PL201664B1 - Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki - Google Patents

Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki

Info

Publication number
PL201664B1
PL201664B1 PL353344A PL35334400A PL201664B1 PL 201664 B1 PL201664 B1 PL 201664B1 PL 353344 A PL353344 A PL 353344A PL 35334400 A PL35334400 A PL 35334400A PL 201664 B1 PL201664 B1 PL 201664B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antigen
fusion protein
protein
adjuvant
heavy chain
Prior art date
Application number
PL353344A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353344A1 (pl
Inventor
Stephen D. Gillies
Kin Ming Lo
John S. Wesolowski Jr
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of PL353344A1 publication Critical patent/PL353344A1/pl
Publication of PL201664B1 publication Critical patent/PL201664B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy kompozycji do wzmacniania immunogenno sci antygenów peptydowych lub bia lkowych u ssaka, która zawiera bia lko fuzyjne zawieraj ace sta ly region immunoglobulinowego ci ez- kiego lancucha, z wykluczeniem cz esci zmiennej, po laczony wi azaniem polipeptydowym z antygenem oraz bia lko fuzyjne zawieraj ace sta ly region immunoglobulinowego ciezkiego lancucha, z wyklucze- niem cz esci zmiennej, po laczony wi azaniem polipeptydowym z bialkiem adiuwantowym, gdzie immu- noglobulinowe sta le regiony pochodz a od tych samych gatunków oraz wiaza si e z receptorem Fc. Przedmiotem wynalazku jest równie z zastosowanie kompozycji wed lug wynalazku do wywarzania szczepionki do wywo lywania zwi ekszonej odpowiedzi immunologicznej u ssaka przeciwko wybranemu antygenowi. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201664 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 353344 (13) (22) Data zgłoszenia: 21.07.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
21.07.2000, PCT/US00/19816 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
01.02.2001, WO01/07081 PCT Gazette nr 05/01 (51) Int.Cl.
A61K 39/39 (2006.01) A61K 39/385 (2006.01) A61K 39/21 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01)
Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki
(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo: MERCK PATENT GmbH,Darmstadt,DE
21.07.1999,US,60/144,965 (72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: Stephen D. Gillies,Carlisle,US
17.11.2003 BUP 23/03 Kin Ming Lo,Lexington,US John S. Jr Wesolowski,Weymouth,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09 (74) Pełnomocnik:
Kamiński Zbigniew, Kancelaria Patentowa
(57) Wynalazek dotyczy kompozycji do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka, która zawiera białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z antygenem oraz białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z białkiem adiuwantowym, gdzie immunoglobulinowe stałe regiony pochodzą od tych samych gatunków oraz wiążą się z receptorem Fc. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji według wynalazku do wywarzania szczepionki do wywoływania zwiększonej odpowiedzi immunologicznej u ssaka przeciwko wybranemu antygenowi.
PL 201 664 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy kompozycji do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy kompozycji obejmujących sekwencje aminokwasowe białek fuzyjnych stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z antygenem, który jest zdolny do wywołania silniejszej odpowiedzi immunologicznej u ssaków wzglę dem samego wcze ś niej wybranego antygenu.
Rozwój szczepionek zazwyczaj koncentrował się na tworzeniu przeciwciał ochronnych zdolnych do neutralizacji czynników zakaźnych. Środki stosowane dotychczas, jako szczepionki typowo obejmowały dezaktywowane lub atenuowane mikroorganizmy (na przykład, bakterie lub wirusy), ich produkty (na przykład, toksyny), lub oczyszczone antygeny. Dzięki zastosowaniu technik nowoczesnej biologii molekularnej, a zwłaszcza klonowania genów, możliwe było przygotowanie czystszej i zdecydowanie bardziej specyficznej szczepionki. Ponadto poznanie funkcjonowania układu immunologicznego na poziomie molekularnym pozwoliła na wyodrębnienie i charakterystykę odpowiedzi immunologicznych stymulowanych czynnikami zakaźnymi. Dwa składniki układu immunologicznego uważane za konieczne do skutecznego wywoływania odpowiedzi immunologicznych obejmują: podstawowe działanie regulacyjne i cytotoksyczne limfocytów T oraz sposób, w jaki antygen jest prezentowany tym komórkom przez komórki prezentujące antygen (APC). Patrz, na przykład, W. E. Paul, wyd. (1993) Fundamentals of Immunology, Raven Press, Ltd., New York.
Typowo białko lub antygen białkowy uzyskany spoza APC (antygen egzogenny) ulega degradacji w pęcherzyku endocytowym lub endosomie (fagosomie) APC. Powstałe w wyniku degradacji fragmenty peptydowe tworzą kompleks z białkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II. Otrzymany kompleks przenoszony jest na powierzchnię komórki, gdzie jest on przedstawiany komórkom układu immunologicznego sąsiadującym z APC. Jeśli fragment peptydowy odpowiada przestrzennie wgłębieniu w cząsteczce MHC, to kompleks może być rozpoznany przez limfocyt T, u którego zachodzi ekspresja receptora limfocytu T, specyficznie wiążącego się z kompleksem. Oddziaływanie pomiędzy związaną z peptydem cząsteczką MHC klasy II i pomocniczym limfocytem T, nosi nazwę w stanie techniki limfocytu T CD4+, jest dodatkowo stabilizowane przez drugie oddział ywanie, zachodzące pomiędzy cząsteczką MHC klasy II a receptorem CD4+ powierzchni limfocytu T. W ten sposób antygen egzogenny, który jest poddany obróbce wewnątrz komórek APC jest prezentowany na powierzchni komórki poprzez cząsteczkę MHC klasy II. Kompleks MHC klasy II, w wyniku prezentacji limfocytom T CD4+, prowadzi do wydzielania przez komórki pomocnicze CD4+ cytokinaz, które stymulują limfocyty B do produkcji przeciwciał przeciwko temu peptydowi. Patrz, Paul, supra.
Szczepienie antygenem egzogennym zwykle prowadzi do wywołania odpowiedzi odpornościowej limfocytów T, w którym pośredniczy CD4, co zasadniczo prowadzi do produkcji przeciwciał. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zwykle nie ulegają stymulacji tą drogą. Oczywiste jest, że CTL są stymulowane w sytuacjach, w których antygen pochodzi z wnętrza APC (antygen endogenny), na przykład, w wyniku produkcji białek wirusowych w komórce zakażonej wirusem, lub białek specyficznych dla nowotworu w komórce nowotworowej. Faktycznie, w wielu chorobach wirusowych wytwarzanie CTL uważa się za podstawowe przy eliminowaniu komórek zakażonych wirusem, a zatem prowadzące do zwalczenia zakażenia.
W badaniach wykazano, że endogenne i egzogenne antygeny ulegają różnym procesom. Podczas syntezy powstających peptydów, część polipeptydu ulega degradacji w wyniku działania wewnątrzkomórkowego organellum zwanego proteosomem. Fragmenty wytworzone w tym procesie tworzą kompleks z nowo zsyntetyzowanymi cząsteczkami MHC klasy I, lecz nie oddziałują z cząsteczkami MHC klasy II. Tak uzyskane kompleksy MHC klasy I, zawierające antygen, przenoszone są na powierzchnię komórki. Również tutaj, limfocyty T o specyficzności względem określonego fragmentu peptydowego wiążą limfocyty T, lecz w tym przypadku, niezbędne oddziaływanie ko-receptorowe występuje pomiędzy cząsteczką MHC klasy I a cząsteczką CD8. Zgodnie z powyższym, antygen endogenny na powierzchni APC jest prezentowany limfocytom T CD8+. Pomimo, że występują pewne rodzaje limfocytów T CD8+, które nie są cytotoksyczne, limfocyty T CD8+ stanowią większość CTL.
Zgodnie z powyższym, wydaje się, że do zaprojektowania szczepionki zdolnej do wywołania wzmocnionej odpowiedzi CTL, konieczne jest, aby cząsteczka antygenowa (ogólnie białko), była bądź utworzona wewnątrz komórki lub dostarczona do odpowiedniego organellum komórkowego, aby została ona włączona do ścieżki MHC klasy I. Jedna strategia uzyskania takiej odpowiedzi polega na
PL 201 664 B1 włączeniu genu kodującego żądane białko lub peptyd do wirusa, a następnie zastosowanie zaprojektowanego wirusa jako szczepionki (Lorenz i wsp. (1999) Hum. Gene Ther. 10: 623-631). Inna strategia obejmuje iniekcję do komórki wektora DNA kodującego żądane białko, a następnie podanie komórki zwierzęciu lub pacjentowi, u którego zachodzi ekspresja w komórce tego białka, które jest następnie prezentowane na powierzchni komórki poprzez cząsteczki MHC klasy I (Donnelly i wsp. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 617). Wykazano, że prostsza technika, polegająca na iniekcji wektorów DNA bezpośrednio do mięśnia lub skóry, indukuje CTL i/lub odpowiedzi przeciwciał na kilka antygenów (Lai i wsp. (1988) Crit. Rev. Immunol. 18: 449-84 i Patent USA nr 5,589,466). Wykazano w badaniach, że antygen jest pobierany i poddawany działaniu APC, w którym jest prezentowany w układzie immunologicznym (Lai i wsp., supra).
Wprowadzenie peptydów lub białek egzogennych do drogi MHC klasy I zostało częściowo uwieńczone powodzeniem dzięki zastosowaniu chemicznych adiuwantów, takich jak adiuwant Freunda, oraz mieszanin skwalenów i detergentów (Hilgers i wsp. (1999) Vaccin. 17: 219-228), a obecnie dzięki zastosowaniu małych kulek powlekanych antygenem, który jest fagocytowany przez makrofagi i indukuje odpowiedzi CTL poprzez alternatywną drogę MHC klasy I (De Bruijn i wsp. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 1274-1285). Ponadto, inne sposoby wzmacniania odpowiedzi immunologicznych wybranym antygenem mogą obejmować zastosowanie chemicznych adiuwantów w połączeniu z rekombinantowymi cytokinami immunostymulującymi, na przykład, IL-2, IL-12, GM-CSF, i innymi. Na przykład, możliwe jest wykorzystanie przeciwciała przeciwko antygenowi resztowemu połączonego z IL-2, jako sposób połączenia tej cytokiny z antygenem białkowym, który oddziałuje chemicznie z haptenem (przeciwciałem resztkowym) (Harvill i wsp. (1996) J. Immunol. 157: 3165).
Inna technika wykorzystuje antygenizację przeciwciała, w wyniku której część zmienną regionu immunoglobulinowego zastąpiono antygenem peptydowym. Antygen peptydowy cząsteczki hybrydowej jest prezentowany APC podczas gdy rekombinantowe przeciwciało wiąże się z APC w wyniku oddziaływania z receptorami Fc na powierzchni APC (Lanza i wsp. (1993) PROC. NATL. ACAD. Sci. USA 90: 11683-11687). Podejście takie może zostać rozciągnięte przez wykorzystanie iniekcji do śledziony plazmidu DNA kodującego antygenizowany immunoglobulinowy ciężki łańcuch, w wyniku czego limfocyty B pochodzące ze śledziony uwalniają rekombinantowe przeciwciało, gdy pojawi się odpowiedni immunoglobulinowy lekki łańcuch.
Jednakże immunogenność układu dostarczania antygenu stanowi jedną z głównych technicznych problemów koniecznych do rozwiązania przy opracowywaniu nowoczesnych szczepionek. Celem przeprowadzenia szczepienia jest wywołanie silnych odpowiedzi immunologicznych. Jednak, ze względu na fakt, że układ immunologiczny gospodarza wyewoluował tak aby zwalczać bakterie i wirusy, zastosowanie bakterii i wirusów jako nośników (wektorów), prowadzi do zniszczenia nośnika informacji wraz z informacją. Ponadto, silne odpowiedzi immunologiczne występujące w wyniku podania pewnych wektorów wirusowych, na przykład wirusa krowianki czy adenowirusa, ograniczają użyteczność tych wektorów. Uważa się zatem, czy podobne problemy mogą wystąpić podczas zastosowania toksyn bakteryjnych jako wektorów białkowych. Podobnie, oparte na przeciwciałach wektory białkowe wykorzystujące regiony zmienne, które zgodnie z ich charakterystyką, nie zostały rozpoznane przez układ immunologiczny jako swoje mogą ewentualnie wywoływać odpowiedź immunologiczną. Powstaje więc wątpliwość, czy wielokrotne użycie takich cząsteczek nośnikowych może indukować anty-idiotypowe odpowiedzi i w wyniku tego wykluczać ich skuteczne zastosowanie. Zgodnie z powyższym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie szczepionki, która wywołuje silną i długotrwałą odporność przeciwko określonemu antygenowi białkowemu lub peptydowemu.
Niniejszy wynalazek jest oparty, częściowo, na odkryciu, że możliwe jest wzmocnienie immunogenności wcześniej wybranego peptydowego lub białkowego antygenu u ssaków, poprzez fuzję wybranego antygenu ze stałym regionem immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Otrzymane białko fuzyjne (określane jest również tutaj, jako antygenowe białko fuzyjne Fc lub antygenowe białko fuzyjne) lub sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko fuzyjne może następnie być podawane ssakowi w postaci szczepionki wywołując odpowiedź immunologiczną przeciwko określonemu antygenowi. Ponadto, stwierdzono, że siła i rodzaj odpowiedzi immunologicznej wywołanej przeciwko określonemu antygenowi może być modulowana przez podawanie specyficznych adiuwantów wraz z antygenowym białkiem fuzyjnym Fc lub sekwencją kwasu nukleinowego kodującą antygenowe białko fuzyjne Fc.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka, która zawiera:
PL 201 664 B1 białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z antygenem oraz białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z białkiem adiuwantowym, gdzie immunoglobulinowe stałe regiony pochodzą od tych samych gatunków oraz wiążą się z receptorem Fc.
Korzystnie kompozycja zawiera białko fuzyjne obejmujące sekwencje ludzkich immunoglobulinowych stałych regionów. W korzystnym rozwiązaniu kompozycji według wynalazku białkiem adiuwantowym jest cytokina. Korzystniej cytokina jest wybrana z grupy obejmującej interferon: gammaIFN, interleukinę: IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, czynnik martwicy nowotworu - TNF oraz czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów -GM-CSF. Zgodnie z najkorzystniejszym rozwiązaniem cytokiną jest GM-CSF.
W korzystnej kompozycji według wynalazku antygen jest wybrany z grupy obejmującej antygen błonowy specyficzny dla prostaty - PSMA, ektodomena receptora cytokiny, białko wirusowe oraz antygen specyficzny dla nowotworu.
Korzystnie każdy stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha białek fuzyjnych zawiera region zawiasowy. W innym korzystnym rozwiązaniu każdy stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha białek fuzyjnych zawiera domenę CH2 i CH3. W korzystnej kompozycji częścią immunoglobulinową każdego białka fuzyjnego jest Fc.
Inna odmiana wynalazku dotyczy zastosowania kompozycji według wynalazku do wywarzania szczepionki do wywoływania wzmocnionej odpowiedzi immunologicznej u ssaka przeciwko wybranemu antygenowi. Korzystnie wzmocnienie immunogenności następuje, gdy białko fuzyjne jest w obecności adiuwantowego białka fuzyjnego. Ponadto w korzystnym rozwiązaniu białka fuzyjne są podawane jednocześnie.
Zgodnie z wynalazkiem podaje się ssakowi sekwencję kwasu nukleinowego, na przykład, kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub kwasu rybonukleinowego (RNA), kodującego antygenowe białka fuzyjne Fc według wynalazku, który następnie ulega ekspresji w organizmie gospodarza.
Ponadto, odpowiedzi immunologiczne przeciwko określonemu antygenowi z antygenowego białka fuzyjnego Fc mogą być wzmacniane lub modulowane przez podawanie antygenowego białka fuzyjnego Fc razem z adiuwantem. Pomimo, że w realizacji wynalazku różne rodzaje adiuwantów mogą być użyteczne, na przykład, adiuwanty chemiczne, takie jak kompletny adiuwant Freunda lub oligonukleotyd zawierający niemetylowaną sekwencję CpG, zgodnie z wynalazkiem, stosowane jest drugie białko fuzyjne Fc (określane jest tutaj jako adiuwantowe białko fuzyjne Fc lub adiuwantowe białko fuzyjne) lub kwas nukleinowy kodującej takie białko fuzyjne Fc. Jako adiuwantowe białka fuzyjne Fc mogą być stosowane również białka fuzyjne obejmujące immunoglobulinowy ciężki łańcuch region połączony z resztą adiuwanta odpowiadającą zewnątrzkomórkowej domenie białka, które zwykle jest częściowo lub całkowicie związane z błoną. Przykładem może być ligand CD40, który jest połączony z resztą Fc.
Wspólne podawanie antygenu Fc i adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, zarówno jednocześnie lub jeden po drugim (na przykład, antygen Fc po którym podaje się adiuwant Fc lub adiuwant Fc po którym podaje się antygen Fc), mogą być stosowane do modulowania odpowiedzi immunologicznej, przeciwko określonemu antygenowi. Dwie klasy odpowiedzi immunologicznej, zwane Th1 i Th2, są inicjowane przez różne bodźce i zaangażowane są różne cytokiny. Odpowiedzi immunologiczne w których uczestniczy Th1 mają zwykle charakter komórkowy, podczas gdy odpowiedzi immunologiczne w których uczestniczy Th2 typowo mają charakter humoralny. Zgodnie z powyższym, odpowiedź Th1 może być użyteczna do atakowania komórek zmienionych, takich jak komórek nowotworowych lub komórek zainfekowanych wirusem, podczas gdy odpowiedź Th2 może być użyteczna do atakowania czynników zewnątrzkomórkowych, np. pasożytów. Często drogi te mogą być wykorzystane do podawania cytokin, połączonych ze stałym regionem immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, w celu stymulowania ogólnej odpowiedzi immunologicznej, lub zapoczą tkowania lub modulowania specyficznej odpowiedzi Th1 lub Th2.
Na przykład, adiuwantowe białko fuzyjne Fc obejmujące stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha połączony wiązaniem peptydowym z GM-CSF jest silnym ogólnym stymulatorem odpowiedzi immunologicznych, obejmujących obie odpowiedzi Th1 i Th2. adiuwantowe białko fuzyjne
Fc obejmujące IL-12 lub IFN-γ może być łącznie podawane w celu stymulowania odpowiedzi immunologicznej głównie komórkowej lub z udziałem Th1. W innym rozwiązaniu, adiuwantowe białko fuzyjne
PL 201 664 B1
Fc obejmujące IL-4 może być podawane w celu stymulowania odpowiedzi immunologicznej głównie humoralnej lub z udziałem Th2.
Ponadto wybór konkretnej cytokiny do adiuwantowego białka fuzyjnego Fc może wpływać na klasę przeciwciał produkowanych przeciwko określonemu antygenowi antygenowego białka fuzyjnego Fc. Na przykład, adiuwantowe białko fuzyjne Fc zawierające IL-12 może stymulować pomocnicze limfocyty T i produkcję przeciwciał klasy IgG2a. W innym rozwiązaniu, adiuwantowe białko fuzyjne zawierające IL-4 może stymulować produkcję przeciwciał klasy IgE.
Jak przedyskutowano uprzednio, w korzystnym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje podawanie antygenowego białka fuzyjnego Fc lub kwasu nukleinowego kodującego antygenowe białko fuzyjne Fc w połączeniu z adiuwantowym białkiem fuzyjnym Fc. Zastosowanie dwóch biał ek fuzyjnych, z których każde zawiera stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, umożliwia łączne dostarczenie w okreś lone miejsce obu wybranych cz ą steczek: antygenu i bia ł ka adiuwanta (na przykł ad, cytokiny) w tych samych lub podobnych rodzajach komórek u ssaków. Na przykł ad, makrofagów, limfocytów B, granulocytów i komórek dendrytycznych, w których zachodzi ekspresja receptorów Fc na powierzchni komórki. Zgodnie z powyższym, w wyniku łącznego podawania antygenu Fc i adiuwantowego białka fuzyjnego Fc zdolnych do wiązania receptorów Fc, możliwe jest dostarczenie w określone miejsce zarówno antygenu antygenowego białka fuzyjnego jak i adiuwanta z adiuwantowego białka fuzyjnego w tych samych rodzajach komórek. Adiuwant moż e nastę pnie stymulować , wzmacniać lub w inny sposób modulować odpowiedź immunologiczną w pobliżu wybranego antygenu.
W korzystnym rozwiązaniu, w wynalazku wykorzystano dwie różne formy dostarczenia cząsteczki w określone miejsce lub stężenia. Po pierwsze, wykorzystano wspólną część cząsteczki, która jest sprzężona z obydwoma cząsteczkami antygenem i adiuwantem, i jej obecność ograniczona jest do pewnych części ciała. W ten sposób efektywne lokalne stężenie antygenu w sąsiedztwie adiuwanta wzrasta. Po drugie, zgodnie z wynalazkiem antygen jest poddany obróbce i procesowi prezentacji w ukł adzie immunologicznym. Pierwszy etap nagromadzenia moż e być przeprowadzony poprzez fuzję antygenu i białkowych adiuwantów z częścią cząsteczki, prowadzącą do osiągnięcia żądanego nagromadzenia antygenu w określonych częściach ciała, które są dostępne dla układu immunologicznego. Drugi etap, ukierunkowania, może być przeprowadzony poprzez fuzję antygenowego białka z dowolną częścią cząsteczki, która wzmacnia dostarczanie lub obróbkę przez układ prezentowania antygenu.
Zgodnie z powyższym, w rozwiązaniu według wynalazku nagromadzenie antygenu osiąga się dwoma alternatywnymi drogami. W jednym sposobie tworzy się i podaje dwa różne białka fuzyjne, białko fuzyjne dostarczające antygen i białko fuzyjne dostarczające adiuwant. Druga droga obejmuje utworzenie i podawanie białka fuzyjnego zawierającego antygen, adiuwant i białko lokalizującego. Część cząsteczki Fc jest przykładem białka dostarczającego antygen i adiuwant do żądanego miejsca.
Ważną cechą stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha jest to, że inaczej niż w wybranym antygenie w antygenowym białku fuzyjnym Fc, korzystnie nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej lub wywołuje bardzo słabą odpowiedź u biorcy. Innymi słowy, w antygenowym białku fuzyjnym Fc określony antygen jest tak zaprojektowany, aby był bardziej immunogenny u biorcy niż stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Podobnie, uważa się, że adiuwantowe białko fuzyjne Fc nie powinno wywoływać odpowiedzi immunologicznej u biorcy. Immunogenność stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha może być obniżona i, w pewnych w przypadkach, eliminowana przez zastosowanie sekwencji immunoglobulinowych stałych regionów pochodzących od obecnych u gatunku biorcy lub podobnych do nich. Na przykład, stałe regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, korzystnie pochodzenia ludzkiego, są stosowane do wytworzenia białek fuzyjnych do podawania ludziom. Podobnie, jeśli biorca jest człowiekiem, białko adiuwanta w adiuwantowym białku fuzyjnym Fc również korzystnie jest pochodzenia ludzkiego. Dobór odpowiednich sekwencji aminokwasowych stałych regionów immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha i adiuwantów białkowych, bezpośrednio umożliwia optymalizację głównej odpowiedzi immunologicznej przeciwko określonemu antygenowi.
W korzystnym rozwiązaniu, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha antygenowego białka fuzyjnego Fc obejmuje immunoglobulinowy region zawiasowy i ewentualnie domenę stałego regionu immunoglobulinowego wybraną z grupy złożonej z domeny CH2, domeny CH3 i domeny CH4, lub ich połączenie. Jednakże stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, korzystnie jest pozbawiony przynajmniej domeny CH1. Ponadto, białka fuzyjne Fc według wynalazku nie mają domeny regionu zmiennego immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha (VH). Jeśli białko fuzyjne ma być podawane człowiekowi, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha korzystnie obej6
PL 201 664 B1 muje region zawiasowy i domenę CH2 lub domenę CH3, i najkorzystniej obejmuje region zawiasowy i obie domenę CH2 i domenę CH3. Uważ a się , ż e stał e regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha użyteczne w realizacji wynalazku mogą pochodzić od immunoglobulin należących do dowolnej z pięciu klas immunoglobulinowych określanych w stanie techniki jako IgA (Iga), IgD (^δ), IgE (^ε), IgG (IgY), i IgM (^μ). Jednakże, korzystne są stałe regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha z klasy IgG.
Uważa się, że dowolny określony antygen może być włączony do antygenowego białka fuzyjnego Fc według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu, określony antygen jest wybrany z grupy obejmującej błonowy antygen specyficzny dla prostaty, ektodomenę receptora cytokiny, białka wirusowe i antygen specyficzny dla nowotworu lub guza.
W realizacji wynalazku mogą być wykorzystane białka fuzyjne antygenu Fc mające różne konfiguracje. Na przykład, koniec N wybranego antygenu może być połączony wiązaniem polipeptydowym z końcem C stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. W innym rozwiązaniu, koniec C wybranego antygenu może być połączony wiązaniem polipeptydowym z końcem N stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Ponadto, uważa się, że białka fuzyjne antygenu Fc mogą zawierać wiele kopii przynajmniej jednego określonego antygenu, z których przynajmniej jeden może być połączony bezpośrednio lub przez łącznik polipeptydowy ze stałym regionem immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha lub jeśli antygenów jest więcej, mogą być one połączone wzajemnie ze sobą. Ponadto, dwa lub więcej białka fuzyjne antygenu Fc mogą być połączone razem wiązaniami niekowalencyjnymi lub kowalencyjnymi, na przykład, co najmniej jednym wiązaniem disiarczowym, tworząc dimeryczne lub multimeryczne kompozycje. Uważa się, że antygenowe białka fuzyjne Fc w konstruktach dimerycznych mogą być takie same lub różne. Na przykład, pomimo, że oba białka fuzyjne antygenu Fc mogą zawierać taki sam stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, to określony antygeny może być różny. Uważa się, że podobne konfiguracje mogą również odnosić się do adiuwantowego białka fuzyjnego Fc.
Ponadto w realizacji wynalazku mogą być stosowane różne sekwencje kwasów nukleinowych kodujących białka fuzyjne Fc. Na przykład, sekwencje kwasu nukleinowego mogą kodować, w kierunku 5' do 3', stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha i określony antygen, lub określony antygen i stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Ponadto, sekwencje kwasu nukleinowego ewentualnie mogą również obejmować sekwencję liderową lub sygnałową opartą na przykład, na sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobulinowego połączonego bezpośrednio z regionem zawiasowym stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. W korzystnym rozwiązaniu, jeśli region Fc jest oparty na sekwencjach IgG, to region Fc koduje w kierunku 5' do 3', przynajmniej immunoglobulinowy region zawiasowy (to znaczy, region zawiasowy zawierający przynajmniej jedną resztę aminokwasową cysteiny zdolną do tworzenia wiązania disiarczkowego z drugą sekwencją immunoglobulinowego regionu zawiasowego), immunoglobulinową domenę CH2 i domenę CH3. Ponadto, sekwencje kwasu nukleinowego kodujące antygenowe białka fuzyjne Fc mogą również być wbudowane do replikującego wektora ekspresji, który umożliwia ekspresję białka fuzyjnego Fc na przykład, w komórce gospodarza bakteryjnego, u biorcy, lub w obu organizmach.
Uważa się, że iniekcja sekwencji kwasu nukleinowego kodujących antygenowe białko fuzyjne Fc, w połączeniu z sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi adiuwantowe białko fuzyjne Fc, może prowadzić do wzmocnienia komórkowej odpowiedzi immunologicznej, humoralnej odpowiedzi immunologicznej, lub obu typów odpowiedzi. Sprzężona immunizacja oparta na podaniu kwasu nukleinowego i białka (to jest na podaniu antygenowego białka fuzyjnego Fc przed, podczas lub po podaniu kwasu nukleinowego kodującego antygenowe białko fuzyjne Fc) może działać synergistycznie, prowadząc do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko określonemu antygenowi w porównaniu do immunizacji tylko kwasem nukleinowym lub tylko białkiem.
Przedmiot wynalazku, jego rozwiązania i sposoby realizacji zostaną wyjaśnione w poniższym szczegółowym opisie i przedstawione na rysunku.
Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym: fig. 1A-1G przedstawiają schematycznie przykładowe białka fuzyjne Fc według jednej z realizacji wynalazku. Fig. 1A przedstawia antygen Fc lub adiuwantowe białko fuzyjne Fc, w którym stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony z końcem N antygenu lub adiuwanta 2; fig. 1B przedstawia antygen Fc lub adiuwantowe białko fuzyjne Fc, w którym stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony z końcem C antygenu lub adiuwanta 2; fig. 1C i 1D przedstawiają dimeryczne białko, w którym jeden lub oba polipeptydowe łańcuchy zawierają antygen Fc lub adiuwantowe białko fuzyjne
PL 201 664 B1
Fc; fig. 1C, przedstawia układ, w którym w przynajmniej jednym łańcuchu polipeptydowym, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony z końcem N antygenu lub adiuwanta 2, a fig. 1D, przedstawia układ, w którym stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony z końcem C antygenu lub adiuwanta 2; fig. 1E przedstawia dimeryczne białko, w którym jeden z lub oba łańcuchy polipeptydowe zawierają antygen-antygen-Fc, adiuwant-adiuwant-Fc, adiuwant-antygen-Fc lub antygen-adiuwantowe białko fuzyjne Fc; fig. 1F przedstawia dimeryczne białko fuzyjne, w którym jeden z, lub oba łańcuchy polipeptydowe zawierają antygen-adiuwant-Fc lub adiuwant-antygen-białko fuzyjne Fc; fig. 1G przedstawia dimeryczne białko fuzyjne, w którym jeden z, lub oba łańcuchy polipeptydowe zawierają antygen-adiuwant-Fc lub białko fuzyjne adiuwant-antygen-Fc.
Fig. 2A-2B stanowi schematyczne przedstawienie sekwencji DNA stosowanych w realizacji wynalazku. Fig. 2A przedstawia wektor ekspresji ludzkiego białka fuzyjnego Fc. Fig. 2B przedstawia gen kodujący białko fuzyjne odpowiedni do przeprowadzenia ekspresji mysiego białka fuzyjnego IgG 2a Fc.
Fig. 3A-3F przedstawiają graficznie wpływ adiuwantów chemicznych i Fc-cytokinowych na produkcję przeciwciał u myszy immunizowanych antygenowym białkiem fuzyjnym Fc, mysim białkiem fuzyjnym Fc ludzkiego receptora ektodermy IL-4 (Fc-IL-4R). Fig. 3A, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R i Fc-IL-2 w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA); fig. 3B, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R w buforze fosforanowym (PBS); fig. 3C, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R w CFA; fig. 3D, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R i Fc-IL-2 w PBS; fig. 3E, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R i Fc-GMCSF w CFA, fig. 3F, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych Fc-IL-4R i Fc GMCSF w PBS; fig. 3A-3F, kwadraty, romby i trójkąty przedstawiają dane uzyskane od trzech oddzielnych grup myszy. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom mierzono testem ELISA; na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Fig. 4A-4D przedstawiają graficznie wpływ immunizowania u myszy ludzkim antygenem nowotworowym, PSMA, w postaci antygenowego białka fuzyjnego Fc przy użyciu różnych ilości Fc-GMCSF jako adiuwantem; fig. 4A, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg samego białka fuzyjnego Fc PSM; fig. 4B, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 Fg Fc-PSMA i 0,05 μg FcGMCSF jako adiuwantem; fig. 4C, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg Fc-PSMA i 0,5 μg Fc-GMCSF jako adiuwantem; fig. 4D przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg Fc-PSMA i 5 μg Fc-GMCSF. Na fig. 4A-4D, kwadraty, romby i trójkąty przedstawiają dane uzyskane od trzech osobnych grup myszy.
Fig. 5A-5F przedstawiają wykresy porównujące specyficzne odpowiedzi przeciwciał na podawanie antygenu PSMA zarówno w postaci białka natywnego (5A-5C) i jako mysiego białka fuzyjnego Fc-PSM (5D-5F); fig. 5A, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg PSMA jako antygenem; fig. 5B, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg PSMA jako antygenem i 0,2 μg GMCSF jako adiuwantem; fig. 5C, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg PSMA jako antygenem i 0,5 μg Fc-GMCSF jako adiuwantem; fig. 5D, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg Fc-PSMA jako antygenem; fig. 5E, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg Fc-PSMA jako antygenem i 0,2 μg GMCSF jako adiuwantem; fig. 5F, przedstawia wyniki dla myszy immunizowanych 50 μg Fc-PSMA jako antygenem i 0,5 μg Fc-GMCSF jako adiuwantem; fig. 5A-5F, kwadraty, romby, i trójkąty przedstawiają dane uzyskane od trzech osobnych grup myszy. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA; na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Fig. 6 przedstawia wykres porównujący wpływ jednoczesnego podania adiuwanta Fc-GMCSF lub Fc-F3L z Fc-PSMA na produkcję przeciwciał przeciwko ludzkiemu PSMA. Wszystkie zwierzęta otrzymały 50 μg Fc-PSMA samego lub w połączeniu ze wskazaną cytokiną Fc jako adiuwantem. Trzy myszy badano w każdym doświadczeniu.
Fig. 7A-7B przedstawiają graficznie immunogenności białka fuzyjnego FcEpCAM u poszczególnych myszy, samego lub w połączeniu z adiuwantem Fc-GMCSF. Fig. 7A i 7B przedstawiają miana przeciwciał mierzone w odpowiednio 7 i 14 dniu po podaniu dawki przypominającej. Dawkę przypominającą podano trzy tygodnie po pierwotnej immunizacji. Na obu fig., nie zaczernione romby przedstawiają wyniki dla myszy immunizowanych podskórnie 10 μg samym FcEpCAM, a pełne trójkąty przedstawiają wyniki dla myszy immunizowanych podskórnie 10 μg Fc-EpCAM i 1 μg Fc-GMCSF jako adiuwantem. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA; na osi Y oznaczono gęstość optyczną odczytów ELISA.
PL 201 664 B1
Fig. 8A-8B przedstawiają graficznie immunogenności u myszy EpCAM-Fc (odwrócony układ regionu Fc i antygenu), które podano samo lub w połączeniu z adiuwantowym białkiem fuzyjnym Fc-GMCSF. Fig. 8A i 8B przedstawiają miana przeciwciał mierzone odpowiednio 14 dnia i 21 dnia (to znaczy, 7 dnia po podaniu dawki przypominającej) po immunizacji. Na obu fig., niewypełnione romby przedstawiają średnie miana przeciwciał u trzech myszy immunizowanych 25 μg białek fuzyjnych EpCAM-Fc, a zaciemnione trójkąty przedstawiają myszy immunizowane 25 μg EpCAM-Fe i 2,5 μg FcGMCSF jako adiuwantem. Poziomy przeciwciał przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA, na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Fig. 9 przedstawia diagram uzyskiwania wektora plazmidowego kodującego białko fuzyjne EpCAM-Fc-GMCSF. W tym przypadku antygen EpCAM łączy się z końcem aminowym stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha (region Fc), a adiuwant GM-CSF jest połączony z końcem karboksylowym regionu Fc.
Fig. 10A-10D przedstawiają graficznie miana przeciwciał u myszy, którym wstrzyknięto wektory plazmidowe kodujące białko fuzyjne Fc-EpCAM stosując jako nośnik PBS lub 25% (masa/objętość) roztwór sacharozy. Fig. 10A-10D przedstawiają miana przeciwciał oznaczone odpowiednio 14 dni, 27 dni, 55 dni i 69 dni po wstępnej iniekcji. Niewypełnione romby przedstawiają miana oznaczone u myszy, którym wstrzyknięto Fc-EpCAM kodowany przez plazmid roztworzony w PBS, a wypełnione trójkąty przedstawiają miana myszy, którym wstrzyknięto Fc-EpCAM kodowany przez plazmid roztworzony w sacharozie. Poziomy przeciwciał przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA, na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Fig. 11A-11B przedstawiają graficznie stymulację wbudowywania 3H-tymidyny w odpowiedzi na stymulację in vitro antygenem limfocytów śledzionowych wyizolowanych z myszy immunizowanych szczepionką DNA lub iniekcją białka. Fig. 11B przedstawia przybliżenie danych z dolnej części Fig. 11 A. Wypełnione romby przedstawiają limfocyty śledzionowe pobrane od myszy immunizowanych 100 μg plazmidu DNA kodującego białko fuzyjne CMV-Fc-EpCAM, niewypełnione kółka przedstawiają limfocyty śledzionowe pobrane od myszy immunizowanych 100 μg plazmidu DNA kodującego białko fuzyjne CMV-EpCAM-Fc, a krzyżyki przedstawiają limfocyty śledzionowe pobrane od myszy immunizowanych 10 μg białka Fc-EpCAM. Śledziony usunięto z myszy 70 dnia po pierwszej iniekcji plazmidu DNA lub białka i dwóch iniekcjach przypominających po 3 tygodniowych przerwach.
Fig. 12A-B przedstawiają graficznie test cytotoksycznego uśmiercania limfocytów T (CTL) przy użyciu limfocytów śledzionowych z myszy immunizowanych plazmidem DNA lub białkiem Fc-EpCAM. Fig. 12A przedstawia aktywność limfocytów śledzionowych skierowanych przeciwko mysim komórkom nowotworowym CT26 prowadzącym ekspresję ludzkiego białka EpCAM. Fig. 12B przedstawia aktywność limfocytów śledzionowych przeciwko rodzicielskim mysim komórkom nowotworowym CT26. Niewypełnione romby przedstawiają limfocyty śledzionowe immunizowane DNA niosącym konstrukt (CMV-promotor)-EpCAM, niewypełnione kwadraty przedstawiają limfocyty śledzionowe z myszy immunizowanych DNA niosącym konstrukt kodujący białko fuzyjne (CMV-promotor)-Fc-EpCAM, niewypełnione trójkąty przedstawiają limfocyty śledzionowe z myszy immunizowanych DNA niosącym konstrukt kodujący białko fuzyjne (CMV-promotor)-EpCAM-Fc i krzyżyki przedstawiają limfocyty śledzionowe z myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym Fc-EpCAM. W teście CTL stosowano limfocyty śledzionowe z immunizowanych myszy hodowanych przez pięć dni z 10 U/ml IL-2. Znakowane komórki docelowe zwieszano ze wskazanymi efektorami i inkubowano przez cztery godziny. Na podstawie uwolnionej radioaktywności obliczano procent specyficznej lizy.
Fig. 13 stanowi graf przedstawiający miana przeciwciał u myszy immunizowanych podskórnie 50 μg białka fuzyjnego Fc-MCSP w PBS samego lub w połączeniu z 5 μg Fc GMCSF jako adiuwantem. Wypełnione romby przedstawiają miana przeciwciał w normalnej surowicy krwi, niewypełnione kwadraty przedstawiają miana przeciwciał w surowicy krwi myszy immunizowanych samym białkiem fuzyjnym Fc-MCSP, a wypełnione trójkąty przedstawiają miana przeciwciał w surowicy krwi myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym Fc-MCSP w połączeniu z adiuwantowym Fc-GMCSF. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA; na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Fig. 14A-B przedstawiają graficznie miana przeciwciał u myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym Fc-gp41 pep 626, samym lub w połączeniu z Fc-cytokiną jako adiuwantem. Fig. 14A i 14B przedstawiają miana przeciwciał uzyskanych odpowiednio 7 i 33 dnia po drugiej dawce przypominającej. Niewypełnione romby przedstawiają miana przeciwciał u myszy immunizowanych przezskórną iniekcją samego antygenu 25 μg Fc-gp41 pep 626, niewypełnione kwadraty przedstawiają miana
PL 201 664 B1 u myszy immunizowanych przezskórną iniekcją antygenu 25 μ g Fcgp41pep626 w połączeniu z 2,5 μ g
Fc-GMCSF jako adiuwantem i zaciemnione trójkąty przedstawiają miana przeciwciał u myszy immunizowanych przezskórną iniekcją antygenu 25 μg Fcgp41pep626 w połączeniu z 2,5 μg adiuwanta Fc-IL2. Poziomy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi mierzono testem ELISA; na osi Y odłożono gęstość optyczną odczytów ELISA.
Wynalazek dotyczy skutecznego dostarczenia antygenów białkowych lub peptydowych in vivo indukujących odpowiedzi immunologiczne: humoralną (to znaczy, opartą na przeciwciałach) lub komórkową za pośrednictwem komórek Th2, lub za pośrednictwem komórek Th1, oraz w pewnych przypadkach, oba typy odpowiedzi immunologicznych u ssaków. Obecnie stwierdzono, że jest możliwe wzmocnienie immunogenności określonego antygenu białkowego lub peptydowego u ssaków poprzez połączenie wybranego antygenu ze stałym regionem immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, prowadzące do uzyskania antygenowego białka fuzyjnego Fc. Otrzymane antygenowe białko fuzyjne Fc, lub sekwencje kwasu nukleinowego kodującego antygenowe białko fuzyjne Fc może następnie być podawane ssakowi, na przykład człowiekowi, w postaci szczepionki wywołującej odpowiedź immunologiczną przeciwko określonemu antygenowi.
Antygenowe białko fuzyjne Fc selektywnie skierowuje antygen ku komórkom prezentującym antygen (APCs). Nie wchodząc w rozważania nad mechanizmem, uważa się, że wiązanie antygenowego białka fuzyjnego Fc z APCs zachodzi za pośrednictwem receptorów Fc, których ekspresja występuje w wielu rodzajach komórek układu immunologicznego, takich jak na przykład: komórki dendrytyczne; makrofagi; limfocyty B i granulocyty. Po podawaniu ssakowi antygenowe białko fuzyjne Fc wiąże się z receptorami Fc, po czym ulega ono endocytozie przez APCs. Uważa się, że endocytowane białko fuzyjne, obejmujące określony antygen, następnie ulega degradacji na małe peptydy, które są następnie prezentowane na powierzchni komórki. Prezentowane peptydy następnie pośredniczą w humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Określony typ stymulowanej odpowiedzi immunologicznej może być modulowany przez łączne podawanie antygenowego białka fuzyjnego Fc z adiuwantowym białkiem fuzyjnym.
Mogą być różne tryby podawania biorcy antygenowego białka fuzyjnego Fc. W jednym trybie podawania podawane jest bezpośrednio antygenowe białko fuzyjne Fc, w innym sekwencja kwasu nukleinowego kodująca antygenowe białko fuzyjne Fc. Określony antygen, zarówno przy podawaniu antygenowego białka Fc lub w wyniku ekspresji z podanego kwasu nukleinowego, jest bardziej immunogenny niż sam antygen, to znaczy, antygen nie połączony wiązaniem polipeptydowym ze stałym regionem immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Ponadto w pewnych okolicznościach, do maksymalizacji immunogenności wybranego antygenu można podawać kolejne białka fuzyjne, po których podaje się kwas nukleinowy kodujący takie samo białko fuzyjne, lub w innym rozwiązaniu, podawać kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne, po którym podaje się takie samo białko fuzyjne. Mianowicie, optymalną odpowiedź immunologiczną uzyskuje się jeśli oba składniki białka fuzyjnego antygenu Fc są aktywne. Innymi słowy, określony antygen w antygenowym białku fuzyjnym Fc jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, a stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha jest zdolny do wiązania z powierzchniowym receptorem Fc z APCs.
Ponadto, jak przedyskutowano powyżej, nasilenie i typ odpowiedzi immunologicznej wywołanej przeciwko określonemu antygenowi może być modulowana przez łączne podawanie specyficznych adiuwantów z antygenowym białkiem fuzyjnym Fc i/lub kwasem nukleinowym kodującym antygenowe białko fuzyjne Fc. Pomimo, że adiuwanty chemiczne, np., glin lub pełny lub niepełny adiuwant Freunda, znajdują zastosowanie według wynalazku w pewnych okolicznościach, na przykład w weterynarii, ich działania uboczne, takie jak bliznowacenie tkanki, mogą powodować ich niedopuszczalność w zastosowaniu u ludzi. Zgodnie z powyższym, adiuwanty według wynalazku zawierają drugie białko fuzyjne Fc, w którym stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha jest połączony z białkiem adiuwanta, dzięki czemu uzyskuje się adiuwantowe białko fuzyjne Fc. Podobnie jak w przypadku antygenowego białka fuzyjnego Fc, jest zrozumiałe, że optymalną odpowiedź immunologiczną uzyskuje się, gdy oba składniki adiuwantowego białka fuzyjnego Fc są aktywne. Innymi słowy, adiuwant w adiuwantowym białku fuzyjnym Fc jest zdolny do modulowania odpowiedzi immunologicznej, a stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha jest zdolny do wiązania z receptorem Fc na powierzchni APCs.
W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, zarówno antygen, jak i adiuwant są podawane jako białka fuzyjne Fc lub kwasy nukleinowe kodujące takie białka fuzyjne.
PL 201 664 B1
Innymi słowy, antygen jest podawany jako antygenowe białko fuzyjne Fc i adiuwant jest podawany jako adiuwantowe białko fuzyjne Fc. Pewne korzystne rozwiązania obejmujące białka fuzyjne Fc użyteczne w realizacji wynalazku przedstawiono na fig. 1A-1G.
Fig. 1A przedstawia przykładowe białko fuzyjne Fc, w którym koniec C immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha stałego regionu 1 jest połączony, bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera polipeptydowego, z końcem N wybranego antygenu lub adiuwanta 2. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie linker polipeptydowy oznacza sekwencję aminokwasową, która sprzęga dwa białka razem. Linker polipeptydowy często stanowi sekwencję aminokwasów o około 10-15 resztach obejmującą, na przykład, powtarzające się reszty glicynowe i/lub serynowe. Fig. 1B przedstawia przykładowe białko fuzyjne Fc, w którym koniec C wybranego antygenu lub adiuwanta 2 jest połączony, bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera polipeptydowego, z końcem N stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1.
Fig. 1C przedstawia dimeryczny konstrukt zawierający dwa białka fuzyjne Fc połączone kowalencyjnie za pośrednictwem dwóch wiązań disiarczkowych. Dimeryczny konstrukt obejmuje dwa białka fuzyjne Fc, w których koniec C każdego stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony z końcem N wcześniej wybranego antygenu adiuwanta 2. Podobnie, Fig. 1D przedstawia dimeryczny konstrukt zawierający dwa białka fuzyjne Fc połączone kowalencyjnie za pośrednictwem dwóch wiązań disiarczkowych. Dimeryczny konstrukt obejmuje dwa białka fuzyjne Fc w których koniec C każdego wybranego antygenu lub adiuwanta 2 jest połączony z końcem N stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1.
Fig. 1E przedstawia dimeryczny konstrukt zawierający dwa białka fuzyjne Fc połączone za pośrednictwem dwóch wiązań disiarczkowych. Dimeryczny konstrukt obejmuje dwa białka fuzyjne Fc w których koniec C każdego stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1 jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy, z końcem N określonego antygenu lub adiuwanta 2, którego koniec C jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy, z drugim antygenem lub adiuwantem 2'.
Fig. 1F przedstawia dimeryczny konstrukt zawierający dwa białka fuzyjne Fc również połączone za pośrednictwem dwóch wiązań disiarczkowych. Dimeryczny konstrukt obejmuje dwa białka fuzyjne Fc, w których koniec C antygenu lub adiuwanta 2 jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy, z końcem N stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1, którego koniec C jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy, z końcem N innego adiuwanta lub antygenu 2'. Na przykład, takie białka fuzyjne mogą obejmować, w kierunku od końca N do C, określony antygen-stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha- adjuwant.
Fig. 1G przedstawia dimeryczny konstrukt zawierający dwa białka fuzyjne Fc również połączone za pośrednictwem dwóch wiązań disiarczkowych. Dimeryczny konstrukt obejmuje dwa białka fuzyjne Fc w których koniec C antygenu lub adiuwanta 2 jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy, z końcem N innego adiuwanta lub antygenu 21, którego koniec C jest połączony, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy z końcem N stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha 1. Na przykład, takie białka fuzyjne mogą obejmować, w kierunku od końca N- do C, określony antygen-adiuwant-stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha.
W realizacji wynalazku, korzystne jest wprowadzenie części cząsteczki Fc na końcu N względem adiuwantowej części cząsteczki. Jeśli adiuwantowa część cząsteczki jest umieszczona na końcu N względem części Fc, to połączenie adiuwant-Fc może wiązać się z receptorem adiuwanta obecnym na powierzchni komórki odpornościowej, przy czym część Fc będzie w takiej samej orientacji, która występuje gdy przeciwciało wiąże się z powierzchnią komórki. Może to prowadzić do ADCC lub wiązania dopełniacza. Jednakże, jeśli część Fc jest umieszczona na końcu N adiuwantowej części, ADCC i wiązania dopełniacza nie wystąpią.
Konstrukty widoczne na fig. 1C-1G przedstawiono jako dimery usieciowane parą wiązań disiarczkowych pomiędzy resztami cysteininowymi z sąsiadujących regionów zawiasowych. Na rysunku mostki disiarczkowe przedstawiono jako połączenie dwóch stałych regionów immunoglobulinowych ciężkich łańcuchów przez region zawiasowy charakterystyczny dla naturalnych postaci tych cząsteczek. Korzystne są konstrukty obejmujące immunoglobulinowe regiony zawiasowe, jednak jeśli to byłoby wskazane wynalazek obejmuje również sieciowanie w innych pozycjach. Ponadto, w pewnych przypadkach, dwa lub więcej monomery mogą łączyć się wiązaniami niekowalencyjnymi, tworząc dimery lub multimery według wynalazku.
PL 201 664 B1
Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha jest stosowane wymiennie z określeniem region Fc i oznacza karboksylową końcową część stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, lub jego analogu lub części zdolnej do wiązania z receptorem Fc. Jak wiadomo, każdy stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha obejmuje cztery lub pięć domen. Domeny zostały nazwane kolejno następująco: CH1-zawiasCH2-CH3(-CH4). Domena CH4 jest obecna w IgM, która nie ma regionu zawiasowego. Stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, który jest stosowany w rozwiązaniu według wynalazku korzystnie obejmuje immunoglobulinowy region zawiasowy i korzystnie również obejmuje domenę CH3. Stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha najkorzystniej obejmuje immunoglobulinowy region zawiasowy, domenę CH2 i domenę CH3. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie immunoglobulinowy region zawiasowy oznacza cały immunoglobulinowy region zawiasowy lub przynajmniej część immunoglobulinowego regionu zawiasowego wystarczającą do utworzenia co najmniej jedno wiązania disiarczkowego z drugim immunoglobulinowym regionem zawiasowym.
Uważa się, że odpowiednie stałe regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha mogą pochodzić od przeciwciał należących do każdej z immunoglobulinowych klas określanych jako IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, jednakże, korzystne są stałe regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha z klasy IgG. Ponadto, uważa się, że stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha może pochodzić z przeciwciała z dowolnej podklasy IgG, określanych w stanie techniki jako IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.
Domeny stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha wykazują homologię pomiędzy poszczególnymi klasami immunoglobulin. Na przykład, domena CH2 IgG jest homologiczna z domeną CH2 IgA i IgD, i z domeną CH3 IgM i IgE. Korzystne stałe regiony immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha obejmują białkowe domeny odpowiadające regionowi CH2 i regionowi CH3 IgG, lub ich funkcjonalnej części lub ich pochodnej. Jednakże, korzystnie stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, jest pozbawiony domeny CH1. Ponadto, antygen Fc lub adiuwantowe białka fuzyjne Fc nie zawierają immunoglobulinowego zmiennego regionu. W bardziej korzystnym rozwiązaniu, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha zawiera, w kierunku od końca N do C, immunoglobulinowy region zawiasowy, domenę CH2 i domenę CH3 z których wszystkie są oparte na sekwencjach cząsteczki IgG. Wybór odpowiedniego stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha przedyskutowano szczegółowo w opisach patentów US nr 5,541,087, i 5,726,044. Dobranie poszczególnych sekwencji stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha z pewnych klas i podklas immunoglobulin, tak aby uzyskać żądane białko fuzyjne, jest w zakresie wiedzy z dziedziny.
W pewnych okolicznościach może być wskazane zmodyfikowanie stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, na przykład, przez mutację, delecję lub inne zmiany stosowane w inżynierii genetycznej lub innych rozwiązaniach tak, aby wyeliminować lub ograniczyć pewne aktywności, takie jak wiązanie dopełniacza lub stymulacja odpornościowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał, w której pośredniczą komórki (ADCC). Jednakże uważa się za konieczne utrzymanie zdolności stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha do wiązania z receptorem Fc.
W rozwiązaniu według wynalazku, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha będący składnikiem antygenowego białka fuzyjnego Fc lub adiuwantowego białka fuzyjnego Fc korzystnie jest nieimmunogenny lub jest słabo immunogenny u biorcy. Region Fc jest uważany za słabo immunogenny lub nieimmunogenny, jeśli stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha nie może wytwarzać wykrywalnych przeciwciał w odpowiedzi skierowanej przeciwko stałemu regionowi immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Zgodnie z powyższym, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha powinien być uzyskany z immunoglobulin obecnych u biorcy, lub oparty na sekwencjach aminokwasowych odpowiadających immunoglobulinom obecnym u takich samych gatunków jak biorca białka fuzyjnego. Innymi słowy, jeśli konstrukt fuzyjny Fc (antygen Fc i/lub adiuwantowe białko fuzyjne Fc) ma być podany człowiekowi, powinny być stosowane sekwencje ludzkiego stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha. Nukleotydowe i aminokwasowe sekwencje ludzkiego Fc IgG ujawniono, na przykład, w pracy Ellizona i wsp. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 40714079. Podobnie, powinny być stosowane mysie sekwencje Fc jeśli białko fuzyjne Fc ma być podawane myszom. Nukleotydowe i aminokwasowe sekwencje mysie Fc IgG2a ujawniono, na przykład, w pracy Bourgoisa i wsp. (1974) Eur. J. Biochem. 43: 423-435. Takie samo rozumowanie należy zastosować, gdy białka fuzyjne Fc będą podawane innym zwierzętom, np. zwierzętom domowym, na przykład, kotom i psom, jak i zwierzętom gospodarskim, na przykład, krowom i koniom.
Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie wybrany/określony antygen oznacza dowolne białko lub jego fragment, lub polipeptyd który, sam lub w połączeniu z innymi czynnikami, jest zdolny
PL 201 664 B1 do wywołania odpowiedzi immunologicznej u ssaka. Uważa się, że każdy określony antygen może być częścią antygenowego białka fuzyjnego Fc według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu, określony antygen jest wybrany z grupy złożonej z błonowego antygenu specyficznego dla prostaty (PSMA); ektodomeny receptora cytokiny, na przykład, ektodomeny ludzkiego receptora IL-4; antygenu specyficznego dla guza (na przykład, antygenu, którego ekspresja jest podwyższona lub w inny sposób jego poziom w komórce guza jest wyższy w porównaniu do poziomu w normalnej komórce) i białka wirusowego, na przykład, białka kodowanego przez genom ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie adiuwant oznacza dowolną substancję, która jest zdolna do działania jako immunomodulator, przez na przykład, wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej (zarówno humoralnej jak i komórkowej) przeciwko określonemu antygenowi. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie odporność humoralna oznacza odporność, w której pośredniczą przeciwciała obecne w płynach ciała, na przykład, w osoczu krwi lub limfie, podczas gdy określenie odporność komórkowa, również znane w stanie techniki jako odporność, w której uczestniczą komórki oznacza odpowiedzi immunologiczne inicjowane przez limfocyty T, w których pośredniczą efektorowe limfocyty T i/lub makrofagi.
Jak przedyskutowano uprzednio, różne rodzaje adiuwantów chemicznych, na przykład, kompletny adiuwant Freunda, mogą być stosowane do immunizowania ssaków, poza ludźmi. Pomimo, że adiuwanty chemiczne są szeroko stosowane u zwierząt do wytworzenia wysokich mian przeciwciał lub wysoce cytotoksycznych odpowiedzi limfocytów T (CTL), ich działania uboczne, na przykład, bliznowacenie tkanki, powoduje, że są niedopuszczalne do użycia u ludzi. Dlatego istnieje potrzeba indukowania silnych odpowiedzi immunologicznych, bez towarzyszących im stanów zapalnych w miejscu iniekcji. Zdecydowaną korzyścią osiąganą dzięki zastosowaniu adiuwantowego białka fuzyjnego Fc według wynalazku, jest zdolność do wywołania silnych odpowiedzi immunologicznych bez konieczności stosowania chemicznych adiuwantów takich jak adiuwant Freunda.
Korzystne adiuwanty użyteczne według wynalazku obejmują adiuwantowe białko fuzyjne Fc lub kwas nukleinowy kodujący to białko. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie cytokina oznacza dowolne białko lub analog peptydu lub jego funkcjonalny fragment, który jest zdolny do modulowania aktywności komórek układu immunologicznego u ssaków, na przykład: limfocytów T; limfocytów B; makrofagów; neutrofili; eozynofili; bazofili; komórek dendrytycznych; i ich prekursorów. Korzystne cytokiny obejmują, na przykład, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF, i GMCSF. Również korzystnym białkiem, które może być połączone z Fc, aby utworzyć adiuwantowe Fc, jest zewnątrzkomórkowa domena ligandu CD40. Podawany z adiuwantem Fc, antygen, w antygenowym białku fuzyjnym Fc, może wywoływać odpowiedź immunologiczną, silniejszą niż gdy antygenowe białko fuzyjne Fc jest podawane bez adiuwantowego białka fuzyjnego Fc. W pewnych przypadkach, poziom przeciwciała osiągany po tylko dwóch immunizacjach antygenem Fc z adiuwantem Fc jest równie wysoki lub nawet wyższy niż poziom uzyskany z adiuwantem Freunda, lecz bez wykrywalnych reakcji skórnych.
Podobnie jak w przypadku stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha antygenu Fc lub adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, białko adiuwantowe korzystnie jest nieimmunogenne lub tylko słabo immunogenne u biorcy. Osiąga się to przez zastosowanie w adiuwantowym białku fuzyjnym Fc, cytokiny zdefiniowanej przez sekwencje aminokwasowe odpowiadające cytokinie pochodzącej z tego samego gatunku co biorca. Na przykład, jeśli adiuwantowe białko fuzyjne Fc ma być podawane człowiekowi, białko adiuwanta (na przykład, cytokina) korzystnie jest pochodzenia ludzkiego.
Łączne podawanie antygenu Fc i adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, jednocześnie lub kolejno, jest stosowane według wynalazku do modulowania odpowiedzi immunologicznej, która jest stymulowana przeciwko określonemu antygenowi. Dwie klasy odpowiedzi immunologicznej, określone Th1 i Th2, są stymulowane w odpowiedzi na różne typy infekcji i zaangażowane są różne cytokiny. Odpowiedzi immunologiczne z udziałem Th1 zwykle mają charakter komórkowy, podczas gdy Th2 pośredniczy w odpowiedziach immunologicznych typowo mających charakter humoralny. Zgodnie z powyższym, odpowiedź Th1 może być użyteczna do atakowania zmienionych komórek, takich jak komórki guza lub komórki zakażone wirusem, podczas gdy odpowiedź Th2 może być użyteczna do atakowania zewnątrzkomórkowych czynników takich jak pasożyty. Często pożądane jest podawanie cytokin, w połączeniu ze stałymi regionami immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, aby stymulować ogólną odpowiedź immunologiczną, lub aby zapoczątkować lub modulować specyficzne odpowiedzi Th1 lub Th2.
Ponadto, wybór konkretnej cytokiny do adiuwantowego białka fuzyjnego Fc może wpływać na klasę przeciwciała produkowanego przeciwko określonemu antygenowi w antygenowym białku fuzyjnym Fc. Na przykład, Fc-IL12 stymuluje odpowiedź pomocniczych limfocytów T poprzez stymulowanie
PL 201 664 B1 produkcji tzw. cytokin Th1, na przykład, IFN-y, IL-2, i TNF, które w znacznym stopniu wzmacniają odporność komórkową i produkcję przeciwciał klasy IgG2a. Przeciwnie, Fc-IL-4 stymuluje produkcję cytokin Th2, na przykład, IL-5, IL-6, IL-10, i IL-4, które wzmacniają odporność humoralną.
Zgodnie z wynalazkiem podaje się antygenowe białko fuzyjne Fc lub kwas nukleinowy kodujący antygenowe białko fuzyjne Fc w połączeniu z adiuwantowym białkiem fuzyjnym Fc. Dzięki zastosowaniu dwóch białek fuzyjnych, z których każde zawiera stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, możliwe jest równoczesne dostarczenie określonego antygenu, jak i białka adiuwanta (na przykład, cytokiny) w tych samych lub podobnych rodzajach komórek u ssaków, na przykład, makrofagach, limfocytach B, granulocytach i komórkach dendrytycznych, w których zachodzi ekspresja receptorów Fc na powierzchni komórki. Zgodnie z powyższym, dzięki łącznemu podaniu antygenu Fc i adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, zdolnych do wiązania z receptorem Fc, uzyskuje się jednoczesne umieszczenie antygenu z antygenowego białka fuzyjnego adiuwanta z adiuwantowego białka fuzyjnego, w tych samych przedziałach komórkowych APCs. Adiuwant może następnie wzmacniać lub w inny sposób modulować odpowiedź immunologiczną w pobliż u wybranego antygenu.
Połączenia Fc-cytokin mogą również być stosowane w sposób synergistyczny, w celu stymulowania ogólnej odpowiedzi immunologicznej, a następnie wpływać na odpowiedź, bez względu na jej rodzaj, czy komórkową (Th1), czy humoralną (Th2). Na przykład, Fc-GMCSF jest silnym ogólnym stymulatorem odpowiedzi immunologicznych. Jednakże, w celu uzyskania modulowania komórkowej odpowiedzi odpornościowej lub odpowiedzi z udziałem Th1, łącznie z Fc-GMCSF może być podawane na przykład białko adiuwantowe Fc-IL12 lub Fc-IFNy. Chcąc wzmocnić bardziej odpowiedź humoralną lub odpowiedzi z udziałem Th2, z Fc GMCSF może być łącznie podawane na przykład białko adiuwanta Fc-IL4, które umożliwi wzmacnianie odpowiedzi, w której uczestniczy wytwarzanie komórek Th2. Również inne cytokiny wpływające korzystnie na Th1 lub Th2, mogą być zastosowane stosowane jako białka fuzyjne z Fc, w zależności od typu żądanej odpowiedzi fizjologicznej. Uważa się, że to ogólne podejście może również być stosowane do modulowania istniejących odpowiedzi patogennych takich jak autoodporność (choroba w której pośredniczy Th1) i alergia (choroba w której pośredniczy Th2) dzięki wzmocnieniu odpowiedzi na określony antygen, a osłabienie niepożądanych odpowiedzi przez immunizowanie z uzyskaniem nowej odpowiedzi innego typu Th.
W pewnych okolicznościach, do immunizowania zwierzęcia antygenowym białkiem fuzyjnym Fc, stosuje się jako adiuwanty kwasy nukleinowe. Kwasy nukleinowe, takie jak na przykład, oligonkleotydy zawierające sekwencję wzbogaconą o cytozynę połączoną wiązaniem fosfodiestrowym z guanozyną (CpG) mogą wzmocnić odpowiedź immunologiczną, w której bierze udział Th1 i ewentualnie mogą być stosowane w połączeniu z innymi adiuwantami takimi jak cytokiny (patrz, na przykład, Brazolot i wsp. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 15553-8; Liu I Wsp. (1998) Blood 92: 3730-6; i Klinman i wsp. (1997) Immunol. 158: 3635-3639). Zgodnie z powyższym, uważa się, że oligonkleotydy zawierające CpG mogą być podawane łącznie z białkiem fuzyjnym antygen-Fc, aby osiągnąć wzmocnienie i odpowiednio zmodulowaną odpowiedź immunologiczną. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego mogą mieć dowolną długość, jednakże korzystne są nukleotydy dłuższe niż 8 nukleotydów. Sekwencje kwasu nukleinowego korzystnie zawierają sekwencję CpG, a korzystniej sekwencję puryna-puryna-C-Gpirymydyna-pirymydyna, w której cytozyny po środkowym CpG są niemetylowane. Częstość dinukleotydów CpG w DNA adiuwanta wynosi korzystnie przynajmniej około 5%, a korzystniej około 10%. Na przykład jako adiuwant może być stosowana oligodezoksynukleotyd TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ. ID NO. 22) w postaci podwójnej nici. W zależności od typu żądanej odpowiedzi immunologicznej, może być wskazane połączenie kwasu nukleinowego z glinem.
Według wynalazku do wytwarzania białek fuzyjnych Fc stosuje się tradycyjne sposoby rekombinacji DNA. Konstrukty kodujące białka fuzyjne Fc korzystnie są wytwarzane na poziomie DNA i otrzymane cząsteczki DNA są wprowadzane do wektorów ekspresyjnych, po czym prowadzi się ekspresję tych wektorów otrzymując białka fuzyjne antygen-Fc lub adiuwant-Fc według wynalazku. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie wektor oznacza dowolny kwas nukleinowy obejmujący kompetentną sekwencję nukleotydową, odpowiednią do wprowadzenia do komórki gospodarza, rekombinacji i włączenia do genomu komórki gospodarza, lub do autonomicznej replikacji jako epizom. Takie wektory obejmują liniowe kwasy nukleinowe, plazmidy, plazmidy fagowe, kosmidy, wektory RNA, wektory wirusowe i tym podobne. Przykładami wirusowych wektorów mogą być między innymi retrowirus, adenowirus i skojarzony adenowirus. Jak stosowano w niniejszym opisie, określenie gen umożliwiający ekspresję lub ekspresja białka fuzyjnego Fc, oznacza transkrypcję sekwencji DNA, translację transkryptu mRNA i wyodrębnienie białka fuzyjnego Fc jako produktu. Stosując układy ekspresyjne przed14
PL 201 664 B1 stawione powyżej, przeprowadzono ekspresję białek fuzyjnych Fc, z których każde obejmuje IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, bIG-H3, receptor IgE, PSMA, lub gp120. Takie same lub podobne konstrukty ekspresyjne przedstawiono w opisach patentów USA nr 5,541,087 i 5,726,044.
Innym rozwiązaniem niż łączenie białek technikami inżynierii genetycznej, jest tworzenie wiązań na zasadzie chemicznej, przy użyciu tradycyjnych chemicznych środków sieciujących.
Podstawowe wektory, które stosuje się według wynalazku obejmują: marker selekcyjny, na przykład, gen kodujący reduktazę dihydrofolanową (DHFR), regulowany przez transkrypcyjne sekwencje regulatorowe, pochodzące, na przykład, z wirusa SV40, i bakteryjne sekwencje plazmidowe do selekcji i utrzymywania plazmidu w E. coli. Ekspresję sekwencji białka fuzyjnego Fc prowadzi się pod kontrolą promotora i ewentualnie sekwencji wzmacniających, na przykład, promotor cytomegalowirusa (CMV) i sekwencji enhancera.
Jeśli białko fuzyjne Fc lub kwas nukleinowy kodujący takie białko fuzyjne mają być podawane ludziom, to sekwencje kodujące białko fuzyjne Fc korzystnie rozpoczynają się w kierunku 5' do 3' „sekwencją liderową pochodzącą na przykład, z lekkiego (L) łańcucha przeciwciała połączonego w ramce z przynajmniej częścią immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha lub jego zmutowaną postacią, korzystnie od regionu Fcy1 ludzkiego genu g 1 kodującego immunoglobulinę. Region Fcy1 genu kodującego immunoglobulinę Fcy1 korzystnie obejmuje przynajmniej część domeny zawiasowej i domeny CH3, korzystniej obejmuje przynajmniej domenę zawiasową i domenę CH3. Jeśli białko fuzyjne ma być podawane myszy, korzystne sekwencje nukleotydowe kodujące stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha obejmują sekwencję nukleotydową kodującą w kierunku 5' do 3' region zawiasowy, domenę CH2 i domenę CH3 mysiego przeciwciała IgG2a. Koniec karboksylowy stałego regionu immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, jeśli jest to konieczne, jest zmodyfikowany na poziomie kwasu nukleinowego, aby umożliwić ligację w ramce z sekwencjami kodującymi określony antygen (w przypadku antygenu Fc) lub immunostymulującą cytokinę (w przypadku adiuwantowej cytokiny Fc). DNA kodujące kasetę wydzielniczą może być włączony do genomu lub mieć postać cDNA.
Część DNA kodującego sekwencję sygnałową, korzystnie koduje segment peptydu, który kieruje wydzieleniem białka fuzyjnego Fc. Peptyd ten jest następnie odcinany od pozostałego białka fuzyjnego Fc. Sekwencją sygnałową wynalazku jest polinukleotyd, który koduje sekwencję aminokwasową inicjującą transport białka przez błonę retikulum endoplazmatycznego. Sekwencje sygnałowe według wynalazku obejmują sekwencje sygnałowe lekkiego łańcucha przeciwciała, np. przeciwciało 14.18 (Gillies i wsp. (1989) J. of Immunol. Meth., 125: 191), sekwencje sygnałowe ciężkiego łańcucha przeciwciała, np. sekwencja sygnałowa ciężkiego łańcucha przeciwciała MOPC 141 (Sakano i wsp. (1980) Nature 286: 5774) i wszystkie inne sekwencje sygnałowe, znane w stanie techniki (patrz, na przykład, Watson (1984) Nucleic Acids Research 12: 5145).
Sekwencje sygnałowe zostały dobrze scharakteryzowane w stanie techniki i wiadomo, ze typowo zawierają 16 do 30 reszt aminokwasowych, lecz mogą zawierać więcej lub mniej reszt aminokwasowych. Typowy peptyd sygnałowy zawiera trzy regiony: zasadowy region na końcu N, środkowy hydrofobowy region i bardziej polarny region C-końcowy. Środkowy hydrofobowy region zawiera 4 do 12 reszt hydrofobowych, które utrzymują peptyd sygnałowy w dwuwarstwie lipidowej podczas transportu powstającego polipeptydu. Po inicjacji, peptyd sygnałowy zwykle jest odcinany wewnątrz retikulum endoplazmatycznego przez enzymy komórkowe znane jako peptydazy sygnałowe. Możliwe miejsca cięcia peptydu sygnałowego ogólnie spełniają zasadę (-3,-1) . Zatem typowy peptyd sygnałowy ma małe, obojętne reszty aminokwasowe w pozycjach -1 i -3, i nie ma reszty prolinowej w tym regionie. Peptydaza sygnałowa będzie cięła taki peptyd sygnałowy pomiędzy aminokwasami -1 a +1. Zatem, sekwencja sygnałowa może być odcinana od końca aminowego białka fuzyjnego podczas wydzielania białka. Uzyskuje się w ten sposób wydzielanie białka fuzyjnego Fc. Sekwencje peptydów sygnałowych według wynalazku są dobrze znane w stanie techniki. Patrz, na przykład, von Heijne (1986) Nucleid Acids Res. 14: 4683.
Zgodnie z wiedzą specjalisty w stanie techniki, zastosowanie konkretnej sekwencji sygnałowej w kasecie wydzielniczej może wymagać pewnych rutynowych doświadczeń. Doświadczenia te mogą obejmować określenie zdolności sekwencji sygnałowej do kierowania wydzieleniem białka fuzyjnego Fc i/lub określenie optymalnej konfiguracji, genomowego lub cDNA sekwencji stosowanej w celu osiągnięcia skutecznego wydzielenia białek fuzyjnych Fc. Dodatkowo, specjalista w stanie będzie umiał opracować syntetyczny peptyd sygnałowy, zgodnie z zasadami zaprezentowanymi przez von Heijne'a, cytowanego powyżej, i zbadać jego sekwencję pod względem skuteczności w rutynowych doświadPL 201 664 B1 czeniach. Określenia sekwencja sygnałowa, peptyd sygnałowy, sekwencja lidera lub peptydy liderowe są stosowane wymiennie.
Uważa się, że wiele różnych sposobów podawania białek fuzyjnych Fc lub sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko fuzyjne może być stosowanych do immunizowania biorcy przeciwko określonemu antygenowi. Zastosowanie niniejszego wynalazku można prowadzić w celu wytworzenia odpowiedzi CTL, przez iniekcję DNA kodującego antygenowe białko fuzyjne Fc, albo przez podawanie antygenowego białka fuzyjnego Fc odpowiedniego do wprowadzenia białka w ścieżkę MHC klasy I.
W celu wywołania odpowiedzi immunologicznej u ssaków typowo stosowana jest iniekcja antygenów białkowych. Jednakże, wynalazek również przedstawia sposoby dostarczania antygenu APCs przez iniekcję DNA. Szeroko stosowane techniki obejmują iniekcję domięśniową wektorów ekspresyjnych DNA, kodujących białko antygenowe. W publikacjach sugeruje się, ze antygen białkowy ulega ekspresji w komórkach mięśnia, ale nie jest prezentowany układowi immunologicznemu przez te komórki. Natomiast, uważa się, że wyspecjalizowane APCs, na przykład, makrofagi i komórki dendrytyczne, migrują do miejsca iniekcji, zbierają i prezentują antygen w procesie, który jeszcze nie został rozpoznany. Zastosowanie wektorów ekspresyjnych kodujących antygenowe białko fuzyjnego Fc czynią ten proces bardziej skutecznym ze względu na to, że wydzielane białko fuzyjne wiąże się bardziej skutecznie z APCs niż naturalne białko antygenowe.
Konsekwencją sposobu iniekcji DNA jest to, że często może prowadzić do wytworzenia obu odpowiedzi, humoralnej i komórkowej. Typowo, białka podawane egzogenicznie mają trudniejsze dostanie się do ścieżki prezentującej je cząsteczkom MHC klasy I. Jednakże, podawanie białek fuzyjnych Fc według wynalazku wzmacnia wytwarzanie komórek cytotoksycznych, podobnie jak w wyniku prezentacji określonego, egzogennego antygenu komórkom MHC klasy I. Połączenie immunizacji przez DNA i immunizacji przez białko również może działać synergistycznie na układ immunologiczny pierwszego rzędu, w wyniku tego można uzyskać wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej w postaci zarówno produkcji przeciwciał jak i cytotoksycznych odpowiedzi komórkowych. Łącznie podawanie adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, na przykład, ligandu Fc-IL-2, Fc GMCSF, Fc-IL-12, i Fc-Flt3, z antygenowym białkiem fuzyjnym Fc, zapewnia jednoczesne dostarczenie białek fuzyjnych do tych samych przedziałów komórkowych APCs, przez co stymuluje się silniejszą odpowiedź immunologiczną przeciwko określonemu antygenowi.
Kompozycje według niniejszego wynalazku (to znaczy, antygen Fc i/lub adiuwantowe białka fuzyjne Fc, lub sekwencje kwasu nukleinowego kodujące takie białka fuzyjne) mogą być dostarczone zwierzęciu odpowiednimi środkami, bezpośrednio (np., lokalnie, przez iniekcję, wszczepienie lub miejscowe podawanie domiejscowe do tkanki) lub ogólnoustrojowo (np., pozajelitowo lub doustnie). Gdy kompozycja ma być dostarczona pozajelitowo lub doustnie, np. dożylnie, podskórnie, do gałki ocznej, śródotrzewnowo, domięśniowego, dopoliczkowo, doodbytniczo, dopochwowo, dooczodołowo, przezskórnie, śródmózgowo, wewnątrzczaszkowo, dordzeniowo, dokomorowo, dooponowo, dopotylicznie, dowęwnątrztorebkowo, donosowo lub ma być podawana w aerozolu, kompozycja korzystnie stanowi wodną lub dostosowaną fizjologicznie zawiesinę lub roztwór. Nośnik lub zaróbka jest dopuszczalny fizjologicznie tak, że oprócz dostarczenia zadanej kompozycji pacjentowi, nie działa w inny, niekorzystny sposób, na elektrolit pacjenta i/lub bilans płynów ustrojowych. Nośnik płynny może zatem stanowić normalny roztwór soli fizjologicznej (np., 9,85% wodny roztwór NaCl, 0,15M, pH 7-7,4).
Korzystne dawki antygenowego białka fuzyjnego Fc są w zakresie od 50 ng/m2 do 1 g/m2, korzystniej od 5 μg/m2 do 200 mg/m2, a najkorzystniej od 0,1 mg/m2 do 50 mg/m2. Korzystne dawki adiuwantowego białka fuzyjnego Fc wynoszą od 1 ng/m2 do 0,1 g/m2, korzystniej 0,5 μg/m2 do 20 mg/m2, a najkorzystniej 10 μg/m2 do 5 mg/m2. Korzystne dawki kwasów nukleinowych kodujących antygen Fc lub adiuwantowe białka fuzyjne Fc są w zakresie od 1 μg/m2 do 100 mg/m2, korzystniej od 20 μg/m2 do 10 mg/m2, a najkorzystniej od 400 μg/m2 do 4 mg/m2.
Uważa się, że maksymalną immunizację można uzyskać dzięki przeprowadzeniu wielu osobnych immunizacji, na przykład, jednej do trzech szczepień oddalonych o około 3 tygodnie do sześciu miesięcy. Ponadto, jak przedyskutowano powyżej, maksymalne odpowiedzi immunologiczne mogą być uzyskane czasami poprzez zamienne podawanie białek fuzyjnych Fc i kwasów nukleinowych kodujących takie białka fuzyjne Fc. Uważa się, że antygenowe białko fuzyjne Fc lub kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne może być podawany przed, jednocześnie z, lub po podanym ssakowi adiuwantowym białku fuzyjnym Fc lub kwasie nukleinowym kodującym adiuwantowe białko fuzyjne Fc. Uważa się, jednakże, że optymalne tryby podawania, dawkowania i zwiększenia są łatwe do określenia w rutynowych doświadczeniach, zgodnie z poziomem wiedzy specjalisty z dziedziny.
PL 201 664 B1
Wynalazek przedstawiono na następujących przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d I
Konstrukcja wektorów ekspresyjnych antygenu Fc i adiuwanta Fc
W celu właściwego zbadania immunogenności białek fuzyjnych Fc na mysim modelu, skonstruowano wektory ekspresyjne stosując sekwencje kwasu nukleinowego kodujące mysie regiony Fc IgG2a. To obniża ryzyko, że region Fc każdego z białek fuzyjnych wywoła odpowiedź immunologiczną u muszy. Ponadto, w adiuwantowych konstruktach fuzyjnych Fc jako część białka fuzyjnego zastosowano mysie cytokiny, które ze względu na swoją aktywność biologiczną mogą być bardzo specyficzne względem gatunku. Zatem, wektory opisane wcześniej (Lo i wsp. (1998) Protein Engineering 11: 495500) zmodyfikowano (patrz Fig. 2) przez zastąpienie ludzkiej sekwencji Fc IgGI sekwencją cDNA kodującego mysi IgG2a Fc (Opis patentowy US nr. 5,726,044).
Sekwencję mysiego IgG2a Fc sklonowano z biblioteki z mysich komórek śledziony techniką amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Startery PCR zawierały sekwencje dostosowawcze do łączenia sekwencji liderowej na końcu 5' i pojedyncze miejca cięcia Sma I/Xma I na końcu 3' do ligacji z sekwencjami kodującymi antygeny lub cytokinę adiuwantową. Sekwencje antygenu i adiuwanta (cytokina) otrzymywano z miejscem cięcia 5'Sma I i utrzymywano ramki odczytu pomiędzy Fc a antygenem lub białkowymi adiuwantami, podczas gdy pojedyncze miejsce cięcia Xho I umieszczono tuż po sygnale terminacji translacji.
Otrzymany konstrukt DNA kodował sekwencję liderową lekkiego łańcucha połączoną bezpośrednio z regionem zawiasowym mysiego łańcucha IgG2a H i obejmował mysie egzony IgG2a CH2 i CH3 i element fuzyjny (antygen lub cytokina adiuwantowa). Transkrypcją kierował promotor/enhancer CMV, który jak stwierdzono jest odpowiedni do uzyskania ekspresji w większości rodzajów komórek hodowlanych, jak i do ekspresji w komórkach mięśnia oraz innych rodzajach komórek in vivo w wyniku iniekcji DNA. Aby ułatwić selekcję stabilnie transfekowanych klonów do każdego wektora wprowadzono gen kodujący selekcyjny markera reduktazy dihydrofolanowej (DHFR), podobnie jak sekwencje konieczne do utrzymywania plazmidu DNA w E. coli.
Poniżej przedstawiono przykładowe konstrukty kodujące antygen Fc, utworzone przez wprowadzenie odpowiednio dostosowanych sekwencji w pojedyncze miejsca cięcia Sma I i Xho I w wektorze nazwanym pdCs-muFc, gdzie mu wskazuje, że Fc pochodzi od myszy.
Ektodomenę (część zewnątrzkomórkową) ludzkiego receptora IL4 (IL-4R) sklonowano z ludzkich obwodowych jednojądrowych komórek krwi (PBMC) stosując amplifikację PCR. Aby wprowadzić ten gen do wektora pdCs-muFc, zastosowano następujące startery: 5'GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC (SEQ ID NO: 1) i 5'CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG (SEQ ID NO: 2), które zawierały odpowiednio miejsca cięcia Sma I i Xho I. Warunki reakcji PCR w tym i poniższych klonowaniach, podano poniżej. Do amplifikacji żądanych genu(ów) stosowano mieszaninę polimerazy: Advantage KlenTaa i Polimerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA) i specyficzne startery. Mieszaniny reakcyjne zawierały 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% żelatynę (wag./obj.), 0,2 mM każdego z dNTP i 1,25 jednostek KlenTaq w całkowitej objętości 100 ml. Przeprowadzano trzydzieści cykli PCR, każdy cykl złożony z denaturacji cieplnej w temp. 94°C przez 1 min, annealing w 42°C przez 45 sec, i wydłużenie startera w 72°C przez 1 min. Amplifikowany produkt następnie wklonowano do wektora SK (Stratagene, San Diego, CA), i jego sekwencję DNA sprawdzano standardowymi technologiami sekwencjonowania.
Ectodomenę ludzkiego błonowego antygenu specyficznego względem prostaty (PSMA) sklonowano z linii komórkowej raka prostaty LnCAP (ATCC CRL1740) techniką PCR przy użyciu starterów 5'AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC (SEQ ID NO: 3) i 5'CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG (SEQ ID NO: 4), odpowiednio dla nici sensowej i antysensowej. Sekwencję DNA sprawdzono i fragment PCR wprowadzono do wektora pdCs-muFc, aby uzyskać konstrukt kodujący białko fuzyjne pdCs-muFc-PSMA.
Ektodomenę ludzkiego EpCAM (znaną również jako antygen KS), białko powierzchniowe komórek śródbłonka o podwyższonej ekspresji w większości komórkach raka, sklonowano z komórek LnCAP stosując PCR, przy użyciu starterów 5'CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (SEQ ID NO: 5), i 5'CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG (SEQ ID NO: 6) odpowiednio dla nici sensowej i antysensowej. Sekwencję DNA sprawdzano standardowymi technikami sekwencjonowania i fragment PCR wprowadzono do wektora pdCs-muFc do produkcji konstruktu fuzyjnego pdCs-muFcEpCAM. Inny wektor skonstruowano przy użyciu ektodomeny EpCAM jako części białka fuzyjnego na
PL 201 664 B1 końcu N i w tym przypadku produkt PCR obejmował cDNA odcinanej sekwencji liderowej EpCAM i dojrzałą sekwencję ektodomeny do granicy domeny śródbłonowej. Koniec 3' tego produktu PCR zawiera zaprojektowane miejsce cięcia Afl II do ligacji z miejscem cięcia 5'Afl mysiego fragmentu Fc. Stosowano następujące startery PCR 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (SEQ ID NO: 7) i 5'CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG (SEQ ID NO: 8). W tym przypadku, mysi Fc został pozbawiony miejsca insercji 3' do wprowadzenia białka fuzyjnego, ale zawierał sygnał terminacji translacji na końcu sekwencji kodującej Fc.
Względnie konserwowana część sąsiadującego z błoną regionu HIV gp41, od miejsca restrykcyjnego Hind III do reszty lizyny przylegającej do regionu sąsiadującego z błoną, poddano ekspresji jako białko fuzyjne Fc będące przykładem sekwencji krótkiego antygenu polipeptydowego. Pomimo, że zastosowano sekwencję białka ze szczepu IIIB HIV, sekwencję kodującą optymalizowano, w celu uzyskania optymalnej ekspresji w komórkach eukariotycznych przy użyciu kodonu nonsensowego o wysokiej zawartości GC. Sekwencję DNA kodującego reszty aminokwasowe 626 do 669 podaną poniżej: C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAĆ AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTCGAG (SEQ ID NO: 9) zsyntetyzowano chemicznie i ligowano z wektorem pdCs-muFc. Sekwencja aminokwasowa połączonego polipeptydu była następująca: SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (SEQ ID NO: 10).
W kolejnych rozwiązaniach wynalazku zastosowano inne sekwencje kodujące białko HIV do utworzenia białka fuzyjnego antygenu Fc jak opisano wcześniej (Opisy patentowe US nr 5,541,087 i 5,726,044) przy użyciu mysiego IgG2a Fc, a nie pochodzenia ludzkiego IgG1 Fc.
W taki sam sposób jak antygenowe białko fuzyjne Fc skonstruowano serię adiuwantowych białek fuzyjnych Fc (cytokina) obejmujących mysi IgG2a Fc i kilka mysich cytokin. Specyficzne cytokiny i startery do klonowania przedyskutowano poniżej.
Mysi IL-2 sklonowano z ludzkich obwodowych jednojądrowych komórek krwi (PBMCs) techniką PCR przy użyciu starterów PCR (sensowe) 5'GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (SEQ ID NO: 11), i (antysensowe) 5'CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO 12).
Mysi GMCSF sklonowano z mysich PBMCs techniką PCR przy użyciu starterów PCR (sensowe) 5'CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC (SEQ ID NO: 13), i (antysensowe) 5'CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC (SEQ ID NO: 14).
Mysi Flt3 ligand sklonowano z mysie thymus techniką PCR przy użyciu starterów PCR (sensowe) 5'CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC (SEQ ID NO: 15), i (antysensowe) 5'CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC (SEQ ID NO: 16).
Mysi IL-12p35 sklonowano z mysich PBMCs techniką PCR przy użyciu starterów PCR (sensowe) 5'CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 17), i (antysensowe) 5'CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 18).
Mysi IL 12 p40 sklonowano z mysich PBMCs techniką PCR przy użyciu starterów PCR (sensowe) 5'TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 19), i (antysensowe) 5'CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 20).
Wszystkie produkty PCR, z wyjątkiem mysiego IL-12 p40, sklonowano jako fragmenty Sma I do Xho I, analizowano standardowymi technikami sekwencjonowania DNA, i ligowano z wektorem pdCsmuFc zawierającym jako jego region Fc mysie Fc IgG2a. Mysi IL-12 p40 jako produkt PCR poddano ekspresji oddzielnie (nie jako białko fuzyjne Fc) w wektorze zawierającym taki sam promotorowy enhancer CMV, sekwencję liderową lekkiego łańcucha połączonym bezpośrednio z dojrzałym mysim p40 kodującym podjednostkę IL-12 i gen oporności na neomycynę zamiast genu markera selekcyjnego DHFR w wektorze pdCs-muFc. Otrzymany wektor nazwano pNC-mp40, gdzie N oznacza selekcyjny gen oporności na neomycynę.
Wszystkie konstrukty plazmidowe indukowały syntezę i wydzielenie specyficznych białek fuzyjnych w wyniku przejściowej ekspresji w ludzkich komórkach nerek 293. Pokrótce, plazmidy wprowadzono do monowarstwy ludzkich komórek nerek 293 poprzez strącanie z fosforanem wapnia (Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y.). Komórki pozostawiono przez noc (16 godzin), przemyto PBS i wprowadzono świeżą pożywkę hodowlaną (DMEM zawierającą 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS)). Po kolejnych 2-3 dniach, pożywkę hodowlaną badano pod kątem wydzielanych białek fuzyjnych testem ELISA specyficznym względem Fc (Gillies i wsp. (1989) J. Immunol. Methods 125: 191) przy użyciu przeciwciał specyficznych względem mysiego białka IgG-Fc. W przypadku mysiego Fc-IL12, oba DNA w plazmidach ekspresyjnych Fc-p35 i p40 przej18
PL 201 664 B1 ściowo ulegały ekspresji w takiej samej hodowli komórkowej tak, że heterodimeryczne cytokiny białka fuzyjnego ulegały składaniu przed wydzieleniem z komórki (Gillies i wsp. (1998) J. Immunol. 160: 6195).
Następnie, w wyniku wprowadzenia zlinearyzowanego DNA do mysich NS/0 komórek szpiczaka standardowymi technikami elektroporacji uzyskano stabilnie transfekowane komórki prowadzące ekspresję różnych białek fuzyjnych Fc. Pokrótce, komórki zawieszono w kuwecie Gene Pulser Cuvette (BioRad) w ilości 107 komórek/ml i 0,5 ml zawiesiny zmieszano z 10 μg DNA, mieszaninę schłodzono w lodzie przez 10 minut. Elektroporację przeprowadzano przy użyciu Gene Pulser (BioRad) przy ustawieniach 0,25 V i 500 pF. Komórki pozostawiono do odzyskania żywotności w lodzie przez 10 minut, po czym zawieszono ponownie w pożywce hodowlanej i przeniesiono do 96-studzienkowych szalek. Komórkom dostarczano co 2-3 dni pożywkę hodowlaną zawierającą 0,1 μM metotreksan rozpoczynając 2 dnia po elektroporacji. Kolonie oporne na lek w 96-studzienkowych szalkach badano pod kątem ekspresji stosując protokół Fc ELISA.
Aby uzyskać ekspresję mysiego białka fuzyjnego Fc-IL12, wektorem ekspresji z mysią podjednostką Fc-p35 transfekowano uprzednio transfekowaną linię komórkową NS/0, prowadzącą już ekspresję podjednostki p40 mysiego IL-12, jak opisano powyżej. W wyniku elektroporacji komórek NS/0 wektorem pNC-mp40, jak opisano powyżej, otrzymano linę prowadzącą ekspresję p40 i prowadzono selekcję w pożywce zawierającej analog neomycyny G418 (Life Sciences Technologies). Po drugiej transfekcji, klony komórek, które przeżyły badano ELISA Fc i ELISA mysi IL-12 (Genzyme, Cambridge, MA, USA).
Integralność strukturalną otrzymanych białek fuzyjnych testowano prowadząc elektroforezę w żelu SDS-poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Początkowo, białka fuzyjne były związane z małą objętością (10-20 μl na ml pożywki) Sefarozy-białka A (Repligen, Needham, MA). Materiał związany przemyto PBS zawierającym Tween-20 (0,01%), następnie wymywano w buforze do żelu zawierającym SDS, a następnie doprowadzono do wrzenia przez 2 minuty w obecności 5% 2-merkaptoetanolu. Zredukowane białka następnie poddano elektroforezie we wcześniej przygotowanym żelu SDS PAGE i barwiono barwnikiem Coomassie. Oczyszczanie na dużą skalę ze stabilnych klonów komórkowych przeprowadzano przy użyciu kolumn z Sefarozą-białkiem A (Repligen, Needham, MA) zgodnie z instrukcją producenta.
P r z y k ł a d II
Immunogeniczność Fc-antygenu i wpływ na produkcję przeciwciał adiuwantów chemicznych lub Fc-cytokin
Konstrukt mysiej podjednostki alfa Fc-huIL-4R otrzymany jak w przykładzie 1 stosowano jako antygen do badania na modelu zwierzęcym działania tych białek skierowanego na APC. Ektodomena IL-4R podjednostki alfa stanowi część cząsteczki całkowicie konserwowaną u różnych gatunków, mającą ponad 50% identyczność sekwencji ludzkiej i mysiej.
Grupy myszy poddano iniekcji podskórnej 50 μg antygenowego białka fuzyjnego Fc (Fc-IL-4R) w PBS lub w postaci emulsji w pełnym adiuwancie Freunda (CFA). Określone grupy również otrzymały 5 μg dawkę (zmieszaną z Fc-IL-4R) białkowego adiuwanta Fc Fc-IL2 lub Fc-GMCSF. Dwa tygodnie później myszy poddano iniekcji taką samą mieszaniną ale podawaną do jamy otrzewnej. Preparaty CFA tworzą micelle, które stanowią źródło antygenu o powolnym uwalnianiu, umożliwiając stałą stymulację układu immunologicznego. Mykobakteryjne białka w CFA również indukują silną zapalną odpowiedź przez stymulację cytokin, przez co nadal wzmacniają odpowiedzi immunologiczne. CFA, jednakże, powoduje poważne działania uboczne obejmujące uszkodzenia skóry i w konsekwencji nie może być stosowany u ludzi. Podczas gdy mieszaniny z adiuwantowymi białkami fuzyjnymi Fc w PBS nie wydają się wywołać jakichkolwiek widocznych reakcji skórnych lub innych jawnych objawów toksyczności w zwierząt.
Dwa tygodnie po dawce przypominającej (to znaczy, 28 dzień po pierwszej iniekcji), zwierzęta skrwawiano i otrzymano surowice krwi, pozostawiając w probówkach do mikrowirówki krew całkowitą do utworzenia skrzepu, wirowano komórki i skrzep z dużą szybkością 12000 RPM przez 5 minut i odzyskiwano supernatant. Otrzymane surowice krwi rozcieńczono buforem (PBS zawierający 0,01% Tween-20) i badano pod kątem obecności przeciwciał oddziałujących z ludzkim IL-4R. ELISA specyficzny względem antygenu przeprowadzano przy użyciu 96-studzienkowych szalek powlekanych ludzkim Fc-huIL-4R (do każdej studzienki dodawano 100 μl 5 μg/ml w PBS i inkubowano w 4°C przez noc). Następnie powlekane antygenem szalki przemyto i przed użyciem blokowano buforem blokującym (1% BSA, 0,01% Tween-20 w PBS). Rozcieńczone badane surowice krwi inkubowano w studzienkach przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie studzienki przemywano osiem razy
PL 201 664 B1 buforem testowym. Dodano drugorzędowe specyficzne połączone z peroksydazą chrzanu przeciwciało skierowane przeciwko mysim Fc (rozcieńczenie 1:2000, Jackson ImmunoResearch) i szalki inkubowano przez następną godzinę. Po ośmiu dodatkowych przemyciach buforem do badań, dodano roztwór dichlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD) zawierający 25 mM kwas cytrynowy, 50 mM Na2HPO4, pH5 i 0,03% świeżo dodanego H2O2. Reakcję zatrzymano po około 30 minutach przez dodanie 100 μl 4N H2SO4. Otrzymane szalki odczytywano przy 490 nm w czytniku szalek, które automatycznie odejmują zliczenie tła przy 650 nm. Wyniki wykreślono jako gęstość optyczną w funkcji rozcieńczenia surowicy odpornościowej. Względne miana przeciwciał określano jako ilość surowicy krwi, która musi być rozcieńczona zanim gęstość optyczna spadnie poniżej wybranej wartości, na przykład, 1 jednostkę O. D.
Wyniki immunizacji przedstawiono na fig. 3. Iniekcja samego mysiego białka fuzyjnego Fc-IL-4R w PBS według tego protokołu indukowała odpowiedź przeciwciała tylko u jednej myszy (Fig. 3B). Jednakże dodanie CFA doprowadziło odpowiedzi u większej ilości myszy lecz miana przeciwciał były w przybliżeniu takie same jak u myszy, u których uzyskano odpowiedź na iniekcję samego białka fuzyjnego Fc-IL4R w PBS (Fig. 3C). Łączne podawanie adiuwantowego mysiego Fc-IL2 z Fc-IL4R w PBS indukowało odpowiedzi u wszystkich zwierząt, jednakże, ilość przeciwciał produkowanych w każdym przypadku była zmienna (Fig. 3D). Połączenie CFA i adiuwantowego mysiego Fc-IL2 (Fig. 3A) doprowadziło do uzyskania wyższego miana przeciwciał niż każdego środka osobno (Fig. 3C i 3D). Łączne podawanie adiuwantowego mysiego Fc GMCSF w PBS indukowało najsilniejszą odpowiedź immunologiczną u wszystkich grup (Fig. 3E), obejmujących grupę, którą immunizowano łącznie adiuwantem Fc GMCSF i CFA (Fig. 3F). Innymi słowy, adiuwantowy mysi Fc-GMCSF w PBS, jeśli jest podawany łącznie z mysim antygenem Fc-IL4R, eliminuje konieczność podania CFA. Uważa się, że jest to sposób bardziej odpowiedni do zastosowania u ludzi.
P r z y k ł a d III
Wpływ dawki adiuwanta Fc-GMCSF na poziom przeciwciał produkowanych przeciwko antygenowi nowotworowemu, PSMA w białku fuzyjnym Fc-PSMA.
PSMA obecnie stanowi ludzki, związany z guzem antygen stosowany w terapii celowanej, ze względu na jego ograniczone rozmieszczenie w normalnej tkance. PMSA testowano w badaniach klinicznych jako obiecującą substancję aktywną szczepionki przeciwko guzom. W tym przykładzie, oszacowano immunogenność antygenu PMSA w białku fuzyjnym Fc-PSMA.
Mysie białko fuzyjne Fc-PSMA otrzymano jak przedyskutowano w przykładzie I. Grupy myszy poddano iniekcji podskórnej 50 μg mysiego Fc-PSMA w PBS, razem z różnymi stężeniami adiuwantowego białka fuzyjnego Fc Fc-GMCSF, a następnie po 14 dniach podano iniekcję śródotrzewnową dawkę przypominającą. Miana przeciwciał mierzono przez wychwyt w ELISA antygenu Fc-PSMA, jak opisano w przykładzie II dla białka fuzyjnego Fc-IL4R. Wyniki wykreślono na fig. 4 jako miano przeciwciał (rozcieńczenie przy którym OD jest obniżone do 1) względem czasu od pierwszej iniekcji.
Jeśli nie podano Fc-GMCSF, myszy wykazywały miana przeciwciał przeciwko PSMA w zakresie 1000 do około 20,000 (Fig. 4A). Jednakże łączne podanie nawet tak małej ilości jak 0,05 μg Fc-GMCSF, doprowadziło do mian w zakresie 30,000 do 140,000 (Fig. 4B). Dziesięciokrotny wzrost Fc-GMCSF powodował wzmocnienie stymulacji mian przeciwciał przeciwko temu antygenowi nowotworowemu (Fig. 4C i 4D). Nawet najwyższa podana dawka (5 μg białka fuzyjnego Fc-GMCSF na mysz), stanowiąca tylko około 2 μg GMCSF na iniekcję, nie powodowała żadnego widocznego wpływu na skórę myszy lub żadnych oznak układowych immunizowania zwierzęcia (patrz, Fig. 4D). Ponadto, inaczej niż przy CFA, nie było widocznego powiększenia śledziony.
P r z y k ł a d IV
Wpływ dostarczenia PSMA w którym pośredniczy Fc na odpowiedź przeciwciał na immunizację
Specyficzne działanie składnika Fc w białkach fuzyjnych antygen-Fc i adiuwant-Fc badano porównując indukowane odpowiedzi immunologiczne u myszy, którym wstrzyknięto białka fuzyjne, niepołączony antygen lub białkowe adiuwanty lub ich mieszaniny. W tym celu wykorzystano ludzki układ PSMA.
Nie połączone PSMA otrzymano w wyniku trawienia proteolitycznego plazminą ludzkiego białka fuzyjnego Fc-PSMA (Lo i wsp. (1998) Protein Engineering 11: 495-500) zgodnie z instrukcjami producenta. Uwolniony Fc i nietrawiony Fc-PSMA usunięto przez adsorpcję na Sefarozie-białku A (Repligen, Needham, MA).
Grupy myszy (n=3) poddano iniekcji pojedynczą podskórną dawką 50 μg samego PSMA (Fig. 5A), lub w połączeniu z 0,2 μg wolnego GMCSF (Fig. 5B) lub z 0,5 μg Fc-GMCSF (Fig. 5C) (0,5 μg FcGMCSF zawiera około 0,2 μg GMCSF). W innej grupie myszy, każdej myszy wstrzyknięto jedną pod20
PL 201 664 B1 skórną dawkę 50 μg mysiego białka fuzyjnego Fc-PSMA (Fig. 5D), samego lub razem z 0,2 μg wolnego CMCSF (fig. 5E) lub z 0,5 μg Fc-GMCSF (Fig. 5F). Wszystkie preparaty do iniekcji przygotowano w PBS bez chemicznego adiuwanta. Przeciwciała reagujące z mysim FcPSMA mierzono 14 dnia po immunizacji.
Wpływ składnika Fc w białku fuzyjnym antygenu Fc w białku fuzyjnym Fc-PSMA na immunogenność PSMA był zdumiewający, gdy zwierzętom wstrzykiwano preparaty PBS bez chemicznych adiuwantów. Nie stwierdzono zasadniczo żadnej pierwszorzędowej odpowiedzi odpornościowej na podawane PSMA w PBS (fig. 5A). Dodanie GMCSF lub Fc-GMCSF miało bardzo mały wpływ na immunizację (Fig. 5B i 5C), z wyjątkiem słabej odpowiedzi u jednego zwierzęcia (fig. 5B). Przeciwnie, zwierzęta, którym wstrzykiwano samo Fc-PSMA, wykazywały silne pierwszorzędowe odpowiedzi odpornościowe we wszystkich przypadkach (fig. 5D). Dodatek Fc- GMCSF wolnego GMCSF do zwiększyło ten wpływ jedynie w niewielkim stopniu (fig. 5E), lecz łączne podawanie zarówno antygenu jak i cytokiny w postaci białek fuzyjnych z Fc prowadziło do najwyższego poziomu odpowiedzi (fig. 5F).
Wyniki te wskazują, że połączenie antygenu Fc z adiuwantem-Fc ma wyjątkowe działanie w wytwarzaniu odpowiedzi immunologicznej i wykazuje widoczną korzyść wspólnego zlokalizowania antygenu i stymulującej cytokiny in vivo, prawdopodobnie względem APCs.
P r z y k ł a d V
Porównanie wpływu adiuwanta w białkach fuzyjnych Fc- GMCSF lub Fc-Flt3L.
Wykazano, że ligand wiążący się z Flt3, nazywany również w stanie techniki ligandem Flt3 (Lft3L) odgrywa zasadniczą rolę w tworzeniu i dojrzewaniu komórek dendrytycznych (Soligo i wsp. (1998) Br. J. Haematol. 101:352-63. Komórki dendrytyczne, wraz z makrofagowymi komórkami tkankowymi są uważane za najważniejsze APC. Badania na myszach wykazały, że codzienne iniekcje trwające 10 dni zwiększają ilość i aktywność APC komórek dentrytycznych, uzyskanych z chłonki i śledziony, i że komórki te są wyjątkowo skuteczne w prezentowaniu antygenu limfocytom zarówno T CD4+, jak i CD8+. Uważa się, że komórki Langerhansa skóry stanowią jeden typ komórek dendrytycznych zdolnych do prezentowania antygenu po jego pobraniu i migracji do lokalnych węzłów chłonnych. Ze względu na to, że jak się uważa, w większości komórek dendrytycznych nie zachodzi ekspresja układu receptorów Fc typowo występujących w makrofagach (np. FcyRI), nie można przewidzieć czy w działaniu jednoczesnego lokalizowania białek fuzyjnych Fc może być zaangażowana ta linia APC.
Aby zbadać czy Flt-3L może działać jako adiuwant, grupy myszy poddano iniekcji mysim FcPSMA i mysim Fc-FLt3l, zamiast stosować mysie białko fuzyjne Fc-GMCSF (będące silnym stymulatorem makrofagów i granulocytów). W tym przypadku, wpływ każdego adiuwanta, w którym jak się spodziewano pośredniczy aktywacja i pobieranie komórek dendrytycznych, może ewentualnie prowadzić do odpowiedzi z wytworzeniem przeciwciał na PMSA. Wyniki podsumowano na fig. 6.
Badanie to wskazuje, że mysie Fc-Flt3L jest skutecznym adiuwantem, który stymuluje wytwarzanie przeciwciał anty-PSMA, tak samo skutecznie, jeśli nie lepiej, co taka sama dawka Fc-GMCSF. Wyniki potwierdzają obserwację, że połączenie antygenu Fc i adiuwanta Fc może być szczególnie silne w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej. Wyniki również wykazują, że dendrytyczne APC mogą być ewidentnie elementem antygenu-Fc i cytokiny-Fc jak i makrofaga APC, co sugeruje, że w komórkach tych obecna jest przynajmniej jedna postać receptora Fc.
P r z y k ł a d VI.
Odpowiedzi immunologiczne na podanie białek fuzyjnych Fc-EpCAM i EpCAM Fc
Inny, potencjalnie ważny, ludzki antygen nowotworowy, EpCAM (również zwany antygenem KSA i 17-1 A), produkowano jako białko fuzyjne z mysim regionem Fc IgG2a przy użyciu plazmidów i sposobów jak opisano w przykładzie I, i podawano sam, lub w połączeniu z Fc-GMCSF jako adiuwantem. Myszy poddano iniekcji podskórnej i dawce przypominającej po 3 tygodniach, 10 μg Fc-EpCAM i 1 μg Fc GMCSF w PBS. Kontrolne myszy nie otrzymywały Fc-GMCSF. Miana przeciwciał skierowanych przeciwko EpCAM mierzono 7 (Fig. 7A) i 14 dnia (Fig. 7B) po dawce przypominającej. Wyniki wskazują, ze Fc-EpCAM, jeśli było podawane samo, jest silnym immunogenem (niewypełnione romby), i że Fc-GMCSF może nadal zwiększać odpowiedź na ten antygen (wypełnione trójkąty).
Ponadto, antygen EpCAM ulegał ekspresji w odwróconej orientacji w odniesieniu do fragmentu Fc jako EpCAM-muFc (patrz przykład I, Fig. 1B). Tę cząsteczkę stosowano do immunizacji myszy Balb/c przez podskórną iniekcję. Stosowano wyższe dawki białka fuzyjnego EpCAM- Fc (25 μg na dawkę) i zwiększono również ilość adiuwanta (2,5 μg Fc-GMCSF). Miana przeciwciał skierowanych przeciwko EpCAM mierzono 14 (Fig. 8A) i 21 dnia (Fig. 8B) po immunizacji. Samo białko fuzyjne
PL 201 664 B1
EpCAM-Fc było całkiem immunogenne przy braku Fc-GMCSF (Fig. 8A i 8B, (niewypełnione romby)). Dodanie Fc-cytokiny zwiększyło miana przeciwciał około 3-krotnie (Fig. 8A i 8B, (wypełnione trójkąty)).
W celu zbadania czy odpowiedź immunologiczna przeciwko EpCAM może zabezpieczać ssaki przed komórkami guza prowadzącymi ekspresję tego antygenu, nieimmunizowane myszy lub immunizowane przez podanie białka fuzyjnego EpCAM-Fc (i w pewnych przypadkach Fc-cytokinami) poddano iniekcji do żyły ogonowej komórkami 105 CT26 mysiego nowotworu okrężnicy, transfekowanymi ludzkim EpCAM (Gillies i wsp. (1998) J. Immunol. 160: 6195). Dwadzieścia jeden dni później, aby określić różnice zwiększenia masy guza, zwierzęta uśmiercono i wielkość przerzutów w płucach oszacowano przez (1) klasyfikację według pokrycia powierzchni płuc i (2) przez zważenie płuc i porównaniu ich z normalnymi płucami zwierząt. Wyniki podsumowane w tabeli 1 wykazują, że wszystkie immunizowane myszy wykazały statystycznie wysokie obniżenie przerzutów guza w porównaniu do myszy kontrolnych, obejmujących zwierzęta immunizowane samym białkiem fuzyjnym EpCAM-Fc. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu jako antygenu białka fuzyjnego Fc-EpCAM.
T a b e l a 1
Grupa poddana leczeniu Zliczenia ognisk przerzutowych Średnia masa płuc (mg)
Kontrola 4, 4, 4, 1, 1 412+/-130
EpCAM-Fc 0, 0, 0, 0, 0 210+/-21
EpCAM-Fc+Fc-GM 0, 0, 0, 0, 0 240+/-19
EpCAM-Fc+Fc-IL2 0, 0, 0, 0, 0 230+/-19
Zliczenia przerzutów oparto na powierzchni pokrycia płuc przy użyciu następującej skali: 1 = 1-25% pokrycia; 2 = 26-50% pokrycia; 3 = 51-75% pokrycia; i 4 = 76-100% pokrycia.
P r z y k ł a d VII
Połączenie antygenu-Fc i cytokinowego adiuwanta w jednym białku fuzyjnym
Białko opisane w przykładzie VI, EpCAM-Fc, jest przykładem antygenu na końcu N, połączonego z immunoglobulinowym regionem Fc jako karboksylową domeną białka. Aby zwiększyć odpowiedź immunologiczną na antygen, białko to, i inne podobne białka, może być podawane łącznie z adiuwantowym białkiem fuzyjnym Fc, np., Fc-cytokinami. W innym rozwiązaniu, antygen, stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha i białko adiuwanta (na przykład, cytokina) mogą być produkowane jako jedno białko fuzyjne, na przykład, jako białko fuzyjne EpCAM-Fc-GMCSF.
Plazmid ekspresyjny kodujący takie białko, skonstruowano przy użyciu mysich sekwencji IgG2a Fc i GM-CSF, tak aby konstrukt mógł być badany na mysim modelu. Mały fragment od miejsca cięcia Xba I do Sma I zawierający sekwencje kodujące sekwencję liderową-EpCAM-Fc otrzymano z oryginalnego wektora ekspresji EpCAM-Fc (Przykład I) i ligowano z dużym fragmentem od miejsca cięcia Sma I do Xba z wektora ekspresji Fc-GMCSF (Fig. 9).
Otrzymany wektor, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF, wprowadzono komórek 293 przy użyciu metody współstrącania z fosforanem wapnia, aby uzyskać przejściowej ekspresji i do komórek NS/0 stosując elektroporację, aby uzyskać stabilną ekspresję. Stabilne transfektanty selekcjonowano przez hodowanie komórek w pożywce zawierającej metotreksan (0,1 μM). Klony, w których zachodziła ekspresja identyfikowano ELISA Fc (patrz Przykład I) i komórki produkujące z dużą wydajnością żądane białko były rozmnażane w hodowli. Białko EpCAM-Fc-GMCSF oczyszczono z pożywki immunizowanej przez wiązanie z Sefarozą-białkiem A i wymywano (Repligen, Needham, MA), i integralność strukturalną analizowano SDS-PAGE po redukcji 2-merkaptoetanolem. Wyniki wykazały, że białko miało masę cząsteczkową około 90 kD, jak spodziewano się dla jednego połączonego białka EpCAM, Fc i GMCSF.
W celu porównania względnej immunogenności połączonego białka fuzyjnego, wstrzykiwano podskórnie myszom równoważne dawki EpCAM-Fc-GMCSF i poszczególnych białek fuzyjnych łącznie: EpCAM-Fc i Fc-GMCSF. Te same iniekcje podano 14 dni później jako dawkę przypominającą i próbki surowic krwi badano pod kątem specyficznego przeciwciała reagującego z ludzkim EpCAM 7 dnia po dawce przypominającej. Takie samo rozwiązanie może być zastosowane dla innych białek lub antygenów białkowych, jak i innych stymulujących cytokin, takich jak IL-2, IL-12 i Flt3L.
P r z y k ł a d VIII
Immunizacja antygenem Fc przez iniekcję DNA.
Takie same wektory ekspresyjne stosowane do transfekcji i produkcji mysich FcEpCAM i EpCAM-Fc w komórkach ssaczych (patrz Przykład I) wprowadzono przez iniekcję jako nagi plazmid
PL 201 664 B1
DNA do mięśnia pośladkowego grupy myszy Balb/c. DNA wstrzyknięto w stężeniu 0,5 mg/ml i całkowita ilość 100 μg została przygotowana w PBS lub 25% roztworze (wag./obj.) sacharozy. Iniekcje powtarzano co 3 tygodnie dla wszystkich 3 iniekcji. Odpowiedzi przez produkcję przeciwciał mierzono w różnych czasach i obliczano stosując test ELISA stosując powlekane ludzkim Fc-EpCAM 96studzienkowe szalki do wychwytu przeciwciał, i wykrywając sprzężone z HRP specyficzne poliklonalne przeciwciało skierowane przeciwko mysiemu Fc (Jackson ImmunoResearch). Dane na fig. 10 przedstawiają miana przeciwciał z 14 dnia (Fig. 10A), 27 dnia (Fig. 10B), 55 dnia (Fig. 10C) i 69 dnia (Fig. 10D) po iniekcji.
Wyniki zaprezentowane na fig. 10 wskazują, że podczas pierwszego miesiąca stosowania obu preparatów wytworzono jedynie niskie miana specyficznego przeciwciała anty-EpCAM (Fig. 10A i 10B). Znacznie wyższe miana otrzymano 55 dnia (Fig. 10C), a nawet wyższe poziomy 69 dnia (Fig. 10D). Podobne wyniki otrzymano przy użyciu iniekcji DNA wektora prowadzącego ekspresję EpCAM-Fc, pomimo, że miana były niższe. Te dane wykazują, że antygen, który ulegał ekspresji jako cząsteczka fuzyjna obejmująca antygen białkowy i immunoglobulinowy region Fc może indukować odpowiedź immunologiczną, gdy zostanie wprowadzony jako nagie DNA, i że stałe poddanie działaniu antygenu prowadzi do opóźnionej odpowiedzi u większości zwierząt.
Komórkowe odpowiedzi immunologiczne badano stosując hodowlę limfocytów śledzionowych od myszy szczepionych DNA lub immunizowanych białkiem (70 dnia po iniekcji), stymulowanych in vitro różnymi stężeniami białka Fc-EpCAM. Dane przedstawione na fig. 11 (górny wykres) wskazują odpowiedź proliferacyjną (jak zmierzono jako wbudowanie 3H-tymidyny) na antygen u zwierząt immunizowanych białkiem Fc-EpCAM (krzyżyki) lub szczepionych DNA wektorów ekspresyjnych CMVpromotor-EpCAM-Fc (niewypełnione kółka) lub promotorCMV-Fc-EpCAM (wypełnione romby). Immunizowane białkiem zwierzęta wykazywały znacznie większe odpowiedzi na antygen, nawet przy bardzo niskich dawkach. Odpowiedzi zwierząt szczepionych DNA (również przedstawione w różnych skalach na dolnym wykresie fig. 11) zależały od dawki, ale były niższe niż u myszy, którym wstrzyknięto białko. Te odpowiedzi były charakterystyczne dla odpowiedzi ograniczonych limfocytów T CD4+ w MHC klasy II.
W celu zbadania cytotoksycznej aktywności (ogólnie będącej wskaźnikiem odpowiedzi ograniczonych limfocytów T w MHC klasy I), hodowle limfocytów śledzionowych pochodzących od myszy z immunizowanej DNA lub białkiem prowadzono przez 5 dni w obecności o około 10 U/ml IL-2. Komórkami efektorowymi były hodowane limfocyty ze śledziony, a komórkami docelowymi były znakowane ludzkim EpCAM prowadzącym ekspresję CT26 komórki nowotworu okrężnicy (izogeniczne dla myszy Balb/c), lub znakowane komórki rodzicielskie (nietransfekowane CT26). Komórki efektorowe i docelowe zmieszano w różnych stosunkach i określano zakres lizy. Wartość 100% lizy uzyskano przez inkubację znakowanych komórek docelowych w obecności detergentu i zmierzono ilość uwolnionego znacznika.
Wyniki zaprezentowano na fig. 12, gdzie fig. 12A przedstawia aktywność limfocytów śledzionowych przeciwko CT26 komórkom prowadzącym ekspresję ludzkiego EpCAM, podczas gdy fig. 12B przedstawia aktywność limfocytów śledzionowych przeciwko rodzicielskim komórkom CT26. Na fig. 12A i 12B, niewypełnione romby przedstawiają limfocyty śledzionowe wyizolowane z myszy immunizowanych DNA kodującym konstrukt EpCAM, niewypełnione kwadraty przedstawiają limfocyty śledzionowe wyizolowane z myszy immunizowanych DNA kodującym konstrukt fuzyjny Fc-EpCAM, niewypełnione trójkąty przedstawiają limfocyty śledzionowe wyizolowane z myszy immunizowanych DNA kodującym konstrukt fuzyjny EpCAM- Fc, a krzyżyki przedstawiają limfocyty śledzionowe wyizolowane z myszy immunizowanych białkami fuzyjnymi Fc-EpCAM.
Fig. 12 przedstawia, że pomimo, że szczepienie DNA prowadzi do uzyskania słabej odpowiedzi cytotoksycznej przeciwko obu komórkom docelowym, znacząco wyższą cytotoksyczność obserwowano u myszy immunizowanych białkiem. Zarówno komórki rodzicielskie guza CT26, jak komórki guza CT26 prowadzące ekspresję EpCAM uległy uśmierceniu w teście. Cytotoksyczność obserwowana przeciwko komórkom rodzicielskim CT26 może być spowodowana tym, że komórki te mogą prowadzić ekspresję na wysokim poziomie mysiego homologa EpCAM, który wykazuje około 81% identyczności z ludzkim białkiem, biorąc pod uwagę sekwencje aminokwasowe. Jednakże, immunizacja białkiem FcEpCAM doprowadziła do znaczącej aktywności cytotoksycznej przeciwko komórkom guza CT26 prowadzącym ekspresję ludzkiego EpCAM, co wyjaśnia dużą aktywność w zabezpieczaniu przed nowotworem opisaną w przykładzie VI.
PL 201 664 B1
P r z y k ł a d IX
Immunizacja białkiem fuzyjnym Fc zawierającym podregion białkowego antygenu nowotworowego.
Pomimo, że pewne całe białka mogą nie być użyteczne jako antygeny w terapii immunologicznej, to ich mniejsze regiony mogą być skuteczne. Na przykład, białka mogą zawierać domeny, zmodyfikowane po translacji, co uczyni je mniej immunogennymi, a zatem odpowiedź immunologiczna na rzeczywiste składniki polipeptydowe jest mniejsza. Duże białka mogą indukować przeciwciała, które działają tylko z niepolipeptydowymi częściami antygenu i które nie pośredniczą w komórkowej cytotoksyczności zależnej od antygenu (ADCC), która jest potencjalnie ważnym składnikiem przeciwrakowej odpowiedzi immunologicznej. Dobrym przykładem takiego rozwiązania jest ludzki antygen swoisty dla chondroityno siarczano proteoglikanu czerniaka (MCSP), który ulega ekspresji w praktycznie wszystkich typach czerniaka jak i kilku typach raka mózgu. Białko to jest silnie glikozylowane i jest modyfikowane przez przyłączenie kilku łańcuchów glikozoaminoglikanowych. Przeciwciało znane jako 9.2.27 (Bumol i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 1245-1249), wiąże się z tym białkiem z dużym powinowactwem ale nie pośredniczy w żadnej funkcji efektorowej, ani w ADCC lub cytotoksyczności z pośrednictwem dopełniacza (CDC). Nawet częściowo humanizowane (chimeryczne) postacie tego przeciwciała nie biorą udziału w takiej aktywności.
W celu wywołania bardziej ukierunkowanych odpowiedzi na korzystniejsze regiony docelowe tej dużej cząsteczki, zidentyfikowano w sekwencji białkowej możliwe miejsce przyłączenia glikanu. (Pluske i wsp. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9710-9715). Wybrano część sekwencji, nie zbyt odległą od sekwencji występującej w błonie komórkowej przy jej powierzchni i oddaloną od miejsca przyłączenia glikanu.
Sekwencję peptydu: QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSWRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD (SEQ ID NO: 21) poddano odwrotnej translacji i otrzymaną sekwencję DNA z syntetyzowano chemicznie, i ligowano z wektorem ekspresji pdCs-Fc-X przy użyciu takich samych miejsc restrykcyjnych stosowanych we wcześniejszych przykładach. Miejsce zakończenia translacji dodawano na końcu 3', tuż za sekwencją kodującą ostatni aminokwas, po którym występuje pojedyncze miejsce cięcia Xho I. Ostateczny plazmid ekspresyjny elektroporowano z komórkami NS/0 szpiczaka i stabilne transfektanty prowadzące ekspresję żądanego białka otrzymano jak opisano w przykładzie I.
Białko Fc-MCSP oczyszczano z supernatantów hodowli przy użyciu chromatografii na Sefarozie-białku A (Repligen, Needham, MA). Miana przeciwciał mierzono u myszy Balb/c immunizowanych podskórnie 50 μg białka fuzyjnego Fc-MCSP w PBS samym lub w połączeniu z 5 μg Fc-GMCSF jako adiuwantem. Wyniki przedstawiono na fig. 13. Wypełnione romby przedstawiają miana przeciwciał w normalnej surowicy krwi, niewypełnione kwadraty przedstawiają miana przeciwciał w surowicy krwi myszy immunizowanych Fc-MCSP, a wypełnione trójkąty przedstawiają miana przeciwciał w surowicy krwi myszy immunizowanych adiuwantem Fc-MCSP i Fc-GMCSF.
Specyficzne odpowiedzi immunologiczne na ten podregion MCSP wykrywano 14 dnia i ulegały one znaczącemu zwiększeniu po dawce przypominającej. Wyniki wskazują, że myszy immunizowane Fc-GMCSF i Fc-MCSP produkowały wyższe miana przeciwciał przeciwko MCSP (zaciemnione trójkąty) niż myszy immunizowane samym Fc-MCSP (niewypełnione kwadraty).
P r z y k ł a d X
Immunizacja białkiem fuzyjnym Fc zawierającym antygen wirusowy.
Opracowanie skutecznej szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV), który powoduje AIDS, jest jednym z najważniejszych celów w pracach nad szczepionkami. Obecnie w kilku publikacjach wykazano, że pewne właściwości otoczki wirusowej służą do zmylenia odpowiedzi immunologicznej, tak aby przeciwciała odpowiadały na nie mające znaczenia epitopy, które maskują ważne regiony cząsteczki wirusa, które mogą być zneutralizowane. Nieważne regiony cząsteczki obejmują obecność wysoce immunodominujących regionów antygenicznych, które służą jako wabiki, a nadmierna glikozylacja, fizycznie maskuje i obniża immunogenność ważnych epitopów (Wyatt i wsp. (1998) Nature 393: 705-11).
Jedna możliwa droga obejścia tego mechanizmu obejmuje ekspresję małych regionów genu osłonki wirusa, co pozwala uniknąć odpowiedzi immunodominujących, które nie są ochronne i aby indukować odpowiedź neutralizującą. Problemem w przypadku małych podjednostek w szczepionkach jest ich obniżona immunogenność zarówno jako peptydu syntetycznego lub jako małego białka. Rozwiązaniem było sprzęganie białka lub peptydu z immunogennym nośnikowym białkiem, takim jak hemocyjanina z Fissurwellidae (keyhole limpet hemocyanin - KLH). Indukuje to silną odpowiedź na
PL 201 664 B1 zależne od białka lub peptydu KLH. Inne rozwiązanie polegało na otrzymaniu białka fuzyjnego z Fc jak opisano w przykładzie I z wykorzystaniem podregionu na przykład, ektodomeny gp41 (domena zakotwiczająca wirusową otoczkę, gp 160). Inaczej niż inne nośniki, region immunoglobulinowy jest widziany jako sam, dzięki czemu minimalizuje się wszelkie działania immunodominujące.
Konstrukt fuzyjny Fc-gp41pep626 zawierał polipeptyd złożony z 44 aminokwasów połączony z końcem karboksylowym mysiego immunoglobulinowego regionu Fc. Sekwencja szczepu IIIB HIV w tym regionie zawiera sygnał glikozylacji przez N, tak że białko fuzyjne Fcgp41 pep626, produkowane w komórkach 293 w przejściowej ekspresji, lub w komórkach szpiczaka NS/0 po stabilnej transfekcji, wykazała wysoki poziom zmian w analizie mobilności w żelu SDS-PAGE, co sugeruje heterogenność w zakresie glikozylacji.
Pomimo, że ten wirusowy antygen był całkiem mały (44 reszt aminokwasowych długości) i ulegał zmiennej glikozylacji, możliwe było wywołanie odpowiedzi immunologicznej u myszy Balb/c (patrz, Fig. 14). W tym przypadku, grupy po pięć myszy poddano iniekcji podskórnie 25 μg Fc-gp41pep626 w dniu 1, i myszy otrzymały dwukrotną dawkę w dwutygodniowych okresach, samego (niewypełnione romby) lub w połączeniu z 2,5 μg adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, Fc-GMCSF (niewypełnione kwadraty) lub Fc-IL2 (zaciemnione trójkąty). Fig. 14A i 14B przedstawiają miana przeciwciał uzyskane odpowiednio 7 i 33 dnia po drugiej dawce przypominającej.
Odpowiedzi immunologiczne były bardziej zależne do łącznego podawania Fc-cytokiny, i dłużej trwało osiągnięcie wysokiego miana. Uważa się, że wyższe odpowiedzi immunologiczne mogą być wywołane dzięki zastosowaniu modyfikacji tych sekwencji, które nie zawierają sygnału glikozylacji (faktycznie, wiele szczepów nie koduje tego miejsca) lub w wyniku enzymatycznego usuwania in vitro węglowodorowych łańcuchów bocznych.
P r z y k ł a d XI
Aktywność adiuwantowa białka fuzyjnego Fc zawierającego zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki powierzchniowej komórki
Do uzyskania adiuwantowego białka fuzyjnego Fc, czasami wskazane jest połączenie Fc z zewnątrzkomórkową domeną białka, która jest związana z błoną. Na przykład, ligand CD40 (CD40L) jest połączony z Fc końcem N na końcu C. Można zastosować linker.
CD40L jest użyteczny ze względu na fakt, że jego receptor, CD40, ulega ekspresji na powierzchni limfocytów B i jest zaangażowany w stymulację limfocytów B przez limfocyty T. CD40L, podobnie jak czynnik martwicy nowotworów jest trimerem, który powoduje dimeryzację lub trimeryzację swojego receptora na powierzchni komórki. W rezultacie, wewnątrzkomórkowe domeny receptora wchodzą ze sobą kontakt i następuje przekazanie sygnału. Podobnie jak TNF, również CD40L może być związany z błoną, ale może również być odcinany z powierzchni komórki i działać jako cytokina.
Białko fuzyjne Fc-CD40L podawano zwierzętom łącznie z białkiem fuzyjnym antygen-Fc. W doświadczeniach kontrolnych, białko Fc-CD40L i antygen białkowy Fc były podawane różnym grupom zwierząt. Uważa się, że zwierzęta, którym wstrzyknięto oba białka fuzyjne produkują wyższe miano przeciwciał niż zwierzęta, którym wstrzyknięto każde białko fuzyjne osobno. W innym rozwiązaniu, stosowane jest jedno białko fuzyjne-Fc zawierające zarówno antygen, jak i część cząsteczki CD40L, z ewentualnymi liknerami (L) pomiędzy Fc, CD40L, a resztami antygenowymi. Białko fuzyjne może mieć budowę od końca N do końca C: Fc-(L)-antygen- (L)-CD40L, FC-(L)-CD40L- (L)-antygen, antygen) L)-CD40L- (L)-Fc, CD40L- (L)antygen- (L)-Fc, antygen- (L)-Fc-(L)-CD40L, lub CD40L-Fc-(L)-antygen- (L). Białko fuzyjne obejmujące Fc, antygen, i CD40L wstrzykiwano zwierzętom i miana przeciwciał następnie mierzono.
Uważa się, że miana przeciwciał wytwarzane w wyniku iniekcji białka fuzyjnego zarówno CD40L jak i antygenu są wyższe niż miana otrzymane w wyniku iniekcji białek fuzyjnych zawierających tylko Fc i antygen lub Fc i CD40L.
W powyższych sposobach podawania białek fuzyjnych, zwierzętom wstrzykuje się białka dożylnie, podskórnie, lub innymi odpowiednimi sposobami podawania. Czasy pomiędzy pierwotnym podawaniem antygenów i/lub adiuwantów a dawką przypominającą i pomiar miana przeciwciał prowadzono jak opisano w poprzednich przykładach.
W innym rozwiązaniu, stosowane są standardowe dawkowanie i sposoby przeprowadzania testów.
Równoważniki
Wynalazek może być realizowany w innych postaciach, bez oddalania się od istoty i zasadniczych cech tego wynalazku. Powyższe rozwiązania są zatem uważane we wszelkich zakresach jako ilustrujące wynalazek, ale nie ograniczają one wynalazku opisanego tutaj. Zakres wynalazku zatem jest określony przez załączone zastrzeżenia a nie powyższy opis i wszystkie zmiany, które są w zakresie znaczeń i równoważników zastrzeżeń są objęte wynalazkiem.
PL 201 664 B1
Wykaz sekwencji <110> Gillies, Stephen D.
Lo, Kln-Ming
Wesołowski, John
Lexigen Pharroaceuticals Corp.
Białka fuzyjne Fc do wzmacniania immunogenności antygenów białkowych i peptydowych <130> ŁEX-007PC <140:· <141>
<1Ξ0> US 60/144,965 <151> 1999-07-21 <16O> 22 <17O> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2Θ <212> DNA <213> Sekwenc j a syntetyczna <220>
<223: Opis sekwencji syntetycznej: starter IL-4R <400> λ gtcccgggta tgaaggtett gcaggagc 20 <210> 2 <211> 34 <212? DNA <213>Sekwencja syntetyczna <220>
<223; Opis sekwencji syntetycznej: starter IL-4R <400 s 2 cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg 34 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213>Sekwencja syntetyczna <22 0>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter PSMA <400> 3 aagcttaaat cctccaatga agc 23 <210> 4 <211> 26 <212> DMA <213>Sekwencja syntetyczna <22C>
PL 201 664 B1
2« <2233 Opis sekwencji syntetycznej: starter PSMA <40D> 4 ctcgagttag gcfcacttcac tcaaag <210> 5 <2113 30 <2123 DNA <213>Sekwencja syntetyczna . <220 3 <223> Opis sekwencji syntetycznej: starter EpCAM <400> 5 occcgggtaa aoaggaagaa tgtgtctgtg <210> 6 <2113 28 <212> IMA <2133 Sekwencja syntetyczna «220» <223> Opis sekwencji syntetycznej <400> 6 otogagtcat tttagaccct gcattgag <210> 7 <2113 24 <212> DWA <213> Sekwencja syntetyczna starter EpCAM
2Θ «220» <223>
Opis sekwencji syntetycznej: starter EpCAM <400> 7 tatagagcag catggcgccc ccgc <210> 8 «211» 28 <2123 DMA <213> Sekwencja syntetyczna .
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter EpCAM <400> 8 ccttaagcac cctgcattga gaattcag <21O> 9 <211> 148 <2123 DMA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223s Opis sekwencji syntetycznej: DNA kodujący reszty aminokwasowe 626 do 669 HIV IIIB gp 41 <4003 9 ' ’ cccgggatcc ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60
PL 201 664 B1 gaaggagetg ctggagctcg aeaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120 ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag 14B <21O> 10 <211> 44 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223; Opis sekwencji syntetycznej: polipepyd fuzyjny z wektora pdC7mufC _ <40O> 10
Sec 1 Leu Ile His Ser 5 Leu Ile Olu Olu Ser 10 Gin Aen Gin Gin Glu Lys 15
Asn Olu Gin Olu Leu Leu Olu Leu Asp Lya Trp Ala Ser Leu Trp Asn
20 25 30
Trp Pha Aan Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
35 40
<210> 11 <211> 30 <212> DNA.
<213> Sekwencja syntetyczna .
<320 >
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego 112 <400> 11 ggcccgggta aagcacccac ttcaagetec 30 <210> 12 <211? 25 <212i DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego 112 <400> 12 ccctcgagtt attgagggct tgttg 25 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223? Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego CMCSF <400> 13 cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc <210> 14
PL 201 664 B1 <211? 29 <212? DNA <213? Sekwencja syntetyczna <220?
<223: Opis sekwencji syntetycznej;
starter dla mysiego GMCSF <400? 14 ctcgagtcat ttttggcttg g-tŁŁŁttgc 29 <210? 15 <211? 29 <212? DNA <213 ? Sekwencja syntetyczna <220?
<223; Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego ligandu Flt3 <400? 15 caagcttaca cctgactgtt acttcagc 2g <210? 16 <211? 30 <212? DNA <213? Sekwencja syntetyczna <220?
<223? Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego ligandu F1Ł3 <400? 16 ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc <210? 17 <211? 2B <212? DNA <213? Sekwencja syntetyczna <220?
<223? Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego IL-12p35 <400? 17 cccogggtag ggtcattcca gtctctgg <210? la <211? 26 <212? DNA <213? Sekwencja syntetyczna <220?
<223? Opis sekwencji syntetycznej mysiego IL-12p35 «400» 18 ctcgagtcag gaggagctca gatago <210? 19 starter dla
PL 201 664 B1 <211» 28 <212» DNA <213» Sekwencja syntetyczna <220?
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego 1112 p40 <400> 19 tctagaceat gtgtcctcag aagctaac 2B <210? 20 «211» 25 <212» DNA <213»Sekwencja syntetyczna <220» «223» opis sekwencji syntetycznej: starter dla mysiego 1112 p40 <400» 20 ctagagctag gatcggaccc tgcag 25 <210» 21 <211» 83 <312» PRT <213» Sekwencja syntetyczna <220:
<223: Opis sekwencji syntetycznej: peptyd MSCP <400» 21
Gin 1 Gly Ala Thr Leu S Arg Leu Aep Pro Thr 10 Val Leu Asp Ala Gly 15 Glu
Leu Ala Asn Arg 20 Thr Gly Ser Val Pro 25 Arg Phe Arg Leu Leu 30 Glu Gly
Αχ® Hie Gly 35 Arg Val Val Arg Val 40 Pro Arg Ala Arg Thr 45 Glu Pro Gly
Gly Sar 50 Gin. Leu val Glu Gin 55 Ph* Thr Sin Gin Asp 60 Leu Glu Aep Gly
Arg 65 Leu Gly Leu Glu Val 70 Gly Arg Pro Glu Gly Arg 75 Ala Pro Gly Pro BO
Als Gly Aep <2l0> 22 <211» 20 <212> DNA <213>Sekwencja syntetyczna <320>
<223>
Opis sekwencji syntetycznej: oligodezoksynukleotyd, który może być użyty jako adjuwant
PL 201 664 B1

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka, znamienna tym, że zawiera:
    białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z antygenem oraz białko fuzyjne zawierające stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha, z wykluczeniem części zmiennej, połączony wiązaniem polipeptydowym z białkiem adiuwantowym, gdzie immunoglobulinowe stałe regiony pochodzą od tych samych gatunków oraz wiążą się z receptorem Fc.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencje ludzkich immunoglobulinowych stałych regionów.
  3. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że białkiem adiuwantowym jest cytokina.
  4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że cytokina jest wybrana z grupy obejmującej interferon: gamma-IFN, interleukinę: IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, czynnik martwicy nowotworu - TNF oraz czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów - GM-CSF.
  5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że cytokina jest GM-CSF.
  6. 6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4, znamienna tym, że antygen jest wybrany z grupy obejmującej antygen błonowy specyficzny dla prostaty - PSMA, ektodomena receptora cytokiny, białko wirusowe oraz antygen specyficzny dla nowotworu.
  7. 7. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4, znamienna tym, że każdy stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha białek fuzyjnych zawiera region zawiasowy.
  8. 8. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4, znamienna tym, że każdy stały region immunoglobulinowego ciężkiego łańcucha białek fuzyjnych zawiera domenę CH2 i CH3.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4, znamienna tym, że częścią immunoglobulinową każdego białka fuzyjnego jest Fc.
  10. 10. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1, do wywarzania szczepionki do wywoływania zwiększonej odpowiedzi immunologicznej u ssaka przeciwko wybranemu antygenowi.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że wzmocnienie immunogenności następuje gdy białko fuzyjne jest w obecności adiuwantowego białka fuzyjnego.
  12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11 albo 12, znamienne tym, że białka fuzyjne są przeznaczone do podawania jednoczesnego.
PL353344A 1999-07-21 2000-07-21 Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki PL201664B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14496599P 1999-07-21 1999-07-21
PCT/US2000/019816 WO2001007081A1 (en) 1999-07-21 2000-07-21 Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353344A1 PL353344A1 (pl) 2003-11-17
PL201664B1 true PL201664B1 (pl) 2009-04-30

Family

ID=22510982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353344A PL201664B1 (pl) 1999-07-21 2000-07-21 Kompozycja do wzmacniania immunogenności antygenów peptydowych lub białkowych u ssaka i zastosowanie kompozycji do wytwarzania szczepionki

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7955590B2 (pl)
EP (1) EP1198250B8 (pl)
JP (1) JP4764585B2 (pl)
KR (1) KR100689739B1 (pl)
CN (1) CN1308037C (pl)
AT (1) ATE374042T1 (pl)
AU (1) AU779388B2 (pl)
BR (1) BR0012569A (pl)
CA (1) CA2378866C (pl)
CZ (1) CZ304884B6 (pl)
DE (1) DE60036552T2 (pl)
DK (1) DK1198250T3 (pl)
ES (1) ES2292457T3 (pl)
HU (1) HUP0202796A2 (pl)
MX (1) MXPA02000746A (pl)
NO (1) NO20020255L (pl)
PL (1) PL201664B1 (pl)
PT (1) PT1198250E (pl)
RU (1) RU2248214C2 (pl)
SK (1) SK782002A3 (pl)
WO (1) WO2001007081A1 (pl)
ZA (1) ZA200200501B (pl)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DE60025832T2 (de) 1999-08-09 2006-08-31 Emd Lexigen Research Center Corp., Billerica Mehrere zytokin-antikörper komplexen
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
CN1406249B (zh) 2000-02-11 2010-06-16 默克专利股份有限公司 增加基于抗体的融合蛋白的循环半衰期
PT1294401E (pt) 2000-06-29 2007-11-09 Merck Patent Gmbh Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas
GB0102145D0 (en) 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
WO2002061389A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Tanox, Inc. Methods to generate and identify monoclonal antibodies to a large number of human antigens
RU2003129528A (ru) 2001-03-07 2005-04-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
PL403488A1 (pl) * 2001-05-24 2013-07-08 Zymogenetics, Inc. Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina
EP2354791A1 (en) 2001-12-04 2011-08-10 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
CN1315536C (zh) * 2002-09-13 2007-05-16 李进 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
PT1572748E (pt) 2002-12-17 2010-09-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
AU2004308952A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Centocor, Inc. Anti-retroviral agents, compositions, methods and uses
BRPI0418286A (pt) 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
KR20060124656A (ko) 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
JP2007517506A (ja) 2004-01-05 2007-07-05 イーエムディー・レキシゲン・リサーチ・センター・コーポレーション 標的化用化合物
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN101072793B (zh) 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US20070104689A1 (en) 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
US20090238822A1 (en) * 2005-10-13 2009-09-24 Virexx Medical Corp. Chimeric Hepatitis C Virus Antigens For Eliciting an Immune Response
BRPI0620797A2 (pt) 2005-12-30 2011-11-22 Merck Patent Ges Mit Beschonkter Haftung anticorpos anti-il-6 que previnem a ligação de il-6 complexado com il-6ralfa a gp130
DK2270050T3 (da) 2005-12-30 2013-08-12 Merck Patent Gmbh Anti-CD19-antistoffer med nedsat immunogenicitet
CN101351475B (zh) * 2005-12-30 2013-05-15 默克专利有限公司 具有提高的稳定性的白细胞介素12p40变体
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP3056568B1 (en) * 2006-03-31 2021-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
RU2325172C2 (ru) * 2006-07-24 2008-05-27 Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ФГУ РКНПК Росздрава) Сорбент для удаления иммуноглобулинов
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
RU2526512C2 (ru) 2007-09-26 2014-08-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Модифицированная константная область антитела
AU2008304756B8 (en) 2007-09-26 2015-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-IL-6 receptor antibody
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
WO2009072604A1 (ja) * 2007-12-05 2009-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗nr10抗体、およびその利用
CA2721052C (en) 2008-04-11 2023-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US8383767B2 (en) * 2008-06-27 2013-02-26 Academia Sinica Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
EP2409990A4 (en) 2009-03-19 2013-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANT OF A CONSTANT ANTIBODY REGION
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2010238858A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
KR20120024763A (ko) 2009-05-15 2012-03-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ａｘｌ 항체
EA017172B1 (ru) * 2009-08-04 2012-10-30 Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" Способ получения изоиммунной плазмы крови
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
GB0922209D0 (en) 2009-12-18 2010-02-03 Univ Nottingham Proteins, nucleic acid molecules and compositions
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9347951B2 (en) 2010-10-28 2016-05-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Fusion protein comprising the extracellular domain of a filovirus glycoprotein fused to an immunoglobulin heavy chain constant region
KR101962483B1 (ko) 2010-11-17 2019-03-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
CN103328632A (zh) 2010-11-30 2013-09-25 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
CN112812184A (zh) 2011-02-25 2021-05-18 中外制药株式会社 FcγRIIb特异性Fc抗体
CN102212139A (zh) * 2011-03-29 2011-10-12 中国人民解放军第二军医大学 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
CN111978409B (zh) 2013-03-15 2024-01-26 因斯瑞拜奥有限公司 自组装合成蛋白
CN103212069B (zh) * 2013-05-13 2014-07-30 上海赛伦生物技术有限公司 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
EP3017048A4 (en) * 2013-07-01 2017-05-17 University of Maryland, College Park Fc coupled compositions and methods of their use
MX377339B (es) * 2013-08-28 2025-03-06 Abbvie Stemcentrx Llc Metodos de conjugacion de anticuerpos especificos de sitio y composiciones.
AU2014325063B2 (en) 2013-09-27 2019-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
PL3482766T3 (pl) 2014-08-11 2020-11-16 Delinia, Inc. Modyfikowane warianty il-2, które selektywnie aktywują limfocyty t regulatorowe do leczenia chorób autoimmunologicznych
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TW201627318A (zh) * 2014-10-22 2016-08-01 臺北醫學大學 膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用
IL278014B2 (en) 2014-12-19 2023-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variable FC regions and methods of use
AR103162A1 (es) 2014-12-19 2017-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y métodos para su uso
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CN107847594B (zh) 2015-05-06 2022-04-15 詹森生物科技公司 前列腺特异性膜抗原(psma)双特异性结合剂及其用途
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US10697883B2 (en) 2015-05-19 2020-06-30 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient
WO2016199904A1 (ja) * 2015-06-10 2016-12-15 国立大学法人東京大学 ワクチン用アジュバント、ワクチン、及び免疫誘導方法
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
BR112018009312A8 (pt) 2015-12-28 2019-02-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd método para promover eficiência de purificação de polipeptídeo contendo região de fc
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
SG11201807765PA (en) 2016-04-28 2018-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody-containing preparation
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2017220989A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN106177932A (zh) * 2016-07-03 2016-12-07 查文娟 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗
CN109689099B (zh) 2016-08-05 2023-02-28 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EA201991142A1 (ru) 2016-11-08 2019-10-31 Варианты il-2 для лечения аутоиммунных заболеваний
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
WO2019078344A1 (ja) 2017-10-20 2019-04-25 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
CR20240273A (es) 2017-11-01 2024-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Variantes e isoformas de anticuerpos con actividad biológica reducida (divisional 2020-229)
MA51291A (fr) 2017-12-19 2020-10-28 Xencor Inc Protéines de fusion il-2 fc modifiées
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
CA3091184A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Viela Bio, Inc. Antibodies to feline mcdonough sarcoma (fms)-like tyrosine kinase 3 receptor ligand (flt3l) and uses thereof for treating autoimmune and inflammatory diseases
TWI887899B (zh) 2018-03-15 2025-06-21 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體之用途
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
CN112566494B (zh) 2018-06-12 2023-05-23 Kbio控股有限公司 病毒和抗原纯化和偶联
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
CN112566650A (zh) * 2018-06-21 2021-03-26 沙塔克实验室有限公司 异二聚体蛋白及其用途
CN112888711A (zh) * 2018-08-29 2021-06-01 沙塔克实验室有限公司 基于flt3l的嵌合蛋白
US20220002370A1 (en) 2018-09-27 2022-01-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
WO2020118605A1 (zh) * 2018-12-13 2020-06-18 丁邦 抗体-肿瘤坏死因子α融合蛋白及其制法和应用
CN113811549A (zh) 2019-02-21 2021-12-17 Xencor股份有限公司 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白
US20220177550A1 (en) * 2019-03-28 2022-06-09 Orionis Biosciences, Inc. Chimeric proteins and chimeric protein complexes directed to fms-like tyrosine kinase 3 (flt3)
WO2020236655A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusi0n proteins
CN115916233A (zh) 2019-10-03 2023-04-04 Xencor股份有限公司 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
US20230043257A1 (en) * 2020-01-21 2023-02-09 Jinyu Zhang Pharmaceutical composition and use thereof
CN115210249A (zh) * 2020-02-28 2022-10-18 赛特瑞恩股份有限公司 水痘带状疱疹病毒融合蛋白以及包含该融合蛋白的免疫原性组合物
TW202204388A (zh) * 2020-04-01 2022-02-01 美商艾希利歐發展股份有限公司 經遮蔽之il-2細胞激素及其裂解產物
JP7681041B2 (ja) * 2020-04-21 2025-05-21 クビオ・ホールディングス・リミテッド ウイルス及び抗原のコンジュゲーションによって形成されるワクチン
CN118267456A (zh) * 2020-07-01 2024-07-02 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
EP4566671A3 (en) * 2020-07-01 2025-09-24 Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences Construction and application of fusion protein vaccine platform
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
TW202235431A (zh) 2020-11-25 2022-09-16 美商艾希利歐發展股份有限公司 腫瘤特異性可裂解連接子
AU2021410089B2 (en) * 2020-12-23 2025-06-05 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
JP2024508683A (ja) 2021-03-04 2024-02-28 ヘリックス ナノテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｓｂｉアジュバントを含む組成物及びその使用方法
CU24734B1 (es) * 2021-03-30 2025-02-07 Ct Inmunologia Molecular Composicones vacunales depletantes de factores de crecimiento hematopoyéticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
CN120022357A (zh) * 2021-03-31 2025-05-23 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
CN116375881A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 广州国家实验室 融合蛋白疫苗
WO2023178169A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Anemoi Biotech Holdings, Inc. Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection
US20250327799A1 (en) * 2022-05-16 2025-10-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating caveolinopathy diseases
CN114699521B (zh) * 2022-06-07 2023-02-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用
CN119613573B (zh) * 2025-02-14 2025-05-30 浙江大学 一种CD40L-Fc融合蛋白、基因片段、重组质粒、重组细胞以及制备方法和用途

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US650064A (en) * 1898-11-14 1900-05-22 Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company System of liquid distribution.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) * 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
ES2073394T3 (es) 1987-06-10 1995-08-16 Dana Farber Cancer Inst Inc Constructos de anticuerpos bifuncionales y su utilizacion para destruir selectivamente las poblaciones celulares.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
DE3880766D1 (de) 1987-09-02 1993-06-09 Ciba Geigy Ag Konjugate von interferon alpha mit immunglobulinen.
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
ES2058199T3 (es) 1987-09-23 1994-11-01 Bristol Myers Squibb Co Heteroconjugados de anticuerpos para la eliminacion de celulas infectadas por el vih.
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
ZA888978B (en) 1987-12-04 1990-07-25 Du Pont Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6750329B1 (en) 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
AU648509B2 (en) * 1989-07-14 1994-04-28 Wyeth Holdings Corporation Stable vaccine compositions containing interleukins
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
DE69034249T2 (de) 1989-12-22 2008-05-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Monoklonale Antikörper spezifisch für den zytotoxischen Lymphozyten-Reifefaktor
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
WO1992015609A1 (en) * 1991-03-11 1992-09-17 The General Hospital Corporation Compositions and methods to inhibit the activation of active factor xiii
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
AU651228B2 (en) 1991-05-31 1994-07-14 Genentech Inc. Treatment of HIV-associated immune thrombocytopenic purpura
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993005169A1 (en) 1991-08-30 1993-03-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
DK0654085T3 (da) 1992-01-23 1997-09-22 Merck Patent Gmbh Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner
ATE260971T1 (de) 1992-04-01 2004-03-15 Univ Rockefeller Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
WO1994009820A1 (en) 1992-11-05 1994-05-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
CN1079830C (zh) 1993-04-20 2002-02-27 索利斯治疗学公司 对受胞内传染原感染的个体进行治疗的方法和物质
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
FI955128L (fi) 1993-04-29 1995-10-27 Abbott Lab Erytropoietiinianalogikoostumuksia ja menetelmä niiden valmistamiseksi ja käyttämiseksi
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
WO1995029242A1 (en) 1994-04-26 1995-11-02 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
CA2560114A1 (en) * 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
JPH11501506A (ja) * 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
MX9706827A (es) 1995-03-10 1997-11-29 Genentech Inc Activacion de receptor por gas6.
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
JPH11507632A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 トリメリス，インコーポレーテッド 併用療法を用いたｈｉｖおよび他のウイルス感染の治療
KR19990028388A (ko) 1995-06-30 1999-04-15 피터 지. 스트링거 당뇨병 치료 방법
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
ATE298367T1 (de) 1996-04-26 2005-07-15 Beth Israel Hospital Interleukin-15 antagoniste
CN1136197C (zh) 1996-05-30 2004-01-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新的哒嗪酮衍生物
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
DK0826696T3 (da) 1996-09-03 2002-09-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Anvendelse af bi- og trispecifikke antistoffer til inducering af en tumorimmunitet
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6737057B1 (en) * 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
PT973550E (pt) 1997-04-11 2003-01-31 Searle & Co Anticorpos antagonistas anti-integrina avb3
WO1998056807A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Gryphon Sciences Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
EP1071468B1 (en) 1998-04-15 2006-06-14 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
MXPA00010151A (es) 1998-04-17 2002-08-06 Lexigen Pharm Corp Mejoramiento de las respuestas inmunes mediadas por proteina de fusion de anticuerpo-citocina mediante la soadministracion con inhibidores de prostaglandina.
US6284536B1 (en) 1998-04-20 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobin molecules and methods for use thereof
EP1088888A4 (en) 1998-05-14 2005-03-16 Merck Patent Gmbh MERGED PROTEIN
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ES2342239T3 (es) 1998-08-25 2010-07-02 Merck Patent Gmbh Expresion y exportacion de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU1262900A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
CZ20012406A3 (cs) 1999-01-07 2002-03-13 Lexigen Pharmaceuticals, Corp. Exprese a export proteinů působících proti obezitě jako Fc fúzních proteinů
KR100873157B1 (ko) 1999-05-06 2008-12-10 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
ES2291205T3 (es) 1999-05-19 2008-03-01 Merck Patent Gmbh Expresion y exportacion de proteinas interferon alfa como proteinas de fusion fc.
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
JP2003503426A (ja) * 1999-07-02 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＦＶＩＩａアンタゴニスト
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DE60025832T2 (de) 1999-08-09 2006-08-31 Emd Lexigen Research Center Corp., Billerica Mehrere zytokin-antikörper komplexen
ATE392479T1 (de) * 1999-10-20 2008-05-15 Univ Johns Hopkins Med Chimäre immunogene zusammensetzungen und dafür kodierende nukleinsäure
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
CN1406249B (zh) 2000-02-11 2010-06-16 默克专利股份有限公司 增加基于抗体的融合蛋白的循环半衰期
DK1719528T3 (da) 2000-02-24 2012-01-09 Philogen Spa Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af angiogenese i patologiske læsioner
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
WO2001088117A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Neose Technologies, Inc. In vitro fucosylation recombinant glycopeptides
PT1294401E (pt) 2000-06-29 2007-11-09 Merck Patent Gmbh Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
BR0116803A (pt) 2001-01-18 2004-02-17 Merck Patent Gmbh Proteìnas de fusão bifuncionais com atividade de glicocerebrosidase
EP1998266A3 (en) 2001-02-19 2009-02-11 Merck Patent GmbH Method for identification of T-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
KR20040074587A (ko) 2001-02-19 2004-08-25 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 인공 단백질
RU2003129528A (ru) 2001-03-07 2005-04-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE10118308A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
JP2005507870A (ja) 2001-08-13 2005-03-24 ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア 低毒性のインターロイキン−２突然変異体
EP2354791A1 (en) 2001-12-04 2011-08-10 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
EP1478394B1 (en) * 2002-02-27 2008-07-30 Immunex Corporation Stabilized TNFR-Fc composition comprising arginine
CA2479212A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
PT1572748E (pt) 2002-12-17 2010-09-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2
HUE026384T2 (en) * 2003-05-06 2016-06-28 Biogen Hemophilia Inc VII coagulation factor-FC chimeric proteins for the treatment of hemostasis disorder
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050037947A1 (en) * 2003-05-06 2005-02-17 Bitonti Alan J. Inhibition of drug binding to serum albumin
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) * 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites

Also Published As

Publication number Publication date
SK782002A3 (en) 2003-08-05
AU6358300A (en) 2001-02-13
MXPA02000746A (es) 2002-09-18
CA2378866C (en) 2011-06-07
ZA200200501B (en) 2003-03-26
CA2378866A1 (en) 2001-02-01
CZ304884B6 (cs) 2015-01-07
ES2292457T3 (es) 2008-03-16
US20050261229A1 (en) 2005-11-24
US8043608B2 (en) 2011-10-25
KR20020020794A (ko) 2002-03-15
AU779388B2 (en) 2005-01-20
CZ2002182A3 (cs) 2003-11-12
NO20020255D0 (no) 2002-01-17
DE60036552D1 (de) 2007-11-08
HUP0202796A2 (en) 2002-12-28
WO2001007081A1 (en) 2001-02-01
EP1198250B1 (en) 2007-09-26
CN1308037C (zh) 2007-04-04
PL353344A1 (pl) 2003-11-17
CN1374871A (zh) 2002-10-16
BR0012569A (pt) 2002-05-28
NO20020255L (no) 2002-03-15
ATE374042T1 (de) 2007-10-15
JP2003505431A (ja) 2003-02-12
US20100068175A1 (en) 2010-03-18
US7955590B2 (en) 2011-06-07
JP4764585B2 (ja) 2011-09-07
EP1198250A1 (en) 2002-04-24
PT1198250E (pt) 2008-01-02
DK1198250T3 (da) 2007-12-27
DE60036552T2 (de) 2008-06-26
EP1198250B8 (en) 2007-11-21
KR100689739B1 (ko) 2007-03-09
RU2248214C2 (ru) 2005-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU779388B2 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7118751B1 (en) DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40
US6749856B1 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
EP2970427B1 (en) Composition comprised of antigen linked to a tnf superfamily ligand
US10077296B2 (en) Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer
TW201938793A (zh) 一種新型疫苗佐劑
WO2019101062A9 (zh) 重组疫苗及其应用
AU757310B2 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US7011833B1 (en) Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent
JP2023549112A (ja) Ｉｌ－７タンパク質とヌクレオチドワクチンの組み合わせで腫瘍を治療する方法
CA3194929A1 (en) Modified cxcl10 for immunotherapy of cancer diseases
US20090074814A1 (en) DNA Vaccines Encoding Antigen Linked to a Domain That Binds CD40
KR20250043313A (ko) 신규 백신 조성물
HK40009043A (zh) 靶向检查点分子的dna单克隆抗体