ES2389780T7

ES2389780T7 - Anticuerpos anti-IL-17

Info

Publication number: ES2389780T7
Application number: ES06846464T
Authority: ES
Inventors: Barrett Allan; Chi-Kin Chow; Lihua Huang; Ling Liu; Jirong Lu; Kingman Ng; Jonathan Wendell Tetreault; Andrew Gordon Werner
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2021-01-14
Also published as: AU2006325860B2; NO340827B1; EP3366702B1; HRP20180941T1; EA014298B1; EP1963368A1; EP3808769A1; US20110027290A1; CA2631938A1; CY1113097T1; ES2389780T3; EP2481753B1; CY2016030I1; NO2017044I2; CN101326195B; SI1963368T1; BRPI0619792B1; EP1963368B3; KR20080068122A; LTPA2016026I1

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-IL-17

Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de la medicina, en particular en el campo de anticuerpos monoclonales contra IL-17 humana. La invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-IL-17 que se unen con afinidad elevada a un epítope antigénico no lineal o conformacional de IL-17 que comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276). Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos, inmunoconjugados de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y son útiles como medicamento para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios, inflamatorios, de proliferación celular y de desarrollo.

Antecedentes de la invención

La familia de citocinas IL-17 incluye actualmente IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E y IL-17F. Todos los miembros de la familia IL-17 tienen cuatro restos de cisteína altamente conservados que están implicados en la formación de enlaces disulfuro intracatenarios y tienen dos o más restos de cisteína que pueden estar implicados en los enlaces disulfuro intracatenarios. Los miembros de la familia IL-17 no tienen similitud de secuencia con cualesquiera otras citocinas conocidas. No obstante, se encontró un homólogo viral de IL-17A en el marco de lectura abierto 13 de herpesvirus saimiri (Yao, Z. y col., Immunity, 3:811, 1995) y tiene el 72 % de identidad de restos de aminoácidos con la IL-17A humana. Se ha informado de múltiples funciones de los miembros de la familia IL-17 que implican en su mayor parte la regulación de la respuesta inmunitaria.

La interleucina 17 (IL-17, también denominada IL-17A) es una glucoproteína homodimérica de 20-30kD producida predominantemente por linfocitos T CD4+ activados y funciona como una citocina proinflamatoria. Cuando un miembro particular de la familia IL-17 se denomina sencillamente "IL-17," se entiende que el miembro de la familia al que se hace referencia es a la IL-17A. La IL-17 es segregada por linfocitos T activados en sitios de inflamación, no en la circulación sistémica. La IL-17 se une a un receptor transmembrana de tipo I denominado IL-17R, que es una proteína grande expresada de forma ubicua que no muestra similitud de secuencia significativa con otros receptores de citocinas conocidos. La IL-17 tiene múltiples propiedades biológicas que incluyen la regulación al alza de moléculas de adhesión e induce la producción de múltiples citocinas y quimiolinas inflamatorias de diversos tipos celulares, incluidos sinoviocitos, condrocitos, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales, queratinocitos y macrófagos. Además, la IL-17 induce el reclutamiento de neutrófilos en un sitio de inflamación mediante la inducción de la liberación de quimiocinas, estimula la producción de prostaglandinas y metaloproteinasas e inhibe la síntesis de proteoglicanos. Además, la IL-17 tiene un papel importante en la maduración de células progenitoras hematopoyéticas. Se ha demostrado que la IL-17 tiene papeles señalizadores en diferentes órganos y tejidos que incluyen pulmón, cartílago articular, hueso, cerebro, células hematopoyéticas, riñón, piel e intestino. Para una revisión de la bioactividad de IL-17 véase, por ejemplo, Kolls y Linden, Immunity 21:467-476, 2004, o Fossiez y col. Int. Rev. Immunol. 16:541, 1998.

Los niveles aumentados de IL-17 (es decir, IL-17A) se han asociado con diversas afecciones, enfermedades o trastornos que incluyen inflamación de vías aéreas, artritis reumatoide ("AR"), osteoartritis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, trastorno inflamatorio del intestino ("IBD"), rechazo de aloinjerto, psoriasis, determinados tipos de cáncer, angiogénesis, ateroesclerosis y esclerosis múltiple ("EM") (para una revisión, véase Witkowski y col., Cell. Mol. Life Sci. 61:567-579, 2004). Tanto la IL-17 como el IL-17R están regulados al alza en el tejido sinovial de pacientes con AR. El bloqueo de la bioactividad de una IL-17 mediante su unión al anticuerpo específico de IL-17 o receptor soluble de IL-17 reduce la inflamación y la erosión ósea en varios modelos de artritis animal. (Véase, por ejemplo, Lubberts y col, Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004). Además, la IL-17 tiene efectos independientes de IL-1P sobre la degradación y la inflamación de la matriz de colágeno y lesiones articulares, mientras que la IL-17 tiene sinergia con TNF-a para amplificar la inflamación.

Por lo tanto, dada su distribución localizada en el sitio de inflamación, la IL-17 parece ser una diana novedosa para el tratamiento de AR y de otras enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias con un perfil de seguridad potencialmente superior al de fármacos dirigidos a la circulación sistémica de citocinas proinflamatorias tales como TNF-a. Los productos biológicos aprobados por la FDA (Agencia de alimentos y fármacos de Estados Unidos) (anticuerpos ENBREL®, REMICADE®y HUMIRA®) que se unen y neutralizan TNF-a han demostrado una eficacia en la reducción de signos y síntomas de AR y en la ralentización de la progresión de la enfermedad en una serie de pacientes con AR. Sin embargo, no todos los pacientes con AR responden igual a la inhibición de la bioactividad de una TNF-a con estos productos biológicos. Adicionalmente, el ARNm de IL-17 aumenta en lesiones de esclerosis múltiple y en células mononucleares de la sangre y fluido cerebroespinal de pacientes con EM, en particular durante la exacerbación clínica. En consecuencia, existe la necesidad de composiciones que antagonicen o neutralicen la actividad de IL-17 con el fin de tratar trastornos, enfermedades o afecciones en los que la presencia de bioactividad de IL-17 causa, o contribuye a, un efecto patológico no deseado o en los que una disminución de la bioactividad de IL-17 contribuye a un efecto terapéutico deseado, incluidos trastornos inflamatorios, trastornos de proliferación celular y de desarrollo y trastornos autoinmunitarios tales como AR y EM e IBD.

Giavedoni, L D, Journal of Immunological Methods, Vol. 301, N° 1-2, 89-101, junio de 2005, describe la detección simultánea de múltiples citocinas y quimiocinas a partir de primates no humanos usando tecnología luminex. En la tabla 1 se mencionan tres anticuerpos anti-IL-17.

Moseley, T a y col., Cytokine and Growth Factor Reviews, Vol. 14, N° 2, 155-174, abril de 2003, describe la familia de interleucina-17 y receptores de IL-17.

El documento WO 2004/106377 describe un procedimiento de obtención de un anticuerpo con una función deseada. En la tabla 4 se describen anticuerpos anti-IL-17 C9 y D12.

Hofstetter y col., Cellular Immunology, Vol. 237, N° 2 123-130, octubre de 2005, describe la eficacia terapéutica de la neutralización de IL-17 en encefalomielitis autoinmunitaria experimental en murinos. Se encontró que la neutralización de IL-17 con un anticuerpo monoclonal mejora el curso de la enfermedad.

Existe la necesidad de un anticuerpo anti-IL-17 neutralizante que se una específicamente a IL-17 de origen humano, así como a IL-17 de un mamífero no humano, permitiendo de este modo que el anticuerpo se use en estudios preclínicos y clínicos in vivo. Además, existe la necesidad de un anticuerpo específico de IL-17 que se una a IL-17 con una afinidad alta y/o tenga una constante de disociación lenta, permitiendo de este modo minimizar la dosis terapéutica eficaz dando como resultado una menor frecuencia de dosificación con dicho anticuerpo que con un anticuerpo que se una a IL-17 con una afinidad menor (es decir, una Kd superior) y/o tenga una constante de disociación más rápida. Un anticuerpo específico de IL-17 con afinidad alta es también deseable porque puede permitir que el anticuerpo se administre a un paciente subcutáneamente en vez de intravenosamente. Existe también la necesidad de un anticuerpo específico de IL-17 con un valor de CI⁵⁰bajo en un ensayo de bioactividad de IL-17 con el fin de generar un anticuerpo anti-IL-17 terapéutico con una dosis terapéutica eficaz mínima. También es deseable proporciona un anticuerpo específico de IL-17 con el que se reduzca a un mínimo la respuesta inmunitaria al anticuerpo evocada por un paciente que recibe el anticuerpo. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas asociadas.

Sumario de la invención

El alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones y cualquier información que no entre dentro de las reivindicaciones se proporciona sólo como información.

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales anti-IL-17 quiméricos, humanizados o totalmente humanos, y porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a epítopes no lineales que comprenden los aminoácidos de IL-17 DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) y antagonizan o neutralizan al menos una actividad biológica in vitro o in vivo asociada con IL-17 o con una porción de la misma.

En una realización, los anticuerpos de la invención tienen una CI⁵⁰inferior o igual a aproximadamente 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600pM, 560 pM o 500 pM en un ensayo indicador de IL-8 in vitro tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 6A del presente documento o inferior o igual a 560 pM en un ensayo indicador de GROa in vitro tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 6B del presente documento.

En otra realización, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una afinidad de unión (K^d) fuerte por IL-17 humana, es decir, inferior a aproximadamente 7 pM, 6,5 pM, 6,0 pM, 5,5 pM, 5,0 pM, 4,5 pM o 4,0 pM. Alternativamente, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una K^dpor IL-17 humana no superior a aproximadamente 7 pM, 6,5 pM, 6,0 pM, 5,5 pM, 5,0 pM, 4,5 pM o preferentemente no superior a aproximadamente 4,0 pM. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se caracterizan también por una constante de disociación k^offde IL-17 humana inferior a 2 x 10^{' 5}s^_1.

En otra realización, un anticuerpo anti-IL-17 de la invención se caracteriza porque se une específicamente a IL-17 humana así como a IL-17 de mono cynomolgus, mientras que no se une a IL-17de ratón o rata a niveles superiores al nivel de fondo. Adicionalmente, un anticuerpo anti-IL-17 de la invención se une a IL-17 (es decir, IL-17A) humana pero no se une a IL-17B, C, D, E o F humana.

En una realización, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende un polipéptido de la región variable de cadena ligera ("LCVR") que comprende 3 secuencias de la CDR que están presentes juntas en un Fab enumerado más adelante en la tabla 3 y que están presentes en el anticuerpo de la invención en la misma posición de la CDR que en el Fab enumerado en la tabla 3. Preferentemente, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende un polipéptido de la LCVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 178-243.

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-17, comprendiendo dicho anticuerpo:

a) un péptido con SEQ ID NO: 131 en la CDRL1.

b) un péptido con SEQ ID NO: 167 en la CDRL2.

c) un péptido con SEQ ID NO: 168 en la CDRL3.

d) un péptido con SEQ ID NO: 26 en la CDRH1.

e) un péptido con SEQ ID NO: 30 en la CDRH2, y

f) un péptido con SEQ ID NO: 52 en la CDRH3.

Preferentemente, el anticuerpo monoclonal anti-IL-17 humanizado según la presente invención comprende una LCVR con SEQ ID NO: 241 y una HCVR con SEQ ID NO: 118.

Un anticuerpo humanizado según la presente invención es un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv monocatenario.

Preferentemente, el anticuerpo según la presente invención comprende una región constante de cadena pesada seleccionada entre IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM e IgD.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo según la presente invención, comprendiendo además dicha composición un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo según la presente invención para su uso como medicamento.

Preferentemente, el anticuerpo según la presente invención se usa en el tratamiento de una o varias afecciones seleccionadas entre artritis reumatoide, trastorno inflamatorio del intestino, psoriaris y esclerosis múltiple.

En otra realización, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende un polipéptido de la región variable de cadena pesada ("HCVR") que comprende 3 CDR que están presentes juntas en un Fab enumerado más adelante en la tabla 2 y que están presente en el anticuerpo de la invención en la misma posición de la CDR que en el Fab enumerado en la tabla 2. Preferentemente, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende un polipéptido de la HCVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56 121.

En otra realización, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende un polipéptido de la LCVR que comprende 3 CDR que están presentes juntas en un Fab enumerado en la tabla 3 y que están presentes en el anticuerpo de la invención en la misma posición de la CDR que en el Fab enumerado en la tabla 3 y además comprende un polipéptido de la HCVR que comprende 3 CDR que están presentes juntas en un Fab enumerado en la tabla 2 y que están presentes en el anticuerpo de la invención en la misma posición de la CDR que en el Fab enumerado en la tabla 2. Preferentemente, las 6 CDR de un anticuerpo de la invención, o fragmento funcional del mismo, están presentes juntas en un Fab enumerado más adelante en la tabla 1 y están presentes en el anticuerpo de la invención en la misma posición de la CDR que en el Fab enumerado en la tabla 1.

En una realización preferente, un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende (i) un polipéptido de la LCVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 178-243 y (ii) un polipéptido de la HCVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56 121. En una realización más preferente, un anticuerpo de la invención que comprende un polipéptido de la LCVR con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 178-243 comprende además el polipéptido de la HCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-121 que está presente en un Fab enumerado en la tabla 1 que comprende la LCVR particular presente en el anticuerpo.

En otra realización, un anticuerpo monoclonal de la invención es uno que puede competir por la unión a IL-17 humana, o una porción de IL-17 humana, con un anticuerpo competidor, comprendiendo el anticuerpo competidor dos polipéptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 241 y 118.

En otra realización, una LCVR de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende 1, 2 o 3 péptidos, preferentemente 3 péptidos, seleccionados del grupo que consiste en péptidos con una secuencia tal como se muestra en (a) SEQ ID NO: 122-149; (b) SEQ ID NO: 150-167 y (c) SEQ ID NO:168-177 (es decir, un péptido de (a), un péptido de (b) y un péptido de (c) para un anticuerpo que comprende 3 de dichos péptidos). Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 122-149, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL1. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150-167, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL2. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150-167, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL3.

En otra realización, una HCVR de una anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención comprende 1, 2 o 3 péptidos, preferentemente 3 péptidos, seleccionados del grupo que consiste en péptidos con una secuencia tal como se muestra en (a) SEQ ID NO: 11-28; (b) SEQ ID NO: 29-32 y (c) SEQ ID NO: 33-55 y 261 (es decir, un péptido de (a), un péptido de (b) y un péptido de (c) para un anticuerpo que comprende 3 de dichos péptidos). Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11-28, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH1. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 29-32, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH2. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33-55 y 261, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH3.

La presente invención proporciona también un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 que comprende seis péptidos seleccionados del grupo que consiste en péptidos con una secuencia tal como se muestra en (a) SEQ ID NO: 122 149; (b) SEQ ID NO: 150-167, (c) SEQ ID NO: 168-177, (d) SEQ ID NO: 11-28; (e) SEQ ID NO: 29-32 y (f) SEQ ID NO: 33-55 y 261 (es decir, un péptido de cada uno de (a-f)); preferentemente los seis péptidos coexisten en un Fab enumerado en la tabla 1 del presente documento. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 122-149, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL1. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150-167, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL2. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150-167, cuando está presente en un anticuerpo de la invención, está en la CDRL3. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11-28, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH1. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 29-32, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH2. Un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33-55 y 261, cuando está presente en dicho anticuerpo, está en la CDRH3.

La presente invención proporciona también un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 que comprende los seis péptidos con las secuencias tal como se muestran en SEQ ID NO: 247, 248, 249, 244, 245 y 246. El péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 247 está en la CDRL1. El péptido con la secuencia mostrada en SeQ ID NO: 248 está en la CDRL2. El péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 249 está en la CDRL3. El péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 244 está en la CDRH1. El péptido con la secuencia mostrada en s Eq ID NO: 245 está en la CDRH2. El péptido con la secuencia mostrada en Se Q ID NO: 246 está en la CDRH3.

Un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención puede comprender, o consta de, un anticuerpo intacto (es decir, de longitud completa), o un anticuerpo sustancialmente intacto o una porción de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv monocatenario. Además, un anticuerpo de la invención puede estar marcado con una marca detectable, inmovilizado en una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo, por ejemplo una enzima, toxina o molécula de polietilenglicol.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención que comprende mantener una célula huésped de la invención (es decir, célula huésped que se ha transformado, transducido o infectado con un vector (o vectores) de la invención que expresa un anticuerpo de la invención) en condiciones apropiadas para la expresión de un anticuerpo monoclonal de la invención, con lo que se expresa dicho anticuerpo. El procedimiento puede comprender además la etapa de aislar el anticuerpo monoclonal de la invención a partir de la célula o, preferentemente, a partir de los medios de cultivo en los que se cultiva la célula.

Se contemplan usos diagnósticos para anticuerpos monoclonales de la invención. En una aplicación diagnóstica, la invención proporciona un procedimiento para determinar el nivel de proteína IL-17 en una muestra que comprende exponer una muestra que se va a analizar a un anticuerpo anti-IL-17 de la invención en condiciones de unión y determinar la unión específica del anticuerpo a la muestra. Un anticuerpo anti-IL-17 de la invención puede usarse para determinar los niveles de IL-17 en muestras de ensayo comparando valores de la muestra de ensayo en una curva estándar generada mediante la unión de dicho anticuerpo a muestras con cantidades conocidas de IL-17. La invención también proporciona un kit que comprende un anticuerpo de la invención y, preferentemente, instrucciones para usar el anticuerpo para detectar proteína IL-17 en una muestra.

La invención proporciona una composición, preferentemente una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede comprender también un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En dicha composición farmacéutica, el anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención es el único ingrediente activo. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención. La composición para uso terapéutico es fisiológicamente compatible, estéril y puede liofilizarse y opcionalmente suministrarse con un diluyente apropiado.

En el presente documento se divulga un procedimiento para inhibir al menos una bioactividad de IL-17 en un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, con necesidad de ello, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz, o cantidad neutralizante de IL-17, de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención a dicho animal. En el presente documento se divulga también un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno mejorado por la neutralización o antogonización de una bioactividad de IL-17, por ejemplo inhibiendo la transducción de la señal resultante de la unión de IL-17 a su receptor, que comprende administrar a un paciente (por ejemplo un ser humano) con necesidad de dicho tratamiento o prevención una cantidad terapéuticamente eficaz de una cantidad neutralizante de IL-17, de un anticuerpo monoclonal de la invención.

Una realización de la invención es un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para la administración a un mamífero, preferentemente un ser humano, para el tratamiento de, por ejemplo, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio o trastorno de proliferación celular.

La invención también proporciona un artículo manufacturado que comprende un material de envasado y un anticuerpo de la invención contenido en dicho material de envasado, en el que el material de envase comprende un prospecto de envasado que indica que el anticuerpo neutraliza específicamente la actividad de la IL-17 o reduce el nivel de la IL-17 funcional presente en el sistema.

La invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo de la invención o cadena ligera o cadena pesada del mismo; un vector (o vectores) que comprende dicho ácido nucleico, opcionalmente unido operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped que comprende ese vector; un procedimiento para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar la célula huésped de modo que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo a partir del medio de cultivo de la célula huésped.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican IL-17 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 253) o IL-17 de conejo (SEQ ID NO: 251); la proteína IL-17 codificada por el ácido nucleico de mono o conejo (SEQ ID NO: 10 o 9 respectivamente); vectores que comprende dicha molécula de ácido nucleico; la célula huésped que comprende dicho vector; y un procedimiento para producir IL-17 de mono cynomolgus o IL-17 de conejo.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos de miembros de la familia de proteínas IL-17 humanas (IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E y IL-17F).

La FIG. 2 muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos de IL-17 humana, de conejo, de rata, de mono cynomolgus y de especies murinas.

Descripción detallada de la invención

La invención presenta anticuerpos monoclonales anti-IL-17 quiméricos, humanizados o totalmente humanos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, capaces de neutralizar o antagonizar al menos una actividad de IL-17 in vitro y/o in vivo. Preferentemente, dichos anticuerpos de la invención se caracterizan también por tener una CI⁵⁰inferior a aproximadamente 600 o 560 pM en, por ejemplo, un ensayo indicador de IL-8 in vitro o ensayo indicador de GROa (véase, por ejemplo, el ejemplo 6) y/o preferentemente tiene una afinidad de unión con IL-17 inferior a 4 pM. Los anticuerpos de la invención se caracterizan además porque se unen específicamente a IL-17 humana y de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 1 y 10 respectivamente) pero no se une a IL-17 murino o de rata (SEQ ID NO: 7 y 8 respectivamente). El epítope antigénico al que se unen anticuerpo monoclonales de la invención es un epítope no lineal de IL-17 humana (y de mono) y comprende los restos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de la IL-17. Un anticuerpo de la invención entra en contacto con el péptido DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) cuando está en el contexto de la IL-17 de longitud completa.

Definiciones

La "interleucina 17" también denominada "IL-17" o "IL-17A" es una proteína homodimérica glucosilada de 20-30 kD. El gen IL-17 humano codifica una proteína de 155 aminoácidos que tiene una secuencia de señal de 19 aminoácidos y un segmento maduro de 136 aminoácidos. La IL-17 humana muestra una identidad de secuencia de aminoácidos del 62,5 % y del 58 % con las secuencias de aminoácidos de IL-17 de ratón y de rata, respectivamente, tal como se muestra en la figura 2. La IL-17 humana muestra una identidad de secuencia de aminoácidos del 97,4 % con la IL-17 de mono cynomolgus.

Un anticuerpo de longitud completa tal como existe en la naturaleza es una molécula de inmunoglobulina que comprende cuatro cadenas peptídicas, dos cadenas pesadas (H) (aproximadamente 50-70 kDa cuando la longitud es completa) y dos cadenas ligeras (L) (aproximadamente 25 kDa cuando la longitud es completa) interconectadas mediante enlaces disulfuro. La porción del extremo amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento de los antígenos. La porción del extremo carboxi terminal de cada cadena define una región constante que es principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (en el presente documento "LCVR") N-terminal y una región constante de cadena ligera que comprende por un dominio, CL. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, y definen el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente, y varios de éstos pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos) por ejemplo IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Cada tipo de cadena pesada está caracterizado por una región constante particular. Cada cadena pesada consta de una región variable de cadena pesada N-terminal (en el presente documento "HCVR") y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios (CH1, c H2 y CH3) para IgG, IgD y IgA; y de 4 dominios (CH1, CH2, CH3 y CH4) para IgM e IgE.

Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), intercaladas entre regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales ("FR"). Cada HCVR y cada LCVR está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas partiendo del extremo amino terminal hacia el extremo carboxi terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Para anticuerpos de longitud completa de la invención las cadenas ligeras comprenden preferentemente, cadena abajo de la FR4, un polipéptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 277. Para anticuerpos de longitud completa de la invención las cadenas pesadas comprenden preferentemente, cadena abajo de la FR4, un polipéptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 278. En el presente documento, las 3 CDR de la cadena pesada se denominan "CDRH1, CDRH2 y CDRH3" y las 3 CDR de la cadena ligera se denominan "CDRL1, CDRL2 y CDRL3." Las CDR contienen la mayor parte de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y ubicación de restos de aminoácido de la CDR dentro de las regiones HCVr y LCVR está de acuerdo con la convención de numeración, bien conocida, de Kabat.

El término "anticuerpo", con referencia a un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención (o simplemente "anticuerpo de la invención"), tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo monoclonal. Un "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo de roedor, preferentemente murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano, a menos que se indique otra cosa en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden producirse usando, por ejemplo, técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, así como tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas o recombinantes o combinaciones de dichas tecnologías muy conocidas en la técnica. La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, no está limitada a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. “Anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que está derivado de una copia única o clon, incluido cualquier clon de eucariota, procariota o fago, y no al procedimiento por el que se produce. Un "anticuerpo monoclonal" puede ser un anticuerpo intacto (que comprende una región Fc completa o de longitud completa), un anticuerpo sustancialmente intacto o una porción o fragmento de un anticuerpo que comprende una porción de unión a antígeno, por ejemplo un fragmento Fab, fragmento Fab' o fragmento F(ab')²de un anticuerpo murino o de un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. El fragmento "Fab" contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo "F(ab')²" comprenden un par de fragmentos Fab que están generalmente unidos covalentemente cerca de sus extremos carboxi terminales mediante cisteínas bisagras entre los mismos. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

La región variable de cada cadena ligera-pesada forma un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión a antígeno del anticuerpo son el mismo. Tal como se usa en el presente documento, la "porción de unión al antígeno" o "región de unión al antígeno" o "dominio de unión al antígeno" se refiere de forma intercambiable a esa porción de una molécula de anticuerpo que contiene los restos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. La porción de anticuerpo incluye el "marco estructural" de restos de aminoácidos necesarios para mantener la conformación apropiada de los restos de unión a antígeno. Preferentemente, las CDR de la región de unión al antígeno de los anticuerpos de la invención son total o sustancialmente de origen murino, opcionalmente con determinados restos de aminoácidos alterados, por ejemplo sustituidos con un resto de aminoácido diferente (véanse, por ejemplo, las tablas 2 y 3) para optimizar una propiedad particular del anticuerpo, por ejemplo, K^d, k^off, CI⁵⁰. Preferentemente, las regiones estructurales de anticuerpos de la invención son de origen humano o sustancialmente de origen humano (al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de origen humano. Las regiones estructurales preferentes de anticuerpos de la invención tienen las secuencias siguientes: SEQ ID NO: 262 (FR1 de HCVR), 263 (FR2 de HCVR), 264 (FR3 de HCVR), 265 (FR4 de HCVR), 266 (FR1 de LCVR), 267 (FR2 de LCVR), 268 (FR3 de LCVR), 269 (FR4 de LCVR) y siguen la numeración de Kabat. En otras realizaciones, la región de unión al antígeno de un anticuerpo IL-17 de la invención puede derivarse de otras especies no humanas, incluidas, pero sin limitarse a, conejo, rata o hámster. Alternativamente, la región de unión al antígeno puede derivarse de la secuencia humana.

Además, un "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, puede ser un Fv monocatenario que puede producirse uniendo el ADN que codifica una LCVR y el ADN que codifica una HCVR con una secuencia enlazadora. (Véase, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore ed., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315, 1994). Se entiende que independientemente de si se especifican fragmentos, el término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, incluye dichos fragmentos así como formas monocatenarias. Siempre que la proteína retenga la capacidad para unirse específica o de forma preferencial a su diana pretendida (es decir, epítope o antígeno), está incluida dentro del término "anticuerpo". Los anticuerpos pueden o no pueden estar glucosilados y entrar aún dentro de los límites de la invención.

Una población de "anticuerpos monoclonales" se refiere a una población de anticuerpos homogénea o sustancialmente homogénea (es decir, al menos aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 97 % o 98 % o del modo más preferente al menos el 99 % de los anticuerpos en la población competiría en un ensayo ELISA por el mismo antígeno o epítope o más preferentemente los anticuerpos son idénticos en la secuencia de aminoácidos. Los anticuerpos pueden o no pueden estar glucosilados y entrar aún en los límites de la invención. Los anticuerpos monoclonales pueden ser homogéneos si tienen secuencias de aminoácidos idénticas aunque puedan diferir en una modificación postraduccional, por ejemplo, el patrón de glucosilación.

Una "variante" de anticuerpo se refiere, en el presente documento, a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo “parental” por virtud de adición, deleción y/o sustitución de uno o varios restos de aminoácidos de la secuencia del anticuerpo parental. En una realización preferente, la variante de anticuerpo comprende al menos una adición, deleción y/o sustitución de aminoácidos (por ejemplo, de una a aproximadamente diez, y preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) en las regiones CDR del anticuerpo parental. La identidad u homología con respecto a la secuencia de la variante de anticuerpo se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia de la variante de anticuerpo que son idénticas a los restos del anticuerpo parental después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La variante de anticuerpo mantiene la capacidad de unión con el antígeno, o preferentemente, el epítope, al que se une al anticuerpo parental y preferentemente tiene al menos una propiedad o bioactividad que es superior a la del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante de anticuerpo tiene preferentemente una afinidad de unión más fuerte, una constante de disociación más lenta, una CI⁵⁰inferior o una capacidad potenciada para inhibir la bioactividad del antígeno que las del anticuerpo parental. Una variante de anticuerpo de particular interés en el presente documento es una que presenta al menos aproximadamente una propiedad o bioactividad potenciada 2 veces, preferentemente al menos 5 veces, 10 veces o 20 veces en comparación con el anticuerpo parental.

El anticuerpo "parental", en el presente documento, es uno que está codificado por una secuencia de aminoácidos usados para la preparación de una variante de anticuerpo. El anticuerpo parental puede tener una secuencia estructural de origen murino, pero preferentemente la secuencia estructural es total o sustancialmente de origen humano. El anticuerpo parental puede ser un anticuerpo murino, quimérico, humanizado o humano.

La expresión "se une específicamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la situación en la que un miembro de un par de unión específico no se une significativamente a moléculas diferentes a su(s) asociado(s) de unión específico(s). La expresión también es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención es especifico de un epítope particular portado por una serie de antígenos, en cuyo caso el anticuerpo específico que porta el dominio de unión al antígeno será capaz de unirse a diversos antígenos que portan el epítope. En consecuencia, un anticuerpo monoclonal de la invención se une específicamente a IL-17 humana (es decir, IL-17A) aunque no se una específicamente a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F humanas. Además, un anticuerpo monoclonal de la invención se une específicamente a IL-17 humana y a IL-17 de mono cynomolgus pero no se une específicamente a IL-17 de rata o IL-17 murina. Además, un anticuerpo monoclonal de la invención se une específicamente a un epítope de IL-17 humana no lineal o conformacional que comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) pero no se une a un epítope de IL-17 humana que no comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276).

La expresión "se une de forma preferencial", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una situación en la que un anticuerpo se une a un antígeno específico al menos aproximadamente el 20 % más, preferentemente al menos el 50 % más, 2 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces más que lo que se une a un antígeno diferente al medir mediante técnicas disponibles en la técnica, por ejemplo, ensayo ELISA de competencia o de medición de Kd con un BIACORE o KINEXA. Un anticuerpo puede unirse de forma preferencial a un epítope dentro de un antígeno más que a epítopes diferentes dentro del mismo antígeno. En consecuencia, un anticuerpo de la invención se une de forma preferencial a IL-17 humano más que a IL-17 de conejo.

El término "epítope" se refiere a esa porción de una molécula capaz de ser reconocida por, y unirse a, un anticuerpo en una o varias regiones de unión a antígeno del anticuerpo. Los epítopes constan a menudo de una agrupación de moléculas superficiales químicamente activas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por "epítope inhibidor" y/o "epítope neutralizador" se quiere decir un epítope que, en el contexto de la molécula antigénica intacta y cuando se une a un anticuerpo específico del epítope, da como resultado una pérdida o disminución de la actividad biológica de la molécula in vivo o in vitro o en un organismo que contiene la molécula.

El término "epítope," tal como se usa en el presente documento, se refiere además a un polipéptido que tiene actividad antigénica y/o inmunogénica en un animal, preferentemente un mamífero, por ejemplo un ratón o un ser humano. La expresión "epítope antigénico", tal como se usa en el presente documento, se define como una porción de un polipéptido a la que se puede unir específicamente un anticuerpo tal como se determina por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, por ejemplo, por inmunoanálisis convencional. Los epítopes antigénicos no deben ser necesariamente inmunogénicos, pero pueden ser inmunogénicos. Un "epítope inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, se define como una porción de un polipéptido que desencadena una respuesta del anticuerpo en un animal, tal como se determina mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Un "epítope no lineal" o "epítope conformacional" comprende polipéptidos (o aminoácidos) no contiguos de la proteína antigénica a la que se une un anticuerpo específico del epítope.

Las expresiones "propiedad biológica" o "característica biológica" o los términos "actividad" o "bioactividad", con referencia a un anticuerpo de la presente invención, se usan en el presente documento de forma intercambiable e incluyen, pero no están limitadas a, afinidad y especificidad epítope/antígeno, capacidad para neutralizar o antagonizar la actividad de IL-17 in vivo o in vitro, CI⁵⁰, estabilidad in vivo del anticuerpo y las propiedades inmunogénicas del anticuerpo. Otras propiedades o características biológicas identificables de un anticuerpo reconocidas en la técnica incluyen, por ejemplo, reactividad cruzada (es decir, con homólogos no humanos del péptido diana o con otras proteínas o tejidos, generalmente) y la capacidad para conservar niveles de expresión altos de proteínas en células de mamífero. Las propiedades y características mencionadas anteriormente pueden observarse, medirse o evaluarse usando técnicas reconocidas incluidas, pero sin limitarse a, ELISA, ELISA competitivo, análisis de resonancia de plasmón superficial por BIACORE o KINEXA, ensayos de neutralización in vitro o in vivo sin límite, unión al receptor, producción y/o secreción de citocinas o factores del crecimiento, transducción de señal e inmunohistioquímica con secciones de tejidos de diferentes fuentes incluidas ser humano, primate o cualquier otra fuente.

Los términos "inhibe" o "neutraliza", tal como se usan en el presente documento, con respecto a la actividad de un anticuerpo de la invención significan la capacidad para antagonizar, prohibir, prevenir, reprimir, ralentizar, interrumpir, eliminar, detener o invertir sustancialmente, por ejemplo, la progresión o gravedad de la actividad que está siendo inhibida que incluye, pero no está limitada a, una actividad o propiedad biológica (por ejemplo, la actividad de IL-17), una enfermedad o una afección. La inhibición o neutralización de la actividad de la IL-17 resultante de la unión de un anticuerpo de la invención con la IL-17 es preferentemente de al menos aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o superior.

El término "aislado", cuando se usa con relación a un ácido nucleico o proteína (por ejemplo, un anticuerpo), se refiere a una molécula de ácido nucleico o proteína que se ha identificado y separado de al menos un contaminante con el que está asociada ordinariamente en su fuente natural. Preferentemente, una "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-17 y que está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes al IL-17).

Las expresiones "numeración de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se usan en el presente documento de forma intercambiable. Estas expresiones, que son reconocidas en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de restos de aminoácido que son más variables (es decir, hipervariables) que otros restos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo (Kabat y col., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, Publicación NIH N° 91-3242 (1991)).

Un polinucleótido está "unido operativamente" a otro polinucleótido cuando está dispuesto en una relación funcional con el otro polinucleótido. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de una secuencia. Un péptido está "unido operativamente" a otro péptido cuando los polinucleótidos que los codifican están unidos operativamente, preferentemente se encuentran en el mismo marco de lectura abierta.

Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente" se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a un mamífero, incluidos, pero sin limitarse a, murinos, simios, seres humanos, animales mamíferos de granja, animales mamíferos de deportes y mamíferos mascotas; los términos se refieren preferentemente a seres humanos. En una realización determinada, el sujeto, preferentemente un mamífero, preferentemente un ser humano, se caracteriza además por una enfermedad o trastorno o afección que se beneficiaría de una bioactividad de la IL-17 reducida.

El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido incluidos, pero sin limitarse a, plásmidos y vectores víricos. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se han introducido mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped después de su introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión") y se conocen bien en la técnica ejemplos de vectores.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "célula", "célula huésped,", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable e incluyen una célula o cultivo celular que es un receptor de cualquier polinucleótido aislado de la invención o cualquier vector (o vectores) recombinante que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo HCVR, LCVR o monoclonal de la invención. Las células huésped incluyen progenie de una célula huésped única y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en ADN complementario total) a la célula parental original debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula huésped incluye células transformadas, transducidas o infectadas con un vector recombinante o un polinucleótido que expresa un anticuerpo monoclonal de la invención o una cadena ligera o una cadena pesada del mismo. Una célula huésped que comprende un vector recombinante de la invención, bien incorporado de forma estable en el cromosoma huésped o no, también puede denominarse una "célula huésped recombinante". Las células huésped preferentes para su uso en la invención son células de CHO (por ejemplo, ATCC CRL-9096), células NS0, células SP2/0, células COS (ATCC, por ejemplo, CRL-1650, CRL-1651) y HeLa (ATCC CCL-2). Las células huésped adicionales para su uso en la invención incluyen células vegetales, células de levadura, células de otros mamíferos y células procarióticas.

Caracterización de anticuerpos

La presente invención se refiere a anticuerpos aislados, monoclonales que se unen específicamente a IL-17 humana (es decir, IL-17A) con alta afinidad. Los anticuerpos de la invención son preferentemente anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos o porciones de unión a antígeno. Además, los anticuerpos de la invención neutralizan o antagonizan al menos una actividad biológica de IL-17 in vivo y/o in vitro. La unión específica de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención, (incluidas porciones de unión a antígeno del mismo), a la IL-17 permite a dicho anticuerpo usarse como producto terapéutico para enfermedades y trastornos asociados a la IL-17, es decir, afecciones, enfermedades o trastornos que se benefician de la inhibición de una actividad biológica de la IL-17.

El epítope antigénico al que se unen anticuerpo de la invención es un epítope no lineal que comprende los restos de aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), más preferentemente los restos de aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de IL-17 humana. Los anticuerpos que se unen a dicho epítope, específicamente y de forma preferencial se unen a IL-17 humana e IL-17 de mono cynomolgus en comparación con su unión a IL-17 murino o IL-17 de rata. Los anticuerpos monoclonales de la invención se unen a IL-17 humana al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces más (por ejemplo, afinidad superior o especificidad superior) que lo que se unen a IL-17 murina o IL-17 de rata; más preferentemente al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 veces más que lo que se unen a IL-17 murino o IL-17 de rata, incluso más preferentemente, no se unen a IL-17 murina o IL-17 de rata a niveles superiores a los niveles de fondo tal como se determina, por ejemplo, mediante ensayo ELISA, ensayo de ELISA de competencia o valores K^den un ensayo con BIACORE o KINEXA.

En una realización preferente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 que posee una afinidad de unión fuerte por IL-17 humana, es decir, se une a IL-17 humana o a una porción de la misma que comprende DGNVDYH (Se Q ID NO: 276) [es decir, anticuerpo que entra en contacto con el polipéptido DGNVDYH (SEQ ID NO: 276)], con una afinidad de unión (K^d) para IL-17 humana de menos de aproximadamente 7 pM, 6,5 pM o 6 pM, preferentemente menos de aproximadamente 5,5 pM, 5 pM o 4,5 pM y del modo más preferente menos de aproximadamente 4 pM. Alternativamente, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una K^dpor IL-17 humana no superior a aproximadamente 7 pM, 6,5 pM o 6 pM o preferentemente no superior a aproximadamente 5,5 pM, 5,0 pM, 4,5 pM o preferentemente no superior a aproximadamente 4,0 pM. Las afinidades de los anticuerpos pueden determinarse tal como se describe más adelante en los ejemplos u otros procedimientos disponibles en la técnica. Preferentemente, los anticuerpos anti-IL-17 de la invención que poseen una afinidad de unión fuerte tal como se ha descrito anteriormente también se unen a un epítope de IL-17 humana no lineal que comprende los aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), más preferentemente los restos de aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276), entrando el anticuerpo en contacto con el polipéptido DGNVDYH (SEQ ID NO:276).

En una realización, los anticuerpos de la invención tienen una constante de disociación (k^off) para IL-17 humana inferior a 5 x 10^{' 5}, 4 x 10^{' 5}, 3 x 10^{' 5}o 2 x 10^{' 5}s^_1. En una realización preferente, los anticuerpos de la invención se caracterizan por poseer una afinidad de unión fuerte por IL-17 humana tal como se ha descrito anteriormente (K^dinferior a aproximadamente 7 pM o 6 pM, preferentemente inferior a 5 pM o 4,5 pM y del modo más preferente inferior a aproximadamente 4 pM) también tienen una constante de disociación (k^off) para IL-17 humana inferior a 5 x 10^{' 5}, 4 x 10^{' 5}, 3 x 10^{' 5}o 2 x 10^{' 5}s^_1e incluso más preferentemente se une también a un epítope de IL-17 humana no lineal que comprende los aminoácidos ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), más preferentemente los restos de aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de la IL-17 humana.

En otra realización, los anticuerpos de la invención tienen una CI⁵⁰inferior a InM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM o 500 pM en, por ejemplo, un ensayo indicador de IL-8 in vitro o inferior a 560 pM en un ensayo indicador de GROa (véase el ejemplo 6). En una realización preferente, los anticuerpos de la invención están caracterizados por poseer una afinidad de unión fuerte por la IL-17 humana tal como se ha descrito anteriormente (K^dinferior a aproximadamente 7 pM o 6 pM, preferentemente inferior a 5 pM o 4.5 pM y del modo más preferente inferior a aproximadamente 4 pM) y también tienen una CI⁵⁰inferior a InM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM o 500 pM en, por ejemplo, un ensayo indicador de IL-8 in vitro o inferior a 560 pM en un ensayo indicador de GROa e incluso más preferentemente también tienen una constante de disociación (k^off) para IL-17 humana inferior a 5 x 10^{' 5}, 4 x 10^{' 5}, 3 x 10^{' 5}o 2 x 10^{' 5}s^_1e incluso más preferentemente se une también a un epítope de IL-17 humana no lineal que comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) de la IL-17 humana, entrando el anticuerpo en contacto con el polipéptido DGNVDYH (SEQ ID NO: 276).

La realización más preferente de la invención es un anticuerpo anti-IL-17 que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 279 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 280. Preferentemente este anticuerpo comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Preferentemente la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 279 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 281 (incluida la secuencia de señal) o SEQ ID NO: 283 (sin la secuencia de señal). Preferentemente la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 280 está codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 282 (incluida la secuencia de señal) o SEQ ID NO: 284 (sin la secuencia de señal).

Los anticuerpos monoclonales ("mAb") pueden fabricarse usando el procedimiento de hibridoma ampliamente conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler y col., Nature, 256:495, 1975) o pueden fabricarse mediante procedimientos de ADN recombinante (por ejemplo como en el documento de patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Generalmente, un hibridoma puede producirse fusionando una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como SP2/0) con células productoras de anticuerpo del animal inmunizado. La célula productora de anticuerpo, preferentemente las del bazo o de los ganglios linfáticos, se obtienen a partir de animales inmunizados con el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) pueden aislarse usando condiciones de cultivo selectivas y pueden clonarse mediante dilución limitante. El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de mAb producido por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo o ELISA. Las células que producen anticuerpo con las propiedades de unión deseadas pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado. Los procedimientos para dicho aislamiento y análisis son bien conocidos en la técnica.

Pueden usarse otros procedimientos adecuados de producción o aislamiento de anticuerpos de la invención, incluidos anticuerpos humanos o artificiales, incluidos, por ejemplo, procedimientos que seleccionan un anticuerpo recombinante (por ejemplo, Fv o Fab monocatenerio) a partir de una biblioteca, o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) capaces de producir un repertorio de anticuerpos (véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits y col., Nature, 362:255-258, 1993; documentos de patente de Estados Unidos N° 5.545.806 y 5.545.807).

Los anticuerpos monocatenarios y los anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados (injertados a la CDR), así como anticuerpos monocatenarios quiméricos o injertados a la CDR, y similares, que comprenden porciones derivadas de diferentes especies, también están abarcados por la presentes invención y por el término "anticuerpo". Las diversas porciones de estos anticuerpos pueden unirse conjuntamente químicamente mediante técnicas convencionales, sintéticamente, o pueden prepararse en forma de proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada pueden expresarse para que produzcan una proteína contigua. Véanse, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos N° 4.816.567; el documento de patente europea N° 125.023 B1; el documento de patente de Estados Unidos N° 4.816.397; el documento de patente europea N° 120.694 B1; el documento WO 86/01533; el documento de patente europea N° 194.276 B1; el documento de patente de Estados Unidos N° 5.225. 539; el documento de patente europea N° 239.400 B1 y los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.585.089 y 5.698.762.

Además, también pueden producirse fragmentos funcionales de anticuerpos (es decir, fragmentos de unión al antígeno), incluidos anticuerpos quiméricos, humanizados, privatizados o monocatenarios, y entran dentro del alcance de la invención. Los fragmentos funcionales preferentes mantienen una función de unión al antígeno de un anticuerpo de longitud completa correspondiente. Los fragmentos funcionales particularmente preferentes mantienen la capacidad de inhibir una o varias funciones o bioactividades características de una IL-17 madura de mamífero, preferentemente una IL-17 humana, tal como una actividad de unión, una actividad de señalización y/o estimulación o inhibición de una respuesta celular. Por ejemplo, en una realización, un fragmento funcional puede inhibir la interacción de IL-17 madura con su receptor y/o puede inhibir una o varias funciones mediadas por receptor.

Las porciones de anticuerpo capaces de unirse a IL-17 incluyen, pero no están limitadas a, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')²y están abarcados por la invención. Dichos fragmentos pueden producirse mediante escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión con papaína o pepsina de un anticuerpo intacto puede generar fragmentos Fab o F(ab')², respectivamente. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno único. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab)²que tiene dos sitios de combinación con antígeno y es aún capaz de un entrecruzamiento con el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de, y unión a, antígeno total. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero Vh-Vl. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Para superar la tendencia de dominios HCVR y LCVR unidos de forma no covalente en el Fv para disociarse cuando se coexpresan en una célula huésped, puede construirse un fragmento Fv monocaternario (FVmc) en el que un polipéptido flexible y adecuadamente largo une bien el extremo C terminal de la HCVR al extremo N terminal de la LCVR o bien el extremo C terminal de la LCVR al extremo N terminal de la HCVR. Un enlazador usado comúnmente es un péptido de 15 restos (Gly⁴Ser)³. Para una revisión de Fvmc, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore ediciones, Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994). Los anticuerpos también pueden producirse en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que uno o varios codones de detención se han introducido cadena arriba del sitio de detención natural. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena pesada de F(ab')²puede diseñarse para que incluya secuencias de ADN que codifican el dominio CH¹y la región bisagra de la cadena pesada.

La selección de fragmentos de anticuerpos de bibliotecas que usan tecnologías de enriquecimiento tales como presentación en fagos (Matthews DJ y Wells JA. Science. 260:1113-7, 1993), presentación en ribosomas (Hanes y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5, 1998), presentación bacteriana (Samuelson P.y col., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) o presentación en levadura (Kieke M.C. y col., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997) han demostrado ser alternativas exitosas a la tecnología de hibridoma clásica (revisión: Little M. y col., Immunology Today, 21:364-70, 2000).

Variantes de anticuerpos

Un anticuerpo monoclonal murino o un anticuerpo humano (producido, por ejemplo, en un ratón transgénico) obtenidos contra IL-17 puede ser un anticuerpo parental. Un anticuerpo parental puede alterarse adicionalmente para crear una forma quimérica o humanizada del anticuerpo u otra forma variante del anticuerpo usando procedimientos disponibles en la técnica, por ejemplo, mutagénesis por PCR. Dichos anticuerpos quiméricos, humanizados o de otra variante pueden servir como anticuerpos parentales para una variación o mutagénesis posterior. Los anticuerpos parentales de la invención pueden estar mutagenizados, por ejemplo, dentro del dominio o los dominios de la c Dr (véase, por ejemplo, las tablas 2 y 3) para crear variantes de anticuerpo que pueden analizarse para determinar la presencia de una propiedad de interés, por ejemplo, afinidad de unión (Kd inferior), CI⁵⁰, especificidad, unión preferencial, etc. Preferentemente, la propiedad de interés en la variante del anticuerpo representa una mejora sobre la propiedad del anticuerpo parental. Una sustitución de aminoácidos de la variante del anticuerpo es preferente y tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de aminoácidos de la molécula de anticuerpo parental eliminados y un resto diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución es una o varias regiones CDR, pero también se contemplan las alteraciones de la FR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son preferentes; aunque, para más cambios sustanciales, pueden introducirse cambios de aminoácidos no conservativos y analizarse los anticuerpos resultantes para evaluar la propiedad de interés.

Una forma conveniente para generar variantes de sustitución de un anticuerpo parental es la maduración de afinidad usando presentación en fagos. Brevemente, una molécula de polinucleótido que codifica un anticuerpo parental se somete a mutación dentro de una o varias regiones CDR para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada resto de aminoácido en el que se desea una sustitución. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosas fusionadas con el producto del gen III de M13 introducidas en cada partícula. Después se analizan las variantes de anticuerpo presentados en fagos para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión, CI⁵⁰). Para identificar sitios de la región CDR candidatos para la modificación, puede realizarse una mutagénesis mediante alanina para identificar los restos de la región CDR que contribuyen de forma significativa a la unión a los antígenos.

Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígenoanticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la IL-17. Dichos restos de contacto y los restos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento o conocidas en la técnica. Alternativamente, o adicionalmente, puede realizarse mutagénesis aleatoria o mutagénesis puntual en una o varias moléculas de polinucleótidos que codifican al menos una CDR. La mutagénesis puede realizarse en una o en varias posiciones, bien mientras la CDR está unida operativamente a la región estructural dentro de la región variable o bien mientras la CDR es independiente de otra secuencia de región variable y después la CDR alterada se hace retornar a la región variable usando tecnología de ADN recombinante. Una vez se han generado dichas variantes de anticuerpo, el panel de variantes se somete a tamizado para determinar una propiedad o actividad de interés y pueden seleccionarse los anticuerpos con mejores propiedades en uno o más ensayos relevantes para su ulterior desarrollo.

Cualquier resto de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada de un anticuerpo anti-IL-17 puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir entrecruzamientos aberrantes. A la inversa, pueden añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alterar se pretende decir eliminar uno o varios restos carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o añadir uno o varios sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo parental. La glucosilación de anticuerpos habitualmente está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de una de las azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución por uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación ligados a O).

Secuencia

Un anticuerpo monoclonal preferente de la invención comprende una LCVR que comprende un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 178-243 y/o una HCVR que comprende un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-121. En una realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una LCVR que comprende un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 178-243 y/o una HCVR que comprende un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-121, en el que la HCVR y la LCVR presentes en un anticuerpo de la invención existen juntas en un Fab enumerado en la tabla 1. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención que comprende un polipéptido de la LCVR con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 178, comprende además preferentemente una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, 60, 68-93 y 95. Además, un anticuerpo de la invención que comprende un polipéptido de la LCVR con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 241, comprende además preferentemente una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 118 y 106. El experto apreciará que los anticuerpos de la invención no están limitados a las secuencias específicas de HCVr y LCVR tal como se enumeran en la tabla 1 del presente documento, sino que también incluyen variantes de estas secuencias que, cuando están presentes en un anticuerpo anti-IL-17 de la invención, mantienen o mejoran la capacidad de unión al antígeno y al menos otra propiedad funcional del anticuerpo parental, por ejemplo, especificidad del epítope, capacidad para competir con el anticuerpo parental para unirse a IL-17, CI⁵⁰y/o valores de Kd o k^offpara la unión a IL-17 humana.

Además, un anticuerpo monoclonal de la invención es uno que está competitivamente inhibido de su unión a IL-17 humana (o una porción del mismo que comprende DGNVDYH (SEQ ID NO: 276)) por un anticuerpo monoclonal competidor, comprendiendo el anticuerpo monoclonal competidor dos polipéptidos con las secuencias de aminoácidos mostradas en s Eq ID NO: 241 (LCVR) y 118 (HCVR). Dicha inhibición competitiva entre anticuerpo puede medirse mediante ensayos de la técnica, por ejemplo, un ensayo ELISA de competencia.

Preferentemente, un anticuerpo de la invención que compite con el anticuerpo competidor definido anteriormente está caracterizado además porque se une específicamente a IL-17 humana, pero no se une a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E o IL-17F humanas. Adicionalmente, el anticuerpo se caracteriza además por unirse específicamente a IL-17 humana e IL-17 de mono cynomolgus, pero no se une a IL-17 de rata o IL-17 de ratón a niveles superiores al nivel de fondo.

Más preferentemente, un anticuerpo de la invención que compite por la unión a IL-17 humana con un anticuerpo competidor que comprende secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 241 y 118 está caracterizado además porque se une a un epítope no lineal de IL-1 humana que comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276). Incluso más preferentemente, un anticuerpo de la invención que compite por la unión a IL-17 humana con un anticuerpo competidor que comprende secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 241 y 118 está caracterizado además por tener una Kd para IL-17 humana inferior a aproximadamente 7 pM, 6,5 pM o 6 pM, preferentemente inferior a aproximadamente 5,5 pM, 5 pM o 4,5 pM y del modo más preferente inferior a aproximadamente 4 pM y/o está caracterizada por una CI⁵⁰, preferentemente en un ensayo indicador de IL-8 in vitro, que es inferior a 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM o 500 pM, o por una CI⁵⁰en una ensayo indicador de GROa in vitro inferior a 560 pM, y/o tiene una constante de disociación (k^off) para IL-17 humana inferior a 5 x 10^{' 5}, 4 x 10^-5, 3 x 10^-5o 2 x 10^-5s^-1.

En una realización, un anticuerpo anti-IL-17 de la invención tiene una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que la región variable de cadena pesada comprende regiones CDR con las secuencias de aminoácidos siguientes: CDRH1 (SEQ ID NO: 244), CDRH2 (SEQ ID NO: 245) y CDRH3 (SEQ ID NO: 246); y/o en el que la región variable de cadena ligera comprende regiones CDR con las secuencias de aminoácidos siguientes: CDRL1 (SEQ ID NO: 247), CDRL2 (SEQ ID NO: 248) y CDRL3 (SEQ ID NO: 249). Preferentemente, las seis CDR de un anticuerpo de la invención existen juntas como en un Fab enumerado en la tabla 1 del presente documento. Incluso más preferentemente, las CDR de cadena pesada están en el contexto de las secuencias estructurales siguientes: FR1 con SEQ ID NO: 262, FR2 con SEQ ID NO: 263, FR3 con SEQ ID NO: 264 y FR4 con SEQ ID NO: 265 y las CDR de cadena ligera están en el contexto de las secuencias estructurales siguientes: FR1 con SEQ ID NO: 266, FR2 con SEQ ID NO: 267, FR3 con SEQ ID NO: 268 y FR4 con SEQ ID NO: 269, siendo el orden partiendo del extremo amino terminal FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Se contempla también que un anticuerpo anti-IL-17 de la invención comprenda una HCVR que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11-28 y/o una CDRH2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-32 y/o una CDRH2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33-55 y 261. Se contempla también que un anticuerpo anti-IL-17 de la invención comprenda una LCVR que comprende una CDRL1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 122-149 y/o una CDRL2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 150-167, y/o una CDRL3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consta SEQ ID NO: 168-177. En una realización preferente, un anticuerpo anti-IL-17 de la invención comprende una HCVR que comprende una CDRH1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11-28 y/o una CDRH2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29-32 y/o una CDRH3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33-55 y 261, y además comprende una LCVR que comprende una CDRL1 con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 122-149 y/o una CDRL2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 150-167 y/o una CDRL3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 168-177.

La composición que comprende una CDR de la invención será generalmente una secuencia de la cadena pesada o ligera del anticuerpo o una porción sustancial del mismo, en el que la CDR está ubicada en una ubicación consistente con la numeración de Kabat. Las tres regiones CDR para cada cadena, pesada y ligera, se proporcionan en una región estructural como secuencia contigua representada por la fórmula siguiente: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

El FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena pesada o ligera se combinan para formar una región estructural de un anticuerpo cuando se disponen como una secuencia contigua con las CDR en el orden indicado. Preferentemente, las regiones estructurales de un anticuerpo de la invención son de origen humano o sustancialmente de origen humano (es decir, con más de aproximadamente el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97 %).

En un anticuerpo humanizado para uso terapéutico en seres humanos, la secuencia estructural es preferentemente total o sustancialmente de origen humano. Preferentemente, la región estructural de la cadena ligera de un anticuerpo humanizado, humano o quimérico de la invención comprende una FR1 con SEQ ID NO: 266, FR2 con SEQ ID NO: 267, FR3 con SEQ ID NO: 268 y FR4 con SEQ ID NO: 269. Preferentemente, la región estructural de cadena pesada de un anticuerpo humanizado, humano o quimérico de la invención comprende FR1 con SEQ ID NO: 262, FR2 con SEQ ID NO: 263, FR3 con SEQ ID NO: 264 y FR4 con SEQ ID NO: 265. Por ejemplo, una realización preferente de LCVR del anticuerpo 126 de la invención, tal como se describe en las tablas 1, 2 y 3 del presente documento comprende (polipéptidos ordenados a partir del extremo N terminal) FR1 con SEQ ID NO: 266, c Dr 1 con SEQ ID NO: 131, FR2 con SEQ ID NO: 267, CDR2 con SEQ ID NO: 167, FR3 con SEQ ID NO: 268, CDR3 con SEQ ID NO: 168 y FR4 con SEQ ID NO: 269. La secuencia de LCVR total, unida operativamente a una región constante kappa humana es como se muestra en SEQ ID NO: 274. Además, una realización preferente de HCVR del anticuerpo 126 de la invención comprende (ordenados a partir del extremo N terminal) una FR1 con SEQ ID NO: 262, CDR1 con SEQ ID NO: 26, FR2 con SEQ ID NO: 262, CDR2 con SEQ ID NO: 30, FR3 con SEQ ID NO: 264, CDR3 con SEQ ID NO: 52 y FR4 con SEQ ID NO: 265. La secuencia de la HCVR total, unida operativamente a una región Fc de IgG⁴humana es como se muestra en SEQ ID NO: 273.

En una realización, un anticuerpo anti-IL-17 de la invención, en el que la totalidad o una porción de la región variable está limitada por una secuencia particular tal como se muestra en SEQ ID NO en el presente documento (véase, por ejemplo, las tablas 1-3) está caracterizado también por ser un anticuerpo quimérico, humanizado o totalmente humano o una porción de unión al antígeno del mismo que antagoniza o neutraliza al menos la actividad de una IL-17 humana in vivo o in vitro. Un anticuerpo IL-17 de la invención, en el que la totalidad o una porción de la región variable está limitada por una secuencia particular tal como se muestra en SEQ ID NO en el presente documento está caracterizada porque se une a IL-17 humana pero no se une a IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E o IL-17F humana. Adicionalmente, el anticuerpo se caracteriza además por unirse específicamente a IL-17 humana e IL-17 de mono cynomolgus, pero no se une a IL-17 de rata o IL17 de ratón a niveles superiores al nivel de fondo.

Más preferentemente, dicho anticuerpo está caracterizado además porque se une a un epítope no lineal de IL-1 humana que comprende los aminoácidos DGNVDYH (SEQ ID NO: 276), en la que el anticuerpo entra en contacto con el polipéptido con SEQ ID NO: 276. Incluso más preferentemente, dicho anticuerpo está caracterizado además por tener una Kd para IL-17 humana inferior a aproximadamente 7 pM, 6,5 pM o 6 pM, preferentemente inferior a aproximadamente 5,5 pM, 5 pM o 4,5 pM y del modo más preferente inferior a aproximadamente 4 pM y/o está caracterizado por una CI⁵⁰, preferentemente en un ensayo indicador de IL-8 in vitro, que es inferior a 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM o 500 pM, o por una CI⁵⁰en un ensayo indicador de GROa in vitro inferior a 560 pM, y/o tiene una constante de disociación (k^off) para IL-17 humana inferior a 5 x 10^{' 5}, 4 x 10^{' 5}, 3 x 10^{' 5}o 2 x 10^{' 5}s^{' 1}.

Expresión de anticuerpos

La presente invención también se refiere a líneas celulares que expresan un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención o una porción del mismo. La creación y aislamiento de líneas celulares que producen un anticuerpo monoclonal de la invención puede realizarse usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Las líneas celulares preferentes incluyen COS, CHO, SP2/0, NS0 y levadura (disponibles de depósitos públicos tales como ATCC, Colección estadounidense de cultivos tipo, Manassas, VA).

Puede usarse una amplia diversidad de sistemas de expresión de huéspedes para expresar un anticuerpo de la presente invención, incluidos sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos (tales como levaduras, baculovirus, células vegetales, de mamíferos y otras células animales, animales transgénicos y células de hibridoma), así como sistemas de expresión de presentación en fagos. Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano adecuado es pUC119 y un vector de expresión eucariótico adecuado es un vector pcDNA3.1 modificado con un sistema de selección dhfr debilitado. También se conocen en la técnica otros sistemas de expresión de anticuerpo y se contemplan en el presente documento.

Un anticuerpo de la invención puede prepararse mediante expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo recombinantemente, una célula huésped se transforma, se transduce, se infecta o similar con uno o varios vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y/o pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que las cadenas ligera y/o pesada se expresen en la célula huésped. La cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse independientemente de promotores diferentes a los que están unidas operativamente en un vector o, alternativamente, la cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse independientemente de diferentes promotores a los que están unidas operativamente en dos vectores: uno que expresa la cadena pesada y uno que expresa la cadena ligera. Opcionalmente, la cadena pesada y la cadena ligera pueden expresarse en distintas células huésped. Preferentemente, los anticuerpos recombinantes se segregan en el medio en el que se cultivan las células huésped a partir de las cuales se van a recuperar o purificar los anticuerpos. Se usan metodologías de ADN recombinante estándar para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células huésped. Dichas tecnologías de ADN recombinante estándar se describen, por ejemplo, por Sambrook, Fritsch y Maniatis (ediciones), en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel y col. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniéndose operativamente al ADN que codifica la HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de regiones constantes de cadena pesada humanos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, publicación NIH N° 91-3242 (1991). Pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estás regiones, por ejemplo, mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM o IgD), clase (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3 y IgG4) o subclase de región constante y cualquier variante alotípica de las mismas tal como se describe en Kabat (referencia anterior). Alternativamente, la porción de unión a antígeno puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, Fd o un fragmento Fv monocatenario (FVmc). Para un gen de cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica la HCVR puede estar operativamente unido a otra molécula de ADN que codifica una región constante CH1 de cadena pesada.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica la LCVR a otra molécula de ADN que codifica una región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat, referencia anterior. Pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estás regiones mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen FVmc, los fragmentos de ADN que codifican la HCVR y la LCVR se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias HCVR y LCVR puedan expresarse en forma de proteína monocatenaria contigua, con las regiones LCVR y HCVR unidas con un enlazador flexible. Véase, por ejemplo, Bird y col., Science 242:423-6, 1988; Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988; McCafferty y col., Nature 348:552-4, 1990.

En una realización, la invención proporciona un vector, preferentemente (pero sin estar limitado a) un plásmido, un vector de expresión recombinante, un vector de expresión de levadura o un vector de expresión retroviral que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención. Alternativamente, un vector de la invención comprende un polinucleótido que codifica una LCVR y/o un polinucleótido que codifica una HCVR de la invención. Cuando una secuencia que codifica tanto una LCVR como una HCVR está presente en el mismo vector, pueden transcribirse independientemente, cada una a partir de un promotor aparte al que está unida operativamente. Si las secuencias que codifican la LCVR y la HCVr están presentes en el mismo vector y se transcriben a partir de un promotor al que están unidas operativamente, la LCVR puede estar en la posición 5' con respecto a la HCVR o la LCVR puede estar en la posición 3' con respecto a la HCVR; además, la LCVR y la HCVR que codifican la región en el vector pueden estar separadas por una secuencia enlazadora de cualquier tamaño o contenido, siendo preferentemente dicho enlazador, si está presente, un polinucleótido que codifica un sitio de entrada de ribosoma interna.

Para expresar un anticuerpo de la invención, se inserta un ADN que codifica una cadena ligera y/o pesada parcial o de longitud completa, obtenido tal como se ha describe anteriormente, en un vector de expresión de modo que el gen esté unido operativamente a secuencias control transcripcionales y traduccionales. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión usando procedimientos estándar. Adicionalmente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal anti-IL-17 a partir de una célula huésped. El gen de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal anti-IL-17 puede clonarse en un vector de modo que el péptido de señal quede unido operativamente en fase al extremo amino terminal del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo.

Además del gen o los genes de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, un vector de expresión recombinante de la invención porta secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen o los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. La expresión "secuencia reguladora" se pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación), tal como sea necesario, que controlen la transcripción o traducción del gen o los genes de la cadena del anticuerpo. El diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado. Las secuencias reguladoras preferentes para la expresión de células huésped de mamífero incluyen elementos víricos que se dirigen a niveles altos de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y virus de polioma.

Además de los genes de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y uno o varios genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector. Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferentes incluyen el gen dihidrofolato reductasa (dhfr) (para su uso en células huésped dhfr-menos con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para selección de G418) y glutamina sintasa (GS) en una línea celular GS negativa (tal como NS0) para selección/amplificación.

Para la expresión de las cadenas ligera y/o pesada, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y/o ligera se introducen en una célula huésped usando técnicas estándar, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano, transducción, infección y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células procarióticas o eucarióticas, son preferentes células eucarióticas, y las más preferentes las células huésped de mamífero, debido a que es más probable que dichas células se ensamblen y segreguen un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo. Las células huésped de mamífero preferentes para expresar anticuerpo recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) [que incluyen células CHO dhfr menos, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, tal como se describe por Kaufman y Sharp, en J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982] células de mieloma NS0, células COS y células SP2/0. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped en condiciones apropiadas conocidas en la técnica. Los anticuerpos pueden recuperarse a partir de la célula huésped y/o el medio de cultivo usando procedimientos de purificación estándar.

También pueden usarse células huésped para producir porciones, o fragmentos, de anticuerpos intactos, por ejemplo, fragmentos Fab o moléculas FVmc usando técnicas que son convencionales. Se entenderá por parte de un experto que las variaciones del procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifique bien la cadena ligera o bien la cadena pesada de un anticuerpo de la invención. También puede usarse tecnología de ADN recombinante para eliminar parte o todo el ADN que codifica bien ambas o bien una de las cadenas ligera y pesada que no es necesario para unirse a la IL-17. Las moléculas expresadas a partir de dicho ADN truncado también están abarcadas por los anticuerpos de la invención.

La invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferentemente, una célula huésped de la invención comprende uno o varios vectores o constructos que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. La célula huésped de la invención es una célula en la que se ha introducido un vector de la invención, comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica una LCVR de un anticuerpo de la invención y/o un polinucleótido que codifica una HCVR de la invención. La invención también proporciona una célula huésped en al que se han introducido dos vectores de la invención, uno que comprende un polinucleótido que codifica una LCVR de un anticuerpo de la invención y uno que comprende un polinucleótido que codifica una HCVR presente en un anticuerpo de la invención y cada uno se ha unido operativamente a una secuencia promotora. Los tipos de célula huésped incluyen células de mamífero, bacterianas, vegetales y de levadura. Preferentemente, la célula huésped es una célula CHO, una célula COS, una célula SP2/0, una célula NS0, una célula de levadura o un derivado o progenie de cualquier tipo de células preferente.

En un sistema preferente para la expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO dhfr-menos mediante, por ejemplo transfección mediada con fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno unidos operativamente a elementos reguladores de potenciador/promotor (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador potenciador SV40/promotor AdMLP) para conducir niveles altos de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen dhfr que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera a partir del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huéspedes, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo a partir del medio de cultivo. Los anticuerpos, o porciones de unión al antígeno de los mismos, de la invención pueden expresarse en un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor y col., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992).

Una vez expresados, los anticuerpos intactos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención pueden purificarse según procedimientos estándar de la técnica, incluidos precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad, fase inversa, interacción hidrófoba, electroforesis en gel y similares. Son preferentes las inmunoglobulinas sustancialmente puras con al menos aproximadamente el 90 %, 92 %, 94 % o 96 % de homogeneidad y las más preferentes con del 98 al 99 % o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad según se desee, los péptidos pueden usarse después terapéutica o profilácticamente, tal como se dirige en el presente documento.

Anticuerpo quimérico

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero formado por una cadena pesada quimérica asociada por medio de puentes disulfuro con una cadena ligera quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero formado por dos dímeros de cadena pesada-cadena ligera asociados por medio de al menos un puente disulfuro.

Una cadena pesada quimérica de un anticuerpo comprende una región de unión al antígeno derivada de la cadena pesada de un anticuerpo no humano específico para IL-17, que está unido operativamente a al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, o sustancialmente humana (o especie diferente de esa de la que se derivó la región de unión al antígeno), tales como CH1 o CH2, o preferentemente a una región constante de cadena pesada de longitud completa. Una cadena ligera quimérica de un anticuerpo para su uso en seres humanos comprende una región de unión al antígeno derivada total o sustancialmente a partir de la cadena ligera o de un anticuerpo no humano específica de IL-17, unida operativamente a al menos una porción de una región constante de cadena ligera humana, o sustancialmente humana (o especie diferente de esa de la que se derivó la región de unión al antígeno), (CL), o preferentemente a una región constante de cadena ligera. Los anticuerpos, fragmentos o derivados que tienen cadenas pesadas quiméricas y cadenas ligeras de la misma o diferente especificidad de unión a la región variable, también pueden prepararse asociando apropiadamente cadenas de polipéptidos individuales según etapas de procedimientos conocidos.

Con este enfoque, los huéspedes que expresan cadenas pesadas quiméricas se cultivan aparte de los huéspedes que expresan cadenas ligeras quiméricas, y las cadenas de inmunoglobulinas se recuperan por separado y después se asocian. Alternativamente, los huéspedes pueden cultivarse conjuntamente y se permite que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por la recuperación de la inmunoglobulina o fragmento ensamblado. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos N°: 6.284.471; 5.807.715; 4.816.567 y 4.816.397).

Anticuerpos humanizados

Preferentemente, un anticuerpo de la invención para su uso para fines terapéuticos tendría la secuencia de la región estructural y de la región constante (en la medida que exista en el anticuerpo) derivada del mamífero en el que se va a usar como producto terapéutico con el fin de reducir la posibilidad de que el mamífero desencadene una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo terapéutico. Los anticuerpos humanizados son de interés particular ya que se considera que son valiosos para su aplicación terapéutica y evitan la respuesta al anticuerpo anti-ratón humano observada frecuentemente con anticuerpos de roedores. Adicionalmente, en anticuerpos humanizados, la porción efectora del anticuerpo es de origen humano de modo que pueda interactuar mejor con las otras partes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, destruir las células diana más eficazmente mediante citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxidad celular dependiente del anticuerpo. Además, los anticuerpos humanizados inyectados pueden tener una semivida más parecida a la de los anticuerpos humanos de origen natural que, por ejemplo, anticuerpos murinos, permitiendo de este modo la administración de dosis pequeñas y menos frecuentes. La expresión "anticuerpo humanizado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que comprende porciones de anticuerpos de origen diferente, en el que al menos una porción es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender porciones derivadas de un anticuerpo de origen no humano con la especificidad requerida, tal como un ratón, y de un anticuerpo de origen humano, unidos conjuntamente químicamente mediante técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparadas en forma de un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética.

Preferentemente, un "anticuerpo humanizado" tiene CDR originadas (o sustancialmente originadas) a partir de un anticuerpo no humano (preferentemente un anticuerpo monoclonal de ratón), mientras que el marco estructural y la región constante, en la medida en que esté presente, (o una porción significativa o sustancial de la misma, es decir, al menos aproximadamente el 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %), están codificados por la información de secuencias de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, la base de datos internacional InternationallmMunoGeneTicsDatabase) o en formas recombinadas o mutadas de los mismos tanto si se producen dichos anticuerpos en células humanas o como si no.

Las CDR de un anticuerpo humanizado pueden alterarse u optimizarse a partir de las CDR de un anticuerpo parental no humano que originaron para generar propiedades deseadas, por ejemplo, especificidad, afinidad y/o unión preferencial. Las CDR alteradas u optimizadas pueden tener sustituciones de aminoácidos, adiciones y/o deleciones en comparación con unas CDR parentales, preferentemente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 en total entre los seis dominios de CDR. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos de las CDR que están subrayadas y en negrita en las tablas 2 y 3 son posiciones que se han alterado a partir de las CDR tal como se muestran en Fab 1 de las tablas 2 y 3. Alternativamente, el anticuerpo 2321 murino puede ser un anticuerpo parental para la comparación de las CDR de un anticuerpo de la invención.

Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) incluyen un anticuerpo intacto, un anticuerpo sustancialmente intacto, una porción de un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno, o una porción de un anticuerpo que comprende un fragmento Fab, un fragmento Fab', F(ab')2, o un fragmento Fv monocatenario. Los anticuerpos humanizados contienen preferentemente secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los aminoácidos de las regiones CDR corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los aminoácidos de las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprende, óptimamente, al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. [Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).]

Los anticuerpos humanizados pueden someterse a mutagénesis in vitro usando procedimientos de uso rutinario en la técnica (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, así, las secuencias de aminoácidos estructurales de las regiones HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes humanizados son secuencias que, aunque derivadas de las relacionadas con secuencias de HCVr y LCVR de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural en el repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos in vivo. Se contempla que dichas secuencias de aminoácidos de las regiones estructurales de HCVR y LCVR de los anticuerpos recombinantes humanizados son al menos el 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 % o del modo más preferente al menos el 99 % idénticas a una secuencia de línea germinal humana. Preferentemente, esos restos estructurales del anticuerpo parental (por ejemplo, anticuerpo murino o generalmente el anticuerpo del que se deriva el anticuerpo humanizado) que conservan o afectan a estructuras de sitio de combinación, se mantendrán. Estos restos pueden identificarse, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X del anticuerpo parental o fragmento Fab, identificando de este modo la estructura tridimensional del sitio de unión al antígeno. Una estrategia para humanizar anticuerpos es elegir una secuencia de línea germinal humana con la mayor homología con el marco estructural del anticuerpo parental como el marco estructural que recibe las CDR donantes. Este enfoque de línea germinal se basa en el mismo fundamento que la estrategia más adecuada, pero sólo se buscan secuencias de líneas germinales en las bases de datos.

El anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender o derivarse de un marco estructural de cadena ligera de línea germinal humana. En realizaciones particulares, la secuencia de línea germinal de cadena ligera se selecciona de secuencias de VK humanas que incluyen, pero no están limitadas a, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 y 08. en determinadas realizaciones, este marco estructural de línea germinal humana de cadena ligera I se selecciona entre V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6.

En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender, o derivarse de, un marco estructural de cadena pesada de línea germinal humana. En realizaciones particulares, este marco estructural de línea germinal humana de cadena pesada se selecciona entre VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81. Véase el documento PCT WO 2005/005604 para una descripción de las distintas secuencias de línea germinal.

En realizaciones particulares, la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada comprenden una región estructural o al menos una porción de una región estructural (que, por ejemplo, contiene 2 o 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En determinadas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, f RL3 o FRL4 es totalmente humana. En otras realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH3 o FRH4 es totalmente humana. En algunas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, FRL3 o FRL4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias consenso humanas para el marco estructural particular. En algunas realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH3 o FRH4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias consenso humanas para el marco estructural particular. En realizaciones preferentes, la totalidad de la región estructural es una región estructural humana.

En general, pueden producirse anticuerpos humanizados obteniendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican la HCVR y la LCVR de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo murino o un anticuerpo fabricado mediante hibridoma, que se une al epítope IL-17 de la invención, que identifica las CDR en dichas HCVR y LCVR (no humanas), e injerta dichas secuencias de ácidos nucleicos que codifican CDR en secuencias de ácidos nucleicos que codifican el marco estructural humano seleccionadas. Opcionalmente, una región CDR puede optimizarse mutagenizando aleatoriamente o en ubicaciones particulares con el fin de sustituir uno o varios aminoácidos de la CdR por un aminoácido diferente antes de injertar la región DCR en la región estructural. Alternativamente, una región CDR puede optimizarse subsiguientemente a la inserción en la región estructural humana usando procedimientos disponibles para un experto en la técnica. Preferentemente, las secuencias de aminoácidos estructurales humanas se seleccionan de modo que sea probable que el anticuerpo resultante sea adecuado para la administración in vivo en seres humanos. Esto puede determinarse, por ejemplo, sobre la base del uso previo de anticuerpos que contienen dicha secuencia estructural humana. Preferentemente, la secuencia estructural humana no será por sí misma significativamente inmunogénica.

Alternativamente, las secuencias de aminoácidos de los marcos estructurales de los anticuerpos que se van a humanizar pueden compararse con las secuencias de marcos estructurales humanos conocidos, las secuencias de marcos estructurales humanos que se van a usar para el injerto de CDR, y se seleccionan sobre la base de las secuencias comprendidas que son muy similares a las del anticuerpo parental, por ejemplo, un anticuerpo murino que se une a IL-17 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una HCVR con SEQ ID NO: 270 y que además comprende una LCVR con SEQ ID NO: 271). Se han aislado numerosas secuencias estructurales humanas y se ha informado de sus secuencias en la técnica. Esto mejora la probabilidad de que el anticuerpo humanizado injertado a CDR resultante, que contiene CDR del anticuerpo parental (por ejemplo, murino) o CDR optimizadas del anticuerpo parental injertado a marcos estructurales humanos seleccionados (y posiblemente también la región constante humana) mantendrán sustancialmente la estructura de unión al antígeno y, de este modo, mantendrán la afinidad de unión del anticuerpo parental. Para mantener un grado significativo de afinidad de unión a antígeno, las regiones estructurales humanas seleccionadas serán preferentemente las que se espera que sean adecuadas para la administración in vivo, es decir, no inmunogénicas.

En ambos procedimientos, se obtiene la secuencia de ADN que codifica las regiones HCVR y LCVR del anticuerpo anti-IL- 17 preferentemente murino. Los procedimientos para clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas son conocidas en la técnica. Dichos procedimientos pueden, por ejemplo, implicar la amplificación de las secuencias que codifican inmunoglobulina que se van a clonar usando cebadores apropiados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha informado de cebadores adecuados para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos de inmunoglobulina y específicamente las secuencias de HCVR y LCVR murinas en la bibliografía. Después de que dichas secuencias que codifican inmunoglobulina se hayan clonado, serán secuencias mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

Después de que las secuencias que codifican CDR se injerten en las secuencias que codifican marcos estructurales humanos seleccionadas, las secuencias de ADN resultantes que codifican las secuencias pesada variable y ligera variable "humanizadas" se expresan después para producir un Fv humanizado o un anticuerpo humanizado que se une a IL-17. La HCVR y la LCVR humanizadas pueden expresarse como parte de una molécula de anticuerpo anti-IL-17 completa, es decir, como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humano cuyas secuencias de ADN codificante se han obtenido de bibliotecas disponibles comercialmente o que se han obtenido usando, por ejemplo, uno de los procedimientos descritos anteriormente para obtener secuencias de ADN, o que existen en la técnica. No obstante, las secuencias de HCVR y LCVR también pueden expresarse en ausencia de secuencias constantes para producir un Fv anti-IL-17 humanizado. De todas las maneras, la fusión de secuencias constantes humanas con la región variable es potencialmente deseable, debido a que al anticuerpo anti-IL-17 humanizado resultante puede poseer funciones efectoras humanas.

Los procedimientos para sintetizar ADN que codifica una proteína de secuencia conocida son bien conocidos en la técnica. Usando dichos procedimientos, se sintetizan secuencias de ADN que codifican las secuencias de HCVR y LCVR humanizadas objeto (con o sin regiones constantes), y después se expresan en un sistema vector adecuado para la expresión de anticuerpos recombinantes. Esto puede efectuarse en cualquier sistema vector que proporcione secuencias de HCVR y LCVR humanizadas objeto que se expresen como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humano y se asocien para producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión al antígeno).

Las secuencias de dominios constantes humanos son conocidas en la técnica y se ha informado de las mismas en la bibliografía. Las secuencias de cadena ligera constante humana preferentes incluyen las secuencias de cadena ligera constante kappa y lambda. Las secuencias de cadena pesada constante humana preferentes incluyen IgG1 humana, IgG2 humana, IgGa humana, IgG4 humana (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 257-260 respectivamente) y versiones mutadas de las mismas que proporcionan una función efectora alterada, por ejemplo, una semivida in vivo potenciada, una unión al receptor reducida y un perfil de desaminación alterado y similares.

Si están presentes, las regiones estructurales humanas se derivan preferentemente de una región variable del anticuerpo humano que tenga similaridad de secuencia con la región análoga o equivalente del donante de la región de unión al antígeno (es decir, el anticuerpo parental). Otras fuentes de regiones estructurales para porciones de origen humano de un anticuerpo humanizado incluyen secuencias consenso variables humanas (véase, por ejemplo, Kettleborough, C.A. y col. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter y col., el documento WO 94/04679. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o región variable usada para obtener la porción no humana puede compararse con las secuencia humanas tal como se describen por Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH, Oficina de Impresión del Gobierno de Estados Unidos (1991). En una realización particularmente preferente, las regiones estructurales de una cadena de anticuerpo humanizado se derivan de una región variable humana que tiene al menos aproximadamente el 60 % de identidad de secuencia total, preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, 80 %, o 90 % de identidad de secuencia total y más preferentemente al menos aproximadamente el 85 % de identidad de secuencia total, con la región variable de un donante no humano. Una porción humana también puede derivarse de un anticuerpo humano que tanga al menos aproximadamente el 65 % de identidad de secuencia, y preferentemente al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia, dentro de una porción particular (por ejemplo, FR) que está usándose, en comparación con la porción equivalente (por ejemplo, FR) del donante no humano.

Las referencias que describen también procedimientos implicados en la humanización de anticuerpo de ratón que pueden usarse son, por ejemplo, Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; documento de patente de Estados Unidos N° 5.693.761; documento de patente de Estados Unidos N° 4.816.397; documento de patente de Estados Unidos N° 5.225.539; programas informáticos ABMOD y ENCAD tal como se describen por Levitt, M.,J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983; la humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann y col., Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536, 1988).

Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluidas bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381, 1991; Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, páginas. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147:86-95, 1991). De forma similar, pueden fabricarse anticuerpos humanos introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Después de la inmunización, por ejemplo con un antígeno que comprende un epítope inmunogénico de la invención, se obtiene un repertorio completo de producción de anticuerpo humano, que se parece mucho al visto en seres humanos en todos los aspectos, incluidos reordenamiento de genes, ensamble y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.589.369; 5.591.669; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., BioTechnology 10:779-783, 1992; Lonberg y col., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild y col., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) y Jobkobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993.

También se describen genes de inmunoglobulina humana introducidos en el ratón, creando de este modo ratones transgénicos capaces de responder a antígenos con anticuerpos que tienen secuencias humanas por Bruggemann y col. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713, 1989). Hay varias estrategias que existen para la generación de mamíferos que producen anticuerpos humanos. en particular, existe el enfoque de "minilocus" en el que se imita un locus de Ig exógeno mediante la inclusión de piezas (es decir, genes individuales) a partir del locus de Ig (véase, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos N° 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650 y 5.814.318, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215), introducción de YAC de grandes y sustancialmente fragmentos de línea germinal de los locus de Ig (Véase Mendez y col. Nature Genetics 15:146-156, 1997; Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495, 1998), e introducción de locus completos o sustancialmente completos mediante el uso de fusión de microcélulas (véase la solicitud de patente europea EP 0843 961 A1).

Cualquier ratón transgénico capaz de responder a la inmunización con anticuerpos que tenga secuencias humanas puede usarse para producir un anticuerpo anti-IL-17 de la invención cuando se usan procedimientos disponibles para un experto en la técnica, por ejemplo, cuando dicho ratón se inmuniza con un polipéptido que comprende un epítope inmunogénico de la invención.

Usos

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico y de investigación. Un anticuerpo de la invención puede usarse para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado con la expresión de IL-17 humano. De un modo similar, el anticuerpo de la invención puede usarse en un ensayo para realizar un seguimiento de los niveles de IL-17 en un sujeto que está siendo analizado para determinar la afección asociada a IL-17. Las aplicaciones de investigación incluyen procedimientos que usan el anticuerpo de la invención y un marcador para detectar IL-17 en una muestra, por ejemplo en un fluido corporal humano o en una célula o extracto de tejido. Los anticuerpos de la invención pueden usarse con o sin modificación, y se marcan mediante la unión covalente o no covalente de un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que sea capaz de producir, bien directa o bien indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo tal como, por ejemplo, 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminescente tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar por separado el anticuerpo al resto detectable, incluidos los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature 144:945, 1962; David y col., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain y col., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981; y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407, 1982.

Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para medir IL-17, incluidos, por ejemplo, ELISA, RIA y FACS, y proporcionan una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de expresión de IL-17. Los valores de expresión normales o estándar se establecen usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo combinando una muestra que comprende un polipéptido IL-17 con, por ejemplo, anticuerpos en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno:anticuerpo. El anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversos enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplos de material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de un material radioactivo incluyen 1251,131I, 35S o 3H. (Véase, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)).La cantidad de un complejo estándar formada se cuantifica usando diversos procedimientos, tales como, por ejemplo medios fotométricas. Las cantidades de polipéptido IL-17 expresado en muestras se compara después con los valores estándar.

Por razones de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un kit, un envase con una combinación de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se etiqueta con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores que requiere la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos puede variarse de forma amplia para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, generalmente liofilizados, que incluyen excipientes que proporcionarán en disolución una solución del reactivo que tenga la concentración apropiada.

Usos terapéuticos del anticuerpo

La IL-17 es una citocina proinflamatoria segregada por linfocitos T activados en los sitios de la inflamación, no en la circulación sistémica; no es fácilmente detectable en el suero o tejidos de una persona sana. La IL-17 regula al alza moléculas de adhesión, induce la producción de múltiples citocinas y quimiocinas inflamatorias de diversos tipos de células incluidas sinoviocitos, condrocitos, figroblastos, células endoteliales, células epiteliales, induciendo de este modo el reclutamiento de neutrófilos en un sitio inflamatorio, estimula la producción de prostaglandinas y metaloproteinasas, e inhibe la síntesis de proteoglicano. Además, la IL-17 tiene un papel importante en la maduración de células progenitoras hematopoyéticas. La IL-17 tiene papeles señalizadores en diferentes órganos y tejidos que incluyen pulmón, cartílago articular, hueso, cerebro, células hematopoyéticas, riñón, piel e intestino. La IL-17 comparte el 15-27 % de homología de aminoácidos con las IL-17 B, C y E y el 44-50 % de homología de aminoácidos con las IL-17 D y F. La IL-17 se une al receptor de IL-17 con afinidad baja (aproximadamente 1 nM), mientras que otros miembros de la familia de las IL-17 no se unen al receptor de IL-17.

Los niveles aumentados de IL-17 (es decir, IL-17A) se han asociado con varias afecciones que incluyen inflamación de las vías aéreas, AR, osteoartritis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, IBD, rechazo de aloinjerto, psoriasis, determinados tipos de cáncer, angiogénesis, ateroesclerosis y EM. Tanto IL-17 como IL-17R están reguladas al alza en el tejido sinovial de pacientes con AR. La IL-17 ejerce un papel en la patogénesis de AR mediante rutas dependientes e independientes de IL-1-p y TNF-a. La IL-17 estimula la secreción de otras citocinas y quimiocinas, por ejemplo TNF-a, IL-1p, IL-6, IL-8 y Gro-a. La IL-17 contribuye directamente a la progresión de la enfermedad en AR. La inyección de IL-17 en la rodilla del ratón promueve la destrucción de la articulación independientemente de la actividad de IL-1a (Ann. Rheum. Dis. 59:529-32, 2000). El anticuerpo anti-IL-1 p no tiene ningún efecto sobre la inflamación inducida por IL-17 y la lesión de la articulación (J. Immunol. 167:1004-1013, 2001). En un modelo de artritis murino inducido por SCW, la iL-17 indujo la infiltración de célula inflamatoria y la reducción de proteoglicano en el tipo silvestre y desactiva la IL-1p y desactiva la TNF-a en ratones. Los ratones con IL-17 desactivada son fenotípicamente normales en ausencia de cambios antigénicos, pero tienen artritis marcadamente reducida siguiendo la inmunización con colágeno de tipo II (J. Immunol. 171:6173-6177,2003).

La esclerosis múltiple (“EM”) es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por inflamación en el sistema nervioso central (“SNC”) con lesión de axones que rodean la capa de mielina. Una característica de la EM es que los linfocitos T se infiltran en el SNC. La EM afecta a más de 350.000 personas en Estados Unidos y a 2,5 millones en todo el mundo. Hay muchas formas y la más común es la recaída/remisión de la enfermedad (“RREm ”) seguida por una etapa progresiva secundaria. Los productos terapéuticos actuales constan de Interferón-p (AVONEX, BETASERON y REBIF) que reduce la tasa de recaída/exacerbación en el 31 %-34 %, pero puede producir síntomas similares a la gripe y/o síntesis de anticuerpos neutralizadores (por ejemplo, aproximadamente el 15 % de pacientes que reciben AVONEX producen anticuerpos neutralizadores en 18 meses. TYSABRI, aprobado por la FDA para RREM se retiró subsiguientemente del mercado debido a asuntos de inmunosupresión del SNC. Existe aún una necesidad médica no satisfecha en el tratamiento de EM. El ARNm de IL-17 se incrementa en lesiones de EM y en células mononucleares (MNC) en sangre en el fluido cerebroespinal de pacientes con EM. Se detectaron niveles más elevados de MNC en sangre que expresan ARNm de IL-17 durante la exacerbación clínica de EM en comparación con la remisión (Multiple Sclerosis, 5:101-104, 1999). Además, la encefalomielisis autoinmunitaria experimental ("EAE"), un modelo animal preclínico para EM se suprime significativamente en ratones desactivados con IL-17.

Por lo tanto, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la invención puede ser útil para el tratamiento o la prevención de afecciones en las que la presencia de IL-17 provoca, o contribuye a, efectos patológicos no deseados o una disminución de la actividad de IL-17 tiene un beneficio terapéutico en mamíferos, preferentemente seres humanos, incluidos, pero sin estar limitados a, inflamación de las vías aéreas, asma, AR, osteoartritis, erosión ósea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, IBD, rechazo de aloinjerto, psoriasis, determinados tipos de cáncer, angiogénesis, ateroesclerosis y EM, así como otros trastornos, afecciones, enfermedades o estados inflamatorios incluidos sin ser limitantes: eritematosis, respuesta a exposición alergénica, gastritis asociada a Helicobacter pylori, asma bronquial y rechazo de aloinjerto (por ejemplo, renal), eritematosis de lupus sistémico y nefritis de lupus. El uso de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la presente invención para tratar o prevenir al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente en los que la actividad de IL-17 es perjudicial o que beneficia la disminución de niveles de IL-17 se contempla en el presente documento. Adicionalmente, se contempla el uso de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la presente invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o los síntomas de los mismos y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en el presente documento, incluye la administración de un compuestos de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o afección en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad tenga lugar en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero todavía no se ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o trastorno o aliviar síntomas o complicaciones de la misma. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporciona una respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente tal como se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

Composición farmacéutica

Un anticuerpo de la invención puede incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para su administración al sujeto (véase, por ejemplo, el ejemplo 14). Los compuestos de la invención también pueden administrarse solos o en combinación con un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, tanto en dosis individuales como múltiples. Las composiciones farmacéuticas para administración están diseñadas para que sean apropiadas para el modo de administración seleccionado y se usan según sea apropiado, diluyentes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersores, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares (véase, por ejemplo, el ejemplo 14 del presente documento). Dichas composiciones se diseñan según técnicas convencionales como en, por ejemplo, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que proporciona un compendio de técnicas de formulación que son generalmente conocidas por parte de los profesionales.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 de la presente invención puede administrarse a un sujeto con riesgo de o que exhibe patologías tal como se describen en el presente documento usando técnicas de administración estándar, incluida la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o de supositorio.

Una composición farmacéutica de la invención es preferentemente una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en un estado temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz es al menos la dosis mínima, pero menor que la dosis tóxica, de un agente activo que es necesario para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Dicho de otro modo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención es una cantidad que reduce la bioactividad de IL-17 en mamíferos, preferentemente seres humanos, por ejemplo uniéndose a IL17R, causando o contribuyendo la presencia de IL-17 a efectos patológicos no deseados o la disminución de los niveles de IL-17 da como resultado un efecto terapéutico beneficioso en un mamífero, preferentemente un ser humano.

La vía de administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. Preferentemente, los anticuerpos de la invención pueden incorporarse a una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. La administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea es preferente. Los vehículos adecuados para dichas inyecciones son sencillos en la técnica.

La composición farmacéutica debe ser típicamente estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento en un recipiente proporcionado, incluyendo, por ejemplo, un vial o jeringa sellado. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden filtrarse de forma estéril después de preparar la formulación, o se hacen microbiológicamente aceptables de otro modo. Una composición típica para infusión intravenosa podría tener un volumen de hasta 250-1000 ml de fluido, tal como solución de Ringer estéril, solución salina fisiológica, solución de dextrosa y solución de Hank y una dosis terapéuticamente eficaz (por ejemplo, de 1 a 100 mg/ml, o más) de concentración de anticuerpo. La dosis puede variar dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad. Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosificaciones para un sujeto cualquiera dependen de muchos factores, incluidos la altura del paciente, el área superficial corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y de otros fármacos que se van a administrar simultáneamente. Una dosis típica puede encontrarse, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 pg; no obstante, se consideran dosis inferiores o superiores a este ejemplo de intervalo, especialmente considerando los factores mencionados anteriormente. El régimen de dosificación parental diario puede ser de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal total, preferentemente de aproximadamente 0,3 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg y más preferentemente de aproximadamente 1 pg/kg a 1 mg/kg, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal al día. Puede realizarse un seguimiento del progreso mediante evaluaciones periódicas. Para la administración repetida durante varios días o más prolongada, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que tenga lugar una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. No obstante, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y no quedan excluidos. La dosificación deseada puede administrarse mediante una administración de bolo única, mediante administraciones de bolos múltiples o mediante administración en infusión continua del anticuerpo, dependiendo de los patrones de decaimiento farmacocinético que el especialista desee lograr.

Estas cantidades de anticuerpo sugeridas están sometidas a una gran discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis y una agenda apropiadas es el resultado obtenido. Los factores que se consideran en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el procedimiento de administración, la agenda de administración y otros factores conocidos por el especialista médico.

Los agentes terapéuticos de la invención pueden congelarse o liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y la reconstitución pueden causar diversos grados de pérdida de actividad del anticuerpo. Las dosificaciones pueden haberse ajustado con fines de compensación. Generalmente, es preferente un pH entre 6 y 8.

Artículo manufacturado

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el tratamiento o la prevención de los trastornos o afecciones descritos anteriormente. El artículo manufacturado comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botes, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar fabricados de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de un anticuerpo de la invenció que sea eficaz para prevenir o tratar el trastorno o afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial con solución intravenosa que tenga un tapón que puede oradarse con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo de la composición es un anticuerpo anti-IL-17 de la invención. La etiqueta de, o asociada con, el recipiente indica que la composición se usa para tratar la afección de la elección. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable tal como una solución salina, una solución de Ringer y una solución de dextrosa tamponadas con fosfatos. Puede incluir también otros materiales deseados desde un punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos del envase con instrucciones de uso.

Los siguientes ejemplos de formulación se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ningún modo.

TABLA 1 SE ID NÚMEROS

continuación

continuación

Tabla 2 Alineamientos de CDR de cadena pesada

Fab N° CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID NO NO NO

1 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 2 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGGY 34 3 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 4 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGAY 35 5 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGLY 36 6 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGGY 37 7 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 8 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 9 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGGY 39 10 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGGY 37 11 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 12 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGTY 40 13 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGGY 41 14 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGPY 42 15 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGGY 43 16 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGGY 39 17 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGVY 38 18 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYSTGTGGY 44 19 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 20 GYSFTDYNIN 12 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 21 GYSFTDYNLN 13 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 22 GYSFGDYNMN 14 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 23 GYSFRDYNMN 15 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 24 GYSFTWYNMN 16 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 25 GYSFNDYNMN 17 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 26 GYSFTDYNMS 18 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 (continuación)

CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3

NO NO

GYSFTDYNTN 19 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFPDYNMN 20 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 HYSFTDYNMN 21 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYHFTDYNMN 22 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYPFTDYNMN 23 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDFNMN 24 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPAYGTTDYNQRFKG 31 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYWTGTGAY 35 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYSTGTGAY 45 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDAFTGTGAY 26 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYLTGTGAY 49 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATSTGAY 50 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYAPGTGAY 51 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 53 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDPATGTGAY 54 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYNMN 11 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYATGTGAY 33 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGVY 55 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 GYSFTDYHMS 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 (continuación)

Fab N° CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 S NO NO NO

91 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 92 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 93 GYSFTDYHMS 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 94 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 95 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 96 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 97 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 98 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 99 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 100 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYATGTGAY 33 101 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 102 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 103 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 104 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 105 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYYTGTGAY 47 106 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 107 GYSFTDYHLG 25 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYUHTGTGAY 48 108 GYSFTDYHLG 25 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 109 GYSFTDYHMS 27 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 110 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 111 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGAY 46 112 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYHTGTGAY 48 113 GYSFTDYHMS 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 114 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 115 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 116 GYSFTDYHMS 27 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 47 117 GYSFTDYHIS 28 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYYTGTGY 53 118 GYSFTDYHIH 26 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 119 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYFTGTGVY 52 120 GYSFTDYHIS 28 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGAY 46 121 GYSFTDYHIS 28 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGAY 46 122 GYSFTDYHIH 26 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 123 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGVY 53 124 GYSFTDYNMN 11 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGVY 53 125 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGVY 52 126 GYSFTDYHIH 26 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52 127 GYSFTDYHIH 26 VINPNYGTTDYNQRFKG 29 YDYYTGTGAY 47 128 GYSFTDYHMS 27 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGAY 47 129 GYSFTDYHIH 26 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52 130 GYSFTDYHMS 27 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYYTGTGAY 47 131 GYSFTDYHIH 26 VINPEYGTTDYNQRFKG 32 YDYFTGTGVY 52 132 GYSFTDYHMS 27 VINPMYGTTDYNQRFKG 30 YDYFTGTGVY 52

Consenso:

SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 246 X1YX3FX5X6X7X8X9X10 VINPX5YGTTDYNQRFKG YDX3X4x5X6TGX9Y

X1 es H o G X5 es N, A, M o E X3 es Y, A o P

X3 es S, H o P X4 es Y, F, H, S, W, L o A X5 es G,R,T,N o P X5 es T o P

X6 es D o W X6 es G o S

X7 es Y o F X9 es A,G,L,V, P o T

X8 es N o H

X9 es M,T,L o I

X10 es N,G,H o S

Tabla 3 Alineamientos de CDR de cadena ligera

Fab N° CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID NO: NO: NO: 1 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 2 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 3 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 4 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 (continuación)

Fab N° CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID NO: NO: NO: 5 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 6 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 7 RSSQSLVHSYGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHIPFT 170 8 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSLHVPFT 171 9 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHIPFT 170 10 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 11 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 12 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHEPFT 172 13 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 14 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 NQSTHVPFT 173 15 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQTTHVPFT 174 16 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 17 RSSQSLVHSHGNTYLH 123 KVSNRFS 150 SQSTHYPFT 169 18 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 19 RSSQSLVHSNGNTYLH 124 KVSNRFS 150 SQSMHVPFT 175 20 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 21 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 22 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 23 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 24 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 25 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 26 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 27 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 28 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 29 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 30 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 31 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 32 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 33 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 34 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 35 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 36 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 37 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 38 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 39 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 40 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 41 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 42 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 43 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 44 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 45 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 46 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 47 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 48 RSSQSVVHSRGNTYLH 126 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 49 VSSQSLVHSRGNTYLH 127 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 50 RSSA SLVHSRGNTYLH 128 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 51 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 52 RSSQSLRHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 53 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 54 RSHQSLVHSRGNTYLH 132 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 55 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 56 RSSQSLVHNRGNTYLH 134 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 57 RSSQSLVHSRGRTYLH 135 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 58 RSSQSLVH RRGNTYLH 136 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 59 RSSQSLVHSRGNTYTH 137 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 60 RSSQSLVHSRGNTYSH 138 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 61 RSSQSLVHSRGNTYHH 139 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 62 RSSQSLVHA RGNTYLH 140 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 63 RSSQSLVHSRGNTYFH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 64 RSSQSLVHSRGNTW LH 141 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 65 RSSQSLVHSRGNVYLH 142 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 66 RSSQSLVHSRGKTYLR 143 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 (continuación)

Fab N° CDR1 SEQ ID CDR2 SEQ ID CDR3 SEQ ID NO: NO: NO: 67 RSSQSLVHLRGNTYLH 144 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 68 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 69 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQTTHLPFT 176 70 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTSLPFT 177 71 RSSKSLVHSRGNTFLH 145 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 72 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 73 RSSQSLRHSRGNTFLH 146 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 74 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 75 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 76 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 78 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 79 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 80 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 82 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 84 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 85 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 86 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 87 RSSQSLKHSRGNTFLH 147 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 88 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 89 RSSQSLRKSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SOSTHLPFT 168 91 RSSQSLRHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 92 RSSQSLKHSRGNTFLH 147 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 93 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 94 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 95 RSSQSLRHSRGNTYLH 130 KVSNRFH 152 SQSTHLPFT 168 96 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVA NRFS 153 SQSTHLPFT 168 97 RSSKSLVHSRGNTFLH 145 KVSVRFS 154 SQSTHLPFT 168 98 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 99 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 100 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 155 SQSTHLPFT 168 101 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVDNRFS 156 SQSTHLPFT 168 102 RSSRSLVHSRGNTFLH 148 KVSNRFS 157 SQSTHLPFT 168 103 RSSQSL RHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 158 SQSTHLPFT 168 RSS KSLVHSRGNT

104 FLH 145 KVSNRFS 159 SQSTHLPFT 168 105 RSSQSL RHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 150 SQSTH YPFT 169 106 RSSQSLVHSRGNTFLH 133 KVSNRFS 160 SQSTHLPFT 168 107 RSSQSLR HSRGNTYLH 130 KVSNRFS 161 SQSTH YPFT 169 108 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFS 162 SQSTH YPFT 169 109 RSSQSLRHSRGNTYLH 130 KVSNRFS 163 SQSTHLPFT 168 110 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFT 164 SQSTH_YPFT 169 111 RSSQSLRHSRGNT FLH 146 KVSNRFS 165 SQSTHLPFT 168 112 RSSRSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFS 166 SQSTHLPFT 168 113 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 114 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFS 159 SQSTHLPFT 168 115 RSSQSLVHSRGNT_FLH 133 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 116 RSSQSLKfiSHGNTYLH 149 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 117 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 118 RSSQSLVHSRGNT FLH 133 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 119 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 120 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 121 RSSQSLKfiSRGNT FLH 147 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 122 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 123 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 124 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 125 RSSQSLVHSRGNTYLH 122 KVSNRFS 150 SQSTHLPFT 168 126 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFS 167 SQSTHLPFT 168 127 RSSRSLVHSRGNTYLH 131 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 128 RSSQSLRHSRGNTYLH 129 KVSNRFI 167 SQSTHYPFT 169 129 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 130 RSSQSLKHSRGNTYLH 129 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 131 RSSR_SLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 132 RSSKSLVHSRGNTYLH 125 KVSNRFI 167 SQSTHLPFT 168 Consenso:

SEQ ID NO: 247 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 249 X1SX3X4SX6X7HX9X10GX12X13X14X15H X1VX3X4RX6X7 X1QX3X4X5X6PFT

X1 es R o V X13 es K o I X1 es S o N

X3 es S o H X3 es S, A, D, T, R, H o P X3 es S o T

X4 es Q, K, R o A X4 es N, V o T X4 es T, L o M

X6 es V o L X5 es R, I o N x5 es H o S

X7 es R, V o K X6 es F, I o N o X6 es L, I, V, E o Y

X9 es S, N, R, A o L X7 es S, H, I, T o V

X10 es H,R,N o Y

X12 es N, K o R

X13 es T o V

X14 es F, Y o W

X15 es L, T, S, H o F

Ejemplos

Ejemplo 1 ELISA I: Unión de anticuerpos a IL-17 de diversas especies

Un ejemplo de ensayo ELISA para medir la unión de anticuerpos a IL-17 usa placas de microvaloración Costar 3366 selladas que se recubren durante la noche a 4 °C con 50 j l de 1,0 jg/m l de IL-17 humana por pocillo (R&D Systems, N° ref:317-IL/CF) en tampón de recubrimiento de carbonato (carbonato de sodio 50 mM, pH 9,0). Alternativamente, se usan IL-17 de ratón, de conejo o de mono cynomolgus. Se usa IL-22 humana (R&D Systems) como antígeno de control. Las IL-17 de conejo y de mono cynomolgus no están disponibles comercialmente y, por lo tanto, requieren la clonación y expresión, o síntesis artificial, según procedimientos conocidos en la técnica que usan las secuencias de aminoácidos de IL-17 de las diversas especies proporcionadas en la figura 2 (SEQ ID NO: 9 y 10). Ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican la IL-17 de las diversas especies se muestran en SEQ ID NO: 250-254.

La placa se bloquea subsiguientemente añadiendo 100 j l de tampón de bloqueo (Pierce N° ref:37515). La placa se incuba durante 1 hora a 37 °C y después se lava tres veces con tampón de lavado (PBS pH 7,4 y Tween al 0,05 %). Después, se añaden 50 j l de bien anticuerpo de la muestra o bien de anticuerpo de control (diluidos a diferentes concentraciones en PBS (solución salina tamponada con fosfatos), pH 7,4, por ejemplo, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 y 0 jg/m l) a cada pocillo, y la placa se incuba posteriormente durante 1 hora a 37 °C. La placa se lava después tres veces con tampón de lavado antes de añadir 50 j l por pocillo de un conjugado de kappa anti-human kappa-fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en PBS, pH 7,4. Las muestras de ensayo se incuban durante 1 hora a 37 °C. Después se prepara en el momento sal de disodio de p-nitrofenil fosfato (PNPP, Pierce N° ref:37620) disolviendo en dietenolamino tampón de sustrato según las instrucciones del fabricante y se añaden 50 j l a cada pocillo. Se permite que tenga lugar el desarrollo de color durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente y después se mide la señal de color mediante absorbancia a 405 nm usando un lector de placas de ELISA. El grado de unión es proporcional a la producción de señal de color.

Los anticuerpos de la invención se unen a IL-17 humana en un ensayo ELISA tal como se describe en el presente documento, pero no se unen a IL-17 de rata o de ratón. Se anticipa, dados los datos de Biacore del ejemplo 4 que demuestran que los anticuerpos de la invención se unen a IL-17 humana o de mono, que los anticuerpos de la invención también demostrarían la unión a IL-17 de mono en un ensayo ELISA tal como se describe en el presente documento.

Ejemplo 2 ELISA II: Unión del anticuerpo a proteínas de la familia IL-17

Se usó un ELISA para medir si los anticuerpos de la invención se unen selectiva y/o de forma preferencial a miembros particulares de IL-17 humana (por ejemplo, IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17e o IL-17F) o IL-22 humana (control negativo).

En un ejemplo de ensayo, los pocillos de la placa de ELISA (Nunc Immuno Maxisorp) se recubren con 100 j l (0,5 jg/m l en 1X tampón de recubrimiento (BioFx)) de proteínas miembros de la familia IL-17 (R&D Systems) se sellan y se incuban durante la noche a 4 °C. La solución de los pocillos se elimina mediante desplazamiento y se añade tampón de bloqueo (200 j l de BSA al 1,5 % en PBS). Las placas se incuban en un agitador giratorio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se añaden 100 j l del anticuerpo que se va a analizar por pocillo a diferentes concentraciones (por ejemplo, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 y 0 jg/ml). Las placas se incuban de nuevo durante la noche (4 °C) seguido de un calentamiento en un agitador giratorio (60 min, a temperatura ambiente). Cada pocillo de la placa se lava después cinco veces con tampón (1X tampón Ish, BioFX). Después de lavar, se añade un anticuerpo secundario conjugado a HRP disponible comercialmente apropiado (1:2000 en PBS con BSA (albúmina de suero bovino) al 1,5 %) (100 jl/pocillo). Las placas se vuelven a incubar en un agitador giratorio (60 min, temperatura ambiente) seguido por lavado con tampón (5X) tal como se ha descrito anteriormente. La señal colorimétrica se desarrolla añadiendo TMB (100 jl/pocillo) hasta saturación (aprox 3-5 min) y después se finaliza un desarrollo adicional añadiendo solución de detención (100 pl/pocillo, BioFX). La señal de color se mide a 450 nm de absorbancia usando cualquier lector de placas de ELISA apropiado. El grado de unión es proporcional a la producción de señal de color. Los anticuerpos de la invención (por ejemplo, Fabs 103, 104, 118, 121, 126 y 131 tal como se describen en la tabla 1) se unen específicamente a IL-17 humana (es decir, IL-17A), pero, en condiciones similares, no se unen a niveles superiores la nivel de fondo a IL-17B humana, IL-17C humana, IL-17D humana, IL-17E humana, IL-17F humana, IL-17 murina o IL-22 humana.

Ejemplo 3 Aislamiento y activación de células para la clonación de IL-17

A. Esplenocitos de rata

Usando tenazas y tijeras estériles, se retira el bazo de una rata sacrificada mediante inhalación de CO²y se coloca el bazo en un tubo que contiene 5 ml de medio RPMI 1640 suero de bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina (solución de medio). Se vierte el contenido del tubo en un disco de Petri de 10 cm y se retira la grasa del bazo. Se homogeneiza el bazo usando cuidadosamente un par de portaobjetos de microscopia sometidos previamente al autoclave totalmente congelados. Se lavan las células de los portaobjetos usando solución de medio, se pipetea unas pocas veces y se filtran las células a través de un cedazo de células (Fisher Scientific). Se lavan las células una vez con solución de medio, se realiza el recuento de células y se resuspenden a una concentración final de 2 x 10⁷células/ml en 80 ml. Se añade la solución de células a un recipiente T150, se añade concanavalina A a una concentración final de 3 pg/ml y se incuba a 37 "C durante aproximadamente 15 horas. Se recolectan las células, se lavan con PBS, se congela la pella de células sobre hielo seco y se procede inmediatamente a la realización de procedimientos de aislamiento de ARN estándar.

B. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de mono cynomolgus y de conejo

Se cargan aproximadamente 7 ml de sangre completa de mono cynomolgus o 10 ml de sangre completa de conejo blanco de Nueva Zelanda en un sistema BD Vacutainer™ CPT™ para realizar la separación de células mononucleares de la sangre completa. Se centrifuga el tubo con la preparación de células CPT durante 20 min a 1500 x gravedad en un rotor de cubeta oscilante horizontal. Se recogen linfocitos y monocitos en la interfase, se lavan dos veces con solución de medio, se realiza el recuento y se resuspenden en solución de medio a una concentración final de 10⁶células/ml. Se añade concanavalina A a una concentración final de 3 pg/ml y se incuba a 37 "C durante aproximadamente 15 horas. Se recolectan las células, se lavan con PBS, se congela la pella de células sobre hielo seco y se procede inmediatamente a la realización de procedimientos de aislamiento de ARN estándar.

Ejemplo 4 Medición de las constantes cinéticas de unión

Se usa un instrumento BIACORE^®2000 para medir la cinética y la afinidad de unión antígeno-anticuerpo. El instrumento usa las propiedades ópticas de resonancia de plasmón superficial para detectar alteraciones en la concentración de proteínas de moléculas interactuantes dentro de una matriz biosensora de dextrano. Excepto cuando se indica, todos los reactivos y materiales se adquirieron de BIACORE^®AB. Todas las mediciones se realizan a 25 "C. Las muestras se resuspenden en tampón HBS-EP a una concentración final de 2 pg/ml (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P-20 al 0,005 % (p/v)y HEPES 10 mM, pH 7,4). Se inmoviliza la proteína A en células de flujo 1 a 4 de un chip sensor CM4 a un nivel de 500 unidades de respuesta usando un kit de acoplamiento amínico.

La unión se evalúa usando múltiples ciclos analíticos. Cada ciclo se realiza a una velocidad de flujo de 50 pl/minuto y consta de las etapas siguientes: Inyección de aproximadamente 20 pl de una composición de anticuerpo a 2 pg/ml dirigida a la captura de 100-200 unidades de respuesta, inyección de 250 pl de IL-17 humana, IL-17 de mono cynomolgus, IL-17 de conejo blanco de Nueva Zelanda, IL-17 de rata o IL-17 de ratón (comenzando por 10 nM y usando diluciones seriadas dos veces para cada ciclo), seguido por 20 minutos para la disociación, y regeneración usando 30 pl de clorhidrato de glicina 10 mM, pH 1,5. Las constantes de asociación y disociación para cada ciclo se evalúan usando un modelo de unión "1:1 con transferencia de masa" en un programa informático BIAevaluation.

Los mAb de longitud completa 103, 104, 118, 121, 126 y 131 (véase la tabla 1) que tienen una región Fc de IgG⁴muestran una unión de afinidad alta a la IL-17 humana y a la IL-17 de mono con una K^dinferior a 5 pM, una K^offmás lenta que 2 x 10^-5s^-1y una K^onde al menos 5 x 10⁶M^-1s^-1. La K^dy la k^offse mejoran (es decir, K^dinferior, k^offmás lenta) en estas variantes de mAb mediante mAb Fab 2321 (Fab parental de, por ejemplo, Fab 103 y 104) que comprenden una región variable murina [SEQ ID NO: 261 (VH de 2321), 262 (VL de 2321)], una región constante de cadena pesada de IgG⁴humana (SEQ ID NO: 260) y regiones constante de cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 272). Los anticuerpos de la invención muestran una unión no superior a los niveles de fondo a IL-17 de ratón o IL-17 de rata; no se detecta unión hasta una concentración 200 nM de IL-17 de ratón y no se detecta unión hasta una concentración 1 pM de IL-17 de rata. Cuando se analizan los mAb de longitud completa 103, 104, 121 y 126, en las mismas condiciones que las descritas anteriormente, para determinar su unión a IL-17 de mono cynomolgus y IL-17 de conejo, la unión a IL-17 de conejo es débil y bifásica mientras que la unión a IL-17 de mono es similar a la unión a IL-17 humana. Los valores específicos para determinados mAb (los valores se indican como media ± error estándar de la media) de la invención cuando se analizan en este ensayo se enumeran en la tabla 4 más adelante. Se contempla que regiones Fc diferentes a las de IgG⁴no afectarán significativamente a la K^dy a la k^off.

Tabla 4

Ejemplo 5 Estudios de competencia de unión a receptor de IL-17/anticuerpo anti-IL-17

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos de la invención compiten por la unión a IL-17 con el receptor de IL-17.

Los estudios de unión en BIACORE se realizan usando la proteína de fusión receptor de IL-17 Fc (R&D N° ref:177-IR). Para demostrar que la proteína de fusión receptor de IL-17 Fc se une a IL-17 humana, se realiza un ensayo en B iAc ORE en tampón de unión BIACORE (HBS-EP) 1 mg/ml de BSA a 25 "C en un instrumento BIACORE 2000. Se usó un chip CM4 con aproximadamente 600 unidades de respuesta de proteína A inmovilizada en células de flujo 1, 2 y 3 del chip. Se capturaron aproximadamente 100 unidades de respuesta de la proteína de fusión receptor de IL-17 Fc en la célula de flujo 2 del chip. La IL-17 humana se expuso después a células de flujo 1 y 2 en concentraciones que varían de 600 nM a 9,4 nM. Después de cada inyección de 250 gl de IL-17 humana, se permite que el complejo se disocie durante aproximadamente 12 minutos haciendo pasar tampón a través del chip. Al finalizar la disociación, se usa una inyección de 20 gl de glicina 100 mM, pH 1,5, para regenerar el chip antes de comenzar el siguiente ciclo de unión. La célula de flujo 1 se usa como una célula de flujo de referencia. Los datos se ajustan usando el modelo de "analito bivalente" en el programa informático BIAevaluation versión 3.2. Los resultados indican que esta interacción tiene una constante de asociación de 1,06 x 105 M-1 s-1, una constante de disociación rápida de 20,3 s-1 y una constante de disociación lenta de 1,63 x 10-4 s-1. Por lo tanto, esta interacción tiene una K^do afinidad de unión de 1,5 nM y 0,19 mM que es mucho más débil que las afinidades de unión de los anticuerpos de la invención a IL-17 humana.

La unión para el experimento de competencia también se mide en HBS-EP 1 mg/ml BSA a 25 "C en un instrumento BIACORE 2000 con un chip CM4. Aproximadamente 1000 unidades de respuesta de un anticuerpo de la invención están inmovilizadas en células de flujo 2, 3 y 4 del chip; la célula de flujo 1 se deja como blanco. Usando una velocidad de flujo de 50 gl/ml, se inyectan 25 gl de IL-17 humana 500 nM en las cuatro células de flujo, formando el complejo anticuerpo:antígeno en la superficie del chip. Después de completar la inyección y de formarse el complejo, se inyectan 250 gl de proteína de fusión receptor de IL-17 humana Fc 500 nM a las cuatro células de flujo. Al finalizar esta inyección se usa una inyección de 25 gl de glicina 100 mM, pH 1,5, para regenerar el chip: El mismo experimento de unión se repite después usando una inyección de 250 gl de tampón en vez de proteína de fusión receptor de IL-17 Fc.

Los perfiles de unión para la inyección de receptor al complejo anticuerpo;antígeno y para la inyección de control de tampón al complejo anticuerpo:antígeno son idénticos. Esto indica que no existen sitios de unión disponibles para que la IL-17 dimérica se una a su receptor una vez se ha unido a un anticuerpo de la invención. Este resultado también indica que el receptor no es capaz de "desplazar" la IL-17 de ninguno de los anticuerpos una vez se ha formado el complejo. Estos anticuerpos pueden inhibir la IL-17 humana de que se una a su receptor, neutralizando, por lo tanto, la actividad biológica de la IL-17 humana.

Ejemplo 6A Ensayo indicador de IL-8 in vitro

Para analizar la capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar o antagonizar la bioactividad de una IL 17, se puede usar el ensayo indicador de IL-8 descrito en el presente documento. Este enfoque también puede usarse para determinar la potencia de Fab o mAb de la invención en un ensayo basado en células. La línea celular HS27 humana (ATCC N° ref:CRL-1634) segrega la IL-8 en respuesta a la IL-17. La secreción de IL-8 inducida por IL-17 se inhibe neutralizando anticuerpos anti-IL-17 (Véase, por ejemplo, J. Imm. 155:5483-5486, 1995 o Cytokine 9:794-800, 1997). En consecuencia, la secreción de IL-8 inducida por IL-17 debería tener lugar de forma no limitada si se añade suficiente IL-17 a células HS27 en ausencia de anticuerpo anti-IL-17 neutralizador.

Las células HS27 se mantienen en medio de ensayo: medio DMEM con alta concentración de glucosa que carece de rojo fenol (Invitrogen N° ref:31053-028) con suero de bovino fetal al 10 %, L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G (100 U/500 ml) y estreptomicina (100 pg/500 ml). Las células se cultivan en recipientes T 150 hasta que son aproximadamente el 80-90 % confluentes el día del ensayo. Se reconstituye IL-17 humana (R&D Systems, N° ref:317-IL-050) en PBS estéril sin Ca2+ni Mg2+almacenado congelado, descongelado recientemente para su uso y diluido a 200 ng/ml en medio de ensayo. Se añade una parte alícuota de 50 pl de la IL-17 diluida a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos (Falcon N° ref:35-3072) dejando vacíos los pocillos exteriores. Se usan pocillos por duplicado para un control de sólo el medio (100 pl/pocillo) y un control de sólo la IL-17 (100 pl/pocillos). El análisis se realiza por duplicado o por triplicado. Se diluyen proteínas mAb de longitud completa a una concentración máxima de 24 mg/ml de medio de ensayo. Se realizan diluciones seriadas (típicamente 1:5) en una placa de ensayo aparte y se añaden 50 pl de las muestras de Fab a diversas diluciones a los pocillos que contienen la IL-17 y después se incuban a 37 °C durante 1 hora. El medio de ensayo solo se usa como control negativo.

Se añaden células HS27 (típicamente 20.000 células en 100 pl de medio de ensayo) a cada pocillo de la placa que contiene Fab IL-17 (o controles) y se incuba durante 48 horas a 37 °C. Después, los sobrenadantes del medio se recogen después de la centrifugación de las placas de 96 pocillos durante 5 minutos a 500 veces la gravedad y se diluyen 1:15 o 1:10 en medio de ensayo. El nivel de neutralización de IL-17 se mide determinando las cantidades de IL-8 en el sobrenadante usando un kit de ELISA comercial siguiendo las instrucciones del fabricante excepto que el medio de ensayo se sustituye por diluyente estándar y el volumen de sustrato es de 100 pl/pocillo (R&D Systems, ELISA D-8000C o R&D DuoSet ELISA N° ref:DY208hIL-8). Las mediciones de ELISA (450 nm) se toman en un lector de microplacas. Las curves de calibración se obtienen usando un ajuste logístico de 4 parámetros con valores de IL-8 (pg/ml) determinados a partir de las curvas de calibración usando técnicas estadísticas estándar. Los valores de CI50 se obtienen usando técnicas estadísticas estándar.

Los mab de longitud completa 103, 104, 121 y 126 de la invención (con región Fc de IgG4), cuando se analizan en el ensayo descrito (2-4 replicaciones), tienen una CI50 media (basada en un peso molecular estimado de 150 kD para cada mAb) de entre 450 y 500 pM, estando el intervalo de todos los valores medidos entre 365 y 618 pM.

Ejemplo 6B Ensayo indicador de GRO-a in vitro

Para analizar la capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar o antagonizar la bioactividad de una IL-17, se puede usar el ensayo basado en células siguiente. La IL-17 puede estimular células epiteliales y otras células para que segregen GRO-a. La capacidad de un anticuerpo de la invención para neutralizar la secreción de GRO-a inducida por IL-17 a partir de la línea celular HT-29 epitelial de adenocarcinoma colorrectal humana se analiza en este ensayo.

Para analizar si la secreción de GRO-a inducida de forma dependiente de la dosis por IL-17 a partir de células HT-29, se diluye IL-17 recombinante (R&D Systems N° ref:317-IL-050/CF, reconstituido en PBS de Dulbecco sin Ca2+ ni Mg2+ (D-PBS)) (a 4,5 pg/ml; 3X la concentración de ensayo más alta) en medio de ensayo/cultivo (McCoy's 5A (Invitrogen); FSA al 10 %(Invitrogen); penicilina G (100 U/500 ml) y estreptomicina (100 pg/500 ml. La IL-17 se diluye serialmente posteriormente (1:5) en medio de ensayo. Se dispensan diversas concentraciones de IL-17 (0,096 ng/ml - 1,500 ng/ml; 3,0 pM - 46,875 pM) (50 pl cada una) en pocillos internos de una placa de 96 pocillos tratados con cultivo tisular. Se dispensa medio de ensayo (50 pl) en 3 pocillos para un tratamiento de "medio solo". El análisis se realiza por triplicado (3 pocillos por tratamiento). La placa que contiene IL-17 en medio de ensayo se incuba durante aproximadamente 60 90 minutos a 37 °C, CO2 al 5 % antes de la adición de células HT-29.

Para la evaluación de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, mAb 126 con una región Fc de IgG4 , se usa una concentración de IL-17 que daba aproximadamente el 70 % de secreción de GRODa de células HT-29 (60 ng/ml). Se diluye IL-17 humana recombinante (R&DSystems) (a 240 ng/ml; 4X concentración de trabajo) en medio de ensayo/cultivo. La IL-17 diluida se dispensa (50 pl) en 60 pocillos interiores separados de placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular (Becton Dickinson Falcon N° ref:35-3072). Se dispensa medio de ensayo (50 pl) en 3 pocillos para un tratamiento "medio solo".

Un intervalo de dosis de un anticuerpo de la invención que se va a analizar es típicamente de 2,56 - 40.000 pM. En una placa de dilución aparte, el anticuerpo de la invención y el anticuerpo control (estéril, en 1X PBS, pH 7,4) se diluye a 160.000 pM en medio de ensayo. El anticuerpo de la invención y el anticuerpo de control se diluyen posteriormente serialmente (1:5) en medio de ensayo. Cada concentración de ensayo del anticuerpo de la invención que se va a analizar se añade después (50 pl) a pocillos que contiene IL-17. El análisis se realiza típicamente por triplicado. Se usa medio de ensayo solo (50 pl) para controles de "medio solo" y "IL-17 solo". Las placas que contiene IL-17 y anticuerpo en medio de ensayo se incuban durante aproximadamente 60-90 minutos a 37 °C, CO2 al 5 % antes de la adición de células HT-29.

Las células HT-29 (células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano, ATCC N° ref:HTB-38) se mantienen en medio de cultivo/ensayo en recipientes tratados con cultivo tisular usando técnicas estándar. Las células HT-29 se cultivan en recipientes de cultivo tisular hasta que son el 50-80 % confluentes el día del ensayo. El día del ensayo, las células se enjuagan con HBSS (Cambrex N° ref:CC-5024) y se retiran de los recipientes de cultivo con tripsina EDTA. La tripsina se inactiva con medio de ensayo completo. Después, las células HT-29 se centrifugan a 500X g durante 5 min a TA (temperatura ambiente). La pella de células se resuspende después en medio de ensayo y se añaden 20.000 células HT-29 (en 100 j l) a cada pocillo de tratamiento de las placas de 96 pocillos. Se añade un volumen igual de D-PBS a cada uno de los pocillos laterales no usados (sin células) para reducir los efectos colaterales resultantes de la evaporación. Las placas de 96 pocillos se disponen en una incubadora de cultivo tisular (37 °C, CO2 al 5 %) durante aproximadamente 48 horas.

Al finalizar el ensayo, las placas se centrifugan (500X g durante 5 min a Ta) y el medio de cultivo celular se transfiere a placas de 96 pocillos de polipropileno. Los niveles de GROa se miden con un ELISA sándwich de GROa (R+D Systems, DuoSet N° ref:DY275) tal como se indica en las instrucciones del fabricante excepto en que: se usa medio de ensayo como diluyente estándar, se usa 1X tampón de lavado de ELISA de BioFX Labs, se usan volumen de muestra y estándar de 50 j l por pocillo, se usa un sustrato de BioFX Labs (sustrato HRP, N° ref:TMBW-1000-01) y se usa una solución de detención de BioFX Labs (N° ref:LSTP-1000-01) (100 j l por pocillo). Al finalizar las reacciones del ELISA, las placas se leen a 450 nm en un lector de microplacas. Las curvas de calibración para GROa se obtienen realizando un ajuste logístico de 4 parámetros. Los valores de GROa (concentración en pg/ml) para las muestras se obtienen a partir de las curvas de calibración. La línea celular epitelial de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 segregó GROa cuando se estimuló con IL-17 de un modo dependiente de la dosis (tabla 5). La IgG4 humana de control no causó una disminución en la secreción de GROa inducida por IL-17. Estos resultados (tabla 6) demuestran que el mAb 126 es capaz de neutralizar completamente la secreción de GROa inducida por IL-17 por parte de células HT-29 in vitro usando las condiciones descritas. El valor de CI50 para mAb 126 en este ensayo es aproximadamente 560 pM.

______________________________________Tabla 5_______________________

IL-17 humana (ng/ml)____________GROaDPROM (pg/ml)___________ DEVT

1.500.00 2.420,4 311,8

300.00 2.047,5 509,9

60.00 1.556,0 209,0

12.00 960,0 24,9

2,40 502,5 12,3

0,48 297,9 6,3

0,10 205,8 4,8 0_____________________________ 149,2__________________________16,7

Abreviaturas: PROM = promedio; DEVT = desviación típica

Tabla 6

mAb 126 IgG4 negative control

Concentración de GROaPROM, DEVT GROaPROM, DEVT

anticuerpo, pM pg/ml pg/ml

40.000,0 123,8 1,4 1.297,3 29,4

8.000,0 134,1 6,4 1.419,9 133,4

1.600,0 151,3 9,5 1.370,4 114,7

320,0 1.170,6 56,0 1.388,6 54,1

64,0 1.340,8 59,1 1.380,4 36,0

12,8 1.362,0 21,1 1.346,2 81,6

2,56 1.280,9 56,1 1.243,4 118,3

0 (IL-17 solo) 1.201,4 66,1

Medio solo 117,2 10,0

Abreviaturas: PROM = promedio; DEVT = desviación típica

Ejemplo 7 Neutralización In vivo de IL-17h

La IL-17 humana es capaz de unirse y estimular el receptor de IL-17, dando como resultado una elevación y la subsiguiente secreción de quimiocina KC de ratón (CXCL1). Se realizan experimentos que varían el tiempo y la dosis para identificar la dosis óptima de IL-17 humana y el tiempo óptimo para la inducción de KC de ratón. Estos experimentos indican que una dosis de 150 jg/kg de IL-17 humana y un tiempo de 2 horas después de la administración de IL-17 da niveles máximos de KC en suero de ratón. Los anticuerpos de longitud completa de la presente invención (por ejemplo, Fab 126 o Fab 121 con HCVR unida operativamente a Fc de IgG4, SEQ ID NO: 260 [o SEQ ID NO: 278] y la LCv R unida operativamente a una región constante kappa humana, SEQ ID NO: 263 [o SEQ ID NO: 277]) se administran intravenosamente a ratones a 1, 10, 100 y 1000 pg/kg una hora antes de una inyección subcutánea de IL-17 humana. A las dos horas después de la administración de IL-17 humana, los ratones se sacrifican y se determinan niveles de KC mediante ELISA usando un kit disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante (KC Quantikine, R&D). Se usa como controles negativos anticuerpos emparejados con isotipos. Los anticuerpos bloquean la capacidad de IL-17 humana para estimular el receptor de IL-17 de ratón, causando la inhibición de la elevación de KC de ratón, de un modo dependiente de la dosis. El mab126 (un anticuerpo de longitud completa que comprende Fab 126), a una dosis de 20 pg/ratón en las condiciones descritas, disminuye el nivel de KC promedio en aproximadamente cuatro veces en comparación con un anticuerpo control que no tiene efecto. El mab 121, a una dosis de 20 pg/ratón en las condiciones descritas, disminuye el nivel de KC promedio en aproximadamente tres veces en comparación con el anticuerpo de control.

Ejemplo 8 Cartografía de epítopes

Se usan dos de los anticuerpos anti-IL-17 (Fab 126 y Fab 104) para determinar que la humanización y optimización del Fab murino parental (2321, SEQ ID NO: 261 y 262) no altera la capacidad de unión al epítope de las Fab resultantes de la humanización y optimización del compuesto parental. Las Fab optimizadas humanizadas se unen al mismo epítope que el Fab murino parental según se determina mediante un ELISA de competencia estándar o mediante intercambio H-D y análisis de espectroscopia de masas para cartografiar el epítope (Véase, por ejemplo, Hoofnagle, A. y col., Methods Mol. Biol. 250:283-298, 2004; Hoofnagle, A. y col., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32:1-25, 2003; Baerga-Ortiz, A. y col., Protein Sci. 11:1300-8,2002) por lo tanto, los Fab 1-132 de la invención derivados del mismo Fab parental, se esperaría que se unan al mismo epítope.

Usando el intercambio H-D y el ensayo de espectroscopia de masas (H/DXMS) para cartografiar, se determina qué aminoácidos entre 80 y 89 [Ad GNVDYHMN (Se Q ID n O: 275) o IL-17 humana (SeQ ID NO: 1) están comprendidos dentro del epítope discontinuo al que se unen los anticuerpos de la invención. DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) es una secuencia esencial comprendida dentro del epítope discontinuo al que se unen anticuerpos de la invención sobre la base de una comparación de variación de secuencia de IL-17 entre diferentes especies y capacidad de unión. El cambio de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 267 dentro del contexto de la secuencia de IL-17 total, da como resultado la unión no detectable a la IL-17 alterada por parte de un anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de la invención no se unen a IL-17 de rata o ratón a niveles superiores al anticuerpo de control.

El ensayo de H/DXMS se usa para identificar regiones de IL-17 a las que se unen anticuerpos de la invención. La tasa de intercambio de hidrógeno de amida es dependiente de la estructura y de la accesibilidad al disolvente del hidrógeno de la amida. La IL-17 libre o el complejo IL-17: anticuerpo en agua se mezcla con agua deuterada (D2O) para permitir el intercambio de protones de la amida por deuterio. Esos grupos amida del esqueleto que participan en la unión a proteína se protegen del intercambio y permanecen protonados. Estas regiones se identifican después mediante proteólisis péptica, acoplada con CL y espectroscopia de masas por ionización mediante electropulverización. La IL-17 humana que contiene una etiqueta C-terminal His y Flag (IL-17-Flis) se expresa y purifica a partir de células GS-CHO usando una columna IMAC. Dos partes alícuotas de 10 pg (7,7 pl) de solución de IL-17-Flis se transfieren a 2 Microcon y se añaden 100 pg de bien mAb104 o bien mAb126 (relación molar de IL-17/Mab = 1/2) al Microcon. Se transfieren veinte pg de solución de IL-17-Flis a otro Microcon y no se añade anticuerpo. Después, se añade 1x PBS a cada Microcon a un volumen final de ~180 pl y se centrifuga a 14.000 g durante 14 min. Después se añaden 150 ml de 1x tampón PBS a cada Microcon y se centrifuga a 14.000 g durante 14 min. Estas etapas son necesarias para asegurar que el antígeno libre y el complejo antígeno:anticuerpo se encuentran en condiciones de tamponamiento idénticas.

La porción de proteína se recoge y el volumen final se ajusta a 50 pl (complejo) u 80 pl (IL-17-Flis solo) con 1x PBS. Seis microlitros de IL-17-Flis o complejo de IL-17-Flis y mAb se transfieren a un vial de micro plástico y se añaden 14 pl de D2O al 100 % al mismo, dando como resultado un 70 % de D2O en la muestra. La solución se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. El intercambio se inactiva inmediatamente, se digiere añadiendo 20 pl de solución de ácido fórmico al 1 % y 2 pl de solución 2 mg/ml de pepsina, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 segundos o a 0 °C durante 10 min. La digestión se inyecta inmediatamente en una columna manualmente. Se usan Waters 2795 HPLC y Micromass LTC Premier para todos los ensayos. La corriente de HPLC de la bomba de HPLC se conecta a un tubo metálico (aproximadamente 1 ml), a un inyector manual, a una columna Zorbax C18 (2.135 mm) que operan con estos ajustes (temperatura de columna :0 °C; fase móvil C: ácido fórmico al 0,15 % en H2O, D: ácido fórmico al 0,12 % en a CN; tiempo de ejecución:23 min). La columna se equilibra con el 98 % de A (solución acuosa de ácido fórmico al 0,15 %) y el 2 % de B (ácido fórmico al 0,12 % en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Se realiza un gradiente de elución del 2 % al 10 % de B durante 0,5 min, después al 40 % de B durante 14,5 min, después al 90 % de B durante 1 min y se mantiene 2 min, y después se vuelve al 2 % de B en 1 min). La muestra de HPLC se analiza mediante espectrometría de masas realizada con estos ajustes (modo ion: positivo; intervalo de escaneo de masas: 300-2000; cono de voltaje de la muestra: 80; flujo de gas de desolvatación (l/h):700; temperatura de desolvatación: 300 °C). El tubo metálico, el bucle inyector y la columna se sumergen en agua helada a lo largo del ensayo. El espectro de masas de cada péptido péptico de IL-17 se obtiene después del intercambio H/D con o sin un mAb anti-IL-17 analizado. Para péptidos pequeños, la masa promedio de cada péptido se calcula sobre la base de sus iones isotópicos e intensidades. Para péptidos grandes, las masas promedio se obtienen a partir de espectros de masas desconvulados después de calibración interna.

Cuando el anticuerpo forma un complejo con la IL-17, la región de unión (epítope) de IL-17 se protege del disolvente. Esto da como resultado unas velocidades de intercambio de hidrógeno de amida más lentas en comparación con la IL-17 sola. Comparando la masa de péptidos a partir de la forma libre y de complejo después del intercambio por deuterio, los péptidos protegidos mediante formación de complejo deberían ser diferentes de los péptidos correspondientes en la IL-17 libre. La tabla 7 más adelante enumera diferencias de masa que se obtienen por H/DXMS para péptidos pépticos de IL-17. Estos péptidos pépticos cubren la secuencia completa de IL-17-Flis. Tal como demuestran los datos de la tabla, la diferencia de masa de péptido IL-17-Flis entre el complejo y el mismo es similar para ambos anticuerpos analizados, es decir, se unen al mismo epítope. Se encuentra una diferencia de masa mayor para el péptido péptico 24-87+117-133 (es decir, aminoácidos 24 a 87 y 117 a 133 de IL-17) (estos dos péptidos están conectados mediante un enlace disulfuro) y 6-87+117-134, lo que sugiere que restos de estas regiones están implicados en la unión. Debido a que esos péptidos pépticos son bastante grandes, son necesarias otras digestiones enzimáticas para reducir los restos de aminoácidos específicos implicados en la unión. Además de estos datos, los anticuerpos de la invención no se unen a otro miembro de la familia IL-17 (IL-17 B, C, D, E y F) y tampoco se unen a IL-17 de ratón o de rata. Estos datos sugieren conjuntamente con la comparación y examen de secuencia del modelo estructural de homología de IL-17 que los restos 80-89 están comprendidos en un epítope no lineal de IL-17 al que se unen los anticuerpos de la invención.

Tabla 7

Ejemplo 9 Expresión de IL-17 en tejidos cancerosos

Se analizan diversos lisados de células no cancerosas y cancerosas humanas para determinar la presencia de proteína IL-17. Los tejidos (aproximadamente 50-100 mg por pieza) se congelan instantáneamente sobre hielo seco, se descongelan sobre hielo y se lisan en 350 pl de tampón TPER (Pierce N° ref:78510) incluidos inhibidores de proteasas (Pierce N° ref:78410) e inhibidores de fosfatasa en tubos que contienen perlas de lisis cerámicas (Qbiogene N° ref:6913-050; perlas cerámicas de 1,4 mm en tubos de 2,0 ml). Los tubos se disponen sobre hielo durante 5-10 min y después se centrifugan a 13.000 x gravedad durante 10 min a 4 °C y el material se transfiere a tubos nuevos para eliminar los desechos. Se vuelven a centrifugar tal como se describe y se transfieren a tubos nuevos. La concentración de proteína se determina usando un procedimiento en BSA estándar. Las muestras se analizan después para determinar la IL-17 usando un kit de ELISA IL-17 comercial según las instrucciones del fabricante (R&D N° ref:DY317 usando tampón de lavado, solución de sustrato y solución de detención de BioFX Labs). Los niveles de IL-17 se normalizan a la concentración de proteínas total. Los niveles de IL-17 aumentan entre dos y tres veces en tejidos de colon cancerosos (60 muestras analizadas) en comparación con tejido de colon normal (63 muestras analizadas). Los niveles de IL-17 aumentan de media entre tres y cuatro veces en tejidos de riñón cancerosos (21 muestras analizadas) en comparación con tejido de riñón normal (21 muestras analizadas). Los niveles de IL-17 en tejido de próstata canceroso (44 muestras analizadas) aumentan en comparación con el tejido de próstata normal (7 muestras analizadas). Los niveles de IL-17no se elevaron en otros tipos de tejido tumoral analizados, incluido de mama, cuello, pulmón, laringe, tiroides, lengua, ovario y cerebro.

Ejemplo 10 Activación de IL-17 de células m icrogliales

La IL-17 induce a una línea celular de microglía de cerebro murina (BV-2) a segregar IFN y p70 de IL-12. La línea celular microglial murina BV-2 [obtenida de Scios, con permiso de Elisabeta Blasi (Universidad de Microbiología de Perugia, Italia) que las aisló originariamente (E. Blasi y col., J. Immunology 1990, 27:229-237)] se cultivan en recipientes de cultivo tisular recubiertos con poli-D-lisina, a una confluencia no superior al 60 % en DMEM con alta concentración de glucosa (Invitrogen N° ref:31053-028) con L-glutamina 2 mM (Invitrogen/GIBCO N° ref:25030-081), FBS al 10 % (inactivada mediante calentamiento; Invitrogen/GIBCO N° ref:10082-147), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen/GIBCO N° ref:11360-070), 100 pg/ml de Normocina (InvivoGen) a 37 °C, CO2 al 5 %.

El día 0 del ensayo, las células BV-2 se enjuagan (PBS de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+; Invitrogen), se retiran (tripsina al 0,25 % EDTA) seguido por la inactivación con tripsina y después se centrifugan (500X g 5 min a TA). La pella de células resultante se resuspende a una densidad de células de ~7.000 células/100 j l de medio de cultivo. Se dispensan 100 j l de suspensión de células en 60 pocillos interiores separados de placas de 96 pocillo tratadas con cultivo tisular recubiertas con poli-D-lisina. Las placas se incuban tal como se describe durante aproximadamente 48 horas antes del tratamiento con IL-17.

El día 2 del ensayo, se diluye IL-17 de ratón recombinante (IL-17r) (exento de vehículo; R&D Systems); reconstituido en PBS de Dulbecco sin Ca2+ ni Mg2+ en una placa de polipropileno a 1,5 jg/m l (la concentración de ensayo más elevada) en medio de cultivo. La IL-17 de ratón se diluye serialmente posteriormente en la placa de polipropileno. Un control positivo es LPS diluido en medio de cultivo a 1 jg/m l (la concentración de ensayo más elevada). El medio de ensayo se usa como control negativo. El medio se aspira cuidadosamente de las células, antes de añadir tratamientos (150 jl/pocillo). El análisis se realiza por triplicado (3 pocillos por tratamiento). Se incuban placas replicadas aparte durante bien 24 h o bien 48 h a 37 °C, CO2 al 5 %.

Los días 3 y 4 del ensayo, las placas se centrifugan (500X g durante 5 min a TA), después el medio de cultivo celular se transfiere a placas de 96 pocillos de polipropileno, que están selladas y congeladas (-80 °C). Las muestras de medio se descongelan y se analizan para determinar los niveles de citocina y quimiocina con un kit multiplex 22-plex (Linco), según las instrucciones del fabricante (excepto: una placa de filtro de policarbonato con las paredes negras (Millipore) reemplaza a la placa de filtro incluida en el kit). La fluorescencia se lee en un instrumento Luminex® (50 perlas por cada conjunto de perlas, ajuste de ganancia de RP1 bajo). Los datos se muestran más adelante en la tabla 8.

Se obtienen curves estándar usando un ajuste logístico de cuatro o cinco parámetros. Los valores de IFNy y IL-12p70 (pg/ml) se determinan a partir de las curvas estándar usando técnicas estadísticas estándar.

Tabla 8

Ejemplo 11 Modelo de inducción de DSS de trastorno del intestino irritable

El IBD es una enfermedad inflamatoria crónica que incluye la enfermedad de Crohny colitis ulcerativa. Los niveles de proteína IL-17 son significativamente elevados en los sueros y en los tejidos de colon de pacientes con colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. No obstante, la IL-17 no es detectable en los sueros de individuos normales, o de pacientes con colitis infecciosa o colitis isquémica. El modelo de DSS (sulfato de dextrano y sodio) es uno de los modelos preclínicos más antiguos y representativos para la enfermedad del intestino irritable (IBD). En el modelo de DSS (véase, por ejemplo, FASEB Journal. 2004;18:1550-1552) se inducen tanto lesiones inflamatorias agudas como crónicas. Los ratones tienen un alto grado de uniformidad de las lesiones con perdida de peso corporal y longitud de colon. Es reproducible con respecto al transcurso del tiempo y la gravedad entre ratones individuales. Para inducir la enfermedad, los ratones reciben DSS al 5 % de 30-40 Kd) en agua de bebida durante 7 días. El índice de actividad de la enfermedad (DAI) que incluye hemocultivo positivo o sangrado rectal, deposiciones blandas y perdida de peso corporal (5-8 %) se observa a aproximadamente el día 8. Se realiza un seguimiento del peso corporal de los ratones cada día durante 2 semanas. Los ratones se sacrifican de aproximadamente el día 12 a aproximadamente el día 15. La proteína IL-17 está aumentada significativamente en colon tratado con DSS en comparación con colon sin tratamiento previo. El tratamiento con anticuerpo IL-17 puede reducir el índice de actividad de la enfermedad.

Ejemplo 12 Modelo EAE para esclerosis múltiple

La EAE es una enfermedad desmielinizante mediada por linfocitos T CD4+ del sistema nervioso central (SNC) que sirve como modelo para EM en seres humanos. Los mecanismos patógenos del desarrollo de EAE incluyen activación de linfocitos T específicos del antígeno y diferenciación de Th1 seguido por infiltración de macrófagos en el SNC. La IL-17 contribuye a la patología de la esclerosis múltiple (EM). Los análisis de microselección de lesiones de EM en pacientes humanos demostraron un aumento de IL-17 (Lock y col. Nat. Med. 8:500-508, 2002). Las células mononucleares (MNC) que expresan ARNm de IL-17 en sangre y fluido cerebroespinal están significativamente elevados en un número de pacientes con EM y se detectaron niveles más altos de MNC que expresa ARNm de IL-17 durante la exacerbación clínica de EM en comparación con la remisión (Matusevicius y col. Multiple Sclerosis. 5:1-1-104, 1999). La EAE se suprime significativamente en ratones con IL-17 inactivada (Nakae y col., J. Immun. 171:6173-6177).

El ejemplo descrito en el presente documento demuestra que la proteína IL-17 aumenta en la medula espinal de ratones con EAE y el tratamiento con un anticuerpo IL-17 antimurino reduce los registros de EAE en el modelo de EAE activo. Para la inducción de la enfermedad, se inmunizaron subcutáneamente ratones C57BL/6 hembra de 8-9 semanas de edad el día 0 con bien (i) 200 pl de 5 mg/ml de toxina pertussis (PT) y coadyuvante de Freund completo (CFA) o bien (ii) PT, CFA y 300 pg/200 pl de MOG35-55 (glucoproteína de oligodendrocito de mielina emulsionada en CFA que contiene 5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis inactivado mediante calor). El día 2, los ratones se tratan de nuevo con PT. Los ratones se registran a lo largo del estudio para determinar niveles de parálisis. Se espera la enfermedad en el grupo que recibe MOG. Un anticuerpo IgG1 monoclonal IL-17 anti-murino o anticuerpo de control isotípico se administra a ratones los días 1, 7 y 15 (BD Biosciences para anticuerpo IL-17 anti-murino de rata). Los ratones que recibieron MOG se sacrificaron cuando se alcanzaron registros clínicos entre 1-3 (en una escala de 0-4); esto es entre los días 14-31 para el estudio 1 en la tabla 9 más adelante y entre los días 14-16 para el estudio 2 en la tabla 10 más adelante. Los signos clínicos de la enfermedad se desarrollan aproximadamente el día 10. Los animales individuales se registran subjetivamente mediante al menos 2 registros independientemente y se ciegan a la identidad de grupos de tratamiento según la gravedad de la enfermedad del SNC clínica. El grado 0 es normal; el grado 1 es un rabo completamente mustio; el grado 2 es debilidad de las extremidades posteriores parcial unilateral; el grado 3 es parálisis total de las extremidades posteriores y el grado 4 es que el ratón está moribundo. (véase J. Exp. Med. 194: 873-881, 2001). Se sacrifica un ratón de control el mismo día que los ratones tratados con MOG. Las médulas espinales se aíslan en el momento del sacrificio y se congelan instantáneamente para usarlas para el análisis de proteína IL-17 por ELISA. El grupo de tratamiento de anticuerpo IL-17 tiene registros de la enfermedad significativamente inferiores en comparación con el grupo de control isotípico.

Se preparan lisados de cada médula espinal completa en 1 ml (estudio 1 en la tabla 9 más adelante) o 0,4 ml (estudio 2 en la tabla 7 más adelante) de reactivo de extracción de proteína TPER (Pierce N° ref:78510) con inhibidores de proteasa completos (Roche Applied Science N° ref:11697498), en tubos de 2 ml que contienen perlas cerámicas (matriz de lisis D, QBiogene N° ref:6913050), e instrumento FastPrep (Bio101) durante 30 segundos a una escala de 5,5. Después de la lisis, las muestras se centrifugan (5 min a 14.000 rpm en un microcentrifugador) para eliminar desechos. Los sobrenadantes se transfieren a tubos de microcentrifugador nuevos. La concentración total de proteína en cada lisado se determina con el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce N° ref:23225), usando el protocolo de microplaca del fabricante. Los lisados se congelan y se almacenan a -80 °C.

Después de descongelar los lisados sobre hielo y aclararlos por centrifugación, los niveles de IL-17 de ratón se miden en muestras no diluidas por ELISA (R&D Quantikine N° ref:M1700) según las instrucciones del fabricante. Se obtienen curves estándar usando un ajuste logístico de cuatro parámetros. Los valores de IL-17 se determinan a partir de las curvas estándar usando técnicas estadísticas estándar. Los niveles de IL-17 se normalizan a la concentración de proteína en cada muestra y se expresan como pg de IL-17/ml en cada lisado en las tablas 9 y 10 más adelante. Tal como se demuestra por los datos de las tablas, se detectaron niveles aumentados de IL-17 en ratones con EAE.

Tabla 9

Tabla 10

Ejemplo 13 Modelo de artritis inducida por colágeno

La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo de roedor usado ampliamente para artritis reumatoide ("AR") y tiene características histopatológicas en común con AR humana. La artritis experimental inducida en ratones DBA/1 mediante inmunización y refuerzo con emulsiones de colágeno de tipo II, es una enfermedad poliartrítica caracterizada por la inflamación de articulaciones y erosión progresiva del cartílago y el hueso (Trentham D y col., J. Exp. Med.

146:857-858, 1977). Recientemente, Lubberts y col., (Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004; incorporado al presente documento) demostraron que el anticuerpo IL-17 anti-murino de conejo policlonal, administrado bien en el momento de aparición o en un estadio más tardío de CIA murina, mejora los signos clínicos de la artritis.

En el modelo CIA, los ratones a los que se administró una única inyección de mAb de IgG2a de IL-17 anti-murino de rata intraperitonealmente (8 mg/kg R&D, clon 50104.11 de MAB421) muestran registros clínicos significativamente más bajos que los ratones a los que se inyectó 16 mg/kg de IgG2a de rata de control. El reactante de fase aguda, la proteína C-reactiva (CRP), es un índice aceptado de la actividad de la enfermedad en pacientes con AR. De forma similar al CRP, la proteína amiloide en suero murina (SAP) sirve como indicador de la enfermedad en el modelo de CIA murina (Bliven, M. y col., Arthritis & Rheumatism, 29:1131-1138, 1986). En animales tratados con 8 mg/kg de IL-17 anti-murino los niveles de SAP fueron significativamente inferiores a los encontrados en los tratados con anticuerpo de control. Además, la disminución de registros clínicos y valores de SAP son comparables a un grupo de IL-1p anti ratón (8 mg/kg) usado como control positivo. Finalmente, la reducción significativa en inflamación sinovial a 8 mg/kg de anticuerpo y la reabsorción ósea a 16 mg/kg de anticuerpo está presente en comparación con la de ratones tratados con anticuerpo de control. Puede realizarse un estudio de respuesta a la dosis en el modelo CIA con anticuerpo IL-17 antimurino (por ejemplo, a 0,1, 1 y 8 mg/kg). Los registros clínicos para IL-17 anti-murino de rata representan una tendencia para una respuesta a la dosis. Se puede realizar un ensayo similar en monos cynomolgus como modelo para AR usando un anticuerpo de la invención.

Ejemplo 14 Purificación de mAb anti-IL-17

Un vector que expresa un mAb de la invención se incorpora de forma estable a una célula huésped apropiada, (por ejemplo, células CHO DG44 (dhfr-) (Chasin) o células NSO) usando procedimientos estándar y se purifican usando una columna de afinidad de Proteína A. Brevemente, se aplica medio acondicionado clarificado a una columna FF de sefarosa de 5 ml HiTrap rProtein A (Amersham Biosciences) que se ha equilibrado con PBS (pH 7,4). La columna se lava con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibración a una velocidad de flujo de 110 cm/h para retirar mediante lavado componentes de unión no específicos. El anticuerpo de unión se eluye usando un gradiente de pH lineal (tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,8, a tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 2,5). El pico de proteína principal en la elución se recoge y su pH se ajusta para neutralizar con tampón de Tris 1 M (pH 8,5). La proteína reunida se concentra a 1-2 mg/ml usando membrana Vivaspina 10K (Vivasciences) y se filtra de forma estéril (0,45 |jm) antes de almacenamiento a 4 °C.

Para preparaciones grandes de un mAb de la invención, el concentrado exento de células se purifica mediante tres columnas cromatográficas secuenciales (proteína A, intercambio aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba).

La pureza del mAb después de estas etapas cromatográficas es superior al 99 % tal como se evalúa mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica. El mAb se intercambia en un tampón tal como se enumera más adelante dependiendo de la concentración del anticuerpo. Los resultados de estabilidad química indican un pH entre 6,0 y 7,0 (incluidos); aunque para preparaciones de 20 mg/ml, el pH puede encontrarse entre 5,5 y 7,0 (incluidos, por ejemplo, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6, o 7,0). Para el producto liofilizado es preferentes un nivel de cloruro sódico de 90-30 mM (90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 o 30 mM o cualquier valor entre 30 y 90 mM), mientras que para una formulación líquida (por ejemplo, para administrar subcutáneamente) es preferente un nivel de cloruro de sodio de 100 - 150 mM (100, 110, 120, 130, 140 o 150 mM o cualquier valor entre 100 y 150 mM). El producto se concentra después a una concentración final de aproximadamente 10, 20 o 25 mg/ml (alternativamente superior, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mg/ml o superior) y se filtra de forma estéril. El producto filtrado puede congelarse inmediatamente a -70 °C o puede liofilizarse. Es necesaria una relación en peso mínima de 1:2 para el anticuerpo con respecto al lioprotector (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) para lograr una formulación liofilizada estable pero no se requiere para una formulación química. Adicionalmente, se añade tensioactivo al 0,02 % (p/v), es decir, polisorbato-80, a ambas formulaciones en solución y las soluciones se liofilizan. El material liofilizado se resuspende en agua estéril para inyección o cloruro de sodio al 0,9 % estéril antes de la administración.

Tabla 11

Conc. de mAb Tampón pH NaCl (mM)

10 mg/ml citrato 10 mM(Na) 6,0 30, 50-150

20 mg/ml citrato 10 mM 5,5 50-150

20 mg/ml citrato 10 mM 6,0 50-150

20 mg/ml citrato 10 mM 6,5 50-150

20 mg/ml citrato 10 mM 7,0 50-150

20 mg/ml histidina 10 mM 6,5 150

>50 mg/ml citrato 10 mM 5,5 50-150

>50 mg/ml citrato 10 mM 6,0 50-150

>50 mg/ml citrato 10 mM 6,5 50-150

>50 mg/ml histidina 10 mM 6,5 150

Ejemplo 15 Semivida del anticuerpo in vivo

La farmacocinética en suero de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, mAb 126 y 121 [región Fc de IgG4 con Fab 126 o 121 respectivamente]) se determina después de la administración intravenosa o subcutánea en monos cynomolgus macho. Las concentraciones de los anticuerpos en el suero se determinan usando un ensayo ELISA de captura de antígeno estándar en el cual se recubren placas con IL-17 humana y se detecta el anticuerpo en suero usando un anticuerpo secundario anti-IgG4. Siguiendo la administración intravenosa de 1 mg/kg, se elimina mAb 126 con una semivida media de 6,5 días y se elimina mAb 121 con una semivida media de aproximadamente 11 días. Siguiendo a la administración subcutánea de 1 mg/kg, el mAb 126 tiene una semivida de eliminación media de 10,3 días y el mAb 121 tiene una semivida de eliminación media de 13 días.

Ejemplo 16 Modelo de xenoinjerto tumoral

Para establecer modelos de xenoinjerto tumoral con el que analizar la actividad antitumoral de anticuerpos anti-IL-17 de la invención, se mezclan 5 millones de células de carcinoma colorrecta1HCT116 con Matrigel y se inyectan en el costado derecho de ratones atímicos hembra de 56 semanas de edad (nu/nu) (laboratorios Charles River, Wilmington. MA, Estados Unidos). Los ratones se tratan mediante inyección subcutánea cada 7 días con anticuerpos de control (por ejemplo, IgG4 humana e IgG1 de ratón), 4 mg/kg de IL-17 anti-humana, 8 mg/kg de IL-17 anti-ratón o una combinación de 4 mg/kg de IL-17 anti-humana y 8 mg/kg de IL-17 anti-ratón durante 4 semanas. La primera administración del anticuerpo comienza un día antes del implante de células. Los tumores se miden dos veces cada semana con un calibrador y se realiza un seguimiento del peso corporal dos veces a la semana. Se recoge plasma de cada ratón el día 34 y se miden los niveles de KC usando un kit de ELISA de KC según las instrucciones del fabricante (R&D System). En comparación con ratones inyectados con IgG control, los ratones tratados con la combinación de anticuerpo IL-17 anti-humana y anticuerpo IL-17 anti-ratón han reducido significativamente el volumen del tumor. Además, los ratones tratados tanto con anticuerpo IL-17 anti-humano como con anticuerpo IL-17 anti-ratón han reducido dramáticamente el KC en plasma. Los ratones tratados con bien 4 mg/kg de IL-17 anti-humana o bien 8 mg/kg de IL-17 anti-ratón no revelaron ninguna reducción significativa del volumen del tumor y de niveles de KC en plasma. Los datos se muestran en las tablas 12 y 13 del presente documento.

Para medir el nivel de IL17 en los tumores, los tumores de modelos de xenoinjerto de ratón se preparan extensamente tal como se describe en el ejemplo 9. Para la medición de proteínas, los lisados tumorales se diluyen 1:10 en TPER 1X Halt en una placa de dilución de 96 pocillos de polipropileno. La concentración de proteína se determina usando el protocolo de microplaca del Ensayo de proteína Coomassie Plus (Pierce N° ref:23236). Se diluye BSA estándar en TPER Halt. Los niveles de proteína IL-17 se determinan usando el kit de ELISA IL-17 de R&D System siguiendo las instrucciones del fabricante (El ISAI DuoSet de IL-17 humana, R+D Systems, Cat. N° ref:DY317; e LiSA IL-17 de ratón, R+D System, N° de cat.421). Ambos IL-17, humano y de ratón, aumentaron en tumores de modelos de xenoinjerto tumoral de colon HCT116 y HT29 en comparación con el modelo de xenoinjerto de pulmón H460.

Tabla 12 Volumen del tumor

T l 1 i l imi in n l m í l im l n

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 humanizado, comprendiendo dicho anticuerpo:

a) un péptido con SEQ ID NO: 131 en CDRL1,

b) un péptido con SEQ ID NO: 167 en CDRL2,

c) un péptido con SEQ ID NO: 168 en CDRL3,

d) un péptido con SEQ ID NO: 26 en CDRH1,

e) un péptido con SEQ ID NO: 30 en CDRH2,

f) un péptido con SEQ ID NO: 52 en CDRH3.

2. Un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 humanizado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera (LC) que consiste en SEQ ID NO: 279 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada (HD) que consiste en SEQ ID NO: 280, en el que SEQ ID NO: 279 (LC) es:

Asp lie Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser lie

Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe lie Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys;

y en el que SEQ ID NO: 280 (HC) es:

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr His lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Val lie Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly.

3. Un anticuerpo humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv monocatenario.

4. Un anticuerpo según la reivindicación 1 o 3, en el que el anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada seleccionada entre IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM e IgD.

5. Una composición que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y en la que dicha composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento.

7. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de una o varias afecciones seleccionadas entre artritis reumatoide, trastorno inflamatorio intestinal, psoriasis y esclerosis múltiple.