PT2650310T - Anticorpo anti-adamts-5, derivados e utilizações dos mesmos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPO ANTI—ADAMTS—5, DERIVADOS E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos anti-ADAMTS-5 úteis no tratamento de uma condição associada com a degradação das cartilagens.

Em particular, tal degradação é observada na osteoartrite e noutras formas de artrites.

TÉCNICA ANTECEDENTE A osteoartrite (OA) é um grupo de doenças distintas que se sobrepõem, que podem ter diferentes etiologias mas resultados biológicos, morfológicos e clínicos semelhantes. 0 processo de doença não só afeta a cartilagem articular, mas envolve toda a articulação, incluindo o osso subcondral, ligamentos, cápsula, membrana sinovial e músculos periarticulares. Em última análise, a cartilagem articular degenera-se com fibrilação, fissuras, ulceração, e perda da superfície articular em toda a espessura. Esta condição caracteriza-se por áreas focais de perda de cartilagem articular dentro das articulações sinoviais, associadas com hipertrofia óssea (osteófitos e esclerose óssea subcondral) e espessamento da cápsula. Pode ser interpretado como a reação das articulações sinoviais frente a lesão. Este fenómeno pode ocorrer em qualquer articulação, mas é mais comum em articulações selecionadas da mão, coluna vertebral, joelho, pé e anca. Esta alteração patológica, quando grave, resulta em alterações radiológicas (perda de espaço articular e osteófitos), que foram utilizadas em estudos epidemiológicos para estimar a prevalência de OA em diferentes locais articulares. Os mecanismos moleculares e celulares na base do início da OA são, atualmente, desconhecidos; formula-se a hipótese que uma carga anormal bem como trauma podem ter um papel, mas parece ser certo que a genética e fatores hereditários também estão envolvidos. A inflamação, quando presente, é apenas secundária a um evento primário. A OA é a forma mais comum de artrite. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em todo o mundo, 9,6 % dos homens e 18 % das mulheres com idades superiores a 60 anos têm OA sintomática, classificando a OA como a 4a causa de incapacidade nas mulheres e a 8a causa nos homens. Considera-se que o risco de incapacidade é o mesmo para a OA do joelho e para a doença cardiovascular. A artrite reumatoide (AR), outra forma comum de artrite, é uma doença inflamatória crónica caracterizada por sinovite articular que conduz à degradação da cartilagem, erosão óssea e dor, conduzindo a uma incapacidade grave e mortalidade prematura.

Embora a OA e AR possam ser desencadeadas por diferentes causas e progredir de acordo com diferentes vias, elas partilham o processo subjacente que consiste num desequilíbrio na síntese e degradação da síntese de matriz, levando à destruição da cartilagem articular, o que por sua vez resulta no movimento articular limitado, instabilidade articular, dor e incapacidade crónica. Além disso, apesar do número impressionante de pacientes afetados pela OA ou AR, relativamente pouco se sabe sobre a sua etiologia, patogénese e progressão. De forma ainda mais impressionante, muito poucos fármacos antirreumáticos de agentes modificadores de doença (DMARD) existem para o seu tratamento, e estão principalmente limitados à AR.

Para a OA, na ausência de uma cura, o tratamento apenas pode ser paliativo, estando limitado à utilização de inibidores seletivos da COX-2, como celecoxib, e fármacos anti-inflamatórios não esteroides tradicionais (AINEs), como naproxeno e diclofenaco, ou mesmo fármacos mais antigos para o controlo da dor, como acetaminofeno. Uma classe adicional de fármacos, que inclui compostos como sulfato de condroitina e de glucosamina, também existem como uma opção de tratamento para a OA, mas muitos médicos ainda não estão convencidos da sua eficácia.

Em relação à AR, ao longo da última década, a utilização ótima dos DMARDs, em particular metotrexato e a disponibilidade de novos agentes biológicos, tipicamente suportados por AINEs e/ou corticosteroides para proporcionar um alívio da dor, bem como para controlar a inflamação em certa medida, melhoraram dramaticamente o sucesso desta gestão. Contudo, os DMARDs tradicionais têm um lento início de ação e toxicidade que exigem uma monitorização frequente. Além disso, a utilização de AINEs tem sido dominada pelos efeitos secundários gastrointestinais, quando se consideram os fármacos AINEs clássicos, e por efeitos secundários cardiovasculares e renais quando se consideram os inibidores seletivos da COX-2.

Portanto, a investigação por novos agentes terapêuticos que previnem a degradação da cartilagem é de grande interesse, uma vez que a OA e AR afetam milhões de pessoas em todo o mundo com uma incidência esperada aumentando com o aumento da idade média da população. A degradação da cartilagem que ocorre na OA e AR é o resultado da clivagem enzimática dos seus componentes estruturais. A cartilagem está principalmente constituída por condrócitos e uma matriz extracelular (ECM) que consiste em proteoglicanos (principalmente agrecano), colagénios e água. Dentro da matriz, a interação entre o agrecano, ácido hialurónico (HA) e colagénio tipo II provê a cartilagem com uma compressibilidade e elasticidade, propriedades biomecânicas para suporte de peso e funções motoras articulares únicas. 0 agrecano consiste em três regiões globulares: G1 e G2 perto do terminal N da proteína e G3 no terminal C. As regiões G1 e G2 estão separadas por um curto domínio interglobular (IGD) enquanto as regiões G2 e G3 estão separadas por uma longa região de ligação de glicosaminoglicano (GAG) . 0 domínio G1 constitui, através de uma proteína acessória, a região de ligação de agrecano a HA. A região de ligação de GAG do agrecano proporciona a elevada densidade de carga aniónica necessária para ligar água e conferir à cartilagem as suas propriedades osmóticas únicas necessárias para garantir a sua funcionalidade. Portanto, a compreensão dos mecanismos bioguimicos gue conduzem à clivagem de agrecano pode ajudar no desenvolvimento dos agentes terapêuticos adeguados para bloquear ou controlar a doença OA. A perda da integridade da cartilagem na artrite está associada com uma integridade de agrecano prejudicada devido à clivagem proteolítica da proteína. As agrecanases (principalmente agrecanase-2, também denominada ADAMTS-5 e agrecanase-1, também denominada ADAMTS-4) , foram recentemente identificadas como estando entre as enzimas chave para a degradação da cartilagem. Em particular, as publicações Glasson et al., 2005. Nature. 434:644-648) e Stanton et al., 2005. Nature. 434:648-652), demonstraram que ADAMTS-5 desempenha um papel fundamental nas alterações articulares patológicas associadas com dois modelos de OA e de RA no ratinho. Ambas ADAMTS-4 e -5 são glutamil endopeptidases e clivam o agrecano em cinco sítios específicos: Glu373-Ala374 (domínio interglobular-IGD), Glul545-Glyl546, Glul714-Glyl715, Glul819-Alal820, e ligações Glul919-Leul920 (sequência humana), resultando na destruição da cartilagem. A ADAMTS-4 (fig. 1, SEQ. ID NO: 1) e ADAMTS-5 humanas (fig. 1, SEQ. ID NO: 2) são metaloproteinases multidomínio secretadas a partir da célula para o espaço extracelular. Ambas as enzimas têm uma disposição de domínios semelhante consistindo numa seguência de sinal (SS), um prodomínio (Pro), um domínio de metaloproteinase catalítica (Cat), um domínio de desintegrina (Dis), um domínio de tromboespondina tipo I (TS), um domínio rico em cisteína (CysR) e um domínio espaçador (Sp). Adicionalmente, ADAMTS-5 contém um domínio TS extra depois do domínio espaçador. Todas as regiões de domínio mencionadas acima fora do domínio catalítico, que desempenham papéis significativos no reconhecimento e processamento dos substratos proteicos naturais, são denominadas "exosítios".

Foi demonstrado, por exemplo, que os domínios Sp e CysR das agrecanases contêm motivos de ligação de GAG que modulam a afinidade das proteinases para os seus substratos (Kashiwagi et al., 2004. J Biol Chem. 279:10109-10119); (Gendron et al., 2007. J Biol Chem. 282:18294-18306); (Flannery, Curr. 11:614-619); (Zeng et al., 2006. Biochim Biophys Acta. 1760:517-524) .

Assim, o interesse tem crescido no desenvolvimento de inibidores para ADAMTS-4 e -5 para o tratamento de OA e/ou RA. Numerosos inibidores de metaloproteinases foram desenvolvidos, e vários foram clinicamente testados em pacientes com cancro (Zucker et al., 2000. Oncogene. 19:6642-6650) e artrite reumatoide (Milner e Cawston, 2005. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4:363-375), mas foram incapazes de demonstrar eficácia e exibiram efeitos secundários como dor musculoesquelética e trombocitopenia ligeira (Zucker et al., 2000. Oncogene. 19:6642-6650). Acredita-se que estas incapacidades se devem à falta de seletividade dos inibidores e inibição de metaloproteinases não alvo biologicamente importantes e outros efeitos. A seletividade é, portanto, um pré-requisito para os inibidores terapêuticos não tóxicos. Uma forma de aumentar a seletividade contra metaloproteinases específicas consiste em gerar uma ligação alostérica ou exosítio. Os inibidores que se ligam a um exosítio enzimático poderiam bloquear a interação com substratos de ECM naturais e poderiam ser uma alternativa atrativa aos inibidores dirigidos a sítios ativos porque podem ser altamente específicos e bloquear eficazmente a hidrólise de apenas o substrato alvo, minimizando assim os efeitos secundários in vivo (Troeberg et al., 2008. Faseb J. 22:3515-3524) . O pedido WO 2011/002968 divulga um anticorpo capaz de ligação a ambos o domínio catalítico e domínio de desintegrina da ADAMTS-5 humana. Os documentos WO 01/11074 e WO 00/53774 divulgam uma proteína ADAMTS-5 e geralmente referem-se a anticorpos contra tal proteína.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Na presente invenção, os autores isolaram anticorpos que reconhecem e se ligam a um epítopo compreendido no domínio espaçador de ADAMTS-5 (denominados anticorpos anti-Sp_ADAMTS-5) . Os anticorpos são úteis para aplicações terapêuticas em seres humanos. Tipicamente, os anticorpos são totalmente humanos ou quiméricos ou humanizados para minimizar o risco de respostas imunitárias contra os anticorpos quando administrados a um paciente. Como descrito no presente documento, outras moléculas de ligação a antigénio como, por exemplo, fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio, derivados de anticorpos e moléculas multiespecíficas, pode ser concebidos ou derivados a partir de tais anticorpos. Os anticorpos da presente invenção apresentam uma ação inibidora contra a degeneração da matriz da cartilagem, controlam a produção de enzima de degradação da matriz da cartilagem e melhoram a síntese da matriz da cartilagem, consequentemente tratando e/ou prevenindo a degradação da cartilagem. Portanto, o anticorpo pode ser utilizado no tratamento e/ou prevenção de uma condição associada com a degradação da cartilagem. Tal condição inclui osteoartrite (OA), artrite reumatoide (AR), gota, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistémico artrite séptica, polimialgia reumática, espondilite anquilosante, pseudogota, polimiosite, fibromialgia ou doença de Lyme.

Em particular, os anticorpos da presente invenção, podem ser utilizados para o tratamento e/ou prevenção da doença classificada no estádio precoce até ao estádio avançado de OA e AR. Cada estádio desde o estádio inicial até ao estádio avançado de OA é classificado de acordo com a classificação de Mankin e OARSI.

Em ambas as patologias, as doenças classificadas em qualquer dos graus ou pontuações anteriormente mencionados são acompanhadas com degeneração da cartilagem como condição de doença. Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados eficazmente para tratar ou prevenir as doenças classificadas no estádio inicial até ao estádio avançado de 0Ά e RA.

Os fragmentos de ligação a anticorpo de tais anticorpos, bem como as moléculas que compreendem tais fragmentos de ligação a antigénio, incluindo fragmentos de anticorpo manipulados, derivados de anticorpos, anticorpos biespecificos e outras moléculas multiespecificas, são também descritos. Composições farmacêuticas e kits ou outros artigos que compreendem os anticorpos da invenção também fazem parte da invenção. É, portanto, um objeto da invenção um anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo capazes de reconhecer e ligar-se a um epitopo compreendido na região do aa. 732 ao aa. 874 da SEQ ID N.2 2 de ADAMTS-5. Preferentemente o epitopo está compreendido na região do aa. 732 ao aa 745 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 746 ao aa 763 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 764 ao aa 779 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 780 ao aa 795

da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 796 ao aa 811 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 812 ao aa 827 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 828 ao aa 843 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 844 ao aa 859 da SEQ ID N.2 2, preferentemente do aa 860 ao aa 874 da SEQ ID N.2 2. Ainda preferentemente, o epitopo está compreendido na região do aa. 757 ao aa 771 da SEQ ID N.2 2.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreendem pelo menos uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 62, 65, 68, 71,74, 77, 80, 83, 86, 89 e 92.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, adicionalmente conforme descrito acima, compreendem uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 e 91.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81,84, 87 e 90.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreendem adicionalmente pelo menos uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL3) tendo pelo menos 8 0 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 e 59.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 e 58.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 e 57. Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 e 90 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 e 91 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 62, 65, 68, 71,74, 77, 80, 83, 86, 89 e 92.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 e 57 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 28, 31,34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 e 58 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 e 59.

Numa forma de realização ainda preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 60, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 61, uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 62.

Numa forma de realização ainda preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRL1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 27, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 28 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 29.

Numa forma de realização ainda preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, compreendem uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 81, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 82 e uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 83. Numa forma de realização ainda preferida, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRLl tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 48, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 8 0 % de identidade com a SEQ ID NO 4 9 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 50.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreendem uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 87, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 88 e uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 89. Ainda preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRL1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 54, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 55 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 56.

Na presente invenção "pelo menos 80 % de identidade" significa que a identidade pode ser de pelo menos 80 % ou pelo menos 85 % ou 90 % ou 95 % ou 100 % de identidade de sequência com as sequências referidas.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima é um anticorpo quimérico, ou humanizado, ou desimunizado, ou completamente humano. É um objeto adicional da invenção, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima, para utilização médica. Preferentemente, para utilização no tratamento e/ou prevenção de uma condição associada com a degradação da cartilagem, tal como osteoartrite e/ou artrite reumatoide. É um objeto adicional da invenção uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme definido acima. Preferentemente, a molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 99 até à SEQ ID NO 120. Preferentemente, a molécula de ácido nucleico Preferentemente, o anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, é selecionado a partir do grupo que consiste num anticorpo que compreende: a) uma CDRH1 que consiste na SEQ id NO 69, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 70, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 71, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 36, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 37, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 38; b) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 72, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 73, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 74, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 39, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 40, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 41; c) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 75, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 76, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 77, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 42, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 43, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 44; d) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 78, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 79, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 80, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 45, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 46, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 47; e) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 81, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 82, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 83, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 48, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 49, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 50; f) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 84, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 85, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 86, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 51, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 52, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 53; g) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 87, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 88, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 8 9, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 54, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 55, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 56; h) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 90, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 91, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 92, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 57, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 58, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 59. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 são também selecionados a partir do grupo que consiste num anticorpo que compreende: a) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 60, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 61, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 62, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 27, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 28, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 2 9; b) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 63, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 64, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 65, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 30, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 31, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 32; c) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 66, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 67, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 68, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 33, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 34, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 35, compreende pelo menos uma das seguintes sequências: SEQ ID NO: 99, 100, 113, 114, 117 e 118. É um objeto adicional da invenção um vetor de expressão que codifica o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção. É um objeto adicional da invenção uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico como descrito acima. Preferentemente, a célula hospedeira produz o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção. É um objeto adicional da invenção um vetor de produção do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, compreendendo cultivar a célula que produz o anticorpo conforme descrito acima e recuperar o anticorpo a partir da cultura celular. É outro objeto da invenção uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A composição compreende uma quantidade eficaz do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo. Composições farmacêuticas são convencionais neste campo e podem ser feitas pelo perito na especialidade com base no conhecimento geral comum. Composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo e/ou um fragmento e/ou um derivado recombinante e/ou um conjugado do mesmo em mistura com pelo menos um excipiente e/ou veiculo farmaceuticamente aceitável estão incluídas no âmbito da presente invenção.

Numa forma de realização preferida, a composição de acordo com a invenção é para utilização em administração intra-articular.

Também é um objeto da invenção um anticorpo para utilização num método de tratamento e/ou prevenção de uma condição associada com a degradação da cartilagem, tal como osteoartrite, artrite reumatoide e outras formas de artrites que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima. Também é um objeto da invenção um anticorpo para utilização num método de tratamento e/ou prevenção da destruição articular da cartilagem, para o tratamento e/ou prevenção de doenças autoimunes e/ou inflamatórias compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima. É um objeto da invenção um método para a redução e/ou inibição de ADAMTS-5 compreendendo administrar uma quantidade eficaz do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito acima.

Na presente invenção, podem ser gerados mutantes das CDRs divulgadas mutando um ou mais aminoácidos na sequência das CDRs. Sabe-se que uma única substituição de aminoácido apropriadamente posicionada numa CDR pode ser suficiente para melhorar a afinidade. Os investigadores utilizaram a mutagénese sitio-dirigida para aumentar a afinidade de alguns produtos de imunoglobulina em cerca de 10 vezes. Este método de aumentar ou diminuir (ou seja, modular) a afinidade dos anticorpos por mutação de CDRs constitui conhecimento comum (veja-se, por exemplo, Paul, W. E., 1993). Assim, a substituição, eliminação ou adição de aminoácidos às CDRs da invenção para aumentar ou diminuir (ou seja, modular) a afinidade ou especificidade de ligação está também dentro do âmbito desta invenção.

Por questão de brevidade, o anticorpo preferido de acordo com a invenção deverá ser identificado com o nome CRB0017 (compreendendo a SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4), CRB0102 (compreendendo a SEQ ID NO 17 e SEQ ID NO 18) e CRB0123 (compreendendo a SEQ ID NO 21 e SEQ ID NO 22) como indicado no Quadro III. Enquanto a presente invenção se foca em tais anticorpos, como uma exemplificação da presente invenção, um perito na especialidade apreciará que, uma vez dada a presente divulgação, outros anticorpos semelhantes, e fragmentos de anticorpos do mesmos, bem como fragmentos de anticorpos destes anticorpos semelhantes podem ser produzidos e utilizados dentro do âmbito da presente invenção. Tais anticorpos semelhantes podem ser produzidos através de uma quantidade razoável de experimentação pelos peritos na especialidade.

Ainda preferentemente, o anticorpo é um fragmento scFv, fragmento Fv, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um anticorpo multimérico, um péptido ou um fragmento proteolitico contendo uma região de ligação a epítopo. Preferentemente, o fragmento scFv compreende uma sequência selecionada a partir do grupo da SEQ ID NO 125 a 132 e SEQ ID NO 135, 136, 137. É um objeto adicional da presente invenção um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou derivados funcionais do mesmo da invenção, ou híbrida com o ácido nucleico anterior, ou consiste numa sequência degenerada do mesmo. 0 processo para a preparação do anticorpo monoclonal encontra-se dentro da experiência de um perito na técnica e compreende cultivar células hospedeiras e isolar o anticorpo de acordo com procedimentos padrão.

No que diz respeito aos aspetos industriais da presente invenção, o anticorpo divulgado no presente documento pode ser adequadamente formulado em composições farmacêuticas conforme normalmente realizado neste campo técnico.

Os anticorpos da presente invenção podem compreender pelo menos uma CDRH como definida anteriormente que contém uma ou mais substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos de não mais do que 4 aminoácidos, preferentemente de não mais do que 2 aminoácidos. Os anticorpos da presente invenção podem adicionalmente compreender pelo menos uma CDRL como definida anteriormente que contém uma ou mais substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos de não mais do que 4 aminoácidos, preferentemente de não mais do que 2 aminoácidos.

Os anticorpos da invenção competem pela ligação a ADAMTS-5. 0 método para tratar ou prevenir uma condição associada com a degradação da cartilagem, compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito anteriormente. Em alguns aspetos, a invenção compreende um método de inibição da ligação de ADAMTS-5 a agrecano num indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme descrito anteriormente.

Os anticorpos, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, ligam-se seletivamente a ADAMTS-5, preferentemente com uma Kd que é < 2 nM.

Em alguns aspetos, a invenção compreende anticorpos para utilização num método para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com a degradação da cartilagem num indivíduo, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção em simultâneo ou sequencialmente com um agente que especificamente bloqueia a dor. 0 anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, é um anticorpo neutralizante (ou seja, um anticorpo que reduz ou anula a atividade biológica do antigénio relacionado) que se liga a ADAMTS-5 e reduz a probabilidade de que ADAMTS-5 se ligue a agrecano.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção ligam-se a ADAMTS-5 numa localização dentro dos resíduos 732-874 da SEQ. ID NO: 2. Nalgumas formas de realização, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, quando ligado a ADAMTS-5, é posicionado a 8 angstroms ou menos a partir de pelo menos um dos seguintes resíduos de ADAMTS-5: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741, S742, K743, G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751, P752, E753, G754, A755, T75 6, H7 57, 1758, K759, V760, R761, Q762, F763, K764, A765, K766, D767, Q768, T769, R770, F771, T772, A773, Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781, G782, E783, Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M791, 1792, S793, T794, S795, E796, T797, 1798, 1799, D800, 1801, N802, G803, T804, V805, M806, N807, Y808, S809, G810, W811, S812, H813, R814, D815, D816, F817, L818, H819, G820, M821, G822, Y823, S824, A825, T826, K827, E828, 1829, L830, 1831, V832, Q833, 1834, L835, A836, T837, D838, P839, T840, K841, P842, L843, D844, V845, R846, Y847, S848, F849, F850, V851, P852, K853, K854, S855, T856, P857, K858, V859, N860, S861, V862, T863, S864, H865, G866, S867, N868, K869, V870, G871, S872, H873 ou T874.

Em algumas formas de realização, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, bloqueia um anticorpo para ADAMTS-5 de se bloquear no espaço de 8 angstroms de um resíduo de ADAMTS-5. Em algumas formas de realização, o resíduo de ADAMTS-5 é selecionado a partir de pelo menos um dos seguintes resíduos de ADAMTS-5: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741, S742, K743, G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751, P752, E753, G754, A755, T756, H757, 1758, K759, V760, R761, Q762, F763, K764, A765, K766, D767, Q768, T769, R770, F771, T772, A773, Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781, G782, E783, Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M791, 1792, S793, T794, S795, E796, T797, 1798, 1799, D800, 1801, N802, G803, T804, V805, M806, N807, Y808, S809, G810, W811, S812, H813, R814, D815, D816, F817, L818, H819, G820, M821, G822, Y823, S824, A825, T826, K827, E828, 1829, L830, 1831, V832, Q833, 1834, L835, A836, T837, D838, P839, T840, K841, P842, L843, D844, V845, R846, Y847, S848, F849, F850, V851, P852, K853, K854, S855, T856, P857, K858, V859, N860, S861, V862, T863, S864, H865, G866, S867, N868, K869, V870, G871, S872, H873 ou T874.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, liga-se a ADAMTS-5 numa localização que se sobrepõe com uma localização na qual o agrecano se liga a ADAMTS-5.

Preferentemente, o anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção reduz a probabilidade de que o agrecano se ligará a ADAMTS-5 no espaço de 8 angstroms de pelo menos um dos seguintes resíduos em ADAMTS-5: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741, S742, K743, G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751, P752, E753, G754, Ά755, T756, H757, 1758, K759, V760, R761, Q762, F763, K764, Ά765, K766, D767, Q768, T769, R770, F771, T772, Ά773, Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781, G782, E783, Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M7 91,17 92, S793, Τ794, S795, Ε796, Τ797, 1798, 1799, D800, 1801, Ν802, G803, Τ804, V805, Μ806, Ν807, Υ808, S809, G810, W811, S812, Η813, R814, D815, D816, F817, L818, Η819, G820, Μ821, G822, Υ823, S824, Α825, Τ826, Κ827, Ε828, 1829, L830, 1831, V832, Q833, 1834, L835, Α836, Τ837, D838, Ρ839, Τ840, Κ841, Ρ842, L843, D844, V845, R846, Υ847, S848, F849, F850, V851, Ρ852, Κ853, Κ854, S855, Τ856, Ρ857, Κ858, V859, Ν860, S861, V862, Τ863, S864, Η865, G866, S867, Ν868, Κ869, V870, G871, S872, Η873 ou Τ874. A invenção proporciona formulações que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como divulgado no presente documento, um tampão mantendo o pH no intervalo desde cerca de 4,5 até cerca de 6, 5, e, opcionalmente, um tensioativo.

As formulações são tipicamente para uma concentração de principio ativo de anticorpo como divulgado no presente documento, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção, desde cerca de 0,1 mg/ml até cerca de 100 mg/ml. Em determinadas formas de realização, a concentração do anticorpo, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, é desde cerca de 0, 1 mg/ml até 1 mg/ml; preferentemente desde 1 mg/ml até 10 mg/ml, preferentemente desde 10 até 100 mg/ml.

Para os propósitos do presente documento, uma "composição farmacêutica" é uma que está adaptada e é adequada para administração a um mamífero, especialmente um ser humano. Assim, a composição pode ser utilizada para tratar uma doença ou distúrbio no mamífero. Além disso, o anticorpo na composição foi submetido a uma ou mais etapas de purificação ou isolamento, de modo que um ou mais contaminantes que possam interferir com a sua utilização terapêutica foram separados do mesmo. Geralmente, a composição farmacêutica compreende a proteína terapêutica e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição é normalmente estéril e pode ser liofilizada. Preparações farmacêuticas são descritas em maior detalhe abaixo.

As formulações terapêuticas do anticorpo/anticorpos podem ser preparadas por mistura do anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. 1980), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues, e podem incluir tampões, antioxidantes, conservantes, péptidos, proteínas polímeros hidrofílicos, agentes quelantes tais como EDTA, açúcares, contraiões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG) .

Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respetivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. 1980) . As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Noutra forma de realização, para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo/anticorpos anti-Sp-ADAMTS-5 da presente invenção, dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, de se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapêutica prévia, do historial clinico do paciente e resposta ao anticorpo, e do julgamento do médico assistente. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao paciente numa vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg de anticorpo, ou fragmento do mesmo, é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, ou por infusão continua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas de doença. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. 0 progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais. A composição de anticorpo deverá ser formulada, doseada e administrada de uma forma consistente com a boa prática médica. Os anticorpos/derivados da presente invenção podem ser administrados por uma via adequada. Isto inclui (mas não está limitada a) administração intraperitoneal, intramuscular, administração intravenosa, subcutânea, intra-articular, intratraqueal, oral, entérica, parentérica, intranasal ou dérmica. Um modo preferido de administração é a via intra-articular. Fatores para a consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos para os clínicos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a ser administrada será governada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para impedir, atenuar ou tratar uma doença ou distúrbio. 0 anticorpo não tem de ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz dos ditos outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. 0 termo "anticorpo" no presente documento é utilizado no sentido mais lato e engloba várias estruturas de anticorpo, incluindo mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos), e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade de ligação a antigénio desejada.

Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antigénio ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Um "anticorpo que se liga ao mesmo epítopo" como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antigénio num ensaio de competição em 50 % ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antigénio num ensaio de competição em 50 % ou mais. Um ensaio de competição exemplificativo é proporcionado no presente documento. O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada a partir de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado a partir de uma fonte ou espécie diferente. A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD IgE IgG e IgM; e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas denominam-se [alfa] , [delta], [épsilon], [gama], e [mu] , respetivamente. 0 termo "região Fc" no presente documento é utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. 0 termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. A menos que especificado de outra forma no presente documento, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é feita de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, como descrito em Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. "Região estrutural" (framework) ou "FR" refere-se a resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Os termos "anticorpo de comprimento completo", "anticorpo intacto" e "anticorpo completo" são utilizados no presente documento indistintamente para referir-se a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc como definido no presente documento.

Os termos "células hospedeira", "linha de célula hospedeira" e "cultura de célula hospedeira" são utilizados indistintamente e referem-se a células nas quais foi introduzido ácido nucleico exógeno, incluindo a progénie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas" gue incluem a célula primária transformada e progénie derivada da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progénie pode não ser completamente idêntica no teor de ácidos nucleicos em relação a uma célula parental, mas podem conter mutações. Progénie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída no presente documento. Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano ou célula humana ou derivado a partir de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos.

Uma "região estrutural de consenso humana" é uma região estrutural que representa os resíduos de aminoácidos que ocorrem mais comummente numa seleção de sequências de região estrutural de VL ou VH de imunoglobulinas humanas. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação NIH 913242). Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos a partir de FRs humanas. Em determinadas formas de realização, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aquelas de um anticorpo não humano, e todas, ou substancialmente todas, as FRs correspondem aquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido a humanização.

Um anticorpo "desimunizado" é um anticorpo com imunogenicidade reduzida com base na interrupção da ligação de HLA, um requisito subjacente para a estimulação das células T. 0 termo "região hipervariável" ou "HVR" conforme utilizado no presente documento refere-se a cada das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam ansas estruturalmente definidas ("ansas hipervariáveis"). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativos compreendem seis HVRs; três na VH (Hl, H2, H3) , e três na VL (Ll, L2, L3) . As HVRs geralmente compreendem resíduos de aminóácidos a partir de ansas hipervariáveis e/ou a partir de "regiões de determinação de complementaridade" (CDRs) , a última sendo da variabilidade de sequência mais elevada e/ou estando envolvida no reconhecimento antigénico. Ansas hipervariáveis exemplificativas ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (Ll), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl), 53-55 (H2), e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901- 917, 1987). CDRs exemplificativas (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de Hl, 50-65 de H2, e 95-102 de H3 (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Com a exceção da CDR1 em VH, as CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as ansas hipervariáveis. As CDRs também compreendem "resíduos de determinação de especificidade" ou "SDRs" que são resíduos que entram em contacto com o antigénio. As SDRs estão contidas dentro de regiões das CDRs denominadas CDRs abreviadas, ou a-CDRs. As a-CDRs exemplificativas (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de LI, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de HI, 50-58 de H2, e 95-102 de H3 (Veja-se Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633, 2008). A menos que indicado ο contrário, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados no presente documento de acordo com Rabat et al. O termo "anticorpo monoclonal" conforme utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou ligam-se ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades mínimas. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal está dirigido contra um único determinante sobre um antigénio. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, e não deve ser interpretado como necessitando a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não limitadas, ao método do hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de exibição em fagos e métodos utilizando animais transgénicos contendo a totalidade ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplificativos para fabricar anticorpos monoclonais estando descritos no presente documento. 0 termo "folheto informativo" é utilizado para referir-se a instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais dos produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, terapêutica de combinação, contraindicações e/ou avisos relacionados com a utilização de tais produtos terapêuticos. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se for necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. 0 alinhamento para propósitos de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançada em várias formas que estão dentro da perícia da técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente, tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sob o comprimento total das sequências a serem comparadas. 0 termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que se encontra sob tal forma de modo a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente numa formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que é não tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

Conforme é utilizado no presente documento, "tratamento" (e variações gramaticais do mesmo como "tratar" ou "tratando") refere-se à intervenção clinica numa tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado, e pode realizar-se para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenir a ocorrência ou recorrência de doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências diretas ou indiretas da doença, prevenir metástases, diminuir a taxa da progressão da doença, melhora ou paliação do estado patológico e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção são utilizados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para abrandar a progressão de uma doença. 0 termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de um anticorpo, de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antigénio. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respetivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs, Veja-se, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6- ed., W.H. Freeman arid Co., página 91, 2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação a antigénio. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antigénio particular podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antigénio para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respetivamente (Veja-se, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880- 887, 1993; Clarkson et al., Nature 352:624-628, 1991). O termo "vetor" conforme utilizado no presente documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligada. 0 termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicativa bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Determinados vetores são capazes de dirigir a expressão dos ácidos nucleicos aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como "vetores de expressão".

Noutro aspeto, o anticorpo ou derivados do mesmo compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) tendo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24.

Noutro aspeto, o anticorpo ou derivados do mesmo compreendem um domínio variável de cadeia leve (VK ou VL) tendo pelo menos 80 %, 85 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23.

Em determinadas formas de realização, a sequência VH ou sequência VK/VL tendo pelo menos 80 % 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a dita SEQ ID NO contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções, ou eliminações em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-Sp-ADAMTS-5 compreendendo aquela sequência retém a capacidade de se ligar ao domínio espaçador de ADAMTS-5. Em determinadas formas de realização, um total de 1 a 4 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou eliminado na sequência da CDRH3 tal como na SEQ ID NO 62. Em determinadas formas de realização, substituições, inserções, ou eliminações ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs).

Preferentemente, o anticorpo da invenção é o anticorpo CRB0017, CRB0102, CRB0123 como definido no Quadro III.

Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção tem uma constante de dissociação (Kd) de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM ou menos, por exemplo, desde 10~8 M até 10^13 M, por exemplo, desde 10-9 M até 10-13 M.

Numa forma de realização, a Kd é medida por um ensaio de ligação de antigénio radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antigénio como descrito pelo seguinte ensaio. A afinidade de ligação em solução dos Fabs a antigénio é medida equilibrando Fab com uma concentração minima de antigénio (I)-marcado na presença de uma série de titulação de antigénio não marcado, e posteriormente capturando o antigénio ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (veja-se, por exemplo, Chen et al. , J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)) . A invenção será agora descrita por exemplos não limitativos com referência às seguintes figuras.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática de ADAMTS-4 e ADAMTS-5. Ambas as enzimas são metaloproteinases multidominio secretadas a partir da célula para o espaço extracelular. Ambas as enzimas têm uma disposição de domínios semelhante consistindo numa sequência de sinal (SS), um prodomínio (Pro), um domínio de metaloproteinase catalítica (Cat), um domínio de desintegrina (Dis), um domínio de tromboespondina tipo I (TS) , um domínio rico em cisteína (CysR) e um domínio espaçador (Sp). Adicionalmente, ADAMTS-5 contém um domínio TS extra depois do domínio espaçador.

Figura 2. Análise de Western blot de ADAMTS-5 p75 depois da purificação por FPLC, utilizando um anticorpo contra a etiqueta FLAG da proteína. Os Western blots são sondados com anticorpos monoclonais que reconhecem as proteínas contendo uma sequência peptídica FLAG (Sigma Aldrich, Monoclonal ANTI-FLAG M2, diluição 1:1000). Para a deteção utilizando substrato de peroxidase quimioluminescente, foi empregue um anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com peroxidase (1:10.000). TS5= Células transfetadas com ADAMTS-5; NT= Células não transfetadas; M= Simuladas.

Figura 3. Reatividade de ELISA de scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 isolados com Espaçador-GST e controlo negativo de GST. Os antigénios de Espaçador-GST e GST foram revestidos a 10 pg/ml. scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 foram utilizados a 50 e/ou 5 pg/ml (dados não mostrados) . A absorvância média a 450 nm das experiências realizadas em poços duplicados é mostrada com o DP indicado pelas barras.

Figura 4. ELISA de tipo sanduíche. Curvas de diluição de CRB0017_IgG4 revestido ligando-se a Espaçador-GST e/ou GST em solução a 30 pg/ml. Como anticorpo secundário foi utilizado um anti-GST (1:1000) após um anti-IgG de coelho com HRP (1:2000) para deteção final. A absorvância média a 450 nm das experiências realizadas em poços duplicados é mostrada com o DP indicado pelas barras.

Figura 5. Análise cinética de CRB0017_IgG4 ligando Espaçador-GST em solução utilizando Biacore X-100. 5610 RU de CRB0017_IgG4 foram imobilizadas num chip CM5. A associação e dissociação foram realizadas durante 180 seg. e 800 seg. respetivamente. As constantes de taxa cinética e afinidade determinadas para a interação de CRB0017_IgG4/Espaçador-GST estão mostradas no quadro abaixo.

Figura 6. Imunoprecipitação (IP) de ADAMTS-5 de comprimento completo (TS5-FL) por CRB0017_IgG4. 0,1 pg de TS5-FL dialisada/purifiçada por afinidade foram imunoprecipitados (IP) com anticorpo CRB0017_IgG4 anti-Sp_ADAMTS-5 (11, 22 e 25 pg na pista 1, 2 e 3, respetivamente) ou com 11 pg de anticorpo não relacionado como um controlo negativo (pista 4). Os imunoprecipitados foram analisados por imunotransferência com anticorpo anti-FLAG (1 : 1000) . A banda de TS5-FL de ~ 81 kDa imunoprecipitada com CRB0017_IgG4 foi observada correspondendo à proteína TS5-FL p75. A massa molecular da proteína TS5-FL imunoprecipitada é ligeiramente superior do que a prevista a partir da sua composição de aminoácidos. Esta diferença deve-se à N-glicosilação nos domínios Dis, CysR, e Sp e a O-glicosilação no domínio C-terminal. Os marcadores de massa molecular estão indicados do lado esguerdo da Figura.

Figura 7. IP de ADAMTS-4 de comprimento completo (TS4-FL) por CRB0017_IgG4. 0,2 pg de TS4-FL dialisada/purifiçada por afinidade foram imunoprecipitados (IP) com anticorpo CRB0017_IgG4 anti-Sp_ADAMTS-5 (30 e 60 pg na pista 1 e 2, respetivamente) ou com um anticorpo não relacionado (30 pg) como um controlo negativo (pista 3) . Na pista 4, TS4-FL dialisada/purifiçada por afinidade foi carregada como um controlo positivo. Os imunoprecipitados foram analisados por imunotransferência com anticorpo anti-FLAG (1 : 1000) . A banda de TS5-FL de ~ 75 kDa imunoprecipitada com CRB0017_IgG4 foi observada correspondendo à proteína TS4-FL p68. A massa molecular da proteína TS4-FL imunoprecipitada é ligeiramente superior do que o previsto a partir da sua composição de aminoácidos e isto deve-se principalmente à N- e O-glicosilação na proteína. Os marcadores de massa molecular estão indicados do lado esquerdo da Figura.

Figura 8. Efeito de IgG4 anti-Sp_ADAMTS-5 na proteólise in vitro de cartilagem bovina induzida por IL-Ια. A Figura representa a atividade de IL-Ια a 5 ng/ml na ausência ou presença de CRB0017 IgG4 depois de 48 h de incubação (três experiências independentes diferentes) . Como um controlo negativo em cada experiência, foi utilizado uma IgG4 nativa humana (Serotec). Como um controlo positivo em cada experiência, foram utilizados um inibidor de ADAMTS-5 sintético (Cpd 23) e um inibidor de ADAMTS-5 natural (TIMP-3). Os resultados são expressos como % de libertação de GAG, ou seja, a quantificação de glicosaminoglicanos (GAGs) sob a forma de fragmentos de agrecano libertados a partir da cartilagem em cultura; este método mede a eficiência das citocinas na simulação do metabolismo da cartilagem.

Figura 9. Avaliação do efeito da proteína de ligação a HéliceB-ADAMTS-5, CRB0016_IgG4 no modelo de ratinho STR/ort de osteoartrite. CRB0016_IgG4 foi administrada por via intra-articular em ambos os joelhos de cada animal, uma vez no início da experiência e novamente depois de 6 semanas, a doses de 1,2 e 12 pg/joelho. Três meses depois da primeira administração, CRB0016_IgG4 não modificou o curso da OA na estirpe de ratinhos STR/ort, como avaliado histopatogicamente. 0 grau é definido como a profundidade da lesão através da cartilagem articular. 0 estádio é definido como a extensão horizontal do envolvimento da cartilagem dentro de um lado de um compartimento articular independentemente do grau subjacente. Tomados conjuntamente, ambos constituem um índice da gravidade ou progressão patológica do processo osteoartrítico, e efetivamente a pontuação OARSI é definida como grau x estádio. A perda celular é definida como a fração de condrócitos articulares gue passaram por morte celular, dentro do compartimento articular considerado. A perda de GAG (glicosaminoglicanos) é definida, e avaliada, pela perda de uma coloração catiónica gue apresenta metacromasia em relação aos GAGs como, por exemplo, Azul de toluidina ou Safranina 0. Manin definiu a sua pontuação como a soma do grau, perda celular e perda de GAG, enguanto a pontuação total é definida como a soma da pontuação OARSI, perda celular e perda de GAG. Todos os parâmetros anteriores constituem características da OA e a sua pontuação fornece uma medida da gravidade e progressão da patologia.

Figura 10. Avaliação do efeito de CRB0017_IgG4 no modelo de ratinho STR/ort de osteoartrite. CRB0017_IgG4 foi administrada por via intra-articular em ambos os joelhos de cada animal, uma vez no início da experiência e novamente depois de 6 semanas, a doses de 1,2 e 12 pg/joelho. Três meses depois da primeira administração, CRB017_IgG4 mostrou uma atividade dependente da dose na redução da gravidade de OA no modelo de ratinho STR/ort. Todos os parâmetros são definidos como na Fig. 9.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ. ID N0:1: ATS4_HUMANA Uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de tromboespondina 4 (UniProtKB/Swiss-Prot: 075173.3) SEQ. ID NO 2: ATS5_HUMANA Uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de tromboespondina 5 (UniProtKB/Swiss-Prot: Q9UNA0.2)

SEQ. ID NO: 3, CRB0017VK

SEQ. ID NO: 4, CRB0017VH

SEQ. ID NO: 5, CRB0018VK

SEQ. ID NO: 6, CRB0018VH

SEQ. ID NO: 7, CRB0019VK

SEQ. ID NO: 8, CRB0019VH

SEQ. ID NO: 9, CRB0091VK

SEQ. ID NO: 10, CRB0091VH

SEQ. ID NO: 11, CRB0092VL

SEQ. ID NO: 12, CRB0092VH

SEQ. ID NO: 13, CRB0093VK

SEQ. ID NO: 14, CRB0093VH

SEQ. ID NO: 15, CRB0094VL

SEQ. ID NO: 16, CRB0094VH

SEQ. ID NO: 17, CRB0102VK

SEQ. ID NO: 18, CRB0102VH

SEQ. ID NO: 19, CRB0122VL

SEQ. ID NO: 20, CRB0122VH

SEQ. ID NO: 21, CRB0123VK

SEQ. ID NO: 22, CRB0123VH

SEQ. ID NO: 23, CRB0124VL

SEQ. ID NO: 24, CRB0124VH

SEQ. ID NO: 25, CRB0016VK

SEQ. ID NO: 26, CRB0016VH SEQ. ID NO: 27, CDRL1_17 SEQ. ID NO: 28, CDRL2_17 SEQ. ID NO: 29, CDRL3_17 SEQ. ID NO: 30, CDRL1_18 SEQ. ID NO: 31, CDRL2_18 SEQ. ID NO: 32, CDRL3_18 SEQ. ID NO: 33, CDRL1_19 SEQ. ID NO: 34, CDRL2_19 SEQ. ID NO: 35, CDRL3_19 SEQ. ID NO: 36, CDRL1_91 SEQ. ID NO: 37, CDRL2_91 SEQ. ID NO: 38, CDRL3_91 SEQ. ID NO: 39, CDRL1_92 SEQ. ID NO: 40, CDRL2_92 SEQ. ID NO: 41, CDRL3_92 SEQ. ID NO: 42, CDRL1_93 SEQ. ID NO: 43, CDRL2_93 SEQ. ID NO: 44, CDRL3_93 SEQ. ID NO: 45, CDRL1_94 SEQ. ID NO: 46, CDRL2_94 SEQ. ID NO: 47, CDRL3_94 SEQ. ID NO: 48, CDRL1_102 SEQ. ID NO: 49, CDRL2_102 SEQ. ID NO: 50, CDRL3_102 SEQ. ID NO: 51, CDRL1_122 SEQ. ID NO: 52, CDRL2_122 SEQ. ID NO: 53, CDRL3_122 SEQ. ID NO: 54, CDRL1_123 SEQ. ID NO: 55, CDRL2_123 SEQ. ID NO: 56, CDRL3_123 SEQ. ID NO: 57, CDRL1_124 SEQ. ID NO: 58, CDRL2_124 SEQ. ID NO: 59, CDRL3_124 SEQ. ID NO: 60, CDRH1_17 SEQ. ID NO: 61, CDRH2_17 SEQ. ID NO: 62, CDRH3_17 SEQ. ID NO: 63, CDRH1_18 SEQ. ID NO: 64, CDRH2_18 SEQ. ID NO: 65, CDRH3_18 SEQ. ID NO: 66, CDRH1_19 SEQ. ID NO: 67, CDRH2_19 SEQ. ID NO: 68, CDRH3_19 SEQ. ID NO: 69, CDRH1_91 SEQ. ID NO: 70, CDRH2_91 SEQ. ID NO: 71, CDRH3_91 SEQ. ID NO: 72, CDRH1_92 SEQ. ID NO: 73, CDRH2_92 SEQ. ID NO: 74, CDRH3_92 SEQ. ID NO: 75, CDRH1_93 SEQ. ID NO: 76, CDRH2_93 SEQ. ID NO: 77, CDRH3_93 SEQ. ID NO: 78, CDRH1_94 SEQ. ID NO: 79, CDRH2_94 SEQ. ID NO: 80, CDRH3_94 SEQ. ID NO: 81, CDRH1_102 SEQ. ID NO: 82, CDRH2_102 SEQ. ID NO: 83, CDRH3_102 SEQ. ID NO: 84, CDRH1_122 SEQ. ID NO: 85, CDRH2_122 SEQ. ID NO: 86, CDRH3_122 SEQ. ID NO: 87, CDRH1_123 SEQ. ID NO: 88, CDRH2_123 SEQ. ID NO: 89, CDRH3_123 SEQ. ID NO: 90, CDRH1_124 SEQ. ID NO: 91, CDRH2_124 SEQ. ID NO: 92, CDRH3_124 SEQ. ID NO: 93, lexA-Espaçador

SEQ. ID NO: 94, Espaçador-GST

SEQ. ID NO: 95, CRB0016_VK SEQ. ID NO: 96, CRB0016_IgG4

SEQ. ID NO: 97, CRBO017_VK_CK

SEQ. ID NO: 98, CRBO017_IgG4 SEQ. ID NO: 99, CRB0017_VK SEQ. ID NO: 100, CRB0017_VH

SEQ. ID NO: 101, CRB0018_VK

SEQ. ID NO: 102, CRB0018_VH

SEQ. ID NO: 103, CRB0019_VK

SEQ. ID NO: 104, CRB0019_VH

SEQ. ID NO: 105, CRB0091_VK

SEQ. ID NO: 106, CRB0091_VH

SEQ. ID NO: 107, CRB0092_VL

SEQ. ID NO: 108, CRB0092_VH

SEQ. ID NO: 109, CRB0093_VK

SEQ. ID NO: 110, CRB0093_VH

SEQ. ID NO: 111, CRB0094_VL

SEQ. ID NO: 112, CRB0094_VH

SEQ. ID NO: 113, CRB0102_VL

SEQ. ID NO: 114, CRB0102_VH

SEQ. ID NO: 115, CRB0122_VL

SEQ. ID NO: 116, CRB0122_VH

SEQ. ID NO: 117, CRB0123_VK

SEQ. ID NO: 118, CRB0123_VH

SEQ. ID NO: 119, CRB0124_VL

SEQ. ID NO: 120, CRB0124_VH

SEQ. ID NO: 121, DOMÍNIO ESPAÇADOR HUMANO_AA

SEQ. ID NO: 122, HÉLICE_B_ADAMTS-5_AA

SEQ. ID NO: 123, DOMÍNIO ESPAÇADOR HUMANO SEQ. ID NO: 124, HÉLICE_B_ADAMTS-5 SEQ. ID NO: 125, CRB0017_scFv SEQ. ID NO: 126, CRB0018_scFv SEQ. ID NO: 127, CRB0019_scFv SEQ. ID NO: 128, CRB0091_scFv SEQ. ID NO: 129, CRB0092_scFv SEQ. ID NO: 130, CRB0093_scFv SEQ. ID NO: 131, CRB0094_scFv SEQ. ID NO: 132, CRB0102_scFv SEQ. ID NO: 133, ADAMTS-5_ADNc HUMANO SEQ. ID NO: 134, ADAMTS-4_ADNc HUMANO SEQ. ID NO: 135, CRB0122_scFv SEQ. ID NO: 136, CRB0123_scFv SEQ. ID NO: 137, CRB0124_scFv SEQ. ID NO: 138, ligante peptídico pequeno

SEQ. ID NO: 139-216, iniciadores sintéticos MATERIAIS E MÉTODOS

Biblioteca SPLINT a partir de linfócitos humanos. 0 desenvolvimento de anticorpos terapêuticos para utilização no tratamento de doenças humanas tem sido um objetivo há muito tempo para muitos investigadores no campo dos anticorpos. Uma forma de obter estes anticorpos é através de Single Pot Library of Intracellular Antibodies (bibliotecas SPLINT) construídas a partir de linfócitos humanos. A tecnologia SPLINT expressa bibliotecas de scFv (fragmento de anticorpo de cadeia simples) humano clonado no vetor pMVl, um vetor derivado a partir do vetor pLinker220 (Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153), como fusão do domínio de ativação VP16. As regiões variáveis estão ligadas com um ligante peptídico pequeno (SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT, SEQ ID NO 138) . pMVl contém o gene LEU2 que permite a manutenção do plasmídeo e seleção em meios que carecem de leucina na estirpe de levedura L40 e o gene bla que permite a seleção do plasmídeo em E. coli.

Para a construção de bibliotecas SPLINT humanas, foram utilizadas as doações de sangue periférico a partir de cem dadores não imunizados. Foram recolhidos aproximadamente 2-20 ml de amostras de sangue a partir de cada dador. Os linfócitos-B foram isolados a partir do sangue periférico utilizando reagente de placas Ficoll (Amersham, EUA) . De forma breve, a amostra de sangue diluída (1:1 de sangue para PBS) foi cuidadosamente colocada em camada sobre o reagente de placas Ficoll, e depois a solução de duas fazes foi centrifugada a 400 x g durante 30 minutos. Linfócitos-B foram recolhidos a partir da interface entre as duas fases. ARN total foi extraído a partir dos linfócitos-B através do RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. ARN total foi preparado a partir dos linfócitos B e agrupado em conjunto antes de ser utilizado para o isolamento de ARNm. 0 ARNm foi preparado utilizando o Oligotex mRNA mini kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 sistema ThermoScript™ RT-PCR (Invitrogen) foi utilizado para reações de síntese de ADNc de acordo com as instruções do fabricante. Oligo (dT)20 foram utilizados para sintetizar ADNc do repertório de genes V. De modo a reduzir a tendência da ampliação, os autores realizaram 62 (para huSPLINT_09) e 75 (para huSPLINT_10) reações de PCR independentes para amplificar os segmentos de gene V, utilizando todas as combinações possível dentro de um conjunto de iniciadores (para huSPLINT_09 veja-se o Quadro I; para huSPLINT_10 veja-se o Quadro II).

As sequências iniciadoras, que em teoria englobam a totalidade do repertório dos genes de anticorpos humanos, foram obtidas a partir de IMGT/GENE-DB (Giudicelli et al., 2005. Stud Health Technol Inform. 116:3-8), e modificadas de acordo com protocolos previamente publicados (Sblattero e Bradbury, 1998. Immunotechnology. 3:271-278); (Marks et al., 1991. EurJ Immunol. 21:985-991); (Orlandi et al., 1992. Biotechnology. 24:527-531). Neste método, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve rearranjadas individuais são amplificadas separadamente e são ligadas através de uma série de etapas de reação em cadeia da polimerase (PCR) sobrepostas para dar os produtos de scFv finais que são utilizados para clonagem (Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153). As reações de PCR para huSPLINT_9 (Quadro I) incluíram sete iniciadores diretos de VH emparelhados com quatro iniciadores inversos de VH que geraram um total de vinte e oito reações; enquanto quatro iniciadores diretos de Vk emparelhados com quatro iniciadores inversos geraram um total de dezasseis reações; e nove iniciadores diretos de VÀ emparelhados com dois iniciadores inversos de νλ geraram um total de dezoito reações. Quadro I:Iniciadores de PCR inversos (rv) e diretos (fw) de huSPLINT_09 para a cadeia de genes V humanos

As reações de PCR para huSPLINT_9 (Quadro II) incluíram seis iniciadores diretos de VH com quatro iniciadores inversos de VH que geraram um total de vinte e oito reações; enquanto seis iniciadores diretos de Vk emparelhados com cinco iniciadores inversos de Vk geraram um total de trinta reações; e sete iniciadores diretos de VX emparelhados com três iniciadores inversos de VX geraram um total de vinte e uma reações.

Quadro II: Iniciadores de PCR inversos (rv) e diretos (fw) de huSPLINT_10 para a cadeia de genes V humanos

As PCRs conduzem à representação no repertório de regiões variáveis derivadas a partir de todas as montagens de regiões estruturais concebíveis. Todos os iniciadores continham sítios de restrição de BssHII ou Nhel ou sequência ligante. A última PCR de recuperação (pull-through) poderia ser feita com dois iniciadores (PTfw&amp;PTrv) . Depois de os repertórios de genes scFv terem sido sequencialmente digeridos com BssHII e Nhel, eles foram ligados diretamente no vetor pMVl pré-digerido e desfosforilado. A partir de uma reação de ligação e trinta eletroporações para cada biblioteca, os autores foram capazes de obter as bibliotecas finais de huSPLINT_09 e huSPLINT_10 cada consistindo de ~108 moléculas de scFv diferentes com 0,04 % de clones a partir de ligação sem inserto.

Clonagem de isco Espaçador-ADAMTS-5 e expressão nas células de levedura L40. ADNc humano codificando Espaçador-ADAMTS-5 humano (SEQ ID NO 123) foi amplificado a partir de ADAMTS-5 pSecTag2A utilizando iniciadores: 5'-TGGCTGGAATTCACAAAGATTGTTGGA-3' SEQ ID NO 211 5'-GTCGACGGATCCTTAAGTGTGTGATCCCAC-3' SEQ ID NO 212 O ADNc digerido com EcoRI-BamHI foi clonado no vetor pMICBDI (Visintin et ai., 2004. J Immunol Methods . 290:135-153) concebido para conter o gene TRP1 de resistência bacteriana a cloranfenicol, (que permite que leveduras que contenham este plasmideo cresçam em meio mínimo isento de triptofano) e a origem de replicação 2μ. Este plasmideo contém toda a região da proteína lexA de Escherichia coli, expressa a partir do promotor da álcool desidrogenase I (ADH1) de levedura, seguida por um poliligante para a inserção de ADNc, para gerar fusões em estrutura com lexA. Foi sequenciado um isco para confirmar a fusão em estrutura do inserto com o domínio de ligação lexA no vetor. Células de levedura L40 foram transfetadas com o vetor Sp_ADAMTS-5/MICBDl de isco utilizando o protocolo de transformação de acetato de lítio. Os transformantes foram avaliados quanto à prototropia em placas YC-Lys/-Ura/-His/-Trp (Visintin e Cattaneo, 2001. Antibody

Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 2 90:135-153.; Visintin et al., 2004. Métodos. 34:200-214;

Visintin et al., 2002. JMol Biol. 317:73-83.; Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sei EUA. 96:11723-11728) . As colónias de leveduras foram avaliadas quanto à atividade de β-galactosidase utilizando filtros de elevação de colónias, como anteriormente descrito (Visintin e Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1: 790) . A transfeção do isco não resultou na ativação do gene lacZ (dados não mostrados).

Clonagem de isco HéliceB—ADAMTS—5 e expressão nas células de levedura L40. O ADNc que codifica uma hélice ot (héliceB, SEQ ID NO 124) na posição superficial do domínio catalítico humano de ADAMTS-5 foi montado utilizando os iniciadores: 5’-AATTCAACGCTGCCACCACACTCAAGAACTTTTGCAAGTGGCAGCACCAACAC AACTAACTGCA-3’ SEQ ID No. 213 5 ’ -GTTAGTTGTGTTGGTGCTGCC ACTTGC AAAAGTTCTTGAGTGTGGTGGC AGCGT TG-3’ SEQ ID No. 214 O ADNc digerido com EcoRI-PstI foi clonado no vetor pMICBDI (Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153). Células de levedura L40 foram transfetadas com o vetor Sp_ADAMTS-5/MICBD1 de isco utilizando o protocolo de transformação de acetato de lítio. Os transformantes foram avaliados quanto à prototropia em placas YC-Lys/-

Ura/-His/-Trp (Visintin e Cattaneo, 2001. Antibody

Engineering. 1:790). As colónias de leveduras foram avaliadas quanto à atividade de β-galactosidase utilizando filtros de elevação de colónias, como anteriormente descrito (Visintin e Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790). A transfeção do isco não resultou na ativação do gene lacZ (dados não mostrados).

Análise de Western blot de isco Espaçador-ADAMTS-5.

Uma cultura de leveduras durante a noite foi diluída em 5 ml de meio YC a uma D0600 0, 15 e cultivadas a 30 2C até D0600 0,6. 1 ml de cultura foi centrifugado a 10000xg durante 5 minutos e o sedimento celular foi ressuspendido em tampão Laemmli, desenvolvido em SDS-PAGE a 12 %, e transferido para uma membrana de PVDF (Millipore). Foi utilizado anticorpo policlonal anti-LexA (Invitrogen) , seguido por anti-coelho-HPR (DAKO). 0 sistema ECL-quimioluminescente (Amersham) foi utilizado para deteção (dados não mostrados). Seleções SPLINT.

As bibliotecas SPLINT foram transformadas na estirpe de levedura L40 expressando o isco (Sp_ADAMTS-5/MICBDl ou HéliceB- ADAMTS-5/MICBD1) utilizando o método de acetato de litio e a seleção como descrito (Visintin e Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153.; Visintin et al., 2004. Métodos. 34:200-214; Visintin et al. , 2002. J Mol Biol. 317:73-83.; Visintin et al. r 1999.ProcNatl Acad Sei EUA. 96:11723-11728) . Células de levedura transformadas foram colocadas em placas em meio sólido isento de Trp (W), Leu (L), Uracilo (U), Lys (K) e His (H) (YC- WHULK) . A expressão do marcador seletivo Trp (W) é proporcionada pelo plasmídeo pMICBDl, Leu (L) pelo plasmideo pMVl, e Uracilo (U) , Lys (K) e His (H) são marcadores prototróficos da estirpe de levedura. Os clones positivos foram cultivados em meio seletivo YC-WHULK. Os ensaios de β-galactosidase foram realizados conforme descrito (Visintin e Cattaneo, 2 0 01. Antibody Engineering. 1:790; Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153.; Visintin et al., 2004. Métodos. 34:200-214; Visintin et al., 2002. JMol Biol. 317:73-83.; Visintin et al., 1999. Proc Natl Acad Sei EUA. 96:11723-11728). 11 scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 positivos foram isolados depois do rastreio secundário a partir de quatro rastreios independentes de diferentes bibliotecas SPLINT (mSPLINT, huSPLINT_0 9 e huSPLINT_10) . Os resultados das seleções realizadas para o isco Sp_ADAMTS-5 estão resumidos no Quadro III.

Quadro III. Resumo das seleções Sp__ADAMTS-5 SPLINT

Clonagem e expressão da proteína de Espaçador-ADAMTS-5-GST.

Um domínio espaçador humano de ADAMTS-5 (SEQ. ID NO: 121 e 123) foi clonado nos sítios de restrição Nco-Xhol de pET41b (Novagen). 0 ADNc que codifica o domínio Espaçador foi amplificado a partir de ADAMTS-5 pSecTag2A utilizando os iniciadores: 5'-ATCCATGGTCACAAAGATTGTTGGAACC-3' SEQ ID NO 215 5'-ATCTCGAGTTAAGTGTGTGATCCCACTTTATTG-3' SEQ ID NO 216 0 plasmídeo Sp_ADAMTS-5-GST/pET41b foi transformado em Rosetta 2 (DE3) E. coli (Novagen) por sistema de transformação de choque térmico (Hanahan, 1983. J Mol Biol. 166:557-580.) e colocadas em placas LB Kan/Cam.

No dia seguinte, uma única colónia foi inoculada e diluída em 10 ml de meio LB Kan/Cam. As bactérias transformadas foram cultivadas durante a noite a 37 2C com agitação a 250 RPM.

No dia seguinte, as bactérias que cresceram durante a noite foram diluídas em 500 ml de meio LB Kan/Cam e depois deixadas a crescer a 37 2C com agitação a 250 RPM até a cultura atingir DO(600)=0,7. Depois, foi adicionado ITPG a 0,2 mM (concentração final). As bactérias induzidas foram incubadas durante 5-6 horas a 25 2C com agitação a 250 RPM. As bactérias foram finalmente centrifugadas a 6000 RPM durante 15 minutos e o sedimento foi congelado a -80 2C.

Reformatação de scFvs anti-ADAMTS-5 em anticorpos IgG completos. scFv anti-catalítico-ADAMTS-5 CRB0016 e scFv anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0017 foram reformatados em anticorpos IgG quiméricos completos por acoplamento dos domínios variáveis de ligação a antigénio murinos com domínios constantes humanos. Para cada anticorpo os ADNc que codificam a cadeia leve e pesada (Fc a partir de IgG4 humana) foram gerados por GENEART (Alemanha) com sítios de restrição adequados para subclonagem. As sequências foram otimizadas quanto à expressão em mamíferos (linha celular CHO-S) (SEQ ID NO: 95 e 96; 97 e 98) . Depois da síntese de ambas cadeias, os ADNc foram subclonados em plasmídeos de expressão (derivados de pcDNA3.1 contendo um promotor CMV estendido para expressão do gene de interesse) utilizando HindiII e Xhol como sítios de clonagem. Para cada cadeia de anticorpo, foram gerados dois plasmídeos de expressão: um plasmídeo contendo o ADNc que codifica a cadeia leve e um contendo o ADNc que codifica a cadeia pesada. 0 plasmídeo de expressão contendo os insertos corretos foi verificado por análise de restrição e análise de sequência de ADN do inserto. scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0102 e CRB0123 foram também reformatados em anticorpos IgG4 após o procedimento de clonagem adotado para CRB0016 e CRB0017 descrito anteriormente. Produção de anticorpos IgG4 CRB0016 e IgG4 CRB0017 a partir de células transfetadas.

Anticorpos anti-ADAMTS-5 foram produzidos a partir de células transfetadas. Células CHO-S foram transfetadas com plasmídeos que codificam cadeias pesadas de CRB0016 e CRB0017. Os meios condicionados a partir das células transfetadas foram recuperados através da remoção das células e detritos. Os meios condicionados clarificados foram carregados sobre uma coluna de proteína A-sefarose. Ligações não específicas foram removidas por extensivas lavagens com tampão de ligação (fosfato de sódio a 20 mM pH 7,0) . Proteínas de anticorpo ligadas sobre a coluna de proteína A foram recuperada por eluição ácida dos anticorpos a partir da proteína A (glicina-HCl a 0,1 M pH 3,0) . As proteínas eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris-HCl a 1 M pH 9,0 (100 μΐ por ml de frações eluídas). As frações eluídas agrupadas foram dialisadas contra PBS. As proteínas de anticorpo agregadas foram removidas por cromatografia de exclusão de tamanho. Purificação de proteína de Espaçador-ADAMTS-5-GST recombinante.

Bactérias induzidas e expressando Sp_ADAMTS-5-GST descongeladas foram ressuspendidas em 20 ml de tampão de lise (PBS, DNase a 10 pg/ml, Lisozima a 20 pg/ml) . Os sedimentos ressuspendidos foram incubados durante 45 minutos a 4 2C sem agitação. Depois da incubação, as bactérias lisadas foram sonicadas em gelo por 3 vezes (15 segundos cada) . Depois de 10 minutos de centrifugação a 600 RPM a 4 2C, o sobrenadante foi recolhido, filtrado com um filtro de 0,2 micrómetros e processado para purificação. Uma coluna GST Trap (GE) foi conectada com um Purificador AKTA (GE) e lavada com 5 CV de água a um fluxo de 5 ml/min. Posteriormente, a coluna foi lavada com 5 CV de PBS a um fluxo de 5 ml/min. A coluna foi depois conectada a uma bomba peristáltica e carregada a um fluxo de 1 ml/min com sobrenadante filtrado. Depois da lavagem com 5 CV de PBS a um fluxo de 5 ml/min, a coluna foi reconectada ao purificador AKTA e lavada novamente com 2 CV de PBS a um fluxo de 5 ml/min. A proteína foi eluída em tampão de eluição a 100 % (PBS, glutationa a 10 mM) . Frações do pico foram recolhidas em tubos eppendorf de 2 ml. Um agrupamento de 3 frações centrais principais diluído em PBS foi concentrado utilizando Amicon Ultra 15 de acordo com as especificações do fabricante. A proteína concentrada foi quantificada com um Protein 80 BioAnalyser (Agilent) . As alíquotas foram armazenadas a -80 2C. Expressão e redobragem de scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 no citoplasma de E. coli.

Fragmentos de scFv anti-Sp_ADAMTS-5 (SEQ ID 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 135, 136, 137) foram subclonados em sítios de restrição Ncol/Notl do vetor de expressão bacteriano pETM-13. E coli BL21DE3 albergando o plasmídeo de expressão foram cultivadas em 500 ml de meio 2YT/Kan até à fase exponencial intermédia (D0600 = 0,75) e depois induzidas com IPTG (1,5 mM) durante 5-6 horas adicionais a 37 2C com agitação (180 rpm). As células foram recolhidas a 6000 rpm (Beckman) e os sedimentos foram utilizados para preparação de corpos de inclusão (IB) . Um método de expressão a grande escala como corpos de inclusão de E. coli foi otimizado, utilizando redobragem in vitro (Patil et al., 2008. J Biotechnol. 134:218-221. Epub 2008 Jan 2018); (Umetsu et al., 2003. JBiol Chem. 27 8:8 97 9-8 987. Epub 2003 Jan 8977). O sedimento foi ressupendido a 5 ml g-1 com tampão IBR (Tris/HCl a 50 mM, EDTA a 0,5 mM, lisozima a 20 pg/ml, DNase a 10 pg/ml a pH 8) e colocado numa placa de agitação durante 1 h à TA. A amostra foi sonicada durante 45 segundos em gelo durante três pulsos, seguida por 1 min de incubação em gelo. O lisado foi depois centrifugado durante 10 min a 4 2C a 6.000 rpm. O sedimento foi ressuspendido em 20 ml de tampão de lavagem 1 (Tris a 10 mM pH 8, EDTA a 1 mM, Triton-X100 a 1 %, submetido a vórtice e, posteriormente, os corpos de inclusão foram sedimentados por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 min a 4 2C. O sedimento foi lavado com 20 ml de tampão de lavagem 2 (Tris a 10 mM pH 8, EDTA a 1 mM, NaCl a 1 M), submetido a vórtice e, posteriormente, centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min a 4 2C. Finalmente o sedimento foi lavado com 20 ml de tampão de lavagem 3 (Tris a 10 mM pH 8, EDTA a 1 mM), submetido a vórtice e centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min a 4 2C. A preparação de IB foi solubilizada a 5 ml g F v guanidina HC1 a 6 M; EDTA a 1 mM; DTT a 100 mM a pH 8). As proteínas solubilizadas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente sob agitação vigorosa. Depois de diminuição do pH da solução proteica a pH 4 com HC1 a 1 Μ, o material insolúvel foi removido por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 min. De modo a remover o DTT a partir do soluto, foi realizada uma diálise tripla contra tampão IBD (guanidina HC1 a 6 M a pH 4) . As proteínas solubilizadas e quantificadas foram diluídas a 35 mg/1, o mais rápido possível, em tampão REF frio (Tris/HCl a 100 mM; arginina a 0,5 M, 1-glutationa oxidada a 375 μΜ; EDTA a 5 mM a pH 8,5) . A solução proteica foi dispensada cada 50 minutos com uma pipeta diretamente no tampão REF enquanto se submetia a vórtice. Depois de 16 horas desde a última adição, a amostra foi primeiramente concentrada e o guanidínio restante foi removido por diálise em tampão IEXA (de acordo com o pi de scFv e, assim, com o protocolo de permuta iónica subsequentemente empregue). Os scFvs redobrados foram purificados por uma cromatografia de permuta iónica e armazenados em alíquotas a -80 2C. ELISA de especificidade: scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 frente a Sp_ADAMTS 5-GST.

Uma imunoplaca Nunc Maxi-Sorp foi revestida com 100 ml de Sp_ADAMTS-5-GST e GST a 10 pg/ml em tampão de revestimento (Na2C03 a 100 mM pH 9,6). A placa foi incubada durante a noite a 4 2C. No dia seguinte, os antigénios não ligados foram descartados e a placa foi lavada 3x com PBS. A ligação não específica foi bloqueada pela adição de 200 ml de MPBS a 3 % (leite desnatado a 3 % em PBS). A placa foi incubada durante 1 h à TA. A placa foi lavada com 3xTPBS (Tween20 0,1 % em PBS) e 3xPBS. 100 μΐ de diluição seriada de scFv anti-Sp_ADAMTS-5 (0,5-50 pg/ml) em MPBS a 3 % foram adicionados a poços apropriados. A placa foi depois incubada durante 2 h à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, 100 μΐ de anticorpo anti-V5 (Invitrogen) diluídos a 1:5000 em MPBS a 3 % foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 1 h e 30 min à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, 100 μΐ de anticorpo anti-ratinho com HRP (DAKO) diluídos a 1:2000 em MPBS a 3 % foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 1 h à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, foram adicionados 80 μΐ de TMB (Sigma). A placa foi incubada numa câmara escura até que as amostras atingiram o sinal desejado. 80 μΐ de solução de paragem (H2S04 a 500 mM) foram adicionados a cada poço antes da leitura. Os dados foram recolhidos medindo a DO(450 nm) por um Detetor de Luminescência LD 400 (Beckman Coulter). ELISA de tipo sanduíche: mAb anti-Sp_ADAMTS-5 frente a Sp_ADAMTS—5—GST.

Uma imunoplaca Nunc Maxi-Sorp foi revestida com uma diluição seriada de 100 ml de imunoglobulina anti-Sp_ADAMTS-5 em tampão de revestimento (Na2C03 a 100 mM pH 9,6). A placa foi incubada durante a noite a 4 2C. No dia seguinte, os anticorpos não ligados foram descartados e a placa foi lavada 3x com PBS. A ligação não específica foi bloqueada pela adição de 200 μΐ de MPBS a 3 % (leite desnatado a 3 % em PBS) . A placa foi incubada durante 1 h à TA. A placa foi lavada com 3xTPBS (Tween20 0,1 % em PBS) e 3xPBS . 100 μΐ de Sp_ADAMTS-5-GST e GST (30 pg/ml) em MPBS a 3 % foram adicionados a poços apropriados. A placa foi depois incubada durante 2 h à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, 100 μΐ de anticorpo anti-GST (Sigma) diluídos a 1:1000 em MPBS a 3 % foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 1 h e 30 min à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, 100 μΐ de anticorpo anti-coelho com HRP (DAKO) diluídos a 1:2000 em MPBS a 3 % foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 1 h à TA. Depois da lavagem com 3xTPBS e 3xPBS, foram adicionados 80 μΐ de TMB (Sigma Aldrich) . A placa foi incubada numa câmara escura até que as amostras atingiram o sinal desejado. 80 μΐ de solução de paragem (H2S04 a 500 mM) foram adicionados a cada poço antes da leitura. Os dados foram recolhidos medindo a DO (450 nm) por um Detetor de Luminescência LD 400 (Beckman Coulter).

Avaliação das constantes de afinidade e cinéticas de scFv e/ou mAb anti-Sp_ADAMTS-5 por medidas de Ressonância de Plasmón de Superfície.

Cinéticas de ligação da ligação de Sp_ADAMTS-5-GST a anticorpo (scFv ou IgG) anti-Sp_ADAMTS-5-GST imobilizado por acoplamento de amina numa matriz de carboximetildextrano de um chip CM5. Foram utilizados procedimentos de imobilização padrão (Schuck, 1997. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26:541-566). 20-50 pg/ml de scFv ou IgG foram dissolvidos em tampão de acetato (tampão de pré-concentração adequado a pelo menos 2 unidades de pH abaixo do pi da imunoglobulina de modo a obter uma carga global positiva). O nível de imobilização de 5000 RU para a imunoglobulina e 1000 RU para scFv foi definido para se obter uma imobilização de baixa densidade do ligando. Foi utilizada uma condição de regeneração ligeira do chio (tempo de contacto de 30 segundos a glicina a 10 mM pH 2). Sp_ADAMTS-5-GST foi diluído em tampão de corrida PBS+0,005 % Tween20 a 5 diluições seriadas (iniciando-se no intervalo micromolar e diluindo-se a 1:2) e aplicado a uma taxa de fluxo de 30 μΐ/min. Uma Etapa de condição da amostra foi inicialmente definida com um tempo de contacto de 60 segundos e um tempo de dissociação de 400 segundos. Com base nos sensorgramas resultantes, na etapa de cinética/afinidade, as concentrações de analito, tempo de contacto, tempo de dissociação e solução de regeneração foram ajustados.

Os dados foram analisados por software de Bioavaliação: a qualidade do ajuste dos dados pode ser verificada pelo valor de Chi2 e do valor de U.

Clonagem e expressão das formas de comprimento completo de ADAMTS-4 e ADAMTS-5 3xFLAG. ADNc que codificam as sequências de ADAMTS-5 humana (SEQ ID NO: 133) e ADAMTS-4 humana (SEQ. ID NO: 134) foram amplificados para introduzir o sítio de restrição para Κρη I (terminal 5' ) e para Xho I (terminal 3' ) e para remover a região que codifica o propéptido. Depois da digestão com Kpnl e Xhol, os insertos foram subclonados no vetor pSecTag2A (Invitrogen) . ADAMTS-5 3XFLAG/pSecTag2A e ADAMTS-5 3XFLAG/pSecTag2A foram tranfetados na linha celular Freestyle™ 293-F. As células foram adaptadas para cultura de suspensão em Meio de Expressão Freestyle™ 293. Um agente anti-aglomeração (Invitrogen) foi adicionado ao meio, antes ou depois da transfeção. As células foram transfetadas com um complexo de reagente Freestyle™ MAX em SFM OptiMEM™ livre de origem animal. As células transfetadas foram incubadas a 37 2C, 8 % de CO2 numa plataforma de agitação definida a 75 rpm. Heparina a 100 pg/ml foi adicionada à cultura 24 horas após a transfeção. As expressões de ADAMTS-5 3XFLAG e ADAMTS- 4 3XFLAG atingiram uma atividade proteica significativa 48-72 horas após a transfeção. Após 2-3 dias, os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 2C até à purificação.

Purificação de proteínas ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG de comprimento completo. 300 ml de sobrenadantes de ADAMTS-5 3XFLAG/ADAMTS-4 3XFLAG foram carregados em 1 m de Gel de afinidade anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) . As amostras foram aplicadas a uma taxa de fluxo de 1 ml/min com pressão de 0,5 MPa e as colunas foram lavadas com 10 volumes de Tris-HCl a 50 mM (pH 7,4), CaCl2 a 10 mM, ZnCl a 10 μΜ, Bril-35 a 0,02 % contendo NaCl a 1 M de modo a remover a heparina ligada à enzima. A eluição das proteínas de fusão FLAG foi alcançada por competição com 200 pg/ml de péptido 3XFLAG (Sigma-Aldrich) em tampão de reação de agrecanase (Tris-HCl a 50 mM (pH 7,4), NaCl a 150 mM, CaCl2 a 10 mM, ZnCl a 10 μΜ, Brij-35 a 0,02 %). Foi mantida uma taxa de fluxo de 1 ml/min ao longo de todo o procedimento de purificação e foram recolhidas frações de 1,0 ml. As frações contendo as proteínas eluídas foram agrupadas e concentradas 5X utilizando um concentrador Vivaspin (Sartorius) (limite de 30 kD) .

Análise de Western blot de proteínas purificadas ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG.

Amostras purificadas de ADAMTS-5 3X FLAG e ADAMTS-5 3X FLAG, foram ressuspendidas em Tampão de amostra (Invitrogen), aquecidas durante 10 min e carregadas sobre um sistema de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (Invitrogen, NuPage System) e depois submetidas a Western blotting. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de PVDF (GE Healthcare). As membranas foram bloqueadas 30' com solução Starting Block (Pierce) e incubadas 1 h com anticorpo monoclonal primário anti 3XFLAG (Sigma) 1:1000 à TA. Depois da incubação à TA (1 h) com anticorpo anti-ratinho secundário acoplado com peroxidase (AbCam), diluído a 1:10.000, as bandas proteicas foram detetadas utilizando Super Signal Dura West (Pierce). As imagens foram adquiridas com uma câmara CCD utilizando um sistema de obtenção de imagens Las3000 (Fuji) (veja-se a figura 2 para o Western blot de ADAMTS-5). Análise da atividade enzimática.

As enzimas de comprimento completo purificadas ADAMTS-4 3X FLAG e ADAMTS-5 3X FLAG foram testadas quanto à atividade através de um ensaio enzimático. Agrecano purificado a partir de cartilagem nasal bovina aprisionado em poliacrilamida (Nagase e Woessner, 1980. Anal. Biochem. 107:385-392) foi utilizado como um substrato para determinar a atividade de degradação de agrecano.

Amostras de partículas de agrecano/poliacrilamida (5, 0 ± 0,2 mg peso seco) foram colocadas em tubos de 1,5 ml com 400 μΐ de TNC (Tris-HCl a 0,1 M, NaCl a 0,1 M, CaCl2 a 10 mM, CHAPS a 0,1 %, pH 7,5) e 100 μΐ de preparações de ADAMTS-4 (p68, FL) e ADAMTS-5 (p7 5, FL) recombinantes, expressas em células FreeStyle-293 transfetadas de forma transiente e incubadas a 37 2C durante 6 ou 24 h. As reações foram interrompidas com 500 μΐ de solução de paragem (Tris a 50 mM, acetato de sódio a 200 mM, EDTA a 100 mM; pH=6,8) e as partículas foram separadas a partir da fase líquida por centrifugação (10000 rpm, 4 min, 4 °C) . A quantidade de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) no sobrenadante foi determinada por um ensaio colorimétrico (azul de 1,9-dimetilmetileno, DMB). A curva padrão (Sulfato de condroitina extraído a partir de traqueia bovina) e amostras foram diluídas em PBS-BSA a 1 %. Depois de uma reação de 5-20 min, as amostras foram lidas a 590 nm. A concentração de GAGs de cada amostra foi calculada a partir de medições de absorvância (branco subtraído) e comparadas com a curva padrão de referência.

Explante e cultura de cartilagem.

Discos de cartilagem nasal bovina foram obtidos a partir do septo nasal de bovinos machos de oito meses de idade. De forma breve, amostras de punção de 2 mm de diâmetro foram obtidas a partir da cartilagem nasal. As amostras de punção foram primeiramente lavadas três vezes com tampão PBS-AASS (1XPBS, penicilina G a 100 U/ml, estreptomicina a 100 pg/ml e anfotericina B a 2,5 pg/ml). As amostras de punção foram subsequentemente incubadas a 37 2C numa atmosfera de 5 % de C02, em poços de microplaca contendo DMEM a 10 %, penicilina G a 100 U/ml, estreptomicina a 100 pg/ml e anfotericina B a 2,5 pg/ml (meio DMEM-AASS) . Depois de três horas as amostras foram lavadas com tampão PBS-AASS e incubadas com meio DMEM-AASS. 48 h depois da preparação das células de cartilagem, as amostras foram tratadas com IL-Ια a 5 ng/ml mais uma concentração diferente do inibidor (ou seja, CRB0017_IgG4 e TIMP-3) e incubadas em DMEM, BSA a 0,1 % + AASS durante 48 horas. Depois dos tratamentos, os sobrenadantes e pequenas peças de cartilagem foram recolhidos e utilizados para a análise de GAG (a medição da libertação de GAG é a quantificação de gl icosaminoglicanos - GAGs - sob a forma de fragmentos de agrecano libertados a partir da cartilagem em cultura). As amostras de punção das cartilagens foram primeiro incubadas com papaína a 500 pg/ml a 65 °C durante 2 h para a medição da percentagem de GAG total restante no tecido. A determinação dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) é feita por um ensaio colorimétrico com azul de 1, 9-dimetilmetileno (DMB) . A curva padrão (Sulfato de condroitina extraída a partir de traqueia bovina), amostras de meio e amostras de cartilagem digerida foram diluídas em PBS-BSA a 1 %. Depois de 5-20 min de reação, as amostras foram lidas a 590 nm.

Imunoprecipitação de proteínas de comprimento completo ADAMTS-5 e ADAMTS-4 3xFLAG. A imunoprecipitação foi realizada utilizando um kit de Imunoprecipitação de Proteína G (SIGMA). Para reduzir a interferência de fundo causada por adsorção não específica de proteínas celulares irrelevantes à Proteína G Agarose, foi realizada etapa de pré-clarificação. 50 μΐ da suspensão de Proteína G Agarose foram adicionados à amostra (proteínas purificadas ADAMTS-5 ou ADAMTS-4) num tubo de microcentrífuga e incubadas durante 2 horas a 4 SC com agitação. As esferas foram sedimentadas por centrifugação a 12.000 g durante 30 segundos numa microcentrífuga e o sobrenadante recolhido (amostra pré-clarifiçada) foi transferido para um tubo novo. Esta amostra foi utilizada para imunoprecipitação. Anti-Sp_ADAMTS-5 foi adicionado à amostra e o volume foi ajustado para 600 μΐ em tampão IP. Esta amostra foi adicionada a uma coluna de rotação tapada e incubada durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, 50 μΐ de esferas de Proteína G Agarose lavadas foram adicionadas à coluna. Depois de 2 h de incubação com agitação a 4 2C, a ponta da coluna de rotação foi quebrada e a coluna foi colocada num tubo Eppendorf de 2 ml. O tubo foi submetido a rotação a 12.000x g durante 30 segundos a 4 2C. As esferas na coluna de rotação foram ressuspendidas em 700 μΐ de lx de tampão IP e, em seguida, a coluna foi centrifugada a 12.000x g durante 30 segundos a 4 2C. Esta etapa de lavagem foi repetida 3 vezes. A última lavagem foi realizada com 0,lx de tampão IP. As esferas foram ressuspendidas com 50 μΐ de lx de tampão de amostra Laemmli quente. Depois de 10 minutos de incubação a 95 2C, as proteínas foram eluídas por centrifugação a 13.000x g durante 1 minuto. A amostra foi carregada sobre gel de SDS-PAGE para análise de Western blot.

Avaliação do efeito de mAbs anti-ADAMTS-5 no modelo de ratinho STR/ort de osteoartrite.

Ratinhos machos STR/ort (Mason et al., 2001. Osteoarthritis Cartilage. 9:85-91) foram recrutados aos 5 meses de idade (n=20-22), randomizados para tratamento em cada gaiola, com 4 animais por gaiola, pesados e tratados por via intra-articular em cada joelho com 1,2 μg de IgG4 anti-ADAMTS-5, 12 pg de IgG4 anti-ADAMTS-5, ou veículo. Depois de 6 semanas, a administração intra-articular de IgG4 anti-ADAMTS-5 foi repetida com as mesmas doses. Depois de 3 meses desde o recrutamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os membros posteriores foram explantados e fixados em formalina o/n. Os membros posteriores foram incorporados em parafina, foram produzidas secções de 5 micrómetros de espessura e coradas com azul de toluidina e posteriormente classificadas de uma forma cega de acordo com os métodos de Mankin (Mankin et al., 1971. J Bone Joint Surg Am. 53:523-537) e OARSI (Pritzker et al., 2006. Osteoarthritis Cartilage. 14:13-29). Este método produz uma pontuação de OA com um intervalo de 0-24 com base no grau mais avançado (6) e o estádio mais estendido (4) . A análise estatística foi realizada com o teste t de Student comparando veículo vs. basal, e com ANOVA seguida pelos testes de Dunn ou Dunnett comparando todos os grupos de tratamento vs. veiculo.

RESULTADOS

Seleção de anticorpos específicos anti-domínio espaçador utilizando a tecnologia SPLINT.

Para selecionar anticorpos específicos anti-domínio espaçador de ADAMTS-5 por tecnologia SPLINT, o domínio espaçador de ADAMTS-5 (aa 732 ao aa 874 da SEQ ID NO 2) foi clonado no terminal 3' de LexA (LexA-Sp_ADAMTS-5; SEQ ID NO: 93) e utilizado para desafio de uma biblioteca SPLINT de ratinho (mSPLINT) e duas SPLINT humanas diferentes (huSPLINT_09 and huSPLINT_10) (Visintin et al., 2004. J Immunol Methods. 290:135-153). A partir do procedimento de seleção, foram obtidas 325 colónias capazes de crescer na ausência de histidina e apresentando ativação da β-Galactosidase. Os plasmídeos scFv-VP16 foram isolados e classificados pelas suas sequências e padrões de restrição. As especificidades dos scFvs com diferentes impressões digitais de ADN foram analisados novamente utilizando estirpes de leveduras que expressam

LexA-Sp_ADAMT S-5 e LexA-lamina, como antigénios não relevantes. 11 scFvs anti-dominio espaçador diferentes foram assim identificados. A análise das sequências de nucleótidos da região V dos scFvs anti-espaçador selecionados revelou que eram derivadas a partir de genes de região V de linha germinal (Quadro IV) com muito poucas mutações somáticas (dados não mostrados).

Quadro IV: Análise das sequências de nucleótidos de região V do scFv anti-Espaçador selecionado

As sequências de aminoácidos das regiões V dos scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 isolados estão no grupo de sequências que consistem na SEQ ID NO: 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8; 9 e 10; 11 e 12; 13 e 14; 15 e 16; 17 e 18; 19 e 20; 21 e 22; 23 e 24. Expressão e redobragem de scFv anti-Espaçador no citoplasma de E. coli.

Para identificar ligantes in vivo anti-espaçador, ADNc expressando scFv anti-Sp_ADAMTS-5 foram clonados no vetor de expressão E.coli pET41b. As proteínas foram bem expressas no citoplasma e foram maioritariamente retidas em corpos de inclusão (IB). Os fragmentos scFv podem ser redobrados por diálise depois da solubilização dos IB (Umetsu et al.r 2003. J Biol Chem. 278:8 97 9-8 987. Epub Jan de 2003 8977) . Os autores realizaram a técnica de redobragem por diluição (Patil et al.r 2008. J Biotechnol. 134:218-221. Epub Jan de 2008 2018). A condição de redobragem de scFv foi otimizada para cada amostra. scFv redobrados foram subsequentemente quantificados por um Bioanalyzer 2100 (Agilent) e testados por ELISA e análise Biacore.

Especificidade de ligação de anti-ADAMTS-5 a ADAMTS-5 humano.

Para compreender a especificidade do painel de scFvs anti-Sp_ADAMTS-5 isolados a partir de bibliotecas SPLINT, foi demonstrada a imunoreatividade para Espaçador-GST (SEQ ID NO: 94) e ADAMTS-5 FL destes anticorpos. Todos os scFvs anti-Espaçador isolados foram reativos com a proteína de fusão GST da forma truncada de ADAMTS-5 no ensaio de ELISA. Contudo, os scFvs CRB0017, CRB0018 e CRB0093 foram altamente específicos e foi observada apenas uma ligação fraca à proteína GST utilizada como controlo negativo (Fig. 3). A imunoglobulina CRB0017_IgG4 quimérica reformatada apresenta o mesmo padrão de imunorreatividade no ensaio de ELISA de uma forma dependente da dose (Fig. 4). Resultados semelhantes foram obtidos com os anticorpos monoclonais CRB0102 e CRB0123 (dados não mostrados). Além disso, a CRB0017_IgG4 anti-Sp_ADAMTS-5 quimérica (compreendendo regiões variáveis de ratinho) foi capaz de imunoprecipitar a proteína ADAMTS-5 FL recombinante bem como ADAMTS- 4 FL humana recombinante (Fig. 6 e 7) . Adicionalmente, os autores levaram a cabo análises de ressonância de plasmón de superfície (SPR) para determinar as cinéticas de ligação de CRB0017_IgG4. 0 anticorpo monoclonal quimérico (mAb) foi imobilizado num chip CM5 seguido por injeções a várias concentrações de Sp_ADAMTS-5-GST ou utilizado como ligando em combinação com um chip sensor imobilizado com Sp_ADAMTS-5-GST. Utilizando um modelo de ligação bivalente, os autores determinaram constantes de ligação de estado constante (KD2). Quando utilizado como ligante, os autores mediram as forças de ligação por SPR em torno a subnanomolar-7 nM de KD2 (dados não mostrados) . CRB0017_IgG4 também apresentou uma forte afinidade (KDi de ~2 nM) quando imobilizado no chip sensor (Fig. 5) que se correlacionou melhor com os valores de ligação conforme determinado por ELISA específica de antigénio (Fig. 4). Medição da atividade neutralizante anti-ADAMTS-5.

Os autores também avaliaram a inibição da degradação de agrecano induzida por IL-Ια no tecido de cartilagem bovina. 48 h depois dos tratamentos, a proporção de GAG total restante no tecido foi medida. Esta análise revelou que CRB0017_IgG4 inibiu a libertação de GAG (50 % de inibição) a partir do tecido a uma concentração de 20 nM (Fig. 8) . Nesta experiência, o anticorpo de controlo (nhIG4) não foi capaz de interferir com a enzima na mesma concentração. Além disso, o inibidor natural TIMP-3 não demonstrou inibir marcadamente o processo de conversão e libertação mediado por IL-Ια quando testado na concentração de 20 nM (dados não mostrados). O composto químico Cpd23, um inibidor à base de hidroxamato 3,3-dimetil-5-hidroxipipecólico da agrecanase e MMP-13 (utilizado na concentração de 1 μΜ, Noe et al., 2005. Bioorg

Med Chem Lett. 15:2808-2811), foi utilizado como controlo positivo, porque exibe um melhor efeito inibidor em relação ao inibidor natural TIMP-3 neste ensaio.

Avaliação do efeito de CRB0016_IgG4 no modelo de ratinho STR/ort de osteoartrite.

Proteína de ligação a HéliceB-ADAMTS-5, CRB0016_IgG4, foi administrada por via intra-articular em ambos os joelhos de cada animal, uma vez no início da experiência e novamente depois de 6 semanas, nas doses de 1,2 e 12 pg/joelho.

Depois de três meses, os autores observaram que os joelhos dos animais tratados com veículo apresentavam uma OA grave com fissuras e erosão da cartilagem articular até ao osso subcondral, com metaplasias condro-ósseas proeminentes e, frequentemente, inflamação e pannus. Nenhumas outras alterações significativas em qualquer dos parâmetros examinados estiveram associadas com a administração de CRB0016_IgG4 em qualquer dose. 0 procedimento de classificação a cegas das amostras histológicas não mostrou um efeito do composto sobre a diminuição do dano sobre a cartilagem. Tomados conjuntamente, estes dados mostram que a administração intra-articular nos joelhos da proteína de ligação a HéliceB-ADAMTS-5, CRBO016_IgG4, duas vezes em três meses não poderia reduzir a gravidade da patologia osteoartrítica nos ratinhos STR/ort. Avaliação do efeito de CRB0017_IgG4 no modelo de ratinho STR/ort de osteoartrite. CRB0017_IgG4 foi administrada por via intra-articular em ambos os joelhos de cada animal, uma vez no início da experiência e novamente depois de 6 semanas, nas doses de 1,2 e 12 pg/joelho. Depois de três meses, os autores observaram que os joelhos dos animais tratados com veículo apresentavam uma OA grave com fissuras e erosão da cartilagem articular até ao osso subcondral, com metaplasias condro-ósseas proeminentes e, frequentemente, inflamação e pannus. A pontuação de Mankin de OA foi significativamente diminuída no grupo de 12 pg de CRB0017_lgG4 em comparação com o veículo. 0 grau x estádio de OA tem em conta não só a profundidade do dano (grau) , mas também a sua extensão na superfície articular (estádio). 0 grau x estádio de OA foi significativamente inferior no grupo de 12 pg de CRB0017_IgG4 em comparação com o veículo. A administração de 1,2 pg de CRB0017_IgG4 esteve associada com uma tendência de uma diminuição com ambos os métodos de pontuação. Em conclusão, os autores observaram que CRB0017_IgG4 pode modificar o curso da OA na estirpe de ratinhos STR/ort, atrasando a degradação da cartilagem como avaliado histologicamente. 0 procedimento de classificação a cegas das amostras histológicas mostrou claramente um efeito do composto dependente da dose na diminuição do dano sobre a cartilagem.

Tomados em conjunto, estes dados mostram que a administração intra-articular de CRB0017_IgG4 duas vezes em três meses de forma dependente da dose reduziu a gravidade da patologia osteoartritica nos ratinhos STR/ort.

Algumas enzimas proteolíticas, em adição aos seus domínios catalíticos, também têm domínios acessórios não catalíticos que são moduladores importantes da interação entre a enzima e substrato ou inibidores.

Os membros da família de ADAMTS de enzimas degradam os proteoglicanos e, portanto, têm o potencial de alterar a arquitetura tecidual e regular a função celular.

Em particular, ADAMTS-4 e ADAMTS-5 podem clivar o agrecano em vários sítios, libertando as regiões portadoras de condroitina e sulfato de queratano da molécula a partir do tecido. Isto demonstrou ser uma etapa precoce e crucial no desenvolvimento da osteoartrite.

Estas enzimas também podem ser proteolisadas em isoformas mais pequenas, que têm uma atividade proteolítica alterada.

Infelizmente, a arquitetura de domínio 3D das agrecanases de comprimento completo não é conhecida, pois é muito difícil obter as estruturas de raios-X destas enzimas, devido à complexidade para produzir e purificar estas proteínas.

Até à data, apenas estão disponíveis os domínios catalítico e de desintegrina de ADAMTS1, ADAMTS-4 e ADAMTS-5 e, portanto, é impossível extrapolar as disposições e orientação destes domínios em relação ao domínio catalítico. As estruturas cristalinas dos domínios catalítico e de desintegrina de ADAMTS-4 e ADAMTS-5 determinadas por Mosyak (Mosyak et al., 2008. Protein Sei. 17:16-21) indicaram que as enzimas apresentam uma forma "aberta" quando estão ligadas ao inibidor e uma forma "fechada" quando são autoinibidas e não estão em ligação. Nesta base, o autor propôs que a agrecanase madura existe como uma mistura de dois isómeros, que podem coexistir em equilíbrio. Nesta "montagem" apenas uma destas formas é proteoliticamente ativa. Além disso, foi demonstrado que ambas as formas de comprimento completo de ADAMTS-5 e ADAMTS-4 são altamente ativas contra o seu substrato natural, o agrecano, e a eliminação dos domínios não catalíticos C-terminais das enzimas reduz grandemente a sua atividade (Kashiwagi et al., 2004. J Biol Chem. 279:10109-10119); (Gendron et al. , 2007. J Biol Chem. 282:18294-18306); (Fushimi et al., 2008. J Biol Chem. 283:6706-6716) . Isto sugere que os domínios por si próprios ou na forma de ligação a proteína podem perturbar o equilíbrio para a forma mais aberta. A invenção proporciona a evidência de que um anticorpo direcionado contra um domínio não catalítico acessório, tal como o domínio espaçador de ADAMTS-5, poderia inibir fortemente a atividade enzimática desta proteína. Os resultados obtidos com o domínio anti-espaçador CRB0017_IgG4 esclarecem o conceito de que a inibição da agracanase2 dentro do domínio espaçador é mais proficiente do que a inibição da enzima dentro do domínio catalítico. De forma notável, foi demonstrado que, enquanto CRB0017_IgG4 é capaz de inibir fortemente in vitro e in vivo o efeito proteolítico de ADAMTS-5, um anticorpo anti-catalítico, como CRB0016_IgG4, não é capaz de produzir um efeito semelhante.

Os excelentes resultados obtidos com o anticorpo

CRB0017_IgG4 não são obtidos por acaso, mas devem-se ao bloqueio do domínio espaçador de ADAMTS-5. Através da ligação do sítio ativo de ADAMTS-5, os anticorpos da invenção desencadeiam a enzima a assumir uma forma "fechada" inibindo assim a enzima diretamente ou favorecem a interação da enzima com o seu inibidor natural TIMP-3, como a hipótese formulada por Troeberg (Troeberg et al., 2009. Matrix Biol. 28:463-469) . LISTA SEQUÊNCIAS <110> Rottapharm Biotech S.r.l. VISINTIN, Michela CASELLI, Gianfranco CHIUSAROLI, Riccardo ROVATI, Lucio Claudio

<120> ANTICORPO ANTI-ADAMTS-5, DERIVADOS E UTILIZAÇÕES DOS

MESMOS <130> BE 115522 <160> 216 <170> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 837

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Mat Sar Sin Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg trp IS 10 15

Leu Trp Gly Ala Gin Pro Cys Leu Leu Leu Pro lie Val Pro Leu Ser 20 25 30

Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser 35 40 45

Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu lie Val Phe Pro 50 55 60

Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg 65 70 75 80

Leu Leu Cys Arg Leu Gin Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu 85 90 95

Glu Gin Asp Ser Gly Val Gin Val Glu Gly Leu Thr Val Gin Tyr Leu 100 105 110

Gly Gin Ala Pro Glu Leu Leu Gly Sly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu 115 120 125

Thr Gly Thr lie Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp 130 135 140

Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gin Tyr Arg Gly Ala Glu Leu 145 150 155 160

His Leu Gin Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro 165 170 175

Gly Ala His lie teu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gin Gly Pro ISO 185 190

Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg 195 200 205

Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val 210 215 220

Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg 225 230 235 240

Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro 245 250 255

Ser lie Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val lie Leu 260 265 270

Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gin Val Gly Pro Ser Ala Ala Gin Thr 275 280 285

Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gin Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp 290 295 300

Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala lie Leu Phe Thr Arg Gin Asp 305 310 315 320

Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly 325 330 335

Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala He Val Glu Asp Asp Gly 340 345 350

Leu Gin Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn 355 360 365

Met Leu His A3p Asn Ser Lys Pro Cys lie Ser Leu Asn Gly Pro Leu 370 375 380

Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro 385 390 395 400

Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe He Thr Asp Phe Leu 405 410 415

Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu 420 425 430

His Leu Fro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gin 435 440 445

Cys Gin Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gin Leu Pro 450 455 460

Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala 465 470 475 480

Met Cys Gin Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly 485 490 495

Pro Ala Gin Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gin Leu 500 505 510

Gin Asp Phe Asn lie Pro Gin Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro 515 520 525

Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gin Phe Ser Ser 530 535 540

Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu 545 550 555 560

Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr 565 570 575

Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gin Cys Ala Ala Tyr Asn His 580 585 590

Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro 595 600 605

Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gin Asp Gin Cys Lys Leu Thr Cys Gin 610 €15 620

Ala Gin Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp 625 630 635 640

Gly Thr Pro Cys Ser Pro Aap Ser Ser Ser Val Cys Val Gin Gly Arg 645 650 655

Cys lie His Ala Gly Cys Asp Arg lie lie Gly Ser Lys Lys Lys Phe 660 665 670

Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gin 675 680 685

Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asn Vai Vai Thr 690 695 700

He Pro Ala Gly Ala Thr Ris lie Leu Vai Arg Gin Gin Gly Asn Pro 705 710 715 720

Gly His Arg Ser He Tyr Leu Ala Leu Lye Leu Pro Asp Gly Ser Tyr 725 730 735

Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Vai vai 740 745 750

Leu Pro Gly Ala Vai Ser Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser 755 760 765

Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro Leu Ala Gin Pro Leu Thr Leu Gin 770 775 780

Vai Leu Vai Ala Gly Asn Pro Gin Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe 785 790 795 800

Phe Vai Pro Arg Pro Thr Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gin Asp 805 810 815

Trp Leu His Arg Arg Ala Gin lie Leu Glu lie Leu Arg Arg Arg Pro 820 825 830

Trp Ala Gly Arg Lys 835

<210> 2 <211> 930 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro 15 10 15

Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gin Asp Lys Ala Gly 20 25 30

Gin Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gin Pro Arg Arg Arg Gin Gly 35 40 45

Glu Glu Val Gin Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu 50 55 60

Ala Gin Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gin Asn lie Asp Gin Leu 65 70 75 80

Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg 85 90 95

Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly lie Ala Gly 100 105 110

Phe Val Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Arg His Arg Ser 115 120 125

His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala 130 135 140

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Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Glu 165 170 175

Glu Lys Gly Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ala Arg lie Leu His Val 180 185 190

Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser 195 200 205

Cys Glu Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Ala His Glu His Ala Fro Ala 210 215 220

His Ser Asn Pro Ser Gly Arg Ala Ala Leu Ala Ser Gin Leu Leu Asp 225 230 235 240

Gin Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gin Thr Trp Trp 245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser lie Ser Arg Ala Arg Gin Val Glu Leu Leu 260 265 270

Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Gin 275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser lie Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His 290 295 300

Ala Ser lie Glu Asn His lie Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val 305 310 315 320

Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr 325 330 335

Thr Leu Lys Agn Phe Cys Lys Trp Gin His Gin His Asn Gin Leu Gly 340 345 350

Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala lie Leu Phe Thr Arg Glu 355 360 365

Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val 370 375 380

Gly Thr lie Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val lie Glu Asp Asp 385 390 395 400

Gly Leu Kis Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu He Gly His Leu Leu 405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Thr Phe Gly Ser 420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser lie Leu Thr Ser He Asp Ala 435 440 445

Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr He Thr Glu Phe Leu 450 455 460

Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro Arg Lys Gin lie 465 470 475 480

Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gin Thr Tyr Asp Ala Thr Gin Gin 485 490 495

Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp 500 505 510

Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gin Gly Gin Met Val 515 520 525

Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys 530 535 540

Gly Arg lie Cys Leu Gin Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lye Lys 545 550 555 560

Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Ser Trp 565 570 575

Gly Gin Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gin Phe Ala Tyr Arg 580 585 590

His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Asn Gly Arg Tyr Cys Thr Gly 595 600 605

Lys Arg Ala lie Tyr Arg Ser Cys Ser Leu Met Pro Cys Pro Pro Asn 610 615 620

Gly Lys Ser Phe Arg His Glu Gin Cys Glu Ala Lys Asn Gly Tyr Gin 625 630 635 640

Ser Asp Ala Lys Gly Val Lys Thr Phe Val Glu Trp Val Pro Lys Tyr 645 650 655

Ala Gly Val Leu Pro Ala Asp Val Cys Lys Leu Thr Cys Arg Ala Lys 660 665 670

Gly Thr Gly Tyr Tyr Val Val Phe Ser Pro Lys Val Thr Asp Gly Thr 675 680 685

Glu Cys Arg Leu Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val Arg Gly Lys Cys Val 690 69S 700

Arg Thr Gly Cys Asp Gly lie lie Gly Ser Lys Leu Gin Tyr Asp Lys 705 710 715 720

Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys Thr Lys lie Val Gly 725 730 735

Thr Phe Asn Lys Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Asp Val Val Arg lie Pro 740 745 750

Glu Gly Ala Thr His lie Lys Val Arg Gin Phe Lys Ala Lys Asp Gin 755 760 765

Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu Tyr 770 775 780

Leu lie Asn Gly Lys Tyr Met lie Ser Thr Ser Glu Thr lie lie Asp 785 790 795 800 lie Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp Asp 805 810 815

Phe Leu His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu lie Leu lie Val 820 825 830

Gin lie Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr Ser 835 840 845

Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr Ser 650 855 860

His Gly Ser Asn Lys Vai Gly Ser His Thr Ser Gin Pro Gin Trp Val 865 870 875 880

Thr Gly Pro Trp Leu Ala Cys Ser Arg Thr Cys Asp Thr Gly Trp His 885 890 895

Thr Arg Thr Val Gin Cys Gin Asp Gly Asn Arg Lys Leu Ala Lys Gly 900 905 910

Cys Pro Leu Ser Gin Arg Pro Ser Ala Phe Lys Gin Cys Leu Leu Lys 915 920 925

Lys Cys 930 <210> 3 <211> 112

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Asp lie Val lie Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly 15 10 IS

Glu Ser Val Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Pro lie Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95

Val Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Sex Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Sex Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Axg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Sex Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vãl Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Axg Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Gly Tyr Trp Gly 61n Gly Thr Thr 100 105 HO

Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 5 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5

Asp 11« Vai Hat Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Gin Gly 1 5 10 . 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met Hie Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Pro lie Tyr Leu Ala Ser Aen Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asp 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn 85 90 95

Glu Glu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 HO

<210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6

Glu Vai Ly$ Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu lie Asn Pro Asp Ser Ser Thr lie Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Lys Vai Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala Gly Thr Ser 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7

Asp He Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 2S 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 €0

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr lie Cys Gin Gin Tyr Cys Ser His Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Pro Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Arg lie Asp Pro Ala His Gly Arg Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 «0

Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr $er $er Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Phe Tyr Ser Tyr Ala lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115

<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro See See Leu See Ale Ser Vel Gly 15 10 15

Asp Arg Vel Thr lie The Cys Arg Ale Sec Gin Ale lie Gly Asn Asp 20 2S 30

Leu Ale Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys val Glu Zle Lys 100 105

<210> 10 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10

Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val His Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn 20 25 30

Phe Trp Ser Trp Val Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu Val Asn His Arg Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Gin Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Lys Leu Pro Arg Arg Arg Ala Glu Asp Arg Pro Ser Ser Leu Arg 100 105 110

Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11

Gin Ser Vai Vai Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Vai Thr Xle Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly 20 25 30

Tyr Asp Vai His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Asp Asn Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Asn Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Tyr Ala Vai Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 12 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Ser His 20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gin Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Arg lie Gly Thr Val Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 SO

Gin Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Cys Ser Arg Thr Ser Cys His Ser Gly Tyr 100 105 110

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125

Ser Ser 130

<210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13

Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cy$ Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 05 »0 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105

<210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Tbr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Lys Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Leu Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ser Asp Ala Phe Gly Leu Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 15 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15

Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Ser Vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Gly Tyr 20 25 30

Asn Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Hie Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Vai Ser Asn Arg Pro Ser Gly Vai Ser Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Arg Arg 85 80 95

Ser Thr Leu Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu 100 105 110 <210> 16

<211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu lie Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Thr lie Trp Ser Thr Arg His Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser 100 105 110

Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125

Ser

<210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Glu Thr The Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 15 10 15

Asp Lys lie Tyr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie 35 40 45

Gin Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 €0

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn Met Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Pro Gin Gin Asp Asn Val Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105

<210> 18 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ser Asp Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Arg Vai Ser Cys Lys Vai Ser Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Tyr 20 25 30

Pro lie His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45

Gly Gly Phe Asp Leu Glu Asn Gly Vai Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Ser Vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Vai Lys Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Vai Thr Ser Phe Thr Ser Trp 100 105 110

Gly Leu Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19

Gin Ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Thr Leu Thr Cye Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Aan Tyr Lys 20 25 30

Vai Asp Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Vai Met 35 40 45

Arg Vai Gly Thr Gly Gly Thr Vai Gly Ser Lys Gly Asp Gly lie Pro 50 55 50

Asp Arg Phe Ser Vai Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Ile Zle 65 70 75 80

Lys Asn lie Gin Glu Glu Asp Glu Thr Asp Tyr His Cys Gly Ala Asp 85 90 95

His Gly Ser Gly Ser Asn Phe Vai Tyr Vai Phe Gly Ser Gly Thr Lys 100 105 110

Vai Thr Vai Leu 115

<210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Asp Leu Leu His Lys Asp Gly Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Asp lie Gin Met Tbr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg val Thr He Thr Cys Arg Pro Ser Gin Gly lie Gly Lys Tyr 20 25 30

Ser Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Pro lie 35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Asp 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pró 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Arg A$n Thr Tyr Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105

<210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp val 35 40 45

Ala Thr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 €0

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr £5 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Trp Ser Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Met 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Ser Tyr Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Glu Asp Lys Tyr Ala 20 25 30

Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

His Asp Tyr Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 1 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Vai Glu Gly Gly 65 70 75 8g

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Vai Trp Asp Ser Gly Ser Asp Asp 85 90 d5

Gin Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105

<210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala IS 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Tyr 20 2S 30

Pro lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45

Gly Gly Phe Asp Leu Glu Asn Gly Val Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Ser Val Tyr 65 70 7S 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser Trp 100 105 110

Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25

Asp lie Val Leu Ihr Gin Ser Pro Ala lie Met. Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gin Tyr His Ser Tyr Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Glu Net Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly Gin Asp Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Ser Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 10 15 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Thr Val Glu Lys Leu Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29

Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 15 10 15

<210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Gin Gin Asn Asn Glu Glu Leu Thr 1 5

<210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33

Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 15 10

<210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5

<210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

Gin Gin Tyr Cys Ser His Pro Tyr Thr 1 5

<210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Arg Ala 5er Gin Ala lie Gly Asn Asp leu Ala 1 5 10

<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Gly Ala Ser Thr Leu Ser Ser 1 5

<210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Gin Gin Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr Thr 1 S <210> 39

<211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 15 10

<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Gly Asn Asp Asn Arg Pro Ser 1 5

<210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Gin Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Ser Gly Tyr Ala Val 15 10

<210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Axg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr Leu Asn 15 10

<210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5

<210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 15 10

<210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5

<210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Ser Sex Tyr Thr Arg Arg Ser Thr Leu Glu 15 10

<210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Lys Ala Ser Gin Asp He Asp Asp Asp Met Asn 15 10

<210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro 1 5

<210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50

Pro Gin Gin Asp Asn Val Pro Leu Thr 1 5

<210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Lys Val Asp 15 10

<210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Val Gly Thr Gly Gly Thr Val Gly Ser Lys Gly Asp 15 10

<210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 53

Gly Ala Asp His Gly Ser Gly Ser Asn Phe Val Tyr Val 15 10

<210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

Arg Pro Ser Gin Gly lie Gly Lys Tyr Ser Ala 15 10

<210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55

Leu Ala Ser Thr Leu Gin Ser 1 5

<210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Leu Gin Arg Asn Thr Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 57

<211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57

Ser Gly Asp I>ys Leu Glu Asp Lys Tyr Ala Cys 15 10

<210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

His Asp Tyr Lys Arg Pro Ser 1 5

<210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59

Gin Val Trp Asp S«r Gly Ser Asp Asp Gin Val 1,5 10

<210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60

Ser Tyr Trp Met His 1 5

<210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61

Tyr lie Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Asp

<210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62

Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Gly Tyr 1 5

<210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63

Arg Tyr Trp Met Ser 1 5

<210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64

Glu lie Asn Pro Asp Ser Ser Thr lie Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Asp

<210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65

Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5

<210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 6

Asp Thr Tyr Met His 1 5

<210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 67

Arg lie Asp Pro Ala His Gly Arg Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 15 10 15

Gly

<210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 68

Tyr Ser Tyr Ala lie Asp Tyr 1 5

<210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69

Gly Asn Phe Trp Ser 1 5

<210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70

Glu Vai Asn His Arg Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71

Lys Leu Pro Arg Arg Arg Ala Glu Asp Arg Pro Ser Ser Leu Arg Pro 15 10 15

Phe Asp Tyr

<210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

Ser His Asp Met His 1 5

<210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Arg Xle Gly Thr Vai Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly 15 10 15 <210> 74

<211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74

Asp Gly Thr Arg Tyr Cys Ser Arg Thr Ser Cys His Ser Gly Tyr Tyr 15 10 15

Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20

<210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75

Asp His Tyr Met Asp 1 5

<210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76

Arg lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 15 10 15

Val Lys Gly <210> 77 <211> 10

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

Asp Leu Gly Ala Ser Asp Ala Phe Gly Leu 15 10

<210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78

Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5

<210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79

Glu lie Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15

<210> 80 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

Thr He Trp Ser Thr Arg His Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ser Ser 15 10 15

Asn Trp Phe Asp Pro 20

<210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81

Glu Tyr Pro lie Hie 1 5

<210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82

Gly Phe Asp Leu Glu Asn Gly Val Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe Arg 15 10 15

Gly /

<210> 83 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83

Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser 1 5 10

<210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

Ser Tyr Ala Met Thr 1 5

<210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85

Ala He Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86

Asp Arg Asp Leu Leu His Lys Asp Gly Phe Asp lie 15 10

<210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87

Gly Tyr Gly Met Asn 1 5

<210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88

Thr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89

Asp Trp Ser Tyr Ala Met Asp Val 1 5

<210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90

Glu Tyr Pro Ele His 1 5

<210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91

Gly Ph© Asp Leu Glu Asn Gly Val Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe Arg 1 5 10 15

Gly

<210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92

Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser 15 10

<210> 93 <211> 352 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <400> 93

Met Lys Ala Leu Thr Ala Arg Gin Gin Glu Val Phe Asp Leu lie Arg 1 5 10 15

Asp His lie Ser Gin Thr Gly Met Pro Pro Thx Arg Ala Glu lie Ala 20 25 30

Gin Arg Leu Gly Phe Arg Ser Pro Asn Ala Ala Glu Glu His Leu Lys 35 40 45

Ala Leu Ala Arg Lys Gly Val lie Glu lie Val Ser Gly Ala Ser Arg 50 55 60

Gly lie Arg Leu Leu Gin Glu Glu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Val Gly 65 70 75 80

Arg Val Ala Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gin Gin His lie Glu Gly 85 90 95

His Tyr Gin Val Asp Pro Ser Leu Phe Lys Pro Asn Ala Asp Phe Leu 100 105 110

Leu Arg Val Ser Gly Met Ser Met Lys Asp lie Gly lie Met Asp Gly 115 120 125

Asp Leu Leu Ala Val His Lys Thr Gin Asp Val Arg Asn Gly Gin Val 130 135 140

Val Val Ala Arg lie Asp Asp Glu Val Thr Val Lys Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160

Gin Gly Asn Lys Val Glu Leu Leu Pro Glu Asn Ser Glu Phe Lys Pro 165 170 175 lie Val Val Asp Leu Arg Gin Gin Ser Phe Thr lie Glu Gly Leu Ala 180 185 190

Val Gly Val lie Arg Asn Gly Asp Trp Leu Glu Phe Thr Lys lie Val 195 200 205

Gly Thr Phe Asn Lys Lys Ser Lys Sly Tyr Thr Asp Val Val Arg lie 210 215 220

Pro Glu Gly Ala Thr His lie Lys Val Arg Gin Phe Lys Ala Lys Asp 225 230 235 240

Gin Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu 245 250 255

Tyr Leu lie Asn Gly Lys Tyr Met lie Ser Thr Ser Glu Thr lie lie 260 265 270

Asp lie Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp 275 280 285

Asp Phe Leu His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu lie Leu lie 290 295 300

Val Gin lie Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr 305 310 315 320

Ser Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr 325 330 335

Ser His Gly Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr Lys lie Tyr Ala lie 340 345 350

<210> 94 <211> 424 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <400> 94

Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Tip Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro 15 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr He Asp Gly Asp Val Lys 50 55 «0

Leu Thr Gin Ser Met Ala He lie Are Tyr He Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu 85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg He Ala Tyr Ser 100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 Π0 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr 180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 195 200 205

Thr phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser 210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg 225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala lie Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu 245 250 255

Arg Gin His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Val Thr Lys lie Val Gly Thr Phe 275 280 285

Asn Lys Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Asp Val Val Arg lie Pro Glu Gly 290 295 300

Ala Thr His lie Lys Val Arg Gin Phe Lys Ala Lys Asp Gin Thr Arg 305 310 315 320

Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu Tyr Leu lie 325 330 335

Asn Gly Lys Tyr Met He Sec Thr Sec Glu Thr lie lie Asp lie Asn 340 345 350

Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp Asp Phe Leu 355 360 365

His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu lie Leu lie Val Gin lie 370 375 380

Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr Ser Phe Phe 385 390 395 400

Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr Ser His Gly 405 410 415

Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr 420

<210> 95 <211> 708 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 95 atggaatggt ccggcgtgtt catgttcctg ctgtccgtga ccgotggcgt gcactccgac 60 atcgtgctga cccagtcccc cgccatcatg tctgcctccc tgggcgagcg cgtgacaatg 120 acctgcaccg cctcctccag cgtgtcctcc tcctacctgc actggtatca gcagaagccc iso ggctccagcc ccaagctgtg gatctactcc acctccaacc tggccteegg cgtgcccgcc 240 agattctctg gctccggctc cggcacctcc tactocctga ccatotceag catggaagcc 300 gaggacgccg ccacctacta ctgtcggcag taccactcct acccctggic ctteggcgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat Cttcccaece 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaocgcc agcgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480 coccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caacrtcccag 540 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagttc caccctgacc 600 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gctgataa 708

<210> 96 <211> 1398 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 96 atggaatggt ccggcgtgtt catgttcctg ctgtcegtga ccgctggcgt gcactcccag 60 gtgcagctgc agcagtccgg ccctgagctg gtcaagectg gcgcctcggt ggaaatgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac cttcaccagc tacgtgatgc actgggtcaa gcagaagccc ISO ggccaggacc tggaatggat cggctacate aacccctact ccgacggcac caagtacaac 240 gagaagttca agggcaaggc caccctgace tccgacaagt cctcctccac cgcctacatg 300 gaaetgtcct ccctgaccag cgaggactcc gccgtgtact actgcgccac caccgtggaa 360 aagctgtact ccgactactg gggccagggc accacactga ccgtgtcctc tgcctacacc 420 aagggccctt cogtgttccc tctggcccct tgctcccggt.ccacctctga gtctaoogce 480 gctctgggct gcctggtgaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactcc 540 ggcgebetga cctccggcgt gcacaccttc cctgeegtgc tgcagtccag cggcctgtac 600 tccctgtcct ccgtggtgac cgtgccttcc tccagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 660 aacgtggacc acaagccctc caacaocaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 720 ccaccctgcc ccccctgccc tgctcctgag tttctgggcg gaccctccgt gttcctgttc 780 cccccaaagc ccaaggatae cctgatgatc tcccggaccc ccgaagtgac etgegtggtg 840 gtggacgtgt cccaggaaga tcccgaggtc cagttoaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 900 gtgcacaaeg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca actccaccta ccgggtggtg 960 tetgtgctga cagtgctgca toaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaagtc 1020 tccaacaagg gactgccctc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggcc&amp;a gggccagccc 1080 cgcgagcctc aggtgtacac cctgccacct agceaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1140 tccctgacct gtctggtgaa aggcttctac ccctccgaca tcgccgtgga atgggagtct 1200 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc acaccccctg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctgt actctcggct gacagtggac aagtcccggt ggcaggaagg caacgtcttc 1320 tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg 1380 agectgggea agtgataa 1398 <210> 97 <211> 720

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 97 atggaatggt ccggcgtgtt catgttcctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcactccgac 60 atcgtgatoa cccaggacga gctgtccaac cccgtgacct ccggcgagtc cgtgtccatc 120 tcctgceggt cctccaagtc cctgctgtac aaggaeggea agaoctaect gtactggttc 180 ctgeagegge ctggceagtc cccccagctg cccatctacc tgatgtccac ccgggccagc 240 ggcgtgtccg aeagattctc eggetecgge agcggeaecg actttaccct ggaaatetee 300 agagtgaagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agctggtgga atacccctac 360 aecttcggcg gaggcaccaa gotggaaatc aagoggaeog tggoogotcc ctccgtgttc 420 atcttaccac cctccgacga gcagctgaag tccggcaccg cctccgtcgt gtgcctgctg 480 aacaacttct accccogcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagtcc 540 ggeaactccc aggaatccgt caccgagcag gactccaagg acagcaccta ctccctgtcc 600 tccaccctga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 660 acccaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aagtccttca accggggcga gtgctgataa 720

<210> 98 <211> 1393 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 98

atggaatggt ccggcgtgtt catgttcctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcactcccag GO gtgcagctgc agcagtctgg agccgagctg gctaagcctg gcgoctacgt gaagatgtcc 120 tgcaaggcot ecggctacao cttcaccagc tactggatgo aotgggtcaa gcagcggcct 180 ggccagggcc tggaatggat eggctacatc aacccctcca ccggctatac cgagtacaac 240 eagaagttea aggacaaggc caccctgacc gccgacaagt cctcctccac cgcctacatg 300 cagctgggct ccctgaccte cgaggactcc gccgtgtact actgcgccag aggcggctac 360 gacgacctgg gatactgggg ccagggcacc acactgaecg tgtcetetgc ctccaccaag 420 ggccettccg tgttccctct ggccocttgc teccggteca cctctgagtc tacegcegct 480 ctgggctgcc tggtgaaaga etacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 540 gctctgacct ccggcgtgca eaccttccct gccgtgctgc agtccagcgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tggtgaccgt gccttcctcc agcctgggea ccaagaccta cacctgtaac 660 gtggaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagcggg tggaatctaa gtacggccca 720 ccctgccccc cctgccctgc tcctgagttt ctgggcggac cctccgtgtt cctgttcccc 780 ccaaagccca aggataccct gatgatctcc cggaccceeg aagtgacctg cgtggtggtg 840 gacgtgtccc aggaagatcc cgaggtccag ttcaattggt aagtggaagg agtggaagtg 900 cacaacgcca agaccaagcc cagagaggaa cagttcaact ceaectaeeg ggtggtgtct 960 gtgctgaoag tgotgcatca ggaatggctg aacggcaaag agtacaagtg eaaagtctcc 1020 aacaagggac tgccctccag catcgaaaag aocatctcoa aggccaaggg ceagocccgc 1080 gagcctcagg tgtacaccct gccacctagc caggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1140 ctgacctgtc tggtgaaagg cttctaccec tccgacatcg ccgtggaatg ggagtctaac 1200 ggccagcccg agaacaacta caagaccaca ccccctgtgc tggactecga eggetccttc 1260 ttcctgtact ctcggctgac agtggacaag tcccggtggc aggaaggcaa cgtcttetce 1320 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtocct gtccctgagc 1380 ctgggcaagt gat 1393

<210> 99 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 99 gacattgtga taactcagga tgaactctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgtattgg 120 tttctgcaga gaccaggaca atctectcag ctcccgatct atttgatgtc caeccgtgca 180 tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc 240 agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc aacaacttgt agagtatccg 300 taeacgttcg gaggggggac caagctggaa atcaaa 336

<210> 100 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 100 caggttcagc tgcagcagtc tggggotgag ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta tactgagtac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag caoagcctac 240 atgcaactgg gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggggg 300 tatgatgatc ttggctactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 101 <211> 330 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 101 gacattgtga tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcaagggca gagggccacc 60 atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc cccatctatc ttgcttccaa cctagaatct 180 ggggtocotg coaggttcag tggcagtggg tctaggaeag acttcaccct caccattgat 240 cctgtggagg ctgatgatgc tgeaaeetat tactgtcagc aaaataatga ggagctcacg 300 ttcggtgctg ggaccaagct ggagetgaaa 330

<210> 102 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 102 gaagtgaagc ttctcgagtc tggaggtgge ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcetgtaeaa ecteaggatt cgactttagt agatactgga tgagttgggt eeggeaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtao gataaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcectfct attactgtgc aagaaggagc 300 tactggtaet tcgatgtctg gggcgcaggg acctcagtea ecgtetectc a 351

<210> 103 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 103 gacattgtga tgacaoagto tcacaaattc atgtccacat cagaaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggccaatcte etaaaetaet gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagattatat ctgtcageaa tattgcagcc atccgtacac gttcggtgct 300 gggaccaago tggaaatcaa a 321

<210> 104 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 104 caagttcagc tgcagcagtc tggggcagaa cctgtgaagc caggggccto agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt. caacatt«aa gacacctata tgcactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg attgatcCtg cgcatggcag aactaaatat ISO gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catectccaa cacagcctac 240 ctgcaactca gcagcctgtc atctgaggac actgccgtct attactgtgc tttttactcc 300 tatgctattg actactgggg fccagggaacc tcagtcaccg tctoctca 348

<210> 105 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 105 gatattgtga tgaetcagtc tccatcctcc Gtgtetgcat ctgtaggaga cagagteacc 60 ateaettgcc gggcaagtca ggccattggc aatgatttag cctggtatca gcagagacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatggt gcatccactt tgtccagtgg ggtcccatca 1Θ0 cgattcagcg gcagtggate tgggaeagaa ttcactctca ecatcagcag cctgeagcct 240 gatgattttg eaacttatta ctgeeaaeaa tataataatt tcccctacac ttttggcctg 300 gggaeeaagg fcggaaatcaa a 321

<210> 106 <211> 381 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 106 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcaggg ctgttgaagc cctcggagae cctgtccctc 60 acctgcgctg tgcatggtgg gtccttcagt ggtaacttct ggagctgggt ccgccaacac 120 ccagggaagg gactggagtg gatcggggaa gtoaateate gtggaagcge caectacaac 180 ccgtcactca agagtcgagt caccatgtca gttgacaoat ccaagaatca gttctccctg 240 caattgagct ctgtgaccgc egcggacacg gctgtctatt actgtgcgag aaagcttcca 300 agacgacggg cggaggaccg accctcgagt ttacggccgt ttgactactg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcctc a 381

<210> 107 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 107 cagtetgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctggggoec aagggcagag ggtcaccate 60 tcctgcactg ggagcagctc eaacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 ettceaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaatg acaatcggcc ctcaggggtc 180 eotgaccgat tctctggcto oaagtotgga aoetcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggotga ttattaetge eagtcotatg aeaacagect gagtggctat 300 gctgtgttcg gaggaggcac ecagetgaee gtcctc 336

<210> 108 <211> 390 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 108 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caggttctcc agecacgaca tgcaetgggt ccgecaagtt 120 ccaggaaaag gtctggagtg ggtctcacgt attgggactg ttggtgacac atactacgea 180 gaetecgtga agggaeggtt oaccatctcc agagaeaatt ccaagaacac gctgtttctg 240 eaaatgaaea gcctgggagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatggtacc 300 egttattgta gtagaaaoag otgocacagc ggctactact actacggtat ggacgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtetcctea 390

<210> 109 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 109 gatattgtga tgaeeeagae teeatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatget gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tetgeaaect 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaaeag agttacagta ccccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 110 <211> 363 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 110 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggagge ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc €0 tcotgtgcag cctccggatt cacebteagt gaccactaca tggactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggocgt attagaaaca aagcfcaacag ttacaccaea 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc aceatctcaa gagatgattc aaagaaaaea 240 ctgtatctgc aaatgaccag ectgaaaacc gacgaeaegg ccctttatta ttgtgctaga 300 gatotggggg cetctgatgc ttttggtctc tggggccaag ggaccacggt caccgtctce 360 tea 363

<210> 111 <211> 330 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 111 cagtctgtct tgacgcagcc geectecgeg teegggtetc ctggaeagtc agtcaecate 60 tectgcactg gaaccageag tgaegttggt ggttataact atgtctcctg gtaeeaaeaa 120 cacccaggca aageceecaa actcttgatt tatgatgtea gtaateggee ctcaggggtt 180 tetagteget tctctggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattaetgc ageteatata caagaaggag cactctggag 300 tteggeggag ggaceaaget gaeegtecta 330

<210> 112 <211> 387 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 112 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata grtggaagcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatoa gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aaccatatgg 300 agcacccgac acgatttttg gagtggttat tattcctcca actggttcga eccctggggc 360 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 387

<210> 113 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 113 gaaaegaeae tcaegcag-te tccagcattc atgtcggcga ctccaggaga caaaatctat 60 atetcctgca aagccagcca agacattgat gatgatatga aetggtacea acagaaacca 120 ggagaagctg ctattttcat tattcaagaa gctactactc tcgttcctgg aatcccacct 180 cgattcagtg gcagcgggta tggaacagat tttacectea caattaataa catggaatct 240 gaggatgctg eatattactt ctgtccacaa caagataatg toaooetoae tttcggcgga 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321

<210> 114 <211> 366 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 114 gaggtgcagc tggtggagtc tgggtctgac gtgaagaagc cgggggcctc agtgagggtc ¢0 tcctgcaaag tttccggata cagactcact gagtatccca tacactgggt tcgacaggcg 120 ccggggaaag gacttgagta catgggaggc tttgatcttg aaaatggtgt aacaaaggcc 180 gcaccgaggt tcaggggcag attcaccatg accgaggaca catctacaga ctctgtttat 240 atggagttga agagcctgac atctgaagac acggccgtct attattgtgt aaaggggccg 300 ggatacggtg cgttggtgac ctcctttacc tcctggggcc tgggaaccct ggtcaccgtc 300 tcctca 366

<210> 115 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 115 cagtctgtgt tgacgcagcc gccttctgca teageeteee tgggagcctc ggbeacactc 60 acctgcaccc tgagcagcgg ctacagtaat tataaagtgg actggtacca acagacacea 120 gggaagggcc cccggtttgt gatgcgagtg ggcactggtg ggactgtggg atceaagggg 180 gatggcatcc ctgatcgctt ctcagtcttg ggctcaggcc tgaatcggta cctgatcatc 240 aagaacatcc aggaagagga tgagactgac taccactgtg gggcagacca tggcagtggg 300 agcaacttcg tgtatgtctt cggaagtggg accaaggtca ccgtccta 348

<210> 116 <211> 363 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 116 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ttggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 eeagggaagg ggctggagtg ggtetcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gtteaecate tccagagaea attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatgg acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgc 300 gatctectgc acaaagatgg ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tea 363

<210> 117 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 117 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcaettgte ggeegagtea gggaattggc aagtactcag cctggtatca gcagaaaeca 120 gggaaagccc ctgagctccc gatetatett gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg acagtggatc tgggacagaa ttcactatca oaatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag egtaataett acccgtggao gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 118 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 118 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc gtggtceagc ctgggaggtc cctgaggctc 60 tcctgtgcgg cetctgggtt caecttcagt ggctatggca tgaaetgggt ccgccaggct 120 ccaggcacgg ggctggagtg ggtggcaaca atatcatttg atggaactga taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaea acgctgagaa cacgctctat 240 ctgcaaatga aeagtctgag ageagaggae atggctgtgt attactgtgc aagagattgg 300 tegtaegega tggacgtctg gggccaaggg acaatggtca ocgtctcttc a 351

<210> 119 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 119 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc ¢0 acctgctctg gagataaatt ggaggataaa tacgcttgct ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tgctggtcat ctatcatgat tacaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacaaagcc aeectgacea tcagcagggt cgaaggeggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagcggta gtgatgatca ggtcttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324

<210> 120 <211> 366 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 120 caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgac gtgaagaagc egggggcctc agtgagggtc 60 tcctgcaaag tttccggata cagactcact gagtatccca tacactgggt tcgacaggcg 120 ccggggaaag gacttgagta catgggaggc tttgatcttg aaaatggtgt aacaaaggcc 180 gcaccgaggt tcaggggcag attcaccatg accgaggaca catctacaga ctctgtttat 240 atggagttga agagcctgac atctgaagac acggccgtct attattgtgt aaaggggccg 300 ggataeggtg cgttggtgac ctcctttaee tectggggee fcggggaeeae ggtcaccgtc 360 tcctca 366

<210> 121 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 121

Thr Lye He Val Gly Thr Ehe Aen Lye Lye ser Lys Gly Tyr ihr Asp IS 10 IS val val Arg He Pro Glu Gly Ala Thr His He Lys val Arg Gin Phe 20 25 30

Lys Ala Lys Asp Gin Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys 35 40 45

Lys Asn Gly Glu Tyr Leu lie Aen Gly Lys Tyr Met Ile Ser Thr Ser 50 55 60

Glu Thr He lie Asp lie Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp 65 70 75 80

Ser His Arg Asp Asp Phe Leu Kis Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys 85 90 95

Glu He Leu lie Val Gin lie Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu 100 105 110

Asp Val Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val 115 120 125

Asn Ser Val Thr Ser Hie Gly Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr 130 135 140 <210> 122 <211> 17

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 122

Asn Ala Ala Thr Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gin His Gin His 15 10 IS

Asn <210> 123

<211> 429 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 123 acaaagattg ttggaacctt taataagaaa agtaagggtfc acactgacgt ggtgaggatt 60 cctgaagggg caacccacat aaaagttcga cagttcaaag ccaaagacca gactagattc 120 actgcctatt tagccctgaa aaagaaaaac ggtgagtacc ttatcaatgg aaagtacatg 180 atctceactt cagagactat cattgacatc aatggaacag tcatgaacta tagcggttgg 240 agccacaggg atgacttcct gcatggcatg ggctactctg ecacgaagga aattctaata 300 gtgcagattc ttgcaacaga ccccactaaa ccattagatg tccgttatag cttttttgtt 360 cccaagaagt eeactccaaa agtaaactct gtcaetagtc atggcagcaa taaagtggga 420 tcacacact 429

<210> 124 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 124 aacgctgcca ccacactcaa gaacttttgc aagtggcagc acoaaoacaa c 51

<210> 125 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 125

Asp lie Val lie Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Sex Gly 15 10 IS

Glu Ser Val Ser He Ser Cys Axg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr lys 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Pro lie Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95

Val Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Ser Gly Gly Ser Thr Arg Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 115 120 125

Gly Ser Ser Gly Thr Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu 130 135 140

Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 145 150 155 160

Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp val Lye Gin Arg Pro Gly Gin 165 170 175

Gly Leu Glu Trp He Gly Tyr He Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu 180 185 190

Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 195 200 205

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Gly Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250

<210> 126 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 126

Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Gin Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Pro lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asp 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn 85 90 95

Glu Glu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser 100 105 110

Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser 115 120 125

Ser Gly Thr Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asp Phe 145 150 155 160

Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175

Glu Trp lie Gly Glu lie Asn Pro Asp Ser Ser Thr He Asn Tyr Thr 180 185 190

Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe He He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 225 230 235 240

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245

<210> 127 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 127

Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Glu Gly 15 10 15

Asp Arg val Ser lie rhr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr He Cys Gin Gin Tyr Cys Ser His Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ser Gly Gly Ser 100 105 110

Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Arg Gly Thr 115 120 125

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Pro Val Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Thr 145 150 155 160

Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 165 170 175

Gly Arg He Asp Pro Ala His Gly Arg Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 180 185 190

Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 195 200 205

Leu Gin Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Phe Tyr Ser Tyr Ala lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val 225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 128 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 128

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ala lie Gly Asn Asp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 €0

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Ser Gly Gly Ser Thr 100 105 110

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Gin 115 120 125

Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr 130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val His Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn Phe 145 150 155 160

Trp Ser Trp Val Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly 165 170 175

Glu Val Asn His Arg Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 180 185 190

Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Gin 195 200 205

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy$ Ala Arg 210 215 220

Lys Leu Pro Arg Arg Arg Ala Glu Asp Arg Pro Ser Ser Leu Arg Pro 225 230 235 240

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250

<210> 129 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129

Gin Ser Vai Vai Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15

Arg Vai Ihr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30

Tyr Asp Vai His Tzp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Asp Asn Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Asn Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Tyr Ala Vai Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Vai Leu 100 105 110

Ser Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 115 120 125

Ser Ser Gly Thr Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai 130 135 140

Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg 145 150 155 160

Phe Ser Ser His Asp Met His Trp Vai Arg Gin Vai Pro Gly Lys Gly 165 170 175

Leu Glu Trp Vai Ser Arg Xle Gly Thr Vai Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Vai 210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Cys Ser Arg Thr Ser Cys 225 230 235 240

His Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr 245 250 255

Thr Vai Thr Vai Ser Ser 260

<210> 130 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130

Asp II· Val Mot Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Ser Gly Gly Ser Thr 100 105 110

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Gin 115 120 125

Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr 145 150 155 160

Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 165 170 175

Arg lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 180 185 190

Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Lys Thr Leu 195 200 205

Tyr Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 210 215 220

Cys Ala Arg Asp Leu Gly Ala Ser Asp Ala Phe Gly Leu Trp Gly Gin 225 230 235 240

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245

<210> 131 <211> 259 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 131

Gin Ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala ser Gly ser Pro Gly Gin 15 10 15

Ser Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Gly Tyr 20 25 30

Asn Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin His Fro Gly Lys Ala Pro Lye Leu 35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Vai Ser Aen Arg Pro Ser Gly Vai Ser Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Arg Arg 85 90 95

Ser Thr Leu Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Ser Gly 100 105 110

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser 115 120 125

Gly Thr Gin Vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro 130 135 140

Ser Gly Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Tyr Gly Gly Ser Phe Ser 145 150 155 160

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 165 170 175

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Hls Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 180 185 190

Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 195 200 205

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 210 215 220

Cys Ala Arg Thr Ile Trp Ser Thr Arg His Asp Phe Trp Ser Gly Tyr 225 230 235 240

Tyr Ser Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 245 250 255

Vai Ser Ser

<210> 132 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 132

Glu VaX GXn Leu Vai GXu Ser GXy Ser Asp VaX Lys Lys Pro GXy Ala 15 XO 15

Ser Vai Arg Vai Ser Cys Lya Vai Ser Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Tyr 20 25 30

Pro lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45

Gly Gly Phe Asp Leu Glu A$n Gly Val Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Ser Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser Trp 100 105 110

Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser 115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Glu Thr 130 135 140

Thr Leu Thr Gin Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 lie Tyr He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asp Asp Asp Met Asn 165 170 175

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Ala Ala lie Phe lie lie Gin Glu 180 185 190

Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly lie Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205

Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Asn Met Glu Ser Glu Asp 210 215 220

Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Pro Gin Gin Asp Asn Val Pro Leu Thr Phe 225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp He Lys 245

<210> 133 <211> 2793 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 133 atgetgeteg ggtgggcgtc cctgctgctg tgcgcgttcc gcctgcccct ggecgeggtc 60 ggccccgecg cgacacctgc ccaggataaa gccgggcagc ctccgactgc tgeageagee 120 gcccagcccc gccggcggca gggggaggag gtgeaggage gagccgagcc tcccggccac 180 ccgcaccccc tggcgcagcg gcgcaggagc aaggggctgg tgcagaacat cgaccaactc 240 tactccggcg gcggcaaggt gggctacctc gtetaegegg geggeeggag gttcctcttg 300 gacctggagc gagatggttc ggtgggcatt gctggcttcg tgcccgcagg aggcgggacg 360 agtgcgccct ggcgccaccg gagccactgc ttctatcggg gcacagtgga cgctagtccc 420 cgctctetgg ctgtctttga cctctgtggg ggtctcgacg gcttcttcgo ggtcaagcac 480 gegegetaea ccctaaagec aetgctgcgc ggaccctggg eggaggaaga aaaggggcgc 540 gtgtacgggg atgggtccgc acggatcctg cacgtctaca cccgcgaggg cttcagcttc 600 gaggccctgc cgccgcgcgc cagctgcgaa acccccgcgt ccacaccgga ggcccacgag 660 catgctccgg cgcacagcaa cecgagegga cgegcageac tggcctcgca getettggae 720 cagtccgctc tctcgcccgc tgggggctca ggaccgcaga egtggt'ggcg gcggcggcgc 780 cgctccatct cccgggceeg ocaggtggag ctgcttctgg tggctgacgc gtccatggeg 840 cggttgtatg gccggggcct gcagcattac ctgctgaccc tggectccat cgccaatagg 900 ctqtacagcc atgetageat cgagaaccac atccgcctgg ccgtggtgaa ggtggtggtg 960 ctaggcgaca aggacaagag cetggaagtg agcaagaacg ctgccaccac actcaagaac 1020 ttttgcaagt ggeageacca acacaaccag ctgggagatg accatgagga geaetaegat 1080 gcaqctatcc tgtttactcg ggaggattta tgtgggeate attcatgtga eaeectggga 1140 atggcagaeg ttgggaccat atgttctcca gagegeaget gtgctgtgat tgaagaegat 1200 ggcctccacg cagccttcac tgtggctcac gaaatcggac atttacttgg cctctcccat 1260 gacgattcea aattctgtga agagaccttt ggttccacag aagataagcg ettaatgrtet 1320 tceatcctta ccagcattga tgeatetaag ccctggtcca aatgeaette agccaceatc 1360. acagaattcc tggatgatgg ccatggtaac tgtttgctgg acotaocacg aaageagate 1440 etgggeeeeg aagaactccc aggaeagacc tacgatgcca cccagcagtg caacotgaca 1500 ttcgggcctg agtaetccgt gtgtcccggc atggatgtct gtgetegeet gtggtgtgct 1560 gtggtacgcc agggccagat ggtctgtctg accaagaagc Lgcctgcggt ggaagggacg 1620 ccttgtggaa aggggagaat ctgcctgcag ggcaaatgtg tggacaaaac caagaaaaaa 1680 tattattcaa cgtca&amp;gcca tggcaactgg ggatcttggg gatcctgggg ccagtgttct 1740 cgeteatgtg gaggaggagt gcagtttgcc tatcgteact gtaataaccc tgctcccaga 1800 aacaacggac gctactgcac agggaagagg gccatctace getectgeag tctcatgccc 1860 tgcccaccca atggtaaatc atttegteat gaacagtgtg aggccaaaaa tggetatcag 1920 tctgatgcaa aaggagtcaa aacttttgtg gaatgggttc ccaaatatgc ággtgtcctg 1980 ccagcggatg tgtgcaagct gacctgcaga gccaagggca ctggctacta tgtggtattt 2040 tctccaaagg tgaccgatgg eactgaatgt aggccgtaca gtaattccgt ctgcgtccgg 2100 gggaagtgtg tgagaaetgg etgtgaeggc atcattggct caaagctgca gtatgacaag 2160 tgcggagtat grtggaggaga caactccagc tgtaeaaaga ttgttggamc ctttaataag 2220 aaaagtaagg gttacactga cgtggtgagg attcetgaag gggcaaccca cataaaagtt 2280 cgacagttca aagccaaaga ccagactaga ttcactgcct atttagcect gaaaaagaaa 2340 aacggtgagt accttatcaa tggaaagtae atgatctcca cttcagagac tatcattgac 2400 atcaatggaa cagtcatgaa ctatagcggt tggagccaca gggatgactt cctgoatggc 2460 atgggctact ctgccacgaa ggaaattcta atagtgcaga ttcttgcaac agaecccact 2520 aaaccattag atgtccgtta tagctttttt gttcccaaga agtccactoc aaaagtaaao 2580 tctgtcacta gtcatggcag caataaagtg ggatoaoaca cttegcagcc gcagtgggte 2640 aogggoooat ggotcgectg etctaggacc tgtgacacag gttggcacac eagaaeggtg 2700 eagtgeeagg atggaaaeeg gaagttagca aaaggatgte ctctcteeca aaggccttct 2760 gegtfctaage aatgettgtt gaagaaatgt tag 2793

<210> 134 <211> 2514 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 134 atgtcccaga caggctcgca tcccgggagg ggcttggcag ggcgctggct gtggggagcc 60 caaccctgcc tcctgctcce cattgtgceg eteteetggc tggtgtggct gcttctgcta 120 ctgctggcct ctctcctgcc ctcagcccgg ctggccagcc ccctcccccg ggaggaggag 180 atcgtgtttc cagagaagct caacggcagc gtcctgcctg gctcgggcgc ccctgccagg 240 ctgttgtgcc gcttgcaggc otttggggag aegetgctac tagagctgga gcaggactcc 300 ggtgtgcagg tcgaggggct gacagtgcag taoctgggcc aggcgcctga gctgctgggt 360 ggagcagagc ctggcaccta cctgaetgge accatcaatg gagatccgga gtcggtggea 420 tetctgcact gggatggggg agcectgtta ggegtgttac aatatcgggg ggctgaacto 480 c&amp;cctocagc ccctggaggg aggcacccct aactctgctg ggggacctgg ggcteacatc 540 ctaegccgga agagtcctgc cagcggtcaa ggtcccatgt gcaacgtcaa ggctcctctt 600 ggaagccoca gccccagacc cegaagagec aagcgctttg cttcactgag tagatttgtg 660 gagacactgg tggtggcaga tgacaagatg gccgcattcc acggtgcggg gctaaagcgc 720 tacctgetaa cagtgatggc agcagcagcc aaggccttca agcacccaag catccgcaat 780 cctgteaget tggtggtgac tcggctagtg atcctggggt caggogagga ggggccccaa 840 gtggggeeea gtgetgceea gaecetgege agcttctgtg cctggcagcg gggcctcaac 900 aecectgagg actcggaccc tgaccacttt gacacagcca ttctgtttac ccgtcaggac 960 ctgtgtggag tctccacttg cgacacgctg ggtatggctg atgtgggcac cgtctgtgac 1020 ccggctcgga gctgtgccat tgtggaggat gatgggctcc agtcagcctt cactgctgct 1080 catgaactgg gtcatgtctt caacatgctc catgacaact ccaagccatg catcagtttg 1140 aatgggeett tgagcacctc tcgccatgtc atggcccctg tgatggçtca tgtggatcct 1200 gaggagccct ggtccccctg cagtgcccgc ttcatcaotg acttcctgga caatggctat 1260 gggeaetgtc tcttagacaa aocagagget ccattgcatc tgcctgtgac tttccctggc 1320 aaggaotatg atgctgaccg ccagbgeeag ctgacetteg ggcccgactc aegccattgt 1380 ccacagctgc cgccgcectg tgetgccctc tggtgctctg gccacctcaa tggccatgcc 1440 atgtgccaga ceaaacactc gccctgggee gatggeacac ectgcgggcc cgcaeaggcc 1500 tgcatgggtg gtogctgcct ccacatggae eagcteeagg acttcaatat tccacaggct 1560 ggtggctggg gtccttgggg aceatggggt gmetgctcte ggacetgtgg gggtggtgtc 1620 eagttetcet cccgagactg cacgaggeet gtcccccgga atggtggcaa gtactgtgag 1680 ggccgccgta cccgcttccg ctcetgcaao aotgaggaot gcccaaotgg ctcagccotg 1740 accttccgcg aggagcagtg tgctgcctac aaccacegea ccgacctctt caagagctte 1800 ccagggecca tggactgggt tectcgctac acaggcgtgg ccccccagga ccagtgcaaa 1860 ctcacctgoc aggeecagge actgggctac taotatgtge tggagesaog ggtggtagat 1920 gggaacccct gttccccgg» cagctcctcg gtctgtgtcc agggecgatg catccatgct 1980 ggctgtgatc gcatcattgg ctccaagaag aagtttgaca agtgcatggt gtgcggaggg 2040 gacggttctg gttgcagcaa gcagtcaggc tccttcagga aattcaggta cggatacaac 2100 aatgtggtca ctatccccgc gggggccacc cacattcttg tccggcagca gggaaaccct 2160 ggccaccgga gcatctactt ggccctgaag ctgccagatg gctcctatgc cctcaatggt 2220 gaatacacgc tgatgccctc ccccacagat gtggtactgc ctggggcagt eagettgcgc 2280 tacagcgggg ccactgcagc ctcagagaca ctgtcaggcc atgggccact. ggcccagcet 2340 ttgacactgc aagtcctagt ggctggcaac ccceaggaca cacgcctccg atacagcttc 2400 ttcgtgcccc ggccgacccc ttcaacgcca cgccccactc cccaggactg gctgcaccga 2460 agagcacaga tfcctggagat cetteggcgg cgcccctggg cgggcaggaa ataa 2514

<210> 135 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ale Ale Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ale Met Thr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vsl 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Vai Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Asp Leu Leu His Lys Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Gly 115 120 125

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Gin Ser Vai 130 135 140

Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ser Vai Thr 145 150 155 160

Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Lys Vai Asp Trp 165 170 175

Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Vai Met Arg Vai Gly 180 185 190

Thr Gly Gly Thr Vai Gly Ser Lys Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe 195 200 205

Ser Vai Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Ile Ile Lys Asn Ile 210 215 220

Gin Glu Glu Asp Glu Thr Asp Tyr His Cys Gly Ala Asp His Gly Ser 225 230 235 240

Gly Ser Asn Phe Vai Tyr Vai Phe Gly Ser Gly Thr Lys Vai Thr Vai 245 250 255

Leu

<210> 136 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 136

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Tbr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Xle Ser Phe Asp Gly Thr Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Trp Ser Tyr Ala Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Met 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 115 120 125

Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 130 135 140

Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 145 150 155 160

Arg Pro Ser Gin Gly lie Gly Lys Tyr Ser Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 165 170 175

Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Pro lie Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Gin 180 185 190

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Asp Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe 195 200 205

Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220

Cys Leu Gin Arg Asn Thr Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 225 230 235 240

Val Glu lie Lys

<210> 137 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Leu Thr Glu Tyr 20 25 30

Pro lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45

Gly Gly Phe Asp Leu Glu Asn Gly Val Thr Lys Ala Ala Pro Arg Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Sec Val Tyr 65 70 75 90

Met Glu Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Gly Pro Gly Tyr Gly Ala Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser Trp 100 105 110

Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser 115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Thr Ser Tyr 130 135 140

Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr Ala 145 150 155 160

Ser He Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Glu Asp Lys Tyr Ala Cys Trp 165 170 175

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr His Asp 180 185 190

Tyr Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 195 200 205

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Gly Gly Asp Glu 210 215 220

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp Asp Gin Val 225 230 235 240

Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250

<210> 138 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> ligante sintético <400> 138

Ser Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 15 10 15

Ser Ser Gly Thr 20

<210> 139 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 139 ttatcctcga gcggtaccca ggtgcagctg caggagtcsg 40 <210> 140

<211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 140 ttatcctcga gcggtaccca ggtacagctg cagcagtca 39

<210> 141 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 141 ttatcctcga gcggtaccca ggtgcagcta cagcagtggg 40

<210> 142 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 142 ttatcctcga gcggtaccga ggtgcagctg ktggagwcy 39

<210> 143 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 143 ttatcctcga gcggtaccca ggtccagctk gtrcagtctg g 41

<210> 144 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 144 ttatcctcga gcggtaccca grtcaccttg aaggagtctg 40

<210> 145 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 145 ttatcctcga gcggtaccca ggtgcagctg gtgsartctg g 41

<210> 146 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 146 gattggtttg ccgctagctg aggagacrgt gaccagggtg 40

<210> 147 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 147 gattggtttg ccgctagctg aggagacggt gaccagggtt 40

<210> 148 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 148 gattggtttg ccgctagctg aagagacggt gaccattgt 39

<210> 149 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 149 gattggtttg ccgctagctg aggagacggt gaccgtggtc c 41

<210> 150 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 150 agcaagcggc gcgcatgccg acatccrgdt gacccagtct cc 42

<210> 151 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 151 agcaagcggc gcgcatgccg aaattgtrwt gacrcagtct cc 42

<210> 152 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 152 agcaagcggc gcgcatgccg atattgtgmt gacbcagwct cc 42

<210> 153 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 153 agcaagcggc gcgcatgccg aaacgacact cacgcagtct c 41

<210> 154 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 154 gaagttatgg tcgaccctcc ggatttgatt tccaccttgg tcc 43

<210> 155 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 155 gaagttatgg tcgaccctcc ggatttgatc tccascttgg tcc 43 <210> 156 <211> 43

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 156 gaagttatgg tcgaccctcc ggatttgata tccactttgg tcc 43

<210> 157 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 157 gaagttatgg tcgaccctcc ggatttaatc tccagtcgtg tcc 43

<210> 158 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 158 agcaagcggc gcgcatgccc agtctgtsbt gacgcagccg cc 42

<210> 159 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 159 agcaagcggc gcgcatgcct cctatgwgct gacwcagcca c 41

<210> 160 <211> 42 <212> ADN <213> Seguência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 160 agcaagcggc gcgcatgcct cctatgagct gayrcagcya cc 42

<210> 161 <211> 39 <212> ADN <213> Seguência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 161 agcaagcggc gcgcatgccc agcctgtgct gactcaryc 39

<210> 162 <211> 42 <212> ADN <213> Seguência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 162 agcaagcggc gcgcatgccc agdctgtggt gacycaggag cc 42

<210> 163 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 163 agcaagcggc gcgcatgccc agccwgkgct gactcagccm cc 42

<210> 164 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 164 agcaagcggc gcgcatgcct cctctgagct gastcaggas cc 42

<210> 165 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 Ο 0> 165 agcaagcggc gcgcatgccc agtctgyyct gaytcagcct 40

<210> 166 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 166 agcaagcggc gcgcatgcca attttatgct gactcagccc c 41

<210> 167 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 167 gaagttatgg tcgaccctcc ggataggacg gtsascttgg tcc 43

<210> 168 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 168 gaagttatgg tcgaccctcc ggagaggacg gtcagctggg tgc 43

<210> 169 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 169 cgctggattg ttattactcg cagcaagcgg cgcgcatgcc 40

<210> 170 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 170 accgctcgag ccttcaccgg aacctggttt cccagaaccg ctggtcgacc ctcc 54

<210> 171 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 171 ggagggtcga ccagcggttc tgggaaacca ggttccggtg aaggctcgag cggta 55

<210> 172 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 172 ccaggcccag cagtgggttt gggattggtt tgccgcta 38

<210> 173 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 173 tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactc 39

<210> 174 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 174 tggtgatggt gagtactatc caggcccagc agtgggtttg 40

<210> 175 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 175 agcaagcggc gcgcatgccc aggtgcagct ggtgcagtct gg 42

<210> 176 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 176 agcaagcggc gcgcatgccc aggtcaactt aagggagtct gg 42

<210> 177 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 177 agcaagcggc gcgcatgccg aggtgcagct ggtggagtct gg 42 <210> 178 <211> 42

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 178 agcaagcggc gcgcatgccc aggtgcagct gcaggagtcg gg 42

<210> 179 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 179 agcaagcggc gcgcatgccg aggtgcagct gttgcagtct gc 42

<210> 180 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 180 agcaagcggc gcgcatgccc aggtacagct gcagcagtca gg 42

<210> 181 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 181 gaagttatgg tcgaccctcc ggatgaggag acggtgacca gggtgcc 47

<210> 182 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 182 gaagttatgg tcgaccctcc ggatgaagag acggtgacca ttgtccc 47

<210> 183 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 183 gaagttatgg tcgaccctcc ggatgaggag acggtgacca gggttcc 47

<210> 184 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 184 gaagttatgg tcgaccctcc ggatgaggag acggtgaccg tggtccc 47

<210> 185 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 185 ttatcctcga gcggtaccga catccagatg acccagtctc c 41

<210> 186 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 186 ttatcctcga gcggtaccga tgttgtgatg actcagtctc c 41

<210> 187 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 187 ttatcctcga gcggtaccga aattgtgttg acgcagtctc c 41

<210> 188 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 188 ttatcctcga gcggtaccga catcgtgatg acccagtctc c 41

<210> 189 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 189 ttatcctcga gcggtaccga aacgacactc acgcagtctc c 41

<210> 190 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 190 ttatcctcga gcggtaccga aattgtgctg actcagtctc c 41

<210> 191 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 191 gattggtttg ccgctagcac gtttgatttc caccttggtc cc 42

<210> 192 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 192 gattggtttg ccgctagcac gtttgatctc cagcttggtc cc 42

<210> 193 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 Ο 0> 193 gattggtttg ccgctagcac gtttgatatc cactttggtc cc 42

<210> 194 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 194 gattggtttg ccgctagcac gtttgatctc caccttggtc cc 42

<210> 195 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 195 gattggtttg ccgctagcac gtttaatctc cagtcgtgtc cc 42

<210> 196 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 196 ttatcctcga gcggtaccca gtctgtgttg acgcagccgc c 41

<210> 197 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 197 ttatcctcga gcggtaccca gtctgccctg actcagcctg c 41

<210> 198 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 198 ttatcctcga gcggtacctc ctatgtgctg actcagccac c 41

<210> 199 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 199 ttatcctcga gcggtacctc ttctgagctg actcaggacc c 41 <210> 200

<211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 200 ttatcctcga gcggtaccca cgttatactg actcaaccgc c 41

<210> 201 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 201 ttatcctcga gcggtaccca ggctgtgctc actcagccgt c 41

<210> 202 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 202 gattggtttg ccgctagcac ctaggacggt gaccttggtc cc 42

<210> 203 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 203 gattggtttg ccgctagcac ctaggacggt cagcttggtc cc 42

<210> 204 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 204 gattggtttg ccgctagcac ctaaaacggt gagctgggtc cc 42

<210> 205 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 205 cgctggattg ttattactcg cagcaagcgg cgcgcatgcc 40 <210> 206

<211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 206 accgctcgag ccttcaccgg aacctggttt cccagaaccg ctggtcgacc ctcc 54

<210> 207 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 207 ggagggtcga ccagcggttc tgggaaacca ggttccggtg aaggctcgag cggta 55

<210> 208 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 208 ccaggcccag cagtgggttt gggattggtt tgccgcta 38

<210> 209 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 209 tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactc 39

<210> 210 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 210 tggtgatggt gagtactatc caggcccagc agtgggtttg 40

<210> 211 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 211 tggctggaat tcacaaagat tgttgga 27

<210> 212 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4Ο0> 212 gtcgacggat ccttaagtgt gtgatcccac 30

<210> 213 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 213 aattcaacgc tgccaccaca ctcaagaact tttgcaagtg gcagcaccaa cacaactaac 60 tgca 64

<210> 214 <211> 56 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <400> 214 gttagttgtg ttggtgctgc cacttgcaaa agttcttgag tgtggtggca gcgttg 56

<210> 215 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <4Ο0> 215 atccatggtc acaaagattg ttggaacc 28

<210> 216 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 216 atctcgagtt aagtgtgtga tcccacttta ttg 33

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, capazes de reconhecer e ligar-se a um epítopo compreendido na região do aa. 732 ao aa. 874 da SEQ ID NO 2 de ADAMTS-5.

2. 0 anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 que compreendem pelo menos uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89 e 92.

3. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 2 que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 e 91.

4. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 3 que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 e 90.

5. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 que compreendem pelo menos uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 e 59.

6. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 5 que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 e 58.

7. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 6 que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de região de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 e 57.

8. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 e 90 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 e 91 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRH3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 62, 65, 68, 71,74, 77, 80, 83, 86, 89 e 92.

9. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 8 que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL1) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51,54 e 57 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL2) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 e 58 e uma sequência de aminoácidos de regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (CDRL3) tendo pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID NO: 29, 32, 35, 38, 41,44, 47, 50, 53, 56 e 59.

10. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 8, que compreendem uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 60, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 61 e uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 62.

11. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 10, que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRL1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 27, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 28 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 29.

12. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 8, que compreendem uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 81, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 82 e uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 83.

13. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 12, que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRL1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 48, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 49 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 50.

14. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 8, que compreendem uma sequência de aminoácidos CDRH1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 87, uma sequência de aminoácidos CDRH2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 88 e uma sequência de aminoácidos CDRH3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 89.

15. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 14, que compreendem adicionalmente uma sequência de aminoácidos CDRL1 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 54, uma sequência de aminoácidos CDRL2 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 55 e uma sequência de aminoácidos CDRL3 tendo pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO 56.

16. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 são também selecionados a partir do grupo que consiste num anticorpo que compreende: a) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 69, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 70, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 71, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 36, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 37, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 38; b) uma CDRHl que consiste na SEQ ID NO 72, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 73, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 74, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 39, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 40, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 41; c) uma CDRHl que consiste na SEQ ID NO 75, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 76, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 77, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 42, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 43, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 44; d) uma CDRHl que consiste na SEQ ID NO 78, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 79, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 80, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 45, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 46, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 47; e) uma CDRHl que consiste na SEQ ID NO 81, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 82, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 83, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 48, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 49, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 50; f) uma CDRHl que consiste na SEQ ID NO 84, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 85, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 86, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 51, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 52, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 53; g) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 87, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 88, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 89, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 54, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 55, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 5 6; h) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 90, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 91, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 92, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 57, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 58, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 59.

17. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 são também selecionados a partir do grupo que consiste num anticorpo que compreende: a) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 60, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 61, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 62, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 27, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 28, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 2 9; b) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 63, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 64, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 65, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 30, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 31, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 32; c) uma CDRH1 que consiste na SEQ ID NO 66, uma CDRH2 que consiste na SEQ ID NO 67, uma CDRH3 que consiste na SEQ ID NO 68, uma CDRL1 que consiste na SEQ ID NO 33, uma CDRL2 que consiste na SEQ ID NO 34, uma CDRL3 que consiste na SEQ ID NO 35.

18. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 sendo um anticorpo quimérico ou humanizado, ou desimunizado ou completamente humano.

19. 0 anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 17 sendo um anticorpo quimérico ou humanizado, ou desimunizado.

20. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento e/ou prevenção de uma condição caracterizada por degradação da cartilagem.

21. O anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento e/ou prevenção humana de osteoartrite ou artrite reumatoide.

22. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo, conforme definido nas reivindicações 1 a 21.

23. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com a reivindicação 22 compreendendo pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 99 até à SEQ ID NO 120.

24. Um vetor de expressão que codifica o anticorpo monoclonal neutralizante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

25. Uma célula hospedeira isolada que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22 ou 23.

26. A célula hospedeira isolada de acordo com a reivindicação 25 que produz o anticorpo monoclonal neutralizante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

27. Um método para a produção do anticorpo monoclonal neutralizante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 que compreende cultivar a célula que produz o anticorpo monoclonal neutralizante de acordo com a reivindicação 25 e recuperar o anticorpo monoclonal neutralizante a partir da cultura celular.

28. Uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo monoclonal neutralizante, fragmentos de ligação a antigénio recombinantes ou sintéticos do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

29. A composição de acordo com a reivindicação 28 para utilização na administração intra-articular.