MXPA06004910A

MXPA06004910A - Secuencias de inmunoglobulina de mono

Info

Publication number: MXPA06004910A
Application number: MXPA/A/2006/004910A
Authority: MX
Inventors: J Allen Martin; Aldrich Teri; Shen Wenyan; W Jacobsen Frederick; E Morris Arvia
Original assignee: Aldrich Teri; J Allen Martin; Amgen Inc; W Jacobsen Frederick; E Morris Arvia; Shen Wenyan
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2006-12-13

Abstract

Las secuencias de nucleótidos codificando, y secuencias de aminoácidos comprendiendo, regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de monos cinomólgo. Se describen anticuerpos quiméricos con regiones constantes de mono cinomólgo.

Description

SECUENCIAS DE INMUNOGLOBULINA DE MONO REFERENCIA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. No. 60/517,970, presentada el 7 de Noviembre de 2003.

CAMPO La presente invención se refiere a secuencias de inmunoglobulina de mono.

ANTECEDENTES Los monos se utilizan para evaluar anticuerpos. Por ejemplo, los primates inferiores tales como monos con frecuencia proporcionan un modelo animal para estudiar enfermedades. En aquellos casos donde un mono se utiliza para estudiar enfermedades, los anticuerpos pueden introducirse para determinar su eficacia para tratar o curar la enfermedad. En ciertos casos, los anticuerpos que se prueban son de otras especies. Como cualquier otro antígeno externo, un anticuerpo externo, introducido puede accionar un sistema inmune del mono para montar una respuesta contra el anticuerpo. Por ejemplo, los humanos quienes reciben anticuerpos generados en ratones pueden desarrollar una respuesta inmune a los anticuerpos de ratón (Exley A.R. et al., Lancet 335: 1275-77 (1990)). Del mismo modo, en ciertos casos, un mono puede desarrollar anticuerpos al anticuerpo de otra especie que se está probando. La respuesta inmune del mono a anticuerpos externos puede inhibir su función, impidiendo de esta manera la evaluación de los anticuerpos externos. Los anticuerpos quiméricos, conteniendo secuencias de aminoácidos de más de una especie, pueden en ciertos casos reducir la respuesta inmune que un huésped montaría contra el anticuerpo quimérico, en comparación con la respuesta inmune del huésped a un anticuerpo que contiene secuencias de aminoácidos solamente de una especie diferente de las especies del huésped. Por ejemplo, como se trata arriba, los humanos pueden montar una respuesta inmune a anticuerpos de ratón. Cuando parte de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo de ratón se reemplaza con secuencia de anticuerpo humano, la respuesta inmune del humano al anticuerpo quimérico resultante puede reducirse (LoBuglio A. F. et al., PNAS-USA 86:4220-24 (1989)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades, un polipéptido aislado se proporciona comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ I D NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; o SEQ ID NO:20 y comprendiendo además una región variable de cadena pesada de anticuerpo. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado se proporciona comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:30. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado se proporciona comprendiendo una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 1 0; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:20 y comprendiendo además una secuencia codificando un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado se proporciona comprendiendo una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:30 y comprendiendo además una secuencia codificando un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo aislado se proporciona comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 o SEQ I D NO:20 y un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:30. En ciertas modalidades, un método para hacer un polipéptido se proporciona. En ciertas modalidades, un método para hacer un anticuerpo quimérico se proporciona. En ciertas modalidades, un método para evaluar los efectos de un anticuerpo se proporciona comprendiendo: a) introducir en un mono cinomólgo un anticuerpo quimérico comprendiendo regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo y regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de un mono cinomólgo; y b) evaluar los efectos del anticuerpo quimérico en el mono cinomólgo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno3-16 (SEQ ID NO: 1 ) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno3-16 (SEQ ID NO:2). La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN genómico codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno33 (SEQ ID NO:3) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno33 (SEQ ID NO:4). La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno2-4 (SEQ ID NO:5) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno2-4 (SEQ ID NO:6).

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno2-4cys (SEQ ID NO:7) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno2-4cys (SEQ I D NO:8). La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cynodsl (SEQ ID NO:9) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cynodsl La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno439 (SEQ ID NO: 1 1 ) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de «cadena pesada de mono cinomólgo cyno439 (SEQ ID NO: 12). La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno686 (SEQ ID NO:13) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno686 (SEQ ID NO: 14). La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno35 (SEQ ID NO: 15) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno35 (SEQ ID NO: 16).

La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno36 (SEQ ID NO: 17) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno36 (SEQ ID NO: 1 8). La Figura 1 0 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno477 (SEQ ID NO: 19) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno477 (SEQ ID NO:20). ?> La Figura 1 1 muestra la secuencia de nucleótidos genómica codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno32 (SEQ ID NO:21 ) y la secuencia de aminoácidos de lá región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno32 (SEQ ID NO:22). La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno3-18 (SEQ ID NO:23) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno3-18 (SEQ ID NO:24). La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno1 -3 (SEQ ID NO:25) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno1 -3 (SEQ ID NO:26).

La Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno1 -4 (SEQ I D NO:27) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de mono cinomólgo cyno1 -4 (SEQ ID NO:28). La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos de cADN codificando la región constante de cadena ligera de mono cinomólgo cynoKappa (SEQ ID NO:29) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera de mono cinomólgo cynoKappa (SEQ ID NO:30). La Figura 16 muestra las alineaciones de la secuencia de nucleótidos para cierta secuencia de región constante de inmunoglobulina de mono cinomólgo ejemplificativo. Las regiones constantes pueden dividirse en tres familias de secuencia, con las regiones de codificación de articulación mostrando la mayoría de la variación entre las familias. La secuencia resaltada en negritas es la secuencia endógena que corresponde a los cebadores utilizados para clonación. A. Cinco regiones constantes con secuencias de codificación de articulación similar. B. Cinco regiones constantes con regiones de articulación similares. En este caso existe una inserción de 21 nucleótidos encontrados en dos regiones constantes, cyno686 y cyno439, que no están presentes en cyno2-4, cyno2-4cys, o cyno 2-4ds. Cyono2-4 y cyno2-4cys son idénticos excepto en el nucleótido 41 donde existe una substitución de G por C que permite un codón Cys preferentemente que un codón Ser. Cyno 2-4ds1 incluye los primeros 288 nucleótidos de cyno33 reemplazando los primeros 288 nucleótidos de Cyno2-4. C. Cuatro regiones constantes relacionadas. La Figura 17 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de ciertas secuencias de regiones constantes de inmunoglobulina de mono cinomólgo. El texto en cursivas indica la región CH1 , el texto en negritas indica la región de articulación, texto regular indica la región CH2, y texto en negritas, cursiva indica la región CH3. La Figura 1 8 muestra ciertas secuencias de nucleótidos ejemplificativas (A) y secuencias de aminoácidos (B) que pueden utilizarse como regiones variables en una cadena pesada quimérica. La estructura (FR) y regiones CDR se muestran. La Figura 1 9 muestra ciertas secuencias de nucleótidos ejemplificativas (A) y secuencias de aminoácidos (B) que pueden utilizarse como regiones variables en una cadena ligera quimérica. La estructura (FR) y regiones CDR se muestran.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS MODALIDADES PREFERIDAS Los encabezados de la sección utilizados en la presente son para propósitos organizacionales solamente y no se construyen como limitantes de la materia sujeto descrita. Todas las referencias o porciones de referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente para referencia en la misma en su totalidad para cualquier propósito.

Definiciones Las técnicas estándar pueden utilizarse para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la materia o como se describen en la presente. Las técnicas anteriores y procedimientos pueden realizarse generalmente de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describe en varias referencias más específicas y generales que se citan y tratan por toda la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. f Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que se incorpora en la presente para referencia para cualquier propósito. Se proporcionan definiciones al menos específicas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la materia. Las técnicas estándar pueden utilizarse para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, al menos que se indique de otra manera, deben entenderse que tienen los siguientes significados.

El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en la presente debe significar un polinucleótido de origen sintético, cADN, genómico o alguna combinación de los mismos, que en virtud del su origen el "polinucleótido aislado" (1 ) no se asocia con todo o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) se enlaza a un polinucleótido que no se enlaza en naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más larga. El término "polipéptido aislado" referido en la presente significa un polipéptido codificado por cADN, ARN recombinante, u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que (1 ) está libre de al menos algunas proteínas con las cuales normalmente se encontraría, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en naturaleza. El término "polipéptido" se utiliza en la presente como un término genérico para referirse a cualquier polipéptido comprendiendo dos o más aminoácidos unidos entre sí por uniones de péptido o uniones de péptido modificadas, es decir, isópteros de péptido. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente referidas como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes a aquellos normalmente codificados por un codón. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos codificadas ya sea por procesos naturales, tal como procesamiento post-translacional, o por técnicas de modificación química que se conocen bien en la materia. Tales modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en una literatura de búsqueda voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la estructura de péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos carboxilo o amino. Tales modificaciones pueden estar presentes en los mismos grados o variables en varios sitios en un polipéptido dado. También, en ciertas modalidades, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y/o substituciones de uno o más aminoácidos de una secuencia nativa. En ciertas modalidades, los polipéptidos pueden ramificarse como un resultado . de ubiquitinación, y, en ciertas modalidades, pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales post-translación o pueden hacerse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ribosilación ADP, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, degradación, ciclización, formación de unión de disulfuro, demetilación, formación de degradaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de sujetador GPI, hidroxilación, yodinación, mutilación, mirostoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación. El término "polipéptido" también comprende secuencias que comprenden la secuencia de aminoácidos de cyno3-16, cyno33, cyno2-4, cyno2-4cys, cynodsl , cyno439, cyno686, cyno35, cyno36, cyno477, cyno32, cyno3-1 8, cyno1 -3, cyno1 -4, cynoKappa, H 1 , H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1 0, H 1 1 , H12, H 13, H 14, L1 , L2, L3, L4, L5, L6 (como se describe abajo, SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 61 -74 y 81 ^86) y secuencias que tienen eliminaciones, adiciones y/o substituciones de uno o más aminoácidos de aquellas secuencias. El término "que ocurre de manera natural" como se utiliza en la presente como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que pueden aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra manera está ocurriendo de manera natural. El término "enlazado de manera operativa" como se utiliza en la presente, se refiere a componentes que están en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada de manera operativa" a una secuencia de codificación se liga en tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se utiliza en la presente se refiere a secuencias de polinucleótidos que pueden afectar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo huésped. De acuerdo a ciertas modalidades, las secuencias de control para procariotas pueden : incluir secuencia promotora, de sitio de unión ribosomal, y terminación de transcripción. De acuerdo a ciertas modalidades, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir secuencias de terminación de transcripción y promotoras. En ciertas modalidades, "secuencias de control" pueden incluir secuencias guía y/o secuencias de patrón de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases en longitud. En ciertas modalidades, las bases pueden comprender al menos uno de ribonucleótidos, deoxiribonucleótidos y una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de doble filamento y único de ADN. El término "polinucleótido" también comprende secuencias que comprenden SEQ ID NOS: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 47-60 y 75-80. En ciertas modalidades, los polinucleótidos tienen secuencias de nucleótidos que son aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95 por ciento, o aproximadamente 96 por ciento, o aproximadamente 97 por ciento, o aproximadamente 98 por ciento o aproximadamente 99 por ciento idénticas a secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 1 -15, 18A, y 19A. El término "oligonucleótido" referido en la presente incluye nucleótidos modificados y/o que ocurren de manera natural enlazados juntos por enlaces de oligonucleótido que ocurren de manera natural y/o que no ocurren de manera natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos generalmente comprendiendo una longitud de 200 bases o menos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases en longitud. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8, 1 9 o 20 a 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de filamento único o de doble filamento, por ejemplo, para utilizarse en la construcción de un mutante genético. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o anti-sentido. El término "nucleótidos que ocurren de manera natural" incluye deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" incluyen nucleótidos con grupos de azúcar modificados o substituidos y lo similar. El término "enlaces de oligonucleótido" incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fósforotioato, fósforoditioato, fósforoselenoato, fósforodiselenoato, fósforoanilotioato, fósforoanilidato, fósforoamidato, y lo similar. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec eí al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein eí al., Nucí. Acids Res. 16:3209 (1 988); Zon eí al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991 ); Zon eí al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-1 08 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1 991 )); Stec eí al., Pat. De EE.UU. No. 5, 151 ,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad para cualquier propósito. En ciertos casos, un oligonucleótido puede incluir una marca para detección. La identidad y similitud de los polipéptidos relacionados pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 , Griffin, A. M. , and Griffin, H.G. , eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press (1 987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M. Stockton Press, New York (1991 ); y Carillo eí al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). En ciertas modalidades, los polipéptidos tienen secuencias de aminoácidos que son aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95 por ciento, o aproximadamente 96 por ciento, o aproximadamente 97 por ciento, o aproximadamente 98 por ciento, o aproximadamente 99 por - ciento idénticas a secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 1 -15, 18B y 1 9B. Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar igualdad más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en los programas computacionales públicamente disponibles. Los métodos del programa computacional preferido para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG, incluyendo GAP (Devereux eí al., Nucí. Acid. Res., 12:387(1984); Genetics Computer Gropu; University of Wisconsin, Madison, Wl , BLASTP, -=BLASTN, y FASTA (Altschul eí al., J. Mol.

Biol., 21 5:403-410 (1990)). Programa BLASTX está públicamente disponible del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes {BLAST Manual, Altschul eí al., NCB/NLM/NIH - Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). El algoritmo bien conocido Smith Waterman también puede utilizarse para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en igualdad de solamente una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta aún cuando no existe relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. De acuerdo con lo anterior, en ciertas modalidades, el método de alineación seleccionado (programa GAP) resultará en una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipétido objetivo.

Por ejemplo, utilizando el algoritmo computacional GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl), dos polipéptidos para los cuales la identidad de secuencia porcentual está por determinarse se alinean para igualdad óptima de sus aminoácidos respectivos (el "abarcado igualado", como se determina por el algoritmo). En ciertas modalidades, una penalidad de abertura de espacio (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se utiliza; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada igualación de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y penalidad de extensión de espacio (que es usualmente 1 /10 veces la penalidad de abertura de espacio), así como también una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff eí al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff eí al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se utiliza por el algoritmo. En ciertas modalidades, los parámetros para una comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman eí al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff eí al., supra (1 992); Penalidad de Espacio: 12 Penalidad de Longitud de Espacio:4 Umbral de Similitud: 0 El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. En ciertas modalidades, los parámetros arriba mencionados son los parámetros de falla para comparaciones de polipéptido (sin penalidad para espacios finales) utilizando el algoritmo GAP. Como se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones1 permiten uso convencional. Ver Immunology — A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991 )), que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos. D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a y a-disibustituidos, aminoácidos de N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e- N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxiIisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e ¡minoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptido utilizada en la preente, la dirección a mano izquierda es la dirección de terminal amino y la dirección a mano derecha es la dirección de terminal carboxi, de acuerdo con la convención y uso estándar. De manera similar, al menos que se especifique de otra manera, el extremo a mano izquierda de secuencias de polinucleótidos de filamento único es el extremo 5'; la dirección a mano derecha de las secuencias de polinucleótidos de doble filamento se refiere como la dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de transcripciones de ARN nascentes se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia del filamento de ADN teniendo la misma secuencia que ARN y que son 5' al extremo 5' de la transcripción de ARN se refieren como "secuencias aguas arriba"; regiones de secuencia del filamento de ADN teniendo la misma secuencia que ARN y que son 3' al extremo 3' de la transcripción de ARN s& refieren como "secuencias aguas abajo". Las substituciones de aminoácidos conservadoras pueden comprender residuos de aminoácidos que no ocurren de manera natural, que se incorporan típicamente por síntesis de péptido químico preferentemente por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidoimitaciones y otras formas invertidas y revertidas de porciones de aminoácido. Los residuos que ocurren de manera natural pueden dividirse en clases en base a las propiedades de cadena lateral común: 1 ) hidrofóbicos: norleucína, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicos naturales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidicos: Asp, Glu; 4) básicos; His, Lys, Arg; 5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Por ejemplo, las substituciones no conservadoras pueden incluir el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Para hacer tales cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, el índice hidropático de ??- aminoácidos puede considerarse. A cada aminoácido se ha asignado un índice hidropático en la base de su hidrofobicidad y características de carga. Son: isoleucína (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cisteína (+2.5); metionina (+1 .9); alanina (+1 .8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofan (-0.9); tirosina (-1 .3); prolina (-1 .6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice de aminoácido hidropático para conferir función biológica interactiva en una proteína se entiende en la materia. Kyte eí al., J. Mol. Biol., 157: 1 05-131 (1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden substituirse por otros aminoácidos teniendo un índice hidropático similar o clasificar y aún mantener una actividad biológica similar. Para hacer cambios en base al índice hidropático, en ciertas modalidades, la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2 se incluye. En ciertas modalidades, aquellos que están dentro de +1 se incluyen, y en ciertas modalidades, aquellos dentro de +0.5 se incluyen. También se entiende en la materia que la substitución de aminoácidos similares puede hacerse efectiva en la base de hidrofilicidad, particularmente donde la proteína biológicamente funcional o péptido así creado se propone para utilizarse en modalidades inmunológicas, como en el caso presente. En ciertas modalidades, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácido; arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0+1 ); glutamato (+3.0+1 ); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5+1 ); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1 .0); metionina (-1 .3); valina (-1 .5); leucina (-1 .8); isoleucína (-1 .8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptofan (-3.4). Para hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades, la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad se encuentran dentro de 2 se incluye, en ciertas modalidades, aquellos que están dentro de +1 se incluyen, y en ciertas modalidades, aquellos dentro de +0.5 se incluyen. Uno también puede identificar epítopos de secuencias de aminoácidos primarias en la base de hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitópico".

Las substituciones de aminoácido ejemplificativas son como se establece en la Tabla 1 . Tabla 1 : Substituciones de Aminoácidos Un experto será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se establece en la presente utilizando técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad al tener como objetivo regiones que no se creen importantes para actividad. En ciertas modalidades, uno puede identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En ciertas modalidades, áreas uniformes que pueden ser importantes para actividad biológica o para estructura pueden someterse a substituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar de manera adversa la estructura de polipéptido. Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función de estructura identificando residuos en polipéptidos similares que son importantes para actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por substituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes, predichos. Un experto en la materia puede también analizar la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la materia puede predecir la alineación de residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas modalidades, un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a residuos de aminoácido predichos por estar en la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden incluirse en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la materia puede generar variantes de prueba conteniendo una substitución de aminoácido única en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden seleccionarse utilizando ensayos de actividad conocidos por aquellos expertos en la materia. Tales variantes podrían utilizarse para obtener información acerca de tales variantes. Por ejemplo, si uno descubrió que un cambio a un residuo de aminoácido particular resultó en actividad destruida, indeseablemente reducida, o inadecuada, variantes con tal cambio pueden evitarse. En otras palabras, en base a la información obtenida de tales experimentos de rutina, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde las substituciones adicionales deben evitarse ya sea solas o en combinación con otras mutaciones. Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de estructura secundaria. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech. , 7(4):422-427 (1996); Chou eí al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou eí al., Biochemistry 1 13(2):21 1 -222 (1974); Chou eí al., Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol. Biol., 47:45-148 (1 978); Chou eí al., Ann. Rev. Biochem., 47:251 -276 y Chou eí al., Biophys, J., 26:367-384 (1 979). Además, los programas de computadora están actualmente disponibles para ayudar con la predicción de estructura secundaria. Un método para predecir estructura secundaria se basa en modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor a 30%, similitud mayor a 40% con frecuencia tienen topologías similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteína (PDB) ha proporcionado predicción mejorada de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de dobleces dentro de una estructura de la proteína o del polipéptido. Ver Holm eí al., Nucí. Acid. Res., 27(1 ):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner eí al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1 997)) que existe un número limitado de dobleces en un polipéptido dado o proteína y que una vez que un número crítico de estructuras se ha resuelto, la predicción estructural será dramáticamente más exacta. Los métodos adicionales para predecir estructura secundaria incluyen "enroscado" (Jones, D. , Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1 997); Sippl eí al., Structure, 4(1 ): 15-1 9 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie eí al., Science, 253: 164-1 70 (1991 ); Gribskov eí al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1 990); Gribskov eí al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), "enlace evolutivo" (Ver Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)). En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpo incluyen variantes de glicosilación en donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido de origen. En ciertas modalidades, las variantes de proteína comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación N-enlazados que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La substitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-enlazada. Alternativamente, las substituciones que eliminan esta secuencia removerán una cadena de carbohidrato N- enlazada existente. También se proporciona una reinstalación de cadenas de carbohidrato N-enlazadas en donde uno o más sitios de glicosilación N-enlazados (típicamente aquellos que ocurren de manera natural) se eliminan y uno o más nuevos sitios N-enlazados se crean. En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpo incluyen variantes de cisteína. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína tienen uno o más residuos de cisteína que se eliminan de o que se reemplazan por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos de origen. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína tienen uno o más residuos de cisteína que se agregan a o que reemplazan otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos de origen. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos se redoblan en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína tienen pocos residuos de cisteína que la proteína nativa. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína tienen más residuos de cisteína que la proteína nativa. En ciertas modalidades, las variantes de cisteína tienen un número par de residuos de cisteína para minimizar interacciones resultando de cisteínas no pares. De acuerdo a ciertas modalidades, las substituciones de aminoácidos son aquellos que: (1 ) reducen la susceptibilidad a proteolísis; (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades funcionales o fisicoquímicas en tales polipéptidos. De acuerdo a ciertas modalidades, las substituciones de aminoácido única o múltiples (en ciertas modalidades, substituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia que ocurre de manera natural (en ciertas modalidades, en la porción del polipéptido fuera del(los) dominio(s) formando contactos intermoleculares). En ciertas modalidades, una substitución de aminoácido conservadora típicamente puede no cambiar substancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tener a romper una hélice que ocurre en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la materia se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991 )); y Thornton eí al., Nature 354: 105 (1 991 ), que se incorporan cada una en la presente para referencia. El término "fragmento de polipéptido" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación de terminal carboxi y/o terminal amino. En ciertas modalidades, los fragmentos son al menos 5 a 467 aminoácidos de largo. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de largo. Los análogos de péptido se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos sin péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido templado. Estos tipos de compuesto sin péptido se denominan "imitaciones de péptido" o "péptidoimitaciones". Fauchure, J. Adv. Drug Res 15:29 (1 986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans eí al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), que se incorporan en la presente para referencia para cualquier propósito. Tales compuestos con frecuencia se desarrollan con la ayuda de modelación molecular computarizada. Las imitaciones de péptido que son estructuralmente similares a péptidos •terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto profiláctico o terapéutico similar. Generalmente, las péptidoimitaciones son estructuramente similares a un polipéptido de paradigma (es decir. , un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazadas por un enlace seleccionado de: ~CH2NH— , — CH2S~, — CH2-CH2--, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2«, «CH(OH)CH2-- y -CH2SO~, por métodos bien conocidos en la materia. La substitución sistémica de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede utilizarse en ciertas modalidades para generar péptidos más estables. Además, los péptidos limitados comprendiendo una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso substancialmente idéntica puede generarse por métodos conocidos en la materia (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992), incorporada en la presente para referencia para cualquier propósito); por ejemplo, al agregar residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido. "Anticuerpo" o "péptido(s) de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento de unión que compite con el anticuerpo intacto para unión específica. En ciertas modalidades, los fragmentos de unión se producen por técnicas de ADN recombinantes. En ciertas modalidades, los fragmentos de unión se producen por separación química o enzimática de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Facb y anticuerpos de cadena única. Los fragmentos de unión sin antígeno incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fe. "Anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que tiene una región variable de anticuerpo de una primer especie fusionada a otra molécula, por ejemplo, una región constante de anticuerpo de otra segunda especie, tal como un mono cinomólgo. En ciertas modalidades, las primeras especies pueden ser diferentes de las segundas especies. En ciertas modalidades, las primeras especies pueden ser las mismas como las segundas especies. En ciertas modalidades, los anticuerpos quiméricos son "anticuerpos de mono" que tienen regiones variables alteradas (a través de mutagénesis o injerto CDR) para igualarse a una porción de la secuencia conocida de regiones variables de mono. El injerto CDR típicamente incluye injertar los CDRs de un anticuerpo con especificidad deseada sobre FRs de un anticuerpo de mono, reemplazando así algo o mucha de la secuencia de no mono con secuencia de mono. Los anticuerpos de mono, por lo tanto, pueden igualarse cercanamente (en secuencia de aminoácidos) a la secuencia de anticuerpos de mono. El término "cadena pesada" incluye cualquier polipéptido teniendo suficientes secuencias de región variable para conferir especificidad para un antígeno particular. El término "cadena ligera" incluye cualquier polipéptido teniendo suficientes secuencias de región variable para conferir especificidad a un epítopo particular. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1 , CH2 y CH3. El dominio VH está en el término amino del polipéptido, y el dominio CH3 está en el término carboxi. El término "cadena pesada", como se utiliza en la presente, comprende una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, V , y un dominio de región constante, C . Como la cadena pesada, el dominio de región variable de la cadena ligera es el término amino del polipéptido. El término "cadena ligera", como se utiliza en la presente, comprende una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma. Un fragmento Fab se comprende de una cadena ligera y las regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar una unión de disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un fragmento Fab' contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de manera que una unión de disulfuro de intercadena puede formarse entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2. Un fragmento Facb es similar a una molécula F(ab')2, excepto que la región constante en las cadenas pesadas de la molécula se extiende al extremo del dominio CH2. La región Fv comprende las regiones variables de ambas cadenas, pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes. Los anticuerpos de cadena única son moléculas Fv - en las cuales las regiones variables de cadena pesada y ligera se han conectado por un enlazador flexible para formar una cadena de polipéptidos única que forma una región de unión de antígeno. Los anticuerpos de cadena única se tratan en detalle, por ejemplo, en WO 88/01649 y Patentes de EE. UU. Nos. 4,946,778 y 5,260,203. Un fragmento Fe contiene los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada y contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de manera que una unión de disulfuro de intercadena puede formarse entre dos cadenas pesadas. Un anticuerpo bivalente diferente a un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional", en ciertas modalidades, típicamente se entiende por tener cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo substancialmente inhibe la adhesión de un ligando a un receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al ligando por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, o más (como se mide en un ensayo de unión competitivo in vitro). El término "epítopo" incluye cualquier polipéptido determinante capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En ciertas modalidades, un anticuerpo une específicamente un antígeno cuando la constante de disasociación es <1 µM en ciertas modalidades, cuando la constante de disasociación es £100 nM, y en ciertas modalidades, cuando la constante de disasociación es <10 nm. El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. Como se utiliza en la presente, los términos "etiqueta" o "con etiqueta" se refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de porciones de biotina que pueden detectarse por avidita marcada (por ejemplo, estraptividina conteniendo un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos colorimétricos u ópticos). En ciertas modalidades, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. Varios métodos de marcado de polipéptidos y glicoproteínas se conocen en la materia y pueden utilizarse. Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Te, 1 1 1 In, 125 I, 131. I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanida), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, galactosidasa ß, luciferasa, fosfatasa alcalina). Quimioluminescente, grupos biotinilo, epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportador secundario (por ejemplo, secuencias pares de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítopo). En ciertas modalidades, las etiquetas se unen por brazos separadores de varias longitudes para reducir los obstáculos esféricos potenciales. El término "muestra biológica", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una substancia de una cosa viviente o cosa anteriormente viviente. Tales cosas vivientes incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos, y otros animales. Tales substancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, nodos linf y piel. El término "fármaco o agente farmacéutico" como se utiliza en la presente se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de manera apropiada a un paciente. El término "modulador", como se utiliza en la presente, es un compuesto que cambia o altera la actividad o función de una molécula. Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o reducción en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Ciertas actividades ejemplificativas y funciones de una molécula incluyen, pero no se limitan a, afinidad de unión, actividad enzimática, y transducción de señal. Ciertos inhibidores ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Pepticuerpos se describen, por ejemplo, en WO01 /83525. Como se utiliza en la presente, "substancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En ciertas modalidades, una fracción substancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento 5 (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas modalidades, una composición substancialmente pura comprenderá más de aproximadamente, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En ciertas modalidades, las especies 1.0 objeto se purifican para homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular única. El término "paciente" incluye sujetos humanos y animales.

En esta solicitud, el uso del singular incluye plural al menos que se establezca específicamente de otra manera. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" al menos que se establezca de otra manera. Además, el uso del término "incluyendo", así como también otras formas, tal como "incluye" e "incluyó", no es limitante. 0 También, los términos tales como "elemento" o "componente" comprende ambos elementos y componentes comprendiendo una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad al menos que se establezca específicamente de otra manera. 5 En ciertas modalidades, esta solicitud trata ciertos polinucleótidos codificando regiones constantes de cadena ligera y pesada. En ciertas modalidades, esta solicitud trata ciertas secuencias de polipéptidos comprendiendo regiones constantes de cadena ligera y pesada. En ciertas modalidades, estos polipéptidos y polinucleótidos de región constante se derivan de monos cinomólgos. En ciertas modalidades, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NOS: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23 , 25, 27 y 29. En ciertas modalidades, un polipéptido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, 12. 14, 16, 1 8, 20, 22, 24, 26, 28 y 30. En ciertas modalidades, un polinucleótido comprende una secuencia codificando una secuencia de aminoácidos comprendiendo una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 1 8, 20, 22, 24, 26, 28 y 30. En ciertas modalidades, las secuencias ... de región variable correspondientes a regiones de determinación complementarias (CDR's), específicamente de CDR1 a CDR3, se proporcionan. En ciertas modalidades, los polinucleótidos de región variable y polipéptidos se derivan de humanos. En ciertas modalidades, el polinucleótido de región variable comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ I D NOS:47-60 y SEQ ID NOS:75-80. En ciertas modalidades, un polipéptido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS:61 -74 y SEQ ID NOS:81 -86. En ciertas modalidades, los polipéptidos y polinucleótidos de región variable se derivan de monos cinomólgos. De acuerdo a ciertas modalidades, las estirpes expresando moléculas de inmunoglobulina comprendiendo regiones constantes derivadas de monos cinomólgos también se proporcionan. En ciertas modalidades, los anticuerpos quiméricos que comprende al menos una porción de una secuencia de mono y otra secuencia de especie se proporcionan. En ciertas modalidades, tal anticuerpo quimérico puede resultar en una respuesta inmune reducida en un mono que un anticuerpo sin secuencias de mono. Por ejemplo, en ciertos casos, un antígeno conteniendo un epítopo de interés puede introducirse en un huésped animal (por ejemplo, un ratón), ^produciendo así anticuerpos específicos a ese epítopo. En ciertos casos, los anticuerpos específicos para un epítopo de interés pueden obtenerse de muestras biológicas tomadas de huéspedes que se exponen de manera natural al epítopo. En ciertos casos, la introducción de |oci inmunoglobulina humana (Ig.) en ratones en los cuales los genes Ig endógenos que se han inactivado ofrece la oportunidad de obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos (MAbs). En ciertos casos, tales anticuerpos de otras especies, pueden producir una respuesta inmune a los anticuerpos ellos mismos en monos, impidiendo así evaluación de estos anticuerpos. En ciertas modalidades, la parte de reemplazo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo con secuencia de mono puede disminuir la magnitud de la respuesta del anti-cuerpo del mono. En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico comprende una región variable de una primer especie y una región constante de una segunda especie. En ciertas modalidades, la región constante es una región constante de mono cinomólgo. Las regiones variables ejemplificativas incluyen, pero no se limitan a, regiones variables de humano, ratón, puerco, conejillo de Indias, mono cinomólgo, y conejo. En ciertas modalidades, las regiones de estructura de la región variable en la cadena pesada y la cadena ligera pueden reemplazarse con regiones de estructura derivadas de secuencias de mono cinomólgo. Los anticuerpos quiméricos pueden producirse por métodos bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. En ciertas modalidades, el polinucleótido de las primeras especies codificando la región variable de cadena pesada y el polinucleótido de las segundas especies codificando la región constante de cadena pesada pueden fusionarse. En ciertas modalidades, el polinucleótido de las primeras especies codificando la región variable de cadena ligera y la secuencia de nucleótidos de las segundas especies codificando la región constante de cadena ligera pueden fusionarse. En ciertas modalidades, estas secuencias de nucleótidos fusionadas pueden introducirse en una célula ya sea en un vector de expresión único (por ejemplo, un plásmido). En ciertas modalidades, una célula comprendiendo al menos un vector de expresión puede utilizarse para hacer el polipéptido. En ciertas modalidades, estas secuencias de nucleótidos fusionadas pueden introducirse en una célula ya sea en vectores de expresión separados. En ciertas modalidades, la célula huésped expresa tanto la cadena pesada quimérica como la cadena ligera quimérica, que se combinan para producir un anticuerpo quimérico. En ciertas modalidades, una célula comprendiendo al menos un vector de expresión puede utilizarse para hacer un anticuerpo quimérico. Los métodos ejemplificativos para producir y expresar anticuerpos quiméricos se tratan abajo. En ciertas modalidades, los dominios funcionales, CH1 , CH2, CH3 y secuencias de intervención pueden arrastrarse para crear una región constante de anticuerpo diferente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, tales regiones constantes de -híbrido pueden optimizarse para vida media en suero, para ensamble y doblez del tetrámero de anticuerpo, y para función efectuadora mejorada. En ciertas modalidades, las regiones constantes de anticuerpo modificadas también pueden producirse al introducir mutaciones de un solo punto en la secuencia de aminoácidos de la región constante y probar el 'anticuerpo resultante para cualidades mejoradas, por ejemplo, aquellas enlistadas arriba. En ciertas modalidades, los anticuerpos quiméricos, comprendidos de secuencias de aminoácidos de mono, pueden utilizarse para desarrollar tratamientos para enfermedades de humano o animales. Los tratamientos ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a tratamientos para VI H, cáncer e inflamación. Por ejemplo, en ciertas modalidades, uno puede desarrollar un anticuerpo de ratón que se une a un epítopo de un patógeno humano, tal como un virus, para el cual existe un modelo animal de mono para la enfermedad del humano. En ciertas modalidades, para determinar si un anticuerpo que se une a ese epítopo particular sería benéfico para tratar al humano, un anticuerpo quimérico comprendiendo una región variable de anticuerpo de ratón y una región constante de anticuerpo de mono podrían evaluarse para su eficacia para tratar la enfermedad en monos antes de intentar el tratamiento en humanos. De esta manera, en ciertas modalidades, un método para evaluar los efectos de un anticuerpo se proporciona comprendiendo: a) introducir en un mono cinomólgo un anticuerpo quimérico comprendiendo regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo y regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera de un mono cinomólgo; y b) evaluar los efectos del anticuerpo quimérico en el mono cinomólgo. En ciertas modalidades, . los efectos pueden evaluarse al medir una reducción en la cantidad de patógeno en el mono o al medir una reducción en los síntomas de la enfermedad. Por supuesto, el tratamiento no se limita al tratamiento de una enfermedad causada por un patógeno. En ciertas modalidades, una enfermedad puede establecerse en un mono por otros métodos incluyendo introducción de una substancia (tal como un carcinógeno) y manipulación genética. En ciertas modalidades, los efectos pueden evaluarse al detectar uno o más eventos adversos en el mono. El término "evento adverso" incluye, pero no se limita a, una reacción adversa en un mono que recibe un anticuerpo que no está presente en un mono que no recibe el anticuerpo. En ciertas modalidades, los eventos adversos incluyen, pero no se limitan a, fiebre, una respuesta inmune a un anticuerpo, inflamación, o muerte del mono.

Estructura de Anticuerpo que Ocurre de Manera Natural Las unidades estructurales de anticuerpo que ocurre de manera natural típicamente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero típicamente se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par teniendo una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 25 kDa) y "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 50-70 kDa). La porción de terminal amino de cada cadena típicamente incluye una región variable de aproximadamente 100 a 1 1 0 o más aminoácidos que típicamente es responsable del reconocimiento de antígeno. La porción de terminal carboxi de cada cadena ' típicamente define una región constante que puede ser responsable de la función efectuadora. Las funciones efectuadoras de anticuerpo incluyen activación de estimulación y complemento de opsonofagocitosis. Las cadenas ligeras de humano se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas, típicamente se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, epsilón, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo pero no limitándose a lgG1 , lgG2, lgG3, y lgG4. IgM tiene subclases incluyendo, pero no limitándose a lgM1 e lgM2. IgA se subdivide de manera similar en subclases incluyendo, pero no limitándose a lgA1 e lgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, típicamente, las regiones constantes y variables se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Ver, por ejemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1 989)) (incorporada para referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada típicamente forman el sitio de unión de antígeno. Las regiones variables típicamente muestran la misma estructura general de regiones de estructura relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones de determinación complementarias o CDRs. CDRs de las dos cadenas de cada par típicamente se alinean por las regiones de estructura, que pueden permitir la unión a un epítopo específico. De la terminal N a la terminal C, ambas regiones variables de cadena pesada y ligera típicamente comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La cesión de los aminoácidos a cada dominio es típicamente de acuerdo con las definciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), o Clothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1 987); Clothia eí al., Nature 342:878-883 (1989). Anticuerpos Biespecíficos o Bifuncionales Un anticuerpo biespecífico o bifuncional típicamente es un anticuerpo de híbrido artificial teniendo dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitándose a, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1 990), Kostelny eí al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1 992). En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una proteína de fusión comprendiendo toda o una porción funcional de una región constante de anticuerpo de mono cinomólgo de cadena ligera y/o pesada. La proteína de fusión puede comprender cualquier secuencia de polipéptido adicional deseada, incluyendo opcionalmente una o más secuencias enlazadoras. La secuencia de polipéptido adicional puede comprender, por ejemplo, toda o parte de una secuencia de polipéptido que ocurre de manera natural. Cualquier secuencia de polipéptido que ocurre de manera natural, o porción- de la misma, puede utilizarse, por ejemplo, una secuencia de polipéptidos de una proteína que se une a otra molécula, por ejemplo, a otra proteína. Ejemplos de secuencias de polipéptido que ocurren de manera natural que se unen a otra proteína incluyen secuencias derivadas de una proteína receptora, una proteína ligando, una proteína de multimep'zación, una proteína de factor de transcripción, una proteína ribosomal, y una proteína citoesquelética. Otros ejemplos de secuencias de polipéptidos que ocurren de manera natural adecuadas para utilizarse en tales proteínas de fusión incluyen secuencias de polipéptido teniendo una actividad enzimática, por ejemplo, actividad enzimática que modifica la proteína, por ejemplo, una quinasa, fosfatasa, o actividad de proteasa. En otras modalidades, la secuencia de polipéptidos adicional no ocurre de manera natural. Puede ser, por ejemplo, una versión modificada, mutada o de otra manera derivada de una secuencia de proteína que ocurre de manera natural. Alternativamente, puede ser una secuencia artificial. En tal modalidad, la secuencia de polipéptidos que no ocurre de manera natural confiere una propiedad deseada a la proteína de fusión, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, detectabilidad o lo similar. En una modalidad, la secuencia de polipéptidos que no ocurre de manera natural permite a la proteína de fusión unirse a una molécula objetivo deseada, por ejemplo, a otra proteína. Ejemplos de proteína objetivo incluyen ligandos y proteínas de recepción. La proteína de fusión puede, por ejemplo, no tener efecto en el funcionamiento del objetivo, o puede afectar el funcionamiento del objetivo, por- ejemplo, puede incrementar o reducir el nivel de función de la molécula objetivo. La proteína de fusión puede ejercer su efecto en la proteína objetivo a través de cualquier mecanismo, por ejemplo, al ocultar estéricamente la interacción del objetivo con su efectuador y/o molécula(s) de substrato, o al de manera aloesteárica la afinidad de la molécula objetivo para su efectuador y/o molécula(s) de substrato. Las secuencias de polipéptidos adecuadas para modalidades de las proteínas de fusión de la invención pueden diseñarse o seleccionarse utilizando cualquier técnica conocida en la materia. En una modalidad, una biblioteca de proteínas de fusión se hace, y una o más proteínas de fusión individuales se seleccionan de la biblioteca por su habilidad para unirse a una molécula objetivo deseada. Ejemplos adicionales de métodos y composiciones relacionándose con las proteínas de fusión de la presente invención pueden encontrarse en la Pat. de EE. UU. No. 6,660,843, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, las proteínas de fusión de la invención se proporcionan como parte de composiciones farmacéuticas adecuadas para utilizarse en un sujeto, por ejemplo, en un primate tal como un mono cinomólgo o un humano. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto, por ejemplo, un primate tal como un mono cinomólgo o un humano, utilizando proteína de fusión de la invención. Preparación de Anticuerpos En ciertas modalidades, las modificaciones conservadoras a las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de mono cinomólgo quimérico (y modificaciones correspondientes a los nucleótidos de codificación) producirán anticuerpos teniendo características químicas y funcionales similares a aquellas del anticuerpo quimérico original.

En contraste, las modificaciones substanciales en las características químicas y/o funcionales de un anticuerpo de mono cinomólgo quimérico puede acompañarse al seleccionar substituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la estructura molecular en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación helicoidal u hoja, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Por ejemplo, una "substitución de aminoácido conservadora" puede incluir una substitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo no nativo de manera que hay poco o nada de efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también substituirse con alanina, como se ha descrito previamente para "mutagénesis de exploración de alanina". Las substituciones de aminoácido deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden determinarse por aquellos expertos en la materia en el momento que tales substituciones se desean. En ciertas modalidades, las substituciones de aminoácido pueden utilizarse para identificar residuos importantes del anticuerpo de mono cinomólgo quimérico, '. tales como aquellos que pueden incrementar o reducir lá afinidad de los anticuerpos quiméricos a antígeno dado o la función efectuadota de los anticuerpos quiméricos. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden expresarse en estirpes diferentes a las estirpes de hibridoma. En ciertas modalidades, las secuencias codificando anticuerpos particulares, incluyendo anticuerpos quiméricos, pueden utilizarse para transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. De acuerdo a ciertas modalidades, la transformación puede ser por cualquier método para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y translucir una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la materia, como se ejemplifica por las Pat. de EE. UU. Nos. 4,399,21 6, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (tales patentes se Incorporan en la presente para referencia para cualquier propósito). En ciertas modalidades, el procedimiento de transformación utilizado puede depender del huésped a transformarse. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la materia e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextran, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibereno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del(los) polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. Las estirpes de mamífero disponibles como huéspedes para expresión se conocen bien en la materia a incluyen, pero no se limitan a, muchas estirpes inmortalizadas disponibles de American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo pero no limitándose a células de ovario de hámster chino (CHO), células E5, células HeLa, células de riñon de hámster bebe (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras estirpes. En ciertas modalidades, las estirpes pueden seleccionarse a través de determinar que estirpes tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión de antígeno constitutivas. De acuerdo a ciertas modalidades, los anticuerpos son útiles para detectar un antígeno particular en muestras biológicas. En ciertas modalidades, esto permite la identificación de células o tejidos que producen la proteína. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen a una proteína particular y bloquean la interacción con otros compuestos de unión pueden tener uso terapéutico. En ciertas modalidades, los métodos se proporcionan para tratar un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo. En ciertas modalidades, el agente terapéutico adicional se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. > En ciertas modalidades, un anticuerpo se utiliza junto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, los factores morfogénicos óseos designados BMP-1 a BMP-12; factor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß) y miembros de la familia TGF-ß; inhibidores de interléukina-1 (IL-1 ), incluyendo, pero no limitándose a, IL-1 ra y derivados de la misma y Kineret™; inhibidores de TNFa, incluyendo, pero no limitándose a, receptores de TNFa solubles, Enbrel ™, anticuerpos anti-TNFa, Remicade™, y anticuerpos D2E7; hormona de paratiroides y análogos de la misma; proteína relacionada con paratiroides y análogos de la misma; proteína relacionada con paratiroides y análogos de la misma; prostaglandinas de serie E; bifosfonatos (tal como alendronato y otros), minerales intensificadores de hueso tales como fluoruro y calcio; medicamentos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAIDs), incluyendo, pero no limitándose a, inhibidores COX-2, tales como Celebrex™ y Vioxx™; inmunosupresores, tales como metotrexato o leflunomida; inhibidores de proteasa de serina, incluyendo, pero no limitándose a, inhibidor de proteasa de leucocito secretorio (SLP1 ); inhibidores IL-6 (incluyendo pero no limitándose a anticuerpos para IL-6), inhibidores IL-8 (incluyendo pero no limitándose a, anticuerpos para IL-8); inhibidores IL-1 8 (incluyendo, pero no limitándose a, proteína de unión I L-18 y anticuerpos IL-18); moduladores de enzima de conversión de interleukina 1 (ICE); factores de crecimiento de fibroblasto FGF-1 a FGF-10 y moduladores FGF; antagonistas PAF; factor de crecimiento de queratinocito (KGF), moléculas relacionadas con KGF, y moduladores KGF; moduladores de metaloproteinasas matriz (MMP); moduladores de sintasa de óxido nítrico (NOS), incluyendo pero no limitándose a, moduladores de NOS inducibles; moduladores de receptor de glucocorticoide; moduladores de receptor de glutamato; moduladores de niveles de lipopolisacárido (LPS); y noradrenalina y moduladores e imitaciones de los mismos. Ver, por ejemplo, Solicitud PCT Publicada No. WO 03/0002713 para detalles ejemplificativos en agentes terapéuticos adicionales ejemplificativos. En ciertas modalidades, en vista de la condición y el nivel deseado de tratamiento, dos, tres o más agentes pueden administrarse. En ciertas modalidades, tales agentes pueden proporcionarse juntos por inclusión en la misma formulación. En ciertas modalidades, tales agentes y un anticuerpo pueden proporcionarse juntos por inclusión en la misma formulación. En ciertas modalidades, tales agentes pueden proporcionarse juntos por inclusión en un equipo de tratamiento. En ciertas modalidades, tales agentes y un anticuerpo pueden proporcionarse juntos por inclusión en un equipo de tratamiento. En ciertas modalidades, tales agentes pueden proporcionarse por separado, En ciertas modalidades, cuando se administran por terapia genética, los genes codificando agentes de proteína y/o un anticuerpo pueden incluirse en el mismo vector. En ciertas modalidades, los gentes codificando agentes de proteína y/o un anticuerpo pueden estar bajo el control de la misma región promotora. En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsificador, conservador y/o adyuvante -> . terapéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo y una cantidad terapéuticamente efectiva de la menos un agente terapéutico adicional, junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsificador, conservador y/o adyuvante terapéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, al menos un agente terapéutico se selecciona de factores morfogénicos óseos designados BMP-1 a BMP-12; factor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß) y miembros de la familia TGF-ß; inhibidores de interleukina-1 (IL-1 ), incluyendo, pero no limitándose a, I L-1 ra y derivados de la misma y Kineret™; inhibidores de TNFa, incluyendo, pero no limitándose a, receptores de TNFa solubles, Enbrel ™, anticuerpos anti-TNFa, Remicade™, y anticuerpo D2E7; hormona de paratiroides y análogos de la misma, prostaglandinas de serie E; bifosfonatos (tal como alendronato y otros), fluoruro y calcio; medicamentos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAI Ds), incluyendo inhibidores COX-2, tales como Celebrex™ y Vioxx™; inmunosupresores, tales como metotrexato o leflunomida; inhibidores de proteasa de serina tal como inhibidor de proteasa de leucocito secretorio (SLP1 ); inhibidores IL-6 (por ejemplo, anticuerpos para IL-6), inhibidores IL-8 (por ejemplo, anticuerpos para IL-8); inhibidores IL-18 (por ejemplo, proteína de unión IL-18 o anticuerpos IL-18); moduladores de enzima de conversión de interleukina 1 (ICE); factores de crecimiento de fibroblasto FGF-1 a FGF-10 y moduladores FGF; antagonistas PAF; factor de crecimiento de queratinocito (KGF), moléculas relacionadas con KGF, o moduladores KGF; moduladores de metaloproteinasas matriz (MMP); moduladores de sintasa de óxido nítrico (NOS), incluyendo moduladores de NOS inducibles; moduladores de receptor de glucocorticoide; moduladores de receptor de glutamato; moduladores de niveles de lipopolisacárido (LPS); y noradrenalina y moduladores e imitaciones de los mismos. Ver, por ejemplo, Solicitud PCT Publicada No. WO 03/0002713 para detalles ejemplificativos en agentes terapéuticos adicionales ejemplificativos. En ciertas modalidades, los materiales de formulación aceptables preferentemente son no tóxicos para receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En ciertas modalidades, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobiales, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); reguladores (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes voluminosos (tal como manitol o glicina); agentes de quelación (tal como ácido tetraacético etilenodiamina (EDTA)); agentes de composición (tal como cafeína, poliyinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), rellenos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes o diluyentes; agentes emulsificadores; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tal como sodio); conservadores (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tal como glicerina, glicol de propileno o glicol de polietileno); alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; agentes tensoactivos o agentes humectantes (tales como pluróncis, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tale como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxApal); agentes intensificadores de estabilidad (tales como sucrosa o sorbitol); agentes intensificadores de tonicidad (tales como haluros de metal álcali, preferentemente cloruro de potasio o sodio, sorbitol de manitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company (1 990). En ciertas modalidades, un anticuerpo y/o una molécula terapéutica adicional se enlaza a un vehículo de extensión de vida media conocido en la materia. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, dominio Fe, glicol de polietileno, y dextran. Tales vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de EE. UU. No. de Serie 09/428,082 y la Solicitud PCT publicada No. WO 99/25044, que se incorporan en la presente para referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la materia dependiendo de, por ejemplo, la vía propuesta de administración, formato de suministro y dosificación deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceuticals Sciences, supra. En ciertas modalidades, tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de despejo in vivo de los anticuerpos de la invención.

En ciertas modalidades, el portador o vehículo primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuoso o no acuoso en naturaleza. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un portador o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. En ciertas modalidades, la salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero son vehículo ejemplificativos adicionales. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden regulador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o regulador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, que puede incluir además sorbitol o un substituto adecuado para el mismo. Los portadores farmacéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a, aceites, incluyendo aceite de petróleo, aceite animal, aceite vegetal, aceite de maní, aceite de semilla de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, y lo similar. Las soluciones de glicerol y dextrosa acuosas también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. En ciertas modalidades, una composición comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede prepararse para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada teniendo el grado deseado de pluralidad con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, una composición comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tal como sucrosa. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para suministro parenteral. En ciertas modalidades, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para suministro a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la materia. En ciertas modalidades, . los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas modalidades, los reguladores se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o aun pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un rango de pH de desde aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En ciertas modalidades, cuando la administración parenteral se contempla, una composición terapéutica puede estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógeno comprendiendo el anticuerpo deseado, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, un vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual el anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una solución isotónica, estéril, adecuadamente conservada. En ciertas modalidades, la preparación puede incluir la formación de la molécula deseada con un agente, tales como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación sostenida o controlada del producto que puede entonces suministrarse a través de una inyección de depósito. En ciertas modalidades, el ácido hialurónico también puede utilizarse, y puede tener el efecto de promover duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, los dispositivos de suministro de fármaco implantables pueden utilizarse para introducir la molécula deseada. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. En ciertas modalidades, un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un polvo seco para inhalación. En ciertas modalidades, una solución de inhalación comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse con un propulsor para suministro en aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe además en la solicitud PCT no. PCT/US94/001875, que describe suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas. En ciertas modalidades, se contempla que las formulaciones pueden administrarse oralmente. En ciertas modalidades, un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que se administra en esta manera puede formularse con o sin aquellos portadores utilizados comúnmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. En ciertas modalidades, una cápsula puede designarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. En ciertas modalidades, al menos un agente adicional puede incluirse para facilitar la absorción del anticuerpo y/o cualquier agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegradores de tableta, y aglutinantes pueden también emplearse. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva de anticuerpos, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. En ciertas modalidades, al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en forma de dosis única. En ciertas modalidades, los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la materia, incluyendo formulaciones incluyendo anticuerpos, con o sin al menos agentes terapéuticos adicionales, en formulaciones de suministro controlado o sostenido. En ciertas modalidades, las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro controlado o sostenido, tales como portadores de liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por aquellos expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Solicitud PCT No. PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3,773,919 y EP 058,481 ), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato gamma (Sidman eí al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer eí al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981 ) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de vinilo etileno (Langer eí al., supra) o ácido po!i-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). En ciertas modalidades, las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Eppstein eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949.

En ciertas modalidades, la composición farmacéutica para utilizarse para administración in vivo es estéril. En ciertas modalidades, esto puede realizarse por filtración a través de membranas de filtración estériles. En ciertas modalidades, donde la composición se liofiliza, la esterilización utilizando este método puede conducirse ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. En ciertas modalidades, la composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un contenedor teniendo un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco teniendo un detenedor perforable por una aguja de inyección hipodérmica. En ciertas modalidades, después de que la composición farmacéutica se ha formulado; puede almacenarse en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo liofilizado o deshidratado. En ciertas modalidades, tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de administración. En ciertas modalidades, la presente invención se dirige a equipos para producir una unidad de administración de dosis única. En ciertas modalidades, los equipos pueden contener cada uno tanto un primer contenedor teniendo una proteína seca como un segundo contenedor teniendo una formulación acuosa. En ciertas modalidades de esta invención, los equipos conteniendo jeringas pre-llenadas de múltiples cámaras y únicas (por ejemplo, jeringas de líquido o liojeringas) se incluyen. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos y contextos terapéuticos. Un experto en la materia apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento, de acuerdo a ciertas modalidades, de esta manera variará -dependiendo en parte, de la molécula suministrada, la indicación para la cual el anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se está utilizando, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el médico puede concentrar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En ciertas modalidades, una dosificación tópica puede variar de aproximadamente 0.1 µg/kg a hasta aproximadamente 1 00 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. En ciertas modalidades, la dosificación puede variar de 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 µg/kg hasta aproximadamente 1 00 mg/kg. En ciertas modalidades, la frecuencia de dosificación tomará en cuenta los parámetros farmacocinéticas del anticuerpo y/o cualquier agente terapéutico adicional en la formulación utilizada. En ciertas modalidades, un médico administrará la composición hasta que una dosificación se alcanza que logra el efecto deseado. En ciertas modalidades, la composición por lo tanto puede administrarse como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter. Refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace de manera rutinaria por aquellos de experiencia ordinaria en la materia y está dentro del ámbito de tareas rutinariamente realizadas por ellos. En ciertas modalidades, las dosificaciones apropiadas pueden acertarse a través del uso de datos de respuesta a dosis apropiados. En ciertas modalidades, la vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intraarterial, intraportal o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En ciertas modalidades, las composiciones pueden administrarse por inyección de bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación. En ciertas modalidades, la composición puede administrare localmente a través de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. En ciertas modalidades, donde un dispositivo de implantación se utiliza, el dispositivo puede implantarse en un órgano o tejido adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser a través de difusión, bolo de liberación de tiempo, o administración continua. En ciertas modalidades, puede ser deseable utilizar una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos y/u órganos que se han removido del paciente se exponen a una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo, con o sin al menos r un agente terapéutico adicional, después dee lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantan subsiguientemente de nuevo en el paciente. En ciertas modalidades, un anticuerpo y/o cualquier agente terapéutico adicional puede suministrarse al implantar ciertas células que se han formado genéticamente, utilizando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos. En ciertas modalidades, tales células pueden ser células humanas o de animal, y pueden ser antologas, heterólogas, o xenogenéicas. En ciertas modalidades, las células pueden inmortalizarse. En ciertas modalidades, para reducir la elección de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En ciertas modalidades, los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, membranas o anexos poliméricos semi-permeables que permiten la liberación del(los) producto(s) de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes. EJEMPLOS Ejemplo 1 Clonación de Región Constante de Cadena Pesada de Secuencias de Mono Cinomólgo Los polinucleótidos codificando regiones constantes de cadena pesada de anticuerpo de mono cinomólgo nativo se clonan como sigue: A. Para la región constante cyno3-16, ARN se aisla de células de mono B cinomólgo purificadas de sangre completa de un mono cinomólgo. cADN se sintetiza del ARN y el cADN se utiliza como un templado para PCR con los siguientes cebadores: (5-'GCCTCCACCAAGGGCCCTCG-3' (SEQ ID NO:31 ) y 5'-TTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:32): PCR se realiza utilizando un Sistema PCR de Alta Fidelidad de Expansión (Roche) con la adición de 5% DMSO. Las muestras se incuban primero por 2 minutos a 94°C, seguido por 40 ciclos bajo las siguientes condiciones por ciclo: 30 seg a 94°C; 30 segundos a ya sea 45°C o 50°C; y 1 minuto o 1 .5 minutos a 72°C. Las muestras son entonces incubadas por 7 minutos a 72°C después del último ciclo PCR. Los cebadores PCR se utilizan a una concentración de 30 pmol y 2 ul preparación de cADN se utiliza. B. Para las regiones constantes cyno2-4 y cyno33, el ADN genómico aislado de una estirpe de célula B de mono cinomólgo se tulipa como un templado para PCR. Dos conjuntos de cebadores diferentes se utilizan para amplificación de estas regiones constantes IgG cyno. 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCTCG-3' (SEQ ID NO:33) y 5'- TTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:34) se utilizan para cyno2-4 mientras que 5'-GTCACATGGCACCACCTCTCT-3' (SEQ ID NO:35) y 5'-GGTACGTGCCAAGCATCCTCG-3' (SEQ ID NO:36) se utilizan para cyno33. Las reacciones PCR se realizan como se describe en el Ejemplo 1 A anterior excepto que 1 µl de ADN genómico se utiliza como un templado. Después de la clonación inicial, cada uno de los polinucleótidos codificando las regiones constantes de mono cinomólgo se construye como un cassette Nhel-Notl al introducir un sitio de restricción de enzima Nhel y Notl en el cebador PCR apropiado. Específicamente, las modificaciones de nucieótido se '- hacen eñ el extremo 5' de cada región constante para introducir un sitio Nhel . Esto no altera la secuencia de aminoácidos. Un sitio Notl se introduce inmediatamente 3' en el codón de terminación. C. La región constante cyno2-4cys se construye por mutagénesis dirigida por sitio PCR del polinucleótido codificando la secuencia cyno2-4. La mutagénesis dirigida por sitio se lleva a cabo utilizando un Equipo de Mutagénesis Dirigido por Sitio QuikChange (Stratagene). La tercer serina en el dominio CH1 se convierte en una cisteína al introducir una mutación de punto único. Los cebadores utilizados son: 5'-CTGGCGTCCTGCTCCAGGAGC-3' (SEQ ID NO:37) y 5'-GCTCCTGGAGCAGGACGCCAG-3' (SEQ ID NO:38). D. La región constante cynodsl comprende secuencias de las regiones constantes cyno33 y cyno2-4. Los polinucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 94 del dominio CH 1 de cyno33 se amplifican por PCR como se describe arriba en el Ejemplo 1 A, generando un cassette Nhel-Sall al introducir los sitios de restricción Nhel y Salí en los cebadores PCR por métodos conocidos en la materia. Los cebadores utilizados son 5'- GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT-3' (SEQ ID NO:39) y 5'-AACTGTCTTGTCGACCTTGGTGTTG-3' (SEQ ID NO:40). El extremo 3' de los polinucleótidos codificando CH 1 , articulación, dominios CH2 y CH3 de cyno2-4 se amplificanr.por PCR como se describe arriba en el Ejemplo 1 A para generar un cassette Sall-Notl utilizando cebadores 5'-CAACACCAAGGTCGACAAGAGAGTT-3' (SEQ ID NO:41 ) y 5'-GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACACGGAG-3' (SEQ ID NO:42). La introducción del sitio Salí no altera la secuencia de polipéptidos. El cassette Nhel-Sall y el cassette Sall-Notl se ligan para hacer una secuencia de polinucleótidos codificando la región constante cynodsl . La construcción resultante contiene el dominio CH1 de cyno33 con la excepción de un cambio T a R en el segundo al último aminoácido del dominio CH1. La articulación, dominios CH2 y CH3 se codifican por la secuencia de polinicleótidos cyno2-4. E. Para las regiones constantes cyno686 y cuno439, una biblioteca cADN se prepara de ARN aislado de tejidos linfoides de mono cinomólgo mezclado. Este cADN se utiliza como un templado para PCR, que se lleva a cabo utilizando dos cebadores 5'-CGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3' (SEQ ID NO:43) y 5'- GCATGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:44). La mezcla de reacción PCR incluye dos microlitros de cada cebador, los cebadores en una concentración de 5 picomoles por microlitro; 5 microlitos de Stratagene 10X Pfu regulador, una mezcla de 0.5 microlitro de 10 milimolares dNTPs (A, C, G, T); 0.5 microlitros de dos y unidades medias por polimerasa Pfu Stratagene microlitro; 1 microlitro de templado cADN; y 39 microlitros de agua estéril. El volumen final de la reacción es 50 microlitros. Veintiocho ciclos PCR se llevan a cabo utilizando los siguientes parámetros por ciclo: 20 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, y 150 segundos a 74°C. Los productos PCR se clonan utilizando el sistema de clonación Invitrogen PCRI I TOPO-TA (K4600-01 SC) utilizando las instrucciones proporcionadas por el sistema. t Las regiones constantes de cadena pesada adicionales pueden aislarse de acuerdo a los procedimientos generales tratados arriba. Los clones cyno3-16, cyno2-4, cyno33, cyno2-4cys, cynodsl , y clones adicionales preparados por métodos como aquellos descritos arriba pueden compararse para similitudes en secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos. Ver, por ejemplo, Figuras 16 y 17. Ejemplo 2 Clonación de la Región Constante de Cadena Ligera de Secuencias de Mono Cinomólgo Los polinucleótidos nativos que codifican la región constante kappa de cadena ligera de mono cinomólgo se clona de una estirpe de célula B de mono cinomólgo. ARN se aisla de la estirpe y el cADN se sintetiza del ARN. El cADN se utiliza como un templado para PCR con los siguientes cebadores: 5'- ATCAAACGAGCTGTGGCTGCACAA-3' (SEQ ID NO:45) y 5'- CAGGTGGGGGCACTTCTCCCT-3' (SEQ ID NO:46). PCR se utiliza utilizando un Sistema PCR de Alfa Fidelidad de Expansión (Roche) con la adición de 5% DMSO. Las muestras se incuban primero por 2 minutos a 94°C, seguido por 40 ciclos bajo las siguientes condiciones por ciclo: 30 segundos a 94°C; 30 segundos a 45°C; y 1 minuto a 72°C. Las muestras se incuban entonces por 7 minutos a 72°C después del último ciclo PCR. Los cebadores PCR se utilizan a una concentración de 30 pmol y 2 µl de preparación de cADN se utiliza. Después de la clonación inicial, el polinucleótido que codifica- la región constante kappa de mono cinomólgo se construye como ún cassette BssHIl-Notl por PCR. Las modificaciones de nucleótido se hacen en el extremo 5' de la región constante para introducir un sitio BssHI l. Esto no altera la secuencia de aminoácidos. Un sitio Notl se introduce 3' al codón de terminación. Ejemplo 3 Ensamble de la Cadena Pesada Quimérica y Cadena Ligera v Producción de Anticuerpos Quiméricos Cadena Pesada Quimérica Una molécula de cadena pesada completa comprendiendo una región variable de cadena pesada y una región constante de mono cinomólgo se hacen. El polinucleótido codificando la región variable se sintetiza por PCR para generar ya sea un cassette Sall- Nhel o un cassette Sall-Apal. Ambos cassettes incluyen Kozak y secuencias guía 5' de la secuencia que codifica la región variable. El extremo 3' del cassette Sall-Apal incluyen los nucleótidos codificando los primeros 5 aminoácidos de la región constante de mono cinomólgo. Ciertas cadenas pesadas quiméricas ejemplificativas pueden producirse con las secuencias variables de cadena pesada proporcionadas en la Figura 18. Para hacer el plásmido de cadena pesada cyno3-16, el cassette de región variable Sall-Apal se une a-ios cassettes de región constante de mono cinomólgo descritos en el Ejemplo 1 A en el sitio Apal ubicado cinco aminoácidos del comienzo de las regiones constantes. La construcción formada se clona entre los sitios Salí y Notl del vector de expresión transitorio pDC414-N. Para hacer el plásmido de cadena pesada cyno33, el cassette de región variable Sall-Apal se une a los cassettes de región constante de mono cinomólgo descritos en el Ejemplo 1 B en el sitio Apal ubicado cinco aminoácidos del comienzo de las regiones constantes. La construcción formada se clona entre los sitios Salí y Notl del vector de expresión transitorio pDC414-N. Para hacer el plásmido de cadena pesada cyno2-4, el cassette de región variable Sall-Nhel se une al polinucleótido que codifica los cassettes de región constante de mono cinomólgo como se describe en el Ejemplo 1 B en el sitio Nhel . La construcción formada también se clona entre los sitios Salí y Notl de pDC414-N.

Para hacer el plásmido de cadena pesada cynodsl , el cassette de región variable Sall-Nhel se une al polinucleótido que codifica los cassettes de región constante de mono cinomólgo como se describe en el Ejemplo 1 D en el sitio Nhel . La construcción formada también se clona entre los sitios Salí y Notl de pDC414-N. pDC414-N es una versión modificada de pDC412 (Ettehadieh eí al., Cytotechnology 38: 1 1 -14 (2002)). PDC414-N contiene un origen de réplica Epstein-Barr de 120 pares base mínimo (Shirakaía and Iría, J. Biochem. 123: 175-181 (1998)) en lugar del origen de réplica Epstein-Bar de 2.1 pares kilobase en pDC412. El sitio Nhel también se remueve de la estructura de vector de pDC414-N. Para hacer el plásmido de cadena pesada cyno2-4cys, el cassette de región variable Sall-Nhe!. se une al polinucleótido que codifica la región distante cyno2-.4cys descrita en el Ejemplo 1 C en el sitio Nhel . La construcción formada se clona entre los sitios Salí y Notl del vector de expresión transitorio pDC409 (Giri eí al., EMBO J. 13:2822-2830 (1994)). Cadena Ligera Quimérica Una molécula de cadena ligera completa comprendiendo una región variable de cadena ligera y una región constante de mono cinomólgo se hace. La región variable se sintetiza por PCR como un cassette Sall-BssHIl. El cassette incluye Kozak y secuencias guía 5' de la región variable. De acuerdo a varias modalidades, cualquier región variable de cadena ligera de cualquier especie puede combinarse con una región constante de cadena pesada de un orno cinomólgo. Ciertas cadenas ligeras quiméricas ejemplificativas pueden producirse con las secuencias variables de cadena ligera proporcionadas en la Figura 19. Para hacer el plásmido de cadena ligera, el cassette de región variable Sall-BssHI l se une al cassette de región constante NotL-BssHH cynokappa descrito en el Ejemplo 2 en el sitio BssH I l . El cassette Sall-Notl resultante se clona entre los sitios Salí y Notl de pDC414-N. Métodos para construir estas cadenas pesadas y ligeras quiméricas conllevan a la digestión enzimática, ligación, y transformación en huéspedes celulares bacterianos de acuerdo a procedimientos bien conocidos en la materia. Producción de Anticuerpos Quiméricos Los plásmidos de cadena ligera y pesada de mono cinomólgo quimérico se co-transfectan en células E5 de acuerdo a los métodos de Ettehadieh eí al., (Cytotechnology 38: 1 1 -14 (2002)) para expresión transitoria de anticuerpos. Generalmente, las células se transfectan utilizando DEAE/dextran seguido por ataque DMSO. Después de la transfección, las células se desarrollan por 7 días en medio bajo en suero, conteniendo 0.5% suero de bovino fetal. Los anticuerpos se purifican de los sobrenadantes celulares. El sobrenadante se pasa sobre una columna de resina A de proteína de 4.6 x 100 mm (POROS20 A de Perseptive Biosystems) a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto, después de equilibrar primero la columna con PBS (Salina Regulada con Fosfato pH 7.4). El flujo directo se recolecta. La columna se enjuaga con 40 mi de PBS pH 7.4 y la proteína se eluye utilizando 15 mi de 0.1 M Glicina pH 2.7+0.3 M NaCI recolectando 15x1 mi fracciones. Las fracciones se neutralizan utilizando 100 ul de 1 .0 M Tris pH 8.0. Las muestras se preparan utilizando un equipo de chip lab 200 plus de proteína (Agilent) y se pasan en bioanalizador Agilent 2100 utilizando el ensayo 200 de proteína, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para anticuerpos comprendiendo cyno3-16, cyno33, y cyno2-4, 3 ul de PBS se mezclan con 1 ul de muestra de anticuerpo. Para anticuerpos comprendiendo cyno2-4cys y cynodsl , 4 ul de muestra de anticuerpo se utiliza. Este 4 ul se mezcla entonces con 2 ul de solución no reductora, desnaturalizante. Las muestras se calientan por 3 minutos a 100°C y después se diluyen con 84 ul de agua destilada. Seis microlitros de estas muestras diluidas se aplican a chips de lab y analizan para la presencia de anticuerpo. Alternativamente, las muestras pueden analizarse en un gel SDS-PAGE, de acuerdo a técnicas estándar en la materia. El peso molecular aproximado de una cadena ligera quimérica es 23.3 kDa y el peso molecular aproximado de una cadena pesada quimérica es 49.7 kDa. En un gel SDS-PAGE, estos pesos moleculares son aproximadamente 29 kDa para la cadena ligera quimérica y aproximadamente 53 kDa para la cadena pesada quimérica. Las fracciones conteniendo el anticuerpo se transfieren en PBS pH 7.2 o 6.8 utilizando diálisis o una unidad de filtro Amicon Centricon Plus 10k MWCO (no. cat. UFC2LGC24) a 3000 RPM en un centrífugo a 4°C. Después de la transferencia a PBS las muestras se filtran estériles con un filtro de 22 micrones. Ejemplo 4 Medir la Habilidad de Unión de Epítopo del Anticuerpo Quimérico Para probar la actividad de ciertos anticuerpos ejemplificativos, se utilizan en ensayos de actividad para buscar el bloqueo de inducción por IL4 e IL1 3 de CD23 en células B. Ver, por ejemplo, T. Defrance eí al., (J Exp Med 165: 1459 (1987)) y J. Punnonen eí al., (Proc. Nat. Acad. Sci. 90:3730-34 (1993)) para una descripción de la inducción de CD23 de células B por IL4 e IL13 -respectivamente. En los ensayos de actividad, los anticuerpos se concentran en cultivos de célula B conteniendo IL4. Inhibición de expresión CD23 se mide, por ejemplo, por análisis FACS utilizando un anticuerpo fluorescente para detectar la superficie celular CD23. Ejemplo 5 Medir la Habilidad de Unión Fe del Anticuerpo Quimérico Los anticuerpos quiméricos se concentran en PBS de 20 mg/ml (nM) en diluciones de 2 dobleces, se diluyen 6 veces y pre-incuban con exceso (1 mM9 de hulL-4R soluble biotinilado (hecho con aminohexanoil-Biotin-N-hidroxi-éster de succinimida; Zymed cat. No. 004302) a 4°C por 30 minutos. hulL-4R soluble biotinilado se hace con éster de aminohexanoil-Biotin-N-hidroxisuccinimida (Zymed cat. No. 004302) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Este ensayo se adapta para utilizarse con cualquier anticuerpo quimérico y el antígeno que reconoce. Las células mononucleares de sangre periférica eliminadas de T (PBMC) se incuban en RPMI de suero libre por 1 hora a 37°C para permitir el sombreado de IgG citofílico unido a FcR. Las células se colorean entonces con ab/biotin-hulL-4R anti-hulL-4R compuesto concentrado. Las células se enjuagan 2X en PBS, girando a 150Xg. Las células se incuban entonces con estreptatividina-ficoeritrina (Molecular Probes, cat. No. S-866) que se diluye a 1 : 150 en PBS, a 4°C por 30 minutos. Las células se enjuagan 2X en PBS, a 150Xg, y la unión de complejo se detecta por análisis citométrico de flujo accesándose en los monolitos por tamaño.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un polipéptido aislado comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:14; o SEQ ID NO:20 y comprendiendo además una región variable de cadena pesada de anticuerpo.
2. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena pesada de anticuerpo es una región variable de cadena pesada de anticuerpo de mono cinomólgo.
3. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena pesada de anticuerpo es una región variable de cadena pesada de anticuerpo de una especie diferente a un mono cinomólgo.
4. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena pesada de anticuerpo es una región variable de cadena pesada de anticuerpo de humano.
5. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la región variable de cadena pesada de anticuerpo es una región variable de cadena pesada de anticuerpo de ratón.
6. Un polipéptido aislado comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:30 y comprendiendo además una región variable de cadena ligera de anticuerpo.
7. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, caracterizado porque la región variable de cadena ligera de anticuerpo es una región variable de cadena ligera de anticuerpo de mono cinomólgo.
8. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, caracterizado porque la región variable de cadena ligera de anticuerpo es una región variable de cadena ligera de anticuerpo de una especie diferente a un mono cinomólgo.
9. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, caracterizado porque la región variable de cadena ligera de anticuerpo es una región variable de cadena ligera de anticuerpo de humano.
1 0. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, caracterizado porque la región variable de cadena ligera de anticuerpo es una región variable de cadena ligera de anticuerpo de ratón.
1 1 . Un polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; o SEQ ID NO:20 y comprendiendo además una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo.
12. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de mono cinomólgo.
13. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de una especie diferente a un mono cinomólgo.
14. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque Ja secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de humano.
15. El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena pesada de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de ratón.
16. Un polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO.30 y comprendiendo además una secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo.
17. El polinucleótido aislado según la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo de mono cinomólgo.
18. El polinucleótido aislado según la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo de una especie diferente a un mono cinomólgo.
19. El polinucleótido aislado según la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo de humano.
20. El polinucleótido aislado según la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia que codifica un polipéptido comprendiendo una región variable de cadena ligera de anticuerpo es una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo de ratón.
21 . El polinucleótido aislado según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO: 1 1 ; SEQ ID NO: 13; o SEQ ID NO: 19.
22. El polinucleótido aislado según la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO:29.
23. Un anticuerpo aislado comprendiendo un primer polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; o SEQ I D NO:20 y un segundo polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:30.
24. El anticuerpo aislado según la reivindicación 23, comprendiendo además una región variable de cadena pesada de mono cinomólgo y una región variable de cadena ligera de mono cinomólgo.
25. El anticuerpo aislado según la reivindicación 23, comprendiendo además una región variable de cadena pesada de una especie diferente a un mono cinomólgo y una región variable de cadena ligera de la especie diferente a un mono cinomólgo.
26. El anticuerpo aislado según la reivindicación 25, caracterizado porque la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera son de la misma especie.
27. El anticuerpo aislado según la reivindicación 23, comprendiendo además una región variable de cadena pesada de anticuerpo de humano y una región variable de cadena ligera de anticuerpo de humano.
28. El anticuerpo aislado según la reivindicación 23, comprendiendo además una región variable de cadena pesada de anticuerpo de ratón y una región variable de cadena ligera de anticuerpo de ratón.
29. Un método para evaluar los efectos de un anticuerpo comprendiendo: a) introducir en un mono cinomólgo un anticuerpo quimérico comprendiendo regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo y regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera de un mono cinomólgo; y b) evaluar los efectos del anticuerpo quimérico en el mono cinomólgo.
30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la evaluación comprende evaluar la eficacia del anticuerpo quimérico para tratar o prevenir una enfermedad en el mono.
31 . El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la evaluación comprende detectar un evento adverso en el mono.
32. Un vector de expresión comprendiendo un polinucleótido aislado de la reivindicación 1 1 .
33. Un vector de expresión comprendiendo un polinucleótido aislado de la reivindicación 16.
34. Una célula comprendiendo al menos uno de los vectores de expresión de la reivindicación 32 o reivindicación 33.
35. Un método para hacer un polipéptido comprendiendo: a) incubar una célula comprendiendo el vector de expresión de la reivindicación 32 en condiciones adecuadas para expresión del polipéptido; y b) aislar el polipéptido.
36. Un método para hacer un polipéptido comprendiendo: a) incubar una célula comprendiendo el vector de expresión de la reivindicación 33 en condiciones adecuadas para expresión del polipéptido; y b) aislar el polipéptido.
37. Un método para hacer un anticuerpo quimérico comprendiendo: a) incubar una célula comprendiendo el vector de expresión de la reivindicación 32 y comprendiendo además el vector de expresión de la reivindicación 33 en condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo quimérico; y b) aislar el anticuerpo quimérico.