wird und (2) die Auswirkungen des Wirkstoffes auf die Zelllinie
gemessen werden.
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Es
kann somit auch vorgesehen werden, einen Diagnosekoffer vorzubereiten,
der die erfindungsgemäßen Epithelzellen
und Reagenzien umfasst, um eine Stoffwechselantwort der Zellen auf
mutagene, toxische oder günstige
Wirkstoffe zu bestimmen.
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Die
erfindungsgemäße Linie
ist auch für
die Expression von rekombinanten Proteinen angepasst. Die Transfektionsmethoden
von fremder DNA sind nun dem Fachmann gut bekannt (siehe beispielsweise
WO 94/05472).
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Die
erfindungsgemäße Linie
hat auch einen potentiellen Nutzen bei der Gentherapie ex vivo.
Diese Linie könnte
nämlich
ein geeignetes Werkzeug darstellen, um rekombinante Zellen zu entwickeln,
die Gene von Interesse für
eine therapeutische Anwendung ausdrücken. Ein zusätzlich von
der erfindungsgemäßen Linie
gebotener Vorteil besteht darin, dass sie nicht einem tierischen
Serum ausgesetzt ist, was die Gefahren von potentiellen Kontaminationen
durch Viren oder andere pathogene Wirkstoffe beträchtlich
verringert.
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Die
vorliegende Erfindung ist nachstehend im Detail mit Hilfe der nachfolgenden
ergänzenden
Beschreibung beschrieben, die sich auf Beispiele von Präparaten
einer erfindungsgemäßen Zelllinie
bezieht. Die Kultur der Zelllinien, die Herstellung von Vektoren
SV40, die Transfektion, die Herstellung der Sonden und DNA-Ansätze und
die Analyse der Expressionen der Marker erfolgen, falls nicht anders
angegeben, nach den Protokollen, die in den oben genannten Referenzen
und jenen des Werkes von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) beschrieben
sind. Die Prozentsätze
beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.
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Beispiel 1
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Das
Plasmid p1/SV40U19 wird konstruiert, wobei Bereiche BamHI an den
Enden des Fragments BgI-Hpa1 von SV40 erzeugt werden und dieses
Fragment im Bereich FamHI des Plasmids pZIPSVU19 geklont wird, das
von Jat et al., Mol. Cell. Biol., 9, 1672-1681, 1989 beschrieben
wurde. Zum Hinweis umfasst der Vektor pZIPSVU19, der schematisch
in 1 dargestellt ist, den Neomycin-Auswahlmarker
und den LTR des Moloney-Virus.
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Die
Viren SV40 werden nach einer modifizierten Version des Protokolls
von Lynch und Miller (J. Virol., 65, 3887-3890, 1991) hergestellt.
Dazu werden die ekotrope Zelllinie Psi2 (Mann et al., Cell, 33,
153-159, 1983) und die amphotrope Zelllinie PA317 (ATCC CRL 9078)
in dem Medium DMEM (Dulbecco, USA), das 10 % eines Kalbsfötenserums
enthält,
bei 37 °C
unter einer Atmosphäre,
die 5 % CO2 enthält, kultiviert. Diese Linien
werden auf herkömmliche
Weise getrennt transfiziert, wobei 250 mM CaCl2 und
10 μg des
Plasmids p1/SV40U19 verwendet werden, sie werden einer Behandlung
mit Trypsin nach 48 h Inkubation unterzogen, dann in gleicher Menge
gemischt, und die Gesamtheit wird bei 37 °C unter einer Atmosphäre, die
5 % CO2 enthält, inkubiert. Nach einem Wachstum
bis zu 80 % Konfluenz werden die Viren in dem Medium ohne Serum KGM-1
geerntet (= Medium KBM von Clonetics, US, ferner umfassend 0,15
mM CaCl, 30 μg/ml
eines Extrakts der Rinderhypophyse, 0,5 μg/ml Hydrokortison, 0,5 μg/ml Insulin,
10 μg/ml
Transferin, 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumsfaktors der Maus
(EGF), 10000 U/ml Penizillin und 10000 U/ml Streptomycin). Nach
dem Filtern (0,45 μm,
Mikropore) wird die Virenmenge auf Zellen NIH 3T3 (ATCC CRL 1658)
bestimmt.
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Es
wurden primäre
Epithelzellen der Kornea nach der Biopsie des Auges eines Spenders
von 73 Jahren, der an einem Herzinfarkt gestorben ist, erhalten.
Die Probe wird in dem Phosphatpuffer PBS gewaschen, bei 4 °C 24h mit
10 U/ml Dispase II (Boehringer Mannheim, Nr. 295825) in einem Puffer
mit 50 % eines Mediums KGM-2 behandelt (= KBM + 0,05 mM CaCl, 30 μg/ml eines
Extrakts der Rinderhypophyse, 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumsfaktors
der Maus, 0,5 μg/ml
Hydrokortison, 0,05 μg/ml
Amphoterizin B, 5 μg/ml
Insulin, 10 μg/ml
Transferin, 50 μg/ml
Gentamycin). Nach der Inkubation werden die Zellen manuell getrennt,
in dem Medium DMEM (Dulbecco's
modified Eagle medium, US), umfassend 10 % eines Rinderfötenserums,
gewaschen, zentrifugiert, werden die Ansätze im Medium KGM-2 aufgenommen,
auf den vorher in einer Lösung
von 0,1 % Gelatine A (sigma G2500) vorinkubierten Kulturplatten
ausgebreitet. Die Platten werden bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 100
% relativer Feuchtigkeit, 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid inkubiert.
Das Kulturmedium, das die Epithelzellen enthält, wird sooft gewechselt,
wie es erforderlich ist, um ein konfluentes Wachstum zu optimieren.
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Nachdem
eine Konfluenz von ungefähr
90 % nach 2 Kulturwochen erreicht wurde, werden die Zellen herkömmlich durch
Behandlungen in einer Dispaselösung
IL getrennt. Die getrennten Zellen werden dann in das Medium KGM-1
und in mit einer Lösung
von 0,1 % Gelatine A vorinkubierte Kulturplatten transferiert. Die Kulturen
werden dann im Beisein von 8 μg/ml
Polybren und eines hohen Titers eines rekombinanten Virus SV40 (105-107
CFU), das wie oben beschrieben, hergestellt wurde, infiziert. Nach
2h Inkubation mit dem Virus werden die Kulturen in PBS gewaschen
und die Zellen in aufeinander folgenden Durchgängen in einem frischen Medium
KGM-1 kultiviert, wobei bei jedem Durchgang darauf zu achten ist,
dass nacheinander die Zellen in einem Puffer HBSS (Hanks Balanced
Salt Solution, Biofluids Nr. 325) gewaschen werden; sie werden durch
eine Behandlung 1-2h lang bei 37 °C
in einer Lösung,
umfassend 2,4 U/ml Dispase II, 50 % Puffer HBSS und 50 % eines Mediums
KBM, getrennt; sie werden in einem Medium KBM geerntet; zentrifugiert;
der Ansatz wird in dem Medium KBM-1 aufgenommen; dann werden die
Zellen auf neuen frischen Platten ausgebreitet.
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In
aufeinander folgenden Durchgängen
wurden die transformierten Zellen der primären Epithelzellen gereinigt.
Dann konnten durch Verdünnen
in einem Kulturmedium der vorher durch die Dispase II getrennten transformierten
Zellen 9 immortalisierte Einzelepithelzell-Linien der menschlichen Kornea ausgewählt werden, von
denen eine unter dem Vertrag von Budapest bei der Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur
Roux, 75724 Paris, am 22. Oktober 1996 angemeldet wurde, wo sie
die Anmeldungsnummer CNCM I-1777 erhalten hat.
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1. Analyse des Karyotyps
des Stamms CNCM I-1777
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Die
Analyse des Karyotyps des Stamms CNCM I-1777 erfolgt durch das „Children's Hospital of Michigan", 3901 Beaubien Blvd,
Detroit nach dem in dem Handbuch „Human cytogenetics, Edts:
Rooney DE, Czepulkowski BH, IRL Press, Oxford, 1986 beschriebenen
Verfahren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Linie in ihrem Genom
ein Chromosom jedes Chromosomenpaares intakt bewahrt. Das Geschlecht
der Linie ist XX.
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2. Tumorgenizität des Stamms
CNCM I-1777
-
Es
werden 107 Zellen der Linie CNCM I-1777,
die im 33. Durchgang an Mäusen
ohne Immunabwehr („nude") entnommen wurden,
nach dem von Stauffer et al. beschriebenen Protokoll (The American
journal of surgery, 169, 190-196, 1995) eingespritzt. Es ist keine
Tumorbildung nach mehreren Monaten zu sehen.
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4. Virale Kontamination
der Linie CNCM I-1777
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Es
wird bestimmt, ob die Linie CNCM I-1777 mit dem Virus der Hepatitis
C (HCV), dem Virus der Hepatitis B (HBV) und dem Aids-Virus (HIV-1)
kontaminiert ist. Die Ergebnisse der nachstehend beschriebenen Tests
sind für
das Vorhandensein der 3 Viren negativ.
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Für die Analyse
von HBV wird DNA aus ungefähr
2 × 106 Zellen durch Behandlung in Phenol- und Chloroformlösungen,
gefolgt von einer Ausfällung
in Ethanol, entnommen. DNA-Proben werden nun einer Erweiterung durch
PCR unterzogen, wobei spezifische Ansätze der Vorkernregion des Virus
verwendet werden (Lynch et al, J. Virol., 65, 3887-3890). Dann werden
die Produkte der Erweiterung auf Agarosegel getrennt und unter UV
im Beisein von Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zum Vergleich wird
auf dieselbe Weise parallel eine Verdünnung eines Serums, umfassend
10-105 HBV, analysiert (Anawa Biomedical
Services 6 Product, USA).
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Für die Analyse
des HIV-1 werden die oben beschriebenen DNA-Proben einer Erweiterung
durch PCR unterzogen, wobei spezifische Ansätze der Region GAG des Virus
verwendet werden. Dann werden die Produkte der Erweiterung auf Agarosegel
getrennt und unter UV im Beisein von Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zum
Vergleich wird auf dieselbe Weise parallel eine Verdünnung eines
Serums, umfassend 10-105 HIV-1, analysiert
(Anawa Biomedical Services 6 Product, USA).
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Für die Analyse
des HCV wird RNA aus ungefähr
2 × 106 Zellen durch das Verfahren von Chomczynski et
al. (Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987) entnommen. Es wird auf
herkömmliche
Weise eine reverse Transkription durchgeführt und die erhaltene komplementäre DNA einer
Erweiterung durch PCR unterzogen, wobei spezifische Ansätze der
nicht codierenden Region 5' des
Virus verwendet wird. Dann werden die Produkte der Erweiterung auf
einem Agarosegel getrennt und unter UV im Beisein von Ethidiumbromid
sichtbar gemacht. Zum Vergleich wird auf dieselbe Weise parallel
eine Verdünnung
eines Serums, umfassend 10-105 HCV, analysiert
(Anawa Biochemical Services 6 Product, USA).
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5. Spezifische Marker
von menschlichen Epithelzellen für
die Linie CNCM I-1777
-
- 5.a Zytokeratine: die Zellen einer Kultur der
Linie CNCM I-1777, die im 22. Durchgang entnommen wurden, werden
auf Glasplatten durch eine Lösung
von 100 % kaltem Methanol fixiert, dann werden die Platten in einem
Puffer gewaschen, der 0,05M Tris pH 8,6, 1,8 % NaCl und 0,2 % Glykolpolyethylen
2000 enthält
(Puffer TNP). Dann werden die Zellen 30 min lang im Beisein von
spezifischen Mäuseantikörpern für gewisse Zytokeratine
inkubiert (Anti-CH-Peptid 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 19, 20: Sigma
und Boehringer). Nach 3 Waschungen in dem Puffer TNP, umfassend
0,5 % BSA, werden die Platten 60 min lang mit einem Ziegenantikörper Maus-Anti-IgG,
umfassend eine Immunfluoreszenzverbindung (1:300, FITC-goat anti
mouse IgG; Biosys.) inkubiert. Nach 3 Waschungen in dem vorhergehenden
Puffer werden die Platten fixiert und durch Fluoreszenz unter dem
Mikroskop analysiert. Alle Zellen sind für die Zytokeratine 4, 7, 8,
13, 14, 17, 18, 19 positiv.
- 5.b Vimentin: die Zellen einer Kultur der Linie CNCM I-1777,
die im 22. Durchgang entnommen wurden, werden wie oben beschrieben
entnommen. Dann werden die fixierten Zellen einem Anti-Vimentin-Mäuseantikörper (DAKO,
USA), dann dem oben erwähnten
Ziegenantikörper
Maus-Anti-IgG ausgesetzt. Unter der Fluoreszenzmikroskopie sind
alle Zellen für
das Vimentin positiv.
- 5.c Verbindungen zwischen den Zellen: die Zellen der Linie CNCM
I-1777, die im 22. Durchgang entnommen wurden, werden auf einer
Glasplatte bis zur Konfluenz kultiviert, dann durch Behandlung mit
einer Lösung
von 2,5 % Glutaraldehyd in einem Phosphatpuffer 0,1 M pH 7,4 1h
lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach zwei Waschungen in demselben
Phosphatpuffer werden die Zellen wieder in einer Lösung von
2 % OsO4 in demselben Puffer fixiert. Dann
werden die Zellen in aufeinander folgenden Lösungen von Ethanol zu 30, 50,
70, 90 und 100 % dehydratisiert (Polaron Equipment Ltd., Watford,
UK), dann werden die Zellen mit einer feinen Goldschicht überzogen
(SEM coating unit E5100, Polaron). Dann werden die Zellen unter dem
Elektronenmikroskop (Philips 505 SEM) untersucht. Die Analyse zeigt,
dass die Zellen interzelluläre Verbindungen
aufweisen, die für
die Epithelzellen kennzeichnend sind (tight junctions).
- 5.d Zytochrom P450: die Expression der Zytochrome durch die
Zellen der Linie CNCM I-1777,
die im 30. Durchgang entnommen wurden, wird mit Hilfe der bekannten
Technik RT-PCR unter
Verwendung der spezifischen DNA-Ansätze der verschiedenen Zytochrome
P450 analysiert. Diese Ansätze
wurden auf herkömmliche
Weise aus DNA-Sequenzen der verschiedenen Zytochrome hergestellt,
die in der Datenbasis GeneBank zugänglich sind (CYP1A1: Zugriffsnummer
X02612; CYP2C: Zugriffsnummer M61855 oder M61858 oder M61856 oder
MM61854; CYP2D6: Zugriffsnummer M33388; CYP1A2: Zugriffsnummer Z00036).
Dazu werden die Zellen bis zur Konfluenz auf Kästen von 35 mm (Coster) kultiviert,
und wird die RNA mit Hilfe des Koffers RNAeasy (Qiagen) entnommen,
wird eine reverse Transkription (1st Strand cDNA Synthesis Kit for
RT-PCR, Boehringer Mannheim) durchgeführt und die erhaltene komplementäre DNA einer
Erweiterung durch PCR unterzogen, wobei die spezifischen DNA-Ansätze der
verschiedenen Zytochrome P450 verwendet werden, werden dann die
Produkte der Erweiterung auf Agarosegel getrennt und unter UV im
Beisein von Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen,
dass die Zellen CNCM I-1777 die Zytochrome CYP1A1, CYP1A2, CYP2C,
CYP2D6 ausdrücken.
- 5.e Enzyme die an der Zelloxydation und Detoxikation von Elektrophilen
beteiligt sind: die Zellen der Linie CNCM I-1777, die im 30. Durchgang
entnommen wurden, werden kultiviert, die RNA wird durch das Verfahren
von Chomczynski et al. (Anal. Biochem. 162, 156-159, 1987) entnommen,
dann wird ein Northern-blot dieser RNA mit DNA-Sonden, die teilweise
für die
Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD), die Glutathion-Peroxidase (GP),
die Katalase (CA) und die Glutathion-S-Transferase π (GSTπ) codieren,
durchgeführt.
Die DNA-Sonden werden auf herkömmliche
Weise aus DNA-Sequenzen der für
diese Enzyme codierenden Gene hergestellt, die in der Datenbasis
GeneBank verfügbar
sind (GSTπ Zugriffsnummer
X08058; GP: Zugriffsnummer M21304; CA: Zugriffsnummer M81578; SOD:
Zugriffsnummer 729336). Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, dass
alle Zellen eine Transkription der für die Aktivität SOD, GP,
CA und GSTπ codierenden
Gene ausdrücken. Überdies
wird die Expression der Glutathion-Reduktase auch durch den von Gondhowiardjo
(Cornea, 12, 310-314, 1993) beschriebenen Enzymtest bestätigt. Die
Katalaseaktivität
wird auch durch den von Aeby et al. (Method and Enzymology, 105,
121-126, 1984) beschriebenen Enzymtest bestätigt. Schließlich wird
die Aldehydaktivität
ebenfalls durch den von Ellis et al. (Biochemical Journal, 312, 535-541,
1995) beschriebenen Enzymtest nachgewiesen.
-
6. Spezifische Marker
der Epithelzellen der Korea für
die Linie CNCM I-1777
-
- 6.a Expression des Zytokeratins von 64kD: wie
für die
Analyse der Zytokeratine, die oben beschrieben ist, werden die Zellen
auf Glasplatten durch eine Lösung
von 100 % kaltem Methanol fixiert, dann werden die Platten in dem
Puffer TNP (siehe oben) gewaschen. Dann werden die Zellen 30 min
lang im Beisein von spezifischen Mäuseantikörpern für das Zytokeratin von 64kD
(Anticorps AE5, ICM Biomedical Inc., US) inkubiert. Nach 3 Waschungen
im Puffer TNP, umfassend 0,5 % BSA, werden die Platten 30 min lang
mit einem Ziegenantikörper
Maus-Anti-IgG, umfassend eine Immunfluoreszenzverbindung (1:300,
FITC-goat anti mouse IgG; Biosys.) inkubiert. Nach 3 Waschungen
im vorhergehenden Puffer werden die Platten fixiert und durch Fluoreszenz
unter dem Mikroskop analysiert. Die Zellen sind für das Zytokeratin
von 64 kD positiv.
- 6.b Expression der Glutathion-S-Transferase hGST5.8: die Expression
der Glutathion-S-Transferase hGST5.8
wird mit Hilfe des von Singhal et al. (Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.
36, 142-150, 1995) beschriebenen Tests analysiert. Zusammenfassend
werden 10 μg/ml
eines Zytosolextrakts der Linie CNCM I-1777 mit 0,1 mM 4-Hydroxy-Nonenal
und 0,5 mM eines Glutathions in einem Kaliumphosphatpuffer 100 mM
mit einem pH-Wert 6,5 gemischt, dann wird die Enzymaktivität durch
die Änderung
der Absorption des Gemisches auf 224 nm gemessen. Die Ergebnisse
zeigen, dass die Linie CNCM I-1777 eine Glutathion-S-Transferase hGST5.8-Aktivität ausdrückt.
- 6.c Expressionsprofil der Zytokine und der Wachstumsfaktoren:
die Zellen der Linie CNCM I-1777, die im 30. Durchgang entnommen
wurden, werden kultiviert, die RNA wird entnommen, dann erfolgt
eine PCR auf dieser RNA mit verschiedenen Ansätzen, um die Transkription
der RNA zu bestätigen,
die für
die folgenden Zytokine und/oder Wachstumsfaktoren codiert: TNFα, IL-1β, IL-1α, IL-6, IL-8,
GM CSF-β,
IL-ra, TGF-β1, TGF-β2, TGFα, EGF und
PDGF-β.
-
Diese
Ansätze
entsprechen einem Teil der für
diese Verbindungen codierenden Gene, wobei die DNA-Sequenzen der
Gene in der Datenbasis GeneBank zugänglich sind (Zugriffsnummer
TNFα: X2910; IL-1β: M15840;
IL-1α: M15329;
IL-6: M14584; Rosenbaum et al., Inv. Opht. & Vi. Sc., 36, 2151-2155, 1995; IL-8:
M28130; GM CSF-β:
X03021; IL-ra: M97748; Kennedy et al., 7. Clinical Inv., 95, 82-88,
1995; TGF-β1: X02812,
Nishida et al., Curr. Eye Res., 14, 235-241, 1995; TGF-β2: Y00083;
TGFα: M22440;
EGF: L17032; PDGF-β:
X02811).
-
Zum
Vergleich wird dieselbe Analyse des Expressionsprofils der Zytokine
und der Wachstumsfaktoren an einer RNA durchgeführt, die von Epithelgeweben
der menschlichen Kornea stammen (4 verschiedene Biopsien).
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 nachstehend angeführt. Das Zeichen * zeigt an,
dass die Expression der Verbindungen TNFα, IL-1β, IL-1α, IL-6 und IL-8 auch durch Tests
ELISA aus dem Kulturmedium der Zellen CNCM I-1777 bestätigt wurde.
Die spezifischen Antikörper
gegen diese verschiedenen Zytokine sind im Handel erhältlich (TNFα, IL-1β: BioSource
Inter., US, Katalognr. KH00012 und KHC3013; IL-1α, IL-6 und IL-8: CLB corp.,
US, Katalognr. M1901, M1916, M1918). Tabelle
1
- (–: nicht
erfasst; +/–:
leicht erfasst; +++: im Überfluss)
-
7. Spezifische Marker
einer entzündlichen
Reaktion für
die Linie CNCM I-1777
-
- 7.a Kollagenase I: die Kollagenase I ist ein
Molekül,
dessen Expression einen normalen Entzündungszustand der Zellen der
Kornea kennzeichnet. Die Expression der Kollagenase kann durch PCR,
Western Blot oder Elisa erfasst werden.
-
Um
die Kollagenase I durch PCR u erfassen, werden die Zellen CNCM I-1777,
die im 29. Durchgang entnommen wurden, im Beisein von 20 ng/ml TPA
16 bis 24h lang kultiviert, wird die RNA entnommen und das Vorhandensein
von RNAm der Kollagenase I durch PCR mit einem abgeleiteten Ansatz
der DNA-Sequenz der Kollagenase I (Genebank: Nr. X05231) erfasst.
-
Um
die Kollagenase I durch Western Blot zu erfassen, wird, nachdem
die Zellen CNCM I-1777 im Beisein von 20 ng/ml TPA 16 bis 24h lang
kultiviert wurden, das Kulturmedium wiedergewonnen, mit einem Filter Amicon30® konzentriert,
werden die Proteine durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel
SDS-Page getrennt, durch Western-blot auf einen Filter übertragen,
wird der Filter einem ersten Anti-Kollagenase-Antikörper I (Cortex Biochem., US,
Nr. 60338P), einen zweiten, mit einer Peroxydase gekoppelten Antikörper (Pierce,
US, Nr. 31400), dann dem Substrat der Peroxydase unterzogen.
-
Um
die Kollagenase I durch Elisa zu erfassen, reicht es aus, den Koffer
hMMP-1 von Amershan (Katalog, rpn 2610) zu verwenden und den Herstellerhinweisen
zu folgen.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Expression der Kollagenase I erfasst
werden kann, wenn die Zellen CNCM I-1777 einer entzündlichen
Behandlung unterzogen werden. Wenn hingegen die Zellen CNCM I-1777 nicht
mit TPA in Kontakt gebracht werden, drücken diese keine durch PCR,
Western-Blot oder Elisa erfassbare Kollagenase I aus.
- 7.b Marker die für
eine entzündliche
Reaktion notwendig sind: die Rezeptoren für Bradykinin, Histamin, PAF und
das Transduktionssystem der Phosphoinositide sind Marker, die notwendig
sind, damit die Linie CNCM I-1777 physiologisch in einem normalen
Entzündungszustand
sein kann. Um das Vorhandensein dieser Marker zu erfassen, werden die
Zellen CNCM I-1777 oder primäre
Epithelzellen der menschlichen Kornea im Beisein von entzündlichen
Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie mit Rezeptoren
in Interaktion treten, die mit dem Transduktionssystem von entzündlichen
Signalen durch die Phosphoinositide gekoppelt sind, inkubiert und
die Konzentration von so erzeugten Inositolphosphat-Molekülen (PI)
gemessen. Die Anhäufung
von PI ist tatsächlich
für das
Vorhandensein von Rezeptoren an den entzündlichen Verbindungen kennzeichnend.
-
Die
Tests basieren auf den Protokollen von Sharif et al., die in J.
Ocular Pharmacol., 10, 653-664, 1994; und Neurochem. Res., 12, 1313-1320,
1993 beschrieben sind. Zusammenfassend werden auf Platten mit 24
Schächten
im Medium DMEM ungefähr
2,5 × 105 Zellen CNCM I-1777 pro Schacht im Beisein
von [3H] Myoinositol (1μCi/0,5 ml; 15.17 Ci/mM, Amersham
Corp.) 24h lang bei 37 °C
kultiviert. Das Medium der Schächte
wird angesaugt, und sie werden 60 min lang bei 37 °C einem Medium
DMEM ausgesetzt, umfassend 10 mM LiCl, 15 mM Puffer HEPES und verschiedene
Konzentrationen an Bradykinin (Collaborative Biomedical, US), Histamin
(Sigma US) oder PAF (BioMol Research Lab, US). Um die Reaktion anzuhalten,
wird dann das Medium angesaugt, und in die Schächte werden 0,1 M Ameisensäure hinzugefügt. Danach
werden die Zellen lysiert, die Komponenten des Lysats auf einer
Ionenaustauschsäule
getrennt (Harz AG1x8; Säule
Econo®,
Biorad, US), wobei die Säule
mit 10 ml entionisiertem Wasser und 8 ml einer Lösung aus 50 mM Ammoniumformat
eluiert und die durch die Elutionsfraktionen freigesetzte Radioaktivität mit einem
Szintillationszähler
quantifiziert wird.
-
Die
Ergebnisse werden nach dem von Sharif et al. (Neurochem. Int., 18,
89-96, 1991) beschriebenen Verfahren analysiert. Der Wert EC50 definiert
die Konzentration der Verbindung, die notwendig ist, um 50 % der
maximalen Aktivität
des Transduktionssystems der Phosphoinositide zu stimulieren.
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Die
in den 2, 3 und 4 dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass die Zellen CNCM I-1777 Rezeptoren für Bradykinin,
Histamin, PAF aufweisen, und dass sie sich wie primäre Epithelzellen
der menschlichen Kornea verhalten.
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Beispiel 2
-
Wie
in Beispiel 1 beschrieben, wird die Fähigkeit der Linie CNCM I-1777,
die im Durchgang 106 entnommen wurde, zur Expression der spezifischen
Stoffwechselmarker der nicht immortalisierten menschlichen Epithelzellen,
der spezifischen Stoffwechselunterscheidungsmarker der nicht immortalisierten
Epithelzellen der menschlichen Kornea und der Marker einer Entzündungsreaktion
analysiert. Die Ergebnisse sind mit jenen des Beispiels 1 vergleichbar.
