HUP0202796A2 - Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens - Google Patents

Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens Download PDF

Info

Publication number
HUP0202796A2
HUP0202796A2 HU0202796A HUP0202796A HUP0202796A2 HU P0202796 A2 HUP0202796 A2 HU P0202796A2 HU 0202796 A HU0202796 A HU 0202796A HU P0202796 A HUP0202796 A HU P0202796A HU P0202796 A2 HUP0202796 A2 HU P0202796A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antigen
immunoglobulin
adjuvant
heavy chain
protein
Prior art date
Application number
HU0202796A
Other languages
English (en)
Inventor
Gillies
Wesolowskijr
Original Assignee
Lexigen Pharm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharm Corp filed Critical Lexigen Pharm Corp
Publication of HUP0202796A2 publication Critical patent/HUP0202796A2/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát emlősökben, előre kiválasztott fehérje- vagypeptid-antigének immunogenitásának fokozására szolgáló eljárások éskészítmények képezik. Immunogenitás fokozása során, Fc-antigén-fúziósfehérje előállítása céljából a kiválasztott antigéntimmunglobulin nehézlánc eredetű konstans régióval fuzionáljuk. Az Fc-antigén-fúziósfehérje az antigént bemutató sejtek felszínén találhatóFc receptorokhoz kötődik, az emlősben ezáltal az antigén az antigéntbemutató sejteket veszi célba. Ezenfelül, a találmány tárgya akiválasztott antigén elleni konkrét immunválaszt fokozó vagy modulálóadjuvánsok - például Fc-adjuváns fúziós fehérje - családjának az Fc-antigén-fúziós fehérjékkel kombinálva történő alkalmazása. A találmánytárgyát, általában, emlősökben, fehérje vagy peptid-antigénekimmunogenitásának fokozására szolgáló eljárások és készítményekképezik. Előnyösen, a találmány tárgyát eljárások, és immunglobulinnehézlánc eredetű konstans régiót és kiválasztott antigént tartalmazófúziós fehérjéket kódoló nukleinsavakat, illetve azokat meghatározóaminosavakat tartalmazó készítmények képezik, ahol a fúziós fehérjerészét képező antigén képes a kiválasztott antigén egymagában történőbeadása esetén tapasztalt immunválasznál erősebb immunválasztkiváltani az emlősben. Ó

Description

P02 02796
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
Képviselő:
Danubia
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Budapest
Fehérje- és peptid-antigének. immunogenitásának fo kozására szolgáló Fc-fúziósfehérjék
A találmány tárgyát emlősökben, előre kiválasztott fehérje- vagy peptid-antigének immunogenitásának fokozására szolgáló eljárások és készítmények képezik. Immunogenitás fokozása során, Fc-antigén-fúziósfehérje előállítása céljából a kiválasztott antigént immunglobulin nehézlánc-eredetű konstans régióval fuzionáljuk. Az Fc-antigén-fúziósfehérje az antigént bemutató sejtek felszínén található Fc receptorokhoz kötődik, az emlősben ezáltal az antigén az antigént bemutató sejteket veszi célba. Ezenfelül, a találmány tárgya a kiválasztott antigén elleni konkrét immunválaszt fokozó vagy moduláló adjuvánsok - például Fc-adjuvánsfüziósfehérje — családjának az Fc—antigén—fúziósfehérjékkel kombinálva történő alkalmazása.
A találmány tárgyát, általában, emlősökben, előre kiválasztott fehérje- vagy peptid-antigének immunogenitásának fokozására szolgáló eljárások és készítmények képezik. Előnyösen, a találmány tárgyát eljárások, és immunglobulin neAktaszámunk: 96191-13092/SG hézlánc-eredetű konstans régiót és kiválasztott antigént tartalmazó fúziós fehérjéket kódoló nukleinsavakat, illetve azokat meghatározó aminosavakat tartalmazó készítmények ké pezik, ahol a kiválasztott, a fúziós fehérje részét képező antigén képes a kiválasztott antigén egymagában történő beadása esetén tapasztalt immunválasznál erősebb immunválaszt kiváltani az emlősben.
A vakcinafejlesztés hagyományosan a fertőző ágenseket semlegesíteni képes, védő antitestek előállítására irányul. Ezideig, a vakcinaként alkalmazott ágensek közé, jellemzően, inaktivált vagy attenuált mikroorganizmusok (például baktériumok vagy vírusok), ezek termékei (például toxinok), illetve tisztított antigének tartoztak. A modern molekuláris biológiai és génklónozási eljárások előnyein alapulva lehetségessé vált tisztább, és kétségtelenül specifikusabb vakcinák előállítása. Továbbá, az immunrendszer molekuláris szinten történő megismerése lehetővé tette a kórokozó ágensek által serkentett immunválaszok izolálását és jellemzését. Az elképzelések szerint a megfelelő immunválasz sikeres generálásában az immunrendszer két összetevője kiemel ten lényeges: a regulációs és citotoxikus T-sejtek döntő fontosságú szerepe; és az a mód, ahogyan valamely antigén e sejtek számára, az antigént bemutató sejtek (APC) által bemutatásra kerül [lásd például, Paul, Fundamentals of Immunology, kiad.: Raven Press, Ltd., New York (1993)].
Jellemzően, Az APC-n kívülről érkező fehérje- vagy peptidtermészetű antigén (exogén eredetű antigén) az APC endocitikus vezikulumainak vagy endoszómáinak belsejében lebomlik, ami után az eredményül kapott peptidfragmentumok a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) II. osztályába tartozó fehérjékkel komplexet képeznek. A képződött komplex a sejt felszínére kerül, ahol az APC-vel szomszédos immunsejtek számára bemutatásra kerül. A peptidfragmentum az MHC molekulák által meghatározott, peptidkötő hajlatba illeszkedik, és a komplexet felismerheti, a komplexet specifikusan megkötni képes T-sejt-receptort expresszáló T-sejt. Peptidet már megkötött MHC II. osztályú molekula és - a technikában CD4 T-sejtként ismert - helper T-sejt közötti kölcsönhatást tovább stabilizálja egy másik MHC II. osztályú molekulával és a T-sejt felszínén lévő CD4+ receptorral létrejövő kölcsönhatás. így, az APC sejteken belül proceszszált exogén eredetű antigén a sejt felszínén, az MHC II. osztályba sorolt molekula közreműködésével kerül bemutatásra. Az MHC II. osztályba sorolt molekulával képződött komplex, CD4+ T-sejteknek történő bemutatás esetén, a CD4+ helper sejtekben citokinek szekretálását serkenti. A citokinek a B-sejteket a peptid elleni antitestek termelésére serkentik [lásd Paul, mint fent].
Exogén antigénnel végzett vakcinálás jellemzően CD4 sejtek által közvetített T-sejt-választ, és ezáltal antitest-termelést eredményez. Citotoxikus T-sejtek (CTL) jellemzően nem ilyen útvonal mentén stimulálódnak. Úgy látszik, hogy a CTL-ek olyan esetekben stimulálódnak, amikor az antigének magából az APC-n belülről származnak (endogén eredetű antigének), például vírusokkal fertőzött sejtből származó vírusfehérjék keletkezésekor vagy rákos sejtből származó rák-specifikus fehérjék hatására. Tény, hogy sok vírusbetegség esetében úgy gondolják, hogy a CTL-ek keletkezése kulcsfontosságú a vírussal fertőzött sejt eliminálásában, és ezáltal a fertőzésből való felépülésben.
A kísérletek eredményei azt jelzik, hogy az endogénés exogén eredetű antigének különböző módon processzálódnak. Nascens polipeptidek szintézise során egy sejten belüli, proteoszómának nevezett szerkezet a polipeptid egy részét lebontja. E folyamatból származó fragmentumok elsősorban nem az MHC II. osztályú molekulákkal, hanem újonnan szintetizálódott MHC I. osztályba sorolt molekulákkal képeznek komplexet, ami után az MHC I. osztályú molekulát és az antigént tartalmazó komplex a sejt felszínére transzportálódik. Ezután, a konkrét peptidfragmentumra specifikus T-sejtek T-sejtekhez kötődnek, azonban ez esetben MHC I. osztályú molekula és CD8 molekula között receptorok közötti kölcsönhatás létrejötte szükséges. Eszerint, az APC felszínén lévő, endogén eredetű antigén CD8+ T-sejtek számára bemutatásra kerül. Bár léteznek nem citotoxikus CD8+ T-sejttípusok is, a CTL-ek legnagyobb részét CD 8 T-sejtek teszik ki.
Eszerint, úgy tűnik, hogy erős CTL-válaszokat kiváltani képes vakcinák tervezéséhez az szükséges, hogy az antigén tulajdonságú molekula (általában fehérje) vagy a sejten belül keletkezzen, vagy pedig a megfelelő sejtkompartmentumhoz szállítódjon, és ott belépjen az MHC I. osztály processzálási útvonalába. Egy lehetséges stratégia szerint a kérdéses fehérjét vagy peptidet kódoló gént vírusba épít jük be, és a genetikailag módosított vírust alkalmazzuk vakcinaként [Lorenz és mtsai., Hum. Gene Ther. 10, 623-631 (1999)]. Egy másik stratégia szerint fehérjét kódoló DNSvektort sejtbe injektálunk, és a sejtet adjuk be az állatnak vagy a páciensnek, ahol a fehérje a sejten belül expresszálódik, és az MHC I. osztályú molekulák útján kerül bemutatásra a sejtfelszínen [Donelly és mtsai., Annu. Rév. Immunoi. 15, 617 (1997)]. DNS-vektor közvetlenül izomba vagy bőrbe történő injektálásán alapuló egyszerűbb eljárásról kimutatták, hogy számos antigén ellen CTL- és/vagy antitestválaszt indukál [Lai és mtsai., Crit. Rév. Immunoi. 18, 449-484 (1988); 5.589.466 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Kísérletekkel kimutatták, hogy az antigént az APC felveszi és processzálja, és bemutatja az immunrendszer számára [Lai és mtsai., mint fent].
Az exogén peptidek vagy fehérjék MHC I. osztály útvonalához történő eljuttatása kémiai adjuvánsok (mint például Freund-féle adjuváns), szkvalénok és detergensek keverékei [Hilgers és mtsai., Vaccine 17, 219-228 (1999)], és újabban kisméretű, antigénnel bevont gyöngyök (amelyeket a makrofágok bekebeleznek és alternatív MHC I. osztály útvonalat indukálnak) [DeBruijn és mtsai., Eur. J. Immunoi. 25, 1274-1285 (1995)] alkalmazásával bizonyos mértékig eredményesnek mondható. Ezenfelül, valamely antigénnel szembeni immunválasz fokozására szolgáló más eljárások közé tartozik a kémiai adjuvánsok és rekombináns immunstimulációs citokinek (például IL-2, IL-12, GM-CSF, és mások) kombinációinak alkalmazása. Például, egy eljárásban haptén ellenes antitestet IL-2-vel· fuzionáltattak oly módon, hogy e citokint a hapténnel kémiai úton reagáltatott fehérjeantigénnel kapcsolták össze [Harvill és mtsai., J. Immunoi. 157, 3165 (1996)].
Egy másik eljárás valamely antitest antigénné alakításán alapul, azaz amikor immunglobulin-eredetű variábilis régió egy részét peptidtermészetű antigénnel helyettesítjük. Miután a rekombináns antitest az APC felszínén lévő Fc-receptorokkal történő kölcsönhatás segítségével APC-hez kötődik, a hibrid molekula peptid-antigénje APC-nek kerül bemutatásra [Lanza és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11683-11687 (1993)]. E megközelítés további fejlesztése szerint, antigénné változtatott, immunglobulin-eredetű nehézláncot kódoló plazmid DNS—t a lépbe injektálunk, ami után a lépből származó B-sejtek a rekombináns antitestet fogják szekretálni, amennyiben immunglobulin-eredetű könynyűlánc-partnert is biztosítunk.
A modern vakcinafejlesztésben, azonban, az antigén beviteli rendszer immunogenitása csak egyike a fő technikai akadályoknak. A vakcinálás célja erős immunválasz kiváltá sa. Azonban, mivel a gazda immunrendszere baktériumok és vírusok elleni küzdelemre alakult ki, baktériumok és vírusok vektorként történő alkalmazása esetén az információt hordozó organizmus az információval együtt jellemzően elpusztul. Továbbá, bizonyos vírusvektorok, például vakciniaés adenovirus, elleni erős immunválaszok behatárolják ezek alkalmazhatóságát, és úgy gondoljuk, hogy hasonló problémák származhatnak a bakteriális toxinok fehérjevektorként tör <5 ténő alkalmazásából is. Hasonlóképpen, variábilis régiókat tartalmazó, antitesten alapuló fehérjevektorok - melyeket természetüknél fogva az immunrendszer sajátként nem ismer fel - potenciálisan immunogének. Úgy gondoljuk, hogy e hordozómolekulák többszörös alkalmazása anti-idiotipikus válaszokat indukálhat, amely eleve kizárja ezek hatékony alkalmazását. Eszerint, a találmány szerinti megoldás célja elő re kiválasztott fehérje- vagy peptid-antigénekkel szembeni erős és hosszú ideig fennmaradó immunválaszt kiváltó vakcina előállítása.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány részben azon a felismerésen alapul, hogy valamely előre kiválasztott fehérje- vagy peptid-antigénnel szembeni immunogenitást emlősben fokozni lehet oly módon, hogy az előre kiválasztott antigént immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával fuzionáltakjuk. Az eredményül kapott fúziós fehérjét (amelyre Fc-antigén-fúziósfehérje vagy antigén-fúziósfehérje neveken is hivatkozunk) vagy a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát vakcina formájában beadhatjuk az emlősnek abból a célból, hogy az előre kiválasztott antigénnel szemben immunválaszt váltsunk ki. Továbbá, felismerték, hogy az előre kiválasztott antigénnel szembeni immunválasz erősségét és típusát az Fcantigén-fúziósfehérjével vagy az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciával együtt beadott specifikus adjuvánssal modulálni lehet.
Eszerint, a találmány tárgya eljárás előre kiválasztott antigén immunogenitásának fokozására valamely emlősben. A találmány egy szempontja szerint, az eljárás során az emlősnek immunválasz kiváltására alkalmas mennyiségben, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával, polipeptid kötés útján kapcsolt, előre kiválasztott antigént tartalmazó Fc-antigén-fúziósfehérjét adunk be. A találmány egy másik szempontja szerint, az eljárás során az emlősnek immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával kapcsolt, előre kiválasztott antigént tartalmazó Fc-antigénfúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát, például dezoxiribo-nukleinsavat (DNS) vagy ribonukleinsavat (RNS), adunk be. Az előre kiválasztott antigént, Fc-antigénfúziósf ehér j eként (akár fúziós fehérjeként, akár pedig nukleinsavként — amelynek a gazdában történő expressziójával a fúziós fehérje képződik - beadva) az jellemez, hogy képes az emlősben, az előre kiválasztott antigén önmagában (azaz az előre kiválasztott antigén nincs immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával fuzionáltatva), megfelelő mennyiségben történő beadása esetén kapott immunválasznál erősebb immunválaszt stimulálni.
Továbbá, az Fc-antigén-fúziósfehérje részét képező, előre kiválasztott antigén elleni immunválaszt fokozni vagy modulálni lehet oly módon, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérjét adjuvánssal együtt adjuk be. Bár különféle adjuvánsok, például kémiai adjuvánsok (például Freund—féle komplett adjuváns vagy nem metilezett CpG szekvenciát tartalmazó oligonukleotid), alkalmasak lehetnek a találmány gyakorlatba vétele esetén, az Fc-antigén-fúziósfehérjével együtt alkalmazható, jelenleg előnyös adjuváns második Fcfúziósfehérjét (a továbbiakban Fc-adjuváns-fúziósfehérje vagy adjuváns-fúziósfehérje) vagy ilyen Fc-fúziósfehérjét kódoló nukleinsavat tartalmaz. Előnyös Fc-adjuvánsfúziósfehérje immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával, polipeptid kötés útján kapcsolt adjuvánsfehérjét, például citokint, tartalmaz. Az Fc-adjuváns-fúziósfehérjék konstrukciójában alkalmas citokinek közé tartozik, például, az a-interferon (IFN-a) , interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-12 (IL-12), IL-18, tumornekrozis-faktor (TNF), granulocita makrofág kolónia stimuláló faktor (GMCSF). Az Fc-adjuváns-fúziósfehérjék egy másik osztályába immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójának és valamely fehérje, extracelluláris doménjának (amely általában gyakorlatilag vagy kizárólag membránkötött) megfelelő adjuváns részének fúziójával előállított fehérjét tartalmazó fúziós fehérjéket soroljuk. Például, CD40 ligandum és Fc-rész fúziójával előállított fúziós fehérje megnövelt adjuváns tulajdonságú fehérjeként alkalmazható .
Az Fc-antigén és Fc-fúziósfehérjék - akár szimultán, akár pedig egyik a másik után történő (például, Fc-antigént Fc-adjuváns követ, vagy Fc-adjuvánst Fc-antigén követ) együttes beadását alkalmazhatjuk az előre kiválasztott antigén által stimulált immunválasz típusának modulálására. Különböző stimulusok hatására kétféle, Thl-nek, illetve Th2-nek nevezett, immunválasz indul be, és ezen immun- 10 válaszokban különféle citokinek vesznek részt. A Thl által közvetített immunválasz természetét tekintve celluláris immunválasz, míg a Th2 által közvetített válasz humorális természetű. Eszerint, Thl-válasz megváltozott sejtek, például rákos sejtek vagy vírusfertőzött sejtek, megtámadására alkalmazható, míg a Th2-válasz extracelluláris ágensek, mint például paraziták, ellen alkalmazható. Gyakran hasznos, ha immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával fuzionáltatott citokineket is beadunk, mivel ezzel általános immunválaszt stimulálhatunk, vagy specifikus Thl- vagy Th2-válaszokat indíthatunk be, illetve modulálhatunk.
Például, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával peptid kötéssel kapcsolt GMCSF-et tartalmazó Fcadjuváns-fúziósf ehér j e az immunválasz (ideértve mind a Thl és Th2 válaszokat is) általános, hatékony stimulátora. IL12-t vagy IFN-a-t tartalmazó Fc-adjuváns-fúziósfehérjét együttesen beadva elsősorban sejtes vagy Thl által közvetített immunválaszt serkenthetünk. További lehetőségként, IL4-et tartalmazó Fc-adjuváns-fúziósfehérje beadásával elsősorban humorális vagy Th2 által közvetített immunválaszt serkenthetünk.
Továbbá, Fc-adjuváns-fúziósfehérj ében lévő konkrét citokin kiválasztása hatással lehet az Fc-antigén-fúziósfehérjében lévő, előre kiválasztott antigén ellen termelődött antitest-osztályokra. Például, IL-12-őt tartalmazó Fcadjuváns-fúziósfehér j e helper T-sejteket, és az IgG2a osztályba sorolt antitestek termelődését serkenthet. További lehetőségként, IL-4-et tartalmazó adjuváns-fúziósfehérjével
- 11 az IgE osztályba sorolt antitestek termelődését serkenthetj ük.
Az fentiekben leírtak szerint, a találmány előnyös megvalósítási módja szerint, az eljárás során Fc-antigénfúziósfehérjét vagy Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsavat adunk be Fc-adjuváns-fúziósfehérjével kombinálva. Az emlősben a két, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót tartalmazó fúziós fehérje alkalmazásával azonos vagy hasonló sejttípusokba együttesen lokalizálhatjuk mind az előre kiválasztott antigént mind, pedig az adjuvánsfehérjét (például citokint). Például, makrofágok, B-sejtek, granulociták és dendritikus sejtek felszínükön Fcreceptorokat expresszálnak. Következésképpen, Fc-receptorokhoz kötődni képes Fc-antigén- és Fc-adjuvánsfúziósfehér j ék együttes beadásával azonos sejttípusokba lehet együttesen lokalizálni az antigén-fúziósfehérje antigénjét és az adjuváns-fúziósfehérje adjuvánsát. Az adjuváns így serkenti, fokozza, vagy valahogy másként modulálja az immunválaszt az előre kiválasztott antigén körül.
A találmány ezen előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti megoldás két különálló lokalizációs vagy koncentrálási formát alkalmaz. Először, a találmány szerinti megoldásban közös, a test bizonyos régióiba koncentrálást biztosító fragmentumot fuzionáltatunk mind az antigénhez, és mind pedig az adjuvánshoz. Ezáltal fokozzuk az antigén hatékony, lokális koncentrálását az adjuváns szomszédságában. Másodszor, a találmány szerinti megoldásban az antigént az immunrendszer antigén-processzáló és
- 12 bemutató rendszerébe irányítjuk. Az első, koncentrálási lépést az antigén- és adjuváns fehérjék olyan fragmentummal történő fúziójával hajtható végre, amely a lehetővé teszi a koncentrálást a test olyan részében, amely az immunrendszer számára könnyen hozzáférhető. A második, célbajuttatási lépést az antigénfehérje és bármely olyan fragmentum fúziójával hajtható végre, amely fokozza a szállítást az antigénbemutatási rendszerhez vagy az antigén-bemutatási rendszer általi processzálást.
Következésképpen, a találmány szerinti megoldás ezen koncentrálási hatásokat két, alternatív eljárással éri el. Az egyik eljárásban két, különböző fúziós fehérjét - az antigént lokalizáló fúziós fehérjét, illetve az adjuvánst lokalizáló fúziós fehérjét - állítunk elő és adunk be. A második eljárásban az antigént, az adjuvánst és a lokalizációs fehérjét tartalmazó fúziós fehérjét állítunk elő és adunk be. Az Fc-fragmentum például lehet ilyen lokalizációs fehérj e.
Az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió fontos tulajdonsága az, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérjében lévő, előre kiválasztott antigéntől eltérően, a kérdéses befogadó számára előnyösen nem immunogén vagy csak gyengén immunogén. Más szavakkal, az Fc-antigén-fúziósfehérjében lévő, előre kiválasztott antigént olyanra tervezzük, hogy a befogadóban az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiónál immunogénebb legyen. Hasonlóképpen, úgy gondoljuk, hogy a befogadóban az Fc-adjuváns-fúziósfehérje szintén nem, vagy csak gyengén lehet immunogén. Valamely immunglo
- 13 bulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunogenitását csökkenteni és, bizonyos esetekben, eliminálni lehet oly módon, hogy a kiválasztott befogadóval azonos fajból származó vagy ahhoz hasonló immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió szekvenciáját alkalmazzuk. Például, előnyösen emberből származó, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiókat alkalmazunk emberi beadásra szánt fúziós fehérjék előállítására. Hasonlóképpen, amennyiben a kiválasztott befogadó ember, az Fc-adjuváns-fúziósfehérjében lévő adjuvans fehérje előnyösen szintén emberi eredetű. Az alkalmas, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiókat és adjuváns fehérjéket meghatározó aminosav-szekvenciákat oly módon lehet optimalizálni, hogy az immunválasz elsősorban a kiválasztott antigénre irányuljon.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, az Fc-antigén-fúziósfehérje immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiója tartalmaz immunglobulin-eredetű csukló (hinge) régiót, és igény szerint immunglobulin-eredetű CH2, CH3 vagy CH4 konstans régiódomének közül bármelyiket, illetve ezek kombinációját. Az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióból, azonban, előnyösen hiányzik legalább egy CHl-domén. Továbbá, a találmány szerinti Fcfúziósfehérjében előnyösen nincs immunglobulin-eredetű nehézlánc variábilis régiódomén (VH). Amennyiben a fúziós fehérjét embernek kívánjuk beadni, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió előnyösen immunglobulin-eredetű csukló régiót, és CH2-domént vagy CH3-domént, legelőnyösebben immunglobulin-eredetű csukló régiót, és mind CH2-domént
- 14 mind pedig CH3-domént tartalmaz. Úgy gondoljuk, hogy a találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiók bármelyik öt, a technikában IgA (Iga), IgD (Igö), IgE (Igs), IgG (így) és IgM (Igμ) néven besorolt immunglobulin-osztályba sorolt immunglobulinból származhatnak. Azonban, előnyösek az IgG osztályból származó immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiók.
Úgy gondoljuk, hogy bármilyen kérdéses, előre kiválasztott antigén része lehet a találmány szerinti Fcantigén-fúziósfehérjének. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, az előre kiválasztott antigén prosztatára specifikus, membráneredetű antigén, citokinreceptor ektodoménje, vírusfehérje, vagy rák-, illetve daganatspecifikus antigén lehet.
Különböző konfigurációjú Fc-antigén-fúziósfehérjék lehetnek alkalmasak a találmány gyakorlatba vétele során. Például, az előre kiválasztott antigén N-terminálisát polipeptid kötéssel az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió C—terminálisához lehet kapcsolni. Kívánság szerint, az előre kiválasztott antigén C-terminálisát lehet kapcsolni polipeptid kötéssel az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió N-terminálisához. Továbbá, úgy gondoljuk, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérjék tartalmazhatják az egy vagy több előre kiválasztott antigén többszörös kópiáját is, amelyek közül egy vagy több közvetlenül, vagy polipeptid linker útján egymáshoz vagy az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régióhoz van kapcsolva. Továbbá,
- 15 két vagy több Fc-antigén-fúziósfehérjét egymással nem kovalens vagy kovalens úton, például egy vagy több diszulfidkötéssel, összekapcsolhatunk abból a célból, hogy dimer vagy multimer készítményeket állítsunk elő. Úgy gondoljuk, hogy a dimer konstrukciókban az Fc-antigén-fúziósfehérjék egymással azonosak vagy egymástól eltérőek lehetnek. Például, bár az Fc-antigén-fúziósfehérjék ugyanazon immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót tartalmazhatják, az előre kiválasztott antigének eltérhetnek. Úgy gondoljuk, hogy az Fc-adjuváns-fúziósfehérjék esetében is alkalmazhatunk hasonló konfigurációkat.
Továbbá, a találmány gyakorlatba vételére különböző, Fc-fúziósfehérjéket kódoló nukleinsav-szekvenciák lehetnek alkalmasak. Például, a nukleinsav-szekvenciák 5'-3' irányban kódolhatják mind az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót és az előre kiválasztott antigént, vagy az előre kiválasztott antigént és az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót. Továbbá, a nukleinsav-szekvenciákban, igény szerint, jelen lehetnek leader- vagy szignálszekvenciák, amelyek például immunglobulin-eredetű könnyűlánc szekvencián alapulnak, és amelyeket közvetlenül az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió csukló régiójához fuzionáltattunk. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, ha az Fc-régió IgG-eredetű szekvenciákon alapul, az Fc-régió 5'-3' irányban legalább egy immunglobulin-eredetű csukló régiót (azaz, legalább egy, második immunglobulin-eredetű csukló régió szekvenciával diszulfid híd kialakítására képes cisztein aminosavat tartalmazó
- 16 csukló régiót), immunglobulin-eredetű CDH2-domént és -HC3 domént kódol. Továbbá, az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát replikálható expressziós vektorba integrálhatjuk azért, hogy az Fc-fúziósfehérjét expresszálhasson, például, vagy bakteriális gazdában, vagy pedig a kiválasztott befogadóban, esetleg mindegyikben.
Úgy gondoljuk, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia önmagában, vagy Fc-adjuvánsfúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciával együtt történő beinjektálása sejtes- vagy humorális, illetve mindkét immunválasz létrejöttét eredményezi. Nukleinsav- és fehérjealapú immunizálások kombinálása (azaz, Fc-antigénfúziósf ehér j ét adunk be Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav beadása előtt, közben, vagy után), az egymásra gyakorolt szinergista hatás miatt, erősebb immunválaszt vált ki az előre kiválasztott antigénnel szemben, mint önmagában a nukleinsavval vagy a fehérjével végzett immunizálás esetén.
A találmány eddigi és további tárgyai, sajátságai és előnyei világosabbak lesznek a következő részletes leírás, ábrák és igénypontok segítségével.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányhoz tartozó ábrákat.
A találmány eddigi és további tárgyai, sajátságai és előnyei, illetve a találmány önmagában, jobban megérthetővé válik a találmány előnyös megvalósítási módjainak alábbi
- 17 leírásából, amennyiben a csatolt ábrákkal együtt kerülnek értelmezésre.
1A-1G. ábrák a találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas, példaként szolgáló Fc-fúziósfehérjék vázlatos bemutatása. Az 1A. ábra olyan Fc-antigén vagy Fcadjuváns-fúziósfehérjét képvisel, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót (1) az antigén vagy adjuváns (2) N-terminálisához rögzítettünk. Az 1B. ábra olyan Fc-antigén vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérjét képvisel, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót (1) az antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisához rögzítettünk. Az IC. és 1D. ábrák olyan dimer fehérjét mutatnak be, amelyben a polipeptid láncok egyike vagy mindkettő Fcantigén- vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérjét tartalmaz. Az IC. ábrán legalább egy polipeptid lánc, az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régió (1), az antigén vagy adjuváns (2) N-terminálisához van kapcsolva, az 1D. ábrán pedig az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) az antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisához van kapcsolva. Az 1E. ábra olyan dimer fehérjét mutat be, amelyben a polipeptidláncok egyike vagy mindkettő Fc-antigén-antigén-, Fc-adjuváns-adjuváns-, vagy adjuváns-Fc-antigén-fúziósfehérjét tartalmaz. Az 1F. ábra olyan dimer fúziós fehérjét mutat be, amelyben a polipeptid láncok egyike vagy mindkettő adjuváns-Fc-antigén- vagy antigén-Fc-adjuváns-fúziósfehérjét tartalmaz. Az 1G. ábra olyan dimer fúziós fehérjét mutat be, amelyben a polipeptid láncok egyike vagy mindkét
- 18 tő antigén-adjuváns-Fc- vagy adjuváns-antigén-Fc-fúziósfehérjét tartalmaz.
A 2A-2B. ábrák a találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas DNS-szekvenciákat mutatják be vázlatosan. A 2A. ábra emberi eredetű Fc-fúziósfehérje expressziós vektort mutat be. A 2B. ábra egéreredetű IgG 2a Fc-fúziósfehérje expressziójára szolgáló fúziós gént mutat be.
A 3A-3F. ábrák bemutatják a kémiai- és Fc-citokin adjuvánsok antitest-termelésre gyakorolt hatását az Fcantigén-fúziósfehérjével, illetve az egéreredetű Fc és emberi IL-4-receptor-ektodomén fúziójával előállított fehérjével (Fc-IL-4R-rel) immunizált egerek esetében. A 3A. ábra szerint, egereket immunizáltunk Fc-IL-4R-rel és Freund-féle komplett adjuvánsban (CFA) felvett Fc-IL-2-vel. A 3B. ábra szerint, egereket immunizáltunk foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) oldott Fc-IL-4R-rel. A 3C. ábra szerint, egereket immunizáltunk CFA-ban felvett Fc-IL-4R-rel. A 3D. ábra szerint, egereket immunizáltunk PBS-ben oldott Fc-IL-4Rrel és Fc-IL-2-vel. A 3E. ábra szerint, egereket immunizáltunk CFA-ban felvett Fc-IL-4R-rel és Fc-GMCSF-el. A 3F. ábra szerint, egereket immunizáltunk PBS-ben oldott Fc-IL-4Rrel és Fc-GMCSF-el. A 3A-3F. ábrákon, a négyzetek, trapézok és háromszögek három különálló egéren végzett vizsgálatnak felelnek meg. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISAval mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
- 19 A 4A-4D, ábrákat alkotó grafikonok, Fc-antigénfúziósfehérje formájában, emberi rákból származó antigénnel (PSMA-val) és adjuvánsként különböző mennyiségű Fc-GMCSF alkalmazásával egereken végzett immunizálás hatását mutatja be. A 4A. ábra szerint, az egerek immunizálása egyedül 50 μς Fc-PSMA fúziós fehérjével történt. A 4B. ábra szerint, az egerek immunizálása 50 μg Fc-PSMA fúziós fehérjével és adjuvánsként 0,05 μg Fc-GMCSF-fel történt. A 4C. ábra szerint, az egerek immunizálása 50 μς Fc-PSMA fúziós fehérjével és adjuvánsként 0,5 μσ Fc-GMCSF-fel történt. A 4D. ábra szerint, az egerek immunizálása 50 μg Fc-PSMA fúziós fehérjével és adjuvánsként 5 μg Fc-GMCSF-fel történt. A 4A-4D. ábrákon, a négyzetek, trapézok és háromszögek három különálló egéren végzett vizsgálatnak felelnek meg.
Az 5A-5F. ábrákon összehasonlítottuk a natív fehérjeként (5A-5C) vagy egéreredetű Fc és PSMA fúziós fehérjeként (5D-5F) beadott PSMA antigénnel szembeni specifikus antitest-válaszokat. Az 5A. ábra szerint, az egereket antigénként 50 μg PSMA-val immunizáltuk. Az 5B. ábra szerint, az egerek immunizálásában antigénként 50 μg PSMA-t adjuvánsként pedig 0,2 μg Fc-GMCSF-t alkalmaztunk. Az 5C. ábra szerint, az egerek immunizálásában antigénként 50 μg PSMA-t adjuvánsként pedig 0,5 μg Fc-GMCSF-t alkalmaztunk. Az 5D. ábra szerint, az egereket antigénként 50 μg Fc-PSMA-val immunizáltuk. Az 5E. ábra szerint, az egerek immunizálásában antigénként 50 μg Fc-PSMA-t adjuvánsként pedig 0,2 μg GMCSF-t alkalmaztunk. Az 5F. ábra szerint, az egerek immunizálásában antigénként 50 μg Fc-PSMA-t adjuvánsként pedig
- 20 0,5 μg Fc-GMCSF-t alkalmaztunk. Az 5A-5F. ábrákon, a négyzetek, trapézok és háromszögek három különálló egéren végzett vizsgálatnak felelnek meg. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISA-val mértük; az Y-tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
A 6. ábra grafikon, amelyen összehasonlítottuk az FcPSMA-val együtt beadott Fc-GMCSF illetve Fc-F3L, emberi PSMA elleni antitest képződésére gyakorolt hatását. Minden állatot vagy egyedül 50 μg Fc-PSMA-val, vagy 50 μg Fc-PSMA és adjuvánsként a jelzett Fc-citokin kombinációjával oltottunk. Kísérletenként három egeret teszteltünk.
A 7A-7B. ábrák olyan grafikonok, amelyek az Fc-EpCAM fúziós fehérje - önmagában vagy Fc-GMCSF adjuvánssal kombinálva - immunogenitását mutatja be az egyes egerek esetén. A 7A. és 7B. ábrák a rásegítő oltást követő 7. és 14. napon mért antitest-titereket mutatja be, megfelelően. A rásegítő oltást az elsődleges immunizálás után 3 héttel adtuk be. Mindkét ábrán, a üres trapézok egyedül 10 μς Fc-EpCAM-mal, szubkután végzett immunizálás eredményeit mutatják be, míg a telt háromszögek a 10 μg Fc-EpCAM-mal és adjuvánsként 1 μg Fc-GMCSF-fel végzett immunizálás eredményeit mutatják be. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISA-val mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
A 8A-8B. ábrák olyan grafikonok, amelyek az EpCAM-Fc (az Fc régió és az antigén fordított orientációban) fúziós fehérje - önmagában vagy Fc-GMCSF adjuvánssal kombinálva
- 21 immunogenitását mutatja be az egyes egerek esetén. A 8A. és 8B. ábrák a rásegítő oltást követő 14. és 21. napon (azaz a rásegítő oltás után Ί nappal) mért antitest-titereket mutatja be, megfelelően. Mindkét ábrán, az üres trapézok egyedül 25 μg EpCAM-Fc-vel, szubkután végzett immunizálás eredményeit mutatják be, míg a telt háromszögek a 25 μg EpCAM-Fc-vel és adjuvánsként 2,5 μg Fc-GMCSF-fel végzett immunizálás eredményeit mutatják be. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISA-val mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
A 9. ábra EpCAM-Fc-GMCSF fúziós fehérjét kódoló plazmid vektor kialakítását bemutató ábra. Ebben az esetben, az EpCAM antigént az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (Fc-régió) aminoterminális végével, míg a GMCSF adjuvánst az Fc-régió karboxiterminális végével fuzionáltattuk.
A 10A-10D. ábrák a hordozóanyagként PBS-ben vagy 25% szacharóz oldatban felvett, Fc-EpCAM fúziós fehérjét kódoló plazmiddal injektált egerek esetében mért antitesttitereket bemutató grafikonok. A 10A-10D. ábrák a kezdési injekciót követő 14, 27, 55 és 69 nap elteltével, megfelelően, mért antitest-titereket mutatják be. Ezen ábrákon, az üres trapézok PBS-ben oldott, Fc-EpCAM fúziós fehérjét kódoló plazmiddal injektált egyedi egereknél kapott Litereket, a telt háromszögek pedig a szacharózoldatban feloldott Fc-EpCAM fúziós fehérjét kódoló plazmiddal injektált egyedi egereknél kapott Litereket mutatja be. Az anti
- 22 gén elleni antitest szintjeit ELISA-val mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
A 11A-11B. ábrák DNS-sel végzett vakcinálással vagy fehérjeinjekcióval immunizált egerekből izolált lépsejtantigénnel végzett in vitro serkentésre adott válaszként történt 3H-timidin beépülés stimulációját mutatja be. A 11B. ábra a 11A. ábra alsó része adatainak felnagyított képét mutatja be. Az ábrákon a telt trapézok 100 μg, a CMVFc-EpCAM fúziós fehérjét kódoló, plazmid DNS-sel immunizált egerekből gyűjtött lépsejtek, az üres körök 100 μg, a CMVEpCAM-Fc-fúziósfehérjét kódoló, plazmid DNS-sel immunizált egerekből gyűjtött lépsejtek, míg a keresztek 10 μς FcEpCAM fehérjével immunizált egerekből gyűjtött lépsejtek esetében kapott eredményeknek felelnek meg. A lépet az egerekből a plazmid DNS-sel vagy fehérjével oltott és 3 hetes időközönként két rásegítő injekciót kapott egerekből, az első injekciót követő 70 nap múlva távolítottuk el.
A 12A-B. ábrák plazmid DNS-sel vagy Fc-EpCAM fehérjével immunizált egerek lépsejtjeinek alkalmazásával végzett citotoxikus T-limfocita (CTL) ölő esszét bemutató grafikonok. A 12A. ábra a lépsejteknek az emberi EpCAm fehérjét expresszáló, egéreredetű CT26 daganatsejtek elleni aktivitását mutatja be. A 12B. ábra a lépsejteknek a szülői, egéreredetű CT26 daganatsejtek elleni aktivitását mutatja be. Mindkét ábrán, az üres trapézok a (CMV-promóter)-FcEpCAM-fúzióskonstrukciót hordozó DNS-sel immunizált egerekből származó lépsejtek, az üres háromszögek a (CMV
- 23 promoter)-EpCAM-Fc fúziós konstrukciót hordozó DNS-sel immunizált egerekből származó lépsejtek, a keresztek pedig az Fc-EpCAM fúziós fehérjével immunizált egerekből származó lépsejtek esetében kapott eredményeknek felelnek meg. A CTL esszében alkalmazott, immunizált egerekből származó lépsejteket öt napig 10 U/ml IL-2-vel tenyésztettük. Jelzett célsejteket a kérdéses effektorokkal kevertük össze és négy órán át inkubáltuk. A specifikus lizis arányának kiszámítására a radioaktivitás felszabadulásának mértékét alkalmaztuk .
A 13. ábra 50 μg, PBS-ben oldott Fc-MCSP fúziós fehérjével, önmagában vagy adjuvánsként 5 μg Fc-GMCSF-vel kombinálva, immunizált egerekben mért antitest-titereket bemutató grafikon. A telt trapézok a normál szérumban, az üres körök az Fc-MCSP fúziós fehérjével önmagában immunizált egerek szérumában, a telt háromszögek pedig Fc-MCSP fúziós fehérje és adjuvánsként Fc-GMCSF kombinációjával immunizált egerek szérumában mért antitest-titereknek felelnek meg. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISA-val mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
A 14A-B. ábrák Fc-gp41pep-626 fúziós fehérjével, önmagában vagy Fc-citokin adjuvánssal kombinálva, immunizált egerekben mért antitest-titereket bemutató grafikon. A 14A. és 14B. ábrák a második rásegítő injekció utáni 7. és 33. napon mért antitest-titereket, megfelelően, mutatják be. Az ábrákon az üres trapézok 25 μς Fc-gp41pep-626 fúziós fehérjével önmagában, intradermális injekcióval immunizált ege
- 24 rek szérumában, az üres négyzetek 25 μα Fc gpílpep 626 an tigén és 2,5 μg Fc-GMCSF adjuváns kombinációjával immunizált egerek szérumában, a telt háromszögek pedig 25 μg Fc gp41pep-626 antigén és 2,5 μς Fc-IL2 adjuváns kombinációjával immunizált egerek szérumában mért antitest-titereknek felelnek meg. Az antigén elleni antitest szintjeit ELISAval mértük; az Y tengelyen feltüntetett értékek az ELISA mérésben leolvasott optikai sűrűséget jelzik.
Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány emlősökben humorális (azaz antitesten alapuló) vagy Th2-sejt által közvetített immunválaszok, sejtes vagy Thl-sejtek által közvetített irmiunválaszok, és bizonyos esetekben, mindkét immunválasz indukálása céljából, fehérje- vagy peptid-antigének hatékony ín vivo bevitelére irányul. Most már ismert, hogy az előre kiválasztott antigén és immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió fúziójával előállított Fc-antigén-fúziósfehérjével lehetséges fokozni az előre kiválasztott fehérje- vagy peptidantigén immunogenitását valamely emlősben. Az Fc-antigenfúziósfehérje, vagy az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvencia vakcina formájában beadható az emlősnek, például embernek, abból a célból, hogy az előre kiválasztott antigén ellen immunválaszt váltsunk ki.
Az Fc-antigén-fúziósfehérje szelektíven célbajuttatja az antigént az antigént bemutató sejtekhez (APC-k). Anélkül, hogy bármilyen elmélethez kötődnénk, úgy hisszük, hogy
- 25 az Fc-antigén-fúziósfehérje APC-khez való kötődése számos immunsejttípuson (ideértve például: a dendritikus sejteket, makróiágokat, B-sejteket, és granulocitákat) expresszált Fc-receptorok közvetítésével történik. Az Fc-antigén fúziósfehérje emlősbe történő beadása esetén Fc-receptorhoz kötődik, és ezután az Fc-antigén-fúziósfehérjét az APC-k endocitózis útján bekebelezik. A bekebelezett, előre kiválasztott antigént tartalmazó fúziós fehérje, elképzelésünk szerint rövid peptidekké degradálódik, amelyek azután a sejt felszínén bemutatásra kerülnek. A bemutatott peptidek ezután humorális és/vagy sejtes immunválaszt közvetítenek. A konkrét, stimulált immunválasz típusát modulálni lehet oly módon, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérjével együtt adjuvánst, például adjuváns-fúziósfehérjét, is beadunk.
A beadás egyik módja szerint, Fc-antigén-fúziósfehérjét adunk be a befogadónak. A beadás egy másik módja szerint, a befogadónak Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát adunk be. Az előre kiválasztott antigén, akár Fc-antigén fehérjeként adjuk be, akár pedig a beadott nukleinsav expressziója következtében jön létre, immunogénebb mint az antigén önmagában (azaz ha az antigén nincs polipeptid kötéssel immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióval fuzionáltatva) . Továbbá, bizonyos körül mények esetén, egymás után, fúziós fehérje beadását, ugyanazon fúziós fehérjét kódoló nukleinsav beadása követ, vagy esetleg, fúziós fehérjét kódoló nukleinsav beadását követi ugyanazon fúziós fehérje beadása, ezzel maximalizálhatjuk az előre kiválasztott antigén immunogenitását. Egyértelmű,
- 26 hogy optimális immunválasz akkor váltható ki, ha az Fcantigén-fúziósf ehér j e mindkét komponense aktív. Más szavakkal, az Fc-antigén-fúziósfehérjében az előre kiválasztott antigén képes immunválaszt kiváltani és az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régió képes az APC-k felszínén lévő Fc-receptorhoz kötődni.
Továbbá, ahogy a fentiekben tárgyaltuk, az előre kiválás ztott antigén ellen kiváltott immunválaszt modulálni lehet az Fc-antigén-fúziósfehérjével és/vagy az Fc-antigénfúziósf ehér j ét kódoló nukleinsavval együtt beadott specifi kus adjuvánsokkal. Bár kémiai adjuvánsok, például alum, vagy Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuvánsok, bizo nyos körülmények között, például állatgyógyászati alkalma zás esetén, alkalmazhatók a találmány gyakorlatba vétele során, azonban mellékhatásaik, például szövetkárositás, mi att emberi alkalmazásra nem elfogadhatók. Eszerint, előnyös adjuvánsok második Fc-fúziósfehérjét tartalmaznak, amely immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió és adjuvánsfehérje fuzionálásával előállított Fc-adjuváns-fúziósfehérje. Akárcsak az Fc-antigén-fúziósfehérje esetében, egyértelmű, hogy optimális immunválasz akkor váltható ki, ha az Fc-adjuváns-fúziósfehérje mindkét komponense aktív. Más szavakkal, az Fc-adjuváns-fúziósfehérjében az adjuváns képes immunválaszt modulálni és az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió képes az APC-k felszínén lévő Fcreceptorhoz kötődni.
- 27 A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, mind az antigént, és mind pedig az adjuvánst Fc-fúziósfehérjeként vagy az ilyen fúziós fehérjéket kódoló nukleinsavakat adjuk be. Más szavakkal, az antigént Fc-antigénfúziósf ehér j eként és az adjuvánst Fc-adjuváns-fúziósfehérjeként adjuk be. A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas Fc-fúziósfehérjéket mutatnak be az IÁIG. ábrák.
Az 1A. ábra példaként olyan Fc-fúziósfehérjét mutat be, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) C-terminálisa kapcsolódik, akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linkerrel, az előre kiválasztott antigén vagy adjuváns (2) N-terminálisához. A leírás szerinti értelemben, a polipeptid linker olyan, egy vagy több aminosavból álló szekvencia, amely két fehérjét összekapcsol. A polipeptid linker gyakran körülbelül 10-15 aminosav hosszúságú sorozat, amely például ismétlődő glicin és/vagy szerin aminosavakat tartalmaz. Az 1B. ábra példaként olyan Fcfúziósfehérjét mutat be, amelyben az előre kiválasztott antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisa, akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, immunglobulineredetű nehézlánc konstans régió (1) N-terminálisához kapcsolódik.
Az IC. ábra két diszulfid híddal kovalensen összekapcsolt két Fc-fúziósfehérjét tartalmazó dimerkonstrukciót mutat be. A dimerkonstrukció két Fc-fúziósfehérjét tartalmaz, amelyekben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans
- 28 régió (1) C-terminálisát az előre kiválasztott antigén vagy adjuváns (2) N-terminálisához kapcsoltuk. Ehhez hasonlóan, az 1D. ábra két diszulfid híddal kovalensen összekapcsolt két Fc-fúziósfehérjét tartalmazó dimerkonstrukciót mutat be. A dimerkonstrukció két Fc-fúziósfehérjét tartalmaz, amelyekben az előre kiválasztott antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisát az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) N-terminálisához kapcsoltuk.
Az 1E. ábra két diszulfid híddal kovalensen összekapcsolt két Fc-fúziósfehérjét tartalmazó dimerkonstrukciót mutat be. A dimerkonstrukció két Fc-fúziósfehérjét tartalmaz, amelyekben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) C-terminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, az előre kiválasztott antigén vagy adjuváns (2) N-terminálisához, és ennek Cterminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, egy második antigénhez vagy adjuvánshoz (2') kapcsoltunk.
Az 1F. ábra is két diszulfid híddal kovalensen összekapcsolt két Fc-fúziósfehérjét tartalmazó dimerkonstrukciót mutat be. A dimerkonstrukció két Fc-fúziósfehérjét tartalmaz, amelyekben az antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) N-terminálisához és ennek C-terminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, egy második antigén vagy adjuváns (2') N-terminálisához kapcsoltunk. Például, ilyen fúziós fehérje tartalmazhat, N-terminális C
- 29 terminális irányban, előre kiválasztott antigén immun globulin-eredetű nehézlánc konstans régió - adjuváns konstrukciót.
Az 1G. ábra is két diszulfid híddal kovalensen összekapcsolt két Fc-fúziósfehérjét tartalmazó dimerkonstrukciót mutat be. A dimerkonstrukció két Fc-fúziósfehérjét tartalmaz, amelyekben antigén vagy adjuváns (2) C-terminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, egy másik, az előzőtől különböző adjuváns vagy antigén (2') N-terminálisához, és ennek C-terminálisát akár közvetlenül, akár pedig polipeptid linker segítségével, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió (1) Nterminálisához kapcsoltunk. Például, ilyen fúziós fehérje tartalmazhat, N-terminális C-terminális irányban, előre kiválasztott antigén - adjuváns - immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió konstrukciót.
A találmány gyakorlatba vétele szempontjából általában előnyös, ha az Fc-fragmentumot az adjuvánsfragmentumhoz képest N-terminális pozícióba helyezzük. Amennyiben az adjuvánsfragmentumot helyezzük az Fc-fragmentumhoz képest N-terminális pozícióba, az adjuváns-Fc fúzió valamely immunsejten lévő adjuváns receptorhoz kötődhet és az Fc fragmentum olyan orientációban lesz, mint amikor antitest kötődik a sejtfelszínhez, és ez ADCC- vagy komplementkötést eredményezhet. Azonban, ha az Fc-fragmentumot helyezzük az adjuvánsfragmentumhoz képest N-terminális pozícióba, ez feltehetően ADCC- és komplementkötést nem eredményez.
- 30 AZ ic~lG. ábrákon bemutatott konstrukciók ellentétes csukló régiókon lévő ciszteinek közötti diszulfid-kotespárral keresztkötött dimereket illusztrálnak. A rajzokon vázolt diszulfid hidak immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió részeit kapcsolják össze az e molekulákra natív állapotban jellemző csukló régiók segítségével. Annak ellenére, hogy immunglobulin-eredetű csukló régiókat tartalmazó konstrukciók az előnyösek, a találmány oltalmi körébe tartoznak azok a konstrukciók is, amelyek esetében a keresztkötésre más pozíciókat választottak. Továbbá, bizonyos esetekben, két vagy több monomert nem kovalens úton is össze lehet kapcsolni a találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas dinerek vagy multimerek kialakítása célj ából.
A leírás szerinti értelemben az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régió és az ezzel felcserélhetően alkalmazható Fc-régió kifejezés az inmunglobulineredetű nehézlánc konstans régió karboxiterminális részét, vagy annak analógját vagy olyan részét, amely képes Fcreceptorhoz kötődni, jelenti. Ismert, hogy minden egyes immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió négy vagy öt domént tartalmaz. A domének egymás után az alábbiak szerint nevezték el: CHl-csukló-CH2-CH3(-CH4). A CH4, a csukló régióval egyébként nem rendelkező, IgM-ben található meg. A találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió előnyösen immunglobulin-eredetű csukló régiót, és előnyösen CH3-domént is tartalmaz. Az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans ré
- 31 gió legelőnyösebben immunglobulin-eredetű csukló régiót, CH2-domént és CH3-domént tartalmaz. A leírás szerinti értelemben az immunglobulin-eredetű „csukló régió jelenti a teljes immunglobulin-eredetű csukló régiót, illetve az immunglobulin-eredetű csukló régió azon részét, amely elégséges ahhoz, hogy közte és egy másik immunglobulin-eredetű csukló régió között egy vagy több diszulfid kötés jöjjön létre.
Úgy gondoljuk, hogy bár alkalmas immunglobulin eredetű nehézlánc konstans régiók származhatnak az IgA, IgD, IgE, IgD és IgM immunglobulin osztályok bármelyikébe tartozó antitestekből, azonban előnyösek az IgG osztályból származó immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiók. Továbbá, úgy gondoljuk, hogy az immunglobulin-eredetű ne hézlánc konstans régiók származhatnak az IgG antitest alosztályok, azaz a technikában IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4 néven ismert alosztályok, bármelyikéből.
Az egyes immunglobulin osztályokba tartozó immunglo bulin-eredetű nehézlánc konstans régiók között kereszthomológia áll fenn. Például, az IgG CH2-doménja homológ az IgA és IgD osztályok CH2-doménjével, illetve az IgM és IgE osztályok CH3-doménjével. Előnyös immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiók tartalmaznak IgG-eredetű CH2-régiót vagy CH3-régiót, illetve azok funkcionális részeit vagy származékait. Az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiókból, azonban, előnyösen legalább a CHl-domén hiány zik. Továbbá, az Fc-antigén vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérj ék, igény szerint, nem tartalmaznak immunglobulin
- 32 eredetű variábilis régiót. A találmány előnyösebb megvalósítási módja szerint, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió tartalmaz, N-terminális C-terminális irány ban, immunglobulin-eredetű csukló régiót, CH2-domént és CH3-domént, amelyek mindegyike IgG molekulából származó szekvencián alapul. A megfelelő immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió szekvenciák kiválasztását részletesen taglalja az 5.541.087 sz. és a 5.726.044 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. Bizonyos immunglobulin osztályokból és alosztályokból, egy konkrét cél elérésére szolgáló előnyös immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió szekvenciákat, megítélésünk szerint, a szakember ki tudja választani.
Bizonyos körülmények között hasznos lehet, ha - például mutációval, delécióval vagy más, génsebészeti eljárás, illetve egyéb megközelítések útján - módosítjuk az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót oly módon, hogy bizonyos aktivitások - mint például komplementkötés vagy antitesttől függő sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) stimulációja - lecsökkenjenek vagy megszűnjenek. Azonban, szükségesnek véljük, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió megtartsa Fc-receptort kötő képességét.
A találmány gyakorlatba vétele szempontjából, az Fcantigén vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérje irrmunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióból álló komponense előnyösen nem immunogén vagy gyengén immunogén hatást fejt ki a kiválasztott befogadóban. Az Fc régiót akkor tekintjük nem immunogénnek vagy gyengén immunogénnek, ha az immunglobu
- 33 lm eredetű nehézlánc konstans régió nem vált ki kimutatható, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió ellen irányuló antitestválaszt. Eszerint, az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régiónak, a fúziós fehérjét befogadóval megegyező fajban jelenlévő immunglobulinból kell származnia, illetve a fúziós fehérjét befogadóval megegyező fajban jelenlévő immunglobulinnak megfelelő aminosavszekvenciákon kell alapulnia. Más szavakkal, emberi immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió szekvenciákat kell alkalmazni akkor, ha az Fc fúziós konstrukciót (az Fcantigén és/vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérjét) embernek szándékozzuk beadni. Emberi eredetű Fc IgG nukleotid- és aminosav-szekvenciát ismertet, például, Ellison és mtsai. publikációja [Nucl. Acid Res. 10, 4071-4079 (1982)]. Ehhez hasonlóan, egéreredetű Fc-szekvenciát kell alkalmazni, ha az Fc fúziót egérnek szándékozzuk beadni. Egéreredetű Fc IgG2a nukleotid- és aminosav-szekvenciát ismertet, például, Bourgois és mtsai. publikációja [Eur. J. Biochem., 43, 423435 (1974)]. Ez a logika alkalmazható, ha az Fcfúziósfehérjét más állatoknak, így háziállatoknak (például macskáknak és kutyáknak), és háztáji állatoknak (például teheneknek és lovaknak) szándékozzuk beadni.
A leírás szerinti értelemben, az előre kiválasztott antigén kifejezés jelent bármilyen fehérjét vagy annak fragmentumát, illetve bármilyen polipeptidet, amely - önmagában vagy más reagensekkel kombinálva - emlősben immunválaszt képes indukálni. Úgy gondoljuk, hogy bármilyen kérdéses, előre kiválasztott antigén részét képezheti a talál
- 34 mány szerinti Fc-antigén-fúziósfehérjének. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, az előre kiválasztott antigén az alábbiak bármelyike lehet: prosztatára specifikus, membráneredetű antigén (PSMA) , citokinreceptor ektodoménje (például az emberi IL-4 receptor ektodoménje), daganatspecifikus antigén (például, daganatsejtekben a normális sejtekhez képest felülszabályzott vagy megnövelt szinten jelenlévő antigén), és vírusfehérje (például, az emberi immunhiányt okozó vírus, HÍV, genomja által kódolt fehérje).
A leírás szerinti értelemben, az adjuváns kifejezés jelent bármely olyan anyagot, amely immunmodulátorként képes hatni, azaz például képes (akár humorális akár pedig sejtes) immunválaszt fokozni az előre kiválasztott antigén ellen. A leírás szerinti értelemben, a humorális kifejezés testfolyadékokban, például plazmában és nyirokban, lévő antitestek által közvetített immunitást, míg a sejtes kifejezés, amely a technikában még sejt által közvetített immunitás-ként is ismert, pedig T-limfociták által beindított, és effektor T-limfociták és/vagy makrofágok által közvetített immunológiai reakciókat jelent.
A fentiekben tárgyaltak szerint, állatok immunizálásában különféle kémiai adjuvánsok, például Freund-féle komplett adjuváns, alkalmazhatók. Bár ezeket állatokban széles körben alkalmazzák magas antitest-titerek vagy jelentős citotoxikus T-limfocita (CTL) válaszok elérésére, mellékhatásaik (például szövetroncsolás) folytán emberi alkalmazásra nem elfogadhatóak. Ezért igény mutatkozik olyan, erős immunválasz indukálására, amelynél az oltás nem jár az
- 35 oltás helyén bekövetkező gyulladással. A találmány szerinti Fc-adjuváns-fúziósfehérje egyik jól megkülönböztethető előnye az, hogy erős immunválasz kiváltására képes anélkül, hogy kémiai adjuvánst, például Freund-féle adjuvánst, kellene alkalmazni.
A találmány gyakorlatba vétele szempontjából előnyös adjuvánsok Fc-adjuváns-fúziósfehérjét vagy az azt kódoló nukleinsavat tartalmaznak. Az Fc-fúziósfehérjékbe beépíthető, előnyös adjuváns fehérjék közé citokinek tartoznak. A leírás szerinti értelemben, a citokin kifejezés jelent bármilyen olyan fehérje- vagy peptidanalógot, illetve azok funkcionális fragmentumát, amely képes az immunsejtek például: T-sejtek, B-sejtek, makrofágok, neutorfilek, eozinofilek, bazofilek, dendritikus sejtek, és ezek prekurzorai — aktivitásának modulálására emlősben. Előnyös citokinek közé tartoznak például az alábbiak: IFN-α, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF és GMCSF. A CD40 ligandum extracelluláris doménje is előnyös fehérje arra a célra, hogy az Fc-vel fuzionáltatva Fc-adjuvánst állítsunk elő. Fc-adjuvánssal történő beadás esetén, az Fc-antigénfúziósfehérje antigénje erősebb immunválaszt vált ki, mint amikor az Fc-antigén-fúziósfehérjét az Fc-adjuvánsfúziósfehér je nélkül adjuk be. Bizonyos esetekben, az Fc adjuvánssal és az Fc-antigénnel végzett két immunizálással elérhető antitest-szint éppoly magas, vagy magasabb, mint ami Freund-féle adjuvánssal elérhető, és eközben nincsenek kimutatható bőrreakciók.
- 36 Az Fc-antigén- vagy az Fc-adjuváns-fúziósfehérjékben lévő immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiókhoz hasonlóan az adjuváns fehérje is nem vagy csak gyengén immunogén tulajdonságú a befogadóban. Ezt oly módon teljesíthetjük, hogy az Fc-adjuváns-fúziósfehérjékbe a befogadóval azonos fajból izolálható citokineknek megfelelő aminosav-szekvenciák által meghatározott citokineket építünk be. Például, ha az Fc-adjuváns-fúziósfehérjét embernek szándékozzuk beadni, az adjuváns fehérje (például citokin) előnyösen emberi eredetű.
Az Fc-antigén- és Fc-adjuváns-fúziósfehérjék együttes beadásával, akár szimultán akár pedig egyiket a másik után, modulálhatjuk az előre kiválasztott antigén elleni immunválasz típusát. Különböző fertőzések hatására két osztályba sorolt, Thl-nek, illetve Th2-nek nevezett, immunválasz indul be, és ezen immunválaszokban különféle citokinek vesznek részt. A Thl által közvetített immunválasz természetét tekintve celluláris immunválasz, míg a Th2 által közvetített válasz humorális természetű. Eszerint, Thl-válasz megváltozott sejtek, például rákos sejtek vagy vírusfertőzött sejtek, megtámadására alkalmazható, míg a Th2-válasz extracelluláris ágensek, mint például paraziták, ellen alkalmazható. Gyakran hasznos, ha immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiójával fuzionáltatott citokineket is beadunk, mivel ezzel általános immunválaszt stimulálhatunk, vagy specifikus Thl- vagy Th2-válaszokat indíthatunk be, illetve modulálhatunk.
- 37 Továbbá, Fc-adjuváns-fúziósfehérjében lévő konkrét citokin kiválasztása hatással lehet az Fc-antigénfúziósfehérjében lévő, előre kiválasztott antigén ellen termelődött antitest-osztályokra. Például, IL-12 helper Tsejtválaszt serkent a Thl-citokinek (például IFN-α, IL-2, és TNF) termelődésének serkentésével, amely előmozdítja a potens sejtes immunitást és serkenti az IgG2a osztályba sorolt antitestek termelődését. Ezzel szemben, Fc-IL-4 a Th2citokinek (például, IL-5, IL-6, IL-10 és IL-4) előállítását serkenti, amelyek a humorális immunitást mozdítják elő.
A fentiekben tárgyaltak szerint, a találmány előnyös megvalósítási módjában az eljárás az Fc-antigén-fúziósfehérje vagy az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav és Fc-adjuváns-fúziósfehérje kombinációjának beadását tartalmazza. Két fúziós fehérje alkalmazásával - amelyek mindegyike immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót tartalmaz - lehetővé válik mind az előre kiválasztott antigén, mind pedig az adjuváns fehérje (például citokin) együttes lokalizációja ugyanazon vagy hasonló sejttípusokba az emlősben. Például makrofágok, B-sejtek, granulociták és dendritikus sejtek expresszálnak felszínükre Fc-receptorokat. Eszerint, Fc-antigén- és - Fc-receptorhoz kötődni képes - Fc-adjuváns-fúziósfehérje együttes beadásával, lehetővé válik az antigén-fúziósfehérje antigénjének és az adjuváns-fúziósfehérje adjuvánsának együttes lokalizációja az APC-k ugyanazon celluláris kompartmentumába. Az adjuváns ekkor fokozhatja, vagy más módon modulálhatja az immunva
- 38 laszt az előre kiválasztott antigén közvetlen környezetében .
Fc-citokinek kombinációit szinergista módon alkalmazni lehet általános válasz serkentése céljából, és ezáltal hatást gyakorolni arra, hogy sejtes (Thl) vagy pedig humorális (Th2) válasz jöjjön létre. Azonban, abból a célból, hogy a választ inkább a sejtes vagy Thl által közvetített immunitás irányába tereljük, Fc-IL-12 vagy Fc-IFN-a adjuvánsfehérj ét, például Fc-GMCSF-fel együtt adhatunk be. Azonban, abból a célból, hogy inkább humorális vagy Th2 által közvetített választ váltsunk ki, Fc-IL-4 adjuvánsfehérj ét, például Fc-GMCSF-fel együtt adunk be. A kívánt fiziológiai válasz pontos természetétől függően, Fc-vel kialakított fúzió formájában egyéb, Thl- vagy Th2-választ előmozdító, citokineket is alkalmazhatunk. Úgy gondoljuk, hogy ezen általános megközelítés alkalmazható már meglévő kóros válaszok, mint például autoimmunitás (Thl által közvetített betegség) és allergia (Th2 által közvetített betegség) modulálására is oly módon, hogy az ellenkező Thtípusra történő immunizálással a választ egy konkrét antigén irányába toljuk el, az ártalmastól távolodva.
Bizonyos körülmények között, ha Fc-antigén-fúziósfehérjével immunizálunk állatot hasznos, ha adjuvánsként nukleinsavat alkalmazunk. Nukleinsavak, például citozinfoszfodiészter kötés-guanozin (CpG) fragmentumokat tartalmazó oligonukleotidokkal feldúsított szekvenciák, az immunválaszt THl-válasz felé tudják terelni, és igény szerint más adjuvánsokkal, például citokinekkel, kombinálva lehet
- 39 ezeket alkalmazni [lásd például: Brazolot és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15553-15558 (1998); Liu és mtsai., Blood 92, 3730-3736 (1998); Klinman és mtsai., Immunoi. 158, 3635-3639 (1997)]. Eszerint, úgy gondoljuk, hogy CpG-t tartalmazó oligonukleotidokat Fc-antigén-fúziósfehérjével együtt lehet beadni abból a célból, hogy fokozott és megfelelőképpen modulált immunválaszt érjünk el. Ilyen nukleinsav molekulák bármilyen hosszúságúak lehetnek, azonban előnyösek a 8 nukleotidnál hosszabb nukleotidok. A nukleinsavszekvenciák előnyösen tartalmazzák a CpG szekvenciát, a szekvencia előnyösebben purin-porin-C-G-pirimidinpirimidin, amelyben a központi CpG-ben levő citozinok nem metiláltak. Az adjuváns DNS-ben a CpG-szekvenciák gyakorisága előnyösen legalább 5%-os, előnyösebben körülbelül 10%os. Például, a TCC ATG ACG TTC CTG AGG TT oligodeoxinukleotid (a szekvencialistában 22. azonosítószámon megadott szekvencia) kettősszálú formáját adjuvánsként alkalmazni lehet. A kívánt immunválasz típusának függvényében, hasznos lehet, ha a nukleinsavat alummal kombináljuk.
A találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas Fc-fúziósfehérjék előállítására a találmány konvencionális rekombináns DNS eljárásokat alkalmaz. Az Fc fúziós konstrukciókat előnyösen a DNS szinten állítjuk elő, és az eredményül kapott DNS-eket expressziós vektorokba integráljuk, és az Fc-antigén- vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérjék előállítása céljából expresszáljuk. A leírás szerinti értelemben, a vektor kifejezés bármilyen olyan nukleinsavat jelent, amely gazdasejtbe történő beépülésre, a gazdasejt genom
- 40 jával rekombinációra, illetve a gazdasejt genomjába történő beépülésre alkalmas nukleotidszekvenciát tartalmaz, vagy képes episzómaként autonóm módon replikálódni. Ilyen vektorok közé tartoznak lineáris nukleinsavak, plazmidok, fagemidek, kozmidok, RNS-vektorok, vírusvektorok, és hasonlók. A vírusvektorok, a találmányt semmiben sem korlátozó példái közé tartoznak retrovírusok, adenovirusok, és adenoasszociált vírusok. A leírás szerinti értelemben, a génexpresszió vagy valamely Fc-fúziósfehérje expresszió-ja kifejezés a DNS-szekvencia transzkripcióját, a mRNS transzkriptum transzlációját, és Fc-fúziósfehér jetermék szekrécióját jelenti. Mindegyik, IL-2-t, CD26-ot, Tat-ot, Rev-et, OSF-2-t, bIG-H3-at, IgE receptort, PSMA-t, vagy gp 120-at tartalmazó fúziós fehérjét az itt tárgyalt típusú expressziós rendszer alkalmazásával expresszáltuk. Azonos vagy hasonló expressziós konstrukciókat ismertetnek az 5.541.087 sz. és 5.726.044 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban.
Génsebészeti eljárásokkal végzett fehérjefúziók mellett, alternatív lehetőségként kémiai keresztkötő vegyúletekkel végzett kémiai konjugációval is fuzionáltathatunk fehérj efragmentumokat.
A találmány gyakorlatba vétele során alkalmazható alapvektorok szelektálható markert, például az SV40 vírusból származó transzkripciós regulációs szekvenciákkal meghajtott dihidrofolát reduktázt (DHFR) kódoló gént, és a plazmid E. coliban történő tenyésztése és szelektálása céljából bakteriális plazmidszekvenciákat tartalmaznak. Az Fc
- 41 fúziósfehérje szekvenciák expresszióját promoter és igény szerint — enhancer szekvenciákkal, például a citomegalovirus (CMV) promoter- és enhancer szekvenciákkal, hajtjuk meg.
Ha az Fc-fúziósfehérjét vagy az ilyen fúziós fehérjét kódoló nukleinsavat embernek szándékozzuk beadni, az Fcfúziósfehér j ét kódoló szekvenciák 5' - 3' irányban előnyösen az alábbi szekvenciákkal kezdődnek: leader szekvencia, amely például antitest könnyűláncból (L) származik, ezt leolvasási keretben — előnyösen az emberi immunglobulin gl gén Fcal régiójából származó - immunglobulin-eredetű nehézláncnak vagy annak mutáns formájának legalább egy részéhez fuzionálhattuk. Az immunglobulin Fcal gén Fcal régiója előnyösen a csukló dómén legalább egy részét és CH3 domént tartalmaz, előnyösebben a csukló dómén legalább egy részét, CH2-domént és CH3-domént tartalmaz. Amennyiben az Fc-fúziósfehérjét egérnek kívánjuk beadni, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót kódoló előnyös nukle insav-szekvenciák 5' - 3' irányban előnyösen az alábbi fe hérjéket kódoló nukleinsav-szekvenciákat tartalmazzák, egéreredetű IgG2a antitestből származó csukló régió, CH2domén és CH3-domén. Az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió karboxiterminálisa, szükség esetén, nuklein sav szinten módosítható, vagy az előre kiválasztott antigént (Fc-antigén esetében) vagy immunstimulációs citokint (Fc-adjuváns citokin esetében) kódoló szekvenciákkal, leolvasási keretben történő ligáció céljából. A szekréciós ka
- 42 zettát kódoló DNS genomi konfigurációban vagy cDNS konfigu rációban lehet.
A DNS-nek a szignálszekvenciát kódoló része előnyösen kódolja az Fc-fúziósfehérje szekrécióját irányító és a szekréciót követően, az Fc-fúziósfehérje fennmaradó részéről lehasadó peptidszegmenst kódolja. A találmány szerinti szignálszekvencia olyan polinukleotid, amely az endoplazmatikus retikulum membránján keresztül történő fehérjetranszportot beindító aminosav-szekvenciát kódolja. A ta lálmány szempontjából alkalmas szignálszekvenciák közé tar toznak antitest-eredetű könnyűlánc-szignálszekvenciák, például 14.18 sz. antitest [Gillies és mtsai., J. Immunoi. Meth. 125, 191 (1989)], antitest-eredetű nehézlánc szignálszekvenciák, például a M0PC141 antitestből származó nehézlánc szignálszekvencia [Sakano és mtsai., Nature 286, 5774 (1980)], és bármely más, a technikában ismert szignálszekvencia [lásd például, Watson, Nucl. Acid Res. 12, 5145 (1984)] .
A szignálszekvenciákat technikában jól leírták és ismert ezekről, hogy jellemzően 16-30 aminosavból állnak, azonban állhatnak ennél több vagy kevesebb aminosavból is. Egy jellemző szignálpeptid három régiót tartalmaz: bázikus N-terminális régiót, központi hidrofób régiót, és polárosabb C-terminális régiót. A 4-12 hidrofób aminosavat tartalmazó központi hidrofób régió, a nascens polipeptid transzportja során, a szignálpeptidet lehorgonyozza a membrán kettős lipidrétegén keresztül. A beindítást követően, az endoplazmatikus retikulum üregén belül a szignálpeptidet
- 43 bizonyos, szignálpeptidázok néven ismert, celluláris enzi mek általában lehasítják. A szignálpeptidek potenciális hasítóhelyei általában megfelelnek a (-3, -1) szabálynak. így egy jellemző szignálpeptidben kis, semleges aminosavak helyezkednek el a -1 és -3 pozíciókban, és ebben a régióban nincs prolin. A szignálpeptidáz ilyen szignálpeptidet a —1 és +1 aminosavak között hasit. Tehát, a szignálszekvencia lehasadhat a fúziós fehérje aminoterminális végéről a szekréció során. Ennek eredményeként szekretálódik az Fc-fúziósfehérje. A találmány gyakorlatba vétele szempontjából alkalmas szignálpeptid-szekvenciák a technikában jól ismertek [lásd például, Heijne, Nucl. Acid Res. 14, 4683 (1986)].
A szakember számára egyértelművé válik, hogy egy konkrét szignálszekvencia szekréciós kazettában való alkalmazhatóságának eldöntése bizonyos rutin kísérletes munkát igényelhet. Ilyen kísérletes munka magában foglalhatja a szignálszekvencia azon képességének meghatározását, hogy a szekvencia képes-e az Fc—fúziósfehérje szekrécióját irányi tani és/vagy az alkalmazni kívánt szekvencia optimális konfigurációjának, genomi vagy cDNS, meghatározását abból a célból, hogy hatékony Fc-fúziósfehérje szekréciót érhessünk el. Ezenfelül, a Heinje szabályt (lásd fent) követve a szakember rutin kísérletezéssel képes szintetikus szignál peptidet előállítani és az ilyen szintetikus szignálszek venciák hatékonyságát tesztelni. A szignálszekvencia , szignálpeptid, leader szekvencia, vagy leader peptidek egymással felcserélhetően alkalmazhatók.
- 44 Úgy gondoljuk, hogy az Fc-fúziósfehérjék vagy az Fcfúziósfehér j éket kódoló nukleinsav-szekvenciák beadásának különböző módjait alkalmazni lehet valamely befogadót az előre kiválasztott antigén ellen immunizálni. A találmány két, különböző alkalmazásával CTL-válszt generálhatunk: az egyik eljárás az Fc-antigén-fúziósfehérjét kódoló DNS injektálásán, míg a másik a fehérjét az MHC I. osztály útvonalához szállítani képes Fc-antigén-fúziósfehérje beadásán alapul.
A fehérje-antigének injektálását jellemzően alkalmazzák immunválasz kiváltására emlősben. Azonban, a találmány tárgyát olyan eljárások is képezik, amelyek során DNS injektálással APC-khez antigént szállítunk. Általános alkal mázott eljárás anatigén-fehérjéket kódoló DNS expressziós vektorokat izomba injektálunk. Különféle jelentések szerint azonban, annak ellenére, hogy az izomsejtek expresszálják a fehérje-antigént, az antigént ezek a sejtek az immunrendszernek nem mutatják be. Ezzel szemben, úgy hisszük, hogy specializált APC-k, például makrofágok és dendritikus sejtek, vándorolnak az injektálás helyére, ott az antigént felveszik és bemutatják egy általunk meg nem tisztázott folyamaton keresztül. Fc—antigén—fúziosfehérje expressziós vektorok alkalmazása e folyamatot hatékonyabbá teszi, mivel a szekretált fúziós fehérje a natív antigén-fehérjénél hatékonyabban kötődik az APC-khez.
A DNS-injektálási megközelítés egyik következménye az, hogy gyakran eredményezi mind a humorális, és mind pedig a celluláris válaszok generálását. Jellemzően, exogén
- 45 módon beadott fehérjéknek sokkal bonyolultabb bejutnia az MHC I. osztály molekulákon történő bemutatás útvonalába. Mindazonáltal, a találmány szerinti Fc-fúziósfehérjék beadása fokozza a citotoxikus sejtek generálását, valószínűleg az előre kiválasztott, exogén eredetű antigén az MHC I. osztály molekulákon történő bemutatása folytán. DNS-sel és fehérjével végzett immunizációk kombinálásai gyakran szinergista módon működnek: először beindítják az immunrendszert, majd pedig mind az antitest termelés és mind pedig a citotoxikus sejtek generálása formájában a válaszok szintjét megnövelik. Fc-adjuváns-fúziósfehérje, például FcIL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12, és Fc-Flt3 ligandum, és az Fcantigén-fúziósfehérje együttes beadása biztosítja a fúziós fehérjék együttes lokalizációját az APC-k ugyanazon celluláris kompartmenumába, és ezáltal sokkal potensebb immunválaszt stimulálnak az előre kiválasztott antigénnel szemben.
A találmány szerinti készítmények (azaz Fc-antigén és/vagy Fc-adjuváns-fúziósfehérjék, vagy ilyen fúziós fehérjéket kódoló nukleinsav-szekvenciák) állatoknak bármilyen alkalmas módon, közvetlenül (például, lokálisan injekcióként, inplantátumként vagy topikálisan valamely szövet helyén) vagy szisztemikusan (például parenterálisan vagy orálisan) beadhatók. Amennyiben a készítményt parenterálisan (így például, intravénásán, szubkután, szemen keresztül, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szájüregen keresztül, végbélen, vaginán, intraorbitálisan, transzdermálisan, intracerebrálisan, intrakraniálisan,
- 46 intraspinalisan, intraventrikulárisan, intratracheálisan, intraciszternálisan, intrakapszulárisan, orron keresztül vagy aeroszol alkalmazásával) adjuk be, a készítmény előnyösen részben vizes vagy fiziológiailag elfogadható folyadékszuszpenziót vagy oldatot is tartalmaz. Tehát, a hordozó- vagy vivőanyag fiziológiailag elfogadott, így azon felül, hogy elősegíti a kívánt komponens bejuttatását a páciensbe, nem gyakorol káros hatást a páciens elektrolit és/vagy folyadékegyensúlyára. így, az ágenssel alkalmazható folyékony közeg tartalmazhat normális fiziológiai sóoldatot (például, 9,85%-os vizes NaCl oldatot, pH 7-7,4).
Az Fc-antigén-fúziósfehérje beadásonként! dózisai előnyösen az 50 ng/m2-től 1 g/m2-ig terjedő tartományba, előnyösebben 5 μg/m2-től 200 mg/m2-ig terjedő tartományba, és legelőnyösebben a 0,1 mg/m2-től 50 mg/m2-ig terjedő tartományba esnek. Az Fc-adjuváns-fúziósfehérje beadásonként! dózisai előnyösen az 1 ng/m2-től 0,1 g/m2-ig terjedő tartományba, előnyösebben 0,5 μg/m2-től 20 mg/m2-ig terjedő tartományba, és legelőnyösebben a 10 μg/m2-től 5 mg/m2-ig terjedő tartományba esnek. Az Fc-antigén- vagy Fc-adjuvánsfúziósfehér j ét kódoló nukleinsavak beadásonként! dózisai előnyösen az 1 μg/m2-től 100 mg/m2-ig terjedő tartományba, előnyösebben 20 μg/m2-től 10 mg/mz-ig terjedő tartományba, és legelőnyösebben a 400 μg/m2-től 4 mg/m2-ig terjedő tartományba esnek.
Úgy gondoljuk, hogy maximális immunizációt számos, egymástól elválasztott immunizációval - például egy-három oltás 1 hónaptól 3 hétig terjedő időtartamonként - érhetünk
- 47 el. Továbbá, a fentiekben tárgyaltak szerint, maximális immunválaszt olyan körülmények esetén érhetünk el, ha az Fcfúziósfehérjéket és az ilyen Fc-fúziósfehérjéket kódoló nukleinsavakat felváltva adjuk be. Úgy gondoljuk, hogy az Fc-antigén-fúziósfehérje vagy a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav beadható az emlősnek beadni szándékozott Fcadjuváns-fúziósfehérje, illetve az Fc-adjuváns-fúziósfehérjét kódoló nukleinsav beadása előtt, után , vagy az Fc-antigén-fúziósfehérjével szimultán. Úgy gondoljuk azonban, hogy a beadás optimális módjának, a dozirozásnak és a rásegítő injekciók beadási rendjének meghatározását a szakember rutin kísérletes munkával képes meghatározni.
A találmányt az alábbi, a találmányt semmiben sem korlátozó példák segítségével tovább illusztráljuk.
Példák
1. példa
Fc-antigén- és Fc-adjuváns expressziós vektorok előállítása
Abból a célból, az Fc-fúziósfehérjék immunogenitását egér modellen teszteljük, egéreredetű IgG2a Fc-régiókat kódoló nukleinsav-szekvenciák alkalmazásával expressziós vektort állítottunk elő. Ezzel lecsökken annak kockázata, hogy az egyes fúziós fehérjékben lévő Fc-régiók az emlősben immunválaszt indukáljanak. Továbbá, az Fc-adjuváns fúziós konstrukciókban fúziós partnerként egéreredetű citokineket alkalmaztunk, miután ezek biológiai aktivitása magasan faj specifikus lehet. így, a korábbiakban leírt vektorokat
- 48 [Lo és mtsai . , Prot. Eng. 11, 495-500 (1998)] úgy módosítottuk (lásd 2. ábra), hogy az emberi IgGl Fc-szekvenciát egéreredetű IgG2a Fc-t kódoló cDNS-ből származó szekvenciákkal helyettesítettük [5.726.044 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat].
Az egéreredetű IgG2a Fc-szekvenciát egérből származó lépsejtből készült könyvtárból klónoztuk polimerázláncreakcióval (PCR) történt amplifikálással. A PCR láncindítók adapter szekvenciákat tartalmaztak azért, hogy antigéneket vagy pedig adjuváns citokineket kódoló szekvenciákkal történő ligálás céljából, az 5' végen lévő leader szekvenciát, és a 3' végen lévő egyedi Smal/Xmal restrikciós helyet összekapcsoljuk. Az antigén és adjuváns (citokin) szekvenciákat 5' Smal-hellyel állítottuk elő, és megtartottuk az Fc és az antigén- vagy adjuvánsfehérje közötti leolvasási keretet, és egyedi Xhol helyet vittünk be közvetlenül a transzlációs stop szignál mögé.
Az eredményül kapott DNS konstrukció az alábbiakat kódolta: az egéreredetű IgG2a H-lánc csukló régiójával közvetlenül fuzionáltatott könnyűlánc leader szekvencia, és az egéreredetű IgG2a-n keresztül folytatólagosan CH2- és CH3-exonok és a fúziós partner (az antigén vagy az adjuváns citokin). A transzkripciót - a legtöbb tenyésztett sejttípusban történő expresszióra, illetve ín vívó DNS injekciót követően, izomban és más sejttípusokban történő expresszióra alkalmasnak talált - CMV promóter/enhancer hajtotta meg. Az egyes vektorokba a stabilan transzfektált kiónok szelektálásának elősegítésére szelektálható,
- 49 dihidrofolát reduktáz (DHFR) markert, illetve a plazmád DNS E. coliban történő fenntartásához szükséges szekvenciákat illesztettünk be.
Az alábbi, példaként szolgáló, Fc-antigén konstrukciót úgy állítottuk elő, hogy a vektorba az egyedi Sraal-Xholhelyek közé megfelelően adaptált szekvenciákat illesztettünk be, és a kapott vektort pdCs-muFc-nek neveztük el (a mu azt jelzi, hogy az Fc egérből származik).
Az emberi IL-4-receptor (IL-4R) ektodoménját (az extracelluláris részét) emberi perifériális vérből származó mononukleáris sejtekből klónoztuk PCR-amplifikációval. Az alkalmazott láncindítók az alábbiak voltak: 5'-GTC CCG GGT ATG AAG GTC TTG GAG GAG C (a szekvencialistában 1. azonosítószámon megadott szekvencia) és 5'-CCC CTG GAG CTA GTG CTG CTC GAA GGG CTC CCT G (a szekvencialistában 2. azonosítószámon megadott szekvencia). A láncindítók tartalmazták a Smal és Xhol helyeket, megfelelően, a pdCs-muFc vektorba történő beillesztés céljából. Az alkalmazott PCR-reakció, és az azt követő klónozás körülményei az alábbiak voltak. A kérdéses gén(ek) amplifikálására Advantage KlenTaq és Polimeráz Mix-et (Clontech, Palo Alto, CA) , és specifikus láncindítókat alkalmaztunk. A reakciókeverékek összetétele az alábbi volt: 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 inM MgCl2, 0,01% zselatin (w/v), az egyes dNTP-kből 0,2-0,2 mM, és 1,25 egység KlenTaq, a teljes térfogat 100 μΐ volt. Harminc PCR-ciklust futtatunk, az egyes ciklusokban 1 perc 94°C-os hődenaturációt, 45 sec 42°C-on történő annellálást, és 1 perc 72°C-on történő láncindító-hosszabbítást végez
- 50 tünk. Az amplifikált terméket SK vektorba (Stratagene, San Diego, CA) szubklónoztuk, és standard szekvenáló eljárásokkal meghatároztuk ennek DNS-szekvenciáját.
Az emberi prosztata specifikus membrán antigénjének (PSMA) ektodoménjét az LnCAP prosztatarák sejtvonalból (ATCC CRL1740) klónoztuk PCR-rel az alábbi láncindítók alkalmazásával: 5'-AAG CTT ΆΆΆ TCC TCC AAT GAA GC (a szekvencialistában 3. azonosítószámon megadott szekvencia) és 5'-CTC GAG TTA GGC TAG TTC ACT CAA AG (a szekvencialistában 4. azonosítószámon megadott szekvencia), a szensz és antiszensz szálakra, megfelelően. A DNS-szekvenciát ellenőriztük, és a PCR-fragmentumot pdCs-muFc vektorba illesztve jutottunk a pdCs-muFc-PSMA fúziós konstrukcióhoz.
Az emberi (KS-antigénként is ismert) EpCAM (a legtöbb ráksejtben fokozottan expresszált, epitélsejt-eredetű felszíni fehérje) ektodoménját LnCAP sejtekből klónoztuk PCRrel az alábbi láncindítók alkalmazásával: 5'-CCC CGG GTA AAC AGG AAG AAT GTG TCT GTG (a szekvencialistában 5. azonosítószámon megadott szekvencia) és 5'-CTC GAG TCA TTT TAG ACC CTG CAT TGA G (a szekvencialistában 6. azonosítószámon megadott szekvencia), a szensz és antiszensz szálakra, megfelelően. A DN szekvenciát standard szekvenáló eljárásokkal ellenőriztük, és a PCR-fragmentumot pdCs-muFc vektorba illesztve jutottunk a pdCs-muFc-EpCAM fúziós konstrukcióhoz. Egy másik vektort is előállítottunk, amelyben az EpCAM ektodomént N-terminális partnerként alkalmaztuk, és ebben az esetben a PCR-termék tartalmazta az EpCAM cDNS természetes leader szekvenciáját, és az érett.
membránt átívelő
- 51 domént határoló ektodomén szekvenciát. E PCR termék 3'végén, az egéreredetű Fc-fragmentum AflII helyéhez történő ligáció céljából egy AflII-helyet alakítottunk ki génsebészeti úton. Az alkalmazott PCR-láncindítók az alábbiak voltak: 5'-TCT AGA GCA GCA TGG CGC CCC CGC (a szekvencialistában 7. azonosítószámon megadott szekvencia) és 5' -CCT TAA GCA CCC TGC ATT GAG AAT TCA G (a szekvencialistában 8. azonosítószámon megadott szekvencia). Ez esetben, az egéreredetű Fc-ből hiányzott a fúziós fehérje beillesztésére szolgáló 3' inzerciós hely, de az Fc kódoló szekvencia a végénél transzlációs terminációs szignált tartalmazott.
A HIV gp41, a lizin aminosavnál lévő HíndlII-helytől a membránt átszövő régióig terjedő, membránon belüli régiójának viszonylag konzervált részét - rövid antigén-szekvenciára példaként - Fc-fúziósfehérjeként expresszáltuk. Annak ellenére, hogy a HIV IIIB törzsből származó fehérjeszekvenciát alkalmaztuk, a kódoló szekvenciát eukarióta sejtben történő expresszióra optimalizáltuk oly módon, hogy a kodonban megnöveltük a GC tartalmat. Az alábbi, a 62 6669. aminosavakat kódoló DNS szekvenciát - C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTC GAG (a szekvencialistában 9. azonosítószámon megadott szekvencia) - kémiai úton szintetizáltuk meg és a pdCs-muFc vektorba ligáltuk. a fuzionáltatott polipeptid aminosavszekvenciája az alábbi volt: SLIHS LIEES QNQQE KNEQE LLELD
- 52 KWASL WNWFN ITNWL WYIK (a szekvencialistában 10. azonosítószámon megadott szekvencia).
Más, HIV fehérjét kódoló szekvenciákat alkalmaztunk a korábbiakban leírtak szerinti Fc-antigén-fúziósfehérjék előállítására [5.541.087 sz. és 5.726.044 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok], azonban ez esetben az eredetileg alkalmazott emberi IgGl Fc helyett, inkább az egéreredetű IgG2a Fc-t választottuk. E konstrukciók a találmány további, előnyös megvalósítási módjait képezik.
Az egéreredetű IgG2a Fc-t és számos egéreredetű citokint tartalmazó Fc-adjuváns (citokin) fúziós fehérjékből sorozatot készítettünk az Fc-antigén-fúziósfehérjékhez hasonló módon. A specifikus citokineket és a klónozáshoz alkalmazott láncindítókat az alábbiakban tárgyaljuk.
Egéreredetű IL-2-t klónoztunk egéreredetű perifériális vérből származó mononukleáris sejtekből (PBMC-k) PCRrel az alábbi PCR-láncindítók alkalmazásával:
(szensz) 5'-GCG CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AAG CTC C (a szekvencialistában 11. azonosítószámon megadott szekvencia) , és (antiszensz) 5'-CCC TCG AGT TTA TTG AGG GCT TGT TG (a szekvencialistában 12. azonosítószámon megadott szekvencia) .
Egéreredetű GMCSF-et klónoztunk egéreredetű PBMC-kből PCR-rel az alábbi PCR-láncindítók alkalmazásával:
(szensz) 5'-CCC GGG AAA AGC ACC CGC CCG CTC ACC C (a szekvencialistában 13. azonosítószámon megadott szekvencia) , és
- 53 (antiszensz) 5'-CTC GAG TCA TTT TTG GOT TGG TTT TTT GC (a szekvencialistában 14. azonosítószámon megadott szekvencia) .
Egéreredetű Flt3 ligandumot klónoztunk egéreredetű csecsemőmirigyből PCR-rel az alábbi PCR-láncindítők alkalmazásával :
(szensz) 5'-CAA GCT TAG ACC TGA CTG TTA CTT GAG C (a szekvencialistában 15. azonosítószámon megadott szekvencia) , és (antiszensz) 5'-CTC GAG TCA AGG CTC TGG GAG CTC CGT GGC (a szekvencialistában 16. azonosítószámon megadott szekvencia).
Egéreredetű IL-12p35-öt klónoztunk egéreredetű PBMCkből PCR-rel az alábbi PCR-láncindítók alkalmazásával:
(szensz) 5'-CCC CGG GTA GGG TCA TTC CAG TCT CTG G (a szekvencialistában 17. azonositószámon megadott szekvencia) , és (antiszensz) 5'-CTC GAG TCA GGC GGA GCT CAG ATA GC (a szekvencialistában 18. azonosítószámon megadott szekvencia) .
Egéreredetű IL-12p40-et klónoztunk egéreredetű PBMCkből PCR-rel az alábbi PCR-láncindítók alkalmazásával:
(szensz) 5'-TCT AGA CCA TGT GTC CTC AGA AGC TAA C (a szekvencialistában 19. azonosítószámon megadott szekvencia) , és (antiszensz) 5'-CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA G (a szekvencialistában 20. azonosítószámon megadott szekvencia) .
- 54 Az egéreredetű IL-12 p40 kivételével, az összes PCRterméket Smal-Xhol fragmentumként klónoztuk, standard DNSszekvenálási eljárásokkal analizáltuk, és az - Fc régióként egéreredetű IgG2a Fc tartalmazó - pdCs-muFc vektorba ligáltuk. Az egéreredetű IL-12 p40 PCR-terméket külön (azaz nem Fc-fúziósfehérjeként) expresszáltuk olyan vektorban, amely ugyanazon CMV promóter/enhancert, az érett, egéreredetű IL-12 p40 alegységéhez közvetlenül fuzionált, könnyűláncból származó leader szekvenciát, a pdCs-muFc vektorban egyébként lévő DHFR szelektálható marker helyett pedig neomicinrezisztencia-gént tartalmazott. Az eredményül kapott vektort pNC-mp40-nek neveztük el, amely névben az N a neomicin szelekciós gént jelenti.
Emberi veséből származó 293-as sejtekben történt tranziens expresszióval, mindegyik plazmidkonstrukció indukálta a specifikus fúziós fehérjék szintézisét és szekrécióját. Röviden, plazmidokat vittünk be emberi veséből származó, egyrétegben tenyésztett 293-as sejtek kalcium-foszfát precipitációval [Sambrook és mtsai., Molecular cloning: A laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)]. A sejteket 16 órán keresztül inkubáltuk, PBS-sel mostuk, és friss tenyészoldattal ( 10% újszülött borjúból származó szérumot (FBS) tartalmazó DMEM) felöntöttük. További 2-3 nap elteltével, a tenyészoldatot, egéreredetű IgG-Fc fehérjére specifikus antitestek alkalmazásával végzett, Fc-re specifikus ELISA-val [Gillies és mtsai., J. Immunol. Meth. 125, 191 (1989)] a szekretált fúziós fehérjékre teszteltük. Az egéreredetű Fc
- 55 IL-12 esetében, miután mind az Fc-p35 és mind pedig a p40 expressziós plazmid DNS-ek tranziensen expresszálódott ugyanabban a sejttenyészetben, így a heterodimer citokin fúziós fehérje összeszerelődött még azelőtt, hogy a sejtből kiszekretálódott volna [Gillies és mtsai., J. Immunoi. 160, 6195 (1998)].
Ezt követően, a különböző fúziós fehérjéket expresszáló, stabilan transzfektált sejteket állítottunk elő oly módon, hogy standard elektroporációs eljárások alkalmazásával, linearizált DNS-t vittünk be egéreredetű NS/0 mielóma sejtekbe. Röviden, milliliterenként 107 sejtet Gene Pulser küvettában (BioRad) felszuszpendáltunk, és a szuszpenzió 0,5 ml-éhez 10 μg DNS-t kevertünk, majd a keveréket 10 percig jégen hűtöttük. Elektroporációt végeztünk Gene Pulser (BioRad) elektroporációs készülék alkalmazásával, 0,25 V és 500 μΕ beállítások mellett. Elektroporáció után a sejteket 10 percig jégen inkubáltuk, majd tápoldatban felszuszpendáltuk és 96-lyukú lemezre transzferáltuk. Az elektroporációt követő 2. naptól kezdve a sejteken a - 0,1 μΜ metotrexátot tartalmazó - szelekciós tápoldatot 2-3 naponként cseréltük. A 96-lyukú lemezeken szaporodó, metotrexátra rezisztens telepeket az Fc ELISA protokol alkalmazásával expresszióra nézve teszteltük.
Az egéreredetű Fc-IL-12 fúziós fehérje expressziója esetében, az egéreredetű IL-12 p40 alegységét már expresszáló, transzfektált NS/0 sejtvonalat, a fentiekben leírtak szerint egéreredetű Fc-p35 alegység expresszálására készített vektorral transzfektáltuk. A p40-et expresszáló
- 56 sejtvonalat NS/0 sejteknek a pNC-mp40 vektorral, a fentiekben leírt módon végzett elektroporációjával állítottuk elő, azonban a szelekciós tápoldat G418 neomicin analógot (Life Sciences Technologies) tartalmazott. A második transzfekciót követően, túlélő kiónokat teszteltünk Fc ELISA-val és egéreredetü IL-12 vizsgálatára alkalmas ELISA-val (Genzyme, Cambridge, MA).
Az eredményül kapott fúziós fehérjék szerkezeti integritását SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel (SDSPAGE) vizsgáltuk. Először, a fúziós fehérjéket kis térfogatú (10-20 μΐ/tápoldat) protein A Sepharose gyantához (Repligen, Needham, MA) kötöttük. A kötött anyagot 0,01% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel mostuk, és SDS-t tartalmazó gélpufferrel oldottuk le, majd 2 percig, 5%-os 2merkaptoetanol jelenlétében forraltuk. A redukált fehérjéket előre-elkészített pre-cast SDS-PAGE géleken futtattuk meg és Coomassie Blue-val festettük. Stabil sejtklónokból történő, nagy léptékű tisztítást protein A Sepharose oszlopokon (Repligen, Needham, MA) végeztünk a gyártó útmutatásai szerint.
2. példa
Fc-antigén immunogenitása és a kémiai-, illetve Fccitokin adjuvánsok hatása az antitest-termelésre
Az 1. példában leírtak szerint előállított, egéreredetű Fc-huIL-4R alfa alegység konstrukciót alkalmaztuk antigénként az e fehérjék potenciálisan APC-re irányuló hatásának állatmodellben történő vizsgálatára. Az IL-4R alfa alegység ektodoménja az egyes fajok között viszonylag kon
- 57 zervált molekulát képvisel, amely esetében az emberi és humán molekulák közötti szekvenciaazonosság több mint 50%-os.
Egércsoportokat 50 μg Fc-antigén-fúziósfehérjét tartalmazó PBS-sel vagy emulgeált Freund-féle komplett adjuvánssal (CFA) szubkután injektáltunk. Bizonyos csoportok Fc-IL-2 vagy Fc-GMCSF Fc-adjuváns fehérjéből (az Fc-IL4R-rel összekeverve) 5-5 μg-ot kaptak. Két héttel később, az egereket azonos keverékkel, de intraperitoneálisan injektáltuk. A CFA formuláció micellákat képez, amelyekből az antigént csak fokozatosan szabadul fel, így az immunrendszer folyamatos stimuláció alatt áll. A CFA-ban lévő mikobakteriális fehérjék is erős gyulladásos választ és a citokinek stimulációját váltják ki, így tovább erősítik az immunválaszt. A CFA, azonban, súlyos mellékhatásai, igy például a bőr károsítása, miatt emberi alkalmazásra alkalmatlan. Az Fc-adjuváns fehérje és PBS keveréke, azonban, úgy tűnik, hogy nem vált ki semmiféle látható bőrreakciót, illetve a toxicitás semmiféle látható jele nem tapasztalható az állatok egyikében sem.
Két héttel a rásegítő oltást követően (azaz 28 nappal az első injekció után), az állatokat elvéreztettük és a teljes vér, mikrocentrifuga-csövekben történt megalvasztásával, a sejtek és az alvadt anyag nagy sebességű (12000 RPM, 5 perc) lecentrifugálásával, és a felülúszó összegyűjtésével szérumokat állítottunk elő. Az eredményül kapott szérumokat esszé pufferrel (0,01% Tween-20-at tartalmazó PBS) hígítottuk és emberi IL-4R-rel szemben reaktív antitestekre nézve teszteltük. Antigénre specifikus ELISA-t vé
- 58 geztünk, emberi Fc-huOL-4R-rel bevont (5 μg/100 μΐ PBS minden egyes lyukhoz, inkubálás 4°C-on, 12 órán keresztül) 96lyukú lemezek alkalmazásával. Az antigénnel bevont lemezeket alkalmazás előtt mostuk és blokkoló pufferrel (1% BSA, 0,01% Tween-20 PBS-ben) blokkoltuk. A tesztelni kívánt szérumból készített hígításokat a lyukakban 2 órán keresztül, szobahőmérsékleten inkubáltuk, és a lyukakat esszé pufferrel nyolcszor mostuk. Szekunder antitestként, egéreredetű Fc-re specifikus, retekeredetű peroxidázzal konjugált antitestet (1:2000 hígításban, Jackson ImmunoResearch) adtunk, és a lemezeket további egy órán át inkubáltuk. Az esszé pufferrel végzett nyolcszoros mosást követően, 25 mM citromsavat, 50 mM Na2HPO4-et (pH 5) és frissen hozzáadott 0,03% H2O2-t tartalmazó ortofenilén-diamin dihidroklorid oldatot adtunk a lyukakhoz. A reakciót körülbelül 30 perc múlva, 100-100 μΐ, 4 N H2SO4 hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket lemezleolvasó berendezésben, amely a 650 nm-en mért hátteret automatikusan levonta, 490 nm-en leolvastuk. Az eredményeket az antitest hígítás függvényében mért optikai denzitás formájában ábrázoltuk. Relatív antitest titereket a szérumhígítás azon fokának megállapításával határoztuk meg, amely az általunk önkényesen meghatározott érték (pl. 1 O.D. egység) alá eső értéket eredményező hígítás értéke volt.
Az immunizálási protokolok eredményeit a 3. ábrán mutatjuk be. Az egéreredetű Fc-IL-4R fúziós fehérjét, e protokol szerint, önmagában, PBS-ben injektálva mindössze egy egérben indukált antitest-választ (3B. ábra). A CFA
- 59 hozzáadása, azonban, több egérben generált immunválaszt, bár az antitest-titerek durván azonosak voltak annál az egérnél kapott értéknél, amelynél a csak Fc-IL-4R fúziós fehérjét önmagában tartalmazó PBS-sel történt injektálás immunválaszt eredményezett (3C. ábra). A egéreredetű Fc-IL2 adjuváns és az Fc-IL-4R, PBS-ben történt együttes beadása minden állatban immunválaszt eredményezett, azonban, a termelődött antitest mennyisége esetenként eltért (3D. ábra) . A CFA és az egéreredetű Fc-IL-2 adjuváns együttes alkalmazása (3A. ábra) magasabb antitest-tireket eredményezett, mint mindkét ágens külön-külön (3C. és 3D. ábrák) . A PBSben oldott, egéreredetű Fc-GMCSF adjuvánssal sikerült a legerősebb immunválaszt indukálni az összes csoportban (3E. ábra), beleértve azt a csoportot is, amelyet az Fc-GMCSF adjuváns és CFA kombinálásával immunizáltunk (3F. ábra). Más szavakkal, a PBS-ben oldott, egéreredetű Fc-GMCSF adjuváns, egéreredetű FC-IL-4R antigénnel együtt történő beadásával elkerülhetjük a CFA alkalmazását. Úgy gondoljuk, hogy emberi alkalmazásra az ilyen eljárás megfelelőbb lehet .
3. példa
Fc-GMCSF adjuváns dózisainak hatása az Fc-PSMA fúziós fehérjében lévő, rákeredetű PSMA-antigén ellen termelt antitestekre
A normál szövetekben való korlátozott elterjedése miatt a PSMA kedvező, emberi eredetű daganattal kapcsolatos antigén. A PSMA-t klinikai kísérletekben jelenleg is tesztelik, mint esetleges tumor elleni vakcinajelültet. E pél
- 60 dában, Fc PSMA fúziós fehérje részeként vizsgáltuk a PSMAantigén immunogenitását.
Az egéreredetű Fc-PSMA fúziós fehérjét az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. Egércsoportokat 50 μg FcPSMA fúziós fehérjével együtt, különböző koncentrációjú Fc-GMCSF Fc-adjuváns-fúziósfehérjét tartalmazó PBS-sel szubkután, majd 14 nappal később rásegítő oltásként intraperitoneálisan injektáltunk. Antitest-titereket FcPSMA antigén befogási ELISA-val, a 2. példában az Fc-IL-4R fúziós fehérjére leírtak szerint határoztunk meg. Az eredményeket a 4. ábrán, antitest-titert (olyan mértékű hígítás, hogy az O.D. 1-re csökkenjen) az első injekciót követő idő függvényében, grafikusan ábrázoltuk.
Fc-GMCSF hiányában, az egerekben a PSMA elleni antitest titerek 1000-től körülbelül 20.000-ig terjedtek (4A ábra). Azonban, 0,05 pg Fc-GMCSF együttes beadására a titer tartománya 30.000-tól 140.000-ig terjedő tartományra nőtt (4B. ábra). Tízszer nagyobb mennyiségű Fc-GMCSF tovább serkentette az e rákeredetű antigén elleni antitest-titert (4C. és 4D. ábrák) . A beadott legnagyobb dózis (5 pg FcGMCSF fúziós fehérje egerenként), ez a mennyiség csak 2 pg GMCSF-et jelent oltásonként, olyan dózis, amely nem okoz az egerek bőrén látható elváltozásokat, illetve nem okoz semmilyen olyan szisztemikus jelet, amely mutatná, hogy az egereket immunizáltuk (lásd 4D. ábra). Továbbá, a CFA-val ellentétben, a lép láthatóan nem növekedett meg.
4. példa
A PSMA, Fc által közvetített szállításának hatása az immunizációra adott antitestválaszra
Az Fc-antigén- és Fc-adjuváns-fúziósfehérjék Fckomponensének specifikus hatását vizsgáltuk a fúziós fehérjékkel, a nem fuzionáltatott antigén- vagy adjuvánsfehérjével, illetve az előzők keverékével injektált egerekben indukált immunválaszok összehasonlításával. E célra az emberi PSMA rendszert alkalmaztuk.
Nem fuzionálhatott PSMA-t állítottunk elő emberi FcPSMA fúziós fehérje, plazminnal végzett proteolitikus emésztésével [Lo és mtsai., Prot. Eng. 11, 495-500 (1998)] a gyártó útmutatásai szerint. A felszabadult Fc-t és az emésztetlen Fc-PSMA-t protein A Sepharose-hoz (Repligen, Needham, MA) történő adszorpcióval távolítottuk el.
Három-három egérből álló csoportokat 50 μg PSMA-val önmagában (5A. ábra), vagy 50 μg PSMA-t 0,2 μg szabad GMCSF-fel (5B. ábra), illetve 0,5 μg Fc-GMCSF-fel (5C. ábra) (0,5 μg Fc-GMCSF körülbelül 0,2 μg GMCSF-et tartalmaz) kombinálva, egyetlen dózisban, szubkután injektáltunk. Egy másik sorozat egeret 50 μg Fc-PSMA fúziós fehérjével önmagában (5D. ábra), vagy 50 μg Fc-PSMA-t 0,2 μg szabad GMCSFfel (5E. ábra), illetve 0,5 μg Fc-GMCSF-fel (5F. ábra) kombinálva, egyetlen dózisban, injektáltunk szubkután. Minden injektálás esetén a készítmény PBS-sel készült oldat volt, és nem tartalmazott kémiai adjuvánst. Egéreredetű Fc-PSMAval reagáló antitesteket az immunizálást követő 14. napon mértük.
- 62 A PSMA immunogenitása szempontjából az Fc PSMA fúziós fehérjében az Fc-antigén-fúziósfehérje Fc-komponensének jelentősége meglepően fontosnak bizonyult akkor, amikor az állatokat kémiai adjuvánstól mentes, PBS-sel készült készítményként injektáltuk. A PBS-ben beadott PSMA ellen lényegében nem kaptunk elsődleges immunválaszt (5Ά. ábra). Az immunizálásban alkalmazott készítményhez adott GMCSF-nek vagy Fc-GMCSF-nek - egy állatban kapott gyenge választól eltekintve - csak igen kevés hatása volt (5B. és 5C. ábrák) . Ezzel szemben, egyedül Fc-PSMA-val oltott állatokban, minden esetben, erős elsődleges immunválaszt tapasztaltunk (5D. ábra). Az Fc-PSMA-hoz szabad GMCSF-t adva a hatas kissé megerősödött (5E. ábra), azonban a legerősebb válaszokat az antigén és a citokin Fc-fúziósfehérjeként történő együttes beadása esetén értük el (5F. ábra).
Ezen eredmények jelzik, hogy immunválasz generálására az Fc-antigén és Fc-adjuváns kombinációja előnyösen alkalmas, és itt mutatkozik meg annak egyértelműen előnyös hatása, ha az antigént és a stimulációs citokint együtt lokalizáljuk ín vivo, feltehetően az APC-kre.
5. példa
AZ Fc-GMCSF és Fc-Flt3L fúziós fehérjék adjuváns hatásainak összehasonlítása
Az Flt3 ligandumáról, amely a technikában Flt3 ligandumként (Flt3L) is ismert, kimutatták, hogy a dendritikus sejtek generálásában és érésében kritikus szerepet tölt be [Soligo és mtsai., Br. J. Haematol. 101, 352363 (1998)]. A dendritikus sejteket, a szöveti makrofág
- 63 sejtekkel együtt, tartjuk a legfontosabb APC-nek. Egereken végzett kísérletekkel kimutatták, hogy 10 napon keresztül, naponként beadott egy injekció eredményeként a nyiroksejtekbol es lépből kinyerhető dendritikus sejtek száma és APC-aktivitása megnő, és hogy ezek a sejtek rendkívül hatékonyak az antigén bemutatásában a CD4+ és a CD8+ sejteknek. A bor Langerhans-féle sejtjeiről úgy gondolják a dendritikus sejtek egyik típusát képviselik, amelyek - az antigen felvétele és a helyi nyirokcsomókhoz történő vándorlása után - antigén-bemutatásra képesek. Miután úgy hisszük, hogy a legtöbb dendritikus sejt nem expresszálja a jellemzően makrofágokon (például FcaRI) található Fcreceptor-sorozatokat, nem jósolható meg előre az, hogy az Fc-fúziósfehérj ék ko-lokalizációs hatása érvényesül-e ebben az APC családban.
Annak vizsgálatára, hogy az Flt-3L adjuvánsként képes-e működni, az egéreredetű Fc-GMCSF fúziós fehérje helyett (amely a makrofágok és granulociták hatékony stimulátora) , egéreredetű Fc-PSMA-val és egéreredetű FcFlt3L-lel injektáltunk egércsoportokat. Ebben az esetben, bármilyen adjuváns hatásról azt gondoltuk, hogy a dendritikus sejtek aktiválása és általi felvétele folytán jön létre, amely adjuváns hatás egyértelműen a PSMA elleni antitestválaszban fog megnyilvánulni. Az eredményeket a 6. ábrán foglaltuk össze.
E kísérlet jelzi, hogy az egéreredetű Fc-Flt3L hatékony adjuváns, amely épp olyan jól, ha nem még jobban, mint az Fc-GMCSF azonos dózisa, stimulálja a PSMA elleni anti
- 64 testeket. Az eredmények alátámasztják azt a megfigyelést, amely szerint Fc-antigén és Fc-adjuváns kombinálása immunválasz indukálásában előnyösen hatékony lehet. Az eredmények arra is rávilágítottak, hogy akárcsak a makrofág APC, a dendritikus APC is egyértelműen célbavehető Fc-antigénnel és Fc-citokinnel, ami azt sugallja, hogy e sejteken az Fcreceptorok legalább egy formája jelen van.
6, példa
Fc-EpCAM-Fc-fúziósfehérj ék elleni immunválaszok
Az 1. példában leírt plazmidok és eljárások alkalmazásával, egéreredetű IgG2a Fc régióval készített fúziós fehérjeként, egy másik potenciálisan jelentős, emberi eredetű rákantigént, az EpCAM-ot (KSA és 17-1A antigénként is ismert) is előállítottuk, és önmagában, vagy adjuvánsként FcGMCSF-fel kombinálva beadtuk. Egereket szubkután injektáltunk, és 3 hét múlva PBS-ben oldott 10 μg Fc-EpCAM-ot és 1 μg Fc-GMCSF-et tartalmazó készítménnyel rásegítő oltást adtunk. A kontroll egerek nem kaptak Fc-GMCSF-et. EpCAM elleni antitest-titereket a rásegítő injekció után 7 nappal (7A. ábra) és 14 nappal (7B. ábra) mértünk. Az eredmények jelzik, hogy az EpCAM önmagában beadva is hatékony immunogén (üres trapézok) illetve, hogy az Fc-GMCSF tovább fokozza az ezen antigén elleni választ (zárt háromszögek).
Ezenfelül, az EpCAM antigént az Fc-fragmentum viszonylatában fordított orientációban, azaz EpCAM-muFc formájában expresszáltuk (lásd 1. példa, 1B. ábra). Ezzel a molekulával Balb/c egereket szubkután injektáltunk. Az EpCAM-Fc-fúziósfehérje nagyobb dózisait (25 pg/dózis) al
- 65 kalmaztuk, és növeltük az adjuváns dózisát (2,5 μg FcGMCSF) is. EpCAM elleni antitest-titereket az immunizálás után 14 nappal (8A. ábra) és 21 nappal (8B. ábra) mértünk. Az EpCAM-Fc-fúziósfehérje, az Fc GMCSF hiányában is, eléggé immunogén volt (8A. és 8B. ábrák, üres trapézok) . Az Fccitokin hozzáadásának eredményeként az antitest-titerek körülbelül háromszorosára emelkedtek (8A. és 8B. ábrák, telt háromszögek).
Annak tesztelésére, hogy vajon az EpCAM elleni immunválasz képes-e megvédeni az emlősöket az EpCAM-ot expresszáló daganatsejtekkel szemben, nem immunizált, illetve EpCAM-fúziós fehérjével (és bizonyos esetekben Fccitokinekkel) immunizált egerek farki vénájába 105, emberi EpCAM-mal transzfektált, egéreredetű CT26 vastagbélráksejtet [Gillies és mtsai., J. Immunoi. 160, 6195 (1998)] injektáltunk. Huszonegy nappal később, az egereket elöltük és a tüdőn tapasztalható áttéteket értékeltük (1) a tüdő felszínén tapasztalható kiterjedés szempontjából, és (2) a tüdők tömegének mérésével és a normális állati tüdők tömegével történt összehasonlítással, annak meghatározására, hogy tapasztalható-e a daganatokkal kapcsolatba hozható tömegnövekedés. Az 1. táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy az immunizált egerekben a daganat-áttétek statisztikailag jelentős mértékben alacsonyabbak, mint a kontrol egerekben, ideértve az egyedül EpCAM-Fcfúziósfehérjével immunizált állatokat is. Hasonló eredményeket kaptunk akkor, amikor antigénként Fc-EpCAM fúziós fehérjét alkalmaztunk.
1. táblázat
Kezelt csoport az Áttét pontszáma átlagos tüdőtömeg (mg)
Kontrol 4, 4, 4, 1, 1 412 ± 130
EpCAM-Fc 0, 0, 0, 0, 0 210 ± 21
EpCAM-Fc + Fc-GM 0, 0, 0, 0, 0 240 ± 19
EpCAM-Fc + Fc-IL-2 0, 0, 0, 0, 0 230 ± 19
Az áttétekre adott pontszámok a tüdő felszínén tapasztalható kiterjedéseken alapultak, az alábbi besorolás szerint: 1 = 1-25%-os kiterjedés, 2 = 26-50%-os kiterjedés, 3 = 51-75%-os kiterjedés, és 4 = 76-100%-os kiterjedés.
7. példa
Antigén-Fc és citokin adjuváns kombinálása egyetlen fúziós fehérjében
A 6. példában leírt EpCAM-Fc fehérje, immunglobulin eredetű Fc-régióhoz karboxil-fehérjedoménként kapcsolt Nterminális antigénre szolgál példaként. E fehérjéket, és az ehhez hasonlókat, Fc-adjuváns-fúziósfehérjékkel, például Fc-citokinekkel, együtt beadva az antigén elleni immunválaszt meg lehet erősíteni. Igény szerint, az antigént, az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót és az adjuváns fehérjét (például citokint) egyetlen fúziós fehérje formájában, például EpCAM-Fc-GMCSF fúziós fehérjeként, elő lehet állítani.
- 67 Miután az e protein expressziójára szolgáló plazmidot az egéreredetű IgG2a Fc és GMCSF szekvenciák alkalmazásával állítottuk elő, a konstrukciót egérmodellen értékelhettük. A leader-EpCAM-Fc kódoló szekvenciákat tartalmazó, kisméretű, Xbal-Smal fragmentumot az eredeti EpCAM-Fc expressziós vektorból (1. példa) állítottuk elő, és az Fc-GMCSF expressziós vektor nagyméretű, Smal-Xbal fragmentumába ligáltuk (9. ábra).
Az eredményül kapott, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF vektort tranziens expresszió céljából, kalcium-foszfát precipitációs eljárással 293-as sejtekbe, illetve stabil expresszió céljából, elektroporációval NS/0 sejtekbe juttattuk be. Stabil transzfektánsok szelektálására a sejteket metotrexátot (0,1 μΜ) tartalmazó tápoldatban tenyésztettük. Expresszáló kiónokat azonosítottunk Fc ELISA-val (lásd 1. példa) és a nagy mennyiségben termelő kiónokat tenyészetben felszaporítottuk. Az EpCAM-Fc-GMCSF fehérjét, a szelekciós tapoldatból, protein A Sepharose-hoz (Repligen, Needham, MA) történt kötéssel és az arról végzett elúcióval tisztítottuk. A fehérjék szerkezeti integritását 2-merkaptoetanollal végzett redukciót követő SDS-PAGE-vel analizáltuk. Az eredmények jelezték, hogy a fehérje molekulatömege, az EpCAM, Fc és GMCSF egyetlen láncba történt fúziójának megfelelő méretű, azaz körülbelül 90 kD.
A kombinált fúziós fehérjék relatív immunogenitásának meghatározása céljából egereket szubkután injektáltunk az EpCAM-Fc-GMCSF fúziós fehérjével, illetve az azt alkotó egyedi fúziós fehérjék (az EpCAM-Fc és Fc-GMCSF) kombináci
- 68 ójának, az EpCAM-Fc-GMCSF fúziós fehérjével ekvivalens dózisával. Tizennégy nappal később az eredetivel azonos injekciót adtuk be, majd ezután 7 nappal szérummintákat vizsgáltunk emberi EpCAM-mal reagáló specifikus antitestek azonosítására. Ugyanezt a megközelítést alkalmaztuk más fehérje-, illetve peptid-antigének mellett más serkentő citokinek, mint például IL-2, IL-12 és Flt3L, esetében is.
8. példa
Immunizálás Fc-antigén ellen DNS injektálással
Az egéreredetű Fc-EpCAM és EpCAM-Fc, emlőssejtekben végzett transzfekciójára és előállítására már alkalmazott expressziós vektorokat (lásd 1. példa) csupasz (naked) plazmid DNS-ként Balb/c egerek hátsó lábába injektáltuk intramuszkulárisan. A PBS-ben vagy 25%-os szacharózban oldott DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban, illetve 100 μμ összmennyiségben adtuk be. Az injektálást összesen háromszor, 3 hetes időtartamonként ismételtük meg. Antitestválaszokat mértünk különböző időpontokban befogáshoz Fc-EpCAMmal bevont 96-lyukú lemezek, kimutatáshoz pedig HRP-vel konjugált, egéreredetű Fc-re specifikus antitestek (Jackson ImmunoResearch) alkalmazásával. A 10. ábrán bemutatott adatok az injektálás után 14 nappal (10A. ábra), 27 nappal (10B. ábra), 55 nappal (10C. ábra) és 69 nappal (10D. ábra) mért antitest-titerekre vonatkoznak.
A 10. ábrán bemutatott eredmények jelzik, hogy mindkét formuláció alacsony szintű, specifikus, EpCAM elleni antitest-indukálódást eredményezett az első hónap során (10A. és 10B. ábrák). Sokkal magasabb titereket mértünk az
55. napon (10C. ábra), és még ennél is magasabbat a 69. napon (10D. ábra). Hasonló eredményeket értünk el az EpCAMFc-t expresszáló vektor DNS-ének injektálásával, bár a literek alacsonyabbak voltak. Ezen adatok mutatják, hogy az antigént, fehérje-antigént és immunglobulin-eredetű Fc-t tartalmazó, fúziós molekulaként expresszálva immunválaszt indukálhatunk, ha injektálással csupasz DNS-t viszünk be, és az állandó antigén jelenlét a legtöbb állatban késleltetett válaszhoz vezet.
Sejtes immunválaszt vizsgáltunk DNS-sel vakcináit vagy fehérjével immunizált egerekből (az injekció után 70 nappal) izolált, majd tenyésztett lépsejtek különböző koncentrációjú Fc-EpCAM fehérjével végzett in vitro stimulálásával. A 11. ábrán (felső panel) bemutatott adatok az FcEpCAM fehérjével immunizált (keresztek), illetve CMVpromóter-EpCAM-Fc (üres körök) vagy CMVpromóter-Fc-EpCAM (telt trapézok) vektorokkal vakcináit állatokban az antigénnel szembeni (3H-timidin-beépüléssel mért) proliferativ választ jelzik. A fehérjével immunizált állatok, még igen alacsony dózisban is, sokkal nagyobb választ mutattak. A DNS-sel vakcináit állatok esetében kapott válaszok (a 11. ábra alsó paneljén, eltérő léptékben ábrázolva) dózistól függő válaszok voltak ugyan, de a fehérjével injektált egereknél kapott értékeknél egy nagyságrenddel alacsonyabbnak bizonyultak. E válaszok az MHC II. osztályára korlátozódó CD4+ válaszokat jellemzik.
- 70 Citotoxikus aktivitás (általában az MHC I. osztályára korlátozódó T-sejtválaszt jelzi) vizsgálatához a DNS-sel vagy fehérjével immunizált egerekből származó lépsejteket 5 napig lOegység/ml IL-2 jelenlétében tenyésztettük. Az effektorsejtek tenyésztett lépsejtek voltak, a célsejtek pedig jelzett, emberi EpCAM-ot expresszáló CT26 vastagbélrák-sejtek (Balb/c egerekre nézve szüngénikus) , vagy jelzett parentális sejtek (nem transzfektált CT26 sejtek) voltak. Az effektor- és célsejteket különböző arányban kevertük össze és meghatároztuk a lizis mértékét. A 100%-os lizisértéket a jelzett célsejtek detergens jelenlétében történt inkubálásával, és a felszabadult jelzés mennyiségének mérésével állapítottuk meg.
Az eredményeket a 12. ábrán mutatjuk be, ahol a 12A. ábra a lépsejtek aktivitását mutatja az emberi EpCAM-ot expresszáló CT26 sejtek ellen, míg a 1B. ábra a lépsejtek, parentális CT26 sejtek elleni aktivitását mutatja. Mindkét ábrán, az üres trapézok az EpCAM konstrukciót hordozó DNSsel immunizált egerekből származó lépsejteknek, az üres négyzetek az Fc-EpCAM konstrukciót hordozó DNS-sel immunizált egerekből származó lépsejteknek, az üres háromszögek az EpCAM-Fc konstrukciót hordozó DNS-sel immunizált egerekből származó lépsejteknek, és a keresztek pedig Fc-EpCAM fúziós fehérjével immunizált egerekből izolált lépsejteknek felelnek meg.
A 12. ábra szerint, bár a DNS-sel végzett vakcinálás gyenge citotoxikus választ generált mindkét célsejt ellen, szignifikánsan magasabb citotoxicitást találtunk a fehérjé
- 71 vei immunizált egerek esetében. Mind a parentális CT26 daganatsejtek, mind pedig az EpCAM-ot expresszáló, CT26 daganatsejtek a vizsgálatban elpusztultak. A parentális CT26 sejtekkel szemben megfigyelt citotoxicitás oka az lehetett, hogy ezek a sejtek nagy mennyiségben termelik az EpCAM egéreredetű homológját, amely pedig aminosav szinten 81%ban azonos az emberi fehérjével. Mindazonáltal, az Fc-EpCAM fehérjével végzett immunizálás jelentős citotoxikus aktivitást generált az emberi EpCAM-ot expresszáló CT26 daganatsejtek ellen, és ez magyarázza a 6. példában leírt, potens tumor elleni védelmet biztosító aktivitást.
9. példa
Fehérjetermészetű rákantigén alrégióját tartalmazó Fc-fúziósfehérjével végzett immunizálás
Bár bizonyos teljes hosszúságú fehérjék immunterápiában antigénként nem feltétlenül alkalmazhatók, a fehérjék kisebb alrégiói sokkal hatékonyabbak lehetnek. Például, a fehérjék tartalmazhatnak olyan doméneket, amelyeket a poszttranszlációs módosítások kevéssé immunogénné alakítanak, csökkentve ezzel az aktuális polipeptid-komponens immunreaktivitását. Nagy fehérjék olyan antitesteket indukálhatnak, amelyek csak az antigén nem polipeptid természetű részeivel reagálnak, és amelyek nem közvetítenek, a tumor ellenes válaszok különösen fontos komponensének tekintett, antitesttől függő sejtes citotoxicitást (ADCC). E helyzetre jó példa az emberi melanómára specifikus kondrotionin-szulfát-proteoglikán (MCSP) antigén esete, amely gyakorlatilag az összes melanoma mellett, számos agy
- 72 rák típusban is expresszálódik. E fehérje különösen nagymértékben glikozilált és emellett még számos glikozaminoglikán-lánc is kapcsolódik hozzá. A 9.2.27 sz. ismert antitest [Bumol és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1245-1249 (1982)] nagy affinitással kötődik ehhez a fehérjéhez, de nem közvetít egyetlen effektor funkciót, sem ADCC sem pedig komplement által közvetített citotoxicitást (CDC) sem. Ezen antitestnek még a részben humanizált (kimérikus) formája sem közvetít ilyen aktivitásokat.
E nagy molekula optimálisabb célrégióira irányuló sokkal koncentráltabb válaszok kiváltása céljából, a fehérjeszekvenciában azonosítottuk a glikánok feltételezett kapcsolódási helyeit [Pluske és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9710-9715 (1996) ] . A sejtfelszíni membránt átszövő szekvenciától nem messze, illetve a glikánok kapcsolódási helyeitől bizonyos távolságra lévő alrégiót választottuk ki.
A peptid szekvenciáját: QGATL RLDPT VLDAG ELANR TGSVP RFRLL EGRHG RWRV PRART EPGGS QLVEQ FTQQD LEDGR LGLEV GRPEG RAPGP AGD (a szekvencialistában 21. azonosítószámon megadott szekvencia) fordítottan transzláltuk, és a kapott DNS-szekvenciát kémiai úton megszintetizáltuk, és a pdCsFc-X expressziós vektorba ligáltuk a korábbi példákban alkalmazott restrikciós helyek alkalmazásával. Közvetlenül az utolsó aminosavat kódoló szekvenciát követően, a 3' véghez transzlációs terminációs helyet adtunk, és e mögé egyedi Xhol helyet építettünk be. A végső expressziós plazmidot NS/0 mielóma sejtekbe vittük be elektroporációval és az 1.
- 73 példában leírtak szerint a kívánt fehérjét stabilan expresszáló transzfektánsokat állítottunk elő.
A tenyészet felülúszójából Fc-MCSP fehérjét tisztítottunk protein A Sepharose kromatográfiával (Repligen, Needham, MA). PBS-ben oldott, 50 gg Fc-MCSP fúziós fehérjével, önmagában vagy adjuvánsként 5 μg Fc-GMCSF-fel kombinálva, Balb/c egereket immunizáltunk szubkután. Az eredményeket a 13. ábrán mutatjuk be. A telt trapézok a normális szérumban mért antitest-titereket jelentik, az üres négyzetek az Fc-MCSP-vel immunizált egerek szérumában mért antitest-titereket jelentik, míg a telt háromszögek az Fc-MCSPvel és adjuvánsként Fc-GMCSF-fel immunizált egerek szérumában mért antitest-titereket jelentik.
Az MCSP ezen alrégiójára specifikus immunválaszokat a 14. napon mutattunk ki, és a válasz a rásegítő immunizálást követően szignifikánsan megnőtt. Az eredmények jelzik, hogy az Fc-GMCSF és Fc-MCSP kombinációjával immunizált állatokban magasabb antitest-titert sikerült generálni az MCSP ellen (telt háromszögek), mint önmagában csak az Fc-MCSP-vel immunizált egerekben (üres négyzetek).
10. példa
Immunizálás vírus-antigént tartalmazó Fc-fúziósfehérj ével
Az AIDS megbetegedés okozó, emberi immunhiányt okozó vírus (HÍV) elleni hatékony vakcina kifejlesztése a vakcinakutatás egyik legfontosabb célja. Jelenleg, számos jelentés jelzi, hogy a vírust burkoló fehérje envelope bizonyos tulajdonságai azt a célt szolgálják, hogy a vírus,
- 74 az immunválaszt rászedi úgy, hogy a választ irreleváns epitópokra irányítja, álcázva ezzel a vírusrészecskék jelentős és lehetséges neutralizáló régióit. Ilyen álcázás az erősen immundomináns antigén-régiók, mint csapdák jelenléte, és a nagyfokú glikoziláció, amely fizikailag álcázza és így csökkenti a fontos epitópok immunogenitását [Wyatt és mtsai., Nature 393, 705-711 (1998)].
A csapda-mechanizmus kijátszásának egyik lehetséges útja a vírust burkoló fehérje envelope gén kis régióinak expresszálása abból a célból, hogy elkerüljük a nem védő hatású immundomináns válaszokat, és neutralizáló választ indukáljunk. A kis alegység-vakcinákkal kapcsolatban azonban fennáll egy probléma, a szintetikus peptidekkel vagy kisméretű fehérjékkel szembeni csökkent immunogenitás. Egyik, e probléma áthidalására szolgáló megközelítés szerint a fehérjéket vagy peptideket immunogén hordozófehérjékhez, mint például kürtőscsiga (keyhole limpet) hemocianin (KLH), kapcsoljuk. Ezzel erős választ indukálhatunk a KLH mellett a fehérje vagy peptid ellen is. Egy másik megközelítés szerint az 1. példában leírtak szerint Fcvel és egy alrégióval, például, a gp41 ektodoménjaval (a vírus envelope, gpl60, horgonydoménje) fúziós fehérjét állítunk elő. Más hordozóktól eltérően, az immunglobulinrégiót a szervezet sajátjaként ismeri fel, ezáltal bármilyen immundomináns hatás minimalizálódik.
Az Fc-gp41pep626 fúziós konstrukció az egéreredetű immunglobulin Fc-régiójának karboxiterminálisával fuzionáltatott, 44 aminosavból álló polipeptidet tartalmazott. A
- 75 HIV IIIB törzs szekvenciája ebben a régióban Nglikozilációs jelet tartalmaz, így akár a 293-as sejtekben, tranziens expresszióval, akár pedig az NS/0 mielóma sejtekben, stabil transzfekcióval előállított Fc-gp41pep626 fúziós fehérje SDS-PAGE analízisben igen nagyfokú mobilitásbeli változékonyságot mutatott, jelezve ezzel a glikoziláció kiterjedtségének heterogenitását.
Azon tény ellenére, hogy e virális antigén eléggé kisméretű (44 aminosav hosszúságú) és glikoziláltsága heterogén, immunválaszt tudtunk kiváltani Balb/c egerekben (lásd 14. ábra). Ez esetben, 5-5 egérből álló csoportokat az első napon, majd kéthetes időközönként még kétszer 25 μρ Fc-gp41pep626 fúziós konstrukcióval önmagában (üres trapézok), illetve 2,5 μg Fc-adjuvánssal, azaz Fc-GMCSF-fel (üres négyzetek) vagy Fc-IL-2-vel (telt háromszögek), kombinálva injektáltunk intradermálisan. A 14A. ábra és 14B. ábra a második rásegítő injekciót követő 7. és 33. napon elért antitest-titereket mutatja be, megfelelően.
Az immunválaszok sokkal jobban függtek az Fccitokinekkel végzett együttes beadástól, és a magas titer elérése hosszabb ideig tartott. Úgy vélük, hogy a szekvencia módosításával, a glikozilációs szignál elhagyásával (valójába sok törzs nem is kódolja ezt a helyet) , vagy a szénhidrát oldalláncok in vitro enzimatikus eltávolításával, erősebb immunválaszokat válthatunk ki.
11. példa
Sejtfelszíni molekula extracelluláris doménjét tartalmazó Fc-fúziósfehérje adjuváns aktivitása
Fc-adjuváns-fúziósfehérjék konstruálásánál néha hasznos, ha az Fc-t olyan fehérjével fuzionálhatjuk, amelynek extracelluláris doménje membránhoz képes kötődni. Például, CD40-ligandum (CD40L) N-terminális végét Fc fehérje Cterminális végével fuzionáltattuk. Igény szerint linkért is alkalmazhatunk.
A CD40L alkalmas, mivel receptora, a CD40, a B-sejtek felszínére expresszálódik, és részt vesz a B-sejtek Tsejtek általi stimulálásában. A tumornekrózis-faktorhoz hasonlóan, a CD40L olyan trimer, amely sejtfelszínen a CD40 dimerizációját vagy trimerizációját idézi elő, melynek eredményeként intracelluláris doménekkel kerülnek érintkezésbe és szignáltranszdukció következik be. A TNF-hez hasonlóan, a CD40L is kötődhet membránhoz, azonban a sejtfelszínről le is hasadhat és citokinként működhet.
Fc-CD40L fúziós fehérjét Fc-antigén-fúziósfehérjével együtt adtuk be állatoknak. A kontrol kísérletekben, az FcCD40L fehérjét és az Fc-antigén fehérjét állatok különböző csoportjainak adtuk be. Úgy gondoljuk, hogy a mindkét fúziós fehérjével injektált állatok magasabb antitest-titereket termeltek, mint az egyes fúziós fehérjékkel külön-külön injektált állatok.
Esetleg, előállíthatunk olyan Fc-fúziósfehérjét, amely mind antigént, mind pedig CD40L fragmentumot tartalmaz, és amelyben az Fc-, CD40L- és antigén-fragmentumok kö
- 77 zé, igény szerint, linkereket (L) építünk be. A fúziós fehérje N-terminális - C-terminális sorrendben az alábbi lehet: Fc-(L)-antigén-(L)-CD40L, Fc-(L)-CD40L-(L)-antigén, antigén-(L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)-antigén-(L)-Fc, antigén- (L) -Fc- (L) -CD40L, vagy CD40L-FC-(L)-antigén-(L). Az Fct, az antigént, és CD40L-et tartalmazó fúziós fehérjét állatokba injektáltuk, majd antitest-titereket mértünk. Úgy gondoljuk, hogy CD40L-et és antigént tartalmazó fúziós fehérjék injektálásával generált antitest-titerek magasabbak, mint a csak Fc-t és antigént, vagy csak Fc-t és CD40L-et tartalmazó fúziós fehérjéket injektálásával kapott titerek.
A fúziós fehérjék fenti beadásai során, az állatokat intravénásán, szubkután, vagy a beadás megfelelő módjai szerint injektáltuk. Az antigének és/vagy adjuvánsok első és a rásegítő beadása közötti időtartamokat, és az antitest-titerek mérését a fenti példákban írtuk le. esetleg, standard dozírozás és vizsgálati rend is alkalmazható.
A találmány megoldási módjai más specifikus formákban is végrehajthatók anélkül, hogy a találmány alapgondolatától vagy annak lényeges jellemzőitől eltérnénk. A fentiekben ismertetett megoldási módokat, minden tekintetben úgy kell felfogni, hogy csak a találmány illusztrálására szolgálnak és a találmányt semmiben sem korlátozzák. A találmány oltalmi körét így inkább a mellékelt szabadalmi igénypontok jelzik, mint a fentiekben ismertetett leírás, és minden, a szabadalmi igénypontok ekvivalenciájának tartományába és jelentésébe eső változtatásokat a találmány oltalmi körébe tartozónak tekintjük.
- 78 A fentiekben idézett összes szabadalmi dokumentum és tudományos publikáció által ismertetettek, a kitanítás részét képezik.
- 79 SZEKVENCIALISTA (210)1 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: IL-4R láncindító (400)1 gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc28 (210)2 (211)34 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: IL-4R láncindító (400)2 cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg (210)3 (211)23 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PSMA (400)3 aagcttaaat cctccaatga agc (210)4 (211)26 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PSMA láncindító láncindító (400) 4 ctcgagttag gctacttcac tcaaag (210)5 (211)30 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia
- 81 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: EpCAM láncindító (400)5 ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg30 (210)6 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: EpCAM láncindító (400)6 ctcgagtcat tttagaccct gcattgag28 (210)7 (211)24 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: EpCAM láncindító (400)7 tctagagcag catggcgccc ccgc (210)8 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: EpCAM láncindító (400)8 ccttaagcac cctgcattga gaattcag28 (210)9 (211)148 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: HIV IIIB gp41
626-669. aminosavait kódoló DNS (400) 92 cccgggatcc ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60 gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120 ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag 148
210) 10
211) 44
212) PRT
213) mesterséges szekvencia
(220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: pdC-puFC vektor által kódolt fúziós polipeptid (400)10
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys
1015
Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Alá Ser Leu Trp Asn
2530
Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
3540 (210)11 (211)30 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító egér-
IL2-höz (400) 11 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc (210)12 (211)25 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító egér
IL2-höz (400)12 ccctcgagtt attgagggct tgttg (210)13 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító egér-
GMCSF-höz (400) 13 cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc (210)14 (211)29 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncmdito eger
GMCSF-hez (400)14
9 ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc (210)15 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncmdito eger
Flt3-ligandhoz (400) 15
8 caagcttaca cctgactgtt acttcagc
(210) 16
(211) 30
(212) DNS
(213) mesterséges szekvencia
- 86 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító egér
Flt3-ligandhoz (400)16 ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc (210)17 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) a mesterséges szekvencia leírása: láncindító égé
IL~12p35-hez (400)17 ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg (210)18 (211)26 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) a mesterséges szekvencia leírása: láncindító egér
IL_12p35-höz (400) 18 ctcgagtcag gcggagctca gatagc (210)19 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása
IL12-p40-hez (400)19 tctagaccat gtgtcctcag aagctaac (210)20 (211)25 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása:
IL12-p40-hez (400)20 ctcgagctag gatcggaccc tgcag (210)21 (211)83 (212) PRT (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása:
láncindító egér28 láncindító egér25
MSCP peptid
- 88 (400)
Gin Gly
Leu Ala
Arg His
Gly Ser
Arg Leu 65
Ala Gly (210) (211) (212) (213) (220) (223) (400)
Ala Thr Leu Arg Leu Asp Pro Thr Vai Leu Asp Ala Gly Glu
1015
Asn Arg Thr Gly Ser Vai Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly
2530
Gly Arg Vai Vai Arg Vai Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly
4045
Gin Leu Vai Glu Gin Phe ThrGln Gin Asp Leu Glu Asp Gly
5560
Gly Leu Glu Vai Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro
7580
Asp
DNS mesterséges szekvencia
A mesterséges szekvencia leírása: oligodezoxinukleotid, amely talán adjuvánsként alkalmazható tccatgacgt tcctgacgtt

Claims (45)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Eljárás az előre kiválasztott antigén immunogenitásának fokozására emlősben azzal jellemezve, hogy:
az előre kiválasztott antigént, és az ahhoz polipeptid kötéssel kapcsolt immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót tartalmazó fúziós fehérjét intramuszkulárisan, intravénásán, transzdermálisan vagy szubkután az emlősnek beadjuk, ezáltal az előre kiválasztott antigén ellen immunválaszt váltunk ki, ahol a fúziós fehérje részét képező, előre kiválasztott antigén erősebb immunválaszt vált ki az emlősben, mint az előre kiválasztott antigén önmagában.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérje és adjuváns kombinációját is beadjuk, olyan mennyiségben, amely elégsége az előre kiválasztott antigén elleni immunválasz fokozására, a fúziós fehérje részét képző, előre kiválasztott antigén ellen, adjuváns nélkül kapott immunválaszhoz viszonyítva .
3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fúziós fehérjét és adjuvánst szimultán adjuk be.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az adjuváns, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióhoz polipeptid kötéssel kapcsolt adjuvánsfehérjét tartalmazó fúziós fehérjét tartalmaz.
5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű csukló régiót tartalmaz.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió domént tartalmaz, amely CH2-domén, CH3-domén vagy CH3-domén.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió CH2domént és CH3-domént tartalmaz.
8. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót, az emlőssel azonos fajban jelenlévő immunglobulin eredetű nehézlánc konstans régiót meghatározó aminosav-szekvenciának megfelelő aminosav-szekvencia határozza meg.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót meghatározó aminosav-szekvencia, emberi immunglobulineredetű nehézlánc konstans régiónak felel meg.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az előre kiválasztott antigén prosztatára specifikus, membráneredetű antigén, citokinreceptor ektodoménje, vírusfehérje, vagy daganatspecifikus antigén.
11. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az adjuvánsfehérje citokin.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a citokint meghatározó aminosav-szekvencia, amely az emlőssel azonos fajban jelenlévő citokint meghatározó aminosav-szekvenciának felel meg.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a citokin emberi eredetű citokin.
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emlős ember.
15. Készítmény előre kiválasztott antigén elleni immunválasz kiváltására emlősben, amely készítmény az alábbi, intramuszkulárisan, intravénásán, transzdermálisan vagy szubkután beadható keverékek bármelyike:
(a) immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót és az ahhoz polipeptid kötéssel kötött, előre kiválasztott antigént tartalmazó fúziós fehérje és adjuváns keveréke; és (b) előre kiválasztott antigén, és immunglobulineredetű nehézlánc konstans régiót és az ahhoz polipeptid kötéssel kötött adjuvánsfehérjét tartalmazó, adjuvánsfúziósfehérje keveréke.
16. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben az (a) klauzula szerinti adjuváns és immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót és az ahhoz polipeptid kötéssel kötött adjuvánsfehérjét tartalmaz.
17. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben a (b) klauzula szerinti, előre kiválasztott antigén polipeptid kötéssel immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióhoz van kapcsolva.
18. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin—eredetű csukló régiót tartalmaz.
19 · A 18. igénypont szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin eredetű nehézlánc konstans régió domént tartalmaz, amely CH2-domén, CH3-domén vagy CH3-domén.
20. A 18. igénypont szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió CH2-domént és CH3-domént tartalmaz.
21. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben az (a) klauzula szerinti adjuváns oligonukleotid CpG szekvenciát tartalmaz.
22. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben az előre kiválasztott antigén prosztatára specifikus, membráneredetű antigén, citokinreceptor ektodoménje, vírusfehérje, vagy daganatspecifikus antigén.
23. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben az (a) klauzula szerinti fúziós fehérje, vagy a (b) klauzula szerinti adjuváns fúzió diszulfid-híddal egy második immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióhoz van kapcsolva.
24. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben az (a) klauzula szerinti adjuváns, vagy a b) klauzula szerinti adjuvánsfehérje citokin.
25. A 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben a citokin emberi eredetű citokin.
26. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót, emberből származó immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót meghatározó aminosav-szekvenciának megfelelő aminosav-szekvencia határozza meg.
27. Eljárás előre kiválasztott antigén immuno— genitásának fokozására emlősben azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazza:
az előre kiválasztott antigént, és az ahhoz polipeptid kötéssel kapcsolt immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót tartalmazó fúziós fehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát az emlősnek beadjuk, aminek következtében az emlősben a nukleinsav-szekvencia expressziója a fúziós fehérje előállítását eredményezi, amelynek részét képező, előre kiválasztott antigén erősebb immunválaszt vált ki, mintha csak az előre kiválasztott antigént önmagában kódoló nukleinsavat expresszálnánk.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a nukleinsav 5' - 3' irányban az immunglobulineredetű nehézlánc konstans régiót és az előre kiválasztott antigént kódolja.
29. A 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű csukló régiót tartalmaz.
30. A 27. vagy 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin—eredetű nehézlánc konstans régió
- 94 domént tartalmaz, amely CH2-domén, CH3-domén vagy CH3domén.
31. A 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió CH2-domént és CH3-domént tartalmaz.
32. A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az előre kiválasztott antigén prosztatára specifikus, membráneredetű antigén, citokinreceptor ektodoménje, vírusfehérje, vagy rákspecifikus antigén.
33. A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy továbbá a nukleinsav-szekvenciát adjuvánssal kombinálva adjuk be.
34. A 33. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az adjuváns, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióhoz kapcsolt adjuvánsfehérjét tartalmazó fúziós fehérjét kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmaz.
35. Készítmény előre kiválasztott antigén elleni immunválasz kiváltására emlősben, amely készítmény az alábbiakat tartalmazza:
(a) immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régiót és az előre kiválasztott antigént tartalmazó fúziós fehérjét kódoló, első nukleinsav-szekvencia, amelynek beadásával az emlősben a nukleinsav-szekvencia expressziója a fúziós fehérje előállítását eredményezi, amelynek részét képező, előre kiválasztott antigén erősebb immunválaszt vált ki, mintha csak az előre kiválasztott antigént önmagában kódoló nukleinsavat expresszálnánk, (b) adjuváns.
36. A 35. igénypont szerinti készítmény, amelyben az adjuváns egy második, immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régióhoz polipeptid kötéssel kapcsolt adjuvánsfehérjét tartalmazó fúziós fehérjét kódoló, nukleinsav-szekvenciát tartalmaz.
37. A 35. vagy 36. igénypont szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin—eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű csukló régiót tartalmaz.
38. A 35. vagy 36. igénypont szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin—eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió domént tartalmaz, amely CH2-domén, CH3-domén vagy CH3-domén.
39. A 37. igénypont szerinti készítmény, amelyben az immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió immunglobulin-eredetű nehézlánc konstans régió domént tartalmaz, amely CH2-domén, CH3-domén vagy CH3-domén.
40. A 35. igénypont szerinti készítmény, amelyben az előre kiválasztott antigén prosztatára specifikus, membráneredetű antigén, citokinreceptor ektodoménje, vírusfehérje, vagy rákspecifikus antigén.
41. A 36. igénypont szerinti készítmény, amelyben az adjuvánsfehérje citokin.
42. A 35. igénypont szerinti készítmény, amelyben az első nukleinsav-szekvencia működésképesen, replikációra képes vektorba lett elhelyezve.
43. A 36. igénypont szerinti készítmény, amelyben a második nukleinsav-szekvencia működésképesen, replikációra képes vektorba lett elhelyezve.
- 96 ί-
44. Eljárás előre kiválasztott antigén immunogenitásának fokozására emlősben azzal jellemezve, hogy:
emlősnek szimultán, vagy egymást követően beadunk antigénfehérjét és lokalizáló fehérjét tartalmazó első fúziós fehérjét, és adjuvánsfehérjét és az említett lokalizáló fehérjét tartalmazó második fúziós fehérjét, awl y lokalizáló fehérje az emlősben, az immunrendszer által elérhető régióban az említett első és második fúziós fehérje koncentrációjának megnövekedését okozza.
45. Eljárás előre kiválasztott antigén immunogenitásának fokozására emlősben azzal jellemezve, hogy:
antigénfehérjét, adjuvánsfehérjét és lokalizáló fehérjét tartalmazó fúziós fehérjét emlősnek adunk be, amely lokalizáló fehérje az emlősben, az immunrendszer által elérhető régióban az említett antigén- és adjuvánsfehérje koncentrációjának megnövekedését okozza.
A meghatalmazott:
DANUBIA
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
//I
Svingór Ádám szabadalmi ügyvivőjelölt .
HU0202796A 1999-07-21 2000-07-21 Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens HUP0202796A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14496599P 1999-07-21 1999-07-21
PCT/US2000/019816 WO2001007081A1 (en) 1999-07-21 2000-07-21 Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUP0202796A2 true HUP0202796A2 (en) 2002-12-28

Family

ID=22510982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0202796A HUP0202796A2 (en) 1999-07-21 2000-07-21 Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7955590B2 (hu)
EP (1) EP1198250B8 (hu)
JP (1) JP4764585B2 (hu)
KR (1) KR100689739B1 (hu)
CN (1) CN1308037C (hu)
AT (1) ATE374042T1 (hu)
AU (1) AU779388B2 (hu)
BR (1) BR0012569A (hu)
CA (1) CA2378866C (hu)
CZ (1) CZ304884B6 (hu)
DE (1) DE60036552T2 (hu)
DK (1) DK1198250T3 (hu)
ES (1) ES2292457T3 (hu)
HU (1) HUP0202796A2 (hu)
MX (1) MXPA02000746A (hu)
NO (1) NO20020255L (hu)
PL (1) PL201664B1 (hu)
PT (1) PT1198250E (hu)
RU (1) RU2248214C2 (hu)
SK (1) SK782002A3 (hu)
WO (1) WO2001007081A1 (hu)
ZA (1) ZA200200501B (hu)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AU778611B2 (en) 1999-08-09 2004-12-16 Merck Patent Gmbh Multiple cytokine-antibody complexes
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
ATE368475T1 (de) 2000-06-29 2007-08-15 Emd Lexigen Res Ct Corp Steigerung von durch antikörper-zytokin- fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme
GB0102145D0 (en) 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
WO2002061389A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Tanox, Inc. Methods to generate and identify monoclonal antibodies to a large number of human antigens
BR0207854A (pt) 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
DK1436003T3 (da) * 2001-05-24 2010-03-15 Zymogenetics Inc TACI-immunoglobulin-fusionsproteiner
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
CN1315536C (zh) * 2002-09-13 2007-05-16 李进 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
DK1572748T3 (da) 2002-12-17 2010-08-23 Merck Patent Gmbh Humaniseret antistof (H14.18) af muse-14.18-antistof der binder til GD2 og dets fusionsprotein med IL-2
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
AU2004308952A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Centocor, Inc. Anti-retroviral agents, compositions, methods and uses
ES2305886T3 (es) 2003-12-30 2008-11-01 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de il-7 con porciones de anticuerpo, su preparacion y su empleo.
KR20060124656A (ko) 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
US8420087B2 (en) 2004-01-05 2013-04-16 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
JP4937132B2 (ja) 2004-12-09 2012-05-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 免疫原性の低下したｉｌ−７変種
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
WO2007041861A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-19 Virexx Medical Corp. Chimeric antigen containing hepatitis c virus polypeptide and fc fragment for eliciting an immune response
ES2365046T3 (es) 2005-12-30 2011-09-21 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anti-cd19 con inmunogenicidad reducida.
EP1966244B1 (en) 2005-12-30 2012-03-21 Merck Patent GmbH Anti-il-6 antibodies preventing the binding of il-6 complexed with il-6ralpha to gp130
PT1966238E (pt) * 2005-12-30 2012-07-31 Merck Patent Gmbh Uso de hsp70 como um regulador de atividade enzimática
DK2006381T3 (en) * 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
EP2009101B1 (en) * 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
RU2325172C2 (ru) * 2006-07-24 2008-05-27 Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ФГУ РКНПК Росздрава) Сорбент для удаления иммуноглобулинов
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
RU2505603C2 (ru) 2007-09-26 2014-01-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против рецептора il-6
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
MX337081B (es) * 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
PT2708559T (pt) 2008-04-11 2018-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de ligação ao antigénio capaz de se ligar repetidamente a duas ou mais moléculas de antigénio
US8383767B2 (en) * 2008-06-27 2013-02-26 Academia Sinica Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
MX2011011044A (es) 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.
MX2011012136A (es) 2009-05-15 2012-04-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-axl.
EA017172B1 (ru) * 2009-08-04 2012-10-30 Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" Способ получения изоиммунной плазмы крови
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
GB0922209D0 (en) 2009-12-18 2010-02-03 Univ Nottingham Proteins, nucleic acid molecules and compositions
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
EP2632484B1 (en) * 2010-10-28 2018-02-28 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Filovirus fusion proteins and their uses
TR201802772T4 (tr) 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Kan pıhtılaşma faktörü VIII in işlevi için alternatif işleve sahip multi-spesifik antijen bağlayıcı molekül.
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
EP3604330A1 (en) 2011-02-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc antibody
CN102212139A (zh) * 2011-03-29 2011-10-12 中国人民解放军第二军医大学 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
JP6873530B2 (ja) * 2013-03-15 2021-05-19 イン3バイオ・リミテッドIn3Bio Ltd. 自己組織化合成タンパク質（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
CN103212069B (zh) * 2013-05-13 2014-07-30 上海赛伦生物技术有限公司 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用
EP3009518B1 (en) 2013-06-11 2020-08-12 National Center of Neurology and Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (rrms) patient, and method for determining applicability of novel therapy
WO2015002985A2 (en) * 2013-07-01 2015-01-08 University Of Maryland Fc coupled compositions and methods of their use
PE20160674A1 (es) * 2013-08-28 2016-07-21 Stemcentrx Inc Metodos de conjugacion de anticuerpos especificos de sitio y composiciones
ES2881306T3 (es) 2013-09-27 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
EP3482766B1 (en) 2014-08-11 2020-05-20 Delinia, Inc. Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN105859837B (zh) * 2014-10-22 2020-11-20 台北医学大学 胆固醇酯转运蛋白抗原肽和融合蛋白以及其组合物和应用
MX2017005774A (es) 2014-12-19 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos antimiostatina, polipeptidos que contienen regiones fc variantes, y metodos de uso.
HUE056489T2 (hu) 2014-12-19 2022-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások
SG11201706014PA (en) 2015-02-05 2017-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
SG11201705093UA (en) 2015-02-27 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composition for treating il-6-related diseases
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CA2985125A1 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP6875683B2 (ja) 2015-05-19 2021-05-26 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
US10857228B2 (en) * 2015-06-10 2020-12-08 The University Of Tokyo Adjuvant for vaccines, vaccine, and immunity induction method
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
EP3431102A4 (en) 2016-03-14 2019-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL DAMAGING THERAPEUTIC MEDICAMENT FOR USE IN CANCER THERAPY
JP7320943B2 (ja) 2016-04-28 2023-08-04 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
BR112018076260A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a hpd-l1, anticorpo biespecífico ou proteína de fusão, uso de um anticorpo ou fragmento, método, composição farmacêutica, método de modulação, método de inibição, método de tratamento, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e imunocitocina
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN106177932A (zh) * 2016-07-03 2016-12-07 查文娟 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗
KR102538749B1 (ko) 2016-08-05 2023-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CN110167957A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
EP3698808B1 (en) 2017-10-20 2025-01-01 Hyogo College Of Medicine Anti-il-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
AU2018361430B2 (en) 2017-11-01 2025-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody variant and isoform with lowered biological activity
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
KR20250139415A (ko) * 2018-02-14 2025-09-23 호라이즌 테라퓨틱스 아일랜드 디에이씨 고양이 맥도너 육종(fms)-유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(flt3l)에 대한 항체 및 자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 이의 용도
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
KR102714626B1 (ko) 2018-06-12 2024-10-08 케이바이오 홀딩스 리미티드 바이러스 및 항원 정제 및 접합
KR20210025054A (ko) * 2018-06-21 2021-03-08 샤턱 랩스 인코포레이티드 이형이량체 단백질 및 이의 용도
EP3843755A4 (en) * 2018-08-29 2022-08-31 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-BASED CHIMERIC PROTEINS
KR20250154552A (ko) 2018-09-27 2025-10-28 실리오 디벨럽먼트, 인크. 마스킹된 사이토카인 폴리펩타이드
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN112166122A (zh) * 2018-12-13 2021-01-01 丁邦 抗体-肿瘤坏死因子α融合蛋白及其制法和应用
EP3927728A2 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Xencor, Inc. Untargeted and targeted il-10 fc-fusion proteins
US20220177550A1 (en) * 2019-03-28 2022-06-09 Orionis Biosciences, Inc. Chimeric proteins and chimeric protein complexes directed to fms-like tyrosine kinase 3 (flt3)
EP3969119A1 (en) 2019-05-17 2022-03-23 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusi0n proteins
CA3157024A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Xencor, Inc. Targeted il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
WO2021147886A1 (zh) * 2020-01-21 2021-07-29 张晋宇 一种药物组合物及其用途
KR20210110242A (ko) * 2020-02-28 2021-09-07 (주)셀트리온 수두 대상포진 바이러스 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물
IL296915A (en) * 2020-04-01 2022-12-01 Xilio Dev Inc Masked il-2 cytokines and their cleavage products
CN115996750B (zh) * 2020-04-21 2024-10-29 Kbio控股有限公司 通过病毒和抗原偶联形成的疫苗
CN113876938B (zh) * 2020-07-01 2024-04-19 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
AU2021301953B2 (en) * 2020-07-01 2025-01-02 Institute Of Biophysics, Chinese Academy Of Sciences Construction and application of fusion protein vaccine platform
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4251187A4 (en) 2020-11-25 2025-09-10 Xilio Dev Inc TUMOR-SPECIFIC CLASSIBLE LINKERS
EP4263836A1 (en) * 2020-12-23 2023-10-25 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
CA3211083A1 (en) * 2021-03-04 2022-09-09 Kyle BACKMAN Compositions including sbi adjuvants and methods of use thereof
CU24734B1 (es) * 2021-03-30 2025-02-07 Ct Inmunologia Molecular Composicones vacunales depletantes de factores de crecimiento hematopoyéticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
CN120022357A (zh) * 2021-03-31 2025-05-23 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
CN116375881A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 广州国家实验室 融合蛋白疫苗
WO2023178169A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Anemoi Biotech Holdings, Inc. Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection
WO2023224914A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating caveolinopathy diseases
CN114699521B (zh) * 2022-06-07 2023-02-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用
CN119613573B (zh) * 2025-02-14 2025-05-30 浙江大学 一种CD40L-Fc融合蛋白、基因片段、重组质粒、重组细胞以及制备方法和用途

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US650064A (en) * 1898-11-14 1900-05-22 Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company System of liquid distribution.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) * 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
DE3853515T3 (de) 1987-05-21 2005-08-25 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0294703B1 (en) 1987-06-10 1995-05-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
ES2054753T3 (es) 1987-09-02 1994-08-16 Ciba Geigy Ag Conjugados de citoquinas con inmunoglobulinas.
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
DE3850542T2 (de) 1987-09-23 1994-11-24 Bristol Myers Squibb Co Antikörper-Heterokonjugate zur Töting von HIV-infizierten Zellen.
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
ZA888978B (en) 1987-12-04 1990-07-25 Du Pont Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ATE123065T1 (de) * 1989-07-07 1995-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren herstellung.
WO1991001143A1 (en) * 1989-07-14 1991-02-07 Praxis Biologics, Inc. Stable vaccine compositions containing interleukins
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DE69032086T2 (de) 1989-12-22 1998-09-17 Hoffmann La Roche Zytotoxischer Lymphozyten-Reifefaktor
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
EP0577699A4 (en) * 1991-03-11 1995-03-15 Gen Hospital Corp COMPOSITIONS AND METHODS INHIBITING ACTIVATION OF THE ACTIVE FACTOR XIII.
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
ATE170559T1 (de) 1991-05-31 1998-09-15 Genentech Inc Behandlung der hiv-assoziierten immun- thrombopenie purpura
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993005169A1 (en) 1991-08-30 1993-03-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1993015210A1 (en) 1992-01-23 1993-08-05 Merck Patent Gmbh Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
DK0633929T3 (da) 1992-04-01 2004-06-28 Univ Rockefeller Fremgangsmåde til in vitro proliferation af dendritcelleforstadier og deres anvendelse til at producere immunogener
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
AU4528493A (en) 1992-06-04 1994-01-04 Regents Of The University Of California, The In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
EP1757694A3 (en) 1992-11-05 2008-02-27 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
JPH08509606A (ja) 1993-04-20 1996-10-15 ロビンソン，ウィリアム エス． 細胞内感染因子に感染した個体を処置する方法および物質
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
KR960701650A (ko) 1993-04-29 1996-03-28 찰스 엠. 브룩 에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods)
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
CZ312296A3 (en) 1994-04-26 1997-05-14 Childrens Medical Center Angiostatin and its application for angiogenesis inhibition
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
EP0772619B2 (en) * 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
EP1621206A1 (en) * 1994-12-12 2006-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP3342873B2 (ja) 1995-03-10 2002-11-11 ジェネンテク・インコーポレイテッド ｇａｓ６による受容体活性化
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
NZ311319A (en) 1995-06-07 2000-01-28 Trimeris Inc The treatment of HIV and other viral infections using the peptide DP-178 or DP-107 in combination therapy
IL122718A0 (en) 1995-06-30 1998-08-16 Lilly Co Eli Methods for treating diabetes
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
CA2252557A1 (en) 1996-04-26 1997-11-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonists of interleukin-15
CN1136197C (zh) 1996-05-30 2004-01-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新的哒嗪酮衍生物
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
ES2176574T3 (es) 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6737057B1 (en) * 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
AU6954398A (en) 1997-04-11 1998-11-11 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
ES2235336T3 (es) 1997-06-13 2005-07-01 Gryphon Therapeutics, Inc. Ligacion quimica nativa en fase solida de peptidos desprotegidos o protegidos en la cisteina n-terminal en solucion acuosa.
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
HK1038882A1 (zh) 1998-04-15 2002-04-04 利思进药品公司 通过共同给予血管生成抑制剂增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答
MXPA00010151A (es) 1998-04-17 2002-08-06 Lexigen Pharm Corp Mejoramiento de las respuestas inmunes mediadas por proteina de fusion de anticuerpo-citocina mediante la soadministracion con inhibidores de prostaglandina.
US6284536B1 (en) 1998-04-20 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
PL202057B1 (pl) 1998-08-25 2009-05-29 Merck Patent Gmbh Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, sposób jego otrzymywania oraz cząsteczka DNA i wektor ekspresyjny zawierający to DNA
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU1262900A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
JP2002534962A (ja) 1999-01-07 2002-10-22 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としての抗肥満症タンパク質の発現および輸送
ATE418340T1 (de) 1999-05-06 2009-01-15 Univ Wake Forest Zusammensetzungen und methoden zur identifikation von antigenen, die eine immunantwort hervorrufen
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
ATE369384T1 (de) 1999-05-19 2007-08-15 Emd Lexigen Res Ct Corp Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
AU5617900A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Robert C. Gallo Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
AU781618C (en) * 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AU778611B2 (en) 1999-08-09 2004-12-16 Merck Patent Gmbh Multiple cytokine-antibody complexes
EP1222289B1 (en) * 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
CA2399866C (en) 2000-02-24 2011-05-10 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
NZ522320A (en) 2000-05-12 2007-03-30 Neose Technologies Inc In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
ATE368475T1 (de) 2000-06-29 2007-08-15 Emd Lexigen Res Ct Corp Steigerung von durch antikörper-zytokin- fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
HUP0401300A3 (en) 2001-01-18 2005-06-28 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
AU2002233340B2 (en) 2001-02-19 2008-05-22 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
EP1366455B1 (en) 2001-02-19 2008-07-02 MERCK PATENT GmbH Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
BR0207854A (pt) 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE10118308A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
WO2003015697A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
US20030180287A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-25 Immunex Corporation Polypeptide formulation
CN100343393C (zh) 2002-03-15 2007-10-17 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
DK1572748T3 (da) 2002-12-17 2010-08-23 Merck Patent Gmbh Humaniseret antistof (H14.18) af muse-14.18-antistof der binder til GD2 og dets fusionsprotein med IL-2
CA2522690A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DE602004031390D1 (de) * 2003-05-06 2011-03-24 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor VII-Fc chimäre Proteine zur Behandlung von hämostatischen Krankheiten
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) * 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
MX2011011044A (es) * 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.

Also Published As

Publication number Publication date
SK782002A3 (en) 2003-08-05
CA2378866C (en) 2011-06-07
ZA200200501B (en) 2003-03-26
JP4764585B2 (ja) 2011-09-07
EP1198250A1 (en) 2002-04-24
AU6358300A (en) 2001-02-13
DK1198250T3 (da) 2007-12-27
KR20020020794A (ko) 2002-03-15
ES2292457T3 (es) 2008-03-16
CZ304884B6 (cs) 2015-01-07
DE60036552D1 (de) 2007-11-08
US20050261229A1 (en) 2005-11-24
AU779388B2 (en) 2005-01-20
JP2003505431A (ja) 2003-02-12
EP1198250B8 (en) 2007-11-21
US8043608B2 (en) 2011-10-25
PL353344A1 (en) 2003-11-17
US7955590B2 (en) 2011-06-07
BR0012569A (pt) 2002-05-28
PT1198250E (pt) 2008-01-02
MXPA02000746A (es) 2002-09-18
NO20020255D0 (no) 2002-01-17
PL201664B1 (pl) 2009-04-30
EP1198250B1 (en) 2007-09-26
WO2001007081A1 (en) 2001-02-01
DE60036552T2 (de) 2008-06-26
CZ2002182A3 (cs) 2003-11-12
KR100689739B1 (ko) 2007-03-09
NO20020255L (no) 2002-03-15
ATE374042T1 (de) 2007-10-15
CA2378866A1 (en) 2001-02-01
CN1308037C (zh) 2007-04-04
RU2248214C2 (ru) 2005-03-20
US20100068175A1 (en) 2010-03-18
CN1374871A (zh) 2002-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU779388B2 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
EP0680513B1 (en) Lysosomal targeting of immunogens
KR100671036B1 (ko) 오스테오프로테게린 리간드 활성을 하향-조절하는 방법
EP0997477B1 (en) MHC complexes and uses thereof
US20110182926A1 (en) Minigene
WO2001026608A2 (en) Dna vaccines encoding antigen linked to a domain that binds cd40
JP2001503014A (ja) 防御免疫応答を増強するための方法
US10077296B2 (en) Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer
CN101260152A (zh) 负调节Osteoprotegerin配体活性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees