TWI579302B - 抗－ａｄａｍｔｓ－５抗體、衍生物及其用途 - Google Patents

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Description

抗-ADAMTS-5抗體、衍生物及其用途
本發明係關於適用於治療與軟骨退化相關之病狀的抗-ADAMTS-5抗體。
特定而言，在骨關節炎及其他形式之關節炎性皮疹中觀測到此退化。
骨關節炎(OA)為一組重疊獨特疾病，該等疾病可具有不同病因但具有類似生物學、形態及臨床結果。疾病過程不僅影響關節軟骨，而且涉及整個關節，包括軟骨下骨、韌帶、囊、滑膜及關節周圍肌肉。最終，關節軟骨退化並伴隨關節表面之纖維性顫動、裂縫、潰瘍及整個厚度損失。此病狀之特徵在於滑動關節內與骨肥大(骨贅及軟骨下骨硬化)及囊增厚相關聯之關節軟骨損失之病灶區域。其可解釋為滑動關節對損傷之反應。此現象可發生在任何關節中，但最常見於手、脊椎、膝、腳及髖之所選關節中。此病理學變化嚴重時導致放射學變化(關節空間損失及骨贅)，其已用於流行病學研究來評估OA在不同關節位點之流行性。目前未知基於OA發作之分子學及細胞學機制；假定異常負載以及創傷可能具有作用，但似乎確定亦涉及遺傳學及遺傳因素。炎症存在時僅繼發於初級事件之後。
OA為最常見形式之關節炎。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計世界範圍內60歲以上有9.6%之男性及18%之女性 具有症狀性OA，將OA分類為導致女性失能之第4病因及導致男性失能之第8病因。認為膝部OA之失能風險等同於心臟病。
類風濕性關節炎(RA)(另一種常見形式之關節炎)為一種慢性發炎性疾病，其特徵在於關節滑膜炎，導致軟骨退化、骨蝕及疼痛，從而導致嚴重失能及過早死亡。
儘管OA及RA可由不同病因及進程根據不同路徑觸發，但其共有由軟骨基質合成與分解失衡組成之潛在過程，導致關節軟骨破壞，此又導致關節運動受限、關節失穩、疼痛及慢性失能。此外，儘管大量患者受到OA及RA影響，但關於其病因、發病機理及進程則相對知之甚少。即使更為嚴重，但對於其治療仍存在極少疾病改善劑抗風濕性藥物(DMARD)，且其主要侷限於RA。
對於OA而言，在不存在治癒之情形下，治療僅可為舒緩性的，侷限於使用COX-2選擇性抑制劑(諸如塞內昔布(celecoxib))及傳統非類固醇消炎藥物(NSAID)(諸如萘普生(naproxen)及雙氯芬酸(diclofenac))或甚至更早用於疼痛控制之藥物(諸如乙醯胺苯酚(acetaminophen))。另一類藥物(包括諸如軟骨素及硫酸葡糖胺之化合物)亦作為OA之治療選擇存在，但許多醫師對於其功效仍不確信。
關於RA，在過去十年間，最佳使用DMARD(特定而言為甲胺喋呤(methotrexate))及可用新生物學藥劑(典型地受到NSAID及/或皮質類固醇支持以提供疼痛緩解以及控制某種程度之炎症)已顯著增強其管理之成功性。然而，傳統DMARD之作用及毒性發作慢，此要求頻繁監測。此外，NSAID使用在考慮經典NSAID藥物時因胃腸副作用而受到影響，且在考慮選擇性COX-2抑制劑時因心血管及腎臟副作用而受到影響。
因此，對於防止軟骨退化之新型治療劑的研究受到極大關注，此係因為OA及RA影響全世界數以百萬計之人群，且預期其發生率將 隨平均人群年齡之增加而上升。
OA及RA中發生之軟骨退化係其結構組分發生酶促裂解的結果。軟骨主要由軟骨細胞與由蛋白聚糖(主要為聚集蛋白聚糖)、膠原蛋白及水組成之細胞外基質(ECM)構成。在基質內，聚集蛋白聚糖、玻尿酸(HA)與II型膠原蛋白間之相互作用為軟骨提供用於重量承載及關節運動功能之獨特可壓縮性及彈性、生物機械特性。聚集蛋白聚糖由三個球狀區組成：接近蛋白N-末端之G1與G2及位於C-末端之G3。G1與G2區由短的球間結構域(IGD)分開，而G2與G3區由長的葡糖胺聚糖(GAG)連接區分開。G1結構域經由輔助蛋白構成聚集蛋白聚糖與HA之結合區。聚集蛋白聚糖之GAG連接區提供結合水所需之高陰離子電荷密度且對軟骨賦予確保其功能所必需之獨特滲透特性。因此，對於導致聚集蛋白聚糖裂解之生物化學機制的理解可能有助於研發適於阻斷或控制OA疾病之治療劑。關節炎中之軟骨完整性損失與由於蛋白之蛋白水解裂解引起之聚集蛋白聚糖完整性受損相關聯。聚集蛋白聚糖酶(主要為聚集蛋白聚糖酶-2(亦稱作ADAMTS-5)及聚集蛋白聚糖酶-1(亦稱作ADAMTS-4))近來經鑑別為用於軟骨退化之重要酶。特定而言，公開文獻Glasson等人，2005.Nature.434：644-648及Stanton等人，2005.Nature.434：648-652證實ADAMTS-5在與兩種小鼠OA及RA模型相關聯之病理學關節變化中具有重要作用。ADAMTS-4及-5為麩胺醯基內肽酶且在五個特定位點裂解聚集蛋白聚糖：Glu373-Ala374(球間結構域-IGD)、Glu1545-Gly1546、Glu1714-Gly1715、Glu1819-Ala1820及Glu1919-Leu1920鍵(人類序列)，導致軟骨破壞。
人類ADAMTS-4(圖1，SEQ.ID NO：1)及ADAMTS-5(圖1，SEQ.ID NO：2)為由細胞分泌至細胞外空間中之多結構域金屬蛋白酶。兩種酶均具有由信號序列(SS)、前結構域(Pro)、催化性金屬蛋白酶結構域(Cat)、去整合素(Dis)結構域、血小板反應蛋白I型(TS)結構域、 半胱胺酸-富集(CysR)結構域及間隔子(Sp)結構域組成之類似結構域排列。另外，ADAMTS-5在間隔子結構域之後含有額外TS結構域。催化性結構域以外之所有上文提及之結構域區在識別及加工天然蛋白受質中均發揮重要作用，稱作「外結合位點(exosite)」。
舉例而言，證實聚集蛋白聚糖酶之Sp及CysR結構域含有調節蛋白酶與其受質之親和力的GAG-結合基元(Kashiwagi等人，2004.J Biol Chem.279：10109-10119)；(Gendron等人，2007.J Biol Chem.282：18294-18306)；(Flannery,Curr.11：614-619)；(Zeng等人，2006.Biochim Biophys Acta.1760：517-524)。
因此，對於研發用於治療OA及/或RA之ADAMTS-4及-5抑制劑的關注日益增加。已研發多種金屬蛋白酶抑制劑，且若干種已在癌症(Zucker等人，2000.Oncogene.19：6642-6650)及類風濕性關節炎(Milner及Cawston，2005.Curr Drug Targets Inflamm Allergy.4：363-375)患者中臨床測試，但其未展示功效而展現副作用，諸如肌肉骨骼痛及輕度血小板減少(Zucker等人，2000.Oncogene.19：6642-6650)。認為該等失敗係歸因於缺乏抑制劑選擇性及對生物學上重要之脫靶(off-target)金屬蛋白酶之抑制作用及其他作用。因此，選擇性為非毒性治療性抑制劑之先決條件。增加針對特異性金屬蛋白酶之選擇性的一種方式為產生異位或外結合位點結合。與酶外結合位點結合之抑制劑可阻斷與天然ECM受質之相互作用且可為活性位點定向抑制劑之有力替代，因為其可具高度特異性且有效阻斷僅目標受質之水解，由此使得活體內副作用最小化(Troeberg等人，2008.Faseb J.22：3515-3524)。
申請案WO 2011/002968揭示一種能夠與人類ADAMTS-5之催化結構域及去整合素結構域兩者結合之抗體。文獻WO 01/11074及WO 00/53774揭示一種ADAMTS-5蛋白且一般係指針對該蛋白之抗體。
在本發明中，作者分離識別且結合ADAMTS-5之間隔子結構域中所包含之抗原決定基的抗體(稱作抗體抗-Sp_ADAMTS-5)。該等抗體適用於人類之治療性應用。該等抗體典型地為完全人類或嵌合或經人類化以最小化在投予患者時針對抗體之免疫反應的風險。如本文中所述，其他抗原-結合分子(諸如抗原-結合抗體片段、抗體衍生物及多特異性分子)可經設計或衍生自該等抗體。本發明之抗體對軟骨基質退化展現抑制作用，其控制軟骨基質退化酶產生且其改良軟骨基質合成，由此治療及/或預防軟骨退化。因此，該抗體可用於治療及/或預防與軟骨退化相關聯之病狀。該病狀包括骨關節炎(OA)、類風濕性關節炎(RA)、痛風、牛皮癬性關節炎、全身性紅斑狼瘡、敗血性關節炎、風濕性多肌痛、僵直性脊椎炎、假性痛風、多肌炎、肌肉纖維疼痛或萊姆病(lyme disease)。
特定而言，本發明之抗體可用於治療及/或預防分類為早期至晚期OA及RA之疾病。自OA初期至晚期之每一階段係根據OARSI及Mankin分類法來分類。
在兩種病理中，分類為任何上文提及之級別或計分之疾病均伴有軟骨退化作為疾病病狀。本發明之抗體可有效用於治療或預防分類為OA及RA初期至晚期之疾病。
該等抗體之抗體-結合片段以及包含該等抗原結合片段之分子(包括工程改造之抗體片段、抗體衍生物、雙特異性抗體及其他多特異性分子)亦為本發明之目標。
包含本發明抗體之醫藥組成物及套組或其他物件亦為本發明之部分。
因此，能夠識別及結合ADAMTS-5之SEQ ID No.2之aa.732至aa.874區中所包含之抗原決定基的抗體、其重組或合成抗原結合片段為 本發明之目標。該抗原決定基較佳包含於SEQ ID No.2之aa.732至aa 745中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 746至aa 763中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 764至aa 779中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 780至aa 795中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 796至aa 811中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 812至aa 827中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 828至aa 843中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 844至aa 859中，較佳包含於SEQ ID No.2之aa 860至aa 874中。該抗原決定基更佳包含於SEQ ID No.2之aa.757至aa 771區中。
如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳包含至少一個與選自由SEQ.ID NO：62、65、68、71、74、77、80、83、86、89及92組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH3)胺基酸序列。
如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳進一步包含與選自由SEQ ID No.61、64、67、70、73、76、79、82、85、88及91組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH2)胺基酸序列。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳進一步包含與選自由SEQ ID No.60、63、66、69、72、75、78、81、84、87及90組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH1)胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段進一步包含至少一個與選自由SEQ.IDNO：29、32、35、38、41、44、47、50、53、56及59組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL3)胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，本發明之抗體、其重組或合成抗原結 合片段進一步包含一個與選自由28、31、34、37、40、43、46、49、52、55及58組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL2)胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段進一步包含一個與選自由27、30、33、36、39、42、45、48、51、54及57組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL1)胺基酸序列。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳包含一與選自由SEQ.ID NO：60、63、66、69、72、75、78、81、84、87及90組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH1)胺基酸序列及一與選自由SEQ.ID NO：61、64、67、70、73、76、79、82、85、88及91組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH2)胺基酸序列及一與選自由SEQ.ID NO：62、65、68、71、74、77、80、83、86、89及92組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之重鏈互補決定區(CDRH3)胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段進一步包含一與選自由SEQ.ID NO：27、30、33、36、39、42、45、48、51、54及57組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL1)胺基酸序列及一與選自由SEQ.ID NO：28、31、34、37、40、43、46、49、52、55及58組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL2)胺基酸序列及一與選自由SEQ.ID NO：29、32、35、38、41、44、47、50、53、56及59組成之群之胺基酸序列具有至少80%一致性之輕鏈互補決定區(CDRL3)胺基酸序列。
在又一較佳具體實例中，如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段包含與SEQ ID No.60具有至少80%一致性之CDRH1胺基酸 序列、與SEQ ID No.61具有至少80%一致性之CDRH2胺基酸序列、與SEQ ID No.62具有至少80%一致性之CDRH3胺基酸序列。
在又一較佳具體實例中，本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段進一步包含與SEQ ID No.27具有至少80%一致性之CDRL1胺基酸序列、與SEQ ID No.28具有至少80%一致性之CDRL2胺基酸序列及與SEQ ID No.29具有至少80%一致性之CDRL3胺基酸序列。
在又一較佳具體實例中，如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段包含與SEQ ID No.81具有至少80%一致性之CDRH1胺基酸序列、與SEQ ID No.82具有至少80%一致性之CDRH2胺基酸序列及與SEQ ID No.83具有至少80%一致性之CDRH3胺基酸序列。在又一較佳具體實例中，本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段進一步包含與SEQ ID No.48具有至少80%一致性之CDRL1胺基酸序列、與SEQ ID No.49具有至少80%一致性之CDRL2胺基酸序列及與SEQ ID No.50具有至少80%一致性之CDRL3胺基酸序列。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳包含與SEQ ID No.87具有至少80%一致性之CDRH1胺基酸序列、與SEQ ID No.88具有至少80%一致性之CDRH2胺基酸序列及與SEQ ID No.89具有至少80%一致性之CDRH3胺基酸序列。該抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳進一步包含與SEQ ID No.54具有至少80%一致性之CDRL1胺基酸序列、與SEQ ID No.55具有至少80%一致性之CDRL2胺基酸序列及與SEQ ID No.56具有至少80%一致性之CDRL3胺基酸序列。
在本發明中，「至少80%一致性」意謂一致性可為與參考序列至少80%或至少85%或90%或95%或100%之序列一致性。
如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳為單株抗體或嵌合或人類化、或去免疫化或完全人類抗體。
如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段用於醫學用途為本發明之另一目標。較佳用於治療及/或預防與軟骨退化相關聯之病狀，諸如骨關節炎及/或類風濕性關節炎。如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳可用於治療由多配體蛋白聚糖(Syndecan)-4介導之病理學反應，特定而言為由多配體蛋白聚糖-4介導之軟骨細胞病理學反應。
一種編碼如上文定義之抗體、其重組或合成抗原結合片段之核酸分子為本發明之另一目標。編碼本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段之核酸分子較佳包含至少一個選自由SEQ ID No.99至SEQ ID No.120組成之群之核酸序列。該核酸較佳包含至少一個以下序列：SEQ ID NO.：99、100、113、114、117及118。
一種編碼本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段之表現載體為本發明之另一目標。
一種包含如上文所述之核酸之宿主細胞為本發明之另一目標。該宿主細胞較佳產生本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段。
一種產生本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段之方法為本發明之另一目標，其包含培養產生如上文所述之抗體之細胞及自細胞培養物回收抗體。
一種包含如上文所述之至少一種抗體、其重組或合成抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組成物為本發明之另一目標。該組成物包含有效量之抗體、其重組或合成抗原結合片段。醫藥組成物在此領域中為習知的且可由熟習此項技術者僅基於一般常識來製造。包含與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑及/或媒劑混合之抗體及/或其片段及/或重組衍生物及/或結合物之醫藥組成物包括於本發明之範疇中。
在一較佳具體實例中，根據本發明之組成物係用於關節內投藥。
一種治療及/或預防與軟骨退化相關聯之病狀的方法亦為本發明之目標，該病狀諸如骨關節炎、類風濕性關節炎及其他形式之關節炎性皮疹，該方法包含投予治療有效量之如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段。一種治療及/或預防關節破壞、治療及/或預防自體免疫及/或發炎性疾病之方法亦為本發明之目標，其包含投予治療有效量之如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段。
一種減少及/或抑制ADAMTS-5之方法為本發明之目標，其包含投予有效量之如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段。
在本發明中，可藉由使CDR序列中之一或多個胺基酸突變而產生所揭示CDR之突變體。已知適當定位於CDR中之單一胺基酸取代可足以改良親和性。研究者已使用定點突變誘發來使某些免疫球蛋白產物之親和力增加約10倍。此藉由使CDR突變來增加或減少(亦即，調節)抗體親和力之方法為常識(例如，參見Paul, W. E.,1993)。因此，藉由本發明CDR之胺基酸取代、缺失或添加來增加或減少(亦即，調節)結合親和力或特異性亦在本發明之範疇內。
為簡明起見，根據本發明之較佳抗體將由如表III中所示之名稱CRB0017(包含SEQ ID No.3及SEQ ID No.4)、CRB0102(包含SEQ ID No.17及SEQ ID No.18)及CRB0123(包含SEQ ID No.21及SEQ ID No.22)來鑑別。儘管本發明關注於該等抗體作為本發明之例示，但一般熟習此項技術者將瞭解，一旦給定本發明揭示內容，在本發明之範疇內可產生及使用其他類似抗體及其抗體片段以及該等類似抗體之抗體片段。該等類似抗體可由熟習此項技術者以合理實驗量產生。
抗體又較佳為scFv、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片段、多聚抗體、肽或含有抗原決定基結合區之蛋白水解片段。scFv片段較佳包含選自SEQ ID No.125至132及SEQ ID No.135、136、137之群之序列。
一種編碼本發明之抗體或其功能衍生物、或與以上核酸雜交或由其退化序列組成之核酸為本發明之另一目標。
單株抗體之製備方法在熟習此項技術者之技術範圍內且包含根據標準程序培養宿主細胞及分離抗體。
只要涉及本發明之工業態樣，本文揭示之抗體將如在此技術領域中正常進行般適當調配於醫藥組成物中。
本發明之抗體可包含至少一個如上文定義之CDRH，其含有一或多個不超過4個胺基酸、較佳不超過2個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入。本發明之抗體可進一步包含至少一個如上文定義之CDRL，其含有一或多個不超過4個胺基酸、較佳不超過2個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入。
本發明之抗體競爭結合至ADAMTS-5。用於治療或預防與軟骨退化相關聯之病狀的方法包含向有需要之患者投予有效量之至少一種如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段。在一些態樣中，本發明包含一種抑制個體體內之ADAMTS-5與聚集蛋白聚糖結合之方法，其包含投予有效量之至少一種如上文所述之抗體、其重組或合成抗原結合片段。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段選擇性地結合至ADAMTS-5之間隔子結構域，較佳Kd□2nM。
在一些態樣中，本發明包含一種治療或預防個體之與軟骨退化相關聯之病狀的方法，該方法包含與特定阻斷疼痛之藥劑同時或相繼向有需要之個體投予有效量之至少一種本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段係結合至ADAMTS-5且減少ADAMTS-5結合至聚集蛋白聚糖之可能性的中和抗體(亦即，減少或消除相關抗原之生物活性的抗體)。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳在SEQ.ID NO：2之殘基732至874內之一位置處結合至ADAMTS-5。在一些具體實例中，本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段在結合至ADAMTS-5時係定位於距ADAMTS-5之以下殘基中至少一者8埃或8埃以下處：T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873或T874。
在一些具體實例中，本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段阻斷抗體與ADAMTS-5在ADAMTS-5殘基之8埃以內結合。在一些具體實例中，ADAMTS-5之殘基係選自以下ADAMTS-5殘基之至少一者：T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、 N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873或T874。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳在與聚集蛋白聚糖結合至ADAMTS-5之位置重疊之位置處結合至ADAMTS-5。
本發明之抗體、其重組或合成抗原結合片段較佳減少聚集蛋白聚糖在ADAMTS-5上之以下殘基中至少一者之8埃以內結合至ADAMTS-5的可能性：T732、K733、I734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、I786、N787、G788、K789、Y790、M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、I829、L830、I831、V832、Q833、I834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、 S872、H873或T874。
本發明提供包含治療有效量之如本文所揭示之抗體、維持約4.5至約6.5範圍內的pH之緩衝劑及視情況選用之界面活性劑之調配物。
該等調配物典型地以本發明之如本文揭示之抗體、其重組或合成抗原結合片段作為活性主要成分，其濃度為約0.1mg/ml至約100mg/ml。在某些具體實例中，抗體、其重組或合成抗原結合片段之濃度為約0.1mg/ml至1mg/ml、較佳為1mg/ml至10mg/ml，較佳為10至100mg/ml。
為達成本文之目的，「醫藥組成物」為適應且適合投予哺乳動物(尤其為人類)之醫藥組成物。因此，該組成物可用於治療哺乳動物之疾病或病症。此外，組成物中之抗體已經受一或多個純化或分離步驟以使得可自其分離可能干擾其治療用途之污染物。該醫藥組成物一般包含治療性蛋白及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。該組成物通常無菌且可經凍乾。下文更詳細描述醫藥學製劑。
抗體之治療性調配物可藉由將具有所需純度之抗體與可選生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編，1980)，呈凍乾調配物或水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用劑量及濃度下對接受者無毒，且可包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、肽、蛋白質、親水性聚合物、螯合劑(諸如EDTA)、糖、成鹽相對離子(諸如鈉)、金屬錯合物(例如，Zn-蛋白錯合物)及/或非離子性界面活性劑(諸如TWEEN®、PLURONICS®或聚乙二醇(PEG))。
活性成分亦可截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠態藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.編，1980中。欲用於活體內投藥之調配物必須為無菌的。此易於藉由經無菌過濾膜過濾來達成。
在另一具體實例中，為預防或治療疾病，本發明之抗-Sp-ADAMTS-5抗體之適當劑量將取決於待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及過程、投予抗體係用於預防或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。抗體適當地一次性或經一系列治療投予至患者。視疾病類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg之抗體或其片段係用於投予患者之初始候選劑量，而無論例如藉由一或多次獨立投藥或藉由連續輸液。對於經數天或更長時間重複投藥，視病狀而定，持續治療直至發生對疾病症狀之所需抑制作用。然而，其他劑量方案亦可適用。此療法之進程易於由習知技術及分析法來監測。
抗體組成物應以與良好醫學實踐一致之方式來調配、給藥及投予。本發明之抗體/衍生物可經任何適當途徑投予。此途徑包括(但不限於)腹膜內、肌肉內、靜脈內、皮下、關節內、氣管內、經口、經腸、非經腸、鼻內或真皮投藥。一種較佳投藥模式為關節內途徑。本文中之考慮因素包括經治療之特定病症、經治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。待投予抗體之「治療有效量」將由該等考慮因素來控制，且係預防、緩解或治療疾病或病症所必需之最小量。抗體不需要、但視情況與目前用於預防或治療所論述病症之一或多種藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之抗體之量、病症或治療類型及上文論述之其他因素。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需之抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)及由抗體片段形成之多特異性抗體。
作為參考抗體之「與相同抗原決定基結合之抗體」係指在競爭分析法中使參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上之抗體，且相反，參考抗體在競爭分析法中使該抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上。本文中提供一種例示性競爭分析法。
術語「嵌合」抗體係指其中一部分重及/或輕鏈源自特定來源或物種，而剩餘重及/或輕鏈源自不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。主要存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且若干該等類別可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱作[α]、[δ]、[ε]、[γ]及[μ]。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有至少一部分恆定區之C-末端區。該術語包括原生序列Fc區及變體Fc區。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱作EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR一般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般出現在VH(或VL)之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。術語「全長抗體」、「完整抗體」及「 完全抗體」在本文中可互換使用以指具有與原生抗體結構實質上類似之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中引入有外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括一級轉型細胞及源於其之子代，而與繼代數目無關。子代之核酸含量可不與母細胞完全相同，而可含有突變。本文中包括具有如在初始轉型細胞中篩檢或選擇之相同功能或生物活性之突變子代。「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞產生或源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體胺基酸序列的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」係表示在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。人類免疫球蛋白VL或VH序列一般選自可變結構域序列亞群。序列亞群一般為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案91-3242,Bethesda MD(1991)，第1至3卷中之亞群。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些具體實例中，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個且典型地兩個可變結構域，其中所有或實質上所有HVR(例如，CDR)對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含至少一部分源自人類抗體之抗體恆定區。「人類化形式」之抗體(例如，非人類抗體)係指經受人類化之抗體。
「去免疫化」抗體係基於破壞HLA結合而使免疫原性減小之抗體，此係對於T細胞刺激之潛在要求。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中序列高變及/或形成結構確定環(「高變環」)之每一區。原生四鏈抗體一般包含六個HVR；三個位於VH中(HI、H2、H3)且三個位於VL中(LI、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或涉及於抗原識別中。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32(LI)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(HI)、53-55(H2)及96-101(H3)處(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917,1987)。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在LI之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、HI之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。除VH中之CDR1以外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於稱作縮略CDR或a-CDR之CDR區內。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在LI之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、HI之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633,2008)。除非另外指示，HVR殘基及可變結構域中之其他殘基(例如，FR殘基)在本文中根據Kabat等人來編號。
如本文所用之術語「單株抗體」係指由實質上均質性抗體群體獲得之抗體，亦即構成此群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，除了可能之變異體抗體，例如含有天然存在之突變或在製造單株抗體製劑期間產生，該等變異體一般少量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特 徵係由實質上均質性抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可由各種技術來製造，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，本文中描述該等方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法。
術語「藥品說明書」用於指常包括於治療產品之商業封裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或關於使用該等治療產品之警示的資訊。
關於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在對準序列且引入間隙(若必需)以達成最大序列一致性百分比且不考慮任何保守性取代作為序列一致性部分之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百分比。為達成確定胺基酸序列一致性百分比目的之對準可由此項技術中之各種方式來達成，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於對準序列之適當參數，包括在所比較序列之全長上達成最大對準所需之任何演算法。
術語「醫藥學調配物」係指製劑呈使得其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含對調配物將投予之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥學調配物中除活性成分以外對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指臨床干預以試圖改變所治療個體之自然過程，且可針對預防或在臨床病理學過程期間進行。所需之治療 效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理學結果、預防轉移、降低疾病進程速率、緩解或緩和疾病狀態及減輕或改良預後。在一些具體實例中，本發明之抗體係用於延遲疾病發展或減緩疾病進程。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重或輕鏈中牽涉於抗體與抗原結合之結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中每一結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR，例如參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co.，第91頁，2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用VH或VL結構域自結合抗原之抗體分離以分別篩檢互補VL或VH結構域之文庫(例如參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887,1993；Clarkson等人，Nature 352：624-628,1991)。
如本文所用之術語「載體」係指能夠傳送所連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其所引入之宿主細胞基因組中之載體。某些載體能夠導引其可操作性連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱作「表現載體」。
在另一態樣中，該抗體或其衍生物包含與選自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24之群之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。
在另一態樣中，該抗體或其衍生物包含與選自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23之群之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VK或VL)序列。
在某些具體實例中，與該SEQ ID No.具有至少80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列或VK/VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗-Sp-ADAMTS-5抗體保留結合至ADAMTS-5之間隔子結構域之能力。在某些具體實例中，在CDRH3之序列中(諸如在SEQ ID No.62)，總計1至4個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些具體實例中，在HVR外部之區中(亦即，在FR中)發生取代、插入或缺失。
本發明之抗體較佳為如表III中定義之抗體CRB0017、CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123、CRB0124。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其片段具有<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM或更小之解離常數(Kd)，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M。
在一具體實例中，如以下分析法所述，藉由以所關注抗體之Fab型式及其抗原進行之放射性標記抗原結合分析法(RIA)來量測Kd。藉由在滴定系列之未標記抗原存在下以最小濃度之(I)-標記抗原平衡Fab，隨後以經抗-Fab抗體塗佈之培養盤捕獲結合抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(例如參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。
現將參考以下圖式由非限制性實施例來描述本發明。
圖1. ADAMTS-4及ADAMTS-5圖示。兩種酶均為自細胞分泌至細胞外空間中之多結構域金屬蛋白酶。兩種酶均具有由信號序列(SS)、前結構域(Pro)、催化性金屬蛋白酶結構域(Cat)、去整合素(Dis)結構域、血小板反應蛋白I型(TS)結構域、半胱胺酸-富集(CysR)結構域及間隔子(Sp)結構域組成之類似結構域排列。另外，ADAMTS-5在間隔子結構域之後含有額外TS結構域。
圖2.在FPLC純化之後使用針對蛋白之FLAG標籤之抗體對ADAMTS-5 p75進行之西方墨點分析。以識別含有FLAG肽序列之融合蛋白之單株抗體探測西方墨點(Sigma Aldrich,Monoclonal ANTI-FLAG M2，稀釋度1：1000)。對於使用化學發光過氧化酶受質之偵測而言，採用抗小鼠IgG-過氧化酶(1：10,000)。TS5=ADAMTS-5轉染細胞；NT=非轉染細胞；M=模擬。
圖3.經分離抗-Sp_ADAMTS-5 scFvs與間隔子-GST及GST陰性對照物之ELISA反應性。以10μg/mL塗佈間隔子-GST及GST抗原。以50及/或5μg/mL使用抗-Sp_ADAMTS-5scFvs(資料未展示)。以條狀指示之SD展示在雙重複孔中進行之實驗在450nm下之平均吸光度。
圖4.夾層ELISA。與間隔子-GST及/或GST結合之經塗佈CRB0017_IgG4在30μg/mL溶液中之稀釋曲線。在抗兔IgG HRP(1：2000)後使用抗-GST(1：1000)作為二級抗體以供最終偵測。以條狀指示之SD展示在雙重複孔中進行之實驗在450nm下之平均吸光度。
圖5.使用Biacore X-100對結合間隔子-GST之CRB0017_IgG4在溶液中進行之動力學分析。將5610 RU之CRB0017_IgG4固定在CM5晶片上。使締合與解離分別進行180s及800s。下表中展示關於CRB0017_IgG4/間隔子-GST相互作用測定之動力學速率常數及親和力。
圖6.由CRB0017_IgG4對ADAMTS-5全長(TS5-FL)進行之免疫沈澱(IP)。以抗-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4抗體(在泳道1、2及3中分別為11、22及25μg)或以11μg無關抗體作為陰性對照物(泳道4)使0.1μg經透析/親和力純化之TS5-FL免疫沈澱。藉由以抗-FLAG抗體(1：1000)進行免疫墨點法來分析免疫沈澱物。對應於TS5-FL p75蛋白觀測經CRB0017_IgG4-免疫沈澱之約81kDa TS5-FL帶。經免疫沈澱之TS5-FL蛋白之分子質量略高於由其胺基酸組成所預測。此差異係歸因於Dis、CysR、Sp結構域之N-糖基化及C-末端結構域之O-糖基化。在該圖之左手側指示分子質量標記。
圖7.由CRB0017_IgG4對ADAMTS-4全長(TS4-FL)進行之IP。以抗-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4抗體(泳道1及2中分別為30及60μg)或以無關抗體(30μg)作為陰性對照物(泳道3)使0.2μg經透析/親和力純化之TS4-FL免疫沈澱(IP)。在泳道4中，負載經透析/親和力純化之TS4-FL作為陽性對照物。藉由以抗-FLAG抗體(1：1000)進行免疫墨點法來分析免疫沈澱物。對應於TS4-FL p68蛋白觀測經CRB0017_IgG4-免疫沈澱之約75kDa TS5-FL帶。經免疫沈澱之TS4-FL蛋白之分子質量略高於由其胺基酸組成所預測且此主要係歸因於蛋白之N-及O-糖基化。在該圖之左手側指示分子質量標記。
圖8.抗-Sp_ADAMTS-5 IgG4對IL-1α誘發之牛軟骨試管內蛋白水解之作用。圖表示在培育48h之後在不存在或存在CRB0017 IgG4情況下之IL-1α 5ng/ml活性(三個不同獨立實驗)。在每一實驗中使用人類原生IgG4(Serotec)作為陰性對照物。在每一實驗中使用合成ADAMTS-5抑制劑(Cpd 23)及天然ADAMTS-5抑制劑(TIMP-3)作為陽性對照物。結果表述為GAG釋放%，亦即以聚集蛋白聚糖片段形式自培養物中之軟骨釋放之葡糖胺聚糖(GAG)的定量；此方法量測細胞激素在刺激軟骨代謝中之效率。
圖9.評估HelixB-ADAMTS-5結合蛋白CRB0016_IgG4在骨關節炎STR/ort小鼠模型中之作用。在每一動物之兩膝中經關節內投予CRB0016_IgG4，一次在實驗開始時且再次在6週後，以每膝1,2及12μg之劑量。首次投藥三個月之後，CRB0016_IgG4未改善STR/ort小鼠菌株中之OA進程，如由組織病理學所評估。等級定義為穿過關節軟骨之病變深度。階段定義為關節隔室一側內軟骨累及之水平程度，而與潛在等級無關。總而言之，兩者構成骨關節炎進程之嚴重程度或病理學進展的指數，且實際上OARSI分值定義為等級×階段。細胞損失定義為在所考慮之關節隔室內，經歷細胞死亡之關節軟骨細胞的分數。GAG(葡糖胺聚糖)損失定義 為呈現針對GAG之染色變化性之陽離子染色損失且由此來評估，例如甲苯胺藍(Toluidine blue)或番紅(Safranin O)。Mankin已將其分值定義為等級、細胞損失及GAG損失之總和，而總分值定義為OARSI分值與細胞損失及GAG損失之總和。所有以上參數構成OA之特徵，且其計分產生對於病理學嚴重程度及進展之量度。
圖10.評估CRB0017_IgG4在骨關節炎STR/ort小鼠模型中之作用。在每一動物之兩膝中經關節內投予CRB0017_IgG4，一次在實驗開始時且再次在6週後，以每膝1,2及12μg之劑量。首次投藥三個月之後，CRB017_IgG4展示在STR/ort小鼠模型中對降低OA嚴重程度之劑量依賴性活性。所有參數如圖9中所定義。
圖11. A)CRB0017_IgG4能夠識別以劑量依賴性方式自滲透或非滲透細胞分泌之ADAMTS-5。使用ADAMTS-5商用抗體之抗-催化及兩個抗-cys結構域作為對照物。B)CRB0017_IgG4不與HEK293細胞之細胞表面上的任何蛋白交叉反應。
圖12.在夾層ELISA中在如下文材料部分中所述之塗層中使用mAb CRB0017_IgG4來攻擊自Hek293-ADAMTS-5(ADAMTS-5濃培養基)及Hek293(Hek-293濃培養基)收集之上清液。「無mAb CRB0017」係孔未經CRB0017_IgG4塗佈之對照條件，「無培養基」係孔中未添加上清液之對照條件，且「Ab」係孔中僅添加二級抗體之對照條件。如圖中所示，CRB0017_IgG4能夠識別自以高特異性表現HEK293之細胞分泌之ADAMTS-5。
圖13.單邊內側半月板撕裂模型(MMT)係一種廣泛使用之膝部OA大鼠手術模型。發生快速進行性退化性變化，即軟骨細胞及蛋白聚糖損失、基質纖維性顫動及裂隙、骨贅形成。手術一週後，以每膝35μg CRB0017_IgG4、每膝70μg CRB0017或媒劑經關節內處理大鼠。注射3週後，將動物處死且處理股脛關節用於組織學。與媒劑相比，藉由以 CRB0017_IgG4處理使得所有組織學分值均劑量依賴性地減少。
圖14.游離多配體蛋白聚糖-4對mAb ADAMTS-5結合至經mAb CRB0017塗佈之培養盤之競爭性抑制作用。在阻斷之前使mAb CRB0017(2μg/ml於塗佈緩衝液中)吸附至免疫培養盤。在多配體蛋白聚糖-4(0.1μg/ml)存在下培育ADAMTS-5(4μg/ml)，之後添加至固定之mAb CRB0017中。使用抗-FLAG商用抗體證實ADAMTS-5結合至經mAb CRB0017塗佈之培養盤。
圖15. mAb抗-間隔子CRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB094_IgG4及CRB0124_IgG4能夠以類似特異性在夾層ELISA中特異性地識別全長ADAMTS-5。mAb CRB0123_IgG4在此分析法中比其他抗-間隔子mAb對ADAMTS-5展現更高之結合能力。
序列描述
SEQ.ID NO：1：ATS4_人類 一種去整合素及具有血小板反應蛋白基元4之金屬蛋白酶(UniProtKB/Swiss-Prot：O75173.3)
SEQ.ID NO 2：ATS5_人類 一種去整合素及具有血小板反應蛋白基元5之金屬蛋白酶(UniProtKB/Swiss-Prot：Q9UNA0.2)
下文中：VK=輕鏈，VH=重鏈，CDRL=輕鏈之互補決定區，CDRH=重鏈之互補決定區。
SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：125至132及SEQ ID NO：135至SEQ ID NO：137為胺基酸序列，SEQ ID NO：95至120為核苷酸序列。
SEQ.ID NO：3,CRB0017VK
SEQ.ID NO：4,CRB0017VH
SEQ.ID NO：5,CRB0018VK
SEQ.ID NO：6,CRB0018VH
SEQ.ID NO：7,CRB0019VK
SEQ.ID NO：8,CRB0019VH
SEQ.ID NO：9,CRB0091VK
SEQ.ID NO：10,CRB0091VH
SEQ.ID NO：11,CRB0092VL
SEQ.ID NO：12,CRB0092VH
SEQ.ID NO：13,CRB0093VK
SEQ.ID NO：14,CRB0093VH
SEQ.ID NO：15,CRB0094VL
SEQ.ID NO：16,CRB0094VH
SEQ.ID NO：17,CRB0102VK
SEQ.ID NO：18,CRB0102VH
SEQ.ID NO：19,CRB0122VL
SEQ.ID NO：20,CRB0122VH
SEQ.ID NO：21,CRB0123VK
SEQ.ID NO：22,CRB0123VH
SEQ.ID NO：23,CRB0124VL
SEQ.ID NO：24,CRB0124VH
SEQ.ID NO：25,CRB0016VK
SEQ.ID NO：26,CRB0016VH
SEQ.ID NO：27,CDRL1_17
SEQ.ID NO：28,CDRL2_17
SEQ.ID NO：29,CDRL3_17
SEQ.ID NO：30,CDRL1_18
SEQ.ID NO：31,CDRL2_18
SEQ.ID NO：32,CDRL3_18
SEQ.ID NO：33,CDRL1_19
SEQ.ID NO：34,CDRL2_19
SEQ.ID NO：35,CDRL3_19
SEQ.ID NO：36,CDRL1_91
SEQ.ID NO：37,CDRL2_91
SEQ.ID NO：38,CDRL3_91
SEQ.ID NO：39,CDRL1_92
SEQ.ID NO：40,CDRL2_92
SEQ.ID NO：41,CDRL3_92
SEQ.ID NO：42,CDRL1_93
SEQ.ID NO：43,CDRL2_93
SEQ.ID NO：44,CDRL3_93
SEQ.ID NO：45,CDRL1_94
SEQ.ID NO：46,CDRL2_94
SEQ.ID NO：47,CDRL3_94
SEQ.ID NO：48,CDRL1_102
SEQ.ID NO：49,CDRL2_102
SEQ.ID NO：50,CDRL3_102
SEQ.ID NO：51,CDRL1_122
SEQ.ID NO：52,CDRL2_122
SEQ.ID NO：53,CDRL3_122
SEQ.ID NO：54,CDRL1_123
SEQ.ID NO：55,CDRL2_123
SEQ.ID NO：56,CDRL3_123
SEQ.ID NO：57,CDRL1_124
SEQ.ID NO：58,CDRL2_124
SEQ.ID NO：59,CDRL3_124
SEQ.ID NO：60,CDRH1_17
SEQ.ID NO：61,CDRH2_17
SEQ.ID NO：62,CDRH3_17
SEQ.ID NO：63,CDRH1_18
SEQ.ID NO：64,CDRH2_18
SEQ.ID NO：65,CDRH3_18
SEQ.ID NO：66,CDRH1_19
SEQ.ID NO：67,CDRH2_19
SEQ.ID NO：68,CDRH3_19
SEQ.ID NO：69,CDRH1_91
SEQ.ID NO：70,CDRH2_91
SEQ.ID NO：71,CDRH3_91
SEQ.ID NO：72,CDRH1_92
SEQ.ID NO：73,CDRH2_92
SEQ.ID NO：74,CDRH3_92
SEQ.ID NO：75,CDRH1_93
SEQ.ID NO：76,CDRH2_93
SEQ.ID NO：77,CDRH3_93
SEQ.ID NO：78,CDRH1_94
SEQ.ID NO：79,CDRH2_94
SEQ.ID NO：80,CDRH3_94
SEQ.ID NO：81,CDRH1_102
SEQ.ID NO：82,CDRH2_102
SEQ.ID NO：83,CDRH3_102
SEQ.ID NO：84,CDRH1_122
SEQ.ID NO：85,CDRH2_122
SEQ.ID NO：86,CDRH3_122
SEQ.ID NO：87,CDRH1_123
SEQ.ID NO：88,CDRH2_123
SEQ.ID NO：89,CDRH3_123
SEQ.ID NO：90,CDRH1_124
SEQ.ID NO：91,CDRH2_124
SEQ.ID NO：92,CDRH3_124
SEQ.ID NO：93,lexA-間隔子
SEQ.ID NO：94,間隔子-GST
SEQ.ID NO：95,CRB0016_VK
SEQ.ID NO：96,CRB0016_IgG4
SEQ.ID NO：97,CRB0017_VK_CK
SEQ.ID NO：98,CRB0017_IgG4
SEQ.ID NO：99,CRB0017_VK
SEQ.ID NO：100,CRB0017_VH
SEQ.ID NO：101,CRB0018_VK
SEQ.ID NO：102,CRB0018_VH
SEQ.ID NO：103,CRB0019_VK
SEQ.ID NO：104,CRB0019_VH
SEQ.ID NO：105,CRB0091_VK
SEQ.ID NO：106,CRB0091_VH
SEQ.ID NO：107,CRB0092_VL
SEQ.ID NO：108,CRB0092_VH
SEQ.ID NO：109,CRB0093_VK
SEQ.ID NO：110,CRB0093_VH
SEQ.ID NO：111,CRB0094_VL
SEQ.ID NO：112,CRB0094_VH
SEQ.ID NO：113,CRB0102_VL
SEQ.ID NO：114,CRB0102_VH
SEQ.ID NO：115,CRB0122_VL
SEQ.ID NO：116,CRB0122_VH
SEQ.ID NO：117,CRB0123_VK
SEQ,ID NO：118,CRB0123_VH
SEQ.ID NO：119,CRB0124_VL
SEQ.ID NO：120,CRB0124_VH
SEQ.ID NO：121，人類間隔子結構域_AA
SEQ.ID NO：122,HELIX_B_ADAMTS-5_AA
SEQ.ID NO：123，人類間隔子結構域
SEQ.ID NO：124,HELIX_B_ADAMTS-5
SEQ.ID NO：125,CRB0017_scFv
SEQ.ID NO：126,CRB0018_scFv
SEQ.ID NO：127,CRB0019_scFv
SEQ.ID NO：128,CRB0091_scFv
SEQ.ID NO：129,CRB0092_scFv
SEQ.ID NO：130,CRB0093_scFv
SEQ.ID NO：131,CRB0094_scFv
SEQ.ID NO：132,CRB0102_scFv
SEQ.ID NO：133，人類ADAMTS-5_cDNA
SEQ.ID NO：134，人類ADAMTS-4_cDNA
SEQ.ID NO：135,CRB0122_scFv
SEQ.ID NO：136,CRB0123_scFv
SEQ.ID NO：137,CRB0124_scFv
SEQ.ID NO：138，小肽連接子
SEQ.ID NO：139-216，合成引子
材料及方法
來自人類淋巴細胞之SPLINT文庫。
研發用於治療人類疾病之治療性抗體長期以來係抗體領域諸多研究者之目標。一種獲得該等抗體之方式係經由自人類淋巴細胞建構之全套細胞內抗體文庫(Single Pot Library of Intracellular Antibodies,SPLINT文庫)。SPLINT技術表現在pMV1載體中選殖之人類scFv(單鏈抗體片段)文庫，該pMV1載體係一種源自pLinker220載體之載體(Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153)，呈與VP16活化結構域融合之形式。可變區與小肽連接子(SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT,SEQ ID No.138)相聯接。pMV1含有允許維持質體且在酵母菌株L40中在缺乏白胺酸之培養基上選擇之LEU2基因及允許在大腸桿菌(E.coli)中選擇質體之bla基因。
為建構人類SPLINT文庫，使用來自一百個非免疫供體之末梢血液捐獻物。自每一供體收集約2至20ml血液樣品。藉由使用Ficoll溶菌斑試劑(Amersham,USA)自末梢血液分離B-淋巴細胞。簡言之，將經稀釋之血液樣品(1：1之血液/PBS)小心鋪層於Ficoll溶菌斑試劑頂部上，且隨後將此兩相溶液以400×g離心30分鐘。自兩相間之界面處收集B-淋巴細胞。根據製造商說明書，藉由Rneasy微小套組(Qiagen)自B-淋巴細胞 提取總RNA。自B淋巴細胞製備總RNA且彙集在一起，之後用於分離mRNA。根據製造商說明書，使用Oligotex mRNA微小套組(Qiagen)製備mRNA。根據製造商說明書，將ThermoScriptTM RT-PCR系統(Invitrogen)用於cDNA合成反應。使用寡(dT)20來合成V基因譜系之cDNA。為減少擴增偏差，作者進行62次(對於huSPLINT_09而言)及75次(對於huSPLINT_10而言)獨立PCR反應以在引子集合內使用所有可能組合擴增V基因區段(對於huSPLINT_09而言，參見表I；對於huSPLINT_10而言，參見表II)。
理論上涵蓋整個人類抗體基因譜系之引子序列係由IMGT/GENE-DB獲得(Giudicelli等人，2005.Stud Health Technol Inform.116：3-8)且根據先前公開之實驗方案經修飾(Sblattero及Bradbury,1998.Immunotechnology.3：271-278)；(Marks等人，1991.Eur J Immunol.21：985-991)；(Orlandi等人，1992.Biotechnology.24：527-531)。在此方法中，個別重排之重鏈及輕鏈可變區係經獨立擴增且經由一系列重疊聚合酶鏈反應(PCR)步驟連接以產生用於選殖之最終scFv產物(Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153)。
用於huSPLINT_9之PCR反應(表I)包括七個VH正向引子與四個VH反向引子配對，產生總計28次反應；而四個Vκ正向引子與四個反向引子配對，產生總計16次反應；及九個Vλ正向引子與兩個Vλ反向引子配對，產生總計18次反應。
表I：關於人類V-基因鏈之反向(rv)及正向(fw)huSPLINT_09PCR引子
huSPLINT_10之PCR反應(表II)包括六個VH正向引子與四個VH反向引子配對，產生總計24次反應；而六個Vκ正向引子與五個Vκ反向引子配對，產生總計30次反應；及七個Vλ正向引子與三個Vλ反向引子配對，產生總計21次反應。
表II：關於人類V-基因鏈之反向(rv)及正向(fw)huSPLINT_10PCR引子
PCR導致在源自所有可設想之構架總成之可變區譜系中表示。所有引子均含有BssHII或NheI限制位點或連接子序列。最終拉通PCR可由兩個引子(PTfw與PTrv)來進行。在最終scFv基因譜系相繼由BssHII及NheI消化之後，使其直接接合至預消化且去磷酸化之pMV1載體中。由每一文庫之一次接合反應及三十次電穿孔，作者能夠獲得最終huSPLINT_09及huSPLINT_10文庫，其每一者由約108個不同scFv分子及0.04%來自無插入接合之純系組成。
間隔子-ADAMTS-5誘餌之選殖及在酵母細胞L40中之表現。
使用以下引子自ADAMTS-5 pSecTag2A擴增編碼人類間隔子-ADAMTS-5(SEQ.ID No.123)之cDNA：5'-TGGCTGGAATTCACAAAGATTGTTGGA-3'SEQ ID No.211
5'-GTCGACGGATCCTTAAGTGTGTGATCCCAC-3'SEQ ID No.212。
將經EcoRI-BamHI消化之cDNA選殖至經設計含有細菌氯黴素抗性、TRP1基因(其使得含有此質體之酵母可在缺乏色胺酸之最小培養基中生長)及2μ複製源之pMICBD1載體(Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153)中。此質體含有自酵母醇脫氫酶I(ADH1)啟動子表現之整個大腸桿菌(Escherichia coli)lexA蛋白區，繼而含有用於cDNA插入之多酶連接子以產生與lexA之框內融合。對誘餌定序以證實插入物與lexA結合結構域在載體中之框內融合。
藉由使用乙酸鋰轉型實驗方案以誘餌Sp_ADAMTS-5/MICBD1載體轉染L40酵母細胞。在YC-Lys/-Ura/-His/-Trp培養盤上分析法轉型體之組胺酸質子移動作用(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790；Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153.；Visintin等人，2004.Methods.34：200-214；Visintin等人，2002.J Mol Biol.317：73-83.；Visintin等人，1999.Proc Natl Acad Sci U S A.96：11723-11728)。如先前所述，使用菌落轉移過濾器分析酵母菌落之β-半乳糖苷酶活性(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790)。轉染誘餌未導致lacZ基因活化(資料未展示)。
HelixB-ADAMTS-5誘餌之選殖及在酵母細胞L40中之表現。
使用以下引子在ADAMTS-5之人類催化結構域之表面位置處組裝編碼α-螺旋(helixB，SEQ.ID No.124)之cDNA：5'-AATTCAACgCTgCCACCACACTCAAgAACTTTTgCAAgTggCAgCACCAACACAACTAACTgCA-3'SEQ ID No.213
5'-gTTAgTTgTgTTggTgCTgCCACTTgCAAAAgTTCTTgAgTgTggTggCAgCgTTg-3'SEQ ID No.214
將經EcoRI-PstI消化之cDNA選殖至pMICBD1載體中(Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153)。藉由使用乙酸鋰轉型實驗方案以誘餌helixB/MICBD1載體轉染L40酵母細胞。在YC-Lys/-Ura/-His/-Trp培養盤上分析轉型體之組胺酸質子移動作用(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790)。如先前所述，使用菌落轉移過濾器分析酵母菌落之β-半乳糖苷酶活性(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790)。轉染誘餌未導致lacZ基因活化(資料未展示)。
間隔子-ADAMTS-5誘餌之西方墨點分析。
在5ml YC培養基(OD600 0.15)中稀釋隔夜酵母培養物且在30℃下生長直至OD600 0.6。將1ml培養物以10000×g離心5min且使細胞集結粒再懸浮於Laemmli緩衝液中、在12% SDS-PAGE上解析且轉移至PVDF膜上(Millipore)。使用多株抗體抗-LexA(Invitrogen)，繼而使用抗-兔-HPR(DAKO)。使用ECL-化學發光系統(Amersham)進行偵測(資料未展示)。
SPLINT選擇。
使用乙酸鋰方法使SPLINT文庫轉型至表現誘餌(Sp_ADAMTS-5/MICBD1或HelixB-ADAMTS-5/MICBD1)之L40酵母菌株中且如所述進行選擇(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790；Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153.；Visintin等人，2004.Methods.34：200-214；Visintin等人，2002.J Mol Biol.317：73-83.；Visintin等人，1999.Proc Natl Acad Sci U S A.96：11723-11728)。將轉型之酵母細胞塗於缺乏Trp(W)、Leu(L)、尿嘧啶(U)、Lys(K)及His(H)(YC-WHULK)之固體培養基上。選擇性標記Trp(W)之表現由pMICBD1質體提供，Leu(L)之表現由pMV1 質體提供，且尿嘧啶(U)、Lys(K)及His(H)為酵母菌株之原始營養標記。使陽性純系在選擇性培養基YC-WHULK上生長。如所述進行β-半乳糖苷酶分析法(Visintin及Cattaneo,2001.Antibody Engineering.1：790；Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153.；Visintin等人，2004.Methods.34：200-214；Visintin等人，2002.J Mol Biol.317：73-83.；Visintin等人，1999.Proc Natl Acad Sci U S A.96：11723-11728)。在自不同SPLINT文庫(mSPLINT、huSPLINT_09及huSPLINT_10)之四次獨立篩檢進行二次篩檢後分離11個陽性抗-Sp_ADAMTS-5scFvs。對於Sp_ADAMTS-5誘餌進行之選擇結果概述於表III中。
重組間隔子-ADAMTS-5-GST蛋白之選殖及表現。
將ADAMTS-5之人類間隔子結構域(SEQ.ID NO：121及123)選殖至pET41b之Nco-XhoI限制位點中(Novagen)。使用以下引子自ADAMTS-5 pSecTag2A擴增編碼間隔子結構域之cDNA：5'-ATCCATGGTCACAAAGATTGTTGGAACC-3'SEQ ID No.215
5'-ATCTCGAGTTAAGTGTGTGATCCCACTTTATTG-3'SEQ ID No.216。
藉由熱休克轉型系統將Sp_ADAMTS-5-GST/pET41b質體轉 型至Rosetta2(DE3)大腸桿菌(Novagen)中(Hanahan,1983.J Mol Biol.166：557-580.)且塗於LB Kan/Cam培養盤上。
次日，接種單一菌落且稀釋於10mL LB Kan/Cam培養基中。使轉型細菌在250RPM下，在37℃震盪下生長隔夜。
次日，將隔夜生長之細菌稀釋於500mL LB Kan/Cam培養基中且隨後自培養物達到OD(600)=0.7起伴隨250RPM震盪在37℃下同步生長。隨後添加0.2mM(最終濃度)IPTG。使經誘發之細菌在25℃下伴隨250RPM震盪培育5至6小時。最後以6000RPM使細菌離心15分鐘且在-80℃下冷凍集結粒。
抗-ADAMTS-5scFvs重組為完整IgG抗體。
藉由使鼠類抗原結合可變結構域與人類恆定結構域偶合使抗-催化性_ADAMTS-5 CRB0016 scFv及抗-Sp_ADAMTS-5 CRB0017 scFv重組為完整嵌合IgG抗體。對於每一抗體而言，藉由以具有適合限制位點之GENEART(Germany)用於次選殖而產生編碼輕鏈及重鏈(來自人類IgG4之Fc)之cDNA。使序列最優化以用於哺乳動物表現(CHO-S細胞系)(SEQ.ID.NO：95及96；97及98)。兩個鏈合成之後，使用HindIII及XhoI作為選殖位點將cDNA次選殖於表現質體(含有延伸CMV啟動子用於表現所關注基因之pcDNA3.1衍生物)中。對於每一抗體鏈而言，產生兩種表現質體：一種質體含有編碼輕鏈之cDNA，一種含有編碼重鏈之cDNA。含有正確插入物之表現質體係由對插入物之限制分析及DNA序列分析來證實。
在上文所述對於CRB0016及CRB0017所採用之選殖程序之後，亦使抗-Sp_ADAMTS-5CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123及CRB0124scFvs重組為完整完全人類IgG4抗體。
由經轉染之細胞產生重組嵌合CRB0016_IgG4及CRB0017_IgG4抗體。
由經轉染之細胞產生抗-ADAMTS-5抗體。以編碼CRB0016及CRB0017重鏈及輕鏈之質體轉染CHO-S細胞。藉由移除細胞及碎片回收來自經轉染之細胞之改良性培養基。將澄清之改良性培養基負載至蛋白A-瓊脂糖管柱上。藉由廣泛結合緩衝液洗滌液(20mM磷酸鈉，pH 7.0)移除非特異性結合。藉由自蛋白A進行酸性抗體洗提(0.1M甘胺酸-HCl，pH 3.0)回收蛋白A管柱上之結合抗體蛋白。即刻以1M Tris-HCl pH=9.0(每mL經洗提部分100μL)中和經洗提之蛋白。針對PBS透析所彙集之經洗提部分。藉由尺寸排阻層析法移除聚集之抗體蛋白。
重組間隔子-ADAMTS-5-GST蛋白之純化。
使解凍之Sp_ADAMTS-5-GST誘發及表現性細菌再懸浮於20mL溶解緩衝液(PBS，10μg/mL DNase、20μg/mL溶菌酶(Lysozime))中。將再懸浮之集結粒在4℃下伴隨晃動培育45分鐘。培育之後，使溶解之細菌在冰中音波處理3次(每次15秒鐘)。在4℃下以6000RPM離心10分鐘之後，收集上清液，以0.2微米過濾器過濾且經處理以供純化。將GST捕獲管柱(GE)與AKTA純化器(GE)連接且以5CV水以5mL/min之通量洗滌。隨後以5CV PBS以5mL/min之通量洗滌管柱。隨後使管柱連接至蠕動泵且以1mL/min通量負載經過濾之上清液。在以5CV PBS以5mL/min通量洗滌之後，使管柱再連接至AKTA純化器且以2CV PBS以5mL/min通量再次洗滌。以100%洗提緩衝液(PBS，10 mM麩胱甘肽)洗提蛋白。將峰部分收集至2mL微量離心管中。根據製造商說明書，使用Amicon Ultra 15濃縮在PBS中稀釋之3種主要中心部分的彙集。以Protein 80 BioAnalyser(Agilent)對濃縮蛋白進行定量。將等分試樣儲存於-80℃下。
大腸桿菌細胞質中抗-Sp_ADAMTS-5scFvs之表現及再摺疊。
將抗-Sp_ADAMTS-5 scFv片段(SEQ、ID 125、126、127、128、129、130、131、132、135、136、137)次選殖至pETM-13細菌表現載體之 NcoI/NotI限制位點中。將具有表現質體之大腸桿菌BL21DE3在500mL 2YT/Kan培養基中培養直至中間指數階段(OD600=0.75)且隨後在37℃下伴隨震盪(180rpm)再以IPTG(1.5mM)誘發5至6h。以6000rpm(Beckman)收集細胞且將集結粒用於包涵體(IB)製備。使用試管內再摺疊最優化作為大腸桿菌包涵體之大型表現方法(Patil等人，2008.J Biotechnol.134：218-221.Epub 2008 Jan 2018)；(Umetsu等人，2003.J Biol Chem.278：8979-8987.Epub 2003 Jan 8977)。用IBR緩衝液(50mM Tris/HCl、0.5mM EDTA、20μg/mL溶菌酶、10μg/mL Dnase(pH 8))使集結粒以5mL/g-1再懸浮且在室溫下置於震盪培養盤上並持續1h。將樣品在冰上音波處理45sec並持續三次脈衝，繼而在冰上培育1min。隨後將溶解產物在4℃下以6,000rpm離心10min。將集結粒再懸浮於20mL洗滌緩衝液1(10mM Tris pH 8、1mM EDTA、1% Triton X-100)中、渦旋且隨後藉由在4℃下以10,000rpm離心10min使包涵體沈降。將集結粒以20mL洗滌緩衝液2(10mM Tris pH8、1mM EDTA、1M NaCl)洗滌、渦旋且隨後在4℃下以10,000rpm離心10min。最後將集結粒以20mL洗滌緩衝液3(10mM Tris pH8、1mM EDTA)洗滌、渦旋且在4℃下以10,000rpm離心10min。用溶解緩衝液(100mM Tris/HCl；6M胍HCl；1mM EDTA；100mM DTT，pH 8)使IB製劑以5mLg-1溶解。將溶解之蛋白在劇烈攪拌下在室溫下培育2h。在以HCl 1M將蛋白溶液之pH降低為pH 4之後，藉由以10,000rpm離心10min移除不溶性物質。為自溶質移除DTT，針對IBD緩衝液(6M胍HCl，pH 4)進行三重透析。將溶解且定量之蛋白以35mg/L儘可能快速地稀釋至冷REF緩衝液(100mM Tris/HCl；0.5M精胺酸；375μM氧化1-麩胱甘肽；5 mM EDTA，pH 8.5)中。每隔50分鐘將蛋白溶液在渦旋下以移液管直接施配至REF緩衝液中。最後添加16h之後，首先將樣品濃縮且藉由透析至IEXA緩衝液中(根據scFv之pI且因此根據隨後採用之離子交換實驗方案)移除剩餘胍鹽。藉由離子交換 層析法純化再摺疊之scFvs，以等分試樣儲存於-80℃下。
特異性ELISA：抗-Sp_ADAMTS-5 scFvs對Sp_ADAMTS-5-GST。
以塗佈緩衝液(100mM Na2CO3，pH 9.6)中10μg/mL之100mL Sp_ADAMTS-5-GST及GST塗佈Nunc Maxi-Sorp免疫培養盤。將培養盤在4℃下培育隔夜。次日，丟棄未結合之抗原且以PBS將培養盤洗滌3次。藉由添加200mL之3% MPBS(PBS中3%無脂牛奶)阻斷非特異性結合。將培養盤在室溫(RT)下培育1h。將培養盤以TPBS(PBS中0.1%吐溫(Tween)20)洗滌3次且以PBS洗滌3次。向適當孔中添加100μL在3% MPBS中連續稀釋之抗-Sp_ADAMTS-5scFv(0.5-50μg/mL)。隨後將培養盤在室溫下培育2h。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，向每孔中添加100μL在3% MPBS中以1：5000稀釋之抗-V5抗體(Invitrogen)。將培養盤在室溫下培育1小時又30分鐘。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，向每孔中添加100μL在3% MPBS中以1：2000稀釋之抗-小鼠HRP(DAKO)。將培養盤在室溫下培育1h。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，添加80μL TMB(Sigma)。在暗室中培育培養盤直到樣品達到所需信號。在讀取之前向每孔中添加80μL終止溶液(500mM H2SO4)。藉由以LD 400發光偵測器(Luminescence Detector,Beckman Coulter)量測OD(450nm)來收集資料。
夾層ELISA：抗-Sp_ADAMTS-5 mAb對Sp_ADAMTS-5-GST。
以在塗佈緩衝液(100mM Na2CO3，pH 9.6)中連續稀釋之100mL抗-Sp_ADAMTS-5免疫球蛋白塗佈Nunc Maxi-Sorp免疫培養盤。將培養盤在4℃下培育隔夜。次日，丟棄未結合之抗原且以PBS將培養盤洗滌3次。藉由添加200μL之3% MPBS(PBS中3%無脂牛奶)阻斷非特異性結合。將培養盤在室溫下培育1h。將培養盤以TPBS(PBS中0.1%吐溫20) 洗滌3次且以PBS洗滌3次。向適當孔中添加100μL在3% MPBS中之Sp_ADAMTS-5-GST及GST(30μg/mL)。隨後將培養盤在室溫下培育2h。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，向每孔中添加100μL在3% MPBS中以1：1000稀釋之抗-GST抗體(Sigma)。將培養盤在室溫下培育1小時又30分鐘。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，向每孔中添加100μL在3% MPBS中以1：2000稀釋之抗-兔HRP(DAKO)。將培養盤在室溫下培育1h。在以TPBS洗滌3次且以PBS洗滌3次之後，添加80μL TMB(Sigma Aldrich)。在暗室中培育培養盤直到樣品達到所需信號。在讀取之前向每孔中添加80μL終止溶液(500mM H2SO4)。藉由以LD 400發光偵測器(Beckman Coulter)量測OD(450nm)來收集資料。
藉由表面電漿子共振量測來評估抗-Sp_ADAMTS-5scFv及/或mAb親和力及動力學常數
Sp_ADAMTS-5-GST與藉由在CM5晶片之羧甲基葡聚糖基質中進行胺偶合固定之抗-Sp_ADAMTS-5抗體(scFv或IgG)結合之結合動力學。使用標準固定程序(Schuck,1997.Annu Rev Biophys Biomol Struct.26：541-566)。將20至50μg/mL scFv或IgG溶解於乙酸鹽緩衝液中(比免疫球蛋白之pI低至少2個pH單位之適合預濃縮緩衝液以獲得淨正電荷)。設定對於免疫球蛋白而言5000RU且對於scFv而言1000RU之固定值以獲得對於配位體之低密度固定。使用晶片之輕度再生條件(在10mM甘胺酸pH 2下之接觸時間為30秒鐘)。
將Sp_ADAMTS-5-GST稀釋於5次連續稀釋之PBS+0.005%吐溫20操作緩衝液中(以微莫耳濃度範圍開始且以1：2稀釋)且以30μl/min之流動速率塗覆。將樣品調節步驟初始設定為60秒鐘之接觸時間及400秒鐘之解離時間。基於所得感應圖，在動力學/親和力步驟中，調整分析物濃度、接觸時間、解離時間及再生溶液。
藉由生物評估軟體分析資料：可藉由Chi2及U值之值檢查資料擬合之品質。
評估抗-間隔子ADAMTS-5 mAb與ADAMTS-5目標抗原之結合能力。
以2μg/mL在100mM Na2CO3(pH 9.6)中塗佈mAb抗-間隔子CRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB0094_IgG4、CRB0123_IgG4及CRB0124_IgG4且在4℃下培育隔夜。次日，自培養盤丟棄未結合之免疫球蛋白且以TBS洗滌3次。藉由添加200μL無蛋白阻斷緩衝液(Pierce-未經稀釋)阻斷培養盤且在37℃下培育1小時。如上洗滌培養盤。隨後每孔添加100μL於阻斷緩衝液(於TBS中以1：2稀釋)中之經純化ADAMTS-5(4μg/ml)，且每孔添加100μl於TBS中以1：2稀釋之阻斷緩衝液作為陰性對照物。將培養盤在37℃下培育1小時。隨後將培養盤以TTBS洗滌3次。在阻斷緩衝液(以TTBS以1：2稀釋)中每孔添加100μl以1：8000稀釋之小鼠抗-Flag抗體(Sigma；cod F3165)。將培養盤在37℃下培育1小時。將培養盤以TTBS洗滌3次。添加100μl在TTBS中以1：2000稀釋之抗-小鼠抗體(DAKO)且將培養盤在37℃下培育1小時。最後將培養盤以TTBS洗滌3次且以TBS洗滌3次。為進行偵測，添加100μl TMB且在黑暗中培育直至信號可見(通常為5至15min)。每孔添加100μL終止溶液以終止反應且繼續進行O.D.量測。
ADAMTS-4及ADAMTS-5 3xFLAG全長形式之選殖及表現。
使編碼人類ADAMTS-5(SEQ.ID NO：133)及人類ADAMTS-4(SEQ.ID NO：134)序列之cDNA擴增以引入針對Kpn I(5'末端)及Xho I(3'末端)之限制位點且移除編碼前肽之區。在以KpnI及XhoI消化之後，將插入物次選殖至pSecTag2A載體(Invitrogen)中。
在FreeStyleTM 293-F細胞系中轉染ADAMTS-5 3XFLAG/pSecTag2A及ADAMTS-43XFLAG/pSecTag2A。使細胞適應在FreeStyleTM 293表現培養基中之懸浮培養。在轉染之前或之後向培養基中添加抗凝結劑(Invitrogen)。在無動物來源之OptiMEMTM SFM中以FreeStyleTM MAX試劑複合物轉染細胞。在37℃、8% CO2下在設定為75rpm之攪拌平台上培育經轉染之細胞。在轉染後24小時，向培養物中添加100μg/ml肝素。ADAMTS-5 3XFLAG及ADAMTS-4 3XFLAG表現在轉染後48至72小時達到顯著之蛋白活性。2至3天後，收集上清液且儲存在-80℃下直至純化。
全長ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG蛋白純化。
將300ml ADAMTS-5 3XFLAG/ADAMTS-4 3XFLAG上清液負載至1mL抗-FLAG M2親和力凝膠(Sigma-Aldrich)中。在0,5MPa壓力下以1mL/min之流動速率塗覆樣品且以10體積之50mM Tris-HCl(pH 7,4)、10mM CaCl2、10μM ZnCl、0.02%含有1M NaCl之Brij-35洗滌管柱以移除與酶結合之肝素。藉由在聚集蛋白聚糖酶反應緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 7,4)、150mM NaCl、10mM CaCl2、10μM ZnCl、0.02% Brij-35)中與200μg/ml之3XFLAG肽(Sigma-Aldrich)競爭來達成FLAG融合蛋白之洗提。在整個純化程序期間維持1mL/min之流動速率且收集1,0ml部分。一起拉動含有經洗提蛋白之部分且使用Vivaspin濃縮器(Sartorius)(30kD之截止值)濃縮5倍。
ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG純化蛋白之西方墨點分析。
將ADAMTS-5 3X FLAG及ADAMTS-5 3X FLAG純化樣品再懸浮於樣品緩衝液(Invitrogen)中，加熱10min且負載於10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳系統(Invitrogen,NuPage System)上且隨後經受西方墨點法。將分離之蛋白轉移至PVDF膜(GE Healthcare)。以起始阻斷溶液(Pierce)將該等膜阻斷30'且在室溫下以一級單株抗體抗3XFLAG(Sigma)1：1000培育1h。在室溫下以1：10.000稀釋之過氧化酶偶合二級抗體抗小鼠(AbCam) 培育(1h)之後，藉由使用Super Signal Dura West(Pierce)偵測蛋白頻帶。使用Las3000成像系統(Fuji)以CCD攝影機獲取影像(參見圖2關於ADAMTS-5西方墨點)。
酶促活性之分析。
藉由酶促分析法測試經純化全長酶ADAMTS-4 3X FLAG及ADAMTS-5 3X FLAG之活性。使用聚丙烯醯胺中截留之自牛鼻軟骨純化之聚集蛋白聚糖(Nagase及Woessner,1980.Anal Biochem.107：385-392)作為受質來測定聚集蛋白聚糖降解活性。
將聚集蛋白聚糖/聚丙烯醯胺粒子樣品(5,0±0.2mg乾重)置於具有400μL TNC(0,1MTris-HCl、0,1MNaCl、10mM CaCl2、0,1% CHAPS；pH 7,5)及100μL重組ADAMTS-4(p68，FL)與ADAMTS-5(p75，FL)製劑之1,5mL管中，在經短暫性轉染之FreeStyle-293細胞中表現且在37℃下培育6或24h。以500μL終止溶液(50Mm Tris、200mM乙酸鈉、100mM EDTA；pH=6.8)終止反應且藉由離心(10000rpm，4min，4℃)自液相分離粒子。藉由比色分析法(1,9二甲基亞甲基藍，DMB)測定上清液中硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)之量。標準曲線(自牛氣管提取之硫酸軟骨素)且於PBS-BSA 1%中稀釋樣品。在反應5至20min之後，在590nm下讀取樣品。由吸光度量測值(減去空白)計算每一樣品之GAG濃度且與參考標準曲線相比較。
軟骨外植體及培養物。
自8個月大雄性牛鼻隔膜獲取牛鼻軟骨盤。簡言之，自鼻軟骨獲取2-mm直徑之軟骨衝孔。首先將衝孔以PBS-AASS緩衝液(1×PBS、100U/ml青黴素G、100μg/ml鏈黴素及2.5μg/ml兩性黴素B)洗滌三次。隨後在37℃下，在5% CO2氛圍下，在含有DMEM 10%、100U/ml青黴素G、100μg/ml鏈黴素及2.5μg/ml兩性黴素B之微培養盤孔(DMEM-AASS培 養基)中培育衝孔。三小時之後，將樣品以PBS-AASS緩衝液洗滌且以DMEM-AASS培養基培育。在製備軟骨細胞48h之後，以5ng/mL IL-1α加上不同濃度之抑制劑(亦即，CRB0017_IgG4及TIMP-3)處理樣品且在DMEM、0.1% BSA+AASS中培育48h。處理之後，收集上清液及小片軟骨且用於GAG分析(對GAG釋放之量測係對葡糖胺聚糖之定量--GAG係呈在培養物中自軟骨釋放之聚集蛋白聚糖片段形式)。首先將軟骨衝孔在65℃下以500μg/mL木瓜酶培育2h以量測組織中保留之總GAG的百分比。藉由比色分析法使用1,9二甲基亞甲基藍(DMB)進行硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)測定。標準曲線(自牛氣管提取之硫酸軟骨素)、於PBS-BSA 1%中稀釋培養基樣品及經消化之軟骨樣品。在反應5至20min之後，在590nm下讀取樣品。
ADAMTS-5及ADAMTS-4 3xFLAG全長蛋白之免疫沈澱。
使用蛋白G免疫沈澱套組(SIGMA)進行免疫沈澱。
為減少由無關細胞蛋白與蛋白G瓊脂糖之非特異性吸附引起之背景，進行預澄清步驟。向微離心管中之樣品(ADAMTS-5或ADAMTS-4純化蛋白)中添加50μl蛋白G瓊脂糖懸浮液且在4℃下伴隨晃動培育2小時。藉由在微離心器中以12,000g離心30秒鐘使珠粒集結成粒且將所收集之上清液(預澄清樣品)轉移至新鮮管中。此樣品用於免疫沈澱。向樣品中添加抗-Sp_ADAMTS-5且在IP緩衝液中將體積調整至600μL。將此樣品添加至加蓋旋轉管柱中且在4℃下培育隔夜。次日，向管柱中添加50μL經洗滌之蛋白G瓊脂糖珠粒。在4℃下晃動培育2h之後，使旋轉管柱尖端斷裂且將管柱置於2mL離心管中。使管在4℃下以12,000×g旋轉30秒鐘。將旋轉管柱中之珠粒再懸浮於700μl之1×IP緩衝液中且隨後使管柱在4℃下以12,000×g離心30秒鐘。將此洗滌步驟重複3次。以0.1×IP緩衝液進行最後一次洗滌。以50μL熱1×Laemmli樣品緩衝液使珠粒再懸浮。在95℃ 下培育10分鐘之後，藉由以13,000×g離心1分鐘洗提蛋白。將樣品負載於SDS-PAGE凝膠上以用於西方墨點分析。
本發明抗體在Hek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293上以細胞-ELISA型式結合。
基於細胞之ELISA型式使得可在同一孔中分析目標細胞蛋白，從而最小化孔與孔間之變化性。使用穩定表現ADAMTS-5 3XFLAG之FreeStyleTM 293-F細胞系。在FreeStyleTM 293表現培養基中以懸浮培養形式培養細胞。將表現ADAMTS-5 3XFLAG之FreeStyleTM 293-F細胞及FreeStyleTM 293-F細胞接種於96孔培養盤中(每孔100.000個細胞)且在37℃下培育1h。隨後以CRB0017_IgG4(最終濃度為10-5-2μg/ml)處理細胞且在37℃下培育1h。隨後在室溫下以HBSS(具有Ca/Mg)中之4%對甲醛(每孔50μL)將細胞固定15min且在室溫下以100μl於TBS中之0,1% Igepal(每孔100μL)於孔中滲透或不滲透並持續15min。隨後以TBS(每孔100μL)洗滌細胞，繼而在室溫下以TBS中之1% H2O2(每孔100μL)中止20min。隨後以TBS(每孔100μL)洗滌細胞，繼而在室溫下以TBS中之5% BSA(每孔100μL)阻斷30min。在以TBS中之0,1%吐溫(TTBS)(每孔100μL)將細胞洗滌3次之後，隨後在室溫下將細胞與二級抗體(每孔100μL驢抗-人類-HRP抗體1：5000於TTBS中)一起培育30min。在以TTBS(每孔200μL)將細胞洗滌3次之後，藉由每孔添加100μL TMB來偵測細胞。藉由在15分鐘內以0,5M H2SO4(每孔100μL)偵測終止反應。使用pAb抗-ADAMTS-5 Cys 636-649(Abcam#ab111918)及pAb抗-ADAMTS-5 Cys 600-700(Abcam # ab41037)來偵測ADAMTS-5之有效保留及/或分泌。
評估本發明抗體與ADAMTS-5之結合能力。
在100mM Na2CO3 pH 9.6中以2μg/mL塗佈mAb CRB0017_IgG4且在4℃下培育隔夜。次日，自培養盤丟棄未結合之免疫球 蛋白且以TBS洗滌3次。藉由添加200μL無蛋白阻斷緩衝液(Pierce-未稀釋)阻斷培養盤且在37℃下培育1小時。如上洗滌培養盤。隨後每孔添加100μL補充有肝素100μg/ml之HEK-293-ADAMTS-5-3XFLAG或HEK-293(陰性對照物)改良性培養基。將培養盤在37℃下培育1小時。隨後將培養盤以TTBS洗滌3次。每孔添加100μl在阻斷緩衝液(經TTBS以1：2稀釋)中以1：8000稀釋之小鼠抗-Flag抗體(Sigma；cod F3165)。將培養盤在37℃下培育1小時。將培養盤以TTBS洗滌3次。添加100μl在TTBS中以1：2000稀釋之抗-小鼠抗體(DAKO)且將培養盤在37℃下培育1小時。最後將培養盤以TTBS洗滌3次且以TBS洗滌3次。為進行偵測，添加100μl TMB且在黑暗中培育直至信號可見(通常為5至15min)。每孔添加100μL終止溶液以終止反應且繼續進行O.D.量測。
評估多配體蛋白聚糖-4干擾CRB0017_IgG 4 抗-間隔子ADAMTS-5結合至ADAMTS-5抗原之能力。
在塗佈緩衝液(2μg/ml)中以每孔100μl將CRB0017_IgG4(2μg/ml)塗佈於免疫培養盤中且在4℃下培育隔夜。自培養盤丟棄未結合之免疫球蛋白且以TBS洗滌3次。藉由每孔添加200μl阻斷緩衝液(未稀釋)阻斷非特異性結合且在37℃下培育1小時。同時，在TBS中以1：2稀釋之阻斷緩衝液中以[ADAMTS-5(4μg/ml)+多配體蛋白聚糖-4(R&D System# 2918-SD-050)製備管；對於多配體蛋白聚糖-4測試之濃度範圍：0.05至2μg/ml；在為此分析法設定之條件下，以0.1μg/ml獲得最大干擾作用。隨後如上洗滌培養盤。每孔添加100μl在TBS中以1：2稀釋之阻斷緩衝液中之ADAMTS-5(4μg/ml)或[ADAMTS-5(4μg/ml)+多配體蛋白聚糖-4(0.1μg/ml)]。作為陰性對照物，向一些孔中添加100μl在TBS中以1：2稀釋之阻斷緩衝液。向一些孔中添加100μl多配體蛋白聚糖-4(在適當濃度下)作為對照物。將培養盤在37℃下培育1小時。培育之後，將培養盤 以TTBS洗滌3次。每孔添加100μl在阻斷緩衝液(經TTBS以1：2稀釋)中以1：2000稀釋之抗-Flag抗體(Sigma)。在僅具有多配體蛋白聚糖-4之孔中，每孔添加100μl在阻斷緩衝液(經TTBS以1：2稀釋)中以1：5000稀釋之抗-多配體蛋白聚糖-4(Santa Cruz Biotechnology # sc-12766)。隨後將培養盤在37℃下培育1小時。培育之後，將培養盤以TTBS洗滌3次。每孔添加100μl在TTBS中以1：5000稀釋之過氧化酶結合抗-小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)且將培養盤在37℃下培育1小時。最後將培養盤以TTBS洗滌3次且以TBS洗滌3次，且每孔添加100μl TMB。將培養盤在黑暗中培育直至信號可見(通常為5至15min；在任何情形下均不大於30min)。每孔添加100μL終止溶液以繼續進行O.D.量測。
評估抗-ADAMTS-5 mAbs在骨關節炎之STR/ort小鼠模型中之作用。
募集5個月大之STR/ort雄性小鼠(Mason等人，2001.Osteoarthritis Cartilage.9：85-91)(n=20-22)，隨機分入每一籠中進行處理，每一籠中4隻動物，稱重且在每一膝部以抗-ADAMTS-5 IgG4 1.2μg、抗-ADAMTS-5 IgG4 12μg或媒劑經關節內處理。6週後，以相同劑量重複抗-ADAMTS-5 IgG4之關節內投藥。自募集起3個月之後，藉由頸椎脫位處死動物且將後肢移植且固定於福馬林中隔夜。將後肢嵌埋於石蠟中，製備5微米厚切片且以甲苯胺藍染色，且隨後根據Mankin(Mankin等人，1971.J Bone Joint Surg Am.53：523-537)及OARSI方法(Pritzker等人，2006.Osteoarthritis Cartilage.14：13-29)以盲方式計分。此方法基於最高級(6)及更延伸階段(4)產生0至24範圍內之OA分值。相繼以Student氏t測試(比較媒劑對基底)、ANOVA及Dunn氏或Dunnett氏測試(比較所有處理組對媒劑)進行統計學分析。
在骨關節炎之內側半月板撕裂(MMT)大鼠模型中評估本 發明抗體。
大鼠之單邊內側半月板撕裂(MMT)導致快速進行性軟骨退化，其特徵在於軟骨細胞及蛋白聚糖損失、纖維性顫動、骨贅形成及軟骨細胞選殖。進行性退化變化發生在手術後3至6週時：脛骨軟骨退化可局部退化性變化嚴重，而周圍基質及凸起骨贅較不嚴重。
使用稱重200g之雄性Lewis大鼠。右膝經歷手術或假手術。切斷內側副韌帶且以止血鉗抓住內側半月板，且在朝向股骨之近端反射。以解剖刀或小手術剪切斷半月板。假手術僅由打開皮膚及囊組成。手術一週後，在經手術之膝部以本發明抗體(諸如CRB0017_IgG4 34μg、CRB0017_IgG4 72μg或媒劑)經關節內處理大鼠。
手術四週後，藉由頸椎脫位處死動物，且移植經手術之膝部且固定於福馬林中隔夜且嵌埋於石蠟中；製備5微米厚切片且以甲苯胺藍染色，且隨後根據Mankin及OARSI方法以盲方式計分。以Student氏t測試(比較媒劑對假手術)且以ANOVA進行統計學分析。
結果
使用SPLINT技術選擇特異性抗-間隔子結構域抗體。
為藉由SPLINT技術選擇ADAMTS-5之特異性抗-間隔子結構域，將ADAMTS-5之間隔子結構域(SEQ.ID NO.2之aa 732至aa 874)選殖至LexA之3'中(LexA-Sp_ADAMTS-5；SEQ.ID NO：93)且用於攻擊小鼠SPLINT(mSPLINT)及兩種不同人類SPLINT(huSPLINT_09及huSPLINT_10)文庫(Visintin等人，2004.J Immunol Methods.290：135-153)。由選擇程序，總計325個菌落能夠在不存在組胺酸時生長且展示獲得β-半乳糖苷酶之活化。scFv-VP16質體藉由其限制圖案及序列來分離及分類。使用表現LexA-Sp_ADAMTS-5及LexA-核纖層蛋白之酵母菌株作為無關抗原再分析具有不同DNA指紋之scFv的特異性。由此識別11種不同抗-間隔子結構域 scFv。對所選抗-間隔子scFv之V區核苷酸序列的分析證實其係源自具有極少體細胞突變(資料未展示)之生殖系V區基因(表IV)。
經分離抗-Sp_ADAMTS-5scFvs之V區之胺基酸序列係在由SEQ.ID NO：3及4；5及6；7及8；9及10；11及12；13及14；15及16；17及18；19及20；21及22；23及24組成之序列群中。
大腸桿菌細胞質中抗-間隔子scFv之表現及再摺疊。
為鑑別潛在抗-間隔子活體內結合子，將表現抗-Sp_ADAMTS-5 scFv之cDNA選殖至大腸桿菌pET41b表現載體中。蛋白在細胞質中良好表現且主要保留於包涵體(IB)中。可藉由在IB溶解後透析 使scFv片段再摺疊(Umetsu等人，2003.J Biol Chem.278：8979-8987.Epub 2003 Jan 8977)。作者藉由稀釋進行再摺疊技術(Patil等人，2008.J Biotechnol.134：218-221.Epub 2008 Jan 2018)。最優化每一樣品之scFv再摺疊條件。隨後由Bioanalyzer 2100(Agilent)定量再摺疊之scFv且由ELISA及Biacore分析來測試。
抗-ADAMTS-5與人類ADAMTS-5之結合特異性。
為理解自SPLINT文庫分離之抗-Sp_ADAMTS-5scFv組之特異性，證實該等抗體對於間隔子-GST(SEQ.ID NO：94)及ADAMTS-5 FL之免疫反應性。所有分離之抗-間隔子scFv均在ELISA分析法中與截斷形式之ADAMTS-5之GST融合蛋白具反應性。然而，CRB0017、CRB0018及CRB0093 scFv係高度特異性且僅對於用作陰性對照物之GST蛋白觀測到弱結合(圖3)。
重組之嵌合免疫球蛋白CRB0017_IgG4以劑量依賴性方式在ELISA分析法中展示相同免疫反應性圖案(圖4)。以單株抗體CRB0102及CRB0123獲得類似結果(資料未展示)。此外，嵌合抗-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4(包含小鼠可變區)能夠免疫沈澱重組ADAMTS-5 FL蛋白以及重組人類ADAMTS-4 FL(圖6及7)。另外，作者進行表面電漿子共振(SPR)分析以確定CRB0017_IgG4之結合動力學。將嵌合單株抗體(mAb)固定於CM5晶片上，繼而以各種濃度之Sp_ADAMTS-5-GST注射，或與Sp_ADAMTS-5-GST-固定之感應晶片組合用作配位體。使用二價結合模型，作者確定穩態結合常數(KD2)。當用作結合子時，作者藉由SPR量測約次奈莫耳濃度(7nM)之結合強度KD2(資料未展示)。CRB0017_IgG4在固定於與如由抗原特異性ELISA測定之結合值(圖4)更佳相關之感應晶片上時亦展現強親和力(KD1為約2nM)(圖5)。
評估抗-間隔子ADAMTS-5 mAb與ADAMTS-5目標抗原之結 合能力
在ELISA中使用塗料中之mAb CRB0017_IgG4、CRB0093_IgG4、CRB094_IgG4、CRB0123_IgG4及CRB0124_IgG4攻擊經純化之ADAMTS-5酶。如圖15中所示，在此分析法中，mAb CRB0017、CRB0093、CRB0094及CRB00124對ADAMTS-5展示相當特異性，而mAb CRB0123_IgG4對ADAMTS-5展示比mAb CRB0017_IgG4高之結合能力(圖15)。
本發明抗體在Hek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293上以細胞-ELISA型式結合
細胞內ELISA使用定量免疫細胞化學來量測培養細胞中之蛋白表現或轉譯後修飾。將細胞固定於96孔培養盤中且以高特異性良好特性化之單株抗體偵測所關注之目標，且以酶標記之二級抗體定量水準。使用此方法，評估由穩定HEK293細胞系表現之全長ADAMTS-5與CRB0017_IgG4間之結合。該酶由此細胞系有效分泌且亦保留至細胞外基質(ECM)中。當CRB0017_IgG4由此重組細胞系攻擊時，其能夠以劑量依賴性方式識別在其原生摺疊條件下之酶ADAMTS-5(圖11)。
評估mAb CRB0017與ADAMTS-5之結合能力。
在夾層ELISA分析法中使用塗料中之mAb CRB0017_IgG4攻擊自含有原生全長ADAMTS-5及FreeStyleTM 293-F細胞系之穩定表現ADAMTS-5 3XFLAG之FreeStyleTM 293-F細胞系收集之上清液(在每次稀釋經穩定轉染之細胞彙集時進行收集)。上清液在收集之後即刻使用以保持ADAMTS-5之功能且儘可能多地避免酶之自身催化。
如圖12中所示，抗體能夠以高特異性識別改良性培養基中存在之酶ADAMTS-5。
評估多配體蛋白聚糖-4干擾CRB0017_IgG 4 抗-間隔子 ADAMTS-5與ADAMTS-5抗原結合之能力。
已藉由肥大OA軟骨細胞經由抑制ADAMTS-5介導之聚集蛋白聚糖裂解之活化而證實多配體蛋白聚糖-4在功能方面牽涉於軟骨退化中(Echtermeyer, F.等人，2009.Nat Med.15(9)：1072-6)。ADAMTS-5活化取決於多配體蛋白聚糖-4在骨關節炎軟骨細胞表面上之直接相互作用；軟骨退化中所涉及之機制似乎涉及ADAMTS-5與多配體蛋白聚糖-4之直接結合及MMP-3對ADAMTS-5活化之調節作用，此調節係由多配體蛋白聚糖-4以ERK依賴性方式來調節。
在OA期間誘發多配體蛋白聚糖-4表現之確切途徑以及在軟骨重塑中涉及之機制仍在集中研究。為評估mAb抗-ADAMTS-5 CRB0017可調節由多配體蛋白聚糖-4所介導之軟骨細胞病理學反應的可能性，吾人建立一種初級試管內分析法來證實mAb CRB0017干擾ADAMTS-5-多配體蛋白聚糖-4相互作用之能力。如圖14中所示，當向孔中添加多配體蛋白聚糖-4時，OD相對於僅向CRB0017_IgG4中添加ADAMTS-5之孔而言減少。此證實ADAMTS-5與mAb CRB0017間之特定相互作用與多配體蛋白聚糖-4有效相關。
已證實，間隔子結構域及TSP型-1結構域對於與細胞外基質之緊密相互作用而言係重要的。此外，已證實ADAMTS-5結合至多配體蛋白聚糖-4之硫酸乙醯肝素鏈且藉由此機制固定至細胞表面。尚未理解與多配體蛋白聚糖-4結合中所涉及之ADAMTS-5之結構域。作為抗體作用最終結果之結合損失此時不允許關於直接競爭(相同結合抗原決定基)對間接解離機制(位阻)之任何推斷，即使最終導致結合特性受損之任何機制已致使ADAMTS-5與多配體蛋白聚糖-4間之相互作用損失。
量測抗-ADAMTS-5中和活性。
作者亦評估牛軟骨組織中IL-1α誘發之聚集蛋白聚糖降解 之抑制作用。處理48h之後，量測組織中保留之總GAG比例。此分析表明，在20nM濃度下，CRB0017_IgG4抑制自組織釋放GAG(50%抑制作用)(圖8)。在此實驗中，對照抗體(nhIgG4)在相同濃度下無法干擾酶。此外，天然抑制劑TIMP-3在20nM濃度下測試時未明顯展示抑制IL-1α-介導之轉化及釋放過程(資料未展示)。使用化合物Cpd23，即基於3,3-二甲基-5-羥基哌啶甲酸異羥肟酸鹽之聚集蛋白聚糖酶抑制劑及MMP-13(以1μM之濃度使用，Noe等人，2005.Bioorg Med Chem Lett.15：2808-2811)作為陽性對照物，因為其在此分析法中相對於天然抑制劑TIMP-3展示更佳之抑制作用。
評估CRB0016_IgG4在骨關節炎之STR/ort小鼠模型中之作用。
在每一動物之雙膝內經關節內投予HelixB-ADAMTS-5結合蛋白CRB0016_IgG4，一次在實驗開始時且在6週後再次投予，以每膝1,2及12μg之劑量。
三個月之後，作者觀測到來自經媒劑處理動物之膝部展示嚴重OA，其關節軟骨開裂且侵蝕至軟骨下骨，伴有顯著軟骨-骨化生及常見炎症與血管翳。所檢查之任何參數均無顯著變化係與以任一劑量投予CRB0016_IgG4相關。
組織學樣品之盲計分程序未展示該化合物在減少軟骨損害中之作用。總而言之，該等資料表明在三個月內兩次在膝部關節內投予HelixB-ADAMTS-5結合蛋白CRB0016_IgG4未能降低STR/ort小鼠中骨關節炎病理學之嚴重性。
評估CRB0017_IgG4在骨關節炎STR/ort小鼠模型中之作用。
在每一動物之兩膝內經關節內投予CRB0017_IgG4，一次在實驗開始時且在6週後再次投予，以每一膝部1,2及12μg之劑量。三個月之後，作者觀測到來自經媒劑處理動物之膝部展示嚴重OA，其關節軟骨開 裂且侵蝕至軟骨下骨，伴有顯著軟骨-骨化生及常見炎症與血管翳。與媒劑相比，CRB0017_IgG4 12μg群組中之OA Mankin分值顯著減少。OA等級×階段不僅考慮損害深度(等級)，而且考慮其在關節表面上之擴展(階段)。與媒劑相比，CRB0017_IgG4 12μg群組中之OA等級×階段顯著降低。投予CRB0017_IgG4 1.2μg與以兩種計分方法減少之傾向相關。總之，作者觀測到CRB0017_IgG4可藉由延遲如組織學上評估之軟骨損壞來改變STR/ort小鼠菌株中之OA過程。組織學樣品之盲計分程序明確展示該化合物在減少軟骨損害中之劑量依賴性作用。
總而言之，該等資料表明在三個月內兩次在膝部關節內投予CRB0017_IgG4以劑量依賴性方式降低STR/ort小鼠中骨關節炎病理學之嚴重性。
在骨關節炎之內側半月板撕裂(MMT)大鼠模型中評估本發明抗體。
注射3週後，作者觀測到來自經媒劑處理動物之膝部展示嚴重OA，其關節軟骨開裂且侵蝕至軟骨下骨，伴有凸起骨贅、炎症及血管翳。投予CRB0017_IgG4與所有組織病理學嚴重性分值之劑量相關性減少相關(圖13)。組織學樣品之盲計分程序展示OA嚴重性在以CRB0017_IgG4關節內處理之後以劑量依賴性方式降低。
一些蛋白水解酶除其催化結構域以外亦具有作為酶與受質或抑制劑間相互作用之重要調節劑的非催化性輔助結構域。ADAMTS酶家族之成員使蛋白聚糖降解且因此具有改變組織架構且調節細胞功能之潛能。
特定而言，ADAMTS-4及ADAMTS-5可在各種位點裂解聚集蛋白聚糖，從而自組織釋放分子之含有軟骨素及硫酸角質素之區。此經證實為骨關節炎發展之早期且重要之步驟。該等酶亦可經蛋白水解為較小 同功異型物，其具有改變之蛋白水解活性。不幸的是，未知全長聚集蛋白聚糖酶之3D結構域架構，因為由於其複雜製造及純化而極難獲得該等酶之X射線結構。
迄今為止，僅可獲得ADAMTS-1、ADAMTS-4及ADAMTS-5酶之完整X射線結構之一部分(由X射線結晶學解決之結構僅包含催化性與去整合素結構域)。且因此不可能相對於催化性結構域推斷所有結構域之排列及定向。由Mosyak確定之ADAMTS-4及ADAMTS-5之催化性結構域與去整合素結構域之晶體結構(Mosyak等人，2008.Protein Sci.17：16-21)表明該等酶在結合至抑制劑時展示「開放」形式且在自身抑制且未結合時展示「封閉」形式。基於此，作者提議成熟聚集蛋白聚糖酶以兩種異構體混合物之形式存在，其可平衡共存。在此「總體(ensemble)」中，僅此形式之一具蛋白水解活性。此外，證實兩種全長形式之ADAMTS-5與ADAMTS-4對於其天然受質聚集蛋白聚糖均具高度活性，且缺失酶之C-末端非催化性結構域使其活性大幅降低(Kashiwagi等人，2004.J Biol Chem.279：10109-10119)；(Gendron等人，2007.J Biol Chem.282：18294-18306)；(Fushimi等人，2008.J Biol Chem.283：6706-6716)。此表明結構域自身或以蛋白結合方式可干擾與更開放形式之平衡。
本發明提供證據表明針對輔助非催化性結構域(諸如ADAMTS-5之間隔子結構域)之抗體強烈抑制此蛋白之酶促活性。特定而言，由抗-間隔子結構域抗體CRB0017_IgG4獲得之結果說明以下觀點，聚集蛋白聚糖酶-2在間隔子結構域中之抑制作用比該酶在催化性結構域中之抑制作用更有效。應注意，已證實儘管CRB0017_IgG4能夠在試管內及活體內強烈抑制ADAMTS-5蛋白水解作用，但抗催化性抗體(諸如CRB0016_IgG4)無法產生此作用。
由本發明抗體(特定而言由CRB0017_IgG4)獲得之傑出結 果係歸因於其對ADAMTS-5之間隔子結構域的阻斷特性。如Troeberg所假定，藉由結合至ADAMTS-5之活性位點，本發明之抗體觸發酶呈現「封閉」形式，由此直接抑制酶或有利於酶與其天然抑制劑TIMP-3之相互作用(Troeberg等人，2009.Matrix Biol.28：463-469)。
此外，迄今獲得之資料表明，mAbCRB0017_IgG4對ADAMTS-5與多配體蛋白聚糖-4間結合之抑制作用可調節由多配體蛋白聚糖-4所介導之軟骨細胞的病理學反應。
除藉由活化之軟骨細胞誘發酶以外，藉由與基質分子及細胞表面蛋白聚糖相互作用來進一步調節多配體蛋白聚糖-4之功能。多配體蛋白聚糖-4係一種似乎對於ADAMTS-5活性至關重要之跨膜硫酸乙醯肝素蛋白聚糖。
已證實，多配體蛋白聚糖-4活性損失顯著降低鼠類DMM OA模型中之OA軟骨病理學。此在多配體蛋白聚糖-4基因剔除小鼠以及經關節內注射多配體蛋白聚糖-4特異性抗體局部處理之WT小鼠中均得以證實。試管內研究鑑別出多配體蛋白聚糖-4與ADAMTS-5之直接相互作用。另外，證實ADAMTS-5活性取決於MMP-3且後者活性由多配體蛋白聚糖-4控制。
多配體蛋白聚糖在接近膜之胞外結構域位點處經歷由基質金屬蛋白酶及胞內蛋白酶之含鋅金屬蛋白酶(metzincin)家族調節之蛋白水解裂解(一種稱作脫落之過程)，其係作為正常周轉之部分以及對外部刺激之反應，且由多種途徑來調節。除中斷多配體蛋白聚糖信號傳導以外，所釋放之可溶性胞內結構域充當拮抗劑與完整多配體蛋白聚糖競爭其配位體。儘管已知由生理學刺激物活化多配體蛋白聚糖胞內結構域脫落且認為胞內結構域具有病理生理學作用(特定而言在腫瘤形成及炎症中)，但關於如何調節其自細胞表面之釋放知之甚少。因此，可能有興趣研究抗 -ADAMTS-5 CRB0017_IgG4是否可有助於進一步理解此方法。
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 合成引子
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Claims (13)

  1. 一種抗體、其重組或合成抗原結合片段，其能夠識別且結合ADAMTS-5之SEQ ID No.2之aa.732至aa.874區的抗原決定基，該抗體、其重組或合成抗原結合片段包含由SEQ ID NO：60組成之CDRH1、由SEQ ID NO：61組成之CDRH2、由SEQ ID NO：62組成之CDRH3、由SEQ ID NO：27組成之CDRL1、由SEQ ID NO：28組成之CDRL2以及由SEQ ID NO：29組成之CDRL3。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗體、其重組或合成抗原結合片段，其包含由SEQ ID NO：3組成之VL鏈和由SEQ ID NO：4組成之VH鏈。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體、其重組或合成抗原結合片段，其係單株抗體或嵌合或人類化或去免疫化或完全人類抗體。
  4. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體、其重組或合成抗原結合片段，其係用於治療及/或預防與軟骨退化相關之病狀。
  5. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體、其重組或合成抗原結合片段，其係用於人類治療及/或預防骨關節炎或類風濕性關節炎。
  6. 一種編碼根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體、其重組或合成抗原結合片段的核酸分子。
  7. 根據申請專利範圍第6項之編碼抗體、其重組或合成抗原結合片段之核酸分子，其包含至少一個選自由SEQ ID No.99至SEQ ID No.100組成之群之核酸序列。
  8. 一種編碼根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體的表現載體。
  9. 一種包含根據申請專利範圍第6項或第7項之核酸之宿主細胞。
  10. 根據申請專利範圍第9項之宿主細胞，其產生根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體。
  11. 一種製備根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體的方法，其包含培養根據申請專利範圍第10項之產生該抗體的細胞及自細胞培養物回收該抗體。
  12. 一種醫藥組成物，其包含至少一種根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體、其重組或合成抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
  13. 根據申請專利範圍第12項之組成物，其係用於關節內投藥。
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