CZ2002182A3 - Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi, její použití, kit, fúzní protein, nukleová kyselina a expresní vektor - Google Patents

Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi, její použití, kit, fúzní protein, nukleová kyselina a expresní vektor Download PDF

Info

Publication number
CZ2002182A3
CZ2002182A3 CZ2002182A CZ2002182A CZ2002182A3 CZ 2002182 A3 CZ2002182 A3 CZ 2002182A3 CZ 2002182 A CZ2002182 A CZ 2002182A CZ 2002182 A CZ2002182 A CZ 2002182A CZ 2002182 A3 CZ2002182 A3 CZ 2002182A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antigen
fusion protein
protein
adjuvant
heavy chain
Prior art date
Application number
CZ2002182A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304884B6 (cs
Inventor
Stephen D. Gillies
Kin Ming Lo
John S. Wesolowski Jr.
Original Assignee
Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharmaceuticals Corp. filed Critical Lexigen Pharmaceuticals Corp.
Publication of CZ2002182A3 publication Critical patent/CZ2002182A3/cs
Publication of CZ304884B6 publication Critical patent/CZ304884B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi, její použití, kit, fúzní protein, nukleová kyselina a expresní vektor
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobů a přípravků pro zesílení imunogenicity preselektovaného antigenního proteinu nebo peptidu u savce. Konkrétně se vynález týká způsobů a přípravků obsahujících kódující nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence definující fúzní proteiny obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen, přičemž preselektovaný antigen ve fúzním proteinu je schopen u savce vyvolat silnější imunitní reakci ve srovnání s preselektovaným antigenem samotným.
Dosavadní stav techniky
Vývoj vakcín je tradičně zaměřen na vytváření protektivních protilátek schopných neutralizovat infekční agens. Až doposud agens používaná jako vakcíny typicky obsahovala inaktivované nebo oslabené mikroorganizmy (například bakterie nebo viry), jejich produkty (například toxiny) nebo purifikované antigeny. S nástupem moderní molekulární biologie a metod klonování genů je možné vyrobit čistší a mnohem specifičtější vakcíny. Kromě toho znalost imunitního systému na molekulární úrovni umožnila izolaci a charakterizaci imunitních reakcí stimulovaných infekčními agens. Dvě složky imunitního systému, o kterých se předpokládá, že jsou ústřední pro úspěšnou tvorbu imunitních reakcí, zahrnují: hlavní úlohu regulačních a cytotoxických T lymfocytů a způsob, kterým je těmto buňkám prezentován antigen buňkami prezentujícími antigen (antigen presenting cell - APC) . (Viz například W. E. Paul, vyd. (1993) Fundamentals Of Immunology, Raven Press, Ltd., New York).
Typicky je antigenni protein nebo peptid přijatý z vnějšku APC (exogenní antigen) degradován v endocytárním vezikulu nebo endozomu APC, načež výsledné peptidové fragmenty tvoří komplex s proteiny hlavního histokompatibilního systému (MHC) II. třídy. Výsledný komplex se přesune na buněčný povrch, kde je vystaven imunitním buňkám obklopujícím APC. Peptidový fragment je přizpůsoben prostoru definovaném MHC molekulou a komplex může být rozpoznáván T lymfocytem exprimujícím receptor lymfocytů T, který má pro komplex vazebnou specificitu. Interakce mezi molekulou MHC II. třídy opatřenou peptidem a pomocným T lymfocytem, nazývaným v oboru T lymfocytem CD4, je dále stabilizována další interakcí mezi molekulou MHC II. třídy samotnou a CD4+ receptorem na povrchu T lymfocytů. Tedy exogenní antigen, který je zpracován v APC buňkách, je předložen na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC II. třídy. Komplex MHC II. třídy, když je prezentován CD4+ T lymfocytům, vede k tomu, že CD4+ pomocné lymfocyty sekretují cytokiny, které stimulují B lymfocyty k tvorbě protilátek proti peptidu. (viz Paul, výše).
Vakcinace exogenním antigenem má typicky za následek CD4 lymfocyty zprostředkovanou T lymfocytární reakci, která obecně končí produkcí protilátky. Cytotoxické T lymfocyty (CTL) nejsou touto dráhou typicky stimulovány. CTL jsou zjevně stimulovány v situacích, kdy antigen vzniká z vnitřku APC samotné (endogenní antigen), například prostřednictvím produkce virových proteinů v buňce infikované virem nebo proteinů specifických pro nádory v karcinomových buňkách. Ve skutečnosti se u mnoha virových onemocněni věři, že vytvořeni CTL je rozhodující pro eliminaci buněk infikovaných virem, a tedy zotavení z infekce.
Studie ukazují, že endogenní a exogenní antigeny jsou zpracovávány odlišně. Během syntézy vznikajících polypeptidů je část polypeptidů degradována intracelulární strukturou nazývanou proteozom. Fragmenty z tohoto procesu tvoří komplex s nově syntetizovanými molekulami MHC I. třídy spíše než MHC II. třídy, načež výsledné komplexy MHC I. třídy obsahující antigen jsou transportovány na buněčný povrch. Opět T lymfocyty se specificitou pro specifický peptidový fragment vážou T lymfocyty, ale v tomto případě nezbytná interakce koreceptorů nastává mezi molekulou MHC I. třídy a CD8 molekulou. V souladu s tím je endogenní antigen na povrchu APC prezentován CD8+ T lymfocytům. Ačkoliv existují některé typy CD8+ T lymfocytů, které nejsou cytotoxické, CD8+ T lymfocyty tvoří většinu CTL.
Proto se zdá, že návrh/konstrukce vakcíny schopné indukovat silnou CTL reakci vyžaduje, aby antigenní molekula (obecně protein) byla buď vytvořena uvnitř buňky nebo dopravena do vhodného buněčného kompartmentu, aby mohla vstoupit do dráhy MHC I. třídy. Jedna strategie je zavést gen kódující požadovaný protein nebo peptid do viru, a pak použít modifikovaný virus jako vakcínu (Lorenz et al. (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631). Další strategií je injikovat DNA vektor kódující protein do buňky, a pak podávat buňku zvířeti nebo pacientovi, kde je exprimována buňkou, a je pak předložena na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC I. třídy (Donnelly et al. (1997) ANNU. REV. IMMUNOL. 15:617). Bylo ukázáno, že jednodušší technika injikování DNA vektorů přímo do svalu nebo kůže indukuje CTL a/nebo protilátkovou reakci na několik antigenů (Lai et al. (1988) CRIT. REV. IMMUNOL. 18: 449-84 a patent Spojených Států č. 5 589 466). Studie ukázaly, že antigen je zabrán a zpracován APC, kde je prezentován imunitnímu systému (Lai et al., výše).
Aplikace exogenních peptidů nebo proteinů dráze MHC I. třídy byla částečně úspěšná díky použití chemických adjuvancií, jako je například Freundovo adjuvans a směsi skvalenů a detergentů (Hilgers et al. (1999) VACCINE, 17: 219228) a nověji díky použití malých perliček potažených antigenem, které jsou fagocytovány makrofágy a indukují CTL reakce prostřednictvím alternativní dráhy MHC I. třídy (De Bruijn et al. (1995) EUR. J. IMMUNOL. 25: 1274-1285). Kromě toho další metody pro zesílení imunitní reakce na antigen mohou obsahovat použití chemických adjuvancií v kombinaci s rekombinantními imunostimulačními cytokiny, například IL-2, IL-12, GM-CSF a dalšími. Například jeden způsob používá antihaptenovou protilátku fúzovanou k IL-2 jako způsob spojení tohoto cytokinu k antigennímu proteinu, který chemicky reagoval s haptenem (Harvill et al. (1996) J. IMMUNOL. 157:3165).
Další technika využívá protilátkovou „antigenizaci, pomocí níž je část variabilního úseku imunoglobulinu nahrazena antigenním peptidem. Antigenní peptid hybridní molekuly je prezentován APC, jakmile se rekombinantní protilátka váže na APC prostřednictvím interakce s Fc receptory na povrchu APC (Lama et al. (1993) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 90: 1168311687). Rozšíření tohoto přístupu používá splenickou injekci plazmidové DNA kódující „antigenizovaný těžký řetězec imunoglobulinu, po které B lymfocyty pocházející ze sleziny sekretují rekombinantní protilátku, jakmile je poskytnut partner lehký řetězec imunoglobulinu.
Imunogenicita aplikačního systému pro antigen je ale jeden z hlavních technických překážek v rozvoji moderních vakcín. Cílem vakcinace je vyvolat silnou imunitní reakci. Ale protože hostitelský imunitní systém je vyvinut k boji proti bakteriím a virům, když jsou bakterie nebo viry použity jako vektory, je posel/vektor typicky zničen spolu se zprávou. Kromě toho silné imunitní reakce na určité virové vektory, například vakcinii a adenovirus, omezují jejich použitelnost a předpokládá se, že podobné problémy mohou povstat v průběhu použití bakteriálních toxinů jako proteinových vektorů. Podobně „proteinové vektory založené na protilátce používající variabilní úseky, které díky své vlastní povaze, nejsou považovány za vlastní („šelf) imunitním systémem, jsou potenciálně imunogenní. Předpokládá se, že mnohonásobné použití těchto nosičských molekul může indukovat anti-idiotypové reakce, a tím předem vyloučit jejich účinné použití. V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout vakcínu, která vytvoří silnou a dlouhodobou imunitu proti preselektovanému antigennímu proteinu nebo peptidu.
Podstata vynálezu
Tento vynález je částečně založen na objevu, že je možné zvýšit imunogenicitu preselektovaného peptidu nebo antigenního proteinu u savce fúzí preselektovaného antigenu ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Výsledný fúzní protein (v tomto textu také nazývaný „Fc-antigenní fúzní protein nebo „antigenní fúzní protein) nebo sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein pak mohou být podávány savci ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenu. Kromě toho bylo objeveno, že intenzita a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu mohou být modulovány podáváním specifických adjuvancií spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem nebo sekvenci nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzni protein.
V souladu s tím vynález poskytuje způsob zvýšeni imunogenicity preselektovaného antigenu u savce. V jednom aspektu způsob obsahuje podávání savci Fc-antigenniho fúzniho proteinu obsahujícího. konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou k preselektovanému antigenu v množství postačujícím k tomu, aby se vyvolala imunitní reakce. V dalším aspektu způsob obsahuje podáváni savcisekvence nukleové kyseliny, například deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo ribonukleové kyseliny (RNA), kódující Fc-antigenni fúzni protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k preselektovanému antigenu. Preselektovaný antigen, když je částí Fc-antigenniho fúzniho proteinu (buď podávaný jako fúzni protein nebo nukleová kyselina, která je pak exprimována v příjemci za vzniku fúzni protein), je charakterizován tím, že je schopen stimulace imunitní reakce u savce, která je silnější než reakce vyvolaná srovnatelným množstvím (například hmotností nebo počtem molekul) preselektovaného antigenu samotného, t j. preselektovaným antigenem nefúzovaným ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu.
Kromě toho imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu Fc-antigenniho fúzniho proteinu mohou být zesíleny nebo modulovány podáváním Fc-antigenního fúzniho proteinu spolu s adjuvans. Ačkoliv v praxi vynálezu může být použitelná celá řada adjuvancií, například chemická adjuvancia, jako je například Freundovo kompletní adjuvans nebo oligonukleotid obsahující nemethylovanou CpG sekvenci, běžně výhodná adjuvancia pro použití s Fc-antigenními fúznimi proteiny zahrnuji druhý Fc fúzni protein (v tomto textu nazývaný „Fc-adjuvantni fúzni protein nebo „adjuvantni fúzni protein) nebo nukleovou kyselinu kódující takový Fc fúzni protein. Výhodné Fc-adjuvantni fúzni proteiny zahrnují konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinuu, například cytokinu. Výhodné cytokiny použitelné pro konstrukci Fc-adjuvantni fúznich proteinů zahrnují například interferon-y (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-12 (IL-12), IL-18, faktor nekrotizujicí nádory (TNF) , faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GMCSF). Další třída Fc-adjuvantni fúznich proteinů zahrnuje úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k adjuvantni skupině odpovídající extracelulárni doméně proteinu, která je obvykle částečně nebo výlučně vázaná k membráně. Například CD40 ligand je fúzován k Fc skupině, aby byl použit jako zesílený adjuvantni protein.
Společné podáváni Fc-antigenního a Fc-adjuvantního fúzního proteinu, buď současně nebo jednoho po druhém (například Fc-antigen následovaný Fc-adjuvans nebo Fc-adjuvans následované Fc-antigenem), může být použito k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thl a Th2, jsou spouštěny jako reakce na odlišné podněty a zapojují odlišné cytokiny. Thl zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thl reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například karcinomové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulárních agens, jako jsou například paraziti, často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné imunitní reakce nebo ke spuštění či modulaci specifických Thl nebo Th2 reakcí.
Například Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený peptidovou vazbou k GMCSF je účinný všeobecný stimulátor imunitní reakce, včetně obou reakcí Thl a Th2. Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-12 nebo IFN-γ může být společně podáván ke stimulaci primárně buněčné nebo Thl zprostředkované imunitní reakce. Alternativně může být Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-4 podáván ke stimulaci primárně humorální nebo Th2 zprostředkované imunitní reakce.
Kromě toho výběr konkrétního cytokinu přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu. Například Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-12 může stimulovat pomocné T lymfocyty a produkci IgG2a třídy protilátek. Alternativně adjuvantní fúzní protein obsahující IL-4 může stimulovat produkci IgE třídy protilátek.
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob zahrnuje podávání Fc-antigenního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fc-adjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fúzních proteinů, každý obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantnímu proteinu (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické buňky exprimují Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu s tím společným podáváním Fc-antigenu a Fc-adjuvantních fúzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigenního fúzního proteinu a adjuvans adjuvantního fúzniho proteinu ve stejných buněčných typech. Adjuvans pak může stimulovat, zesílit nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenu.
V tomto výhodném provedení používá vynález dvě odlišné formy lokalizace nebo koncentrace. Zaprvé vynález používá společnou skupinu, která je fúzována jak k antigenu tak k adjuvans, které jsou koncentrovány v určitých oblastech organizmu. Tímto způsobem je zvýšena účinná lokální koncentrace antigenu v sousedství adjuvans. Zadruhé vynález cílí antigen k mechanizmům imunitního systému pro zpracování a prezentaci antigenu. První koncentrační krok může být prováděn fúzí antigenu a adjuvantních proteinů ke skupině, což má za následek koncentraci v některé části organizmu, která je dostupná imunitnímu systému. Druhý cílící krok může být prováděn fúzí antigenního proteinu ke kterékoliv skupině, která zesiluje prezentaci nebo zpracování systémem prezentujícím antigen.
V souladu s tím vynález dosahuje těchto koncentračních účinků dvěma alternativními metodami. První metodou je konstrukce a podávání dvou různých fúzních proteinů, fúzní protein lokalizující antigen a fúzní protein lokalizující adjuvans. Druhou metodou je konstrukce a podávání fúze obsahující antigen, adjuvans a lokalizující protein. Fc skupina je příklad lokalizujícího proteinu.
Důležitý charakteristický rys konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu je to, že na rozdíl od preselektovaného antigenu v Fc-antigenním fúzním proteinu, je výhodně neimunogenní nebo je pouze slabě imunogenní pro předpokládaného příjemce. Jinak řečeno, v Fc-antigenním fúzním proteinu je preselektovaný antigen navržen tak, aby byl více imunogenní pro příjemce než konstantní úsek těžkého řetězce
imunoglobulinu. Podobně se předpokládá, že Fc-adjuvantní fúzní protein by také byl neimunogenní nebo slabě imunogenni pro předpokládaného příjemce. Imunogenicita konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu může být redukována a v určitých případech eliminována s použitím sekvencí konstantního úseku imunoglobulinu pocházejících ze stejného živočišného druhu nebo podobných sekvencím přítomným u stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například jsou konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu, výhodně humánního původu, použity k vytvoření fúzních proteinů pro podávání člověku. Podobně, když je předpokládaný příjemce člověk, je adjuvantní protein v Fc-adjuvantním fúzním proteinu také výhodně humánního původu. Výběrem vhodných aminokyselinových sekvencí definujících konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu a adjuvantní proteiny, je možné optimalizovat imunitní reakce přímo primárně proti preselektovanému antigenu.
Ve výhodném provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenního fúzního proteinu obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu a volitelně doménu konstantního úseku imunoglobulinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří CH2 doména, CH3 doména a CH4 doména nebo jejich kombinace. Ale konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu výhodně postrádá alespoň CH1 doménu. Kromě toho Fc fúzní proteiny podle vynálezu výhodně postrádají doménu variabilního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu (VH). Když má být fúzní protein podáván člověku, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu výhodně obsahuje kloubový úsek a CH2 doménu nebo CH3 doménu a nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek a obě CH2 doménu a CH3 doménu. Předpokládá se, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu použitelné v praxi vynálezu mohou pocházet z imunoglobulinů patřících do kterékoliv z pěti
imunoglobulinových tříd nazývaných v oboru IgA (Iga), IgD (IgÓ), IgE (Igs), IgG (Igy) a IgM (Igμ) . Ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu z IgG třídy.
Předpokládá se, že kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen může být zahrnut v Fc-antigenním fúzním proteinu podle vynálezu. Ve výhodném provedení je preselektovaný antigen vybrán ze skupiny, kterou tvoři membránový antigen specifický pro prostatu, ektodoména cytokinového receptoru, virový protein a antigen specifický pro karcinom nebo nádor.
Fc-antigenní fúzní proteiny mající velký počet konfigurací mohou být použitelné v praxi vynálezu. Například N-koncová část preselektovaného antigenu může být spojena polypeptidovou vazbou s C-koncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Alternativně může být C-koncová část preselektovaného antigenu spojena polypeptidovou vazbou s Nkoncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho se předpokládá, že Fc-antigenní fúzní proteiny mohou obsahovat velké množství jednoho nebo více preselektovaných antigenů, z nichž jeden nebo více může být spojeno přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k sobě navzájem nebo ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho dva nebo více Fc-antigenních fúzních proteinů může být spojeno spolu buď nekovalentně nebo kovalentně, například jednou nebo více disulfidovými vazbami za vzniku dimerních nebo multimerních přípravků. Předpokládá se, že Fc-antigenní fúzní proteiny v dimerních konstruktech mohou být stejné nebo navzájem odlišné. Například i když oba Fc-antigenní fúzní proteiny mohou obsahovat stejný konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, preselektované antigeny se mohou lišit. Předpokládá se, že podobné konfigurace mohou být použity také s Fc-adjuvantními fúzními proteiny.
Kromě toho v praxi vynálezu může být použitelná celá řada
sekvenci nukleových kyselin kódujících Fc fúzní proteiny. Například sekvence nukleové kyseliny mohou kódovat ve směru od 5' ke 3', buď konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen nebo preselektovaný antigen a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho sekvence nukleové kyseliny volitelně mohou také obsahovat „vedoucí nebo „signální sekvenci založenou například na sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu fúzované přímo ke kloubovému úseku konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Ve výhodném provedení, když Fc úsek je založen na IgG sekvencích, Fc úsek kóduje ve směru od 5' ke 3' alespoň kloubový úsek imunoglobulinu (tj . kloubový úsek obsahující alespoň jednu aminokyselinu cystein schopnou tvorby disulfidové vazby s druhou sekvencí kloubového úseku imunoglobulinu), imunoglobulinovou CH2 doménu a CH3 doménu? Kromě toho sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní proteiny mohou také být integrovány do replikovatelného expresního vektoru, který může buď exprimovat Fc fúzní protein například v bakteriálním hostiteli, v předpokládaném příjemci nebo v obou.
Předpokládá se, že injekce sekvencí nukleové kyseliny kódujících Fc-antigenní fúzní protein, buď samotných nebo v kombinaci se sekvencemi nukleové kyseliny kódujícími Fc-adjuvantní fúzní protein, může mít za následek vznik buněčné imunitní reakce, humorální imunitní reakce nebo obou. Kombinace imunizace založené na nukleové kyselině a imunizace založené na proteinu (např. podávání Fc-antigenního fúzního proteinu před podáváním, během podávání nebo po podávání nukleové kyseliny kódující Fc antigenní fúzní protein) může působit synergicky, aby se vyvolala silnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenu relativně k imunizaci buď se samotnou nukleovou kyselinou nebo samotným proteinem.
Předcházející a další cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zjevnější z následujícího podrobného popisu, obrázků a patentových nároků, které následuj i.
Popis obrázků
Předcházejícím a dalším cílům, charakteristickým rysům a výhodám předkládaného vynálezu, a také vynálezu samotnému bude plněji porozuměno z následujícího popisu výhodných provedení při společném čtení s doprovázejícími obrázky, ve kterých:
Obrázky 1A-1G jsou schématická zobrazení příkladů Fc-fúznich proteinů použitelných v praxi vynálezu. Obrázek 1A představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantni fúzni protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k N-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázek 1B představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantni fúzni protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázky 1C a ID představují dimerní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantni fúzni protein. Na obrázku 1C, v alespoň jednom polypeptidovém řetězci, je konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 připojen k N-koncové části antigenu nebo adjuvans 2 a na obrázku ID, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenu nebo adjuvans 2. Obrázek 1E představuje dimerní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigen-antigen, Fc-adjuvans-adjuvans, Fc-adjuvans-antigen nebo Fc-antigenadjuvans fúzni protein. Obrázek 1F představuje dimerní fúzni
protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigen-Fc-adjuvantní nebo adjuvans-Fc-antigenní fúzní protein. Obrázek 1G představuje dimerní fúzní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigenadj uvans-Fc nebo adjuvans-antigen-Fc fúzní protein.
Obrázky 2A-2B jsou schématická znázornění DNA sekvencí použitelných v praxi vynálezu. Obrázek 2A představuje expresní vektor humánního Fc fúzního proteinu. Obrázek 2B představuje genovou fúzi pro expresi myšího IgG2a Fc fúzního proteinu.
Obrázky 3A-3F jsou grafy ukazující účinek chemických a Fc-cytokinových adjuvancií na produkci protilátek u myší imunizovaných Fc-antigenním fúzním proteinem, fúzním proteinem myší Fc - humánní ektodomén receptoru IL-4 (FC-IL-4R). Na obrázku 3A byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-IL-2 ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Na obrázku 3B byly myši imunizovány Fc-IL-4R ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS). Na obrázku 3C byly myši imunizovány Fc-IL-4R v CFA. Na obrázku 3D byly myši imunizovány FC-IL-4R a Fc-IL-2 v BBS. Na obrázku 3E byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-GMCSF v CFA. Na obrázku 3F byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-GMCSF v PBS. Na obrázcích 3A-3F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 4A-4D jsou grafy ukazující účinek imunizace myší s humánním karcinomovým antigenem, PSMA, ve formě Fc-antigenního fúzního proteinu s' použitím proměnného množství Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4A byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA
fúzniho proteinu samotného. Na obrázku 4B byly myši imunizovány 50 μς Fc-PSMA a 0,5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4C byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA a 0,5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4D byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA a 5 μg Fc-GMCSF. Na obrázcích 4A-4D čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myši.
Obrázky 5A-5F jsou grafy srovnávající specifické protilátkové reakce na PSMA antigen podávány buď jako nativní protein (5A-5C) nebo jako myší Fc-PSMA fúzní protein (5D-5F). Na obrázku 5A byly myši imunizovány 50 μg PSMA jako antigenem. Na obrázku 5B byly myši imunizovány 50 μg PSMA jako antigenem a 0,2 μg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5C byly myši imunizovány 50 μg PSMA jako antigenem a 0,5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5D byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA jako antigenem. Na obrázku 5E byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA jako antigenem a 0,2 μg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5F byly myši imunizovány 50 μg Fc-PSMA jako antigenem a 0,5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázcích 5A-5F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázek 6 je graf srovnávající adjuvantni účinky Fc-GMCSF nebo Fc-F3L společně podávaného s Fc-PSMA na produkci protilátek proti humánnímu PSMA. Všechna zvířata dostala 50 μg Fc-PSMA buď samotného nebo v kombinaci s uvedeným Fc-cytokinem jako adjuvans. V jednotlivých pokusech byly testovány tři myši.
Obrázky 7A-7B jsou grafy ukazující u jednotlivých myší imunogenicitu Fc-EpCAM fúzního proteinu, buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Obrázky 7A a 7B představují protilátkové titry měřené 7 a 14 dnů po zesilovací injekci, v daném pořadí. Zesilovací injekce byla podávána tři týdny po primární imunizaci. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují myši imunizované subkutánně 10 μς Fc-EpCAM samotného a plné trojúhelníky představují myši imunizované subkutánně 10 μς Fc-EpCAM a 1 μς Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 8A-8B jsou grafy ukazující u myší imunogenicitu EpCAM-Fc (opačná orientace Fc úseku a antigenu) buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvantním fúzním proteinem. Obrázky 8A a 8B představují protilátkové titry měřené 14 dnů a 21 dnů (tj. 7 dnů po zesilovací injekci) po imunizaci, v daném pořadí. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují průměrné titry tři myší imunizovaných 25 μς EpCAM-Fc fúzního proteinu a plné trojúhelníky představují myši imunizované 25 μς EpCAM-Fc a 2,5 μς Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázek 9 ukazuje schéma konstrukce plazmidového vektoru kódujícího EpCAM-Fc-GMCSF fúzní protein. V tomto případě je antigen EpCAM fúzován k aminokoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu (Fc úsek) a adjuvans GMCSF je fúzováno ke karboxykoncové části Fc úseku.
Obrázky 10A-10D jsou grafy ukazující protilátkové titry u myši, kterým byla podána injekce plazmidových vektorů kódujících Fc-EpCAM fúzni protein s použitím buď PBS nebo 25% (hmotnost/objem) roztoku sacharózy jako nosiče. Obrázky 10A10D představuji protilátkové titry zaznamenané 14 dnů, 27 dnů, 55 dnů a 69 dnů po počáteční injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představuji titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidu v PBS a plné trojúhelníky představují titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidu v sacharóze. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 11A-11B jsou grafy ukazující stimulaci inkorporace 3H-thymidinu jako reakci na in vitro stimulaci antigenem splenocytů izolovaných z myši imunizovaných DNA vakcinaci nebo injekcí proteinu. Obrázek 11B ukazuje rozšířený přehled dat v nižší části obrázku 11A. Na obrázcích plné kosočtverce představuji splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 μg plazmidové DNA kódující CMV-Fc-EpCAM fúzni protein, prázdné kroužky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 μg plazmidové DNA kódující CMV-EpCAM-Fc fúzni protein a křížky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 10 μg Fc-EpCAM proteinu. Sleziny byly odstraněny myším v 70. Den po první injekci plazmidové DNA nebo proteinu a dvou zesilovacích injekcích ve 3 týdenních intervalech.
Obrázky 12A-B jsou grafy ukazující test usmrcování cytotoxickými T lymfocyty (CTL) s použitím splenocytů z myší imunizovaných plazmidovou DNA nebo Fc-EpCAM proteinem. Obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti myším CT26 nádorovým buňkám exprimujícím humánní EpCAM protein. Obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parentálním myším CT26 nádorovým buňkám. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují splenocyty imunizované DNA nesoucí konstrukt (CMV-promotor)EpCAM, prázdné čtverce představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt (CMV-promotor)Fc-EpCAM, prázdné trojúhelníky představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt (CMV-promotor)EpCAM-Fc a křížky představují splenocyty z myší imunizovaných Fc-EpCAM fúzním proteinem. CTL test používal splenocyty z imunizovaných myší pěstovaných pět dnů s 10 U/ml IL-2. Značené cílové buňky byly smíchány s označenými efektory a inkubovány čtyři hodiny. Uvolňování radioaktivity bylo použito pro výpočet procenta specifické lýzy.
Obrázek 13 je graf ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných subkutánně 50 μg Fc-MCSP fúzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fúzním proteinem samotným a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fúzním proteinem v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 14A-B jsou grafy ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných Fc-gp41 pep 626 fúzním proteinem buď samotným nebo v kombinaci s Fc-cytokinovým adjuvans. Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 pg Fc-gp41 pep 626 antigenu samotného, prázdné čtverce představují titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 pg Fc-gp41 pep 626 antigenu v kombinaci s 2,5 pg Fc-GMCSF adjuvans a plné trojúhelníky představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 2,5 pg Fc-gp41 pep 626 antigenu v kombinaci s 2,5 pg Fc-IL2 adjuvans. Hladiny protilátek k antigenu byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Detailní popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká účinné aplikace antigenních proteinů nebo peptidů in vivo pro indukci humorální imunitní reakce (tj. založené na protilátkách) nebo Th2 buňkami zprostředkované imunitní reakce, buněčné nebo Thl buňkami zprostředkované imunitní reakce a v některých případech obou typů imunitní reakce u savce. Nyní bylo objeveno, že je možné zesílit imunogenicitu preselektovaného antigenního proteinu nebo peptidu u savce fúzí preselektovaného antigenu ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu, aby se vytvořil Fc-antigenní fúzní protein. Výsledný Fc-antigenní fúzní protein nebo sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní proteiny pak mohou být podávány savci, například člověku, ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenu.
Fc-antigenní fúzní protein selektivně cílí antigen k buňkám prezentujícím antigen (APC). Bez ohledu na jakékoliv teorie, má se za to, že vazba Fc-antigenního fúzniho proteinu k APC je zprostředkována Fc receptory exprimovanými na četných typech imunitních buněk, včetně například: dendritických buněk, makrofágů, B lymfocytů a granulocytů. Fc-antigenní fúzní protein se při podávání savci váže na Fc receptory, a poté je Fc-antigenní fúzní protein pohlcen APC endocytózou. Předpokládá es, že fúzní protein pohlcený endocytózou, včetně preselektovaného antigenu, je pak degradován na malé peptidy, které jsou pak prezentovány na buněčném povrchu. Předložené peptidy pak zprostředkovávají humorální a/nebo buněčnou imunitní reakci. Konkrétní typ stimulované imunitní reakce může být modulován společným podáváním Fc-antigenního fúzniho proteinu s adjuvans, například adjuvantním fúznim proteinem.
V jednom způsobu podávání je příjemci podáván Fc-antigenní fúzní protein. V dalším způsobu podávání je příjemci podávána sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein. Preselektovaný antigen, buď v podávaném Fc-antigenním proteinu nebo jako exprimovaný z podávané nukleové kyseliny, je více imunogenní než antigen samotný, tj. antigen, který není fúzovaný polypeptidovou vazbou ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho za určitých okolností může být postupné podávání fúzniho proteinu následované podáváním nukleové kyseliny, která jej kóduje fúzní protein nebo alternativně podávání nukleové kyseliny kódující fúzní protein následované podáváním stejného fúzniho proteinu použito k maximalizaci imunogenicity preselektovaného antigenu. Má se za to, že optimální imunitní reakce byla vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-antigenních fúzních proteinů. Jinak řečeno, preselektovaný antigen v Fc-antigenním fúznim proteinu je schopen vyvolat imunitní reakci a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je schopen vazby Fc receptorů na povrchu APC.
Kromě toho, jak diskutováno, sila a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu může být modulován společným podáváním specifických adjuvancií s Fc-antigenním fúzním proteinem a/nebo nukleovou kyselinou kódující Fc-antigenní fúzní protein. Ačkoliv chemická adjuvancia, např. alum nebo Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, mohou být za určitých okolností, například při veterinárních aplikacích, použitelná v praxi vynálezu, jejich vedlejší účinky, například zjizvení tkáně, je mohou činit nepřijatelná pro humánní použití. V souladu s tím výhodná adjuvancia obsahují druhý Fc fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je fúzován k adjuvantnimu proteinu za vzniku Fc-adjuvantního fúzního proteinu. Má se za to, že co se týče Fc-antigenních fúzních proteinů, je optimální imunitní reakce vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-adjuvantního fúzního proteinu. Jinak řečeno, adjuvans v Fc-adjuvantnim fúzním proteinu je schopno modulace imunitní reakce a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je schopen vazby Fc receptoru na povrchu APC.
Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba antigen a adjuvans podávány jako Fc fúzní proteiny nebo nukleové kyseliny kódující takové fúzní proteiny. Jinak řečeno, antigen je podáván jako Fc-antigenní fúzní protein a adjuvans je podáván jako Fc-adjuvantní fúzní protein. Unčitá výhodná provedení Fc fúzních proteinů použitelná v praxi vynálezu jsou ukázána na obrázcích 1A-1G.
Obrázek 1A ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém Ckoncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovou spojovací částí (linker), k N-koncové části preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2. Jak se v tomto textu používá, termín „polypeptidový linker označuje sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, které spojuji dva proteiny dohromady. Polypeptidový linker je často řada aminokyselin dlouhých přibližně 10-15 zbytků, obsahující například opakující se glycinové a/nebo serinové zbytky. Obrázek 1B ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém C-koncová část preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovým linkerem, k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek 1C ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené kovalentně dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena k N-koncové části preselektovaného antigenu adjuvans 2. Podobně, obrázek ID ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené kovalentně dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek 1E ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2, jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k druhému antigenu nebo adjuvans 2r .
Obrázek 1F ukazuje dimerní konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny také spojené dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerní konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých
C-koncová část antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Nkoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1, jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části odlišného adjuvans nebo antigenu 2'. Například tyto fúzni proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu-adj uvans.
Obrázek 1G ukazuje dimerni konstrukt obsahující dva Fc fúzni proteiny také spojené dvěmi disulfidovými vazbami. Dimerni konstrukt obsahuje dva Fc fúzni proteiny, ve kterých C-koncová část antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k Nkoncové části odlišného adjuvans nebo antigenu 2' , jehož Ckoncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1. Například tyto fúzni proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-adjuvans-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu.
V praxi vynálezu je obecně výhodné umístit Fc skupinu do N-koncové polohy relativně k adjuvantni skupině. Jestliže je adjuvantni skupina umístěna N-koncově k Fc skupině, pak se fúze adjuvans-Fc může vázat k receptoru adjuvans na imunitní buňce a Fc skupina je ve stejné orientaci, která je přijata, když se protilátka váže k buněčnému povrchu. Výsledkem je ADCC nebo fixace komplementu. Ale když je Fc skupina umístěna Nkoncově k adjuvantni skupině, nenastane ADCC a fixace komplementu.
Konstrukty ukázané na obrázcích 1C-1G jsou ukázány jako dimery zesítěné párem disulfidových vazeb mezi cysteiny na sousedních kloubových úsecích. Na obrázcích jsou disulfidové můstky ukázány jako spojující dohromady části dvou konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu prostřednictvím kloubového úseku charakteristického pro nativní formy těchto molekul. I když jsou výhodné konstrukty zahrnující kloubové úseky imunoglobulinů, vynález předpokládá, že může být vybráno zesítění v jiných polohách, je-li žádoucí. Kromě toho v některých případech mohou nekovalentně asociovat dva nebo více monomerů za vzniku dimerů nebo multimerů použitelných v praxi vynálezu.
Jak se v tomto textu používá, termín „konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je zaměnitelný s termínem „Fc úsek a označuje karboxy-koncovou část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její analog nebo část schopnou vazby Fc receptoru. Jak je známo, každý konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu obsahuje čtyři nebo pět domén. Domény jsou nazvány postupně, jak následuji: CH1kloubový úsek-CH2-CH3(-CH4). CH4 se vyskytuje v IgM, který nemá kloubový úsek. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu použitelný v praxi vynálezu výhodně obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu a výhodně také zahrnuje CH3 doménu. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu. Jak se v tomto textu používá, termín „kloubový úsek imunoglobulinu označuje celý kloubový úsek imunoglobulinu nebo alespoň část kloubového úseku imunoglobulinu postačující pro vznik jedné nebo více disulfidových vazeb s druhým kloubovým úsekem imunoglobulinu.
Předpokládá se, že vhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu mohou pocházet z protilátek patřících do každé třídy imunoglobulinů nazývaných IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu z
třídy IgG. Kromě toho se předpokládá, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu mohou pocházet z kterékoliv podtřidy IgG protilátky v oboru nazývaných IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.
Domény konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu mají zkříženou homologii mezi imunoglobulinovými třídami. Například CH2 doména IgG je homologni k CH2 doméně IgA a IgD a k CH3 doméně IgM a IgE. Výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu obsahují proteinové domény odpovídající CH2 úseku a CH3 úseku IgG nebo jeho funkční části nebo derivátům. Konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu ale výhodně postrádají alespoň CH1 doménu. Kromě toho Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantni fúzni proteiny volitelně postrádají variabilní úsek imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu obsahuje, ve směru od N-konce k C-konci, kloubový úsek imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu, které jsou všechny založeny na sekvencích z molekuly IgG. Výběr vhodných konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu je detailně diskutován v patentech Spojených Států č. 5 541 087 a 5 726 044. Výběr konkrétních sekvencí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu z určitých imunoglobulinových tříd a podtříd pro dosaženi konkrétního výsledku je považován za rutinní činnost na úrovni znalostí v oboru.
Za některých okolností může být užitečné modifikovat konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, například mutací, delecí nebo jinými změnami zprostředkovanými genetickým inženýrstvím nebo jinými přístupy, tak, že určité aktivity, jako například fixace komplementu nebo stimulace cytotoxicity zprostředkované buňkami závislé na protilátkách (ADCC), jsou redukovány nebo odstraněny. Ale je považováno za nezbytné, že je udržována schopnost konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu vázat Fc receptor.
V praxi tohoto vynálezu je složka konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenních nebo Fcadjuvantních fúzních proteinů výhodně pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo slabě imunogenní. Fc úsek je považován za neimunogenní nebo slabě imunogenní, jestliže konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nevyvolá detekovatelnou protilátkovou reakci namířenou proti konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. V souladu s tím by konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu měl pocházet z imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném druhu nebo by měl být založen na aminokyselinových sekvencích odpovídajících imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném druhu, jakého je předpokládaný příjemce fúzního proteinu. Jinak řečeno, když Fc fúzní konstrukt (Fc-antigen a/nebo Fc-adjuvantní fúzní protein) má být podáván člověku, měly by být použity humánní sekvence konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence humánních Fc IgG jsou popsány například v Ellison et al. (1982, NUCLEIC ACIDS RES. 10: 4071-4079). Podobně by měly být použity myší Fc sekvence, když Fc fúzní protein má být podáván myším. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myších Fc IgG2a jsou popsány například v Bourgois et al. (197 4, EUR. J. BIOCHEM. 43: 423-435). Měla by být použita stejná logika, jestliže Fc fúzní proteiny mají být podávány jiným zvířatům včetně domácích zvířat, například koček a psů, a hospodářských zvířat, například krav a koní.
Jak se v tomto textu používá, termín „preselektovaný antigen označuje kterýkoliv protein nebo jeho fragment nebo polypeptid, který je schopen buď samotný nebo v kombinaci s jinými reagenciemi indukovat imunitní reakci u savce. Předpokládá se, že v Fc-antigenním fúzním proteinu podle vynálezu může být obsažen kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen. Ve výhodném provedeni preselektovaný antigen je vybrán ze skupiny, kterou tvoří membránový antigen specifický pro prostatu (PSMA), ektodoména cytokinového receptorů, například ektodoména humánního IL-4 receptorů, nádorový specifický antigen (například antigen, který je řízené zvýšeně exprimován nebo je v nádorové buňce jinak přítomný ve zvýšených hladinách relativně k normální buňce) a virový protein, například protein kódovaný genomem humánního viru imunodeficience (HIV).
Jak se v tomto textu používá, termín „adjuvans označuje kteroukoliv látku, kter je schopna působit jako imunomodulátor, například zesílením imunitní reakce (buď humorální nebo buněčné) proti preselektovanému antigenu. Jak se v tomto textu používá, termín „humorální imunita označuje imunitu zprostředkovanou protilátkami přítomnými v tělesných tekutinách, například v plazmě nebo v lymfě, zatímco termín „buněčná imunita, v oboru také nazývaná imunita „zprostředkovaná buňkami, označuje imunologické reakce spouštěné T lymfocyty a zprostředkované efektorovými T lymfocyty a/nebo makrofágy.
Jak diskutováno výše, v imunizaci savců kromě člověka může být použitelná celá řada chemických adjuvancií, například Freundovo kompletní adjuvans. Ačkoliv je široce používáno u zvířat k vytváření vysokých titrů protilátky nebo významných reakcí cytotoxických T lymfocytů (CTL), jeho vedlejší účinky, například jizvení tkáně, jej činí nepřijatelné pro humánní použití. Tudíž je zapotřebí indukovat silné imunitní reakce bez doprovodného zánětu v místě injekce. Jedna nesporná výhoda použití Fc-adjuvantních fúzních proteinů podle vynálezu je schopnost vyvolat silnou imunitní reakci bez potřeby chemických adjuvancií, jako je například Freundovo adjuvans.
Výhodná adjuvancia použitelná v praxi vynálezu zahrnují Fc-adjuvantní fúzní protein nebo nukleovou kyselinu, která jej kóduje. Výhodné adjuvantní proteiny pro zahrnutí do Fc fúzních proteinů jsou cytokiny. Jak se v tomto textu používá, termín „cytokin označuje kterýkoliv protein nebo peptidový analog nebo jeho funkční fragment, který je u savce schopen modulovat aktivitu imunitních buněk, například T lymfocytů, B lymfocytů, makrofágů, neutrofilů, eosinofilů, basofilů, dendritických buněk a jejich prekurzorů. Výhodné cytokiny zahrnují například IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF a GMCSF. Extracelulární doména CD40 ligandu je také výhodný protein k fúzi k Fc za vzniku Fc-adjuvans. Když je podáván s Fc-adjuvans, antigen v Fc-antigenním fúzním proteinu může vyvolat imunitní reakci, která je silnější, než když je Fc-antigenní fúzní protein podáván bez Fc-adjuvantního fúzního proteinu. V některých případech je hladina protilátky dosažená po pouze dvou imunizacích Fc-antigenu s Fc-adjuvans zrovna tak vysoká nebo vyšší než hladina dosažená s Freundovým adjuvans, a bez zjistitelné reakce kůže.
Co se týče konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů, adjuvantní protein výhodně je pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo pouze slabě imunogenní. To může být uskutečněno zavedením do Fc adjuvantních fúzních proteinů, cytokinů definovaných aminokyselinovými sekvencemi odpovídajícími cytokinům, které lze izolovat ze stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například když má být Fc adjuvantní fúzní protein podáván člověku, je výhodně adjuvantní protein (například cytokin) humánního původu.
Společné podávání Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů, buď současně nebo jeden po druhém, může být použito
k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thl a Th2, jsou stimulovány jako reakce na odlišné typy infekce a zapojují odlišné cytokiny. Thl zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thl reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například nádorové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulárních agens, jako jsou například paraziti, často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné imunitní reakce nebo ke spuštění či modulaci specifických Thl nebo Th2 reakcí.
Kromě toho výběr konkrétního cytokinu přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu. Například Fc-IL12 stimuluje reakci pomocných T lymfocytů stimulací produkce působků, které jsou známy jako Thl cytokiny, například IFN-γ, IL-2 a TNF, které podporují silnou buněčnou imunitu a produkci IgG2a třídy protilátek. Naopak Fc-IL-4 stimuluje produkci Th2 cytokinů, například IL5, IL-6, IL-10 a IL-4, které podporují humorální imunitu.
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob obsahuje podávání Fc-antigenního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fc-adjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fúzních proteinů, z nichž každý obsahuje konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantni protein (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické buňky exprimuji Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu s tím společným podáváním Fc-antigennich a Fc-adjuvantních fúzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigen-fúzního proteinu a adjuvans adjuvantního fúzního proteinu ve stejném buněčném kompartmentu APC. Adjuvans pak může zesilovat nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenu.
Kombinace Fc-cytokinů může být také použita synergicky ke stimulaci obecné reakce a pak pro ovlivnění, zda nastane buněčná (Thl) nebo humorální (Th2) reakce. Například Fc-GMCSF je silný obecný stimulátor imunitních reakcí. Ale aby se modulovala reakce dále směrem k buněčné nebo Thl zprostředkované imunitě, může být FC-IL12 nebo Fc-IFNy adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF. Aby se podporovala více humorální nebo Th2 zprostředkovaná reakce, může být Fc-IL4 adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF k modulaci reakce k vytváření Th2 buněk. V závislosti na přesné povaze požadované fyziologické reakce mohou také být použity další Thl nebo Th2 podporující cytokiny, použité jako fúzní cytokiny pro Fc. Předpokládá se, že tento obecný přístup může také být použit k modulaci existující patologické reakce, jako je například autoimunita (Thl-zprostředkované onemocnění) a alergie (Th2zprostředkované onemocnění) posunutím reakce směrem ke konkrétnímu antigenu a pryč od škodlivé reakce imunizací k nové reakci opačného Th typu.
Za některých okolností, při imunizaci zvířete Fc-antigenním fúznim proteinem, je užitečné použít nukleové kyseliny jako adjuvancia. Nukleové kyseliny, například oligonukleotidy obsahující sekvence obohacené cytosinfosfodiesterová vazba-guanosin (CpG) , mohou nasměrovat imunitní reakci směrem k Thl reakci a mohou volitelně být použity v kombinaci s dalšími adjuvancii, jako například cytokiny (viz například Brazolot et al. (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 95: 15553-8, Liu et al. (1998) BLOOD 92: 3730-6 a Klinman et al. (1997) IMMUNOL. 158: 3635-3639). V souladu s tím se předpokládá, že oligonukleotidy obsahující CpG mohou být společně podávány s Fc-antigenovou fúzí pro dosažení zesílené a příslušně modulované imunitní reakce. Takové molekuly nukleové kyseliny mohou být jakkoliv dlouhé, ale jsou výhodné nukleotidy delší než 8 nukleotidů. Sekvence nukleové kyseliny výhodně obsahují sekvenci CpG a výhodněji sekvenci purin-purin-C-G-pyrimidin-pyrimidin, přičemž cytosiny v centrální CpG jsou nemethylovány. Frekvence CpG dinukleotidů v DNA adjuvans je výhodně alespoň přibližně 5% a výhodněji přibližně 10%. Například jako adjuvans může být použita dvouvláknová forma oligodeoxynukleotidu TCCATGACGTTCCTGACGTT (sekv. id. č. 22). V závislosti na typu imunitní reakce, která je hledána, může být užitečné smíchat nukleovou kyselinu s alumem.
Předkládaný vynález používá obvyklou metodologii rekombinantní DNA pro tvorbu Fc fúzních proteinů použitelných v praxi vynálezu. Fc fúze konstrukty výhodně jsou tvořeny na úrovni DNA a výsledné DNA integrovány do expresních vektorů a exprimovány za vzniku Fc-antigennich nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů podle vynálezu. Jak se v tomto textu používá, termín „vektor označuje kteroukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci kompetentní pro zavedení do hostitelské buňky a pro rekombinaci a integraci do genomu hostitelské buňky nebo pro autonomní replikaci jako epizom. Takové vektory zahrnují lineární nukleové kyseliny, plazmidy, fagemidy, kosmidy, RNA vektory, virové vektory apod. Neomezující příklady virových vektorů zahrnují retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Jak se v tomto textu
používá, termín „genová exprese nebo „exprese Fc fúzního proteinu označuje transkripci DNA sekvence, translaci mRNA transkriptu a sekreci Fc fúzního proteinového produktu. Fc fúzní proteiny obsahující IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, bIG-H3, IgE receptor, PSMA nebo gpl20 byly exprimovány s použitím expresních systémů typů diskutovaných v tomto textu. Stejné nebo podobné expresní konstrukty jsou popsány v patentech Spojených Států č. 5 541 087 a 5 726 044.
Jako alternativa k fúzi proteinů technikami genetického inženýrství může být k fúzi proteinových skupin použita chemická konjugace s použitím obvyklých chemických zesíťovacích činidel.
Základní vektory použitelné v praxi vynálezu zahrnují selekční (t j. selektovatelný) marker, například gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR), řízený transkripčními regulačními sekvencemi, pocházejícími například z viru SV40 a bakteriální plazmidové sekvence pro selekci a udržování plazmidu v E. coli. Exprese sekvencí Fc-fúzního proteinu je řízena promotorem a volitelně zesilujícími sekvencemi, například cytomegalovirovým (CMV) promotorem a zesilujícími sekvencemi.
Jestliže Fc-fúzní protein nebo nukleová kyselina kódující tento fúzní protein má být podávána člověku, sekvence kódující Fc fúzní protein výhodně začínají ve směru od 5' k 3' „vedoucí sekvencí pocházející například z protilátkového lehkého (L) řetězce, fúzovanou ve shodném čtecím rámci alespoň s částí těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její mutantní formou, výhodně z Εογΐ úseku humánního imunoglobulinového gl genu. Fcyl úsek imunoglobulinového Fcyl genu výhodně zahrnuje alespoň část kloubové domény a CH3 domény a výhodněji zahrnuje alespoň kloubovou doménu, CH2 doménu a CH3 doménu. Jestliže Fc fúzní protein má být podáván myším, výhodné sekvence nukleové
kyseliny kódující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu zahrnují sekvence nukleové kyseliny kódující ve směru od 5' k 3' kloubový úsek, CH2 doménu a CH3 doménu z myší IgG2a protilátky. Je-li nutné, je karboxy-koncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu modifikována na úrovni nukleové kyseliny tak, aby byla možná ligace ve shodném čtecím rámci se sekvencemi kódujícími buď preselektovaný antigen (v případě Ec-antigenu) nebo imunostimulační cytokin (v případě Fc-adjuvantního cytokinu). DNA kódující sekreční kazetu může být ve své genomové konfiguraci nebo své cDNA konfiguraci.
Část DNA kódující signální sekvenci výhodně kóduje peptidový segment, který řídí sekreci Fc fúzního proteinu a potom je odštěpen od zbytku Fc fúzního proteinu. Signální sekvence podle vynálezu je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci, která zahajuje transport proteinu přes membránu endoplazmatického retikula. Signální sekvence, které jsou použitelné ve vynálezu zahrnují signální sekvence protilátkového lehkého řetězce, např. protilátky 14.18 (Gillies et al. (1989) J. of IMMUNOL. METH., 12: 191), signální sekvence protilátkového těžkého řetězce, např. signální sekvence těžkého řetězce protilátky MOPC141 (Sakano et al. (1980) NATURE 286: 5774) a každé další signální sekvence, kter jsou v oboru známy (viz například Watson (1984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12: 14).
Signální sekvence byly v oboru dobře charakterizovány a je známo, že typicky obsahují 16 až 30 aminokyselinových zbytků a mohou obsahovat více nebo méně aminokyselinových zbytků. Typický' signální peptid se skládá ze tří úseků: základní Nkoncový úsek, centrální hydrofobní úsek a polárnější C-koncový úsek. Centrální hydrofobní úsek obsahuje 4 až 12 hydrofobních zbytků, které ukotvují signální peptid přes membránovou lipidovou dvouvrstvu během transportu vznikajícího polypeptidu. Po iniciaci je signální peptid obvykle štěpen v lumen endoplazmatického retikula buněčnými enzymy známými jako signální peptidázy. Potenciální štěpná místa signálního peptidu obecně sledují ,,(-3, -1) pravidlo. Tedy typický signální peptid má malé neutrální aminokyselinové zbytky v polohách -1 a -3 a postrádá prolinové zbytky v tomto úseku. Signální peptidáza štěpí tento signální peptid mezi -1 a +1 aminokyselinami. Tedy signální sekvence může být štěpena z amino-koncové části fúzního proteinu v průběhu sekrece. To má za následek sekreci Fc fúzního proteinu. Sekvence signálního peptidu použitelné v praxi vynálezu jsou v oboru dobře známy, (viz například von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14: 4683).
Jak je odborníkovi zjevné, vhodnost konkrétní signální sekvence pro použití v sekreční kazetě může vyžadovat určité rutinní experimenty. Tyto experimenty mohou zahrnovat stanovení schopnosti signální sekvence řídit sekreci Fc fúzního proteinu a/nebo stanovení optimální konfigurace, genomové nebo cDNA, sekvence, která bude použita, aby se dosáhlo účinné sekrece Fc fúzních proteinů. Kromě toho je odborník schopen vytvořit umělý signální peptid sledující předložená pravidla (von Heijne, odkaz výše) a testovat takovou umělou signální sekvenci na účinnost rutinními experimenty. Termíny „signál sekvence, „signální peptid, „vedoucí sekvence nebo „vedoucí peptidy jsou v tomto textu použit zaměnitelně.
Předpokládá se, že může být použit velký počet různých způsobů podávání Fc fúzních proteinů nebo sekvencí nukleové kyseliny kódující fúzní protein k imunizaci příjemce proti preselektovanému antigenu. K vyvolání CTL reakcí mohou být použity dvě odlišné aplikace podle předkládaného vynálezu, jedna založená na injekci DNA kódující Fc-antigenní fúzní protein a druhá založená na podávání Fc-antigenního fúzního proteinu schopného dodat protein dráze MHC I. třídy.
Injekce antigenních proteinů je použita typicky, aby se vyvolala imunitní reakce u savců. Ale vynález také poskytuje způsoby dodání antigenu k APC injekcí DNA. Obecně používaná technika je injikovat DNA expresní vektory kódující antigenni protein do svalu. Publikace svědčí pro to, že antigenni protein je exprimován svalovými buňkami, ale že antigen není těmito buňkami prezentován imunitnímu systému. Místo toho se má za to, že specializované APC, například makrofágy a dendritické buňky, migrují do místa injekce, navážou a prezentují antigen procesem, který ještě nebyl upřesněn. Použití expresních vektorů pro Fc-antigenní fúzní protein činí tento postup účinnější, protože sekretovaný fúzní protein se váže účinněji k APC než nativní antigenni protein.
jeden důsledek přístupu s injekcí DNA je, že může mít často za následek vyvolání jak humorální tak buněčné reakce. Typicky mají proteiny podávané exogenně obtížnější příležitost pro vstup do dráhy pro prezentaci na molekulách MHC I. třídy. Nicméně podávání Fc fúzních proteinů podle vynálezu zesílí vytváření cytotoxických buněk, pravděpodobně prezentací preselektovaného exogenního antigenu prostřednictvím MHC I. třídy. Kombinace DNA imunizace a proteinové imunizace může také působit synergicky, nejdříve instruovat imunitní systém a pak zesílit stupeň reakce ve formě jak produkce protilátek tak cytotoxických buněčných reakcí. Společné podávání Fc-adjuvantního fúzního proteinu, například Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 a ligandu Fc-Flt3, spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem, zajistí společnou lokalizaci fúzních proteinů do stejného buněčného kompartmentu APC, a tím stimulaci účinnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenu.
Přípravky podle předkládaného vynálezu (tj. Fc-antigen a/nebo Fc-adjuvantní fúzni proteiny nebo sekvence nukleové kyseliny kódující tyto fúzni proteiny) mohou být poskytnuty zvířeti kterýmkoliv vhodným prostředkem, přímo (např. lokálně, jako injekcí, implantaci nebo topickým podáváním do určitého místa tkáně) nebo systémově (např. parenterálně nebo perorálně). Kde má být přípravek poskytnut parenterálně, jako například intravenózním, subkutánnim, oftalmickým, intraperitoneálnim, intramuskulárním, bukálním, rektálním, vaginálním, intraorbitálnim, transdermálnim, intracerebrálnim, intrakraniálnim, intraspinálním, intraventrikulárním, intrathekálním podáváním, podáváním do cisteren, intrakapsulárním, intranazálnim podáváním nebo podáváním aerosolu, obsahuje přípravek výhodně část vodné nebo fyziologicky kompatibilní tekuté suspenze nebo roztoku. Tedy nosič nebo vehikulum je fyziologicky přijatelné tak, že kromě aplikace požadovaného přípravku pacientovi neovlivni nijak nepříznivě pacientovu elektrolytovou rovnováhu a/nebo rovnovážný objem. Tekuté médium pro přípravek může tedy zahrnovat normální fyziologický roztok (např. 9,85% vodný NaCl, 0,15 M, pH 7-7,4).
Výhodné dávky Fc-antigenniho fúzniho proteinu při podáváni jsou v rozmezí 50 ng/m2 až 1 g/m2, výhodněji 5 μg/m2 až 200 mg/m2 a nej výhodněji 0,1 mg/m2 až 50 mg/m2. Výhodné dávky Fc-adjuvantniho fúzniho proteinu při podávání jsou v rozmezí 1 ng/m2 až 0,1 g/m2, výhodněji 0,5 μg/m2 až 20 mg/m2 a nej výhodněji 10 μg/m2 až 5 mg/m2. Výhodné dávky nukleových kyselin kódujících Fc-antigenni nebo Fc-adjuvantní fúzni proteiny při podávání jsou v rozmezí 1 μg/m2 až 100 mg/m2, výhodněji 20 μg/m2 až 10 mg/m2 a nej výhodněji 400 μg/m2 až 4 mg/m2.
Předpokládá se, že maximální imunizace může být dosaženo prováděním četných samostatných imunizací, například jedna až tři inokulace přibližně 3 týdny až šest měsíců od sebe. Kromě toho, jak diskutováno výše, maximálních imunitních reakcí může být dosaženo za určitých okolností střídáním mezi podáváním Fc fúzních proteinů a nukleových kyselin kódujících tyto Fc fúzní proteiny. Předpokládá se, že Fc-antigenní fúzní protein nebo nukleová kyselina kódující fúzní protein může být podávána savci před podáváním Fc adjuvantního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc adjuvantní fúzní protein, současně s tímto podáváním nebo po něm. předpokládá se ale, že optimální způsoby podávání, dávky a zesilovací režimy mohou být stanoveny rutinními experimenty v rozsahu schopností odborníka.
Vynález je dále ilustrován následující příklady, které rozsah vynálezu nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce expresních vektorů pro Fc-antigen a Fc-adjuvans
Aby se řádně otestovala imunogenicita Fc fúzních proteinů v myším modelu, byly konstruovány expresní vektory s použitím sekvencí nukleové kyseliny kódujících Fc úseky myšího IgG2a. To snížilo riziko, že Fc úsek každého fúzního proteinu indukuje u savce imunitní reakci. Kromě toho jako fúzní partneři v Fc-adjuvantních fúzních konstruktech byly použity myší cytokiny, protože jejich biologické aktivity mohou být vysoce specifické pro daný živočišný druh. Tedy vektory publikovaná dříve (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:
495-500) byly modifikovány (viz obrázek 2) nahrazením humánní Fc sekvence IgGl sekvencemi cDNA kódující Fc myšího IgG2a (patent Spojených Států č. 5 726 044).
Fc sekvence myšího IgG2a byly klonovány z knihovny myších splenocytů amplifikací polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR primery obsahovaly adaptérové sekvence pro spojení vedoucí sekvence na 5' konci, a unikátní restrikčni místo Smal/Xmal na 3' konci pro ligaci se sekvencemi kódujícími buď antigeny nebo adjuvantni cytokiny. Antigen a adjuvantni (cytokinové) sekvence byly připraveny s místem 5' Smál a udržováním čtecího rámce mezi Fc a antigenem nebo adjuvantnimi proteiny a unikátním místem Xhol umístěným hned po translačním stop signálu.
Výsledný DNA konstrukt kódoval vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke kloubovému úseku H řetězce myšího IgG2a a pokračoval CH2 a CH3 exony myšího IgG2a a fúznim partnerem (buď antigen nebo adjuvantni cytokin). Transkripce byla řízena' CMV promotorem/enhancerem, který byl shledán použitelným pro expresi ve většině typů buněk v kultuře, a také pro expresi ve svalu a dalších typech buněk po DNA injekci in vivo. Selekční marker, gen dihydrofolátreduktázy (DHFR), byl vložen do každého vektoru pro usnadnění selekce trvale transfekovaných klonů, a také sekvence nezbytné pro udržování plazmidové DNA v E. coli.
Následující názorné konstrukty Fc-antigenu byly tvořeny zavedením správně upravených sekvencí mezi unikátní místa Smál až Xhol ve vektoru nazvaném pdCs-muFc, kde „mu vyjadřuje, že Fc je myšího původu:
Ektodoména (extracelulárni část) humánního IL4 receptorů (IL-4R) byla klonována z humánních mononukleárnich buněk periferní krve (PBMC) PCR amplifikací. Použité primery byly:
5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC (sekv. id. č. 1) a
5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG (sekv. id. č. 2), které obsahovaly místa Srna! a Xhol, v daném pořadí, pro inzerci do pdCs-muFc vektoru. PCR reakční podmínky použité pro toto a následující klonování jsou uvedené dále. Pro amplifikaci požadovaného genu(ů) byly použity Advantage KlenTaq a Polymeráz Mix (Clontech, Palo Alto, CA) a specifické primery. Reakční směsi obsahovaly lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01% želatinu (hmotnost/objem) , 0,2mM každý z dNTP a 1,25 jednotky KlenTaq v celkovém objemu 100 μΐ. Bylo prováděno třicet PCR cyklů, každý cyklus se skládal z tepelné denaturace v 94 °C po dobu 1 minuty, nasedání primerů ve 42 °C po dobu 45 sekund a prodlužování primerů v 72 °C po dobu 1 minuty. Amplifikovaný produkt pak byl subklonován do SK vektoru (Stratagene, San Diego, CA) a jeho DNA sekvence ověřena standardním sekvencováním.
Ektodoména humánního membránového antigenu specifického pro prostatu (PSMA) byla klonována z buněčné linie LnCAP karcinomu prostaty (ATCC CRL1740) prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC (sekv. id. č. 3) a
5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG (sekv. id. č. 4), pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena a PCR fragment vložen do pdCs-muFc vektoru za vzniku pdCs-muFc-PSMA fúzního konstruktu.
Ektodoména humánního EpCAM (také známá jako KS antigen), povrchového proteinu epitelové buňky zvýšeně exprimovaného na většině karcinomových buněk, byla klonována z LnCAP buněk prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (sekv. id. č. 5) a
5' CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG (sekv. id. č. 6) pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena standardním sekvencováním a PCR fragment byl vložen do vektoru pdCs-muFc za vzniku fúzniho konstruktu pdCsmuFc-EpCAM. Další vektor byl konstruován s použitím EpCAM ektodomény jako N-koncového fúzniho partnera a v tomto případě PCR produkt obsahoval přirozenou vedoucí sekvenci z EpCAM cDNA a sekvenci zralé ektodomény na hranici membránou procházející domény (membránové domény). 3' konec tohoto PCR produktu obsahoval vložené AflII místo pro ligaci k 5' AflII místu myšího Fc fragmentu. Použité PCR primery zahrnovaly:
5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (sekv. id. č. 7) a
5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG (sekv. id. č. 8).
V tomto případě, myší Fc postrádal 3' inzerční místo pro zavedení fúzniho proteinu, ale obsahoval translační terminační signál na konci sekvence kódující Fc.
Relativně konzervativní část úseku HIV gp41 v blízkosti membrány, rozprostírající se od Hind III místa k lysinovému zbytku přilehlému k membránovému úseku, byla exprimována jako Fc fúzní protein, jako příklad krátké polypeptidové antigenové sekvence. Ačkoliv byla použita proteinová sekvence z kmene HIV IIIB, kódující sekvence byla optimalizována pro optimální expresi v eukaryotických buňkách s použitím kodonů s vysokým obsahem GC. DNA sekvence kódující aminokyselinové zbytky 626 až 669, která měla následující sekvenci: C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG MC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC 7XAG TGA CTCGAG (sekv. id. č. 9) byla syntetizována chemicky a ligována do vektoru pdCs-muFc. Aminokyselinová sekvence fúzovaného polypeptidu byla: SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (sekv. id. č. 10).
Další sekvence kódující HIV protein byly použity pro konstrukci Fc-antigennich fúznich proteinů, jak bylo popsáno dříve (patenty Spojených Států č. 5 541 087 a 5 726 044) s použitím spíše Fc myšího IgG2a než původního Fc humánního IgGl. Tyto konstrukty představují další provedení vynálezu.
Řada Fc-adjuvantnich (cytokinových) fúznich proteinů obsahujících Fc myšího IgG2a a několik myších cytokinů byla konstruována stejným způsobem jako Fc-antigenní fúzni proteiny. Specifické cytokiny a klonovací primery jsou diskutovány níže.
Myší IL-2 byl klonován z myších mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (sekv. id. č. 11) a (antisense):
5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (sekv. id. č. 12).
Myší GMCSF byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC (sekv. id. č. 13) a (antisense):
5' CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC (sekv. id. č. 14) .
Myší ligand Flt3 byl klonován z myšího thymu prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC (sekv. id. č. 15) a (antisense):
5' CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC (sekv. id. č. 16).
Myší IL-12 p35 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (sekv. id. č. 17) a (antisense):
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (sekv. id. č. 18).
Myší IL-12 p40 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (sekv. id. č. 19) a (antisense):
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (sekv. id. č. 20).
Všechny PCR produkty, kromě myšího IL-12 p40, byly klonovány jako fragmenty Smal/Xhol, analyzovány standardním DNA sekvencováním a ligovány do vektoru pdCs-muFc obsahujícího jako svůj Fc úsek myší Fc IgG2a. PCR produkt myší IL-12 p40 byl exprimován odděleně (ne jako Fc fúzní protein) ve vektoru obsahujícím stejný CMV promotor enhancer, vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke zralé p40 podjednotce myšího IL-12 a gen rezistence na neomycin v místě selekčního markerového genu DHFR ve vektoru pdCs-muFc. Výsledný vektor byl nazván pNC-mp40, kde „N označuje gen pro selekci neomycinem.
Všechny plazmidové konstrukty indukovaly syntézu a sekreci specifických fúzních proteinů přechodnou expresí v buňkách 293 z lidské ledviny. Stručně, plazmidy byly zavedeny do monovrstvy buněk 293 z lidské ledviny prostřednictvím koprecipitace s fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N.Y.). Buňky byly ponechány přes noc (16 hodin), promyty PBS a živeny čerstvým tkáňovým kultivačním médiem (DMEM obsahující 10% fetální bovinní sérum (FBS)). Po dalších 2-3 dnech bylo kultivační médium testováno na sekretované fúzní proteiny Fc specifickým testem ELISA (Gillies et al. (1989) J. IMMUNOL. METHODS 125: 191) s použitím protilátek specifických pro myší IgG-Fc protein. V případě myšího FC-IL12 byly obě Fc-p35 a p40 DNA expresních plazmidů přechodně exprimovány ve stejné buněčné kultuře, takže heterodimerní cytokinový fúzní protein byl sestaven před sekrecí buňkou (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195).
Potom byly vytvořeny trvale transfekované buňky exprimující různé Fc fúzní proteiny vnesením linearizované DNA do myších myelomových buněk NS/0 standardní technikou elektroporace. Stručně, buňky byly suspendovány v kývete přístroje Gene Pulser (BioRad) v koncentraci 107 buněk/ml a 0,5 ml suspenze bylo smícháno s 10 gg DNA a směs byla chlazena na ledu po dobu 10 minut. Elektroporace byla prováděna s použitím přístroje Gene Pulser (BioRad) s nastavením 0,25 V a 500 μΡ. Buňky byly ponechány zotavit se na ledu po dobu 10 minut, pak byly resuspendovány v růstovém médiu a přeneseny na 96 jamkové destičky. Buňky byly živeny každé 2-3 dny selekčním médiem obsahujícím 0,lM metotrexát počínaje 2 dny po elektroporaci. Rezistentní kolonie rostoucí na 96 jamkových destičkách byly testovány na expresi testem ELISA podle protokolu pro Fc.
Pro expresi myšího FC-IL12 fúzní proteinu byla transfekovaná buněčná linie NS/0 již exprimující p40 podjednotku myšího IL-12 transfekována, jak bylo popsáno výše, expresním vektorem s myší Fc-p35 podjednotkou. Linie exprimující p40 byla získána elektroporaci buněk NS/0 vektorem pNC-mp40, popsaným výše, a selekcí v médiu obsahujícím neomycinový analog 6418 (Life Sciences Technologies). Po druhé transfekci byl prováděn screening přežívajících buněčných klonů testem Fc ELISA a testem ELISA pro myší IL-12 (Genzyme, Cambridge, MA).
Strukturní integrita výsledných fúzních proteinů byla testována elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDSPAGE). Nejprve byly fúzní proteiny navázány k malému objemu (10-20 μΐ na ml média) proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, NA) . Navázaná látka byla promyta PBS obsahujícím Tween-20 (0,01%), pak eluována v gelovém pufru obsahujícím SDS a pak 2 minuty povařena v přítomnosti 5% 2-merkaptoethanolu. Redukované proteiny pak byly analyzovány na SDS-PAGE gelech (předem nalitých) a obarveny modří Coomassie. Purifikace ve velkém měřítku ze stabilních buněčných klonů byly prováděny s použitím kolon protein A Sepharose (Repligen, Needham, MA) podle instrukcí výrobce.
Přiklad 2
Imunogenicita Fc-antigenu a účinek chemického nebo
Fc-cytokinového adjuvans na produkci protilátek
Konstrukt myší Fc-huIL-4R alfa podjednotky připravený v příkladu 1 byl použit jako antigen pro testováni potenciálního účinku těchto proteinů na cílení APC ve zvířecím modelu. Ektodoména IL-4R alfa podjednotky představuje dost konzervativní molekulu mezi živočišnými druhy, která má více než z 50 % identické sekvence mezi člověkem a myší.
Skupinám myší byla podána injekce 50 μg Fc-antigenního fúzního proteinu (FC-IL-4R) subkutánně buď v PBS nebo emulgovaného ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Některé skupiny také dostaly dávku 5 μς (smícháno s FC-IL-4R) Fc-adjuvantniho proteinu, a to buď FC-IL2 nebo Fc-GMCSF. Dva týdny později byla myším podána injekce stejné směsi, ale byla podána do peritoneálni dutiny. CFA formulace tvoři micely, které slouží jako zdroj pomalu uvolňovaného antigenu, který umožňuje kontinuální stimulaci imunitního systému. Mycobakteriálni proteiny v CFA také indukují silnou zánětlivou reakci stimulací cytokinů, a tím dále zesilují imunitní reakci. CFA ale vyvolává vážné vedlejší účinky včetně poškození kůže, čímž je u lidí nepoužitelné. Ukazuje se ale, že směsi s Fc-adjuvantními fúznimi proteiny v PBS, nevyvolávají žádnou viditelnou kožní reakci či jakoukoliv jinou zjevnou známku toxicity u zvířete.
Dva týdny po zesilovací injekci (tj. 28 dnů po první injekce) byla zvířatům odebrána krev a byla připravena séra tak, že se plná krev nechala srazit v mikrozkumavkách, buňky a sraženina se stočily při vysoké rychlosti 12 000 RPM po dobu 5 minut a byl získán supernatant. Výsledná séra byla naředěna testovacím pufrem (PBS obsahující 0,01% Tween-20) a testována na protilátky reaktivní s humánním IL-4R. Byla prováděna antigen-specifická ELISA s použitím 96 jamkových destiček potažených humánním Fc-huIL-4R (100 μΐ o koncentraci 5 μg/ml v PBS bylo přidáno do každé jamky a inkubováno ve 4°C přes noc). Antigenem potažené destičky pak byly promyty a blokovány blokujícím pufrem (1% BSA, 0,01% Tween-20 v PBS) před použitím. Naředěná testovaná séra byla inkubována v jamkách po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, a pak byly jamky osmkrát promyty testovacím pufrem. Byla přidána sekundární proti-myší Fc-specifická protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:2000, Jackson ImmunoResearch) a destičky byly inkubovány další hodinu. Po osmi dalších promytich testovacím pufrem byl přidán roztok o-fenylendiamindihydrochloridu (OPD) obsahující 25mM kyselinu citrónovou, 50mM NaHPO4, pH 5 a 0,03% čerstvě přidaný H2O2. Reakce byla zastavena přibližně po 30 minutách přidáním 100 μΐ 4N H2SO4. Výsledné destičky byly odečítány ve 490 nm na přístroji pro odečítání destiček, který automaticky subtrahoval pozadí odečítané v 650 nm. Výsledky byly vyneseny do grafu jako optická denzita versus ředění antiséra. Relativní protilátkové titry byly určovány množstvím ředění séra, které bylo zapotřebí k tomu, aby se optická denzita snížila pod arbitrární hodnotu, například 1 jednotku O.D.
Výsledky imunizačních protokolů jsou ukázány na obrázku 3. Injekce myšího Fc-IL-4R fúzního proteinu samotného v PBS podle tohoto protokolu indukovala protilátkovou reakci pouze u jedné myši (obrázek 3B) . Přidání CFA ale mělo za následek více reagujících myší, ale titry byly zhruba stejné jako u reagujících myší, kterým byla podána injekce Fc-IL4R fúzního proteinu samotného v PBS (obrázek 3C). Společné podávání myšího Fc-IL2 adjuvans s FC-IL4R v PBS indukovalo reakci u všech zvířat, ale množství vytvořené protilátky se v jednotlivých případech měnilo (obrázek 3D) . Kombinace CFA a myšího Fc-IL2 adjuvans společně (obrázek 3A) mělo za následek vyšší protilátkové titry než každá sloučenina samotná (obrázky 3C a 3D) . Společné podávání myšího Fc-GMCSF adjuvans v PBS indukovalo nej silnější imunitní reakci ze všech skupin (obrázek 3E), včetně skupiny, která byla imunizována kombinací obou Fc-GMCSF adjuvans a CFA (obrázek 3F). Jinak řečeno, myší Fc-GMCSF adjuvans v PBS, když bylo podáváno společně s myším FC-IL4R antigenem, odstranilo potřebu použití CFA. Předpokládá se, že takový způsob by být vhodnější pro použití u člověka.
Příklad 3
Účinek Fc-GMCSF adjuvantní dávky na protilátku vytvářenou proti karcinomovému antigenu, PSMA, v Fc-PSMA fúzním proteinu
PSMA v současné době představuje lákavý cílový antigen asociovaný s humánními nádory díky své omezené distribuci v normální tkáni. PMSA je v současnosti testován v klinických zkouškách jako uvažovaná nádorová vakcína. V tomto příkladě byla hodnocena imunogenicita PMSA antigene v Fc-PMSA fúzním proteinu.
Myší Fc-PSMA fúzní protein byl připraven tak, jak bylo projednáno v příkladu 1. Skupinám myší byla podána subkutánně injekce 50 μg myšího Fc-PSMA v PBS, spolu s měnící se koncentrací Fc-adjuvantního fúzního proteinu Fc-GMCSF, a pak jim byla intraperitoneálně podána zesilovací injekce 14 dnů později. Protilátkové titry byly měřeny testem ELISA zachytávajícím Fc-PSMA antigen, jak bylo popsáno v příkladu 2 pro FC-IL4R fúzní protein. Výsledky byly vyneseny do grafu na obrázku 4 jako protilátkový titr (ředění, ve kterém OD byla snížena k 1) versus čas po první injekci.
V nepřítomnosti Fc-GMCSF měly myši protilátkové titry proti PSMA v rozmezí od 1000 do přibližně 20 000 (obrázek 4A). Společné podávání tak malého množství, jako 0,05 μg Fc-GMCSF ale mělo za následek titry v rozmezí od 30 000 do 140 000 (obrázek 4B) . Desetinásobné zvýšení Fc-GMCSF dále stimulovalo protilátkové titry proti tomuto karcinomovému antigenu (obrázky 4C a 4D). Nejvyšší podaná dávka (5 μg Fc-GMCSF fúzního proteinu na myš) ještě stále představuje přibližně 2 μg GMCSF na injekci - dávka bez zjevného účinku na myší kůži nebo bez
jakýchkoliv systémových příznaků, že bylo zvíře imunizováno (viz obrázek 4D) . Kromě toho na rozdíl od CFA nebylo znatelné zvětšení sleziny.
Příklad 4
Účinek Fc-zprostředkovaného dování PSMA na protilátkovou reakci na imunizaci
Specifické účinky Fc složky Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů byly testovány srovnáním indukované imunitní reakce u myší, kterým byla podána injekce fúzních proteinů, nefúzovaného antigenu nebo adjuvantních proteinů nebo směsi předchozích. Pro tento účel byl použit humánní PSMA systém.
Nefúzovaný PSMA byl připraven proteolytickým štěpením humánního Fc-PSMA fúzního proteinu (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11: 495-500) plazminem podle instrukcí výrobce. Uvolňovaný Fc a neštěpený Fc-PSMA byly odstraněny adsorpcí k proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, MA).
Skupinám myší (n=3) byla podána injekce jedné subkutánní dávky 50 μg PSMA buď samotného (obrázek 5A) nebo v kombinaci s 0,2 μg volného GMCSF (obrázek 5B) nebo s 0,5 μg Fc-GMCSF (obrázek 5C) (0,5 μg Fc-GMCSF obsahuje přibližně 0,2 μg GMCSF). V dalším souboru myší byla každé myši podána injekce jedné subkutánní dávky 50 μρ myšího Fc-PSMA fúzního proteinu samotného (obrázek 5D) nebo spolu s 0,2 μρ volného GMCSF (obrázek 5E) nebo s 0,5 μg Fc-GMCSF (obrázek 5F) . Všechny injekční formulace byly v PBS bez chemického adjuvans.
Protilátky reaktivní s myším Fc-PSMA byly měřeny 14. Den po imunizaci.
Důležitost Fc složky Fc-antigenního fúzního proteinu ve Fc-PSMA fúzním proteinu pro imunogenicitu PSMA byla nápadná, když zvířatům byla podána injekce PBS formulací bez chemických adjuvancií. V podstatě nebyla primární imunitní reakce na PSMA podávaný v PBS (obrázek 5A) . Přidání GMCSF nebo Fc-GMCSF k imunizaci mělo velmi malý účinek (obrázky 5B a 5C) , kromě slabé reakce u jednoho zvířete (obrázek 5B). Na rozdíl od toho zvířata, kterým byla podána injekce Fc-PSMA samotného vykazovala silnou primární imunitní reakci ve všech případech (obrázek SD). Přidání volného GMCSF k Fc-PMSA slabě zesilovalo účinek (obrázek 5E) , ale společné podávání obou antigenu a cytokinu jako Fc fúzních proteinů poskytlo nejvyšši stupeň reakce (obrázek 5F).
Tyto výsledky ukazují, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans je obzvláště užitečná při vytváření imunitní reakce a prokazují zjevný prospěch společné lokalizace antigenu a stimulačního cytokinu in vivo, pravděpodobně k APC.
Příklad 5
Srovnání adjuvantních účinků fúzních proteinů Fc-GMCSF nebo
Fc-Flt3L
Bylo ukázáno, že ligand pro Flt3, v oboru také nazývaný ligand Flt3 (Flt3L) , má rozhodující úlohu při vytváření a maturaci dendritických buněk (Soligo et al. (1998) BR. J. HAEMATOL. 101: 352-63). Předpokládá se, že dendritické buňky, spolu s tkáňovými makrofágy, jsou nejdůležitější APC. Studie
na myších prokázaly, že denní injekce po dobu 10 dnů zvyšují počet a APC aktivitu dendritických buněk navratitelných z lymfatické tkáně a sleziny a že tyto buňky jsou neobyčejně účinné při prezentaci antigenu oběma CD4+ a CD8+ T lymfocytům. Předpokládá se, že Langerhansovy buňky kůže představují jeden typ dendritických buněk schopných prezentace antigenu po vychytáni a migraci do lokálních lymfatických uzlin. Protože se předpokládá, že většina dendritických buněk neexprimuje uspořádání Fc receptorů typicky zjišťované na makrofágu (např. FcyRI), nemůže být předpovězeno, zda by společný lokalizující účinek Fc fúzních proteinů zapojil tuto linii APC.
Aby se otestovalo, zda by Flt3L mohl působit jako adjuvans, skupinám myší byla podána injekce myšího Fc-PSMA a myšího Fc-Flt3L, spíše než použití myšího Fc-GMCSF fúzniho proteinu (silný stimulátor makrofágů a granulocytů) . V tomto případě bylo očekáváno, že jakýkoliv adjuvantní účinek bude zprostředkován aktivací a vychytáváním dendritických buněk, což bude mít nakonec za následek protilátkovou reakci na PMSA. Výsledky jsou shrnuty na obrázku 6.
Tato studie ukazuje, že myší Fc-Flt3L je silné adjuvans, které stimuluje anti-PSMA protilátky právě tak jako, jestli ne lépe, stejná dávka Fc-GMCSF. Výsledky podporují pozorování, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans může být obzvláště účinná při indukci imunitní reakce. Výsledky také ukazují, že dendritické APC zjevně mohou být cíleny Fc-antigenem a Fc-cytokinem, a také makrofágem APC, což svědčí pro to, že na těchto buňkách je přítomná alespoň jedna forma Fc receptorů.
Přiklad 6
Imunitní reakce na Fc-EpCAM a EpCAM-Fc fúzní proteiny
Další potenciálně důležitý humánní karcinomový antigen, EpCAM (také nazýván KSA a 17-1A antigen) byl produkován jako fúzní protein Fc úsekem myšího IgG2a s použitím plazmidů a metod, jak byly popsány v příkladu 1 a byl podáván buď samotný nebo v kombinaci s Fc-GMCSF jako adjuvans. Myším byla podána subkutánně injekce a po 3 týdnech zesilovací injekce 10 gg Fc-EpCAM a 1 μg Fc-GMCSF v PBS. Kontrolní myši nedostaly Fc-GMCSF. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 7 dnů (obrázek 7A) a 14 dnů (obrázek 7B) po zesilovací injekci. Výsledky ukazují, že Fc-EpCAM, když byl podáván samotný, je účinný imunogen (prázdné kosočtverce) a že Fc-GMCSF může dále zesílit reakci na tento antigen (plné trojúhelníčky).
Kromě toho byl EpCAM antigen exprimován v opačné orientaci vzhledem k Fc fragmentu jako EpCAM-muFc (viz příklad 1, obrázek 1B) . Tato molekula byla použita k imunizaci Balb/c myší subkutánní injekcí. Byly použity vyšší dávky EpCAM-Fc fúzního proteinu (25 μρ na dávku) a množství adjuvans (2,5 μg Fc-GMCSF) bylo zvýšeno také. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 14 dnů (obrázek 8A) a 21 dnů (obrázek 8B) po imunizaci. EpCAM-Fc fúzní protein samotný byl úplně imunogenni v nepřítomnosti Fc-GMCSF (obrázky 8A a 8B, (prázdné kosočtverce)) . Přidání Fc-cytokinu zvýšilo protilátkové titry přibližně 3krát (obrázek 8A a 8B, (plné trojúhelníčky)).
Aby se otestovalo, zda by imunitní reakce proti EpCAM mohla chránit savce před nádorovými buňkami exprimujícími tento antigen, neimunizovaným myším nebo myším imunizovaným
EpCAM-Fc fúznim proteinem (a v některých případech Fc-cytokiny) byla podána injekce do ocasní žíly 105 buněk CT26 myšího karcinomu tračníku transfekovaných humánním EpCAM (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195). Po jedenadvaceti dnech byla zvířata utracena a rozsah plicních metastáz byl hodnocen (1) určováním stádia co se týče rozsahu na povrchu plic a (2) zvážením plic a srovnáním s normálními plícemi zvířete, aby se zjistil rozdíl hmotnosti, jejíž zvýšení bylo připisováno nádorové mase. Výsledky shrnuté v tabulce 1 ukazují, že všechny imunizované myši vykazovaly statisticky významnou redukci nádorových metastáz ve srovnání s kontrolními myšmi, včetně zvířat imunizovaných EpCAM-Fc fúznim proteinem samotným. Podobné výsledky byly dosaženy s použitím Fc-EpCAM fúzního proteinu jako antigenu.
Tabulka 1
Ošetřovaná skupina Skóre metastáz Průměrná hmotnost plic
Kontrolní skupina 4, 4, 4, 1, 1 412+/-130
EpCAM-Fc 0, 0, 0, 0, 0 210+/-21
EpCAM-Fc + Fc-GM 0, 0, 0, 0, 0 240+/-19
EpCAM-Fc + Fc-IL2 0, 0, 0, 0, 0 230+/-19
Skóre metastáz bylo založeno na rozsahu postižení povrchu plic s použitím následujícího hodnocení: 1 = 1-25% rozsah, 2 = 26-50% rozsah, 3 = 51-75% rozsah a 4 = 76-100% rozsah.
Příklad 7
Kombinace antigen-Fc a cytokinových adjuvans v jednom fúznim proteinu
Protein popsaný v příkladu 6, EpCAM-Fc, slouží za vzor N-koncového antigenu, připojeného k Fc úseku imunoglobulinu jako karboxylová proteinová doména. Tento protein a další jemu podobné mohou být společně podávány s Fc-adjuvantními fúzními proteiny, např. Fc-cytokiny, k zesilování imunitní reakce na antigen. Alternativně mohou být antigen, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a adjuvantni protein (například cytokin) tvořeny jako jeden fúzni protein, například jako EpCAM-Fc-GMCSF fúzni protein.
Expresní plazmid pro tento protein byl konstruován s použitím sekvencí myších IgG2a Fc a GM-CSF tak, že konstrukt mohl být hodnocen v myším modelu. Malý fragment Xbal až Smál obsahující sekvence kódující vedoucí sekvence-EpCAM-Fc byl získán z původního EpCAM-Fc expresního vektoru (příklad 1) a ligován do velkého fragmentu Smál až Xbal expresního vektoru Fc-GMCSF (obrázek 9).
Výsledný vektor, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF, byl zaveden do buněk 293 s použitím metody precipitace fosfátem vápenatým pro přechodnou expresi a do buněk NS/0 elektroporaci pro trvalou expresi. Stabilní transfektanty byly vybrány pěstováním buněk v médiu obsahujícím metotrexát (0,1 μΜ) . Exprimující klony byly identifikovány testem Fc ELISA (viz příklad 1) a klony s vysokým stupněm produkce byly množeny v kultuře. EpCAMFc-GMCSF protein byl purifikován z kondicionovaných médií vazbou na protein A Sepharose a následnou eluci (Repligen, Needham, MA) a strukturní integrita byla analyzována SDS-PAGE po redukci 2-merkaptoethanolem. Výsledky ukázaly, že protein měl molekulární hmotnost přibližně 90 kD, jak bylo očekáváno pro jednořetězcovou fúzi EpCAM, Fc a GMCSF.
Aby se porovnala relativní imunogenicita kombinovaného fúzního proteinu, myším byla podána subkutánně injekce ekvivalentních dávek EpCAM-Fc-GMCSF a jednotlivých fúzních proteinů v kombinaci: EpCAM-Fc a Fc-GMCSF. Stejné injekce byly podávány 14 dnů později a vzorky séra byly testovány na specifickou protilátkovou reaktivitu na humánní EpCAM 7 dnů po zesilovací injekci. Stejný přístup může být použit pro jiný antigenní protein nebo peptid, a také pro jiné stimulační cytokiny, jako je například IL-2, IL-12 a Flt3L.
Příklad 8
Imunizace Fc-antigenem injekcí DNA
Stejné expresní vektory použité pro transfekci a produkci myších Fc-EpCAM a EpCAM-Fc v savčích buňkách (viz příklad 1) byly injikovány jako „nahá plazmidová DNA do svalu zadní končetiny skupiny myší Balb/c. DNA byla injikována v koncentraci 0,5 mg/ml a celkové množství 100 pg bylo podáváno buď v PBS nebo roztoku 25% (hmotnost/objem) sacharózy. Injekce byly opakovány každé 3 týdny do celkového množství 3 injekcí. Protilátkové reakce byly měřeny v různou dobu a byly kvantifikovány testem ELISA s použitím 96 jamkových destiček potažených humánním Fc-EpCAM pro navázání antigenu a s použitím proti-myší Fc specifické polyklonální protilátky konjugované s HRP (Jackson ImmunoResearch) pro detekci. Data předložená na obrázku 10 představují protilátkové titry zaznamenávané 14 dnů (obrázek 10A), 27 dnů (obrázek 10B), 55
dnů (obrázek 10C) a 69 dnů (obrázek 10D) po injekci.
Výsledky předložené na obrázku 10 ukazuji, že nízké titry specifické anti-EpCAM protilátky byly indukovány v průběhu prvního měsíce při použití obou formulací (obrázky 10A a 10B) . Mnohem vyšší titry byly získány 55. den (obrázek 10C) a ještě vyšší hladin 69. den (obrázek 10D). Podobné výsledky byly získány s použitím DNA injekce vektoru exprimujícího EpCAM-Fc, ačkoliv titry byly nižší. Tato data ukazují, že antigen exprimovaný jako fúzní molekula obsahující antigenní protein a Fc úsek imunoglobulinu může indukovat imunitní reakci, když je zaveden injekcí nahé DNA a že perzistentní expozice antigenu vede k oddáleným reakcím u většiny zvířat.
Buněčné imunitní reakce byly testovány pěstováním splenocytů z myší očkovaných DNA nebo imunizovaných proteinem (70 dnů po injekci) stimulovaných odlišnými koncentracemi Fc-EpCAM proteinu in vitro. Data ukázaná na obrázku 11 (horní panel) ukazují proliferativní reakci (měřenou inkorporací 3Hthymidinu) na antigen u zvířat imunizovaných buď Fc-EpCAM proteinem (křížky) nebo DNA vakcinací expresním vektorem CMVpromotor-EpCAM-Fc (prázdné kroužky) nebo expresním vektorem CMVpromotor-Fc-EpCAM (plné kosočtverce). Proteinem imunizovaná zvířata vykazovaly mnohem větší reakce na antigen, dokonce i při velmi nízkých dávkách. Reakce u DNA vakcinovaných zvířat (také ukázány v odlišném měřítku na dolním panelu na obrázku 11) byly závislé na dávce, ale byly menší než u myší, kterým byla podána injekce proteinu. Tyto reakce byly charakteristické pro reakce CD4 + T lymfocytů omezených MHC II. třídy.
Aby se otestovala cytotoxická aktivita (obecný ukazatel reakcí T lymfocytů omezených MHC I. třídy), kultury splenocytů z myší imunizovaných DNA nebo proteinem byly pěstovány po dobu 5 dnů v přítomnosti přibližně 10 U/ml IL-2. Efektorové buňky byly pěstované splenocyty a cílové buňky byly buď značené buňky CT26 exprimujíci EpCAM humánního karcinomu tračníku (syngenní pro myši Balb/c) nebo značené parentální buňky (netransfekované buňky CT26). Efektorové a cílové buňky byly smíchány v odlišných poměrech a byl určován rozsah lýzy. Hodnoty 100 % lýzy bylo dosaženo inkubací značených cílových buněk v přítomnosti detergentu a bylo měřeno množství uvolňované značky.
Výsledky jsou ukázány na obrázku 12, kde obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti buňkám CT26 exprimujicim humánní EpCAM, zatímco obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parentálnim buňkám CT26. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představuji splenocyty izolované z myši imunizovaných DNA nesoucí EpCAM konstrukt, prázdné čtverce představuji splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí Fc-EpCAM fúzni konstrukt, prázdné trojúhelníky představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí EpCAM-Fc fúzni konstrukt a křížky představují splenocyty izolované z myši imunizovaných Fc-EpCAM fúzními proteiny.
Obrázek 12 ukazuje, že ačkoliv DNA vakcinace vyvolala slabé cytotoxické reakce proti oběma cílovým buňkám, významně vyšší cytotoxicita byla pozorována u myši imunizovaných proteinem. Oba druhy buněk, parentální nádorové buňky CT26 a nádorové buňky CT26 exprimující EpCAM, byly v testu usmrceny. Cytotoxicita pozorovaná proti parentálnim buňkám CT26 může být proto, že tyto buňky exprimují vysoké hladiny myšího homologu EpCAM, který je přibližně z 81 % identický s humánním proteinem na aminokyselinové úrovni. Nicméně imunizace proteinem Fc-EpCAM nevyvolala významnou cytotoxickou aktivitu proti nádorovým buňkám CT26 exprimujicim humánní EpCAM, čímž se vysvětluje účinná protektivní aktivita proti nádorům ♦ · · 9 · W · popsaná v přikladu 6.
Přiklad 9
Imunizace Fc-fúznim proteinem obsahujícím podoblast karcinomového antigenního proteinu
Ačkoliv některé celé proteiny nemusí být použitelné jako antigeny pro imunitní terapii, menší podoblasti proteinů mohou být daleko účinnější. Například proteiny obsahují domény, které jsou post-translačně modifikovány, aby byly učiněny méně imunogenní, a tím se sníží imunitní reaktivita na aktuální polypeptidové složky. Velké proteiny mohou indukovat protilátky, které reagují pouze s nepolypeptidovými částmi antigenu a které nezprostředkují buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) , potenciálně důležitou složku protinádorové imunitní reakce. Jako dobrý příklad této situace lze uvést proteoglykanový antigen chondroitinsulfát (MCSP) specifický pro humánní melanom, který je exprimován fakticky na všech melanomech, a také u několika typů karcinomu mozku. Tento protein je hodně glykosylovaný a je dále modifikován připojením několika řetězců glykosaminoglykanu. Protilátka známá jako 9.2.27 (Bumol et al. (1982) PROC. NATL. ACAD. SCI. 79: 1245-1249) váže tento protein s vysokou afinitou, ale nezprostředkovává žádnou efektorovou funkci, ani ADCC nebo cytotoxicitu zprostředkovanou komplementem (CDC). Dokonce i částečně humanizované (chimérické) formy této protilátky neuspěly při zprostředkování této aktivity.
Aby se vyvolaly více zaměřené reakce na optimální cílové úseky této velké molekuly, byla v proteinové sekvenci identifikována předpokládaná místa připojení glykanu. (Pluske et al (1996) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 93: 9710-9715). Byla vybrána podoblast nedaleko od membránové sekvence a v určité vzdálenosti od místa připojení glykanu.
Peptidová sekvence: QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVV RVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD (sekv. id. č. 21) byla reverzně translatována, výsledná DNA sekvence byla syntetizována chemicky a ligována do expresního vektoru pdCsFc-X s použitím stejných restrikčních míst použitých v dřívějších příkladech. Místo terminace translace bylo přidáno na 3' konec, hned za sekvenci kódující poslední aminokyselinu, pak následovalo unikátní místo Xhol. Konečný expresní plazmid byl elektroporaci zaveden do myelomových buněk NS/0 a stabilní transfektanty exprimující požadovaný protein byly získány tak, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Protein Fc-MCSP byl purifikován z tkáňových supernatantů s použitím chromatografie s proteinem A Sepharose (Repligen, Needham, MA) . Protilátkové titry byly měřeny u myší Balb/c subkutánně imunizovaných 50 μg Fc-MCSP fúzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 μg Fc-GMCSF jako adjuvans. Výsledky jsou ukázány na obrázku 13. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a Fc-GMCSF adjuvans.
Specifické imunitní reakce na tuto podoblast MCSP byly detekovány 14. den a významně se zvýšily po imunizaci zesilovací injekcí. Výsledky ukazují, že myši imunizované oběma Fc-GMCSF a Fc-MCSP stimulovaly vyšší protilátkové titry proti MCSP (plné trojúhelníky) než myši imunizované Fc-MCSP samotným (prázdné čtverce).
Přiklad 10
Imunizace Fc-fúznim proteinem obsahujícím virový antigen
Vývoj účinné vakcíny proti viru humánního imunodeficitu (HIV), viru, který způsobuje AIDS, je jeden z nejdůležitějších cílů ve výzkumu vakcín. Nedávno několik publikací ukázalo, že určité vlastnosti virového obalu slouží k oklamáni imunitní reakce, aby odpovídala na irelevantní epitopy, a tím se maskuji důležité a potenciálně neutralizační úseky virové částice. To zahrnuje přítomnost vysoce imunodominantních antigennich úseků, které slouží jako návnady, a extenzivní glykosylaci, která fyzicky maskuje a redukuje imunogenicitu důležitých epitopů (Wyatt et al. (1998) NATURE 393: 705-11).
Jeden možný způsob, jak obejit mechanismus návnady, je exprimovat malé úseky gen virového obalu, aby se zabránilo imunodominantnim reakcím, které nejsou protektivní a indukovala se neutralizační reakce. Jeden problém při použití vakcín s malými podjednotkami je snížená imunogenicita buď umělého peptidu nebo malého proteinu. Jeden přístup byl kondenzovat proteiny nebo peptidy k imunogennim nosičským proteinům, jako je například hemokyanin přílipky (KLH). To indukovalo silnou reakci na KLH, a také na protein nebo peptid. Dalším přístupem je vyrobit fúzni protein s Fc, jak bylo popsáno v příkladu 1 pro podoblast, například ektodoménu gp41 (kotvící doména virového obalu, gpl60). Na rozdíl od jiných nosičů je na úsek imunoglobulinu nahlíženo jako na vlastní („self) antigen, čímž se minimalizuje jakýkoliv imunodominantni účinek.
Fc-gp41pep626 fúzni konstrukt obsahoval polypeptid o 44 aminokyselinách, fúzovaný ke karboxy-koncové části Fc úseku myšího imunoglobulinu. Sekvence HIV kmene IIIB v tomto úseku obsahuje signál pro N-vázanou glykosylaci, takže Fc-gp41pep626 fúzní protein, tvořený buď v buňkách 293 přechodnou expresí nebo v myelomových buňkách NS/0 trvalou transfekcí, vykazoval vysoký stupeň variace v mobilitě při analýze SDS-PAGE, což indikovalo heterogenitu v rozsahu glykosylace.
Navzdory faktu, že tento virový antigen byl docela malý (dlouhý 44 aminokyselinových zbytků) a byl heterogenně glykosylován, bylo možné vyvolat imunitní reakci u myší Balb/c (viz obrázek 14). V tomto případě byla skupinám pěti myší podána intradermálni injekce s 25 μg Fc-gp41pep626 1. den a injekce s dvojnásobným množstvím ve dvoutýdenních intervalech, buď samotného (prázdné kosočtverce) nebo v kombinaci s 2,5 μg Fc-adjuvantních fúzních proteinů, Fc-GMCSF (prázdné čtverce) nebo Fc-IL2 (plné trojúhelníky). Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí.
Imunitní reakce byly více závislé na společném podávání Fc-cytokinů a trvalo déle dosáhnout vysoký titr. Předpokládá se, že větší imunitní reakce může být vyvolána s použitím modifikací této sekvence, která neobsahuje glykosylační signál (ve skutečnosti mnoho kmenů toto místo nekóduje) nebo enzymatickým odstraněním sacharidových vedlejších řetězců in vitro.
Příklad 11
Adjuvantní aktivita Fc-fúzniho proteinu obsahujícího extracelulární doménu molekuly buněčného povrchu
Pro konstrukci Fc-adjuvantních fúzních proteinů je někdy užitečné fúzovat k Fc extracelulární doménu proteinu, který může být vázán na membránu. Například je fúzován CD40 ligand (CD40L) v N-koncové části C-koncové části k Fc. Volitelně je použit linker.
CD40L je použitelný, protože jeho receptor, CD40, je exprimován na povrchu B lymfocytů a je zapojen do stimulace B lymfocytů lymfocyty T. Jako faktor nekrotizující nádory, je CD40L trimer, který způsobuje dimerizaci nebo trimerizaci svého receptorů na buněčném povrchu. Výsledkem je, že jsou domény intracelulárního receptorů přivedeny do kontaktu a z tohoto plyne signální transdukce. Také jako TNF, CD40L může být vázaný na membráně, ale může být také z buněčného povrchu odštěpen a působit jako cytokin.
Fc-CD40L fúzní protein je zvířatům podáván společně s Fc-antigenním fúznim proteinem. V kontrolních experimentech jsou Fc-CD40L protein a Fc-antigenní protein podávány odlišným skupinám zvířat. Předpokládá se, že zvířata, kterým byla podána injekce obou fúzních proteinů, tvoří vyšší titr protilátek než zvířata, kterým byla podána injekce každého fúzniho proteinu jednotlivě.
Alternativně byl použit jeden Fc fúzní protein obsahující oba antigeny a CD40L skupinu, s volitelnými linkery (L) mezi Fc, CD40L a antigenovými skupinami. Fúzní protein může mít řádění od N-konce k C-konci Fc-(L)-antigen-(L)-CD40L, FC-(L)CD40L-(L)-antigen, antigen-(L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)~ antigen-(L)-Fc, antigen-(L)-Fc-.(L)-CD40L nebo CD40L-Fc- (L) antigen-(L). Fúzní protein obsahující Fc, antigen a CD40L je injikován zvířatům a pak jsou měřeny protilátkové titry. Předpokládá se, že protilátkové titry vyvolané injekcí fúzního proteinu s oběma CD40L a antigenem jsou vyšší než titry dosažené injekcí fúzních proteinů obsahující pouze Fc a antigen nebo Fc a CD40L.
Ve výše uvedeném podávání fúzních proteinů jsou zvířatům podávány injekce intravenózně, subkutánně nebo jiným vhodným způsobem podávání, časy mezi primárním a zesilovacím podáváním antigenů a/nebo adjuvancií a měřením protilátkových titrů jsou stejné, jak byly popsány v předešlých příkladech. Alternativně jsou použity standardní dávky a testovací režimy.
Ekvivalenty
Vynález může být prováděn v jiných specifických formách bez odchýlení se od vynálezecké myšlenky nebo jejích podstatných charakteristických vlastností. Předchozí provedení je tedy nutné považovat ve všech ohledech spíše za ilustrativní než za omezující vynález popsaný v tomto textu.
Rozsah vynálezu je tedy udán připojenými patentovými nároky včetně všech změny, které spadají do rozsahu patentových nároků ve smyslu ekvivalence.
Zahrnutí formou odkazu
Nauka všech patentových dokumentů a vědeckých publikací, na které se odkazuje výše, je v tomto textu výslovně zahrnuta formou odkazu.
Seznam sekvenci <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer IL-4R <400> 1 gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc 28
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> umělá sekvence
<220>
<223> popis umělé sekvence: primer IL-4R <400> 2 cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg 34 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer PSMA <400> 3 aagcttaaat cctccaatga agc 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer PSMA <400> 4 ctcgagttag gctacttcac tcaaag
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> umělá sekvence
<220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM
<400> 5 ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> 6 ctcgagtcat tttagaccct gcattgag <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> 7 tctagagcag catggcgccc ccgc <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer EpCAM <400> 8 ccttaagcac cctgcattga gaattcag <210> 9 <211> 148 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: DNA kódující aminokyselinové zbytky 626-669 HIV IIIB gp41 <400> 9 cccgggatcč ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60 gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120 ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag 148 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: fúzovaný polypeptid z vektoru pdC-muFC
<400> 10 lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin 10 Gin Glu 15 Lys
Ser Leu 1 lie His Ser 5 Leu
Asn Glu Gin Glu 20 Leu Leu Glu Leu Asp 25 Lys Trp Ala Ser Leu 30 Trp Asn
Trp Phe Asn 35 lie Thr Asn Trp Leu 40 Trp Tyr lie Lys
<210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primery pro myší IL2 <400> 11 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc <210> 12 <211> 25 < 212> DNA < 213> umělá sekvence <220>
< 223> popis umělé sekvence:
<400> 12 ccctcgagtt attgagggct tgttg primer pro myší IL2 primer pro myší GMCSF < 210> 13 < 211> 28 < 212> DNA < 213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence:
<400> 13 cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc
<210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> umělá sekvence
<220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myši GMCSF
<400> 14
ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc 29 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší ligand Flt3 <400> 15 caagcttaca cctgactgtt acttcagc <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší ligand Flt3 <400> 16 ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc 30 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL-12p35 <400> 17 ccccgggtag ggtcattcca gtctetgg <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL-12p35 <400> 18 ctcgagtcag gcggagctca gatagc <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myší IL12 p40 <400> 19 tctagaccat gtgtcctcag aagctaac <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: primer pro myši IL12 p40 <400> 20 ctcgagctag gatcggaccc tgcag 25 <210> 21 <211> 83 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: MSCP peptid <400> 21
Gin 1 Gly Ala Thr Leu 5 Arg Leu Asp Pro Thr 10 Val Leu Asp Ala Gly 15 Glu
Leu Ala Asn Arg 20 Thr Gly Ser Val Pro 25 Arg Phe Arg Leu Leu 30 Glu Gly
Arg His Gly Arg 35 Val Val Arg Val 40 Pro Arg Ala Arg Thr 45 Glu Pro Gly
Gly Ser 50 Gin Leu Val Glu Gin 55 Phe Thr Gin Gin Asp 60 Leu Glu Asp Gly
Arg 65 Leu Gly Leu Glu Val 70 Gly Arg Pro Glu Gly Arg 75 Ala Pro Gly Pro 80
Ala Gly Asp <210> 22 <211> 20 < 212> DNA < 213> umělá sekvence <220>
< 223> popis umělé sekvence: oligodeoxynukleotid, který může být použit jako adjuvans <400> 22 tccatgacgt tcctgacgtt

Claims (23)

1. Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi proti předem vybranému antigenu u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem zvolenému antigenu a adjuvant zahrnující oligonukleotidovou CpG sekvenci.
2. Kompozice pro vyvolání imunitní odpovědi proti předem vybranému antigenu u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje
i) předem vybraný antigen nebo ii) fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu nebo iii) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený antigen nebo iv) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený fúzní protein zahrnující tento antigen a adjuvant zahrnující fúzní protein, který zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu nebo nukleovou kyselinu kódující tento fúzní protein.
3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kódující fúzní protein zahrnující antigen kóduje ve směru od 5’ ke 3’ poloze konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu a antigen.
4. Kompozice podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že fúzní protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant zahrnuje kloubovou oblast imunoglobulinu.
5. Kompozice podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že fúzni protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzni protein zahrnující adjuvant zahrnuje doménu konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu zvolenou ze souboru sestávajícího z CH2 domény, CH3 domény a CH4 domény.
6. Kompozice podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu zahrnuje CH2 doménu a CH3 doménu.
7. Kompozice podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že předem vybraný antigen je zvolen ze souboru sestávajícího z membránového antigenu specifického vůči prostatě ektodomény receptorů cytokinu, virového proteinu a tumor-specifického proteinu.
8. Kompozice podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že fúzni protein zahrnující předem vybraný antigen a/nebo fúzni protein zahrnující adjuvant je připojen disulfidovou vazbou ke druhé konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu.
9. Kompozice podle některého z nároků 2 až 8, vyznačující se tím, že adjuvantním proteinem je cytokin.
10. Kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že 9 cytokinem je lidský cytokin.
11. Kompozice podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je definována aminokyselinovou sekvencí odpovídající aminokyselinové sekvenci definující konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.
12. Kompozice podle některého z nároků 2 až 11, vyznačující se tím, že sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein zahrnující antigen a/nebo fúzní protein zahrnující adjuvant je operativně uspořádána v replikovatelném expresním vektoru.
13. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje první fúzní protein zahrnující antigenní protein s lokalizačním proteinem a druhý fúzní protein zahrnující adjuvantní protein a uvedený lokalizační protein, přičemž lokalizační protein vyvolává nárůst koncentrace prvního a druhého fúzního proteinu v oblasti savce, která je dosažitelná pro imunitní systém.
14. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein zahrnující antigenní protein, adjuvantní protein a lokalizační protein, přičemž lokalizační protein vyvolává nárůst koncentrace antigenního a adjuvantního proteinu v oblasti savce, která je dosažitelná pro imunitní systém.
15. Fúzní protein zahrnující antigenní protein, adjuvantní protein a lokalizační protein.
16. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein podle nároku 1 5.
17. Expresní vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 6.
18. Fúzní protein podle nároku 15 nebo sekvence nukleové kyseliny podle nároku 16 pro použití jako léčivo.
19. Kompozice podle některého z nároků 1 až 14 pro použití jako léčivo.
20. Použití kompozice podle některého z nároků 1 až 14 nebo fúzního proteinu podle nároku 15 pro výrobu léčiva pro vyvolání imunitní odpovědi na antigen u savce.
21. Použití fúzního proteinu podle nároku 15 nebo sekvence nukleové kyseliny podle nároku 16 pro výrobu léčiva pro vyvolání imunitní odpovědi na antigen u savce.
22. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu podle některého z nároků 1, 4 až 8 a 11, a to v prvním zásobníku, a adjuvant zahrnující oligonukleotidovou CpG sekvenci v druhém zásobníku.
23. Farmaceutický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje
i) předem vybraný antigen nebo ii) fúzní protein zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k předem vybranému antigenu nebo iii) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený antigen nebo iv) sekvenci nukleové kyseliny kódující uvedený fúzní protein zahrnující tento antigen podle některého z nároků 2 až 8 a 11 až 12, a to v prvním zásobníku, a adjuvant zahrnující fúzní protein, který zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu podle některého z nároků 2, 4 až 6 a 8 až 10 nebo nukleovou kyselinu kódující tento fúzní protein.
CZ2002-182A 1999-07-21 2000-07-21 Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny CZ304884B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14496599P 1999-07-21 1999-07-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002182A3 true CZ2002182A3 (cs) 2003-11-12
CZ304884B6 CZ304884B6 (cs) 2015-01-07

Family

ID=22510982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002-182A CZ304884B6 (cs) 1999-07-21 2000-07-21 Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7955590B2 (cs)
EP (1) EP1198250B8 (cs)
JP (1) JP4764585B2 (cs)
KR (1) KR100689739B1 (cs)
CN (1) CN1308037C (cs)
AT (1) ATE374042T1 (cs)
AU (1) AU779388B2 (cs)
BR (1) BR0012569A (cs)
CA (1) CA2378866C (cs)
CZ (1) CZ304884B6 (cs)
DE (1) DE60036552T2 (cs)
DK (1) DK1198250T3 (cs)
ES (1) ES2292457T3 (cs)
HU (1) HUP0202796A2 (cs)
MX (1) MXPA02000746A (cs)
NO (1) NO20020255L (cs)
PL (1) PL201664B1 (cs)
PT (1) PT1198250E (cs)
RU (1) RU2248214C2 (cs)
SK (1) SK782002A3 (cs)
WO (1) WO2001007081A1 (cs)
ZA (1) ZA200200501B (cs)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
CZ2003214A3 (cs) 2000-06-29 2003-08-13 Merck Patent Gmbh Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu
GB0102145D0 (en) 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
AU2002240197A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-12 Tanox, Inc. Methods to generate and identify monoclonal antibodies to a large number of human antigens
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
PL403488A1 (pl) * 2001-05-24 2013-07-08 Zymogenetics, Inc. Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
CN1315536C (zh) * 2002-09-13 2007-05-16 李进 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US7744897B2 (en) 2003-12-23 2010-06-29 Dillon Susan B Human immunodeficiency virus gp41 mimetibody polypeptides
KR101163424B1 (ko) 2003-12-30 2012-07-13 메르크 파텐트 게엠베하 Ｉｌ－７ 융합 단백질
EP1699821B1 (en) 2003-12-31 2012-06-20 Merck Patent GmbH Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
CA2552590A1 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN101072793B (zh) 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
KR101374454B1 (ko) * 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US20070104689A1 (en) 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1948802A4 (en) * 2005-10-13 2009-01-14 Virexx Medical Corp CHIMERIC ANTIGEN WITH HEPATITIS C VIRUS POLYPEPTIDE AND FC FRAGMENT FOR CALLING UP AN IMMUNE RESPONSE
CN101346395A (zh) * 2005-12-30 2009-01-14 默克专利有限公司 阻止复合有IL-6Rα的IL-6与GP130结合的抗IL-6抗体
AU2006332155B2 (en) 2005-12-30 2013-01-10 Cancer Research Technology Limited Anti-CD19 antibodies with reduced immunogenicity
SI1966238T1 (sl) * 2005-12-30 2012-08-31 Merck Patent Gmbh Variante interlevkina-12P40 z izboljšano stabilnostjo
EP4793360A2 (en) * 2006-03-31 2026-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
JP5144499B2 (ja) * 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
RU2325172C2 (ru) * 2006-07-24 2008-05-27 Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ФГУ РКНПК Росздрава) Сорбент для удаления иммуноглобулинов
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
RU2505603C2 (ru) 2007-09-26 2014-01-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против рецептора il-6
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
TWI548418B (zh) 2007-12-05 2016-09-11 中外製藥股份有限公司 Anti-NR10 / IL-31RA antibody and its use
TW201920257A (zh) 2008-04-11 2019-06-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗原結合分子
US8383767B2 (en) * 2008-06-27 2013-02-26 Academia Sinica Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 中外製藥股份有限公司 Antibody constant region change body
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2010238858A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
CN102459344A (zh) 2009-05-15 2012-05-16 中外制药株式会社 抗axl抗体
EA017172B1 (ru) * 2009-08-04 2012-10-30 Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" Способ получения изоиммунной плазмы крови
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
GB0922209D0 (en) 2009-12-18 2010-02-03 Univ Nottingham Proteins, nucleic acid molecules and compositions
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
CN103596587B (zh) * 2010-10-28 2016-09-07 健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府 纤丝病毒融合蛋白及其应用
CN105859889B (zh) 2010-11-17 2020-01-07 中外制药株式会社 具有代替凝血因子viii的功能的功能的多特异性抗原结合分子
TWI654203B (zh) 2010-11-30 2019-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
SG10201609665PA (en) 2011-02-25 2017-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
CN102212139A (zh) * 2011-03-29 2011-10-12 中国人民解放军第二军医大学 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
WO2014140894A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bioven 3 Limited Self-assembling synthetic proteins
CN103212069B (zh) * 2013-05-13 2014-07-30 上海赛伦生物技术有限公司 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用
EP3009518B1 (en) 2013-06-11 2020-08-12 National Center of Neurology and Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (rrms) patient, and method for determining applicability of novel therapy
WO2015002985A2 (en) * 2013-07-01 2015-01-08 University Of Maryland Fc coupled compositions and methods of their use
JP2016531915A (ja) * 2013-08-28 2016-10-13 ステムセントリックス， インコーポレイテッド 部位特異的抗体コンジュゲーション方法および組成物
CA2925256C (en) 2013-09-27 2023-08-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
JP6640834B2 (ja) 2014-08-11 2020-02-05 デリニア， インコーポレイテッド 自己免疫疾患の処置のために調節性ｔ細胞を選択的に活性化させる改変ｉｌ−２変異体
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN105859837B (zh) * 2014-10-22 2020-11-20 台北医学大学 胆固醇酯转运蛋白抗原肽和融合蛋白以及其组合物和应用
MX2017005774A (es) 2014-12-19 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos antimiostatina, polipeptidos que contienen regiones fc variantes, y metodos de uso.
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
TWI759261B (zh) 2015-02-27 2022-04-01 日商中外製藥股份有限公司 Ｉｌ－６受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
US9139653B1 (en) 2015-04-30 2015-09-22 Kymab Limited Anti-human OX40L antibodies and methods of treatment
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
EA201792442A1 (ru) 2015-05-06 2018-06-29 Янссен Байотек, Инк. Биспецифические агенты, связывающие простатический специфический мембранный антиген (psma), и их применение
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP6875683B2 (ja) 2015-05-19 2021-05-26 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
ES2893584T3 (es) * 2015-06-10 2022-02-09 Univ Tokyo Adyuvante para vacunas, vacuna y procedimiento de inducción de inmunidad
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHOD OF USE
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
EP3431102A4 (en) 2016-03-14 2019-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL DAMAGING THERAPEUTIC MEDICAMENT FOR USE IN CANCER THERAPY
AU2017255077B2 (en) 2016-04-28 2024-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing preparation
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN106177932A (zh) * 2016-07-03 2016-12-07 查文娟 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EP3538548A4 (en) 2016-11-08 2020-08-19 Delinia, Inc. IL-2 VARIANTS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7209298B2 (ja) 2017-03-31 2023-01-20 公立大学法人奈良県立医科大学 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｉｘ因子異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物
EP3620531A4 (en) 2017-05-02 2021-03-17 National Center of Neurology and Psychiatry METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS
WO2019078344A1 (ja) 2017-10-20 2019-04-25 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
KR20260090008A (ko) 2017-11-01 2026-06-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 생물 활성이 저하된 항체 배리언트 및 아이소폼
JP7765181B2 (ja) 2017-12-19 2025-11-06 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ－２ ｆｃ融合タンパク質
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
TWI822728B (zh) 2018-01-31 2023-11-21 加藤元一 含有il-6抑制劑的哮喘治療劑
EP3752195A4 (en) * 2018-02-14 2021-11-17 Viela Bio, Inc. FELINE MCDONOUGH'S SARCOMA (FMS) -LIKE TYROSINKINASE-3 RECEPTOR LIGANDS (FLT3L) ANTIBODIES AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISEASES
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
SG11202012366WA (en) 2018-06-12 2021-01-28 Kentucky Bioprocessing Inc Virus and antigen purification and conjugation
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
CN112566650A (zh) * 2018-06-21 2021-03-26 沙塔克实验室有限公司 异二聚体蛋白及其用途
JP2022512540A (ja) * 2018-08-29 2022-02-07 シャタック ラボ，インコーポレイテッド Ｆｌｔ３ｌ系キメラタンパク質
CN113286812B (zh) 2018-09-27 2025-05-30 西里欧发展公司 掩蔽型细胞因子多肽
KR102884523B1 (ko) 2018-10-03 2025-11-10 젠코어 인코포레이티드 IL-12 이종이량체 Fc-융합 단백질
US12344646B2 (en) 2018-12-13 2025-07-01 Bang DING Antibody-TNF α fusion protein and its preparation and applications
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
JP7729778B2 (ja) * 2019-03-28 2025-08-26 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ｆｌｔ３）に対するキメラタンパク質およびキメラタンパク質複合体
AU2020259884A1 (en) 2019-04-17 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for urological cancer which is characterized by being administered with il-6 inhibitor and ccr2 inhibitor in combination
EP3969119A1 (en) 2019-05-17 2022-03-23 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusi0n proteins
EP4037700A2 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Xencor, Inc. Targeted il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US20230043257A1 (en) * 2020-01-21 2023-02-09 Jinyu Zhang Pharmaceutical composition and use thereof
WO2021172971A1 (ko) * 2020-02-28 2021-09-02 (주)셀트리온 수두 대상포진 바이러스 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물
PH12022552627A1 (en) * 2020-04-01 2023-01-04 Xilio Dev Inc Masked il-2 cytokines and their cleavage products
JP7681041B2 (ja) * 2020-04-21 2025-05-21 クビオ・ホールディングス・リミテッド ウイルス及び抗原のコンジュゲーションによって形成されるワクチン
US12558423B2 (en) 2020-05-29 2026-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing formulation
EP4176893A4 (en) * 2020-07-01 2024-10-23 Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences DESIGN AND APPLICATION OF A FUSION PROTEIN VACCINE PLATFORM
CN118267456A (zh) * 2020-07-01 2024-07-02 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4251187A4 (en) 2020-11-25 2025-09-10 Xilio Dev Inc TUMOR-SPECIFIC CLASSIBLE LINKERS
IL303967A (en) * 2020-12-23 2023-08-01 Immunowake Inc Immunogenic cytokines and their uses
WO2022187424A1 (en) * 2021-03-04 2022-09-09 Helix Nanotechnologies, Inc. Compositions including sbi adjuvants and methods of use thereof
CU24734B1 (es) * 2021-03-30 2025-02-07 Ct Inmunologia Molecular Composicones vacunales depletantes de factores de crecimiento hematopoyéticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
CN120022357A (zh) * 2021-03-31 2025-05-23 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
MX2024001877A (es) 2021-08-10 2024-02-28 Kymab Ltd Tratamiento de dermatitis atopica.
WO2023125976A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 广州国家实验室 融合蛋白疫苗
WO2023178169A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Anemoi Biotech Holdings, Inc. Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection
WO2023224914A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating caveolinopathy diseases
CN114699521B (zh) * 2022-06-07 2023-02-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用
CN119219788A (zh) * 2023-06-30 2024-12-31 凯米生物医药(成都)有限公司 经糖基修饰的融合蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞及应用
WO2025151752A1 (en) 2024-01-10 2025-07-17 Xilio Development, Inc. Masked il-2 cytokines and methods of use thereof
CN119613573B (zh) * 2025-02-14 2025-05-30 浙江大学 一种CD40L-Fc融合蛋白、基因片段、重组质粒、重组细胞以及制备方法和用途

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US650064A (en) * 1898-11-14 1900-05-22 Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company System of liquid distribution.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) * 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
ATE122238T1 (de) 1987-06-10 1995-05-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
PH26813A (en) 1987-09-02 1992-11-05 Ciba Geigy Ag Conjugates of cytokines with immunoglobulins
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
AU2635088A (en) 1987-12-04 1989-06-08 Du Pont Merck Pharmaceutical Company, The Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxyl-terminal extension
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6750329B1 (en) 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
DK0482076T3 (da) * 1989-07-14 1995-07-17 American Cyanamid Co Stabile vaccinepræparater indeholdende interleukiner
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE59010908D1 (de) 1989-09-12 2000-08-10 Hoffmann La Roche TNF-bindende Proteine
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DK0433827T3 (da) 1989-12-22 1998-09-28 Hoffmann La Roche Cytotoksisk lumfocytmodningsfaktor
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
JPH06505496A (ja) * 1991-03-11 1994-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 活性因子ｘ１１１の活性化を阻害するための組成物と方法
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
CA2108580A1 (en) 1991-05-31 1992-12-01 Arthur J. Ammann Treatment of hiv-associated immune thrombocytopenic purpura
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
AU666866B2 (en) 1991-08-30 1996-02-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
CA2128511C (en) 1992-01-23 2006-11-07 Andreas Pluckthun Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
PT633929E (pt) 1992-04-01 2004-07-30 Merix Bioscience Inc Metodo para proliferacao (in vitro) de precursores de celulas dentifricas e sua utilizacao para produzir imunogenios
ATE311895T1 (de) 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
EP0671926B1 (en) 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
EP1757695A3 (en) 1992-11-05 2008-02-27 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
KR960701988A (ko) 1993-04-20 1996-03-28 윌리엄 에스. 로빈슨 세포내 감염원에 감염된 개체의 치료방법 및 치료물질(methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular in-fectious agents)
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
KR960701650A (ko) 1993-04-29 1996-03-28 찰스 엠. 브룩 에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods)
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
CN1636594B (zh) 1994-04-26 2012-08-29 儿童医学中心公司 血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
AU713040B2 (en) * 1994-07-15 1999-11-18 University Of Iowa Research Foundation, The Immunomodulatory oligonucleotides
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
PT706799E (pt) 1994-09-16 2002-05-31 Merck Patent Gmbh Imunoconjugados ii
CA2205572A1 (en) * 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0815224B1 (en) 1995-03-10 2004-07-21 Genentech, Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
CN1192688A (zh) 1995-06-07 1998-09-09 特莱默里斯公司 联合疗法治疗hiv和其它病毒性感染
AU695934B2 (en) 1995-06-30 1998-08-27 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
JP2001502521A (ja) 1996-04-26 2001-02-27 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インターロイキン―１５の拮抗剤
CA2205757C (en) 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
EP0826696B1 (de) 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6737057B1 (en) * 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
CA2284726A1 (en) 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
DE69837170T2 (de) 1997-06-13 2007-11-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc., San Diego Festphasige native chemische Ligation von ungeschützten oder n-cystein-geschützten Peptiden in wässrigen Lösungen
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
CN1318092C (zh) 1998-04-15 2007-05-30 利思进药品公司 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物
HK1038881A1 (zh) 1998-04-17 2002-04-04 利思进药品公司 通过共同给予前列腺素抑制剂增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答
AU3655899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Regents Of The University Of California, The Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
JP2002523036A (ja) 1998-08-25 2002-07-30 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション イムノフュージンとしての新脈管形成インヒビターの発現および輸送
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4463988B2 (ja) 1998-11-06 2010-05-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子の生産方法
MXPA01006922A (es) 1999-01-07 2002-04-24 Lexigen Pharm Corp Expresion y exportacion de proteinas de anti-obesidad como proteinas de fusion en fc.
KR100773109B1 (ko) 1999-05-06 2007-11-02 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
KR20020018197A (ko) 1999-05-19 2002-03-07 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서의 인터페론-알파 단백질의 발현 및분비
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
AU781618C (en) * 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
DE60038622D1 (de) * 1999-10-20 2008-05-29 Univ Johns Hopkins Med Chimäre immunogene zusammensetzungen und dafür kodierende nukleinsäure
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
US8623373B2 (en) 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
NZ522320A (en) 2000-05-12 2007-03-30 Neose Technologies Inc In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
CZ2003214A3 (cs) 2000-06-29 2003-08-13 Merck Patent Gmbh Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
WO2002057435A2 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
JP4279554B2 (ja) 2001-02-19 2009-06-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｔ細胞エピトープの識別方法および低減された免疫原性を有する分子の製造方法
PL362324A1 (en) 2001-02-19 2004-10-18 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE10118308A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
CA2456470A1 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
CA2476934C (en) * 2002-02-27 2009-06-16 Immunex Corporation Stabilized tnfr-fc composition comprising arginine
CA2479212A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI1624891T2 (sl) * 2003-05-06 2013-09-30 Biogen Idec Hemophilia Inc. Strjevalni faktor-FC himerni proteini za zdravljenje hemofilije
US20050281829A1 (en) * 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004100882A2 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA02000746A (es) 2002-09-18
CZ304884B6 (cs) 2015-01-07
PL353344A1 (en) 2003-11-17
KR100689739B1 (ko) 2007-03-09
DE60036552T2 (de) 2008-06-26
DE60036552D1 (de) 2007-11-08
AU779388B2 (en) 2005-01-20
US7955590B2 (en) 2011-06-07
PL201664B1 (pl) 2009-04-30
CA2378866C (en) 2011-06-07
RU2248214C2 (ru) 2005-03-20
ZA200200501B (en) 2003-03-26
US8043608B2 (en) 2011-10-25
CA2378866A1 (en) 2001-02-01
NO20020255D0 (no) 2002-01-17
EP1198250B1 (en) 2007-09-26
US20050261229A1 (en) 2005-11-24
JP2003505431A (ja) 2003-02-12
SK782002A3 (en) 2003-08-05
ATE374042T1 (de) 2007-10-15
EP1198250A1 (en) 2002-04-24
WO2001007081A1 (en) 2001-02-01
EP1198250B8 (en) 2007-11-21
US20100068175A1 (en) 2010-03-18
CN1308037C (zh) 2007-04-04
ES2292457T3 (es) 2008-03-16
CN1374871A (zh) 2002-10-16
JP4764585B2 (ja) 2011-09-07
BR0012569A (pt) 2002-05-28
PT1198250E (pt) 2008-01-02
DK1198250T3 (da) 2007-12-27
AU6358300A (en) 2001-02-13
HUP0202796A2 (en) 2002-12-28
KR20020020794A (ko) 2002-03-15
NO20020255L (no) 2002-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2378866C (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AU2009326524B2 (en) Use of Flt3 ligand for strengthening immune responses in RNA immunization
KR100671036B1 (ko) 오스테오프로테게린 리간드 활성을 하향-조절하는 방법
US7118751B1 (en) DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40
US6749856B1 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US20120328640A1 (en) Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer
AU757310B2 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US7011833B1 (en) Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent
CN101260152A (zh) 负调节Osteoprotegerin配体活性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160721