CZ2002182A3 - Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi, její použití, kit, fúzní protein, nukleová kyselina a expresní vektor - Google Patents

Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi, její použití, kit, fúzní protein, nukleová kyselina a expresní vektor Download PDF

Info

Publication number
CZ2002182A3
CZ2002182A3 CZ2002182A CZ2002182A CZ2002182A3 CZ 2002182 A3 CZ2002182 A3 CZ 2002182A3 CZ 2002182 A CZ2002182 A CZ 2002182A CZ 2002182 A CZ2002182 A CZ 2002182A CZ 2002182 A3 CZ2002182 A3 CZ 2002182A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antigen
fusion protein
protein
adjuvant
heavy chain
Prior art date
Application number
CZ2002182A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304884B6 (cs
Inventor
Stephen D. Gillies
Kin Ming Lo
John S. Wesolowski Jr.
Original Assignee
Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharmaceuticals Corp. filed Critical Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Publication of CZ2002182A3 publication Critical patent/CZ2002182A3/cs
Publication of CZ304884B6 publication Critical patent/CZ304884B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin

Description

Předkládaný vynález se týká způsobů a přípravků pro zesílení imunogenicity preselektovaného antigenního proteinu nebo peptidu u savce. Konkrétně se vynález týká způsobů a přípravků obsahujících a aminokyselinové sekvence obsahující konstantní úsek kódující nukleové kyseliny definující fúzní proteiny těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen, přičemž preselektovaný antigen ve fúzním proteinu je schopen u savce vyvolat silnější imunitní reakci ve srovnání s preselektovaným antigenem samotným.
Dosavadní stav techniky
Vývoj vakcín je tradičně zaměřen na vytváření protektivních protilátek schopných neutralizovat infekční agens. Až doposud agens používaná jako vakcíny typicky obsahovala inaktivované nebo oslabené mikroorganizmy (například bakterie nebo viry), jejich produkty (například toxiny) nebo purifikované antigeny. S nástupem moderní molekulární biologie a metod klonování genů je možné vyrobit čistší a mnohem specifičtější vakcíny. Kromě toho znalost imunitního systému na molekulární úrovni umožnila izolaci a charakterizaci imunitních reakcí stimulovaných infekčními
agens. Dvě složky imunitního systému, o kterých se předpokládá, že jsou ústřední pro úspěšnou tvorbu imunitních reakcí, zahrnují: hlavní úlohu regulačních a cytotoxických T lymfocytů a způsob, kterým je těmto buňkám prezentován antigen buňkami prezentujícími antigen (antigen presenting cell - APC) . (Viz například W. E. Paul, vyd. (1993) Fundamentals Of Immunology, Raven Press, Ltd., New York).
Typicky je antigenní protein nebo peptid přijatý z vnějšku APC (exogenní antigen) degradován v endocytárním vezikulu nebo endozomu APC, načež výsledné peptidové fragmenty tvoří komplex s proteiny hlavního histokompatibilního systému (MHC) II. třídy. Výsledný komplex se přesune na buněčný povrch, kde je vystaven imunitním buňkám obklopujícím APC. Peptidový fragment je přizpůsoben prostoru definovaném MHC molekulou a komplex může být rozpoznáván T lymfocytem exprimujícím receptor lymfocytů T, který má pro komplex vazebnou specificitu. Interakce mezi molekulou MHC II. třídy opatřenou peptidem a pomocným T lymfocytem, nazývaným v oboru T lymfocytem CD4, je dále stabilizována další interakcí mezi molekulou MHC II. třídy samotnou a CD4+ receptorem na povrchu T lymfocytů. Tedy exogenní antigen, který je zpracován v APC buňkách, je předložen na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC II. třídy. Komplex MHC II. třídy, když je prezentován CD4+ T lymfocytům, vede k tomu, že CD4+ pomocné lymfocyty sekretují cytokiny, které stimulují B lymfocyty k tvorbě protilátek proti peptidů. (viz Paul, výše).
Vakcinace exogenním antigenem má typicky za následek CD4 lymfocyty zprostředkovanou T lymfocytární reakci, která obecné končí produkcí protilátky. Cytotoxické T lymfocyty (CTL) nejsou touto dráhou typicky stimulovány. CTL jsou zjevně stimulovány v situacích, kdy antigen vzniká z vnitřku APC samotné (endogenní antigen), například prostřednictvím ·· ·· ··
produkce virových proteinů v buňce infikované virem nebo proteinů specifických pro nádory v karcinomových buňkách. Ve skutečnosti se u mnoha virových onemocnění věří, že vytvoření CTL je rozhodující pro eliminaci buněk infikovaných virem, a tedy zotavení z infekce.
Studie ukazují, že endogenní a exogenní antigeny jsou zpracovávány odlišně. Během syntézy vznikajících polypeptidů je část polypeptidu degradována intracelulární strukturou nazývanou proteozom. Fragmenty z tohoto procesu tvoří komplex s nově syntetizovanými molekulami MHC I. třídy spíše než MHC II. třídy, načež výsledné komplexy MHC I. třídy obsahující antigen jsou transportovány na buněčný povrch. Opět T lymfocyty se specificitou pro specifický peptidový fragment vážou T lymfocyty, ale v tomto případě nezbytná interakce koreceptorů nastává mezi molekulou MHC I. třídy a CD8 molekulou. V souladu s tím je endogenní antigen na povrchu APC prezentován CD8+ T lymfocytům. Ačkoliv existují některé typy CD8+ T lymfocytů, které nejsou cytotoxické, CD8+ T lymfocyty tvoří většinu CTL.
Proto se zdá, že návrh/konstrukce vakcíny schopné indukovat silnou CTL reakci vyžaduje, aby antigenní molekula (obecně protein) byla dopravena do vhodného buď vytvořena uvnitř buňky nebo buněčného kompartmentu, aby mohla vstoupit do dráhy MHC I. třídy. Jedna strategie je zavést gen kódující požadovaný protein nebo peptid do viru, a pak použít modifikovaný virus jako vakcínu (Lorenz et al. (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631). Další strategií je injikovat DNA vektor kódující protein do buňky, a pak podávat buňku zvířeti nebo pacientovi, kde je exprimována buňkou, a je pak předložena na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC I. třídy (Donnelly et al. (1997) ANNU. REV. IMMUNOL. 15:617). Bylo ukázáno, že jednodušší technika injikování DNA vektorů
• · přímo do svalu nebo kůže indukuje CTL a/nebo protilátkovou reakci na několik antigenů (Lai et al. (1988) CRIT. REV. IMMUNOL. 18: 449-84 a patent Spojených Států č. 5 589 466).
Studie ukázaly, že antigen je zabrán a zpracován APC, kde je prezentován imunitnímu systému (Lai et al., výše).
Aplikace exogenních peptidů nebo proteinů dráze MHC I. třídy byla částečně úspěšná díky použití chemických adjuvancií, jako je například Freundovo adjuvans a směsi skvalenů a detergentů (Hilgers et al. (1999) VACCINE, 17: 219228) a nověji díky použití malých perliček potažených antigenem, které jsou fagocytovány makrofágy a indukují CTL reakce prostřednictvím alternativní dráhy MHC I. třídy (De Bruijn et al. (1995) EUR. J. IMMUNOL. 25: 1274-1285). Kromě toho další metody pro zesílení imunitní reakce na antigen mohou obsahovat použití chemických adjuvancií v kombinaci s rekombinantními imunostimulačními cytokiny, například IL-2, IL-12, GM-CSF a dalšími. Například jeden způsob používá antihaptenovou protilátku fúzovanou k IL-2 jako způsob spojení tohoto cytokinů k antigennímu proteinu, který chemicky reagoval s haptenem (Harvill et al. (1996) J. IMMUNOL. 157:3165).
Další technika využívá protilátkovou „antigenizaci, pomocí níž je část variabilního úseku imunoglobulinu nahrazena antigenním peptidem. Antigenní peptid hybridní molekuly je prezentován APC, jakmile se rekombinantní protilátka váže na APC prostřednictvím interakce s Fc receptory na povrchu APC (Lama et al. (1993) PROČ. NATL. ACAD. SCI. USA 90: 1168311687). Rozšíření tohoto přístupu používá splenickou injekci plazmidové DNA kódující „antigenizovaný těžký řetězec imunoglobulinu, po které B lymfocyty pocházející ze sleziny sekretují rekombinantní protilátku, jakmile je poskytnut partner lehký řetězec imunoglobulinu.
Imunogenicita aplikačního systému pro antigen je ale jeden z hlavních technických překážek v rozvoji moderních vakcín. Cílem vakcinace je vyvolat silnou imunitní reakci. Ale protože hostitelský imunitní systém je vyvinut k boji proti bakteriím a virům, když jsou bakterie nebo viry použity jako vektory, je posel/vektor typicky zničen spolu se zprávou. Kromě toho silné imunitní reakce na určité virové vektory, například vakcinii a adenovirus, omezují jejich použitelnost a předpokládá se, že podobné problémy mohou povstat v průběhu použití bakteriálních toxinů jako proteinových vektorů. Podobně „proteinové vektory založené na protilátce používající variabilní úseky, které díky své vlastní povaze, nejsou považovány za vlastní („šelf) imunitním systémem, jsou potenciálně imunogenní. Předpokládá se, že mnohonásobné použití těchto nosičských molekul může indukovat anti-idiotypové reakce, a tím předem vyloučit jejich účinné použití. V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout vakcínu, která vytvoří silnou a proti preselektovanému dlouhodobou imunitu proteinu nebo peptidu antigennímu
Podstata vynálezu
Tento vynález je částečně založen na objevu, že je možné zvýšit imunogenicítu preselektovaného peptidu nebo antigenního proteinu u savce fúzí preselektovaného antigenu ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Výsledný fúzní protein (v tomto textu také nazývaný „Fc-antigenní fúzní protein nebo „antigenní fúzní protein) nebo sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein pak mohou být podávány savci ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenu. Kromě toho bylo objeveno, že intenzita a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu mohou být modulovány podáváním specifických adjuvancií spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem nebo sekvencí nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein.
V souladu s tím vynález poskytuje způsob zvýšení imunogenicity preselektovaného antigenu u savce. V jednom aspektu způsob obsahuje podávání savci Fc-antigenního fúzního proteinu obsahujícího. konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou k preselektovanému antigenu v množství postačujícím k tomu, aby se vyvolala imunitní reakce. V dalším aspektu způsob obsahuje ii savci sekvence nukleové kyseliny, například nebo ribonukleové kyseliny deoxyribonukleové kyseliny (DNA) (RNA), kódující Fc-antigenní fúzní protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k preselektovanému antigenu. Preselektovaný antigen, když je částí Fc-antigenního fúzního proteinu (buď podávaný jako fúzní protein nebo nukleová kyselina, která je pak exprimována v příjemci za vzniku fúzní protein), je charakterizován tím, že je schopen stimulace imunitní reakce u savce, která je silnější než reakce vyvolaná srovnatelným množstvím (například hmotností nebo počtem molekul) preselektovaného antigenu samotného, t j. preselektovaným antigenem nefúzovaným ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu.
Kromě toho imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu mohou být zesíleny nebo modulovány podáváním Fc-antigenního fúzního proteinu spolu s adjuvans. Ačkoliv v praxi vynálezu může být použitelná celá řada adjuvancií, například chemická adjuvancia, jako je například Freundovo kompletní adjuvans nebo oligonukleotid obsahující nemethylovanou CpG sekvenci, běžně výhodná adjuvancia pro použití s Fc-antigenními fúzními proteiny zahrnují druhý Fc fúzní protein (v tomto textu nazývaný „Fc-adjuvantní fúzní protein nebo „adjuvantní fúzní protein) nebo nukleovou kyselinu kódující takový Fc fúzní protein. Výhodné Fc-adjuvantní fúzní proteiny zahrnují konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinuu, například cytokinů. Výhodné cytokiny použitelné pro konstrukci Fc-adjuvantní fúzních proteinů zahrnují například interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-12 (IL-12), IL-18, faktor nekrotizující nádory (TNF), faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GMCSF). Další třída Fc-adjuvantní fúzních proteinů zahrnuje úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k adjuvantní skupině odpovídající extracelulární doméně proteinu, která je obvykle částečně nebo výlučně vázaná k membráně. Například CD40 ligand je fúzován k Fc skupině, aby byl použit jako zesílený adjuvantní protein.
Společné podávání Fc-antigenního a Fc-adjuvantního fúzního proteinu, buď současně nebo jednoho po druhém (například Fc-antigen následovaný Fc-adjuvans nebo Fc-adjuvans následované Fc-antigenem), může být použito k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thl a Th2, jsou spouštěny jako reakce na odlišné podněty a zapojují odlišné cytokiny. Thl zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thl reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například karcinomové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulárních agens, jako jsou například paraziti, často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné tt tttt ·· ♦* tttt· · · · · • · · ♦
imunitní reakce nebo ke spuštění či modulaci specifických Thl nebo Th2 reakcí.
Například Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený peptidovou vazbou k GMCSF je účinný všeobecný stimulátor imunitní reakce, včetně obou reakcí Thl a Th2. Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-12 nebo IFN-γ může být společně podáván ke stimulaci primárně buněčné nebo Thl zprostředkované imunitní reakce. Alternativně může být Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-4 podáván ke stimulaci primárně humorální nebo Th2 zprostředkované imunitní reakce.
fúzního proteinu obsahující IL-12
Kromě toho výběr konkrétního cytokinu přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního Například Fc-adjuvantní fúzní protein může stimulovat pomocné T lymfocyty a produkci IgG2a třídy protilátek. Alternativně adjuvantní fúzní protein obsahující IL-4 může stimulovat produkci IgE třídy protilátek.
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob zahrnuje podávání Fc-antigenního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fc-adjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fúzních proteinů, každý obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantnímu proteinu (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické buňky exprimují Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu s tím společným podáváním Fc-antigenu a Fc-adjuvantních fúzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigenního fúzního
proteinu a adjuvans adjuvantního fúzního proteinu ve stejných buněčných typech. Adjuvans pak může stimulovat, zesílit nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenú.
V tomto výhodném provedení používá vynález dvě odlišné formy lokalizace nebo koncentrace. Zaprvé vynález používá společnou skupinu, která je fúzována jak k antigenú tak k které jsou koncentrovány v určitých oblastech adjuvans, organizmu účinná lokální
Tímto způsobem je zvýšena koncentrace antigenú v sousedství adjuvans. Zadruhé vynález cílí antigen k mechanizmům imunitního systému pro zpracování a prezentaci antigenú. První koncentrační krok může být prováděn fúzí antigenú a adjuvantních proteinů ke skupině, což má za následek koncentraci v některé části organizmu, která je dostupná imunitnímu systému. Druhý cílící krok může být prováděn fúzí antigenního proteinu ke kterékoliv skupině, zesiluje prezentaci nebo která prezentujícím antigen.
zpracovaní systémem
V souladu s tím vynález dosahuje těchto koncentračních účinků dvěma alternativními metodami. První metodou je konstrukce a podávání dvou různých fúzních proteinů, fúzní protein lokalizující antigen adjuvans. Druhou metodou je obsahující antigen, adjuvans a fúzní protein lokalizující konstrukce a podávání fúze a lokalizující protein. Fc skupina je příklad lokalizujícího proteinu.
Důležitý charakteristický rys konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu je to, že na rozdíl od preselektovaného antigenú v Fc-antigenním fúzním proteinu, je výhodně neimunogenní nebo je pouze slabě imunogenní pro předpokládaného příjemce. Jinak řečeno, v Fc-antigenním fúzním proteinu je preselektovaný antigen navržen tak, aby byl více imunogenní pro příjemce než konstantní úsek těžkého řetězce
imunoglobulínu. Podobně se předpokládá, že Fc-adjuvantní fúzní protein by také byl neimunogenní nebo slabě imunogenní pro předpokládaného příjemce. Imunogenicita konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulínu může být redukována a v určitých případech eliminována s použitím sekvencí konstantního úseku imunoglobulínu pocházejících ze stejného živočišného druhu nebo podobných sekvencím přítomným u stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například jsou konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulínu, výhodně humánního původu, použity k vytvoření fúzních proteinů pro podávání člověku. Podobně, když je předpokládaný příjemce člověk, je adjuvantní protein v Fc-adjuvantním fúzním proteinu také výhodně humánního původu. Výběrem vhodných aminokyselinových sekvencí definujících konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulínu a adjuvantní proteiny, je možné optimalizovat imunitní reakce přímo primárně proti preselektovanému antigenu.
Ve výhodném provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu Fc-antigenního fúzního proteinu obsahuje kloubový úsek imunoglobulínu a volitelně doménu konstantního úseku imunoglobulínu vybranou ze skupiny, kterou tvoří CH2 doména, CH3 doména a CH4 doména nebo jejich kombinace. Ale konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu výhodně postrádá alespoň CH1 doménu. Kromě toho Fc fúzní proteiny podle vynálezu výhodně postrádají doménu variabilního úseku těžkého řetězce imunoglobulínu (VH) . Když má být fúzní protein podáván člověku, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu výhodně obsahuje kloubový úsek a CH2 doménu nebo CH3 doménu a nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek a obě CH2 doménu a CH3 doménu. Předpokládá se, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulínu použitelné v praxi vynálezu mohou pocházet z imunoglobulinů patřících do kterékoliv z pěti
·♦·· • ·· φ ·· ·· · · ·· · ♦ • φ · · • · · · · • · · · ·«· ···· ··· ···· imunoglobulinových tříd nazývaných v oboru IgA (Iga), IgD (IgÓ), IgE (IgE) , IgG (Igy) a IgM (Igp) . Ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu z IgG třídy.
Předpokládá se, že kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen může být zahrnut v Fc-antigenním fúzním proteinu podle vynálezu. Ve výhodném provedení je preselektovaný antigen vybrán ze skupiny, kterou tvoří membránový antigen specifický pro prostatu, ektodoména cytokinového receptoru, virový protein a antigen specifický pro karcinom nebo nádor.
Fc-antigenní fúzní proteiny mající velký počet konfigurací mohou být použitelné v praxi vynálezu. Například N-koncová část preselektovaného antigenu může být spojena polypeptidovou vazbou s C-koncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Alternativně může být C-koncová část preselektovaného antigenu spojena polypeptidovou vazbou s Nkoncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho se předpokládá, že Fc-antigenní fúzní proteiny mohou obsahovat velké množství jednoho nebo více preselektovaných antigenů, z nichž jeden nebo více může být spojeno přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k sobě navzájem nebo ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho dva nebo více Fc-antigenních fúzních proteinů může být spojeno spolu buď nekovalentně nebo kovalentně, například jednou nebo více disulfidovými vazbami za vzniku dimerních nebo multimerních přípravků. Předpokládá se, že Fc-antigenní fúzní proteiny v dimerních konstruktech mohou být stejné nebo navzájem odlišné. Například i když oba Fc-antigenní fúzní proteiny mohou obsahovat stejný konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, preselektované antigeny se mohou lišit. Předpokládá se, že podobné konfigurace mohou být použity také s Fc-adjuvantními fúzními proteiny.
Kromě toho v praxi vynálezu může být použitelná celá řada φφ • ·
sekvencí nukleových kyselin kódujících Fc fúzní proteiny. Například sekvence nukleové kyseliny mohou kódovat ve směru od 5' ke 3', buď konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen nebo preselektovaný antigen a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho sekvence nukleové kyseliny volitelně mohou také obsahovat „vedoucí nebo „signální sekvenci založenou například na sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu fúzované přímo ke kloubovému úseku konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Ve výhodném provedení, když Fc úsek je založen na IgG sekvencích, Fc úsek kóduje ve směru od 5' ke 3' alespoň kloubový úsek imunoglobulinu (tj. kloubový úsek obsahující alespoň jednu aminokyselinu cystein schopnou tvorby disulfidové vazby s druhou sekvencí kloubového úseku imunoglobulinu), imunoglobulinovou CH2 doménu a CH3 doménu? Kromě toho sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní proteiny mohou také být integrovány do replikovatelného expresního vektoru, který může buď exprimovat Fc fúzní protein například v bakteriálním hostiteli, v předpokládaném příjemci nebo v obou.
Předpokládá se, že injekce sekvencí nukleové kyseliny kódujících Fc-antigenní fúzní protein, buď samotných nebo v kombinaci se sekvencemi nukleové kyseliny kódujícími Fc-adjuvantní fúzní protein, může mít za následek vznik buněčné imunitní reakce, humorální imunitní reakce nebo obou. Kombinace imunizace založené na nukleové kyselině a imunizace založené na proteinu (např·. podávání Fc-antigenního fúzního proteinu před podáváním, během podávání nebo po podávání nukleové kyseliny kódující Fc antigenní fúzní protein) může působit synergicky, aby se vyvolala silnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenu relativně k imunizaci buď se samotnou nukleovou kyselinou nebo samotným proteinem.
Předcházející a další cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zjevnější z následujícího podrobného popisu, obrázků a patentových nároků, které následuj í.
Popis obrázků
Předcházejícím a dalším cílům, charakteristickým rysům a výhodám předkládaného vynálezu, a také vynálezu samotnému bude plněji porozuměno z následujícího popisu výhodných provedení při společném čtení s doprovázejícími obrázky, ve kterých:
Obrázky 1A-1G jsou schématická zobrazení příkladů Fc-fúzních proteinů použitelných v praxi vynálezu. Obrázek IA představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k N-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázek 1B představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázky 1C a ID představují dimerní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní protein. Na obrázku 1C, v alespoň jednom polypeptidovém řetězci, je konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 připojen k N-koncové části antigenu nebo adjuvans 2 a na obrázku ID, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázek IE představuje dimerní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigen-antigen, Fc-adjuvans-adjuvans, Fc-adjuvans-antigen nebo Fc-antigenadjuvans fúzní protein. Obrázek 1F představuje dimerní fúzní
0
protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigen-Fc-adjuvantní nebo adjuvans-Fc-antigenní fúzní protein. Obrázek 1G představuje dimerní fúzní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigenadjuvans-Fc nebo adjuvans-antigen-Fc fúzní protein.
Obrázky 2A-2B jsou schématická znázornění DNA sekvencí použitelných v praxi vynálezu. Obrázek 2A představuje expresní vektor humánního Fc fúzního proteinu. Obrázek 2B představuje genovou fúzi pro expresi myšího IgG2a Fc fúzního proteinu.
Obrázky 3A-3F jsou grafy ukazující účinek chemických a Fc-cytokinových adjuvancií na produkci protilátek u myší imunizovaných Fc-antigenním fúzním proteinem, fúzním proteinem myší Fc - humánní ektodomén receptoru IL-4 (FC-IL-4R). Na obrázku 3A byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-IL-2 ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Na obrázku 3B byly myši imunizovány Fc-IL-4R ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS). Na obrázku 3C byly myši imunizovány Fc-IL-4R v CFA. Na obrázku 3D byly myši imunizovány FC-IL-4R a Fc-IL-2 v PBS. Na obrázku 3É byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-GMCSF v CFA. Na obrázku 3F byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-GMCSF v PBS. Na obrázcích 3A-3F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 4A-4D jsou grafy ukazující účinek imunizace myší s humánním karcinomovým antigenem, PSMA, ve formě Fc-antigenního fúzního proteinu s' použitím proměnného množství Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4A byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA
9 44 4 4# »·* »♦
• 4 4 4 4· * 9 4 · *
• 4 • 4 » 4
4 » · • «44 · •
• 4 4 • 4 4 «
• 444
fúzního proteinu samotného. Na obrázku 4B byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA a 0,5 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4C byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA a 0,5 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4D byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA a 5 gg Fc-GMCSF. Na obrázcích 4A-4D čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší.
Obrázky 5A-5F jsou grafy srovnávající specifické protilátkové reakce na PSMA antigen podávány buď jako nativní protein (5A-5C) nebo jako myší Fc-PSMA fúzní protein (5D-5F). Na obrázku 5A byly myši imunizovány 50 gg PSMA jako antigenem. Na obrázku 5B byly myši imunizovány 50 gg PSMA jako antigenem a 0,2 gg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5C byly myši imunizovány 50 gg PSMA jako antigenem a 0,5 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5D byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA jako antigenem. Na obrázku 5E byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA jako antigenem a 0,2 gg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5F byly myši imunizovány 50 gg Fc-PSMA jako antigenem a 0,5 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázcích 5A-5F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázek 6 je graf srovnávající adjuvantní účinky Fc-GMCSF nebo Fc-F3L společně podávaného s Fc-PSMA na produkci protilátek proti humánnímu PSMA. Všechna zvířata dostala 50 gg Fc-PSMA buď samotného nebo v kombinaci s uvedeným Fc-cytokinem jako adjuvans. V jednotlivých pokusech byly testovány tři myši.
* * <· »· *
9 • »
Obrázky 7A-7B jsou grafy ukazující u jednotlivých myší imunogenicitu Fc-EpCAM fúzního proteinu, buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Obrázky 7A a 7B představují protilátkové titry měřené 7 a 14 dnů po zesilovací injekci, v daném pořadí. Zesilovací injekce byla podávána tři týdny po primární imunizaci. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují myši imunizované subkutánně 10 gg Fc-EpCAM samotného a plné trojúhelníky představují myši imunizované subkutánně 10 gg Fc-EpCAM a 1 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA. .....
Obrázky 8A-8B jsou grafy ukazující u myší imunogenicitu EpCAM-Fc (opačná orientace Fc úseku a antigenu) buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvantním fúzním proteinem. Obrázky 8A a 8B představují protilátkové titry měřené 14 dnů a 21 dnů (tj. 7 dnů po zesilovací injekci) po imunizaci, v daném pořadí. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují průměrné titry tři myší imunizovaných 25 gg EpCAM-Fc fúzního proteinu a plné trojúhelníky představují myši imunizované 25 gg EpCAM-Fc a 2,5 gg Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázek 9 ukazuje schéma konstrukce plazmidového vektoru kódujícího EpCAM-Fc-GMCSF fúzní protein. V tomto případě je antigen EpCAM fúzován k aminokoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu (Fc úsek) a adjuvans GMCSF je fúzováno ke karboxykoncové části Fc úseku.
Obrázky 10A-10D jsou grafy ukazující protilátkové titry u myší, kterým byla podána injekce plazmidových vektorů kódujících Fc-EpCAM fúzní protein s použitím buď PBS nebo 25% (hmotnost/objem) roztoku sacharózy jako nosiče. Obrázky 10A10D představují protilátkové titry zaznamenané 14 dnů, 27 dnů, 55 dnů a 69 dnů po počáteční injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představují titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidu v PBS a plné trojúhelníky představují titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidu v sacharóze. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 11A-11B jsou grafy ukazující stimulaci inkorporace 3H-thymidinu jako reakci na in vitro stimulaci antigenem splenocytů izolovaných z myší imunizovaných DNA vakcinací nebo injekcí proteinu. Obrázek 11B ukazuje rozšířený přehled dat v nižší části obrázku 11A. Na obrázcích plné kosočtverce představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 μρ plazmidové DNA kódující CMV-Fc-EpCAM fúzní protein, prázdné kroužky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 μρ plazmidové DNA kódující CMV-EpCAM-Fc fúzní protein a křížky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 10 μρ Fc-EpCAM proteinu. Sleziny byly odstraněny myším v 70. Den po první injekci plazmidové DNA nebo proteinu a dvou zesilovacích injekcích ve 3 týdenních intervalech.
Obrázky 12A-B jsou grafy ukazující test usmrcování cytotoxickými T lymfocyty (CTL) s použitím splenocytů z myší imunizovaných plazmidovou DNA nebo Fc-EpCAM proteinem. Obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti myším CT26 nádorovým buňkám exprimujícím humánní EpCAM protein. Obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parentálním myším CT26 nádorovým buňkám. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují splenocyty imunizované DNA nesoucí konstrukt (CMV-promotor)EpCAM, prázdné čtverce představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt (CMV-promotor)Fc-EpCAM, prázdné trojúhelníky představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt (CMV-promotor)EpCAM-Fc a křížky představují splenocyty z myší imunizovaných Fc-EpCAM fúzním proteinem. CTL test používal splenocyty z imunizovaných myší pěstovaných pět dnů s 10 U/ml IL-2. Značené cílové buňky byly smíchány s označenými efektory a inkubovány čtyři hodiny. Uvolňování radioaktivity bylo použito pro výpočet procenta specifické lýzy.
Obrázek 13 je graf ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných subkutánně 50 μg Fc-MCSP fúzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fúzním proteinem samotným a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fúzním proteinem v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 14A-B jsou grafy ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných Fc-gp41 pep 626 fúzním proteinem buď • · · · · · • ·
samotným nebo v kombinaci s Fc-cytokinovým adjuvans. Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 gg Fc-gp41 pep 626 antigenú samotného, prázdné čtverce představují titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 μς Fc-gp41 pep 626 antigenú v kombinaci s 2,5 μς Fc-GMCSF adjuvans a plné trojúhelníky představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 2,5 μg Fc-gp41 pep 626 antigenú v kombinaci s 2,5 ^g Fc-IL2 adjuvans. Hladiny protilátek k antigenú byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Detailní popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká účinné aplikace antigenních proteinů nebo peptidů in vivo pro indukci humorální imunitní reakce (tj. založené na protilátkách) nebo Th2 buňkami zprostředkované imunitní reakce, buněčné nebo Thi buňkami zprostředkované imunitní reakce a v některých případech obou typů imunitní reakce u savce. Nyní bylo objeveno, že je možné zesílit imunogenicitu preselektovaného antigenního proteinu nebo peptidu u savce fúzí preselektovaného antigenú ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu, aby se vytvořil Fc-antigenní fúzní protein. Výsledný Fc-antigenní fúzní protein nebo sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní proteiny pak mohou být podávány savci, například člověku, ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenú.
Fc-antigenní fúzní protein selektivně cílí antigen k buňkám prezentujícím antigen (APC). Bez ohledu na jakékoliv • · · · teorie, má se za to, že vazba Fc-antigenního fúzního proteinu k APC je zprostředkována Fc receptory exprimovanými na četných typech imunitních buněk, včetně například: dendritických buněk, makrofágů, B lymfocytů a granulocytů. Fc-antigenní fúzní protein se při podávání savci váže na Fc receptory, a poté je Fc-antigenní fúzní protein pohlcen APC endocytózou. Předpokládá es, že fúzní protein pohlcený endocytózou, včetně preselektovaného antigenů, je pak degradován na malé peptidy, které jsou pak prezentovány na buněčném povrchu. Předložené peptidy pak zprostředkovávají humorální a/nebo buněčnou imunitní reakci. Konkrétní typ stimulované imunitní reakce může být modulován společným podáváním Fc-antigenního fúzního proteinu s adjuvans, například adjuvantním fúzním proteinem.
V jednom způsobu podávání je příjemci podáván Fc-antigenní fúzní protein. V dalším způsobu podávání je příjemci podávána sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein. Preselektovaný antigen, buď v podávaném Fc-antigenním proteinu nebo jako exprimovaný z podávané nukleové kyseliny, je více imunogenní než antigen samotný, tj. antigen, který není fúzovaný polypeptidovou vazbou ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě okolností může být postupné podávání následované podáváním nukleové kyseliny, fúzní protein nebo alternativně podávání nukleové kyseliny kódující fúzní protein následované podáváním stejného fúzního proteinu použito k maximalizaci imunogenicity preselektovaného antigenů. Má se za to, že optimální imunitní reakce byla vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-antigenních fúzních proteinů. Jinak řečeno, preselektovaný antigen v Fc-antigenním fúzním proteinu je schopen vyvolat imunitní reakci a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je schopen vazby Fc receptorů na povrchu APC.
toho za určitých fúzního proteinu která jej kóduje
Kromě toho, jak diskutováno, síla a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu může být modulován společným podáváním specifických adjuvancií s Fc-antigenním fúzním proteinem a/nebo nukleovou kyselinou kódující Fc-antigenní fúzní protein. Ačkoliv chemická adjuvancia, např. alum nebo Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, mohou být za určitých okolností, například při veterinárních aplikacích, použitelná v praxi vynálezu, jejich vedlejší účinky, například zjizvení tkáně, je mohou činit nepřijatelná pro humánní použití. V souladu s tím výhodná adjuvancia obsahují druhý Fc fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu je fúzován k adjuvantnímu proteinu za vzniku Fc-adjuvantního fúzního proteinu. Má se za to, že co se týče Fc-antigenních fúzních proteinů, je optimální imunitní reakce vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-adjuvantního fúzního. proteinu. Jinak řečeno, adjuvans v Fc-adjuvantním fúzním proteinu je schopno modulace imunitní reakce a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu je schopen vazby Fc receptoru na povrchu APC.
Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba antigen a adjuvans podávány jako Fc fúzní proteiny nebo nukleové kyseliny kódující takové fúzní proteiny. Jinak řečeno, antigen- je podáván jako Fc-antigenní fúzní protein a adjuvans je podáván jako Fc-adjuvantní fúzní protein. Určitá výhodná provedení Fc fúzních proteinů použitelná v praxi vynálezu jsou ukázána na obrázcích 1A-1G.
Obrázek 1A ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém Ckoncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulínu 1 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovou spojovací částí (linker), k N-koncové části preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2. Jak se v tomto textu používá, termín „polypeptidový linker označuje sekvenci jednoho nebo více • · · · aminokyselinových dohromady, dlouhých zbytků, které spojují dva proteiny
Polypeptidový linker je často řada aminokyselin přibližně 10-15 zbytků, obsahující například opakující se glycinové a/nebo serinové zbytky. Obrázek 1B ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém C-koncová část preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovým linkerem, k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek ÍC ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené kovalentně dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena k N-koncové části preselektovaného antigenu adjuvans 2. Podobně, obrázek ID ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené kovalentně dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek IE ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2, jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k druhému antigenu nebo adjuvans 2' .
Obrázek IF ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny také spojené dvěmi disulfidovými vazbami.
Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých
C-koncová část antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Nkoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1, jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části odlišného adjuvans nebo antigenu 2' . Například tyto fúzní proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu-adj uvans.
Obrázek 1G ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny také spojené dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Nkoncové části odlišného adjuvans nebo antigenu 2' , jehož Ckoncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1. Například tyto fúzní proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-adjuvans-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu.
V praxi vynálezu je obecně výhodné umístit Fc skupinu do N-koncové polohy relativně k adjuvantní skupině. Jestliže je adjuvantní skupina umístěna N-koncově k Fc skupině, pak se fúze adjuvans-Fc může vázat k receptoru adjuvans na imunitní buňce a Fc skupina je ve stejné orientaci, která je přijata, když se protilátka váže k buněčnému povrchu. Výsledkem je ADCC nebo fixace komplementu. Ale když je Fc skupina umístěna Nkoncově k adjuvantní skupině, nenastane ADCC a fixace komplementu.
Konstrukty ukázané na obrázcích 1C-1G jsou ukázány jako dimery zesítěné párem disulfidových vazeb mezi cysteiny na sousedních kloubových úsecích. Na obrázcích jsou disulfidové můstky ukázány jako spojující dohromady části dvou konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu prostřednictvím kloubového úseku charakteristického pro nativní formy těchto molekul. I když jsou výhodné konstrukty zahrnující kloubové úseky imunoglobulinů, vynález předpokládá, že může být vybráno zesítění v jiných polohách, je-li žádoucí. Kromě toho v některých případech mohou nekovalentně asociovat dva nebo více monomerů za vzniku dimerů nebo multimerů použitelných v praxi vynálezu.
Jak se v tomto textu používá, termín „konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je zaměnitelný s termínem „Fc úsek a označuje karboxy-koncovou část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její analog nebo část schopnou vazby Fc receptorů. Jak je známo, každý konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu obsahuje čtyři nebo pět domén. Domény jsou nazvány postupně, jak následují: CH1kloubový úsek-CH2-CH3(-CH4). CH4 se vyskytuje v IgM, který nemá kloubový úsek. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu použitelný v praxi vynálezu výhodně obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu a výhodně také zahrnuje CH3 doménu. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu. Jak se v tomto textu používá, termín „kloubový úsek imunoglobulinu označuje celý kloubový úsek imunoglobulinu nebo alespoň část kloubového úseku imunoglobulinu postačující pro vznik jedné nebo více disulfidových vazeb s druhým kloubovým úsekem imunoglobulinu.
Předpokládá se, že vhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu mohou pocházet z protilátek patřících do každé třídy imunoglobulinů nazývaných IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu z • 0 0 · ·
000 0000 ·· třídy IgG. Kromě toho se předpokládá, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu mohou pocházet z kterékoliv podtřídy IgG protilátky v oboru nazývaných IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.
Domény konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu mají zkříženou homologii mezi imunoglobulinovými třídami. Například CH2 doména IgG je homologní k CH2 doméně IgA a IgD a k CH3 doméně IgM a IgE. Výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu obsahují proteinové domény odpovídající CH2 úseku a CH3 úseku IgG nebo jeho funkční části nebo derivátům. Konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu ale výhodně postrádají alespoň CH1 doménu. Kromě toho Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny volitelně postrádají variabilní úsek imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu obsahuje, ve směru od N-konce k C-konci, kloubový úsek imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu, které jsou všechny založeny na sekvencích z molekuly IgG. Výběr vhodných konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu je detailně diskutován v patentech Spojených Států č. 5 541 087 a ·5 726 044. Výběr konkrétních sekvencí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu z určitých imunoglobulinových tříd a podtříd pro dosažení konkrétního výsledku je považován za rutinní činnost na úrovni znalostí v oboru.
Za některých okolností může být užitečné modifikovat konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, například mutací, delecí nebo jinými změnami zprostředkovanými genetickým inženýrstvím nebo jinými přístupy, tak, že určité aktivity, jako například fixace komplementu nebo stimulace cytotoxicity zprostředkované buňkami závislé na protilátkách (ADCC), jsou redukovány nebo odstraněny. Ale je považováno za nezbytné, že je udržována schopnost konstantního úseku těžkého druhu, jakého Jinak řečeno, řetězce imunoglobulinu vázat Fc receptor.
V praxi tohoto vynálezu je složka konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenních nebo Fcadj uvantních fúzních proteinů výhodně pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo slabě imunogenní. Fc úsek je považován za neimunogenní nebo slabě imunogenní, jestliže konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nevyvolá detekovatelnou protilátkovou reakci namířenou proti konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. V souladu s tím by konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu měl pocházet z imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném druhu nebo by měl být založen na aminokyselinových sekvencích odpovídajících imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném je předpokládaný příjemce fúzního proteinu, když Fc fúzní konstrukt (Fc-antigen a/nebo
Fc-adjuvantní fúzní protein) má být podáván člověku, měly by být použity humánní sekvence konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence humánních Fc IgG jsou popsány například v Ellison et al. (1982, NUCLEIC ACIDS RES. 10: 4071-4079). Podobně by měly být použity myší Fc sekvence, když Fc fúzní protein má být podáván myším. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myších Fc IgG2a jsou popsány například v Bourgois et al. (1974, EUR. J. BIOCHEM. 43: 423-435). Měla by být použita stejná logika, jestliže Fc fúzní proteiny mají být podávány jiným zvířatům včetně domácích zvířat, například koček a psů, a hospodářských zvířat, například krav a koní.
Jak se v tomto textu používá, termín „preselektovaný antigen označuje kterýkoliv protein nebo jeho fragment nebo polypeptid, který je schopen buď samotný nebo v kombinaci s jinými reagenciemi indukovat imunitní reakci u savce. Předpokládá se, že v Fc-antigenním fúzním proteinu podle ♦ · • · · · • · · · · • · « · ···· ·♦ ···· vynálezu může být obsažen kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen. Ve výhodném provedení preselektovaný antigen je vybrán ze skupiny, kterou tvoří membránový antigen specifický pro prostatu (PSMA), ektodoména cytokinového receptorů, například ektodoména humánního IL-4 receptorů, nádorový specifický antigen (například antigen, který je řízené zvýšeně exprimován nebo je v nádorové buňce jinak přítomný ve zvýšených hladinách relativně k normální buňce) a virový protein, například protein kódovaný genomem humánního viru imunodeficience (HIV).
Jak se v tomto textu používá, termín „adjuvans označuje kteroukoliv látku, kter je schopna působit jako imunomodulátor, například zesílením imunitní reakce (buď humorální nebo buněčné) proti preselektovanému antigenu. Jak se v tomto textu používá, termín „humorální imunita označuje imunitu zprostředkovanou protilátkami přítomnými v tělesných tekutinách, například v plazmě nebo v lymfě, zatímco termín „buněčná imunita, v oboru také nazývaná imunita „zprostředkovaná buňkami, označuje imunologické reakce spouštěné T lymfocyty a zprostředkované efektorovými T lymfocyty a/nebo makrofágy.
Jak diskutováno výše, v imunizaci savců kromě člověka může být použitelná celá řada chemických adjuvancií, například Freundovo kompletní adjuvans. Ačkoliv je široce používáno u zvířat k vytváření vysokých titrů protilátky nebo významných reakcí cytotoxických T lymfocytů (CTL), jeho vedlejší účinky, například jizvení tkáně, jej činí nepřijatelné pro humánní použití. Tudíž je zapotřebí indukovat silné imunitní reakce bez doprovodného zánětu v místě injekce. Jedna nesporná výhoda použití Fc-adjuvantních fúzních proteinů podle vynálezu je schopnost vyvolat silnou imunitní reakci bez potřeby chemických adjuvancií, jako je například Freundovo adjuvans.
4 4 4 4«
Výhodná adjuvancia použitelná v praxi vynálezu zahrnují Fc-adjuvantní fúzní protein nebo nukleovou kyselinu, která jej kóduje. Výhodné adjuvantní proteiny pro zahrnutí do Fc fúzních proteinů jsou cytokiny. Jak se v tomto textu používá, termín „cytokin označuje kterýkoliv protein nebo peptidový analog nebo jeho funkční fragment, který je u savce schopen modulovat aktivitu imunitních buněk, například T lymfocytů, B lymfocytů, makrofágů, neutrofilů, eosinofilů, basofilů, dendritických buněk a jejich prekurzorů. Výhodné cytokiny zahrnují například IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF a GMCSF. Extracelulární doména CD40 ligandu je také výhodný protein k fúzi k Fc za vzniku Fc-adjuvans. Když je podáván s Fc-adjuvans, antigen v Fc-antigenním fúzním proteinu může vyvolat imunitní reakci, která je silnější, než když je Fc-antigenní fúzní protein podáván bez Fc-adjuvantního fúzního proteinu. V některých případech je hladina protilátky dosažená po pouze dvou imunizacích Fc-antigenu s Fc-adjuvans zrovna tak vysoká nebo vyšší než hladina dosažená s Freundovým adjuvans, a bez zjistitelné reakce kůže.
cytokinů definovaných odpovídajícími cytokinům,
Co se týče konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů, adjuvantní protein výhodně je pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo pouze slabě imunogenní. To může být uskutečněno zavedením do Fc adjuvantních fúzních proteinů, aminokyselinovými sekvencemi které lze izolovat ze stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například když má být Fc adjuvantní fúzní protein podáván člověku, je výhodně adjuvantní protein (například cytokin) humánního původu.
Společné podávání Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů, buď současně nebo jeden po druhém, může být použito k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thi a Th2, jsou stimulovány jako reakce na odlišné typy infekce a zapojují odlišné cytokiny. Thi zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thi reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například nádorové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulárních agens, jako jsou například paraziti, často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné imunitní reakce nebo ke spuštění či modulaci specifických Thi nebo Th2 reakcí.
Kromě toho výběr konkrétního cytokinů přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu. Například FC-IL12 stimuluje reakci pomocných T lymfocytů stimulací produkce působků, které jsou známy jako Thi cytokiny, například IFN-γ, IL-2 a TNF, které podporují silnou buněčnou imunitu a produkci IgG2a třídy protilátek. Naopak Fc-IL-4 stimuluje produkci Th2 cytokinů, například IL5, IL-6, IL-10 a IL-4, které podporují humorální imunitu.
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob obsahuje podávání Fc-antigenního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fc-adjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fúzních proteinů, z nichž každý obsahuje konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantní protein (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické · 1 : ·· * · · « · ? * · · ♦ · · • . * · · ···· · *_ * * · · 9 «
999 9191 ιι9 1119 »» 9911 buňky exprimují Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu s tím společným podáváním Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigen-fúzního proteinu a adjuvans adjuvantního fúzního proteinu ve stejném buněčném kompartmentu APC. Adjuvans pak může zesilovat nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenú.
Kombinace Fc-cytokinů může být také použita synergicky ke stimulaci obecné reakce a pak pro ovlivnění, zda nastane buněčná (Thi) nebo humorální (Th2) reakce. Například Fc-GMCSF je silný obecný stimulátor imunitních reakcí. Ale aby se modulovala reakce dále směrem k buněčné nebo Thi zprostředkované imunitě, může být FC-IL12 nebo Fc-IFNy adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF. Aby se podporovala více humorální nebo Th2 zprostředkovaná reakce, může být Fc-IL4 adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF k modulaci reakce k vytváření Th2 buněk. V závislosti na přesné povaze požadované fyziologické reakce mohou také být použity další Thi nebo Th2 podporující cytokiny, použité jako fúzní cytokiny pro Fc. Předpokládá se, že tento obecný přístup může také být použit k modulaci existující patologické reakce, jako je například autoimunita (Thl-zprostředkované onemocnění) a alergie (nezprostředkované onemocnění) posunutím reakce směrem ke konkrétnímu antigenú a pryč od škodlivé reakce imunizací k nové reakci opačného Th typu.
Za některých okolností, při imunizaci zvířete Fc-antigenním fúzním proteinem, je užitečné použít nukleové kyseliny jako oligonukleotidy fosfodiesterová adjuvancia. Nukleové obsahující sekvence vazba-guanosin (CpG), kyseliny, například obohacené cytosinmohou nasměrovat imunitní reakci směrem k Thi reakci a mohou volitelně být t
4« • 44 4444
4444 použity v kombinaci s dalšími adjuvancii, jako například cytokiny (viz například Brazolot et al. (1998) PROČ. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 95: 15553-8, Liu et al. (1998) BLOOD 92: 3730-6 a Klinman et al. (1997) IMMUNOL. 158: 3635-3639). V souladu s tím se předpokládá, že oligonukleotidy obsahující CpG mohou být společně podávány s Fc-antigenovou fúzí pro dosažení zesílené a příslušně modulované imunitní reakce. Takové molekuly nukleové kyseliny mohou být jakkoliv dlouhé, ale jsou výhodné nukleotidy delší než 8 nukleotidů. Sekvence nukleové kyseliny výhodně obsahují sekvenci CpG a výhodněji sekvenci purin-purin-C-G-pyrimidin-pyrimidin, přičemž cytosiny v centrální CpG jsou nemethylovány. Frekvence CpG dinukleotidů v DNA adjuvans je výhodně alespoň přibližně 5% a výhodněji přibližně 10%. Například jako adjuvans může být použita dvouvláknová forma oligodeoxynukleotidu TCCATGACGTTCCTGACGTT (sekv.· id. č. 22). V závislosti na typu imunitní reakce, která je hledána, může být užitečné smíchat nukleovou kyselinu s alumem.
Předkládaný vynález používá obvyklou metodologii rekombinantní DNA pro tvorbu Fc fúzních proteinů použitelných v praxi vynálezu. Fc fúze konstrukty výhodně jsou tvořeny na úrovni DNA a výsledné DNA integrovány do expresních vektorů a exprimovány za vzniku Fc-antigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů podle vynálezu. Jak se v tomto textu používá, termín „vektor označuje kteroukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci kompetentní pro zavedení do hostitelské buňky a pro rekombinaci a integraci do genomu hostitelské buňky nebo pro autonomní replikaci jako epizom. Takové vektory zahrnují lineární nukleové kyseliny, plazmidy, fagemidy, kosmidy, RNA vektory, virové vektory apod. Neomezující příklady virových vektorů zahrnují retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Jak se v tomto textu
používá, termín „genová exprese nebo „exprese Fc fúzního proteinu označuje transkripci DNA sekvence, translaci mRNA transkriptu a sekreci Fc fúzního proteinového produktu. Fc fúzní proteiny obsahující IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, bIG-H3, IgE receptor, PSMA nebo gpl20 byly exprimovány s použitím expresních systémů typů diskutovaných v tomto textu. Stejné nebo podobné expresní konstrukty jsou popsány v patentech Spojených Států č. 5 541 087 a 5 726 044.
Jako alternativa k fúzi proteinů technikami genetického inženýrství může být k fúzi proteinových skupin použita chemická konjugace s použitím obvyklých chemických zesíťovacích činidel.
Základní vektory použitelné v praxi vynálezu zahrnují selekční (t j. selektovatelný) markér, například gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR), řízený transkripčními regulačními sekvencemi, pocházejícími například z viru SV40 a bakteriální plazmidové sekvence pro selekci a udržování plazmidu v E. coli. Exprese sekvencí Fc-fúzního proteinu je řízena promotorem a volitelné zesilujícími sekvencemi, například cytomegalovirovým (CMV) promotorem a zesilujícími sekvencemi.
Jestliže Fc-fúzní protein nebo nukleová kyselina kódující tento fúzní protein má být podávána člověku, sekvence kódující Fc fúzní protein výhodně začínají ve směru od 5' k 3' „vedoucí sekvencí pocházející například z protilátkového lehkého (L) řetězce, fúzovanou ve shodném čtecím rámci alespoň s částí těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její mutantní formou, výhodně z Fcyl úseku humánního imunoglobulinového gl genu. Fcyl úsek imunoglobulinového Fcyl genu výhodně zahrnuje alespoň část kloubové domény a CH3 domény a výhodněji zahrnuje alespoň kloubovou doménu, CH2 doménu a CH3 doménu. Jestliže Fc fúzní protein má být podáván myším, výhodné sekvence nukleové • ·· · ·· ·· ti ··· * · · · · · ·· • · · · · · ··· ··· ···· ·· ···· kyseliny kódující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu zahrnují sekvence nukleové kyseliny kódující ve směru od 5' k 3' kloubový úsek, CH2 doménu a CH3 doménu z myší IgG2a protilátky. Je-li nutné, je karboxy-koncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu modifikována na úrovni nukleové kyseliny tak, aby byla možná ligace ve shodném čtecím rámci se sekvencemi kódujícími buď preselektovaný antigen (v případě Fc-antigenu) nebo imunostimulační cytokin (v případě Fc-adjuvantního cytokinů). DNA kódující sekreční kazetu může být ve své genomové konfiguraci nebo své cDNA konfiguraci.
Část DNA kódující signální sekvenci výhodně kóduje peptidový segment, který řídí sekreci Fc fúzního proteinu a potom je odštěpen od zbytku Fc fúzního proteinu. Signální sekvence podle vynálezu je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci, která zahajuje transport proteinu přes membránu endoplazmatického retikula. Signální sekvence, které jsou použitelné ve vynálezu zahrnují signální sekvence protilátkového lehkého řetězce, např. protilátky 14.18 (Gillies et al. (1989) J. of IMMUNOL. METH., 12: 191), signální sekvence protilátkového těžkého řetězce, např. signální sekvence těžkého řetězce protilátky MOPC141 (Sakano et al. (1980) NÁTUŘE 286: 5774) a každé další signální sekvence, kter jsou v oboru známy (viz například Watson (1984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12: 14).
Signální sekvence byly v oboru dobře charakterizovány a je známo, že typicky obsahují 16 až 30 aminokyselinových zbytků a mohou obsahovat více nebo méně aminokyselinových zbytků. Typický' signální peptid se skládá ze tří úseků: základní Nkoncový úsek, centrální hydrofobní úsek a polárnější C-koncový úsek. Centrální hydrofobní úsek obsahuje 4 až 12 hydrofobních zbytků, které ukotvují signální peptid přes membránovou • · · · ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · • · · · · 4 lipidovou dvouvrstvu během transportu vznikajícího polypeptidů. Po iniciaci je signální peptid obvykle štěpen v lumen endoplazmatického retikula buněčnými enzymy známými jako signální peptidázy. Potenciální štěpná místa signálního peptidů obecně sledují „(-3, -1) pravidlo. Tedy typický signální peptid má malé neutrální aminokyselinové zbytky v polohách -1 a -3 a postrádá prolínové zbytky v tomto úseku. Signální peptidáza štěpí tento signální peptid mezi -1 a +1 aminokyselinami. Tedy signální sekvence může být štěpena z amino-koncové části fúzního proteinu v průběhu sekrece. To má za následek sekreci Fc fúzního proteinu. Sekvence signálního peptidů použitelné v praxi vynálezu jsou v oboru dobře známy, (viz například von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14: 4683).
Jak je odborníkovi zjevné, vhodnost konkrétní signální sekvence pro použití v sekreční kazetě může vyžadovat určité rutinní experimenty. Tyto experimenty mohou zahrnovat stanovení schopnosti signální sekvence řídit sekreci Fc fúzního proteinu a/nebo stanovení optimální konfigurace, genomové nebo cDNA, sekvence, která bude použita, aby se dosáhlo účinné sekrece Fc fúzních proteinů. Kromě toho je odborník schopen vytvořit umělý signální peptid sledující předložená pravidla (von Heijne, odkaz výše) a testovat takovou umělou signální sekvenci na účinnost rutinními experimenty. Termíny „signál sekvence, „signální peptid, „vedoucí sekvence nebo „vedoucí peptidy jsou v tomto textu použit zaměnitelně.
Předpokládá se, že může být použit velký počet různých způsobů podávání Fc fúzních proteinů nebo sekvencí nukleové kyseliny kódující fúzní protein k imunizaci příjemce proti preselektovanému antigenu. K vyvolání CTL reakcí mohou být použity dvě odlišné aplikace podle předkládaného vynálezu, jedna založená na injekci DNA kódující Fc-antigenní fúzní
protein a druhá založená na podávání Fc-antigenního fúzního proteinu schopného dodat protein dráze MHC I. třídy.
Injekce antigenních proteinů je použita typicky, aby se vyvolala imunitní reakce u savců. Ale vynález také poskytuje způsoby dodání antigenu k APC injekcí DNA. Obecně používaná technika je injikovat DNA expresní vektory kódující antigenní protein do svalu. Publikace svědčí pro to, že antigenní protein je exprimován svalovými buňkami, ale že antigen není těmito buňkami prezentován imunitnímu systému. Místo toho se má za to, že specializované APC, například makrofágy a dendritické buňky, migrují do místa injekce, navážou a prezentují antigen procesem, který ještě nebyl upřesněn. Použití expresních vektorů pro Fc-antigenní fúzní protein činí tento postup účinnější, protože sekretovaný fúzní protein se váže účinněji k APC než nativní antigenní protein.
jeden důsledek přístupu s injekcí DNA je, že může mít často za následek vyvolání jak humorální tak buněčné reakce. Typicky mají proteiny podávané exogenně obtížnější příležitost pro vstup do dráhy pro prezentaci na molekulách MHC I. třídy. Nicméně podávání Fc fúzních proteinů podle vynálezu zesílí vytváření cytotoxických buněk, pravděpodobně prezentací preselektovaného exogenního antigenu prostřednictvím MHC I. třídy. Kombinace DNA imunizace a proteinové imunizace může také působit synergicky, nejdříve instruovat imunitní systém a pak zesílit stupeň reakce ve formě jak produkce protilátek tak cytotoxických buněčných reakcí. Společné podávání Fc-adjuvantního fúzního proteinu, například Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 a ligandu Fc-Flt3, spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem, zajistí společnou lokalizaci fúzních proteinů do stejného buněčného kompartmentů APC, a tím stimulaci účinnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenu.
Přípravky podle předkládaného vynálezu (tj . Fc-antigen »· · · • » » • · ·
a/nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny nebo sekvence nukleové kyseliny kódující tyto fúzní proteiny) mohou být poskytnuty zvířeti kterýmkoliv vhodným prostředkem, přímo (např. lokálně, jako injekcí, implantací nebo topickým podáváním do určitého místa tkáně) nebo systémově (např. parenterálně nebo perorálně). Kde má být přípravek poskytnut parenterálně, jako například intravenózním, subkutánním, oftalmickým, intraperitoneálním, intramuskulárním, bukálním, rektálním, vaginálním, intraorbitálním, transdermálním, intracerebrálním, intrakraniálním, intraspinálním, intraventrikulárním, intrathekálním podáváním, podáváním do cisteren, intrakapsulárním, intranazálním podáváním nebo podáváním aerosolu, obsahuje přípravek výhodně část vodné fyziologicky kompatibilní tekuté suspenze nebo roztoku, nosič nebo vehikulum je fyziologicky přijatelné tak, že kromě aplikace požadovaného přípravku pacientovi neovlivní nijak nepříznivě pacientovu elektrolytovou rovnováhu a/nebo rovnovážný objem. Tekuté médium pro přípravek může tedy zahrnovat normální fyziologický roztok (např. 9,85% vodný NaCl, 0,15 M, pH 7-7,4).
nebo
Tedy
Výhodné dávky Fc-antigenního fúzního proteinu při podávání jsou v rozmezí 50 ng/m2 až 1 g/m2, výhodněji 5 gg/m2 až 200 mg/m2 a nejvýhodněji 0,1 mg/m2 až 50 mg/m2. Výhodné dávky Fc-adjuvantního fúzního proteinu při podávání jsou v rozmezí 1 ng/m2 až 0,1 g/m2, výhodněji 0,5 gg/m2 až 20 mg/m2 a nej výhodněji 10 μg/m2 až 5 mg/m2. Výhodné dávky nukleových kyselin kódujících Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny při podávání jsou v rozmezí 1 μρ/m2 až 100 mg/m2, výhodněji 20 μg/m2 až 10 mg/m2 a nej výhodněji 400 μg/m2 až 4 mg/m2.
Předpokládá se, že maximální imunizace může být dosaženo prováděním četných samostatných imunizací, například jedna až • · « * · « ·· ·· •· · · ··· · · · · tři inokulace přibližně 3 týdny až šest měsíců od sebe. Kromě toho, jak diskutováno výše, maximálních imunitních reakcí může být dosaženo za určitých okolností střídáním mezi podáváním Fc fúzních proteinů a nukleových kyselin kódujících tyto Fc fúzní proteiny. Předpokládá se, že Fc-antigenní fúzní protein nebo nukleová kyselina kódující fúzní protein může být podávána savci před podáváním Fc adjuvantního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc adjuvantní fúzní protein, současně s tímto podáváním nebo po něm. předpokládá se ale, že optimální způsoby podávání, dávky a zesilovací režimy mohou být stanoveny rutinními experimenty v rozsahu schopností odborníka.
Vynález je dále ilustrován následující příklady, které rozsah vynálezu nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce expresních vektorů pro Fc-antigen a Fc-adjuvans
Aby se řádně otestovala imunogenicita Fc fúzních proteinů v myším modelu, byly konstruovány expresní vektory s použitím sekvencí nukleové kyseliny kódujících Fc úseky myšího IgG2a. To snížilo riziko, že Fc úsek každého fúzního proteinu indukuje u savce imunitní reakci. Kromě toho jako fúzní partneři v Fc-adjuvantních fúzních konstruktech byly použity myší cytokiny, protože jejich biologické aktivity mohou být vysoce specifické pro daný živočišný druh. Tedy vektory publikovaná dříve (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:
495-500) byly modifikovány (viz obrázek 2) nahrazením humánní Fc sekvence IgGl sekvencemi cDNA kódující Fc myšího IgG2a (patent Spojených Států č. 5 726 044).
Fc sekvence myšího IgG2a byly klonovány z knihovny myších splenocytů amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR primery obsahovaly adaptérové sekvence pro spojení vedoucí sekvence na 5' konci, a unikátní restrikční místo Smal/Xmal na 3' konci pro ligaci se sekvencemi kódujícími buď antigeny nebo adjuvantní cytokiny. Antigen a adjuvantní (cytokinové) sekvence byly připraveny s místem 5' Smál a udržováním čtecího rámce mezi Fc a antigenem nebo adjuvantními proteiny a unikátním místem Xhol umístěným hned po translačním stop signálu.
Výsledný DNA konstrukt kódoval vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke kloubovému úseku H řetězce myšího IgG2a a pokračoval CH2 a CH3 exony myšího IgG2a a fúzním partnerem (buď antigen nebo adjuvantní cytokin). Transkripce byla řízena' CMV promotorem/enhancerem, který byl shledán použitelným pro expresi ve většině typů buněk v kultuře, a také pro expresi ve svalu a dalších typech buněk po DNA injekci in vivo. Selekční markér, gen dihydrofolátreduktázy (DHFR) , byl vložen do každého vektoru pro usnadnění selekce trvale transfekovaných klonů, a také sekvence nezbytné pro udržování plazmidové DNA v E. coli.
Následující názorné konstrukty Fc-antigenu byly tvořeny zavedením správně upravených sekvencí mezi unikátní místa Smál až Xhol ve vektoru nazvaném pdCs-muFc, kde „mu vyjadřuje, že Fc je myšího původu:
Ektodoména (extracelulární část) humánního IL4 receptoru (IL-4R) byla klonována z humánních mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) PCR amplifikaci. Použité primery byly:
• ·· · a· ·· • · · · « · · · · · · • 9 » 9 9 <9
5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC (sekv. id. č. 1) a
5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG (sekv. id. č. 2), které obsahovaly místa Smál a Xhol, v daném pořadí, pro inzerci do pdCs-muFc vektoru. PCR reakční podmínky použité pro toto a následující klonování jsou uvedené dále. Pro amplifikaci požadovaného genu(ů) byly použity Advantage KlenTaq a Polymeráz Mix (Clontech, Palo Alto, CA) a specifické primery. Reakční směsi obsahovaly lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01% želatinu (hmotnost/objem), 0,2mM každý z dNTP a 1,25 jednotky KlenTaq v celkovém objemu 100 μΐ. Bylo prováděno třicet PCR cyklů, každý cyklus se skládal z tepelné denaturace v 94 °C po dobu 1 minuty, nasedání primerů ve 42 °C po dobu 45 sekund a prodlužování primerů v 72 °C po dobu 1 minuty. Amplifikovaný produkt pak byl subklonován do SK vektoru (Stratagene, San Diego, CA) a jeho DNA sekvence ověřena standardním sekvencováním.
Ektodoména humánního membránového antigenu specifického pro prostatu (PSMA) byla klonována z buněčné linie LnCAP karcinomu prostaty (ATCC CRL1740) prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC (sekv. id. č. 3) a
5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG (sekv. id. č. 4), pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena a PCR fragment vložen do pdCs-muFc vektoru za vzniku pdCs-muFc-PSMA fúzního konstruktu.
Ektodoména humánního EpCAM (také známá jako KS antigen), povrchového proteinu epitelové buňky zvýšeně exprimovaného na většině karcinomových buněk, byla klonována z LnCAP buněk prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (sekv. id. č. 5) a
5' CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG (sekv. id. č. 6) pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena standardním sekvencováním a PCR fragment byl vložen do vektoru pdCs-muFc za vzniku fúzního konstruktu pdCsmuFc-EpCAM. Další vektor byl konstruován s použitím EpCAM ektodomény jako N-koncového fúzního partnera a v tomto případě PCR produkt obsahoval přirozenou vedoucí sekvenci z EpCAM cDNA a sekvenci zralé ektodomény na hranici membránou procházející domény (membránové domény). 3' konec tohoto PCR produktu obsahoval vložené AflII místo pro ligaci k 5' AflII místu myšího Fc fragmentu. Použité PCR primery zahrnovaly:
5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (sekv. id. č. 7) a
5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG (sekv. id. č. 8).
V tomto případě, myší Fc postrádal 3' inzerční místo pro zavedení fúzního proteinu, ale obsahoval translační terminační signál na konci sekvence kódující Fc.
Relativně konzervativní část úseku HIV gp41 v blízkosti membrány, rozprostírající se od Hind III místa k lysinovému zbytku přilehlému k membránovému úseku, byla exprimována jako Fc fúzní protein, jako příklad krátké polypeptidové antigenové sekvence. Ačkoliv byla použita proteinová sekvence z kmene HIV IIIB, kódující sekvence byla optimalizována pro optimální expresi v eukaryotických buňkách s použitím kodonů s vysokým obsahem GC. DNA sekvence kódující aminokyselinové zbytky 626 až 669, která měla následující sekvenci: C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTCGAG (sekv. id. č. 9) byla syntetizována chemicky a ligována do vektoru pdCs-muFc. Aminokyselinová sekvence fúzovaného polypeptidu byla: SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (sekv. id. č. 10) .
Další sekvence kódující HIV protein byly použity pro konstrukci Fc-antigenních fúzních proteinů, jak bylo popsáno dříve (patenty Spojených Států č. 5 541 087 a 5 726 044) s použitím spíše Fc myšího IgG2a než původního Fc humánního IgGl. Tyto konstrukty představují další provedení vynálezu.
Řada Fc-adjuvantních (cytokinových) fúzních proteinů obsahujících Fc myšího IgG2a a několik myších cytokinů byla konstruována stejným způsobem jako Fc-antigenní fúzní proteiny. Specifické cytokiny a klonovací primery jsou diskutovány níže.
Myší IL-2 byl klonován z myších mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (sekv. id. č. 11) a (antisense):
5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (sekv. id. č. 12).
Myší GMCSF byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC (sekv. id. č. 13) a (antisense):
5' CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC (sekv. id. č. 14).
Myší ligand Flt3 byl klonován z myšího thymu prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC (sekv. id. č. 15) a (antisense):
5' CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC (sekv. id. č. 16).
• · · · · «· • · · · · · * • φ φ · »
Myší IL-12 ρ35 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (sekv. id. č. 17) a (antisense):
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (sekv. id. č. 18).
Myší IL-12 p40 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' TCTAGACCÁTGTGTCCTCAGAAGCTAAC (sekv. id. č. 19) a (antisense):
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (sekv. id. č. 20).
Všechny PCR produkty, kromě myšího IL-12 p40, byly klonovány jako fragmenty Smal/Xhol, analyzovány standardním DNA sekvencováním a ligovány do vektoru pdCs-muFc obsahujícího jako svůj Fc úsek myší Fc IgG2a. PCR produkt myší IL-12 p40 byl exprimován odděleně (ne jako Fc fúzní protein) ve vektoru obsahujícím stejný CMV promotor enhancer, vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke zralé p40 podjednotce myšího IL-12 a gen rezistence na neomycin v místě selekčního markerového genu DHFR ve vektoru pdCs-muFc. Výsledný vektor byl nazván pNC-mp40, kde „N označuje gen pro selekci neomycinem.
Všechny plazmidové konstrukty indukovaly syntézu a sekreci specifických fúzních proteinů přechodnou expresí v buňkách 293 z lidské ledviny. Stručně, plazmidy byly zavedeny do monovrstvy buněk 293 z lidské ledviny prostřednictvím koprecipitace s fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N.Y.). Buňky byly ponechány přes noc (16 hodin), promyty PBS a živeny čerstvým tkáňovým kultivačním médiem (DMEM obsahující 10% fetální bovinní sérum (FBS)). Po dalších 2-3 dnech bylo kultivační médium testováno na sekretované
fúzní proteiny Fc specifickým testem ELISA (Gillies et al. (1989) J. IMMUNOL. METHODS 125: 191) s použitím protilátek specifických pro myší IgG-Fc protein. V případě myšího FC-IL12 byly obě Fc-p35 a p40 DNA expresních plazmidu přechodně exprimovány ve stejné buněčné kultuře, takže heterodimerní cytokinový fúzní protein byl sestaven před sekrecí buňkou (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195).
Potom byly vytvořeny trvale transfekované buňky exprimující různé Fc fúzní proteiny vnesením linearizované DNA do myších myelomových buněk NS/0 standardní technikou elektroporace. Stručně, buňky byly suspendovány v kyvetě přístroje Gene Pulser (BioRad) v koncentraci 107 buněk/ml a 0,5 ml suspenze bylo smícháno s 10 gg DNA a směs byla chlazena na ledu po dobu 10 minut. Elektroporace byla prováděna s použitím přístroje Gene Pulser (BioRad) s nastavením 0,25 V a 500 gF. Buňky byly ponechány zotavit se na ledu po dobu 10 minut, pak byly resuspendovány v růstovém médiu a přeneseny na 96 jamkové destičky. Buňky byly živeny každé 2-3 dny selekčním médiem obsahujícím 0,lM metotrexát počínaje 2 dny po elektroporaci. Rezistentní kolonie rostoucí na 96 jamkových destičkách byly testovány na expresi testem ELISA podle protokolu pro Fc.
Pro expresi myšího Fc-IL12 fúzní proteinu byla transfekovaná buněčná linie NS/0 již exprimující p40 podjednotku myšího IL-12 transfekována, jak bylo popsáno výše, expresním vektorem s myší Fc-p35 podjednotkou. Linie exprimující p40 byla získána elektroporaci buněk NS/0 vektorem pNC-mp40, popsaným výše, a selekcí v médiu obsahujícím neomycinový analog 6418 (Life Sciences Technologies). Po druhé transfekci byl prováděn screening přežívajících buněčných klonů testem Fc ELISA a testem ELISA pro myší IL-12 (Genzyme, Cambridge, MA).
*· «· » · ·
Strukturní integrita výsledných fúzních proteinů byla testována elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDSPAGE) . Nejprve byly fúzní proteiny navázány k malému objemu (10-20 μΐ na ml média) proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, MA) . Navázaná látka byla promytá PBS obsahujícím Tween-20 (0,01%), pak eluována v gelovém pufru obsahujícím SDS a pak 2 minuty povařena v přítomnosti 5% 2-merkaptoethanolu. Redukované proteiny pak byly analyzovány na SDS-PAGE gelech (předem nalitých) a obarveny modří Coomassie. Purifikace ve velkém měřítku ze stabilních buněčných klonů byly prováděny s použitím kolon protein A Sepharose (Repligen, Needham, MA) podle instrukcí výrobce.
Příklad 2
Imunogenicita Fc-antigenu a účinek chemického nebo Fc-cytokinového adjuvans na produkci protilátek
Konstrukt myší Fc-huIL-4R alfa podjednotky připravený v příkladu 1 byl použit jako antigen pro testování potenciálního účinku těchto proteinů na cílení APC ve zvířecím modelu. Ektodoména IL-4R alfa podjednotky představuje dost konzervativní molekulu mezi živočišnými druhy, která má více než z 50 % identické sekvence mezi člověkem a myší.
Skupinám myší byla podána injekce 50 μρ Fc-antigenního fúzního proteinu (FC-IL-4R) subkutánně buď v PBS nebo emulgovaného ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Některé skupiny také dostaly dávku 5 μρ (smícháno s Fc-IL-4R) Fc-adjuvantního proteinu, a to buď Fc-IL2 nebo Fc-GMCSF. Dva týdny později byla myším podána injekce stejné směsi, ale byla »« • 4 • · • « • · · · 4 4 * • 99 9999 999 9999 »4 9999 podána do peritoneální dutiny. CFA formulace tvoří micely, které slouží jako zdroj pomalu uvolňovaného antigenu, který umožňuje kontinuální stimulaci imunitního systému. Mycobakteriální proteiny v CFA také indukují silnou zánětlivou reakci stimulací cytokinů, a tím dále zesilují imunitní reakci. CFA ale vyvolává vážné vedlejší účinky včetně poškození kůže, čímž je u lidí nepoužitelné. Ukazuje se ale, že směsi s Fc-adjuvantními fúzními proteiny v PBS, nevyvolávají žádnou viditelnou kožní reakci či jakoukoliv jinou zjevnou známku toxicity u zvířete.
Dva týdny po zesilovací injekci (tj. 28 dnů po první injekce) byla zvířatům odebrána krev a byla připravena séra tak, že se plná krev nechala srazit v mikrozkumavkách, buňky a sraženina se stočily při vysoké rychlosti 12 000 RPM po dobu 5 minut a byl získán supernatant. Výsledná séra byla naředěna testovacím pufrem (PBS obsahující 0,01% Tween-20) a testována na protilátky reaktivní s humánním IL-4R. Byla prováděna antigen-specifická ELISA s použitím 96 jamkových destiček potažených humánním Fc-huIL-4R (100 μΐ o koncentraci 5 gg/ml v PBS bylo přidáno do každé jamky a inkubováno ve 4°C přes noc). Antigenem potažené destičky pak byly promyty a blokovány blokujícím pufrem (1% BSA, 0,01% Tween-20 v PBS) před použitím. Naředěná testovaná séra byla inkubována v jamkách po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, a pak byly jamky osmkrát promyty testovacím pufrem. Byla přidána sekundární proti-myší Fc-specifická protilátka konjugované s křenovou peroxidázou (ředění 1:2000, Jackson ImmunoResearch) a destičky byly inkubovány další hodinu. Po osmi dalších promytích testovacím pufrem byl přidán roztok o-fenylendiamindihydrochloridu (OPD) obsahující 25mM kyselinu citrónovou, 50mM NaHPO4, pH 5 a 0,03% čerstvě přidaný H2O2. Reakce byla zastavena přibližně po 30 minutách přidáním 100 μΐ 4N H2SO4. Výsledné destičky byly
• ♦
odečítány ve 490 nm na přístroji pro odečítání destiček, který automaticky subtrahoval pozadí odečítané v 650 nm. Výsledky byly vyneseny do grafu jako optická denzita versus ředění antiséra. Relativní protilátkové titry byly určovány množstvím ředění séra, které bylo zapotřebí k tomu, aby se optická denzita snížila pod arbitrární hodnotu, například 1 jednotku O.D.
Výsledky imunizačních protokolů jsou ukázány na obrázku 3. Injekce myšího Fc-IL-4R fúzního proteinu samotného v PBS podle tohoto protokolu indukovala protilátkovou reakci pouze u jedné myši (obrázek 3B) . Přidání CFA ale mělo za následek více reagujících myší, ale titry byly zhruba stejné jako u reagujících myší, kterým byla podána injekce Fc-IL4R fúzního proteinu samotného v PBS (obrázek 3C). Společné podávání myšího Fc-IL2 adjuvans s FC-IL4R v PBS indukovalo reakci u všech zvířat, ale množství vytvořené protilátky se v jednotlivých případech měnilo (obrázek 3D) . Kombinace CFA a myšího Fc-IL2 adjuvans společně (obrázek 3A) mělo za následek vyšší protilátkové titry než každá sloučenina samotná (obrázky 3C a 3D) . Společné podávání myšího Fc-GMCSF adjuvans v PBS indukovalo nej silnější imunitní reakci ze všech skupin (obrázek 3E), včetně skupiny, která byla imunizována kombinací obou Fc-GMCSF adjuvans a CFA (obrázek 3F). Jinak řečeno, myší Fc-GMCSF adjuvans v PBS, když bylo podáváno společně s myším FC-IL4R antigenem, odstranilo potřebu použití CFA. Předpokládá se, že takový způsob by být vhodnější pro použití u člověka.
»0 «·
4
4
4
4
4 4 4
Účinek Fc-GMCSF adjuvantní dávky na protilátku vytvářenou proti karcinomovému antigenu, PSMA, v Fc-PSMA fúzním proteinu
Příklad 3
PSMA v současné době představuje lákavý cílový antigen asociovaný s humánními nádory díky své omezené distribuci v normální tkáni. PMSA je v současnosti testován v klinických zkouškách jako uvažovaná nádorová vakcína. V tomto příkladě byla hodnocena imunogenicita PMSA antigene v Fc-PMSA fúzním proteinu.
Myší Fc-PSMA fúzní protein byl připraven tak, jak bylo projednáno v příkladu 1. Skupinám myší byla podána subkutánně injekce 50 μg myšího Fc-PSMA v PBS, spolu s měnící se koncentrací Fc-adjuvantního fúzního proteinu Fc-GMCSF, a pak jim byla intraperitoneálně podána zesilovací injekce 14 dnů později. Protilátkové titry byly měřeny testem ELISA zachytávajícím Fc-PSMA antigen, jak bylo popsáno v příkladu 2 pro Fc-IL4R fúzní protein. Výsledky byly vyneseny do grafu na obrázku 4 jako protilátkový titr (ředění, ve kterém OD byla snížena k 1) versus čas po první injekci.
V nepřítomnosti Fc-GMCSF měly myši protilátkové titry proti PSMA v rozmezí od 1000 do přibližně 20 000 (obrázek 4A). Společné podávání tak malého množství, jako 0,05 gg Fc-GMCSF ale mělo za následek titry v rozmezí od 30 000 do 140 000 (obrázek 4B) . Desetinásobné zvýšení Fc-GMCSF dále stimulovalo protilátkové titry proti tomuto karcinomovému antigenu (obrázky 4C a 4D). Nejvyšší podaná dávka (5 gg Fc-GMCSF fúzního proteinu na myš) ještě stále představuje přibližně 2 gg GMCSF na injekci - dávka bez zjevného účinku na myší kůži nebo bez
ttH jakýchkoliv systémových příznaků, že bylo zvíře imunizováno (viz obrázek 4D) . Kromě toho na rozdíl od CFA nebylo znatelné zvětšení sleziny.
Příklad 4
Účinek Fc-zprostředkovaného dování PSMA na protilátkovou reakci na imunizaci
Specifické účinky Fc složky Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů byly testovány srovnáním indukované imunitní reakce u myší, kterým byla podána injekce fúzních proteinů, nefúzovaného antigenu nebo adjuvantních proteinů nebo směsi předchozích. Pro tento účel byl použit humánní PSMA systém.
Nefúzovaný PSMA byl připraven proteolytickým štěpením humánního Fc-PSMA fúzního proteinu (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11: 495-500) plazminem podle instrukcí výrobce. Uvolňovaný Fc a neštěpený Fc-PSMA byly odstraněny adsorpcí k proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, MA).
Skupinám myší (n=3) byla podána injekce jedné subkutánní dávky 50 pg PSMA buď samotného (obrázek 5A) nebo v kombinaci s 0,2 pg volného GMCSF (obrázek 5B) nebo s 0,5 pg Fc-GMCSF (obrázek 5C) (0,5 pg Fc-GMCSF obsahuje přibližně 0,2 pg GMCSF).
V dalším souboru myší byla každé myši podána injekce jedné subkutánní dávky 50 pg myšího Fc-PSMA fúzního proteinu
samotného (obrázek 5D) nebo spolu s 0,2 pg volného GMCSF
(obrázek 5E) nebo s 0,5 pg Fc-GMCSF (obrázek 5F). Všechny
injekční formulace byly v PBS bez chemického adjuvans.
·· ·«»·
Protilátky reaktivní s myším Fc-PSMA byly měřeny 14. Den po imunizaci.
Důležitost Fc složky Fc-antigenního fúzního proteinu ve Fc-PSMA fúzním proteinu pro imunogenicitu PSMA byla nápadná, když zvířatům byla podána injekce PBS formulací bez chemických adjuvancií. V podstatě nebyla primární imunitní reakce na PSMA podávaný v PBS (obrázek 5A) . Přidání GMCSF nebo Fc-GMCSF k imunizaci mělo velmi malý účinek (obrázky 5B a 5C) , kromě slabé reakce u jednoho zvířete (obrázek 5B). Na rozdíl od toho zvířata, kterým byla podána injekce Fc-PSMA samotného vykazovala silnou primární imunitní reakci ve všech případech (obrázek SD). Přidání volného GMCSF k Fc-PMSA slabě zesilovalo účinek (obrázek 5E) , ale společné podávání obou antigenu a cytokinů jako Fc fúzních proteinů poskytlo nejvyšší stupeň reakce (obrázek 5F).
Tyto výsledky ukazují, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans je obzvláště užitečná při vytváření imunitní reakce a prokazují zjevný prospěch společné lokalizace antigenu a stimulačního cytokinů in vivo, pravděpodobně k APC.
Příklad 5
Srovnání adjuvantních účinků fúzních proteinů Fc-GMCSF nebo Fc-Flt3L
Bylo ukázáno, že ligand pro Flt3, v oboru také nazývaný ligand Flt3 (Flt3L), má rozhodující úlohu při vytváření a maturaci dendritických buněk (Soligo et al. (1998) BR. J. HAEMATOL. 101: 352-63). Předpokládá se, že dendritické buňky, spolu s tkáňovými makrofágy, jsou nejdůležitější APC. Studie tt* • · · • · • · • · ·· ·
tt tttt tt tttt
tttt tt · tttt · tt
• • • ·
• • · • ·
• • tt ·
tttttt tttttttt
•tt • tttt na myších prokázaly, že denní injekce po dobu 10 dnů zvyšují počet a APC aktivitu dendritických buněk navratitelných z lymfatické tkáně a sleziny a že tyto buňky jsou neobyčejně účinné při prezentaci antigenu oběma CD4 + a CD8 + T lymfocytům. Předpokládá se, že Langerhansovy buňky kůže představují jeden typ dendritických buněk schopných prezentace antigenu po vychytání a migraci do lokálních lymfatických uzlin. Protože se předpokládá, že většina dendritických buněk neexprimuje uspořádání Fc receptorů typicky zjišťované na makrofágu (např. FcyRI) , nemůže být předpovězeno, zda by společný lokalizující účinek Fc fúzních proteinů zapojil tuto linii APC.
Aby se otestovalo, zda by Flt3L mohl působit jako adjuvans, skupinám myší byla podána injekce myšího Fc-PSMA a myšího Fc-Flt3L, spíše než použití myšího Fc-GMCSF fúzního proteinu (silný stimulátor makrofágů a granulocytů). V tomto případě bylo očekáváno, že jakýkoliv adjuvantní účinek bude zprostředkován aktivací a vychytáváním dendritických buněk, což bude mít nakonec za následek protilátkovou reakci na PMSA. Výsledky jsou shrnuty na obrázku 6.
Tato studie ukazuje, že myší Fc-Flt3L je silné adjuvans, které stimuluje anti-PSMA protilátky právě tak jako, jestli ne lépe, stejná dávka Fc-GMCSF. Výsledky podporují pozorování, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans může být obzvláště účinná při indukci imunitní reakce. Výsledky také ukazují, že dendritické APC zjevně mohou být cíleny Fc-antigenem a Fc-cytokinem, a také makrofágem APC, což svědčí pro to, že na těchto buňkách je přítomná alespoň jedna forma Fc receptorů.
Příklad 6
Imunitní reakce na Fc-EpCAM a EpCAM-Fc fúzní proteiny
Další potenciálně důležitý humánní karcinomový antigen, EpCAM (také nazýván KSA a 17-1A antigen) byl produkován jako fúzní protein Fc úsekem myšího IgG2a s použitím plazmidů a metod, jak byly popsány v příkladu 1 a byl podáván buď samotný nebo v kombinaci s Fc-GMCSF jako adjuvans. Myším byla podána subkutánně injekce a po 3 týdnech zesilovací injekce 10 gg Fc-EpCAM a 1 gg Fc-GMCSF v PBS. Kontrolní myši nedostaly Fc-GMCSF. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 7 dnů (obrázek 7A) a 14 dnů (obrázek 7B) po zesilovací injekci. Výsledky ukazují, že Fc-EpCAM, když byl podáván samotný, je účinný imunogen (prázdné kosočtverce) a že Fc-GMCSF může dále zesílit reakci na tento antigen (plné trojúhelníčky).
Kromě toho byl EpCAM antigen exprimován v opačné orientaci vzhledem k Fc fragmentu jako EpCAM-muFc (viz příklad 1, obrázek IB) . Tato molekula byla použita k imunizaci Balb/c myší subkutánní injekcí. Byly použity vyšší dávky EpCAM-Fc fúzního proteinu (25 gg na dávku) a množství adjuvans (2,5 gg Fc-GMCSF) bylo zvýšeno také. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 14 dnů (obrázek 8A) a 21 dnů (obrázek 8B) po imunizaci. EpCAM-Fc fúzní protein samotný byl úplně imunogenní v nepřítomnosti Fc-GMCSF (obrázky 8A a 8B, (prázdné kosočtverce) ) . Přidání Fc-cytokinu zvýšilo protilátkové titry přibližně 3krát (obrázek 8A a 8B, (plné trojúhelníčky)).
Aby se otestovalo, zda by imunitní reakce proti EpCAM mohla chránit savce před nádorovými buňkami exprimujícími tento antigen, neimunizovaným myším nebo myším imunizovaným • ·· · ·· ·· • β · · · · · · » «· • · · · · ♦
EpCAM-Fc fúzním proteinem (a v některých případech Fc-cytokiny) byla podána injekce do ocasní žíly 105 buněk CT26 myšího karcinomu tračníku transfekovaných humánním EpCAM (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195). Po jedenadvaceti dnech byla zvířata utracena a rozsah plicních metastáz byl hodnocen (1) určováním stádia co se týče rozsahu na povrchu plic a (2) zvážením plic a srovnáním s normálními plícemi zvířete, aby se zjistil rozdíl hmotnosti, jejíž zvýšení bylo připisováno nádorové mase. Výsledky shrnuté v tabulce 1 ukazují, že všechny imunizované myši vykazovaly statisticky významnou redukci nádorových metastáz ve srovnání s kontrolními myšmi, včetně zvířat imunizovaných EpCAM-Fc fúzním proteinem samotným. Podobné výsledky byly dosaženy s použitím Fc-EpCAM fúzního proteinu jako antigenu.
Tabulka 1
Ošetřovaná skupina Skóre metastáz Průměrná hmotnost plic
Kontrolní skupina 4, 4, 4, 1, 1 412+/-130
EpCAM-Fc 0, 0, 0, 0, 0 210+/-21
EpCAM-Fc + Fc-GM 0, 0, 0, 0, 0 240+/-19
EpCAM-Fc + FC-IL2 0, 0, 0, 0, 0 230+/-19
Skóre metastáz bylo založeno na rozsahu postižení povrchu plic s použitím následujícího hodnocení: 1 = 1-25% rozsah, 2 = 26-50% rozsah, 3 = 51-75% rozsah a 4 = 76-100% rozsah.
Příklad 7
Kombinace antigen-Fc a cytokinových adjuvans v jednom fúzním proteinu
Protein popsaný v příkladu 6, EpCAM-Fc, slouží za vzor N-koncového antigenu, připojeného k Fc úseku imunoglobulínu jako karboxylová proteinová doména. Tento protein a další jemu podobné mohou být společně podávány s Fc-adjuvantními fúzními proteiny, např. Fc-cytokiny, k zesilování imunitní reakce na antigen. Alternativně mohou být antigen, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulínu a adjuvantní protein (například cytokin) tvořeny jako jeden fúzní protein, například jako EpCAM-Fc-GMCSF fúzní protein.
Expresní plazmid pro tento protein byl konstruován s použitím sekvencí myších IgG2a Fc a GM-CSF tak, že konstrukt mohl být hodnocen v myším modelu. Malý fragment Xbal až Smál obsahující sekvence kódující vedoucí sekvence-EpCAM-Fc byl získán z původního EpCAM-Fc expresního vektoru (příklad 1) a ligován do velkého fragmentu Smál až Xbal expresního vektoru Fc-GMCSF (obrázek 9).
Výsledný vektor, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF, byl zaveden do buněk 293 s použitím metody precipitace fosfátem vápenatým pro přechodnou expresi a do buněk NS/0 elektroporací pro trvalou expresi. Stabilní transfektanty byly vybrány pěstováním buněk v médiu obsahujícím metotrexát (0,1 μΜ). Exprimující klony byly identifikovány testem Fc ELISA (viz příklad 1) a klony s vysokým stupněm produkce byly množeny v kultuře. EpCAMFc-GMCSF protein byl purifikován z kondicionovaných médií vazbou na protein A Sepharose a následnou elucí (Repligen, Needham, MA) a strukturní integrita byla analyzována SDS-PAGE po redukci 2-merkaptoethanolem. Výsledky ukázaly, že protein měl molekulární hmotnost přibližně 90 kD, jak bylo očekáváno pro jednořetězcovou fúzi EpCAM, Fc a GMCSF.
Aby se porovnala relativní imunogenicita kombinovaného fúzního proteinu, myším byla podána subkutánně injekce ekvivalentních dávek EpCAM-Fc-GMCSF a jednotlivých fúzních proteinů v kombinaci: EpCAM-Fc a Fc-GMCSF. Stejné injekce byly podávány 14 dnů později a vzorky séra byly testovány na specifickou protilátkovou reaktivitu na humánní EpCAM 7 dnů po zesilovací injekci. Stejný přístup může být použit pro jiný antigenní protein nebo peptid, a také pro jiné stimulační cytokiny, jako je například IL-2, IL-12 a Flt3L.
Příklad 8
Imunizace Fc-antigenem injekcí DNA
Stejné expresní vektory použité pro transfekci a produkci myších Fc-EpCAM a EpCAM-Fc v savčích buňkách (viz příklad 1) byly injikovány jako „nahá plazmidová DNA do svalu zadní končetiny skupiny myší Balb/c. DNA byla injikována v koncentraci 0,5 mg/ml a celkové množství 100 ng bylo podáváno buď v PBS nebo roztoku 25% (hmotnost/objem) sacharózy. Injekce byly opakovány každé 3 týdny do celkového množství 3 injekcí. Protilátkové reakce byly měřeny v různou dobu a byly kvantifikovány testem ELISA s použitím 96 jamkových destiček potažených humánním Fc-EpCAM pro navázání antigenu a s použitím proti-myší Fc specifické polyklonální protilátky konjugované s HRP (Jackson ImmunoResearch) pro detekci. Data předložená na obrázku 10 představují protilátkové titry zaznamenávané 14 dnů (obrázek 10A), 27 dnů (obrázek 10B) , 55 ··· · «· *w ·« •» · · »· · · ř · · • · · · · · ··· »·· ···· ·· ···· dnů (obrázek 10C) a 69 dnů (obrázek 10D) po injekci.
Výsledky předložené na obrázku 10 ukazují, že nízké titry specifické anti-EpCAM protilátky byly indukovány v průběhu prvního měsíce při použití obou formulací (obrázky 10A a 10B) . Mnohem vyšší titry byly získány 55. den (obrázek 10C) a ještě vyšší hladin 69. den (obrázek 10D). Podobné výsledky byly získány s použitím DNA injekce vektoru exprimuj ícího Ep.CAM-Fc, ačkoliv titry byly nižší. Tato data ukazují, že antigen exprimovaný jako fúzní molekula obsahující antigenní protein a Fc úsek imunoglobulinu může indukovat imunitní reakci, když je zaveden injekcí nahé DNA a že perzistentní expozice antigenú vede k oddáleným reakcím u většiny zvířat.
Buněčné imunitní reakce byly testovány pěstováním splenocytů z myší očkovaných DNA nebo imunizovaných proteinem (70 dnů po injekci) stimulovaných odlišnými koncentracemi Fc-EpCAM proteinu in vitro. Data ukázaná na obrázku 11 (horní panel) ukazují proliferativní reakci (měřenou inkorporací 3Hthymidinu) na antigen u zvířat imunizovaných buď Fc-EpCAM proteinem (křížky) nebo DNA vakcinací expresním vektorem CMVpromotor-EpCAM-Fc (prázdné kroužky) nebo expresním vektorem CMVpromotor-Fc-EpCAM (plné kosočtverce) . Proteinem imunizovaná zvířata vykazovaly mnohem větší reakce na antigen, dokonce i při velmi nízkých dávkách. Reakce u DNA vakcinovaných zvířat (také ukázány v odlišném měřítku na dolním panelu na obrázku 11) byly závislé na dávce, ale byly menší než u myší, kterým byla podána injekce proteinu. Tyto reakce byly charakteristické pro reakce CD4 + T lymfocytů omezených MHC II. třídy.
Aby se otestovala cytotoxická aktivita (obecný ukazatel reakcí T lymfocytů omezených MHC I. třídy), kultury splenocytů z myší imunizovaných DNA nebo proteinem byly pěstovány po dobu dnů v přítomnosti přibližně 10 U/ml IL-2. Efektorové buňky byly pěstované splenocyty a cílové buňky byly buď značené buňky CT26 exprimující EpCAM humánního karcinomu tračníku (syngenní pro myši Balb/c) nebo značené parentální buňky (netransfekované buňky CT26). Efektorové a cílové buňky byly smíchány v odlišných poměrech a byl určován rozsah lýzy. Hodnoty 100 % lýzy bylo dosaženo inkubací značených cílových buněk v přítomnosti detergentu a bylo měřeno množství uvolňované značky.
Výsledky jsou ukázány na obrázku 12, kde obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti buňkám CT26 exprimujícím humánní EpCAM, zatímco obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parentálním buňkám CT26. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí EpCAM konstrukt, prázdné čtverce představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí Fc-EpCAM fúzní konstrukt, prázdné trojúhelníky představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí EpCAM-Fc fúzní konstrukt a křížky představují splenocyty izolované z myší imunizovaných Fc-EpCAM fúzními proteiny.
Obrázek 12 ukazuje, že ačkoliv DNA vakcinace vyvolala slabé cytotoxické reakce proti oběma cílovým buňkám, významně vyšší cytotoxicita byla pozorována u myší imunizovaných proteinem. Oba druhy buněk, parentální nádorové buňky CT26 a nádorové buňky CT26 exprimující EpCAM, byly v testu usmrceny. Cytotoxicita pozorovaná proti parentálním buňkám CT26 může být proto, že tyto buňky exprimují vysoké hladiny myšího homologu EpCAM, který je přibližně z 81 % identický s humánním proteinem na aminokyselinové úrovni. Nicméně imunizace proteinem Fc-EpCAM nevyvolala významnou cytotoxickou aktivitu proti nádorovým buňkám CT26 exprimujícím humánní EpCAM, čímž se vysvětluje účinná protektivní aktivita proti nádorům •0 · · · • · A 0 · ♦ »
0 · · 0 · • · f · · 0 ♦
I· · 0 0 ·
0 0 · k « · 0 · · · 0· 0000 popsaná v příkladu 6.
Příklad 9
Imunizace Fc-fúzním proteinem karcinomového antigenního proteinu obsahuj ícím podoblast
Ačkoliv některé celé proteiny nemusí být použitelné jako antigeny pro imunitní terapii, menší podoblasti proteinů mohou být daleko účinnější. Například proteiny obsahují domény, které jsou post-translacně modifikovány, aby byly učiněny méně imunogenní, a tím se sníží imunitní reaktivita na aktuální polypeptidové složky. Velké proteiny mohou indukovat protilátky, které reagují pouze s nepolypeptidovými částmi antigenu a které nezprostředkují buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), potenciálně důležitou složku protinádorové imunitní reakce. Jako dobrý příklad této situace lze uvést proteoglykanový antigen chondroitinsulfát (MCSP) specifický pro humánní melanom, který je exprimován fakticky na všech melanomech, a také u několika typů karcinomu mozku. Tento protein je hodně glykosylovaný a je dále modifikován připojením několika řetězců glykosaminoglykanu. Protilátka známá jako 9.2.27 (Bumol et al. (1982) PROČ. NATL. ACAD. SCI. 79: 1245-1249) váže tento protein s vysokou afinitou, ale nezprostředkovává žádnou efektorovou funkci, ani ADCC nebo cytotoxicitu zprostředkovanou komplementem (CDC).
částečně humanizované (chimérické) formy této neuspěly při zprostředkování této aktivity.
Aby se vyvolaly více zaměřené reakce na optimální cílové úseky této velké molekuly, byla v proteinové sekvenci identifikována předpokládaná místa připojení glykanu. (Pluske
Dokonce i protilátky
• v ·· * » · a ♦ » ΰ» · · ·>
et al (1996) PROČ. NATL. ACAD. SCI. USA 93: 9710-9715). Byla vybrána podoblast nedaleko od membránové sekvence a v určité vzdálenosti od místa připojení glykanu.
Peptidová sekvence: QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVV RVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD (sekv. id. č. 21) byla reverzně translatována, výsledná DNA sekvence byla syntetizována chemicky a ligována do expresního vektoru pdCsFc-X s použitím stejných restrikčních míst použitých v dřívějších příkladech. Místo terminace translace bylo přidáno na 3' konec, hned za sekvenci kódující poslední aminokyselinu, pak následovalo unikátní místo Xhol. Konečný expresní plazmid byl elektroporací zaveden do myelomových buněk NS/0 a stabilní transfektanty exprimující požadovaný protein byly získány tak, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Protein Fc-MCSP byl purifikován z tkáňových supernatantu s použitím chromatografie s proteinem A Sepharose (Repligen, Needham, MA) . Protilátkové titry byly měřeny u myší Balb/c subkutánně imunizovaných 50 μς Fc-MCSP fúzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 μς Fc-GMCSF jako adjuvans. Výsledky jsou ukázány na obrázku 13. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a Fc-GMCSF adjuvans.
Specifické imunitní reakce na tuto podoblast MCSP byly detekovány 14. den a významně se zvýšily po imunizaci zesilovací injekcí. Výsledky ukazují, že myši imunizované oběma Fc-GMCSF a Fc-MCSP stimulovaly vyšší protilátkové titry proti MCSP (plné trojúhelníky) než myši imunizované Fc-MCSP samotným (prázdné čtverce).
• ·
Příklad 10
Imunizace Fc-fúzním proteinem obsahujícím virový antigen
Vývoj účinné vakcíny proti viru humánního imunodeficitu (HIV), viru, který způsobuje AIDS, je jeden z nejdůležitějších cílů ve výzkumu vakcín. Nedávno několik publikací ukázalo, že určité vlastnosti virového obalu slouží k oklamání imunitní reakce, aby odpovídala na irelevantní epitopy, a tím se maskují důležité a potenciálně neutralizační úseky virové částice. To zahrnuje přítomnost vysoce imunodominantních antigenních úseků, které slouží jako návnady, a extenzivní glykosylaci, která fyzicky maskuje a redukuje imunogenicitu důležitých epitopů (Wyatt et al. (1998) NÁTUŘE 393: 705-11).
Jeden možný způsob, jak obejít mechanismus návnady, je exprimovat malé úseky gen virového obalu, aby se zabránilo imunodominantním reakcím, které nejsou protektivní a indukovala se neutralizační reakce. Jeden problém při použití vakcín s malými podjednotkami je snížená imunogenicita buď umělého peptidu nebo malého proteinu. Jeden přístup byl kondenzovat proteiny nebo peptidy k imunogenním nosičským proteinům, jako je například hemokyanin přílipky (KLH). To indukovalo silnou reakci na KLH, a také na protein nebo peptid. Dalším přístupem je vyrobit fúzní protein s Fc, jak bylo popsáno v příkladu 1 pro podoblast, například ektodoménu gp41 (kotvící doména virového obalu, gpl60). Na rozdíl od jiných nosičů je na úsek imunoglobulinu nahlíženo jako na vlastní („šelf) antigen, čímž se minimalizuje jakýkoliv imunodominantní účinek.
Fc-gp41pep626 fúzní konstrukt obsahoval polypeptid o 44
aminokyselinách fúzovaný ke karboxy-koncové části Fc úseku myšího imunoglobulinu. Sekvence HIV kmene IIIB v tomto úseku obsahuje signál pro N-vázanou glykosylaci, takže Fc-gp41pep626 fúzní protein, tvořený buď v buňkách 293 přechodnou expresí nebo v myelomových buňkách NS/0 trvalou transfekcí, vykazoval vysoký stupeň variace v mobilitě při analýze SDS-PAGE, což indikovalo heterogenitu v rozsahu glykosylace.
Navzdory faktu, že tento virový antigen byl docela malý (dlouhý 44 aminokyselinových zbytků) a byl heterogenně glykosylován, bylo možné vyvolat imunitní reakci u myší Balb/c (viz obrázek 14). V tomto případě byla skupinám pěti myší podána intradermální injekce s 25 gg Fc-gp41pep626 1. den a injekce s dvojnásobným množstvím ve dvoutýdenních intervalech, buď samotného (prázdné kosočtverce) nebo v kombinaci s 2,5 gg Fc-adjuvantních fúzních proteinů, Fc-GMCSF (prázdné čtverce) nebo Fc-IL2 (plné trojúhelníky). Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí.
Imunitní reakce byly více závislé na společném podávání Fc-cytokinů a trvalo déle dosáhnout vysoký titr. Předpokládá se, že větší imunitní reakce může být vyvolána s použitím modifikací této sekvence, která neobsahuje glykosylační signál (ve skutečnosti mnoho kmenů toto místo nekóduje) nebo enzymatickým odstraněním sacharidových vedlejších řetězců in vitro.
Adjuvantní aktivita Fc-fúzního proteinu obsahujícího extracelulární doménu molekuly buněčného povrchu
Příklad 11
Pro konstrukci Fc-adjuvantních fúzních proteinů je někdy užitečné fúzovat k Fc extracelulární doménu proteinu, který může být vázán na membránu. Například je fúzován CD4 0 ligand (CD40L) v N-koncové části C-koncové části k Fc. Volitelně je použit linker.
CD40L je použitelný, protože jeho receptor, CD40, je exprimován na povrchu B lymfocytů a je zapojen do stimulace B lymfocytů lymfocyty T. Jako faktor nekrotizující nádory, je CD40L trimer, který způsobuje dimerizaci nebo trimerizaci svého receptorů na buněčném povrchu. Výsledkem je, že jsou domény intracelulárního receptorů přivedeny do kontaktu a z tohoto plyne signální transdukce. Také jako TNF, CD40L může být vázaný na membráně, ale může být také z buněčného povrchu odštěpen a působit jako cytokin.
Fc-CD40L fúzní protein je zvířatům podáván společně s Fc-antigenním fúzním proteinem. V kontrolních experimentech jsou Fc-CD40L protein a Fc-antigenní protein podávány odlišným skupinám zvířat. Předpokládá se, že zvířata, kterým byla podána injekce obou fúzních proteinů, tvoří vyšší titr protilátek než zvířata, kterým byla podána injekce každého fúzního proteinu jednotlivě.
Alternativně byl použit jeden Fc fúzní protein obsahující oba antigeny a CD40L skupinu, s volitelnými linkery (L) mezi
Fc, CD40L a antigenovými skupinami. Fúzní protein může mít řádění od N-konce k C-konci Fc-(L)-antigen-(L)-CD40L, FC-(L)CD40L-(L)-antigen, antigen-(L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)~
* · φ • 9 94 antigen-(L)-Fc, antigen-(L)-Fc-(L)-CD40L nebo CD40L-Fc-(L)antigen-(L). Fúzní protein obsahující Fc, antigen a CD40L je injikován zvířatům a pak jsou měřeny protilátkové titry. Předpokládá se, že protilátkové titry vyvolané injekcí fúzního proteinu s oběma CD40L a antigenem jsou vyšší než titry dosažené injekcí fúzních proteinů obsahující pouze Fc a antigen nebo Fc a CD40L.
Ve výše uvedeném podávání fúzních proteinů jsou zvířatům podávány injekce intravenózně, subkutánně nebo jiným vhodným způsobem podávání, časy mezi primárním a zesilovacím podáváním antigenů a/nebo adjuvancií a měřením protilátkových titrů jsou stejné, jak byly popsány v předešlých příkladech. Alternativně jsou použity standardní dávky a testovací režimy.
Ekvivalenty
Vynález může být prováděn v jiných specifických formách bez odchýlení se od vynálezecké myšlenky nebo jejích podstatných charakteristických vlastností. Předchozí provedení je tedy nutné považovat ve všech ohledech spíše za ilustrativní než za omezující vynález popsaný v tomto textu.
Rozsah vynálezu je tedy udán připojenými patentovými nároky včetně všech změny, které spadají do rozsahu patentových nároků ve smyslu ekvivalence.
Zahrnutí formou odkazu
Nauka všech patentových dokumentů a vědeckých publikací, na které se odkazuje výše, je v tomto textu výslovně zahrnuta formou odkazu.
Seznam sekvencí <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer IL-4R <400> 1 gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc 28 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer IL-4R <400> 2 eccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg 34 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: <400> 3 aagcttaaat cctccaatga age primer PSMA 23
<210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence
<220> <223> popis umělé sekvence: <400> 4 ctcgagttag gctacttcac tcaaag primer PSMA 26
<210> <211> <212> <213> 5 30 DNA umělá sekvence
<220> <223> popis umělé sekvence: primer EpCAM
» ·
Φ
<400> 5 ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> β ctcgagtcat tttagaccct gcattgag 28 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> 7 tctagagcag catggcgccc ccgc 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> 8 ccttaagcac cctgcattga gaattcag 28 <210> 9 <211> 148 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: DNA kódující aminokyselinové zbytky 626-669 HIV IIIB gp41 <400> 9 cccgggatcč ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60 gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120 ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag 145 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: fúzovaný polypeptid z vektoru pdC-muFC
<400> 10 Leu Ile Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys
Ser 1 Leu Ile gis Ser 5
10 15
Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
20 25 30
Trp Phe Asn Xle Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
35 40
<210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primery pro myší IL2 <400> 11 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL2 <400> 12 ccctcgagtt attgagggct tgttg <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší GMCSF <400> 13 cccgggaaaa gcacccgccc gctcaecc <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší GMCSF <400> 14 ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc ·· · · • · ♦· · <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší ligand Flt3 <400> 15 caagcttaca cctgactgtt acttcagc
<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence
<220> <223> popis umělé sekvence: primer <400> 16 ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc pro myší ligand Flt3
<210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> <223> popis umělé sekvence: primer pro myši IL-12p35
<400> 17 ccccgggtag ggtcattcca gtctetgg 28 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL-12p35 <400> 18 ctcgagtcag gcggagctca gatagc <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL12 p40 <400> 19 tctagaccat gtgtcctcag aagctaac
*· ·· Μ • · φ φ · • « ' · » • · φ φ · • φφφ • ΦΦΦ φφ φφφ* <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myši IL12 p40 <400> 20 ctcgagctag gatcggaccc tgcag 25 <210> 21 <211> 83 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: MSCP peptid
<400> 21 Gin Gly Ala Thr 1 Leu 5 Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu
10 15
Leu Ala Asn Arg 20 Thr Gly Ser Val Pro Arg 25 Phe Arg Leu Leu Glu Gly 30
Arg His Gly Arg 35 Val Val Arg Val 40 Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly 45
Gly Ser Gin Leu 50 Val Glu Gin Phe 55 Thr Gin Gin Asp Leu Glu Asp Gly 60
Arg Leu Gly Leu 65 Glu Val Gly Arg 70 Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro 75 80
Ala Gly Asp <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: oligodeoxynukleotid, který může být použit jako adjuvans <400> 22 tccatgacgt tcctgacgtt • ·· ·· · ·· ····
0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·
0 0 ···· · · · • ··· · · 0 ··· · · · · • · · · · · · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Claims (23)

1. Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi proti předem vybranému antigenu u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulínu připojený polypeptidovou vazbou k předem zvolenému antigenu a adjuvant zahrnující oligonukleotidovou CpG sekvenci.
2. Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi proti předem vybranému antigenu u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje
i) předem vybraný antigen nebo ii) fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulínu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu nebo iii) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený antigen nebo iv) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený fúzní protein zahrnující tento antigen a adjuvant zahrnující fúzní protein, který zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulínu připojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu nebo nukleovou kyselinu kódující tento fúzní protein.
3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kódující fúzní protein zahrnující antigen kóduje ve směru od 5’ ke 3’ poloze konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulínu a antigen.
4. Kompozice podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že fúzní protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant zahrnuje kloubovou oblast imunoglobulínu.
5. Kompozice podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že fúzní protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant zahrnuje doménu konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu zvolenou ze souboru sestávajícího z CH2 domény, CH3 domény a CH4 domény.
6. Kompozice podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu zahrnuje CH2 doménu a CH3 doménu.
7. Kompozice podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že předem vybraný antigen je zvolen ze souboru sestávajícího z membránového antigenu specifického vůči prostatě ektodomény receptorů cytokinů, virového proteinu a tumor-specifického proteinu.
8. Kompozice podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že fúzní protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant je připojen disulfidovou vazbou ke druhé konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu.
9. Kompozice podle některého z nároků 2 až 8, vyzná ěující se tím, že adjuvantním proteinem je cytokin.
10. Kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že 9 cytokinem je lidský cytokin.
11. Kompozice podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je definována aminokyselinovou sekvencí odpovídající aminokyselinové sekvenci definující konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.
• · ·· • · • · • · · · • · · · · · ·· · ·· · · · · fcfc · ····· · ····· · · • fcfc · fcfcfcfc ··· fcfc fcfc fcfc fcfc
12. Kompozice podle některého z nároků 2 až 11, vyznačující se tím, že sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein zahrnující antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant je operativně uspořádána v replikovatelném expresním vektoru.
13. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje první fúzní protein zahrnující antigenní protein s lokalizačním proteinem a druhý fúzní protein zahrnující adjuvantní protein a uvedený lokalizační protein, přičemž lokalizační protein vyvolává nárůst koncentrace prvního a druhého fúzního proteinu v oblasti savce, která je dosažitelná pro imunitní systém.
14. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein zahrnující antigenní protein, adjuvantní protein a lokalizační protein, přičemž lokalizační protein vyvolává nárůst koncentrace antigenního a adjuvantního proteinu v oblasti savce, která je dosažitelná pro imunitní systém.
15. Fúzní protein zahrnující antigenní protein, adjuvantní protein a lokalizační protein.
16. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein podle nároku 1 5.
17. Expresní vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 6.
18. Fúzní protein podle nároku 15 nebo sekvence nukleové kyseliny podle nároku 16 pro použití jako léčivo.
19. Kompozice podle některého z nároků 1 až 14 pro použití jako léčivo.
• 0 0 0 · · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · · 0 0 0 0 0
00·0· 00 00 00 00
20. Použití kompozice podle některého z nároků 1 až 14 nebo fúzního proteinu podle nároku 15 pro výrobu léčiva pro vyvolání imunitní odpovědi na antigen u savce.
21. Použití fúzního proteinu podle nároku 15 nebo sekvence nukleové kyseliny podle nároku 16 pro výrobu léčiva pro vyvolání imunitní odpovědi na antigen u savce.
22. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu podle některého z nároků 1, 4 až 8 a 11, a to v prvním zásobníku, a adjuvant zahrnující oligonukleotidovou CpG sekvenci v druhém zásobníku.
23. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje
i) předem vybraný antigen nebo ii) fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu nebo iii) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený antigen nebo iv) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený fúzní protein zahrnující tento antigen podle některého z nároků 2 až 8 a 11 až 12, a to v prvním zásobníku, a adjuvant zahrnující fúzní protein, který zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu podle některého z nároků 2, 4 až 6 a 8 až 10 nebo nukleovou kyselinu kódující tento fúzní protein.
CZ2002-182A 1999-07-21 2000-07-21 Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny CZ304884B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14496599P 1999-07-21 1999-07-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002182A3 true CZ2002182A3 (cs) 2003-11-12
CZ304884B6 CZ304884B6 (cs) 2015-01-07

Family

ID=22510982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002-182A CZ304884B6 (cs) 1999-07-21 2000-07-21 Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7955590B2 (cs)
EP (1) EP1198250B8 (cs)
JP (1) JP4764585B2 (cs)
KR (1) KR100689739B1 (cs)
CN (1) CN1308037C (cs)
AT (1) ATE374042T1 (cs)
AU (1) AU779388B2 (cs)
BR (1) BR0012569A (cs)
CA (1) CA2378866C (cs)
CZ (1) CZ304884B6 (cs)
DE (1) DE60036552T2 (cs)
DK (1) DK1198250T3 (cs)
ES (1) ES2292457T3 (cs)
HU (1) HUP0202796A2 (cs)
MX (1) MXPA02000746A (cs)
NO (1) NO20020255L (cs)
PL (1) PL201664B1 (cs)
PT (1) PT1198250E (cs)
RU (1) RU2248214C2 (cs)
SK (1) SK782002A3 (cs)
WO (1) WO2001007081A1 (cs)
ZA (1) ZA200200501B (cs)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
GB0102145D0 (en) 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
WO2002061389A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Tanox, Inc. Methods to generate and identify monoclonal antibodies to a large number of human antigens
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
IL158920A0 (en) * 2001-05-24 2004-05-12 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin fusion proteins
AU2002357784B2 (en) 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
CN1315536C (zh) * 2002-09-13 2007-05-16 李进 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
EP1696952A4 (en) * 2003-12-23 2007-11-07 Centocor Inc ANTIRETROVIRAL AGENTS, COMPOSITIONS, PROCESSES AND USES
BRPI0418286A (pt) * 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
AU2005203962C1 (en) 2004-01-05 2012-11-08 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
KR20070085886A (ko) * 2004-12-09 2007-08-27 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성의 ｉｌ-7 변이체
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US20070104689A1 (en) 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
JP2009511024A (ja) * 2005-10-13 2009-03-19 ヴィレックス メディカル コーポレイション 免疫応答を誘導するためのＣ型肝炎ウイルスポリペプチドおよびＦｃフラグメントを含むキメラ抗原
ES2382164T3 (es) 2005-12-30 2012-06-05 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anti-IL-6 que impiden la unión de la IL-6 en complejo con el IL-6R( ) a la GP130
JP2009521912A (ja) 2005-12-30 2009-06-11 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 低減された免疫原性を有する抗ｃｄ１９抗体
ATE555125T1 (de) * 2005-12-30 2012-05-15 Merck Patent Gmbh Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4342995A2 (en) * 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
AR068564A1 (es) 2007-09-26 2009-11-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti- receptor de il-6 (interleuquina 6)
MX2010003450A (es) * 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
MX337081B (es) * 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
KR102269708B1 (ko) 2008-04-11 2021-06-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
US8383767B2 (en) * 2008-06-27 2013-02-26 Academia Sinica Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
AU2010238858A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
JP5669732B2 (ja) 2009-05-15 2015-02-12 中外製薬株式会社 抗ａｘｌ抗体
EA017172B1 (ru) * 2009-08-04 2012-10-30 Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" Способ получения изоиммунной плазмы крови
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
GB0922209D0 (en) 2009-12-18 2010-02-03 Univ Nottingham Proteins, nucleic acid molecules and compositions
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
US9347951B2 (en) 2010-10-28 2016-05-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Fusion protein comprising the extracellular domain of a filovirus glycoprotein fused to an immunoglobulin heavy chain constant region
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
CN102212139A (zh) * 2011-03-29 2011-10-12 中国人民解放军第二军医大学 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
MY187936A (en) * 2013-03-15 2021-10-29 In3Bio Ltd Self-assembling synthetic proteins
CN103212069B (zh) * 2013-05-13 2014-07-30 上海赛伦生物技术有限公司 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用
WO2014200018A1 (ja) 2013-06-11 2014-12-18 独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
EP3017048A4 (en) * 2013-07-01 2017-05-17 University of Maryland, College Park Fc coupled compositions and methods of their use
ES2871418T3 (es) * 2013-08-28 2021-10-28 Abbvie Stemcentrx Llc Composiciones y métodos de conjugación de anticuerpos específicos de sitio
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
SI3482766T1 (sl) 2014-08-11 2020-09-30 Delinia, Inc. Spremenjene variante IL-2, ki selektivno aktivirajo regulatorne T celice za zdravljenje avtoimunskih bolezni
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TW201627318A (zh) * 2014-10-22 2016-08-01 臺北醫學大學 膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
WO2016179518A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
ES2888801T3 (es) 2015-05-19 2022-01-07 Nat Center Neurology & Psychiatry Método para determinar la aplicación de una terapia nueva en pacientes con esclerosis múltiple (EM)
EP3308800B1 (en) * 2015-06-10 2021-08-25 The University of Tokyo Adjuvant for vaccines, vaccine, and immunity induction method
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN106177932A (zh) * 2016-07-03 2016-12-07 查文娟 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CN110167957A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
EP3698808A4 (en) 2017-10-20 2021-07-14 Hyogo College Of Medicine MEDICAL COMPOSITION CONTAINING ANTI-IL-6 RECEPTOR ANTIBODIES FOR THE PREVENTION OF POSTOPERATIVE ADHESION
CA3086199A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
SG11202007702UA (en) * 2018-02-14 2020-09-29 Viela Bio Inc Antibodies to feline mcdonough sarcoma (fms)-like tyrosine kinase 3 receptor ligand (flt3l) and uses thereof for treating autoimmune and inflammatory diseases
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
CA3102798A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Kentucky Bioprocessing, Inc. Virus and antigen purification and conjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
JP7439372B2 (ja) * 2018-06-21 2024-02-28 シャタック ラボ，インコーポレイテッド ヘテロ二量体タンパク質及びその使用
EP3843755A4 (en) * 2018-08-29 2022-08-31 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-BASED CHIMERIC PROTEINS
JP2022502088A (ja) 2018-09-27 2022-01-11 エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド マスクされたサイトカインポリペプチド
JP2022503959A (ja) 2018-10-03 2022-01-12 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
US20220098262A1 (en) * 2018-12-13 2022-03-31 Bang DING ANTIBODY-TUMOR NECROSIS FACTOR alpha FUSION PROTEIN AND ITS PREPARATION AND APPLICATIONS
US20220177550A1 (en) * 2019-03-28 2022-06-09 Orionis Biosciences, Inc. Chimeric proteins and chimeric protein complexes directed to fms-like tyrosine kinase 3 (flt3)
US11512122B2 (en) 2019-05-17 2022-11-29 Xencor, Inc. IL-7-FC-fusion proteins
AU2020358979A1 (en) 2019-10-03 2022-04-21 Xencor, Inc. Targeted IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN114945586A (zh) * 2020-01-21 2022-08-26 张晋宇 一种药物组合物及其用途
US20230110839A1 (en) * 2020-02-28 2023-04-13 Celltrion Inc. Varicella zoster virus fusion protein and immunogenic composition comprising same
US20230151072A1 (en) * 2020-04-01 2023-05-18 Xilio Development, Inc. Masked il-2 cytokines and their cleavage products
JP2023523716A (ja) * 2020-04-21 2023-06-07 クビオ・ホールディングス・リミテッド ウイルス及び抗原のコンジュゲーションによって形成されるワクチン
CN113876938B (zh) * 2020-07-01 2024-04-19 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
AU2021410089A1 (en) * 2020-12-23 2023-08-10 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
JP2024508683A (ja) * 2021-03-04 2024-02-28 ヘリックス ナノテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｓｂｉアジュバントを含む組成物及びその使用方法
CN116375881A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 广州国家实验室 融合蛋白疫苗
WO2023178169A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Anemoi Biotech Holdings, Inc. Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection
WO2023224914A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating caveolinopathy diseases
CN114699521B (zh) * 2022-06-07 2023-02-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US650064A (en) * 1898-11-14 1900-05-22 Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company System of liquid distribution.
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ES2073394T3 (es) 1987-06-10 1995-08-16 Dana Farber Cancer Inst Inc Constructos de anticuerpos bifuncionales y su utilizacion para destruir selectivamente las poblaciones celulares.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
EP0305967B1 (de) 1987-09-02 1993-05-05 Ciba-Geigy Ag Konjugate von Interferon alpha mit Immunglobulinen
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
JP2755395B2 (ja) 1987-09-23 1998-05-20 ブリストル―マイアーズ スクイブ コムパニー Ｈｉｖ感染細胞に殺作用する抗体異種結合体
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
PT89121A (pt) 1987-12-04 1989-12-29 Du Pont Processo para a preparacao de interleuquina-2 imobilizada e interleuquina-2 contendo uma extensao no terminal-carboxilo com actividade de interleuquina-2 natural
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ATE123065T1 (de) 1989-07-07 1995-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren herstellung.
ATE121629T1 (de) * 1989-07-14 1995-05-15 Praxis Biolog Inc Stabile interleukine enthaltende impfstoffzusammensetzungen.
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DE69034247T2 (de) 1989-12-22 2008-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Zytotoxischer Lymphozyten-Reifefaktor 40kD Untereinheit und monoklonale Antikörper spezifisch dafür
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
JPH06505496A (ja) * 1991-03-11 1994-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 活性因子ｘ１１１の活性化を阻害するための組成物と方法
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
EP0636173B1 (en) 1991-05-31 1998-09-02 Genentech, Inc. Treatment of hiv-associated immune thrombocytopenic purpura
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
ATE173763T1 (de) 1991-08-30 1998-12-15 Hutchinson Fred Cancer Res Hybride cytokine
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
AU676150B2 (en) 1992-01-23 1997-03-06 Merck Patent Gmbh Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
ATE260971T1 (de) 1992-04-01 2004-03-15 Univ Rockefeller Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
ATE311895T1 (de) 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
EP0671926B1 (en) 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
ES2276390T3 (es) 1992-11-05 2007-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigeno de membrana especifico de la prostata.
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
WO1994024267A1 (en) 1993-04-20 1994-10-27 Robinson, William, S. Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
CN1125401A (zh) 1993-04-29 1996-06-26 艾博特公司 促红细胞生成素类似物组合物和方法
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
NZ285501A (en) 1994-04-26 1998-02-26 Childrens Medical Center Plasminogen analogs (angiostatin), endothelial inhibitors, assays and kits
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
EP0772619B2 (en) * 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
ES2167391T3 (es) 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
WO1996018412A1 (en) * 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AU712585B2 (en) 1995-03-10 1999-11-11 Genentech Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
EP0831873A4 (en) 1995-06-07 2002-07-17 Trimeris Inc COMBINATORY THERAPY FOR THE TREATMENT OF HIV AND OTHER VIRAL INFECTIONS
CZ416797A3 (cs) 1995-06-30 1998-06-17 Eli Lilly And Company Použití leptinu nebo leptonových mimetik pro výrobu léčiv pro léčení nebo prevenci diabetes mellitus a kompozice s jeho obsahem
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
ES2243995T3 (es) 1996-04-26 2005-12-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonistas de interleucina-15.
CA2205757C (en) 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
ES2176574T3 (es) 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6737057B1 (en) * 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
AU6954398A (en) 1997-04-11 1998-11-11 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
EP1001968B1 (en) 1997-06-13 2004-12-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
CA2312188C (en) 1997-12-08 2010-06-29 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
BR9909583A (pt) 1998-04-15 2002-01-15 Lexigen Pharm Corp Aumento da resposta imune mediado por uma proteìna de fusão anticorpo-citocina por co-administração com inibidor de angiogênese
CZ20003817A3 (cs) 1998-04-17 2002-08-14 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi
US6284536B1 (en) 1998-04-20 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobin molecules and methods for use thereof
AU751823B2 (en) 1998-05-14 2002-08-29 Merck Patent Gmbh Fused protein
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
AU761027B2 (en) 1998-08-25 2003-05-29 Merck Patent Gmbh Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusis
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000028065A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
BR0007414A (pt) 1999-01-07 2001-10-16 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc
KR100773109B1 (ko) 1999-05-06 2007-11-02 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
CZ20014123A3 (cs) 1999-05-19 2002-06-12 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Exprese a export interferonů-alfa jako Fc fúzních proteinů
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JP2003503426A (ja) 1999-07-02 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＦＶＩＩａアンタゴニスト
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6617135B1 (en) 1999-08-09 2003-09-09 Emd Lexigen Research Center Corp. Multiple cytokine protein complexes
AU784605B2 (en) * 1999-10-20 2006-05-11 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
AU2154401A (en) 1999-11-12 2001-05-30 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
ATE333900T1 (de) 2000-02-24 2006-08-15 Philogen Spa Zusamensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US20020019342A1 (en) 2000-05-12 2002-02-14 Robert Bayer In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
BR0112111A (pt) 2000-06-29 2003-05-06 Merck Patent Gmbh Realce de respostas imunes mediadas por proteìna de fusão de anticorpo-citocina por tratamento combinado com agentes de realce de captação de imunocitocina
US7138119B2 (en) 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
MXPA03006294A (es) 2001-01-18 2003-09-16 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion disfuncionales con actividad glucocerebrosidasa.
EP1366455B1 (en) 2001-02-19 2008-07-02 MERCK PATENT GmbH Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
MXPA03007323A (es) 2001-02-19 2003-12-12 Merck Patent Gmbh Proteinas artificiales con inmunogenicidad reducida.
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE10118308A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
CA2456470A1 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
AU2002357784B2 (en) 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
MXPA04008215A (es) 2002-02-27 2004-11-26 Immunex Corp Formulacion polipeptidica.
CN101143221A (zh) 2002-03-15 2008-03-19 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
JP4494977B2 (ja) 2002-12-17 2010-06-30 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｇｄ２に結合するマウス１４．１８抗体のヒト化抗体（ｈ１４．１８）およびそのｉｌ−２融合タンパク質
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050037947A1 (en) 2003-05-06 2005-02-17 Bitonti Alan J. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
ATE497783T1 (de) 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites

Also Published As

Publication number Publication date
NO20020255L (no) 2002-03-15
ATE374042T1 (de) 2007-10-15
DE60036552T2 (de) 2008-06-26
EP1198250B1 (en) 2007-09-26
CN1374871A (zh) 2002-10-16
DE60036552D1 (de) 2007-11-08
KR100689739B1 (ko) 2007-03-09
PL201664B1 (pl) 2009-04-30
EP1198250A1 (en) 2002-04-24
NO20020255D0 (no) 2002-01-17
US20100068175A1 (en) 2010-03-18
CZ304884B6 (cs) 2015-01-07
KR20020020794A (ko) 2002-03-15
CN1308037C (zh) 2007-04-04
US7955590B2 (en) 2011-06-07
JP2003505431A (ja) 2003-02-12
US20050261229A1 (en) 2005-11-24
ES2292457T3 (es) 2008-03-16
CA2378866C (en) 2011-06-07
SK782002A3 (en) 2003-08-05
MXPA02000746A (es) 2002-09-18
AU6358300A (en) 2001-02-13
CA2378866A1 (en) 2001-02-01
PL353344A1 (en) 2003-11-17
ZA200200501B (en) 2003-03-26
HUP0202796A2 (en) 2002-12-28
PT1198250E (pt) 2008-01-02
DK1198250T3 (da) 2007-12-27
BR0012569A (pt) 2002-05-28
WO2001007081A1 (en) 2001-02-01
EP1198250B8 (en) 2007-11-21
AU779388B2 (en) 2005-01-20
JP4764585B2 (ja) 2011-09-07
RU2248214C2 (ru) 2005-03-20
US8043608B2 (en) 2011-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2378866C (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AU2009326524B2 (en) Use of Flt3 ligand for strengthening immune responses in RNA immunization
KR100671036B1 (ko) 오스테오프로테게린 리간드 활성을 하향-조절하는 방법
US7118751B1 (en) DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40
US6749856B1 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US20120328640A1 (en) Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer
AU757310B2 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US7011833B1 (en) Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160721