IT202100023816A1 - Anticorpo contro SARS-CoV-2 e suoi usi in campo medico. - Google Patents
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Description
ANTICORPO CONTRO SARS-CoV-2 E SUOI USI IN CAMPO MEDICO
La presente invenzione riguarda un anticorpo contro SARS-CoV-2 e suoi usi in campo medico.
In particolare l?invenzione riguarda un anticorpo contro SARS-CoV-2 e suoi usi in campo medico per la prevenzione e il trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
? noto che la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) ? stata dichiarata pandemia nel Marzo 2020 dall?Organizzazione Mondiale della Sanit? (1), con manifestazioni cliniche e sintomi di tipo respiratorio acuto, infiammazione patologica e disfunzioni multiorgano. In pochi mesi, da dicembre 2019, COVID-19 si ? diffuso in tutto il mondo con oltre 151.803.822 di casi e oltre 3.186.538 decessi confermati al 2 Maggio 2021, 03:09 pm (sito web OMS). Questa situazione richiede con massima urgenza lo sviluppo di agenti preventivi e terapie sicure ed efficaci contro l'infezione del suo agente causale, il SARS-CoV-2.
Il profuso impegno da parte della comunit? scientifica nello sviluppo di vaccini per far fronte a questa emergenza ? senza precedenti e, gi? nel novembre 2020, si ? giunti ad averne diversi in fase di sperimentazione avanzata (Fase III) (Pfizer/BioNtech, Moderna), cos? come molti altri vaccini paralleli in una fase iniziale o intermedia di sviluppo. Nonostante il grande impegno finora operato, ? ipotizzabile che COVID-19 continuer? a diffondersi globalmente anche nei prossimi anni, con ondate pi? o meno cicliche fino a quando la circolazione del virus sar? effettivamente limitata mediante vaccinazione o conseguentemente a immunit? per infezione naturale di tutta la popolazione. Con tali prospettive, ? fondamentale sviluppare, parallelamente ai vaccini, altri strumenti terapeutici per affrontare le prossime ondate di infezioni da SARS-CoV-2 con estrema rapidit?.
Tra le numerose opzioni terapeutiche disponibili, gli anticorpi monoclonali umani (mAbs) sono quelli che possono incontrare maggiormente gli interessi e le strette tempistiche di richiesta.
Negli ultimi anni, i mAbs si sono dimostrati molto efficaci, meglio tollerati e di pi? immediata somministrazione rispetto ad altri tipi di trattamenti. In particolare, anticorpi sviluppati per riconoscere proteine di superficie virali sono stati di grande utilit? contro malattie infettive quali HIV, Ebola e la sindrome respiratoria mediorientale (MERS) (2, 3, 4).
Per loro natura gli anticorpi monoclonali possono fornire una rapida protezione contro le infezioni. Infatti, gli anticorpi, una volta somministrati, entrano prontamente nel flusso sanguigno e offrono una protezione immediata per alcune settimane o mesi. Dall?altra parte, i vaccini richiedono alcune settimane per avere effetto, fornendo tuttavia una protezione solitamente pi? a lungo termine. Pertanto, grazie alle loro peculiarit?, gli anticorpi monoclonali potrebbero integrare in maniera complementare i vaccini nel contenimento della pandemia.
Inoltre, i mAbs hanno la potenzialit? sia di curare pazienti infetti sia di prevenire l'infezione in individui sani. Pertanto, gli anticorpi possono avere applicazioni sia profilattiche sia terapeutiche, in particolare nei confronti di alcune fasce della popolazione, come anziani, bambini piccoli e persone immunocompromesse, che non possono ricevere un vaccino, o per le quali i vaccini non sempre funzionano con altrettanta efficienza.
Per lo sviluppo di anticorpi monoclonali che neutralizzino efficacemente l?infezione da SARS-CoV-2 ? di fondamentale importanza comprendere le modalit? di interazione tra il virus e il suo target, l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (hACE2), proteina cruciale per l?ingresso del virus all?interno della cellula (5). L?ingresso virale dipende dalla glicoproteina Spike (S), una delle proteine strutturali che decorano la superficie di SARS-CoV-2. La proteina ? suddivisa in due differenti subunit?, S1 e S2: la prima ? responsabile del legame ad ACE2 attraverso il dominio di legame al recettore (RBD), mentre la seconda, la subunit? S2, media la fusione della membrana cellulare virale a quella della cellula ospite. Per l?evidente ruolo di ?inizializzazione? dell?infezione virale, la proteina S ? diventata rapidamente il principale bersaglio molecolare da neutralizzare con anticorpi e il focus della progettazione terapeutica dei vaccini (6).
Durante lo scoppio della prima sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus (SARS-CoV) e della sindrome respiratoria mediorientale da coronavirus (MERS-CoV), l?utilizzo del plasma derivante da pazienti convalescenti ? stato utilizzato come efficiente opzione di trattamento per ridurre la carica virale e per ridurre la mortalit? nei casi gravi di ospedalizzazione (7, 8). Nella attuale pandemia COVID-19, allo stesso modo, un piccolo numero di pazienti trattati con plasma di pazienti convalescenti ha presentato un evidente miglioramento clinico e una diminuzione della carica virale (9). Tuttavia, la somministrazione di anticorpi monoclonali purificati con capacit? neutralizzante potrebbe essere sicuramente una strategia di trattamento pi? proficua ed efficace, come dimostrato da studi su pazienti infettati dal virus Ebola (10,11).
Studi preclinici di trattamenti con anticorpi neutralizzanti per l'infezione da SARS-CoV-2 in diversi modelli animali quali topo, criceto e scimmie Rhesus, hanno mostrato risultati promettenti, con marcate riduzioni delle cariche virali nelle vie respiratorie superiori e inferiori (12,13,14,15,16,17,18).
La maggior parte degli anticorpi anti-SARS-CoV-2 attualmente caratterizzati sono stati isolati da singole cellule B di memoria derivate da pazienti convalescenti o da animali transgenici per le regioni variabili delle immunoglobuline umane immunizzati per il virus.
Tuttavia, gli anticorpi derivanti da cellule B umane possono presentare con maggiore probabilit? un alto numero di mAbs a bassa affinit? in dipendenza di una serie di fattori, quali la carica virale o lo stadio di avanzamento dell?infezione del paziente da cui essi derivano.
Ad oggi vi sono circa 200 programmi di ricerca e sviluppo per anticorpi monoclonali contro COVID-19, tra questi circa 80 sono in fase I/II/III di sperimentazione clinica, 60 in fase preclinica e 66 in fase iniziale di sperimentazione, con un coinvolgimento di circa 29 paesi e 291 aziende ed istituzioni (19) (https://chineseantibody.org/covid-19-track/).
Regeneron Pharmaceuticals Inc (Regeneron), utilizzando sia cellule B derivate da pazienti convalescenti sia animali immunizzati, ha isolato anticorpi che si legano in epitopi distinti sul RBD monomerico della proteina S con elevata affinit?, con una costante di dissociazione che va da 0,56 a 45,2 nM (20). Questi anticorpi sono stati testati in saggi con virus e pseudovirus e in entrambi presentano potenti attivit? di neutralizzazione (21). Regeneron ha anche sviluppato due dei loro migliori anticorpi come trattamento cocktail REGN-COV2 (REGN10933/ casirivimab REGN10987/ imdevimab), ottenendone nel novembre 2020 l?autorizzazione all?utilizzo di emergenza (EUA) dalla U.S. Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento di pazienti COVID-19 adulti e pediatrici con sintomi da intermedi a moderati. Allo stesso modo, l?azienda Eli Lilly in collaborazione con AbCellera, utilizzando un campione di sangue prelevato da uno dei primi pazienti statunitensi guariti da COVID-19, ha sviluppato LY-CoV555 (anche chiamato LY3819253 o bamlanivimab), anch?esso autorizzato nel novembre 2020 per la somministrazione come singola dose endovenosa in pazienti con sintomi da intermedi a moderati. La cristallografia a raggi X e la determinazione strutturale tramite cryo-EM suggeriscono che bamlanivimab leghi l?RBD della proteina S in una posizione sovrapposta al sito di legame ACE2 (22) con una KD di 0,071 nM, bloccando, inoltre, l?interazione proteina S-ACE2 con un valore IC50 di 0,025 ?g/mL (23).
La collaborazione tra GSK e Vir Biotechnology, invece, ha condotto allo sviluppo di VIR-7831/GSK4182136(24) o Sotrovimab, un anticorpo monoclonale attualmente in fase III di sperimentazione clinica tramite il progetto COMET-ICE, che ha dimostrato la capacit? di neutralizzare il virus SARS-CoV-2 in vitro legandosi a un epitopo altamente conservato su SARS-CoV-2 condiviso con SARS-CoV-1.
In ultima analisi, tra i mAbs attualmente in fase III di sperimentazione clinica, cos? come l?anticorpo CT-P59 dell?azienda Celltrion, figura AZD7442, sviluppato da Astrazeneca, che consiste in una combinazione di due anticorpi monoclonali (AZD8895/ Tixagevimab AZD1061/ Cilgavimab) per i quali ? stato dimostrato il blocco del legame del virus SARS-CoV-2 alle cellule ospiti e la protezione dalle infezioni in modelli cellulari e animali di malattia (25).
COVID-19 causa anche uno stato iperinfiammatorio che coinvolge pi? cellule e mediatori, quali diversi tipi di interleuchine (IL-), il fattore di necrosi tumorale (TNF), il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi e complemento (C5, C5a).
Considerando tale deregolazione, i farmaci esistenti che hanno come bersagli questi mediatori sono stati riproposti per il trattamento di COVID-19 (26), con il fine di alleviare potenzialmente i sintomi infiammatori correlati all?infezione, invece che agendo direttamente sul virus. Ad esempio, gli inibitori dell'IL-6 levilimab, tocilizumab, sarilumab, olokizumab e siltuximab sono in fase di test contro COVID-19 (26,27).
L'eterogeneit? molecolare e l?evoluzione di SARS-CoV-2 hanno sollevato preoccupazioni circa l'ampiezza e l'efficacia della protezione con specifiche tipologie di vaccino e la possibile fuga del virus dalla pressione selettiva esercitata dal sistema immunitario. Studi recenti hanno, infatti, scoperto che SARS-CoV-2 ha acquisito mutazioni in grado di cambiarne sostanzialmente la patogenicit?, fornendo la prima prova concreta che la mutazione potrebbe influire sulla gravit? del virus che ha causato la malattia o il danno nel suo ospite. Lo sviluppo di farmaci e vaccini deve dunque necessariamente tener conto dell'impatto di queste mutazioni che si accumulano.
Alla luce di quanto sopra, appare evidente la necessit? di fornire nuovi prodotti per la prevenzione e il trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19, che siano alternativi ai prodotti noti o che ne superino gli svantaggi.
In questo contesto viene ad inserirsi la soluzione secondo la presente invenzione, che si propone di fornire un nuovo anticorpo monoclonale, da solo o in combinazione con altri anticorpi, per la prevenzione o il trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19 da esso causata.
In particolare, secondo la presente invenzione, ? stata generata un?estesa e variegata libreria di anticorpi monoclonali di media ed alta affinit?, da cui ? stato selezionato un anticorpo monoclonale che pu? essere vantaggiosamente impiegato per prevenire l?infezione da SARS-CoV-2 o per il trattamento del COVID-19. Secondo la presente invenzione, il suddetto anticorpo pu? essere impiegato da solo oppure in combinazione con altri anticorpi monoclonali selezionati, in modo tale da agire sinergicamente su epitopi distinti dell?RBD di SARS-CoV-2 e contrastare lo sviluppo di mutanti resistenti al trattamento. Come mostrato dai dati sperimentali mostrati pi? avanti, per ottenere l?anticorpo secondo l?invenzione, sono stati scelti come fonte primaria di anticorpi monoclonali topi BALB/C e topi C57BL/6, che sono stati immunizzati mediante un metodo di immunizzazione vantaggioso che prevede la somministrazione alternata di una sequenza di DNA codificante la proteina Spike full lenght e del dominio proteico RBD. Questi animali producono isotipi anticorpali simili a quelli umani, inclusi IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. La scelta di utilizzare topi immunizzati per ottenere gli anticorpi secondo la presente invenzione ? stata dettata dalla necessit? di ottenere una libreria il pi? vasta ed eterogenea possibile di anticorpi che fossero preferenzialmente ad alta affinit? per il target virale, obiettivo conseguibile esclusivamente grazie ad una iperimmunizzazione controllata e riproducibile dell?animale.
Secondo la presente invenzione, tra gli anticorpi monoclonali ottenuti, ? stato selezionato l?anticorpo denominato 9-8F2-B11, che ? risultato essere particolarmente performante in tutti i test sperimentali condotti e mostrati pi? avanti. In particolar modo, l?anticorpo 9-8F2-B11 ? stato in grado di:
- legare in maniera ugualmente efficiente tutte le varianti VOC (Variant of Concern) o VOI (Variant of Interest) che presentano mutazioni nel dominio RBD;
- competere per il legame di RBD ad ACE2; e
- inibire con alta efficacia il virus SARS-Cov-2 in entrambe le varianti D614G e N501Y.
Inoltre, secondo la presente invenzione, l?anticorpo murino 9-8F2-B11 ? stato sottoposto a umanizzazione. In particolare, l?anticorpo murino ? stato mutagenizzato generando un anticorpo chimerico, sostituendo la regione costante Fc murina con quella umana. Successivamente, le regioni variabili sono state umanizzate tramite singole sostituzioni amminoacidiche nelle regioni ipervariabili CDR dell?anticorpo. Tale processo consente vantaggiosamente di ridurre drasticamente l?immunogenicit? dell?anticorpo monoclonale, al fine di renderlo maggiormente fruibile per i fini clinici.
Come detto sopra, l?anticorpo 9-8F2-B11 pu? essere utilizzato in combinazione con altri monoclonali di interesse. In particolare, sono stati identificati anticorpi monoclonali competitivi, denominati 5-12B5-D5, 9-2H7-D7 e 9-3H9-3E9-B12, da poter usare in combinazione con il 9-8F2-B11. Come il 9-8F2-B11, questi anticorpi sono vantaggiosamente in grado di legare le varianti VOC (Variant of Concern) o VOI (Variant of Interest) che presentano mutazioni nel dominio RBD e di competere con il legame di RBD ad ACE2.
Inoltre, secondo la presente invenzione, l?anticorpo 9-8F2-B11 pu? essere vantaggiosamente combinato con un anticorpo non-competitivo, che potrebbe risentire meno di mutazioni a carico della regione RBD e, quindi, risultare pi? efficace nel prevenire l?insorgenza di mutanti resistenti. Tra gli anticorpi non-competitivi, secondo la presente invenzione l?anticorpo 9-H7-B4 ? stato identificato come miglior candidato da poter utilizzare in combinazione con il 9-8F2-B11.
Secondo la presente invenzione ? stato, inoltre, messo a punto un metodo per indurre in maniera attiva ed efficace una risposta immunitaria contro RBD, che prevede l?impiego della combinazione di una sequenza nucleotidica e una sequenza amminoacidica. In particolare, secondo la presente invenzione ? stata impiegata la vaccinazione genetica tramite il vettore plasmidico pNEB-Ad6-Covid FL, contenente il cDNA ottimizzato di Spike (SEQ ID NO:63). Tale vettore ? stato somministrato intramuscolo e a seguire ? stato applicato un campo elettrico tramite un apparato per elettroporazione, allo scopo di aumentare il livello di espressione dell?antigene e generare nell?animale ospite una risposta immune anticorpale e/o cellulomediata contro la proteina Spike. Tale vaccinazione genetica ? stata alternata alla vaccinazione classica tramite somministrazione intraperitoneale della proteina ricombinante RBD-hFc (SEQ ID NO:65), miscelata con l?adiuvante Sigma Adjuvant System. Tramite questa combinazione ? stata vantaggiosamente indotta la produzione di anticorpi contro la proteina Spike nella sua conformazione naturale ed ? stata specificamente indotta una maggiore risposta anticorpale per la porzione RBD della proteina Spike, importante per l?interazione del virus con il recettore ACE2 umano.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un Anticorpo (9-8F2-B11) comprendente
una regione variabile della catena pesante (VH) scelta tra EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:1), EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQGLEWIGRIDHAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:2) e EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQCLEWIGRIDPAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:3) e
una regione variabile della catena leggera (VL) scelta tra DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSHGNTFLHWYLQKPGQSPKVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:4) e DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSHGNTFLHWYLQRPGQSPKVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:5) o un anticorpo umanizzato derivato (od ottenuto a partire da) da detto anticorpo,
in cui le regioni CDR sono evidenziate in grassetto. In particolare:
detta VH di sequenza SEQ ID NO:1 e detta VH di sequenza SEQ ID NO:3 comprendono entrambe una prima CDR di sequenza GFNIKETY (SEQ ID NO:6), una seconda CDR di sequenza IDPAIGDS (SEQ ID NO:7) e una terza CDR di sequenza ARTWGPFFDF (SEQ ID NO:8);
detta VH di sequenza SEQ ID NO:2 comprende una prima CDR di sequenza SEQ ID NO:6, una seconda CDR di sequenza IDHAIGDS (SEQ ID NO:9) e una terza CDR di sequenza SEQ ID NO:8;
detta VL di sequenza SEQ ID NO:4 e detta VL di sequenza SEQ ID NO:5 comprendono entrambe una prima CDR di sequenza QSLVHSHGNTF (SEQ ID NO:10), una seconda CDR di sequenza KVS e una terza CDR di sequenza SQSTHVPYT (SEQ ID NO:11).
Un anticorpo secondo la presente invenzione pu? comprendere una VH di sequenza SEQ ID NO:1 e una VL di sequenza SEQ ID NO:4, una VH di sequenza SEQ ID NO:1 e una VL di sequenza SEQ ID NO:5, una VH di sequenza SEQ ID NO:2 e una VL di sequenza SEQ ID NO:4, una VH di sequenza SEQ ID NO:2 e una VL di sequenza SEQ ID NO:5, una VH di sequenza SEQ ID NO:3 e una VL di sequenza SEQ ID NO:4, oppure una VH di sequenza SEQ ID NO:3 e una VL di sequenza SEQ ID NO:5.
Secondo la presente invenzione, con il termine ?anticorpo? si intende un anticorpo monoclonale intero o un suo frammento in grado di legare l?antigene, come ad esempio Fab, Fab?, Fab?-SH, Fv, scFv, (Fab?)2, doppio anticorpo o diabody (dAb), anticorpo a dominio singolo (sdAb), anticorpo bispecifico, CAR (Chimeric Antigen Receptor) o BiTE (Bispecific T cell Engager).
Secondo la presente invenzione, l?anticorpo umanizzato pu? comprendere
una regione VH comprendente una prima regione CDR scelta tra GFNFKETY (SEQ ID NO:12) e GFNIKETY (SEQ ID NO:6), una seconda regione CDR scelta tra IDHAIGDS (SEQ ID NO:9) e IDPAIGDS (SEQ ID NO:7) e una terza regione CDR di sequenza ARTWGPFFDF (SEQ ID NO:8);
una regione VL comprendente una prima regione CDR scelta tra QSLVHSHGNTF (SEQ ID NO:10) e QSLLHSHGNTF (SEQ ID NO:13), una seconda regione CDR di sequenza KVS e una terza regione CDR di sequenza SQSTHVPYT (SEQ ID NO:11).
Secondo un?altra forma di realizzazione, l?anticorpo umanizzato secondo la presente invenzione pu? comprendere
una regione VH scelta tra QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFKETYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDHAI GDSEYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:14) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKETYVHWVRQAPGQGLEWMGRIDPAI GDSEYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:15);
una regione VL scelta tra DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSHGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:16) e DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSHGNTFLHWYLQKPGQSPQVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:17), in cui le regioni CDR sono evidenziate in grassetto.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione, l?anticorpo umanizzato della presente invenzione pu? comprendere
una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17;
una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:16; oppure
una VH di sequenza SEQ ID NO:14 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17;
preferibilmente una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17.
La presente invenzione concerne, inoltre, una sequenza nucleotidica che codifica per un anticorpo come definito sopra.
Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:1 pu? essere: GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:18);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:2 pu? essere: GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCACGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:19);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:3 pu? essere: GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGTGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:20);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:4 pu? essere: GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGG CCAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCGCCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTT CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:21); e
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:5 pu? essere: GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGG CCAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAGGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCGCCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTT CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:22),
in cui le regioni CDR sono evidenziate in grassetto.
Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:12 pu? essere GGCTTCAACTTCAAGGAGACCTAC (SEQ ID NO:23), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:6 pu? essere GGCTTCAACATCAAGGAGACCTAC (SEQ ID NO:24), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:9 pu? essere ATCGACCACGCCATCGGCGACAGC (SEQ ID NO: 25), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO: 7 pu? essere ATCGACCCCGCCATCGGCGACAGC (SEQ ID NO:26), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:8 pu? essere GCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTC (SEQ ID NO:27), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:10 pu? essere CAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTTC (SEQ ID NO:28), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:13 pu? essere CAGAGCCTGCTGCACAGCCACGGCAACACCTTC (SEQ ID NO:29), la sequenza nucleotidica che codifica per KVS pu? essere AAGGTGAGC e la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:11 pu? essere AGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACC (SEQ ID NO:30).
Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:14 pu? essere: CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACTTCAAGGAGACCTACATGCACTGGGT GAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGACCACGCCATC GGCGACAGCGAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACA CCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:31);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:15 pu? essere: CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACA CCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:32);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:16 pu? essere: GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCG CCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTA CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:33);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:17 pu? essere: GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCG CCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTA CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:34),
in cui le regioni CDR sono evidenziate in grassetto.
Pertanto, la sequenza nucleotidica secondo la presente invenzione pu? comprendere le sequenze nucleotidiche che codificano per VH e per VL secondo le seguenti combinazioni: SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:34, oppure SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33, oppure SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:34, preferibilmente SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:34.
La presente invenzione concerne anche un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica come definita sopra.
Secondo la presente invenzione, il vettore pu? essere scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
La presente invenzione concerne, inoltre, una cellula comprendente un vettore di espressione come definito sopra.
La presente invenzione concerne anche una composizione farmaceutica comprendente un anticorpo, preferibilmente un anticorpo umanizzato, come definito sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra o una cellula come definita sopra, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili. Pertanto, quando l?anticorpo ? un anticorpo umanizzato, detta sequenza nucleotidica codifica per detto anticorpo umanizzato e detti vettore o cellula comprendono detta sequenza nucleotidica che codifica per detto anticorpo umanizzato.
In particolare, un anticorpo, una sequenza nucleotidica, un vettore o una cellula secondo la presente invenzione possono essere inclusi in una composizione farmaceutica o diagnostica. La composizione pu? comprendere veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili, quali ad esempio diluenti, adiuvanti, agenti tamponanti, emulsionanti, umettanti, agenti di solubilizzazione o altre sostanze che permettono o facilitano la somministrazione, la nebulizzazione, la distribuzione nell?organismo e il delivery al sito di azione dell?anticorpo, oppure che ne riducono la tossicit?, ne aumentano la biodisponibilit? o che favoriscono la compliance dell?individuo cui viene somministrato. Per la scelta dell?eccipiente idoneo alle applicazioni qui previste si rimanda al manuale ?Handbook of Pharmaceutical Excipients?, 5a Edizione, R. C. Rowe; P. J. Seskey and S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago. La composizione farmaceutica pu? essere in forma di soluzione, sospensione, emulsione, compressa, capsula, microcapsula, liposoma, polvere, formulazione a rilascio protratto, liofilizzato.
Secondo la presente invenzione, la composizione farmaceutica pu? comprendere ulteriormente almeno un anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, una sequenza nucleotidica che codifica detto anticorpo, un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o una cellula comprendente detto vettore, in cui detto anticorpo ? scelto tra o, quando detto anticorpo ? un anticorpo umanizzato, detto anticorpo umanizzato ? ottenuto a partire da:
un anticorpo (5-12B5-D5) comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGGINPNI GDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAIDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo (9-2H7-D7) comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo (9-3H9-3E9-B12) comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo (9-8H7-B4) comprendente una regione VH di sequenza EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42); o
un anticorpo (9-10E8-D7) comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48),
in cui le regioni CDR di ciascuna VH e VL sono evidenziate in grassetto.
Pertanto, la composizione farmaceutica secondo la presente invenzione pu? comprendere i seguenti anticorpi:
9-8F2-B11 e 5-12B5-D5; 9-8F2-B11 e 9-2H7-D7; 9-8F2-B11 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-2H7-D7; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e9-H7-B4.
Secondo la presente invenzione, le regioni VH e VL degli anticorpi menzionati sopra (5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12, 9-8H7-B4, 9-10E8-D7), da cui pu? essere derivato detto anticorpo umanizzato, possono essere codificate dalle seguenti sequenze nucleotidiche:
GAAGTGCAACTACAACAAAGTGGTCCAGAACTGGTGAAGCCTGGCGCTTC TGTGAAGATCTCCTGCAAGACCTCTGGCTACACCTTCACCGAGTACGCCATCTAC TGGGTCAAGCAGTCTCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGGAATCAACCCCA ACATCGGCGACACCTCCTACATCCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCTACCCTGACCGT GGACCGGAGCAGCTCTACCGCCTACATGGAACTGAGATCTCTGACATCCGAGGAC TCCGCCTTTTACTACTGTGCCAGAGATGGCAACTACGCTATCGACTATTGGGGAC AGGGCACATCCGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO:49), codificante per SEQ ID NO:35;
GATATCGTGATGAGTCAAAGTCCAAGTAGTCTCGCCGTGTCCGTGGGAGA GAACATCACCATGTCCTGCAAGTCCTCTCAGAGCCTGCTGTACTCCTCCAACCAG AAGAACTACCTGGCCTGGTACCAACACAAGCCTGGCCAGTCTCCCAAACTGCTGA TCTACTGGGCTTCTACCAGAGAGTCTGGCGTGCCTGATAGATTTACCGGCTCTGG CTCCGGCACCGACTTCAGCCTGACAATCTCCAGCGTCAAGGCCGAGGACCTGGCT GTGTACCATTGTCACCAGTACTACCGGTATCCTTGGACCTTCGGCGGCGGAACCA AGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:50), codificante per SEQ ID NO:36;
GAAGTGCAACTACAACAAAGTGGTCCAGAACTGGTGAAGCCTGGCGCTTC TGTGACCATCTCCTGCAAGACCTCTGGCTACACCTTTACCGAGTACACCATGTAC TGGGTCAAGCAGTCTCACGGAAAATCTCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCT ACATCGGCGACACCTCCTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGT GGACAAGTCCTCCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGACATCCGAGGAT TCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGATGGATATCCTGACTACTCCGCCATGGACT TCTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACAGTGTCCAGC (SEQ ID NO:51), codificante per SEQ ID NO:37;
GATATCGTGATGAGTCAAAGTCCAAGTAGTCTCGCCGTGTCCGTGGGAGAGAAGG TGACCATGAACTGCAAGTCCTCTCAGAATCTGCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAA CTACCTGGCCTGGTACCAGCAAAAACCTGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTAC TGGGCTTCTACCAGAGAGTCTGGCGTGCCCGATCGGTTTACCGGCTCCGGCTCTG GCACCGACTTCACACTGACCATCTCCAGCGTCAAGGCCGAGGACCTGGCTGTGTA CAGCTGTCAGCAGTACTACACCTATCCTTGGACCTTCGGCGGCGGAACAAAGCTG GAAATCAAG (SEQ ID NO:52), codificante per SEQ ID NO:38; GACGTGAAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGAAGCTTGGAGGGTCCCTGA AACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATTACATGTCTTGGGT TCGACAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAATTGGTCGCAGCCATTAATAGTCATGGT TTTACCACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATGACAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGGAGTCTGAGGACACAGC CTTGTATTACTGTGCAAGACATGGGGACTACGGTAGTAGCCTCTACTGGTACTTC GATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO:53), codificante per SEQ ID NO:39;
CAAATCGTGCTAACTCAAAGTCCAGCAATCATGTCCGCCTCTCTGGGCGA GGAGATCGCCCTGACATGTTCTGCTTCTAGCTCCGTGTCCAACATGAACTGGTAT CAGCAGAAGTCCGGCACCTCTCCCAAACTGCTGATCTACTCCACCAGCAACCTGG TCTCTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGATCTGGCACCTTCTACAGCCT CACCATCTCCTCTGTGGAAGCCGAGGATGCTGCCGACTACTACTGCCACCAGTGG TCCTCCTGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:54), codificante per SEQ ID NO:40;
GAGGTTCACCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCA AGTTGTCCTGTACAGTTTTTGGCTTCAACATTAAAGACACCTCTATACACTGGGT GAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAAC GGTCATACTGAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACA CATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGTAGCCTGACATCTGAGGACACTGC CGTCTATTTCTGTGTTAGATATGATGCTTACTACGCCTATCCTATTGACTACTGG GGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO:55), codificante per SEQ ID NO:41;
GATGTGGTGATGACTCAAACTCCACTAAGTCTGCCTGTGTCCCTGGGCGA CCAGGCCTCCATCTCCTGTAGATCCTCTCCATCTCTGGTGCACTCCAACGGCAAC ACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAACCTGGCCAATCTCCTAAGCTGCTGATCT ACACCGTGTCTAATCGGTTCAGCGGAGTCCCCGATCGGTTTAGCGGCTCTGGCTC CGGCACCGACTTCACACTGAAGATCAACAGAGTGGAAGCTGAGGACCTGGGCGTG TACTTCTGCTCCCAGACCACCCATGTGCCTTGGACCTTCGGCGGCGGAACCAAGC TCGAGATCAAG (SEQ ID NO:56), codificante per SEQ ID NO:42;
GATGTGCAACTACAAGAAAGTGGTCCAGGTCTCGTGAAGCCTTCTCAGTC CCTGTCTCTGACCTGTTCTGTGTCTGGCTACTCCATCACATCCGACTCCTACTGG AACTGGATCAGACAGTTTCCTGGCAACACCCTGGAATGGATGGGCTTCATCAGCT ACGACGGCAATAACAACTACAACCCCAGCCTGAAAAATCGGATCTCTATCACCAG AGATACCTCCAAGAACCAGTTCTTCCTGAACCTGAACTCCGTGACCACCGAGGAC ACCGCCATCTACTTCTGCGCCAGAGAGTACGGCTATGGATACTTCGACGTGTGGG GCGCTGGCACCACAGTCACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO:57), codificante per SEQ ID NO:43;
GATGTGCAACTACAAGAAAGTGGTCCAGGTCTGGTGAAGCCTTCTCAGTC TCTCTCCCTGACCTGTTCCGTGTCTGGCTACTCCATCACCTCTGACTCCTACTGG AACTGGATCAGACAGTTTCCTGGCAACACCCTGGAATGGATGTGCTTCATCAGCT ACGACGGCAATAATAACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCGGATCTCTATCACCAG AGATACCTCCAAAAACCAGTTCTTCCTGAACCTGAACTCCGTCACAACCGAGGAC ACCGCCATCTACTTCTGCGCCAGAGAGTACGGCTATGGATACTTCGACGTGTGGG GCGCTGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO:58), codificante per SEQ ID NO:44;
GATGTGCAACTACAAGAAAGTGGTCCAGGTCTCGTGAAGCCTTCTCAGTC CCTGTCTCTGACCTGTTCTGTGTCTGGCTACTCCATCACCTCCGACTCCTACTGG AACTGGATCAGACAGTTTCCTGGCAACACCCTGGAATGCATGGGCTTCATCTCTT ACGACGGCAATAATAACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCGGATCTCCATCACCAG AGATACAAGCAAAAACCAGTTCTTCCTGAACCTGAACTCCGTGACCACCGAGGAC ACCGCCATCTACTTCTGCGCCAGAGAGTACGGCTATGGATACTTCGACGTGTGGG GCGCTGGCACCACAGTCACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO:59), codificante per SEQ ID NO:45;
GATGTGCAACTACAAGAAAGTGGTCCAGGTCTCGTGAAGCCTTCTCAGTC CCTGTCTCTGACCTGTTCTGTGTCTGGCTACTCCATCACCTCCGACTCCTACTGG AACTGGGTCCGGCAGTTTCCTGGCAACACCCTGGAATGGATGGGCTTCATCTCCT ACGACGGCAATAATAACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCGGATCAGCATCACCAG AGATACCTCTAAAAACCAGTTCTTCCTGAACCTGAACTCCGTGACCACCGAGGAC ACCGCCATCTACTTCTGCGCCAGAGAGTACGGCTATGGCTACTTCGACGTGTGGG GCGCTGGAACAACCGTGACAGTGTCCAGC (SEQ ID NO:60), codificante per SEQ ID NO:46;
GATGTGCAACTACAAGAAAGTGGTCCAGGTCTCGTGAAGCCTTCTCAGTC CCTGAGCCTGACCTGTTCTGTGTCTGGCTACTCCATCACCTCCGACTCCTACTGG AACTGGACCCGGCAGTTTCCTGGCAACACCCTGGAATGGATGGGCTTCATCTCTT ACGACGGCAATAATAACTACAACCCCTCTCTGAAGAACCGGATCTCCATCACCAG AGATACAAGCAAAAACCAGTTCTTCCTGAACCTGAACTCCGTGACCACCGAGGAC ACCGCCATCTACTTCTGCGCCAGAGAGTACGGCTATGGATACTTCGACGTGTGGG GCGCTGGCACCACAGTCACCGTGTCCAGC (SEQ ID NO:61), codificante per SEQ ID NO:47;
GATATCCAAATGACTCAAAGTCCAGCAAGTCTCTCTGCTTCCGTGGGCGA GACAGTCACCATCACCTGTAGAGCCTCCGAGAACATCTACTCCTTCCTGGCTTGG TATCAACAGAACCAGGGCAAGTCCCCTCAGCTGCTGGTGTACTCTGCCAAGACCC TGCTGGAAGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACCCAGTTCTC CCTGAAGATCGACTCTCTGCAGCCTGAGGATTTTGGCTCCTACTACTGCCAGAGA CACTACGGCTCTCCTTACACCTTCGGCGGCGGAACCAAGCTGGAAATCAAA
(SEQ ID NO:62), codificante per SEQ ID NO:48.
La presente invenzione concerne, inoltre, un anticorpo come definito sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra, una cellula come definita sopra o una composizione farmaceutica come definita sopra, per l?uso in campo medico.
Inoltre, la presente invenzione concerne un anticorpo come definito sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra, una cellula come definita sopra o una composizione farmaceutica come definita sopra, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
Secondo la presente invenzione, detti anticorpo, sequenza nucleotidica, vettore, cellula o composizione farmaceutica, per l?uso sopra menzionato, possono essere somministrati per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa, subcutanea, intramuscolare, intradermica o intratecale.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione, un metodo di diagnosi in vitro per la rilevazione di SARS-CoV-2 mediante l?utilizzo di un anticorpo come definito sopra.
La presente invenzione concerne, inoltre, una combinazione di
a) un anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, come definito sopra, una sequenza nucleotidica come definita sopra, un vettore come definito sopra o una cellula come definita sopra, con b) almeno un ulteriore anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, una sequenza nucleotidica che codifica detto ulteriore anticorpo, un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o una cellula comprendente detto vettore, in cui detto ulteriore anticorpo ? scelto tra o, quando detto anticorpo ? un anticorpo umanizzato, detto anticorpo umanizzato ? ottenuto a partire da:
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGGINPNI GDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAIDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42);
un anticorpo comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48),
in cui le regioni CDR di ciascuna VH e VL sono evidenziate in grassetto,
per l?uso separato o sequenziale nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
Pertanto, le combinazioni secondo la presente invenzione, per l?uso sopra indicato, possono essere le seguenti:
9-8F2-B11 e 5-12B5-D5; 9-8F2-B11 e 9-2H7-D7; 9-8F2-B11 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-2H7-D7; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7 e 9-3H9-3E9-B12; 9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 512B5-D5, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4; 9-8F2-B11, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4;
9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e9-H7-B4.
Come detto sopra, le regioni VH e VL degli anticorpi menzionati sopra (5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12, 9-8H7-B4, 9-10E8-D7), da cui pu? essere derivato detto anticorpo umanizzato, possono essere codificate dalle seguenti sequenze nucleotidiche:
SEQ ID NO:49, codificante per SEQ ID NO:35;
SEQ ID NO:50, codificante per SEQ ID NO:36;
SEQ ID NO:51, codificante per SEQ ID NO:37;
SEQ ID NO:52, codificante per SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:53, codificante per SEQ ID NO:39;
SEQ ID NO:54, codificante per SEQ ID NO:40;
SEQ ID NO:55, codificante per SEQ ID NO:41;
SEQ ID NO:56, codificante per SEQ ID NO:42;
SEQ ID NO:57, codificante per SEQ ID NO:43;
SEQ ID NO:58, codificante per SEQ ID NO:44;
SEQ ID NO:59, codificante per SEQ ID NO:45;
SEQ ID NO:60, codificante per SEQ ID NO:46;
SEQ ID NO:61, codificante per SEQ ID NO:47;
SEQ ID NO:62, codificante per SEQ ID NO:48.
Per ?uso separato? si intende la somministrazione, nello stesso momento, dei composti della combinazione secondo l?invenzione in forme farmaceutiche distinte.
Per ?uso sequenziale? si intende la somministrazione successiva dei composti della combinazione secondo l?invenzione, ciascuno in una distinta forma farmaceutica.
Secondo la presente invenzione, a) e b) della combinazione dell?invenzione per l?uso sopra menzionato possono essere somministrati per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa, subcutanea, intramuscolare, intradermica o intratecale.
La presente invenzione concerne, inoltre, l?uso di un anticorpo come definito nella rivendicazione 1 per la preparazione di un anticorpo umanizzato.
La presente invenzione concerne anche un anticorpo scelto tra
un anticorpo (5-12B5-D5) comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGGINPNI GDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAIDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo (9-2H7-D7) comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo (9-3H9-3E9-B12) comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo (9-8H7-B4) comprendente una regione VH di sequenza EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42); o
un anticorpo (9-10E8-D7) comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48),
o un anticorpo umanizzato derivato (od ottenuto a partire da) da detto anticorpo,
in cui le regioni CDR sono evidenziate in grassetto.
Pertanto, secondo la presente invenzione, gli anticorpi competitivi 5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e l?anticorpo non competitivo 9-H7-B4 possono essere usati anche singolarmente, ossia in monoterapia, oppure in combinazione tra loro, in alternativa al 9-8F2-B11.
Inoltre, la presente invenzione concerne anche una sequenza nucleotidica che codifica per uno qualsiasi degli anticorpi 5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12 e 9-H7-B4, un vettore che comprende detta sequenza nucleotidica, una cellula che comprende detto vettore, una composizione farmaceutica comprendente detti anticorpi, sequenza nucleotidica, vettore o cellula assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili e loro usi in campo medico, come nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
Come detto sopra, le regioni VH e VL degli anticorpi menzionati sopra (5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12, 9-8H7-B4, 9-10E8-D7), da cui pu? essere derivato detto anticorpo umanizzato, possono essere codificate dalle seguenti sequenze nucleotidiche:
SEQ ID NO:49, codificante per SEQ ID NO:35;
SEQ ID NO:50, codificante per SEQ ID NO:36;
SEQ ID NO:51, codificante per SEQ ID NO:37;
SEQ ID NO:52, codificante per SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:53, codificante per SEQ ID NO:39;
SEQ ID NO:54, codificante per SEQ ID NO:40;
SEQ ID NO:55, codificante per SEQ ID NO:41;
SEQ ID NO:56, codificante per SEQ ID NO:42;
SEQ ID NO:57, codificante per SEQ ID NO:43;
SEQ ID NO:58, codificante per SEQ ID NO:44;
SEQ ID NO:59, codificante per SEQ ID NO:45;
SEQ ID NO:60, codificante per SEQ ID NO:46;
SEQ ID NO:61, codificante per SEQ ID NO:47;
SEQ ID NO:62, codificante per SEQ ID NO:48.
L?anticorpo 9-8F2-B11, cos? come gli anticorpi 9-2H7-D7, 5-12B5-D5, 9-8H7-B4, e 9-3H9-3E9-B12 secondo la presente invenzione pu? essere utilizzato nella sua versione umanizzata, cio? pu? comprendere sequenze o residui amminoacidici di origine umana e non-umana. Per esempio, l?anticorpo umanizzato pu? comprendere uno o entrambi i domini variabili in cui tutte le regioni ipervariabili (CDR) corrispondono a quelle di un anticorpo non-umano, mentre le regioni ?framework? corrispondono a quelle di un anticorpo umano. L?anticorpo umanizzato pu? comprendere almeno una porzione di una regione costante di derivazione umana. In generale, una forma ?umanizzata? dell?anticorpo si riferisce a un anticorpo che ? stato sottoposto a un processo di umanizzazione. I metodi per umanizzare un anticorpo sono noti nell?arte - si veda per esempio Almagro J. C. and Fransson J., (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633 - e si basano su metodi quali ?CDR-grafting?, ?Resurfacing, ?Superhumanization? e ?Human String Content Optimization?.
Secondo la presente invenzione, le regioni della catena pesante di un anticorpo secondo l?invenzione inoltre possono anche essere modificate per ridurre il legame al recettore Fc gamma umano per eliminare un possibile effetto ?ADE? (Antibody Dependent Enhancement ? aumento dell? infezione dipendente da anticorpo), come ad esempio la mutazione L234A, L235A (28) o ulteriore stimolazione del sistema immunitario tramite ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity ? Citotossicit? Cellulare Dipendente dall? Anticorpo, come ad esempio le mutazioni S298A, E333A, K334A (29) o CDC (Complement Dependent Cytotoxicity ? Citotossicit? Dipendente dal Complemento)come ad esempio le mutazioni S267E, H268F, S324T (30). Inoltre, la regione costante della catena pesante pu? essere modificata per aumentare l?affinit? per il recettore Fc neonatale umano per aumentare l?emivita come ad esempio la mutazione N434A (31).
Come detto sopra, gli anticorpi secondo la presente invenzione possono essere usati come frammenti scelti tra Fab, Fab?, Fab?-SH, Fv, scFv, (Fab?)2, diabodies (dAb), anticorpo a dominio singolo (sdAb) e combinati per generare anticorpi bispecifici. I frammenti scFv possono, inoltre, essere utilizzati per generare CAR-T o combinati con anticorpi e frammenti che legano la CD3 umana per generare BiTE (Bispecific T cell Engager).
Inoltre, gli anticorpi secondo l?invenzione possono essere utilizzati per generare una molecola coniugata contenente un anticorpo secondo la presente invenzione covalentemente legato a un composto scelto tra un marcatore isotopico o fluorescente, una tossina, un enzima o un farmaco.
Gli anticorpi secondo la presente invenzione, oltre a poter essere somministrati in forma di proteina purificata, possono essere veicolati tramite un vettore di espressione contenente un acido nucleico codificante l?anticorpo, sue parti o frammenti, ad esempio mediante liponanoparticelle o altro metodo veicolante il vettore di espressione oppure mediante elettroporazione.
La presente invenzione concerne, inoltre, una combinazione di una sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 (codificante per la proteina Spike di SARS-CoV-2) o in una sequenza nucleotidica avente una identit? di sequenza rispetto a SEQ ID NO:63 di almeno il 96%, almeno il 97%, almeno il 98% o almeno il 99%, o di un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o di una cellula comprendente detto vettore, con una sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67 (ossia il dominio RBD della proteina Spike di SARS-CoV-2) o in una sequenza amminoacidica avente una identit? di sequenza rispetto a SEQ ID NO:67 di almeno il 96%, almeno il 97%, almeno il 98% o almeno il 99%, per l?uso simultaneo, separato o sequenziale nella generazione (preparazione) di anticorpi contro SARS-CoV-2 in un organismo umano o animale, ossia nell?immunizzazione o nella vaccinazione di detto organismo umano o animale. Per ?uso simultaneo? si intende la somministrazione dei due composti della combinazione secondo l?invenzione in una single e identica composizione farmaceutica.
Per ?uso separato? si intende la somministrazione, nello stesso momento, dei due composti della combinazione secondo l?invenzione in forme farmaceutiche distinte.
Per ?uso sequenziale? si intende la somministrazione successiva dei due composti della combinazione secondo l?invenzione, ciascuno in una distinta forma farmaceutica.
Secondo la presente invenzione, detta sequenza amminoacidica della combinazione sopra menzionata per l?uso sopra indicato pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze leader, come ad esempio la sequenza leader dell?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), della IgK, del growth hormone, dell?albumina sierica o della fosfatasi alcalina e/o uno o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT).
Ad esempio, la sequenza amminoacidica pu? essere IgK-RBD-Fc. La sequenza amminoacidica pu? comprendere anche una o pi? sequenze linker. L?utilizzo di sequenze leader e di sequenze immunomodulatorie forniscono l?effetto tecnico di migliorare il titolo anticorpale. In particolare, la sequenza leader ha la funzione di trasportare gli antigeni all?esterno della cellula dell?organismo trasfettata con il vettore o plasmide, ad esempio per elettroporazione. La sequenza leader aumenta la secrezione della proteina, mentre le sequenze immunomodulatorie stimolano il sistema immunitario a produrre anticorpi.
In riferimento alla combinazione della presente invenzione per l?uso sopra indicato, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente la sequenza leader della IgK, o peptide segnale della catena di IgK, di sequenza SEQ ID NO:68 e il dominio Fc di sequenza SEQ ID NO:69. La sequenza leader della IgK, o peptide segnale della catena di IgK, di sequenza SEQ ID NO:68, ? posto all?N-terminale di detta sequenza SEQ ID NO:67, mentre il dominio Fc di sequenza SEQ ID NO:69 pu? essere posto al C-terminale di detta sequenza SEQ ID NO:67 oppure pu? anche essere inserito tra IgK e RBD, quindi nella porzione C-terminale.
Secondo la presente invenzione, detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63, o detto vettore o detta cellula, della combinazione dell?invenzione per l?uso sopra indicato, pu? essere somministrata/o prima di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67.
Sempre in riferimento alla combinazione dell?invenzione per l?uso sopra indicato, secondo una forma di realizzazione, ? somministrata una prima dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula, successivamente ? somministrata una prima dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula e successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, preferibilmente ciascuna dose essendo somministrata dopo una settimana dalla dose somministrata precedentemente.
Secondo la presente invenzione, detta sequenza nucleotidica, o detto vettore o detta cellula, e detta sequenza amminoacidica possono essere somministrate per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa.
La presente invenzione concerne anche un metodo per la produzione di anticorpi contro SARS-CoV-2 in un organismo umano o animale, ossia per l?immunizzazione o la vaccinazione di un organismo umano o animale, detto metodo comprendendo somministrare simultaneamente, separatamente o sequenzialmente
una sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 (codificante per la proteina Spike di SARS-CoV-2), o un vettore di espressione comprendente detta sequenza nucleotidica o cellula comprendente detto vettore, e
una sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67 (ossia il dominio RBD della proteina Spike di SARS-CoV-2).
Per ?somministrare simultaneamente? si intende la somministrazione dei due composti secondo l?invenzione in una singola e identica composizione farmaceutica.
Per ?somministrare separatamente? si intende la somministrazione, nello stesso momento, dei due composti secondo l?invenzione in forme farmaceutiche distinte.
Per ?somministrare sequenzialmente? si intende si intende la somministrazione successiva dei due composti secondo l?invenzione, ciascuno in una distinta forma farmaceutica.
Detta sequenza amminoacidica pu? comprende ulteriormente una o pi? sequenze leader, come ad esempio la sequenza leader dell?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), della IgK, del growth hormone, dell?albumina sierica o della fosfatasi alcalina e/o uno o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT).
Ad esempio, la sequenza amminoacidica pu? essere IgK-RBD-Fc. La sequenza amminoacidica pu? comprendere anche una o pi? sequenze linker.
In particolare, secondo una forma di realizzazione preferita, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente la sequenza leader della IgK, o peptide segnale della catena di IgK, di sequenza SEQ ID NO:68, posto all?N-terminale di detta sequenza SEQ ID NO:67, e il dominio Fc di sequenza SEQ ID NO:69 posto al C-terminale di detta sequenza SEQ ID NO:67.
Secondo il metodo dell?invenzione, la sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 pu? essere somministrata prima della sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67. In particolare, secondo una forma di realizzazione del metodo dell?invenzione, ? somministrata una prima dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula, successivamente ? somministrata una prima dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula e successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, preferibilmente ciascuna dose essendo somministrata dopo una settimana dalla dose somministrata precedentemente.
La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento agli esempi e alle figure dei disegni allegati, in cui:
- la Figura 1 mostra il titolo anticorpale; in particolare, nel grafico sono riportati i valori medi ? SD di assorbanza (405nm), ottenuti tramite saggio ELISA per la proteina RBD WT, dei sieri degli animali immunizzati con diluizioni scalari a partire da 1:400;
- la Figura 2 mostra la distribuzione delle costanti di associazione (Ka) e dissociazione (Kd); in particolare, nel grafico sono riportati i valori delle costanti di associazione (ka) e di dissociazione (kd) ottenuti per gli ibridomi analizzati determinati per Surface Plasmon Resonance utilizzando uno strumento Carterra LSA;
- la Figura 3 mostra il saggio pseudovirus; in particolare, nel grafico sono riportati i valori in percentuale di infezione relativa inerenti agli anticorpi selezionati; tutti i campioni sono stati analizzati come singolo replicato in tre diluizioni differenti (1:2, 1:20, 1:200);
- la Figura 4 mostra la quantificazione delle IgG; in particolare, nel grafico ? riportata la distribuzione della quantificazione delle IgG totali nei campioni analizzati per il saggio pseudovirus (evidenziata in nero la mediana;
- la Figura 5 mostra il saggio di competizione ELISA; in particolare, nel grafico sono riportati i valori EC50 calcolati per ogni anticorpo testato per saggio ELISA competitivo contro ACE2 umano;
- la Figura 6 mostra il saggio di competizione per FACS; in particolare, nel grafico sono riportate le percentuali di binding degli anticorpi nel saggio di competizione FACS con ACE2 umano a tre diluizioni scalari a partire da 1:2; la capacit? degli anticorpi di competere con il legame tra RBD-hFc e la proteina ACE2 ? stata valutata su cellule Vero E6;
- la Figura 7 mostra il saggio FACS sulle varianti RBD; in particolare, Nnel grafico sono riportate le percentuali di binding degli anticorpi purificati nel saggio FACS a una concentrazione finale di 1?g/ml; le cellule HEK-293 sono state trasfettate con un vettore vuoto (EV) come controllo negativo o pNebAd6 Sars-Cov-2 Spike-FL o VOC;
- la Figura 8 mostra il Western Blot delle chimere del 9-8F2-B11; in particolare, la figura mostra il Western blot del terreno di cultura derivante da trasfezioni transienti di cellule ExpiCHO per l?identificazione delle combinazioni VH/VL per l?anticorpo chimerico 9-8F2-B11; la rilevazione ? stata effettuata con un anticorpo secondario specifico per la porzione umana Fc;
- la Figura 9 mostra il saggio ELISA per le chimere del 9-8F2-B11; in particolare, nell?istogramma sono riportati i valori di assorbanza (405nm) delle combinazioni VH/VL dell?anticorpo 9-8F2-B11 chimerico testate per il legame a RBD WT;
- la Figura 10 mostra il Western Blot degli anticorpi umanizzati del 9-8F2-B11; in particolare, la figura mostra il Western blot del terreno di cultura derivante da trasfezioni transienti di cellule ExpiCHO per l?identificazione delle combinazioni VH/VL per l?anticorpo umanizzato del 9-8F2-B11; la rilevazione ? stata effettuata con un anticorpo secondario specifico per la porzione umana Fc;
- la Figura 11 mostra il saggio ELISA per gli anticorpi umanizzati del 9-8F2-B11; in particolare, nell?istogramma sono riportati i valori di assorbanza (405nm) delle combinazioni VH/VL dell?anticorpo 9-8F2-B11 umanizzato testate per il legame a RBD WT; e
- la Figura 12 mostra il saggio pseudovirus in vivo; in particolare nei grafici sono riportati i valori medi ? SD (fotoni/s) della biolumiscenza rilevata nei topi K18-hACE2 sia nei turbinati (grafico a sinistra) sia nel corpo totale dell?animale (grafico a destra) a 96h dopo la trasfezione;
ESEMPIO 1. Identificazione e valutazione dell?efficacia degli anticorpi secondo la presente invenzione.
MATERIALI E METODI
Con riferimento all?Articolo 170bis CPI, si dichiara che gli studi su organismi geneticamente modificati citati di seguito sono avvenuti all?interno dell?impianto con livello di contenimento BSL1 e BSL2, quest?ultimo con ID notifica RM/IC/Imp2/04/001, Takis s.r.l. autorizzato in data 09/04/2015.
Misura del titolo anticorpale contro la proteina RBD.
Per individuare gli animali con il maggior titolo anticorpale da utilizzare per la generazione degli ibridomi, ? stata effettuata la titolazione degli anticorpi IgG contro la porzione RBD della proteina S tramite ELISA al giorno 27 dopo il primo trattamento (Figura 1).
Le piastre ELISA vengono funzionalizzate tramite coating con la proteina RBD-6xHis ad una concentrazione di 1 ?g/ml ed incubate 18 ore circa a 4?C. Successivamente le piastre sono bloccate con 3%BSA/0,05% Tween-20/PBS per 1 ora a temperatura ambiente e quindi la soluzione in eccesso viene eliminata per rovesciamento. Vengono quindi aggiunti i sieri dei topi immunizzati partendo da una diluizione di 1/400 e diluendo serialmente 1:3 fino alla diluizione di 1/874800, in duplicato, e le piastre incubate 2 ore a temperatura ambiente. Dopo un doppio lavaggio con 0,05% Tween-20/PBS, viene aggiunto l?anticorpo secondario anti-murine IgG Human Ads coniugato con la fosfatasi alcalina e le piastre sono incubate per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un doppio lavaggio con 0,05% Tween-20/PBS, il legame del secondario viene rilevato mediante aggiunta del substrato per la fosfatasi alcalina e misura dell?assorbanza a 405nm tramite lettore ELISA dopo incubazione di 1 ora.
Quantificazione della concentrazione degli anticorpi tramite interferometria biostrato.
? stata eseguita mediante interferometria biostrato (BLI) utilizzando il sistema Octet RED96 (FORTEBIO) una rapida quantificazione dell'anticorpo monoclonale presente nel terreno di cultura dell?ibridoma. Le analisi sono state eseguite utilizzando biosensori anti-topo Fc (Anti-mouse IgG Fc Capture Biosensors, cat. No. 18-5088, FORTEBIO) alla temperatura di 30?C in agitazione a 1000 rpm in piastre da 96 pozzetti (micropiastra 96 pozzetti, nera, 655209, da Greiner bio-one). I campioni per sono stati diluiti 1:10 in tampone diluente (diluente per campioni 18-1104, FORTEBIO) per ridurre l'interferenza del mezzo ed ? stato caricato un volume totale di 200 ?l di soluzione per ogni pozzetto. A questo punto, le punte del biosensore sono state immerse per 10 minuti nel tampone di corsa preparato diluendo il terreno degli ibridomi 1:10 nel buffer diluente. ? stata preparata una curva di calibrazione utilizzando un anticorpo di riferimento purificato diluito in tampone di corsa (intervallo di concentrazione: 0,195 - 25 ?g/mL). Le quantificazioni sono state effettuate prendendo in considerazione i valori iniziali (da 0 a 180 s) delle risposte di legame. La concentrazione del campione ? stata calcolata dalla curva standard utilizzando Octet Software V11.1. Per valutare la qualit? della curva di calibrazione, il residuo (%) di ciascun calibratore ? stato stimato inferiore al 18% e l'r2 della curva utilizzato per determinare il tasso di legame ? stato scelto come > 0,98. (Figura 4)
Produzione della proteina RBD-Fc e RBD-6xHis WT e mutanti
Le proteine RBD-Fc e RBD-6xHis sono state prodotte mediante trasfezione transiente delle cellule ad alta densit? Expi293F (Expi293? Expression System Kit, A14635) con il reagente cationico lipidico di trasfezione ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. Il supernatante contenente le proteine ? stato raccolto a distanza di una settimana e sottoposto a chiarifica tramite centrifugazione e filtrazione per i successivi passaggi di purificazione. La proteina RBD-Fc ? stata purificata tramite cromatografia di affinit? all?AktaPure system con colonna di proteina A (TOYOSCREEN AF-RPROTEIN A HC-650F; Tosoh Bioscience). In breve, la colonna ? stata equilibrata con binding buffer (Buffer Phospate 0.1M Ph8) e caricata con il supernatante diluito 1:1 con lo stesso buffer. Dopo lavaggio della colonna, la proteina ? stata recuperata tramite eluizione acida in buffer citrato 0.1M pH3, neutralizzata in Tris-HCl pH9 e sottoposta a dialisi in PBS1X con le slide-A-lyzer (Thermo Fisher) secondo quanto indicato dal datasheet del prodotto.
La proteina RBD-6xHIS e i suoi mutanti sono stati purificati tramite cromatografia di affinit? di residui His Tag per metalli immobilizzati all?AktaPure system con colonna HisPur? Ni-NTA Chromatography Cartridges (Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. In breve, la colonna ? stata equilibrata in PBS1X/Imidazolo 5mM e caricata con il supernatante diluito 1:1 con lo stesso buffer. Dopo lavaggio, la proteina ? stata eluita con PBS1X/Imidazolo 0.3M, pH 7.4 e dializzata in PBS1X con le slide-A-lyzer (Thermo Fisher) secondo quanto indicato dal datasheet del prodotto. Una volta recuperate dalla dialisi le proteine RBD-Fc e RBD-6xHis sono state quantificate allo spettrofotometro tramite assorbanza a 280nm (Figure 5 e 6).
La purezza delle proteine ? stata valutata tramite analisi SDS-PAGE e Western Blot, condotta sia in condizioni ridotte che non ridotte e tramite metodiche standard.
Saggio di neutralizzazione con pseudovirus
Sono stati analizzati per il saggio dello pseudovirus un set di anticorpi selezionati in base alla loro affinit? per l?RBD ricombinante di SARS-CoV-2 (valori compresi tra 10pM e 100pM, alcuni valori nM). Gli anticorpi sono stati analizzati come singolo replicato in tre diluizioni differenti (1:2, 1:20, 1:200) (Figura 3) oppure concentrazioni scalari per calcolarne l?EC50 utilizzando lo pseudovirus vescicolare della stomatite (VSV)(Fluc_eGFP)-CoV2-PP con Fluc come reporter. Un giorno prima del saggio sono state seminate 10.000 cellule Caco-2 (catalogo ECACC no.09042001) in piastre da 96 pozzetti (180 ?l/96w), il giorno successivo alla semina delle cellule i campioni di ibridoma sono stati diluiti in PBS e incubati con pseudoparticelle (miscela 1:1) per 1 ora a 37 gradi e misurato il reporter Fluc 16-20 ore dopo la trasduzione. Le piastre sono state centrifugate per 1 minuto alla velocit? di 270 g il supernatante ? stato rimosso ed ? stato fatto un lavaggio con 100 ul per pozzetto di PBS. Dopo un?ulteriore centrifugazione e rimozione del supernatante sono stati aggiunti 40?l di buffer di lisi per il saggio di luciferasi, con seguente incubazione di 5 minuti. Sono stati successivamente trasferiti 30?l del volume in una piastra bianca, a questo volume sono stati aggiunti 50?l di Reagente Luciferasi ed ? stata misurata la luminescenza totale. I valori di EC50 sono stati normalizzati per la concentrazione degli anticorpi nel supernatante (Figura 4, Tabella 3).
Saggio di competizione tramite test ELISA
Per valutare la capacit? degli anticorpi di competere per il legame tra ACE2 e RBD si ? utilizzato un secondo saggio basato sulla tecnica ELISA. In accordo con i dati di SPR la maggior parte degli anticorpi sono risultati competitivi ed i risultati sono riassunti nella Figura 2. Le piastre sono state rivestite con 50ul per pozzetto della proteina RBD-6His diluita in PBS alla concentrazione finale di 1,42 ?g/ml. La fase di coating ? stata portata avanti tutta la notte alla temperatura di 4 gradi. Successivamente le piastre sono state lavate tre volte con PBS/T e poi bloccate con 100ul di soluzione di blocco (BSA 3%) per un tempo di un?ora a temperatura ambiente. Segue la fase di competizione in cui sono stati incubati a 4 gradi per tutta la notte il supernatante degli ibridomi e ACE2-hFc alla concentrazione di 2?g/ml in BSA 1%. Le piastre sono state lavate per tre volte con PBS/T e successivamente sono state incubate con anticorpo secondario anti-Human AP (Jackson 209-055-098) alla diluizione finale 1:5000. Successivamente le piastre sono state sviluppate con reagente di sviluppo per 1h a temperatura ambiente, ne ? seguita la lettura alla lunghezza d?onda di 405nm (Figura 5).
Saggio di competizione tramite saggio FACS
La capacit? degli anticorpi di competere con il legame tra RBD-hFc e la proteina ACE2 espressa dalle cellule Vero E6 (VERO C1008C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] (ATCC? CRL-1586?) ? stata inoltre valutata mediante citofluorimetria a flusso ed i risultati sono riassunti nella Figura 6 dove si osserva una quasi completa inibizione del legame di RBD-hFc alla proteina ACE2 quando i supernatanti sono usati alla diluizione minore (1:2). In breve, gli anticorpi monoclonali sono stati diluiti a diverse diluizioni (1:2, 1:20, 1:200) in RBD-hFc (0,45 ?g / ml) in tampone FC e incubati per 1 ora a 4 ? C. 200.000 cellule / pozzetto (piastra a 96 pozzetti) sono state quindi colorate con RBD-hFc o siero preincubato / RBD-hFc per 25 minuti a 4 ? C. Le cellule sono state quindi lavate con tampone FC e colorate con anticorpo secondario IgG anti-umano coniugato con Alexa Fluor 488 per 25 minuti a 4 ? C. Infine, le cellule sono state lavate in tampone FC e risospese in tampone FC prima di essere eseguite sul citometro a flusso CytoFlex (Beckman Coulter). L'analisi ? stata eseguita utilizzando il software CytExpert (Beckman Coulter).
Produzione e purificazione degli anticorpi murini I cloni di interesse, previa conferma della positivit?, sono stati gradualmente adattati dopo lo scongelamento da terreno contenente il 10% di FBS a terreno CD Hybrid (Gibco), cresciuti ed amplificati in statico fino a raggiungere un volume finale di circa 400ml. Il supernatante contenente gli anticorpi monoclonali prodotti dagli ibridomi ? stato raccolto e sottoposto a chiarifica tramite centrifugazione e filtrazione per i successivi passaggi di purificazione.
Gli anticorpi monoclonali sono stati purificati tramite cromatografia di affinit? all?AktaPure system con colonna di proteina A (TOYOSCREEN AF-RPROTEIN A HC-650F; Tosoh Bioscience). In breve, la colonna ? stata equilibrata con binding buffer (Buffer Phospate 0.1M Ph8) e caricata con il supernatante diluito 1:1 con lo stesso buffer. Dopo lavaggio della colonna, la proteina ? stata recuperata tramite eluizione acida in buffer citrato 0.1M pH3, neutralizzata in Tris-HCl pH9 e sottoposta a dialisi in PBS1X con le slide-A-lyzer (Thermo Fisher) secondo quanto indicato dal datasheet del prodotto.
RISULTATI
Vaccinazione genetica
Per aumentare la probabilit? di ottenere anticorpi anti-RBD neutralizzanti dal punto di vista funzionale, ? stato adottato un approccio di vaccinazione genetica basato sull?elettroporazione nel muscolo scheletrico (32). Questa tecnologia permette di modificare l'antigene di interesse in maniera appropriata mediante tecniche di ingegneria molecolare consentendone l?espressione endogena nel muscolo e nelle cellule presentanti l?antigene. Per l?immunizzazione ? stato utilizzato il cDNA della Spike selvatica, iniettando in topi BALB/c (Cat: BALB/cOlaHsd ? Envigo) un vettore plasmidico contenente una versione modificata con codoni ottimizzati che esprime la forma completa della proteina Spike di SARS-CoV-2. ? stato ipotizzato che l'immunizzazione con questa variante potesse aumentare la probabilit? di ottenere gli anticorpi neutralizzanti in quanto esposta sulla membrana cellulare.
Il protocollo di immunizzazione consisteva in 2 iniezioni nel quadricipite dell?animale di 50?g di pTK1A-Covid-FL alternate a 2 iniezioni intraperitoneali di 10?g di proteina RBD-hFc distanziate di 2 settimane l?una dall?altra. I topi sono stati quindi immunizzati al giorno 0 e 14 tramite immunizzazione genetica usando il plasmide pTK1A-Covid-FL, mentre sono stati immunizzati con la proteina purificata RBD-hFc nei giorni 7 e 21 dall? inizio del trattamento.
Il plasmide pTK1A-Covid-FL comprendeva il promotore e l?introne A del citomegalovirus (CMV) umano, un sito polylinker per i clonaggi e il bovine Growth Hormone (bGH) come polyA per la terminazione della trascrizione. Inoltre, il plasmide pTK1A-Covid-FL comprendeva la seguente sequenza ottimizzata codificante per la proteina Spike full-lenght:
atgtttgtcttcctggtcctgctgcccctggtctcctctcagtgcgtgaa cctgactactagaactcagctgcctcccgcttacaccaattccttcacccggggc gtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacacaggatc tgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcgg caccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgatggcgtg tacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttggcacca cactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaacgtggt catcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactat cacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattctagcgcca acaattgcacatttgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggagggcaa gcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgatggctac ttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgcctcagg gcttcagcgccctggagccactggtggatctgcctatcggcatcaacatcacccg gtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgactcctct agcggatggaccgcaggagcagcagcctactatgtgggctatctgcagcctagga ccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgccgtggattgcgc cctggatcctctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtggagaag ggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcgtgcgct ttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaaccaggtt cgcaagcgtgtacgcatggaataggaagcgcatctctaactgcgtggccgactat agcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcgtgtccc ccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtgtacgccgattctttcgtgat caggggcgacgaggtgcgccagatcgcacctggacagacaggcaagatcgccgac tacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagca acaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttag aaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctaccaggcc ggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccactgcagt cctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgtggtggt gctgagctttgagctgctgcacgcaccagcaacagtgtgcggacccaagaagtcc accaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggaa caggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcag ggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggagatcctg gatatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacaccaggaaccaata caagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggtgcctgt ggccatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcaccggctcc aacgtgttccagacaagagcaggatgtctgatcggagcagagcacgtgaacaatt cctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagaccca gacaaactctccaaggagagcacggagcgtggcatcccagtctatcatcgcctat accatgtccctgggcgccgagaattctgtggcctactctaacaatagcatcgcca tcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtccatgac caagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgagtgcagc aacctgctgctgcagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccctgacag gcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggtgaagca aatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcccagatc ctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgctgttca acaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgcctggg cgacatcgcagcacgggacctgatctgtgcccagaagtttaatggcctgaccgtg ctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccctgctgg caggaaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctgcagatccc ctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtg ctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcggcaaga tccaggacagcctgtcctctacagcctccgccctgggcaagctgcaggatgtggt gaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagctccaacttc ggcgccatctctagcgtgctgaatgatatcctgagccggctggacaaggtggagg cagaggtgcagatcgaccggctgatcacaggcagactgcagtctctgcagaccta tgtgacacagcagctgatcagggcagcagagatcagggcaagcgccaatctggca gcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggacttttgtg gcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgtggtgtt tctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcccctgcc atctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgtccaacg gcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcatcaccac agacaataccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtgaacaat accgtgtatgatccactgcagcccgagctggacagctttaaggaggagctggata agtacttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcagcggcat caatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggcc aagaatctgaacgagagcctgatcgatctgcaggagctgggcaagtatgagcagt acatcaagtggccatggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccat cgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgcctgaag ggctgctgtagctgcggctcctgttgtaagtttgatgaagacgattccgagcctg tcctgaagggcgtgaagctgcactatacctctagataatga (SEQ ID NO:63), codificante per la seguente sequenza amminoacidica:
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHS TQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWI FGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRD LPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYL QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTES IVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCY GVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIA WNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYF PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG LTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP GTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEH VNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNN SIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNR ALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIED LLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTS ALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSA IGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD KVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRV DFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVF VSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKE ELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK YEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDD SEPVLKGVKLHYTSR (SEQ ID NO:64),
in cui la porzione di sequenza in grassetto indica la regione RBD della proteina Spike.
Il DNA ? stato formulato in Phosphate Buffered Saline (PBS) alla concentrazione di 1 mg/ml. La DNA-EP ? stata effettuata con un elettroporatore Cliniporator ed elettrodi piatti (IGEA, Carpi, Italia) con le seguenti condizioni elettriche in modalit? ElectroGene-Transfer (EGT): 8 impulsi di 20 msec a 110V, 8Hz, 120msec di pausa tra gli impulsi.
La proteina RBD-hFc somministrata ai topi aveva la seguente sequenza: METDTLLLWVLLLWVPGSTGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAW NRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKP FERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELL HAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:65), codificata dalla seguente sequenza nucleotidica atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccagg atccacaggaagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattaca aacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatg cttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataa ttccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaat gatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaag tcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaatt accagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattct aaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctca aaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttg taatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaa cccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaac ttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaa aaacaaatgtgtcaatttcgtcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcca cgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggt ctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggg cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgacca agaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctccc gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:66).
La porzione di sequenza evidenziata sopra in grassetto, ossia RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSAS FSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDD FTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKC VNF (SEQ ID NO:67) rappresenta RBD, la porzione di sequenza sottolineata, ossia METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO:68), rappresenta il peptide segnale della catena di IgK, mentre la porzione di sequenza in corsivo, ossia VDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:69), rappresenta il dominio Fc.
La proteina RBD-hFc ? stata formulata in PBS/Sigma Adjuvant System (1:1). Tutti i topi immunizzati (14 animali) hanno risposto alla vaccinazione ed i loro sieri hanno mostrato una significativa attivit? di legame a RBD-6xHis per saggio ELISA (Figura 1).
Due settimane dopo la quarta immunizzazione, i topi con il maggior titolo anticorpale sono stati sacrificati e milze e linfonodi rimossi. Dopo aver eseguito un protocollo standard di fusione con cellule di mieloma murino come descritto in , ?Antibodies: a laboratory manual?, pi? di 10000 (11819) cloni di ibridoma sono stati isolati per diluizione seriale e i loro sopranatanti sono stati testati nuovamente per le capacit? di legame a RBD in vitro tramite saggio ELISA.
Tra gli ibridomi analizzati, 1750 ibridomi, riportati nella Tabella 1, sono stati selezionati per la loro capacit? di legare il dominio RBD tramite saggio ELISA. In particolare, la Tabella 1 riporta i valori relativi al legame degli anticorpi contenuti nel sopranatante di ciascun ibridoma al frammento RBD tramite ELISA (A405nm) e SPR(KD).
Tabella 1
Gli ibridomi sono stati ulteriormente caratterizzati per la loro affinit? a RBD e la capacit? di competere con il legame di RBD ad ACE2. In particolare, sono stati eseguiti diversi saggi, illustrati nei paragrafi successivi.
Misura dell?affinit?
L?affinit? (KD) per RBD ed i valori di kon/koff sono stati determinati tramite Surface Plasmon Resonance (SPR)utilizzando lo strumento Carterra LSA. Gli anticorpi hanno mostrato un range di affinit? dal pM al nM ed i risultati sono stati riassunti in Tabella 1 e Figura 2. Un biosensore chip HC200M (Carterra) ? stato legato covalentemente con un anti mouse-Fc (Jackson ImmunoResearch #115-005-071) e poi trattato con gli anticorpi a diverse concentrazioni. I campioni sono stati preparati per la cattura in piastre da 384 pozzetti diluendoli di 5 volte in buffer HBSTE (volume finale 220ul). L?antigene RBD ? stato fornito come forma monomerica ricombinante purificata ed ? stato preparato in un buffer HBSTE BSA 0.5 mg/ml ad una concentrazione di partenza di 1 ?M. A questo punto gli analiti sono stati erogati nella cella a flusso in concentrazione crescente, consentendo un tempo di associazione di 5 minuti e un tempo di dissociazione di 15 minuti.
Valutazione della competizione per il recettore ACE2 tramite Surface Plasmon Resonance
Al fine di valutare la capacit? dei cloni di bloccare il legame di ACE2 all? RBD, ? stata eseguita un'iniezione di 500 nM di ACE2 dopo l'ultima iniezione di RBD. I segnali di legame registrati consentono di determinare se i cloni competono con ACE2 per la stessa regione di legame sull? RBD. Per i cloni selezionati, non si osservano segnali aggiuntivi, mostrando quindi che questi anticorpi condividono lo stesso sito di legame di ACE2 e potrebbero essere potenzialmente utilizzati come agente neutralizzante del virus. Nella Tabella 2 sono indicati gli ibridomi che producono anticorpi competitivi o non-competitivi per ACE2 umana.
Tabella 2
Test di neutralizzazione con pseudovirus
A seguito della misura dell?affinit? tramite SPR High-throughput sono stati selezionati circa 430 anticorpi con affinit? ? 1 nM su cui ? stato eseguito un primo saggio di neutralizzazione con pseudovirus utilizzando tre concentrazioni di supernatante (1:2, 1:20, 1:200) i cui risultati, normalizzati per la concentrazione di immunoglobuline (Figura 4) sono riassunti nella Figura 3. Si osserva, per la maggior parte degli anticorpi testati, una risposta dipendente dal dosaggio. Tra i 430 anticorpi testati ne sono stati selezionati 59 su cui ? stata calcolata la EC50, sempre utilizzando il saggio di neutralizzazione con pseudovirus e i cui risultati sono riassunti nella Tabella 3 (valori di EC50 di sopranatanti testati tramite saggio pseudovirus). Come si osserva nella tabella, le attivit? degli anticorpi coprono un range di EC50 che parte da 260 ng/ml circa fino ad arrivare a meno di 1 ng/ml.
Tabella 3
Valutazione della competizione tramite saggio ELISA e citofluorimetrico
Gli anticorpi (59) su cui ? stata calcolata la EC50 tramite il saggio di inibizione dello pseudovirus sono stati inoltre caratterizzati per la loro capacit? di competere per il legame tra ACE2 e RBD tramite saggio ELISA (Figura 5), usando proteine ACE2 e RBD ricombinanti, e tramite citofluorimetria, utilizzando il recettore ACE2 espresso sulle cellule Vero e la proteina RBD ricombinate (Figura 6). Come atteso, la maggior parte degli anticorpi sono risultati competitivi per il legame tra RBD e ACE2.
Produzione degli anticorpi monoclonali murini.
I 59 ibridomi selezionati sono stati quindi sottoclonati e dai sottocloni sono stati prodotti e purificati gli anticorpi murini. Gli anticorpi murini dei cloni maggiormente attivi sono stati analizzati per la loro capacit? di neutralizzare il virus SARS-CoV-2 nelle varianti D614G e N501Y (Tabella 4). La tabella 4 nostra i valori EC50 sul virus D614G e N501Y.
Tabella 4
Saggio di neutralizzazione con virus SARS-CoV-2 D614G e N501Y
Per verificare se i mAbs potessero neutralizzare l'infettivit? del virus SARS-CoV-2, ? stato eseguito un test di neutralizzazione. Le cellule Vero (VERO C1008C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] (ATCC? CRL-1586?) (10.000 cellule/pozzetto) sono state seminate 24 ore prima dell'infezione in una piastra a 96 pozzetti (Costar). Il giorno dell'infezione, le cellule sono state lavate due volte. Gli anticorpi monoclonali sono stati incubati a 56?C per 30 minuti e poi diluiti due volte in mezzo di coltura cellulare. Gli anticorpi alla concentrazione iniziale di 1000 ng/ml sono stati aggiunti al terreno di coltura cellulare contenente 100 particelle virali di SARS-CoV-2 varianti D614G o N501Y (B.1.1.7) su una piastra a 96 pozzetti e incubata a 37?C per 30 minuti in 5% vol/vol CO2. La miscela di anticorpi virali ? stata quindi aggiunta alle cellule in piastre a 96 pozzetti e le piastre sono state incubate a 37?C con esame microscopico per l'effetto citopatico dopo un'incubazione di 3 giorni. La pi? alta diluizione dell?anticorpo che ha mostrato un'attivit? inibitoria di SARS-CoV-2 ? stata registrata come titolo anticorpale neutralizzante. I test sono stati eseguiti in duplicato con la variante D614G e N501Y. Questi test sono stati eseguiti in una struttura BSL-3. I risultati ottenuti hanno fornito valori di EC50 estremamente performanti per un set ristretto di anticorpi, con valori di EC50 che vanno dal micromolare al nanomolare (Tabella 4). Dai risultati ottenuti sono stati identificati gli anticorpi pi? potenti (EC50 < 50 ng/ml) e questi sono stati caratterizzati ulteriormente per:
1) saggio affinit? tramite BLI per la proteina Spike e varianti del dominio RBD (Tabella 5);
2) saggio citofluorimetrico per valutare il legame degli anticorpi purificati alla proteina Spike originale e con mutazioni delle VOC nella regione RBD (Tabella 6 e Figura 7);
3) saggio ELISA per valutare il legame alla proteina Spike (Tabella 7) e alle varianti del dominio RBD (Tabella 8);
4) esperimenti di epitope binning tramite BLI per selezionare gli anticorpi che riconoscono porzioni differenti della regione RBD.
In particolare, la Tabella 5 riporta la misura dell?affinit? degli anticorpi purificati sulle varianti RBD, la Tabella 6 riporta la percentuale di legame degli anticorpi purificati alla Spike tramite saggio FACS, la Tabella 7 riporta il valore IC50 degli anticorpi purificati testati per la Spike e la Tabella 8 riporta il valore IC50 (?g/ml) per gli anticorpi purificati testati per le varianti RBD.
Tabella 5
Tabella 6
Tabella 7
Tabella 8
Gli anticorpi sono stati inizialmente identificati per legare la porzione RBD di Sars-COV-2, sito precedentemente definito sostanziale per la neutralizzazione del virus. Comunque, durante la vaccinazione genetica, come spiegato precedentemente, gli animali sono stati immunizzati usando il DNA che codifica per l?intera Spike per poter ottenere anticorpi che riconoscessero l?RBD nel contesto della proteina completa. Per tale motivo ? stata confermata la capacit? degli anticorpi monoclonali selezionati di legare la proteina Spike tramite saggio ELISA (Tabella 7) e tramite saggio citofluorimetrico (Tabella 6). Allo stesso modo ? risultato interessante comprendere se il legame all?RBD potesse essere compromesso dalle mutazioni a carico di questa porzione della proteina e si ? proceduto quindi a valutare il legame dei monoclonali ad alcune delle varianti RBD attualmente presenti, tramite saggio ELISA (Tabella 8) e citofluorimetrico (Figura 7). I risultati del saggio ELISA hanno permesso di ottenere un valore di IC50 per ogni anticorpo. I risultati di maggiore interesse, che hanno permesso di caratterizzare in maniera pi? approfondita il legame degli anticorpi al proprio target, provengono dagli ELISA per le varianti RBD. Tramite tale saggio si ? potuto evidenziare che gli anticorpi possiedono una buona capacit? di legare tutte le varianti RBD ad eccezione della variante australiana, che risulta debolmente riconosciuta dalla maggior parte degli anticorpi analizzati tranne che da cinque di essi:
1) il 9-8F2-B11, che riconosce con affinit? comparabile tutte le varianti RBD testate nel saggio.
2) il 9-2H7-D7, che riconosce bene tutte le varianti e mediamente la variante australiana
3) 5-12B5-D5, che riconosce la variante australiana, ma debolmente.
4) il 9-8H7-B4, che riconosce le varianti testate e l?australiana similmente
5) il 9-3H9-3E9-B12, che riconosce le varianti testate e l?australiana similmente
Tale analisi ? stata poi ripetuta tramite saggi di affinit? tramite BLI (Tabella 5), confermando la scelta dell?anticorpo 9-8F2-B11 come il candidato migliore per il trattamento e la prevenzione del COVID-19 e la cui attivit? ? stata confermata tramite lo studio in un modello di pseudovirus in vivo (Figura 12). Inoltre, sono stati individuati gli anticorpi 9-2H7-D7, 5-12B5-D5, 9-8H7-B4, e 9-3H9-3E9-B12 come possibili candidati da utilizzare alternativamente al 9-8F2-B11 o in combinazione con esso per aumentarne l?efficacia e ottenere una migliore prevenzione sull?insorgenza di possibili mutanti resistenti.
Saggio pseudovirus in vivo per il 9-8F2-B11
Lo studio di efficacia ? stato condotto su topi K18-hACE2 (B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J catalogo 034860), topi immunocompetenti transgenici che esprimono la forma umana del recettore ACE2 sotto il controllo del promotore umano della cheratina 18. Al giorno 0 i topi sono stati anestetizzati per inalazione di isofluorano e infettati per via intranasale con 10 ml/narice di Pseudovirus SARS-CoV2-Spike (D614G)-Luc o con un Lentivirus-Luc utilizzato come controllo negativo dell?infezione. 2 ore prima e 4 ore dopo l?infezione, gli animali sono stati trattati con 10 ml/narice di anticorpo monoclonale anti-SARS-CoV2 9-8F2-B11 alla concentrazione di 1,78 mg/ml oppure con PBS. Nel corso dello studio sono stati valutati i segni clinici degli animali, di cui giornalmente ? stato registrato il peso corporeo. Poich? lo Pseudovirus reca il gene per la luciferasi, ? stato possibile monitorare l?infezione tramite acquisizione del segnale di bioluminescenza prodotto.
Dopo 96 ore dall?infezione, tutti gli animali sono stati analizzati (Figura 13), in vita, tramite il sistema di Imaging IVIS 200 in modo da misurare quantitativamente la bioluminescenza associata alla presenza dello pseudovirus nell?intero corpo dell?animale. Dopo l?analisi in vivo, gli animali sono stati sacrificati per asfissia e da ognuno sono stati prelevati ed analizzati i turbinati nasali dove si ? osservato la maggior presenza di segnale in assenza di trattamento, mentre nei topi trattati con l?anticorpo 9-8F2-B11 il segnale viene completamente inibito (Figura 12).
Misura dell?affinit? degli anticorpi alle varianti RBD tramite interferometria biostrato.
Studi di legame sono stati effettuati utilizzando il sistema Octet Red (Forte Bio). Tutti i passaggi sono stati eseguiti a 25?C con agitazione a 600 rpm in una piastra a 96 pozzetti (micropiastra 96 pozzetti, nera, 655209, da Greiner bio-one) contenente 200 ?l di soluzione in ciascun pozzetto. Il tampone cinetico 1x (cat. N. 18-1105, Forte Bio) ? stato utilizzato in questo studio per la diluizione di anticorpi e analiti e per il lavaggio dei sensori. I saggi cinetici sono stati eseguiti catturando prima i mAbs usando biosensori anti-topo Fc Octet (anti-topo IgG Fc Capture Biosensors, cat. No. 18-5088, FORTEBIO). I biosensori sono stati immersi per 10 minuti in buffer 1x seguito da una misurazione del segnale di base per 60 secondi, a questo punto sono stati caricati gli anticorpi monoclonali murini (10?g mL) per 300 secondi (fino a quando il biosensore era completamente saturo). Dopo una fase di lavaggio in tampone cinetico 1? per 120 s, le punte del biosensore coniugate con i mAbs sono state quindi immerse per 300 secondi in pozzetti contenenti diverse concentrazioni di antigene (RBD 6xHIS) per valutare le curve di associazione, seguite da 900 secondi di tempo di dissociazione in buffer cinetico. I dati della curva di legame sono stati raccolti e quindi analizzati utilizzando il software di analisi dei dati v11.1 (FORTEBIO). I sensogrammi di legame sono stati allineati all'inizio del ciclo di legame dell'antigene e dopo la singola sottrazione del riferimento. I valori Kd sono stati calcolati utilizzando un modello di legame Langmuir globale 1:1. Le punte del biosensore con i mAbs sono state anche immerse in pozzetti contenenti buffer cinetico per consentire le singole sottrazioni di riferimento per compensare le dissociazioni naturali degli mAb catturati. Le punte del biosensore sono state utilizzate senza rigenerazione (Tabella 5).
Saggio citofluorimetrico per valutare il legame degli anticorpi purificati alla proteina Spike originale e con mutazioni delle VOC nella regione RBD In breve, le cellule HEK-293 (catalogo n R70007) sono state trasfettate con un vettore vuoto (EV) come controllo negativo o pNebAd6 Sars-Cov-2 Spike-FL o varianti. 200.000 cellule/pozzetto (piastra a 96 pozzetti) sono state trattate con anticorpi purificati a una concentrazione finale di 1?g/ml per 20' a 4?C. Le cellule sono state quindi lavate in tampone FACS e colorate con anticorpo secondario IgG anti-topo coniugato con Alexa Fluor 488 o anticorpo secondario anti-IgG umane coniugato con Alexa Fluor 488 per 20 'a 4 ? C. Infine, le cellule sono state lavate in tampone facs e risospese in formaldeide-PBS all'1% prima di essere eseguite sul citometro a flusso CytoFlex (Beckman Coulter). L'analisi ? stata eseguita utilizzando il software CytExpert (Beckman Coulter) (Figura 7, Tabella 6).
Saggio ELISA per valutare il legame alla proteina Spike e alle varianti del dominio RBD
Le piastre sono state rivestite con 50?l per pozzetto della proteina della proteina Spike full lenght o da RBD-6His WT (D614), N501Y (variante inglese), N439K, S477N (variante australiana), variante sudafricana, variante californiana e brasiliana diluita in PBS alla concentrazione finale di 1 ?g/ml. La fase di coating ? stata portata avanti tutta la notte alla temperatura di 4 gradi. Successivamente le piastre sono state lavate tre volte con PBS/T e poi bloccate con 100ul di soluzione di blocco (BSA 3%) per un tempo di un?ora a temperatura ambiente. Segue la fase di incubazione con l?antigene, in cui sono stati incubati a 4 gradi per tutta la notte gli anticorpi purificati alla concentrazione di partenza di 3?g/ml in BSA 1% con diluizioni seriali 1:3 degli stessi. Le piastre sono state lavate per tre volte con PBS/T e successivamente sono state incubate con anticorpo secondario anti-mouse IgG Human AP (Southern Biotech) alla diluizione finale 1:4000. Successivamente le piastre sono state sviluppate con reagente di sviluppo per 1h a temperatura ambiente, ne ? seguita la lettura alla lunghezza d?onda di 405nm ed il calcolo dell?IC50(Tabelle 7 e 8).
Gli ibridomi sono stati sottoposti a sequenziamento delle regioni variabili delle catene leggere e pesanti.
Le sequenze delle regioni VH e VL degli anticorpi murini 9-8F2-B11, 5-12B5-D5, 9-2H7-D7, 9-3H9-3E9-B12, 9-8H7-B4 e 9-10E8-D7 sono le seguenti:
9-8F2-B11 - VH1: SEQ ID NO:1;
9-8F2-B11 - VH2: SEQ ID NO:2;
9-8F2-B11 - VH3: SEQ ID NO:3;
9-8F2-B11 - VL1: SEQ ID NO:4;
9-8F2-B11 - VL2: SEQ ID NO:5;
5-12B5-D5 ? VH1: SEQ ID NO:35;
5-12B5-D5 ? VL1: SEQ ID NO:36;
9-2H7-D7 ? VH1: SEQ ID NO:37;
9-2H7-D7 ? VL1: SEQ ID NO:38;
9-3H9-3E9-B12 ? VH1: SEQ ID NO:39;
9-3H9-3E9-B12 ? VL1: SEQ ID NO:40;
9-8H7-B4 ? VH1: SEQ ID NO:41;
9-8H7-B4 ? VL1: SEQ ID NO:42;
9-10E8-D7 ? VH1: SEQ ID NO:43;
9-10E8-D7 ? VH2: SEQ ID NO:44;
9-10E8-D7 ? VH3: SEQ ID NO:45;
9-10E8-D7 ? VH4: SEQ ID NO:46;
9-10E8-D7 ? VH5: SEQ ID NO:47;
9-10E8-D7 ? VL1: SEQ ID NO:48.
Le informazioni ottenute dal sequenziamento sono state utilizzate per generare anticorpi chimerici (Figura 8 e 9) e le sequenze dell?anticorpo 9-8F2-B11 sono state umanizzate per ottenere un anticorpo completamente umano (Figure 10 e 11).
Di seguito sono riportate le sequenze VH e VL dell?anticorpo umanizzato 9-8F2-B11:
9-8F2-B11-humVH2: SEQ ID NO:14;
9-8F2-B11-humVH3: SEQ ID NO:15;
9-8F2-B11-humVL2: SEQ ID NO:16;
9-8F2-B11-humVL3: SEQ ID NO:17.
L?anticorpo umanizzato 9-8F2-B11 ottenuto mantiene le stesse caratteristiche di affinit? dell?anticorpo murino per il dominio RBD e le varianti VOC (Tabella 9) e pu?, quindi, essere utilizzato efficacemente nel trattamento e prevenzione del COVID-19.
In Tabella 9 riporta la misura dell?affinit? del 9-8F2-B11 VH3VL3 umanizzato purificato sulle varianti RBD.
Tabella 9
Mediante analisi Western Blot si ? potuto constatare come alcune combinazioni VH e VL, sia nel caso dell?anticorpo chimerico sia nel caso dell?anticorpo umanizzato, fossero pi? produttive e maggiormente espresse di altre, requisito essenziale per la loro produzione in larga scala e successivo utilizzo clinico. Tali risultati mostrano quali combinazioni VH e VL siano maggiormente produttive mantenendo la capacit? di riconoscere il dominio RBD in virt? dei saggi ELISA effettuati a valle della purificazione per la determinazione dell?affinit? per RBD come target principale.
Preparazione dei campioni per il sequenziamento Per la preparazione dei campioni al fine del successivo sequenziamento ? stato inizialmente estratto l?RNA messaggero (Qiagen) e sintetizzato il cDNA (Superscript 3 Thermo). Al fine di rendere possibile l?amplificazione delle regioni variabili delle catene pesanti e leggere (VH e VL) sono stati utilizzati specifici primers per le IgG murine. Successivamente, le sequenze dei frammenti ottenuti dell?altezza attesa sono state sequenziate tramite NGS con piattaforma Illumina. Per quanto riguarda l?anticorpo 9-8F2-B11 si sono ottenute tre sequenze equivalenti per la regione variabile della catena pesante e due sequenze equivalenti per la regione variabile della catena leggera le cui combinazioni, prodotte come anticorpo chimerico, che ? composto cio? dalle regioni variabili delle catena pesante e leggera murine e dalle regioni costanti della catena pesante umana di sottoclasse IgG1 e dalla regione costante della catena leggera umana di sottoclasse kappa, mantengono la capacit? di legare il dominio RBD (Figura 9).
Produzione e purificazione degli anticorpi chimerici e umanizzati
Gli anticorpi chimerici e umanizzati sono stati prodotti mediante trasfezione transiente delle cellule ad alta densit? ExpiCHO (ExpiCHO? Expression System Kit, A29133) con il reagente cationico lipidico di trasfezione ExpiFectamine (Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. Il sopranatante contenente le proteine ? stato raccolto a distanza di una settimana e sottoposto a chiarifica tramite centrifugazione e filtrazione per i successivi passaggi di purificazione con proteina A come spiegato nel paragrafo precedente. La purezza degli anticorpi ? stata valutata tramite analisi SDS-PAGE e Western Blot, condotta sia in condizioni ridotte che non ridotte e tramite metodiche standard (Figura 8 e 10) e la loro capacit? di legare l?RBD ricombinante ? stata valutata tramite saggio ELISA (Figura 9 e 11).
Le sequenze umanizzate delle regioni variabili della catena pesante e della catena leggera dell? anticorpo 9-8F2-B11 capaci di legare il dominio RBD (Figura 11) sono indicate come le sequenze nucleotidiche SEQ ID 31, 32, 33, 34 (mentre le corrispondenti sequenze amminoacidiche sono indicate come SEQ ID: 14, 15, 16, 17), che sono state clonate in un vettore di espressione contenente la regione costante della catena pesante di sottoclasse IgG1 e la regione costante della catena leggera di sottoclasse kappa ma potrebbero essere espressa anche come IgG2, IgG3 o IgG4, per la catena pesante, e come lambda per la catena leggera.
In particolare, l?anticorpo umanizzato contenente le regioni variabili della catena pesante con SEQ ID:32 e della catena leggera con SEQ ID:34 mantiene le stesse caratteristiche di affinit? dell?anticorpo murino per il dominio RBD e le varianti VOC (Tabella 9) e potr? quindi essere utilizzato efficacemente nel trattamento e prevenzione del COVID-19 tramite somministrazione per via endovenosa, sottocutanea, intramuscolare o intranasale mediante nebulizzazione.
Claims (27)
1) Anticorpo comprendente
una regione variabile della catena pesante (VH) scelta tra EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:1), EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQGLEWIGRIDHAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:2) e EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKETYVHWVKQRPEQCLEWIGRIDPAI GDSEYDPKFQGKATVTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO:3) e
una regione variabile della catena leggera (VL) scelta tra DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSHGNTFLHWYLQKPGQSPKVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:4) e DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSHGNTFLHWYLQRPGQSPKVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:5) o un anticorpo umanizzato derivato da detto anticorpo.
2) Anticorpo secondo la rivendicazione 1, in cui detto anticorpo umanizzato comprende
una regione VH comprendente una prima regione CDR scelta tra GFNFKETY (SEQ ID NO:12) e GFNIKETY (SEQ ID NO:6), una seconda regione CDR scelta tra IDHAIGDS (SEQ ID NO:9) e IDPAIGDS (SEQ ID NO:7) e una terza regione CDR di sequenza ARTWGPFFDF (SEQ ID NO:8);
una regione VL comprendente una prima regione CDR scelta tra QSLVHSHGNTF (SEQ ID NO:10) e QSLLHSHGNTF (SEQ ID NO:13), una seconda regione CDR di sequenza KVS e una terza regione CDR di sequenza SQSTHVPYT (SEQ ID NO:11).
3) Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto anticorpo umanizzato comprende
una regione VH scelta tra QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFKETYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDHAI GDSEYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:14) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKETYVHWVRQAPGQGLEWMGRIDPAI GDSEYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTWGPFFDFWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO:15);
una regione VL scelta tra DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSHGNTFLHWYLQKPGQSPQLLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:16) e DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSHGNTFLHWYLQKPGQSPQVLIYK VSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:17).
4) Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detto anticorpo umanizzato comprende
una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17;
una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:16; oppure
una VH di sequenza SEQ ID NO:14 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17;
preferibilmente una VH di sequenza SEQ ID NO:15 e una VL di sequenza SEQ ID NO:17.
5) Sequenza nucleotidica che codifica per un anticorpo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4.
6) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 5, in cui
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:1 ? GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:18);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:2 ? GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCACGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:19);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:3 ? GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCCGAGCAGTGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCGTGACCGCCGACA CCAGCAGCAACACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGGCTGACCAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCACCCTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:20);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:4 ? GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGG CCAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCGCCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTT CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:21); e
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:5 ? GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGG CCAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAGGCCCGGCCAGAGCCCCAAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCGCCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTT CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:22).
7) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 5, in cui la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:12 ? GGCTTCAACTTCAAGGAGACCTAC (SEQ ID NO:23), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:6 ? GGCTTCAACATCAAGGAGACCTAC (SEQ ID NO:24), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:9 ? ATCGACCACGCCATCGGCGACAGC (SEQ ID NO: 25), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO: 7 ? ATCGACCCCGCCATCGGCGACAGC (SEQ ID NO:26), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:8 ? GCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTC (SEQ ID NO:27), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:10 ? CAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTTC (SEQ ID NO:28), la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:13 ? CAGAGCCTGCTGCACAGCCACGGCAACACCTTC (SEQ ID NO:29), la sequenza nucleotidica che codifica per KVS ? AAGGTGAGC e la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:11 ? AGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACC (SEQ ID NO:30).
8) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 5 o 7, in cui
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:14 ? CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACTTCAAGGAGACCTACATGCACTGGGT GAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGACCACGCCATC GGCGACAGCGAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACA CCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:31);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:15 ? CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGA AGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGAGACCTACGTGCACTGGGT GAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGACCCCGCCATC GGCGACAGCGAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACA CCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGACCTGGGGCCCCTTCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:32);
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:16 ? GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCG CCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTA CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:33)
la sequenza nucleotidica che codifica per SEQ ID NO:17 ? GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCG CCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCCACGGCAACACCTT CCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGGTGCTGATCTACAAG GTGAGCAGCAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCA CCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTA CTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:34).
9) Vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8.
10) Vettore secondo la rivendicazione 9, in cui detto vettore ? scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
11) Cellula comprendente un vettore di espressione come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10.
12) Composizione farmaceutica comprendente un anticorpo, preferibilmente un anticorpo umanizzato, come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, un vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10 o una cellula come definita nella rivendicazione 11, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti.
13) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, detta composizione farmaceutica comprendendo ulteriormente almeno un anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, una sequenza nucleotidica che codifica detto anticorpo, un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o una cellula comprendente detto vettore, in cui detto anticorpo ? scelto tra o ? ottenuto a partire da:
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGGINPNI GDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAIDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza
EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42); o
un anticorpo comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48).
14) Anticorpo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10, cellula come definita nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 12-13, per l?uso in campo medico.
15) Anticorpo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10, cellula come definita nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 12-13, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
16) Anticorpo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10, cellula come definita nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 12-13, per l?uso secondo la rivendicazione 15, in cui detto anticorpo, sequenza nucleotidica, vettore, cellula o composizione farmaceutica ? somministrato/a per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa, subcutanea, intramuscolare, intradermica o intratecale.
17) Metodo di diagnosi in vitro per la rilevazione di SARS-CoV-2 mediante l?utilizzo di un anticorpo come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4.
18) Combinazione di
a) un anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, una sequenza nucleotidica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, un vettore come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 9-10 o una cellula come definita nella rivendicazione 11, con
b) almeno un ulteriore anticorpo, ad esempio un anticorpo umanizzato, una sequenza nucleotidica che codifica detto ulteriore anticorpo, un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o una cellula comprendente detto vettore, in cui detto ulteriore anticorpo ? scelto tra o ottenuto a partire da:
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGGINPNI GDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAIDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42);
un anticorpo comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48),
per l?uso separato o sequenziale nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione da SARS-CoV-2 e della malattia COVID-19.
19) Combinazione secondo la rivendicazione 18, per l?uso secondo la rivendicazione 18, in cui a) e b) sono somministrati per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa, subcutanea, intramuscolare, intradermica o intratecale.
20) Uso di un anticorpo come definito nella rivendicazione 1 per la preparazione di un anticorpo umanizzato.
21) Anticorpo scelto tra
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYAIYWVKQSHGKSLEWIGG INPNIGDTSYIQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAFYYCARDGNYAID YWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:35) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGENITMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQHKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVKAEDLAVYHCHQYYRYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:36);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza EVQLQQSGPELVKPGASVTISCKTSGYTFTEYTMYWVKQSHGKSLEWIGGINPYI GDTSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGYPDYSAMDFW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO:37) e una regione VL di sequenza DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQNLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYTYPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:38);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPDKRLELVAAINSHG FTTYYPDTVKGRFTISRDNDKNTLYLQMSSLESEDTALYYCARHGDYGSSLYWYF DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:39) e una regione VL di sequenza QIVLTQSPAIMSASLGEEIALTCSASSSVSNMNWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLVS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSWTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:40);
un anticorpo comprendente una regione VH di sequenza
EVHLQQSGAELVKPGASVKLSCTVFGFNIKDTSIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAN GHTEYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCVRYDAYYAYPIDYW GQGSSVTVSS (SEQ ID NO:41) e una regione VL di sequenza DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSPSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYT VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:42); o
un anticorpo comprendente una regione VH scelta tra DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:43), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLEWMCFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:44), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWIRQFPGNTLECMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:45), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWVRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:46), DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVSGYSITSDSYWNWTRQFPGNTLEWMGFISYD GNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLNLNSVTTEDTAIYFCAREYGYGYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:47) e una regione VL di sequenza DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSFLAWYQQNQGKSPQLLVYSAKTLL EGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSYYCQRHYGSPYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:48),
o un anticorpo umanizzato derivato da detto anticorpo.
22) Combinazione di una sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63, o di un vettore comprendente detta sequenza nucleotidica o di una cellula comprendente detto vettore, con una sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, per l?uso simultaneo, separato o sequenziale nella generazione di anticorpi contro SARS-CoV-2 in un organismo umano o animale, ossia nell?immunizzazione o nella vaccinazione di detto organismo umano o animale.
23) Combinazione secondo la rivendicazione 22, per l?uso secondo la rivendicazione 22, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente una o pi? sequenze leader, come ad esempio la sequenza leader dell?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), della IgK, del growth hormone, dell?albumina sierica o della fosfatasi alcalina e/o uno o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT).
24) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22-23, per l?uso secondo la rivendicazione 22, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente la sequenza leader della IgK, o peptide segnale della catena di IgK, di sequenza SEQ ID NO:68 e il dominio Fc di sequenza SEQ ID NO:69.
25) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22-24, per l?uso secondo la rivendicazione 22, in cui detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63, o detto vettore o detta cellula, ? somministrata/o prima di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67.
26) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22-25, per l?uso secondo la rivendicazione 22, in cui ? somministrata una prima dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula, successivamente ? somministrata una prima dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67, successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza nucleotidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:63 o di detto vettore o di detta cellula e successivamente ? somministrata una seconda dose di detta sequenza amminoacidica comprendente o consistente in SEQ ID NO:67.
27) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22-26, per l?uso secondo la rivendicazione 22, in cui detta sequenza nucleotidica, o detto vettore o detta cellula, e detta sequenza amminoacidica sono somministrate per via orale, sublinguale, nasale, parenterale, endovenosa.
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