CZ2003214A3 - Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu - Google Patents

Description

Zesílení odpovědí mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu z Oblast techniky

Vynález se týká fúzních proteinů protilátka-cytokin použitelných pro cílenou imunitní terapii. Obecně se vynález týká použití činidel zvyšujících uptake imunocytokinu při kombinované léčbě pro zvýšení imunitní odezvy mediované fúzním proteinem protilátka-cytokin proti předem zvolenému cíli, například proti nádorovým buňkám. Vynález se zejména týká podání fúzních proteinů protilátka-cytokin v kombinaci s chemoterapeutickými činidly, jakými jsou například taxany a/nebo alkylační činidla, při léčbě nádorových buněk a dalších rakovinových nebo chorobných buněk.

Dosavadní stav techniky

Účinná léčba chorob, jakou je například rakovina, vyžaduje silné imunitní odpovědi jednoho nebo několika typů efektorových buněk, jakými jsou například přirozené „zabíječe nebo-li NK buňky, makrofágy a T lymfocyty. U živočichů a pacientů trpících nádory se imunitní systém nedokáže účinně vypořádat s rostoucím nádorem, zejména z toho důvodu, že specifické mechanismy působí tak, že nádor potlačuje imunitní odpověď. V mnoha případech migrují monocytické buňky potenciálně destruující nádor, např. makrofágy, do ložisek rostoucích nádorů, ale sekrece faktorů, jakými jsou například prostaglandiny, TGF-β a

01-3623-02-Ma

IL-10, nádorovými buňkami moduluje jejich cytotoxickou aktivitu (viz například Sharma a kol., 1999, J. IMMUNOL. 163: str. 5020 až 5028). Podobně mohou být faktory, které jsou sekretovány nádory, a stejně tak interakcemi s receptory, které se exprimují na povrchu nádorových buněk a které aktivují apoptózu imunitních buněk, potlačeny lymfocytické buňky migrující do nádorů, jako například NK a T buňky, (viz například Villunger a kol; 1997, BLOOD 90: str. 12 až 20) . Vystavení těchto lymfocytů působení imunosupresivních monocytických buněk v ložisku nádoru může dále snižovat jejich schopnost vytvořit účinnou protinádorovou odpověď.

Snahy překonat imunitně supresivní účinky místního mikroprostředí nádoru zahrnují cílenou imunitní stimulaci, například léčbu nádorově specifickými fúznímí proteiny protilátka-cytokin. Účinnost tohoto přístupu byla demonstrována na několika myších modelech nádorových metastáz, nicméně léčba je mnohem méně účinná, jakmile se nádor zvětší. Tato snížená účinnost je pravděpodobně způsobena zvýšenou hladinou supresivních faktorů sekretovaných nádorovou hmotou, a stejně tak celou řadou dalších faktorů, jakými jsou například zvýšení tlaku v nádorové intersticiální tekutině (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) a neschopnost terapeutických činidel pronikat pevnými nádory.

Přestože se k léčbě většiny pacientů trpících rakovinou stále používá jeden nebo několik cyklů chemoterapie, je známo, že cytotoxická léčba rakoviny současně poškozuje imunitní systém. Imunitní buňky patří mezi nejrychleji se dělící buňky v lidském těle a jakákoliv léčba, která hubí dělící se buňky, bude hubit i imunitní buňky. Všechny léčby, které zahrnují ozařování, ···*

01-3623-02-Ma

DNA-poškozující chemikálie, inhibitory DNA syntézy a inhibitory submikroskopické funkce tedy současně poškozují imunitní systém. Transplantáty kostní dřeně jsou nutným doplňkem protirakovinové terapie, která, společně s nádorovými buňkami, poškozuje i imunitní systém, jenž je třeba obnovit. Jako imunosupresivní látka se často používá methotrexat a další protirakovinové účinné složky. Rovněž je prokázáno, že protirakovinové léčba může specificky inhibovat funkci T buněk. Například u pacientů s Hodgkinovou chorobou, kteří byli léčeni ozařováním celého těla, vznikla zřejmě trvalá ztráta naivních T buněk (Watanabe a kol., 1997, Blood 90: str. 3662).

S přihlédnutím k současným znalostem se zdá být nepravděpodobné, že by byly standardní léčebné postupy (chemoterapie a ozařování) a lokální imunitní stimulace použitelnou kombinací pro účinnou léčbu rakoviny. Tato oblast si tedy žádá navržení způsobů, které zesílí imunitní odpovědi mediované fúzním proteinem protilátka-cytokin proti předem zvoleným buněčným typům, například proti nádorovým buňkám. Žádané jsou rovněž kompozice využitelné v rámci těchto způsobů.

Podstata vynálezu

Zjistilo se, že pokud se podá savci postiženému nádorem nebo nádorovou metastázou fúzní protein protilátka-cytokin (imunocytokin) , potom je možné vytvořit účinnější protinádorovou odpověď, pokud se podá před léčbou, současně s léčbou nebo po léčbě savce činidlem posilujícím uptake imunocytokinu, který zvyšuje nebo zesiluje terapeutický účinek fúzního proteinu protilátka-cytokin zesílením nebo

01-3623-02-Ma

zvýšením jeho absorpce nádorem. Ukázalo se, že použitelná činidla zvyšující uptake imunocytokinů obsahují alkylační chemoterapeutická činidla a taxany, jakým je například paclitaxel. Zejména se zjistilo, že takové kombinace jsou použitelné při zprostředkování imunitní destrukce předem * zvoleného buněčného typu, například nádorových buněk nebo virem infikovaných buněk.

V jedné kategorii vynález poskytuje způsob indukce cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu u savce. Tento způsob zahrnuje podání (i) imunocytokinu obsahujícího vazebné místo protilátky, které je schopno navázat předem zvolený buněčný typ, a cytokin, který je schopen indukovat imunitní odpověď proti takovému předem zvolenému buněčnému typu, a (ii) činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu v množství dostatečném pro zesílení imunitní odpovědi, v porovnání s imunitní odpovědí získanou při stimulaci samotným imunocytokinem, savci.

U výhodného provedení může být předem zvoleným buněčným typem rakovinová buňka, přítomná například v pevném nádoru, výhodně ve větším pevném nádoru (tj. větším než přibližně 100 mm³) . Alternativně může být předem *

zvoleným buněčným typem rakovinová buňka malých metastáz.

U dalšího výhodného provedení lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat současně s imunocytokinem. Alternativně lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat před podáním imunocytokinu. Do rozsahu vynálezu patří i způsob, kdy lze imunocytokin podávat společně s množinou různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinů. Alternativně lze činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podávat společně s množinou různých imunocytokinů.

····

01-3623-02-Ma

V další kategorii vynález poskytuje kompozici pro indukci cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu u savce. Tato kompozice obsahuje v kombinaci: (i) imunocytokin obsahující vazebné místo protilátky, které je schopno navázat předem zvolený buněčný typ, a cytokin, který je schopen indukovat takovou imunitní odpověď proti předem zvolenému buněčnému typu u savce, a (ii) činidlo zvyšující uptake imunocytokinu v množství dostatečném pro zesílení cytocidní odpovědi indukované kombinací imunocytokinu, v porovnání s cytocidní odpovědí získanou při stimulaci samotným imunocytokinem.

U výhodného provedení vazebné místo protilátky v imunocytokinu výhodně zahrnuje těžký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment vážící antigen. Těžký řetězec imunoglobulinu výhodně zahrnuje, ve směru N-konec -> C-konec, imunoglobulinovou doménu proměnné oblasti (V_H) , která je schopna navázat předem zvolený antigen, imunoglobulinovou konstantní těžkou 1 (CH1) doménu, imunoglobulinovou konstantní těžkou 2 (CH2) doménu, a případně může dále zahrnovat imunoglobulinovou konstantní těžkou 3 (CH3) doménu. U výhodnějšího provedení je imunocytokinem fúzní protein obsahující imunoglobulinový těžký řetězec nebo jeho fragment vážící antigen navázaný přes polypeptídovou vazbu na cytokin. Výhodný fúzní protein protilátka-cytokín tedy obsahuje ve směru N-konec -> C-konec (i) vazebné místo protilátky, které obsahuje imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou vázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CH1 doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu (případně CH3 doménu), a (ii) cytokin. Způsoby výroby a použití takových fúzních proteinů podrobně popisuje Gillies a kol., (1992) Proč. Nati. Acad.

····

Sci. USA 89: str. 1428 až 1432; Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203; a patent US 5 650 150.

Imunoglobulinovými doménami konstantní oblasti (tj. CH1, CH2 a/nebo CH3 doménami) mohou být domény konstantní oblasti zpravidla spojované s doménou proměnné oblastí v přirozeně se vyskytující protilátce. Alternativně lze jednu nebo několik imunoglobulinových domén konstantních oblastí odvodit z protilátek jiných, než je protilátka použitá jako zdroj domény proměnné oblasti. Jinými slovy, imunoglobulinovou doménu proměnné oblasti a konstantní oblasti lze odvodit z různých protilátek, například z protilátek odvozených z různých zdrojů. Viz například patent US 4 816 567. Imunoglobulinové proměnné oblasti mohou dále obsahovat sekvence úseků základní struktury (FR) odvozené z jednoho druhu, například lidské, a komplementaritu určující regionální (CDR) sekvence vložené mezi sekvence FR odvozené z druhého „odlišného druhu, například z myší. Způsoby výroby a použití takových chimérických imuno-globulinových proměnných oblastí jsou popsány například v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089.

Imunocytokiny na bázi protilátky dále výhodně obsahují imunoglobulinový lehký řetězec, který je výhodně kovalentně navázán na imunoglobulinový těžký řetězec, například pomocí disulfidové vazby. Proměnné oblasti navázaných imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců společně definují jediné a kompletní vazebné místo pro navázání předem zvoleného antigenu. U dalších provedení imunocytokiny obsahují dva chimérické řetězce, přičemž každý obsahuje alespoň část imunoglobulinového těžkého řetězce navázaného na cytokin. Tyto dva chimérické řetězce jsou výhodně vzájemně kovalentně navázány, například pomocí jedné nebo několika meziřetězcových disulfidových vazeb.

»···

01-3623-02-Ma

Vynález tedy poskytuje fúzní proteiny, ve kterých je specifičnost pro navázání antigenu a aktivita protilátky zkombinována s účinnou biologickou aktivitou cytokinu. Fúzní protein podle vynálezu lze použít pro selektivní dopravu cytokinu k cílové buňce in vivo tak, aby cytokin mohl vyvinout lokalizovaný biologický účinek v bezprostředním okolí cílové buňky. U výhodného provedení je protilátka, jako jedna ze složek fúzního proteinu, specificky navázána na antigen na rakovinové buňce nebo uvnitř rakovinové buňky, a v důsledku toho vykazuje fúzní protein lokalizovanou protirakovinovou aktivitu. U alternativního výhodného provedení je protilátka jako jedna ze složek fúzního proteinu specificky navázána na virem infikovanou buňku, například na HIV infikovanou buňku, a v důsledku toho fúzní protein vykazuje lokalizovanou antivirovou aktivitu.

Cytokiny, které lze zabudovat do imunocytokinů podle vynálezu, zahrnují například nádor nekrotizující faktory, interleukiny, kolonie stimulující faktory a lymfokiny, a stejně tak další, v daném oboru známé cytokiny. Výhodné nádor nekrotizující faktory zahrnují například tkáně nekrotizující faktor α (TNFa). Výhodné interleukiny zahrnují například interleukin-2 (IL-2), interleukín-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-7 (IL-7), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15) a interleukin-18 (IL-18). Výhodné kolonie stimulující faktory zahrnují například faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF) a faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF). Výhodné lymfokiny zahrnují například lymfotoxin (LT). Další použitelné cytokiny zahrnují interferony včetně IFN-a, IFN-β a IFN-γ, které mají imunologické účinky, a stejně tak

01-3623-02-Ma které jsou nezávislé na jejich ···· antiangiogenní účinky, antivirových aktivitách.

několika typů chemoterapeutických činidel se prokázalo, že jsou účinnými činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů. Použitelná činidla zvyšující uptake imunocytokinů zahrnují zejména taxany a alkylační chemoterapeutická činidla. V dané oblasti je známo několik taxanů (viz Bissery a Lavelle, 1997, v Cancer Therapeutics: Experimental and Clinical Agents, kapitola 8, vydavatel B. Teicher). U výhodného provedení je taxanem Taxol, který je rovněž znám jako paclitaxel. Další provedení zahrnují semisyntetický taxan, docetaxel, který je u některých nádorových modelů a klinických indikací účinnější než paclitaxel. Další provedení zahrnují další deriváty taxanu, například deriváty odvozené z přírodního výchozího materiálu, kterým je 10-deacetyl Baccatin III a který je extrahován z jehličí tisu evropského. Příkladem takového derivátu je orálně dostupná sloučenina, IDN5109, která je rovněž slabým substrátem pro P-glykoprotein a zpravidla je účinnější proti „multidrogově rezistentním nádorům (nádorům rezistentním proti více účinným látkám). Kromě toho, že je orálně biologicky dostupná, má rovněž vyšší tolerovanou dávku a vykazuje méně neurotoxických vedlejších účinků (Polizzi a kol., 1999, Cancer Res. 59: str. 1036 až 1040) .

Vynález rovněž poskytuje výhodné dávky a režimy pro podávání imunocytokinů v kombinaci s činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů.

·· • ·

01-3623-02-Ma ·♦·· .······

Stručný popis obrázků

Obr. 1 je schématickou reprezentací cytokinu.

Obr. 2 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na objem nádoru LLC/KSA v závislosti na čase.

Obr. 3 znázorňuje vliv množiny dávek paclitaxelu a imunocytokinu na nádor středního objemu v závislosti na čase.

Obr. 4 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na hmotnost nádoru v testu plicní metastázy.

Obr. 5 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na objem CT26/KSA nádoru v závislosti na čase.

Obr. 6 znázorňuje vliv paclitaxelu a imunocytokinu na hmotnost nádoru v testu metasťáz střev.

Obr. 7A a 7B znázorňují vliv paclitaxelu na uptake imunocytokinu nádorem.

Obr. 8 znázorňuje vliv cyklofosfamidu na uptake imunocytokinu nádorem.

Obr. 9 znázorňuje vliv cyklofosfamidu a imunocytokinu na hmotnost nádoru při testu metastáz plic.

na	Obr. 9B znázorňuje objem nádoru v testu	vliv cyklofosfamidu a	imunocytokinu
růstu	nádoru.
	Obr. 9C znázorňuje	vliv	cyklofosfamidu a	imunocytokinu
na	objem nádoru v testu	růstu	nádoru.
	Obr. 10 znázorňuje	vliv	karboplatíny a	imunocytokinu
na	objem nádoru v testu	růstu	nádoru.

··

01-3623-02-Ma ····

Studie ukázaly, že velké pevné nádory mnohem více odolávají terapeutické intervenci mediované protilátkou a imunitním terapiím obecně, než roztroušená metastatická centra (Sulitzeanu a kol., (1993) Adv. Cancer Res. 60: str. 247 až 267). Předpokládá se, že podstatou nižší citlivosti pro terapie na bázi protilátky jsou částečně imunosupresivní faktory produkované nádory.

Ačkoliv není mechanismus zneškodnění nádoru zcela pochopen,. předpokládá se, že cytotoxické odpovědi T lymfocytu (CTL) mohou vést k destrukci rakovinové buňky a poskytnout imunitní paměť. Dále se předpokládá, že za určitých okolností jsou přirozené (killer cells) NK buňky odpovědné za zneškodnění nádoru při absenci CTL. Rozdílné imunitní odpovědi mohou být způsobeny faktem, že určité nádory produkují různé typy nebo různá množství látek schopných omezovat T buňky. Spíše než v případě mikrometastatických center to platí v případě pevných nádorů, které dosáhly kritické hmotnosti a jsou schopny produkovat a vylučovat imunosupresivní faktory v hladinách dostatečných pro modulaci imunitní odpovědi proti nádorům.

Zjistilo se, že cytocidní imunitní odpovědi iniciované imunocytokinem proti předem zvolenému buněčnému typu lze významně zesílit podáním imunocytokinu společně s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu. Kombinovaná terapie je účinná, zejména při mediaci imunitní destrukce nemocné tkáně, jakou je například založený nádor. Bez snahy vázat se na určitou konkrétní teorii se dá předpokládat, že činidlo zvyšující uptake imunocytokinu zlepšuje průnik imunocytokinu do mikroprostředí nádoru, a tak mu umožňuje překonat imunitní supresivní účinek a zefektivnit aktivaci buněčných imunitních odpovědí proti nádoru. Podobně se předpokládá, že tato metoda může být použitelná při léčbě

01-3623-02-Ma ·♦ ·*, ► · · l určitých virových onemocnění, kdy podobný imunitu potlačující mechanismus brání účinné buněčné imunitě, například při HIV infekci. Předpokládá se, že činidlo zvyšující uptake imunocytokinu působí synergicky s imunocytokinem při mediaci imunitní destrukce nemocné tkáně, jakou je například založený nádor nebo virově infikovaná buňka. Vynález rovněž popisuje způsoby výroby a použití použitelných imunocytokinů, a stejně tak testy použitelné pro testování jejich farmakokinetických aktivit u pre-klinických in vivo modelů zvířat, pokud se použijí v kombinaci s vhodnými činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů .

Výraz „činidlo zvyšující uptake imunocytokinu, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená libovolné činidlo, které zesiluje cytocidní imunitní odpovědi indukované imunocytokinem proti předem zvolenému buněčnému typu. Konkrétněji je výhodným činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu činidlo zvyšující uptake imunocytokinu, které podporuje pronikání imunocytokinu do nádoru. Příklady činidel zvyšujících uptake imunocytokinů zahrnují neomezujícím způsobem chemoterapeutická činidla, jakými jsou například taxany, činidla poškozující DNA včetně alkylačních chemoterapeutických činidel, činidel používaných při léčebném ozařování a činidel, které modulují krevní tlak. Výhodnými taxany jsou Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty. Výhodnými alkylačními činidly jsou cyklofosfamid, karboplatina, cisplatina a jejich deriváty. Výhodnou formou záření je γ-záření. Výhodným činidlem modulujícím krevní tlak je agonizující činidlo angiotensinu II, například angiotensin II samotný, výhodně podávaný periodicky podle obecných principů, které popsal Netti a kol., (Cancer

01-3623-02-Ma

Research [1995] 55: str. 5451 až 5458) a Netti a kol., (Pros. Nat. Acad. Sci. [1999] 96: str. 3137 až 3142) . Imunitní odpověď lze určit metodami, které jsou odborníkům v daném oboru známé a/nebo za použití metod, které jsou zde popsané.

Výraz „cytocidní imunitní odpověď, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená jakoukoliv imunitní odpověď v těle savce, a to buď humorální nebo celulární povahy, která je stimulována imunocytokinem a která buď hubí, nebo jiným způsobem omezuje životnost předem zvoleného buněčného typu u savce. Imunitní odpověď může zahrnovat jeden nebo více buněčných typů včetně T buněk, NK buněk a makrofágů.

Výraz „imunocytokin, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená fúzi (i) vazebného místa protilátky, které má vazebnou specifičnost a které je schopno navázat předem zvolený antigen, například antigen specifický pro daný buněčný typ, a (ii) cytokinů, který je schopen indukovat nebo stimulovat cytocidní imunitní odpovědi, zpravidla proti rakovinové nebo virově infikované buňce. Příklady předem zvolených antigenů zahrnují antigeny buněčného povrchu, jakými jsou například antigeny na rakovinových buňkách nebo virově infikovaných buňkách, a nerozpustné intracelulární antigeny, například antigeny nekrotických buněk, které mohu zůstat navázané na buněčné membráně. Výhodnými antigeny jsou cílové antigeny, které jsou charakteristické pro nádorové buňky, jakými jsou například antigeny specifické pro nádor. Imunocytokin je tedy schopen selektivně dopravovat cytokin k cíli (kterým je zpravidla buňka) in vivo tak, aby cytokin mohl mediovat lokalizované imunitní odpovědi proti cílové buňce. Pokud se například protilátka jako složka imunocytokinu selektivně naváže na antigen na rakovinové buňce, například na >···

01-3623-02-Ma • · « + «··*· ·· *· ** • · *

» · w

♦ · ·♦ ·· rakovinové buňce v pevném nádoru, a zejména v pevném nádoru, jehož objem je větší než přibližně 100 mm³, potom imunocytokin vykazuje lokalizovanou protinádorovou aktivitu. Alternativně, pokud se protilátka jako složka imunocytokinu selektivně naváže na antigen na virově infikované buňce, jakou je například HIV infikovaná buňka, potom imunocytokin vykazuje lokalizovanou antivirovou aktivitu.

Výraz „vazebné místo protilátky, jak je zde použit, je třeba chápat tak, že znamená alespoň část imunoglobulinového těžkého řetězce, například imunoglobulinovou proměnnou oblast, která je schopna navázat antigen předem zvoleného buněčného typu. Vazebné místo protilátky rovněž výhodně zahrnuje alespoň část imunoglobulinové konstantní oblasti zahrnující například CH1 doménu, CH2 doménu a případně CH3 doménu nebo alespoň CH2 doménu, nebo její jednu nebo více částí. Kromě toho imunoglobulinový těžký řetězec může být asociován kovalentním nebo nekovalentním způsobem na imunoglobulinový lehký řetězec obsahující například proměnnou oblast imunoglobulinového lehkého řetězce, a případně konstantní oblast lehkého řetězce. Předpokládá se tedy, že vazebné místo protilátky může obsahovat intaktní protilátku nebo její fragment nebo jednořetězcovou protilátku, které jsou schopné navázání na předem zvolený antigen.

Pokud jde o imunocytokin, předpokládá se, že fragment protilátky lze navázat na cytokin celou řadou odborníkům v daném oboru známých způsobů. Vazebné místo protilátky se například výhodně naváže přes polypeptidovou vazbu nebo přes linker na cytokin v konstruktu fúzního proteinu. Alternativně lze vazebné místo protilátky chemicky navázat na cytokin prostřednictvím reakčních skupin, například

01-3623-02-Ma

prostřednictvím sulfhydrylových skupin, v aminokyselinových bočních řetězcích přítomných v místě pro navázání protilátky a v cytokinu.

Výraz „cytokin, jak je zde uveden, je třeba chápat tak, že znamená libovolný protein nebo peptid, jejich analog nebo funkční fragment, který je schopen stimulovat nebo indukovat cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolenému buněčnému typu, například proti rakovinové buňce nebo virově infikované buňce, v těle savce. Předpokládá se tedy, že lze do imunocytokinů podle vynálezu zabudovat celou řadu různých cytokinů. Použitelné cytokiny zahrnují například nádor nekrotizující faktory (TNF), interleukiny (IL), lymfokiny (L), kolonie stimulující faktory (CSF), interferony (IFN) včetně jejich druhových variant a zkrácených analogů, které jsou schopny stimulovat nebo indukovat takové cytocidní imunitní odpovědi. Použitelné nádor nekrotizující faktory zahrnují například TNFa. Použitelné lymfokiny zahrnují například LT. Použitelné kolonie stimulující faktory zahrnují například GM-CSF a M-CSF. Použitelné interleukiny zahrnují například IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 a IL-18. Použitelné interferony zahrnují například IFN-a, IFN-β a IFN-γ.

Gen kódující příslušný požadovaný cytokin lze klonovat de novo, získat z dostupného zdroje nebo syntetizovat standardní DNA syntézou ze známé nukleotidové sekvence. Například je známa DNA sekvence LT (viz například Nedwin a kol., (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: str. 6361), stejně jako jsou známy sekvence pro IL-2 (viz například Taniguchi a kol., (1983) NÁTUŘE 302: str. 305 až 318), GM-CSF (viz například Gasson a kol., (1984) SCIENCE 266: str. 1339 až 1342) a TNFa (viz například Nedwin a kol., (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: str. 6361).

·· ·· · · ·· ····

01-3623-02-Ma

U výhodného provedení jsou imunocytokiny rekombinantní fúzní proteiny produkované konvenčními rekombinantními DNA metodami, tj . navázáním nukleokyselinového konstruktu kódujícího chimérický imunocytokin. Konstrukce rekombinantních fúzních proteinů protilátka-cytokin je popsána ve stavu techniky, viz například Gillies a kol., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432; Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203; a v patentu US 5 650 150. Výhodně zahrnuje genový konstrukt kódující imunocytokin podle vynálezu, ve směru 5' -> 3', DNA segment kódující doménu proměnné oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce, DNA segment kódující konstantní oblast ímunoglobulinového těžkého řetězce a DNA kódující cytokin. Fúzovaný gen je součástí expresního vektoru nebo se do něj zavede ve snaze transfektovat jej do vhodného buněčného příjemce, kde se fúzovaný gen exprimuje. Hybridní polypeptidový řetězec se výhodně kombinuje s imunoglobulinovým lehkým řetězcem, například v kombinaci ímunoglobulinové proměnné oblasti těžkého řetězce (V_H) a imunoglobulinové proměnné oblasti lehkého řetězce (V_L) , za vzniku jediného a kompletního místa pro navázání předem zvoleného antigenu. U výhodného provedení jsou imunoglobulinový těžký a lehký řetězec kovalentně spojeny, například pomocí meziřetězcové disulfidové vazby. Kromě toho mohou být například pomocí jedné nebo několika meziřetězcových disulfidových vazeb kovalentně spojeny dva imunoglobulinové těžké řetězce, z nichž jeden nebo oba jsou navázány na cytokin.

Způsoby podle vynálezu jsou tedy použitelné pro zesílení protinádorové aktivity imunocytokinu použitého v rámci terapeutické metody při léčbě nádoru, která zahrnuje přípravky imunocytokinu a způsoby, popsané v mezinárodních

01-3623-02-Ma • 4 4 44 44 444444

444 4 444 4 4 4 4 patentových přihláškách WO 99/29732, WO 99/43713, WO 99/52562, WO 99/53958 a WO 01/10912, a rovněž zahrnuje fúzní proteiny na bázi protilátky se změněnou aminokyselinovou sekvencí v oblastí připojení. U jednoho provedení jsou způsoby podle vynálezu použitelné v kombinaci s Fc fúzními proteiny, jakým je například Fc-interferon-α.

Obr. 1 je schématickou reprezentací příkladného imunocytokinu 2· ^u tohoto provedení jsou molekuly 2 a 4_ cytokinu navázány pomocí peptidové vazby na C-konce 6 a 8. CH3 oblastí 10 a 12 těžkých řetězců 14 a 16 protilátky. Je známo, že V_L oblasti 26 a 28 jsou spárovány s V_H oblastmi 18 a 20 v typické IgG konfiguraci, čímž poskytují dvě vazebná místa 30 a 32 pro navázání antigenu na N-koncích imunocytokinu _1 a dvě vazebná místa 4_0 a £2 pro navázání cytokinového receptorů na C-koncích imunocytokinu jL. Samozřejmě, že v širších aspektech nemusí být imunocytokiny spárovány zde ilustrovaným způsobem nebo může být na molekulu cytokinu navázán pouze jeden ze dvou imunoglobulinových těžkých řetězců.

Imunocytokiny podle vynálezu lze díky dvěma aspektům jejich struktury považovat za chimérické. Za prvé je imunocytokin chimérický proto, že obsahuje imunoglobulinový těžký řetězec mající vazebnou specifičnost pro navázání antigenu navázaného na daném cytokinu. Za druhé může být imunocytokin podle vynálezu chimérický v tom smyslu, že obsahuje imunoglobulinovou proměnnou oblast (V) a imunoglobulinovou konstantní oblast (C) , přičemž každá z nich je odvozena z jiné protilátky, takže výsledným proteinem je V/C chimérou. Proměnnou a konstantní oblast lze například odvodit z přirozeně se vyskytujících molekul protilátky ízolovatelné z různých druhů, viz například

01-3623-02-Ma > · · · · · patent US 4 816 567. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají konstrukty, ve kterých jedna nebo obě imunoglobulinové proměnné oblasti obsahují sekvence úseků základní struktury (FR) a sekvence oblasti určující komplementaritu (CDR) odvozené z různých druhů. Takové konstrukty jsou například popsány v Jones a kol., (1986) Nátuře 321: str. 522 až 525, Verhoyen a kol., (1988) SCIENCE 239: str. 1534 až 1535 a v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089. Kromě toho se předpokládá, že lze sekvence proměnné oblasti odvodit screenmgem knihoven, například fágy zobrazujících knihoven, zaměřeným na sekvence proměnných oblastí, které vážou předem zvolený antigen s požadovanou afinitou. Způsoby sestavení a screeningu fágy zobrazujících knihoven jsou popsány například v Huse a kol., (1989) Science 246: str. 1275 až 1281 a v Kang a kol., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: str. 11120 až 11123.

(Ig5), IgE (Ige), výhodné se jeví

Domény konstantní oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce imunocytokinů lze zvolit z kterékoliv z pěti imunoglobulinových tříd označených jako IgA (Igoí), IgD IgG (Igy) a IgM (Igp) . Nicméně jako konstantní oblastí imunoglobulinového těžkého řetězce z IgG třídy. Kromě toho se předpokládá, že imunoglobulinové těžké řetězce lze odvodit z kterékoliv podtřídy IgG protilátek, které jsou v daném oboru označovány jako IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Je známo, že každá konstantní oblast imunoglobulinového těžkého řetězce obsahuje čtyři nebo pět domén. Domény jsou postupně označeny následujícím způsobem: CHl-pant-CH2-CH3-(-CH4). CH4 Se nachází v IgM, který nemá pantovou oblast. DNA Sekvence domén těžkého řetězce mají křížovou homologii mezi imunoglobulinovými třídami, například CH2 doména IgG je homologická s CH2 doménou IgA a IgD a současně s CH3

01-3623-02-Ma doménou IgM a IgE. Imunoglobulinové lehké řetězce mohou mít buď kapa (k) nebo lambda (λ) konstantní řetězec. Sekvence a zarovnání sekvencí těchto imunoglobulinových oblastí jsou v daném oboru známy (viz například Kabat a kol., „Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 3. vydání 1983, 4. vydání 1987, a Huck a kol., (1986) NUC. ACIDS RES. 14: str. 1779 až 1789).

U výhodných provedení je proměnná oblast odvozena z protilátky specifické pro antigen předem zvoleného buněčného povrchu (antigen asociovaný s nemocnou buňkou, jakou je například rakovinová buňka nebo virově infikovaná buňka) , a konstantní oblast zahrnuje CH1 a CH2 (a případně CH3) domény z protilátky, která je shodná s protilátkou, jenž je zdrojem proměnné oblasti nebo se od této protilátky liší. Při realizaci vynálezu je protilátka, která je částí imunocytokinu, výhodně neimunogenní nebo slabě imunogenní v jí určeném příjemci. Tato protilátka se, pokud je to možné, výhodně odvodí ze stejných druhů jako zamýšlený příjemce. Pokud se má imunocytokin například podávat lidem, potom jsou domény konstantní oblasti výhodně lidského původu. Viz například patent US 4 816 567. Kromě toho, pokud se imunoglobulinová proměnná oblast odvodí z druhu jiného, než jakým je zamýšlený příjemce, například pokud jsou sekvence proměnné oblasti myšího původu a pokud je zamýšleným příjemcem člověk, potom proměnná oblast výhodně obsahuje lidské FR sekvence s myšími CDR sekvencemi zavedenými mezi FR sekvencemi, které tak vytvářejí chimérickou proměnnou oblast mající vazebnou specifičnost pro předem zvolený antigen, ale současně minimalizují imunoreaktivitu v těle zamýšleného hostitele. Návrh syntézy takových chimérických proměnných oblastí popsal Jones a kol., (1986) v Nátuře

01-3623-02-Ma • · * ·

321: str. 522 až 525; Verhoyen a kol., (1988) SCIENCE 239: str. 1534 až 1535 a rovněž jsou popsány v patentech US 5 225 539 a US 5 585 089. Klonování a expresi humanizovaného fúzního proteinu protilátka-cytokin, fúzního proteinu KS-1/4 anti-EpCAM protilátka-IL-12, a stejně tak jeho schopnost zneškodnit založené metastázy karcinomu střev popsal Gillies a kol., (1998) v J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203.

Gen kódující cytokin je napojen buď přímo, nebo pomocí linkeru, například pomocí DNA kódující (Gly4-Ser)₃ linker na 3' konci genu kódujícího imunoglobulinovou konstantní oblast (např. CH2 nebo CH3 exon). U určitých provedení může linker obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující místo proteolytického štěpení. Toto místo, pokud je zařazeno mezi imunoglobulinovou konstantní oblastí a cytokinem, může být navrženo tak, aby umožnilo proteolytické uvolnění cytokinu v cílovém místě. Je například známo, že se plasmin a trypsin štěpí za lysinovým a argininovým zbytkem, což jsou místa, která jsou přístupná proteáze. V daném oboru je známo mnoho dalších místně specifických endoproteáz a aminokyselinových sekvencí, které tyto endoproteázy štěpí. Výhodná místa proteolytického štěpení a proteolytické enzymy, které jsou reaktivní v takových místech štěpení, jsou popsány v patentech US 5 541 087 a US 5 726 044.

Nukleokyselinový konstrukt může případně zahrnovat endogenní promotor a zesilovač pro gen kódující proměnnou oblast, jejichž úkolem je regulovat expresi chimérického imunoglobulinového řetězce. Geny kódující proměnnou oblast lze například získat jako DNA fragmenty obsahující vedoucí peptid, VJ gen (funkčně přeuspořádané proměnné (V) oblasti se spojovacím (J) segmentem) pro lehký řetězec, nebo VDJ gen pro těžký řetězec a endogenní promotor a zesilovač

01-3623-02-Ma • · • · 4 4 4 4 těchto genů. Alternativně lze gen kódující proměnnou oblast získat bez endogenních regulačních prvků a použít jej v expresním vektoru, který tyto prvky poskytuje.

Geny kódující proměnnou oblast lze získat standardními

DNA klonovacími postupy buněk, které požadovanou protilátku, produkuj í knihovny,

Screening genomové zaměřený na specificky funkčně přeuspořádanou proměnnou oblast, lze provádět za použití vhodných DNA sond, jakými jsou například DNA segmenty obsahující DNA sekvenci J oblasti a následující (downstream) sekvence. Identifikace a potvrzení správných klonů se dosáhne sekvencováním klonovaných genů a porovnáním sekvence s odpovídající sekvencí celodélkové a správně sestřižené mRNA.

Cílovým antigenem může být antigen buněčného povrchu nádorové nebo rakovinové buňky, vírem infikované buňky nebo jinak nemocné buňky. Cílovým antigenem může rovněž být nerozpustný intracelulární antigen nekrotické buňky (viz například patent US 5 019 368). Geny kódující vhodné proměnné oblasti lze zpravidla získat z lymfoidních buněčných linií produkujících imunoglobulin. Například hybridomové buněčné linie, produkující imunoglobulin specifický pro antigeny asociované s nádorem nebo pro virové antigeny, lze vyrábět standardními technikami hybridizace somatických buněk, které jsou v daném oboru známy (viz například patent US 4 196 265). Tyto buněčné linie produkující imunoglobulin poskytují zdroj genů proměnných oblastí ve funkčně přeuspořádané formě. Geny proměnné oblasti budou zpravidla myšího původu, protože tento myší systém vyhovuje produkci širokého spektra různých imunoglobulinů s požadovanou specifičností. Kromě toho lze sekvence proměnné oblasti odvodit screeningem knihoven, například fágy zobrazujících knihoven, zaměřeným

01-3623-02-Ma • · ·· ···· na sekvence proměnných oblastí, které vážou předem zvolený antigen s požadovanou afinitou. Způsoby sestavování a screeningu fágy zobrazujících knihoven jsou popsány například v Huse a kol., (1989) Science 246: str. 1275 až 1281 a v Kang a kol., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: str. 11120 až 11123.

DNA Fragment kódující funkčně aktivní gen proměnné oblasti je navázán na DNA fragmentu obsahujícím gen kódující požadovanou konstantní oblast (nebo její část). Imunoglobulinové konstantní oblasti (těžký a lehký řetězec) lze získat z buněk produkujících protilátku standardními technikami klonování genů. Již byly klonovány geny pro dvě třídy lidských lehkých řetězců (k a λ) a pět tříd lidských těžkých řetězců (α, β, ε, γ a μ) a z těchto klonů jsou tedy konstantní oblasti lidského původu snadno dostupné.

Fúzovaný gen kódující hybridní imunoglobulinový těžký řetězec se zkompletuje nebo zavede do expresního vektoru s cílem zabudovat jej do recipientní buňky. Zavedení genového konstruktu do plasmidových vektorů lze realizovat za použití standardních postupů genového sestřihu. Chimérický imunoglobulinový těžký řetězec se může koexprimovat ve stejné buňce jako odpovídající imunoglobulinový lehký řetězec, takže lze kompletní imunoglobulin exprimovat a kompletovat současně. Pro tyto účely lze konstrukt těžkého řetězce a konstrukt lehkého řetězce umístit do stejného vektoru nebo do různých vektorů.

Recipientními buněčnými liniemi jsou zpravidla lymfoidní buňky. Výhodnou recipientní buňkou je myelom (nebo hybridom). Myelomy mohou syntetizovat, kompletovat a vylučovat imunoglobuliny kódované transfektovanými geny, kterými mohou být glykosylátové proteiny. Zvláště výhodné

01-3623-02-Ma • ·· 44 44 ·· ····

4 4 4 4 4 · 4 · 4 ·

444 4 4 4 4 ···· 4 · 4 4 · • 4 · · 4 · · · ·

recipientní neboli hostitelské buňky zahrnují buňky Sp2/0 myelomu, který zpravidla neprodukuje endogenní imunoglobulin, a buňky myšího myelomu NS/0. Při transfekci buňky produkují pouze imunoglobulin kódovaný transfektovanými genovými konstrukty. Transfektované myelomy lze pěstovat v kultuře nebo v peritoneu myší, kde lze imunocytokin izolovat od ascitické tekutiny. Jako recipientní buňky lze použít další lymfoidní buňky, jakými jsou například B lymfocyty.

Existuje několik způsobů transfekce lymfoidních buněk vektory obsahujícími nukleokyselinové konstrukty kódující chimérický imunoglobulinový řetězec. Vektory lze do lymfoidních buněk například zavést pomocí fúze sferoblastů (viz například Gillies a kol., (1989) BIOTECHNOL. 7; str. 798 až 804) . Další použitelné metody zahrnují elektroporaci nebo vysrážení fosforečnanu vápenatého (viz například Sambrook a kol., vydavatelé (1989) „Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press).

Další použitelné metody výroby imunocytokinů zahrnují přípravu RNA sekvence kódující konstrukt a její translaci do vhodného in vivo nebo in vitro expresního systému. Předpokládá se, že rekombinantní DNA metody pro syntézu genů kódujících fúzní proteiny protilátka-cytokin, pro zavedení genů do hostitelských buněk, pro expresi genů v hostiteli a pro sklizeň výsledného fúzního proteinu jsou známy a jsou podrobně zdokumentovány. Specifické protokoly jsou popsány například v Sambrook a kol., vydavatelé (1989) „Molecular Cloning: 4 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.

Je známo, že chemicky navázané imunocytokiny lze produkovat za použití celé řady odborníkům v daném oboru • ·· ·· ·· ·· »··· «« · » · · · » 9 9 9

01-3623-02-Ma • · · · · · · · · • ··« ··«· ··· ·· ···· 99 99 známých metod. Protilátku nebo fragment protilátky lze na cytokin chemicky navázat, například pomocí chemicky reaktivních aminokyselinových bočních řetězců obsažených v protilátce nebo ve fragmentu protilátky a v cytokinu. Aminokyselinové boční řetězce lze kovalentně spojit, například pomocí disulfidových vazeb nebo pomocí homo- nebo heterobifunkčních síťovacích činidel, která zahrnují například W-sukcinimidyl-3(-2-pyridyldithio)propionát, m-maleinimidobenzoyl-W-hydroxysukcinát ester, m-maleinimidobenzoyl-W-hydroxysulfosukcinimid ester a 1,4-di-[3'(2'-pyridylthio)propionamido]butan, které jsou komerčně dostupné u Pierce, Rockford, IL.

Podle způsobu podle vynálezu je kombinace imunocytokinů s činidly zesilujícími uptake imunocytokinu použitelná pro zesílení stimulace způsobující cytotoxickou odpověď imunitního systému na místě cílového buněčného typu, například na nádorových buňkách nebo jinak nemocných buňkách. Dalo by se očekávat, že kombinace imunocytokinu a činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu nebudou mít kombinovaný nebo synergický protinádorový účinek in vitro, protože imunocytokin samotný je necytotoxický.

Bez snahy vázat se na některou konkrétní teorii se dá předpokládat, že účinky kombinované léčby in vivo mohou zahrnovat zesílený uptake jednoho z činidel, který je způsoben účinkem druhého činidla, což vede buď (1) ke zvýšené chemoterapeutické cytotoxicitě (pokud imunocytokin zvýší uptake činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu v nádorových buňkách; a/nebo (2) ke zvýšené imunitní stimulaci (pokud činidlo zvyšující uptake imunocytokinu nějakým způsobem zvýší uptake imunocytokinu v nádoru). Pokud jde o mechanismus (1), • ·· ·· ·· • · · · ·«·· ·· · • 119 19 11

1111 1111 1 11 111 1111

01-3623-02-Ma

999· dřívější studie ukázaly, že je možné zvýšit uptake radioaktivně značených protilátek (a podle všeho léčiv, která mají malou molekulu) do nádorů předběžným ošetřením vysokými dávkami imunokonjugátu protilátka-IL2, který indukuje lokální vaskulární propustnost, viz například Hornick a kol., 1999, CLIN CANCER RES 5: str. 51 až 60). Pokud by příslušný mechanismus fungoval při kombinované léčbě imunocytokiny a činidly zvyšujícími uptake imunocytokinů, potom by bylo nezbytné, aby byl živočich trpící nádorem nejprve léčen imunocytokinem. Nicméně pokud by se před ošetřením imunocytokinem poskytla živočichovi jediná dávka činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu, a tento postup by vedl k dosažení synergického účinku v případě protinádorové aktivity, potom by popsaný mechanismus nemohl fungovat. Jako pravděpodobnější se tedy jeví vysvětlení, že léčba činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu zvýšila uptake imunocytokinu v důsledku mechanismu (2). Tuto hypotézu lze dále podložit skutečností, že souběžné podávání s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu zvyšuje uptake radiologicky značeného imunocytokinu v pevném nádoru.

Výhodou kombinované léčby je podle způsobů podle vynálezu skutečnost, že podání imunocytokinu zesiluje cytotoxický účinek chemoterapeutického činidla, které působí jako činidlo zvyšující uptake imunocytokinu. Pacientovi tedy lze podávat nižší dávku chemoterapeutického činidla. Potlačení některých aspektů imunitního systému pacienta, které často souvisí s ošetřením, které používá chemoterapeutická činidla, se tedy redukuje. U jednoho provedení podle vynálezu se pacientovi před podáním imunocytokinu podá jedna dávka činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu. Činidlo zvyšující uptake

01-3623-02-Ma • 9 9999

99 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • · 9 · 9 9 · · · « • · * » · 9 9 9 9

9999999 99 9999 99 99 chemoterapeutického imunocytokinu se výhodně podává přibližně 4 dny až 4 h a nejvýhodněji přibližně 24 h až 48 h před podáním imunocytokinu. U dalšího provedení podle vynálezu se pacientovi před podáním imunocytokinu podá několik dávek činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu. U dalších provedení podle vynálezu lze činidlo zvyšující uptake chemoterapeutického imunocytokinu podávat před, současně s a/nebo po imunocytokinu.

Paclitaxel je příkladem činidla zvyšujícího uptake chemoterapeutického imunocytokinu, které může potlačit nebo oslabit aspekty imunitního systému pacienta. Zatímco většina vlivu paclitaxelu je v případě potlačení imunity mediována přes buňky makrofágů/monocytů, mnoho studií funkce lymfocytů naznačilo škodlivý vliv paclitaxelu na tento podsoubor. Například se ukázalo, že léčba paclitaxelem závažně oslabuje proliferační kapacitu lymfocytů jak u zdravých, tak u nádorem trpících myší (Mullins a kol., 1998, IMMUNOPHARMACOL IMMUNOTOXICOL 20: str. 473 až 492) a poškozuje jak cytotoxicitu NK buněk, tak tvorbu lymfokinem aktivované cytotoxicity v buněčných kulturách obsahujících IL-2 (Chuang a kol., 1993, GYNECOL ONCOL 49: str. 291 až 298). Ve skutečnosti dostupné důkazy poukazují na lymfocytový podsoubor buněk jako na esenciální efektorovou populaci při protinádorové aktivitě imunocytokinů (Lodě a kol., 1998, PHARMACOL THER 80: str. 277 až 292). Výsledky experimentů, které jsou součástí předloženého vynálezu, odhalují několik nových zjištění, která nebylo možné odvodit z dosavadního stavu techniky, a zejména několik nových zjištění týkajících se pořadí podávání účinných složek.

Taxany lze podávat souběžně s imunocytokinem nebo samostatně, různými způsoby podání. Kompozice podle

01-3623-02-Ma

• *· 9 9	4		4	44 0 4	4	4 9 •	4494 9
9 ·	9		9	4	4	• 4	4
							9
• ·	9		4	9	4	•	4 ·
49 4 9904		49		4994		·*	44

vynálezu lze podávat libovolnou cestou, která je slučitelná s příslušnými molekulami. Vhodným podáním může být tedy orální podání nebo parenterální podání včetně intravenózního a intraperitoneálního podání.

Kompozice podle vynálezu lze podávat živočichovi pomocí libovolného vhodného prostředku přímo (například lokálně, tj. například formou injekce, implantátu nebo topického podání do tkáně) nebo systemicky (například parenterálně nebo orálně). Pokud má být kompozice podána parenterálně, například intravenozně, subkutánně, oftalmicky, intraperitoneálně, intramuskulárně, bukálně, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intraventrikulárně, intratekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranazálně nebo v aerosolu, potom část kompozice výhodně tvoří vodná suspenze nebo roztok nebo suspenze nebo roztok fyziologicky slučitelné tekutiny. Nosič neboli vehikulum je tedy fyziologicky přijatelný, takže kromě dopravy požadované kompozice do těla pacienta jinak nežádoucím způsobem neovlivňuje rovnováhu elektrolytů a/nebo objemovou rovnováhu pacienta. Tekutým médiem může tedy být normální fyziologický roztok (například 9,85% vodný roztok NaCl, 0,15 M, pH 7 až 7,4). U mnoha taxanů jsou formulace zpravidla složitější, což je dáno jejich obecně horší rozpustností. Standardní formulace paclitaxelu například zahrnuje 10% Cremophor, 10% ethanol

80^! solný roztok (0,9% NaCl), zatímco formulace docetaxelu zahrnuje 1:1 roztok ethanolu a polysorbátu 80, který se před podáním naředí v poměru 1:10 5% glukózovým roztokem (Bissery a Lavelle, 1999). Nicméně odbornicí v daném oboru jsou schopni vyvinout další formulace zahrnující taxany a/nebo jejich nově syntetizované analogy.

01-3623-02-Ma • · · » ·· · · ···· • · · · · ·· · • · · · · · · ···· · · · · · • · · · ··«·

Výhodné dávky imunocytokinu pro jedno podání se pohybují v rozmezí 0,1 mg/m² až 100 mg/m², výhodněji 1 mg/m² až 20 mg/m² a nejvýhodněji 2 mg/m² až 6 mg/m². Výhodné dávky činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu budou obecně záviset na typu použitého činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu, nicméně optimální dávky lze určit pomocí rutinních experimentů. Podání imunocytokinu a/nebo činidla zvyšujícího uptake imunocytokinu lze realizovat pomocí periodických bolusových injekcí nebo kontinuálním intravenózním nebo intraperitoneálním podáním z externího zdroje (například z intravenózního vaku) nebo vnitřně (například z biologicky degradovatelného implantátu). Imunocytokiny podle vynálezu lze příjemci rovněž podávat společně s množinou různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinů. Nicméně se předpokládá, že optimální kombinací imunocytokinů a činidel zvyšujících uptake imunocytokinů, způsoby podání a dávky lze určit pomocí v daném oboru známých rutinních experimentů.

K posouzení účinnosti kombinované terapie používající fúzni proteiny protilátka-cytokin a činidla zvyšující uptake imunocytokinů na imunitní odpovědi lze použít celou řadu způsobů. Odborník v daném oboru může například použít zvířecí model popsaný v níže uvedených příkladech nebo další vhodné zvířecí modely k posouzení toho, která činidla zvyšující uptake imunocytokinů nebo které kombinace činidel zvyšujících uptake imunocytokinů jsou nejvýhodnější při synergickém spolupůsobení s imunocytokinem (například fúzní protein protilátka-IL2) při zesilování imunitní destrukce založených nádorů. Činidlo zvyšující uptake imunocytokinu nebo kombinaci činidel zvyšujících uptake imunocytokinů lze podávat před nebo současně s probíhající imunocytokinovou terapií a vliv na nádor lze monitorovat pomocí

01-3623-02-Ma

volumetrického měření. Odborník v daném oboru bude rovněž schopen použít zde popsané metody pro testování potenciálu nově identifikovaných činidel zvyšujících uptake imunocytokinu, ve smyslu zesílení nebo jiné modifikace protirakovinové aktivity fúzních proteinů protilátkacytokin.

Alternativně lze po terapii nádory vyjmout z těla, nařezat na plátky a obarvit standardními histologickými metodami nebo specifickými imuno-histologickými reakčními činidly, ve snaze určit vliv kombinované terapie na imunitní odpověď. Zabarvení hematoxolinem a eosinem může například odhalit rozdíly v lymfocytické infiltraci do pevných nádorů, což lze označit jako celulární imunitní odpověď. Imunologické zabarvení řezů nádoru protilátkami proti specifickým třídám imunitních buněk může dále odhalit povahu indukované odpovědi. Pro určení typu imunitní odpovědi, která byla mediována imunocytokiny podle vynálezu, lze například použít protilátky, které se váží na CD45 (obecný markér leukocytů), CD4 a CD8 (pro identifikaci podtřídy T buněk) a NK1.1 ( markér na NK buňkách).

Alternativně lze typ imunitní odpovědi mediované imunocytokiny zjišťovat studiem konvenčních deplecí buněčného podsouboru, které například popsal Lodě a kol., (1998) Blood 91: str. 1706 až 1715. Příklady deplečních protilátek zahrnují ty, které reagují s T buněčnými markéry CD4 a CD8, a stejně tak ty, které se váží na NK markéry NK1.1 a asialo GM. Stručně řečeno, tyto protilátky se injektují do těla savce před počátečním ošetřením fúzním proteinem protilátka-cytokin ve vysokých dávkách (například v dávce přibližně 0,5 mg/myš) a následně se podávají v týdenních intervalech až do ukončení experimentu. Tato

01-3623-02-Ma technika může identifikovat buněčné typy nezbytné pro zjištění pozorované imunitní odpovědi u savce.

Další přístup představuje metoda, při které se cytotoxická aktivita splenocytů izolovaných z těla zvířat ošetřovaných kombinovanou terapií může porovnat cytotoxickou aktivitou splenocytů izolovaných z dalších skupin. Kultury splenocytů se připraví sterilní sleziny ošetřovaných mechanickým rozemíláním izolované standardními technikami, které lze nalézt ve většině manuálů imunologických laboratoří. Viz například Coligan a kol., (vydavatelé) (1988) „Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, lne. Výsledné buňky se následně kultivují ve vhodném médiu pro kultivaci buněk (například DMEM od GIBCO), které obsahuje sérum, protilátky a nízkou koncentraci IL-2 (přibližně 10 U/ml). Pro porovnání NK aktivity je zpravidla optimální třídenní kultura, zatímco pro porovnání T buněčné cytotoxické aktivity je zpravidla optimální

Cytotoxickou aktivitu lze měřit značením nádorových cílových buněk (například LLC buněk) pomocí ⁵¹Cr. Po odstranění přebytku radioaktivního ohromu se označené buňky 4 h mísí s různými koncentracemi kultivované sleziny. Na konci inkubace se pomocí gama čítače změří ⁵¹Cr uvolněný z buněk a výsledek se následně použije pro kvantifikaci rozsahu buněčné lyže indukované imunitními buňkami. Tímto způsobem se měří tradiční cytotoxická aktivita T lymfocytu (neboli CTL).

pětidenní kultura. 30min radioaktivním

Vynález bude dále ilustrován pomocí následujících příkladů, které mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

01-3623-02-Ma • · · · · · · ♦ · · · ···· · • · · · ···· • · · ·· ···· · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zvířecí modely

Pro studium účinku kombinace imunocytokinů a taxanů při mediaci účinných cytotoxických odpovědí proti nádoru byly vyvinuty myší rakovinové modely. Imunocytokiny použité v následujících příkladech váží EpCAM, což je lidský nádorový antigen, který se nachází na většině nádorů odvozených z epitelu (viz Perez a Walker (1989) J. Immunol. 142: str. 3662 až 3667). Pro test účinnosti u imunokompetentního myšího modelu bylo nutné exprimovat na povrchu buňky myšího nádoru lidský antigen, který je syngenní s myším hostitelem. Buňky Lewisova plicního karcinomu (LLC), což je známá buněčná linie rakoviny plic u myší, byly první buněčnou linií zvolenou pro tento účel. O této buněčné linii je známo, že produkuje vysoké hladiny inhibitorů imunitního systému a indukuje produkci IL-10 imunitními buňkami v mikroprostředí nádoru, což vede k lokalizované imunitní supresi (Sharma a kol., 1999, J IMMUNOL 163: str. 5020 až 5028). Na povrchu LLC buněk se exprimoval lidský nádorový antigen EpCAM (rovněž označovaný jako KSA), takže mohl být zacílen in vivo imunocytokiny odvozenými z myší protilátky anti-EpCAM, KS-1/4. To se realizovalo transdukcí EpCAM cDNA sekvence popsaným rekombinantním retrovirovým vektorem (Gillies, patentová přihláška US 09/293 042), což poskytlo buněčnou linii označenou jako LLC/KSA. Tyto buňky se uchovávaly při 37 °C a 7,0% CO₂ v DMEM obohaceném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem, L-glutaminem, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO).

01-3623-02-Ma ·· · · «· · · · · • · · · · · • ♦ · · · • · » · · · • · · · · · • · ···· · · ··

Další buněčné linie reprezentující karcinom různých tkáňových původů se geneticky upravily podobným způsobem. 4T1 Neímunogenní buněčnou linii karcinomu mléčné žlázy u myší poskytl Dr. Paul Sondel (Univerzita Wisconsin). Tato linie po subkutánní implantaci pozvolna a progresivně rostla a spontánně vytvářela metastázy v mnoha orgánech, a to i před chirurgickým odstraněním primárního nádoru. Rovněž je možné indukovat do plic experimentální metastázi pomocí intravenózní injekce. CT26 Buněčná linie karcinomu střev u myší odvozenou intrarektální injekcí N-nitroso-N-methyluretanu u myší BALB/C poskytl Dr. I.J. Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Buňky 4T1 a CT26 se transfektovaly popsaným Ep-CAM (Gillíes a kol., 1998, str. 6195 až 6203). Buňky 4T1/KSA se a 7,0% CO₂ v RPMI obohaceném 10% tepelně inaktivovaném fetální bovinním séru, L-glutaminem, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO). Buňky CT26/KSA se uchovávaly při 37 °C a 7,0% CO₂ v DMEM obohaceném 10% tepelně inaktivovaném fetální bovinním séru, L-glutaminem, vitaminy, pyruvátem sodným, neesenciálními aminokyselinami, penicillinem/streptomycinem a Geneticinem (GIBCO, Gaithersberg, MD) . Ve snaze udržet KSA expresi se do transfektovaných buněk přidal geneticin. Všechny transfektované buněčné linie rostly progresivně jako kožní nádory (po subkutánní injekci) nebo jako metastázy (po intravenózní injekci) a hubily myši, navzdory expresi molekuly lidského EpCAM (potenciální cizí antigen) na jejich povrchu.

J IMMUNOL 160: uchovávaly při 37 °C

Při studiích růstu nádoru se do hřbetu myší subkutánně implantovaly LLC/KSA nebo CT26/KSA nádory. U studií LLC/KSA se nádory transplantovaly z několika zásobních nádorů injektovaných pomocí jediné buněčné suspenze Ix 10⁶ buněk

01-3623-02-Ma • · · · · • · · · · · · ve 100 μΐ PBS. Přibližně po dvou týdnech se nádory asepticky jímaly a vedly přes síta s velikostí ok 150 μπι. Buňky se následně dvakrát nebo třikrát vedly injekční stříkačkou s jehlou velikosti 23, dvakrát propláchly a resuspendovaly v PBS. Jediná buněčná suspenze lx 10⁶ LLC/KSA buněk ve 100 μΐ PBS se pomocí jehly o velikosti 30¹/2 subkutánně injektovala do hřbetu myší. Při studiích CT26/KSA se buňky rostoucí v kultuře exponenciálně injektovaly ve formě jediné buněčné suspenze lx 10⁶ buněk ve 100 μΐ PBS. Po založení nádorů, tj. přibližně dva týdny po implantaci, byla podána první dávka a tento den se označil jako den 0. Nádory se měřily dvakrát týdně pomocí kaliperu, a to ve třech směrech. Objem nádoru se vypočetl za použití následující rovnice:

Objem = ¹/₂ 4/3 π (L/2 x W/2 x H), kde L = délka, W = šířka a H = výška nádoru.

Během studie se zvířata vážila a sledoval se jejich celkový zdravotní stav. Jakmile se nádory staly nekrotickými nebo pokud se zvířata stala moribundními, potom byla znecitlivěna pomocí zadušení CO2.

Výsledky jsou prezentovány v grafické formě. Grafy ukazují objemy jednotlivých nádorů nebo jejich průměry (+/-SEM) během a po dávkování. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných objemů nádoru léčených myší, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanovení signifikantních rozdílů se použil Studentův t test aplikovaný na objemy jednotlivých nádorů.

Při studiích experimentálních hepatických metastáz se myši znecitlivěly 80 mg/kg ketaminu HCl (Fort Dodge Animal

01-3623-02-Ma

• ·

Health, Fort Dodge, IA) a 5 mg/kg xylazinu (Bayer, Shawnee Mission, KS) . V den 0 se v průběhu 60 s injektovala jediná buněčná suspenze lx 10⁵ CT26/KSA buněk ve 100 μΐ DMEM obsahujícího 25 mM HEPES (GIBCO) pomocí jehly o velikosti 2Ί^γ/₂ pod slezinné pouzdro. Po dalších 2 min se slezinné cévy kauterizovaly kauterizační jednotkou (Roboz, Rockville, MD) a slezina se vyjmula. Těla zvířat se uzavřela pomocí autoklipů. Tři týdny po inokulaci se zvířata usmrtila, jejich játra se vyjmula a zvážila. Po zvážení se játra fixovala a obarvila pomocí Bouinova roztoku (Sigma, St. Louis, MO).

Výsledky jsou znázorněny grafickou formou. Grafy ukazují průměry zátěží jednotlivých nádorů (+/-SEM) v době usmrcení. Nádorové zátěže se určí tak, že se od hmotnosti experimentálních jater odečte hmotnost normálních jater. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných nádorových zátěží léčených myší, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanovení signifikantních rozdílů se použil Studentův t test aplikovaný na jednotlivé nádorové zátěže.

Při studiích experimentálních plicních metastáz se jediná buněčná suspenze 2,5x 10⁵ 4T1/KSA buněk ve 100 μΐ PBS v den 0 pozvolna injektovala za použití jehly o velikosti 27¹/₂ do laterální ocasní žíly. Přibližně tři týdny po naočkování se zvířata usmrtila a jejich plíce se vyjmuly a zvážily. Plíce se následně fixovaly a zabarvily pomocí Bouinova roztoku (Sigma). Výsledky jsou znázorněny grafickou formou. Grafy ukazují průměry zátěží jednotlivých nádorů (+/-SEM) v době usmrcení. Nádorové zátěže se určí tak, že se od hmotnosti experimentálních plic odečte hmotnost normálních plic. Výsledky jsou rovněž vyjádřeny jako procento kontroly průměrných nádorových zátěží

01-3623-02-Ma

léčených myší, vztažené k průměrným objemům nádoru myší, kterým bylo podáváno pouze vehikulum. Ke stanovení signifikantních rozdílů se použil Studentův t test aplikovaný na jednotlivé nádorové zátěže.

Příklad 2

Příprava fúzních proteinů protilátka-cytokin (imunocytokiny)

V následujících příkladech bude diskutováno několik fúzních proteinů protilátka-cytokin.

huKS-huYl-huIL2 (zkráceně KS-IL2)

Gen kódující huKS-huyl-huIL2 fúzní protein se připravil a exprimoval v podstatě způsobem, který popsal Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203 a který je popsán v patentu US 5 650 150. Stručně řečeno, humanizované proměnné oblasti myší KS1/4 protilátky (Varki a kol., (1984) Cancer Res. 44: str. 681 až 687) se modelovaly za použití metod, které popsal Jones a kol., (1986) Nátuře 321: str. 522 až 525 a které zahrnují inzerci CDR každé KS 1/4 proměnné oblasti do konvenčních sekvencí základní struktury lidských proměnných oblastí s nejvyšším stupněm homologie. Molekulová modelace pomocí pracovní stanice Silicon Graphics Indigo pracující s BioSym software potvrdila zachování tvaru CDR. Potom se provedla reverzní translace proteinových sekvencí a geny se konstruovaly ligaci překrývajících se oligonukleotidů.

Výsledné proměnné oblasti se inzertovaly do expresního vektoru obsahujícího konstantní oblasti lidského κ lehkého

01-3623-02-Ma

řetězce a lidského Cyl těžkého řetězce způsobem, který v podstatě popisuje Gillies a kol., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432, s tou výjimkou, že metallothioneinové promotory a zesilovače imunoglobulinového těžkého řetězce byly v případě exprese obou řetězců nahrazeny CMV promotorem/zesilovačem. Fúze zralých sekvencí IL-2 na C-konec lidských těžkých řetězců se provedly způsobem, který popsal Gillies a kol., (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: str. 1428 až 1432, s tou výjimkou, že se 3' netranslatované oblasti IL-2 genu odvodily z SV40 poly(A) oblasti.

IL-2 Fúzní protein se exprimoval transfekci výsledného plasmidu do NS/0 myelomové buněčné linie selekčním médiem obsahujícím 0,1 μΜ methotrexat (MTX). Stručně řečeno, pro získání stabilně transfektovaných klonů se plasmidová DNA zavedla do NS/0 buněk myšího myelomu elektroporací. Buňky NS/0 se pěstovaly v Dulbecco modifikovaném Eagleho médiu obohaceném 10% fetálním bovinním sérem. Přibližně 5x 10⁶ buněk se jednou propláchlo PBS a resuspendovalo v 0,5 ml PBS. 10 pg Linearizované plasmidové DNA se následně 10 min inkubovalo na ledu, společně s buňkami v Gene Pulser Cuvette (0,4 cm rozestup elektrod, BioRad). Elektroporace se prováděla za použití Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) při nastavení 0,25 V a 500 pF. Buňky se nechaly 10 min na ledu zotavit, načež se resuspendovaly v růstovém médiu a následně umístily do dvou 96jamkových ploten. Stabilně transfektované klony se vyselektovaly růstem v přítomnosti 100 nM methotrexatu, který se zaváděl dva dny po transfekci. Buňky se zavedly ještě třikrát v třídenních intervalech a MTX-rezistentní klony se objevily během dvou až tří týdnů.

·♦ 44 4« ·· · 4 4 4 · _ • · 4 4 · « ♦··· 444 » • · · 4 · ·

01-3623-02-Ma •4 4444

Expresní klony se identifikovaly pomocí Fc nebo cytokin ELISA za použití vhodných protilátek (viz například Gillies a kol., (1989) Biotechnol. 7: str. 798 až 804). Výsledný fúzní protein se purifikoval navázáním a eluací z protein A Sepharose (Pharmacia) podle instrukcí výrobce.

huKS-huy4-huIL2

Gen kódující huKS-huy4-huIL2 fúzní protein se konstruoval a exprimoval v podstatě způsobem popsaným v patentové přihlášce US 09/256 156 podané 24. února 1999, která nárokuje prioritu z patentové přihlášky US 60/075 887 podané 25. února 1998.

Stručně řečeno, Igy4 verze huKS-huyl-huIL2 fúzního proteinu popsaná výše, se připravila odstraněním genového fragmentu imunoglobulinové konstantní oblasti Cyl z huKS-huyl-huIL2 expresního vektoru a jeho nahrazením odpovídající sekvencí z lidského Cy4 genu. Sekvence a sekvenční zarovnání konstantních oblastí Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4 lidského těžkého řetězce jsou popsány v Huck a kol., (1986) NUC. ACIDS RES. 14: str. 1779 až 1789.

Výměna Cyl a Cy4 fragmentů se realizovala digescí původní Cyl-obsahu j ící plasmidové DNA Hind III a Xho I a purifikací fragmentu o velikosti 7,8 kb agarózovou gelovou elektroforézou. Druhá plasmidová DNA obsahující Cy4 gen se digerovala Hind III a Nsi I a purifikoval se fragment o velikosti 1,75 kb. Třetí plasmid obsahující lidskou IL-2 cDNA a SV40 polyA místo navázaný na C-konec lidského Cyl genu se digeroval Xho I a Nsi I a purifikoval se fragment o velikosti 470 bp. Všechny tři fragmenty se vzájemně

01-3623-02-Ma ·* ·· ·· • · 4 4 · _ _ • · · · · 4 · ···· ·44· · • · · · 4 · · « ··♦ ·4 ·«·· ·· ·« ligovaly v přibližně ekvimolárních množstvích. Produkt ligace se použil pro transformaci kompetentní E. coli a kolonie se vyselektovaly růstem na plotnách obsahujících ampicillin. Správně sestavené rekombinantní plasmidy se identifikovaly restrikční analýzou plasmidových DNA preparátů z izolovaných transfortmantů a pro diskriminaci Cyl (žádné Fsp I) a Cy4 (jedno místo) genových inzertů se použila digesce Fsp I.

Výsledný vektor obsahující náhradu ve formě Cy4-IL2 těžkého řetězce se zavedl do buněk NS/0 myšího myelomu elektroporací (0,25 V a 500 μΕ) a transfektanty se vyselektovaly růstem v médiu obsahujícím methotrexat (0,1 μΜ) . Buněčné klony exprimující vysoké hladiny huKS-huy4-huIL2 fúzního proteinu se identifikovaly a rozšířily a fúzní protein se purifikoval z kultivačních supernatantů za použití protein A Sepharose chromatografie. Čistota a integrita Cy4 fúzního proteinu se stanovila pomocí SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy. IL-2 Aktivita se měřila v testu T-buněčné proliferace (Gillis a kol., (1978) J. Immunol. 120: str. 2027 až 2032) a ukázalo se, že je identická s T-buněčnou proliferací yl konstruktu.

·♦· · ·· 44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 • · · 4 t • 4 4 4

01-3623-02-Ma »4 ·♦·· huKS-muy2a-muIL2

Gen kódující huKS-muy2a-muIL2 fúzní protein se konstruoval tak, že se konstantní oblastí lidské protilátky a lidský IL-2 huKS-huyl-huIL2 fúzního proteinu, který je popsán výše, nahradily odpovídajícími myšími sekvencemi. Konkrétně se lidská Cyl-IL2 DNA nahradila myším Cy2a cDNA fragmentem navázaným na DNA kódující myší IL-2. Stručně řečeno V_H oblast huKS je ve struktuře navázána na myší y2a cDNA realizací překryvu PCR za použití překrývajících se oligonukleotidových primerů:

(smyslná) 5' CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC (SEQ ID NO: 3);

(protismyslná) 5' GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (SEQ ID NO: 4);

(smyslná) 5' C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG (SEQ ID NO: 5); a (protismyslná) 5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (SEQ ID NO: 6).

Oligonukleotidy SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4 byly navrženy pro hybridizaci na spoj V_H domény huKS a konstantní oblasti myší y2a cDNA (kurzívou) . V prvním kole PCR se provedly dvě samostatné reakce. V první reakci se V_H huKS DNA použila jako templát s oligonukleotidy SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 5. Primer SEQ ID NO: 5 zavedl AfIII (CTTAAG) restrikční místo před (upstream) sekvence kódující zralý N-konec huKS V_H (tučně). Ve druhé reakci se myší y2a cDNA použila jako templát s oligonukleotidy SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6. Primer SEQ ID NO: 6 se hybridizoval na cDNA kódující oblast okolo C-konce y2a a « «·

9 9 ♦ ·

99

9 9 9

9 «

01-3623-02-Ma ·

•4· 9 9*9 • 9 « »* ·« 9 · • · 4 ·· ·· zavedl Xmal (CCCGGG) restrikční místo pro následnou ligaci na muIL2 cDNA. PCR Produkty obou reakcí se smísily a podrobily druhému kolu PCR, kdy se použily oligonukleotidy SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 6. Výsledný PCR produkt se klonoval a po ověření sekvence se AfIII-Xmal fragment kódující V_H huKS a myší y2a konstantní oblast použil pro ligaci na DNA kódující signální peptid v AfIII místě a muIL2 cDNA v Xmal místě.

Myší IL2 cDNA se klonovala z mRNA myších periferních krevních jednojaderných buněk za použití oligonukleotidů SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8, konkrétně:

(smyslná) 5’ GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC (SEQ ID NO: 7); a (protismyslná) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO: 8).

Primer SEQ ID NO: 7 se přizpůsobil muIL2 (sekvence vyznačená tučným písmem), který má být připojen k muy2a v Xmal restrikčním místě (CCCGGG). Primer SEQ ID NO: 8 zavedl Xhol restrikční místo (CTCGAG) bezprostředně za translační terminační kodon (protismyslná tučně).

Podobným způsobem se doména proměnného lehkého řetězce (V_L) huKS navázala na mu κ cDNA sekvenci překryvem PCR. K překryvu se použily následující oligonukleotidy:

(smyslná) 5’G GAA ΑΤΑ AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G (SEQ ID NO: 9);

(protismyslná) 5' GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (SEQ ID NO: 10) ;

(smyslná) 5' C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (SEQ ID NO: 11); a • ·· ·· 4 · • · • · ♦ • · • 4« • t ·· • ♦ * · • ♦ · • · · • * ·

4· «·«·

01-3623-02-Ma • 4 ···· ♦ · · • « · · · • * · · ·· 44 (protismyslná) 5' CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC (SEQ ID NO: 12).

Tyto oligonukleotidy byly navrženy pro hybridizaci na spoj V_L huKS a konstantní oblasti myší κ cDNA (kurzívou). V prvním kole PCR proběhly dvě samostatné reakce. V první reakci se jako templát použila V_L doména huKS DNA s oligonukleotidy SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 11, které zavedly AfIII (CTTAAG) restrikční místo před (upstream) sekvenci kódující zralé N-konce huKS V_L (tučně). Ve druhé reakci se jako templát použila myší κ cDNA s oligonukleotidy SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 12, které zavedly Xhol restrikční místo za translační termínační kodon (protismyslná tučně) .

PCR Produkty z obou reakcí se smísily a podrobily druhému kolu PCR, při kterém se použily oligonukleotidové primery SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12. Výsledný PCR produkt se klonoval a po ověření sekvence se AfIII-Xhol fragment kódující V_L huKS a myší κ konstantní oblast ligovaly na DNA kódující signální peptid v AfIII místě.

Jak sekvence myšího těžkého řetězce, tak sekvence myšího lehkého řetězce se použily jako náhrada lidských sekvencí v pdHL7. Výsledný expresní vektor protilátky obsahující gen dhfr selektovatelného markéru se elektroporoval (6,25 V, 500 pF) do buněk myšího NS/0 myelomu a klony se vyselektovaly kultivací v médiu obsahujícím 0,1 μΜ methotrexat. Transfektované klony rezistentní proti methotrexatu se použily v testech, ve kterých se pomocí standardních ELISA metod určovala sekrece determinantů protilátky. Fúzní proteiny se purífikovaly pomocí protein A Sepharose chromatografie podle instrukci výrobce.

·· ····

01-3623-02-Ma • ·<· · «« ···· huKS-muy2a-muILl2

Gen kódující huKS-muy2a-muIL12 fúzní protein se konstruoval a exprimoval v podstatě stejným způsobem jako v patentové přihlášce US 08/986 997 podané 8. prosince 1997, a Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203. Stručně řečeno, provedla se fúze myší p35 IL-12 podjednotky cDNA na již připravenou oblast kódující huKS-muy2a těžký řetězec. Výsledný vektor se následně transfektoval do NS/0 myelomové buněčné linie předtransfektované pomocí p40 IL-12 podjednotky a schopné tuto podjednotku exprimovat. Jinými slovy, buněčná linie se transfektovala samotným p40 a vyselektovaly se stabilní vysoce exprimující buňky, které se následně použily jako příjemce pro transfekci fúzním proteinem obsahujícím p35 (tj. pro sekvenční transfekci).

Myší podjednotky p35 a p40 IL-12 se izolovaly pomocí PCR z mRNA připravené ze slezinných buněk aktivovaných Concanavalinem A (5 pg/ml v kultivačním médiu po dobu tří dnů). PCR Primery použité pro izolaci p35 kódující nukleosidové sekvence, které jsou rovněž přizpůsobeny pro p35 cDNA jako Xmal-Xhol restrikční fragment, zahrnovaly:

5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 13); a

5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 14).

PCR Primer použitý pro izolaci p40 kódující nukleokyselinové sekvence zahrnoval:

5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 15); a

5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 16).

Plasmidový vektor (pdHL7-huKS-muy2a-p35) se konstruoval již popsaným způsobem (Gillies a kol., J.

·* ·♦·· • ·

01-3623-02-Ma • · · · > · · · • · · »· ·· ··

Immunol. Methods 125: str. 191) a obsahoval dhfr selektovatelný markerový gen, transkripční jednotku kódující lehký řetězec humanizované KS protilátky a transkripční jednotku kódující myší těžký řetězec navázaný na p35 podjednotku myšího IL-12. Navázání neboli fúze se dosáhlo ligaci Xmal na Xhol fragment přizpůsobené podjednotky cDNA p35 na unikátní místo Xmal na konci CH3 exonu předem připraveného myšího y2a genu. Transkripční jednotka těžkého řetězce i lehkého řetězce zahrnuje cytomegalovirový (CMV) promotor (namísto metallothioneinového promotoru v původní referenci) na 5' konci a polyadenylační místo na 3' konci.

Podobný vektor (pNC-p40) se sestrojil pro expresi volné p40 podjednotky, která zahrnovala selektovatelný markerový gen (neomycinově rezistentní gen), ale současně používala pro transkripci CMV promotor. Kódovací oblast v tomto případě zahrnovala přirozenou vedoucí sekvenci p40 podjednotky pro správnou dopravu do endoplasmického retikula a sestavu s fúzním proteinem. Plasmid pNC-p40 se elektroporoval do buněk a buňky se umístily a vyselektovaly v médiu obsahujícím G418. V tomto případě se kultivační supernatanty klonů rezistentních proti účinné látce testovaly pomocí ELISA na produkci p40 podjednotky.

Expresní vektor pdHL7-huKS-muy2a-p35 se elektroporoval do NS/0 buněčné linie již exprimující myší p40, viz Gillies a kol., (1998) J. Immunol. 160: str. 6195 až 6203. Transfektované klony rezistentní proti methotrexatu se testovaly na sekreci determinantů protilátky a myšího IL-12 standardními ELISA metodami. Výsledný protein se purifikoval navázáním na a elucí z protein A Sepharose kolony podle instrukcí výrobce.

·♦·· • ·

01-3623-02-Ma

Příklad 3

In vitro cytotoxická aktivita kombinované léčby

U buněčných linií geneticky upravených pro použití ve zvířecích modelech (příklad 1) se testovala jejich citlivost na taxanem indukovanou cytotoxicitu v buněčné kultuře v přítomností nebo za absence imunocytokinu na bázi IL-2 tvořeného humanizovanou formou KS-1/4 protilátky navázané na C-konec těžkého řetězce lidského IL-2 (huKS-huyl-huIL2, dále jen zkráceně KS-IL2). Buňky se naočkovaly v koncentraci 1000 buněk/jamka do 96jamkových ploten s plochým dnem a 24 h inkubovaly při 37 °C a 7% CO₂. Do buněčné kultury na plotnách se duplicitně přidal paclitaxel, při dvojnásobném ředění z 200 ng/ml na 3,125 ng/ml, KS-IL2, při 200 ng/ml a IL-2, při 33,3 ng/ml (ekvivalentní množství IL-2 v KS-IL2) a 6 dní inkubovaly při 37 °C a 7% C0₂. Přímo v 96jamkových plotnách se provedl MTS kolorimetrický test (Promega) určující životnost buňky na základě buněčné konverze tetrazoliové soli. Po provedení odečtu ploten a záznamu výsledku se životaschopné adherentní buňky obarvily krystalovou violetí (Sigma, St. Louis, MO) . Plotny obarvené krystalovou violetí se použily pro ověření výsledků NITS testů. Výsledky se vyjádřily v tabulární formě. IC₅o Je koncentrace účinné složky, která produkuje cytotoxicitu na úrovni z 50 % kontrolované cytotoxicity.

Test cytotoxicity se prováděl za použití paclitaxelu samotného (3 ng/ml až 200 ng/ml) nebo v kombinaci s KS-IL2 (200 ng/ml) nebo IL-2 (33,3 ng/ml, což je ekvivalentní množství IL-2 v KS-IL2) proti CT26/KSA, LLC/KSA a 4T1/KSA buňkám. V případě těchto tří testovaných buněčných linií byla zjištěna pouze malá nebo žádná cytotoxicita KS-IL2

01-3623-02-Ma > · · * «· ·· nebo samotného IL-2 (81% až 101% kontrola, tabulka 1). Přídavek KS-IL2 nebo IL-2 neměl žádný vliv na cytotoxicitu paclitaxelu. Vzhledem k tomu, že ani KS-IL2 ani IL-2 neovlivnil cytotoxicitu paclitaxelu, muselo být jakékoliv zvýšení protinádorové aktivity u myší při kombinované léčbě způsobeno jinými mechanismy, které se objevují pouze u zvířat trpících nádorem.

Tabulka 1 Cytotoxicita paclitaxelu v kombinaci s IL-2 nebo KS-IL2

Paclitaxel IC5q (ng/ml) CT26/KSA³ LLC/KSA^b 4Tl/KSA^b

Taxol	27	6	16
Taxol + IL-2 (33 ng/ml)	30	8	20
Taxol + KS-IL2 (200 ng/ml)	26	5	19
		% Kontroly
	CT26/KSA3	LLC/KSAb	4T1/KSA1
IL-2 (33 ng/ml)	97	100	95
KS-IL2 (200 ng/ml)	90	101	81

^a průměr tří experimentů ^b průměr dvou experimentů

Příklad 4

Kombinovaná léčba LLC kožních nádorů KS-IL2 a taxanu

Regresní test růstu nádoru se prováděl za použití agresivně rostoucího nádoru LLC/KSA, kdy byla jedna dávka paclitaxelu (80 mg/kg) o týden později následována KS-IL2

01-3623-02-Ma (20 μς) podávaným 5 dnů intravenózní injekcí do ocasní žíly (obr. 2). Nebyl pozorován žádný vliv paclitaxelu nebo samostatně podávaného KS-IL2 (v den 0 až 4). Avšak pokud se podal KS-IL2 jeden týden po paclitaxelu, potom byla pozorována významná redukce průměrného objemu nádoru (41% redukce kontroly) a přibližně o 8 dnů opožděný růst nádoru (TGD), což je velký rozdíl oproti případu, kdy je podáván samotný paclitaxel (p = 0,023). V souvislosti s účinnou složkou nebyla pozorována žádná významnější toxicita, s výjimkou nižšího než 5% hmotnostního úbytku než u skupin léčených paclitaxelem.

Potom se provedlo srovnání léčby, při které se aplikovalo více dávek paclitaxelu a která je považována za účinnější chemoterapii, s léčbou, při které se aplikovala jedna dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 a určilo se, jak ovlivňuje schéma chemoterapie zesílení účinku. Samotný KS-IL2 (20 mg v den 0 až 4) neměl opět žádný vliv na růst nádoru LLC/KSA, ale samotný paclitaxel, pokud se podal v několika dávkách (50 mg/kg každý druhý den), redukoval průměrný objem nádoru na 63 % kontroly a způsobil čtyřdenní prodlevu růstu nádoru (TGD) (obr. 3). Pokud se KS-IL2 imunocytokin podal jeden týden po léčbě paclitaxelem, potom byla pozorována redukce objemu nádoru odpovídající 27 % kontroly lOdenní TGD, což je významný rozdíl v porovnáním se samotným paclitaxelem (p = 0,016). V souvislosti s účinnou složkou nebyla pozorována žádná významnější toxicita, s výjimkou menšího než 5% úbytku u skupin ošetřovaných paclitaxelem. U skupiny postupující kombinovanou léčbu byl hmotnostní úbytek dokonce nižší. Tyto pozitivní výsledky kombinované léčby jsou překvapující, pokud se vezme v úvahu relativně krátký interval mezi chemoterapeutickou léčbou (a potenciálním

01-3623-02-Ma • ·

zhoršení imunity) a zahájením léčby založené na schopnosti stimulovat proliferace lymfocytu a cytotoxicitu.

Jedním z vysvětlení kombinovaného účinku je to, že taxanem indukovaná apoptóza části hmoty rostoucího nádoru snižuje intersticiální tlak, a ten zase zvyšuje účinnost uptake KS-IL2 do nádoru. Nedávné studie (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) naznačují, že vliv jedné dávky paclitaxelu účinně snižuje intersticiální tlak tekutiny, přičemž maximální účinek je patrný po 24 h až 48 h (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782). I když se zdá, že toto je nejlepší okamžik pro uptake imunocytokinu do nádoru, současně představuje velmi krátký časový interval po chemoterapii. Nicméně se provedla léčba myší trpících LLC/KSA nádory pomocí KS-IL2, který se podával po dobu pěti po sobě následujících dnů a léčba se zahájila právě 24 h po podání jediné dávky paclitaxelu. Výsledky naznačují, že dřívější zahájení léčby imunocytokinem než týden po podání jediné dávky paclitaxelu poskytuje u této nádorové linie dokonce lepší kombinovanou odpověď. A totéž platí i pro střevní karcinom CT26 (viz níže).

Příklad 5

Kombinovaná léčba 4T1 metastáz pomocí KS-IL2 a taxanu

Vzhledem k tomu, že se zjistilo, že léčebné intervaly mezi podáním taxanu a imunocytokinu by mohly být kratší, než se očekávalo, bylo možné provést testy kombinovaných režimů, při kterých se taxan a imunocytokin podají ve stejný den, a porovnat jednu dávku (75 mg/kg) paclitaxelu s dělenou dávkou (25 mg/kg po 3 dny) podanou souběžně s

01-3623-02-Ma		• *· ·· ♦ * : .· ·	♦* ·· -**· : :· : i · • ♦ · ·; z • · · *	• · · · • • • • ·
		9 9 999 ···· 47	·· ···· ··
léčbou KS-IL2 (15	pg/dávka	po tří dny	podávaná	4 h po
paclitaxelu). Pro	tento	experiment	se použil	model
experimentálních	plicních	metastáz indukovaný	4T1/KSA
buňkami karcinomu	prsu. Dávky účinných	složek se	zvolily

tak, aby byly nižší než jejich optimální dávky a aby nebylo možné pozorovat jakoukoliv případnou aditivní nebo synergickou aktivitu.

Každé činidlo podané samostatně významně (p <0,02) a podobnou měrou redukovalo průměrné hmotnosti plic: 43% redukce pro jednu dávku paclitaxelu, 49% redukce pro množinu dávek samotného paclitaxelu a 39% redukce při použití samotného KS-IL2 (obr. 4). Kombinace paclitaxelu a KS-IL2 dále mírně, ale méně než aditivně, redukovala plicní metastázy: 58% redukce pro jednu dávku paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 a 68% redukce pro množinu dávek paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2. Přestože nebyl pozorován žádný synergismus, vedla jedna dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 k dosažení velmi odlišných výsledků v porovnání s paclitaxelem podávaným samostatně (p = 0,047).

Nižší než 10% ztráta hmotnosti byla pozorována u všech skupin, nicméně nejvyšší ztráta hmotnosti byla pozorována u skupiny, které se podávalo 25 mg/kg paclitaxelu v režimu třikrát každý druhý den. Na základě získaných výsledků byl jako nejlepší režim tohoto testu 4T1 plicních metastáz, s ohledem na nejvyšší účinnost kombinované léčby, vyhodnocen režim, při kterém po jedné dávce paclitaxelu následovalo podání KS-IL2, což odpovídá zjištění při použití regresního modelu růstu LLC/KSA nádoru. Protože interval dávek v tomto případě byl pouhé 4 h, nemusely být výsledky získané pro účinný nádorový uptake optimální.

• · · · * *

01-3623-02-Ma • · ·« ·· • · ···«

Příklad 6

Kombinovaná léčba CT26 kožních nádorů pomocí KS-IL2 a taxanu

Z výsledků příkladu 5 vyplývá, že časový interval 4 h mezi podáním dávek dvou účinných složek může být příliš krátký. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že hladiny paclitaxelu v těle zvířat, které zůstávají v okamžiku podání KS-IL2 ještě zachovány, nemohou přímo interferovat s aktivitou lymfocytů, což redukuje jejich potenciální protinádorovou aktivitu při kombinované léčbě. Při časovém intervalu 4 h nebylo rovněž dosaženo maximálního účinku na nádorový intersticiální tlak. Proto byl navržen další experiment, tentokrát používající založené kožní nádory CT26/KSA karcinomu střev, při kterém se podala jedna dávka paclitaxelu (75 mg/kg) a pětidenní podávání KS-IL2 bylo zahájeno 24 h po podání taxanu. Samotný paclitaxel neměl žádný vliv na růst nádoru (obr. 5). Léčba nižšími než optimálními dávkami KS-IL2 (10 pg, dny 1 až 5) vedla k dosažení objemu nádoru, který odpovídal 71 % kontroly. Prudká a synergická redukce objemu nádoru na 8 % kontroly byla pozorována při aplikaci kombinace paclitaxelu a KS-IL2, jejíž výsledky se výrazně odlišovaly od výsledků léčby paclitaxelem samotným (p <0,001). Minimální hmotnostní úbytek, tj . přibližně 5 %, byl pozorován u obou skupin léčených paclitaxelem.

Druhý experiment se prováděl za použití modelu CT26/KSA, a tentokrát se testoval vliv kombinované terapie na založené metastázy jater, opět za použití 24 h prodlevy mezi podáním paclitaxelu a KS-IL2 léčbou. Rovněž se porovnávala dávková odpověď paclitaxelu při kombinované léčbě. Do těla myší se v den 5 po indukci metastáz zavedlo ·» ····

01-3623-02-Ma pomocí injekce 25 mg/kg, 50 mg/kg nebo 75 mg/kg paclitaxelu samotného nebo následovaného o den později pětidenní léčbou KS-IL2 (7 pg) . V případě samotného paclitaxelu vedly dávky 25 mg/kg, 50 mg/kg a 75 mg/kg k nádorovému zatížení, které odpovídalo 49 %, 23 %, resp. 10 % kontroly (obr. 6) . Kombinace paclitaxelu (stejné dávky paclitaxelu jako v případě podání paclitaxelu samotného) s KS-IL2 dále redukovaly plicní metastázy na 12 %, 9 % a 6 % kontroly. Nižší dávka paclitaxelu (25 mg/kg) vedla v kombinaci s KS-IL2 k největší a nejvýznamnější (p <0,001) redukci nádorového zatížení v porovnání s vyššími dávkami paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2. Kombinace podání KS-IL2 s předchozím podáním paclitaxelu tedy vede k vyššímu protinádorovému účinku než mají jednotlivá činidla podaná samostatně. Navíc nejnižší dávka paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 vede k dosažení podobné protinádorové účinnosti jako nejvyšší dávka paclitaxelu samotného. Použitím nižší dávky paclitaxelu v kombinaci s KS-IL2 by se tedy redukovala toxicita při současném zachování dobré účinnosti.

Příklad 7

Měření uptake KS-IL2 do nádorů

Pokud má být vliv jednoduchých dávek cytotoxické účinné složky před zahájením imunocytokinové léčby takový, že bude snižovat intersticiální tlak nádoru a zesilovat pronikání nádorem, potom by měl být měřitelný pomocí radioaktivně značeného imunocytokiny, například pomocí KS-IL2. Purifikovaný KS-IL2 se označil isotopem ¹²⁵I za použití standardních postupů (viz odkaz) pomocí kontraktů uzavřených s komerčním dodavatelem (New England Nuclear,

01-3623-02-Ma *

«

Billerica, MA). Kožní nádory CT26/KSA se implantovaly subkutánně způsobem popsaným v příkladu 1 a nechaly růst, dokud nedosáhly objemů 100 mm³ až 200 mm³. Dvěma skupinám po čtyřech myších se injektoval paclitaxel (50 mg/kg) ve vehikulu nebo vehikulum samotné a následně, po 1 h (experiment 1) nebo 24 h (experiment 2), 10 μg ¹²⁵I-KS-IL2 (95 μθί) . Šest hodin po aplikaci radiologicky značeného imunocytokinu se myši usmrtily a nádory se chirurgicky odstranily. Pro kontrolu se zvířatům rovněž odebrala játra a všechny tkáně se zvážily a následně podrobily odečtu v gama čítači. Výsledky jsou vyjádřeny jako počet za minutu (CPM) na gram tkáně vyděleno celkovým CPM ve tkáni a hmotností.

Při injektování značeného KS-IL2 1 h po léčbě paclitaxelem (obr. 7A) se dosáhlo pouze malého zvýšení radioaktivity u nádorů vyjmutých z tel zvířat, kterým byla podána účinná složka. Naopak, pokud se značený KS-IL2 injektoval 24 h po aplikaci paclitaxelu, potom došlo ke dramatickému zvýšení uptake (větší než 200 %) v porovnání s kontrolou, kde bylo aplikováno pouze vehikulum (obr. 7B). Tento velký rozdíl mezi nádorovým uptake v případě podání lha 24 h po léčbě paclitaxelem je v souladu s výsledky získanými při posuzování taxanem indukovaných změn intersticiálního tlaku (Griffon-Etienne a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 3776 až 3782) a souhlasí rovněž s výsledky získanými při hodnocení nádorových modelů, které ukazují, že léčba zahájená 24 h po podání paclitaxelu je účinnější než léčba zahájená dříve (4 h).

Rovněž se zjišťovalo, zda by mohly i další třídy účinných složek zvyšovat uptake značeného imunocytokinu do pevných nádorů. V tomto případě se do těla myší injektovala

01-3623-02-Ma

• · · * jednoduchá dávka cyklofosfamidu (40 mg/kg), a to buď 24 h nebo 3 dny před experimentem. ¹²⁵I-Značený KS-IL2 se injektoval do těla všech myší včetně kontrolních myší předem ošetřených PBS a množství radioaktivity v nádorech vyjmutých z těl těchto myší se hodnotilo o 16 h později. Výsledky (obr. 8) ukazují, že předběžná léčba cyklofosfamidem zvýšila uptake KS-IL2 o 48 % u myší, které byly předběžně ošetřeny 24 h před experimentem a o 70 % u myší, které byly ošetřeny tři dny před experimentem.

Příklad 8

Kombinovaná léčba pomocí huKS-huy4-IL2 a taxanu

Nedávno byly popsány nové formy imunocytokinů, které mají delší cirkulační poločasy života a zvýšenou účinnost v důsledku redukované afinity pro Fc receptory (viz Gillies a kol., 1999, CANCER RES. 59: str. 2159 až 2166). Jedním reprezentativním příkladem těchto zlepšených IL-2 imunocytokinů je huKS-huy4-IL2, který se testoval při kombinované léčbě s jednoduchou dávkou paclitaxelu. Pokud se tyto dvě účinné složky postupně podaly myším trpícím CT26/KSA kožními nádory, potom se opět prokázala zvýšená účinnost.

Příklad 9

Kombinovaná léčba pomocí huKS-muy2a-muIL12 a taxanu

Ve snaze zjistit, zda-li je synergický terapeutický účinek specifický pouze pro imunocytokiny na bázi IL-2 se založené CT26/KSA objemné nádory léčily nejprve

01-3623-02-Ma <♦ ·« • · · · • · · « · · « ♦ » ·

9· 9999 φ» *«·· ·· ♦» paclitaxelem (jednoduchá dávka 75 mg/kg) a o 24 h později se zahájila pětidenní léčba huKS-muy2a-muIL12 (5 pg na den). Tento imunocytokin reprezentuje fúzi mezi myší formou HuKS protilátky (tj . konstantních oblastí, ve kterých byly převedeny myší C kapa a C gama 2a) a myšího IL-12. Bylo nutné použít myší IL-12 sekvence, protože na rozdíl od IL-2 je tento cytokin vysoce druhově specifický a jeho lidská forma není v těle myši příliš aktivní. Výsledky ukazují, že léčba paclitaxelem samotným má velmi malý vliv na růst nádoru. Léčba nižšími než optimálními dávkami huKS-muy2a-muIL12 měla protinádorový účinek, který byl vyšší u myší předem léčených jednoduchou dávkou paclitaxelu.

Příklad 10

Kombinovaná léčba pomocí huKS-IL2 a alkylačního činidla

i. Rovněž byl demonstrován zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem, což je chemoterapeutická účinná látka spadající do třídy alkylačních činidel. Buňky 4T1 karcinomu prsu se tři dny před léčbou intravenózně injektovaly do těla imunokompetentních myší ve snaze založit plicní metastázy. Myši se léčily jednoduchou dávkou cyklofosfamidu (15 mg/kg, 40 mg/kg nebo 80 mg/kg) a o tři dny později se zahájila pětidenní léčba huKS-IL2 (15 pg/den). I přesto, že dvě nejnižší dávky při samotném podání cyklofosfamidu způsobily pouze mírnou redukci plicní metastatické zátěže, kombinace s huKS-IL2 vedla k významnému snížení této nádorové zátěže, v porovnání s výsledkem dosaženým při podání samotného *· ····

01-3623-02-Ma cyklofosfamidu (p <0,05, obr. 9). Nicméně při nejvyšší dávce (80 mg/kg) nedošlo k žádnému synergickému účinku.

ií. Zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem byl rovněž demonstrován v testu nádorového růstu prováděném u imunokompetentních myší trpících subkutánně založenými nádory vyvolanými plicním karcinomem. Myši se léčily buď samotnou jedinou dávkou 80 mg/kg cyklofosfamidu, nebo touto dávkou použitou v kombinaci s pětidenní léčbou huKS-IL2 (30 μρ) , která se zahájila tři dny po léčbě cyklofosfamidem. Průměrné objemy nádorů se v případě samostatně podaného huKS-IL2 a 80 mg/kg cyklofosfamidu redukovaly o 31 %, resp. o 69 % (obr. 9B) . Kombinovaná léčba zredukovala průměrné objemy nádorů v den 25 o 100 %, což je významně vyšší terapeutický účinek než v případě samostatného podání huKS-IL2 nebo cyklofosfamidu (p <0,05). Zvířata snášela léčbu ve všech případech velmi dobře a u všech skupin byla pozorována nižší než 10% ztráta hmotnosti.

iii. Zvýšený terapeutický účinek kombinace huKS-IL2 s cyklofosfamidem byl rovněž demonstrován v testu nádorového růstu prováděném u imunokompetentních myší trpících subkutánně založenými nádory vyvolanými plicním karcinomem. Myši se léčily buď samotnou jedinou dávkou 80 mg/kg cyklofosfamidu, nebo touto dávkou použitou v kombinaci s pětidenní léčbou huKS-IL2 (20 μς) , která se zahájila tři dny po léčbě cyklofosfamidem. Průměrné objemy nádorů se v případě samostatně podaného huKS-IL2 a 80 mg/kg cyklofosfamidu redukovaly o 2 %, resp. o 27 % (obr. 9C) . Kombinovaná léčba zredukovala průměrné objemy nádorů v den 20 o 48 %, což je významně vyšší terapeutický účinek než v případě samostatného podání huKS-IL2 nebo

01-3623-02-Ma cyklofosfamidu (p <0,05). Zvířata snášela léčbu ve všech případech velmi dobře a u všech skupin byla pozorována nižší než 10% ztráta hmotnosti.

Příklad 11

Kombinovaná léčba pomocí huKS-IL2 a alkylačního činidla

V tomto příkladu se demonstroval zvýšený terapeutický účinek huKS-IL2 a karboplatiny, což je další chemoterapeutické činidlo spadající do třídy alkylačních činidel. Myši trpící subkutánně založenými nemalými nádory karcinomu plicních buněk (LLC/KSA) se léčily karboplatinou (75 mg/kg v den 0), načež o tři dny později následovala pětidenní léčba KS-IL2 (20 pg/den). Léčba samotnou karboplatinou a samotným KS-IL2 způsobila mírné snížení nádorového růstu, avšak k významné redukci průměrného objemu nádoru došlo jedině v případě kombinované léčby v den 20 (p <0,05, obr. 10). Růst nádorů u myší, které byly léčeny kombinací zmiňovaných účinných látek byl výrazně nižší než při léčbě samotnou karboplatinou (p <0,05).

Každý výše uvedený patentový dokument a vědecká publikace jsou zde zabudovány formou odkazů.

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití imunocytokinu obsahujícího vazebné místo protilátky pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi proti nádoru u savce, kdy se tento imunocytokin podá společně s činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu, které zesiluje imunitní odpovědi indukované imunocytokinem.

   2 . Použití podle nároku 1, kdy se vazebné místo protilátky váže na rakovinovou buňku. 3. Použití podle nároku 1, kdy se vazebné místo protilátky váže na antigen specifický pro nádor.
2. 4. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podává souběžně s imunocytokinem.
3. 5. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podává před podáním imunocytokinu.
4. 6. Použití podle nároku 1, kdy vazebné místo protilátky obsahuje ve směru N-konec C-konec imunoglobulinovou proměnnou oblast, CH1 doménu a CH2 doménu.

   01-3623-02-Ma
5. 7. Použití podle nároku 6, kdy vazebné místo protilátky dále obsahuje CH3 doménu navázanou na C-konec CH2 domény.
6. 8. Použití podle nároku 1, kdy imunocytokinem je fúzní protein obsahující ve směru N-konec -> C-konec (i) vazebné místo protilátky obsahující imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou navázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CH1 doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu a (ii) cytokin.
7. 9. Použití protilátky dále doménu a cytokin podle obsahuj e nároku 8,

   CH3 doménu kdy vazebné zavedenou mez místo i CH2
8. 10. Použití podle imunocytokinu zvolí z nekrotizujícího faktoru, ho faktoru a iymfokinu.

   nároku 1, kdy se cytokin množiny sestávající z nádor interleukinu, kolonie stimulující
9. 11. Použití podle nároku 1, kdy činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je taxan.
10. 12. Použití podle nároku 11, kdy se taxan zvolí z množiny zahrnující Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty.

    01-3623-02-Ma ·· · ·· ···· ·· ···· ···· ··· · · · • · ····· ·· · • ♦ · · · · · · · ·

    I I I I I I II I ···· ··· ·· ··« ·· ··
11. 13. Použití podle nároku 1, kdy činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je alkylační chemoterapeutické činidlo.
12. 14. Použití podle nároku 13, kdy se alkylační chemoterapeutické činidlo zvolí z množiny zahrnující cyklofosfamid, karboplatinu a jejich deriváty.
13. 15. Použití podle nároku 1, kdy se savci podávají dvě nebo více různých činidel zvyšujících uptake imunocytokinu.
14. 16. Použití podle nároku 1, kdy se savci podávají dva nebo více různých imunocytokinů.
15. 17. Použití podle nároku 1, kdy se činidlo zvyšující uptake imunocytokinu podává přibližně 24 h před imunocytokinem.

    01-3623-02-Ma • ·
16. 18. Kompozice pro indukci imunitní odpovědi proti nádoru u savce, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (i) imunocytokin obsahující vazebné místo protilátky a cytokin a (ii) činidlo zvyšující uptake imunocytokinu.
17. 19. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky obsahuje ve směru N-konec -» C-konec imunoglobulinovou proměnnou oblast, CH1 doménu a CH2 doménu.
18. 20. Kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky dále obsahuje CH3 doménu navázanou na C-konci CH2 domény.
19. 21. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že imunocytokinem je fúzní protein obsahující ve směru N-konec -> C-konec (i) vazebné místo protilátky obsahující imunoglobulinovou proměnnou oblast schopnou navázat antigen buněčného povrchu předem zvoleného buněčného typu, imunoglobulinovou CHl doménu, imunoglobulinovou CH2 doménu a (ii) cytokin.
20. 22. Kompozice podle nároku 21, vyznačující se tím, že vazebné místo protilátky dále zahrnuje CH3 doménu zavedenou mezi CH2 doménu a cytokin.

    01-3623-02-Ma • · «· ·· 4 4 · · · 4 • · · · · · ·

    4 4«· · » 4 * 4 • 4 4 4 4···

    444 44 4444 «4 44
21. 23. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že je cytokin imunocytokinu zvolen z množiny sestávající z nádor nekrotizujícího faktoru, interleukinu, kolonie stimulujícího faktoru a lymfokinu.
22. 24. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je taxan.
23. 25. Kompozice podle nároku 24, vyznačující se tím, že je taxan zvolen z množiny zahrnující Taxol, docetaxel, 10-deacetyl Baccatin III a jejich deriváty.
24. 26. Kompozice podle nároku 18, vyznačující se tím, že činidlem zvyšujícím uptake imunocytokinu je alkylační chemoterapeutické činidlo.
25. 27. Kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že je alkylační chemoterapeutické činidlo zvoleno z množiny zahrnující cyklofosfamid, karboplatinu a jejich deriváty.

    Zastupuj e: