JP2003505431A - タンパク質抗原およびペプチド抗原の免疫原性を増強するためのfc融合タンパク質 - Google Patents
タンパク質抗原およびペプチド抗原の免疫原性を増強するためのfc融合タンパク質Info
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Abstract
Description
4,965(この開示は、本明細書中で参考として援用される)に対する優先権
およびその恩恵を主張する。
びペプチド抗原の免疫原性を増強するための方法および組成物に関する。より詳
細には、本発明は、免疫グロブリン重鎖定常領域および予め選択された抗原を含
む融合タンパク質をコードする核酸、およびその融合タンパク質を規定するアミ
ノ酸配列を含む方法および組成物に関し、ここでこの融合タンパク質における予
め選択された抗原は、この予め選択された抗原単独と比較して、この哺乳動物に
おいてより強力な免疫応答を誘発し得る。
ててきた。現在のところ、ワクチンとして使用される因子としては、代表的に、
不活性化または弱毒化微生物(例えば、細菌またはウイルス)、それらの産物(
例えば、毒素)、または精製された抗原が挙げられる。現代分子生物学および遺
伝子クローニング方法論の到来に伴ない、より純粋であり、かつ明らかにより特
異的なワクチンを作製することが可能となった。さらに、分子レベルでの免疫系
の見識により、感染性因子によって刺激される免疫応答の単離および特徴付けが
可能となった。免疫応答の首尾良い産生に対する中枢であると考えられる免疫系
の2つの要素としては、以下が挙げられる:調節性T細胞および細胞傷害性T細
胞の中心的役割;ならびに、抗原提示細胞(APC)によって、抗原がこれらの
T細胞に提示される様式。例えば、W.E.Paul編(1993)FUNDA
MENTALS OF IMMUNOLOGY,Raven Press,Lt
d., New York。
外因性抗原)は、APCのエンドサイトーシス性小胞またはエンドソーム内で分
解され、ここで、生じたペプチドフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体(
major histocompatability class)(MHC)
クラスIIタンパク質と複合体を形成する。生じた複合体は、細胞表面に移動し
、この表面でこの複合体は、APC付近の免疫細胞に提示される。ペプチドフラ
グメントは、MHC分子によって規定される溝に適合し、そしてこの複合体は、
この複合体に対する結合特異性を有するT細胞レセプターを発現するT細胞によ
って認識され得る。ペプチド負荷MHCクラスII分子とヘルパーT細胞との間
の相互作用は、当該分野ではCD4 T細胞と呼ばれており、それ自身のMHC
クラスII分子とT細胞表面上のCD4+レセプターとの間の別の相互作用によ
ってさらに安定化される。従って、APC細胞内でプロセスされる外因性抗原は
、MHCクラスII分子を介して細胞表面上に提示される。CD4+T細胞に提
示される場合、このMHCクラスII複合体は、サイトカインを分泌するCD4 + ヘルパー細胞を生じ、これが、ペプチドに対する抗体を産生するようにB細胞
を刺激する。Paul(前出)を参照のこと。
じさせ、これが一般的に、抗体産生を生じさせる。細胞傷害性T細胞(CTL)
は、代表的に、このような経路によって刺激されない。明らかに、例えば、ウイ
ルスに感染した細胞におけるウイルスタンパク質の産生または癌細胞における癌
特異タンパク質の産生を介して、抗原がAPC自体の内側から生じる(内因性抗
原)状況下では、CTLは刺激される。実際、多くのウイルス性疾患では、CT
Lの産生が、ウイルスに感染した細胞を排除し、それによって感染から回復する
において重要であると考えられている。
示されている。発生期のポリペプチドの合成の間、ポリペプチドの一部分は、プ
ロテオソームと呼ばれる細胞内構造によって分解される。このプロセスに由来す
るフラグメントは、MHCクラスII分子ではなく、新たに合成されたMHCク
ラスIと複合体化し、ここで、生じたMHCクラスI複合体含有抗原は、細胞表
面に輸送される。再度、特異的ペプチドフラグメントに対する特異性を有するT
細胞は、T細胞に結合するが、この場合、必要とされるコレセプター(co−r
eceptor)相互作用は、MHCクラスI分子とCD8分子との間で生じる
。従って、APCの表面上の内因性抗原は、CD8+T細胞に対して提示される
。細胞傷害性ではないCD8+T細胞のいくつかの型が存在するが、CD8+T細
胞は、CTLの大半を構成する。
的に、タンパク質)が、細胞の内側で作製されるか、または適切な細胞区画内に
送達されるかのいずれかであり、その結果、それがMHCクラスIプロセシング
経路に入り得ることを必要とする。1つのストラテジーは、目的のタンパク質ま
たはペプチドをコードする遺伝子をウイルスに組み込み、次いで、この操作され
たウイルスをワクチンとして使用することである(Lorenzら(1999)
HUM.GENE THER.10:623−631)。別のストラテジーは、
タンパク質をコードするDNAベクターを細胞に注入し、次いで、この細胞を動
物または患者に投与することであり、ここで、これは細胞内から発現され、次い
で、MHCクラスI分子を介して細胞表面上に提示される(Donnellyら
(1997)ANNU.REV.IMMUNOL.15:617)。DNAベク
ターを筋肉または皮膚中に直接注入する類似の技術によって、いくつかの抗原に
対するCTLおよび/または抗体応答を誘導することが示された(Laiら(1
988)CRIT.REV.IMMUNOL.18:449−84、および米国
特許第5,589,466号)。研究によって、抗原がAPCによって取りこま
れ、そしてプロセスされ、ここで免疫系に提示されることが示された(Laiら
、前出)。
ジュバント(例えば、フロイントアジュバント、およびスクアレンと界面活性剤
との混合物(Hilgersら(1999)VACCINE 17:219−2
28))の使用を通して、そしてより近年では、マクロファージによって食作用
を受け、そして代替的なMHCクラスI経路を介してCTL応答を誘導する、抗
原をコーティングした小ビーズの使用を通して、部分的に成功してきた(De
Bruijnら(1995)EUR.J.IMMUNOL.25:1274−1
285)。さらに、抗原に対する免疫応答を増強する他の方法としては、組換え
免疫刺激性サイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、GM−CSFなど)
と組合せた化学的アジュバントの使用が挙げられ得る。例えば、1つの方法は、
ハプテンと化学的に反応したタンパク質抗原に、このサイトカインを連結させる
方法として、IL−2に融合された抗ハプテン抗体を使用する(Harvill
ら(1996)J.IMMUNOL.157:3165)。
体の「抗原化(antigenization)」を使用する。一旦、組換え抗
体が、APC表面上のFcレセプターとの相互作用を介してAPCに結合すると
、ハイブリッド分子のペプチド抗原はAPC上に提示される(Lanzaら(1
993)PROC.NATL.ACAD.Sci.USA 90:11683−
11687)。このアプローチの延長は、「抗原化された」免疫グロブリン重鎖
をコードするプラスミドDNAの脾臓注射を利用し、この後、脾臓由来B細胞は
、一旦免疫グロブリン軽鎖パートナーが与えられると、組換え抗体を分泌する。
ハードルの1つである。ワクチン接種の目標は、強力な免疫応答を誘発すること
である。しかし、宿主免疫系は、細菌およびウイルスと闘うように誘起されるの
で、細菌またはウイルスがベクターとして使用される場合、このメッセンジャー
は代表的に、このメッセージに沿って破壊される。さらに、特定のウイルスベク
ター(例えば、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス)に対する強力な免疫
応答は、その用途を制限し、そしてタンパク質ベクターとして細菌毒素を使用す
る間に、同様の問題が生じ得ることが予期される。同様に、本来、免疫系により
「自己」とはみなされない可変領域を利用する、抗体に基づく「タンパク質ベク
ター」は、潜在的に免疫原性である。これらのキャリア分子を複数使用すること
は、抗イディオタイプ応答を誘導し得、それによって、この有効な用途を妨げる
ことが予期される。従って、予め選択されたタンパク質抗原またはペプチド抗原
に対する強力かつ長期持続的な免疫を生じるワクチンを提供することが、本発明
の目的である。
ることによって、哺乳動物における予め選択されたペプチド抗原またはタンパク
質抗原の免疫原性を増強することが可能であるという発見に基づく。次いで、生
じる融合タンパク質(本明細書中では、「Fc−抗原融合タンパク質」または「
抗原融合タンパク質」ともいわれる)またはこの融合タンパク質をコードする核
酸配列は、ワクチンの形態で哺乳動物に投与されて、この予め選択された抗原に
対する免疫応答を誘発し得る。さらに、予め選択された抗原に対して誘発された
免疫応答の強さおよび型は、Fc−抗原融合タンパク質またはFc−抗原融合タ
ンパク質をコードする核酸配列と共に特定のアジュバントを投与することによっ
て調節され得ることが発見された。
するための方法を提供する。1つの局面では、本方法は、免疫応答を誘発するに
十分な量の予め選択された抗原に対してポリペプチド結合によって連結された免
疫グロブリン重鎖定常領域を含むFc−抗原融合タンパク質を、哺乳動物に投与
する工程を包含する。別の局面では、本方法は、予め選択された抗原に融合され
た免疫グロブリン重鎖定常領域を含むFc−抗原融合タンパク質をコードする、
核酸配列(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA))を
、哺乳動物に投与する工程を包含する。Fc−抗原融合タンパク質の部分の場合
(融合タンパク質として投与されるか、核酸(これは、次いで、宿主において、
融合タンパク質を産生するように発現される)として投与されるかのいずれか)
、予め選択された抗原は、匹敵量(例えば、重量または分子数による)の予め選
択された抗原単独(すなわち、免疫グロブリン重鎖定常領域に融合されていない
、予め選択された抗原)よりも強力な免疫応答を、哺乳動物において刺激し得る
という点で特徴付けられる。
免疫応答は、アジュバントと共にFc−抗原融合タンパク質を投与することによ
って、増強または調節され得る。種々のアジュバント(例えば、フロイント完全
アジュバントまたは非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドのような、
化学的アジュバント)が、本発明の実施において有用であり得るが、Fc−抗原
融合タンパク質と共に使用される現在好ましいアジュバントは、第2のFc融合
タンパク質(本明細書中では、「Fc−アジュバント融合タンパク質」または「
アジュバント融合タンパク質」といわれる)、またはこのようなFc融合タンパ
ク質をコードする核酸を含む。好ましいFc−アジュバント融合タンパク質は、
アジュバントタンパク質(例えば、サイトカイン)に対してポリペプチド結合に
よって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。Fc−アジュバント融合
タンパク質の構築において有用な好ましいサイトカインとしては、例えば、イン
ターフェロン−γ(IFN−γ)、インターロイキン−2(IL−2)、インタ
ーロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−12(IL−12)、IL−
18、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM
CSF)が挙げられる。別のクラスのFc−アジュバント融合タンパク質は、通
常は、部分的(partically)または排他的に膜に結合したタンパク質
の細胞外ドメインに対応するアジュバント部分に融合された免疫グロブリン重鎖
領域を含む。例えば、CD40リガンドは、Fc部分に融合されて、増強された
アジュバントタンパク質として使用される。
与(同時または順次(例えば、Fc−抗原に次いでFc−アジュバント、または
Fc−アジュバントに次いでFc−抗原)のいずれか)を使用して、予め選択さ
れた抗原に対して刺激される免疫応答の型を調節し得る。2つのクラスの免疫応
答(Th1およびTh2と称される)が、異なる刺激および関与する異なるサイ
トカインに応答して開始される。Th1媒介性免疫応答は代表的に、事実上細胞
性であり、一方、Th2媒介性免疫応答は代表的に、事実上体液性である。従っ
て、Th1応答は、改変された細胞(癌細胞またはウイルス感染細胞)を攻撃す
るにおいて有用であり得、一方、Th2応答は、寄生生物のような細胞外因子を
攻撃するにおいて有用であり得る。一般的免疫応答を刺激するためか、または特
異的Th1応答もしくはTh2応答を開始もしくは調節するために、免疫グロブ
リン重鎖定常領域に融合されたサイトカインを投与することが、しばしば有用で
ある。
重鎖定常領域を含むFc−アジュバント融合タンパク質は、免疫応答(Th1応
答およびTh2応答の両方を含む)の強力な一般的刺激物質である。IL−12
またはIFN−γを含むFc−アジュバント融合タンパク質は、同時に投与され
て、主に細胞性またはTh1媒介性の免疫応答を刺激し得る。あるいは、IL−
4を含むFc−アジュバント融合タンパク質を投与して、主に体液性またはTh
2媒介性の免疫応答を刺激し得る。
の選択は、Fc−抗原融合タンパク質の予め選択した抗原に対して産生された抗
体のクラスに影響を与え得る。例えば、IL−12含有Fc−アジュバント融合
タンパク質は、ヘルパーT細胞、およびIgG2aクラスの抗体の産生を刺激し
得る。あるいは、IL−4含有アジュバント融合タンパク質は、IgEクラスの
抗体の産生を刺激し得る。
合タンパク質またはFc−抗原融合タンパク質をコードする核酸をFc−アジュ
バント融合タンパク質と組み合わせて投与する工程を包含する。2つの融合タン
パク質(各々は、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む)を用いることによって、
哺乳動物における同一または類似の細胞型において、予め選択された抗原および
アジュバントタンパク質(例えば、サイトカイン)の両方を同時に局在化するこ
とが可能である。例えば、マクロファージ、B細胞、顆粒球および樹状細胞は、
それらの細胞表面上でFcレセプターを発現する。従って、Fcレセプターを結
合し得る、Fc−抗原融合タンパク質およびFc−アジュバント融合タンパク質
を同時投与することによって、同一の細胞型において抗原融合タンパク質の抗原
およびアジュバント融合タンパク質のアジュバントを同時に局在化することが可
能である。次いで、このアジュバントは、予め選択された抗原の付近での免疫応
答を刺激、増強、または他の方法で調節し得る。
形態を使用する。第1に、本発明は、抗原およびアジュバントの両方に融合され
、身体の特定の領域に濃縮される共通部分を用いる。この方法では、このアジュ
バントの近傍における抗原の効果的な局所濃縮が増加される。第2に、本発明は
、抗原を、免疫系の抗原プロセシングおよび提示機構へ標的化する。第1の濃縮
工程は、抗原タンパク質およびアジュバントタンパク質を免疫系にアクセス可能
である身体のいくつかの部分において濃縮を生じさせる部分に融合することによ
って実行され得る。第2の標的工程は、この抗原タンパク質を抗原提示系への送
達、または抗原提示系によるプロセシングを増強する任意の部分に融合すること
によって実行され得る。
つの方法は、2つの異なる融合タンパク質(抗原局在化タンパク質融合物および
アジュバント局在化タンパク質融合物)を構築および投与することである。第2
の方法は、抗原、アジュバント、および局在化タンパク質を含む融合物を構築お
よび投与することである。Fc部分は、局在化タンパク質の1例である。
ける予め選択された抗原とは異なり、これが、好ましくは、非免疫原性または意
図されたレシピエントにおけるわずかに弱い免疫原性であることである。換言す
ると、Fc−抗原融合タンパク質において、予め選択された抗原は、レシピエン
トにおける免疫原性を免疫グロブリン重鎖定常領域よりも高めるように設計され
る。同様に、Fc−アジュバント融合タンパク質はまた、意図されるレシピエン
トにおいて非免疫原性か、または弱い免疫原性であるべきであることが考慮され
る。免疫グロブリン重鎖定常領域の免疫原性は、減少され得、そして特定の場合
、意図されるレシピエントと同一種に存在する免疫グロブリン定常領域配列に由
来する免疫グロブリン定常領域配列またはこの配列に類似の配列を用いることに
よって排除され得る。例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域(好ましくは、ヒト
起源の)を使用して、ヒトに投与されるべき融合タンパク質を生成する。同様に
、意図されるレシピエントがヒトである場合、Fc−アジュバント融合タンパク
質におけるアジュバントタンパク質もまた、好ましくはヒト起源である。免疫グ
ロブリン重鎖定常領域およびアジュバントタンパク質を規定する適切なアミノ酸
配列の選択によって、主に予め選択された抗原に対する直接的な免疫応答を最適
化することが可能である。
重鎖定常領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびに必要に応じて、CH2ド
メイン、CH3ドメインおよびCH4ドメインまたはそれらの組み合わせからな
る群より選択される免疫グロブリン定常領域ドメインを含む。しかし、この免疫
グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、少なくともCH1ドメインを欠失する
。さらに、本発明のFc融合タンパク質は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖可
変領域ドメイン(VH)を欠失する。この融合タンパク質がヒトに投与される場
合、免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、ヒンジ領域、およびCH2ド
メインもしくはCH3ドメインを含み、そして最も好ましくは、ヒンジ領域なら
びにCH2ドメインおよびCH3ドメインの両方を含む。本発明の実施において
有用である免疫グロブリン重鎖定常領域がIgA(Igα)、IgD(Igδ)
、IgE(Igε)、IgG(Igγ)、およびIgM(Igμ)として当該分
野において言及される5つの免疫グロブリンクラスのいずれかに属する免疫グロ
ブリンに由来し得ることが意図される。しかし、IgGクラス由来の免疫グロブ
リン重鎖定常領域が好ましい。
いて含まれ得ることが意図される。好ましい実施形態において、予め選択された
抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカインレセプターのエクトドメイン(ect
odomain)、ウイルスタンパク質、および癌特異抗原または腫瘍特異抗原
からなる群より選択される。
であり得る。例えば、予め選択された抗原のN末端は、免疫グロブリン重鎖定常
領域のC末端に対してポリペプチド結合によって連結され得る。あるいは、予め
選択された抗原のC末端は、免疫グロブリン重鎖定常領域のN末端に対してポリ
ペプチド結合によって連結され得る。さらに、このFc−抗原融合タンパク質が
複数の1つ以上の予め選択された抗原を含み得、この1つ以上の予め選択された
抗原は、互いにか、または免疫グロブリン重鎖定常領域に直接かまたはポリペプ
チドリンカーを介して連結され得ることが意図される。さらに、2つ以上のFc
−抗原融合タンパク質は、非共有的または共有的のいずれかで(例えば、1つ以
上のジスルフィド結合を通じて)共に結合され、ダイマーまたはマルチマーの組
成物を産生し得る。ダイマー構築物におけるFc−抗原融合タンパク質は、同一
か、または互いに異なり得ることが意図される。例えば、両方のFc−抗原融合
タンパク質が、同一の免疫グロブリン重鎖定常領域を含み得るが、予め選択され
た抗原は異なり得る。類似の構造が、またこのFc−アジュバント融合タンパク
質とともに使用され得ることが意図される。
おいて有用であり得る。例えば、この核酸配列は、5’から3’方向に、免疫グ
ロブリン重鎖定常領域および予め選択された抗原、または予め選択された抗原お
よび免疫グロブリン重鎖定常領域のいずれかをコードし得る。さらに、この核酸
配列はまた、必要に応じて、例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域のヒンジ領域
に直接融合された免疫グロブリン軽鎖配列に基づいて「リーダー」または「シグ
ナル」配列を含み得る。好ましい実施形態において、このFc領域がIgG配列
に基づく場合、このFc領域は、5’から3’方向に、少なくとも免疫グロブリ
ンヒンジ領域(すなわち、第2の免疫グロブリンヒンジ領域配列とジスルフィド
結合を形成し得る少なくとも1つのシステインアミノ酸を含むヒンジ領域)、免
疫グロブリンCH2ドメインおよびCH3ドメインをコードする。さらに、Fc
−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列はまた、例えば、細菌宿主、意図さ
れるレシピエント、またはその両方のいずれかにおいてFc融合タンパク質を発
現し得る複製可能な発現ベクター内に組み込まれ得る。
ュバント融合タンパク質をコードする核酸配列とともにのいずれかでの注射は、
細胞性免疫応答、体液性免疫応答またはその両方の生成を生じ得ることが意図さ
れる。核酸ベースの免疫およびタンパク質ベースの免疫の組み合わせ(例えば、
Fc−抗原融合タンパク質をコードする核酸の、投与前、投与中または投与後の
Fc−抗原融合タンパク質の投与)は、互いに相乗作用し、核酸またはタンパク
質単独のいずれかでの免疫と比較して、予め選択された抗原に対するより強力な
免疫応答を誘発し得る。
および特許請求の範囲からより明らかにされる。
わちTh2細胞性媒介免疫応答、細胞性免疫応答すなわちTh1細胞性媒介応答
、およびいくつかの場合、両方の型の免疫応答を誘導するためのインビボでのタ
ンパク質抗原またはペプチド抗原の効率的な送達に関する。予め選択された抗原
を免疫グロブリン重鎖定常領域に融合し、Fc−抗原融合タンパク質を産生する
ことによって、哺乳動物においてこの予め選択されたタンパク質またはペプチド
抗原の免疫原性を増強することが可能であることが、ここに発見された。次いで
、得られるFc−抗原融合タンパク質、またはFc−抗原融合タンパク質をコー
ドする核酸配列を、ワクチン形態で、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与し、予め
選択された抗原に対する免疫応答を誘発し得る。
標的化する。理論に拘束されることは望まないが、このFc−抗原融合タンパク
質のAPCへの結合が、多数の免疫細胞型(例えば、樹状細胞;マクロファージ
;B細胞;および顆粒球を含む)上で発現されるFcレセプターを通じて媒介さ
れると考えられる。このFc−抗原融合タンパク質が、哺乳動物に投与されると
、Fcレセプターを結合し、その後、このFc−抗原融合タンパク質は、APC
によってエンドサイトーシスされる。次いで、このエンドサイトーシス化融合タ
ンパク質(予め選択された抗原を含む)は、小さなペプチドに分解され、次いで
、この小さなペプチドが細胞表面上に提示されると考えられる。次いで、提示さ
れたペプチドは、体液性および/または細胞性の免疫応答を媒介する。刺激され
た免疫応答の特定の型は、Fc−抗原融合タンパク質をアジュバントとともに(
例えば、アジュバント融合タンパク質)同時投与することによって調節され得る
。
与される。投与の別の様式において、Fc−抗原融合タンパク質をコードする核
酸配列は、レシピエントに投与される。投与されるFc−抗原タンパク質におい
てか、または投与される核酸から発現されるかのいずれかである予め選択された
抗原は、この抗原単独(すなわち、免疫グロブリン重鎖定常領域に対してポリペ
プチド結合によって融合されない抗原)よりも免疫原性が高い。さらに、特定の
環境において、融合タンパク質の連続的な投与、続いて、同一の融合タンパク質
をコードする核酸の投与、または融合タンパク質をコードする核酸の投与、続い
て、同一の融合タンパク質の投与を使用して、予め選択された抗原の免疫原性を
最大化し得る。Fc−抗原融合タンパク質の両方の成分が活性である場合、最適
な免疫応答が誘発されることが理解される。換言すると、Fc−抗原融合タンパ
ク質における予め選択された抗原は、免疫応答を誘発し得、そして免疫グロブリ
ン重鎖定常領域は、APCの表面上でFcレセプターを結合し得る。
の強度および型は、Fc−抗原融合タンパク質および/またはFc−抗原融合タ
ンパク質をコードする核酸とともに特定のアジュバントを同時投与することによ
って調節され得る。化学的アジュバント(例えば、ミョウバンまたはフロイント
完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント)が、特定の環境下で(
例えば、獣医学的適用において)本発明の実施において有用であり得るが、それ
らの副作用(例えば、組織瘢痕化)は、ヒト使用に対して受容不可能にし得る。
従って、好ましいアジュバントは、第2のFc融合タンパク質を含む。ここで免
疫グロブリン重鎖定常領域は、アジュバントタンパク質に融合され、Fc−アジ
ュバント融合タンパク質を産生する。Fc−抗原融合タンパク質と同様に、最適
な免疫応答は、Fc−アジュバント融合タンパク質の両方の成分が活性である場
合に誘発されることが理解される。換言すると、Fc−アジュバント融合タンパ
ク質におけるアジュバントは、免疫応答を調節し得、そして免疫グロブリン重鎖
定常領域は、APCの表面上でFcレセプターを結合し得る。
合タンパク質をコードする核酸として抗原およびアジュバントの両方を投与する
。換言すると、抗原を、Fc−抗原融合タンパク質として投与し、そしてアジュ
バントを、Fc−アジュバント融合タンパク質として投与する。本発明の実施に
有用なFc融合タンパク質の特定の好ましい実施形態を、図1A〜1Gに示す。
ブリン重鎖定常領域1のC末端が、予め選択された抗原またはアジュバント2の
N末端に直接にかまたはポリペプチドリンカーによってかのいずれかで連結され
ている。本明細書中に使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、2つ
のタンパク質をともに連結する1つ以上のアミノ酸残基の配列を意味することが
理解される。このポリペプチドリンカーは、多くの場合、例えば、グリシン残基
および/またはセリン残基の反復を含む約10〜15残基の長さの一連のアミノ
酸である。図1Bは、代表的なFc融合タンパク質を示す。このタンパク質は、
予め選択された抗原またはアジュバント2のC末端が、免疫グロブリン重鎖定常
領域1のN末端に直接にかまたはポリペプチドリンカーによってかのいずれかで
連結されている。
つのFc融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、2つ
のFc融合タンパク質を含む。これらのタンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常
領域1のそれぞれのC末端が予め選択された抗原のN末端またはアジュバント2
に連結されている。同様に、図1Dは、2つのジスフィルド結合による共有結合
によって連結されている2つのFc融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。
この二量体構築物は、2つのFc融合タンパク質を含む。このタンパク質では、
予め選択された抗原またはアジュバント2のそれぞれのC末端が免疫グロブリン
重鎖定常領域1のN末端に連結されている。
ンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、2つのFc融合タン
パク質を含む。これらのタンパク質では、免疫グロブリン重鎖定常領域1のそれ
ぞれのC末端が、予め選択された抗原またはアジュバント2のN末端に、直接的
にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結され、この予め選
択された抗原またはアジュバント2のC末端は、第二の抗原またはアジュバント
2’に直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結され
ている。
合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、2つのFc融合
タンパク質を含む。これらのタンパク質では、抗原またはアジュバント2のC末
端が、免疫グロブリン重鎖定常領域1のN末端に、直接的にかまたはポリペプチ
ドリンカーを介するかのいずれかで連結され、この免疫グロブリン重鎖定常領域
1のC末端は、異なるアジュバントまたは抗原2’のN末端に直接的にかまたは
ポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されている。例えば、このよ
うな融合タンパク質は、予め選択された抗原−免疫グロブリン重鎖定常領域−ア
ジュバントをN末端からC末端の方向に含み得る。
合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、2つのFc融合
タンパク質を含む。これらのタンパク質では、抗原またはアジュバント2のC末
端が、異なるアジュバントまたは抗原2’のN末端に直接的にかまたはポリペプ
チドリンカーを介するかのいずれかで連結されており、この異なるアジュバント
または抗原2’のC末端は、免疫グロブリン重鎖定常領域1のN末端に直接的に
かまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されている。例えば
、このような融合タンパク質は、予め選択された抗原−アジュバント−免疫グロ
ブリン重鎖定常領域をN末端からC末端の方向に含み得る。
配置することが、一般的に好ましい。次いで、このアジュバント部分がFc部分
のN末端に配置される場合、アジュバント−Fc融合物は、免疫細胞上のアジュ
バントレセプターに結合し得、そして、抗体が細胞表面に結合する場合、Fc部
分は、採用される方向と同一の方向である。ADCCまたは補体定着が生じ得る
。しかし、Fc部分がアジュバント部分のN末端に配置される場合、ADCCお
よび補体定着は、生じないようである。
ジスフィルド結合の対によってクロスリンクされた二量体として示される。図に
おいて、ジスフィルド架橋を、これらの分子のネイティブ形態に特徴的なヒンジ
領域を介して、2つの免疫グロブリン重鎖定常領域の一部をともに連結するよう
に示す。免疫グロブリンヒンジ領域を含む構築物が好ましいが、本発明は、他の
部分におけるクロスリンクが所望されるように選択され得ることを意図する。さ
らに、いくつかの場合において、2つ以上のモノマーは、非共有結合で結合し、
本発明の実施に有用なダイマーまたはマルチマーを産生し得る。
「Fc領域」と相互変換可能に使用され、かつ免疫グロブリン重鎖定常領域のカ
ルボキシ末端部分、またはFcレセプターを結合し得るそのアナログもしくは一
部を意味することが理解される。公知のように、各々の免疫グロブリン重鎖定常
領域は、4または5のドメインを含む。これらのドメインを、順に以下のように
呼ぶ:CH1−ヒンジ−CH2−CH3(−CH4)。CH4は、IgMに存在
し、IgMは、ヒンジ領域を有さない。本発明の実施に有用である免疫グロブリ
ン重鎖定常領域は、好ましくは免疫グロブリンヒンジ領域を含み、そして好まし
くは、CH3ドメインもまた含む。免疫グロブリン重鎖定常領域は、最も好まし
くは、免疫グロブリンヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む
。本明細書中で使用される場合、用語免疫グロブリン「ヒンジ領域」は、免疫グ
ロブリンヒンジ領域全体、または第二の免疫グロブリンヒンジ領域と1つ以上の
ジスフィルド結合を形成するに十分な免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一
部を意味することが理解される。
びIgMと称される免疫グロブリンクラスの各々に属する抗体由来であり得るこ
とが考えられる。しかし、IgGクラス由来の免疫グロブリン重鎖定常領域が好
ましい。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域は、IgG抗体サブクラス(当該
分野においてIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4と称される)のいず
れか由来であり得ると考えられる。
性を有する。例えば、IgGのCH2ドメインは、IgAおよびIgDのCH2
ドメインに相同であり、そしてIgMおよびIgEのCH3ドメインに相同であ
る。好ましい免疫グロブリン重鎖定常領域は、IgGのCH2領域およびCH3
領域に対応するタンパク質ドメイン、または、その機能部分もしくは誘導体を含
む。しかし、免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、少なくともCH1ド
メインを欠く。さらに、Fc−抗原またはFc−アジュバントの融合タンパク質
は、必要に応じて免疫グロブリン可変領域を欠く。より好ましい実施形態におい
て、免疫グロブリン重鎖定常領域は、N末端からC末端への方向において、免疫
グロブリンヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、これらの
全ては、IgG分子由来の配列に基づく。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の
選択は、米国特許第5,541,087号および同5,726,044号に詳細
に考察される。特定の結果に到達するための特定の免疫グロブリンクラスおよび
サブクラス由来の特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレ
ベル内であると見なされる。
(例えば、補体定着または抗体依存的細胞媒介細胞傷害性(ADCC)の刺激)
が減少または排除されるような変異、欠失または遺伝子操作もしくは他の手法に
よって媒介される他の変化によって、改変することが有用であり得る。しかし、
免疫グロブリン重鎖定常領域のFcレセプターに結合する能力を維持することが
必要であると見なされる。
質の免疫グロブリン重鎖定常領域成分は、好ましくは、意図されるレシピエント
において非免疫原性であるか、または弱い免疫原性である。免疫グロブリン重鎖
定常領域が免疫グロブリン重鎖定常領域に対して検出可能な抗体応答を生成しな
い場合、Fc領域は、非免疫原性であるか、または、弱い免疫原性である。従っ
て、免疫グロブリン重鎖定常領域は、存在する免疫グロブリン由来であるべきか
、または融合タンパク質の意図されるレシピエントと同じ種に存在する免疫グロ
ブリンに対応するアミノ酸配列に基づくべきである。換言すると、ヒト免疫グロ
ブリン定常重鎖領域配列は、Fc融合構築物(Fc−抗原および/またはFc−
アジュバントの融合タンパク質)がヒトに投与されるべき場合に使用されるべき
である。ヒトFc IgGのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、
Ellisonら(1982)NUCLEIC ACIDS RES.10:4
071−4079に記載される。同様に、マウスFc配列は、Fc融合物がマウ
スに投与される場合に使用されるべきである。マウスFc IgG2aのヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、Bourgoisら(1974)E
UR.J.BIOCHEM.43:423−435に開示される。Fc融合タン
パク質が愛玩動物(例えば、ネコおよびイヌ)ならびに家畜(例えば、ウシおよ
びウマ)を含むほかの動物に投与されるべき場合、同一の論理が適用される。
ク質またはそのフラグメント、あるいは単独でかまたは他の薬剤と組み合わせて
のいずれかで動物における免疫応答を誘導し得るポリペプチドを意味することが
理解される。目的の予め選択された抗原のいずれかが本発明のFc−抗原融合タ
ンパク質に含まれ得ることが意図される。好ましい実施形態において、予め選択
された抗原は、以下からなる群より選択される:前立腺特異的膜抗原(PSMA
);サイトカインレセプターのエクトドメイン(例えば、ヒトIL−4レセプタ
ーのエクトドメイン);腫瘍特異的抗原(例えば、正常細胞と比較して腫瘍細胞
においてアップレギュレートされたか、あるいは増加したレベルで存在する抗原
);およびウイルスタンパク質(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のゲ
ノムによってコードされるタンパク質)。
れた抗原に対する免疫応答(体液性かまたは細胞性のいずれか)を増強すること
によって、免疫調節因子として作用し得る任意の物質を意味することが理解され
る。本明細書中で使用される場合、用語「体液性」免疫は、体液(例えば、血漿
またはリンパ液)に生じた抗体によって媒介される免疫を意味することが理解さ
れる。ここで、当該分野において「細胞媒介性免疫」としてもまた称される用語
「細胞性」免疫は、Tリンパ球によって開始し、そしてエフェクターTリンパ球
および/またはマクロファージによって媒介される免疫学的反応を意味すること
が理解される。
アジュバント)は、非ヒト動物を免疫するに有用であり得る。高力価の抗体また
は顕著な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を生成するために、動物で広範に
使用されるにもかかわらず、このようなアジュバントの副作用(例えば、組織傷
害)のために、ヒトへの使用は受容不可能である。従って、注射部位での炎症を
伴わない強力な免疫応答を誘導する必要がある。本発明のFc−アジュバント融
合タンパク質を使用する明確な利点の1つは、化学アジュバント(例えば、フロ
イントアジュバント)の必要性なしに、強力な免疫応答を誘発する能力である。
パク質またはFc−アジュバント融合タンパク質をコードする核酸を含む。Fc
融合タンパク質に包含される好ましいアジュバントタンパク質は、サイトカイン
を含む。本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、任意のタンパ
ク質またはそのペプチドアナログもしくは機能的フラグメント(これらは、動物
における免疫細胞(例えば:T細胞;B細胞;マクロファージ;好中球;好酸球
;好塩基球;樹状細胞;およびこれらの前駆細胞)の活性を調節し得る)を意味
することが理解される。好ましいサイトカインは、例えば、IFN−γ、IL−
2、IL−4、IL−12、IL−18、TNFおよびGMCSFを含む。CD
40リガンドの細胞外ドメインはまた、Fcに融合しFc−アジュバントを形成
するために好ましいタンパク質である。Fc−アジュバントを投与する場合、F
c−抗原融合タンパク質中の抗原は、Fc−抗原融合タンパク質をFc−アジュ
バント融合タンパク質なしに投与する場合よりも強力な免疫応答を誘発し得る。
いくつかの場合において、Fc−アジュバントを伴うFc−抗原の免疫を2回だ
け行った後に達成される抗体のレベルは、フロイントアジュバントで達成した抗
体のレベルに比べて同程度であるかまたはより高く、そして皮膚の反応は検出さ
れない。
常領域を用いる場合、アジュバントタンパク質は、好ましくは、意図されるレシ
ピエントにおいて、免疫原性ではないか、または弱い免疫原性に過ぎない。この
ことは、意図されるレシピエントと同一の種から単離可能なサイトカインに対応
するアミノ酸配列によって規定されるサイトカインがFc−アジュバント融合タ
ンパク質に組み込まれることによって達成され得る。例えば、Fc−アジュバン
ト融合タンパク質がヒトに投与されるべき場合、アジュバントタンパク質(例え
ば、サイトカイン)は、好ましくはヒト起源である。
または一方を他方の後にかのいずれか)を使用して、予め選択された抗原に対し
て刺激される免疫応答の型を調節し得る。2つのクラスの免疫応答(Th1およ
びTh2と呼ぶ)は、異なる型の感染に応じて刺激され、かつ異なるサイトカイ
ンを含む。代表的には免疫応答に媒介されるTh1は、天然には細胞性であり、
代表的には免疫応答に媒介されるTh2は、天然には体液性である。従って、T
h1応答は、改変された細胞(例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞)を攻
撃するに有用であり得、一方、Th2応答は、規制動物のような細胞外因子を攻
撃するに有用であり得る。場合によって、免疫グロブリン重鎖定常領域に融合さ
れたサイトカインを投与して一般的な免疫応答を刺激するか、あるいは特異的T
h1応答または特異的Th2応答を開始または調節するかのいずれかをすること
は有用である。
選択は、Fc−抗原融合タンパク質の予め選択された抗原に対して作製された抗
体のクラスを影響し得る。例えば、Fc−IL12は、Th1サイトカイン(例
えば、IFN−γ、IL−2およびTNF)として公知のものの産生を刺激する
ことによってヘルパーT細胞応答を刺激する。これは、強力な細胞性免疫および
抗体のIgG2aクラスの産生を促進する。逆に、Fc−IL−4は、Th2サ
イトカイン(例えば、体液性免疫を促進するIL−5、IL−6、IL−10お
よびIL−4)の産生を刺激する。
合タンパク質またはFc−抗原融合タンパク質をコードする核酸を、Fc−アジ
ュバント融合タンパク質と組み合わせて投与する工程を包含する。2つの融合タ
ンパク質(各々が免疫グロブリン重鎖定常領域を含有する)を使用することによ
って、哺乳動物における同一または類似の細胞型で、予め選択された抗原および
アジュバントタンパク質(例えば、サイトカイン)の両方が同時局在することが
可能である。例えば、マクロファージ、B細胞、顆粒球および樹状細胞は、これ
らの細胞表面上にFcレセプターを発現する。従って、Fcレセプターに結合し
得るFc−抗原およびFc−アジュバント融合タンパク質を同時投与することに
よって、抗原融合タンパク質の抗原およびアジュバント融合タンパク質のアジュ
バントが、APCの同じ細胞性成分に同時に局在し得る。次いで、アジュバント
は、予め選択された抗原の近傍における免疫応答を増強し得るか、あるいは、調
節し得る。
激し得、次いで、細胞性応答(Th1)または体液性応答(Th2)のいずれが
生じるかを左右し得る。例えば、Fc−GMCSFは、免疫応答の強力な一般的
刺激因子である。しかし、細胞性免疫またはTh1媒介性免疫に関する応答をさ
らに調節するために、例えば、Fc−IL12またはFc−IFNγのアジュバ
ントタンパク質を、Fc−GMCSFと同時投与し得る。より体液性な応答また
はTh2媒介性応答を促進するために、例えば、Fc−IL4アジュバントタン
パク質を、Fc−GMCSFと同時投与して、Th2細胞の生成に関する応答を
調節し得る。Fcとの融合物として使用した他のTh1促進サイトカインまたは
Th2促進サイトカインをまた、所望の生理学的応答の正確な性質に依存して使
用し得る。この一般的なアプローチをまた使用して、応答を特定の抗原に近づけ
、かつ逆のTh型の新たな応答について免疫することにより有害なものから遠ざ
けることによって、存在する病原性応答(例えば、自己免疫(Th1媒介性疾患
)およびアレルギー(Th2媒介性疾患))を調節し得ることが意図される。
アジュバントとして核酸を使用することが有用である。核酸(例えば、シトシン
ホスホジエステラーゼ連結グアノシン(CpG)に富んだ配列を含むオリゴヌク
レオチド)は、免疫応答をTh1応答に偏らせ得、そして必要に応じて、サイト
カインのような他のアジュバントと組み合わせて利用され得る(例えば、Bra
zoletら(1998)PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A
.95:15553−8;Liuら(1998)BLOOD 92:3730−
6;およびKlinmanら(1997)IMMUNOL.158:3635−
3639を参照のこと)。従って、CpGを含むオリゴヌクレオチドをFc−抗
原融合物と同時投与し、増強されかつ適切に調節された免疫応答を達成し得るこ
とが意図される。このような核酸分子は任意の長さの核酸分子であり得るが、8
ヌクレオチド長より長いヌクレオチドが好ましい。核酸配列は、好ましくは、配
列CpGを含み、そしてより好ましくは、配列プリン−プリン−C−G−ピリミ
ジン−ピリミジンであり、ここで、中央のCpGのシトシンは、メチル化されて
いない。アジュバントDNA中のCpGジヌクレオチドの頻度は、好ましくは、
少なくとも約5%であり、そしてより好ましくは、約10%である。例えば、二
本鎖形態のオリゴヌクレオチドTCCATGACGTTCCTGACGTT(配
列番号22)を、アジュバントとして使用し得る。求められる免疫応答の型に依
存して、核酸をミョウバンに連結することが有用であり得る。
組換えDNA法を利用する。Fc融合構築物を、好ましくは、DNAレベルで作
製し、そして得られたDNAを発現ベクターに組み込み、そして発現して、本発
明のFc−抗原またはFc−アジュバントの融合タンパク質を産生する。本明細
書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞ゲノムと読み換えられ、
そして宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームとして自発的に複
製するにコンピテントなヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味することが理
解される。このようなベクターとしては、核酸ベクター、プラスミドベクター、
ファージミドベクター、コスミドベクター、RNAベクター、ウイルスベクター
などが挙げられる。ウイルスベクターの限定されない例としては、レトロウイル
ス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。本明細書中で使用
される場合、用語Fc融合タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、DN
A配列の転写、mRNA転写物の翻訳、およびFc融合タンパク質産物の分泌を
意味することが理解される。Fc融合タンパク質は、いずれもIL2、CD26
、Tat、Rev、OSF−2、bIG−H3、IgEレセプター、PSMAま
たはgp120を含み、本明細書中で議論される型の発現系を使用して発現され
た。同一または類似の発現構築物は、米国特許第5,541,087号および同
5,726,044号に開示される。
カーを用いる化学的接合を使用して、タンパク質部分を融合し得る。
転写調節配列およびE.coliでのプラスミドの選択および維持のための細菌
性プラスミド配列によって駆動される選択マーカー(例えば、ジヒドロ葉酸還元
酵素(DHFR))が挙げられる。Fc融合タンパク質配列の発現を、プロモー
ター配列そして必要に応じて、エンハンサー配列(例えば、サイトメガロウイル
ス(CMV)のプロモーター配列およびエンハンサー配列)によって駆動する。
に投与されるべき場合、Fc融合タンパク質をコードする配列は、好ましくは、
5’から3’の方向に開始して、例えば、抗体軽(L)鎖由来で、免疫グロブリ
ン重鎖またはその変異体形態の少なくとも一部(好ましくは、ヒト免疫グロブリ
ン重鎖g1遺伝子のFcγ1領域由来)とインフレームで融合した「リーダー配
列」を有する。免疫グロブリンFcγ1遺伝子のFcγ1領域は、好ましくは、
少なくともヒンジドメインの一部およびCH3ドメインを含み、そしてより好ま
しくは、少なくともヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含
む。Fc融合タンパク質がマウスに投与されるべき場合、免疫グロブリン重鎖定
常領域をコードする好ましい核酸配列は、マウスIgG2a抗体由来のヒンジ領
域、CH2ドメインおよびCH3ドメインをコードする核酸配列を5’から3’
の方向に含む。必要ならば、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシ末端を、
予め選択された抗原(Fc−抗原の場合)または免疫刺激サイトカイン(Fc−
アジュバントサイトカインの場合)のいずれかをコードする配列とインフレーム
での連結のために核酸レベルで改変する。選択カセットをコードするDNAは、
そのゲノムの立体構造中またはcDNAの立体構造中であり得る。
の分泌を指向し、その後Fc融合タンパク質の残余から切断されるペプチドセグ
メントをコードする。本発明のシグナル配列は、小胞体の膜を横切るタンパク質
の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明に
おいて有用なシグナル配列として、抗体軽鎖シグナル配列(例えば、抗体14.
18(Gilliesら(1989)J.OF IMMUNOL.METH.1
25:191))、抗体重鎖シグナル配列(例えば、MOPC141抗体重鎖シ
グナル配列(Sakanoら(1980)NATURE 286:5774))
、および当該分野において公知の任意のほかのシグナル配列(例えば、Wats
on(1984)NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:51
45を参照のこと)が挙げられる。
0アミノ酸残基を含むことが代表的に公知であり、より多いかまたはより少ない
アミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、以下の3つの領域から
なる:塩基性N末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性のC末端領域。中
央の疎水性領域は、4〜12の疎水性残基を含み、これらの残基は、初期のポリ
ペプチドの輸送の間、膜脂質二重層を横切るシグナルペプチドをアンカーする。
開始に引き続き、シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼとして公知の
細胞性酵素によって小胞体の内腔内で切断される。シグナルペプチドの潜在的な
切断部位は、一般的に「(−3,−1)規則」に従う。従って、代表的なシグナ
ルペプチドは、−1位および−3位で小さな中性のアミノ酸残基を有し、かつこ
の領域においてプロリン残基を欠く。シグナルペプチダーゼは、−1のアミノ酸
と+1のアミノ酸との間でこのようなシグナルペプチドを切断する。従って、シ
グナル配列を、分泌の間に、融合タンパク質のアミノ末端から切断し得る。これ
によって、Fc融合タンパク質の分解が生じる。本発明の実施に有用なシグナル
ペプチド配列は、当該分野において周知である。例えば、von Heijne
(1986)NUCLEIC ACIDS RES.14:4683を参照のこ
と。
ル配列の適合は、いくつかの慣用的実験を要求し得る。このような実験は、Fc
融合タンパク質の分泌を指向するシグナル配列の能力の決定、および/またはF
c融合タンパク質の十分な分泌に達するために使用される配列の最適な立体構造
(ゲノムまたはcDNA)を決定する工程を含む。さらに、当業者は、上記で参
照したvon Heijneによって提示される規則に従う合成シグナルペプチ
ドを作成し得、そして慣用的実験によってこのような合成シグナル配列の効力を
試験し得る。用語「シグナル配列」「シグナルペプチド」「リーダー配列」また
は「リーダーペプチド」を、本明細書中で相互変換可能に使用する。
異なる投与形態を使用して、予め選択された抗原に対してレシピエントを免疫し
得ることが意図される。本発明の異なる2つの適用を使用して、CTL応答を産
生し得る。一つは、Fc−抗原融合タンパク質をコードするDNAの注射に基づ
き、そして2番目は、タンパク質をMHCクラスIの経路に送達し得るFc−抗
原融合タンパク質の投与に基づく。
発する。しかし、本発明はまた、DNA注射によって抗原をAPCへ送達する方
法を提供する。一般に使用される技術は、抗原性タンパク質をコードするDNA
発現ベクターを筋肉中に注射することである。報告は、タンパク質抗原が筋肉細
胞によって発現されるが、この抗原はこれらの細胞によって免疫系に提示されな
いということを示唆する。代替には、特定化されたAPC(例えば、マクロファ
ージおよび樹状細胞)が注射部位に移動し、未だ詳述されていないプロセスを介
して抗原を拾い上げかつ提示するということが考えられている。Fc−抗原融合
タンパク質発現ベクターの使用は、このプロセスをより効率よくする。なぜなら
、選択された融合タンパク質は、APCにネイティブな抗原タンパク質よりも効
果的に結合するためである。
答の両方の生成を生じ得ることである。代表的には、外因性に投与されるタンパ
ク質は、MHCクラスI分子の提示に関する経路に入るのに困難な時間を有する
。にもかかわらず、本発明のFc融合タンパク質の投与は、おそらく、予め選択
された外因性抗原のMHCクラスI提示を介して、細胞障害性の細胞の生成を増
加する。DNA免疫およびタンパク質免疫の組合せはまた相乗的に働き、まず免
疫系をプライムし、次いで抗体産生および細胞傷害性の細胞性応答の両方の形態
での応答のレベルをブーストする。Fc−アジュバント融合タンパク質(例えば
、Fc−IL−2、Fc−GMCSF、Fc−IL−12およびFc−Flt3
リガンド)をFc−抗原融合タンパク質とともに同時投与することによって、融
合タンパク質をAPCの同一の細胞区画へ同時に局在させることを確保し、それ
によって、予め選択された抗原に対するより強力な免疫応答を刺激する。
融合タンパク質、またはこのような融合タンパク質をコードする核酸配列)を、
任意の適切な手段で直接(例えば、局所的に(組織の位置への注射、移植または
局所投与によって))にかまたは全身的(例えば、非経口でかまたは経口で)に
動物へ提供し得る。組成物が非経口で提供される場合(例えば、静脈内、皮下、
眼、腹腔内、筋肉内、頬、直腸、膣、眼窩内、経皮、大脳内、頭蓋内、脊椎内、
脳室内、髄腔内、槽内、包内、鼻腔内によってかまたはエアロゾル投与によって
)、この組成物は、好ましくは、水性または生理学的に適合性のある液体の懸濁
物または溶液の一部を含む。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受
容可能であり、その結果、所望の組成物の患者への送達に加えて、その他の点で
患者の電解質および/または容積バランスに悪影響を及ぼさない。従って、薬剤
のための液体培地は、正常の生理学的な生理食塩水(例えば、9.85%の水溶
性NaCl、0.15M、pH7〜7.4)を含み得る Fc−抗原融合タンパク質の一投与当たりの好ましい投薬量は、50ng/m 2 〜1g/m2、より好ましくは5μg/m2〜200mg/m2、そして最も好ま
しくは0.1mg/m2〜50mg/m2の範囲内である。Fc−アジュバント融
合タンパク質の一投与当たりの好ましい投薬量は、1ng/m2〜0.1g/m2 、より好ましくは0.5μg/m2〜20mg/m2、そして最も好ましくは10
μg/m2〜5mg/m2の範囲内である。Fc−抗原またはFc−アジュバント
の融合タンパク質をコードする核酸の一投与当たりの好ましい投薬量は、1μg
/m2〜100mg/m2、より好ましくは20μg/m2〜10mg/m2、そし
て最も好ましくは400μg/m2〜4mg/m2の範囲内である。
接種)を実施することによって達成され得ることが意図される。さらに、上記で
議論したように、最大免疫応答を、Fc融合タンパク質とこのようなFc融合タ
ンパク質をコードする核酸の投与との間で相互に行うことによって特定の環境下
で達成し得る。Fc−抗原融合タンパク質またはこの融合タンパク質をコードす
る核酸は、Fc−アジュバント融合タンパク質またはFc−アジュバント融合タ
ンパク質をコードする核酸を動物に投与する前か同時にかまたは後に、投与され
得ることが意図される。しかし、投与、投薬量およびブーストのレジメンの最適
形態は、十分当業者のレベル内である慣用的な実験によって決定され得ることが
意図される。
、発現ベクターを、マウスIgG2a Fc領域をコードする核酸配列を使用し
て構築した。このベクターは、それぞれの融合タンパク質のFc領域が動物にお
いて誘導する免疫応答の危険性を減少する。さらに、マウスサイトカインを、F
c−アジュバント融合構築物における融合パートナーとして使用した。なぜなら
、これらの生物学的活性は、高度に種特異的であり得るからである。従って、以
前に報告されたベクター(Loら(1998)PROTEIN ENGINEE
RING 11:495−500)を、マウスIgG2a Fcをコードするc
DNA(米国特許第5,726,044号)由来の配列でヒトIgG1 Fc配
列を置換することによって改変した(図2を参照のこと)。
て、マウス脾細胞ライブラリーからクローニングした。PCRプライマーは、リ
ーダー配列を連結するためのアダプター配列を5’末端に、そして抗原またはア
ジュバントサイトカインのいずれかをコードする配列との連結のために独特なS
maI/XmaI制限部位を3’末端に含んだ。抗原配列およびアジュバント(
サイトカイン)配列を、5’SmaI部位で調製し、Fcと抗原またはアジュバ
ントタンパク質との間のリーディングフレーム、そして翻訳終止シグナルの直後
に位置される独特なXhoI部位を維持した。
た軽鎖リーダー配列をコードし、そしてマウスIgG2a CH2エキソンおよ
びCH3エキソンならびに融合パートナー(抗原またはアジュバントサイトカイ
ンのいずれか)を通って続く。転写を、培養におけるほとんどの細胞型での発現
に、ならびにインビボでのDNA注射に引き続く筋肉および他の細胞型における
発現に有用であることが見出されているCMVプロモーター/エンハンサーによ
って駆動した。E.coliにおいてプラスミドDNAの維持に必要な配列と同
様に、選択可能なジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)マーカー遺伝子を、安
定にトランスフェクトされたクローンの選択を容易にするために各々のベクター
に含んだ。
)中の独特なSmaI部位からXhoI部位の間に、適切に適合した配列を挿入
することによって作製した。ここで、「mu」はFcがマウス起源であることを
示す: ヒトIL4レセプター(IL−4R)のエクトドメイン(細胞外部分)を、P
CR増幅を介してヒト末梢血単核(PBMC)からクローニングした。以下のプ
ライマーを使用した:
SmaI部位およびXhoI部位を含む。このクローニングおよび以下のクロー
ニングのために使用されたPCR反応条件は以下の通りであった。Advant
age KlenTaqおよびPolymerase Mix(Clontec
h,Palo Alto,CA)ならびに特異的プライマーを使用して、目的の
遺伝子を増幅した。反応混合物は、10mM Tris−HCl(pH8.3)
、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01% ゼラチン(w/v
)、各々0.2mMのdNTPおよび1.25ユニットのKlenTaqを総量
100mlに含んだ。30回のPCRサイクルを実施し、各サイクルは、94℃
で1分間の熱変性、42℃で45秒間のアニーリング、および72℃で1分間の
プライマー伸長からなる。次いで、増幅された産物を、SKベクター(Stra
tagene,San Diego,CA)にサブクローニングし、そしてその
DNA配列は、標準的配列決定方法論によって確認した。
を使用するPCRを介して、LnCAP前立腺癌細胞株(ATCC CRL17
40)からクローニングした:
である。DNA配列を確認し、そしてPCRフラグメントをpdCs−muFc
ベクターに挿入して、pdCs−muFc−PSMA融合構築物を作製した。
であるヒトEpCAM(KS抗原としても公知)のエクトドメインを、以下のプ
ライマーを使用するPCRを介して、LnCAP細胞からクローニングした:
である。DNA配列を、標準的配列決定方法論によって確認し、そしてPCRフ
ラグメントをpdCs−muFcベクターに挿入して、pdCs−muFc−E
pCAM融合構築物を作製した。N末端融合パートナーとしてEpCAMエクト
ドメインを使用して別のベクターを構築した。この場合において、PCR産物は
、膜貫通(spanning)ドメインの境界にEpCAM cDNAの天然の
リーダー配列および成熟エクトドメイン配列を含んだ。このPCR産物の3’末
端に、マウスFcフラグメントの5’Afl II部位との接合のための操作し
たAflII部位を含んだ。使用したPCRプライマーは、以下を含んだ:
を欠くが、Fcコード配列の最後に翻訳終止シグナルを含んだ。
位から膜貫通領域に隣接するリジン残基に伸びている)を、短いペプチド抗原配
列の例としてのFc融合タンパク質として発現した。HIV IIIB株由来の
タンパク質配列を使用したが、コード配列を、GC含量の高いコドンバイアスを
使用することによって最適な真核生物細胞発現のために最適化した。以下の配列
:
し、そしてpdCs−muFcベクターに連結した。融合ポリペプチドのアミノ
酸配列は、以下であった:
(米国特許第5,541,087号および同第5,726,044号)、原文の
ヒトIgG1 Fc以外のマウスIgG2a Fcを用いてFc−抗原融合タン
パク質を構築した。これらの構築物は、さらに本発明の実施形態に示される。
c−アジュバント(サイトカイン)を、Fc−抗原融合タンパク質として同様の
様式で構築した。特定のサイトカインおよびクローニングプライマーは、以下に
議論される。
末梢血単核細胞(PBMC)からクローニングした:
スPBMCからクローニングした:
てマウス胸腺からクローニングした:
てマウスPBMCからクローニングした:
てマウスPBMCからクローニングした:
Iのフラグメントとしてクローニングし、標準的DNA配列方法論によって分析
し、そしてそのFc領域としてマウスIgG2aのFcを含有するpdCs−m
uFcベクターに連結した。マウスIL−12p40のPCR産物を、同一のC
MVプロモーター/エンハンサー、成熟マウスIL−12のp40サブユニット
直接融合した軽鎖にリーダー配列、およびpdCs−muFcベクター中のDH
FR選択マーカー遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクター
において(Fc融合タンパク質としてではなく)別々に発現した。生じたベクタ
ーを、pNC−mp40と称し、ここで、「N」はネオマイシン選択遺伝子を示
す。
異的融合タンパク質の合成および分泌を誘導した。簡単には、プラスミドを、リ
ン酸カルシウムとの同時沈殿によってヒト腎臓単層細胞293に導入した(Sa
mbroolら(1989)MOLECULAR CLONING−A LAB
ORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor,N.
Y.)。この細胞を一晩(16時間)放置し、PBSでリンスし、そして新鮮な
細胞培養培地(10%胎仔ウシ血清(FBS)を含有するDMEM)で給餌した
。さらなる2〜3日の後に、培養培地を、マウスIgG−Fcタンパク質に対し
て特異的な抗体を使用するFc特異的ELISA(Gilliesら(1989
)J.IMMUNOL.METHODS 125:191)によって、分泌され
た融合タンパク質について試験した。マウスFc−IL12の場合において、F
c−p35発現プラスミドDNAおよびFc−p40発現プラスミドDNAの両
方を、同一の細胞培養物に一過性に発現した。その結果、ヘテロ二量体のサイト
カイン融合タンパク質がアセンブリされ、その後細胞外に分泌した(Gilli
esら(1998)J.IMMUNOL.160:6195)。
た細胞を、標準的なエレクトロポレーション技術によって、直線化したDNAを
マウスNS/0ミエローマ細胞に導入することによって作製した。簡単には、細
胞を、Gene Pulser Cuvette(BioRad)に107細胞
/mlで懸濁し、0.5mlの懸濁液を、10μgのDNAと混合し、そしてこ
の混合液を、氷上で10分間冷却した。Gene Pulser(BioRad
)を0.25Vおよび500μFに設定して使用して、エレクトロポレーション
を、実施した。細胞を、10分間氷上で回復させた後、増殖培地中に再懸濁し、
そして96ウェルプレートに移した。この細胞を、0.1μM メトトレキサー
トを含有する選択培地で2〜3日ごとに給餌した(エレクトロポレーションの2
日後に開始した)。96ウェルプレート中で増殖する薬物耐性コロニーを、Fc
ELISAプロトコルによって発現について試験した。
40サブユニットをすでに発現しているNS/0のトランスフェクトした細胞株
を、マウスFc−p35サブユニット発現ベクターで上記のようにトランスフェ
クトした。上記のpNC−mp40ベクターを用いたNS/0細胞のエレクトロ
ポレーションおよびネオマイシンアナログであるG418(Life Scie
nces Technologies)を含有する培地中での選択によって、p
40発現株を得た。2度目のトランスフェクションの後、生存する細胞クローン
を、Fc ELISAおよびマウスIL−12 ELISA(Genzyme,
Cambridge,MA)によってスクリーニングした。
気泳動(SDS−PAGE)によって試験した。最初に、融合タンパク質を、少
容量(培地1ml当たり10〜20μl)のプロテインA Sepharose
(Repligen,Needham,MA)に結合した。結合物質を、Twe
en−20(0.01%)を含有するPBSで洗浄し、次いで、SDS含有緩衝
液中に溶出させ、次いで、5%の2−メルカプトエタノールの存在下で2分間煮
沸した。次いで、還元したタンパク質を、pre−cast SDS−PAGE
ゲルで電気泳動し、そしてクーマシーブルーで染色した。安定な細胞クローンか
らの大容量精製を、プロテインA Sepharoseカラム(Replige
n,Needham,MA)を使用して、製造業者の説明書に従って実施した。
またはFc−サイトカインアジュバントの効果) 実施例1で調製したマウスFc−huIL−4Rαサブユニット構築物を抗原
として使用して、動物モデルにおいてこれらのタンパク質の潜在的APC標的化
効果を試験した。IL−4Rαサブユニットのエクトドメインは、ヒトとマウス
との間で50%より大きな配列同一性を有する種間で完全に保存された分子を示
す。
PBSでかまたはフロイント完全アジュバント(CFA)に乳化してかのいずれ
かで皮下注射した。いくつかの群はまた、5μg用量(Fc−IL−4Rと混合
した)のFc−IL2またはFc−GMCSFのいずれかのFc−アジュバント
タンパク質を受けた。2週間後、このマウスに、同一の混合物を注射したが、腹
腔に投与した。CFA処方物は、徐放性抗原の元を形成するように働き、免疫系
の連続刺激を可能にするミセルを作成する。CFA中のミコバクテリウムタンパ
ク質はまた、サイトカイン刺激を通じて強力な炎症応答を誘導し、これによって
、免疫応答をさらに増強する。しかし、CFAは、ヒトでは利用不可能にする皮
膚損傷を含む重篤な副作用を生じる。しかし、PBS中でのFc−アジュバント
融合タンパク質との混合物は、任意の動物における毒性の任意の可視的皮膚反応
または任意の他の明白な徴候を誘発しないようである。
し、そして遠心管内で全血を塊らせることによって血清を調製し、細胞を遠心分
離によって除き、そして物質を5分間の高速(12000RPM)で凝塊し、そ
して上清を回収した。生じた血清をアッセイ緩衝液(0.01% Tween−
20を含有するPBS)で希釈し、そしてヒトIL−4Rに反応する抗体につい
て試験した。抗原特異的ELISAを、ヒトFc−huIL−4Rでコートした
96ウェルプレート(PBS中5μg/mlを各ウェルに100μl添加し、そ
して4℃で(一晩)インキュベートした)を使用して実施した。次いで、抗原で
コートしたプレートを洗浄し、そしてブロッキング緩衝液(PBS中に1% B
SA、0.01% Tween−20)でブロックした後に使用した。試験血清
の希釈液を、ウェル内で室温にて2時間インキュベートし、次いで、ウェルをア
ッセイ緩衝液で8回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスFc特
異的二次抗体(1:2000希釈、Jackson ImmunoResear
ch)を添加し、そしてプレートをさらに1時間インキュベートした。アッセイ
緩衝液での8回のさらなる洗浄の後、25mMクエン酸、50mM Na2HP
O4(pH5)および0.03%の直前に添加したH2O2を含むo−フェニレン
ジアミンジヒドロクロリド(OPD)溶液を添加した。約30分後に100μL
の4N H2SO4を添加することによって反応を停止した。生じたプレートを、
650nmで読み取られるバックグラウンドを自動的に差し引くプレートリーダ
ーにおいて490nmで読み取った。結果を、光学密度対抗血清の希釈としてプ
ロットした。抗体の相対的力価を、光学密度が任意の値(例えば1O.D.単位
)に低下するまで希釈されるべき血清の量によって決定した。
スFc−IL−4R融合タンパク質単独の注射によって、1匹のマウスのみが抗
体応答を誘導した(図3B)。しかし、CFAの添加は、反応するより多くのマ
ウスを生じたが、これらの力価は、PBS中のFc−IL−4R融合タンパク質
単独での注射に反応するマウスに大まかには同一であった(図3C)。マウスF
c−IL2アジュバントをPBS中のFc−IL4Rとの同時投与によって、全
ての動物において反応を誘導したが、しかし、各々の場合において産生される抗
体の量は変動した(図3D)。CFAおよびマウスFc−IL2アジュバントと
の組合せ(図3A)は、いずれかの因子単独よりも高い抗体力価を生じた(図3
Cおよび3D)。PBS中のマウスFc−GMCSFアジュバントの同時投与は
、Fc−GMCSFアジュバントおよびCFAの両方の組合せで免疫された群を
含む(図3F)全ての群で最も強力な免疫応答を誘導した(図3E)。換言する
と、マウスFc−IL4R抗原と同時投与した場合、PBS中のマウスFc−G
MCSFアジュバントは、CFAの使用の必要性を除く。このような方法は、ヒ
トにおける使用のためにより適切であることが意図される。
て産生される抗体に対するFc−GMCSFアジュバント用量の効果) PSMAは、その制限された正常な組織分布のため、魅力的なヒト腫瘍関連標
的抗原を現在示す。PMSAを、目下、腫瘍ワクチン候補として臨床試験におい
て試験している。本実施例において、Fc−PMSA融合タンパク質におけるP
MSA抗原の免疫原性を評価した。
。マウスの群に、異なる濃度のFc−アジュバント融合タンパク質Fc−GMC
SFと共に、PBS中の50μgのマウスFc−PSMAを皮下注射し、次いで
、14日後に、腹腔内注射によりブーストした。抗体力価を、Fc−IL4R融
合タンパク質について実施例2に記載される通り、Fc−PSMA抗原捕捉EL
ISAを介して測定した。結果を、抗体力価(ODが1まで減少する希釈)対最
初の注射後の時間として、図4においてプロットした。
00までの範囲のPSMAに対する抗体力価を有した(図4A)。しかし、0.
05μgと同じくらい少ないFc−GMCSFのの同時投与は、30,000〜
140,000の範囲の力価を生じた(図4B)。Fc−GMCSFの10倍の
増加は、さらに、この癌抗原に対する抗体力価を刺激した(図4Cおよび4D)
。与えられた最も高い用量(1匹のマウスあたり5μgのFc−GMCSF融合
タンパク質)は、なお、1回の注射あたり約2μgのGMCSF(マウス皮膚ま
たは動物が免疫された任意の全身性の徴候に対して効果を有さない用量)だけ示
した(図4Dを参照のこと)。さらに、CFAと違って、脾臓に明らかな拡大は
存在しなかった。
) Fc−抗原およびFc−アジュバント融合タンパク質の、Fc成分の特異的な
効果を、融合タンパク質、非融合抗原またはアジュバントタンパク質、あるいは
前述の混合物を注射したマウスにおいて誘導された免疫応答を比較することによ
り試験した。ヒトPSMA系を、この目的のために使用した。
−PSMA融合タンパク質のタンパク分解消化により調製した(Loら、(19
98)PROTEIN ENGINEERING 11:495−500)。関
連Fcおよび未消化Fc−PSMAを、プロテインA Sepharose(R
epligen,Needham,MA)に対する吸着により除去した。
5A)あるいは0.2μgの遊離GMCSF(図5B)または0.5μgのFc
−GMCSF(図5C)(0.5μgのFc−GMCSFは、約0.2μgのG
MCSFを含む)と組み合わせて注射した。マウスの別のセットにおいて、各マ
ウスを、一回の皮下用量の50μgのマウスFc−PSMA融合タンパク質単独
(図5D)あるいは0.2μgの遊離GMCSF(図5E)または0.5μgの
Fc−GMCSF(図5F)と共に注射した。全ての注射処方物は、化学的アジ
ュバントを含まないPBS中にあった。マウスFc−PSMAと反応する抗体を
、免疫して14日後に測定した。
抗原融合タンパク質のFc成分の重要性は、動物に化学的アジュバントを含有し
ないPBS処方物を注射した場合に著しかった。PBS中で投与されたPSMA
に対する1次免疫応答は、本質的に存在しなかった(図5A)。免疫に対するG
MCSFまたはFc−GMCSFの添加は、ある動物における弱い応答(図5B
)を除いて、ほとんど効果を有さなかった(図5Bおよび5C)。対照的に、F
c−PSMA単独で注射された動物は、全ての場合において、強い1次免疫応答
を示した(図5D)。Fc−PMSAへの遊離GMCSFの添加は、わずかな効
果をブーストしたが(図5E)、Fc融合タンパク質としての抗原およびサイト
カイン両方の同時投与は、最も高いレベルの応答を与えた(図5F)。
応答を生成するのに特に有用であることを示し、そしておそらくAPCに対して
、インビボでの抗原および刺激サイトカインを同時に局在化する明らかな利益を
示す。
ュバント効果の比較) Flt3についてのリガンド(これは、当該分野でFlt3リガンド(Flt
3L)とも呼ばれる)は、樹状細胞の発生および成熟に重要な役割を果たすこと
が示されている(Soligoら(1998)BR.J.HAEMATOL.1
01:352〜63)。樹状細胞は、組織マクロファージ細胞とともに、最も重
要なAPCであると考えられる。マウスでの研究において、10日間の毎日の注
射が、リンパ組織および脾臓から回収可能な樹状細胞の数およびAPC活性を増
加すること、ならびにこれらの細胞がCD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方
に対する抗原提示において非常に強力であることが示された。皮膚のランゲルハ
ンス細胞は、局所のリンパ節への取り込みおよび移動の後、抗原を提示し得る樹
状細胞の1つの型を示すと考えられる。ほとんどの樹状細胞は、マクロファージ
で典型的に見出されるFcレセプター(例えば、FcγRI)のアレイを発現し
ないと考えられるので、Fc融合タンパク質の同時局在化効果がこの系統のAP
Cに関与するか否かは予測し得ない。
の群に、マウスFc−GMCSF融合タンパク質(マクロファージおよび顆粒球
の強力な刺激因子)を用いるのではなく、マウスFc−PSMAおよびマウスF
c−FLt3Lを注射した。この場合、なんらかのアジュバント効果が樹状細胞
による活性化および取り込みを介して媒介されることが予期された。これは、最
終的には、PMSAに対する抗体応答を生じる。この結果を図6にまとめる。
か、そうでなければより優れた、抗PSMA抗体を刺激する強力なアジュバント
であることを示す。この結果は、Fc−抗原とFc−アジュバントの組合せが、
免疫応答を誘導することにおいて特に強力であり得るという観察を支持する。こ
の結果はまた、樹状APCが、明かにFc−抗原およびFc−サイトカインなら
びにマクロファージAPCで標的され得ることを示し、このことは、Fcレセプ
ターの少なくとも1つの形態がこれらの細胞に存在することを示唆する。
る免疫応答) 別の非常に重要なヒト癌抗原であるEpCAM(KSA抗原および17−1A
抗原とも呼ばれる)は、実施例1に記載のプラスミドおよび方法を用いて、マウ
スIgG2a Fc領域との融合タンパク質として生成され、そして単独でか、
またはアジュバントとしてFc−GMCSFと組合せてのいずれかで投与された
。マウスに皮下注射し、そして10μgのFc−EpCAMおよび1μgのFc
−GMCSFを含有するPBSを用いて3週間後にブースト(追加免疫)した。
コントロールマウスにはFc−GMCSFを投与しなかった。EpCAMに対す
る抗体の力価を、ブースト後、7日(図7A)および14日(図7B)に測定し
た。この結果は、Fc−EpCAMが、単独で投与された場合、強力な免疫原で
あること(白の菱形)、およびFc−GMCSFが、この抗原に対する応答をさ
らにブーストし得ること(黒の三角)を示す。
に関して反対方向に発現された(実施例1、図1Bを参照のこと)。この分子を
用いて、皮下注射により、Balb/cマウスを免疫した。より高用量のEpC
AM−Fc融合タンパク質を用い(1用量あたり25μg)、そしてアジュバン
トの量(2.5μgFc−GMCSF)をまた増加させた。EpCAMに対する
抗体の力価を、免疫後、14日(図8A)および21日(図8B)に測定した。
EpCAM−Fc融合タンパク質単独は、Fc−GMCSFの非存在下で、完全
に免疫原性であった(図8Aおよび8B(白の菱形))。Fc−サイトカインの
添加は、約3倍まで抗体力価を改善した(図8Aおよび8B(黒い三角))。
防御し得るか否かを試験するため、免疫していないマウスまたはEpCAM−F
c融合タンパク質(そして、ある場合は、Fc−サイトカイン)で免疫したマウ
スに、ヒトEpCAMでトランスフェクトした、105のCT26マウス結腸癌
細胞を尾静脈注射した(Gilliesら(1998)J.IMMUNOL.1
60:6195)。21日後、この動物を屠殺し、そして肺転移の程度を、(1
)肺表面範囲の段階付け;および(2)肺を秤量し、そしてこれを正常な動物の
肺と比較して、腫瘍塊に起因する異なる重量増加を決定すること、によって評価
した。表1にまとめる結果は、免疫した全てのマウスが、コントロールマウス(
EpCAM−Fc融合タンパク質単独で免疫した動物を含む)に比べて、腫瘍転
移において、統計学的に有意な減少を示したことを示す。同様の結果が、抗原と
してFc−EpCAM融合タンパク質を用いて得られた。
25%の範囲;2=26〜50%の範囲;3=51〜75%の範囲;そして4=
76〜100%の範囲。
ジュバントの組合せ) 実施例6に記載のタンパク質であるEpCAM−Fcは、カルボキシルタンパ
ク質ドメインとして免疫グロブリンFc領域に連結された、N末端抗原を例示す
る。このタンパク質およびそのような他のタンパク質は、Fc−アジュバント融
合タンパク質(例えば、Fc−サイトカイン)と同時投与され、抗原に対する免
疫応答をブーストし得る。あるいは、抗原、免疫グロブリン重鎖定常領域および
アジュバントタンパク質(例えば、サイトカイン)は、単一の融合タンパク質と
して(例えば、EpCAM−Fc−GMCSF融合タンパク質)産生され得る。
GM−CSFの配列を用いて構築され、その結果この構築物はマウスモデルにお
いて評価され得る。リーダー−EpCAM−Fcコード配列を含有する短いXb
aI〜SmaIのフラグメントは、もとのEpCAM−Fc発現ベクターから得
られ(実施例1)、そしてFc−GMCSF発現ベクターの大きいSmaI〜X
baIフラグメントに連結される(図9)。
性発現のため、リン酸カルシウム沈殿法を用いて293細胞に、そして安定な発
現のためにエレクトロポレーションによりNS/0細胞に導入する。安定なトラ
ンスフェクト体を、メトトレキセート含有培地中で細胞を培養することにより選
択した(0.1μM)。発現クローンをFc ELISAにより同定し(実施例
1を参照のこと)、そして高レベルのプロデューサーを培養中で増殖させた。E
pCAM−Fc−GMCSFタンパク質を、プロテインA Sepharose
(Repligen,Needham,MA)への結合およびそれからの溶出に
よって馴化培地から精製し、そして構造的完全性を、2メルカプトエタノールで
還元後のSDS−PAGEによって分析した。この結果は、このタンパク質が、
EpCAM、FcおよびGMCSFの単鎖融合について予期されるように、約9
0kDの分子量を有したことを示した。
EpCAM−Fc−GMCSF、および以下:EpCAM−FcおよびFc−G
MCSFと組合せた個々の融合タンパク質を皮下注射する。同じ注射を14日後
に行い、そしてブースト7日後、ヒトEpCAM7に対する特異的抗体反応性に
ついて血清サンプルを試験した。同じアプローチを、他のタンパク質またはペプ
チド抗原について、ならびに他の刺激サイトカイン(例えば、IL−2、IL−
12およびFlt3L)について用い得る。
ンスフェクションおよび産生のために用いた同じ発現ベクター(実施例1を参照
のこと)を、「裸の(naked)」プラスミドDNAとして、BAlb/cマ
ウスの群の後肢筋肉に注射した。DNAを0.5mg/mlの濃度で注射し、そ
して総量100μgをPBSまたは25%(w/v)のスクロース溶液のいずれ
かにおいて投与した。注射を3週間ごと、全部で3回の注射を繰り返した。抗体
応答を、異なる時点で測定し、そして捕捉のためにヒトFc−EpCAMでコー
トした96ウェルプレートを用いて、そして検出のためにHRP−結合体化抗マ
ウスFc特異的ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResea
rch)を用いて、ELISAにより定量した。図10に示されるデータは、注
射後14日(図10A)、27日(図10B)、55日(図10C)、および6
9日(図10D)で記録した抗体力価を示す。
の抗Ep−CAM抗体しか誘導されないことを示す(図10Aおよび10B)。
かなり高用量を、55日(図10C)で観察し、そして69日(図10D)でさ
らにより高いレベルを得た。同様の結果を、EpCAM−Fcを発現するベクタ
ーのDNA注射を用いて得たが、この力価はより低かった。これらのデータは、
タンパク質抗原および免疫グロブリンFc領域を含む融合分子として発現された
抗原が、裸のDNAの注射により導入される場合、免疫応答を誘導し得ること、
および永続的な抗原曝露がほとんどの動物において遅延型の応答を導くことを示
す。
クチン接種したマウスまたはタンパク質免疫したマウス(注射後70日)由来の
脾細胞を培養することにより細胞性免疫応答を試験した。図11に示されるデー
タ(上部パネル)は、Fc−EpCAMタンパク質(十字)またはCMVプロモ
ーター−EpCAM−Fc(白丸)を発現するベクターもしくはCMVプロモー
ター−Fc−EpCAM(黒の菱形)を発現するベクターでのDNAワクチン接
種のいずれかで免疫した動物における抗原に対する増殖性反応(3Hチミジン取
り込みにより測定される場合)を示す。タンパク質免疫した動物は、非常に低い
用量でも、抗原に対するより大きい応答を示した。DNAワクチン接種した動物
からの応答(図11の下部分パネルに異なるスケールで示される)は、用量依存
性であるが、タンパク質注射されたマウスよりも程度が低かった。これらの応答
は、MHCクラスII拘束CD4+T細胞応答の特徴であった。
するため、DNAまたはタンパク質で免疫したマウスからの脾細胞培養を、約1
0U/mlのIL−2の存在下で、5日間培養した。エフェクター細胞は、培養
した脾細胞であり、そして標的細胞は、標識したヒトEpCAM−発現CT26
結腸癌細胞(Balb/cマウスと同系)、または標識した親(トランスフェク
トしてないCT26細胞)のいずれかであった。エフェクター細胞および標的細
胞を異なる比で混合し、そして溶解の程度を決定した。界面活性剤の存在下で標
識した標的細胞をインキュベートすることにより、100%の溶解の値を達成し
、そして遊離した標識の量を測定した。
CT26細胞に対する脾細胞の活性を示すが、図12Bは、親のCT26細胞に
対する脾細胞の活性を示す。両方の図について、白い菱形は、EpCAM構築物
を運搬するDNAで免疫されたマウスから単離された脾細胞を示し、白の四角は
、Fc−EpCAM融合構築物を運搬するDNAで免疫したマウスから単離され
た脾細胞を示し、白い三角は、Ep−CAM−Fc融合構築物を運搬するDNA
で免疫したマウスから単離した脾細胞を示し、そして十字は、Fc−EpCAM
融合タンパク質で免疫したマウスから単離した脾細胞を示す。
を生成したが、有意により高い細胞傷害性が、タンパク質で免疫したマウスで見
られたことを示す。親のCT26腫瘍細胞およびEpCAmを発現するCT26
腫瘍細胞の両方を、このアッセイにおいて殺傷した。親のCT26細胞に対して
観察された細胞傷害性は、これらの細胞が高レベルのマウスEpCAMホモログ
(アミノ酸レベルでヒトタンパク質に約81%同一である)を発現し得るためで
あり得る。それにもかかわらず、Fc−EpCAMタンパク質免疫は、ヒトEp
CAMを発現するCT26腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を生じ、これに
より、実施例6に記載される強力な腫瘍防御活性を説明する。
) いくつかの全タンパク質は、免疫療法のための抗原として有用であるかもしれ
ないが、このタンパク質のより小さい小領域が、ずっと効果的であるかもしれな
い。例えば、タンパク質はそれを低免疫原性にするために翻訳後修飾されるドメ
インを含み得、これにより実際のポリペプチド成分に対して免疫活性が低下する
。大きいタンパク質は、抗原の非ポリペプチド部分とのみ反応する抗体、および
抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を媒介しない抗体(抗腫瘍免疫応答の重要な
成分)を誘導し得る。この状況の最適の実施例は、ヒト黒色腫特異的コンドロイ
チン硫酸プロテオグリカン(MCSP)抗原により例示される。この抗原は、実
質的に全ての黒色腫およびいくつかの型の脳癌で発現される。このタンパク質は
、重度にグリコシル化され、そしていくつかのグリコサミノグリカン鎖の付着に
よりさらに修飾される。9.2.27として公知の抗体(Bumolら(198
2)Proc.Natl.Acad.Sci.79:1245〜1249)は、
高い親和性でこのタンパク質に結合するが、どんなエフェクター機能(ADCC
または補体媒介性細胞傷害(CDC)のどちらか)も媒介しない。この抗体の部
分的にヒト化された(キメラ)形態でさえ、このような活性を媒介し得ない。
ク質配列中の推定グリカン付着部位を同定した。(Pluskeら(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9710〜9715)
。細胞表面膜にまたがる配列から遠からぬ小領域およびグリカン付着部位からい
くらか離れた小領域を選択した。
VVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGR
PEGRAPGPAGD(配列番号21)を逆翻訳し、得られたDNA配列を化
学的に合成し、そして先の実施例において用いた同じ制限部位を用いてpdCs
−Fc−X発現ベクター中に連結した。翻訳終止部位を、3’末端(最終のアミ
ノ酸をコードする配列の直後)に加え、これに唯一のXhoI部位が続いた。最
終発現プラスミドをNS/0黒色腫細胞中にエレクトロポレーションし、そして
所望のタンパク質を発現する安定なトランスフェクト体を、実施例1に記載のよ
うに得た。
フィー(Repligen,Needham,MA)を用いて培養上清から精製
した。抗体力価を、アジュバントとして、5μgのFc−GMCSFと組合せて
、または単独のいずれかで、50μgのFc−MCSP融合タンパク質(PBS
中)を用いて皮下免疫したBalb/cマウスで測定した。この結果を図13に
示す。黒の菱形は、正常血清における抗体力価を示し、白の四角は、Fc−MC
SPで免疫したマウスの血清中の抗体力価を示し、そして黒の三角は、Fc−M
CSPおよびFc−GMCSFアジュバントで免疫したマウスの血清における抗
体力価を示す。
してブースター免疫後有意に増加した。この結果は、Fc−GMCSFおよびF
c−MCSPの両方で免疫したマウスが、Fc−MCSP単独で免疫したマウス
(白の四角)よりも、MCSPに対してより高い抗体力価(黒の三角)を刺激し
たことを示す。
る効果的なワクチンの開発は、ワクチン研究の最も重要な目的の1つである。近
年、いくつかの報告により、このウイルスエンベロープの特定の特性が、免疫応
答を、無関係なエピトープに対して応答させるように働き、これによりこのウイ
ルス粒子の重要な領域および潜在的な中和領域をマスクすることが示された。こ
れらは、デコイとして働く、非常にイムノドミナントな抗原性領域の存在、なら
びに重要なエンベロープの免疫原性を物理的にマスクおよび減じる、過剰なグリ
コシル化を含む(Wyattら(1998)Nature 393:705〜1
1)。
遺伝子の小さい領域を発現して、防御的でないイムノドミナントな反応を回避し
、そして中和反応を誘導することである。小さいサブユニットワクチンに伴う問
題の1つは、合成ペプチドまたは小タンパク質のいずれかでは免疫原性が低下す
ることである。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような免疫原性
キャリアタンパク質に対してこのタンパク質またはペプチドを結合することが1
つのアプローチであった。これにより、タンパク質またはペプチドに起因して、
KLHに対して、強力な応答を同様に誘導する。別のアプローチは、例えば、g
p41のエクトドメイン(ウイルスエンベロープ、gp160のアンカードメイ
ン)の小領域について、実施例1に記載のFcとの融合タンパク質を作製するこ
とである。他のキャリアと異なり、免疫グロブリン領域は、「自己」として示さ
れ、これによりいずれのイムノドミナンス効果も最小限にする。
カルボキシル末端に融合した44アミノ酸ポリペプチドを含んだ。この領域にお
けるHIV株IIIBの配列は、N連結グリコシル化のためのシグナルを含み、
これにより、一過性発現によって293細胞でか、または安定なトランスフェク
ションによりNS/0黒色腫細胞かのいずれかで生成された、Fc−gp41p
erp626融合タンパク質は、SDS−PAGE分析の移動度で高い程度の変
異を示し、それによりグリコシル化の程度における異質性を示す。
シル化されているという事実にもかかわらず、Balb/cマウスにおいて免疫
応答を惹起することは可能であった(図14を参照のこと)。この場合、5匹の
マウスの群に、25μgのFc−gp41pep626を、単独でか(白菱形)
、または2.5μgのFc−アジュバント融合タンパク質、Fc−GMCSF(
白四角)もしくはFc−IL2(黒三角)と組合せるかのいずれかで、1日目、
そして2週間間隔でさらに2回、皮内注射した。図14Aおよび14Bは、それ
ぞれ、第2のブースト後、7日および33日後に得られた抗体力価を示す。
価に達するにはより長くかかる。より高い免疫応答がグリコシル化シグナル(実
際には、多くの株がこの部位をコードしない)を含まないこの配列の改変体を用
いて、またはインビトロで炭水化物糖側鎖を酵素的に除去することにより、惹起
され得ることが予想される。
質のアジュバント活性) Fc−アジュバント融合タンパク質を構築するため、膜結合し得るタンパク質
の細胞外ドメインをFcに融合させることが、しばしば有用である。例えば、C
D40リガンド(CD40L)をFcのC末端のN末端に融合する。必要に応じ
て、リンカーを用いる。
細胞の表面で発現され、そしてT細胞によるB細胞の刺激に関与するからである
。腫瘍壊死因子と同様、CD40Lは、三量体であり、細胞表面上で、そのレセ
プターの二量体化または三量体化を生じる。結果として、細胞内レセプタードメ
インは、コンタクト内に入れられ、そしてシグナル伝達を生じる。またTNFと
同様、CD40Lは、膜結合され得るが、また細胞表面から切断され得、そして
サイトカインのように機能し得る。
に同時投与される。コントロール実験では、Fc−CD40Lタンパク質および
Fc−抗原タンパク質は、異なるセットの動物に投与される。両方の融合タンパ
ク質を注射された動物が、個々にそれぞれの融合タンパク質を注射された動物よ
りもより高い力価の抗体を産生するということが考えられる。
を、FcとCD40Lと抗原部分との間の任意のリンカー(L)とともに用いる
。この融合タンパク質は、N末端からC末端に順にFc−(L)−抗原−(L)
−CD40L、FC−(L)−CD40L−(L)−抗原、抗原)L)−CD4
0L−(L)−Fc、CD40L−(L)−抗原−(L)−Fc−抗原−(L)
−Fc−(L)−CD40L、またはCD40L−Fc−(L)−抗原−(L)
であり得る。Fc−抗原、およびCD40Lを含む融合タンパク質を、動物に注
射し、次いで、抗体力価を測定する。CD40Lおよび抗原の両方の融合タンパ
ク質の注射により生成された抗体力価は、Fcおよび抗原またはFcおよびCD
40Lのみを含有する融合タンパク質の注射により得られる力価よりも高いこと
が考えられる。
は投与の他の適切な様式で注射する。抗原および/またはアジュバントの初回投
与およびブースト投与と、抗体力価の測定との間の時間は、前の実施例に記載さ
れるとおりである。あるいは、標準的投与量およびアッセイレジメンを用いる。
の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書において記載さ
れる本発明を限定するのではなく、全ての例示的観点において考慮される。従っ
て、本発明の範囲は、前述の発明の詳細な説明によるのではなく添付の特許請求
の範囲により示される。従って、特許請求の範囲の意図および等価の範囲内であ
る全ての変更は、本明細書に包含されることが意図される。
として本明細書に特に援用される。
の図面とともに読まれる場合、好ましい実施形態の以下の説明からより十分に理
解され得る。
の略図である。図1Aは、免疫グロブリン重鎖定常領域1が抗原またはアジュバ
ント2のN末端に結合される、Fc−抗原融合タンパク質またはFc−アジュバ
ント融合タンパク質を示す。図1Bは、免疫グロブリン重鎖定常領域1が抗原ま
たはアジュバント2のC末端に結合される、Fc−抗原融合タンパク質またはF
c−アジュバント融合タンパク質を示す。図1Cおよび1Dは、ポリペプチド鎖
のいずれかもしくは両方が、Fc−抗原融合タンパク質またはFc−アジュバン
ト融合タンパク質を含むダイマータンパク質を示す。図1Cにおいて、少なくと
も1つのポリペプチド鎖では、免疫グロブリン重鎖定常領域1は、抗原またはア
ジュバント2のN末端に結合され、そして図1Dでは、免疫グロブリン重鎖定常
領域1は、抗原またはアジュバント2のC末端に結合される。図1Eは、ポリペ
プチド鎖のいずれかもしくは両方が、Fc−抗原−抗原融合タンパク質、Fc−
アジュバントアジュバント融合タンパク質、Fc−アジュバント抗原融合タンパ
ク質またはFc−抗原−アジュバント融合タンパク質を含むダイマータンパク質
を示す。図1Fは、ポリペプチド鎖のいずれかもしくは両方が、抗原−Fc−ア
ジュバント融合タンパク質またはアジュバント−Fc−抗原融合タンパク質を含
むダイマー融合タンパク質を示す。図1Gは、ポリペプチド鎖のいずれかもしく
は両方が、抗原−アジュバント−Fc融合タンパク質またはアジュバント−抗原
−Fc融合タンパク質を含むダイマー融合タンパク質を示す。
図2Aは、ヒトFc融合タンパク質発現ベクターを示す。図2Bは、マウスIg
G 2a Fc融合タンパク質の発現のための遺伝子融合を示す。
レセプターエクトドメイン(Fc−IL−4R)融合タンパク質を用いて免疫し
たマウスにおける抗体産生に対する化学的アジュバントおよびFc−サイトカイ
ンアジュバントの効果を示すグラフである。図3Aにおいて、マウスは、フロイ
ント完全アジュバント(CFA)中Fc−IL−4RおよびFc−IL−2を用
いて免疫された。図3Bにおいて、マウスは、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS
)中Fc−IL−4Rを用いて免疫された。図3Cにおいて、マウスは、CFA
中Fc−IL−4Rを用いて免疫された。図3Dにおいて、マウスは、PBS中
Fc−IL−4RおよびFc−IL−2を用いて免疫された。図3Eにおいて、
マウスは、CFA中Fc−IL−4RおよびFc−GMCSFを用いて免疫され
た。図3Fにおいて、マウスは、PBS中Fc−IL−4RおよびFc−GMC
SFを用いて免疫された。図3A〜3Fにおいて、四角、菱形および三角は、3
匹の別個のマウス由来のデータを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ELIS
Aによって測定された;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示す。
c−抗原融合タンパク質の形態でヒト癌抗原、PSMAを用いてマウスを免疫す
ることの効果を示すグラフである。図4Aにおいて、マウスは、50μgのFc
−PSMA融合タンパク質単独で免疫された。図4Bにおいて、マウスは、50
μgのFc−PSMAおよびアジュバントとして0.05μgのFc−GMCS
Fを用いて免疫された。図4Cにおいて、マウスは、50μgのFc−PSMA
およびアジュバントとして0.5μgのFc−GMCSFを用いて免疫された。
図4Dにおいて、マウスは、50μgのFc−PSMAおよび5μgのFc−G
MCSFを用いて免疫された。図4A〜4Dにおいて、四角、菱形および三角は
、3匹の別個のマウス由来のデータを示す。
SMA融合タンパク質(5D〜5F)のいずれかとして投与されたPSMA抗原
に対する特異的抗体応答を比較するグラフである。図5Aにおいて、マウスは、
抗原として50μgのPSMAを用いて免疫された。図5Bにおいて、マウスは
、抗原として50μgのPSMAおよびアジュバントとして0.2μgのGMC
SFを用いて免疫された。図5Cにおいて、マウスは、抗原として50μgのP
SMAおよびアジュバントとして0.5μgのFc−GMCSFを用いて免疫さ
れた。図5Dにおいて、マウスは、抗原として50μgのFc−PSMAを用い
て免疫された。図5Eにおいて、マウスは、抗原として50μgのFc−PSM
Aおよびアジュバントとして0.2μgのGMCSFを用いて免疫された。図5
Fにおいて、マウスは、抗原として50μgのFc−PSMAおよびアジュバン
トとして0.5μgのFc−GMCSFを用いて免疫された。図5A〜5Fにお
いて、三角、菱形、および三角は、3匹の別個のマウス由来のデータを示す。抗
原に対する抗体のレベルは、ELISAによって測定された;Y軸は、ELIS
A読み出しの光学密度を示す。
与されたFc−GMCSFまたはFc−F3Lのアジュバント効果を比較する図
である。全ての動物は、50μgのFc−PSMA単独か、またはアジュバント
として示されたFc−サイトカインと組み合わされてのいずれかを受けた。1回
の実験あたりに3匹のマウスが試験された。
CSFアジュバントと組み合わされてのいずれかの個々のマウスにおける免疫原
性を示すグラフである。図7Aおよび7Bは、それぞれブーストから7日後およ
び14日後に測定された抗体力価を示す。ブーストは、1次免疫から3週間後に
与えられた。両方の図において、白菱形は、10μgのFc−EpCAM単独を
用いて皮下に免疫されたマウスを示し、そして黒三角は、10μgのFc−Ep
CAMおよびアジュバントとして1μgのFc−GMCSFを用いて皮下に免疫
されたマウスを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ELISAによって測定さ
れた;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示す。
はFc−GMCSFアジュバント融合タンパク質と組み合わされてのいずれかで
のマウスにおける免疫原性を示すグラフである。図8Aおよび8Bは、それぞれ
の免疫から14日後および21日後(すなわち、ブーストから7日後)に測定し
た抗体力価を示す。両方の図において、白菱形は、25μgのEpCAM−Fc
融合タンパク質を用いて免疫された3匹のマウスの平均力価を示し、そして黒三
角は、25μgのEpCAM−Fcおよびアジュバントとして2.5μgのFc
−GMCSFを用いて免疫したマウスを示す。抗原に対する抗体のレベルは、E
LISAによって測定された;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示す。
ドベクターを構築するための図を示す。この場合、抗原EpCAMは、免疫グロ
ブリン重鎖定常領域(Fc領域)のアミノ末端に融合され、そしてアジュバント
GMCSFは、このFc領域のカルボキシ末端に融合される。
スクロース溶液のいずれかを用いてFc−EpCAM融合タンパク質をコードす
るプラスミドベクターを注射したマウスにおける抗体力価を示すグラフである。
図10A〜10Dは、それぞれ、最初の注射から14日後、27日後、55日後
および69日後に記録された抗体力価を示す。この図全体にわたって、白菱形は
、PBS中Fc−EpCAMコードプラスミドを注射した個々のマウスについて
の力価を示し、そして黒三角は、スクロース中Fc−EpCAMコードプラスミ
ドを注射した個々のマウスについての力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは
、ELISAによって測定された;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示
す。
されたマウスから単離された脾細胞の抗原でのインビトロ刺激に対する3Hチミ
ジン取り込みの刺激を示すグラフである。図11Bは、図11Aのより低い区分
におけるデータの拡大図を示す。この図全体にわたって、黒菱形は、CMV−F
c−EpCAM融合タンパク質をコードするプラスミドDNAの100μgを用
いて免疫されたマウスから採取された脾細胞を示し、白丸は、CMV−EpCA
M−Fc融合タンパク質をコードするプラスミドDNAの100μgを用いて免
疫さされたマウスから採取された脾細胞を示し、そして×印は、10μgのFc
−EpCAMタンパク質を用いて免疫されたマウスから採取された脾細胞を示す
。この脾臓は、プラスミドDNAまたはタンパク質の第1の注射および3週間間
隔での2回のブースター注射から70日後にマウスから取り出された。
したマウス由来の脾細胞を用いる細胞傷害性Tリンパ球(CTL)殺傷アッセイ
を示すグラフである。図12Aは、ヒトEpCAMタンパク質を発現するマウス
CT26腫瘍細胞に対する脾細胞の活性を示す。図12Bは、親マウスCT26
腫瘍細胞に対する脾細胞の活性を示す。両方の図について、白菱形は、(CMV
プロモーター)−EpCAM構築物を保有するDNAを用いて免疫した脾細胞を
示し、白四角は、(CMVプロモーター)−Fc−EpCAM融合構築物を保有
するDNAを用いて免疫されたマウス由来の脾細胞を示し、白三角は、(CMV
プロモーター)−EpCAM−Fc融合構築物を保有するDNAを用いて免疫さ
れたマウス由来の脾細胞を示し、そして×印は、Fc−EpCAM融合タンパク
質を用いて免疫されたマウス由来の脾細胞を示す。このCTLアッセイには、1
0U/mlのIL−2を用いて5日間育てた免疫したマウス由来の脾細胞を用い
た。標識化標的細胞は、示されたエフェクターと混合し、そして4時間インキュ
ベートした。放射活性の放出を使用して、特異的溶解のパーセンテージを算定し
た。
ジュバントとして5μgのFc−GMCSFと組み合わされてのいずれかで皮下
に免疫されたマウスにおける抗体力価を示すグラフである。黒菱形は、正常血清
中の抗体力価を示し、白四角は、Fc−MCSP融合タンパク質単独を用いて免
疫されたマウスの血清中の抗体力価を示す。そして黒三角は、Fc−GMCSF
アジュバントと組み合わされたFc−MCSP融合タンパク質を用いて免疫され
たマウスの血清中の抗体力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは、ELISA
によって測定された;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示す。
はFc−サイトカインアジュバントと組み合わせてのいずれかで免疫したマウス
における抗体力価を示すグラフである。図14Aおよび14Bは、それぞれ、第
2のブーストから7日後および33日後に達成した抗体力価を示す。この図全体
にわたって、白菱形は、25μgのFc−gp41 pep 626抗原単独で
の皮内注射によって免疫したマウスにおける抗体力価を示し、白四角は、2.5
μgのFc−GMCSFアジュバントと組み合わされた25μgのFc−gp4
1 pep626抗原の皮内注射によって免疫したマウスにおける力価を示し、
そして黒三角は、2.5μgのFc−IL2アジュバントと組み合わされた25
μgのFc−gp41 pep626抗原の皮内注射によって免疫したマウスに
おける抗体力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは、ELISAによって測定
された;Y軸は、ELISA読み出しの光学密度を示す。
Claims (45)
- 【請求項1】 哺乳動物において、予め選択された抗原の免疫原性を増強す
る方法であって、該方法は、以下: 該哺乳動物の筋内、静脈内、経皮、または皮下に、該予め選択された抗原に対
してポリペプチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融
合タンパク質を投与し、それによって、該予め選択された抗原に対する免疫応答
を誘発する工程であって、ここで、該融合タンパク質中の該予め選択された抗原
は、該予め選択された抗原単独よりも、該哺乳動物において強力な免疫応答を誘
発する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 アジュバントを伴なわずに投与された前記融合タンパク質の
前記予め選択された抗原に対する免疫応答と比較して、該融合タンパク質の該予
め選択された抗原に対する免疫応答を増強するに十分な量の該アジュバントと組
合せて、該融合タンパク質を投与する工程をさらに包含する、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項3】 前記融合タンパク質および前記アジュバントが、同時に投与
される、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記アジュバントが、アジュバントタンパク質に対してポリ
ペプチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合タンパ
ク質を含む、請求項2に記載の方法。 - 【請求項5】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンヒンジ
領域を含む、請求項1または4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメイン、CH
3ドメイン、およびCH4ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン重
鎖定常領域ドメインを含む、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメインおよび
CH3ドメインを含む、請求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、前記哺乳動物と同じ種
において存在する免疫グロブリン重鎖定常領域を規定するアミノ酸配列に対応す
るアミノ酸配列によって規定される、請求項1または4に記載の方法。 - 【請求項9】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域を規定するアミノ酸配列が
、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に対応する、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記予め選択された抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカ
インレセプターのエクトドメイン、ウイルスタンパク質、および腫瘍特異タンパ
ク質からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 前記アジュバントタンパク質がサイトカインである、請求
項4に記載の方法。 - 【請求項12】 前記サイトカインが、前記哺乳動物と同じ種において存在
するサイトカインを規定するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列によって規定
される、請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 前記サイトカインがヒトサイトカインである、請求項12
に記載の方法。 - 【請求項14】 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 【請求項15】 哺乳動物において、予め選択された抗原に対する免疫応答
を誘発するための組成物であって、該組成物は、以下: (a)アジュバントと混合された、該予め選択された抗原に対してポリペプチ
ド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗原融合タンパク
質;および (b)アジュバントタンパク質に対してポリペプチド結合によって連結された
免疫グロブリン重鎖定常領域を含むアジュバント融合タンパク質と混合された、
予め選択された抗原 からなる群から選択される、筋内投与、静脈内投与、経皮投与、または皮下投与
のための混合物を含む、 組成物。 - 【請求項16】 前記(a)節に記載のアジュバントが、アジュバントタン
パク質に対してポリペプチド結合によって連結された免疫グロブリン定常領域を
含む融合タンパク質を含む、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項17】 前記(b)節に記載の予め選択された抗原が、免疫グロブ
リン重鎖定常領域に対してポリペプチド結合によって連結されている、請求項1
5に記載の組成物。 - 【請求項18】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンヒン
ジ領域を含む、請求項15、16、または17に記載の組成物。 - 【請求項19】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメイン、C
H3ドメイン、およびCH4ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン
重鎖定常領域ドメインを含む、請求項18に記載の組成物。 - 【請求項20】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメインおよ
びCH3ドメインを含む、請求項18に記載の組成物。 - 【請求項21】 前記(a)節に記載のアジュバントが、オリゴヌクレオチ
ドCpG配列を含む、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項22】 前記予め選択された抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカ
インレセプターのエクトドメイン、ウイルスタンパク質、および腫瘍特異タンパ
ク質からなる群から選択される、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項23】 前記(a)節に記載の抗原融合タンパク質、または前記(
b)節に記載のアジュバント融合物が、第2の免疫グロブリン重鎖定常領域に対
してジスルフィド結合によって連結されている、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項24】 前記(a)節に記載のアジュバント、または前記(b)節
に記載のアジュバントタンパク質が、サイトカインである、請求項15に記載の
組成物。 - 【請求項25】 前記サイトカインがヒトサイトカインである、請求項24
に記載の組成物。 - 【請求項26】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒト免疫グロブリン
重鎖定常領域を規定するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列によって規定され
る、請求項15、16、または17に記載の組成物。 - 【請求項27】 哺乳動物において、予め選択された抗原の免疫原性を増強
する方法であって、該方法は、以下: 該哺乳動物に、該予め選択された抗原に連結された免疫グロブリン重鎖定常領
域を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を投与する工程であって、ここで
、該哺乳動物における該核酸配列の発現が、該融合タンパク質の産生を生じ、該
融合タンパク質の該予め選択された抗原は、該予め選択された抗原単独をコード
する核酸から発現された該予め選択された抗原よりも、強力な免疫応答を誘発す
る、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項28】 前記核酸が、5’から3’の方向で、前記免疫グロブリン
重鎖定常領域および前記予め選択された抗原をコードする、請求項27に記載の
方法。 - 【請求項29】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンヒン
ジ領域を含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメイン、C
H3ドメイン、およびCH4ドメインからなる群から選択される重鎖ドメインを
含む、請求項27または29に記載の方法。 - 【請求項31】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメインおよ
びCH3ドメインを含む、請求項29に記載の方法。 - 【請求項32】 前記予め選択された抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカ
インレセプターのエクトドメイン、ウイルスタンパク質、および癌特異抗原から
なる群から選択される、請求項27に記載の方法。 - 【請求項33】 アジュバントと組合せて前記核酸配列を投与する工程をさ
らに包含する、請求項27に記載の組成物。 - 【請求項34】 前記アジュバントが、アジュバントタンパク質に連結され
た免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含
む、請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 哺乳動物において、予め選択された抗原に対する免疫応答
を誘発するための組成物であって、該組成物は、以下: (a)免疫グロブリン重鎖定常領域および該予め選択された抗原を含む融合タ
ンパク質をコードする第1の核酸配列であって、ここで、該哺乳動物における該
核酸配列の発現が、該融合タンパク質の産生を生じ、該融合タンパク質の該予め
選択された抗原は、該予め選択された抗原単独をコードする核酸から発現された
該予め選択された抗原よりも、強力な免疫応答を誘発する、第1の核酸配列;お
よび (b)アジュバント を含む、組成物。 - 【請求項36】 前記アジュバントが、アジュバントタンパク質に対してペ
プチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合タンパク
質をコードする第2の核酸配列を含む、請求項35に記載の組成物。 - 【請求項37】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリンヒン
ジ領域を含む、請求項35または36に記載の組成物。 - 【請求項38】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメイン、C
H3ドメイン、およびCH4ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン
重鎖ドメインを含む、請求項35または36に記載の組成物。 - 【請求項39】 前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、CH2ドメイン、C
H3ドメイン、およびCH4ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン
重鎖ドメインを含む、請求項37に記載の組成物。 - 【請求項40】 前記予め選択された抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカ
インレセプターのエクトドメイン、ウイルスタンパク質、および癌特異抗原から
なる群から選択される、請求項35に記載の組成物。 - 【請求項41】 前記アジュバントタンパク質がサイトカインである、請求
項36に記載の組成物。 - 【請求項42】 前記第1の核酸配列が、複製可能な発現ベクター中に作動
可能に配置されている、請求項35に記載の組成物。 - 【請求項43】 前記第2の核酸配列が、複製可能な発現ベクター中に作動
可能に配置されている、請求項36に記載の組成物。 - 【請求項44】 哺乳動物において、予め選択された抗原の免疫原性を増強
するための方法であって、該方法は、以下: 該哺乳動物に、局在化タンパク質と共に抗原タンパク質を含む第1の融合タン
パク質と、アジュバントタンパク質および該局在化タンパク質を含む第2の融合
タンパク質とを、同時的または連続的のいずれかで投与する工程であって、該局
在化タンパク質は、免疫系にアクセス可能な哺乳動物の領域における、該第1の
融合タンパク質および該第2の融合タンパク質の濃度増加を生じさせる、工程 を包含する、方法。 - 【請求項45】 哺乳動物において、予め選択された抗原の免疫原性を増強
するための方法であって、該方法は、以下: 哺乳動物に、抗原タンパク質、アジュバントタンパク質、および局在化タンパ
ク質を含む融合タンパク質を投与する工程であって、該局在化タンパク質は、免
疫系にアクセス可能な哺乳動物の領域における、該抗原タンパク質および該アジ
ュバントタンパク質の濃度増加を生じさせる、工程 を包含する、方法。
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