MX2014012295A - Anticuerpos anti-ad amts-5, derivados y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintéticos de los mismos capaces de reconocer y enlazarse a un epítopo comprendido en el dominio spacer de ADAMTS-5, ácidos nucleicos y vectores de expresión que codifican la misma, el método de producción y usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-AD AMTS-5, DERIVADOS Y USOS DE LOS MISMOS Campo De La Invención Esta invención se refiere a anticuerpos anti-ADAMTS-5 útiles en el tratamiento de una condición asociada con la degradación del cartílago.

En particular, tal degradación se observa en la osteoartritis y en otras formas de artritis.

Antecedentes de la técnica La osteoartritis (OA) es un grupo de la superposición de distintas enfermedades, que pueden tener diferentes etiologías pero biológicas similares, morfológica, y los resultados clínicos. El proceso de la enfermedad no sólo afecta al cartílago articular, pero involucra a toda la articulación, incluyendo el hueso subcondral, ligamentos, cápsula, membrana sinovial, y los músculos periarticulares . En última instancia, el cartílago articular degenera con fibrilación, fisuras, ulceración, y la pérdida de grosor completo de la superficie articular. Esta condición se caracteriza por áreas focales de pérdida de cartílago articular dentro de las articulaciones sinoviales, asociados con la hipertrofia de hueso (osteofitos y esclerosis ósea subcondral) y engrosamiento de la cápsula. Se puede interpretar como la reacción de las articulaciones sinoviales a las lesiones. Este fenómeno puede ocurrir en cualquier articulación, pero es más común en las articulaciones seleccionadas de la mano, la columna vertebral, la rodilla, el pie y la cadera. Este cambio patológico, cuando graves, como resultado cambios radiológicos (pérdida de espacio articular y osteofitos), que han sido utilizados en estudios epidemiológicos para estimar la prevalencia de la OA en diferentes sitios conjuntas. Los mecanismos moleculares y celulares en la base de la aparición de la OA son, en la actualidad, desconocido; Es la hipótesis de que la carga anormal, así como traumas pueden tener un papel , pero parece cierto que la genética y los factores hereditarios también están involucrados. La inflamación, cuando está presente, sólo es secundaria a un evento primario.

OA es la forma más común de artritis. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que, a nivel mundial, el 9,6% de los hombres y el 18% de las mujeres mayores de 60 años tienen artrosis sintomática, la clasificación de la OA como la cuarta causa de discapacidad en mujeres y la octava causa en los hombres . Se considera que el riesgo de discapacidad es la misma para OA de la rodilla como para la enfermedad cardíaca.

La artritis reumatoide (RA) , otra forma común de artritis, es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por sinovitis articular que conduce a la degradación del cartílago, la erosión ósea y el dolor, lo que conduce a una discapacidad severa y mortalidad prematura .

Aunque la OA y RA pueden ser provocados por diferentes causas y progreso de acuerdo a las diferentes vías, que comparten el proceso subyacente que consiste de un desequilibrio en la síntesis de la matriz del cartílago y la descomposición, lo que lleva a la destrucción del cartílago articular que a su vez se traduce en el movimiento articular restringido, inestabilidad de la articulación, el dolor y la discapacidad crónica. Por otra parte, a pesar del impresionante número de pacientes afectados por la OA y RA, se sabe relativamente poco sobre su etiología, patogenia y progresión. Aún más impresionante, existen muy pocos agentes, modificadores de la enfermedad medicamentos antirreumáticos (DMARD) para su tratamiento, y se limitan principalmente a la AR.

Para OA, en ausencia de una cura, el tratamiento puede ser sólo paliativos, está limitada al uso de la COX-2 inhibidores selectivos, tales como celecoxib, y fármacos anti-inflamatorios no esteroideos tradicionales (AINE) , tales como el naproxeno y el diclofenaco o drogas, incluso mayores para el control del dolor, como el acetaminofeno . Una clase adicional de medicamentos, que incluye compuestos tales como la condroitina y sulfato de glucosamina, también existe como una opción de tratamiento para la OA, pero muchos médicos no están convencidos de su eficacia.

En cuanto a la AR, en la última década, el uso óptimo de FARME, en particular, el metotrexato y la disponibilidad de nuevos agentes biológicos, normalmente soportado por los AINE y/o corticosteroides para proporcionar alivio del dolor, así como para controlar la inflamación en alguna medida han mejorado dramáticamente el éxito de su gestión. Sin embargo, los DMARD tradicionales tienen un inicio de acción lento y la toxicidad que exige una monitorización frecuente. Por otra parte, el uso de AINE se ha visto ensombrecido por los efectos secundarios gastrointestinales, al considerar los fármacos AINE clásicos, y por los efectos secundarios cardiovasculares y renales al considerar los inhibidores selectivos de la COX-2.

Por lo tanto, la investigación de nuevos agentes terapéuticos que impidan la degradación del cartílago es de gran interés, ya que OA y RA afectan a millones de personas en todo el mundo, con una incidencia esperada en aumento con el aumento de la edad promedio de la población.

La degradación del cartílago que ocurre en la OA y RA es el resultado de la escisión enzimática de sus componentes estructurales. El cartílago está constituida principalmente por los condrocitos y una matriz extracelular (ECM) que consiste de los proteoglicanos (principalmente agrecano) , colágenos y agua. Dentro de la matriz, la interacción entre agrecano, ácido hialurónico (HA) y colágeno de tipo II proporciona el cartílago con la compresibilidad y elasticidad único, propiedades biomecánicas para las funciones de movimiento de la articulación y la carga de peso. Agrecano consta de tres regiones globulares : Gl y G2 cerca del extremo N-terminal de la proteína y G3 en el extremo C-terminal. Las regiones Gl y G2 están separadas por un dominio interglobular corto (IGD) mientras que las regiones G2 y G3 están separadas por una región de enlace de (GAG) glicosaminoglicano . El dominio Gl constituye, a través de una proteína accesoria, la región de enlace de agrecano para HA. La región de enlace GAG de agrecano proporciona la alta densidad de carga aniónica necesario para retener el agua y que confiere al cartílago sus propiedades osmóticas únicas necesarias para garantizar su funcionalidad. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos bioquímicos que conducen a la escisión agrecano podría ayudar en el desarrollo de agentes terapéuticos adecuados para bloquear o controlar la enfermedad OA. La pérdida de la integridad del cartílago en la artritis se asocia con integridad del agrecano deteriorado debido a la escisión proteolítica de la proteína. Agrecanasas (agrecanasa-2 , principalmente, también llamados ADAMTS-5 y agrecanasa-1 , también llamado ADAMTS-4) , se han identificado recientemente como uno de los principales enzimas para la degradación del cartílago. En particular, las publicaciones Glasson et al, 2005 Naturaleza. 434: 644-648) y Stanton et al, 2005 Naturaleza. 434: 648-652), demostraron que ADAMTS-5 desempeña un papel fundamental en los cambios en las articulaciones patológicas asociadas con dos modelos de OA y AR en el ratón. Ambos ADAMTS-4 y -5 son endopeptidasas glutamil y unirá agrecano en cinco sitios específicos: Glu373-Ala374 (interglobular dominio-IGD) , Glul545-Glyl546 , Glul714-Glyl715, Glul819-Alal820 y bonos Glul919- Leul920 (secuencia humana) , lo que resulta en la destrucción del cartílago .

ADAMTS-4 humana (figura 1, SEQ ID NO: 1) y ADAMTS-5 (figura 1, SEQ ID NO: 2) son las metaloproteinasas de multidominio secretadas desde la célula en el espacio extracelular . Ambas enzimas tienen una disposición de dominio similar que consta de una secuencia de señal (SS) , un prodominio (Pro) , un dominio catalítico de la metaloproteinasa (Cat) , una desintegrina (Dis) de dominio, un tipo trombospondina I (TS) de dominio, una rica en cisteína (CysR) de dominio, y un spacer (Sp) de dominio. Además, ADAMTS-5 contiene un dominio adicional TS después del dominio spacer. Todas las regiones de dominio antes mencionadas fuera del dominio catalítico, juegan un papel importante en el reconocimiento y tratamiento de los sustratos de proteínas naturales, se denominan "exositios".

Se demostró, por e emplo, que los dominios Sp y CysR de aggrecanases contienen motivos de enlace a GAG que modulan la afinidad de las proteinasas para sus sustratos (Kashiwagi et al, 2004, J Biol Chem 279: 10109 a 10119); (Gendron et al, 2007, J Biol Chem 282: 18.294 a 18306.); (Flannery, Curr 11 614-619.) (Zeng et al, 2006, Biochim Biophys Acta 1760: 517-524).

Por lo tanto, el interés ha ido creciendo en el desarrollo de inhibidores de ADAMTS-4 y -5 para el tratamiento de OA y/o AR. Los numerosos inhibidores de la metaloproteinasa han sido desarrollados, y varios fueron probados clínicamente en pacientes con cáncer (Zucker et al., 2000. Oncogene 19:6642-6650) y la artritis reumatoide (Milner y Cawston, 2005, Curr Drogas Objetivos Inflamm Allergy 4: 363-375), pero no pudieron demostrar la eficacia y los efectos secundarios exhibidos como dolor musculoesquelético y trombocitopenia leve (Zucker et al, 2000, Oncogene 19: 6642- 6650). Estos fallos se cree que es debido a la falta de selectividad de los inhibidores y la inhibición de metaloproteinasas biológicamente importantes fuera de objetivo y otros efectos. La selectividad es un requisito previo para los inhibidores terapéuticos no tóxicos. Una forma de aumentar la selectividad contra las metaloproteinasas específicas es generar alostérico o exositio de enlace. Los inhibidores que se unen a un exositio de enzima podría bloquear la interacción con sustratos ECM natural y podría ser una alternativa atractiva a los inhibidores dirigidos al sitio activo debido a que pueden ser altamente específicos y efectivos para bloquear la hidrólisis de sólo el sustrato objeto, minimizando así los efectos secundarios in vivo (Troeberg et al, 2008, FASEB J 22: 3515-3524).

La solicitud WO 2011/002968 describe un anticuerpo capaz de enlazarse a tanto el dominio catalítico y el dominio desintegrin de ADAMTS-5 humanos. Los documentos WO 01/11074 y WO 00/53774 revelan una proteína ADAMTS-5 y se refieren generalmente a anticuerpos contra tal proteína.

Descripción De La Invención En la presente invención, los autores aislaron anticuerpos que reconocen y se unen a un epítopo comprendido en el dominio spacer de ADAMTS-5 (nombre anticuerpos anti-Sp_ADAMTS-5) . Los anticuerpos son útiles para aplicaciones terapéuticas en seres humanos . Típicamente, Los anticuerpos son completamente humanos o quiméricos o humanizados para minimizar el riesgo de respuestas inmunes contra Los anticuerpos cuando se administra a un paciente. Como se describe aquí, otras moléculas de enlace al antígeno tales como, por ejemplo, antígeno de enlace a fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos y moléculas específicas múltiples, pueden ser diseñados o derivados de tales anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención muestran una acción inhibidora contra la degeneración de la matriz del cartílago, que controlan la matriz del cartílago y la producción de enzimas degradantes que mejoran la síntesis de la matriz del cartílago, por lo tanto tratan y/o previenen la degradación del cartílago. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser utilizado en el tratamiento y/o prevención de una condición asociada con la degradación del cartílago. Tal condición incluye la osteoartritis (OA) , artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) , la gota, la artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico, artritis séptica, polimialgia reumática, espondilitis anquilosante, seudogota, polimiositis , fibromialgia o enfermedad de Lyme.

En particular, Los anticuerpos de la presente invención, se pueden usar para tratar y/o prevenir la enfermedad clasificada en la primera etapa a la etapa avanzada de la OA y RA. Cada etapa de la etapa inicial a la etapa avanzada de la OA se clasifica de acuerdo a la clasificación OARSI y Mankin.

En ambas patologías, las enfermedades clasificadas en ninguna de las calificaciones o puntajes antes mencionados van acompañados de la degeneración del cartílago como condición de la enfermedad. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados eficazmente para tratar o prevenir las enfermedades clasificadas en la etapa inicial a la etapa avanzada de la OA y RA. Los fragmentos de enlace a anticuerpos de dichos anticuerpos, así como moléculas que comprenden dichos fragmentos de enlace a antígeno, incluyendo fragmentos de ingeniería de anticuerpos, derivados de anticuerpos, anticuerpos biespecífieos y otras moléculas multiespecíficas , son también objeto de la invención .

Las composiciones y equipos farmacéuticos u otros artículos que comprenden Los anticuerpos de la invención son también parte de la invención.

Es por tanto un objeto de la invención, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos capaces de reconocer y enlazarse a un epítopo comprendido en el aa. 732 a aa. región 874 de SEQ ID No. 2 de ADAMTS-5. Preferiblemente, el epítopo está comprendido en aa. 732 a aa 745 de SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 746 a aa 763 de SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 764 a aa 779 de SEQ ID NO. 2, preferiblemente en aa 780 a aa 795 de la SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 796 a aa 811 de SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 812 a aa 827 de SEQ ID NO. 2, preferiblemente en aa 828 a aa 843 de SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 844 a aa 859 de SEQ ID No. 2, preferiblemente en aa 860 a aa 874 de SEQ ID No. 2. Todavía preferiblemente , el epítopo está comprendido en el aa . 757 a 771 aa región de SEQ ID NO. 2 Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos, como se describe anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria (CDRH3) al menos una cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89 y 92.

Preferiblemente, el anticuerpo, los fragmentos, recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos como se describen más arriba comprende una cadena pesada región determinante de la complementariedad de secuencia de aminoácidos (CDRH2) que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID No. 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 y 91.

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos, recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos de la invención comprende además complementaria secuencia de aminoácidos de una región determinante complementaria de la cadena pesada (CDRHl) tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO . 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 y 90.

En una modalidad preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno o sintéticos de los mismos como se describe anteriormente comprende además la secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria (CDRL3) al menos una cadena ligera que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste de: SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 y 59.

En una modalidad preferida, el anticuerpo, fragmentos recom inantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención comprende además la secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria (CDRL2) una cadena ligera que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 y 58.

En una modalidad preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos como se describe anteriormente comprende además la secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria (CDRLl) una cadena ligera que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 y 57.

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos regiones determinantes de la complementariedad (CDRHl) que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 y 90 y una cadena pesada regiones determinantes de la complementariedad (CDRH2) secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 y 91 y una cadena pesada regiones determinantes de la complementariedad (CDRH3) secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89 y 92.

En una modalidad preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos como se describe anteriormente comprende además una secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDRLl) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 y 57 y secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDRL2)que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 y 58 y una secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDEL3) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 y 59.

En una modalidad aún preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos como se describe anteriormente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad CDRHl al menos 80% a la SEQ ID No. 60, una secuencia de ácido amino CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 61, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos CDRH3 80% de identidad con SEQ ID No. 62.

En una modalidad todavía más preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención comprende además una secuencia de aminoácidos CDRHl que tiene una identidad al menos 80% a la SEQ ID No. 27, una secuencia de aminoácidos CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 28 y una secuencia de aminoácidos CDRL3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 29.

En una modalidad todavía más preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos como se describe anteriormente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad CDRHl al menos 80% a la SEQ ID No. 81, una secuencia de ácido amino CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 82 y una secuencia de aminoácidos CDRH3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 83. En una modalidad todavía más preferida, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención comprende además una secuencia de aminoácido CDRLl que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NO. 48, una secuencia de ácidoamino CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 49 y una secuencia de aminoácidos CDRL3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 50.

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención comprende una secuencia de aminoácidos CDRHl que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 87, una secuencia de ácido amino CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 88 y una secuencia de aminoácidos CDRH3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 89. Todavía preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la misma comprende además una secuencia de aminoácidos CDRLl que tiene una identidad al menos 80% con la SEC ID No. 54, una secuencia de ácido amino CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 55 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos CDRL3 80% de identidad con SEQ ID No. 56.

En la presente invención "al menos 80% de identidad" significa que la identidad puede ser al menos 80% o al menos 85% o 90% o 95% o 100% de identidad de secuencia con las secuencias mencionadas.

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos como se describió anteriormente es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo quimérico o humanizado, o un desinmunizada o un anticuerpo completamente humano.

Es un objeto adicional de la invención, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos como se describió anteriormente para uso médico. Preferiblemente, para uso en el tratamiento y/o prevención de una condición asociada con la degradación del cartílago, tales como osteoartritis y/o la artritis reumatoide. Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos como se describió anteriormente se puede utilizar para el tratamiento de respuestas patológicas mediadas por syndecan-4, en particular respuestas patológicas de condrocitos mediadas por syndecan-4.

Es un objeto adicional de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintético de los mismos como se definen anteriormente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención comprende al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.99 a la SEQ ID No. 120. Preferiblemente, la nucleico ácido comprende al menos una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO.: 99, 100, 113, 114, 117 y 118.

Es un objeto adicional de la invención un vector de expresión que codifica el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención.

Es un objeto adicional de la invención una célula huésped que comprende el ácido nucleico como se describe anteriormente. Preferiblemente, la célula huésped produce Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención.

Es un objeto adicional de la invención, un método para producir el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención que comprende cultivar la célula que produce el anticuerpo como se describió anteriormente y recuperar el anticuerpo del cultivo celular. Es otro objeto de la invención una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos, como se describe arriba y excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición comprende una cantidad eficaz del anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos. Las composiciones farmacéuticas son convencionales en este campo y se pueden preparar por el técnico en la materia sólo se basa en el conocimiento general común. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo y/o un fragmento y/o un derivado recombinante y/o un conjugado del mismo en mezcla con un excipiente y/o vehículo por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable se incluyen en el alcance de la presente invención .

En una modalidad preferida, la composición según la invención es para uso en la administración intraarticular .

También es un objeto de la invención un método para tratar y/o prevenir una afección asociada con la degradación del cartílago, tales como osteoartritis , artritis reumatoide y otras formas de artritis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos del mismo como se ha descrito anteriormente. También es un objeto de la invención un método para tratar y/o prevenir la destrucción de las articulaciones, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias que comprende administrar una cantidad eficaz terapéutica del anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético del mismo como se ha descrito anteriormente.

Es un objeto de la invención un método para reducir y/o inhibir ADAMTS-5, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos como se describió anteriormente. En la presente invención los mutantes de las CDR descritas pueden ser generados mediante la mutación de uno o más aminoácidos en la secuencia de las CDR. Se sabe que una única sustitución de aminoácido apropiadamente posicionado en una CDR puede ser suficiente para mejorar la afinidad. Los investigadores han utilizado mutagénesis dirigida al sitio para aumentar la afinidad de algunos productos de inmunoglobulina por aproximadamente 10 veces. Este método de aumentar o disminuir (es decir, modulación) de afinidad de anticuerpos por mutantes CDR es de conocimiento común (véase, por ejemplo, Paul, WE, 1993). Por lo tanto, la sustitución, deleción o adición de aminoácidos para las CDR de la invención para aumentar o disminuir (es decir, modulan) la afinidad de enlace o especificidad es también dentro del alcance de esta invención.

En aras de la brevedad, el anticuerpo preferido de acuerdo con la presente invención se identifica con el nombre CRB0017 (que comprende la SEQ ID No. 3 y N 2 ID SEC 4), CRB0102 (que comprende la SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 18) y CRB0123 (que comprende la SEQ ID No. 21 y SEQ ID No. 22) como se indica en la Tabla III. Aunque la presente invención se centra en tales anticuerpos, como una ej emplificación de la presente invención, un técnico en la materia apreciará que, una vez dada la presente descripción, otros anticuerpos similares, y fragmentos de anticuerpos de los mismos, así como fragmentos de anticuerpos de estos anticuerpos similares pueden ser producidos y utilizados dentro del alcance de la presente invención. Tales anticuerpos similares pueden ser producidos por una cantidad razonable de experimentación por los técnicos en la materia.

Todavía preferiblemente, el anticuerpo es un fragmento scFv, Fv, un fragmento Fab, un F (ab) 2 fragmento, un anticuerpo multimérico, un péptido o un fragmento proteolítico que contiene la región de enlace al epítopo. Preferiblemente, el fragmento scFv comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID No. 125-132 y SEQ ID NO. 135, 136, 137.

Es un objeto adicional de la presente invención un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o derivados funcionales de los mismos de la invención, o hibridar con el ácido nucleico anteriormente, o consiste en una secuencia degenerada del mismo.

El proceso para la preparación del anticuerpo monoclonal está dentro de las habilidades de los técnicos en la materia y comprende cultivar la célula huésped y aislar el anticuerpo de acuerdo con procedimientos estándar .

En lo que se refiere a los aspectos industriales de la presente invención, el anticuerpo descrito en el presente documento se formula adecuadamente en composiciones farmacéuticas como se hace normalmente en este campo técnico.

Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender al menos un CDRH como se definió anteriormente que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones de no más de 4 aminoácidos, preferiblemente de no más de 2 aminoácidos . Los anticuerpos de la presente invención puede comprender además al menos un CDRL como se definió anteriormente que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones de no más de 4 aminoácidos, preferiblemente de no más de 2 aminoácidos .

Los anticuerpos de la invención compiten por el enlace a ADAMTS-5. El método para tratar o prevenir una condición asociada con la degradación del cartílago, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos como se describió anteriormente. En algunos aspectos, la invención comprende un método de inhibir la unión de ADAMTS-5 al agrecano en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos como se describió anteriormente.

Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace a antígeno sintéticos de los mismos de la invención se unen selectivamente al dominio Spacer de ADAMTS-5, preferiblemente con una Kd que es <2 nM.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para tratar o prevenir una condición asociada con la degradación del cartílago en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención simultánea o secuencialmente con un agente que bloquea específicamente el dolor.

El anticuerpo, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención son anticuerpos neutralizantes (es decir, un anticuerpo que reduce o suprime la actividad biológica del antígeno relacionado) que se une a ADAMTS-5 y reduce la probabilidad de que ADAMTS-5 se une a agrecano .

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención se unen a ADAMTS-5 en una ubicación dentro de los residuos 732 a 874 de la SEQ ID NO: 2 En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención, cuando se une a ADAMTS-5, se coloca 8 angstroms o menos a partir de al menos uno de los siguientes residuos de ADAMTS -5: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741 , S742 , K743 , G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751 , P752 , E753 , G754, A755, T756, H757, 1758, K759, V760, R761 , Q762 , F763 , K764, A765, 766, D767, Q768, T769, R770, F771 , T772 , A773 , Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781 , G782 , E783 , Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M791 , 1792 , S793 , T794, S795, E796, T797, 1798, 1799, D800, 1801 , N802 , G803 , T804, V805, M806, N807, Y808, S809, G810, W811 , S812 , H813 , R814, D815, D816, F817, L818, H819, G820, M821 , G822 , Y823 , S824, A825, T826, K827, E828, 1829, L830, 1831 , V832 , Q833 , 1834, L835, A836, T837, D838, P839, T840, K841 , P842 , L843 , D844, V845, R846, Y847, S848, F849, F850, V851 , P852 , K853 , K854, S855, T856, P857, K858, V859, N860, S861 , V862 , T863 , S864, H865, G866, S867, N868, K869, V870, G871 , S872 , H873 o T874 En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de los bloques de la invención un anticuerpo para ADAMTS-5 de la unión dentro de 8 angstroms de un residuo de ADAMTS-5. En algunas modalidades, el residuo de ADAMTS-5 se selecciona de al menos uno de los siguientes ADAMTS-5 residuos: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741, S742, K743, G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751, P752, E753, G754, A755, T756, H757, 1758, K759, V760, R761, Q762, F763, K764, A765, K766, D767, Q768, T769, R770, F771, T772, A773 , Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781, G782, E783, Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M791, 1792, S793, T794, S795, E796, T797, 1798, 1799, D800, 1801, N802, G803 , T804, V805, M806, N807, Y808, S809, G810, W811, S812, H813, R814, D815, D816, F817, L818, H819, G820, M821, G822, Y823, S824, A825, T826, K827, E828, 1829, L830, 1831, V832, Q833 , 1834, L835, A836, T837, D838, P839, T840, K841, P842, L843, D844, V845, R846, Y847, S848, F849, F850, V851, P852, K853, K854, S855, T856, P857, K858, V859, N860, S861, V862, T863, S864, H865, G866, S867, N868, K869, V870, G871, S872, H873 o T874 • Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de la invención se une a ADAMTS-5 en una posición que se superpone con una ubicación en la que se une el agrecano a ADAMTS-5.

Preferiblemente, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la invención reduce la probabilidad de que agrecano se unirá a ADAMTS-5 dentro de 8 angstroms de al menos uno de los siguientes residuos en ADAMTS-5: T732, K733, 1734, V735, G736, T737, F738, N739, K740, K741, S742, K743, G744, Y745, T746, D747, V748, V749, R750, 1751, P752, E753, G754, A755, T756, H757, 1758, K759, V760, R761, Q762, F763, K764, A765, 766, D767, Q768, T769, R770, F771, T772, A773, Y774, L775, A776, L777, K778, K779, K780, N781, G782 , E783, Y784, L785, 1786, N787, G788, K789, Y790, M791, 1792, S793, T794, S795, E796, T797 , 1798, 1799, D800, 1801, N802 , G803, T804, V805, M806, N807, Y808, S809, G810, W811, S812, H813, R814, D815, D816, F817, L818, H819, G820, M821, G822, Y823, S824, A825, T826, K827, E828, 1829, L830, 1831, V832, Q833, 1834, L835, A836, T837, D838, P839, T840, K841, P842, L843, D844, V845, R846, Y847, S848, F849, F850, V851, P852, K853, K854, S855, T856, P857, K858, V859, N860, S861, V862 , T863, S864, H865, G866, S867, N868, K869, V870, G871, S872, H873 o T874.

La invención proporciona formulaciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo como se describe aquí, un tampón que mantiene el pH en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 6.5, y opcionalmente, un agente tensioactivo.

Las formulaciones son típicamente para un anticuerpo como se describe en el presente documento, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de los mismos de las invenciones de concentración del principio activo de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml . En ciertas modalidades, el anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintético de la misma concentración es de aproximadamente 0.1 mg/ml a 1 mg/ml; preferiblemente de 1 mg/ml a 10 mg/ml, preferiblemente de 10 a 100 mg/ml .

Para los fines del presente documento, una "composición farmacéutica" es una que está adaptada y adecuada para la administración a un mamífero, especialmente un ser humano. Así, la composición se puede utilizar para tratar una enfermedad o trastorno en el mamífero. Además, el anticuerpo en la composición ha sido sometida a uno o más pasos de purificación o aislamiento, de tal manera que el contaminante (s) que pueda interferir con su uso terapéutico ha sido separado del mismo. Generalmente, la composición farmacéutica comprende la proteína terapéutica y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición es generalmente estéril y se puede liofilizar. Las preparaciones farmacéuticas se describen con más detalle a continuación.

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo/anticuerpos se pueden preparar mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores fisiológicamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes (Ciencias Farmacéuticas de Remington 16a edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y pueden incluir tampones , antioxidantes, conservantes, péptidos, proteínas, polímeros hidrófilos, agentes tales como EDTA, azúcares, quelantes contra-iones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) .

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de conservación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) microcápsula, respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences 16 a edición, Osol, A. Ed. , 1980). Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. En otra modalidad, para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anti-SP-ADAMTS-5 anticuerpo/anticuerpos de la presente invención, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 mg/kg a 15 mg/kg del anticuerpo o fragmento del mismo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .

La composición de anticuerpos debe ser formulada, dosificará y administrará de un modo consistente con la buena práctica médica. Los anticuerpos/derivados de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía apropiada. Esto incluye (pero no se limita a) intraperitoneal , intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraarticular, intratraqueal , oral, enteral, parenteral, intranasal o administración dérmica. Un modo preferido de administración es la vía intraarticular. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar una enfermedad o trastorno. El anticuerpo no necesita ser, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente.

El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero no limitado a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) , y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban el antígeno deseado de actividad de enlace.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no sea un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une el antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab') 2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos .

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más, y por el contrario, los bloques de anticuerpo de referencia de enlace del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más. Un ensayo de competición ejemplar se proporciona en el presente documento.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, igD, igE, IgG, e igM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl , IgG2 , IgG3 , IgG4, IgAl, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan [alfa] , [delta] , [épsilon] , [gamma], y [mu], respectivamente.

El término "región Fe" en el presente documento se utiliza para definir una región C- terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye la secuencia nativa regiones Fe y regiones Fe variantes . A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de residuos de aminoácidos en la región Fe o una región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, también llamado el índice de la UE, como se describe en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable diferentes los residuos de región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable en general consta de cuatro FR dominios: FRl, FR2 , FR3 y FR . En consecuencia, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FRl-Hl (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4. Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define aquí.

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped", y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que el ácido nucleico exógeno se ha introducido, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones . La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como filtrado o seleccionada en la célula originalmente transformada en el presente documento. Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos o de otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace a antígeno no humanos .

Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos que aparecen más frecuentemente en una selección de VL de inmunoglobulina humana o secuencias marco VH. Generalmente, la selección de inmunoglobulina humana de VL o VH de secuencias es un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91- 3242, Bethesda MD (1991), vols . 1-3.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos desde HVR no humanos y residuos de aminoácidos de FR humanos. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y la totalidad o sustancialmente todos los FRs corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivado de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sido objeto de humanización.

Un anticuerpo "desinmunizada" es un anticuerpo con inmunogenicidad reducida basado en la interrupción de enlace de HLA, la obligación subyacente de la estimulación de células T.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa aquí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, Los anticuerpos de cuatro cadenas nativas comprenden seis HVR; tres en el VH (HI, H2, H3), y tres en el VL (LI, L2 , L3 ) . HVR comprenden generalmente residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) , siendo este último de mayor variabilidad de secuencia y/o involucrados en el reconocimiento del antígeno. Los ejemplos de bucles hipervariables se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (LI), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol Biol 196: 901- 917, 1987). Los ejemplos de CDR (CDR-Ll, CDR-L2 , CDR-L3 , CDR-Hl , CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos 24-34 de LI, 50-56 de L2 , L3 de 89-97, 31-35B de HI , 50-65 de H2 , y H3 de 95-102 (Kabat et al, secuencias de proteínas de interés inmunológico, Servicio 5th Ed. Public Health, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 1991) . Con la excepción de CDRl en VH, CDRs generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. CDR también comprenden "residuos especificidad determinante" o "DEG", que son los residuos que entran en contacto con el antigeno. DEG están contenidas dentro de las regiones de los CDR-llamados-CDR abreviados, o un CDR. CDRs a- ejemplares (a-CDR-Ll, un-CDR-L2, un-CDR-L3, un-CDR-Hl , una CDR-H2 , ? un-CDR-H3 ) se producen en los residuos de aminoácidos 31-34 de LI, 50-55 de L2, 89-96 de L3 , 31-35B de HI , 50-58 de H2 , y H3 de 95-102 (Ver Almagro y Fransson, Front Biosci 13:.. 1619-1633, 2008) . A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, Los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, a excepción de posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contiene de forma natural mutaciones que ocurren o que surja durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes siendo generalmente presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, Los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitado a, el procedimiento del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación de fago, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales que se describe en este documento.

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, la terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de este tipo de productos terapéuticos .

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de varias maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los técnicos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la alineación de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan .

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es en tal forma como para permitir que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en el mismo para ser eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que la formulación sería administrada.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante, conservante o .

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales de los mismos tales como "tratar" o "tratamiento") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que está siendo tratado, y se pueden realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la estado de la enfermedad, y la remisión o mejora el pronóstico. En algunas modalidades, Los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para retardar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de un anticuerpo de cadena pesada o ligera que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena de la cadena pesada y ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio comprende cuatro regiones conservadas marco (FR) y tres regiones hipervariables (HVR, Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Inmunología, 6a ed. , H Freeman and Co., página 91, 2007) . Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de enlace al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para escrutar una genoteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (Véase, por ejemplo, Portolano et al, J. Immunol. 150: 880- 887, 1993; Clarkson et al, Nature 352: 624-628, 1991) .

El término "vector", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está vinculado. El término incluye el vector como un auto replicar la estructura del ácido nucleico, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión" .

En otro aspecto, el anticuerpo o derivados de los mismos comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) secuencia que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %) , 98%), 99%), o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24.

En otro aspecto, el anticuerpo o derivados de los mismos comprende un dominio variable de cadena ligera (VK o VL) secuencia que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%), 98%), 99%), o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ó 23.

En ciertas modalidades, la secuencia de VH o secuencia de VK/VL que tiene al menos 80%>, 85%>, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o identidad de 99% a dicha SEQ ID No. contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones respecto a la secuencia de referencia, pero un ADAMTS-5-anti-Sp anticuerpo que comprende esa secuencia retiene la capacidad de enlazarse al spacer dominio de ADAMTS-5. En ciertas modalidades, un total de 1 a 4 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en la secuencia de la CDRH3 como en la SEQ ID No. 62 En ciertas modalidades, las sustituciones, inserciones o deleciones tienen lugar en regiones fuera las HVR (es decir, en las FR) .

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es anticuerpo CRB0017, CRB0093, CRB0094, CRB0102, CRB0123, CRB0124, tal como se define en la Tabla III.

En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención tiene una constante de disociación (Kd) de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM, o <0.001 nM o menos, por e emplo, de 10 -8 M a 10 "13 M, por ejemplo, de 10 "9 M a 10 "13 M.

En una modalidad, Kd se mide mediante un ensayo de enlace a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de Fab para la unión al antígeno solución se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de (I) antígeno marcado con en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, a continuación, la captura de antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al, J. Mol Biol 293: 865-881 (1999)).

La invención se describirá ahora por medio de ejemplos no limitativos se hace referencia a las siguientes figuras .

Figura 1. Representación esquemática ADAMTS-4 y ADAMTS-5. Ambas enzimas metaloproteinasas son multidominio secretadas desde la célula en el espacio extracelular . Ambas enzimas tienen una disposición de dominio similar que consta de una secuencia de señal (SS) , un prodominio (Pro) , un dominio catalítico de la metaloproteinasa (Cat) , una desintegrina (Dis) de dominio, un tipo trombospondina I (TS) de dominio, una rica en cisteína (CysR) de dominio, y un spacer (Sp) de dominio. Además, ADAMTS-5 contiene un dominio adicional TS después del dominio spacer.

Figura 2. Análisis de Western blot de ADAMTS-5 p75 después de la purificación por FPLC, utilizando un anticuerpo contra el marcador FLAG de la proteína. Western blots se probaron con anticuerpo monoclonal que reconoce las proteínas de fusión que contienen una secuencia de péptido FLAG (Sigma Aldrich, monoclonal anti-FLAG M2 , dilución 1: 1000). Para la detección usando sustrato de peroxidasa quimioluminiscente, un anti-IgG de ratón-peroxidasa (1: 10,000) fue empleado. Ts5 = ADAMTS-5 células transfectadas; NT = células no transfectadas ; M = Modelo.

Figura 3. La reactividad de ELISA de anti-Sp_ ADAMTS--5 scFv aislado con spacer-GST y Control negativo GST. Spacer-GST y Antígenos GST se recubrieron a 10 g/ml. Se han usado Anti-Sp_ADAMTS-5scFvs a 50 y/o 5 mg/ml (datos no presentados) . La absorbancia media a 450 nm de los experimentos llevados a cabo en pocilios duplicados se muestra con SD indicada mediante las barras.

Figura 4. Sandwich ELISA. Curvas de dilución de IgG4 enlace CRB0017_ revestido a spacer-GST y/o GST en solución a 30 g/ml . Como anticuerpo secundario un anticuerpo anti-GST (1: 1000) se usó después de una HRP anti-IgG de conejo (1: 2000) para la detección final. La absorbancia media a 450 nm de los experimentos llevados a cabo en pocilios duplicados se muestra con SD indica mediante las barras.

Figura 5. El análisis cinético de enlace CRB0017_lgG4 Spacer-GST en la solución usando Biacore X-100. 5610 RU de CRB0017_lgG4 fueron inmovilizados en el chip CM5. La asociación y la disociación se realizaron para 180s y 800s, respectivamente. Las constantes cinéticas y de afinidad determinados para la interacción CRB0017_IgG4/Spacer-GST se muestran en la siguiente tabla.

Figura 6. inmunoprecipitación (IP) de ADAMTS-5 longitud completa (TS5-FL) por CRB0017_IgG4. 0.1 ug de dializado/purificado por afinidad TS5-FL se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti CRB0017_IgG4 Sp_ADAMTS-5 (11, 22 y 25 ug en el carril 1, 2 y 3, respectivamente) o con 11 ig de anticuerpo no relacionado como un negativo el control (carril 4) . Los inmunoprecipitados se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (1: 1000). CRB0017_IgG4-inmunoprecipitó se observó ~ 81kDa banda TS5-FL correspondiente a la proteína p75 TS5-FL. La masa molecular de la proteína inmunoprecipitada TS5-FL es ligeramente mayor que la predicha a partir de su composición de aminoácidos. Esta diferencia se debe a la N-glicosilación en los dominios Dis, CysR, Sp y para O-glicosilación en el dominio C-plazo. Marcadores de masa molecular se indican a la izquierda de la figura.

Figura 7. IP de ADAMTS-4 de longitud completa (TS4- FL) por CRB0017_IgG4. 0.2 \ig de TS4-FL dializado/de afinidad purificada se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti CRB0017_IgG4 Sp_ADAMTS-5 (30 y 60 mg en el carril 1 y 2, respectivamente) o con un anticuerpo no relacionado (30 g) como un control negativo (carril 3) . En el carril 4/afinidad purificada se dializó TS4-FL se cargó como control positivo. Los inmunoprecipitados se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (1: 1000). Se observó inmunoprecipitado CRB0017_IgG4-banda de 75 kDa ~ TS5-FL correspondiente a la proteína de p68 TS4-FL. La masa molecular de la proteína inmunoprecipitada TS4-FL es ligeramente mayor que la predicha a partir de su composición de aminoácidos y esto es debido principalmente a N y O-glicosilación en la proteína. Los marcadores de masa molecular se indican a la izquierda de la figura.

Figura 8. Efecto de anti-Sp_ADAMTS-5 IgG4 en la proteólisis in vitro de cartílago bovino inducida por IL-la. La figura representa la actividad de IL-5 ng/ml en ausencia o presencia de CRB0017 lgG4 después de 48 h de incubación (tres experimentos independientes diferentes) . Como control negativo en cada uno de los experimentos se utilizó una IgG4 humana nativa (Serotec) . Como control positivo en cada experimento un Inhibidor ADAMTS-5 sintético (Comp 23) y una natural de Inhibidor ADAMTS-5 se utilizaron (TIMP-3) . Los resultados se expresan como% de liberación de GAG, es decir, la cuantificación de los glicosaminoglicanos (GAGs) en forma de fragmentos de agrecano liberados del cartílago en el cultivo. Este método mide la eficiencia de citoquinas en la simulación del metabolismo del cartílago.

Figura 9. Evaluación del efecto de los ADAMTS-5 HelixB- CRB0016_IgG4 de enlace de proteínas en el modelo de ratón STR/ORT de la osteoartritis . CRB0016_lgG4 se administró por vía intraarticular en ambas rodillas de cada animal, una vez al inicio del experimento y otra vez después de 6 semanas, a dosis de 1.2 y 12 ug/rodilla. Tres meses después de la primera administración, CRB0016_IgG4 no modificó el curso de OA en la cepa de ratón STR/ORT, según la evaluación histo-patológicamente . El Grado se define como la profundidad de la lesión a través del cartílago articular. La etapa se define como la extensión horizontal de la participación de cartílago dentro de un lado de un compartimento conjunto independientemente del grado subyacente. Tomados en conjunto, constituyen tanto un índice de la severidad o progresión patológica del proceso de artrosis, y de hecho la puntuación OARSI se define como grado x etapa. La pérdida de células se define como la fracción de los condrocitos articulares que han sufrido muerte celular, dentro del compartimento articular considerado. GAG (glicosaminoglicano) se define como la pérdida y evaluado por la pérdida de una mancha catión que presenta metacromasia hacia GAG, tales como por ejemplo azul de toluidina o safranina O. Mankin ha definido su puntuación como la suma de grado, la pérdida de células y la pérdida de GAG, mientras que la puntuación total se define como la suma de la puntuación y la pérdida de células y GAG pérdida OARSI . Todos los parámetros anteriores constituyen características de OA, y su puntuación da una medida de la severidad y la progresión de la patología.

Figura 10. Evaluación del efecto de CRB0017_IgG4 en el modelo de ratón STR/ORT de la osteoartritis . CRB0017_lgG4 se administró por vía intraarticular en ambas rodillas de cada animal, una vez al principio del experimento y otra vez después de 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 g/rodilla. Tres meses después de la primera administración, CRB017_IgG4 mostró una actividad dependiente de la dosis en la reducción de la gravedad de la OA en el modelo de ratón ort STR. Todos los parámetros se definen como en la fig. 9.

Figura 11. A) CRB0017_IgG4 es capaz de reconocer ADAMTS-5 secretadas a partir de células permeabilizadas o no de una manera dependiente de la dosis. Como controles, anti-catalítica y dos anti-dominio cys de ADAMTS-5 se utilizaron anticuerpos comerciales. B) CRB0017_IgG4 no una reacción cruzada con cualquier proteína de la superficie celular de las células HEK293.

Figura 12. Sobrenadantes cosechados a partir de los Hek293 -ADAMTS-5 (ADAMTS-5 cond. Médium) y Hek293 (HEK-293 cond. Médium) fueron desafiados en un sándwich de ELISA utilizando mAb CRB0017_IgG4 en el recubrimiento como se describe en el siguiente, sección de material "no mAb CRB0017 "es una condición de control en el que los pozos no están recubiertas con CRB0017_IgG4 , " ningún medio "es una condición de control en el que no se añadió a los pocilios sobrenadante y" Ab " " es una condición de control en el que sólo se añadió el anticuerpo secundario a los pocilios. Como se muestra en la figura, CRB0017_IgG4 es capaz de reconocer ADAMTS-5 secretadas a partir de células HEK293 que expresan las células con una alta especificidad.

Figura 13. Modelo unilateral medial del menisco lagrimal (MMT) es un modelo de rata quirúrgico ampliamente utilizado de la OA de rodilla. Rápidamente los cambios degenerativos progresivos ocurridos, que consisten en los condrocitos y la pérdida de proteoglicanos , la fibrilación de la matriz y la hendidura, la formación de osteofitos. Una semana después de la cirugía, las ratas se trataron por vía intraarticular con CRB0017_IgG4 35pg/rodilla, CRB0017 70yg/rodilla, o vehículo. Después de 3 semanas de la inyección a los animales fueron sacrificados y las articulaciones femorotibiales procesados para histología. Todos los resultados histológicos fueron dosis-dependiente disminuyeron un tratamiento con CRB0017_IgG4 comparación con el vehículo.

Figura 14. Inhibición competitiva de mAb ADAMTS-5 que se unen a placas recubiertas con CRB0017 mAb por libre sindecano-4. mAb CRB0017 (2 ug/ml en tampón de recubrimiento) se adsorbe a inmunoplacas antes de bloquear. ADAMTS-5 (4 pg/ml) en presencia de sindecano-4 se incubaron (0.1 ug/ml) antes de añadir a la inmovilizada mAb CRB0017. ADAMTS-5 se unen a placas recubiertas con CRB0017 mAb se revelaron utilizando anti-FLAG anticuerpo comercial.

Figura 15. mAb anti-spacer CRB0017_IgG4 , CRB0093_IgG4, CRB094_IgG4 CRB0124_IgG4 y son capaces de reconocer longitud ADAMTS-5 específicamente completo en sándwich ELISA con especificidad comparable. mAb CRB0123_IgG4 mostrar una mayor capacidad de enlace para ADAMTS-5 que los otros mAbs anti-spacer en este ensayo.

Descripción Detallada De La Invención Descripción De Las Secuencias SEQ ID NO: 1: A S4_HUMAN Un desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 4 (UniProtKB/Swiss-Prot : 075173.3) SEQ ID NO 2: ATS5_HÜMAN Un desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 5 (UniProtKB/Swiss-Prot : Q9UNA0.2) En el siguiente: VK = cadena ligera, la cadena pesada de VH -, - CDRL región determinante de la complementariedad de la cadena ligera, CDRH = región determinante de la complementariedad de cadena pesada.

SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 125 a 132 y SEQ ID NO: 135 a SEC ID NO: 137 son secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 95 a 120 son las secuencias de nucleótidos .

SEQ ID NO: 3, CRB0017VK SEQ ID NO: 4, CRB0017VH SEQ ID NO: 5, CRB0018VK SEQ ID NO: 6, CRB0018VH SEQ ID NO: 7, CRB0019V SEQ ID NO: 8, CRB0019VH SEQ ID NO: 9, CRB0091V SEQ ID NO: 10, CRB0091YH SEQ ID NO: 11, CRB0092VL SEQ ID NO: 12, CRB0092VH SEQ ID NO: 13, CRB0093VK SEQ ID NO: 14, CRB0093VH SEQ ID NO: 15, CRB0094VL SEQ ID NO: 16, CRB0094VH SEQ ID NO: 17, CRB0102V SEQ ID NO: 18, CRB0102VH SEQ ID NO: 19, CRB0122VL SEQ ID NO: 20, CRB0122VH SEQ ID NO: 21, CRB0123VK SEQ ID NO: 22, CRB0123VH SEQ ID NO: 23, CRB0124VL SEQ ID NO: 24, CRB0124VH SEQ ID NO: 25, CRB0016VK SEQ ID NO: 26, CRB0016VH SEQ ID NO: 27, CDRL1_17 SEQ ID NO: 28, CDRL2_17 SEQ ID NO: 29, CDRL3_17 SEQ ID NO: 30, CDRL1_18 SEQ ID NO: 31, CDRL2_18 SEQ ID NO: 32, CDRL3_18 SEQ ID NO: 33, CDRL1_19 SEQ ID NO: 34, CDRL2_19 SEQ ID NO: 35, CDRL3_19 SEQ ID NO: 36, CDRL1_91 SEQ ID NO: 37, CDRL2_91 SEQ ID NO: 38, CDRL3_91 SEQ ID NO: 39, CDRL1_92 SEQ ID NO: 40, CDRL2_92 SEQ ID NO: 41, CD L3_92 SEQ ID NO: 42, CDRL1_93 SEQ ID NO: 43, CDRL2_93 SEQ ID NO: 44, CDRL3_93 SEQ ID NO: 45, CDRL1_94 SEQ ID NO: 46, CDRL2_94 SEQ ID NO: 47, CDRL3_94 SEQ ID NO: 48, CDRL1_102 SEQ ID NO: 49, CDRL2_102 SEQ ID NO: 50, CDRL3_102 SEQ ID NO: 51, CDRIil_122 SEQ ID NO: 52, CDRL2_122 SEQ ID NO: 53, CDRL3_122 SEQ ID NO: 54, CDRL1_123 SEQ ID NO: 55, CDRL2_123 SEQ ID NO: 56, CDRL3_123 SEQ ID NO: 57, CDRL1_124 SEQ ID NO: 58, CDRL2_124 SEQ ID NO: 59, CDKL3_124 SEQ ID NO: 60, CDRH1_17 SEQ ID NO: 61, CDRH2_17 SEQ ID NO: 62, CDRH3_17 SEQ ID NO: 63, CDRH1_18 SEQ ID NO: 64, CDRH2_18 SEQ ID NO: 65, CDRH3_18 SEQ ID NO: 66, CDRH1_19 SEQ ID NO: 67, CDRH2_19 SEQ ID NO: 68, CDKH3_19 SEQ ID NO: 69, CDRH1_91 SEQ ID NO: 70, CDRH2_91 SEQ ID NO: 71, CDRH3_91 SEQ ID NO: 72, CDRH1_92 SEQ ID NO: 73, CDRH2_92 SEQ ID NO: 74, CDRH3_92 SEQ ID NO: 75, CDRH1_93 SEQ ID NO: 76, CDRH2_93 SEQ ID NO: 77, CDRH3_93 SEQ ID NO: 78, CDRH1_94 SEQ ID NO: 79, CDRH2_94 SEQ ID NO: 80, CD H3_94 SEQ ID NO: 81, CDRH1_102 SEQ ID NO: 82, CDRH2_102 SEQ ID NO: 83, CDRH3_102 SEQ ID NO: 84, CDRH1_122 SEQ ID NO: 85, CDRH2_122 SEQ ID NO: 86, CDRH3_122 SEQ ID NO: 87, CDRH1_123 SEQ ID NO: 88, CDRH2_123 SEQ ID NO: 89, CDRH3_123 SEQ ID NO: 90, CDRH1_124 SEQ ID NO: 91, CDRH2_124 SEQ ID NO: 92, CDRH3_124 SEQ ID NO: 93, lexA-Spacer SEQ ID NO: 94, Spacer-GST SEQ ID NO: 95, CRB0016_V SEQ ID NO: 96, CRB0016_IgG4 SEQ ID NO: 97, CRB0017_VK_CK SEQ ID NO: 98, CRB0017_IgG4 SEQ ID NO: 99, CRB0017_VK SEQ ID NO: 100, CRB0017_VH SEQ ID NO: 101, CRB0018_VK SEQ ID NO: 102, CRB0018_VH SEQ ID NO: 103, CRB0019_VK SEQ ID NO: 104, CRB0019_VH SEQ ID NO: 105, CRB0091_VK SEQ ID NO: 106, CRB0091_VH SEQ ID NO: 107, CRB0092_VL SEQ ID NO: 108, CRB0092_VH SEQ ID NO: 109, CRB0093_VK SEQ ID NO: 110, CRB0093_VH SEQ ID NO: 111, CRB0094_VL SEQ ID NO: 112, CRB0094_VH SEQ ID NO: 113, CRB0102_VL SEQ ID NO: 114, CRB0102_VH SEQ ID NO: 115, CRB0122_VL SEQ ID NO: 116, CRB0122_VH SEQ ID NO: 117, CRB0123_V SEQ, ID NO: 118, CRB0123_VH SEQ ID NO: 119, CRB0124_VL SEQ ID NO: 120, CRB0124_VH SEQ ID NO: 121, HUMAN SPACER DOMAIN_AA SEQ ID NO: 122, HELIX_B_ADAMTS-5_AA SEQ ID NO: 123, HUMAN SPACER DOMAIN SEQ ID NO: 124, HELIX_B_ADAMTS-5 SEQ ID NO: 125, CRB0017_SCFv SEQ ID NO: 126, CRB0018_SCFv SEQ ID NO: 127, CRB0019_SCFv SEQ ID NO: 128, CRB0091_scFv SEQ ID NO: 129, CRB0092_ScFv SEQ ID NO: 130, CRB0093_scFv SEQ ID NO: 131, CRB0094_SCFv SEQ ID NO: 132, CRB0102_scFv SEQ ID NO: 133, HUMAN ADAMTS-5_cDNA SEQ ID NO: 134, HUMAN ADAMTS-4_CDNA SEQ ID NO: 135, CRB0122_scFv SEQ ID NO: 136, CRB0123_scPv SEQ ID NO: 137, CRB0124_SCFv SEQ ID NO: 138, enlace de péptido pe<zueño SEQ ID NO: 139- 116, cebadores sintéticos MATERIALES Y MÉTODOS Colección de SPLINT a partir de linfocitos humanos.

El desarrollo de anticuerpos terapéuticos para uso en el tratamiento de enfermedades humanas ha sido durante mucho tiempo un objetivo de muchos investigadores en el campo de anticuerpos . Una manera de obtener estos anticuerpos es a través Individual Pot Colección de anticuerpos intracelulares (colecciones SPLINT) construidos a partir de linfocitos humanos. La tecnología SPLINT expresa colecciones clonadas en vectores pMVl scFv humano (fragmento de anticuerpo de una sola cadena) , un vector derivado de pLinker220 vector (Visintin et al, 2004 J Immunol Met ods 290: 135-153), como la fusión al dominio de activación VP16. Las regiones variables están vinculadas con un pequeño conector pept dico (SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT, ID SEC N2 138) . pMVl contiene gen LEU2 que permite el mantenimiento del plásmido y selección en medio que carece de leucina en la cepa de levadura L40 y el gen bla que permite la selección del plásmido en E. coli.

Para la construcción de SPLINT humanas colecta las donaciones de sangre periférica de un centenar, se utilizaron donantes no inmunizados. Se recogieron aproximadamente 2-20 mi de muestras de sangre de cada donante. Los linfocitos B se aislaron de sangre periférica mediante el uso de Ficoll placa reactivo (Amersham, EE.UU.). Brevemente, la muestra de sangre diluida (1: 1 de sangre por PBS) se depositó cuidadosamente en la parte superior de la placa del reactivo de Ficoll, y después la solución de dos fases se centrifugó a 400 xg durante 30 minutos. Linfocitos B se recogieron de la interfase entre las dos fases. ARN total fue extraído de los linfocitos B por el R easy Mini Equipo (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se preparó a partir de los linfocitos B y se agruparon juntos antes de ser utilizado para el aislamiento de AR m. mRNA se preparó utilizando Oligotex mRNA Mini equipo (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. ThermoScript™ RT-PCR System (Invitrogen) se utilizó para reacciones de síntesis de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Oligo (dT) 20 se utiliza para sintetizar cDNA de los genes en v repertorio. Con el fin de reducir el sesgo de la amplificación, los autores realizaron 62 (por hS PL T NT ¾ uuS_ PLINT_09) y 75 (para huSPLlNT 10) reacciones independientes de PCR para amplificar segmentos de genes V, usando todas las combinaciones posibles dentro de un conjunto de cebadores (véase la Tabla para huSPLINT_09 I; para huSPLINT 10 véase la Tabla II) .

Las secuencias de los cebadores, que en teoría abarcan todo el repertorio de genes de anticuerpos humanos, se obtuvieron de IMG /GENE-DB (Giudicelli et al, 2005 Stud Health Technol Inform. 116: 3-8), y modificados de acuerdo a protocolos publicados previamente (Sblattero y Bradbury, 1998 Immunotechnology 3: . 271-278); (Marks et al, 1991, Eur J Immunol 21:. 985-991); (Orlandi et al, 1992, Biotecnología 24: 527-531.) . En este método, el individuo pesada y de cadena ligera reorganizado regiones variables se amplifican por separado y están vinculados a través de una serie de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la superposición de los pasos para dar los productos finales de scFv que se utilizan para la clonación (Visintin et al, 2004 J Immunol Methods . 290: 135-153.) . Las reacciones de PCR para huSPLINT_9 (Tabla I) incluyen siete VH cebadores directos emparejados con cuatro cebadores inversos VH que generaron un total de veintiocho reacciones; cebadores directos mientras que cuatro VK emparejados con cuatro cebadores inversos generaron un total de dieciséis reacciones; y nueve cebadores directos ?? emparejados con dos cebadores traseros ?? generaron un total de dieciocho reacciones .

Tabla I: Cebadores traseros y delanteros huSPLINT_09 PCR (rv) (fw) para cadena humana de genes V CEBADORES SECUENCIA TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG SEQ ID No. 139 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA SEQ ID No . 140 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG SEQ ID No. 141 VHfw TTATCCTCGAGCGGTACCGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY SEQ ID No . 142 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTCCAGCTKGTRCAGTCTGG SEQ ID No . 143 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG SEQ ID No . 144 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG SEQ ID No. 145 GATTGGTTTGCCGCTAGCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG SEQ ID No . 146 GATTGGTTTGCCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT SEQ ID No . 147 VHrv GATTGGTTTGCCGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGT SEQ ID No. 148 GATTGGTTTGCCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC SEQ ID No . 149 AGCAAGCGGCGCGCATGCCGACATCCRGDTGACCCAGTCTCC SEQ ID No. 150 V]fw AGCAAGCGGCGCGCATGCCGAAATTGTRWTGACRCAGTCTCC SEQ ID No . 151 AGCAAGCGGCGCGCATGCCGATATTGTGMTGACBCAGWCTCC SEQ ID No . 152 AGCAAGCGGCGCGCATGCCGAAACGACACTCACGCAGTCTC SEQ ID No . 153 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATTTGATTTCCACCTTGGTCC SEQ ID No. 154 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATTTGATCTCCASCTTGGTCC SEQ ID No . 155 Vlrv GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATTTGATATCCACTTTGGTCC SEQ ID No. 156 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC SEQ ID No . 157 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC SEQ ID No. 158 AGCAAGCGGCGCGCATGCCTCCTATGWGCTGACWCAGCCAC SEQ ID No . 159 AGCAAGCGGCGCGCATGCCTCCTATGAGCTGAYRCAGCYACC SEQ ID No . 160 AGC AGCGGCGCGCATGCCCAGCCTGTGCTGACTC RYC SEQ ID No . 161 VUfw AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC SEQ ID No . 162 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGCCWGKGCTGACTCAGCCMCC SEQ ID No . 163 AGCAAGCGGCGCGCATGCCTCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC SEQ ID No. 164 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT SEQ ID No . 165 AGCAAGCGGCGCGCATGCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCC SEQ ID No . 166 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATAGGACGGTSASCTTGGTCC SEQ ID No. 167 Vürv GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC SEQ ID No. 168 VL PTfw CGCTGGATTGTTATTACTCGCAGCAAGCGGCGCGCATGCC SEQ ID No . 169 VL PTrv ACCGCTCGAGCCTTCACCGGAACCTGGTTTCCCAGAACCGCTGGTCGACCCTCC SEQ ID No. 170 GGAGGGTCGACCAGCGGTTCTGGGAAACCAGGTTCCGGTGAAGGCTCGAGCGGTA SEQ VH PT f ID No. 171 VH PTrv CCAGGCCCAGCAGTGGGTTTGGGATTGGTTTGCCGCTA SEQ ID No . 172 VL_FINAL TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC SEQ ID No. 173 f VH_FINAL TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG SEQ ID No . 174 rv Las reacciones de PCR para huSPLINT IO (Tabla II) luyen seis VH cebadores directos emparejados con cuatro cebadores inversos VH que generaron un total de veinticuatro reacciones; mientras que seis cebadores directos VK emparejados con cinco cebadores traseros VK generaron un total de treinta y reacciones; y cebadores directos siete ?? emparejados con tres cebadores traseros ?? generaron un total de veintiún reacciones.

Tabla II: Cebadores traseros (rv) y delanteros (fw) huSPLINT. PCR para cadena humana de genes V.

CEBADORES SECUENCIA AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG SEQ ID No . 175 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG SEQ ID No. 176 VHfw AGCAAGCGGCGCGCATGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG SEQ ID No . 177 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG SEQ ID No. 178 AGCAAGCGGCGCGCATGCCGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC SEQ ID No. 179 AGCAAGCGGCGCGCATGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG SEQ ID No. 180 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC SEQ ID No. 181 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC SEQ ID No. 182 VHrv GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC SEQ ID No. 183 GAAGTTATGGTCGACCCTCCGGATGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC SEQ ID No. 184 TTATCCTCGAGCGGTACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC SEQ ID No . 185 TTATCCTCGAGCGGTACCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC SEQ ID No. 186 VOfw TTATCCTCGAGCGGTACCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC SEQ ID No . 187 TTATCCTCGAGCGGTACCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC SEQ ID No. 188 TTATCCTCGAGCGGTACCGAAACGACACTCACGCAGTCTCC SEQ ID No . 189 TTATCCTCGAGCGGTACCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC SEQ ID No.190 GATTGGTTTGCCGCTAGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC SEQ ID No.191 GATTGGTTTGCCGCTAGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC SEQ ID No.192 VDrv GATTGGTTTGCCGCTAGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC SEQ ID No.193 GATTGGTTTGCCGCTAGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC SEQ ID No.194 GATTGGTTTGCCGCTAGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC SEQ ID No . 195 Vüfw TTATCCTCGAGCGGTACCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC SEQ ID No.196 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC SEQ ID No.197 TTATCCTCGAGCGGTACCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC SEQ ID No.198 TTATCCTCGAGCGGTACCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC SEQ ID No.199 TTATCCTCGAGCGGTACCCACGTTATACTGACTCAACCGCC SEQ ID No.200 TTATCCTCGAGCGGTACCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC SEQ ID No.201 GATTGGTTTGCCGCTAGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC SEQ ID No.202 Vllrv GATTGGTTTGCCGCTAGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC SEQ ID No.203 GATTGGTTTGCCGCTAGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC SEQ ID No. 204 VH PTfw CGCTGGATTGTTATTACTCGCAGCAAGCGGCGCGCATGCC SEQ ID No . 205 H PTrv ACCGCTCGAGCCTTCACCGGAACCTGGTTTCCCAGAACCGCTGGTCGACCCTCC SEQ ID No.206 GGAGGGTCGACCAGCGGTTCTGGGAAACCAGGTTCCGGTGAAGGCTCGAGCGGTA VL PT fv SEQ ID No.207 VL PTrv CCAGGCCCAGCAGTGGGTTTGGGATTGGTTTGCCGCTA SEQ ID No.208 VH FINALfw TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC SEQ ID No.209 VL FINALrv TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG SEQ ID No.210 PCR condujo a la representación en el repertorio de las regiones variables derivadas de todas las ensambles del marco concebible. Todos los cebadores que figuran ya sea BssHII o Nhel sitios de restricción o secuencia de engarce. PCR de recuperación final se podría hacer con dos cebadores (PTfw y pTRV) . Después de que los finales de repertorios de genes de scFv se había digerido secuencialmente con BssHII y Nhel, que se ligaron directamente en pre-digerido y desfosforilado vector pMVl . Desde una reacción de ligación y treinta electroporaciones para cada colección, los autores fueron capaces de obtener las últimas colecciones huSPLINT_09 y huSPLINT 10 que consisten cada uno de ~ 10 8 moléculas scFv diferentes con 0.04% de los clones desde no-inserto ligadura.

Clonación de cebo Spacer-ADAMTS-5 y expresión en células de levadura L40.

ADNc que codifica Spacer-ADAMTS-5 humana (SEQ ID No. 123.) se amplificó a partir ADAMTS-5 cebadores pSecTag2A usando: 5 ' -TGGCTGGAATTCACAAAGATTGTTGGA-3 ' SEQ ID No. 211 5 1 -GTCGACGGATCCTTAAGTGTGTGATCCCAC-3 ' SEQ ID No . 212 El EcoRI-BamHI de cDNA digerido se clonó en vector pMICBDl (Visintin y otros, Methods 2004, J Immunol 290: 135-153) diseñado para contener la resistencia bacteriana cloranfenicol , gen TRPl (que permite levadura que contiene este plásmido para crecer en medio mínimo carente triptófano) y el origen de la replicación 2µ. Este plásmido contiene toda la región de la proteína lexA Escherichia coli, expresada a partir de la alcohol deshidrogenasa de levadura I (ADHl) promotor, seguido de un polienlazador para la inserción de ADNc, para generar fusiones en el marco ciones a lexA. Cebo se secuenció para confirmar fusión en marco del inserto con dominio de enlace a lexA en el vector.

Las células de levadura L40 se transíectaron con cebo Sp_ADAMTS-5/MlCBDl vector mediante el uso de protocolo de transformación de acetato de litio. Los transformantes se analizaron para prototropía histidina en YC-Lys/- Ura/-Sus/placas -Trp (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1: 790; Visintin et al, 2004 J Immunol Methods 290:. 135-153; Visintin y otros, 2004 Métodos 34: 200-214; Visintin et al, 2002, J Mol Biol 317: 73-83.; Visintin et al, 1999, Proc Nati Acad Sci EE.UU. A. 96: 11723-. 11728). Colonias de levadura se ensayó la actividad de ß-galactosidasa utilizando filtros de elevación de colonias, como se describe previamente (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1:. 790). La transfección de la carnada no resultó en la activación del gen lacZ (datos no mostrados ) .

Clonación De Cebo Helixb- ADAMTS-5 y Expresión en Células de Levadura L40.

ADNc que codifica una a-hélice (helixB, SEQ ID No. 124.) en la posición de la superficie del dominio catalítico humano de ADAMTS-5 se ensamblan usando los cebadores : 5 ' -AATTCAACGCTGCCACCACACTCAAGAACTTTTGCAAGTGGCAGCACCAACACAAC TAACTGCA-3 ' SEQ ID No. 213 5 ' -GTTAGTTGTGTTGGTGCTGCCACTTGCAAAAGTTCTTGAGTGTGGTGGCAGCGTTG -3 ' SEQ ID No. 214 El EcoRI-PstI de cDNA digerido se clonó en vector pMICBDl (Visintin et al, 2004 J Immunol Methods 290:. 135-153) . Células de levadura L40 se transíectaron con helixB cebo/MICBDl vector mediante el uso de protocolo de transformación de acetato de litio. Los transformantes se ensayaron para determinar la prototrofia de histidina en YC-Lys/- Ura/His/placas Trp (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1: 790.) . Colonias de levadura se ensayó la actividad de ß-galactosidasa utilizando filtros de elevación de colonias, como se describe previamente (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1: . 790) . La transfección de la carnada no resultó en la activación del gen lacZ (datos no mostrados) .

Análisis Western Blot del cebo Spacer-ADAMTS-5.

Un cultivo de levaduras durante toda la noche se diluyó en 5 mi de medio de YC a OD600 0.15 y crecido a 30°C hasta una DO600 de 0.6. 1 mi de cultivo se centrifugó a lOOOOxg durante 5 min y el sedimento celular se resuspendió en tampón de Laemmli, se resolvieron en 12% SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore) . Se usó anticuerpo policlonal anti-LexA (Invitrogen) , seguido por anti-conejo-HPR (DAKO) . Se utilizó el sistema de quimioluminiscencia ECL- (Amersham) para la detección (datos no presentados) .

Selecciones de SPLINT.

Las colecciones SPLINT se transformaron en la cepa de levadura L40 expresar el cebo (Sp ADA TS- 5/MICBDl o HelixB-ADAMTS-5/MICBDl) usando el método de acetato de litio y la selección como se describe (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1:. 790 ; Visintin et al, 2004 J Immunol Methods 290: 135-153.; Visintin et al, 2004 Métodos 34: 200-214; Visintin et al, 2002 JMol Biol 317: 73-83.; Visintin et al, 1999, Proc Nati Acad Sci EE.UU. A. 96: 11723-11728) . Células de levadura transformadas se sembraron en medio sólido que carece de Trp (W) , Leu (L) , uracilo (U) , Lys (K) y Su (H) (YC-WHULK) . La expresión de marcador selectivo Trp (W) se proporciona por el plásmido pMICBDl, Leu (L) por el plásmido pMVl, y uracilo (U) , Lys (K) y Su (H) son marcadores prototroph de la cepa de levadura. Los clones positivos se cultivan en medio selectivo YC-WHULK. ß-galactosidasa ensayos se realizaron como se describe (Visintin y Cattaneo, 2001 Antibody Engineering 1: 790; Visintin et al, 2004 J Immunol Methods 290: 135-153.; Visintin et al, 2004 Métodos 34: 200. -214; Visintin et al, 2002, J Mol Biol 317: 73-83.; Visintin et al, 1999, Proc Nati Acad Sci EE.UU. A. 96: 11.723-11728). 11 anti-Sp_ADAMTS-5scFvs positivos fueron aislados después de la revisión secundaria de cuatro detección independiente de diferentes colecciones SPLINT (mSPLINT, huSPLINT_09 y huSPLINT 10) . Los resultados de las selecciones realizadas para Sp AMTS AD-5 cebo se resumen en la Tabla III.

Tabla III. Resumen de selecciones Sp_ADAMTS-5 SPLINT CEBO COLECCIÓN DE N. ? CLONES N. ? CLONES CLON CRB SEQ ID SPLINT (I (II No. exploración) exploración ) Clonación y expresión de la proteína recombinante Spacer- ADAMTS-5-GST.

El Dominio spacer humano de ADAMTS-5 (SEQ ID NO.: 121 y 123) se clonó en los sitios de restricción Xhol NCO de pET41b (Novagen) . El ADNc que codifica el dominio spacer se amplificó a partir ADAMTS-5 pSecTag2A usando los cebadores: 5 ' -ATCCATGGTCACAAAGATTGTTGGAACC-3 ' SEQ ID No . 215 5' -ATCTCGAGTTAAGTGTGTGATCCCACTTTATTG-3 ' SEQ ID No . 216 Sp_ADAMTS-5-GST/plásmido pET41b se transformó en Rosetta 2 (DE3) de E. coli (Novagen) por el sistema de transformación de choque térmico (Hanahan, 1983, J Mol Biol 166: 557-580) y placa sobre LB Kan/Cam placas.

Al día siguiente, una sola colonia se inoculó y se diluye en medios lOmL LB Kan/Cam. Las bacterias transformadas se cultivaron durante la noche a 37 °C agitación a 250 rpm.

Al día siguiente, las bacterias que crecen durante la noche se diluyeron en 500 mi de medios LB Kan/Cam y luego paseaban a crecer a 37 °C con 250 RPM de agitación ya que el cultivo ha llegado a OD (600) = 0.7. Después, se añadió 0.2 mM (concentración final) de IPTG. Las bacterias inducidas se incubaron durante 5-6 horas a 25°C con de sacudida de 250 RPM. Las bacterias fueron centrifugadas, finalmente, a 6000 rpm durante 15 minutos y se congeló a -80°C.

Reformateo de anti-ADAMTS-5scFvs a la totalidad de Los anticuerpos igG.

Se formatearon Anti-catalytic_ADAMTS-5 CRB0016 y scFv anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0017 scFv a la totalidad de Los anticuerpos igG quiméricos mediante el acoplamiento de los dominios variables de enlace a antígeno murino a dominios constantes humanos. Para cada anticuerpo los ADNc que codifican la cadena ligera y pesada (Fe de IgG humana 4) fueron generados por GENEART (Alemania) con sitios de restricción adecuados para la subclonación. Las secuencias fueron optimizadas para la expresión en mamíferos (línea de células CHO-S) (SEQ.ID. NO: 95 y 96; 97 y 98). Después de la síntesis de ambas cadenas, los ADNc se subclonaron en plásmidos de expresión (pcDNA3.1 derivados que contienen un promotor de CMV extendida para la expresión del gen de interés) usando HindIII y Xhol como sitios de clonación. Para cada cadena de anticuerpo, se generaron dos plásmidos de expresión: un plásmido que contiene el ADNc que codifica la cadena ligera, que contiene el ADNc que codifica la cadena pesada. El plásmido de expresión que contiene las inserciones correctas se verificó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN del inserto.

Anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0093, CRB0094, CRB0102, CRB0123 y CRB0124 scFv también se reordenada a todo totalmente humanos igG4 anticuerpos siguiendo el procedimiento adoptado para la clonación CRB0016 y CRB0017 descrito anteriormente .

Producción de anticuerpos quiméricos recombinantes CRB0016_IgG4 y CRB0017_IgG4 de células transfectadas.

Anti-ADAMTS-5 anticuerpos fueron producidos a partir de células transfectadas. Células CHO-S fueron transfectadas con plásmidos que codifican CRB0016 y CRB0017 cadenas pesadas y ligeras. El medio acondicionado de las células transfectadas fue recuperado mediante la eliminación de las células y los desechos. Los medios condicionados clarificados se cargaron en la columna de proteína A-sefarosa. Los enlaces no específicos se eliminaron mediante lavados con tampón de enlace ampliamente (20 mM fosfato de sodio pH 7.0). Las proteínas de anticuerpo unido en la columna de proteína A se recuperaron por elución ácida anticuerpo de la proteína A (0.1 M glicina-HCl pH 3.0). Las proteínas eluidas se neutralizaron inmediatamente con 1 M Tris-HCl pH = 9.0 (???µ? por fracciones eluidas mi). Fracciones eluidas reunidas se dializan frente a PBS. Proteínas de Los anticuerpos agregados se separaron por cromatografía de exclusión de tamaño.

Purificación de proteínas recombinante Spacer-ADAMTS-5-GST.

Descongelada Sp_ADAMTS-5-GST inducida y bacterias que expresan se resuspendió en 20 mi de tampón de lisis (PBS, 10 mg/ml de DNasa, 20 mg/ml Lisozima) . Los precipitados resuspendidos se incubaron durante 45 minutos a 4°C con balanceo. Después de incubación bacterias lisadas se sometieron a ultrasonidos en hielo durante 3 veces (15 segundos cada uno) . Después de 10 minutos de centrifugación a 6000 rpm a 4°C se recogió el sobrenadante, se filtró con filtro de 02 mieras ? y procesa para la purificación. Trampa columna GST (GE) estaba conectado con purificador AKTA (GE) y se lavó con 5CV de agua a 5 ml/min de flujo. Luego la columna se lavó con 5CV de PBS a 5 ml/min de flujo. A continuación, la columna se conectó a una bomba peristáltica y se carga en lmL/min de flujo con sobrenadante filtrado. Después de lavar con PBS a 5CV de 5 ml/min de flujo de la columna se vuelve a conectar a AKTA purificador y se lavó de nuevo con 2CV de PBS a 5 ml/min de flujo. La proteína se eluyó en 100% de tampón de elución (PBS, Lomm glutatión) . Las fracciones del pico se recogieron en tubos eppendorf de 2 mi. Piscina de 3 fracciones principales centrales diluidas en PBS se concentró usando Amicon Ultra 15 de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Concentrado de proteína se cuantificó con Proteína 80 Bioanalyser (Agilent) . Las alícuotas fueron almacenadas a -80°C.

Expresión y replegamiento de anti-Sp_ADAMTS-5scFvs en el citoplasma de E. coli.

Los Fragmentos anti Sp_AD AMT S -5 scFv (SEQ, ID 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 135, 136, 137) se subclonaron en los sitios de restricción Ncol/Notl de pETM-13 bacteriana vector impresión. E. coli plásmido BL21DE3 que albergan la impresión se cultivó en 500 mi de 2YT/Camping gama media Hasta mediados de la fase exponencial (OD 600 = 0.75) y la inducida con IPTG Entonces (1.5 mm) durante 5-6 horas a 37°C con adicional Sacudiendo (180 rpm) . Las células fueron Harvester a 6000rpm (Beckman) y los sedimentos se utilizan para los cuerpos de inclusión (IB) preparación. Un método de impresión a gran escala como cuerpos de inclusión de E. coli fue optimizada, utilizando in vitro replegado (Patil et al, 2008 JBiotechnol 134: 218-221 Epub 2008 01 2018); (Umetsu et al, 2003 J Biol Chem 278: Desde 8979 hasta 8987 Epub 2003 Ene 8977). El sedimento se resuspendió en 5 ml/gl con tampón de IBR (Tris 50 mM/HCl, EDTA 0.5 mM, 20 microgramos/mi lisozima, g/ml de DNasa a pH 8) y putt en Sacudir la placa para la LH a TA. La muestra se sometió a ultrasonidos durante 45 segundos en hielo durante tres pulsos, seguido de 1 min de incubación en hielo. El lisado se centrifugó durante Lómin Luego, a 4°C a 6000 rpm. El sedimento se resuspendió en 20 mi de tampón de lavado 1 (Lomm Tris pH 8, EDTA, 1% de Tritón X-100) , y se agitaron entonces los cuerpos de inclusión se sedimentaron por centrifugación a 10.000 rpm durante Lómin a 4°C. El sedimento se lavó con 20 mi de tampón de lavado 2 (Lomm Tris pH 8, EDTA, 1 M NaCl), vórtex y se centrifugó a 10,000 rpm Luego, a 4°C durante Lómin. Por último sedimento se lavó con tampón de lavado 20 mi 3 (Lomm Tris pH 8, EDTA IMM) , vórtex y se centrifugó a 10.000 rpm durante Lómin a 4°C. La preparación del IB se solubilizó en 5mLg-l con tampón de solubilización (lOOmM Tris /HCl; 6M guanidina HCl; ImMEDTA; lOOmM DTT a pH 8) . Las proteínas solubilizadas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente bajo agitación vigorosa. Después de bajar el pH de la solución de proteína a pH 4 con 1 M HCl, el material insoluble se eliminó por centrifugación a 10,000 rpm durante Lómin. Con el fin de remover DTT del soluto se realizó un triple diálisis contra el tampón IBD (6 M guanidina HCl a pH 4) . Las proteínas solubilizadas y cuantificados se diluyeron 35 mg/L, lo más rápidamente posible, en tampón frío REF ( lOOmMTris/HCl ; 0.5m arginina; 375µ? oxidado glutatión-1 ; 5 iran EDTA a pH 8.5). La solución de proteína se dispensó cada 50 minutos con la pipeta directamente en el búfer REF mientras vortex. Después de 16 h de la última adición de la muestra fue el primer concentrado y el restante se elimina por diálisis en tampón guanidina IEXA (según empleó posteriormente protocolo lonic mayoría de scFv y por lo tanto el tipo de cambio) . Los scFv replegadas se purificaron por cromatografía de intercambio iónico almacenado en alícuotas a -80°C.

Especificidad ELISA; Anti-Sp_ADAMTS-5 scFv versus Sp_ADAMTS-5-GST.

Nunc Maxi Sorp-Immunoplate se revistió con lOOmL Sp_ADAMTS-5-GST y GST en 10ug/ml en tampón de recubrimiento (lOOmM Na 2 C0 3 pH 9.6) . Placa se incubó durante la noche a 4°C. día siguiente, los antígenos no unidos se descartaron y la placa se lavó 3 veces con PBS . La unión no específica se bloqueó añadiendo 200 mi de PBS al 3% (3% de leche sin grasa en PBS) . La placa se incubó durante lh a TA. Placa se lavó 3xTPBS (0.1% de Tween 20 en PBS) y 3xPBS. 100 µ? de dilución en serie de anti-Sp_ADAMTS-5scFv (0.5-50 mg/ml) en MPBS 3% se añadió a los pocilios apropiados. Luego la placa se incubó durante 2 horas a RT. Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS, 100 µ? de anticuerpo anti-V5 (Invitrogen) diluido 1: 5000 en MPBS 3% se añadió a cada pocilio. Placa se incubó durante lh y 30 minutos a RT. Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS 100 µ? de HRP anti-ratón (DA O) diluido 1: 2000 en MPBS se añadió a cada pocilio 3%. La placa se incubó durante lh a TA. Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS 80 ? se añadió de TMB (Sigma) . La placa se incubó en cámara oscura hasta que las muestras alcancen la señal deseada. 80 DL, de la solución de parada (500 mM H 2 SO 4) se añadió a cada pocilio antes de la lectura. Se recogieron los datos de medición de OD (450 nm) por LD 400 Detector de luminiscencia (Beckman Coulter) .

Sandwich ELISA: Anti-Sp ADA TS-5 mAb versus Sp_ADAMTS-5-GST.

Nunc Maxi Sorp-Immunoplate se revistió con dilución en serie de lOOmL de anti-inmunoglobulina Sp_ADAMTS-5 en tampón de recubrimiento (lOOmM Na2 C03 pH 9.6). Placa se incubó durante la noche a 4°C. El día siguiente, Los anticuerpos no unidos se descartaron y la placa se lavó 3 veces con PBS. La unión no específica se bloqueó añadiendo 200DL de 3% MPBS (leche libre de 3% de grasa en PBS) . LA Placa se incubó durante lh a TA. La Placa se lavó 3xTPBS (0.1% de Tween 20 en PBS) y 3xPBS. 100 µ? de Sp_ADAMTS-5-GST y GST (30 mg/ml) en MPBS 3% se añadió a los pocilios apropiados. Luego la placa se incubó durante 2 horas a RT.

Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS, 100 µ? de anticuerpo anti-GST (Sigma) diluido 1: 1000 en MPBS se añadió a cada pocilio 3%. La Placa se incubó durante lh y 30 minutos a RT. Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS 100 µ?-., de anti-conejo HRP (DAKO) diluido 1: 2000 en MPBS 3% se añadió a cada pocilio. Placa se incubó durante lh a TA. Después de lavar con 3xTPBS y 3xPBS 80 de TMB (Sigma Aldrich) se añadió. La Placa se incubó en cámara oscura hasta que las muestras alcancen la señal deseada. 80 µL, de la solución de parada (500 mM H 2 SO 4) , se añadió a cada pocilio antes de la lectura. Se recogieron los datos de medición de OD (450 nm) por LD 400 Detector de luminiscencia (Beckman Coulter) .

Evaluación de los anti-Sp_ADAMTS-5seFv y/o afinidad de mAb y constantes cinéticas por mediciones de resonancia de plasmón superficial .

Encuademación cinética de Sp_ADAMTS-5-GST enlace a anticuerpo anti-Sp AD AMT -5 S (scFv o IgG) se inmovilizaron por acoplamiento de amina en una matriz de carboximetil dextrano de un chip CM5. Los Procedimientos de inmovilización estándar se utilizaron (Schuck, 1997 Annu Rev Biophys Bio mo 1 Struct 26:. 541-566). 20-50 mg/ml de scFv o IgG se disolvió en tampón de acetato (tampón de pre-concentración adecuada al menos 2 unidades de pH por debajo del pl de la inmunoglobulina con el fin de obtener una carga neta positiva) . El nivel de inmovilización de 5000 RU para la inmunoglobulina y 1000 RU para scFv se creó para conseguir una inmovilización de baja densidad del ligando. Se utilizó la condición de la regeneración moderada del chip (tiempo de contacto de 30 segundos a Lomm glicina pH 2) .

Sp_ADAMTS-5-GST se diluyó en PBS + Tween 20 al 0.005% en tampón de corrida 5 dilución en serie (empezando en el rango micromolar y diluir 1: 2) y se aplicó a una velocidad de flujo de 30 100 µ???/p???. El paso de condición de muestra se fijó inicialmente con tiempo de contacto de 60 segundos y el tiempo de disociación de 400 segundos. Sobre la base de los sensograms resultantes, en la etapa cinética/afinidad, las concentraciones de analitos, tiempo de contacto, el tiempo de disociación y la solución de regeneración se ajustaron.

Los datos fueron analizados por el software de Bioevaluation: la calidad de la conexión de datos se puede comprobar el valor de C i 2 y del valor U.

Evaluación de la capacidad de enlace de anti- spacer ADAMTS 5-mAbs a antígeno objeto ADAMTS-5. mAbs anti-spacer CRB0017_IgG4 , CRB0093_IgG4 , CRB0094_IgG4, CRB0123_IgG4 y CRB0124_lgG4 se recubrieron en 2 mg/ml en lOOmM Na 2 CO 3 pH 9 , 6 y se incubó a 4°C durante la noche. Al día siguiente La inmunoglobulina unida se desecha fuera de la placa y lavar 3 veces con TBS . Placa se bloqueó mediante la adición de tampón de bloqueo 200100DL libre de proteínas (Pierce- sin diluir) y se incuba a 37 °C para 1 hora. Placa se lavó como anteriormente. Entonces 100 µ].,, por pocilio de ADAMTS-5 purificados (4 DL) en tampón de bloqueo (Dil. 1: 2 en TBS) y como control negativo, 100 µ por pocilio de bloqueo trato Buffer. 1: 2 en TBS se añadieron. Placa se incubó a 37°C para 1 hora. Placa A continuación se lavó 3 veces con TTBS . 100 µL por pocilio de anticuerpos de ratón anti-Flag (Sigma; bacalao F3165) dil 1: 8000 se añadió en el amortiguador de bloqueo (Dil 1: 2 con TTBS.). Placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. Lavar la placa se lavó 3 veces con TTBS. 100 100 µ?. de anticuerpo anti-ratón (DA O) diluido 1: 2000 en TTBS fue añadido y la placa se incubó a 37°C durante 1 hora. La placa se lavó finalmente 3X con TTBS y 3X con TBS. Para la detección se añadió y se incubaron en la oscuridad hasta que la señal es visible (normal 5-15 min) 100 µL de TMB. 100 L por pocilio de Solución de interrupción se añadió para detener la reacción y proceder a la medición O.D.

Clonación y expresión de formas de longitud completa ADAMTS-4 y ADAMTS-5 3xFLAG.

ADNc que codifica ADAMTS-5 humanos (. SEQ ID NO: 133) y ADAMTS-4 humana (SEQ ID NO.: 134) se amplificaron las secuencias de introducir sitio de restricción para Kpn I (5 'termini) y Xho I (3' termini) y para eliminar la región codificante de propéptido. Después de la digestión con Kpnl y hol, los insertos se subclonaron en vector pSecTag2A (Invitrogen) .

Se transfectaron ADAMTS-5 3xFLAG/pSecTag2A y ADAMTS-4 3xFLAG/pSecTag2A en FreeStyle línea celular ™ 293-F. Las células se adaptan al cultivo en suspensión en FreeStyle ™ 293 Expression Media. Agente anti-formación de grumos (Invitrogen) se añadió al medio, antes o después de la transfección. Las células fueron transfectadas con complejo FreeStyle ™ MAX Reactivo en animal- origen libre de SFM OptiMEM ™. Las células transfectadas se incubaron a 37°C, 8% de C02 en una plataforma de agitación fijado en 75 rpm. Se añadieron 100 mg/ml de heparina en la hora posterior a la transfección de cultivo de 24. ADAMTS-5 3xFLAG y ADAMTS-4 3xFLAG expresiones llegaron a una actividad de la proteína significativa de 48-72 horas después de la transfección . Después de 2-3 días, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -80°C hasta la purificación .

Purificación de proteínas ADAMTS-4 /ADAMTS-5 3xFLAG de longitud total. 300 mi de ADAMTS-5 3 FLAG/ADAMTS-4 3xFLAG sobrenadantes se cargan en lmL anti-FLAG Affinity Gel M2 (Sigma-Aldrich) . Las muestras se aplicaron a un caudal de 1 ml/min con una presión de 0.5 MPa y las columnas se lavaron con 10 volúmenes de 50 mMTris-HCl (pH 7,4), 10 mM CaCl2, 10 µ? ZnCl, 0.02% Brij- 35 que contiene 1 M de NaCl con el fin de eliminar la heparina unida a la enzima. La elución de las proteínas de fusión FLAG se logró por la competencia con 200 µ/ L de péptido 3xFLAG (Sigma-Aldrich) en tampón de reacción agrecanasa (mM Tris-HCl 50 (pH 7.4), NaCl 150 mM, 10 mM CaC12, 10 µ? de ZnCl, 0.02% de Brij-35). Una velocidad de flujo de 1 ml/min se mantuvo durante todo el procedimiento de purificación y se recogieron fracciones de 1.0 mi . Las fracciones que contenían las proteínas eluidas se sacaron juntos y se concentraron 5X utilizando un concentrador Vi aspin (Sartorius) (30 kD de corte) .

Análisis Western blot de ADAMTS-4/ADAMTS-5 3xFLAG de proteínas purificadas.

ADAMTS-5 3X FLAG y se resuspendieron ADAMTS-5 muestras FLAG purificado 3x, en tampón de muestra (Invitrogen) , se calentó durante 10 min y se cargaron en un sistema de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% (Invitrogen, Sistema de NuPage) y después se sometieron a Western secante. Las proteínas separadas se transfirieron a membrana de PVDF (GE Healthcare) . Las membranas se bloquearon 30' con Bloque de salida de la solución (Pierce) y se incubaron con el anticuerpo monoclonal LH primaria contra 3xFLAG (Sigma) 1: 1000° a RT. Después de incubación a RT° (LH) con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa anti-ratón (AbCam) , diluido 1: 10.000, bandas de proteínas se detectaron mediante el uso de Super Señal West Dura (Pierce) . Las imágenes fueron adquiridas con una cámara CCD usando un sistema de imágenes LAS3000 (Fuji) (véase la figura 2 para ADA TS-5 western blot) .

Análisis de la actividad enzimática.

Las enzimas purificadas longitud completa ADAMTS-4 3X FLAG y ADAMTS-5 3X FLAG se ensayaron para la actividad mediante un ensayo enzimático. Agrecano purificado a partir de cartílago nasal bovino atrapado en poliacrilamida (Nagase y Woessner, 1980, Anal Biochem 107: 385-392.) Se utilizó como sustrato para determinar la actividad agrecano-degradantes .

Muestras de partículas Agrecano/poliacrilamida^ (5,0 ± 0,2 mg de peso seco) se colocaron en tubos de 1.5 mi con 400µ? de TNC (M Tris-HCl 0.1, NaCl 0.1 M, 10 mM CaC12, 0.1% de CHAPS, pH 7.5) y 100 µ? de ADAMTS-4 recombinantes (P68, FL) y ADAMTS-5 (p75, FL) preparados, expresados en células transíectadas transitoriamente de estilo libre 293 y se incubaron a 37°C durante 6 o 24 h. Las reacciones se detuvieron con 500 de solución de parada (50 mM Tris, 200 mM de acetato de sodio, EDTA 100 mM, pH = 6.8) y las partículas se separaron de la fase líquida por centrifugación (10.000 rpm, 4 min, 4°C) . La cantidad de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) en el sobrenadante se determinó mediante un ensayo colorimétrico (1,9 dimetil azul de metileno, DMB) . Curva estándar (sulfato de condroitina extrae de tráquea bovina) y las muestras se diluyeron en PBS-BSA 1%. Después de un 5-20 minutos de reacción, las muestras se leyeron a 590 nm. La concentración de GAGs de cada muestra se calcula a partir de medidas de absorbancia (sustraída en blanco) y se comparó con la curva patrón de referencia.

Cartílago explante y cultivo.

Los discos de cartílago nasal bovino se obtuvieron de ocho meses tabique nasal bovino macho. En resumen, golpes 2 mm de diámetro de cartílago se obtuvieron a partir del cartílago nasal. Los punzones se lavaron primero tres veces con tampón PBS-AASS (lxPBS, 100 µL/ml de penicilina G, 100 pg/ml de estreptomicina y 2.5 µg/ml de anfotericina B) . Los punzones se incubaron posteriormente a 37°C en una atmósfera de 5% de C02, en pocilios de la microplaca que contienen DMEM 10%, 100 µ/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina y 2.5 mg/ml de anfotericina B (medio DMEM-AASS) . Después de tres horas, las muestras se lavaron con tampón de PBS-AASS y se incubaron con medio DMEM-AASS. 48h después de la preparación de las células del cartílago, las muestras se trataron con 5 ng/ml de IL-la más diferente concentración del inhibidor (es decir CRB0017_IgG4 y TIMP-3) y se incubaron en DMEM, 0.1% de BSA + AASS durante 48 h. Después se recogieron y se utilizaron para el análisis GAG tratamientos sobrenadantes y pequeños trozos de cartílago (la medición de la liberación de GAG es la cuantificación de glicosaminoglicanos - GAGs- en forma de fragmentos de agrecano liberados del cartílago en cultivo) . Los punzones de cartílagos se incubaron primero con 500 g/ml de papaína a 65°C durante 2 h para la medición del porcentaje de GAG total restante en el tejido. El glicosaminoglicans sulfatados (GAGs) la determinación se realiza mediante un ensayo colorimétrico con azul de 1.9 dimetilmetileno (DMB) . Curva estándar (sulfato de condroitina extrae de tráquea bovina) , y muestras de medio y se digirió cartílago muestras se diluyeron en PBS-BSA 1%. Después de un 5-20 min de muestras de reacción se leyeron a 590 nm.

Inmunoprecipitación de ADAMTS-5 y ADAMTS-4 3xFLAG de proteínas de longitud completa.

La inmunoprecipitación se realizó usando Proteína G inmunoprecipitación Equipo (SIGMA) . Para reducir el fondo causado por la adsorción no específica de las proteínas celulares irrelevantes a la proteína G agarosa, se desempeñasen una etapa de pre-compensación. 50 µ?? de la proteína G agarosa suspensión se añadió a la muestra (ADAMTS-5 o ADAMTS-4 proteínas purificadas) en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 2 horas a 4°C con balanceo. Los granos se sedimentó por centrifugación a 12.000 g durante 30 segundos en una microcentrí fuga y el sobrenadante recogido (muestra pre-aclarado) se transfirió a un tubo nuevo. Esta muestra se utilizó para la inmunoprecipitación. Añadir a la muestra de los anti-Sp_ADAMTS-5 y ajustar el volumen a 600 L , en tampón IP. Esta muestra se añadió a una columna de centrifugación tapado y se incubó durante la noche a 4°C. El día después, se añadió 50 ]iL, de la proteína lavada g de perlas de agarosa para la columna. Después de 2 h de incubación mecedora a 4°C la punta de la columna de centrifugación se rompió y la columna se coloca en el tubo Eppendorf de 2 mi . El tubo se centrifugó a 12,000 durante 30 segundos a 4°C. Las perlas en la columna de centrifugación se resuspendieron en 700 µL de tampón lxIP y luego la columna se centrifugó a 12,000 xg durante 30 segundos a 4°C. Esta etapa de lavado se repitió 3 veces. El último lavado se realizó con tampón O.lxIP. Las perlas se resuspendieron con 50 lx de tampón de muestras Laemmli caliente. Después de 10 minutos de incubación a 95 °C, las proteínas se eluyeron mediante centrifugación a 13,000xg durante 1 minuto. La muestra se cargó en gel de SDS-PAGE para el análisis de Western blot .

Enlace de Los anticuerpos de la presente invención en Hek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293 en formato de Cell-ELISA.

El formato ELISA basado en células permite que las proteínas celulares de destino, para ser analizadas en el mismo pozo, reduciendo así al mínimo la variabilidad entre pocilios. Se han usado la línea de células FreeStyle ™ 293-F de forma estable que expresan ADAMTS-5 3xFLAG . Las células fueron cultivadas como cultivo en suspensión en FreeStyle ™ 293 Expression Media. FreeStyle ™ células 293-F expresar ADAMTS-5 ™ células 3xFLAG y FreeStyle 293-F se sembraron en placas de 96 pocilios (100.000 células/pocilio) y se incubaron durante lh a 37°C a. Las células fueron tratadas con CRB0017_IgG4 (concentración final 10-5-2 g/ml) y se incubaron durante lh a 37 °C a. Las células fueron fijadas con 4% de p-formaldehído (50 µL/pocillo) en HBSS (con Ca/Mg) durante 15 min a RT y se permeabilizaron o no en los pocilios con 100 µ]., del 0.1% Igepal en TBS (100 µ?????????) para 15 min a TA. Las células fueron lavadas con TBS (100 µL/pocillo) seguido de inactivación con 1% de H2 02 en TBS (100 µL/pocillo) durante 20 min RT. Las células se lavaron posteriormente con TBS (100 µL pocillo) seguido de bloqueo con 5% de BSA en TBS (100 µ?/pocillo) durante 30 min RT. Después de lavar las células 3 veces con Tween al 0.1% en TBS (TTBS) - (100 µ?/pocillo) las células fueron incubadas con anticuerpo secundario (100 µ?/pocillo de anticuerpos de burro HRP anti-humana 1: 5000 en TTBS) durante 30 min a TA. Después de lavar las células 3 veces con TTBS se detectaron (200 /pocilio células añadiendo TMB 100 µL/pocillo. La reacción se detuvo con detección de 0.5 MH2 S04 ^L/pocillo) en 15 minutos. pAb Anti-ADAMTS-5 636-649 Cys (Abcam # 11918 abl) y pAb Anti-ADAMTS-5 Cys 600-700 (junto a # ab41037) se utilizaron para detectar la retención y/o la secreción eficaz de ADAMTS-5.

Evaluación de la capacidad de enlace de anticuerpos de la presente invención ADAMTS-5. mAb CRB0017_IgG4 se revistió a 2 mg/ml en lOOmM Na 2 C03 pH 9.6 y se incubó a 4°C durante la noche. Al día siguiente, la inmunoglobulina no unida fue descartada de la placa y lavar 3 veces con TBS. La Placa se bloqueó mediante la adición de proteina 200 µ?. tampón de bloqueo libre (Pierce- sin diluir) y se incubó durante 1 hora a 37°C. Placa se lavó como anteriormente. Entonces 100 ?? se añadió por pocilio de células HEK-293 -ADAMTS-5-3XFLAG o HEK-293 (control negativo) medio acondicionado suplementado con heparina 100 mg/ml . La Placa se incubó durante 1 hora a 37 °C. Placa A continuación se lavó 3 veces con TTBS . 100 pL 1 hora por pocilio de ratón Anti-Flag anticuerpos (Sigma; bacalao F3165) dil 1: 8000 se añadió en el amortiguador de bloqueo (dil 1: 2 con TTBS.). La Placa se incubó durante 1 hora a 37 °C. Placa se lavó 3 veces con TTBS Wash. 100 ]ih de anticuerpo anti-ratón (DAKO) diluido 1: 2000 en TTBS fue añadido y la placa se incubó durante 1 hora a 37°C. La placa se lavó finalmente 3X con TTBS y 3X con TBS . Para la detección se añadió y se incubaron en la oscuridad hasta que la señal es visible (normalmente 5-15 min) 100 L de TMB . 100µL por pocilio de solución de interrupción se añadió para detener la reacción y de proceder a la medición de O . D ..

Evaluación de la capacidad de syndecan-4 para interferir en CRB0017_lgG4 anti-spacer ADAMTS-5 que se enlazan al antígeno ADAMTS-5. 100 µL por pocilio de CRB0017_IgG4 (2 g/ml) se revistió en inmunoplaca en tampón de recubrimiento (2 g/ml) ? se incubaron a 4°C durante la noche. La inmunoglobulina no unida fue descartada de la placa y se lavó 3 veces con TBS . La unión no específica se bloqueó añadiendo 200µ1 por pocilio de tampón de bloqueo (no diluido) y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Mientras tanto tubos se preparan con [ADAMTS-5 (4 mg/ml) + sindecano-4 (I + D Sistema # 2 18-SD-050) en el bloqueo de dil buffer. 1: 2 en TBS; rango de concentraciones ensayadas para syndecan-4: 0.05-2 g/ml; en las condiciones establecidas para este ensayo, el efecto de interferencia máxima se ha obtenido con 0.1 mg/ml. Entonces placa se lavó como anteriormente. 100µL por pocilio de cualquiera de ADAMTS-5 (4 mg/ml) o [ADAMTS-5 (4 g/ml) + syndecan-4 (0.1 g/ml) en tampón de bloqueo dil. 1 : 2 en TBS se añadieron. Como control negativo, para algunos bien se añadieron 100 µL de bloqueo dil tampón. 1 : 2 en TBS. Algunos pocilios se añaden con 100µL de syndecan-4 (a una concentración apropiada) como control. Placa se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación la placa se lavó 3 veces con TTBS. 100µL por pocilio de anticuerpo anti-Flag (Sigma) diluido 1: 2000 en tampón de bloqueo (1 dil:. 2 con TTBS) se añadió. En los pozos con sólo syndecan-4, 100 µL por pocilio de Anti-syndecan-4 (Santa Cruz Biotechnology # sc-12766) diluido 1: 5000 en tampón de bloqueo (1 dil: 2 con TTBS) se añadió. Entonces placa se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación la placa se lavó 3 veces con TTBS. 100 µ?,. por pocilio de anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Jackson immunoResearch) diluido 1: 5000 en TTBS se añadieron y la placa se incubó durante 1 hora a 37°C. La placa se lavó finalmente 3X con TTBS y 3X con TBS y 100 µ]-, por pocilio de T B se añadió. La Placa se incubó en la oscuridad hasta que la señal era visible (normalmente 5-15 min; en todo caso no más de 30 min) . 100 L por pocilio de solución de detención fue añadido al proceder a la medición de O.D.

Evaluación del efecto de anti-ADAMTS-5 mAbs en el modelo de ratón STR/ORT de la osteoartritis .

STR/ort de ratones machos (Masón et al, 2001 Osteoartritis cartílago. 9: 85-91) se reclutaron a los 5 meses de edad (n = 20-22), aleatorizado para el tratamiento en cada jaula, con 4 animales por jaula, pesaba y se trató por vía intraarticular en cada rodilla, ya sea con anti-ADAMTS-5 IgG4 1.2 g, anti-ADAMTS-5 IgG4 12 g, o vehículo. Después de 6 semanas, la administración intraarticular de anticuerpos anti-ADAMTS-5 IgG4 fue repetido con las mismas dosis. Después de 3 meses a partir de la contratación los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y Hind extremidades explantados y se fijaron en formalina o/n. Los miembros posteriores se incluyeron en parafina, 5 -micron secciones gruesas se produjeron y se tiñeron con azul de toluidina y luego se calificó de una manera ciega de acuerdo tanto de Mankin (Mankin et al, 1971, J Bone Joint Surg Am 53:. 523-537) y los métodos OARSI (Pritzker et al, 2006 Osteoartritis cartílago 14: 13-29). Este método produce una puntuación de OA con un rango de 0-24 basado en el más avanzado grado (6) y la etapa que se extiende más (4) . El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student comparando vehículo frente a basal, y con ANOVA seguida de Dunn o pruebas de Dunnett comparando los grupos de tratamiento vs vehículo.

Evaluación de anticuerpos de la presente invención en el modelo de rata medial de desgarro meniscal (MM ) de la osteoartritis .

El desgarro de menisco medial unilateral (MMT) en ratas da lugar a cambios degenerativos del cartílago rápidamente progresiva que se caracteriza por los condrocitos y la pérdida de proteoglicanos , auricular, formación de osteofitos y la clonación de condrocitos. Cambios degenerativos progresivos ocurren 3-6 semanas después de la cirugía: la degeneración del cartílago tibial puede ser focalmente severa con cambios degenerativos de menor gravedad en la matriz circundante y osteofitos prominentes .

Se utilizaron ratas macho Lewis que pesan 200 g. Rodillas derechas fueron sometidos a cirugía o cirugía simulada. El ligamento lateral interno se secciona y el menisco medial se sujeta con una pinza hemostática y refleja próximamente hacia el fémur. El menisco se secciona con un bisturí o pequeñas tijeras quirúrgicas. Sham operación consistió en sólo abrir la piel y capsula. Una semana después de la cirugía las ratas se trataron por vía intraarticular en la rodilla operada con presentes anticuerpos invención, tales como cualquiera de CRB0017_IgG4 34 g, 72 g CRB0017_IgG4 , o vehículo. Cuatro semanas después de la cirugía los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y las rodillas operados explantaron y se fijaron en formalina o/n. y embebidos en parafina; las secciones gruesas de 5 mieras se produjeron y se tiñeron con azul de toluidina y luego se calificó de una manera ciega de acuerdo tanto con Mankin y de los métodos OARSI . El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student comparando vehículo vs sham, y con ANOVA.

RESULTADOS Selección de anticuerpos específicos de anti-spacer de dominio usando tecnología SPLINT.

Para seleccionar anti-dominio spacer especifico de ADAMTS-5 por la tecnología SPLINT, el dominio spacer de ADAMTS-5 (Aa 732 a aa 874 de la SEQ ID NO 2 ) se clonó a la 3 De LexA (LexA-Sp_ADAMTS-5; SEQ ID NO.: 93) y se utiliza para impugnar una SPLINT ratón (mSPLINT) y de dos diferentes colecciones SPLINT humana (huSPLINT_09 y huSPLINT 10) (Visintin et al, 2004 J I munol Methods 290: 135-153). Desde el procedimiento de selección se obtuvieron un total de 325 colonias capaces de crecer en ausencia de histidina y que muestra la activación de ß- galactosidasa . Fueron aislados y ordenados por sus patrones de restricción y secuencias Los plásmidos scFv-VPl6. La especificidad de los scFv con diferentes huellas de ADN se volvió a analizar el uso de cepas de levadura que expresan LexA-Sp_ADAMTS-5 y LexA-lamina, como antígeno no relevante. Por tanto, se identificaron 11 scFv anti-dominio spacer diferentes. Análisis de las secuencias de nucleótidos de la región V de la seleccionada anti-Spacer scFv reveló que se derivan de genes de la región V de la línea germinal (Tabla IV) con muy pocas mutaciones somáticas (datos no mostrados) .

Tabla IV; Análisis de las secuencias de nucleótidos de la región V de la seleccionada anti-Spacer scFv CLON CRB SEQ.ID VH-gen/J-gen ? VL-gen/J-gen e identificación de alelo identificación de alelo M6 CRB0017 3,-4 Musmus IGHV1-7*01 F; Musmus IGKV2-112*01 F; Musmus IGHJ2*01 F Musmus IGKJ2*01 F 7A CRB0018 5; 6 Musmus IGHV4-1*02 F; Musmus IGKV3-10*01 F; Musmus IGHJ1*01 F Musmus IG J5*01 F 14 CRB0019 7; 8 Musmus IGHV14-3*02 F; Musmus IGKV6-23*01 F; Musmus IGHJ4*01 F Musmus IGKJ2*01 F 7A CRB0091 9; 10 Homsap IGHV4-34*01 F; Homsap IGKV1-17*01 F; Homsap IGHJ5*02 F Homsap IGLJ3*02 F 15A CRB0102 17; 18 Homsap IGHV1-24*01 F; Homsap IGKV5-2*01 F; Homsap IGHJ6*02 F Homsap IGKJ1*01 F S53a CRB0124 23,-24 Homsap IGHV1-24*01 F; Homsap IGLV3-1*01 F ; Homsap IGHJ4*02 F Homsap IGLJ2*01 F Las secuencias de aminoácidos de las regiones V de la aislada an i-Sp_ADAMTS-5scFvs están en el grupo de secuencias que consisten de SEQ.ID NO: 3 y 4; 5 y 6 ; 7 y 8 ; 9 y 10: 11 y 12; 13 y 14; 1 5 y 16; 1 7 y 18; 19 y 20; 21 y Expresión y replegamiento de anti-Spacer scFv en el citoplasma de E. coli.

Para identificar el potencial anti-spacer en carpetas vivo, ADNc expresar anti-Sp_ADAMTS-5 scFv fueron clonados en el vector de expresión de E. coli pET41b. Las proteínas se expresan bien en el citoplasma y en su mayoría retenidos en cuerpos de inclusión (IB) . Los fragmentos scFv pueden replegarse por diálisis después de la solubilizacion del IB (Umetsu et al, 2003, J Biol Chem 278: 8.979-8.987 Epub 2003 Ene 8977). Los autores realizaron la técnica de replegamiento por dilución (Patil et al, 2008 JBiotechnol 134: 218-221 Epub 2008 01 2018). La condición replegamiento de scFv se optimiza para cada muestra. ScFv replegado fueron posteriormente cuantificó por Bioanalyzer 2100 (Agilent) y se ensayó por análisis ELISA y Biacore.

Especificidad de enlace de anti-ADAMTS-5 a ADAMTS-5 humanos .

Para comprender la especificidad del panel de anti- Sp_ADAMTS-5scFvs se aislaron colecciones de tablilla, la inmunorreactividad para Spacer-GST (SEQ ID NO. : 94) y se demostró ADAMTS-5 FL de estos anticuerpos. Todos los aislados scFv anti-spacer se reactiva con la proteína de fusión GST de la forma truncada de ADAMTS-5 en el ensayo ELISA. Sin embargo, el CRB0017, CRB0018 y CRB0093 scFv fueron altamente específica y sólo se observó enlace débil a la proteína GST utilizado como control negativo (figura 3) .

El reformateado inmunoglobulina quimérica CRB0017_IgG4 muestra el mismo patrón de inmunorreactividad en el ensayo de ELISA de una manera dependiente de la dosis (figura 4) . Se obtuvieron resultados similares con los anticuerpos monoclonales CRB0102 y CRB0123 (datos no presentados). Además, el quimérico anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4 (que comprende las regiones variables de ratón) fue capaz de inmunoprecipitar la proteína recombinante FL ADAMTS-5, así como ADAMTS-4 humanos recombinantes FL (Fig. 6 y 7). Además, los autores llevaron a cabo resonancia de plasmón superficial (SPR) se analiza para determinar la cinética de enlace de CRB0017_IgG4. El anticuerpo monoclonal quimérico (mAb) fue inmovilizado ya sea en un chip CM5 seguido de inyecciones a diversas concentraciones de Sp_ADAMTS-5-GST o utilizado como ligando en combinación con chip sensor inmovilizada-Sp_ADAMTS-5-GST. Utilizando un modelo de enlace bivalente, los autores determinaron las constantes de enlace estado de equilibrio (KD 2) · Cuando se utiliza como aglutinante, los autores midieron a Las intensidades de enlace por SPR alrededor subnanomolar- 7 nM de KD2 (datos no mostrados) .

CRB0017_IgG4 muestra también una fuerte afinidad (KDi de ~ 2 nM) cuando se inmovilizan en el chip sensor (Fig. 5) que se correlaciona mejor con los valores de enlace según lo determinado por ELISA específico de antígeno (figura 4) .

Evaluación de la capacidad de enlace de anti-spacer ADAMTS-5 mAbs a antígeno objeto ADAMTS-5 La enzima ADAMTS-5 purificada fue impugnada en ELISA utilizando anticuerpos monoclonales CRB0017_IgG4 , CRB0093_IgG4, CRB094_IgG4, CRB0123_IgG4 y CRB0124_IgG4 en revestimiento. Como se muestra en la figura 15, mAb CRB0017, CRB0093, CRB0094 y CRB00124 mostró especificidad comparable a ADAMTS-5 , mientras que mAb CRB0123_IgG4 mostrar una mayor capacidad de enlace para ADAMTS-5 que mAb CRB0017_IgG4 en este ensayo (figura 15) .

Enlace de Los anticuerpos en la invención presente en Hek-293-ADAMTS-5-3XFLAG/Hek-293 en formato Cell-ELISA.

In-Cell ELISA utiliza inmunocitoquimica cuantitativa para medir la expresión de proteína o modificaciones posteriores a la traducción en células cultivadas. Se fijan las células en una placa de 96 pocilios y dianas de interés se detectan con anticuerpos monoclonales altamente específicos, bien caracterizados y se cuantifican los niveles con anticuerpos secundarios marcados con enzimas.

Usando este método, la unión entre la longitud de ADAMTS-5 expresado por la línea HEK293 estable y CRB0017_IgG4 completo se evaluó. La enzima es secretada tanto de manera eficiente por esta línea celular y también se retiene en la matriz extracelular (ECM) . Cuando CRB0017_IgG4 fue desafiado con esta línea celular recombinante, que fue capaz de reconocido, de una manera dependiente de la dosis, los ADAMTS-5 de la enzima en su condición de plegado nativo (figura 11 ) .

Evaluación de la capacidad de enlace de mAb CRB0017 a ADAMTS-5.

Los sobrenadantes se cosecharon a partir de FreeStyle ™ 293 -F de línea celular que expresa de forma estable ADAMTS-5 3xFLAG (la recolección se realizó en cada dilución del estanque de células transfectadas de forma estable) que contenía los ADAMTS-5 de la enzima de longitud completa nativas y FreeStyle ™ de células 293 -F líneas fueron desafiados en un ensayo Sándwich ELISA utilizando mAb CRB0017_IgG4 en el recubrimiento. Los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente después de la recogida, a fin de preservar la función de ADAMTS-5 y para evitar en la medida de lo posible la autocatálisis de la enzima.

Como se muestra en la fig. 12, el anticuerpo fue capaz de reconocer la enzima ADAMTS-5 presente en el medio acondicionado con alta especificidad.

Evaluación de la capacidad de syndecan-4 interfiera en CRB0017_igG 4 anti-spacer ADAMTS-5 de enlace al antígeno ADAMTS-5.

Se demostró que syndecan-4 es funcionalmente implicado en la degradación del cartílago OA condrocitos hipertróficos por medio de la inhibición de la activación de ADAMTS-5 escisión mediada agrecano (Echtermeyer, F. et al 2009 Nat Med 15 (9): 1072-6). La activación de ADAMTS-5 depende de la interacción directa con syndecan-4 en la superficie de los condrocitos artrósicos; los mecanismos implicados en la degradación del cartílago parecen implicar tanto la unión directa de ADAMTS-5 a sindecano-4 y la regulación de ADAMTS-5 por la activación de MMP-3, que está regulada por sindecano-4 de una manera dependiente de ER.

Las vías exactas por los que la expresión syndecan-4 es inducida durante la OA, así como los mecanismos por los que está implicada en la remodelación del cartílago, son todavía objeto de investigación intensa. Con el fin de evaluar la posibilidad de que ADAMTS-5 anti-mAb CRB0017 pueden modular las respuestas patológicas de condrocitos mediadas por syndecan-4 establecimos un ensayo preliminar in vitro para demostrar la capacidad del mAb CRB0017 para interferir con ADAMTS-5-Syndecan- 4 interacción. Como se muestra en la figura. 14, cuando se añade sindecano-4 a los pozos, el O.D. se disminuye con respecto a los pozos en los que sólo ADAMTS-5 está en CRB0017_IgG 4. Esto demuestra que la interacción específica entre ADAMTS-5 y mAb CRB0017 fue disociado con eficacia por syndecan-4.

Se demostró que el dominio spacer y el TSP de tipo 1 dominios son importante para una interacción estrecha con la matriz extracelular . Además, se demostró que ADAMTS- 5 está unido a las cadenas de heparán sulfato de Syndccan-4 y por este mecanismo se fija a la superficie celular. Todavía no se entiende que es el dominio de ADAMTS-5 implicados en la unión con syndecan-4. La pérdida de la unión como el resultado final de la acción de anticuerpos no permite por el momento a ninguna conclusión sobre la competencia directa (mismo epítopo de enlace) vs indirecta (impedimento estérico) mecanismo de disociación incluso si ningún mecanismo finalmente conduce a propiedades de enlace con discapacidad han resultado en la pérdida de interacción entre ADAMTS-5 y syndecan-4.

Medición de la actividad anti-ADAMTS-5 neutralizante.

Los autores también evaluaron la inhibición de la degradación de agrecano inducido IL-?a- en el tejido de cartílago bovino. 48h después de los tratamientos, se midió la proporción de GAG total restante en el tejido. Este análisis reveló que CRB0017_IgG4 inhibió la liberación de GAG (inhibición del 50%) a partir de tejido a una concentración de 20 nM (Fig. 8) . En este experimento, el anticuerpo de control (nhIgG4) no fue capaz de interferir con la enzima a la misma concentración. Además, el inhibidor natural TIMP-3 no mostró notablemente para inhibir el proceso de conversión y la liberación de IL-la-mediada cuando se ensayaron a la concentración de 20 nM (datos no mostrados). El compuesto químico Cpd23, un inhibidor a base de hidroxamato 3 , 3-dimetil-5-hidroxipipecolico de agrecanasa y MMP-13 (utilizado a la concentración de ?µ?, Noe et al, 2005, Bioorg Med Chem Lett 15: 2808-2811), se utilizó como control positivo, ya que muestra un mejor efecto inhibidor respecto al inhibidor natural TIMP-3 en este ensayo.

Evaluación del efecto de CRB0016_lgG4 en el modelo de ratón STR/ORT de la osteoartritis.

El HelixB- ADAMTS-5 CRB0016_IgG4 de enlace de proteínas se administra por vía intraarticular en ambas rodillas de cada animal, una vez al inicio del experimento y otra vez después de 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 g/rodilla .

Después de tres meses, los autores observaron que las rodillas de los animales tratados con vehículo muestra O.A. severa con fisura y la erosión del cartílago articular en el hueso subcondral , con metaplasias prominentes-chondro ósea y, a menudo la inflamación y pannus . No hay cambios significativos en ninguno de los parámetros examinados fueron asociados con la administración de CRB0016_IgG4 en cualquiera de las dosis.

El procedimiento de puntuación ciega de las muestras histológicas no mostró efecto del compuesto en la disminución de daño del cartílago. Tomados en conjunto, estos datos muestran que la administración intraarticular de la rodilla de la proteína de enlace HelixB-ADAMTS-5 CRB0016_IgG4 dos veces en tres meses no podría reducir la gravedad de la patología artrósica en los ratones STR/TRO.

La evaluación del efecto de CRB0017_IgG4 en el modelo de ratón STR/ORT de la osteoartritis . CRB0017_lgG4 se administró por vía intraarticular en ambas rodillas de cada animal, una vez al inicio del experimento y otra vez después de 6 semanas, a dosis de 1.2 y 12 g/rodilla. Después de tres meses, los autores observaron que las rodillas de los animales tratados con vehículo muestran OA severa con fisura y la erosión del cartílago articular en el hueso subcondral, con metaplasias prominentes-chondro ósea y, a menudo la inflamación y pannus . La puntuación de Mankin OA disminuyó significativamente en el grupo de 12 mg CRB0017_IgG4 comparación con el vehículo. El grado x etapa OA tiene en cuenta no sólo la profundidad del daño (grado) , sino también su extensión en la superficie articular (etapa) . El grado x etapa OA fue significativamente menor en el grupo de 12 mg CRB0017_IgG4 comparación con el vehículo. La administración de CRB0017_IgG4 1.2 mg se asoció con una tendencia a una disminución con ambos métodos de puntuación. En conclusión, los autores observaron que CRB0017_IgG4 puede modificar el curso de OA en la cepa de ratón STR/Ort, al retrasar la degradación del cartílago como se evaluó histológicamente. El procedimiento de puntuación ciego de las muestras histológicas mostró claramente un efecto dependiente de la dosis del compuesto en la disminución de daño del cartílago.

Tomados juntos, estos datos muestran que la administración intraarticular de la rodilla de CRB0017_lgG4 dos veces en tres meses dosis-dependiente redujo la gravedad de la patología artrósica en los ratones STR/TRO.

Evaluación de Los anticuerpos de la presente invención en el modelo de rata medial de desgarro meniscal (MMT) de la osteoartritis. 3 semanas después de la inyección, los autores observaron que las rodillas de los animales tratados con vehículo muestran OA severa con la hendidura y la erosión del cartílago articular al hueso subcondral, con osteofitos prominente, la inflamación y pannus . La administración de CRB0017_IgG4 se asoció con una disminución relacionada con la dosis en todas las puntuaciones de gravedad lógicas histo-pato (figura 13). El procedimiento de puntuación ciego de las muestras histológicas mostró una disminución dependiente de la dosis en la severidad de OA después del tratamiento intra-articular con CRB0017_lgG4.

Algunas enzimas proteolíticas , además de sus dominios catalíticos, tienen también dominios auxiliares no catalíticos gue son importantes moduladores de la interacción entre la enzima y el sustrato o inhibidores. Los miembros de la familia ADAM S de enzimas degradan los proteoglicanos y por lo tanto tienen el potencial de alterar la arquitectura del tejido y regular la función celular .

En particular, ADAMTS-4 y ADAMTS-5 pueden escindir el agrecano en varios sitios, la liberación de las regiones de condroitina y keratansulfate-coj inete de la molécula del tejido. Esto fue demostrado ser un paso temprano y crucial en el desarrollo de la osteoartritis . Estas enzimas también se pueden proteolizadas a isoformas más pequeñas, que han alterado la actividad proteolítica . Desafortunadamente, el dominio de la arquitectura 3D de los aggrecanases de longitud completa no se conoce, ya que es muy difícil de obtener las estructuras de rayos X de estas enzimas, debido a su producción y purificación compleja.

Hasta la fecha, sólo una parte de toda la estructura de rayos X de la ADAMTS- 1, están disponibles ADAMTS-4 y ADAMTS 5-enzimas (estructura, resuelta por cristalografía de rayos X comprender sólo los dominios catalíticos y desintegrina) y por lo tanto es imposible extrapolar los arreglos y la orientación de todo el respeto dominios para el dominio catalítico. Las estructuras cristalinas de los dominios catalíticos y desintegrantes de ADAMTS-4 y ADAMTS-5 que determine Mosyak (Mosyak et al, 2008, Protein Sci 17:. 16-21) indicó que las enzimas muestran una forma abierta "cuando se está obligado al inhibidor y una forma "cerrada" cuando es auto-inhibido y no vinculante. Sobre esta base, el autor propone que existe agrecanasa madura como una mezcla de dos isómeros, que puede coexistir en equilibrio. En este "conjunto" un solo de esta forma es proteolíticamente activa. Además, se demostró que tanto la forma de longitud completa de ADAMTS-5 y ADAMTS-4 son muy activos en contra de su sustrato natural, agrecano, y la supresión de los dominios no catalíticos C- erminales de las enzimas reduce en gran medida su actividad (Kashiwagi et. al, 2004, J Biol Chem 279: 10109 a 10119); (Gendron et al, 2007, J Biol Chem 282: 18.294 a 18306.); (. Fushimi et al, 2008, J Biol Chem 283: desde 6706 hasta 6716). Esto sugiere que los dominios en su cuenta o en la manera de enlace a proteínas pueden perturbar el equilibrio de la forma más abierta.

La invención proporciona la evidencia de que Los anticuerpos dirigidos contra un dominio auxiliar no catalítica, tales como el dominio spacer de ADAMTS-5, inhiben fuertemente la actividad enzimática de esta proteína. En particular, los resultados obtenidos con el anticuerpo anti-dominio spacer CRB0017_IgG4 ilustran el concepto de que la inhibición de la agrecanasa-2 dentro del dominio spacer es más eficaz que la inhibición de la enzima dentro del dominio catalítico. En particular, se ha demostrado que, mientras que CRB0017_IgG4 es capaz de inhibir fuertemente in vitro e in vivo el efecto proteolítico de ADAMTS-5, un anticuerpo anti-catalítica, tales como CRB0016_IgG4 , no es capaz de producir tal efecto. Los excelentes resultados obtenidos con Los anticuerpos de la presente invención, en particular con CRB0017_IgG4 se deben a sus propiedades de bloqueo en el dominio spacer de ADAMTS- 5. Mediante la unión al sitio activo de ADAMTS-5, los anticuerpos de la invención activan la enzima para asumir una "cerrado" forma de este modo inhiben la enzima directa o favorecer la interacción de la enzima con su inhibidor natural TIMP-3, como hipótesis por Troeberg (Troeberg et al, 2009, Matrix Biol 28:. 463-469).

Además, los datos obtenidos hasta la fecha sugieren que la inhibición de la unión entre ADAMTS-5 y syndecan-4 por el mAb CRB0017_lgG4 podría tener un papel en la modulación de las respuestas patológicas de condrocitos mediadas por syndecan-4.

Aparte de la inducción de las enzimas por los condrocitos activados, la función de syndecan-4 está regulada además por la interacción con moléculas de la matriz y proteoglicanos de la superficie celular. Syndecan-4 es un proteoglicano de heparán sulfato de transmembrana que parece crucial para la actividad de ADAMTS-5.

Se demostró que la pérdida de syndecan-4 redujo notablemente la actividad de la patología del cartílago OA en el modelo murino DMM OA. Esto se demostró tanto en las aberturas de syndecan-4, así como en ratones WT tratados localmente, por medio de inyecciones intraarticulares con anticuerpos específicos syndecan-4. Los estudios in vitro identificado interacción directa de syndecan-4 con ADAMTS-5. Además, se demostró que la actividad ADAMTS-5 es dependiente de MMP-3 y la última actividad es controlada por syndecan-4.

Syndecans se someten a escisión proteolítica regulado en los sitios de ectodominio cerca de la membrana por metaloproteinasas de la matriz y metzincins familia de endoproteasas , un proceso llamado desprendimiento, tanto como parte de la facturación normal, así como en respuesta a estímulos externos y está regulado por múltiples vías. Además de interrumpir la señalización sindecan, los liberados actos ectodominio solubles como un antagonista para competir con syndecans intactos para sus ligandos . Mientras derramamiento ectodominio de sindecano se conoce para ser activado por los estimulantes fisiológicos y los ectodominios están siendo atribuido funciones fisiopatológicas , en particular, en la tumorigénesis y la inflamación, se sabe poco sobre cómo se regula su liberación de la superficie celular. Por lo tanto, podría ser de interés para ver si el anti-ADAMTS-5 CRB0017_lgG4 podría ayudar a una mejor comprensión de este proceso.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos capaces de reconocer y enlazarse a un epítopo comprendido en el aa. 732 a aa. la región 874 de SEQ ID No. 2 de ADAMTS-5.

2. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 1 que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de región de determinación complementaria de cadena pesada (CDRH3) que tiene al menos 80% de identidad para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89 y 92.

3. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 2 que comprende además una secuencia de aminoácidos de región de determinación complementaria de cadena pesada (CDRH2) que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID No. 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 y 91.

4. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 3 que comprende además una secuencia de aminoácidos de región de determinación complementaria de cadena pesada (CDRH1) que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID No. 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 y 90.

5. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende además al menos una secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria de cadena ligera (CDRL3 ) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 y 59.

6. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 5 que comprende además una secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria de cadena ligera (CDRL2) que tiene una al menos 80% de identidad a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 y 58.

7. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 6 que comprende además una secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria de cadena ligera (CDRLl) que tiene una al menos 80% de identidad a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 y 57.

8. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria de cadena pesada (CDRHl) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87 y 90 y una secuencia de aminoácidos de región determinante complementaria de cadena pesada (CDRH2) que tiene una al menos 80% de identidad a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88 y 91 y una secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena pesada (CDRH3) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89 y 92

9. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antigeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 8 que comprende además una secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDRLl) que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54 y 57 y secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDRL2 ) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55 y 58 y una secuencia de aminoácidos de regiones determinantes complementarias de cadena ligera (CDEL3) que tiene una identidad de al menos 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56 y 59.

10. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 8 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad CDRHl que tiene al menos 80% a la SEQ ID No . 60, una secuencia de aminoácidos CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 61 y una secuencia de aminoácidos CDRH3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 62.

11. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 10, que comprende además una secuencia de ácido amino CDRLl que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 27, una secuencia de aminoácidos CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 28 y una secuencia de aminoácidos CDRL3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 29.

12. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 8 que comprende una secuencia de aminoácidos CDRHl que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 81, una secuencia de aminoácidos CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 82 y una secuencia de aminoácidos CDRH3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 83.

13. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 12, que comprende además una secuencia de ácido amino CDRLl que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 48, una secuencia de aminoácidos CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 49 y una secuencia de aminoácidos CDRL3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 50.

14. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 8 que comprende una secuencia de aminoácidos CDRHl que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 87, una secuencia de aminoácidos CDRH2 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 88 y una secuencia de aminoácidos CDRH3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 89.

15. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con la reivindicación 14, que comprende además una secuencia de ácido amino CDRLl que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 54, una secuencia de aminoácidos CDRL2 que tiene al menos 80% de identidad a la SEQ ID No. 55 y una secuencia de aminoácidos CDRL3 que tiene al menos 80% de identidad para la SEQ ID No. 56.

16. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores siendo un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo quimérico o humanizado, o un desinmunizada o completamente humano.

17. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en el tratamiento y/o prevención de una condición asociada con la degradación del cartílago.

18. Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en el tratamiento de seres humanos y/o prevención de la osteoartritis o la artritis reumatoide.

19. Una molécula de ácido nucleico que codifica Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintético de los mismos tal como se define en las reivindicaciones 1 a 18.

20. La molécula de ácido nucleico que codifica Los anticuerpos, fragmentos recombinantes o de enlace de antígeno sintéticos del mismo de conformidad con la reivindicación 19 que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 99 a la SEQ ID No. 120.

21. Un vector de expresión que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

22. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 o 20.

23. La célula huésped de conformidad la reivindicación 22 que produce el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

24. Un método de producir el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 que comprende cultivar la célula que produce el anticuerpo de la reivindicación 23 y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.

25. Una composición farmacéutica que comprende al menos anticuerpo, fragmentos recombinantes o enlace de antígeno sintéticos de los mismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y excipientes farmacéuticamente aceptables .

26. La composición de conformidad con la reivindicación 25 para su uso en la administración intra-articular .