ES2588484T3

ES2588484T3 - Anticuerpo anti-ADAMTS-5, derivados y usos del mismo

Info

Publication number: ES2588484T3
Application number: ES12164107.0T
Authority: ES
Inventors: Michela Visintin; Gianfranco Caselli; Riccardo Chiusaroli; Lucio Claudio Rovati
Original assignee: Rottapharm Biotech SRL
Current assignee: Rottapharm Biotech SRL
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2016-11-03
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: DK2650310T3; PT2650310T; PL2650310T3; JP2015518476A; CN104245737B; EP2836516A1; AU2013246880A1; EP2650310A1; AU2013246880B2; EP2650310B1; HUE031089T2; TWI579302B; AR090668A1; US20150056210A1; CA2869031A1; TW201402606A; KR20150003278A; RU2014145536A; CN104245737A; US9631029B2

Abstract

Un anticuerpo neutralizante monoclonal, recombinante o fragmentos de unión a antígeno sintéticos del mismo capaces de reconocer y unirse a un epitopo comprendido en la región aa. 732 a aa 874 de SEQ ID NO. 2 de ADAMTS-5.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

y concentraciones empleadas, y pueden incluir tampones, antioxidantes, conservantes, péptidos, proteínas, polímeros hidrófilos, agentes quelantes tales como EDTA, azúcares, iones contadores de formación de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).

Los principios activos también pueden estar atrapados en microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidrometilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de reparto de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas están descritas en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16º edición, Osol, A. Ed., 1980). Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

En otra realización, para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo/anticuerpos anti-Sp_ADAMTS-5 de la presente invención, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico que atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg de anticuerpo o fragmento del mismo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se da una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia es fácilmente seguido por técnicas y ensayos convencionales.

La composición del anticuerpo se debería formular, dosificar y administrar de una manera consecuente con la buena práctica médica. Los anticuerpos/derivados de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier vía apropiada. Esto incluye (pero no se limita a) administración intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraarticular, intratraqueal, oral, enteral, perenteral, intranasal o dérmica. Un modo preferido de administración es la vía intraarticular. Factores para considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de reparto del agente, el método de administración, el horario de administración, y otros factores conocidos por los médicos. La “cantidad terapéuticamente eficaz” del anticuerpo a administrar estará gobernada por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar una enfermedad o trastorno. El anticuerpo no necesita estar, pero está opcionalmente formulado con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores anteriormente discutidos.

El término “anticuerpo” en la presente memoria se usa en el más amplio sentido y abarca diversas estructuras de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan, a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión a anticuerpo deseada.

Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula a parte de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan, a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena simple (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un “anticuerpo que se une al mismo epitopo” como anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición mediante el 50 % o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión a su antígeno en un ensayo de competición mediante el 50 % o más. Un ensayo de competición como ejemplo está proporcionado en la presente memoria.

El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada y/o ligera está derivada de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera está derivada de una fuente o especie diferente.

La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseídos por su cadena pesada. Hay cinco clases fundamentales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden dividirse más en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan [alfa], [delta], [épsilon], [gamma] y [mu], respectivamente.

El término “región Fc” en la presente memoria se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye las regiones Fc de la secuencia nativa y las regiones Fc variantes. Al menos que se especifique lo contrario en la presente memoria, la

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

100 % de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23.

En ciertas realizaciones, la secuencia VH o la secuencia VK/VL que tienen al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad a dicha SEQ ID NO. contienen sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-Sp-ADAMTS-5 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse al dominio espaciador de ADAMTS-5. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 4 aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o delecionados en la secuencia de la CDRH3 tal como en SEQ ID NO. 62. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o deleciones se dan en regiones fuera de las HVRs (es decir, en las FRs).

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo CRB0017, CRB0102, CRB0123 como se define en la Tabla III.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención tiene una constante de disociación (Kd) de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM o <0,001 nM o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M.

En una realización, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión a solución de Fabs para antígeno se mide calibrando Fab con una concentración mínima de antígeno (I)-marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen y col., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)).

La invención se describirá a continuación mediante ejemplos no limitantes en referencia a las siguientes figuras.

Leyendas de las Figuras

Figura 1. Representación esquemática de ADAMTS-4 y ADAMTS-5. Ambas enzimas son metaloproteinasas de multidominio secretadas de la célula dentro del espacio extracelular. Ambas enzimas tienen una disposición de dominio similar que consiste en una secuencia señal (SS), un prodominio (Pro), un dominio de metaloproteinasa catalítica (Cat), un dominio de desintegrina (Dis), un dominio de trombospondina tipo I (TS), un dominio rico en cisteína (CysR), y un dominio espaciador (Sp). Además, ADAMTS-5 contiene un dominio TS extra después del dominio espaciador.

Figura 2. Análisis por transferencia tipo Western de ADAMTS-5 p 75 después de la purificación por FPLC, usando un anticuerpo frente a la etiqueta FLAG de la proteína. Las membranas tipo Western se sondaron con anticuerpo monoclonal que reconoce las proteínas de fusión que contienen una secuencia peptídica FLAG (Sigma Aldrich, Monoclonal ANTI-FLAG M2, dilución 1:1.000). Para la detención que usa sustrato de peroxidasa quimioluminiscente, se empleó un anti-IgG de ratón-peroxidasa (1:10.000). TS5 = células sometidas a transfección de ADAMTS-5; NT = células no sometidas a transfección; M = simulación.

Figura 3. Reactividad ELISA de anti-Sp_ADAMTS-5 scFvs aislados con Espaciador-GST y GST control negativo. Los antígenos espaciador-GST y GST se recubrieron a 10 µg/ml. Anti-Sp_ADAMTS-5 scFvs se usaron a 50 y/o 5 µg/ml (datos no mostrados). La absorbancia media a 450 nm de los experimentos realizados en pocillos por duplicado se muestran con SD indicada por las barras.

Figura 4. ELISA tipo sándwich. Curvas de dilución de CRB001_IgG4 unido a Espaciador-GST y/o GST en solución a 30 µg/ml. Como anticuerpo secundario se usó un anti-GST (1:1.000) seguido de un anti-IgG HRP de conejo

(1:2.000) para la dilución final. La absorbancia media a 450 nm de los experimentos realizados en pocillos por duplicado se muestra con SD indicada por las barras.

Figura 5. Análisis cinético de CRB0017_IgG4 que se une a Espaciador-GST en solución usando Biacore X-100. 5610 RU de CRB0017_IgG4 se inmovilizaron sobre CM5 chip. La asociación y la disociación se realizaron para 180s y 800s respectivamente. Las constantes del índice cinético y la afinidad determinadas para la interacción CRB0017_IgG4/Espaciador-GST se muestran en la tabla de a continuación.

Figura 6. Inmunoprecipitación (IP) de la longitud completa de ADAMTS-5 (TS5-FL) por CRB0017_IgG4. 0,1 µg de TS5-FL purificada por afinidad/sometida a diálisis se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-Sp-ADAMTS-5 CRB0017_IgG4 (11, 22 y 25 µg en la línea 1, 2 y 3 respectivamente) o con 11 µg de anticuerpo no relacionado como control negativo (línea 4). Los inmunoprecipitados se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (1:1.000). se observó banda de TS5-FL de alrededor 81 kDa inmunoprecipitada con CRB0017_IgG4 que corresponde a la proteína TS5-FL p75. La masa molecular de la proteína TS5-FL inmunoprecipitada es ligeramente mayor a la prevista a partir de su composición de aminoácidos. Esta diferencia es debida a la N-glicosilación en los dominios Dis, CysR, Sp y a la O-glicosilación en el domino C terminal. Los marcadores de masa molecular están indicados en el lado derecho de la Figura.

Figura 7. IP de la longitud completa de ADAMTS-4 (TS4-FL) por CRB0017_IgG4. Se inmunoprecipitaron (IP) 0,2 µg

5

10

15

20

25

30

35

40

de TS4-FL purificada por afinidad/sometida a diálisis con anticuerpo anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4 (30 y 60 µg en la línea 1 y 2, respectivamente) o con un anticuerpo no relacionado (30 µg) como control negativo (línea 3). En la línea 4, se cargó TS4-FL purificada por afinidad/sometida a diálisis como control positivo. Se analizaron los inmunoprecipitados mediante inmunoprecipitación con anticuerpo anti-FLAG (1:1.000). Se observó banda de TS5-FL de alrededor 75 kDa inmunoprecipitada con CRB0017_IgG4 que correspondía a la proteína TS4-FL p68. La masa molecular de la proteína TS4-FL inmunoprecipitada es ligeramente mayor que la prevista a partir de su composición de aminoácidos y esto es principalmente debido a la N-y O-glicosilación en la proteína. Los marcadores de masa molecular están indicados en el lado izquierdo de la Figura.

Figura 8. Efecto de anti-Sp_ADAMTS-5 IgG4 en proteólisis in vitro de cartílago bovino inducida por IL-1α. La Figura representa la actividad de 5 ng/ml de IL-1α en ausencia o presencia de CRB0017_IgG4 después de 48 h de incubación (tres experimentos independientes diferentes). Como control negativo en cada uno de los experimentos se usó un IgG4 nativo humano (Serotec). Como control positivo en cada experimento se usaron un inhibidor de ADAMTS-5 sintético (Cpd 23) y un inhibidor de ADAMTS-5 natural (TIMP-3). Los resultados se expresan como % de liberación de GAG, es decir, la cuantificación de glicosaminoglicanos (GAGs) en forma de fragmentos de agrecano liberados del cartílago en cultivo; este método mide la eficacia de citoquinina en simular el metabolismo del cartílago.

Figura 9. Evaluación del efecto de la proteína CRB0016_IgG4 de unión a HelixB-ADAMTS-5 en el modelo de ratón STR/ort de osteoartritis. Se administró intraarticularmente CRB0016_IgG4 en ambas rodillas de cada animal, una vez en el inicio del experimento y de nuevo 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 µg/rodilla. Tres meses después de la primera administración, CRB0016_IgG4 no modificó el curso de OA en la cepa de ratón STR/ort, valorado histopatológicamente. El grado está definido como la profundidad de la lesión a través del cartílago articular. La fase está definida como la extensión horizontal de la implicación del cartílago dentro de un lado del compartimiento de la articulación independientemente del grado subyacente. Tomándolos en conjunto, ambos constituyen un índice de la gravedad o progresión patológica del proceso osteoartrítico, y de hecho la puntuación de OARSI está definida como grado x fase. La pérdida celular está definida como la fracción de condrocitos articulares que se han sometido a muerte celular, dentro del compartimento articular considerado. La pérdida de GAG (glicosaminoglicano) está definida como y valorada por la pérdida de un tinte de catión que presenta metacromasia hacia GAGs, tal como por ejemplo azul de Toluidina o Safranina O. Mankin ha definido su puntuación como la suma de grado, pérdida celular y pérdida de GAG, mientras que la puntuación total está definida como la suma de la puntuación de OARSI y pérdida celular y pérdida de GAG. Todos los anteriores parámetros constituyen características de OA, y su puntuación da una medida de la gravedad y progresión de la patología.

Figura 10. Evaluación del efecto de CRB0017_IgG4 en el modelo de ratón STR/ort de osteoartritis. Se administró intraarticularmente CRB0017_IgG4 en ambas rodillas de cada animal, una vez en el comienzo del experimento y de nuevo 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 µg/rodilla. Tres meses después de la primera administración, CRB0017_IgG4 mostró una actividad dependiente de la dosis en la reducción de la gravedad de OA en el modelo de ratón STR/ort. Todos los parámetros están definidos como en la Fig. 9.

Descripción detallada de la invención

Descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1: ATS4_HUMANA Una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 4 (UniProtKB/Swiss-Prot: 075173.3)

SEQ ID NO:2: ATS5_HUMANA Una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 5 (UniProtKB/Swiss-Prot: Q9UNA0.2)

imagen10

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

imagen13

MATERIALES Y MÉTODOS

Genoteca SPLINT de linfocitos humanos

El desarrollo de los anticuerpos terapéuticos para su uso en el tratamiento de enfermedades humanas ha sido durante mucho tiempo un objetivo para muchos investigadores en el campo del anticuerpo. Un modo de obtener estos anticuerpos es a través de Genoteca de Pote Simple de Anticuerpos Intracelulares (genotecas SPLINT) construidas a partir de linfocitos humanos. La tecnología con SPLINT expresa genotecas de scFv humano (fragmento de anticuerpo de cadena simple) clonadas en vector pMV1, un vector derivado del vector pLinker220 (Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods 290:135-153), como fusión al dominio de activación VP16. Las regiones variables se unen con un conector (linker) peptídico pequeño ( SEQ ID NO 138). pMV1 contiene gen LEU2 que permite el mantenimiento del plásmido y la selección sobre medios que carecen de leucina en cepa de levadura L40 y el gen bla que permite la selección del plásmido en E. coli.

Para la construcción de genotecas SPLINT humanas se usaron las donaciones de sangre periférica de cien donantes no inmunizados. Se recogieron aproximadamente 2-20 ml de muestras de sangre de cada donante. Los linfocitos B se aislaron de la sangre periférica usando reactivo de placa Ficoll (Amersham, USA). En resumen, la muestra de sangre diluida (1:1 de sangre por PBS) se extendió cuidadosamente sobre el reactivo Ficoll-Paque y, a continuación, se centrifugó la solución de dos fases a 400 x g durante 30 minutos. Se recogieron los linfocitos B de la interfaz entre las dos fases. El ARN total se extrajo de los linfocitos B mediante RNeasy Mini Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se preparó a partir de los linfocitos B y se juntaron antes de ser usados para el aislamiento de ARNm. El ARNm se preparó usando Oligotex mRNA mini kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se usó sistema RT-PCR ThermoScript™ (Invitrogen) para las reacciones de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante. Se usaron Oligo (dT)20 para sintetizar ADNc del repertorio de genes V. Para reducir el sesgo de la amplificación, los autores realizaron 62 (para huSPLINT_09) y 75 (para huSPLINT_10) reacciones de PCR independientes para amplificar segmentos del gen V, usando todas las combinaciones posibles dentro de un conjunto de cebador (para huSPLINT_09 véase Tabla I; para huSPLINT_10 véase Tabla II).

Las secuencias cebador (primer), las cuales en teoría abarcan el repertorio entero de genes de anticuerpo humano, se obtuvieron de IMGT/GENE-DB (Giudicelli y col., 2005. Stud Health Technol Inform. 116:3-8), y se modificaron según los protocolos previamente publicados (Sblattero y Bradbury, 1998. Immunotechnology. 3:271-278); (Marks y col., 1991. Eur J. Immunol. 21:985-991); (Orlandi y col., 1992. Biotechnology. 24:527-531). En este método, las regiones variables de la cadena pesada y ligera reorganizadas individuales se amplifican por separado y se unen a través de una serie de etapas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para dar los productos scFv finales que se usan para la clonación (Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods. 290:135-153). Las reacciones de PCR para huSPLINT_9 (Tabla I) incluían siete cebadores directos VH emparejados con cuatro cebadores inversos VH que generaban un total de veintiocho reacciones; mientras que cuatro cebadores directos Vκ emparejados con cuatro cebadores inversos generaban un total de siete reacciones; y nueve cebadores directos Vλ emparejados con dos cebadores inversos Vλ generaban un total de ocho reacciones.

Tabla I: cebadores de PCR de huSPLINT_09 inversos (rv) y directos (fw) para la cadena de genes V humanos

HuSPLINT_09: CEBADORES SECUENCIA

VHfw

VHrv

Vκfw

Vκrv

Vλfw

Vλrv

VL_PTfw

VL_PTrv

VH_PTfv

VH_PTrv: imagen14

VL_FINALfw: imagen15

VH_FINALrv

Las reacciones PCR para huSPLINT_10 (Tabla II) incluían seis cebadores directos VH emparejados con cuatro cebadores inversos VH que generaban un total de veinticuatro reacciones; mientras seis cebadores directos Vκ emparejados con cinco cebadores inversos Vκ generaban un total de treinta reacciones; y siete cebadores directos Vλ emparejados con tres cebadores inversos Vλ generaban un total de veintiuna reacciones.

Tabla II: cebadores PCR de huSPLINT_10 inversos (rv) y directos (fw) para la cadena de genes V humanos

HuSPLINT_10: CEBADORES SECUENCIA

VHfw

VHrv: imagen16

Vκfw

Vκrv

Vλfw

Vλrv

HuSPLINT_10: CEBADOR ES SECUENCIA

VH_PTfw

VH_PTrv

VL_PTfv

VL_PTrv: imagen17

VH_FINALf w

VL_FINALr v

Las PCRs guiaron a la representación en el repertorio de regiones variables derivadas de todos los ensamblajes de regiones estructurales concebibles. Todos los cebadores contenían o bien sitios de restricción BssHII o NheI o secuencia conector. La PCR de arrastre final (pull-through PCR) se pudo realizar con dos cebadores (PTfw y PTrv).

5 Después de que los repertorios del gen scFv finales se hubieran digerido secuencialmente con BssHII y NheI, se ligaron directamente dentro del vector pMV1 predigerido y desfosforilado. A partir de una reacción de ligación y treinta electroporaciones para cada genoteca, los autores fueron capaces de obtener las genotecas huSPLINT_09 y huSPLINT_10 finales consistiendo cada una en aproximadamente 108 moléculas de scFv diferentes con 0,04 % de clones a partir de ligación no inserto.

10 Clonación de señuelo Espaciador-ADAMTS-5 y la expresión en células L40 en levadura

Se amplificó el ADNc que codifica Espaciador-ADAMTS-5 humano (SEQ ID NO 123) a partir de ADAMTS-5 pSecTag2A que usa cebadores:

imagen18

El ADNc digerido por EcoRI-BamHI se clonó en el vector pMICBD1 (Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods.

15 290:135-153) diseñado para contener resistencia a cloranfenicol bacteriano, el gen TRP1 (el cual permite que la levadura que contiene este plásmido crezca en medio mínimo que carece de triptófano) y el origen de 2 µ de replicación. Este plásmido contiene la región entera de la proteína lexA de Escherichia coli, expresada a partir del promotor de la alcohol deshidrogenasa I (ADH1) de levadura, seguido de un policonector para la inserción de ADNc, para generar fusiones en el marco a lexA. El señuelo se secuenció para confirmar la fusión en el marco del inserto

20 con el dominio de unión a lexA en el vector.

Las células de levadura L40 se sometieron a transfección con el vector señuelo Sp_ADAMTS-5/MICBD1 usando el protocolo de transformación de acetato de litio. Los transformantes se ensayaron para la prototropía de histidina sobre placas YC-Lys/-Ura/-His/-Trp (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods. 290:135-153; Visintin y col., 2004. Methods. 34:200-214; Visintin y col., 2002. J. Mol Biol. 317:73

25 83; Visintin y col., 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:11.723-11.728). Se ensayaron colonias de levadura para la actividad de β-galactosidasa usando filtros levantados de colonia, como previamente se ha descrito (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering 1:170). La transfección del señuelo no dio como resultado activación del gen LacZ (datos no mostrados).

Clonación de señuelo HelixB-ADAMTS-5 y expresión en célula L40 de levadura

30 Se ensambló el ADNc que codifica una hélice α (HelixB, SEQ ID NO. 124) en la posición de superficie del dominio catalítico humano de ADAMTS-5 usando cebadores:

imagen19

5

10

15

20

25

30

El ADNc digerido por EcoRI-PstI se clonó en el vector pMICBD1 (Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods. 290:135153). Las células de levadura L40 se sometieron a transfección con el vector señuelo helixB/MICBD1 usando el protocolo de transformación de acetato de litio. Los transformantes se ensayaron para el prototipo de histidina sobre placas YC-Lys/-Ura/-His/-Trp (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790). Se ensayaron colonias de levadura para la actividad de β-galactosidasa usando filtros elevados de colonia, como previamente se ha descrito (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering 1:790). La transfección del señuelo no dio como resultado activación del gen LacZ (datos no mostrados).

Análisis por transferencia tipo Western de señuelo Espaciador-ADAMTS-5

Se diluyó un cultivo de levadura de toda la noche en 5 ml de medio YC a DO600 0,15 y se dejó crecer a 30 ºC hasta DO600 0,6. Se centrifugó 1 ml de cultivo a 10.000xg durante 5 min. y el precipitado celular se resuspendió en tampón de Laemmli, se puso en solución sobre SDS-PAGE al 12 %, y se transfirió sobre una membrana de PVDF (Millipore). Se usó anticuerpo policlonal anti-LexA (Invitrogen), seguido de anti-HPR de conejo (DAKO). Se usó el sistema de quimioluminiscencia ECL (Amersham) para la detección (datos no mostrados).

Selecciones de SPLINT

Las genotecas de SPLINT se transformaron dentro de la cepa L40 de levadura que expresa el señuelo (Sp_ADAMTS-5/MICBD1 o HelixB-ADAMTS-5/MICBD1) usando el método de acetato de litio y la selección como se describe (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:790; Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods. 290:135153; Visintin y col., 2004. Methods. 34:200-214; Visintin y col., 2002. J. Mol Biol. 317:73-83; Visintin y col., 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:11.723-11.728). Las células transformadas de levadura se colocaron en una placa sobre medio sólido que carecía de Trp (W), Leu (L), Uracilo (U), Lys (K) y His (H) (YC-WHULK). La expresión del marcador selectivo Trp (W) se proporciona por el plásmido pMICBD1, Leu (L) por el plásmido pMV1, y Uracilo (U), Lys (K) y His (H) son marcadores protótrofos de la cepa de levadura. Los clones positivos se dejaron crecer sobre medio selectivo YC-WHULK. Los ensayos de β-Galactosidasa se realizaron tal como se describen (Visintin y Cattaneo, 2001. Antibody Engineering. 1:1790; Visintin y col., 2004. J. Immunol Methods. 290:135-153; Visintin y col., 2004. Methods. 34:200-214; Visintin y col., 2002. J. Mol Biol. 317:73-83; Visintin y col., 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:11.723-11.728). Se aislaron 11 anti-Sp_ADAMTS-5 scFvs positivos después del cribado secundario a partir de cuatro cribados independientes de diferentes genotecas SPLINT (mSPLINT, huSPLINT_09 y huSPLINT_10). Los resultados de las selecciones realizadas para el señuelo de SP_ADAMTS-5 están resumidas en la Tabla III.

Tabla III. Compendio de selecciones SPLINT de Sp-ADAMTS-5

SEÑUELO: GENOTECA N≠CLONES N≠CLONES CLON CBR SEQ ID

SPLINT: NO

(I cribado): (II cribado)

Sp-ADAMTS: mSPLINT 15 3 M6 CRB0017 3;4

5/MICBD1

7A: CRB0018 5;6

14: CRB0019 7;8

Sp-ADAMTS-huSPLINT_09 121 4 7A CRB0091 9;10 5/MICBD1 C21 CRB0092 11;12 47A CRB0093 13;14 48B CRB0094 15;16

Sp-ADAMTS-huSPLINT_10 90 1 15A CRB0102 17;18 5/MICBD1

Sp-ADAMTS-huSPLINT_10 99 3 S39 CRB0122 19;20 5/MICBD1 S50 CRB0123 21;22 S53a CRB0124 23;24

imagen20

imagen21

imagen22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

400 µl de TNC (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, CaCl2 10 mM, CHAPS al 0,1 %, pH 7,5) y 100 µl de preparaciones de ADAMTS-4 recombinante (p68, FL) y ADAMTS-5 (p75, FL), expresadas en células FreeStyle-293 sometidas a transfección de manera transitoria y se incubaron a 37 ºC durante 6 a 24 h. Las reacciones se pararon con 500 µl de solución de parada (Tris 50 mM, acetato de sodio 200 mM, EDTA 100 mM; pH = 6,8) y las partículas se separaron de la fase líquida por centrifugación (10.000 rpm, 4 min, 4 ºC). La cantidad de los glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados en el sobrenadante se determinó por un ensayo colorimétrico (azul de dimetil metileno 1,9, DMB). La curva estándar (Sulfato de Condroitina extraído de tráquea bovina) y las muestras se diluyeron en PBS-BSA al 1%. Después de una reacción de 5-20 min, las muestras se leyeron a 590 nm. La concentración de GAGs de cada muestra se calculó a partir de mediciones de absorbancia (blanco sustraído) y se compararon con la curva estándar de referencia.

Explante y cultivo de cartílago

Se obtuvieron discos de cartílago nasal bovino del septo nasal bovino de hembra de ocho meses. En resumen, se obtuvieron perforaciones de cartílago de 2 mm de diámetro del cartílago nasal. Las perforaciones primero se lavaron tres veces con tampón PBS-AASS (1xPBS, 100 U/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina y 2,5 µg/ml de amfotericina B). Las perforaciones se incubaron posteriormente a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5%, en pocillos de microplaca que contenían DMEM al 10 %, 100 U/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina y 2,5 µg/ml de amfotericina B (medios DMEM-AASS). Después de tres horas las muestras se lavaron con tampón PBS-AASS y se incubaron con medios DMEM-AASS. 48 h después de la preparación de las células de cartílago, las muestras se trataron con 5 ng/ml de IL-1α más concentración diferente de inhibidor (es decir, CRB0017_IgG4 y TIMP-3) y se incubaron en DMEM, 0,1 % BSA + AASS durante 48 h. Después de los tratamientos se recogieron los sobrenadantes y pequeñas piezas de cartílago y se usaron para el análisis de GAG (la medición de la liberación de GAG es la cuantificación de glicosaminoglicanos-GAGs en forma de fragmentos de agrecano liberados del cartílago en cultivo). Las perforaciones de cartílago se incubaron primero con 500 µg/ml de papaína a 65 ºC durante 2 h para la medición del porcentaje de GAG total restante en el tejido. La determinación de los glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados se hace por un ensayo colorimétrico con azul de dimetilmetileno 1,9 (DMB). Curva estándar (Sulfato de Condroitina extraído de tráquea bovina), las muestras de medio y las muestras de cartílago digeridas se diluyeron en PBS-BSA al 1%. Después de 5-20 min de reacción se leyeron las muestras a 590 nm.

Inmunoprecipitación de proteínas de longitud completa ADAMTS-5 y ADAMTS-4 3XFLAG

La inmunoprecipitación se realizó usando el kit de Inmunoprecipitación de Proteína G (Sigma).

Para reducir el ruido de fondo causado por la adsorción no específica de proteínas celulares irrelevantes a la Proteína G Agarosa, se realizó una etapa de aclarado previo. 50 µl de la suspensión de Proteína G Agarosa se añadió a la muestra (proteínas purificadas ADAMTS-5 o ADAMTS-4) en un tubo de microcentrífuga y se incubaron durante 2 horas a 4 ºC con balanceo. Los granulados se precipitaron por centrifugación a 12.000 g durante 30 segundos en una microcentrífuga y el sobrenadante recogido (muestra preaclarada) se transfirió a un tubo fresco. Esta muestra se usó para inmunoprecipitación. Se añadió a la muestra el anti-Sp_ADAMTS-5 y se ajustó el volumen a 600 µl en tampón IP. Esta muestra se añadió a una columna de centrifugación tapada y se incubó durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, 50 µl de granulados de Proteína G Agarosa lavados se añadieron a la columna. Después de 2 h de incubación con balanceo a 4 ºC la punta de la columna de centrifugación se rompió y la columna se colocó dentro de un tubo Eppendorf de 2 ml. El tubo se centrifugo a 12.000xg durante 30 segundos a 4 ºC. Los granulados en la columna de centrifugación se resuspendieron en 700 µl de tampón 1xIP y la columna se centrifugó a 12.000xg durante 30 segundos a 4 ºC. La etapa de lavado se repitió 3 veces. El último lavado se realizó con tampón 0,1xIP. Los granulados se resuspendieron con 50 µl de 1x tampón de Muestra de Laemmli caliente. Después de 10 minutos de incubación a 95 ºC, se eluyeron las proteínas por centrifugación a 13.000xg durante 1 minuto. La muestra se cargó en gel SDS-PAGE para el análisis por transferencia tipo Western.

Evaluación del efecto de mAbs anti-ADAMTS-5 en el modelo de ratón STR/ort de osteoartritis

Se reclutaron ratones machos STR/ort (Mason y col., 2001. Osteoarthritis Cartilage. 9:85-91) de 5 meses de edad (n = 20-22), se distribuyeron al azar para el tratamiento en cada jaula, con 4 animales por jaula, se pesaron y se trataron intraarticularmente en cada rodilla con o bien 1,2 µg de anti-ADAMTS-5 IgG4, 12 µg de anti-ADAMTS-5 IgG4, o vehiculizante. Después de 6 semanas se repitió la administración intraarticular de anti-ADAMTS-5 IgG4 con las mismas dosis. Después de 3 meses del reclutamiento los animales se sacrificaron por dislocación cervical y se explantaron limbos traseros y se fijaron en formalina durante la noche. Los limbos traseros se incrustaron en parafina, se produjeron secciones de 5 micras de grosor y se tiñeron con azul de toluidina y se puntuó de una manera ciega de acuerdo con tanto el procedimiento de Mankin (Mankin y col., 1971. J. Bone Joint Surg Am. 53:523537) y el OARSI (Pritzker y col., 2006. Osteoarthritis Cartilage 14:13-29). Este método produce una puntuación de OA con un intervalo de 0-24 basado en el grado más avanzado (6) y la fase de más extensión (4). El análisis estadístico se realizó con el ensayo de t de Student comparando vehiculizante con basal, y con ANOVA seguida por los ensayos de Dunn o Dunnet que comparan todos los grupos de tratamiento con el vehiculizante.

imagen23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

replegado se cuantificó posteriormente por Bionalyzer 2100 (Agilent) y se ensayó por ELISA y análisis Biacore.

Especificidad de unión de anti-ADAMTS-5 a ADAMTS-5 humano

Para entender la especificidad del panel de anti-Sp_ADAMTS-5scFvs aislados de las genotecas SPLINT, se demostró la inmunoreactividad para Espaciador-GST (SEQ ID NO: 94) y ADAMTS-5 FL de estos anticuerpos. Todos los anti-espaciador scFvs eran reactivos con la proteína de fusión GST de la forma truncada de ADAMTS-5 en ensayo ELISA. Sin embargo, los scFvs de CRB0017, CRB0018 y CRB0093 eran ligeramente específicos y solamente se observó unió débil a proteína GST usada como control negativo (Figura 3).

La inmunoglobulina CRB001_IgG4 quimérica reformateada manifiesta el mismo patrón de inmunoreactividad en el ensayo ELISA de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4). Se obtuvieron resultados similares con los anticuerpos monoclonales CRB0102 y CRB0123 (datos no mostrados). Además, el anti-Sp_ADAMTS-5 CRB0017_IgG4 quimérico (que comprende regiones variables de ratón) era capaz de inmunoprecipitar el recombinante de la proteína ADAMTS-5 FL, así como ADAMTS-4 FL humana recombinante (Fig. 6 y 7). Además, los autores llevaron a cabo análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR) para determinar las cinéticas de unión de CRB0017_IgG4. El anticuerpo monoclonal quimérico (mAb) o bien se inmovilizó sobre un chip CM5 seguido de inyecciones a diversas concentraciones de Sp_ADAMTS-5-GST o se usó como ligando en combinación con Sp_ADAMTS-5-GST-chip sensor inmovilizado. Usando un modelo de unión bivalente, los autores determinaron las constantes de unión del estado continuo (KD2). Cuando se usó como ligante, los autores midieron una fuerza de unión por SPR alrededor de 7 nM subnanomolar de KD2 (datos no mostrados). CRB0017_IgG4 manifestó también una fuerte afinidad (KD1 de aproximadamente 2 nM) cuando se inmovilizó sobre el chip sensor (Fig. 5) que correlaciona mejor con los valores de unión determinados por ELISA específica a antígeno (Figura 4).

Medición de la actividad neutralizante de anti-ADAMTS-5

Los autores también evaluaron la inhibición de la degradación de agrecano inducida por IL-1α en el tejido de cartílago bovino. 48 h después de los tratamientos, se midió la proporción de GAG total restante en el tejido. Este análisis reveló que CRB0017_IgG4 inhibía la liberación de GAG (inhibición al 50 %) del tejido a concentración 20 nM (Fig. 8). En este experimento, el anticuerpo control (nhIgG4) no era capaz de interferir con la enzima a la misma concentración. Además, el TIMP-3 inhibidor natural no mostró marcadamente inhibición de la conversión mediada por IL-1α y el proceso de liberación cuando se ensayó a la concentración de 20 nM (datos no mostrados). El compuesto químico Cpd23, un inhibidor basado en hidroxamato de 3,3-dimetil-5-hidroxipipecólico de agrecanasa y MMP-13 (usado a la concentración de 1 µM, Noe y col., 2005. Bioorg Med Chem Lett. 15:2.808-2.811), se usó como control positivo, porque manifiesta un mejor efecto inhibidor respecto al inhibidor natural TIMP-3 en este ensayo.

Evaluación del efecto de CRB0016_IgG4 en el modelo de ratón STR/ort de osteoartritis

Se administró la proteína CRB0016_IgG4 de unión a HelixB-ADAMTS-5 intraarticularmente en ambas rodillas de cada animal, una vez al inicio del experimento y de nuevo después de 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 µg/rodilla.

Después de tres meses, los autores observaron que las rodillas de los animales tratados con vehiculizante manifestaban OA grave con fisura y erosión del cartílago articular al hueso subcondral, con metaplasias condroóseas prominentes y con frecuencia inflamación y pannus. No se asociaron cambios significativos en ninguno de los parámetros examinados con la administración de CRB0016_IgG4 a ninguna dosis.

El procedimiento de puntuación ciega de las muestras histológicas no mostró efecto del compuesto en la reducción del daño de cartílago. Tomándolos en conjunto, estos datos muestran que la administración intraarticular de rodilla de la proteína CRB0016_IgG4 de unión a HelixB-ADAMTS-5 dos veces en tres meses no pudo reducir la gravedad de la patología osteoartrítica en los ratones STR/ort.

Evaluación del efecto de CRB0017_IgG4 en el modelo de ratón STR/ort de osteoartritis

Se administró CRB0017_IgG4 intraarticularmente en ambas rodillas de cada animal, una vez al inicio del experimento y de nuevo después de 6 semanas, a dosis de 1,2 y 12 µg/rodilla. Después de tres meses, los autores observaron que las rodillas de los animales tratados con vehiculizante manifestaban OA grave con fisura y erosión del cartílago articular al hueso subcondral, con metaplasias condro-óseas prominentes y con frecuencia inflamación y pannus. La puntuación de Mankin de OA disminuyó significativamente en el grupo de 12 µg de CRB001_IgG4 en comparación con vehiculizante. El grado de OA por fase toma en cuenta no solamente la profundidad del daño (grado), sino también su extensión sobre la superficie articular (fase). El grado por fase de OA era significativamente inferior en el grupo de 12 µg de CRB0017_IgG4 en comparación con el vehiculizante. La administración de 1,2 µg de CRB0017_IgG4 estaba asociada con una tendencia a disminuir con ambos métodos de puntuación. En conclusión, los autores observaron que CRB0017_IgG4 puede modificar el curso de OA en la cepa de ratón STR/ort, retrasando la rotura de cartílago cuando se valora histológicamente. El procedimiento de la puntuación ciega de las muestras histológicas claramente mostró un efecto dependiente de dosis del compuesto en la disminución del daño de cartílago.

Tomándolos en conjunto, estos datos muestran que la administración intraarticular en rodilla de CRB0017_IgG4 dos

imagen24

Claims

imagen1

imagen2

imagen3