PT1963368E

PT1963368E - Anticorpos anti-il-17

Info

Publication number: PT1963368E
Application number: PT06846464T
Authority: PT
Inventors: Kingman Ng; Lihua Huang; Barrett Allan; Chi-Kin Chow; Jirong Lu; Jonathan Wendell Tetreault; Andrew Gordon Werner; Ling Liu
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2012-09-14
Also published as: EP2481753B1; NO2017044I1; EA200870050A1; PL1963368T6; BRPI0619792A2; CN101326195B; RS52509B2; HUE039353T2; NO2017044I2; EP3366702A1; LTC1963368I2; CY2016030I1; EP2481753A1; CN101326195A; IL191217A; LT2481753T; PL1963368T3; AU2006325860A1; JP2009519348A; EP1963368B3

Description

ΡΕ1963368 1 DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ΑΝΤΙ—IL—17"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção situa-se no campo da medicina, particularmente no campo dos anticorpos monoclo-nais contra IL-17 humana. A invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti-Il-17 neutralizantes que se ligam com elevada afinidade a um epitopo antigénico não linear ou conformacional de IL-17, que compreende os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 27 6) . Os anticorpos da invenção podem ser quiméricos, humanizados ou anticorpos humanos, imuno-conjugados dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio e são úteis como um medicamento para o tratamento de distúrbios auto-imunes, inflamatórios, de proliferação e desenvolvimento celular.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A familia IL-17 das citocinas inclui actualmente IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F. Todos os membros da familia IL-17 possuem quatro residuos de cisteina altamente conservados que estão envolvidos na formação de ligações persulfureto intracadeia e possuem dois ou mais residuos de cisteina que podem estar envol- 2 ΡΕ1963368 vidos nas ligações persulfureto intercadeia. Os membros da família IL-17 não possuem semelhança de sequências com nenhumas outras citocinas conhecidas. Contudo, observou-se um homólogo virai da IL-17 na grelha de leitura aberta 13 do vírus herpes saimiri (Yao, Z, et. al, Immunity, 3:811, 1995) e possui uma identidade de 72% em resíduos de aminoácidos com a IL-17A humana. Foram relatadas múltiplas funções para os membros da família IL-17 que envolvem principalmente a regulação da resposta imunitária. A interleucina 17 (IL-17, também referida como IL-17A) é uma glicoproteína homodimérica de 20-30 kD produzida predominantemente através de células T CD4+ activadas e funciona como uma citocina pró-inflamatória. Quando um membro em particular da família IL-17 é referido simplesmente como "IL-17", entende-se que o referido membro da família é o IL-17A. A IL-17 é secretada por células T activadas nos sítios da inflamação que não estão na circulação sistémica. A IL-17 liga-se a um receptor de transmembrana de tipo I denominado IL-17R que é uma proteína grande que se expressa de forma ubíqua, que não apresenta uma semelhança de sequência significativa com nenhuns outros receptores de citocina conhecidos. A IL-17 possui múltiplas propriedades biológicas, incluindo moléculas de adesão de regulação positiva e a indução da produção de múltiplas citocinas inflamatórias e quimiocinas de vários tipos de células, incluindo sinoviócitos, condrócitos, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, queratinócitos, e macrófagos. A IL-17 também 3 ΡΕ1963368 induz o recrutamento de neutrófilos para um local inflamatório através da indução da libertação de quimiocinas, estimula a produção de prostaglandinas e de metaloproteinases e inibe a síntese de proteoglicano. Para além disso, a IL-17 desempenha um papel importante na maturação das células progenitoras hematopoiéticas. Foi demonstrado que a IL-17 possui papéis de sinalização em diferentes órgãos e tecidos, incluindo o pulmão, cartilagem articular, osso, cérebro, células hematopoiéticas, rim, pele e intestino. Para uma revisão da bioactividade da IL-17, ver, e.g., Kolls e Linden, Immunity 21:467-476, 2004, ou Fossiez, et al. Int. Rev. Immunol. 16:541, 1998.

Os níveis aumentados de IL-17 (i.e., IL-17A) têm sido associados a vários estados, doenças ou distúrbios, incluindo inflamação das vias respiratórias, artrite reumatóide ("RA"), osteoartrite, erosão óssea, abcessos e adesões intraperitoneais, distúrbio do intestino inflamatório ("IBD"), rejeição de aloenxertos, psoríase, certos tipos de cancro, angiogénese, aterosclerose e esclerose múltipla ("MS") (para uma revisão ver Witkowski, et al., Cell. Mol. Life Sei. 61:567-579, 2004). Ambas IL-17 e IL-17R são reguladas positivamente no tecido sinovial dos doentes com RA. O bloqueamento de uma bioactividade de IL-17 através da ligação de um anticorpo específico para IL-17 ou receptor solúvel para IL-17 reduz a inflamação e a erosão óssea em vários modelos de artrite animal. (Ver, e.g., Lubberts et al., Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004). Para além disso, a IL-17 possui efeitos 4 ΡΕ1963368 independentes de IL-Ιβ a degradação e inflamação da matriz de colagénio e na lesão das articulações, enquanto a IL-17 tem sinergia com TNF-α para amplificar a inflamação.

Assim, dada a sua distribuição localizada no sitio da inflamação, a IL-17 parece ser um novo alvo para o tratamento de RA e de outras doenças inflamatórias ou auto-imunes com um perfil de segurança potencialmente superior do que o dos fármacos que têm como alvo a circulação sistémica de citocinas pró-inflamatórias, tais como a TNF-a. Os bioprodutos actualmente aprovados pela FDA (os anticorpos ENBREL®, REMICADE® e HUMIRA®) que se ligam a, e neutralizam a TNF-α demonstraram eficácia na redução de sinais e sintomas de RA e no retardamento da progressão da doença num subconjunto de doentes com RA. Contudo, nem todos os doentes com RA respondem de forma igual à inibição de uma bioactividade de TNF-α com estes bioprodutos.

Adicionalmente, o mRNA de IL-17 é aumentado nas lesões de esclerose múltipla e nas células mononucleares no sangue e no fluido cefalorraquidiano em doentes dom MS, particularmente durante a exacerbação clinica. Consequentemente, existe uma necessidade para composições que antagonizem ou neutralizem a actividade de IL-17 de modo a tratar distúrbios, doenças ou estados em que a presença da bioactividade de IL-17 provoca ou contribui para um efeito patológico indesejável ou em que uma diminuição na bioactividade da IL-17 contribui para um efeito terapêutico desejável, incluindo distúrbios inflamatórios, distúrbios 5 ΡΕ1963368 de proliferação e desenvolvimento celular e distúrbios auto-imunes, tais como RA e MS e IBD.

Giavedoni, L D, Journal of Immunological Methods, Vol. 301, N° 1-2, 89-101, Junho de 2005, descreve a detecção simultânea de múltiplas citocinas e quimiocinas a partir de primatas não humanos utilizando a tecnologia luminex. São mencionados três anticorpos anti-IL-17 na Tabela 1.

Moseley, TA, et al., Cytokine and Growth Factor Reviews, Vol. 14, N° 2, 155-174, Abril de 2003, descreve a familias das interleucinas-17 e os receptores de IL-17. WO 2004/106377 descreve um método para obter um anticorpo com uma função desejada. Os anticorpos anti-IL-17 C9 e D12 são descritos na Tabela 4.

Hofstetter et al., Cellular Immunology, Vol. 237, N° 2 123-130, Outubro 2005, descreve a eficiência terapêutica da neutralização de IL-17 em encefalomielite auto-imune experimental. Foi observado que a neutralização de IL-17 com um anticorpo monoclonal melhora o curso da doença. Há uma necessidade para um anticorpo neutrali-zante anti-IL-17 que se liga especif icamente a IL-17 de origem humana assim como IL-17 de um mamifero não humano permitindo desse modo que o anticorpo seja utilizado em 6 ΡΕ1963368 estudos pré-clinicos e clínicos in vivo. Para além disso, existe uma necessidade para um anticorpo específico para IL-17 que se ligue a IL- 17 com uma afinidade elevada e/ou possua uma taxa de eliminação lenta permitindo desse modo que uma dose terapêutica eficaz seja minimizada resultando numa dosagem menos frequente com um tal anticorpo do que com um anticorpo que se liga a IL- 17 com uma afinidade menor (i.e., um KD superior) e/ou possua uma taxa de eliminação mais rápida. É também desejável um anticorpo específico para IL-17 com afinidade elevada na medida em que pode permitir que o anticorpo seja administrado a um doente subcutaneamente em vez de intravenosamente. Há também uma necessidade para um anticorpo específico para IL-17 com um valor de IC50 baixo num ensaio de bioactividade de IL- 17 de modo a criar um anticorpo anti-IL-17 terapêutico com uma dose mínima de efeito terapêutico. É também desejável proporcionar um anticorpo específico para IL- 17 em que uma resposta imunitária para o anticorpo produzida por um doente que recebe o anticorpo é reduzida para um mínimo. A presente invenção satisfaz estas necessidades e proporciona vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não caiam dentro das reivindicações é fornecida apenas para informação.

Os anticorpos da invenção são anticorpos monoclo- 7 ΡΕ1963368 nais anti-IL-17 quiméricos, humanizados, ou totalmente humanos, e suas porções de ligação ao antigénio, que se ligam a um epitopo não linear que compreende os aminoácidos de IL-17 DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) e antagonizam ou neutralizam pelo menos uma actividade biológica in vitro ou in vivo associada a IL-17 ou a uma porção desta.

Numa forma de realização, os anticorpos da invenção possuem uma IC50 inferior a, ou igual a cerca de 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 560 pM ou 500 pM num ensaio de repórter de IL-8 in vitro, como descrito, por exemplo, no Exemplo 6A aqui referido ou inferior a ou igual a 5 60 pM num Ensaio de Repórter de GROa in vitro como descrito, por exemplo, no Exemplo 6B aqui referido.

Noutra forma de realização, os anticorpos da invenção são caracterizados por uma forte afinidade de ligação (KD) para IL-17 humana, i.e., inferior a cerca de 7 pM, 6,5 pM, 6,0 pM, 5,5 pM, 5,0 pM, 4,5 pM ou 4,0 pM. Alternativamente, os anticorpos da invenção são caracterizados por uma KD para IL-17 humana não superior a cerca de 7 pM, 6,5 pM, 6,0 pM, 5,5 pM, 5,0 pM, 4,5 pM ou preferencialmente não superior a cerca de 4,0 pM. Preferencialmente, os anticorpos da invenção são ainda caracterizados com uma taxa de koff de IL-17 humana inferior a 2 x 10~5 s’1.

Noutra forma de realização, um anticorpo anti-IL-17 da invenção é caracterizado ligando especificamente IL- ΡΕ1963368 17 humana, assim como IL-17 de macaco cinomólogo embora não se ligando a IL-17 de murganho ou de rato a niveis superiores ao fundo. Adicionalmente, um anticorpo anti-IL-17 da invenção liga IL-17 humana (i.e., IL-17A), mas não se liga a IL-17B, C, D, E ou F humanas.

Numa forma de realização, um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende um polipéptido da região variável de cadeia leve ("LCVR") compreendendo 3 sequências de CDR que estão presentes em conjunto num Fab listado na Tabela 3, aqui referida abaixo e que estão presentes no anticorpo da invenção na mesma posição de CDR como no Fab listado na Tabela 3. Preferencialmente, um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende um polipéptido de LCVR com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 178-243.

Noutra forma de realização, um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada ("HCVR") compreendendo o polipéptido 3 CDRs que estão presentes em conjunto numa Fab listada na Tabela 2 aqui referido abaixo e que estão presentes no anticorpo da invenção na mesma posição da CDR como na Fab listada na Tabela 2. Preferencialmente, um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende um polipéptido de HCVR com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 56-121. 9 ΡΕ1963368

Noutra forma de realização, um anticorpo mono-clonal anti-IL-17 da invenção compreende um polipéptido de LCVR compreendendo 3 CDRs que estão presentes em conjunto numa Fab listada na Tabela 3 e que estão presentes no anticorpo da invenção na mesma posição de CDR que na Fab listada na Tabela 3 e compreende ainda um polipéptido de HCVR compreendendo 3 CDRs que estão presentes em conjunto numa Fab listada na Tabela 2 e que estão presentes no anticorpo da invenção na mesma posição de CDR que na Fab listada na Tabela 2. Preferencialmente, as 6 CDRs de um anticorpo da invenção, ou seu fragmento funcional, existem em conjunto numa Fab listada na Tabela 1 aqui referida abaixo e estão presentes no anticorpo da invenção na mesma posição de CDR que na Fab listada na Tabela 1.

Numa forma de realização preferida, um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende (i) um polipéptido de LCVR com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 178-243 e (ii) um polipéptido de HCVR com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 56-121. Numa forma de realização mais preferida, um anticorpo da invenção compreendendo um polipéptido de LCVR com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 178-243 compreende ainda o polipéptido de HCVR seleccionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 56-121 que está presente numa Fab listada na Tabela 1 que compreende o LCVR particular presente no anticorpo. 10 ΡΕ1963368

Noutra forma de realização, um anticorpo monoclonal da invenção é aquele que pode competir pela ligação a IL-17 humana, ou uma porção de IL-17 humana, com um anticorpo de competição em que o anticorpo de competição compreende dois polipéptidos com as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 241 e 118.

Noutra forma de realização, uma LCVR de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende 1, 2 ou 3 péptidos, preferencialmente 3 péptidos, seleccionados a partir do grupo que consiste nos péptidos com uma sequência como apresentado em (a) SEQ ID NOs: 122-149; (b) SEQ ID NOs: 150-167, e (c) SEQ ID NOs:168-177 (i.e., um péptido de (a), um péptido de (b) e um péptido de (c) para um anticorpo compreendendo os referidos 3 péptidos). Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 122-149, quando presente num anticorpo da invenção, está na CDRL1. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 150-167, quando presentes num anticorpo da invenção, está na CDRL2. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 150-167, quando presentes num anticorpo da invenção, está na CDRL3.

Noutra forma de realização, uma HCVR de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreende 1, 2 ou 3 péptidos, preferencialmente 3 péptidos, seleccionados a partir do grupo que consiste nos péptidos com uma sequência como apresentado em (a) SEQ ID NOs: 11-28; (b) 11 ΡΕ1963368 SEQ ID NOs: 29-32, e (c) SEQ ID NOs: 33-55 e 261 (i.e., um péptido de (a), um péptido de (b) e um péptido de (c) para um anticorpo compreendendo os 3 péptidos referidos). Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 11-28, quando presente no referido anticorpo, está em CDRH1. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 29-32, quando presente no referido anticorpo, está na CDRH2. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 33-55 e 261, quando presente no referido anticorpo, está na CDRH3. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal anti-IL-17 compreendendo seis péptidos seleccionados a partir do grupo que consiste nos péptidos com uma sequência como apresentada em (a) SEQ ID NOs: 122-149; (b) SEQ ID NOs: 150-167, (c) SEQ ID NOs: 168-177, (d) SEQ ID NOs: 11-28; (e) SEQ ID NOs: 29-32, e (f) SEQ ID NOs: 33-55 e 261 (i.e., um péptido de cada um de (a-f)); preferencialmente os seis péptidos coexistem num Fab listado aqui na Tabela 1. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 122-149, quando presentes num anticorpo da invenção, está na CDRL1. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 150-167, quando presente num anticorpo da invenção, está na CDRL2. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 150-167, quando presente num anticorpo da invenção, está na CDRL3. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 11-28, quando presente no referido anticorpo, está na CDRH1. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 29-32, quando presente no referido anticorpo, está na 12 ΡΕ1963368 CDRH2. Um péptido com a sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 33-55 e 261, quando presente no referido anticorpo, está na CDRH3. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal anti-IL-17 compreendendo os seis péptidos com as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 247, 248, 249, 244, 245 e 246. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 247 está na CDRL1. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 248 está na CDRL2. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 249 está na CDRL3. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 244 está na CDRH1. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 245 está na CDRH2. 0 péptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 246 está na CDRH3.

Um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção pode compreender ou consistir num anticorpo intacto (i.e., comprimento total), um anticorpo substancialmente intacto ou uma sua porção de ligação ao antiqénio, e.g., um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia simples. Para além disso, um anticorpo da invenção pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado numa fase sólida e/ou conjugado com um composto heterólogo, e.g., uma enzima, toxina ou molécula de polietilenoglicol.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção compreendendo manter uma célula 13 ΡΕ1963368 hospedeira da invenção (i.e., a célula hospedeira que foi transformada, transduzida ou infectada com um vector (ou vectores) da invenção que expressa um anticorpo da invenção) nas condições apropriadas para expressão de um anticorpo monoclonal da invenção, através do qual esse anticorpo é expresso. 0 método pode ainda compreender o passo de isolar o anticorpo monoclonal da invenção a partir da célula ou preferencialmente a partir do meio de cultura no qual a célula é cultivada.

Estão contempladas utilizações para diaqnóstico para os anticorpos monoclonais da invenção. Numa aplicação de diaqnóstico, a invenção proporciona um método para determinar o nivel de proteína IL-17 numa amostra compreendendo expor uma amostra a ser testada a um anticorpo anti-IL-17 da invenção em condições de liqação e determinar a ligação específica do anticorpo à amostra. Um anticorpo anti-IL-17 da invenção pode ser utilizado para determinar os níveis de IL-17 em amostras de teste através da comparação dos valores da amostra de teste com uma curva padrão criada através da ligação do referido anticorpo às amostras com quantidades conhecidas de IL-17. A invenção proporciona ainda um estojo ("kit") compreendendo um anticorpo da invenção e, preferencialmente, instruções para utilizar o anticorpo para detectar a proteína IL-17 numa amostra. A invenção proporciona uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica, compreendendo um 14 ΡΕ1963368 anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção. A composição farmacêutica da invenção pode ainda compreender um veiculo, excipiente e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Na referida composição farmacêutica, o anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção é o único ingrediente activo. Preferencialmente, a composição farmacêutica compreende uma população homogénea ou substancialmente homogénea de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção. A composição para utilização terapêutica é fisiologicamente compatível, estéril e pode ser liofilizada e opcionalmente fornecida com um diluente apropriado. É aqui revelado um método de inibição de pelo menos uma bioactividade de IL-17 num animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um humano, que dele tem necessidade, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou quantidade neutra-lizadora de IL-17, de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção ao referido animal. É aqui também revelado um método de tratamento de uma doença ou distúrbio melhorado pela neutralização ou antagonizar de uma bioactividade de IL-17, e.g., inibição de transdução de sinal que resulta da ligação de IL-17 ao seu receptor, que compreende administrar a um doente (e.g., um humano) em necessidade desse tratamento ou prevenção de uma quantidade terapeuticamente eficaz de quantidade neutralizadora de IL-17, de um anticorpo monoclonal da invenção. A invenção corporiza um anticorpo monoclonal 15 ΡΕ1963368 anti-IL-17 da invenção para utilização no fabrico de um medicamento para administração a um mamífero, preferencialmente um humano, para o tratamento de, e.g., um distúrbio auto-imune ou distúrbio de inflamação ou distúrbio de proliferação celular. A invenção incorpora ainda um artigo de fabrico compreendendo um material de empacotamento e um anticorpo da invenção contido no referido material de empacotamento, em que o material de empacotamento compreende uma inserção na embalagem que indica que o anticorpo neutraliza espe-cificamente uma actividade de IL-17 ou diminui o nível de IL-17 funcional presente no sistema. A invenção proporciona ainda moléculas de ácido nucleico isolado que codificam um anticorpo da invenção ou sua cadeia leve ou cadeia pesada; um vector (ou vectores) compreendendo o referido ácido nucleico, ligado opcionalmente de uma forma operacional a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector; uma célula hospedeira compreendendo esse vector; um processo para produzir um anticorpo da invenção compreendendo cultivar a célula hospedeira de modo a que o ácido nucleico seja expresso e, opcionalmente, recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura da célula hospedeira. A invenção proporciona ainda moléculas de ácido nucleico isolado que codificam IL-17 de macaco cinomólogo (SEQ ID NO: 253) ou IL-17 de coelho (SEQ ID NO: 251); a 16 ΡΕ1963368 proteína IL-17 codificada pelo ácido nucleico de macaco ou coelho (SEQ ID NOs: 10 ou 9 respectivamente); compreendendo os vectores a referida molécula de ácido nucleico; a célula hospedeira compreendendo o referido vector; e um processo para produzir IL-17 de macaco cinomólogo ou IL-17 de coelho.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 apresenta o alinhamento das sequências de aminoácidos de membros da família das proteínas de IL-17 humanas (IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F). A FIG. 2 apresenta o alinhamento das sequências de aminoácidos de DL-17 das espécies humana, coelho, rato, macaco cinomólogo e murino.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não caia nas reivindicações é fornecida apenas para informação. A invenção apresenta anticorpos monoclonais anti-IL-17 quiméricos, humanizados ou totalmente humanos, ou suas porções de ligação ao antigénio, capazes de neutralizar ou antagonizar pelo menos uma actividade de IL-17 in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, esses anticorpos da invenção são ainda caracterizados como 17 ΡΕ1963368 possuindo uma ICs0 inferior a cerca de 600 ou 560 pM em e.g., um ensaio de repórter de IL-8 in vitro ou ensaio repórter de GROa (ver, e.g., Exemplo 6) e/ou preferencialmente possuindo uma forte afinidade de ligação com IL-17 inferior a 4 pM. Os anticorpos da invenção são ainda caracterizados por se ligarem especificamente a IL-17 de humano e de macaco cinomólogo (SEQ ID NOs: 1 e 10 respectivamente) mas não se ligarem a IL-17 de murino ou de rato (SEQ ID NOs: 7 e 8 respectivamente) . O epitopo antigénico ao qual os anticorpos monoclonais da invenção se liga é um epitopo não linear de IL-17 de humano (e macaco) e compreende os residuos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de IL-17. Um anticorpo da invenção toma contacto com o péptido DGNVDYH quando está no contexto da IL-17 de comprimento total.

Definições "Interleucina 17" também referida como "IL-17" ou "IL-17A" é uma proteína de 20-30 kD glicosilada homodimérica. O gene de IL-17 humano codifica para uma proteína de 155 aminoácidos que possui uma sequência sinal de 19 aminoácidos e um segmento maduro de 136 aminoácidos. A IL-17 humana apresenta uma identidade de sequência de aminoácidos de 62,5% e 58% em relação às sequências de aminoácidos de IL-17 de murganho e de rato, respectivamente como apresentado na Figura 2. A IL-17 humana apresenta uma identidade de sequência de aminoácidos de 97,4% em relação a IL-17 de macaco cinomólogo. 18 ΡΕ1963368

Um anticorpo de comprimento total, como existe naturalmente, é uma molécula de imunoglobulina compreendida por quatro cadeias peptidicas, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 kDa quando de comprimento total) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kDa quando de comprimento total) interligadas através de ligações persulfureto. A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca e 100-110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efectora.

As cadeias leves são classificadas como kapa ou lambda e caracterizadas por uma região constante particular. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve N-terminal (aqui referida como "LCVR") e uma região constante da cadeia leve compreendida por um domínio, CL. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, e define o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectiva-mente e vários destes podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos) e.g., IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada N-terminal (aqui referida como "HCVR") e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios (CHI, CH2, e CH3) para IgG, IgD, e IgA; e 4 domínios (CHI, CH2, CH3, e CH4) para IgM e IgE. 19 ΡΕ1963368

As regiões HCVR e LCVR podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade ("CDRs"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de grelha ("FR"). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Para os anticorpos de comprimento total da invenção as cadeias leves compreendem preferencialmente, a jusante de FR4, um polipéptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 277. Para os anticorpos de comprimento total da invenção, as cadeias pesadas compreendem preferencialmente, a jusante de FR4, um polipéptido com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 278. Aqui, as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como "CDRH1, CDRH2, e CDRH3" e as 3 CDRs da cadeia leve são referidas como "CDRL1, CDRL2 e CDRL3." As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interacções específicas com o antigénio. A numeração e o posicionamento dos resíduos de aminoácidos da CDR nas regiões HCVR e LCVR estão de acordo com a convenção de numeração de Kabat bem conhecida. 0 termo "anticorpo," em referência a um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção (ou simplesmente "anticorpo da invenção"), como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo monoclonal. Um "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado refere-se a um anticorpo de roedor, preferencialmente de murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo 20 ΡΕ1963368 humanizado ou um anticorpo totalmente humano, salvo aqui indicado em contrário. Podem ser produzidos anticorpos monoclonais da invenção utilizando e.g., técnicas de hibri-doma bem conhecidas na técnica, assim como tecnologias recombinantes, tecnologias de apresentação em fago, tecnologias sintéticas ou recombinantes ou combinações de tecnologias já conhecidas na técnica. O termo "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado, não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia dos hibridomas. "Anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de uma cópia única ou de um clone, incluindo e.g., clone eucariótico, procariótico, ou de fago, e não o método através do qual é produzido. Um "anticorpo monoclonal" pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região Fc completa ou de comprimento total), um anticorpo substancialmente intacto, ou uma porção ou fragmento de um anticorpo compreendendo uma porção de ligação ao antigénio, e.g., um fragmento Fab, fragmento Fab' ou fragmento F(ab')2 de um anticorpo de murino ou de um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. O fragmento "Fab" contém um domínio variável e constante da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos do anticorpo "F(ab')2" compreendem um par de fragmentos Fab que são geralmente ligados covalentemente próximo dos seus terminais carboxilo através das cisteínas da dobra entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos na técnica. A região variável de cada par de cadeia leve- 21 ΡΕ1963368 pesada forma um sítio de ligação ao antigénio do anticorpo. Assim, um anticorpo IgG intacto possui dois sítios de ligação. Excepto em anticorpos bifuncionais ou biespecí-ficos, os dois sítios de ligação ao antigénio do anticorpo são iguais. Como aqui utilizado, a "porção de ligação ao antigénio" ou "região de ligação ao antigénio" ou "domínio de ligação ao antigénio" refere-se indistintamente à porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antigénio e conferem ao anticorpo a sua especificidade e afinidade para o antigénio. Esta porção de anticorpo inclui os resíduos de "grelha" dos aminoácidos necessários para manter a conformação apropriada dos resíduos de ligação ao antigénio. Preferencialmente, as CDRs da região de ligação ao antigénio dos anticorpos da invenção são inteiramente ou substancialmente de origem de murino, opcionalmente com certos resíduos de aminoácidos alterados, e.g., substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, (ver e.g., as Tabelas 2 e 3) para optimizar uma propriedade particular do anticorpo, e.g., KD, koff, IC50. Preferencialmente, as regiões de grelha dos anticorpos da invenção são de origem humana ou substancialmente de origem humana (pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de origem humana. As regiões de grelha preferidas dos anticorpos da invenção possuem as seguintes sequências: SEQ ID NOs: 262 (HCVR FR1), 263 (HCVR FR2), 264 (HCVR FR3), 265 (HCVR FR4), 266 (LCVR FR1), 267 (LCVR FR2), 268 (LCVR FR3), 269 (LCVR FR4) e seguem a numeração de Kabat. Noutras formas de realização, a região de ligação ao antigénio de um anticorpo de 22 ΡΕ1963368 IL-17 da invenção pode ser derivada de outra espécie não humana incluindo, mas não limitada a, coelho, rato ou hamster. Alternativamente, a região de ligação ao antigénio pode ser derivada da sequência humana.

Para além disso, um "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado, pode ser um fragmento Fv de cadeia simples que pode ser produzida através da união do DNA que codifica uma LCVR e o DNA que codifica uma HCVR com uma sequência de ligante. (Ver, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994) . É entendido que, independentemente de os fragmentos serem especificados, o termo "anticorpo", como aqui utilizado, inclui os fragmentos assim como as formas de cadeia simples. Desde que a proteina retenha a capacidade para se ligar especificamente ou preferencialmente ao seu alvo pretendido {i.e., epitopo ou antigénio), está incluido no termo "anticorpo." Os anticorpos podem se ou não glicosilados e ainda assim cairem dentro das fronteiras da invenção.

Uma população de "anticorpos monoclonais," ref e- re-se a uma população de anticorpos homogénea ou subs- tancialmente homogénea {i.e ., pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 97% ou 98% ou muito preferencialmente pelo menos 99% dos anticorpos na população deve competir num ensaio de ELISA para o mesmo antigénio ou epitopo ou mais preferencialmente os anticorpos são idênticos na sequência 23 ΡΕ1963368 de aminoácidos. Os anticorpos podem ser ou não glicosilados e ainda assim caírem dentro das fronteiras da invenção. Os anticorpos monoclonais podem ser homogéneos se possuírem uma sequência de aminoácidos idêntica embora possam diferir numa modificação de pós-tradução, e.g., padrão de glico-silação.

Uma "variante" de anticorpo, refere-se aqui a uma molécula que difere na sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de um anticorpo "parental" em virtude da adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduo (s) de aminoácidos da sequência do anticorpo parental. Numa forma de realização preferida, o anticorpo variante compreende pelo menos um aminoácido (e.g., desde um até cerca de dez, e preferencialmente 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) adição, deleção e/ou substituição nas regiões de CDR do anticorpo parental. Identidade ou homologia em relação à sequência do anticorpo variante é aqui definido como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência do anticorpo variante que são idênticos com os resíduos do anticorpo parental após alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima da identidade de sequência. 0 anticorpo variante retém a capacidade para se ligar ao antigénio, ou preferencialmente, o epitopo, ao qual o anticorpo parental se liga e preferencialmente possui pelo menos uma propriedade ou bioactividade que é superior à do anticorpo parental. Por exemplo, o anticorpo variante possui preferencialmente uma afinidade de ligação mais forte, uma taxa de eliminação - 24 - ΡΕ1963368 mais lenta, IC50 mais baixa ou capacidade aumentada para inibir uma bioactividade do antigénio do que faz o anticorpo parental. Um anticorpo variante de particular interesse aqui referido é aquele que apresenta pelo menos cerca de 2-vezes, preferencialmente pelo menos cerca de 5-vezes, 10-vezes ou 20-vezes aumento numa propriedade ou bioactividade quando comparado com o anticorpo parental. 0 anticorpo "parental" aqui referido é aquele que é codificado por uma sequência de aminoácidos utilizada para a preparação de um anticorpo variante. 0 anticorpo parental pode possuir uma sequência de grelha de origem murinica, mas preferencialmente a sequência de grelha é inteiramente ou substancialmente de origem humana. 0 anticorpo parental pode ser um anticorpo de murino, quimérico, humanizado ou humano. 0 termo "liga-se especificamente", como aqui utilizado, refere-se à situação na qual um membro de um par de ligação especifico não se liga significativamente às moléculas diferentes do(s) seu (s) parceiro(s) de ligação especifico(s). 0 termo é também aplicáveis quando e.g., um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo da invenção é específico para um epitopo particular que é realizado por vários antigénios, em cujo caso, o anticorpo específico que contém o domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios que contêm o epitopo. Consequentemente, um anticorpo monoclonal da invenção liga-se especificamente a IL-17 humana (i.e., IL-17A) embora não se 25 ΡΕ1963368 ligue especificamente a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F humanas. Além disso, um anticorpo monoclonal da invenção liga-se especificamente a IL-17 humana e IL-17 de macaco cinomólogo mas não se liga especif icamente a IL-17 de rato ou a IL-17 de murino. Além disso, um anticorpo monoclonal da invenção liga-se especificamente a um epitopo de IL-17 humana não-linear ou conformacional, compreendendo os aminoácidos DGNDYH mas não se liga a um epitopo de IL-17 humana que não compreende os aminoácidos DGNDYH. 0 termo "liga-se preferencialmente", como aqui utilizado, refere-se à situação em que um anticorpo se liga a um antigénio específico pelo menos cerca de 20% superior, preferencialmente pelo menos cerca de 50%, 2-vezes, 20-vezes, 50-vezes ou 100-vezes superior do que se liga a um antigénio diferente, como medido por uma técnica disponível na técnica, e.g., ELISA de competição ou medição de KD com um ensaio de BIACORE ou KTNEXA. Um anticorpo pode ligar-se preferencialmente a um epitopo num antigénio em relação a um epitopo diferente no mesmo antigénio. Consequentemente, um anticorpo da invenção liga-se preferencialmente a IL-17 humana em relação a IL-17 de coelho. 0 termo "epitopo" refere-se à porção de uma molécula capaz de ser reconhecida por e ser ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação ao antigénio do anticorpo. Os epitopos consistem frequentemente num agrupamento de moléculas de superfície quimicamente activas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açú- 26 ΡΕ1963368 car e possuem características estruturais tridimensionais especificas assim como caracteristicas de carga especificas. Por "epitopo de inibição" e/ou "epitopo neutrali-zador" entende-se um epitopo que, quando no contexto da molécula antigénica intacta e quando ligada por um anticorpo especifico para o epitopo, resulta na perda ou na diminuição de uma actividade biológica da molécula in vivo ou in vitro ou num organismo que contém a molécula. 0 termo "epitopo", como aqui utilizado, além disso refere-se a uma porção de um polipéptido possuindo actividade antigénica e/ou imunogénica num animal, preferencialmente um mamifero, e.g., um murganho ou um humano. 0 termo "epitopo antigénico", como aqui utilizado, é definido como uma porção de um polipéptido ao qual um anticorpo se pode ligar especificamente, como determinado através de qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, através de imunoensaios convencionais. Os epitopos antigénicos não necessitam necessariamente de ser imunogénicos, mas podem ser imunogénicos. Um "epitopo imunogénico", como aqui utilizado, é definido como uma porção de um polipéptido que induz uma resposta de anticorpo num animal, como determinado através de qualquer método conhecido na art. Um "epitopo não linear" ou "epitopo conformacional" compreende polipéptidos não contíguos (ou aminoácidos) na proteína antigénica à qual um anticorpo específico para o epitopo se liga.

As frases "propriedade biológica" ou "caracterís- 27 ΡΕ1963368 tica biológica", ou os termos "actividade" ou "bioacti-vidade", em referência a um anticorpo da presente invenção, são aqui utilizadas indistintamente e incluem, mas não estão limitadas a, afinidade e especificidade epitopo/an-tigénio, capacidade para neutralizar ou antagonizam uma actividade de IL-17 in vivo ou in vitro, IC5o, estabilidade in vivo do anticorpo e as propriedades imunogénicas do anticorpo. Outras propriedades biológicas identificáveis ou caracteristicas de um anticorpo reconhecidas na técnica incluem, por exemplo, reactividade cruzada, (i.e., com homólogos não humanos do péptido alvo, ou com outras proteínas ou tecidos, geralmente), e a capacidade para preservar niveis de expressão elevados da proteina em células de mamíferos. As propriedades ou caracteristicas acima mencionadas podem ser observadas, medidas ou avaliadas utilizando técnicas reconhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a, ELISA, ELISA competitiva, análise de ressonância de plasmão de superfície BIACORE ou KJNEXA, ensaios de neutralização in vitro ou in vivo sem limite, ligação ao receptor, produção e/ou secreção de citocina ou factor de crescimento, transdução de sinal e imuno-histoquímica com secções de tecido de diferentes fontes incluindo humana, primata, ou qualquer outra fonte. 0 termo "inibe" ou "neutraliza", como aqui utilizado em relação a uma actividade de um anticorpo da invenção significa a capacidade para antagonizar, proibir, prevenir, restringir, abrandar, interromper, eliminar, parar, ou reverter substancialmente e.g., a progressão ou a 28 ΡΕ1963368 gravidade daquilo que está a ser inibido, incluindo, mas não limitado a, uma actividade biológica (e.g., uma actividade de IL-17) ou propriedade, uma doença ou um estado. A inibição ou neutralização de uma actividade de IL-17 que resulta da ligação de um anticorpo da invenção com IL-17 é preferencialmente pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou superior. 0 termo "isolado", quando utilizado em relação a um ácido nucleico ou proteina {e.g., um anticorpo) refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou proteina que é identificada e separada de pelo menos um contaminante com a qual está normalmente associada na sua fonte natural. Preferencialmente, um "anticorpo isolado" é um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (e.g., as composições farmacêuticas da invenção compreendem um anticorpo isolado que se liga especificamente a IL-17 e está substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente aos antigénios diferentes de IL-17).

Os termos "numeração de Kabat" e "marcação de Kabat" são aqui utilizados indistintamente. Estes termos, que são reconhecidos na técnica, refere-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (i.e., hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sei 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of proteins of Immunolo- 29 ΡΕ1963368 gical Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)).

Um polinucleótido está "ligado operacionalmente" a outro polinucleótido quando está colocado numa relação funcional com o outro polinucleótido. Por exemplo, um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma sequência codificante se afecta a transcrição da sequência. Um péptido está "ligado operacionalmente" a outro péptido quando os polinucleótidos que os codificam estão ligados operacionalmente, preferencialmente estão na mesma grelha de leitura aberta.

Os termos "indivíduo", "sujeito" e "doente", aqui utilizados indistintamente, referem-se a um mamífero, incluindo, mas não limitados a, murinos, símios, humanos, animais mamíferos de quinta, animais mamíferos de desporto, e animais de companhia mamíferos; preferencialmente o termo refere-se a humanos. Numa certa forma de realização, o sujeito, preferencialmente um mamífero, preferencialmente um humano, é, além disso, caracterizado com uma doença ou distúrbio ou estado que iria beneficiar de uma bioactividade diminuída de IL- 17. 0 termo "vector" inclui uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual está ligado incluindo, mas não limitado a, vectores plasmídicos e virais. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual eles são 30 ΡΕ1963368 introduzidos enquanto outros vectores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Para além disso, certos vectores são capazes de dirigir a expressão dos genes aos quais estão ligados operacionalmente. Esses vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vectores de expressão") e os vectores exemplares são bem conhecidos na técnica.

Como aqui utilizadas, a expressões "célula", "célula hospedeira", "linha celular" e "cultura de células" são utilizadas indistintamente e incluem uma célula individual ou cultura de células que é um recipiente de qualquer polinucleótido isolado da invenção ou qualquer vector(es) recombinante(s) compreendendo uma sequência que codifica uma HCVR, LCVR ou anticorpo monoclonal da invenção. As células hospedeiras incluem uma descendência de uma célula hospedeira única, e a descendência pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA total) à célula parental original devido a mutação e/ou alteração natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transformadas, transduzidas ou infectadas com um vector recombinante ou um polinucleótido que expressa um anticorpo monoclonal da invenção ou uma sua cadeia leve ou cadeia pesada. Uma célula hospedeira que compreende um vector recombinante da invenção, seja incorporado de forma estável no cromossoma hospedeiro ou não, também pode ser referida 31 ΡΕ1963368 como uma "célula hospedeira recombinante". Células hospedeiras preferidas para utilização na invenção são células CHO (e.g., ATCC CRL-9096), células NSO, células SP2/0, células COS (ATCC e.g., CRL-1650, CRL-1651) e HeLa (ATCC CCL-2) . Células hospedeiras adicionais para utilização na invenção incluem células vegetais, células de levedura, outras células de mamíferos e células procarióticas.

Caracterização do Anticorpo A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a IL-17 humana (i.e., IL-17A) com afinidade elevada. Os anticorpos da invenção são preferencialmente anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos ou suas porções de ligação ao antigénio. Para além disso, os anticorpos da invenção neutralizam ou antagonizam pelo menos uma actividade biológica de IL-17 in vivo e/ou in vitro. A ligação específica de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção, (incluindo as suas porções de ligação ao antigénio) a IL-17 permite que o referido anticorpo seja utilizado como um agente terapêutico para doenças e distúrbios associados a IL-17, i.e., estados, doenças ou distúrbio que beneficiam da inibição de uma actividade biológica de IL-17. 0 epitopo antigénico de IL-17 ao qual os anticorpos da invenção se ligam é um epitopo não linear que 32 ΡΕ1963368 compreende os aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), mais preferencialmente os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de IL-17 humana. Os anticorpos que se ligam ao referido epitopo, ligam-se especificamente e preferencialmente a IL-17 humana e IL-17 de macaco cinomólogo em comparação com a sua ligação a IL-17 de murino ou IL-17 de rato. Os anticorpos monoclonais da invenção ligam-se a IL-17 humana pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100-vezes superior (e.g., afinidade superior ou especificidade superior) do que com a qual se liga a IL-17 de murino ou IL-17 de rato; mais preferencialmente pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ou 600-vezes superior àquela com que se liga a IL-17 de murino ou IL-17 de rato, ainda mais preferencialmente não se liga a IL-17 de murino ou IL-17 de rato a niveis superiores aos niveis de fundo como determinado e.g., através de ensaio de ELISA, ensaio de ELISA de competição ou valores de KD num ensaio de BIACORE ou KINEXA.

Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-IL-17 que possui uma forte afinidade de ligação para IL-17 humana, i.e., liga-se a IL-17 humana, ou uma porção desta compreendendo DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) [i.e., o anticorpo contacta o polipéptido DGNVDYH], com uma afinidade de ligação (KD) para a IL-17 humana inferior a cerca de 7 pM, 6,5 pM ou 6 pM, preferencialmente inferior a cerca de 5,5 pM, 5 pM ou 4,5 pM e mais preferencialmente inferior a cerca de 4 pM. Alternativamente, os anticorpos da invenção são 33 ΡΕ1963368 caracterizados por uma K0 para a IL-17 humana não superior a cerca de 7 pM, 6,5 pM ou 6 pM, preferencialmente não superior a cerca de 5,5 pM, 5 pM ou 4,5 pM e muito preferencialmente não superior a cerca de 4 pM. As afinidades para o anticorpo podem ser determinadas como descrito nos exemplos aqui referidos abaixo ou outros métodos disponíveis na técnica. Preferencialmente, os anticorpos anti-IL-17 da invenção que possuem uma forte afinidade de liqação, como descrito acima também se liqam ao epitopo da IL-17 humana não linear que compreende os aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), mais preferencialmente os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276), em que o anticorpo estabelece o contacto com o polipéptido DGNVDYH (SEQ ID NO: 276).

Numa forma de realização, os anticorpos da invenção possuem uma taxa de eliminação (k0ff) para a IL-17 humana inferior a 5 x 10”5, 4 x 10”5, 3 x IO”5 ou 2 x IO”5 s”1. Numa forma de realização preferida, os anticorpos da invenção caracterizados por possuírem uma forte afinidade de liqação para a IL-17 humana como descrito acima (KD inferior a cerca de 7 pM ou 6 pM, prefe rencialmente inferior a cerca de 5 pM ou 4,5 pM e muito preferencialmente inferior a cerca de 4 pM) também possui uma taxa de eliminação (koff) para a IL-17 humana inferior a 5 x 10”5, 4 x 10”5, 3 x 10”5 ou 2 x 10”5 s”1 e ainda mais preferencialmente também se liga ao epitopo de IL-17 humana não linear que compreende os aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), mais preferencialmente aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) da IL-17 humana. 34 ΡΕ1963368

Noutra forma de realização, os anticorpos da invenção possuem uma IC50 inferior a 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ou 500 pM em e.g., um ensaio de repórter de IL-8 in vitro ou inferior a cerca de 560 pM num ensaio de repórter de GROa (ver Exemplo 6) . Numa forma de realização preferida, os anticorpos da invenção são caracterizados por possuirem uma forte afinidade de ligação para a IL-17 humana como descrito acima (KD inferior a cerca de 7 pM ou 6 pM, preferen- cialmente inferior a cerca de 5 pM ou 4,5 pM e muito preferencialmente inferior a cerca de 4 pM) e também possui uma IC50 inferior a 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ou 500 pM em e.g., num ensaio de repórter de IL-8 in vitro ou inferior a cerca de 560 pM num ensaio de repórter de GROa e ainda mais preferencialmente também possui uma taxa de eliminação (k0ff) para a IL-17 humana inferior a 5 x 10~5, 4 x 10”5, 3 x 10”5 ou 2 x 10~5 s-1 e ainda mais preferencialmente também se liga a um epitopo humano de IL-17 não linear que compreende os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de IL-17 humana em que o anticorpo contacta o polipéptido DGNVDYH (SEQ ID NO: 276). A forma de realização mais preferida da invenção é um anticorpo anti-IL-17 compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 279 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 280. Preferencialmente, este anticorpo compreende duas cadeias leves idênticas e duas cadeias 35 ΡΕ1963368 pesadas idênticas. Preferencialmente, a cadeia leve com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 9 é codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 281 (incluindo sequência sinal) ou SEQ ID NO: 283 (sem a sequência sinal) . Preferencialmente, a cadeia pesada com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 280 é codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 282 (incluindo a sequência sinal) ou SEQ ID NO: 284 (sem a sequência sinal).

Os anticorpos monoclonais ("mAbs") podem ser produzidos utilizando o método dos hibridomas largamente conhecido na técnica (ver e.g., Kohler et al., Nature, 256:495, 1975) ou podem ser produzidos através de métodos de DNA recombinante (e.g., como na Patente U.S. N°. 4 816 567) . Geralmente, um hibridoma pode ser produzidos fundindo uma linha de células imortais adequada (e.g., uma linha de células de mieloma, tal como SP2/0) com células que produzem anticorpo do animal imunizado. As células que produzem o anticorpo, preferencialmente as do baço ou dos nódulos linfáticos, são obtidas a partir de animais imunizados com o antigénio de interesse. As células da fusão (hibridomas) podem ser isoladas utilizando condições de cultura selectivas, e clonadas sem diluição limitante. O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferencialmente, a especificidade de ligação dos mAbs produzidos pelas células de 36 ΡΕ1963368 hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radio-imunoensaio ou ELISA. As células que produzem anticorpos com as propriedades de ligação desejada podem ser seleccionadas por um ensaio adequado. Os métodos para esse isolamento e rastreio são bem conhecidos na técnica.

Podem ser utilizados outros métodos adequados de produção ou isolamento dos anticorpos da invenção, incluindo anticorpos humanos ou artificiais, incluindo, por exemplo, métodos que seleccionam um anticorpo recombinante (e.g., Fv de cadeia simples ou Fab) a partir de uma biblioteca, ou que se baseia na imunização de animais transgénicos (e.g., murganhos) capazes de produzir um reportório de anticorpos humanos (ver e.g., Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et al, Nature, 362:255-258, 1993; Patente U.S. Números 5 545 806 e 5 545 807).

Os anticorpos de cadeia simples, e anticorpos quiméricos, humanizados ou primatizados (enxertados na CDR), assim como anticorpos de cadeia simples quiméricos ou enxertados na CDR, e semelhantes, compreendendo porções derivadas de espécies diferentes, estão também contemplados na presente invenção e o termo "anticorpo". As várias porções destes anticorpos podem ser unidas em conjunto quimicamente através de técnicas convencionais, sinteticamente, ou podem ser preparados como uma proteina contigua utilizando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, 37 ΡΕ1963368 podem ser expressos ácidos nucleicos que codificam uma cadeia quimérica ou humanizada para produzir uma proteína contígua. Ver e.g., Patente U.S. N°. 4 816 567; Patente

Europeia N°. 125 023 Bl; Patente U.S. N°. 4 816 397;

Patente Europeia N°. 120,694 Bl; WO 86/01533; Patente Europeia N°. 194 276 Bl; Patente U.S. N°. 5 225 539;

Patente Europeia N°. 239 400 Bl e Patentes U.S. N°s. 5 585 089 e 5 698 762.

Adicionalmente, os fragmentos funcionais dos anticorpos (i.e., fragmentos de ligação ao antigénio), incluindo fragmentos de anticorpos quiméricos, humanizados, primatizados ou de cadeia simples, também podem ser produzidos e caem dentro do âmbito da invenção. Fragmentos funcionais preferidos retêm uma função de ligação ao antigénio de um anticorpo de comprimento total correspondente. Fragmentos funcionais particularmente preferidos retêm a capacidade para inibir uma ou mais funções ou bioactividades características de uma IL-17 madura de mamífero, preferencialmente IL-17 humana, tal como uma actividade de ligação, uma actividade de sinalização, e/ou estimulação ou inibição de uma resposta celular. Por exemplo, numa forma de realização, um fragmento funcional pode inibir a interacção da IL-17 madura com o seu receptor e/ou pode inibir uma ou mais funções mediadas pelo receptor.

Porções do anticorpo capazes de ligação a IL-17 humana incluem, mas não estão limitadas a, fragmentos Fv, 38 ΡΕ1963368

Fab, Fab' e F(ab')2 e estão contempladas pela invenção. Esses fragmentos podem ser produzidos através de clivagem enzimática ou através de técnicas recombinantes. Por exemplo, a clivagem com papaína ou pepsina de um anticorpo intacto pode criar fragmentos Fab ou F(ab')2, respecti-vamente. A digestão com papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um sítio de ligação ao antigénio simples. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. 0 tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação de antigénio e é ainda capaz de ligação cruzada com o antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação ao antigénio. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio de cadeia leve em associação estreita, não covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigénio. Para ultrapassar a tendência de domínios HCVR e LCVR ligados não covalentemente no Fv para dissociar quando co-expresso numa célula hospedeira, pode ser construído um fragmento Fv de cadeia simples (scFv) no qual um polipéptido flexível e 39 ΡΕ1963368 adequadamente longo liga a terminal C de HCVR ao terminal N de LCVR ou o terminal C de LCVR ao terminal N de HCVR. Um ligante normalmente utilizado é um péptido de 15 resíduos (Gly4Ser)3. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Os anticorpos também podem ser produzidos numa variedade de formas truncadas utilizando genes de anticorpo nos quais um ou mais códões stop foram introduzidos a jusante do sítio de terminação natural. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser concebido de modo a incluir sequências de DNA que codificam o domínio CHi e a região da dobra da cadeia pesada. A selecção de fragmentos de anticorpo das bibliotecas utilizando tecnologias de enriquecimento tais como apresentação de fagos (Matthews DJ e Wells JA. Science. 260:1113-7, 1993), apresentação de ribossomas (Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 95: 14130-5, 1998), apresentação em bactérias (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96: 129-54, 2002) ou apresentação em leveduras (Kieke M.C., et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997) demonstraram ser alternativas bem sucedidas em relação à tecnologia de hibridomas clássica (Revisão: Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000) . ΡΕ1963368 40

Anticorpos variantes

Um anticorpo monoclonal de murino ou um anticorpo humano (produzido e.g., num murganho transgénico) criado contra IL-17 pode ser um anticorpo parental. Um anticorpo parental pode ser, além disso, alterado para criar uma forma quimérica ou humanizada do anticorpo ou outra forma variante do anticorpo utilizando métodos disponíveis na técnica, e.g., mutagénese por PCR. Essas variantes quiméricas, humanizadas, ou de outra forma anticorpos variantes, pode servir como anticorpos parentais para além disso variação ou mutagénese. Os anticorpos parentais da invenção podem ser mutagenizados, e.g., no(s) dominio(s) de CDR (ver, e.g., Tabelas 2 e 3) para criar anticorpos variantes que podem ser rastreados quanto à presença de uma propriedade de interesse, e.g., afinidade de ligação (KD inferior), IC5o, especificidade, ligação preferencial, etc. Preferencialmente, a propriedade de interesse no anticorpo variante é um melhoramento em relação a essa propriedade no anticorpo parental. Um anticorpo variante por substituição de aminoácido é preferido e possui pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos da molécula do anticorpo parental removida e um resíduo diferente inserido no seu lugar. O sítio de maior interesse para mutagénese de substituição é uma ou mais regiões de CDR, mas também estão contempladas alterações de FR. São preferidas substituições conservadoras de aminoácido; embora, para alterações mais substanciais, podem ser introduzidas alterações de aminoácidos não conservadoras e os anticorpos resultantes rastreados para a propriedade de interesse. 41 ΡΕ1963368

Uma forma conveniente para criar variantes de substituição de um anticorpo parental é a maturação de afinidade utilizando apresentação de fagos. Resumidamente, uma molécula de polinucleótido que codifica um anticorpo parental é mutada dentro de uma ou mais regiões de CDR para criar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada resíduo de aminoácido no qual a substituição é desejada. As variantes do anticorpo assim criadas são apresentadas de um modo monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões com o produto do gene III de M13 empacotado em cada partícula. As variantes do anticorpo de apresentação em fagos são então rastreadas quanto à sua actividade biológica (e.g., afinidade de ligação, especificidade, IC50) · De modo a identificar os sítios da região de CDR candidata para modificação, podem ser realizados mutagénios de rastreio de alanina para identificar os resíduos da região de CDR contribuindo significativamente para a ligação ao antigénio.

Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antigénio-anticorpo para identificar os pontos de contacto entre o anticorpo e a IL-17. Esses resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas ou conhecidas na técnica. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser realizada mutagénese aleatória ou mutagénese pontual, em uma ou mais moléculas de polinucleótido que codificam pelo 42 ΡΕ1963368 menos uma CDR. A mutagénese pode ser realizada, em um ou mais posições, quer enquanto a CDR está ligada operacionalmente à região de grelha na região variável ou enquanto a CDR é independente de outra sequência de região variável e depois a CDR alterada regressa à região variável utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Assim que essas variantes do anticorpo são criadas, o painel de variantes está sujeito a rastreio para uma propriedade ou actividade de interesse e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionadas for além desse desenvolvimento.

Qualquer residuo de cisterna não envolvido na manutenção da conformação apropriada de um anticorpo anti-IL-17 da invenção pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir ligação cruzada aberrante. Contrariamente, podem ser adicionadas ligação(ões) de cisterna ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv) .

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alterar entende-se eliminar uma ou mais unidades de carbo-hidrato que se encontra no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo parental. A glicosilação dos anticorpos está tipicamente ligado a N ou ligado a 0. Ligado a N refere-se 43 ΡΕ1963368 à ligação da unidade de carbo-hidrato à cadeia lateral de um residuo de asparagina. As sequências tripeptídicas de asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade de carbo-hidrato à cadeia lateral de asparaginas. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptidicas num polipéptido cria um sitio de glicosilação potencial. Glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares de N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais normalmente serina ou treonina, embora também pode ser utilizada 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição dos sitios de glicosilação ao anticorpo é realizada convenientemente através da alteração da sequência de aminoácidos de modo a que contenha uma ou mais das sequências tripeptidicas acima descritas (para sitios de glicosilação ligados a N) . A alteração também pode ser realizada através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a 0) .

Sequência

Um anticorpo monoclonal da invenção preferido compreende uma LCVR compreendendo um péptido com uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 178-243 e/ou uma HCVR compreendendo um péptido 44 ΡΕ1963368 com uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56-121. Numa forma de realização preferida, um anticorpo da invenção compreende uma LCVR compreendendo um péptido com uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 178-243 e compreende ainda uma HCVR compreendendo um péptido com uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 56-121, em que a HCVR e LCVR presentes num anticorpo da invenção existe em conjunto num Fab listado na Tabela 1. Por exemplo, um anticorpo da invenção compreendendo um polipéptido e LCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 178, preferencialmente compreende ainda um polipéptido de HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 56, 60, 68-93 e 95. Para além disso, um anticorpo da invenção compreendendo um polipéptido e LCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 241, preferencialmente compreende ainda um polipéptido de HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 118 e 106. Um especialista na técnica irá entender que os anticorpos da invenção não estão limitados às sequências especificas de HCVR e LCVR como aqui listado na Tabela 1, mas também incluem variantes destas sequências que, quando presentes num anticorpo anti-IL-17 da invenção, retêm ou melhoram a capacidade de ligação ao antigénio e pelo menos uma outra propriedade funcional do anticorpo parental, e.g., especificidade do epitopo, capacidade para competir com o anticorpo parental para ligação a IL-17, valores de IC50 e/ou KD ou k0ff para a ligação a IL-17 humana. 45 ΡΕ1963368

Para além disso, um anticorpo monoclonal da invenção é aquele que é inibido de forma competitiva da ligação a IL-17 humana (ou uma sua porção compreendendo DGNVDYH) (SEQ ID NO: 276), por um anticorpo monoclonal de competição em que o anticorpo monoclonal de competição compreende dois polipéptidos com as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOs: 241 (LCVR) e 118 (HCVR). Essa inibição de competição entre os anticorpos pode ser medida através dos ensaios na técnica, e.g., um ensaio de ELISA de competição.

Preferencialmente, um anticorpo da invenção que compete com o anticorpo de competição definido acima é, além disso, caracterizada por se ligar especificamente a IL-17 humana mas não se ligando a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ou IL-17F humanas. Adicionalmente, o anticorpo é, além disso, caracterizado por se ligar especificamente a IL-17 humana e IL-17 de macaco cinomólogo mas não se ligar a IL-17 de rato ou IL-17 de murganho a niveis superiores ao fundo.

Mais preferencialmente, um anticorpo da invenção que compete para a ligação a IL-17 humana com um anticorpo de competição compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 241 e 118 é, além disso, caracterizado por se ligar a um epitopo de IL-17 humana não linear compreendendo os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276). Ainda mais preferencialmente, um anticorpo da 46 ΡΕ1963368 invenção que compete para a ligação a IL-17 humana com um anticorpo de competição que compreende as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 241 e 118 é, além disso, caracterizado por possuir uma KD para a IL-17 humana inferior a cerca de 7 pM, 6,5 pM ou 6 pM, preferencialmente inferior a cerca de 5,5 pM, 5 pM ou 4,5 pM e muito preferencialmente inferior a cerca de 4 pM e/ou é caracterizado por uma IC50, preferencialmente num ensaio de repórter de IL-8 in vitro, isto é, inferior a 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ou 500 pM, ou por uma IC50 num ensaio de repórter in vitro de GROa inferior a cerca de 560 pM, e/ou possui uma taxa de eliminação (koff) para a IL-17 humana inferior a 5 x 10“5, 4 x 10~5, 3 x 10“5 ou 2 x 10-5 s"1.

Numa forma de realização, um anticorpo anti-IL-17 da invenção possui uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende regiões CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: CDRH1 (SEQ ID NO: 244), CDRH2 (SEQ ID NO: 245), e CDRH3 (SEQ ID NO: 246); e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende as regiões de CDR com as seguintes sequências de aminoácidos: CDRL1 (SEQ ID NO: 247), CDRL2 (SEQ ID NO: 248) e CDRL3 (SEQ ID NO: 249). Preferencialmente, as seis CDRs de um anticorpo da invenção existe em conjunto como num Fab aqui listado na Tabela 1. Ainda mais preferencialmente, as CDRS de cadeia pesada estão no contexto das seguintes sequências de grelha: FR1 com SEQ ID NO: 262, FR2 com SEQ ID NO: 263, 47 ΡΕ1963368 FR3 com SEQ ID NO: 2 64 e FR4 com SEQ ID NO: 2 65 e as CDRs de cadeia leve estão no contexto das seguintes sequências de grelha: FR1 com SEQ ID NO: 266, FR2 com SEQ ID NO: 267, FR3 com SEQ ID NO: 2 68 e FR4 com SEQ ID NO: 2 69, em que a ordem do terminal amino é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Está, além disso, contemplado que um anticorpo anti-IL-17 da invenção compreende uma HCVR compreendendo uma CDRH1 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 11-28, e/ou uma CDRH2 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29-32, e/ou uma CDRH3 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33-55 e 261. Noutra forma de realização, um anticorpo anti-IL-17 da invenção compreende uma LCVR compreendendo uma CDRL1 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 122-149, e/ou uma CDRL2 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150-167, e/ou uma CDRL3 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 168-177. Numa forma de realização preferida, um anticorpo anti-IL-17 da invenção compreende uma HCVR compreendendo uma CDRH1 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 11-28, e/ou uma CDRH2 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29-32, e/ou uma CDRH3 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 48 ΡΕ1963368 33-55 e 261, e compreende ainda uma LCVR compreendendo uma CDRL1 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 122-149, e/ou uma CDRL2 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150-167, e/ou uma CDRL3 compreendendo uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 168-177. A composição compreendendo uma CDR da invenção será geralmente uma sequência de cadeia pesada ou leve do anticorpo ou uma sua porção substancial, na qual a CDR está localizada numa localização consistente com a numeração de Kabat. As três regiões de CDR para cada cadeia, pesada e leve, são fornecidas numa região em grelha como uma sequência contígua representada pela seguinte fórmula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. A FR1, FR2, FR3 e FR4 de cadeia pesada ou cadeia leve combinam-se para formar a região de grelha completa de um anticorpo quando disposta como uma sequência contígua com as CDRs na ordem referida. Preferencialmente, as regiões de grelha de um anticorpo da invenção são de origem humana ou de origem substancialmente humana (i.e., superior a cerca de 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97%) .

Num anticorpo humanizado para utilização terapêutica em humanos, a sequência de grelha é preferencialmente inteiramente ou substancialmente de origem humana. Preferencialmente, a região de grelha da cadeia leve de um anticorpo humanizado, humano ou quimérico da 49 ΡΕ1963368 invenção compreende FR1 com SEQ ID NO: 266, FR2 com SEQ ID NO: 267, FR3 com SEQ ID NO: 268 e FR4 com SEQ ID NO: 269. Preferencialmente, a região de grelha de cadeia pesada de um anticorpo humanizado, humano ou quimérico da invenção compreende FR1 com SEQ ID NO: 262, FR2 com SEQ ID NO: 263, FR3 com SEQ ID NO: 264, e FR4 com SEQ ID NO: 265. Por exemplo, uma forma de realização preferida de LCVR do anticorpo 126 da invenção, como descrito nas Tabelas 1, 2 e 3 aqui compreende (polipéptidos em ordem a partir do terminal N) FR1 com SEQ ID NO: 266, CDR1 com SEQ ID NO: 131, FR2 com SEQ ID NO: 267, CDR2 com SEQ ID NO: 167, FR3 com SEQ ID NO: 2 68, CDR3 com SEQ ID NO: 168 e FR4 com SEQ ID NO: 269. A sequência inteira de LCVR, ligada operacionalmente a uma região constante de kapa humana é como apresentada na SEQ ID NO: 274. Além disso, uma forma de realização preferida de HCVR do anticorpo 126 da invenção compreende (em ordem a partir do terminal N) FR1 com SEQ ID NO: 262, CDR1 com SEQ ID NO: 26, FR2 com SEQ ID NO: 262, CDR2 com SEQ ID NO: 30, FR3 com SEQ ID NO: 264, CDR3 com SEQ ID NO: 52 e FR4 com SEQ ID NO: 265. A sequência inteira de HCVR, ligada operacionalmente a uma região de Fc IgG4 humana é como apresentada na SEQ ID NO: 273.

Numa forma de realização, um anticorpo anti-IL-17 da invenção, em que a totalidade ou uma porção da região variável está limitada por uma sequência particular como aqui apresentada por uma SEQ ID NO (ver, e.g., Tabelas 1-3) é além disso caracterizada por ser um anticorpo quimérico, humanizado, ou totalmente humano ou sua porção de ligação 50 ΡΕ1963368 ao antigénio que antagoniza ou neutraliza pelo menos uma actividade de IL-17 humana in vivo ou in vitro. Um anticorpo de IL-17 da invenção, em que a totalidade ou uma porção da região variável está limitada por uma sequência particular como aqui apresentado por uma SEQ ID NO é além disso caracterizado por se ligar especificamente a IL-17 humana mas não se ligar a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ou IL-17F humana. Adicionalmente, o anticorpo é, além disso, caracterizado por se ligar especificamente a IL-17 humana e IL-17 de macaco cinomólogo mas não se ligar a IL-17 de rato ou a IL-17 de murganho a niveis superiores ao ruido.

Mais preferencialmente, esse anticorpo é, além disso, caracterizado por se ligar a um epitopo de IL-17 humana não linear compreendendo os aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 27 6) em que o anticorpo estabelece contacto com o polipéptido com SEQ ID NO: 276. Ainda mais preferencialmente, esse anticorpo é além disso caracterizado por possuir uma KD para a IL-17 humana inferior a cerca de 7 pM, 6,5 pM ou 6 pM, preferencialmente inferior a cerca de 5,5 pM, 5 pM ou 4,5 pM e muito preferencialmente inferior a cerca de 4 pM e/ou é caracterizado por uma IC50, preferencialmente num ensaio de repórter de IL-8 in vitro, isto é, inferior a 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ou 500 pM, ou uma IC50 num ensaio de repórter in vitro de GROa inferior a cerca de 560 pM, e/ou possui uma taxa de eliminação (k0ff) para IL-17 humana inferior a 5 x 10“5, 4 x 10"5, 3 x 10"5 ou 2 x 10"5 s"1. 51 ΡΕ1963368

Expressão de Anticorpo A presente invenção é também dirigida a linhas celulares que expressam um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção ou uma porção deste. A criação e o isolamento de linhas celulares que produzem um anticorpo monoclonal da invenção podem ser conseguidas utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica. Linhas celulares preferidas incluem COS, CHO, SP2/0, NSO e de levedura (disponíveis em repositórios públicos, tais como ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA).

Pode ser utilizada uma vasta variedade de sistemas de expressão hospedeiros para expressar um anticorpo da presente invenção incluindo sistemas de expressão procarió-ticos e eucarióticos (tais como leveduras, baculovirus, plantas, mamiferos e outras células animais, animais transgénicos, e células de hibridoma), assim como sistemas de expressão de apresentação de fagos. Um exemplo de um vector de expressão bacteriana adequado é o pUC 19 e um vector de expressão eucariótico adequado é um vector pcDNA3.1 modificado com um sistema de selecção de dhfr enfraquecido. Outros sistemas de expressão de anticorpo são também conhecidos na técnica e estão aqui contemplados.

Um anticorpo da invenção pode ser preparado através da expressão recombinante de genes da cadeia pesada e leve da imunoglobulina numa célula hospedeira. Para expressar um anticorpo de forma recombinante, uma célula 52 ΡΕ1963368 hospedeira é transformada, transduzida, infectada ou afim com um ou mais vectores de expressão recombinante contendo fragmentos de DNA que codificam as cadeias leves e/ou pesadas da imunoglobulina do anticorpo de modo a que as cadeias leves e/ou pesadas sejam expressas na célula hospedeira. A cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas independentemente a partir de diferentes promotores aos quais estão ligados operacionalmente num vector ou, alternativamente, a cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas independentemente a partir de diferentes promotores aos quais estão ligados operacionalmente em dois vectores - um expressando a cadeia pesada e um expressando a cadeia leve. Opcionalmente, a cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressos em diferentes células hospedeiras. Preferencialmente, os anticorpos recombinantes são secretados para o meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir do qual os anticorpos podem ser recuperados ou purificados. As metodologias de DNA recombinante convencionais são utilizadas para obter genes da cadeia pesada e leve do anticorpo, incorporar estes genes nos vectores de expressão recombinantes, e introduzir os vectores nas células hospedeiras. Essas tecnologias de DNA recombinante convencionais são descritas, por exemplo, em Sambrook, Fritsch, e Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, et al (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. 53 ΡΕ1963368

Um DNA isolado que codifica uma região HCVR pode ser convertido num gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica HCVR a outra molécula de DNA que codifica a regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2, e CH3). As sequências dos genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica. Ver, e.g., Kabat, et al, Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of

Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991). Os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos e.g., através de amplificação convencional por PCR. A região constante de cadeia pesada pode ser de qualquer tipo, (e.g., IgG, IgA, IgE, IgM ou IgD) , classe (e.g., IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4) ou subclasse de região constante e qualquer sua variante alotipica como descrito em Kabat (supra). Alternativamente, a porção de ligação ao antigénio pode ser um fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, Fd, ou um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica HCVR pode estar ligado operacionalmente a outra molécula de DNA que codifica apenas uma região constante de CHi de cadeia pesada.

Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido num gene de cadeia leve de comprimento total (assim como num gene de cadeia leve de Fab) através da ligação operacional do DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante da cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante 54 ΡΕ1963368 humana da cadeia leve são conhecidas na técnica. Ver, e.g., Kabat, supra. Os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidas através de amplificação de PCR convencional. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA que codificam HCVR e LCVR estão ligados operacionalmente a outro fragmento que codifica um ligante flexível, e.g., codificando a sequência de aminoácidos (Gly4~Ser)3, de modo a que as sequências de HCVR e LCVR possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões LCVR e HCVR unidas pelo ligante flexível. Ver, e.g., Bird, et al, Science 242:423-6, 1988; Huston, et al, Proc Natl. Acad. Sei USA 85:5879-83, 1988; McCafferty, et al, Nature 348:552-4, 1990.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um vector, preferencialmente (mas não limitado a) um plasmídeo, um vector de expressão recombinante, um vector de expressão em levedura, ou um vector de expressão retroviral compreendendo um polinucleótido que codifica um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção. Alternativamente, um vector da invenção compreende a polinucleótido que codifica um LCVR e/ou um polinucleótido que codifica uma HCVR da invenção. Quando ambas as sequências que codificam uma LCVR e uma HCVR estão presentes no mesmo vector, elas podem ser transcritas independentemente, cada uma de um promotor separado ao qual está ligado operacio- 55 ΡΕ1963368 nalmente. Se as sequências que codificam a LCVR e a HCVR estão presentes no mesmo vector e são transcritos a partir de um promotor ao qual estão ambas ligadas operacionalmente, a LCVR pode estar 5' em relação a HCVR ou a LCVR pode estar em 3' em relação a HCVR, para além disso, a região que codifica LCVR e HCVR no vector pode ser separada por uma sequência ligante de qualquer tamanho ou conteúdo, preferencialmente esse ligante, quando presente, é um poli-nucleótido que codifica um sítio de entrada do ribossoma interno.

Para expressar um anticorpo da invenção, um DNA que codifica uma cadeia leve e/ou pesada parcial ou de comprimento total, obtido como descrito acima, é inserido num vector de expressão de modo a que o gene está ligado operacionalmente a sequências de controlo de transcrição e tradução. 0 vector de expressão e as sequências de controlo de expressão são seleccionados para serem compatíveis com a célula de expressão hospedeira utilizada. 0 gene do anticorpo de cadeia leve e o gene do anticorpo de cadeia pesada pode ser inserido em vectores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vector de expressão através de métodos convencionais. Adicionalmente, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilita a secreção da cadeia leve ou pesada do anticorpo monoclonal anti-IL-17 de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo monoclonal anti-IL-17 pode ser clonado no vector de modo a 56 ΡΕ1963368 que o péptido sinal é ligado operacionalmente em grelha ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo.

Adicionalmente ao(s) gene(s) da cadeia pesada e leve do anticorpo, um vector de expressão recombinante da invenção comporta sequências de regulação que controla a expressão do(s) gene(s) da cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência de regulação" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controlo de expressão (e.g., sinais de poliadenilação), como necessário, que controlam a transcrição ou tradução do gene(s) da cadeia do anticorpo. A concepção do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências de regulação pode depender de factores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteina desejada. As sequências de regulação preferidas para células hospedeiras de expressão de mamiferos incluem elementos virais que dirigem niveis elevados de expressão de proteina em células de mamiferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus Simio 40 (SV40), adenovirus, (e.g., o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e virus polioma.

Adicionalmente aos genes da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo e sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinantes da invenção podem conter adicionalmente sequências, tais como as sequências que regulam a 57 ΡΕ1963368 replicação do vector em células hospedeiras (e.g., origens de replicação) e um ou mais genes marcadores de selecção. 0 gene marcador de selecção facilita a selecção de células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador de selecção confere resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina, ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Genes marcadores de selecção preferidos incluem o gene da redutase de di-hidrofolato (dhfr) (para utilização em células hospedeiras dhfr-menos com selec-ção/amplificação em metotrexato), o gene neo (para selecção de G418), e sintetase de glutamina (GS) numa linha celular GS-negativa (tal como NSO) para selecção/amplificação.

Para expressão das cadeias leves e/ou pesadas, o(s) vector(es) de expressão que codificam as cadeias pesada e/ou leves é/são introduzidos numa célula hospedeira através de técnicas convencionais e.g., electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção em DEAE-dextrano, transdução, infecção e semelhantes. Embora seja teoricamente possivel expressar os anticorpos da invenção em qualquer uma das células procarióticas ou eucarióticas, são preferidas células eucarióticas, e muito preferencialmente células hospedeiras de mamíferos, porque essas células têm maior probabilidade de montar e secretar um anticorpo imunologicamente activo e montado de forma adequada. Células hospedeiras de mamiferos preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) 58 ΡΕ1963368 [incluindo células CHO dhfr menos, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-20, 1980, utilizadas com um marcador seleccionável de DHFR, e.g., como descrito em Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982] células de mieloma NSO, células COS, e células SP2/0. Quando os vectores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas em condições apropriadas conhecidas na técnica. Os anticorpos podem ser recuperados a partir da célula hospedeira e/ou do meio de cultura utilizando métodos de purificação convencionais.

Também podem ser utilizadas células hospedeiras para produzir porções, ou fragmentos, de anticorpos intactos, e.g., fragmentos Fab ou moléculas de scFv através de técnicas que são convencionais. Será entendido por um técnico especialista que variações no processo acima descrito estão dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. A tecnologia do DNA recombinante também pode ser utilizada para remover algum ou todo o DNA que codifica qualquer uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não é necessariamente para ligação a IL- 59 ΡΕ1963368 17. As moléculas expressas a partir dessas moléculas de DNA truncado estão também compreendidas pelos anticorpos da invenção. A invenção proporciona uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, a célula hospedeira da invenção compreende um ou mais vectores ou construções compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. A célula hospedeira da invenção é uma célula na qual foi introduzido um vector da invenção, compreendendo o referido vector um polinucleótido que codifica uma LCVR de um anticorpo da invenção e/ou um polinucleótido que codifica uma HCVR da invenção. A invenção também proporciona uma célula hospedeira na qual foram introduzidos dois vectores da invenção; um compreendendo um polinucleótido que codifica uma LCVR de um anticorpo da invenção e um compreendendo um polinucleótido que codifica uma HCVR presente num anticorpo da invenção e cada um ligado operacionalmente a uma sequência de promotor. Os tipos de célula hospedeira incluem células de mamífero, bactérias, plantas e leveduras. Preferencialmente a célula hospedeira é uma célula CHO, uma célula COS, uma célula SP2/0, uma célula NSO, uma célula de levedura ou um derivado ou descendência de qualquer tipo de célula preferida.

Num sistema preferido para a expressão recombi-nante de um anticorpo da invenção, um vector de expressão recombinante que codifica ambas a cadeia pesada do anti- 60 ΡΕ1963368 corpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO dhfr-menos através de e.g., transfecção mediada por fosfato de cálcio. No vector de expressão recombinante, os genes da cadeia pesada e leve do anticorpo são cada um ligado operacionalmente a elementos de regulação de inten-sificador/promotor (e.g., derivados de SV40, CMV, adeno-vírus e semelhantes, tais como um elemento de regulação intensificador CMV/promotor de AdMLP ou um elemento de regulação intensificador de SV40/promotor de AdMLP) para conduzir a niveis elevados de transcrição dos genes. O vector de expressão recombinante também contém um gene dhfr, que permite a selecção de células CHO que foram transfectadas com o vector utilizando selecção com meto-trexato/amplificação. As células hospedeiras transformantes seleccionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. São utilizadas técnicas de biologia molecular convencionais para preparar o vector de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, seleccionar os transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Os anticorpos, ou suas porções de ligação ao antigénio, da invenção podem ser expressos num animal (e.g., um murganho) que seja transgénico para genes de imunoglobulina humana (ver, e.g., Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992).

Uma vez expressos, os anticorpos intactos, seus dímeros, cadeias leves e pesadas individuais, ou outras 61 ΡΕ1963368 formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificadas de acordo com processos convencionais na técnica, incluindo precipitação com sulfato de amónio, cromatografia em coluna de permuta iónica, de afinidade, de fase reversa, de interacção hidrofóbica, electroforese em gel e semelhantes. São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90%, 92%, 94% ou 96% homogeneidade, e mais preferidas as de 98 até 99% ou mais de homogeneidade, para utilizações farmacêuticas. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade como desejado, os péptidos podem ser então utilizados terapeutica-mente ou profilacticamente, como aqui descrito.

Anticorpo Quimérico

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo quimérico" inclui imunoglobulinas monovalentes, divalentes ou polivalentes. Um anticorpo quimérico monovalente é um dimero formado por uma cadeia pesada quimérica associada através de ligações persulfureto com uma cadeia leve quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é um tetrâmero formado por dois dimeros de cadeia pesada-cadeia leve associados através de pelo menos uma ligação persulfureto.

Uma cadeia pesada quimérica de um anticorpo compreende uma região de ligação ao antigénio derivada da cadeia pesada de um anticorpo não humano especifico para IL-17, que está ligado operacionalmente a pelo menos uma porção de uma região constante de cadeia pesada humana, ou 62 ΡΕ1963368 substancialmente humana (ou espécie diferente daquela a partir da qual a região de ligação ao antigénio foi derivada), tal como CHI ou CH2, ou preferencialmente a uma região constante de cadeia pesada de comprimento total. Uma cadeia leve quimérica de um anticorpo para utilização em humanos compreende uma região de ligação ao antigénio derivada inteiramente ou substancialmente da cadeia leve de um anticorpo não humano específico para IL-17, ligado operacionalmente a pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia leve (CL) humana, ou substancialmente humana (ou espécie diferente daquela a partir da qual a região de ligação ao antigénio foi derivada), ou preferencialmente a uma região constante de cadeia leve de comprimento total. Anticorpos, fragmentos ou derivados possuindo cadeias pesadas e cadeias leves quiméricas da mesma ou de diferente especificidade de ligação a região variável, também pode ser preparada através da associação apropriada das cadeias de polipéptido individual, de acordo com passos conhecidos do método.

Com esta abordagem, os hospedeiros que expressam cadeias pesadas quiméricas são cultivados separadamente a partir dos hospedeiros que expressam cadeias leves quiméricas, e as cadeias de imunoglobulina são recuperadas separadamente e depois associadas. Alternativamente, os hospedeiros podem ser co-cultivados e as cadeias deixadas associar-se espontaneamente no meio de cultura, seguido pela recuperação da imunoglobulina montada ou fragmento. São conhecidos na técnica métodos para produzir anticorpos 63 ΡΕ1963368 quiméricos (ver, e.g., Patente U.S. Nos.: 6 284 471; 5 807 715; 4 816 567; e 4 816 397).

Anticorpos Humanizados

Preferencialmente, um anticorpo da invenção a ser utilizado para objectivos terapêuticos, teriam a sequência da região de grelha e constante (até ao ponto de existir no anticorpo) derivado do mamífero no qual deve ser utilizado como um agente terapêutico de modo a diminuir a possibilidade de o mamífero induzir uma resposta imunitária contra o anticorpo terapêutico. Os anticorpos humanizados são de particular interesse uma vez que são considerados como sendo valiosos para aplicação terapêutica e evitar a resposta de anticorpo anti-murganho humano frequentemente observada com anticorpos de roedores. Adicionalmente, em anticorpos humanizados, a porção efectora do anticorpo é de origem humana de modo a que possa interagir melhor com as outras partes do sistema imunitário humano (e.g., destruir as células alvo mais eficientemente através de citoto-xicidade dependente do complemento ou citotoxicidade celular dependente do anticorpo). Também, os anticorpos humanizados injectados podem possuir uma semi-vida mais parecida com aquela dos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente do que e.g., anticorpos de murino, permitindo desse modo que sejam administradas doses mais pequenas e menos frequentes. O termo "anticorpo humanizado", como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo compreendendo porções de anticorpos de origem diferente, em que pelo menos uma 64 ΡΕ1963368 porção é de origem humana. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender porções derivadas de um anticorpo de origem não humana com a especificidade requerida, tal como um murganho, e de um anticorpo de origem humana, unidas em conjunto quimicamente através de técnicas convencionais (e.g., sintéticas) ou preparado como um polipéptido contiguo utilizando técnicas de engenharia genética.

Preferencialmente, um "anticorpo humanizado" possui CDRs que têm origem (ou têm substancialmente origem) a partir de um anticorpo não humano (preferencialmente um anticorpo monoclonal de murganho) enquanto a região da grelha e constante, até ao ponto de estar presente, (ou uma sua porção significativa ou substancial, i.e., pelo menos cerca de 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) são codificados pela informação da sequência de ácido nucleico que ocorre na região da imunoglobulina da linha germinal humana (ver, e.g., the International ImMunoGeneTics Database) ou nas suas formas recombinadas ou mutadas quer os referidos anticorpos sejam produzidos numa célula humana ou não.

As CDRs de um anticorpo humanizado podem ser alteradas ou optimizadas a partir das CDRs de um anticorpo parental não humano a partir do qual tiveram origem para criar as propriedades desejadas, e.g., especificidade, afinidade e/ou ligação preferencial. As CDRs alteradas ou optimizadas podem possuir substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos quando comparadas com as CDRs 65 ΡΕ1963368 parentais, preferencialmente cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 total nos seis domínios de CDR. Por exemplo, as posições de aminoácidos das CDRs que estão sublinhadas e em impressão a negrito nas Tabelas 2 e 3 são posições que foram alteradas a partir das CDRs como apresentado na Fab 1 das Tabelas 2 e 3. Alternativamente, o anticorpo de murino 2321 pode ser um anticorpo parental para a comparação das CDRs de um anticorpo da invenção.

Formas humanizadas de anticorpos não humanos (e.g., murino) incluem um anticorpo intacto, um anticorpo substancialmente intacto, uma porção de um anticorpo compreendendo um sítio de ligação ao antigénio, ou uma porção de um anticorpo compreendendo um fragmento Fab, fragmento Fab', F(ab')2, ou um fragmento Fv de cadeia simples. Anticorpos humanizados contêm preferencialmente uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recipiente nem nas sequências de CDR ou de grelha importadas. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os aminoácidos nas regiões de CDR correspondem aqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os aminoácidos nas regiões FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana de consenso. O anticorpo humanizado também compreende optimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela 66 ΡΕ1963368 de uma imunoglobulina humana. [Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596, 1992].

Os anticorpos humanizados podem ser sujeitos a mutagénese in vitro utilizando métodos de utilização de rotina na técnica (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e, desse modo, as sequências de aminoácido da região de grelha das regiões HCVR e LCVR dos anticorpos humanizados recombinantes são sequências que, embora derivados daqueles relacionados com sequências de HCVR e LCVR da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no reportório da linha germinal de anticorpo humano in vivo. Está contemplado que essas sequências de aminoácidos das regiões de grelha de HCVR e LCVR dos anticorpos humanizados recombinantes são pelo menos 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ou mais preferencialmente pelo menos 99% idênticos a uma sequência de linha germinal humana. Preferencialmente, os resíduos de grelha do anticorpo parental (e.g., anticorpo de murino ou de um modo geral o anticorpo a partir do qual o anticorpo humanizado é derivado) que mantém ou afecta estruturas do sitio de combinação serão retidos. Estes residuos podem ser identificados e.g., através de cristalografia de raios X do anticorpo parental ou fragmento Fab, identificando desse modo a estrutura tridimensional do sitio de ligação ao antigénio. Uma estratégia para humanizar os anticorpos é escolher uma sequência de linha germinal humana com a maior 67 ΡΕ1963368 homologia com a grelha do anticorpo parental gue a grelha para receber as CDRs dadoras. Esta abordagem de linha germinal é baseada na mesma lógica que a estratégia de melhor ajuste, mas apenas as sequências da linha germinal são pesquisadas nas bases de dados. 0 anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender ou ser derivada de uma grelha de cadeia leve da linha germinal humana. Em formas de realização particulares a sequência da linha germinal da cadeia leve é seleccionada a partir de sequências VK humanas, incluindo, mas não limitadas a, Al, AIO, AI 1, A14, A17, Al 8, A19, A2, A2 0 A2 3, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, Ll, LIO, Lll, L12 L14, L15, LI 6, L18, LI 9, L2, L20, L22, L23, L24, L25 L4 /18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014, 018, 02, 04, e 08. Em certas formas de realização, esta grelha da linha germinal de cadeia leve humana é seleccionada a partir de Vl-11, Vl-13, Vl-16, Vl-17, Vl-18, Vl-19, Vl-2, Vl-20, VI-22, Vl-3, Vl-4, Vl-5, Vl-7, Vl-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, e V5-6.

Noutras formas de realização, o anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender ou ser derivada de uma grelha de cadeia pesada de linha germinal humana. Em formas de realização particulares, esta grelha da linha germinal da cadeia pesada humana é seleccionada a partir de VH1-18, VH1-2, VHl-24, VH1-3, VHl-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3- 68 ΡΕ1963368 13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, e VH7-81. Ver a PCT WO 2005/005604 para uma descrição das sequências de linha germinal diferentes.

Em formas de realização particulares, a região variável da cadeia leve e/ou região variável de cadeia pesada compreendem uma região de grelha ou pelo menos uma porção de uma região de grelha (e.g., contendo 2 ou 3 sub-regiões, tais como FR2 e FR3). Em certas formas de realização, pelo menos FRL1, FRL2, FRL3, ou FRL4 é totalmente humana. Noutras formas de realização, pelo menos FRHl, FRH2, FRH3, ou FRH4 é totalmente humana. Em algumas formas de realização, pelo menos FRL1, FRL2, FRL3, ou FRL4 é uma sequência da linha germinal (e.g., linha germinal humana) ou compreende sequências de consenso humanas para a grelha particular. Noutras formas de realização, pelo menos FRHl, FRH2, FRH3, ou FRH4 é uma sequência de linha germinal (e.g., linha germinal humana) ou compreende sequências de consenso humanas para a grelha particular. Em formas de realização preferidas, toda a região de grelha é uma região de grelha humana.

Em geral, os anticorpos humanizados podem ser produzidos através da obtenção de sequências de ácido nucleico que codificam a HCVR e LCVR de um anticorpo, e.g., um anticorpo de murino ou o anticorpo produzido por um 69 ΡΕ1963368 hibridoma, que se liga ao epitopo de IL-17 da invenção, identificando as CDRs na referida HCVR e LCVR (não humana), e enxertando essa sequência de ácido nucleico que codifica CDR para uma sequências de ácido nucleico que codifica a grelha humana. Opcionalmente, uma região CDR pode ser optimizada através de mutagenização aleatória ou em particular localizações de modo a substituir um ou mais aminoácidos na CDR com um aminoácido diferente antes de enxertar a região CDR para a região de grelha. Alternativamente, pode ser obtida uma região CDR subsequente à inserção na região de grelha humana utilizando métodos disponiveis para um especialista na técnica. Preferencialmente, as sequências de aminoácido de grelha humana são seleccionadas de modo a que o anticorpo resultante seja provavelmente adequado para administração in vivo em humanos. Isto pode ser determinado, e.g., com base na utilização prévia de anticorpos contendo essa sequência de grelha humana. Preferencialmente, A sequência de grelha humana não irá ela própria ser significativamente imunogénica.

Alternativamente, as sequências de aminoácidos das grelhas para o anticorpo a ser humanizado podem ser comparadas com as das sequências de grelha humanas conhecidas, as sequências de grelha humanas a serem utilizadas para enxertia em CDR e seleccionadas com base nas suas sequências compreendendo elevada semelhança com as do anticorpo parental, e.g., um anticorpo de murino que se liga a IL-17 (e.g., um anticorpo compreendendo uma HCVR com 70 ΡΕ1963368 SEQ ID NO: 270 e além disso compreendendo uma LCVR com SEQ ID NO: 271). Foram isoladas numerosas sequências de grelha humanas e as suas sequências são relatadas na técnica. Isto aumenta a probabilidade de o anticorpo humanizado enxertado na CDR resultante, que contém CDRs do progenitor (e.g., murino) ou CDRs optimizadas do anticorpo parental enxertado em grelhas humanas seleccionadas (e possivelmente também a região constante humana) irá reter substancialmente a estrutura de ligação ao antigénio e desse modo reter a afinidade de ligação o anticorpo parental. Para reter num grau significativo da afinidade de ligação ao antigénio, as regiões de grelha humanas seleccionadas serão preferencialmente aquelas que se espera que sejam adequadas para administração in vivo, i.e., não imunogénica.

Em qualquer dos métodos, são obtidas as sequências de DNA que codificam as regiões de HCVR e LCVR do anticorpo anti-IL-17 preferencialmente de murino. São conhecidos na técnica métodos para clonar sequências de ácido nucleico que codificam imunoglobulinas. Esses métodos podem, por exemplo, envolver a amplificação das sequências que codificam a imunoglobulina a serem clonadas utilizando iniciadores apropriados, através da reacção em cadeia pela polimerase (PCR). Foram relatados na literatura iniciadores adequados para amplificar sequências de ácido nucleico de imunoglobulina, e especificamente sequências de HCVR e de LCVR de murino. Após essas sequências que codificam a imunoglobulina terem sido clonadas, elas serão sequenciadas através de métodos bem conhecidos na técnica. 71 ΡΕ1963368

Após as sequências que codificam a CDR serem enxertadas nas sequências que codificam a qrelha humana seleccionada, as sequências de DNA resultantes que codificam as sequências variável pesada e variável leve "humanizadas" são então expressas para produzir um anticorpo humanizado ou Fv humanizado que se liga a IL-17. As HCVR e LCVR humanizadas podem ser expressas como parte de uma molécula de anticorpo anti-IL-17 total, i.e., como uma proteina de fusão com sequências de dominio humano constante cujas sequências de DNA codificantes foram obtidas a partir de uma biblioteca comercialmente disponível ou que foram obtidas utilizando, e.g., um dos métodos descritos acima para obter sequências de DNA, ou estão na técnica. Contudo, as sequências de HCVR e LCVR podem também ser expressas na ausência de sequências constantes para produzir um Fv anti-IL-17 humanizado. Contudo, a fusão de sequências constantes humanas com a região variável é potencialmente desejável porque o anticorpo humanizado anti-IL-17 resultante pode possuir funções de efector humano. Métodos para sintetizar DNA que codifica uma proteina de sequência conhecida são bem conhecidos na técnica. Utilizando esses métodos, as sequências de DNA que codificam as sequências de HCVR e LCVR humanizadas do sujeito (com ou sem regiões constantes) são sintetizadas, e depois expressadas num sistema de vector adequado para expressão de anticorpos recombinantes. Isto pode ser 72 ΡΕ1963368 efectuado em qualquer sistema de vector que proporciona as sequências humanizados de HCVR e LCVR do sujeito a serem expressas como uma proteina de fusão com sequências de dominio constante humano e para associar para produzir anticorpos funcionais (ligação ao antigénio) ou fragmentos de anticorpo. São conhecidas na técnica sequências do dominio constante humano, e foram relatadas na literatura. Sequências de cadeia leve humana constante preferidas incluem as sequências de cadeia leve constante kapa e lambda. Sequências de cadeia pesada constante humana preferidas incluem IgGi humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana (ver, e.g., Seq ID NOs: 257-260 respectivamente) e versões mutadas destas que proporcionam função efectora alterada, e.g., aumento da semi-vida in vivo, ligação ao receptor de Fc reduzida, perfil de desamidação alterado e semelhantes.

Se estiverem presentes, as regiões de grelha humanas são preferencialmente derivadas a partir de uma região variável do anticorpo humano possuindo uma semelhança de sequência com a região análoga ou equivalente do dador da região de ligação ao antigénio (i.e., o anticorpo parental). Outras fontes de regiões de grelha para porções de origem humana de um anticorpo humanizado incluem sequências de consenso humanas variáveis (ver e.g., Kettleborough, CA. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Cárter et al, WO 94/04679. Por exemplo, a sequência do anticorpo ou região variável utilizada para obter a uma 73 ΡΕ1963368 porção não humana pode ser comparada a sequências humanas como descrito em Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). Numa forma de realização particularmente preferida, as regiões de grelha de uma cadeia de anticorpo humanizado são derivadas de uma região variável humana possuindo pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência global, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, 80%, ou 90% de identidade de sequência global e mais preferencialmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência global, com a região variável do dador não humano. Um porção humana também pode ser derivada de um anticorpo humano possuindo pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência, e preferencialmente pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, na porção particular (e.g., FR) a ser utilizada, quando comparada com a porção equivalente (e.g., FR) do dador não humano.

Referências que também descrevem métodos envolvidos na humanização de um anticorpo de murganho que podem ser utilizados são e.g., Queen et al, Proc. Natl Acad. Sei USA 88:2869, 1991; Pat. U.S. No. 5 693 761; Pat. U.S. No. 4 816 397; Pat. U.S. No. 5 225 539; programas de computador ABMOD e ENCAD como descrito em Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983; a humanização pode ser realizada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988). ΡΕ1963368 74

Anticorpos Humanos

Como uma alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de apresentação em fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581, 1991). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol, 147:86-95, 1991). De um modo semelhante, podem ser produzidos anticorpos humanos introduzindo loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, e.g., murganhos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inactivados. Após imunização, e.g., com um antigénio compreendendo um epitopo imunogénico da invenção, é obtido um reportório completo da produção de anticorpo humano, que se parece bastante com o que se observa em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo de genes, montagem e reportório de anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825; 5 589 369; 5 591 669; 5 625 126; 5 633 425; 5 661 016, e nas seguintes publicações cientificas: Marks et al., BioTechnology 10:779-783, 1992; Lonberg et al, Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 75 ΡΕ1963368 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996);

Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol 13: 65-93 (1995) e

Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90:2551, 1993.

Genes de imunoglobulina humana introduzidos no murganho, criando desse modo murganhos transgénicos capazes de responder aos antigénios com anticorpos gue possuem sequências humanas são também descritos em Bruggemann et al. (Proc. Natl Acad. Sei. USA 86:6709-6713, 1989). Há várias estratégias que existem para a criação de mamíferos que produzem anticorpos humanos. Em particular, existe a abordagem de "minilocus" na qual um locus de Ig exógeno é mimetizado através da inclusão de pedaços (e.g., genes individuais ) do locus de Ig (ver, e . g., Pat. U. S . Nos. 5 545 807, 5 545 806, 5 625 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, 5 770 429, 5 789 650, e 5 814 318, 5 612 205, 5 721 367, 5 789 215), introdução de YAC de fragmentos grandes e substancialmente da linha germinal dos loci de Ig (ver Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156, 1997; Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495, 1998), e introdução dos loci inteiros ou substancialmente inteiros através da utilização de fusão de microcélulas (ver Pedido de Patente Europeia No. EP 0 843 961 Al).

Qualquer murganho transgénico capaz de responder à imunização com anticorpos que possuem sequências humanas pode ser utilizado para produzir um anticorpo anti-IL-17 da invenção quando se utilizam métodos disponíveis para i, 76 ΡΕ1963368 especialista na técnica, e.g., quando esse murganho é imunizado com um polipéptido compreendendo um epitopo imunogénico da invenção.

Utilizações

Os anticorpos da presente invenção são úteis em aplicações terapêuticas, profilácticas, de diagnóstico e de investigação como aqui descrito. Pode ser utilizado um anticorpo da invenção para diagnosticar um distúrbio ou doença associados com a expressão de IL-17 humana. De um modo semelhante, o anticorpo da invenção pode ser utilizado num ensaio para monitorizar os níveis de IL-17 num indivíduo a ser testado para um estado associado a IL-17. Aplicações de investigação incluem métodos que utilizam o anticorpo da invenção e um marcador para detectar IL-17 numa amostra, e.g., num fluido corporal humano ou num extracto de células ou de tecido. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados com ou sem modificação, e são marcados através de ligação covalente ou não-covalente de uma unidade detectável. A unidade detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, seja directamente ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a unidade detectável pode ser um radioisótopo tal como, e.g., 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I, um composto fluorescente ou quimiolumines-cente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou peroxidase de rábano. Pode ser empregue qualquer método conhecido na técnica para conjugar 77 ΡΕ1963368

separadamente o anticorpo com a unidade detectável, incluindo os métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al, Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981; and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407, 1982. São conhecidos na técnica vários protocolos convencionais para medir IL-17, incluindo e.g., ELISAs, RIAs, e FACS, e proporcionam uma base para diagnosticar niveis alterados ou anormais de expressão de IL-17. Os valores de expressão normais ou convencionais são estabelecidos utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, e.g., através da combinação de uma amostra compreendendo um polipéptido de IL-17 com, e.g., anticorpos em condições adequadas para formar um complexo antigénio:anticorpo. O anticorpo é marcado directamente ou indirectamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de um material radioactivo inclui 125I, 131I, 35S, ou 3H. (ver, e.g., Zola, Monoclonal Antibodies: A 78 ΡΕ1963368

Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). A quantidade de um complexo convencional formado é quantificada através de vários métodos, tais como, e.g., meios fotométricos. As quantidades de polipéptido IL-17 expresso nas amostras são então comparadas com os valores convencionais.

Por uma questão de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser fornecido num estojo ("kit"), uma combinação embalada de reagentes em quantidades pré-determinadas com instruções para realizar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o estojo ("kit") irá incluir substratos e cofactores requiridos pela enzima (e.g., um substrato precursor que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável). Adicionalmente, podem ser incluídos outros aditivos tais como estabilizadores, tampões (e.g., um tampão bloqueador ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser largamente variadas para proporcionar as concentrações na solução dos reagentes que optimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes que, em dissolução, irão proporcionar uma solução de reagente possuindo a concentração apropriada.

Utilizações Terapêuticas para o Anticorpo A IL-17 é uma citocina pró-inflamatória secretada por células T activadas nos sítios da inflamação, não na 79 ΡΕ1963368 circulação sistémica; não é rapidamente detectável no soro ou nos tecidos de uma pessoa saudável. A IL-17 regula positivamente as moléculas de adesão, induz a produção de citocinas inflamatórias múltiplas e quimiocinas de vários tipos de células incluindo sinoviócitos, condrócitos, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, induzindo desse modo o recrutamento de neutrófilos para um sitio inflamatório, estimula a produção de prostaglandinas e metaloproteinases, e inibe a síntese de proteoglicano. Para além disso, a IL-17 desempenha um papel importante na maturação das células hematopoiéticas progenitoras. A IL-17 possui papéis de sinalização em diferentes órgãos e tecidos incluindo pulmão, cartilagem articular, osso, cérebro, células hematopoiéticas, rim, pele e intestino. A IL-17 partilha uma homologia de 15-27% de aminoácidos com IL-17 B, C e E e 44-50% de homologia de aminoácidos com IL-17 D e F. A IL-17 liga-se ao receptor de IL-17 com baixa afinidade (cerca de 1 nM) , enquanto outros membros da família IL-17 não se ligam ao receptor de IL-17.

Os níveis aumentados da IL-17 (i.e., IL-17A) foram associados com vários estados incluindo inflamação das vias respiratórias, RA, osteoartrite, erosão óssea, abcessos e adesões intraperitoneais, IBD, rejeição de aloenxertos, psoríase, certos tipos de cancro, angiogénese, aterosclerose e MS. Ambos IL-17 e IL-17R são regulados positivamente no tecido sinovial de doentes de RA. A IL-17 exerce o seu papel na patogénese de RA através de vias dependentes e independentes de IL-1-β e TNF-α. A IL-17 80 ΡΕ1963368 estimula a secreção de outras citocinas e quimiocinas, e.g., TNF-oí, DL-Ιβ, IL-6, IL-8 e Gro-α. A IL-17 contribui directamente para a progressão da doença em RA. A injecção da IL-17 no joelho de murganhos promove a destruição da articulação independentemente da actividade de IL-I β (Ann. Rheum. Dis. 59:529-32, 2000). O anticorpo anti-IL-Ιβ não tem efeito na inflamação induzida por IL-17 e lesão das articulações (J. Immunol. 167 : 1004-1013, 2001). Num modelo de artrite induzido por SCW, a IL- 17 induziu infiltração de célula inflamatória e eliminação de proteoglicano em murganhos silvestres e de desactivação de IL-Ιβ e desactivação de TNF-oí. Os murganhos com IL-17 desactivado são fenotipicamente normais na ausência de exposição antigénica, mas possuem artrite marcadamente reduzida seguindo a imunização com colagénio de tipo II (J. Immunol. 171:6173-6177, 2003). A esclerose múltipla ("MS") é uma doença auto-imune caracterizada pela inflamação do sistema nervoso central ("CNS") com lesão para a folha de mielina que rodeia os axónios. Uma marca de MS é que as células T se infiltram no SNC. A MS afecta mais de 350 000 pessoas nos E.U.A. e 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo. Existem muitas formas e a mais comum é a recaída/ressurgimento da doença ("RRMS) seguido por um estádio progressivo secundário. As terapêuticas actuais consistem em Interferão-β (AVONEX, BETASERON e REBIF) que reduz a recaída/taxa de exacerbação por 31%-34%, mas pode produzir sintomas tipo gripe e/ou a síntese de anticorpos neutralizantes (e.g., 81 ΡΕ1963368 cerca de 15% dos doentes que receberam AVONEX produzem anticorpos neutralizantes durante 18 meses. TYSABRI, aprovado pela FDA para RRMS foi subsequentemente retirado do mercado devido a preocupações relacionadas com a imunossupressão do SNC. Existe ainda uma necessidade médica não satisfeita no tratamento de MS. 0 mRNA de IL-17 é aumentado nas lesões de MS e em células mononucleares (MNC) no sangue e no liquido cefalorraquidiano de doentes com MS. São detectados números de MNC do sanque que expressam mRNA de IL-17 durante a exacerbação clinica de MS em comparação com a remissão (Multiple Sclerosis, 5:101-104, 1999). Para além disso, a encefalomielite auto-imunitária experimental ("EAE"), um modelo animal pré-clinico para MS é significativamente suprimido em murganhos desactivados para IL-17.

Por isso, uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da invenção pode ser útil para o tratamento ou prevenção de estados em que a presença de IL-17 provoca ou contribui para efeitos patológicos indesejáveis ou a diminuição da actividade de IL-17 possui um efeito terapêutico em mamíferos, preferencialmente humanos, incluindo, mas não limitado a, inflamação das vias aéreas, asma, RA, osteoartrite, erosão óssea, abcessos e adesões intraperitoniais, IBD, rejeição de aloenxerto, psoriase, certos tipos de cancro, angiogénese, aterosclerose e MS, assim como outros distúrbios inflamatórios, condições, doenças ou estados incluindo sem limite: resposta eritematosa, resposta à exposição a alergénios, Helicobacter pylori associada a gastrite, asma brônquica, e 82 ΡΕ1963368 rejeição de aloenxerto (e.g., renal), lúpus eritematoso sistémico e lupus nefrite. A utilização de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da presente invenção para o tratamento ou prevenção de pelo menos um dos distúrbios acima mencionados em que a actividade de IL-17 é lesiva ou benéfica para niveis diminuídos de IL-17 bioactiva está aqui contemplada. Adicionalmente, a utilização de um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da presente invenção para utilização no fabrico de um medicamento para o tratamento de pelo menos um dos distúrbios acima mencionados está contemplado.

Como aqui utilizado, os termos "tratamento", "tratando", e semelhantes, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. 0 efeito pode ser profiláctico em termos de prevenir completamente ou parcialmente uma doença ou sintoma desta e/ou pode ser terapêutica em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", como aqui utilizado, inclui a administração de um composto da presente invenção para o tratamento de uma doença ou estado num mamífero, particularmente num humano, e inclui: (a) prevenção da doença de ocorrer num indivíduo que pode estar predisposto à doença mas ainda não foi diagnosticado como possuindo essa doença; (b) inibir a doença, i.e., parar o seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, i.e., provocar a regressão da doença ou distúrbio ou aliviar os seus sintomas ou complicações. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta 83 ΡΕ1963368 óptima desejada (e.g., a resposta terapêutica ou profiláctica) . Por exemplo, pode ser administrado um único bólus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica.

Composição farmacêutica

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para a administração a um individuo (ver, e.g., Exemplo 14). Os compostos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com um veiculo, diluente, e/ou excipiente farmaceu-ticamente aceitável, em doses únicas ou múltiplas. As composições farmacêuticas para administração são concebidas para serem apropriadas para o modo seleccionado de administração, e diluente, veiculo, e/ou excipientes farma-ceuticamente aceitáveis, tais como agentes de dispersão, tampões, tensioactivos, conservantes, agentes de solubi-lização, agentes de isotonicidade, agentes estabilizadores e semelhantes são utilizados como apropriado (ver, e.g., Exemplo 14 aqui referido). As referidas composições são concebidas de acordo com técnicas convencionais como em e.g., Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que proporciona um compêndio de técnicas de formulação como são geralmente conhecidas dos técnicos. 84 ΡΕ1963368

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal anti-IL-17 da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo em risco de, ou apresentando patologias como aqui descrito utilizando técnicas de administração convencional incluindo administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, trans-dérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou em supositório. A composição farmacêutica da invenção é preferencialmente uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desej ado.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode variar de acordo com factores tais como 0 estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual qualquer efeito tóxico ou lesivo do anticorpo, é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, uma vez que é utilizada uma dose profiláctica em indivíduos 85 ΡΕ1963368 antes de ou num estado precoce da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilacticamente eficaz é pelo menos a dose mínima, mas inferior a uma dose tóxica, de um agente activo que é necessário para provocar um benefício terapêutico a um indivíduo. Dito de outro modo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é uma quantidade que em mamíferos, preferencialmente humanos, diminui uma bioactividade de IL-17, e.g., ligação a IL17R, em que a presença de IL-17 provoca ou contribui para efeitos patológicos indesejáveis ou a diminuição nos níveis de IL-17 resultam num efeito terapêutico benéfico num mamífero, preferencialmente um humano. A via de administração de um anticorpo da presente invenção pode ser oral, parentérica, por inalação, ou tópica. Preferencialmente, os anticorpos da invenção podem ser incorporados numa composição farmacêutica adequada para administração parentérica. 0 termo parentérico, como aqui utilizado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, rectal, vaginal, ou intraperi-toneal. A distribuição sistémica periférica através de injecção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Veículos adequados para essas injecções são simples na técnica. 86 ΡΕ1963368 A composição farmacêutica deve ser tipicamente estéril e estável nas condições de fabrico e armazenamento no recipiente proporcionado, incluindo e.g., um frasco selado ou seringa. Por isso, as composições farmacêuticas podem ser esterilizadas por filtração após preparar a formulação, ou tornada, de outro modo microbiologicamente aceitável. Uma composição típica para a infusão intravenosa pode possuir um volume tão elevado como 250-1000 mL de fluido, tal como solução de Ringer estéril, soro fisiológico, solução de dextrose e solução de Hank e uma dose terapeuticamente eficaz, (e.g., 1 até 100 mg/mL, ou mais) de concentração de anticorpo. A Dose pode variar dependendo do tipo e gravidade da doença. Como é bem conhecido nas artes médicas, as dosagens para qualquer sujeito depende de muitos factores, incluindo o tamanho do doente, área de superfície corporal, idade, o composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros fármacos que são administrados presentemente. Uma dose típica pode ser, por exemplo, no intervalo de 0,001 até 1000 pg; contudo, doses abaixo ou acima deste intervalo exemplar são pensados, considerando especialmente os factores acima mencionados. O regime de dosagem parentérica diário pode ser cerca de 0,1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg do peso corporal total, preferencialmente desde cerca de 0,3 pg/kg até cerca de 10 mg/kg e mais preferencialmente desde cerca de 1 pg/kg até 1 mg/kg, ainda mais preferencialmente desde cerca de 0,5 até 10 mg/kg de peso corporal por dia. O progresso pode ser monitorizado por avaliação periódica. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais prolongadas, dependendo do 87 ΡΕ1963368 estado, o tratamento é repetido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Todavia, podem ser úteis outros regimes de dosagem e não são aqui excluídos. A dosagem desejada pode ser distribuída por uma administração de bólus único, através de múltiplas administrações de bólus, ou por administração de infusão contínua do anticorpo, dependendo do padrão da quebra farmacocinética que o técnico deseja alcançar.

Estas quantidades sugeridas de anticorpo estão sujeitas a uma grande quantidade de descrição terapêutica. 0 factor chave na selecção de uma dose apropriada e calendarização é o resultado obtido. Os factores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o sítio de distribuição do anticorpo, o tipo particular do anticorpo, o método de administração, o calendário da administração, e outros factores conhecidos dos técnicos de saúde.

Os agentes terapêuticos da invenção podem ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituídos num transportador estéril adequado antes da utilização. A liofilização e reconstituição podem conduzir a graus variáveis de perda de actividade do anticorpo. As dosagens podem ter de ser ajustadas para compensar. Geralmente, é preferido o pH entre 6 e 8. ΡΕ1963368 88

Artigo de Fabrico.

Noutra forma de realização da invenção, um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento ou prevenção dos distúrbios ou estados descritos acima é proporcionado. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e um marcador. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. 0 recipiente armazena uma composição de um anticorpo da invenção que é eficaz para prevenir ou tratar o distúrbio ou estado e pode possuir uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma rolha que se pode furar com uma agulha de injecção hipodérmica). 0 agente activo na composição é um anticorpo anti-IL-17 da invenção. 0 marcador em, ou associado ao, recipiente indica que a composição é utilizada para tratar a condição de escolha. 0 artigo do fabrico pode compreender além disso um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode além disso incluir outros materiais desejáveis de um posto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e inserções na embalagem com instruções para utilização. Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para objectivos de ilustração, e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção, de forma alguma. 89 ΡΕ1963368

TABELA 1 NÚMEROS DE SEQ ID

Fab # LCVR CDR1 leve CDR2 leve CDR3 leve HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 1 178 122 150 168 56 11 29 33 2 179 122 150 169 57 11 29 34 3 180 123 150 168 56 11 29 33 4 181 124 150 168 58 11 29 35 5 179 122 150 169 59 11 29 36 6 182 124 150 169 60 11 29 37 7 183 125 150 170 56 11 29 33 8 184 124 150 171 61 11 29 38 9 185 124 150 170 62 11 29 39 10 178 122 150 168 60 11 29 37 11 181 124 150 168 61 11 29 38 12 186 124 150 172 63 11 29 40 13 187 123 150 169 64 11 29 41 14 188 123 150 173 65 11 29 42 15 189 124 150 174 66 11 29 43 16 181 124 150 168 62 11 29 39 17 187 123 150 169 61 11 29 38 18 181 124 150 168 67 11 29 44 19 190 124 150 175 56 11 29 33 20 178 122 150 168 68 12 29 33 21 178 122 150 168 69 13 29 33 22 178 122 150 168 70 14 29 33 23 178 122 150 168 71 15 29 33 24 178 122 150 168 72 16 29 33 90 ΡΕ1963368 (continuação)

Fab # LCVR CDR1 leve CDR2 leve CDR3 leve HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 25 178 122 150 168 73 17 29 33 26 178 122 150 168 74 18 29 33 27 178 122 150 168 75 19 29 33 28 178 122 150 168 76 20 29 33 29 178 122 150 168 77 21 29 33 30 178 122 150 168 78 22 29 33 31 178 122 150 168 79 23 29 33 32 178 122 150 168 80 24 29 33 33 178 122 150 168 81 11 30 33 34 178 122 150 168 82 11 31 33 35 178 122 150 168 83 11 32 33 36 178 122 150 168 58 11 29 35 37 178 122 150 168 84 11 29 45 38 178 122 150 168 85 11 29 261 39 178 122 150 168 86 11 29 47 40 178 122 150 168 87 11 29 48 41 178 122 150 168 88 11 29 49 42 178 122 150 168 89 11 29 50 43 178 122 150 168 90 11 29 51 44 178 122 150 168 91 11 29 52 45 178 122 150 168 92 11 29 53 46 178 122 150 168 93 11 29 54 47 191 125 150 168 56 11 29 33 48 192 126 150 168 56 11 29 33 49 193 127 150 168 56 11 29 33 91 ΡΕ1963368 (continuação)

Fab # LCVR CDR1 leve CDR2 leve CDR3 leve HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 50 194 128 150 168 56 11 29 33 51 195 129 150 168 56 11 29 33 52 196 130 150 168 56 11 29 33 53 197 131 150 168 56 11 29 33 54 198 132 150 168 56 11 29 33 55 199 133 150 168 56 11 29 33 56 200 134 150 168 56 11 29 33 57 201 135 150 168 56 11 29 33 58 202 136 150 168 56 11 29 33 59 203 137 150 168 56 11 29 33 60 204 138 150 168 56 11 29 33 61 205 139 150 168 56 11 29 33 62 206 140 150 168 56 11 29 33 63 199 133 150 168 56 11 29 33 64 207 141 150 168 56 11 29 33 65 208 142 150 168 56 11 29 33 66 209 143 150 168 56 11 29 33 67 210 144 150 168 56 11 29 33 68 211 122 151 168 56 11 29 33 69 212 122 150 176 56 11 29 33 70 213 122 150 177 56 11 29 33 71 214 145 150 168 94 25 29 46 72 191 125 150 168 95 26 29 46 73 215 146 150 168 96 26 29 55 74 199 133 150 168 97 26 29 48 92 ΡΕ1963368 (continuação)

Fab # LCVR CDR1 leve CDR2 leve CDR3 leve HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 75 178 122 150 168 95 26 29 46 76 199 133 150 168 95 26 29 46 78 178 122 150 168 98 26 29 47 79 195 129 150 168 99 27 29 46 80 195 129 150 168 97 26 29 48 82 199 133 150 168 98 26 29 47 84 199 133 150 168 100 26 29 52 85 191 125 150 168 98 26 29 47 86 191 125 150 168 95 26 29 46 87 216 147 150 168 95 26 29 46 88 199 133 150 168 94 25 29 46 89 196 130 150 168 100 26 29 52 91 195 129 150 168 97 26 29 48 92 216 147 150 168 97 26 29 48 93 195 129 150 168 101 27 29 48 94 199 133 150 168 95 26 29 46 95 217 130 152 168 98 26 29 47 96 218 125 153 168 102 26 32 46 97 219 145 154 168 97 26 29 48 98 199 133 150 168 98 26 29 47 99 199 133 150 168 95 26 29 46 100 220 125 155 168 103 26 32 33 101 221 133 156 168 95 26 29 46 102 222 148 157 168 95 26 29 46 103 223 130 158 168 104 26 32 46 93 ΡΕ1963368 (continuação)

Fab # LCVR CDR1 leve CDR2 leve CDR3 leve HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 104 224 145 159 168 104 26 32 46 105 225 130 150 169 105 26 32 47 106 226 133 160 168 106 26 29 47 107 227 130 161 169 107 25 32 48 108 228 133 162 169 108 25 29 47 109 229 130 163 168 109 27 32 46 110 230 131 164 169 100 26 29 52 111 231 146 165 168 95 26 29 46 112 232 125 166 168 97 26 29 48 113 199 133 150 168 110 27 29 47 114 233 129 159 168 106 26 29 47 115 234 133 167 168 106 26 29 47 116 235 149 167 168 110 27 29 47 117 236 125 167 168 111 28 32 53 118 234 133 167 168 112 26 30 53 119 237 122 167 168 100 26 29 52 120 238 122 167 169 112 28 30 46 121 239 147 167 169 113 28 32 46 122 237 122 167 168 114 26 30 53 123 236 125 167 168 115 26 29 53 124 240 131 167 168 116 11 30 53 125 178 122 150 168 117 26 32 52 126 241 131 167 168 118 26 30 52 127 241 131 167 168 106 26 29 47 128 242 129 167 169 119 27 30 47 94 ΡΕ1963368 129 236 125 167 168 120 26 30 52 130 243 129 167 168 119 27 30 47 131 236 125 167 168 117 26 32 52 132 236 125 167 168 121 27 30 52

Tabela 2 Alinhamentos de CDR de cadeia pesada

Fab# CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID No. No. No. 1 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 2 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGGY 34 3 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 4 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGAY 35 5 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGLY 36 6 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGGY 37 7 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 8 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 9 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGGY 39 10 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGGY 37 11 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 12 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGTY 40 13 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGGY 41 14 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGPY 42 15 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGGY 43 16 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGGY 39 17 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 18 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYSTGTGGY 44 19 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 20 GYSFTDYNIN 12 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 21 GYSFTDYNLN 13 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 22 GYSFGDYNMN 14 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 23 GYSFRDYNMN 15 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 24 GYSFTWYNMN 16 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 25 GYSFNDYNMN 17 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 26 GYSFTDYNMS 18 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 ΡΕ1963368 95 (continuação) SEQ ID SEQ ID SEQ ID Fab# CDR1 No. CDR2 No. CDR3 No. 27 GYSFTDYNTN 19 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 28 GYSFPDYNMN 20 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 29 HYSFTDYNMN 21 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 30 GYHFTDYNMN 22 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 31 GYPFTDYNMN 23 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 32 GYSFTDFNMN 24 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 33 GYSFTDYNMN 11 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYATGTGAY 33 34 GYSFTDYNMN 11 VINPAYGTTDYNQRFKG 31 YDYATGTGAY 33 35 GYSFTDYNMN 11 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYATGTGAY 33 36 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGAY 35 37 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYSTGTGAY 45 38 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDAFTGTGAY 261 39 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 40 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 41 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYLTGTGAY 49 42 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATSTGAY 50 43 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYAPGTGAY 51 44 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 45 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 53 46 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDPATGTGAY 54 47 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 48 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 49 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 50 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 51 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 52 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 53 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 54 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 55 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 56 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 57 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 58 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 59 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 ΡΕ1963368 96 (continuação) SEQ ID SEQ ID SEQ ID Fab# CDR1 No. CDR2 No. CDR3 No. 60 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 61 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 62 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 63 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 64 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 65 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 66 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 67 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 68 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 69 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 70 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 71 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 72 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 73 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGVY 55 74 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 75 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 76 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 78 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 79 GYSFTDYHDÇ 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 80 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 82 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 84 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 85 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 86 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 87 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 88 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 89 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 91 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 92 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 93 GYSFTDYHDÇ3 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 94 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 95 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 96 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 ΡΕ1963368 - 97 - (continuação) SEQ ID SEQ ID SEQ ID Fab# CDR1 No. CDR2 No. CDR3 No. 97 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 98 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 99 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 100 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYATGTGAY 33 101 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 102 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 103 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 104 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 105 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYYTGTGAY 47 106 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 107 GYSFTDYHLG 25 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYUHTGTGAY 48 108 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 109 GYSFTDYHtÇ 27 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 110 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 111 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 112 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 113 GYSFTDYHtÇ 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 114 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 115 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 116 GYSFTDYHtÇ 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 47 117 GYSFTDYHIS 28 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYYTGTGY 53 118 GYSFTDYHIH 26 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 119 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 120 GYSFTDYHIS 28 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGAY 46 121 GYSFTDYHIS 28 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 122 GYSFTDYHIH 26 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 123 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 53 124 GYSFTDYNMN 11 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 125 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGVY 52 126 GYSFTDYHIH 26 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52 127 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 128 GYSFTDYHtÇ 27 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGAY 47 129 GYSFTDYHIH 26 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52 ΡΕ1963368 98 (continuação) SEQ ID SEQ ID SEQ ID Fab# CDR1 No. CDR2 No. CDR3 No. 130 GYSFTDYHMS 27 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGAY 47 131 GYSFTDYHIH 26 VINFEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGVY 52 132 GYSFTDYHtÇ 27 VINEMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52

Consenso:

SEQ ID NO: 246 YDX3X4X5X6TGX9Y X3 é Y, A ou P X4 é Y, F, H, S, W, L ou A X5 é T ou P Xè é G ou S X9 é A,G, L,V, P ou T

SEQ ID NO: 244 XiYXsFXsXgXvXgXgX^ Xg e H ou G X3 é S,H ou P X5 é G, R, T,N ou P Xè é D ou W X7 é Y ou F Xs é N ou H X9 é M, T,L ou I X10 é N, G, H ou S

SEQ ID NO: 245 VINPX5YGTTDYNQRFKG X5 é N, A, M ou E

Tabela 3 Alinhamentos de CDR de Cadeia leve Table 3 Light

Fab# CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO 1 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 2 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 3 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 4 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 5 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 6 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 7 RSSQSLVHSYGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHIPFT 170 8 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSLHVPFT 171 9 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHIPFT 170 ΡΕ1963368 99 (continuação)

Fab# CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO 10 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 11 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 12 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHEPFT 172 13 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 14 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 NQSTHVPFT 173 15 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQTTHVPFT 174 16 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 17 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 18 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 19 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSMHVPFT 175 20 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 21 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 22 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 23 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 24 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 25 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 26 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 27 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 28 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 29 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 30 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 31 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 32 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 33 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 34 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 35 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 36 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 37 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 38 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 39 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 40 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 41 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 42 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 43 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 ΡΕ1963368 100 (continuação)

Fab# CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO 44 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 45 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 46 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 47 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 48 RSSQSVVHSRGNTYLH 126 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 49 ySSQSLVHSRGNTYLH 127 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 50 RSSASLVHSRGNTYLH 128 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 51 RSSQSIiCHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 52 RSSQSIBHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 53 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 54 RSHQSLVHSRGNTYLH 132 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 55 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 56 RSSQSLVHNRGNTYLH 134 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 57 RSSQSLVHSRGRTYLH 135 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 58 RSSQSLVH RRGNTYLH 136 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 59 RSSQSLVHSRGNTYTH 137 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 60 RSSQSLVHSRGNTYSH 138 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 61 RSSQSLVHSRGNTYHH 139 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 62 RSSQSLVHARGNTYLH 140 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 63 RSSQSLVHSRGNTYFH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 64 RSSQSLVHSRGN1WLH 141 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 65 RSSQSLVHSRGNVYLH 142 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 66 RSSQSLVHSRGKTYLR 143 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 67 RSSQSLVHLRGNTYLH 144 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 68 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 69 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQTTHLPFT 176 70 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTSLPFT 177 71 RSSKSLVHSRGNTFLH 145 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 72 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 73 RSSQSIRHSRGNTFLH 146 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 74 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 75 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 76 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 78 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 79 RSSQSIiCHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 80 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 ΡΕ1963368 101 (continuação)

Fab# CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO 82 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 84 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 85 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 86 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 87 RSSQSIICHSRGNIFLH 147 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 88 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 89 RSSQSI^KSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SOSTHLPFT 168 91 RSSQSLRHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 92 RSSQSLKHSRGN1FLH 147 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 93 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 94 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 95 RSSQSIBHSRGNTYLH 130 KVSNRFH 152 SQSTHLPFT 168 96 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVftNRFS 153 SQSTHLPFT 168 97 RSSKSLVHSRGN1FLH 145 KVSVRFS 154 SQSTHLPFT 168 98 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 99 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 100 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 155 SQSTHLPFT 168 101 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVDNRFS 156 SQSTHLPFT 168 102 RSSRSLVHSRGNTFLH 148 KVSNRFS 157 SQSTHLPFT 168 103 RSSQSL RHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 158 SQSTHLPFT 168 104 RSS KSLVHSRGNT FLH 145 KVSNRFS 159 SQSTHLPFT 168 105 RSSQSL RHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SQSTH YPFT 169 106 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 160 SQSTHLPFT 168 107 RSSQSLR HSRGNTYLH 130 KVSNRFS 161 SQSTH YPFT 169 108 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFS 162 SQSTH YPFT 169 109 RSSQSLRHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 163 SQSTHLPFT 168 110 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFT 164 SQSTH YPFT 169 111 RSSQSLRHSRGNT_FLH 146 KVSNRFS 165 SQSTHLPFT 168 112 RSSRSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 166 SQSTHLPFT 168 113 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 114 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 159 SQSTHLPFT 168 115 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 116 RS SQS LKf i SHGNTYLH 149 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 117 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 118 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 119 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 ΡΕ1963368 102 (continuação)

Fab# CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO 120 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 121 RSSQSLKfiSRGNT FLH 147 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 122 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 123 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 124 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 125 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 126 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 127 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 128 RSSQSLRHSRGNTYLH 129 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 129 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 130 RSSQSLRHSRGNTYLH 129 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 131 RSSR SLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 132 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168

Consenso: X1SX3X4SX6X7HX9X10GX12X13X14X15H XIVX3X4RX5X7 SEQ ID NO: 247 SEQ ID NO: 248

SEQ ID NO: 249 X1QX3X4X5X6PFI

Xi é R ou V XI 3 é K ou I Xl é S ou N X3 é S ou H X3 é S, A, D, T, R, H ou p X3 é S ou T X4 é Q, K, R ou A Ά é N, V ou T X4 é T, L ou M Χβ é V ou L Xs é R, I ou N X5 é H ou S X7 é R, V ou K Xe é F, I ou N ou Xe é L, I, V, E X9 é S, N, R, A ou L X7 é S, Η, I, T ou V

X10 é H,R,N ou Y

X12 é N, K ou R

X13 é T ou V

X14 é F, Y ou W

Xis é L, T, S, H ou F ΡΕ1963368 103

EXEMPLOS

Exemplo 1 ELISA I: Ligação do Anticorpo a IL-17 de Várias Espécies

Um ensaio de ELISA exemplar para medir a ligação dos anticorpos a IL-17 utiliza placas de microtitulação seladas Costar 3366 que são revestidas durante a noite a 4 °C com 50 pL de 1,0 pg/mL de IL-17 humana por poço (R&D Systems, #317-IL/CF) em tampão de revestimento de carbonato (carbonato de sódio a 50 mM, pH 9,0). Alternativamente, são utilizadas IL-17 de murganho, rato, coelho ou de macaco cinomólogo. É utilizada IL-22 humana (R&D Systems) como um antigénio de controlo. A IL-17 de coelho e de macaco cinomólogo não estão disponíveis comercialmente e por isso requer clonagem e expressão, ou sintese artificial, de acordo com métodos conhecidos na técnica utilizando as sequências de aminoácidos para IL-17 das várias espécies fornecidas na Figura 2 (Seq ID NOs: 9 e 10). Sequências de nucleótidos exemplares que codificam IL-17 das várias espécies são apresentadas nas SEQ ID NOs: 250-254. A placa é bloqueada subsequentemente através da adição de 100 pL de tampão de bloqueamento (Pierce #37515). A placa é incubada durante 1 hora a 37 °C depois lavada três vezes em tampão de lavagem (PBS pH 7,4 e 0,05% Tween). Depois, é adicionado 50 pL de anticorpo da amostra ou anticorpo de controlo (diluida para várias concentrações em PBS a pH 7,4, e.g., 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 e 0 pg/mL) 104 ΡΕ1963368 a cada poço e a placa é além disso incubada durante 1 hora a 37 °C. A placa é então lavada três vezes com tampão de lavagem antes de adicionar 50 pL por poço de fosfatase kapa-alcalina anti-humana conjugada diluida para 1:1000 em PBS pH 7,4. As amostras de teste são incubadas durante 1 hora a 37 °C. Depois é preparado de fresco p-nitrofenil fosfato em sal de dissódio (PNPP, Pierce #37620) dissolvendo em tampão de substrato de dietanolamina de acordo com as instruções do fabricante e é adicionado 50 pL a cada poço. O desenvolvimento de cor é deixado prosseguir durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente depois o sinal da cor é medido a uma absorvência de 405 nm utilizando qualquer leitor de placas de ELISA apropriada. O grau de ligação é proporcional à produção do sinal de cor.

Os anticorpos da invenção ligam-se a IL-17 humana num ensaio de ELISA como aqui descrito, mas não se liga a IL-17 de rato ou murganho. É antecipado, dados os resultados do Biacore de Exemplo 4 demonstrando que os anticorpos da invenção se ligam a IL-17 humana e de macaco, que os anticorpos da invenção também demonstrariam ligação a IL-17 de macaco num ensaio de ELISA como aqui descrito.

Exemplo 2 ELISA II: Ligação do Anticorpo a proteínas da família de IL-17 É utilizada uma ELISA para medir se os anticorpos da invenção se ligam selectivamente e/ou preferencialmente a membros particulares da IL-17 humana (e.g., IL-17A, IL- 105 ΡΕ1963368 17Β, IL-17C, IL-17D, IL-17E ou IL-17F) ou IL-22 humana (controlo negativo).

Num ensaio exemplar, os poços da placa de ELISA (Nunc Immuno Maxisorp) são revestidos com 100 pL (0,5 pg/mL em tampão de revestimento a IX (BioFx)) de proteínas dos membros da família da IL-17 (R&D Systems) seladas e incubadas durante a noite a 4 °C. A solução no poço é removida sacudindo e é adicionado agente de bloqueamento (200 pL 1,5% BSA em PBS) . As placas são incubadas num agitador de rotação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois, é adicionado 100 pL de um anticorpo a ser testado por poço a concentrações variáveis (e.g., 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 e 0 pg/mL). As placas são novamente incubadas durante a noite (4 °C) seguido por aquecimento num agitador de rotação (60 min à temperatura ambiente). Cada placa-poço é então lavada cinco vezes com tampão (IX tampão Ish, BioFX). Após a lavagem, é adicionado um anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado disponível comercialmente (1:2000 em PBS com 1,5% de BSA) (100 pL/poço) . As placas são re-incubadas num agitador de rotação (60 min. temp. ambiente) seguido por lavagem com tampão (5X) como descrito acima. O sinal colorimétrico é desenvolvido adicionando TMB (100 pL/poço) até à saturação (aprox 3-5 min.) depois é terminado o desenvolvimento posterior adicionando solução de terminação (100 pL/poço, BioFX) . O sinal de cor é medido a 450 nm de absorvência utilizando qualquer leitor de placas de ELISA apropriadas. O grau de ligação é proporcional à produção do sinal de 106 ΡΕ1963368 cor. Os anticorpos da invenção (e.g., Fabs 103, 104, 118, 121, 126 e 131 como descrito na Tabela 1) ligam-se especificamente a IL-17 humana (i.e., IL-17A), mas, em condições semelhantes, não se liga a niveis superiores aos de fundo a IL-17B humana, IL-17C humana, IL-17D humana, IL-17E humana, IL-17F humana, IL-17 de murino ou IL-22 humana.

Exemplo 3 Isolamento e activação de células para clonar IL-17 A. Esplenócitos de Rato

Utilizando fórceps e tesouras estéreis, remover o baço de um rato sacrificado por inalação de CO2 e colocar o baço num tubo contendo 5 mL de meio RPMI 1640 media + 10% de soro de bovino fetal e penicilina/estreptomicina (solução do meio) . Verter os conteúdos do tubo para uma placa de Petri de 10 cm e remover a gordura do baço. Homogeneizar o baço suavemente utilizando um par de lâminas de microscópio pré-autoclavadas totalmente foscas. Remover as células das lâminas por lavagem utilizando a solução do meio, pipetar algumas vezes e filtra as células através de uma peneira celular (Fisher Scientific). Lavar as células uma vez com solução do meio, contar as células e ressuspendê-las para uma concentração final de 2 x 107 células/mL em 80 mL. Adicionar solução celular a um frasco T150, adicionar Concanavalina A para uma concentração final de 3 pg/mL e incubar a 37 °C durante cerca de 15 horas. 107 ΡΕ1963368

Recolher as células, lavar com PBS, congelar o sedimento celular em gelo seco e prosseguir imediatamente para processos de isolamento de RNA convencionais. B. Células mononucleares de sangue periférico de macaco cinomólogo e coelho (PBMC)

Aplicar cerca de 7 mL de sangue total de macaco cinomólogo ou 10 mL de sangue total de coelho branco New Zealand num BD Vacutainer™ CPT™ System para separação de células mononucleares de sangue total. Centrifugar o tubo da preparação de células CPT durante 20 min a 1500 x de gravidade num rotor de balde de baloiço horizontal. Recolher linfócitos e monócitos na interface, lavar duas vezes com solução do meio, contar e ressuspender em solução do meio a uma concentração final de 106 células/mL. Adicionar Concanavalina A para uma concentração final de 3 pg/mL e incubar a 37 °C durante cerca de 15 horas. Recolher as células, lavar com PBS, congelar o sedimento celular em gelo seco e prosseguir imediatamente para processos de isolamento de RNA convencionais.

Exemplo 4 Medir as Constantes Cinéticas de Ligação É utilizado um instrumento de BIACORE® 2000 para medir a cinética e a afinidade da ligação antigénio-anticorpo. O instrumento utiliza as propriedades ópticas de 108 ΡΕ1963368 ressonância de plasmão de superfície para detectar a alteração na concentração de proteínas de moléculas de interacção numa matriz de biosensor de dextrano. Excepto se for referido em contrário, todos os reagentes e materiais são adquiridos a BIACORE® AB. Todas as medições são realizadas a 25 °C. As amostras são ressuspensas em tampão HBS-EP para uma concentração final de 2 pg/mL (150 mM de cloreto de sódio, 3 mM de EDTA, 0,005% (p/v) de tensioactivo P-20, e 10 mM de HEPES, pH 7,4). A proteína A é imobilizada nas células de fluxo 1 até 4 de um chip sensor CM4 a um nível de 500 unidades de resposta utilizando um estojo ("kit") de acoplamento de amina. A ligação é avaliada utilizando múltiplos ciclos analíticos. Cada ciclo é realizado a uma taxa de fluxo de 50 pL/minuto e consiste nos seguintes passos: injecção de cerca de 2 0 pL de uma composição de anticorpo a 2 pg/mL tendo como objectivo uma captura de 100-200 unidades de resposta, injecção de 250 pL de IL-17 humana, IL-17 de macaco cinamólogo, IL-17 de coelho branco New Zealand, IL-17 de rato ou IL-17 de murganho (começando a 10 nM e utilizando diluições seriadas de duas vezes para cada ciclo) seguido por 20 minutos para dissociação, e regeneração utilizando 30 pL de cloridrato de glicina a 10 mM, pH 1,5. As taxas de associação e dissociação para cada ciclo são avaliadas utilizando um modelo de ligação de "1:1 com transferência de massa" no software BIAevaluation. 109 ΡΕ1963368

Os mAbs de comprimento total 103, 104, 118, 121, 126 e 131 (ver Tabela 1) possuindo uma região de FC de IgG4 apresenta uma elevada afinidade de ligação a IL-17 humana e a IL-17 de macaco com uma KD inferior a 5 pM, uma Koff mais lenta do que 2 x 10”5 s”1 e uma Kon de pelo menos 5 x 106 M'1 s"1. A KD e a koff são melhoradas (i.e., KD inferior, koff mais lenta) nestes mAbs variantes em relação ao mAb Fab 2321 (parental Fab de e.g., Fab 103 e 104) compreendendo uma região variável de murino [Seq ID Nos: 2 61 (VH de 2321), 262 (VL de 2321)], uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana (SEQ ID NO: 260) e uma região constante de cadeia leve kapa (SEQ ID NO: 272). Os anticorpos da invenção apresentam uma ligação não superior aos niveis de fundo a IL-17 de murganho ou IL-17 de rato; não sendo detectada ligação até 200 nM de IL-17 de murganho e não sendo detectada ligação até 1 μΜ de IL-17 de rato. Quando são testados os mAbs de comprimento total 103, 104, 121 e 126, nas mesmas condições descritas acima, para ligação a IL-17 de macaco cinomólogo e IL-17 de coelho; a ligação a IL-17 de coelho é fraca e bifásica enquanto a ligação a IL-17 de macaco é semelhante à ligação à de humano. Os valores específicos para certos mabs (os valores são apresentados como média ± erro padrão da média) da invenção quando testados neste ensaio estão listados na Tabela 4 abaixo. Está contemplado que as regiões Fc diferentes das de IgG4 não afectam significativamente KD e koff · ΡΕ1963368 110

Tabela 4 IL-17 HUMANA. Kon (M-1 S'1) Koff (S’1) KD (pM) mAB 103 11 (± 2) x 106 1,5 (± 0,7) x IO'5 1,4 (± 0,7) mAB 104 7,7 (± 0,6) x 106 1,1 (± 0,5) x IO'5 1,7 (± 0,9) mAB 118 5 x 106 2 x IO'5 3,9 mAB 121 10 (± 0,9) x 106 1,5 (± 0,3) x IO'5 1,6 (± 0,4) mAB 126 7,5 (± 0,4) x 106 1,3 (± 0,2) x IO'5 1,8 (± 0,3) mAB 131 5,4 x 106 1,6 x 10~5 2,9 mAB 2321 parental 2,7 x 106 6 x IO'5 7 IL-17 CYNO Κ,η (M-1 s'1) Koff (S’1) KD (pM) mAB 103 u? O «—1 X co 00 1,1 x 10~5 1,3 mAB 104 9,4 x 106 0,5 x 10~5 0,5 mAB 121 7,8 (± 0,3) x 106 0,7 (± 0,2) x 10~5 1,1 (± 0,04) mAB 126 7,9 (± 0,3) x 106 0,7 (± 0,6) x 10”5 0,8 (± 0,8) IL-17 de COELHO3 Kon (ΚΓ1 S"1) Koff (S-1) KD (pM) mAB 103 1,8 x 105 10,6 x 106 3,6 x 10~4 19,2 x 10'2 2 18,1 mAB 104 1.0 (± 0,1) x 105 4.0 (± 2) x 106 1,8 (± 1,0) x 10“4 7,0 (± 2) x IO'2 1,9 (± 1,3) 20 (± 6) mAB 121 8 (± 6) x 105 17 (± 11) x 106 4 (± 3) x 10'4 2,1 (± 0,22) x 10~2 0,51 (± 0,13) 1,5 (± 1,0) mAB 126 1,5 (± 0,6) x 105 9 (± 3) x 106 1,7 (± 0,5) x 10“4 11 (± 2) x 10“2 1,3 (± 0,6) 14 (± 4,0) A ligação é bifásica e os resultados são ajustados com modelo de ligação ao ligando heterogéneo resultando duas afinidades.

Exemplo 5 Estudos de Competição da Ligação Receptor IL- 17/Anticorpo anti-IL-17

Este exemplo demonstra que os anticorpos da invenção competem para a ligação a IL-17 com o receptor de IL-17. 111 ΡΕ1963368

Os estudos de ligação de BIACORE são realizados utilizando a proteina de fusão receptor de IL-17 Fc (R&D #177-IR). Para demonstrar que a proteina de fusão IL-17 receptor Fc liga-se a IL-17 humana, é realizado um ensaio BIACORE em tampão de ligação de BIACORE (HBS-EP) + 1 mg/mL de BSA a 25 °C num instrumento BIACORE 2000. É utilizado um chip CM4 com aproximadamente 600 unidades de resposta de Proteina A imobilizada nas células de fluxo 1, 2 e 3 do chip. Aproximadamente 100 unidades de resposta da proteína de fusão IL-17 receptor Fc são capturadas em células de fluxo 2 do chip. A IL-17 humana é então exposta às células de fluxo 1 e 2 em concentrações que variam desde 600 nM até

9.4 nM. Após cada 250 pL de injecção da IL-17 humana, o complexo é deixado a dissociar durante cerca de 12 minutos fazendo passar tampão pelo chip. No final da dissociação, é utilizada uma injecção de 20 pL de glicina a 100 mM a pH 1.5 para regenerar o chip antes que o ciclo seguinte da ligação comece. A célula de fluxo 1 é utilizada como uma célula de fluxo de referência. Os resultados são ajustados utilizando o modelo "Analito bivalente" no software BIAevaluation Versão 3.2. Os resultados indicam que esta interacção possui uma taxa de iniciação de 1,06 x 10 M S 1, uma taxa de eliminação de 20,3 s”1 e uma taxa de eliminação lenta de 1,63 x 10"4 s”1. Por isso, esta interacção possui uma KD ou afinidade de ligação de 1,5 nM e 0,19 mM que é muito mais fraca do que as afinidades de ligação dos anticorpos da invenção à IL-17 humana. 112 ΡΕ1963368 A ligação para a experiência de competição é também medida em HBS-EP + 1 mg/mL de BSA a 25 °C num instrumento BIACORE 2000 com um chip CM4. São imobilizadas aproximadamente 1000 unidades de resposta de um anticorpo da invenção nas células de fluxo 2, 3 e 4 do chip; a célula de fluxo 1 é deixada em branco. Utilizando uma taxa de fluxo de 50 pL/mL, são injectados 25 pL de 500 nM de IL-17 humana ao longo de todas as quatro células de fluxo, formando o complexo anticorpo:antigénio na superfície do chip. Após a injecção estar completa e o complexo ser formado, 250 pL de 500 nM de proteína de fusão IL-17 humana receptor Fc é injectado ao longo de todas as quatro células de fluxo. No final desta injecção é utilizada uma injecção de 25 pL de glicina a 100 mM pH 1,5 para regenerar o chip. A mesma experiência de ligação é então repetida utilizando uma injecção de 250 pL de tampão em vez da proteína de fusão IL-17 receptor Fc.

Os perfis de ligação para a injecção do receptor em relação ao complexo anticorpo: antigénio e para a injecção de controlo de tampão em relação ao complexo anticorpo:antigénio são idênticos. Isto indica que não existem sítios de ligação disponíveis para a IL-17 dimérica se ligar ao seu receptor assim que estiver ligado a um anticorpo da invenção. Este resultado também indica que o receptor não é capaz de "puxar" a IL-17 para longe de qualquer um dos anticorpos assim que o complexo se forme. Estes anticorpos podem inibir a IL-17 humana de se ligar ao seu receptor, neutralizando desse modo a actividade biológica da IL-17 humana. 113 ΡΕ1963368

Exemplo 6A Ensaio de Repórter de IL-8 in vitro

Para testar a capacidade de um anticorpo da invenção neutralizar ou antagonizar uma bioactividade de IL-17, pode utilizar-se o ensaio de repórter de IL-8 aqui descrito. Esta abordagem pode também ser utilizada para determinar a potência de Fabs ou mAbs da invenção num ensaio baseado em células. A linha celular de Hs27 humana (ATCC #CRL-1634) secreta IL-8 em resposta a IL-17. A secreção de IL-8 induzida por IL-17 é inibida através da neutralização de anticorpos anti-IL-17 (ver, e.g., J. Inrni. 155:5483-5486, 1995 ou Cytokine 9:794-800, 1997).

Consequentemente, a secreção de IL-8 induzida por IL-17 deve prosseguir sem constrangimento se for adicionado suficiente IL-17 às células HS27 na ausência do anticorpo neutralizante anti-IL-17.

As células HS27 são mantidas em meio de ensaio: meio de glucose elevada DMEM sem vermelho de fenol (Invitrogen #31053-028) com 10% de soro de bovino fetal, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, penicilina G (100 U/500 mL) e estreptomicina (100 pg/500 mL) . As células são cultivadas em frascos T150 até estarem cerca de 80-90% confluentes no dia do ensaio. A IL-17 humana (R&D Systems, #317-IL-050) é reconstituída em PBS estéril sem Ca2+ e Mg2+ armazenado congelado, descongelado de fresco para utilização e diluído para 200 ng/mL em meio de ensaio. É adicionada uma fracção de 50 pL da IL-17 diluída, a cada 114 ΡΕ1963368 poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo liso de 96 poços (Falcon #35-3072) com as paredes externas deixadas vazias. Os poços em duplicado são utilizados para um controlo apenas do meio (100 pL/poço) e controlo apenas de IL-17 (100 pL/poço) . O teste é realizado em duplicado ou triplicado. As proteínas de mAb de comprimento total estéreis são diluidas para uma concentração máxima de 24 pg/mL em meio de ensaio. São realizadas diluições em série (tipicamente 1:5) numa placa de ensaio separada e são adicionados 50 pL das amostras de Fab nas várias diluições às paredes que contêm IL-17 depois incubadas a 37 °C durante 1 hora. O meio de ensaio isoladamente é utilizado como um controlo negativo.

As células HS27 (tipicamente cerca de 20 000 células em 100 pL de meio de ensaio) são adicionadas a cada poço da placa contendo Fab + IL- 17 (ou controlos) e incubadas durante cerca de 48 horas a 37 °C. Os sobrenadantes do meio são então recolhidos após a centrifugação das placas de 96 poços durante 5 minutos a 500 vezes de gravidade e diluídos 1:15 ou 1:10 em meio de ensaio. O nível de neutralização de IL-17 é medido através da determinação das quantidades de IL-8 no sobrenadante utilizando um estojo ("kit") de ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante, excepto que o meio de ensaio é substituído por diluente convencional e o volume do substrato é de 100 pL/poços (R&D Systems, ELISA D-8000C ou R&D DuoSet ELISA #DY208hIL-8). As medições da ELISA (450 nm) são realizadas num leitor de microplacas. As curvas de 115 ΡΕ1963368 calibração são obtidas utilizando um ajuste logístico de 4 parâmetros com valores de IL-8 (pg/ml) determinados a partir das curvas de calibração utilizando técnicas estatísticas convencionais. Os valores de IC50 são obtidos utilizando técnicas estatísticas convencionais.

Os mAbs de comprimento total 103, 104, 121 e 126 da invenção (com a região Fc de IgG4) , quando testados no ensaio descrito (2-4 replicações) , possuem uma IC50 média (baseada num peso molecular estimado de 150 kD para cada mAb) entre 450 e 500 pM com a vantagem de todos os valores medidos entre 365 e 618 pM.

Exemplo 6B Ensaio In vitro de repórter de GROa

Para testar a capacidade de um anticorpo da invenção neutralizar ou antagonizar uma bioactividade de IL-17, pode utilizar-se o seguinte ensaio à base de célula. A IL-17 pode estimular células epiteliais e outras células para segregar GROa. A capacidade de um anticorpo da invenção para neutralizar a secreção de GROa induzida por IL-17 a partir da linha de células epiteliais de adenocar-cinoma colorrectal humanas HT-29 é testada neste ensaio.

Para testar se a IL-17 humana induzia forma dependente da dose a secreção de GROa pelas células HT-29, IL-17 recombinante (R&D Systems #317-IL-050/CF; reconstituída em PBS de Dulbecco estéril sem Ca2+ e Mg2+ (D-PBS) ) é diluída (para 4.,5 pg/mL; 3X a maior concentração de teste) 116 ΡΕ1963368 em meio de ensaio/cultura (McCoy's 5A (Invitrogen); 10% de FBS (Invitrogen) ; penicilina G (100 U/500 mL) ; e estreptomicina (100 pg/500 mL. A IL-17 é, além disso, diluída de forma seriada (1:5) em meio de ensaio. As várias concentrações de IL-17 (0,096 ng/mL - 1 500 ng/mL; 3,0 pM -46 875 pM) são dispensados (50 pL cada) em poços internos de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos tratada. O meio de ensaio (50 pL) é dispensado em 3 poços para um tratamento "só com meio". O teste é efectuado em triplicado (3 poços por tratamento). A placa contendo IL-17 em meio de ensaio é incubada durante aprox. 60-90 minutos a 37 °C, 5% de CO2, antes da adição de células HT-29.

Para avaliação de um anticorpo da invenção, e.g., o mAb 12 6 com uma região Fc de IgG4, uma concentração de IL-17 que produziu aproximadamente 70% de secreção máxima de GROa a partir das células HT-29 é utilizada (60 ng/mL). A IL-17 humana recombinante (R&D Systems) é diluída (para 240 ng/mL; 4X a concentração de trabalho) em meio de ensaio/cultura. A IL-17 diluída é dispensada (50 pL) em 60 poços internos separados de placas de cultura de tecidos de 96 poços tratadas (Becton Dickinson Falcon #35-3072). O meio de ensaio (50 pL) é dispensado em 3 poços para um tratamento "só com meio".

Um intervalo de dose de um anticorpo da invenção a ser testado é tipicamente de 2,56 -40 000 pM. Numa placa de diluição separada, o anticorpo da invenção e o anticorpo de controlo (estéril, em IX PBS, pH 7,4) são diluídos para 160 000 pM em meio de ensaio. O anticorpo da invenção e 117 ΡΕ1963368 anticorpo de controlo são, além disso, diluidos de forma seriada (1:5) em meio de ensaio. Cada concentração de teste do anticorpo da invenção a ser testado é depois adicionado (50 pL) a poços contendo IL-17. O teste é tipicamente efectuado em triplicado. O meio de ensaio isolado (50 pL) é utilizado para os controlos "só de meio" e "só de IL-17". As placas contendo misturas de IL-17 e anticorpo da invenção são incubadas durante 60-90 minutos a 37 °C, 5% de CO2, antes da adição de células HT-29.

As células HT-29 (células epiteliais de adenocar-cinoma colorrectal humano, ATCC #HTB-38), são mantidas em meio de cultura/ensaio em frascos de cultura de tecidos tratados utilizando técnicas convencionais. As células HT-29 são cultivadas em frascos de cultura de tecidos até se obter 50-80% de confluência no dia do ensaio. No dia do ensaio, as células são lavadas com HBSS (Cambrex #CC-5024) e raspadas dos frascos de cultura com tripsina + EDTA. A tripsina é inactivada com meio de ensaio completo. As células HT-29 são então centrifugadas a 500Xg durante 5 min. a TA. O sedimento de células é depois ressuspendidas em meio de ensaio e 20 000 células HT-29 (em 100 pL) são adicionadas a cada poço de tratamento das placas de 96 poços. Um igual volume de D-PBS é adicionada a cada um dos poços fronteira não utilizados (sem célula) para reduzir efeitos de margem resultantes da evaporação. As placas de 96 poços foram colocadas numa incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% de CO2) durante aproximadamente 48 horas. 118 ΡΕ1963368

No final do ensaio, as placas são centrifugadas (500Xg durante 5 min. À TA), e o meio de cultura de células é transferido para placas de 96 poços de polipropileno. Os niveis de GROa são medidos com uma ELISA sanduíche para GROa (R+D Systems DuoSet #DY275), conforme as instruções do fabricante, excepto para: utilização de meio de ensaio como o diluente convencional, utilizando tampão de lavagem de ELISA IX de BioFX Labs, utilizando uma amostra e volume padrão de 50 pL por poço, utilizando um substrato de BioFX Labs (substrato de HRP, #TMBW-1000-01), e utilizando uma solução de paragem de BioFX Labs (#LSTP-1000-01) (100 pL por poço). No final das reacções ELISA, as placas são lidas a 450 nm num leitor de microplacas. As curvas de calibração para GROa são obtidas efectuando um ajuste logístico de 4-parâmetros. Os valores de GROa (concentração em pg/mL) para as amostras são obtidos a partir das curvas de calibração. A linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 segregou GROa quando estimuladas com IL-17, numa forma dependente da dose (Tabela 5). A IgG4 de controlo humana não causa um decréscimo na secreção de GROa induzida por IL-17. Estes resultados (Tabela 6) demonstram que o mAb 12 6 é capaz de neutralizar completamente a secreção de GROa induzida pela IL-17 humana - a partir de células HT-29 in vitro utilizando as condições descritas. O valor de IC50 para o mAb 126 neste ensaio é de aproximadamente 560 pM. ΡΕ1963368 119

Tabela 5 IL-17 humana (ng/mL) GROa AVG (pg/mL) DP 1 500,00 2 420,4 311,8 300,00 2,047,5 509, 9 60,00 1,556, 0 209, 0 12,00 960,0 24, 9 2,40 502,5 12,3 0,48 297, 9 6, 3 0,10 205, 8 4,8 0 1492 16, 7 Abreviaturas: AVG = média ; DP = Desvio Padrão Tabela 6 mAb 126 controlo negativo IgG4 Anticorpo AVG GROa , DP AVG GROa, pg/mL DP conc., pM pg/mL 40 000,0 123,8 1,4 1 297,3 29,4 8 000,0 134,1 6,4 1 419,9 133,4 1 600,0 151,3 9,5 1 370,4 114,7 320, 0 1 170,6 56,0 1 388,6 54,1 64,0 1 340,8 59,1 1 380,4 36, 0 12,8 1 362,0 21,1 1 346,2 81, 6 2,56 1 280,9 56,1 1 243 4 118,3 0 (só IL-17) 1 201,4 66,1 Só Meio 117,2 10,0 Abreviaturas: conc. = concentração; AVG = média; DP = Desvio padrão. 120 ΡΕ1963368

Exemplo 7 Neutralização In vivo de hIL-17 A IL-17 humana é capaz de se ligar e estimular o receptor de IL-17 de murganho, levando a uma elevação e subsequente secreção da quimiocina KC de murganho (CXCL1). As experiências de intervalo de tempo e dosagem são realizadas para identificar a dose óptima de IL-17 humana e o tempo óptimo para a indução de KC de murganho. Estas experiências indicam que uma dose de 150 pg/kg de IL-17 humana e um tempo de 2 horas pós administração de IL-17 produz niveis máximos de KC no soro de murganho. Os anticorpos completes da presente invenção (e.g., Fab 126 ou Fab 121 com HCVR ligado operacionalmente ao Fc de IgG4 humana, SEQ ID NO:260 [ou SEQ ID NO: 278] e o LCVR ligado operacionalmente a uma região constante kapa humana, SEQ ID NO: 263 [ou SEQ ID NO: 277]) são administrados intravenosamente a murganhos a 1, 10, 100 e 1000 pg/kg, uma hora antes da injecção subcutânea da IL-17 humana. Duas horas após administração de IL-17 humana, os murganhos são sacrificados e os niveis de KC são determinados por ELISA utilizando um estojo ("kit") comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante (KC Quantikine, R&D). Os anticorpos com isotipo correspondente são utilizados como controlos negativos. Os anticorpos bloqueiam a capacidade da IL-17 humana para estimular o receptor de IL-17 de murganho, levando à inibição de uma elevação de KC de murganho, numa forma dependente da dose. 121 ΡΕ1963368 0 Mabl26 (um anticorpo complete compreendendo Fab 126), a uma dose de 20 pg/murganho sob as condições descritas, diminui o nivel médio de KC em aproximadamente quatro vezes em comparação com um anticorpo de controlo que não produzia efeito. O Mab 121, a uma dose de 20 pg/murganho sob as condições descritas, diminui o nivel médio de KC em aproximadamente três vezes em comparação com um anticorpo de controlo.

Exemplo 8 Mapeamento de Epitopo

Dois dos anticorpos anti-IL-17 (Fab 126 e Fab 104) são utilizados para determinar que se humanização e optimização do Fab de murino parental (2321, SEQ ID NOs: 2 61 e 2 62) não altera a capacidade de ligação ao epitopo dos Fabs resultantes da humanização e optimização do parental. Os Fabs humanizados, optimizados ligam-se ao mesmo epitopo como o faz o Fab de murino parental como determinado por uma ELISA de competição convencional ou por troca de H-D e análise de espectrometria de massa para mapeamento de epitopo (ver, e.g., Hoofnagle, A., et al., Methods Mol. Biol. 250:283-298, 2004; Hoofnagle, A., et al. , Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct, 32:1-25, 2003; Baerga-Ortiz, A., et ai., Protein Sei 11:1300-8, 2002) deste modo, espera-se que os Fabs 1-132 da invenção derivados do mesmo Fab parental, se liguem ao mesmo epitopo. 122 ΡΕ1963368

Utilizando a troca de H-D e o ensaio de espectrometria de massa (H/DXMS) para mapear o epitopo, é determinado que os aminoácidos entre 80 e 89 [ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 266)] da IL-17 humana (SEQ ID NO: 1) estão compreendidos no epitopo descontinuo ao qual os anticorpos da invenção se ligam. A DGNVDYH (SEQ ID NO: 267) é uma sequência essencial compreendida no epitopo descontinuo ao qual os anticorpos da invenção se ligam com base na comparação da variação da sequência de IL-17 entre diferentes espécies e da capacidade de ligação. A alteração da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267 no contexto de toda a sequência IL-17, resulta em ligação não detectável à IL-17 alterada por um anticorpo da invenção. Os anticorpos da invenção não se ligam a IL-17 de rato ou murganho em niveis superiores ao do anticorpo de controlo. O ensaio de H/DXMS é utilizado para identificar as regiões de IL-17 a que os anticorpos da invenção se ligam. A taxa da velocidade de troca de hidrogénio de amida é dependente da estrutura e acessibilidade do solvente do hidrogénio da amida. O IL-17 livre ou o complexo de IL-17: anticorpo em água é misturado com água deuterada (D2O) para permitir a troca de protões de amida por deutério. Os grupos amida da estrutura que participam na ligação da proteina são protegidos da troca e permanecem protonados. Estas regiões são então identificadas por proteólise péptica, acoplada com LC e espectrometria de massa por ionização por electrospray. A IL-17 humana contendo uma His 123 ΡΕ1963368 e Flag tag C-terminal (IL-17-Flis) é expressa e purificada a partir de células GS-CHO utilizando uma coluna IMAC. Duas aliquotas de 10 pg (7,7 pL) da solução de IL-17-Flis são transferidas para 2 Microcon, e 100 pg de mAb 104 ou mAb 126 (proporção molar de IL-17/Mab = 1/2) é adicionado no Microcon. Vinte pg de solução de IL-17-Flis são transferidos para outro Microcon e sem adição de anticorpo. Depois, é adicionado tampão PBS IX em cada Microcon para um volume final de -180 pL e centrifugadas a 14 OOOg durante 14 min. Depois são adicionados 150 mL de tampão PBS lx em cada Microcon e centrifugadas a 14 OOOg durante 14 min. Estes passos são necessários para assegurar que o antigénio livre e o complexo de antigénio:anticorpo estão em condições de tampão idênticas. A porção de proteina é recolhida e o volume final é ajustado para 50 pL (complexo) ou 80 pL (IL-17-Flis apenas) com lxPBS. Seis microlitros de IL-17-Flis ou complexo de IL-17-Flis e complexo mAb são transferidos para um microtubo de plástico, e 14 pL de 100% de D20 são adicionados, resultando em 70% de D20 na amostra. A solução é incubada à temperatura ambiente durante 10 min. A troca é imediatamente interrompida, digerida por adição de 20 pL de 1% de ácido fórmico e 2 pL de 2 mg/mL de solução de pepsina, e incubada à temperatura ambiente durante 30 s ou a 0 °C durante 10 min. O digerido é imediatamente injectado numa coluna manualmente. São utilizados Waters 2795 HPLC e Micromassa LTC Premier para todos os ensaios. A corrente de 124 ΡΕ1963368 HPLC a partir da bomba de HPLC é ligada a um tubo de metal (cerca de 1 mL), ao injector manual, a uma coluna Zorbax C18 (2,1 x 50 mm) que migra sob estas condições (Temperatura da Coluna: 0 °C; Fase Móvel C: 0,15%de ácido fórmico em H20, D: 0,12% ácido fórmico em ACN; Tempo de Corrida:23 min). A coluna é equilibrada com 98% de A (0,15% de solução aquosa de ácido fórmico) e 2% de B (0,12% de ácido fórmico em acetonitrilo) a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. Uma eluição de gradiente é realizada de 2% a 10% de B durante 0,5 min, depois para 40% de B durante 14,5 min, depois para 90% de B durante 1 min com 2 min de espera, e depois voltou para 2% de B em 1 min.). A amostra de HPLC é analisada pelo espectrómetro de massa operado com estas condições (Modo de Ião: Positivo; Intervalo de Varrimento de Massa: 300-2000; Voltagem no Cone de Amostra: 80; Fluxo de Gás de Dessolvatação (L/Hr):700; Temp de Dessolvatação: 300 °C) . O tubo de metal, ansa injectora e a coluna são submergidos em água com gelo ao longo do ensaio. O espectro de massa de cada péptido péptico de IL- 17 é obtido após troca H/D com ou sem um mAb anti-IL-17 testado. Para péptidos pequenos, a massa média de cada péptido é calculada com base nos seus iões isotópicos e intensidades. Para péptidos maiores, as massas médias são obtidas a partir do espectro de massa desconvoluído após calibração interna.

Quando o anticorpo forma um complexo com IL-17, a região de ligação (epitopo) de IL-17 é protegida do sol- 125 ΡΕ1963368 vente. Isto leva a taxas mais lentas de troca amida de hidrogénio em comparação com os de IL-17 isolados. Comparando a massa de péptidos do livre e do complexo após troca de deutério, os péptidos protegidos pela formação do complexo devem ser diferentes dos péptidos correspondentes na IL-17 livre. A Tabela 7 a seguir lista as diferenças de massa gue são obtidas por H/DXMS para péptidos pécticos de IL-17. Estes péptidos pécticos cobrem toda a sequência de IL-17-Flis. Como os dados da Tabela demonstram, a diferença de massa do péptido IL-17-Flis entre o complexo e si mesmo é semelhante para ambos os anticorpos testados, i.e. estes ligam-se ao mesmo epitopo. Uma principal diferença de massa é encontrada para o péptido péctico 24-87+117-133 (i.e., os aminoácidos 24 a 87 e 117 a 133 de IL- 17) (estes dois péptidos são conectados através de ligação persulfureto) e 66-87+117-134, sugerindo que os residuos nestas regiões são envolvidos na ligação. Uma vez que estes péptidos pécticos são bastantes grandes, são necessárias outras digestões enzimáticas para encurtar os residuos de aminoácidos específicos envolvidos na ligação. Em adição a estes dados, os anticorpos da invenção não se ligam a outro membro da família de IL-17 (IL-17 B,C,D,E, e F) e estas também não se ligam a IL-17 de murganho ou de rato. Estes dados em conjunto com comparação de sequências e exame do modelo de homologia estrutural de IL-17 sugere que os resíduos 80-89 estão compreendidos num epitopo não linear de IL-17 ao qual se ligam os anticorpos da invenção. ΡΕ1963368 126

Tabela 7 péptido péctico de IL-17-Flis apenas a partir da média da massa do péptido correspondente do complexo IL-17-Flis e anticorpo. * este dado é de uma digestão de 10 min a 0 °C (n=l) . Todas as outras são de digestão ambiente durante 0,5 min. Péptido péptico IL-17-Flis+mAbl04 IL-17-Flis+mAbl26 Média (n=3) DP Média (n=3) DP 1-23+98-116 -0,36 0,61 -0,78 0,59 24-43 -0,79 0,13 -0,44 0,65 27-42 -0,56 0,17 -0,56 0,38 24-65 -1,32 0,54 -1,17 0,19 54 a 65 -0,17 0,37 -0,53 0,25 24-87+117-133 -3,60 0,38 -4,09 0,29 66-87+117-134* -1,94 -2,38 88-97 -0,30 0,8 -0,29 0,14 11-116 -0,08 0,07 -0,17 0,08 135-151 -0,14 0,03 -0,12 0,12 Nota: delta Massa é obtido por subtracção de uma massa média de

Exemplo 9 Expressão de IL-17 em Tecidos de Cancro Vários lisados de células não cancerosas e cancerosas humanas são testados para a presença de proteina IL-17. Os tecidos (aproximadamente 50-100 mg por pedaço) são congelados em gelo seco, descongelados em gelo e lisado em 350 pL de tampão TPER (Pierce #78510) incluindo inibidores de protease (Pierce #78410) e inibidores de 127 ΡΕ1963368 fosfatase em tubos contendo esferas de lise de cerâmica (Qbiogene #6913-050; 1,4 mm de esferas de cerâmica em tubos de 2,0 mL) . Os tubos são colocados em gelo durante 5-10 min, depois centrifugadas a 13 000 x gravidade durante 10 min a 4 °C e o material transferido para tubos novos para remover os residuos. Recentrifugar como descrito e transferir para novo tubo. A concentração de proteina é determinada utilizando um método padrão de BSA. As amostras são analisadas para IL-17 utilizando um estojo ("kit") comercial de ELISA para IL-17 de acordo com as instruções do fabricante (R&D #DY317 utilizando tampão de lavagem, solução de substrato e solução de paragem de BioFX Labs). Os niveis de IL-17 são normalizados para a concentração de proteina total. Os niveis de IL-17 são aumentados entre duas e três vezes em tecido do cólon canceroso (60 amostras testadas) em comparação com o tecido normal do cólon (63 amostras testadas). Os níveis de IL-17 são aumentados em média três a quatro vezes em tecido de rim canceroso (21 amostras testadas) em comparação com tecido normal de rim (21 amostras testadas). Os niveis de IL-17 em tecido da próstata canceroso (44 amostras testadas) são amentados em comparação com o tecido normal da próstata (7 amostras testadas). Os niveis de IL-17 não foram elevados em outros tipos de tecido de tumor testado incluindo mama, pescoço, pulmão, laringe, tiróide, língua, ovário e cérebro.

Exemplo 10 Activação de Células da Microglia por IL-17 A IL-17 induz a secreção por uma linha de células 128 ΡΕ1963368 da microglia do cérebro de murino (BV-2) de IFN e IL-12p70. A linha de células da microglia de murino BV-2 [obtida por Seios, com permissão de Elisabeta Blasi (Microbiology University of Perugia, Itália) que as isolou originalmente (E. Blasi et al., J. Immunology 1990, 27:229-237)] é cultivada em frascos de cultura de tecidos revestidos com poli-D-lisina, até não mais do que 60% de confluência em DMEM rico em glicose (Invitrogen #31053-028) com 2 mM de L-glutamina (Invitrogen/GIBCO #25030-081), 10% de FBS (inactivado pelo calor; Invitrogen/GIBCO #10082-147), 1 mM de piruvato de sódio (Invitrogen/GIBCO #11360-070), 100 pg/mL de Normocina (InvivoGen) a 37 °C, 5% de CO2.

No dia 0 do ensaio, as células BV-2 são lavads (PBS de Dulbecco sem Ca2+ e Mg2+; Invitrogen) , raspadas (0,25% de tripsina + EDTA) seguidas por inactivação por tripsina e depois centrifugadas (500Xg 5 min. a TA) . O precipitado de células resultante é ressuspenso numa densidade de células de ~7 000 células/100 pL de meio de cultura. 100 pL da suspensão de células são dispensados em 60 poços internos separados de placas de 96 poços de cultura de tecidos tratadas revestidas com poli-D-lisina. As placas são incubadas como descrito, durante aprox. 48 h antes do tratamento com IL-17.

No dia 2 do ensaio, IL-17 de murganho recombi-nante (mIL-17) (sem veiculo; R&D Systems); reconstituída em PBS de Dulbecco estéril sem Ca2+ e Mg2+ são diluídos numa placa de polipropileno para 1,5 pg/mL (a maior concentração 129 ΡΕ1963368 de teste) em meio de cultura. A IL-17 de murganho é, além disso, diluida em série na placa de polipropileno. Um controlo positivo é LPS diluido em meio de cultura para 1 pg/mL (a maior concentração de teste). 0 meio do ensaio é utilizado como um controlo negativo. 0 meio é suavemente aspirado das células, antes de adicionar os tratamentos (150 pL/poço) . O teste é realizado em triplicado (3 poços por tratamento). As placas separadas replicadas são incubadas durante 24 hr. ou 48 hr. a 37 °C, 5% de CO2.

Nos dias 3 e dia 4 do ensaio, as placas são centrifugadas (500Xg durante 5 min. TA), depois o meio da cultura de células é transferido para placas de propileno de 96 poços, que são selados e congelados (-80 °C) . As amostras de meio são descongeladas e ensaiadas para os níveis de citoquina e quimiocina com um estojo ("kit") murino 22-plex multiplex (Linco), conforme as instruções do fabricante (excepto: um placa de filtro de policarbonato de parede preta (Millipore) substitui a placa de filtro incluída no estojo ("kit")). A fluorescência é lida num instrumento Luminex® (50 esferas por conjunto de esferas, marcação de baixo ganho de RP1). Os dados são apresentados na Tabela 8 a seguir.

As curvas padrão são obtidas utilizando um ajuste logístico de quatro ou cinco parâmetros. Os valores de IFNy e IL-12p70 (pg/mL) são determinados a partir das curvas padrão utilizando técnicas estatísticas convencionais. ΡΕ1963368 130

Tabela 8 24 horas após tratamento com IL-17 Cone. de mIL-17, IFNy média IL-12p70 média pg/mL pg/mL pg/mL 1,5 125,87 65,58 0,375 123,89 59,63 0, 0938 125,61 67,87 0,0059 58, 91 38,12 0,0015 18,78 12,34 só meio de controlo abaixo do limite de abaixo do limite de detecção detecção LPS, 1 pg/mL 5,11 51,11 LPS, 0,25 pg/mL 5,07 49,00 48 horas após tratamento com IL-17 Cone. de mIL-17, IFNy média IL-12p70 média pg/mL pg/mL pg/mL LO \—1 134,38 61,48 0,375 124,99 58,65 0, 0938 119,96 58,15 0,0059 47, 07 27,87 0,0015 13,97 9,44 só meio de controlo abaixo do limite de abaixo do limite de detecção detecção LPS, 1 pg/mL 5,20 46,37 LPS, 0,25 pg/mL 4,30 36,36 131 ΡΕ1963368

Exemplo 11 Modelo de indução de DSS do Distúrbio do Intestino Irritável IBD é uma doença inflamatória crónica que inclui a doença de Crohn e a Colite Ulcerativa. Os níveis de proteína IL- 17 são significativamente elevados no soro e nos tecidos do cólon de doentes com colite ulcerativa e doença de Crohn. Contudo, IL-17 não é detectável no soro de indivíduos normais, ou doentes com colite infecciosa ou colite isquémica. 0 modelo DSS (Dextrano Sulfato de Sódio) é um dos mais antigos e mais representativos modelos pré-clínicos para a doença do intestino irritável (IBD). No modelo DSS (ver, e.g., FASEB Journal. 2004;18:1550-1552) as lesões inflamatórias agudas e crónicas são induzidas. Os murganhos têm um elevado grau de uniformidade das lesões com perda de peso corporal e de comprimento do cólon. É reprodutível no que respeita à duração e gravidade entre os murganhos individuais. Para a indução de doença, os murganhos recebem 5% de DSS 30-40 Kd) na água de beber durante 7 dias. O índice de Actividade de Doença (DAI) incluindo a hemorragia hemoculta positiva ou rectal, fezes soltas e perda de peso corporal (5-8%) é observado por volta do dia 8. Os pesos corporais dos murganhos são monitorizados todos os dias durante 2 semanas. Os murganhos são sacrificados cerca de dia 12 a cerca do dia 15. A proteína IL-17 é significativamente aumentada no cólon tratado com DSS versus o cólon naíve. O tratamento com anticorpo para IL-17 pode reduzir índice de actividade de doença. 132 ΡΕ1963368

Exemplo 12 Modelo EAE para Esclerose Múltipla A EAE é uma doença desmielinante mediada por células T CD4+ do sistema nervoso central (SNC) que serve como um modelo para MS em humanos. Os mecanismos pato-génicos do desenvolvimento de EAE incluem a activação de células T especificas para o antigénio e diferenciação de Thl seguida por infiltração de células T e macrófagos no SNC. A IL-17 contribui para a patologia da esclerose múltipla (MS) . A análise de microarray de lesões de MS de doentes humanos demonstrou um aumento de IL-17 (Lock, et al. Nat. Med. 8:500-508, 2002). O mRNA que expressa IL-17 de células mononucleares (MNC) no sangue e fluido cérebro-espinal são significativamente elevados em número em doentes com MS e foram detectados números elevados do mRNA que expressa IL-17 em MNC do sangue durante a exacerbação clinica de MS em comparação com remissão (Matusevicius, et al. Multiple Sclerosis. 5:1-1-104, 1999). A EAE é significativamente suprimida em murganhos sem IL-17 (Nakae et al., J. Immun. 171:6173-6177). O exemplo aqui descrito demonstra que a proteína IL-17 é aumentada na espinal medula de murganhos EAE e o tratamento com um anticorpo anti-IL-17 de murino reduz a classificação de EAE no modelo activo de EAE. Para a indução da doença, murganhos fêmea de 8-9 semanas de idade C57BL/6 são subcutaneamente imunizados no dia 0 com (i) 200 pL de 5 mg/mL de toxina pertussis (PT) e Adjuvante Completo de Freund (CFA) ou (ii) PT, CFA e 300 pg/200 pL de 133 ΡΕ1963368 MOG35-55 (glicoproteína de oligodendrócito de mielina emulsificada em CFA contendo 5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis inactivada pelo calor) . No dia 2, os murganhos são tratados de novo com PT. Os murganhos são classificados ao longo do estudo para niveis de parálise. Espera-se a doença no grupo que recebeu MOG. Um anticorpo monoclonal IgGl anti-IL-17 de murino de rato ou anticorpo controlo de isotipo é administrado a murganhos nos dias 1, 7 e 15 (BD Biosciences para anticorpo anti-IL-17 de murino de rato) . Os murganhos que receberam MOG são sacrificados quando a classificação clinica atinge entre 1-3 (numa escala de 0-4); isto é entre os dias 14-31 para o estudo 1 na Tabela 9 a seguir e entre os dias 14-16 para o estudo 2 na Tabela 10 a seguir. Os sinais clinicos de doença desenvolveram-se por volta do dia 10. Os animais individuais são subjectivamente classificados por pelo menos 2 classificadores independentemente e cegos para a identidade dos grupos de tratamento de acordo com a gravidade clinica da doença do SNC. Grau 0 é normal; Grau 1 é cauda completamente mole; Grade 2 é fraqueza do membro traseiro parcial unilateral; Grau 3 é parálise completa do membro traseiro; e Grau 4 é moribundo, (ver J. Exp. Med. 194: 873-881, 2001). Um murganho controlo é sacrificado no mesmo dia dos murganhos tratados com MOG. As medulas espinais são isoladas na altura do sacrifício e imediatamente congeladas para serem utilizadas para análise da proteína IL-17 por ELISA. O grupo de tratamento com o anticorpo para IL-17 tem significativamente menos classificação de doença em comparação com o grupo de controlo de isotipo. 134 ΡΕ1963368

Os lisados de cada medula espinal completa são feitos em 1 mL (estudo 1 na Tabela 9 a seguir) ou 0,4 mL (estudo 2 na Tabela 7 a seguir) de reagente de extracção de proteína TPER (Pierce #78510) com inibidores totais de protease (Roche Applied Science #11697498), em tubos de 2 mL contendo esferas de cerâmica (matriz de lise D, QBiogene #6913050), e instrumento FastPrep (BiolOl) durante 30 segundos numa escala de 5,5. Após a lise, as amostras são centrifugadas (5 min. a 14 000 rpm numa microcentrífuga) para remover os resíduos. Os sobrenadantes são transferidos para novos tubos de microcentrífuga. A concentração de proteína total em cada lisado é determinada com um estojo ("kit") de ensaio de proteína BCA (Pierce #23225), utilizando o protocolo da microplaca do fabricante. Os lisados são congelados e armazenados a -80 °C.

Após descongelar os lisados em gelo, e clarificar por centrifugação, os níveis de IL-17 de murganho são medidos em amostras não diluídas por ELISA (R&D Quantikine #M1700) conforme as instruções do fabricante. As curvas padrão são obtidas utilizando um adaptador logístico de quatro parâmetros. Os valores de IL-17 são determinados a partir das curvas padrão utilizando técnicas estatísticas convencionais. Os níveis de IL-17 são normalizados para a concentração de proteína em cada amostra e expressos como pg de IL-17/mL de proteína total em cada lisado nas Tabelas 9 e 10 a seguir. Como demonstrado pelos dados nas Tabelas, os níveis aumentados de IL-17 foram detectados em murganhos EAE. ΡΕ1963368 135

Tabela 9 ESTUDO 1 GRUPO INTERVALO DE VALORES DE mIL-17 pg/mg mIL-17 MÉDIO (pg/mg) (±EP) INTERVALO DE CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS NO SACRIFÍCIO CLASS. CLIN. MÉDIA NO SACRIFÍCIO (±EP) Naíve (n=7) 3,63-10,06 5,1910,87 N/A N/A CFA (n=14) 3,16-7,51 4,3110,33 N/A N/A CFA+MOG (n=14) 4,12-16,62 8,5711,01 0,9-3,0 1,7410,20 Todos os valores de ELISA de IL-17 estavam no intervalo de detecção da ELISA., média de duplicados

Tabela 10 ESTUDO 2 GRUPO INTERVALO DE VALORES DE mIL-17 pg/mg mIL-17 MÉDIO (pg/mg) (1EP) INTERVALO DE CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS NO SACRIFÍCIO CLASS. CL IN. MÉDIA NO SACRIFÍCIO (±EP) CFA (n=6) 1,88-2,78 2,2410,14 N/A N/A CFA1MOG (n=8) 1,78-5,42 3,3410,45 2,75-3,20 2,9410,06 Todos os detecção valores de ELISA de IL-17 estavam no da ELISA., média dos duplicados intervalo de ΡΕ1963368 136

Exemplo 13 Modelo de artrite induzido por Cola- génio A artrite induzida por colagénio (CIA) é um modelo de roedor vastamente utilizado para a artrite reumatóide ("RA") e possui caracteristicas histopatológicas em comum com a RA humana. A artrite experimental, induzida em murganhos DBA/1 por imunização e reforço com emulsões de colagénio do tipo II, é uma doença poliartrítica caracteri-zada por inflamação das pequenas articulações e erosão progressiva da cartilagem e osso (Trentham, D, et al, J. Exp. Med. 146:857-858, 1977). Recentemente, Lubberts, et al, (Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004; aqui incorporado) demonstrou que o anticorpo policlonal anti-IL-17 de murino de coelho, administrado no inicio ou num estádio mais avançado da CIA de murino, melhorou os sinais clínicos de artrite.

No modelo CIA, os murganhos a que foi dado um injecção única do mAb IgG2a anti-IL-17 de murino de rato intraperitonealmente (8 mg/kg R&D, MAB421 clone 50104.11) apresentam classificações clínicas significativamente inferiores às dos murganhos injectadas com 16 mg/kg de

IgG2a de rato de controlo. O reagente de forma aguda, proteína C reactiva (CRP), é um índice de forma semelhante a CRP, a proteína amiloide do soro de murino (SAP) serve como um indicador de doença no modelo CIA de murino 137 ΡΕ1963368 (Bliven, M., et al, Arthritis & Rheumatism, 29:1131-1138, 1986) . Em animais tratados com 8 mg/kg de anti-IL-17 de murino, os niveis de SAP foram significativamente inferiores aos dos tratados com anticorpo de controlo, além disso, a diminuição nas classificações clinicas e valores de SAP são comparáveis a um grupo anti-IL-Ιβ de murganho (8 mg/kg) utilizado como um controlo positivo. Finalmente, a significativa redução na inflamação sinovial a 8 mg/kg de anticorpo e reabsorção de osso a 16 mg/kg de anticorpo está presente em comparação com a de murganhos tratados com anticorpo de controlo. Pode ser conduzido um estudo de resposta a dose no modelo CIA com anticorpo anti-IL-17 de murino (e.g., a 0,1, 1 e 8 mg/kg). As classificações clinicas para apresentação de anti-IL-17 de murino de rato apresenta uma tendência de resposta a dose. Um ensaio semelhante pode ser efectuado em macacos cinomólogos como um modelo para RA, utilizando um anticorpo da invenção.

Exemplo 14 Purificação do mAb Anti-IL-17

Um vector que expressa um mAb da invenção é estavelmente incorporado numa célula hospedeira apropriada, (e.g., células CHO DG44 (dhfr-) (Chasin) ou células NS) utilizando procedimentos convencionais e purificado utilizando uma coluna de afinidade para a Proteína A. Resumidamente, o meio condicionado clarificado é aplicado a uma coluna de 5 mL de HiTrap rProtein A Sepharose FF (Amersham Biosciences) que tinha sido equilibrada com PBS (pH 7,4) . A coluna é lavada com 5 volumes de coluna de 138 ΡΕ1963368 tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 110 cm/hr para arrastar para fora componentes de ligação não específicos. O anticorpo ligado é eluído utilizando um gradiente linear de pH (0,1 M de tampão de fosfato de sódio, pH 6,8 a 0,1 M tampão de citrato de sódio pH 2,5) . O pico principal de proteína na eluição é recolhido e o seu pH é ajustado para a neutralidade com 1 M de tampão Tris (pH 8,5) . A mistura de proteína é concentrada para 1-2 mg/mL utilizando membrana 10K Vivaspin (Vivasciences) e filtrado de forma estéril (0,45 pm) antes do armazenamento a 4 °C.

Para grandes preparações de um mAb da invenção, o concentrado isento de células é purificado em três colunas de cromatografia sequenciais (cromatografia de Proteína A, Troca Iónica, e de Interacção Hidrofóbica). A pureza do mAb após estes passos de cromatografia é superior a 99% conforme avaliado por cromatografia analítica de exclusão de tamanho. O mAb é trocado num tampão como listado a seguir dependendo da concentração do anticorpo. Os resultados de estabilidade química indicam um pH preferido entre 6,0 e 7,0 (inclusive); embora para preparações de 20 mg/mL, o pH possa estar entre 5,5 e 7,0 (inclusive, e.g., 5,5, LO 5,7,, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6, 2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6 6,7, co 6,9 ou 7,0). Para o produto liofilizado,

preferido um nível de cloreto de sódio de 90-30 mM (90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou 30 mM ou qualquer valor entre 30 e 90 mM) , enquanto para uma formulação líquida (e.g., para ser administrada subcutaneamente) é preferido um nível de cloreto de sódio de 100 - 150 mM 139 ΡΕ1963368 (100, 110, 120, 130, 140, ou 150 mM ou qualquer valor entre 100 e 150 mM) . O produto é depois concentrado para uma concentração final de 20 ou 25 mg/mL (alternativamente maior, 30, 40, 50, 60, 70, superior) e filtrado de forma estéril. O produto filtrado pode ser imediatamente congelado a -70°C ou pode ser liofilizadoO. Uma proporção de peso minima de 1:2 de anticorpo para lipoprotector, (e.g., sacarose ou trealose) é necessária para a formulação liofilizada estável mas não é necessária para uma formulação liquida. Adicionalmente, 0,02% de tensioactivo (p/v), i.e., polissorbato-80, é adicionado para as formulações em solução e para as soluções a ser liofilizadas. O material liofilizado é ressuspenso em Água estéril para Injecção ou cloreto de sódio a 0,9% antes da administração.

Tabela 11 cone. de mAb Tampão pH NaCl (mM) 10 mg/mL citrato a 10 mM (Na) 6, 0 30, 50-150 20 mg/mL citrato a 10 mM 5,5 50-150 20 mg/mL citrato a 10 mM 6, 0 50-150 20 mg/mL citrato a 10 mM 6, 5 50-150 20 mg/mL citrato a 10 mM 7,0 50-150 20 mg/mL histidina a 10 mM LO ÁO 150 >50 mg/mL citrato a 10 mM 5,5 50-150 >50 mg/mL citrato a 10 mM 6, 0 50-150 >50 mg/mL citrato a 10 mM 6, 5 50-150 >50 mg/mL histidina & 10 mM 6, 5 150 140 ΡΕ1963368

Exemplo 15

Semi-vida de Anticorpo in vivo A farmacocinética no soro dos anticorpos da invenção (e.g., mAb 126 e 121 [região Fc de IgG4 com Fab 126 ou 121 respectivamente]) é determinada após administração intravenosa ou subcutânea em macacos machos cinomólogos. As concentrações dos anticorpos no soro são determinados utilizando um ensaio de ELISA de captura de antigénio padrão em que as placas são revestidas com IL-17 humana e o anticorpo do soro ligado é detectado utilizando um anticorpo anti-IgG4 secundário. Após administração intravenosa de 1 mg/kg, mAb 126 é eliminado com uma semi-vida média de 6,5 dias e o mAb 121 é eliminado com uma semi-vida média de cerca de 11 dias. Após administração subcutânea de 1 mg/kg, o mAb 12 6 possui uma semi-vida de eliminação média de 10,3 dias e o mAb 121 possui uma semi-vida de eliminação média de 13 dias.

Exemplo 16 Modelo de Xenoenxerto de Tumor

Para estabelecer quais os modelos de xenoenxerto de tumor com para testar a actividade anti-tumoral de anticorpos anti-IL-17 da invenção, 5 milhões de células de carcinoma colorrectal HCT116 são misturadas com Matrigel e subcutaneamente injectadas no flanco esquerdo de um murganho fêmea de 56 semanas de idade atimico (nu/nu) murganhos (Charles River laboratories, Wilmington. MA). Os 141 ΡΕ1963368 murganhos são tratados por injecção subcutânea em cada 7 dias com anticorpos de controlo (e.g., IgG4 humana e IgGl de murganho), 4 mg/kg de anti-IL-17 humana, 8 mg/kg de anti-IL-17 de murganho, ou combinação de 4 mg/kg de anti-IL-17 humana e 8 mg/kg anti-IL-17 de murganho durante 4 semanas. A primeira administração de anticorpo começa um dia antes do implante das células. Os tumores são medidos duas vezes em cada semana com um paquimetro e o peso corporal é monitorizada duas vezes por semana. 0 plasma é recolhido de cada murganho ao dia 34 e os niveis de KC são medidos utilizando um estojo ("kit") KC ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D System). Em comparação com murganhos controlo injectados com IgG, os murganhos tratados com a combinação de anticorpo anti-IL-17 humana e anticorpo anti-IL-17 de murganho reduziram significativamente o volume de tumor. Para além disso, os murganhos tratados com ambos o anticorpo anti-IL-17 humana e anticorpo anti-IL-17 de murganho diminuíram dramaticamente a KC no plasma. Os murganhos tratados com 4 mg/kg de anticorpo anti-IL-17 humana ou 8 mg/kg de anticorpo anti-IL-17 de murganho não revelaram redução significativa no volume de tumores e níveis de KC no plasma. Os dados são aqui apresentados nas Tabelas 12 e 13.

Para medir o nível de IL17 nos tumores, os tumores de modelos de xenoenxerto de murganho são vastamente preparados como descrito no Exemplo 9. Para a medição de proteína, os lisados de tumor são diluídos 1:10 em TPER + IX Halt numa placa de propileno de diluição de 96 poços. A 142 ΡΕ1963368 concentração de proteína é determinada utilizando o protocolo do Coomassie Plus Protein Assay (Pierce #23236) em microplaca. 0 padrão de BSA é diluído em TPER + Halt. Os níveis de proteína de IL-17 são determinados utilizando estojos ("kits") ELISA para IL-17 humana e de murganho de R&D System de acordo com as instruções do fabricante (human IL-17 DuoSet ELISA, R+D Systems, Cat. #DY317; mouse IL-17 ELISA, R+D System, Cat. # 421) . A IL-17 humana e de murganho foram aumentadas em tumores de modelos de xenoenxerto de tumor do cólon HCT 116 e HT29 em comparação com o modelo de xenoenxerto de tumor de pulmão H460.

Tabela 12 Volume de Tumor

(n=10) Tempo, dias IgGl de rato+controlos Anti IL-17 de murganho (pós implante das de isotipo IgG4 humana + anti-IL-17 humana células HT116) (Média+EP) (Média+EP) 8 101,4+6,7 91,5+9,4 14 149,2±9,2 123,9+16,2 17 162,1112,4 134,6114,7 20 177,7117,1 152,8118,7 24 279,2122,8 222,4135,4 28 323,3122,5 244,6132,8 31 405,8133,4 275,1136,6 34 537,7+50,7 339,8+46,3 Volume de tumor é calculado utilizando o LogVol, método AR 143 ΡΕ1963368

Tabela 13 Níveis de Quimiocina KC no Plasma 35 dias pós- implante INTERVALO DE KC médio, GRUPO VALORES DE KC, pg/mL pg/mL (±EP) IgGl de Rato + controlos do isotipo IgG4 humano 76,3-168,4 112,5±10,0 Anti IL-17 de murganho + 55,6-110,5 84,7±5,7 anti-IL-17 humana PERCENTAGEM MÉDIA DA DIFERENÇA DE KC (grupo anti-IL-17 comparado com o grupo de controlo de isotipo): 24,7%

Lisboa, 7 de Setembro de 2011

Claims

ΡΕ1963368 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal anti-IL- 17 humanizado em que o referido anticorpo compreende: a) um péptido com SEQ ID N° 131 em CDRL1, b) um péptido com SEQ ID N° 167 em CDRL2, c) um péptido com SEQ ID N° 168 em CDRL3, d) um péptido com SEQ ID N° 26 em CDRH1, e) um péptido com SEQ ID N° 52 em CDRH3
2. Anticorpo monoclonal anti-IL-17 de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo compreende um LCVR com SEQ ID N° 241 e um HCVR som DEQ ID N° 118.
3. Um anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, um anticorpo substancialmente intacto, um fragmento Fab, um F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia única.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o anticorpo compreende ainda uma região constante de cadeia pesada seleccionada a partir de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM e IgD.
5. Composição compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e em que a 2 ΡΕ1963368 referida composição compreende ainda um veiculo farmaceu-ticamente aceitável.
6. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, para utilização como medicamento.
7. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, para utilização no tratamento de um ou mais estados seleccionados a partir de artrite reumatóide, distúrbio inflamatório da bexiga, psoriase e esclerose múltipla. Lisboa, 7 de Setembro de 2011