BRPI0620795A2 - anticorpos anti-cd19 imunogenicidade reduzida - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD19 COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA. A presente invenção refere-se a anticorpos B4 anti-CD19 com regiões variáveis modificadas. Os polipeptídeos da região variável anti-CD19 modificada têm alterações para uma ou mais regiões de estrutura ou regiões determinantes de complementaridade da região variável de cadeia pesada ou da região variável de cadeia leve, por meio disso para reduzir uma res- posta de célula T.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-CD19 COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se de um modo geral às regiões va- riáveis da cadeia leve e da cadeia pesada B4 do anticorpo monoclonal de murino anti-CD19 modificadas para reduzir suas imunogenicidades. Antecedentes

CD19 é uma proteína de superfície encontrada nas células B e em certas células cancerosas derivadas das células B, tais como muitos Iin- fomas de células B. Anticorpos monoclonais anti-CD19 foram gerados em camundongos, e apresentam alguma promessa em modelos de animais pré- clínicos de cânceres derivados de células B. Entretanto, anticorpos deriva- dos de camundongos são geralmente imunogênicos em seres humanos. Uma variedade de estratégias foi desenvolvida para alterar anticorpos deri- vados de camundongos para minimizar as suas imunogenicidades em seres humanos. Tal estratégia, a quimerização, envolve a fusão das regiões variá- veis de camundongos em relação às regiões constantes humanas. Entretan- to, as seqüências da região variável derivada de camundongos remanescen- tes após a quimerização serão geralmente imunogênicas. Outra tal estraté- gia, a humanização, envolve a substituição de regiões de estrutura derivadas de camundongos (FRs) nas regiões variáveis com as seqüências derivadas humanas mais intimamente relacionadas, com a reversão opcional de certos aminoácidos de volta para o aminoácido de camundongo correspondente para manter a atividade de ligação. Entretanto, mesmo anticorpos humani- zados podem ser imunogênicos, uma vez que as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo geralmente contêm epitopos de células B e epitopos de células T que não são seguros. De fato, mesmo anti- corpos completamente humanos são imunogênicos; essa é a base para a formação de anticorpos antiidiotipo durante o curso de uma resposta imune. Todos esses problemas podem se aplicar aos anticorpos anti-CD19 deriva- dos de camundongos, uma vez que eles poderiam para qualquer outro tipo de anticorpo. Conseqüentemente, existe uma necessidade por anticorpos anti-CD19 com imunogenicidade reduzida. Sumário da Invenção

A presente invenção é direcionada para um anticorpo B4 mono- clonal de murino anti-CD19, o qual tenha sido modificado para reduzir a sua imunogenicidade em comparação com o anticorpo B4 de tipo selvagem. Mais especificamente, a região variável do anticorpo B4 da invenção é modi- ficada para remover epitopos de células T potenciais. Como resultado, anti- corpos B4 da invenção têm propriedades biológicas melhoradas em compa- ração com anticorpos B4 do tipo selvagem.

Concordantemente, em um aspecto, a invenção exibe uma se- qüência de aminoácidos definindo uma região de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina modificada compreendendo resíduos de aminoácidos de 1 a 30 da SEQ ID NO: 22, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições X5, X12, X19, X20, X23 e X24 são como se segue: X5 é Q ou Ε, X12 é V ou Κ, X19 é R ou Κ, X20 é L ou V, X23 é Κ, E ou D ou X24 é T ou A. De acordo com esse aspecto da invenção, pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições X5, X12, X19, X20, X23 ou X24 não è o mes- mo resíduo de aminoácido que o aminoácido na posição correspondente na região de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina não-modificada que o estabelecido nos resíduos de aminoácidos de 1 a 30 da SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, X23 é E ou D.

Em outro aspecto, a invenção exibe uma seqüência de aminoá- cidos definindo uma região de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina modificada compreendendo os resíduos de aminoácidos de 1 a 14 da SEQ ID NO: 23, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições X3, X5, X7 e X8 são como se segue: X3 é K ou R, X5 é R, T ou A, X7 é G, D ou E ou X8 é Q ou K. De acordo com esse aspecto da invenção, pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições X3, X5, X7 ou X8 não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente na região de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina não-modificada conforme estabelecido nos resíduos de aminoácidos 36 a 49 da SEQ ID NO: 13. Em uma modali- dade, X7 é E ou D. Em um aspecto, a invenção exibe uma seqüência de aminoáci- dos definindo uma região de estrutura da cadeia pesada de imunoglobulina modificada compreendendo resíduos de aminoácidos de 1 a 39 da SEQ ID NO: 24, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições X6, X10, X26, X29 e X34 são como se segue: X6 é K1 D ou Ε, X10 é Κ, E ou D, X26 é S, D ou Ε, X29 é S ou A ou X34 é V ou T. De acordo com esse aspec- to da invenção, pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições X6, X10, X26, X29 ou X34 não é o mesmo que o aminoácido na posição cor- respondente na região de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina não-modificada conforme estabelecido nos resíduos de aminoácidos 60 a 98 da SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, X10 é E ou D.

De acordo com outro aspecto, a invenção exibe uma seqüência de aminoácidos definindo uma região de estrutura de cadeia leve de imuno- globulina modificada compreendendo resíduos de aminoácidos de 1 a 23 da SEQ ID NO: 32, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posi- ções X1, X3, X7, X10, X11 e X19 são como se segue: X1 é Q ou D, X3 é V ou A, X7 é S ou Ε, X10 é I ou Τ, X11 é M ou L ou X19 é V ou A. De acordo com esse aspecto da invenção, pelo menos um dos resíduos de aminoáci- dos nas posições X1, X3, X7, X10, X11 ou X19 não é o mesmo que o ami- noácido na posição correspondente na região da estrutura de cadeia leve de imunoglobulina não-modificada conforme estabelecido nos resíduos de ami- noácidos de 1 a 23 da SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, X3 é A e X7 é E. Em outra modalidade, X1 é D, X10 é I e X11 é L.

Em outro aspecto, a invenção exibe uma seqüência de aminoá- cidos definindo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve de imunoglobulina modificada compreendendo os resíduos de aminoá- cidos 24 a 33 da SEQ ID NO: 28.

Em outro aspecto, a invenção exibe uma seqüência de aminoá- cidos definindo uma região de estrutura de cadeia leve de imunoglobulina modificada compreendendo resíduos de aminoácidos 56 a 87 da SEQ ID NO: 28.

De acordo com outro aspecto, a invenção exibe uma região vari- ável de anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecio- nada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 31, em que a região variável do anticorpo se liga especificamente ao CD19.

De acordo com outro aspecto, a invenção exibe um polipeptídeo pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntico a uma região variável de ca- deia pesada de anticorpo B4, o polipeptídeo compreendendo uma substitui- ção de aminoácido em um ou mais resíduos correspondendo à VaM 2, Leu20, Lys23, Thr24, Lys38, Gly42, Gln43, Lys65, Lys69, Ser85, Ser88 ou Val93. Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende uma ou mais substi- tuições GlnõGIu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, T- hr24Ala, Lys38Arg, Arg40Thr, Gly42Asp, Gly42Glu, Gln43Lys, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu, Ser88Ala ou Val93Thr.

De acordo com outro aspecto, a invenção exibe um polipeptídeo pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntico a uma região variável de ca- deia leve do anticorpo B4, o polipeptídeo compreendendo uma substituição de um aminoácido em um ou mais resíduos correspondendo a Val3, Ser7, Ile10, MetH, Val19, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 ou Ser75. Em uma modali- dade, o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições GInIAsp, Val3Ala, Ser7Glu, IIeIOThr, MetHLeu1 Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp ou Ser75Glu.

Em outro aspecto, a invenção exibe um ácido nucléico codifi- cando um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção.

Em outro aspecto, a invenção exibe um método de tratamento de um paciente, o método compreendendo o etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com qual- quer uma das modalidades da invenção a um paciente.

Em outro aspecto, a invenção exibe um método para direcionar uma célula com CD19 na sua superfície, o método compreendendo a etapa de administrar uma região variável de anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção. Em uma modalidade do método, a célula é uma célula tumoral.

Em suma, a invenção se refere a:

Um anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, porém ainda é competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes regiões de estrutura de cadeia pesada de imuno- globulina:

(i) Qvqlx5Qpgaevx12Kpgasvx19X2OscX23X24Sgytft (seq id no: 22)

Em que X5 é Q ou E, Xi2 é V ou K, X19 é R ou K, X20 é L ou V, X23 é Κ, E ou D e X24 é T ou A, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas referidas posições não é o mesmo que o ami- noácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos 1 a 30 da SEQ ID NO: 13.

(ii) WVX3QX5PX7X8GLEWIG (SEQ ID NO:23)

Em que X3 é K, X5 é R, A, ou T, X7 é G e X8 é Q ou K, com a condição de que um dos resíduos de aminoácidos na posição X5 ou X8 não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos 36 a 49 da SEQ ID NO: 13.

(iii) YNQKFX6GKAX10LTVDKSSSTAYMEVSX26LTX29EDSAX34YYCAR (SEQ ID NO: 24),

Em que X6 é K, D ou E, X10 é Κ, E ou D, X26 é S, D ou E, X29 é S ou A e X34 é V ou T, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas referidas posições não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos 60 a 98 da SEQ ID NO: 13.

• Anticorpo modificado correspondente, compreendendo as regiões da estrutura da cadeia pesada (i), (ii) e (iii);

• Anticorpo B4 modificado correspondente, o qual é menos imunogêni- co do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser hu- mano, porém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compre- endendo as seguintes regiões de estrutura de cadeia leve de imunoglobuli- na:

(iv) X1lX3LTQX7PAX10X11SASPGEKXi9TMTC(SEQ ID NO: 32) em que X1 é Q ou D, X3 é V ou A, X7 é S ou E, X10 é I ou T, X11 é M ou L e X19 é V ou A, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de ami- noácidos nas posições não é o mesmo que o aminoácido na posição corres- pondente nos resíduos de aminoácidos de 1 a 23 da SEQ ID NO: 25.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente; em que X3 é A e X7 é E.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente; em que Xi é D, X10 é I e X11 é L.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente, compreendendo as re- giões de estrutura da cadeia pesada (i), (ii) e (iii) e a região de estrutura de cadeia leve (iv).

• Um anticorpo B4 modificado correspondente, compreendendo as se- guintes regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve de i- munoglobulina (CDRs): SASSGANYMH (resíduos de aminoácidos 24 a 33 da SEQ ID NO: 28).

• Um anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um humano, porém a- inda é competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.

• Um anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, porém ainda é competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia leve selecionadas do grupo consistindo na SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, e pelo menos uma das seguintes se- qüências de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente compreendendo as se- guintes cadeias pesada e leve selecionadas do grupo:

(i) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 14 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 26;

(ii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 27;

(iii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 28;

(iv) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 29; a qual é preferida;

(v) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 29, a qual é preferida.

(vi) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 20 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 30; e

(vii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 31.

• Um anticorpo B4 modificado correspondente, compreendendo as se- guintes regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve de i- munoglobulina (CDRs): SASSGANYMH (resíduos de aminoácidos 24 a 33 da SEQ ID NO: 28).

• Um polipeptídeo pelo menos 90% idêntico a uma região variável da cadeia pesada do anticorpo B4, o qual é menos imunogênico do que o anti- corpo não-modificado B4 quando administrado a um ser humano, porém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o polipeptídeo compreendendo uma substituição de a- minoácido em um ou mais resíduos correspondendo a Val12, Leu20, Lys23, Thr24, Gly42, Lys38, Lys65, Lys69, Ser85 ou Val93.

• Um polipeptídeo correspondente, em que o polipeptídeo é pelo menos 95% idêntico a uma região variável de cadeia pesada do anticorpo B4.

• Um polipeptídeo correspondente, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das substituições Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu ou Val93Thr.

• Um polipeptídeo correspondente a pelo menos 90% de identidade a uma região variável de cadeia leve do anticorpo B4, a qual é menos imuno- gênica do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, porém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o polipeptídeo compreendendo uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos correspondendo a Val3, Ser7, Ile10, Met11, VaM 9, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 ou Ser75.

• Um polipeptídeo correspondente, em que o polipeptídeo é pelo menos 95% idêntico a uma região variável da cadeia leve de anticorpo B4.

• Um polipeptídeo correspondente, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das substituições GInIAsp, Val3Ala, Ser7Glu, IIeIOThr, Metl 1 Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp ou Ser75Glu.

• Um anticorpo B4 modificado compreendendo um polipeptídeo de ca- deia pesada compreendendo as substituições dos aminoácidos Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu ou Val93Thr, e um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo as substituições dos aminoácidos GInIAsp, Val3Ala, Ser7Glu, lle10Thr, Meti 1 Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp ou Ser75Glu. • Uma molécula de DNA codificando um anticorpo B4 modificado ou o polipeptídeo correspondente conforme especificado acima e abaixo.

• Um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA cor- respondente.

• Uma célula hospedeira expressando um anticorpo B4 modificado ou um polipeptídeo correspondente conforme especificado.

• Uma composição farmacêutica adequada para o tratamento de cân- cer e de doenças auto-imunes compreendendo em uma quantidade farma- cologicamente eficaz um anticorpo ou polipeptídeo conforme especificado acima e abaixo, opcionalmente juntamente com um diluente, veículo ou ex- cipiente farmaceuticamente aceitável.

• Uso de uma composição farmacêutica correspondente para a produ- ção de um medicamento para o tratamento de doenças auto-imunes ou cân- cer.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 demonstra a seqüência de ácidos nucléicos que codifi- ca a região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 (B4 VHO) (SEQ ID NO: 1).

Figura 2 demonstra a seqüência de ácido nucléico codificando uma região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações K23E, G42D, K69E e 585D (B4 VHv1) (SEQ ID NO: 2).

Figura 3 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações K69E e S85D (VHv2 B4) (SEQ ID NO: 3).

Figura 4 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D e S88A (VHv3 B4) (SEQ ID NO:4).

Figura 5 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A e V93T (VHv4 B4) (SEQ ID NO: 5).

Figura 6 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D e V93T (VHv5 B4) (SEQ ID NO: 6).

Figura 7 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo B4 exemplar incorporan- do códons para as mutações Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D e V93T (VHv6 B4) (SEQ ID NO:7).

Figura 8 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo B4 (VKO B4) (SEQ ID NO: 8).

Figura 9 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo B4 exemplar incorporando có- dons para as mutações V3A, S7E e A54D (VKv1 B4) (SEQ ID NO: 9).

Figura 10 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo B4 exemplar incorporando có- dons para as mutações Q1D, MOT1 M11L e A54D (B4 VKv2) (SEQ ID NO: 10).

Figura 11 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo B4 exemplar incorporando có- dons para as mutações 110T, M11L, V19A, V29A e S75E (VKv3 B4) (SEQ ID NO: 11).

Figura 12 demonstra a seqüência de ácido nucléico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo B4 exemplar incorporando có- dons para as mutações 110T, M11L, V19A, S51D e L53T (VKv4 B4) (SEQ ID NO: 12).

Figura 13 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 (VH0 B4) (SEQ ID NO: 13).

Figura 14 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações K23E, G42D, K69E e S85D (VHv1 B4) (SEQ ID NO: 14).

Figura 15 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações K69E e S85D (VHv2 B4) (SEQ ID NO:15).

Figura 16 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, S85D e S88A (VHv3 B4) (SEQ ID NO: 16).

Figura 17 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A e V93T (VHv4 B4) (SEQ ID NO: 17).

Figura 18 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D e V93T (B4 VHv5) (SEQ ID NO: 18).

Figura 19 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, R19K, L20V, K65D, S85D e V93T (VHv6 B4) (SEQ ID NO: 19).

Figura 20 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações V12K, K23E, G42D, K65D, K69E e S85D (B4 VHv11) (SEQ ID NO: 20).

Figura 21 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q5E, V12K, R19K, L20V, T24A, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A e V93T (VHv34 B4) (SEQ ID NO: 21).

Figura 22 demonstra a seqüência de aminoácidos da região de estrutura da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com resíduos de ami- noácidos não-definidos X5, X12, X19, X20, X23 e X24 (VHfrl B4) (SEQ ID NO: 22).

Figura 23 demonstra a seqüência de aminoácidos da região 2 de estrutura da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com resíduos de ami- noácidos não-definidos X3, X5, X7 e X8 (VHfr2 B4) (SEQ ID NO: 23).

Figura 24 demonstra a seqüência de aminoácidos da região 3 de estrutura da cadeia pesada do anticorpo B4 exemplar com resíduos de ami- noácidos não-definidos X6, X10, X26, X29 e X34 (VHfr3 B4) (SEQ ID NO:24).

Figura 25 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia leve do anticorpo B4 (VKO B4) (SEQ ID NO: 25).

Figura 26 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações V3A, S7E e A54D (VKv1 B4) (SEQ ID NO: 26).

Figura 27 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações Q1D, I10T, M11Le A54D (VKv2 B4) (SEQ ID NO: 27).

Figura 28 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações I10T, M11L, V19A, V29A e S75E (VKv3 B4) (SEQ ID NO: 28).

Figura 29 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações I10T, M11L, V19A, S51D e L53T (VKv4 B4) (SEQ ID NO: 29).

Figura 30 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações V3A, S7E, V19A, A54D e S75E (VKv11 B4) (SEQ ID NO: 30).

Figura 31 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região

variável da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com as mutações I10T, M11L, V19A, V29A, S51 D, L53T e S75E (VKv34 B4) (SEQ ID NO: 31).

Figura 32 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região de estrutura da cadeia leve do anticorpo B4 exemplar com resíduos de ami- noácidos não-definidos Χ1, X3, X7, X10, X11 e X19 (VKfr1 B4) (SEQ ID NO: 32).

Figura 33 demonstra a seqüência de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade da cadeia leve do anticorpo B4 exem- plar com resíduos de aminoácidos não-definidos X3, X5 e X6 (VKcdr2 B4) (SEQ ID NO: 33).

Figura 34 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia pesada do anticorpo B4. As regiões determinantes de com- plementaridade estão sublinhadas. Os resíduos de aminoácidos modificáveis estão mostrados em negrito.

Figura 35 demonstra a seqüência de aminoácidos da região va- riável da cadeia leve do anticorpo B4. As regiões determinantes de comple- mentaridade estão sublinhadas. Os resíduos de aminoácidos modificáveis estão mostrados em negrito.

Figura 36 é um alinhamento da seqüência dos aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo B4 VHO (SEQ ID NO: 13), VHv1 (SEQ ID NO: 14), VHv2 (SEQ ID NO: 15), VHv3 (SEQ ID NO: 16), VHv4 (SEQ ID NO: 17), VHv5 (SEQ ID NO: 18), VHv11 (SEQ ID NO: 20) e VHv34 (SEQ ID NO: 21).

Figura 37 é um alinhamento da seqüência dos aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo B4 VKO (SEQ ID NO: 25), VKv1 (SEQ ID NO: 26), VKv2 (SEQ ID NO: 27), VKv3 (SEQ ID NO: 28), VKv4 (SEQ ID NO: 29), VKv11 (SEQ ID NO: 30) e VKv34 (SEQ ID NO: 31).

Figura 38 mostra os resultados de um ensaio ADCC nas células do Linfoma de Daudi Burkitt efetuado com anticorpo VHv4/VKv4 B4 expresso ou das células HEK 293T (triângulos vazios) ou das células YB2/0 (triângu- los preenchidos), e o anticorpo VHv5/VKv4 B4 expresso ou da linhagem ce- Lular NS/0 (círculos vazios) ou das células YB2/0 (círculos preenchidos) con- forme descrito no Exemplo 4.

Figura 39 mostra os resultados do tratamento de camundongos transplantados com PBMCs humanos tratados ou com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 da invenção (barras listradas), o anticorpo Leu 16 (barras brancas) ou PBS (barras pretas) conforme descrito no Exemplo 5.

Figura 40 mostra os resultados do tratamento de camundongos carregando células do Linfoma de Namalwa tratadas ou com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 da invenção (círculos vazios) ou PBS (estrelas) conforme descrito no Exemplo 6.

Figura 41 mostra os resultados do tratamento de camundongos carregando células do Linfoma de Daudi Burkitt tratadas ou com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 da invenção (triângulos vazios), ciclofosfamida (quadrados vazios), uma combinação do anticorpo VHv4/VKv4 e de ciclofosfamida (cír- culos vazios) ou PBS (estrelas) conforme descrito no Exemplo 7.

Figura 42 mostra os resultados do tratamento de camundongos carregando células de Iinfoma de Namalwa com um anticorpo da invenção combinado com vários agentes quimioterapêuticos, conforme descrito no Exemplo 8. Na Figura 42(a), os tratamentos são com ciclofosfamida (qua- drados vazios), com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 (X), uma combinação do anticorpo VHv4/VKv4 B4 e ciclofosfamida (quadrados preenchidos) ou PBS (estrelas). Na Figura 42(b), os tratamentos são com a vincristina (triângulos vazios), com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 (X), com uma combinação do anti- corpo VHv4/VKv4 B4 e vincristina (triângulos preenchidos) ou PBS (estre- las). Na Figura 42 (c) os tratamentos são com doxorrubicina (círculos vazi- os), com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 (X) e com uma combinação do anticorpo VHv4/VKv4 B4 e doxorrubicina (círculos preenchidos) ou PBS (estrelas).

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção é direcionada às proteínas B4 que têm imunogenici- dade reduzida em comparação com a B4 do tipo selvagem, assim como aos métodos para fazer e usar tais proteínas. Mais especificamente, a invenção proporciona mutações em um anticorpo B4 que tem o efeito de redução da imunogenicidade do próprio anticorpo B4, primariamente pela remoção dos epitopos de células T em um B4 que pode estimular uma resposta imune.

A presente invenção é direcionada a um grupo de regiões variá- veis de cadeia leve (VK) e de cadeia pesada (VH) do anticorpo modificadas do anticorpo de murino anti-CD19 B4 (Nadler et al, (1983) J. Immunol. 130: 2947-2951; Roguska et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973), os quais são aqui genericamente nomeados "VHvx B4" e "VKvy B4", respec- tivamente. Por referência, a seqüência da região variável da cadeia pesada do anticorpo B4 de murino original (VHO B4) e a seqüência das regiões vari- áveis da cadeia leve do anticorpo B4 de murino original (VKO B4), com as CDRs sublinhadas são fornecidas nas Figuras 34 e 35, respectivamente.

Em comparação com os polipeptídeos VH0 B4 e VK0 B4, os po- lipeptídeos VHvx B4 e VKvy B4 têm imunogenicidade reduzida. Mais especi- ficamente, a invenção proporciona mutações na VH B4 e /ou na VK B4, as quais têm o efeito de reduzir a imunogenicidade dos polipeptídeos da região variável B4, primariamente pela remoção dos epitopos das células T nesses polipeptídeos que podem estimular uma resposta imune. De acordo com a invenção, as composições de proteína contendo as formas modificadas das regiões variáveis B4 são menos imunogênicas quando administradas a um ser humano, porém ainda são competentes para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19.

Conforme aqui utilizados, os termos "Regiões Determinantes de Complementaridade" e "CDRs" são entendidos por significar as regiões hi- pervariáveis ou alças de uma região variável de uma imunoglobulina que interagem primariamente com um antígeno. A região variável da cadeia pe- sada da imunoglobulina (VH) e a região variável da cadeia leve da imuno- globulina (VK) ambas contêm três CDRs interpostos entre as regiões de es- trutura, conforme mostrado nas Figuras 34 e 35, respectivamente. Por e- xemplo, com referência à seqüência de aminoácidos definindo a região vari- ável da cadeia pesada de imunoglobulina do anticorpo B4 conforme mostra- do na Figura 34 (SEQ ID NO: 13), as CDRs são definidas pelas seqüências de aminoácidos da Ser 31 até a His 35 (CDR1), da Glu50 até a Asn59 (C- DR2) e da Gly99 até a Tyr109 (CDR3). Com referência á seqüência de ami- noácidos definindo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina do anticorpo B4 conforme mostrado na Figura 35 (SEQ ID NO: 35), as CDRs são definidas pelas seqüências dos aminoácidos da Ser24 até a His33 (C- DR1), da Asp49 até a Ser 55 (CDR2) e da His88 até a Thr94 (CDR3).

Conforme aqui utilizados, os termos "Regiões de Estrutura" e "FRs" são entendidos por significar as regiões de uma região variável de imunoglobulina adjacente às Regiões Determinantes de Complementarida- de. Cada região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e a regi- ão variável da cadeia leve de imunoglobulina (VK) contêm quatro FRs, con- forme mostrado nas Figuras 34 e 35. Por exemplo, com referência à se- qüência de aminoácidos definindo a variável da cadeia pesada de imunoglo- bulina do anticorpo B4 conforme mostrado na Figura 34 (SEQ ID NO: 13), as FRs são definidas pelas seqüências dos aminoácidos da Glnl até a Thr30 (FR1), da Trp36 até a Gly49 (FR2), da Tyr60 até a Arg98 (FR3) e da Trpl 10 até a Ser120 (FR4). Com referência à seqüência de aminoácidos definindo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina do anticorpo B4, conforme mostrado na Figura 35 (SEQ ID NO: 25), as FRs são definidas pelas se- qüências dos aminoácidos da Glnl até a Cys23 (FR1), de Trp34 até a Tyr48 (FR2), da Gly56 até a Cys87 (FR3), e da Phe95 até a Lys104 (FR4). Além disso, os resíduos dos aminoácidos demonstrados em negrito nas Figuras 34 e 35 são resíduos de aminoácidos que podem ser modificados de acordo com várias modalidades da invenção.

Epitopos de células T podem ser identificados por uma varieda- de de métodos computadorizados e não-computadorizados, incluindo previ- sões baseadas èm modelagem computadorizada baseada em estruturas ou pela síntese de peptídeos e testagem para ligação a moléculas de MHC de classe Il específicas ou em um ensaio de imunogenicidade. De acordo com a invenção, um epitopo de célula T potencial é uma seqüência que, quando considerada como um peptídeo isolado, é predita como se ligando a uma molécula MHC de classe Il ou a um equivalente em uma espécie não- humana. Um epitopo de célula T potencial é definido sem considerar outros aspectos do processamento de antígenos, tais como a eficiência da absor- ção de proteínas nas células apresentadoras de antígenos, a eficiência da clivagem em sítios em uma proteína intacta para produzir um peptídeo que possa se ligar ao MHC de classe II, e assim por diante. Dessa forma, o gru- po de epitopos de células T que são de fato apresentados na MHC de classe II depois da administração de uma proteína para um animal é um subgrupo dos epitopos de células T potenciais. De acordo com a invenção, um epitopo de célula T é um epitopo em uma proteína que interage com uma molécula de MHC de classe II. Sem desejar estar ligado à teoria, se entende que um epitopo de célula T é uma seqüência de aminoácidos em uma proteína que falhou em sofrer o processo de seleção de células T negativo durante o de- senvolvimento de células T e, conseqüentemente, será esperado de ser a- presentado por uma molécula de MHC de classe Il e reconhecido por um receptor de células T.

De acordo com uma modalidade, a invenção proporciona méto- dos relacionados com a redução da imunogenicidade das regiões VH B4 e VK B4. De acordo com uma modalidade da invenção, epitopos de células T não-seguros potenciais são identificados nas seqüências da VH B4 ou da VK B4. Por exemplo, epitopos de células T não-seguras potenciais são identifi- cados por métodos computacionais baseados na modelagem de ligação de peptídeo às moléculas de MHC de classe II. Substituições para resíduos de aminoácidos específicos são, então, feitas de forma que a capacidade dos peptídeos contendo epitopos de células T potenciais de se ligar ao MHC de Classe Il é reduzida ou eliminada.

Seqüências de proteínas modificadas de regiões variáveis da invenção

De acordo com uma modalidade, o efeito de uma modificação ou de modificações de aminoácidos específicas é previsto baseando-se na mo- delagem computadorizada baseada em estrutura. Por exemplo, ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh e Raghava (2001) Bioin- formatics 17: 1236-1237) é uma ferramenta baseada na rede publicamente disponível que pode ser usada para a previsão de peptídeos que se liguem aos alelos HLA-DR. ProPred é baseado em um algoritmo de previsão de matriz descrito por Sturniolo para um grupo de 50 alelos HLA-DR (Sturniolo et al., (1999) Nature Biotechnol. 17: 555-561). Usando tal algoritmo, várias seqüências de peptídeos foram descobertas na VH B4 e na VK B4, as quais são previstas por se ligar a múltiplos alelos do MHC de classe Il e são, des- sa forma, prováveis de serem imunogênicos. Essas seqüências de peptí- deos e suas freqüências de ligação previstas aos alelos HLA-DR estão mos- tradas na Tabela 1.

Com referência à Tabela 1, a seqüência de cada peptídeo 9 me- ros que se liga a pelo menos 5 alelos HLA-DR é indicada, juntamente com a sua posição (n°) na região VH B4 (coluna esquerda) ou na região VK B4 (co- luna direita). "Freqüência de ligação" se refere ao número de alelos, de um total de 50 alelos, que o peptídeo se liga, além de um limiar de ligação arbi- trário, nesse caso 20%. Uma freqüência de ligação de "+" indica que o pep- tídeo se liga de 5 a 9 alelos, "++" indica que o peptídeo se liga de 10 a 19 alelos, e "+++" indica que o peptídeo se liga de 20 a 50 alelos. O limiar de ligação de 20% é em relação a uma pontuação de ligação máxima teórica, conforme calculado por um algoritmo conforme descrito por Sturniolo et al.

Tabela 1 Peptídeos selecionados das regiões V B4 previstas para se ligarem aos alelos HLA-DR humanos.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Essas seqüências potencialmente imunogênicas nos polipeptí- deos VH B4 e VK B4 podem se tornar menos imunogênicas pela introdução de mutações específicas que reduzem ou eliminam a ligação de um peptí- deo particular em um alelo HLA-DR humano (vide, por exemplo, W098/52976 e WOOO/34317). Alternativamente, epitopos de células T não- humanas são modificados de forma que eles correspondam a epitopos puros humanos que estejam presentes em anticorpos da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, US 5.712.120).

Orientações para selecionar modificações apropriadas podem ser obtidas por referência à estrutura terciária e quaternária de regiões vari- áveis de anticorpo. Estruturas cristalinas de domínios variáveis de anticorpo são conhecidas na técnica e é descoberto que estruturas das FRs são ge- ralmente muito similares umas às outras. Um modelo teórico da região vari- ável do anticorpo de VH0/VK0 B4 do anticorpo anti-CD19 pode ser construí- do a partir das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo mais intimamente relacionado para os quais a estrutura tenha sido determinada, a qual pode ser identificada de um alinhamento de estrutura primário (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-415). Um algoritmo de encadeamento é usado para modelar as cadeias leve e pesada B4 nas estruturas separadas (Marti-Renom et al., (2000) Annu Rev Biophys Biomol Struct 29: 291-325), e as estruturas encadeadas podem ser adicionalmente refinadas para obter energias estereoquimicamente favoráveis (Weiner et al., (1984) J Am Chem Soc 106: 765-784). Foi descoberto que as estruturas de cadeia pesada e de cadeia leve separadas respectivamente pelos seus códigos de acesso de banco de dados PDB 1FBI (fragmento Fab do anticorpo monoclonal F9.13.7) e 1 MIM (fragmento Fab do anticorpo quimérico anti-CD25 Sdz Chi621) foram estruturas de referência úteis para esse propósito.

Mutações preferidas não interferem inapropriadamente com a expressão, dobramento ou atividade da proteína. De acordo com a invenção, aminoácidos nas posições Q5, V12, R19, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88 ou V93 no VH B4 e nos aminoácidos nas posições Q1, V3, S7, 110, M11, V19, V29, S51, L53, A54 ou S75 na VK B4 pode sem ser modificados enquanto ainda retêm a capacidade do anticorpo de ser ex- presso e de se ligar ao CD19 em níveis comparáveis com a forma não- modificada de B4. Dessa forma, a invenção engloba anticorpos B4 com pelo menos uma modificação na seqüência VH selecionada do grupo de posições de aminoácidos consistindo em Q5, V12, R19, L20, K23, T24, K38, R40, G42, Q43, K65, K69, S85, S88 e V93 e/ou com pelo menos uma modificação na seqüência VK selecionada do grupo de posições de aminoácidos consis- tindo de Q1, V3, S7, 110, M11, V19, V29, S51, L53, A54 e S75.

Uma lista não completa de posições específicas consideradas por tolerar substituições de aminoácidos de acordo com a invenção é apre- sentada na Tabela 2, juntamente com substituições exemplares naquelas posições.

Tabela 2. Substituições nas regiões V B4.

<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table>

Um grupo de modalidades inclui substituições de aminoácidos no polipeptídeo VH B4, selecionadas de Q5E, V12K, R19K, L20V, K23E, T24A, K38R, R40T, G42D, Q43K, K65D, K69E, S85D, S88A e V93T. Substi- tuições adicionalmente contempladas são K23D, G42E, K65E e K69D.

Combinações particulares de mutações também são consideradas como sendo úteis. Por exemplo, em uma modalidade específica, as substituições K23E e K69E são incluídas. Em outra modalidade específica, adicionalmente as substituições G42D e S88A são incluídas, conforme mostrado, por exem- plo, para VHvI B4 (SEQ ID NO: 14). Em ainda outra modalidade específica, VHvI adicionalmente inclui as substituições V12K e K65D (VHv11 B4) (SEQ ID NO: 20). Em uma outra modalidade específica, as substituições Q5E, V12K, R19K, L20V, S85D e S88A são incluídas, conforme exemplificado por VHv3 B4 (SEQ ID NO: 16). Ainda em outra modalidade específica, as substi- tuições Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A e V93T são in- cluídas, conforme exemplificado por VHv4 B4 (SEQ ID NO: 17). Ainda em uma outra modalidade específica, as substituições Q5E, R19K, L20V, K38R, R40A, Q43K, K65D, S85D e V93T são incluídas, conforme exemplificado por VHv5 B4 (SEQ ID NO: 18). Em outra modalidade específica, substituições de VHv3 B4 e de VHv4 B4 são combinadas, conforme mostrado na seqüen- cia de VHv34 B4 (SEQ ID NO: 21).

Outro grupo de modalidades inclui substituições de aminoácidos no polipeptídeo VK B4, selecionadas de Q1D, V3A, S7E, 11OT, M11L, V19A, V29A, S51D, L53T, A54D e S75E. Em uma modalidade específica, a substi- tuição A54D é incluída. Combinações particulares de mutações também são consideradas como sendo úteis. Por exemplo, em modalidades mais especí- ficas, adicionalmente as substituições V3A e S7E estão incluídas, conforme exemplificado por VKvI B4 (SEQ ID NO: 26), ou as substituições Q1D, I10T e M11L são incluídas, conforme exemplificado por VKv2 B4 (SEQ ID NO: 27). Em uma outra modalidade, VK1 B4 adicionalmente inclui as substitui- ções V19A e S75E, conforme exemplificado em VKv11 B4 (SEQ ID NO: 30). Em ainda outra modalidade, as substituições 110T, M11L, V19A, V29A e S75E são incluídas, conforme exemplificado por VKv3 B4 (SEQ ID NO: 28). Ainda em uma outra modalidade específica, as substituições 110T, M11L, V19A, S51D e L53T são incluídas, conforme exemplificado por VKv4 B4 (SEQ ID NO: 29). Em outra modalidade específica, substituições de VKv3 B4 e de VKv4 B4 são combinadas, conforme mostrado na seqüência de VKv34 B4 (SEQ ID NO: 31).

Um alinhamento de estrutura primário de algumas seqüências exemplares de VHvx B4 e de VKvx B4 da invenção, descrito acima, são re- presentadas nas Figuras 36 e 37, respectivamente. Aminoácidos represen- tados em negrito são as posições de VHO e de VKO que podem ser modifi- cadas de acordo com a invenção, e os aminoácidos sublinhados represen- tam CDRs. VHvI a VHv34 e VKvI a VKv34 são cadeias pesada e leve re- presentativas, respectivamente, com substituições de aminoácidos específi- cas que reduzem a imunogenicidade.

Composições de regiões variáveis da invenção incluem pelo menos uma cadeia pesada ou uma cadeia leve da invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a região variável contém VHvI B4 (SEQ ID NO: 14) e VKO B4 (SEQ ID NO: 25). Em outra modalidade, a região variável contém VHvI B4 (SEQ ID NO: 14) e VKvI B4 (SEQ ID NO: 26). Ainda em outra mo- dalidade, a região variável contém VHv4 B4 (SEQ ID NO: 17) e VKv4 B4 (SEQ ID NO: 29). Ainda em outra modalidade, a região variável contém VHv5 B4 (SEQ ID NO: 23) e VKv4 B4 (SEQ ID NO: 29). É percebido que outras modalidades da invenção são facilmente obtidas por emparelhamento combinatório do grupo completo de polipeptídeos VHvx B4 e de VKvy B4 contemplados pela invenção. Combinações úteis são adicionalmente deter- minadas experimentalmente, pela análise das composições de proteínas contendo essas combinações, tais como anticorpo VHvx/VKvy B4, quanto à sua capacidade de expressão e atividade de ligação ao CD-19, assim como as suas imunogènicidades reduzidas, conforme descrito em maiores deta- lhes abaixo.

Verificação da imunogenicidade reduzida de regiões variáveis da invenção

Para verificar que uma mutação da invenção de fato resultou em uma imunogenicidade reduzida, testes experimentais-padrão, os quais são bem-conhecidos na técnica, podem ser empregados. Por exemplo, um en- saio de estímulo de células T pode ser usado (por exemplo, Jones et al. (2004), J. Interferon Cytokine Res., 24: 560). Em tal ensaio, células mononu- cleares sangüíneas periféricas (PBMCs) são obtidas e cultivadas de acordo com condições padronizadas. Depois de um pré-estímulo opcional, um pep- tídeo correspondente a um epitopo de MHC de classe Il potencial é adicio- nado à cultura de PBMCs; as PBMCs são adicionalmente incubadas e, em um momento posterior timidina tritiada é adicionada. O peptídeo pode ser um 9 meros mínimo, ou pode ter cerca de 10 a 15, ou mais de 15 aminoáci- dos. Depois da incubação adicional das células, a incorporação da timidina tritiada no DNA é, a seguir, medida por técnicas padronizadas.

O ensaio de estimulação de células T é considerado funcionante pelos seguintes mecanismos. Primeiro, se um peptídeo for usado como um estimulador, o peptídeo deve primeiramente se ligar a uma molécula de MHC de classe Il presente em uma célula dentre as PBMCs. Segundo, o complexo MHC de classe ll/peptídeo deve interagir produtivamente com um receptor de células T em uma célula T CD4+. Se o peptídeo teste for inca- paz de se ligar suficientemente firme a uma molécula de MHC de classe II, não aparecerá nenhum sinal. Se o peptídeo for capaz de se ligar a uma mo- lécula de MHC de classe II e houver células T expressando um receptor de células T apropriadamente rearranjado capaz de reconhecer um complexo MHC de classe II/peptídeo particular, deve aparecer um sinal. Entretanto, se tais células T forem anuladas como resultado de um processo de seleção negativo, não aparecerá nenhum sinal. Esses mecanismos são considera- dos relevantes para a imunogenicidade de uma seqüência de proteína, con- forme concluído a partir do estímulo ou da falta de estímulo por um dado peptídeo.

Se o reconhecimento de células T estiverem presentes em quan- tidades muito baixas na população de PBMC por razões estocásticas rela- cionadas com a falha de ocorrência de um receptor de células T apropriado ou proliferação do outro, células T não-relacionadas seguido por homeosta- se da população de células T, pode não haver sinal embora seja esperado um sinal. Dessa forma, podem ocorrer resultados falso-negativos. Basean- do-se nessas considerações, é importante usar um grande número de dife- rentes fontes de PBMCs e testar essas amostras independentemente. Tam- bém é geralmente útil testar PBMCs de um grupo etnicamente diverso de seres humanos, e determinar os alelos de MHC de classe Il presentes em cada população de PBMC.

O ensaio de célula T padrão tem a desvantagem de que o sinal de incorporação de trítio é em geral somente duas vezes maior do que a in- corporação do fundo. As proteínas e peptídeos da invenção também podem ser testadas em um ensaio de célula T modificado no qual, por exemplo, cé- lulas T CD4+ purificadas e células dendríticas purificadas são co-cultivadas na presença do peptídeo de teste, seguido pela exposição à timidina tritiada e, a seguir, ensaidas para a incorporação de timidina tritiada. Esse segundo ensaio tem a vantagem de que a incorporação de timidina tritiada em células irrelevantes, tais como em células T CD8+, é essencialmente eliminada e o fundo é, dessa forma, reduzido.

Um terceiro ensaio envolve a testagem de uma proteína candi- data com imunogenicidade reduzida em um animal, tal como em um primata. Tal ensaio poderia de um modo geral envolver a testagem de uma composi- ção de proteína VHvx/VKvy B4, tal como um anticorpo que tenha sido desig- nado pela testagem dos peptídeos componentes individuais para a imuno- genicidade potencial em um ensaio baseado em células, tal como em um descrito acima. Tal candidato da composição de proteína VHvx/VKvy B4 é designado e expresso, a proteína é testada quanto à imunogenicidade por injeção em um animal.

A injeção da composição de proteína VHvx/VKvy B4 é geralmen- te efetuada da mesma forma que a via antecipada de distribuição durante o uso terapêutico em seres humanos. Por exemplo, a injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou a infusão intravenosa pode ser usada. Se mais de uma administração for usada, as administrações podem ser por diferentes vias.

Para propósitos de testagem de imunogenicidade, pode ser útil coadministrar um adjuvante para aumentar o sinal e minimizar a quantidade de animais que precisam ser usados. Se for usado um adjuvante, é possível usar um adjuvante sem um componente protéico, tal como um DNA com dinucleotídeos CpG não-metilados, lipídeo bacteriano A, N-formilmetionina ou outros componentes não-protéicos bacterianos. Sem desejar estar ligado pela teoria, a lógica racional para evitar adjuvantes contendo proteína é que outras proteínas podem proporcionar epitopos de células T que irão, no final das contas, contribuir para uma resposta de anticorpo contra a proteína can- didata.

Depois de uma ou mais administrações da composição de prote- ína VHvx/VKvy B4 candidata, a presença de anticorpos antiidiotipo é testada de acordo com técnicas padronizadas, tais como o método ELISA. Foi des- coberto que as composições de proteína VHvx/VKvy B4 da invenção indu- zem a formação de anticorpos de modo menos freqüente, e em uma exten- são menor do que as moléculas correspondentes contendo seqüências VH/VK B4 originais.

Outras configurações das regiões variáveis da invenção

Além do uso das regiões V da invenção em um anticorpo nu, também é possível configurar as regiões V da invenção em proteínas de fu- são de anticorpo que direcionem toxinas, imunoestimuladores e outras prote- ínas, assim como em Fabs, Fvs de cadeia única e anticorpos biespecíficos, e outras configurações conhecidas na técnica da engenharia de anticorpo.

Em certas modalidades da invenção, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada podem ser acopladas, respectiva- mente, a uma região constante de cadeia leve e a uma região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina. As cadeias leves de imunoglobulina têm regiões constantes que são designadas ou como cadeias capa ou lâmb- da. Em uma modalidade particular da invenção, a região constante de ca- deia leve é uma cadeia capa. As regiões constantes de cadeia pesada e vá- rias modificações e combinações suas são discutidas abaixo em maiores detalhes.

Porção Fc

Os domínios variáveis de anticorpo da presente invenção são opcionalmente fundidos em uma porção Fc. Conforme aqui utilizado, a por- ção Fc engloba domínios derivados da região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina, preferivelmente de uma imunoglobulina humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. A região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina é definida como um polipeptídeo de ocorrência natural ou sinteticamente pro- duzido homólogo a pelo menos uma porção da região C-terminal da cadeia pesada, incluindo a CH1, dobradiça, CH2, CH3 e, para algumas classes de cadeias pesadas, os domínios CH4. A região "dobradiça" une o domínio CH1 à região CH2-CH3 de uma porção Fe. A região constante das cadeias pesadas de todas as imunoglobulinas de mamíferos exibe uma extensiva similaridade de seqüência de aminoácidos. As seqüências de DNA para es- sas regiões de imunoglobulina são bem-conhecidas na técnica. (Vide, por exemplo, Gillies, et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125: 191).

Na presente invenção, a porção Fc tipicamente inclui pelo me- nos um domínio CH2. Por exemplo, a porção Fc pode incluir a região cons- tante da cadeia pesada de imunoglobulina inteira (CH1-dobradiça-CH2- CH3). Alternativamente, a porção Fc pode incluir toda ou uma porção da re- gião dobradiça, o domínio CH2 e o domínio CH3. A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas funções efetoras de anticorpo im- portantes, incluindo aquelas mediadas pela ligação do receptor Fc (FcR) e pela ligação do complemento. Existem cinco classes principais de região constante de cadeia pesada, classificadas como IgA1 IgG, IgD, IgE e IgM, cada uma com funções efetoras características designadas por isotipo.

IgG, por exemplo, é separada em quatro isotipos γ: γ1, γ2, γ3 e γ4, também conhecidos como IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4, respectivamente. As moléculas de IgG podem interagir com múltiplas classes de receptores celu- lares incluindo três classes de receptores Fc (Fcy R) específicos para a clas- se IgG de anticorpos, a saber, Fcy RI, Fcy Rll e Fcy Rlll. As seqüências im- portantes para a ligação do IgG aos receptores Fcy R foram reportadas co- mo estando nos domínios CH2 e CH3.

Funções efetoras dos anticorpos amplamente reconhecidas, par- ticularmente da classe IgG, incluem citotoxicidade dependente do comple- mento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). To- das as subclasses de IgG (lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4) medeiam a CDC e a ADCC até alguma extensão, com a IgGI e a lgG3 sendo mais potentes para ambas as atividades (Capítulo 3, Tabela 3 em Paul, Essential Immunology 4. Sup. th Ed. p. 62). Acredita-se que a CDC ocorra por múltiplos mecanismos; um mecanismo é iniciado quando um anticorpo se liga a um antígeno em uma superfície celular. Uma vez formado o completo antígeno-anticorpo, acredita-se que a molécula C1q se ligue ao complexo antígeno-anticorpo. C1q, a seguir, cliva a si própria para iniciar uma cascata de ativação enzimá- tica e de clivagem de outras proteínas do complemento as quais, então, se ligam à superfície da célula-alvo e facilitam a sua morte através, por exem- plo, da Iise celular e/ou da ingestão por um macrófago. Acredita-se que a ADCC ocorra quando os receptores Fc nas células citotóxicas, tal como nas células "natural killer" (NK), macrófagos e neutrófilos se ligam à região Fc dos anticorpos ligados a antígeno em uma superfície celular. A ligação ao receptor Fc sinaliza à célula citotóxica que mate a célula-alvo. Caracteristi- camente, as células NK1 consideradas como sendo os mediadores primários da ADCC, expressam somente Fc Rllla.

É geralmente útil alterar as funções efetoras de um anticorpo. Por exemplo, para tratar cânceres associados com uma malignidade de cé- lula B ou para tratar doenças auto-imunes com um componente de célula B, é útil aumentar a atividade ADCC do anticorpo. Pode ser particularmente útil aumentar a atividade ADCC de um anticorpo direcionado para antígenos de superfície de células B presentes em uma densidade relativamente baixa (Niwa et al., (2005) Clin. Câncer Res. 11: 2327-2336), tais como para a CD19. Acredita-se que a densidade de antígeno da CD19 em relação à CD20 na superfície das células B seja aproximadamente dez vezes mais baixa. Alterações nos anticorpos que aumentam a atividade ADCC de um anticorpo em relação ao seu anticorpo de origem são conhecidas na técnica, e geralmente são correlacionadas com modificações que aumentam a afini- dade de ligação do anticorpo variante à Fcy Rlll (vide, por exemplo, Patente norte-americana N9 6.737.056). Por exemplo, são introduzidas modificações na região Fc em uma ou mais posições (com referência às suas posições na IgGyI) selecionadas de 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 339, 360, 378 e 430 (numeração de acordo com Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991). Mutações preferidas são estão em uma ou em mais posições selecionadas de 298, 333 e 334. Por exemplo, substitui- ções de alanina podem ser introduzidas.

A atividade ADCC do anticorpo também é influenciada pela li- nhagem celular particular usada para produzir o anticorpo. Por exemplo, an- ticorpos produzidos nas células NS/0 de mieloma de camundongo (ou nas células SP2/0) geralmente têm baixa ADCC, e anticorpos produzidos em células YO de mieloma de rato (ou células YB2/0) têm alta ADCC (Lifely et al., (1995) Glycobiology 5: 813-822). Sabe-se na técnica que o tipo de linha- gem celular usado para a expressão do anticorpo afeta a estrutura do car- boidrato na cadeia glicosila N-ligada, a qual está ligada à região Fc do anti- corpo na posição correspondente à N297 na IgGy 1. A estrutura de carboi- drato dos anticorpos produzida nas células CHO é fucosilada, enquanto que a cadeia de carboidrato dos anticorpos produzidos na YB2/0 é grandemente ausente de fucose (Shinkawa et al., (2003) JBC 278: 3466-3473). Anticorpos que não têm fucose na estrutura do carboidrato se ligam ao Fc Rllla humano com afinidade maior (Shields et al., (2002) JBC 277: 26733-26740). Em cer- tas modalidades, anticorpos anti-CD19 com regiões variáveis da invenção são caracterizados por ter fucosilação reduzida na cadeia glicosila N-Iigada da porção Fc do anticorpo.

Também é geralmente útil alterar a meia-vida sérica do anticor- po. A meia-vida sérica de um anticorpo, como de uma proteína de fusão de imunoglobulina, é influenciada pela capacidade daquele anticorpo de se ligar a um receptor Fc (FcR) (Gillies et al., Câncer Research (1999) 59: 2159-66). Os domínios CH2 e CH3 da lgG2 e da lgG4 têm afinidade de ligação não- detectável ou reduzida pelos receptores Fc em comparação com aqueles da IgG1. Concordantemene1 a meia-vida sérica do anticorpo caracterizado pode ser aumentada pelo uso do domínio CH2 e/ou do domínio CH3 dos isotipos de lgG2 e lgG4. Alternativamente, o anticorpo pode incluir um domínio CH2 e/ou CH3 da IgGI ou da lgG3 com modificação em um ou mais dos aminoá- cidos nesses domínios para reduzir a afinidade de ligação para os recepto- res Fc (vide, por exemplo, o Pedido de Patente norte-americana No. de Sé- rie 09/256.156, publicado como Publicação do Pedido de Patente norte- americana 2003-0105294).

A região dobradiça da porção Fc normalmente une o C-terminal do domínio CH1 da região constante da cadeia pesada. Quando incluído nas proteínas da presente invenção, a dobradiça é homóloga a uma região de imunoglobulina de ocorrência natural e tipicamente inclui resíduos de cisteí- na ligando duas cadeias pesadas através de pontes dissulfeto como nas i- munoglobulinas naturais. Seqüências representativas das regiões dobradiça para imunoglobulina humana e de camundongo podem ser encontradas em ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE, (Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co, 1992).

Regiões dobradiças adequadas para a presente invenção po- dem ser derivadas de IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4 e de outros isotipos de imu- noglobulinas. O isotipo IgGI tem duas ligações dissulfeto na região dobradi- ça, permitindo a formação de ligação dissulfeto de forma eficiente e consis- tente. Dessa forma, uma região dobradiça preferida da presente invenção é derivada da IgGI. Opcionalmente, a primeira cisteína mais N-terminal de uma dobradiça IgGI é modificada para aumentar a expressão e montagem dos anticorpos ou de proteínas de fusão de anticorpo da invenção (vide, por exemplo, o Pedido de Patente norte-americana N9 de Série 10/093.958, pu- blicado como a publicação do pedido de Patente norte-americana 2003- 0044423).

Ao contrário da IgGI, a região dobradiça da lgG4 é conhecida por formar ligações dissulfeto intercadeia de forma ineficiente (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30: 105-8). Também a região dobradiça da lgG2 tem quatro ligações dissulfeto que tendem a promover a oligomerização e possi- velmente a ligação dissulfeto incorreta durante a secreção em sistemas re- combinantes. Outra região dobradiça adequada para a presente invenção pode ser derivada da região dobradiça lgG4, preferivelmente contendo uma modifiação que aumenta a correta formação de ligações dissulfeto entre por- ções derivadas de cadeia pesada (Angal et al., (1993), Mol. Immunol. 30 (1): 105-8). Outra região dobradiça preferida é derivada de um dobradiça lgG2 no qual as primeiras duas cisteínas são cada uma modificadas para outro aminoácido, tal como, na ordem de preferência geral, serina, alanina, treoni- na, prolina, ácido glutâmico, glutamina, lisina, histidina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glicina, metionina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenila- lanina, triptofano ou selenocisteína (vide, por exemplo, a publicação do pedi- do de Patente norte-americana 2003-0044423).

Uma porção Fc fundida a uma região variável de anticorpo da invenção pode conter domínios CH2 e/ou CH3 e uma região dobradiça que são derivadas de diferentes isotipos de anticorpo. Por exemplo, a porção Fc pode conter domínios CH2 e/ou CH3 de lgG2 ou lgG4 e uma região dobra- diça da IgGI. A montagem de tais porções Fc híbridas foi descrita na publi- cação do pedido de Patente norte-americana 2003-004423.

Quando fundida a uma região variável do anticorpo da invenção, a porção Fc pode conter uma ou mais modificações de aminoácidos que ge- ralmente prolongam a meia-vida sérica de uma proteína de fusão Fc. Tais modificações de aminoácidos incluem modificações que diminuem substan- cialmente ou eliminam a ligação do receptor Fc ou a atividade de fixação do complemento. Por exemplo, um tipo de tal mutação remove o sítio de glicosi- lação da porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Na IgGI, o sítio de glicosilação é o Asn297 (vide, por exemplo, o pedido de Patente nor- te-americana No. de série 10/310.719, publicado como a publicação do pe- dido de Patente norte-americana 2003-0166163).

As regiões variáveis do anticorpo da invenção podem ser ligadas a um agente diagnóstico e/ou terapêutico. O agente pode ser fundido ao an- ticorpo para produzir uma proteína de fusão. Alternativamente, o agente po- de ser quimicamente acoplado ao anticorpo para produzir um imunoconju- gado. O agente pode ser, por exemplo, uma toxina, radiomarcador, um a- gente de visualização, uma porção imunoestimulatória ou similar.

A região variável do anticorpo pode ser ligada a uma citocina. Citocinas preferidas incluem interleucinas tais como interleucina 2 (IL-2), IL- 4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21 e IL-23, fatores hematopoiéticos tais como fator estimulatório de colônia granulócito- macrófago (GM-CSF), fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) e eritropoietina, fatores de necrose tumoral (TNF) tais como TNFoc, Iinfocinas tais como linfotoxina, reguladores de processos metabólicos tais como Iepti- na, interferons tais como interferon a, interferon β e interferon γ, e quimioci- nas. Preferivelmente, a proteína de fusão anticorpo-citocina ou imunoconju- gado apresenta atividade biológica de citocina. Em uma modalidade, o do- mínio variável do anticorpo é fundido à IL-2. Preferivelmente, vários aminoá- cidos na porção de IL-2 são modificados para reduzir a toxicidade, conforme descrito na publicação do pedido de Patente norte-americana 2003- 0166163.

Opcionalmente, complexos de proteínas podem ainda incluir um segundo agente, tal como uma segunda citocina. Em uma modalidade, uma proteína de fusão de anticorpo VHvx/VKvy B4 inclui IL-12 e IL-2. A constru- ção de complexos de proteínas contendo um domínio de imunoglobulina e duas diferentes citocinas é descrita em detalhes na Patente norte-americana No. 6.617.135.

Produção de anticorpos

Anticorpos da invenção, assim como outras proteínas contendo regiões variáveis da invenção, são produzidos por métodos bem-conhecidos na técnica da engenharia de proteínas. Vetores de ácidos nucléicos capazes de expressar uma cadeia pesada e uma cadeia leve, os quais incluem se- qüências da invenção, são introduzidos na célula apropriada e o produto de proteína recombinante é expresso e purificado. Por exemplo, anticorpos da invenção podem ser produzidos em linhagens celulares de mamíferos proje- tadas tais como células NS/0, células CHO, células SP2/0 (SP2/0-Ag14; ATCC-CRL 1581), células YB2/0 (YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20; ATCC CRL- 1662), ou outras células de mamíferos bem-conhecidas na técnica da produ- ção de anticorpos. Em uma modalidade, os anticorpos VHvx/VKvy B4 são produzidos nas células NS/0. Em outra modalidade, anticorpos VHvx/VKvy B4 são produzidos em células YB2/0. Alternativamente, leveduras, plantas, células de insetos ou bactérias podem ser usadas para produzir proteínas contendo regiões variáveis da invenção.

Administração

Os anticorpos da invenção são preferivelmente usados para tra- tar pacientes com distúrbios de células B tais como linfomas de células B ou distúrbios auto-imunes com um componente de célula B tal como artrite reumatóide, miastenia grave, esclerose múltipla, Iupus eritematoso sistêmico e assim por diante. Para o linfoma da célula B, dependendo do julgamento do clínico, pode ser útil tratar um paciente que tenha falhado a outras terapi- as. Por exemplo, alguns pacientes os quais são tratados com Rituxan® po- dem responder inicialmente, porém células cancerígenas resistentes ao Ri- tuxan® podem aparecer. Tais pacientes devem geralmente ainda responder aos anticorpos da invenção.

Nos casos dos anticorpos direcionados contra CD19, é algumas vezes útil limpar as células B normais do corpo, uma vez que essas células são propensas a titular o anticorpo da invenção. Rituxan pode ser usado para esse propósito, de acordo com procedimentos padronizados. Alternati- vamente, os anticorpos anti-CD 19 da invenção podem ser usados para lim- par as células B normais do corpo, por exemplo, conforme descrito no E- xemplo 5 e no Exemplo 9.

Infusão é o método preferido de administração. Outros métodos de administração incluem vias de injeção tais como a distribuição subcutâ- nea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa (bolus). A distribuição por inalação e oral também são métodos possíveis de distribui- ção.

Para um ser humano de 70 Kg, uma dose típica está na faixa de cerca de 50 miligramas até 2 gramas, com uma dose preferida na faixa de cerca de 400 a 600 miligramas. A dosagem pode ser repetida cerca de uma vez a cada três a seis semanas, por exemplo, durante o que células B nor- mais e células tumorais são monitoradas.

Proteínas de fusão da presente invenção são úteis no tratamen- to de doenças humanas, tais como câncer. Ao tratar o câncer, é útil, por e- xemplo, administrar uma proteína de fusão de anticorpo IL-2 compreenden- do as regiões variáveis da invenção por infusão ou injeção subcutânea, u- sando doses de 0,1 a 100 miligramas/metro2/paciente. Em uma modalidade preferida, é particularmente útil administrar uma proteína de fusão de anti- corpo-IL-2 compreendendo as regiões variáveis da invenção por infusão ou injeção subcutânea, usando doses de 1 a 10 miligramas/metro2/paciente, e mais preferivelmente de cerca de 3 a 6 miligramas/metro2/paciente.

Composições farmacêuticas da invenção podem ser usadas na forma de formas de dosagem sólidas, semi-sólidas ou líquidas tais como, por exemplo, pílulas, cápsulas, pós, líquidos, suspensões ou similares, preferi- velmente em formas de dosagens unitárias adequadas para administração de dosagens precisas. As composições incluem um excipiente ou veículo farmacêutico convencional e, além disso, podem incluir outros agentes me- dicinais, agentes farmacêuticos, veículos, adjuvantes, etc. Tais excipientes podem incluir outras proteínas tais como, por exemplo, albumina de soro humano ou proteínas plasmáticas. Métodos vigentes de preparo de tais for- mas de dosagem são conhecidos ou serão aparentes para as pessoas ver- sadas na técnica. A composição ou formulação a ser administrada irá, em qualquer evento, conter uma quantidade do(s) componente(s) ativo(s) em uma quantidade eficaz para alcançar o efeito desejado no indivíduo sendo tratado.

A administração das composições daqui pode ser através de qualquer um dos modos de administração aceitos para agentes que exibem tal atividade. Esses métodos são a administração local ou sistêmica. A inje- ção intravenosa em um veículo farmaceuticamente aceitável é um método preferido de administração. A quantidade de composto ativo administrado irá, é claro, ser dependente do indivíduo sendo tratado, da severidade da aflição, do modo de administração e do julgamento do clínico que está pres- crevendo.

A invenção é ainda ilustrada através dos seguintes exemplos não-limitativos.

Exemplo 1. Construção dos anticorpos anti-CD19 contendo ca- deias pesada e leve de região variável da invenção.

Técnicas de engenharia genética-padrão foram usadas para in- traduzir seqüências de ácidos nucléicos codificando uma região de cadeia pesada e uma região da cadeia leve da invenção em um vetor de expressão de mamífero apropriado. Estratégias de clonagem exemplares são descritas abaixo. O vetor de expressão pdHL12 é um vetor de expressão pdHL de úl- tima geração projetado para conter sítios de restrição únicos para a inserção de cassetes de ácido nucléico que codificam regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve. pdHL12 é projetado para aceitar ácidos nucléicos codificando a região variável da cadeia pesada como um fragmento Nhe I/Hind III, e ácidos nucléicos que codificam a região variável da cadeia leve como um fragmento Afl II/Bam HI, e para co-expressar cadeias pesada e leve do anticorpo intac- to (vide, por exemplo, o pedido de patente norte-americano 2003/0157054).

Seqüências de ácidos nucléicos das regiões variáveis de cadeia pesada da invenção, flanqueadas por seqüências com seqüências de reco- nhecimento de restrição de endonuclease 5'-CTTAAGC-3' (à montante, con- tendo o sítio Nhe I) e 5'-CGTAAGTGGATCC-3' (à jusante, contendo o sítio Hind III), foram sintetizadas de novo e inseridas em um plasmídeo de veículo derivado de vetor pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). O ácido nucléico foi cortado do plasmídeo veículo como um fragmento Nhe I/Hind III e ligado no fragmento de vetor apropriado de um plasmídeo pdHL12 digerido da mesma forma. Seqüências de ácidos nucléicos para VHO B4 (SEQ ID NO: 1), VHvI B4 (SEQ ID NO: 2), VHv2 B4 (SEQ ID NO: 3), VHv3 B4 (SEQ ID NO: 4), VHv4 B4 (SEQ ID NO: 5), VHv5 B4 (SEQ ID NO: 6) e VHv6 B4 (SEQ ID NO: 7) são mostradas.

Semelhantemente, ácidos nucléicos das regiões variáveis de cadeia leve da invenção, flanqueados pelas seqüências com seqüências de reconhecimento de restrição de endonuclease 5'-GCTAGCTCCAGC-3' (à montante, contendo o sítio AfI II) e 5'-GGTAAGCTT-3' (à jusante, contendo o sítio Bam HI), foram sintetizados de novo e inseridos em um plasmídeo veí- culo derivado do vetor pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). O áci- do nucléico foi cortado do plasmídeo veículo como um fragmento Afl II/Bam HI e ligado no fragmento de vetor apropriado de um plasmídeo pdHL12 dige- rido da mesma forma. Seqüências de ácidos nucléicos codificando VKO B4 (SEQ ID NO: 8), VKvI B4 (SEQ ID NO: 9), VKv2 B4 (SEQ ID NO: 10), VKv3 B4 (SEQ ID NO: 11) e VKv4 B4 (SEQ ID NO: 12) são mostradas.

Pela inserção das seqüências de ácidos nucléicos codificando as diferentes regiões variáveis das cadeias leve e pesada diferentes combi- natoriamente no pdHL12, um painel de plasmídeos codificando anticorpos B4 da invenção, VHvx/VKvy B4 foram gerados.

Exemplo 2. Expressão e purificação dos anticorpos da invenção

As seguintes técnicas gerais são usadas nos Exemplos subse- qüentes.

1A. Cultura de células e transfecção.

Para expressar anticorpos transitoriamente a partir de células de mamíferos, o DNA de plasmídeo é introduzido nas células 293 de rins em- brionários humanos, ou em células de rins de hâmster novos (BHK) por co- precipitação do DNA de plasmídeo com fosfato de cálcio e as células cres- cem sem seleção para manutenção de plasmídeos [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Clones transfectados estavelmente são obtidos por um dos vários métodos padroni- zados, por exemplo, por eletroporação ou por nucleofecção. A eletroporação do DNA em células NS/O de mieloma de camundongo é efetuada como se segue. Células NS/O crescem em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Life Technologies) suplementado com soro bovino fetal 10%, glu- tamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1 mM e penicilina/estreptomicina 1x. Cerca de 5 χ 106 células são lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em 0,5 mL de solução tampão fosfato (PBS). Dez microgramas de DNA de plasmídeo Iinearizado são, a seguir, incubados com as células em uma cu- beta Gene Pulser (intervalo de eletrodo de 0,4 cm, BioRad) por dez minutos no gelo. Eletroporação é efetuada usando um Gene Pulser (BioRad) com ajustes a 0,25 V e microF. As células são deixadas recuperar por 10 minutos em gelo, depois do que elas são ressuspensas em meio de crescimento e, a seguir, plaqueadas em duas placas de 96 cavidades. Clones estavelmente transfectados são selecionados por crescimento na presença de metotrexato a 100 nM (MTX), o qual é introduzido dois dias após a transfecção. As célu- las são alimentadas a cada 3 dias por mais duas ou três vezes, e clones re- sistentes ao MTX geralmente apareceram em 2 a 3 semanas. Os sobrena- dantes dos clones são analisados por ELISA Fc anti-humano para identificar grandes produtores [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125: 191]. Clo- nes de alta produtividade são isolados e propagados em meio de crescimen- to contendo MTX a 100 nM.

Semelhantemente, outras linhagens celulares podem ser usadas para obter clones estavelmente transfectados essencialmente pelo menos método, tais como células CHO1 células BHK, células SP2/0 e células YB2/0. Quando as células YB2/0 foram usadas, clones estavelmente transfectados foram geralmente selecionados por crescimento na presença de MTX a 50 nM.

Clones estavelmente transfectados, por exemplo, de células ΥΒ2/0 de mieloma de rato, também foram obtidas por nucleofecção. Cerca de 2 x 106 células YB2/0, crescidas em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) suplementado com calor inativaram 10% do soro bovino fetal, glu- tamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1 mM e 1 x penicilina/estreptomicina, foram centrifugados a 90xg em temperatura ambiente por 10 min e ressus- pensos em 100 μL de Solução Nucleofector V suplementada. 100 μL da sus- pensão celular foram misturados com 2 μg de DNA de plasmídeo Iinearizado (linearizado no sítio Fsp I na seqüência da β-lactamase), transferidos para uma cubeta (Amaxa) e a nucleofecção foi efetuada usando o programa Nu- cleofector apropriado (Amaxa), Q-20. 500 μL de meio de cultura preaquecido foram adicionados e a amostra foi transferida em uma cavidade de uma pla- ca de 12 cavidades. Um dia após a transfecção, as células foram ressus- pensas em meio de crescimento e plaqueadas em placas de 96 cavidades em densidades celulares variando de aproximadamente 10 células/cavidade até aproximadamente 600 células/cavidade. Clones estavelmente transfec- tados foram selecionados por crescimento na presença de metotrexato a 50 nM (MTX), o qual foi introduzido dois dias após a transfecção. As células foram alimentadas a cada 2 ou 3 dias duas vezes mais, e clones resistentes ao MTX apareceram, de um modo geral, em 2 a 3 semanas. Os sobrenadan- tes dos clones foram ensaiados por ELISA Fc anti-humano para identificar grandes produtores [Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125: 191]. Clo- nes de elevada produtividade foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo MTX a 50 nM.

As células podem crescer em um meio alternado conhecido na técnica, tal como em um HSFM suplementado com soro bovino fetal 2,5% e metotrexato a 100 nM, ou um meio livre de proteína tal como meio CD. 1B. ELISAs.

Diferentes ELISAs são usados para determinar as concentra- ções de produtos de proteínas nos sobrenadantes dos clones resistentes a MTX e outras amostras de teste. Por exemplo, o ELISA anti-huFc é usado para medir a quantidade de proteínas contendo Fc humano, por exemplo, anticorpos quiméricos, e o ELISA capa anti-hu é usado para medir a quanti- dade de cadeia leve capa (de imunoglobulinas quiméricas ou humanas).

O ELISA anti-huFc é descrito em detalhes abaixo.

A. Placas de revestimento.

Placas de ELISA são revestidas com IgG anti-humana de cabra AffiniPure (H+L) (Jackson Immuno Research) em 5 microgramas/mL em PBS1 e 100 μL/cavidade em placas de 96 cavidades (Placa Nunc-Immuno Maxisorp). Placas revestidas são cobertas e incubadas a 4 sC de um dia pa- ra o outro. As placas são, a seguir, lavadas 4 vezes com Tween 0,05% (Tween 20) em PBS e bloqueadas com BSA 1%/soro de cabra 1% em PBS, 200 microlitros/cavidade. Depois da incubação com o tampão de bloqueio a 37 2C por 2 horas, as placas são lavadas 4 vezes com Tween 0,05% em PBS e puncionadas secas em toalhas de papel.

B. Incubação com amostras de teste e anticorpo secundário Amostras de teste são diluídas até as concentrações próprias em tampão de amostra, o qual contém BSA 1%/soro de cabra 1%/Tween 0,05% em PBS. Uma curva-padrão é preparada com um anticorpo quimérico (com uma Fc humana), a concentração da qual é conhecida. Para preparar uma curva-padrão, diluições em série são feitas no tampão de amostra para proporcionar uma curva-padrão variando de 125 ng/mL até 3,9 ng/mL. Os padrões e as amostras diluídas são adicionados à placa, 100 microli- tros/cavidade, e a placa é incubada a 379C por 2 horas.

Depois da incubação, a placa é lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. Em cada cavidade são, a seguir, adicionados 100 microlitros do anticorpo secundário, a IgG anti-humana (HRP)-conjugada de peroxidase de rábano silvestre (Jackson Immuno Research), diluída por volta de 1:120.000 no tampão de amostra. A diluição exata do anticorpo secundário teve que ser determinada para cada lote da IgG anti-humana HRP- conjugada. Depois da incubação a 37 -C por 2 horas, a placa é lavada 8 ve- zes com Tween 0,05% em PBS.

C. Desenvolvimento

A solução de substrato é adicionada à placa em 100 μL/cavidade. A solução de substrato é preparada pela dissolução de 30 mg de dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD) (1 comprimido) em 15 ml_ de áci- do cítrico a 0,025 M/tampão de Na2HPO4 a 0,05 M, pH 5, o qual contém 0,03% de H2O2 recentemente adicionado. A cor é deixada se desenvolver por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. O tempo de desenvol- vimento é sujeito a alterações, dependendo da variabilidade lote a lote das placas revestidas, do anticorpo secundário, etc. O desenvolvimento de cor na curva-padrão é observado para determinar quando interromper a reação.

A reação é interrompida pela adição de H2SO4 a 4 N, 100 μL/cavidade. A placa é lida por um leitor de placas, o qual é ajustado tanto em 490 nm quan- to em 650 nm e programado para remover por subtração a OD de fundo a 650 nm da OD a 490 nm.

O ELISA capa anti-hu segue o mesmo procedimento descrito acima, exceto pelo fato de que o anticorpo secundário usado é capa anti-hu de cabra conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Southern Biotech- nology Assoc. Inc., Birmingham, Ala.) usado em uma diluição de 1:4000. Purificação

Procedimentos de purificação de anticorpos padrão foram segui- dos. Tipicamente, composições de anticorpo VHvx/VKvy da invenção foram purificadas dos sobrenadantes da cultura de células através da cromatogra- fia da proteína A baseando-se na afinidade da porção Fc para a proteína A.

O sobrenadante condicionado das células expressando composições de an- ticorpo VHvx/VKvy B4 foi carregado em uma coluna Sepharose de Proteína

A de fluxo rápido pré-equilibrada. A coluna foi lavada extensivamente com tampão de fosfato de sódio (fosfato de sódio a 50 mM, NaCI a 150 mM em pH neutro). A proteína ligada foi eluída por um tampão de fosfato de sódio de baixo pH (pH de 2,5 a 3) (composição conforme acima) e as frações eluí- das foram imediatamente neutralizadas até cerca de pH 6,5 com base Tris a

1M. As composições foram armazenadas em fosfato de sódio a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 6,5 suplementado com Tween 80 até 0,01%.

A pureza e integridade do produto foi rotineiramente avaliada por HPLC de cromatografia de exclusão de tamanho e por SDS-PAGE. Os resul- tados mostraram que os anticorpos VHvx/VKvy B4 da invenção foram tipi- camente maiores do que 90% não-agregados e intactos, com pouca evidên- cia de produtos de degradação.

Exemplo 3. Determinação da afinidade de ligação relativa dos anticorpos B4 da invenção para as células apresentadoras de CD-19.

Para averiguar que os anticorpos da invenção retinham a ligação ao CD19, um ensaio de competição foi usado no qual a força desses anti- corpos para inibir a ligação do anticorpo B4 parental marcado (VH0/VK0 B4) nas células de Iinfoma Daudi, as quais suportam o antígeno CD19, foi medi- do.

Anticorpo VHO/VKO B4 marcado com biotina foi preparado usan- do o kit de biotinilação EZ-Iink SuIfo-NHS-LC (Pierce, N9 21430) de acordo com o protocolo fornecido. O produto foi dialisado com um Slide-a-lyzer (Pi- erce, N- 66425) e analisado por HPLC de cromatografia de exclusão de ta- manho.

Resumidamente, uma série de titulação foi preparada de anti- corpo VHO/VKO B4 marcado com biotina pré-misturada em uma concentra- ção final de 100 ng/mL com um dos anticorpos VHvx/VKvy B4 experimen- tais, não marcados, a 800 ng/mL, 400 ng/mL, 200 ng/mL, 100 ng/mL e 50 ng/mL em um tampão PBS/2% de soro. Como controle, o anticorpo marcado com biotina foi pré-misturado com anticorpo VH0/VK0 B4 não-marcado nas mesmas concentrações que acima (controle de inibição) ou somente com tampão (controle de ligação positivo). Os anticorpos combinados foram adi- cionados em células Daudi por 30 minutos a 4 eC. Uma diluição de 1:200 de estreptavidina marcada com FITC foi adicionada às células e as amostras foram incubadas por mais 30 minutos a 4 5C. A quantidade ligada de anti- corpo VH0/VK0 B4 marcado foi quantificada por análise FACS, e os resulta- dos foram expressos como "inibição porcentual" em relação ao controle de ligação positivo. Os anticorpos testados foram VH0/VK0 B4 (C), VHv1/VKv1 B4 (1), VHv2/VKv1 B4 (2), VHv1/VKv2 B4 (3), VHv2/VKv2 B4 (4), VHv3/VKv3 B4 (5), VHv4/VKv3 B4 (6), VHv3/VKv4 B4 (7), VHv4/VKv4 B4 (8), VHv5/VKv4 B4 (9) e VHv6/VKv4 B4 (10). Resultados representativos dos dois experimentos estão mostrados na Tabela 3 e na Tabela 4. Tabela 3. Inibicão da ligação biotina - VH0/VK0 B4 nas células Daudi pelos anticorpos da invenção.

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tabela 4. Inibicão da ligação biotina - VHO/VKO B4 às células Daudi pelos anticorpos da invenção

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 3 e na Tabela 4, foi descoberto que os anticorpos VHvx/VKvy B4 inibiram a ligação do anticorpo B4 marcado às células Daudi em uma extensão similar à qual o anticorpo VHO/VKO B4 não-marcado fez, indicando que as afinidades dos anticorpos VHvx/VKvy B4 e do anticorpo VHO/VKO B4 são similares.

Exemplo 4. Atividade ADCC dos anticorpos da invenção A atividade ADCC mediada pelos anticorpos da invenção produ- zidos em várias linhagens celulares foi avaliada. ADCC foi determinada por um ensaio de liberação de 51Cr padrão, conforme praticado na técnica. Uma diluição em série dos anticorpos foi preparada (diluições de 4 vezes em uma faixa de 100 ng/mL até 0,025 ng/mL), e Iisada por PBMCs humanos purifica- dos (células efetoras) de células Daudi marcadas com 51Cr (alvo: E:T é de 100:1) na presença dos anticorpos foi medida pela liberação de 51Cr especí- fica, em relação ao 51Cr celular total (ajustando para o 51Cr liberado espon- taneamente). Anticorpos VHv4/VKv4 B4 produzidos das células 293T de rim embrionário humano ou de células YB2/0, e anticorpos VHv5/VKv4 B4 pro- duzidos de uma linhagem celular NS/0 ou de células YB2/0 foram testados.

A figura 38 mostra o resultado de tal experimento. Ambos os an- ticorpos obtidos da expressão celular de YB2/0 foram igualmente ativos na mediação da ADCC, e pelo menos 50 vezes mais ativos do que o anticorpo correspondente obtido pela expressão de uma linhagem celular NS/0 ou das células 293T. O VHv4/VKv4 B4 produzido das células 293T foi mais ativo do que o VHv5/VKv4 B4 produzido de uma linhagem celular NS/0.

Exemplo 5. Depleção de células B humanas em camundongos SCID pelos anticorpos da invenção

A depleção das células B é útil em uma variedade de contextos 15 terapêuticos. Por exemplo, distúrbios auto-imunes e inflamatórios direciona- dos por anticorpo podem ser tratados com anticorpos da invenção para re- duzir ou essencialmente eliminar células B. Alternativamente, ao tratar com um agente de alvejamento de tumor, tal como Zevalin® ou Bexxar® ou uma proteína de fusão Leu16-IL12 (W02005/016969), é útil primeiramente elimi- nar células B normais.

Para endereçar se um anticorpo da invenção poderia ser usado para esgotar células B humanas, o seguinte experimento foi efetuado. No dia 0, camundongos CB17 SCID machos (n = 3) foram enxertados com PBMCs humanos purificados nos quais cerca de 4,5 χ 107 células em 0,2 mL de PBS foram injetadas intraperitonealmente, essencialmente seguindo um protocolo descrito para a transferência de células do baço humanas (Yacoub-Youssef et al., Transpl. Immunol. (2005) 15: 157-164). No dia 3, os camundongos foram injetados intraperitonealmente ou com PBS ou com 50 microgramas do anticorpo anti-CD20 Leu16 ou com o anticorpo anti-CD19 K4H4. Os ní- veis de IgM humanas foram medidos por um kit de quantificação de ELISA de IgM humana (Bethyl Laboratories; Cat η- E80-100) nos dias 7, 14 e 21.

Figura 39 mostra resultados típicos. Nos controles tratados com PBS, o título da IgM humana aumentou constantemente, alcançando cerca de 800 microgramas/mL no dia 42. Nos camundongos tratados ou com Leu16 ou com anticorpo VHv5/VKv4 B4, os títulos de IgM humana foram essencialmente ausentes, indicando que as células B humanas foram esgo- tadas por esses tratamentos com anticorpo.

Exemplo 6. Tratamento de um mamífero com Iinfoma com um anticorpo da invenção.

Para endereçar se os anticorpos da invenção foram funcionais in vivo, o anticorpo VHv4/VKv4 B4, expresso em células YB2/0, foi testado em um modelo animal de Iinfoma humano. Camundongos CB17 SCID de oito semanas de idade (n = 6) foram injetados intravenosamente com cerca de 1 x 106 células Nalm-6-UM-1 "Namalwa" viáveis no dia 0. Nos dias 1, 3 e 5, os camundongos foram tratados com 500 microgramas de anticorpo intraperito- nealmente ou com PBS. Cerca de uma a duas vezes por semana, os ca- mundongos foram examinados para vide qual camundongo havia se tornado doente o suficiente para requerer a eutanásia.

A figura 40 mostra resultados típicos de tal experimento. Todos os camundongos tratados com PBS ficaram doentes em 10 semanas de in- jeção das células tumorais, enquanto que os camundongos tratados com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 se tornaram doentes em momentos posteriores, e três dos seis camundongos nesse grupo permaneceram saudáveis no curso de 30 semanas do experimento.

Exemplo 7. Tratamento de um mamífero com Iinfoma de Burkitt com um an- ticorpo da invenção juntamente com quimioterapia.

Para endereçar se os anticorpos da invenção poderiam ser usa- dos in vivo juntamente com quimioterapia, o anticorpo VHv4/VKv4 B4 foi tes- tado em modelos animais de Iinfoma humano que foram mais estringentes do que no exemplo anterior, correspondendo a mais avançado ou duro para tratar formas de linfoma. Em um experimento representativo, a linhagem ce- lular de Daudi, a qual é uma linhagem celular de linfoma de Burkitt, foi trata- da com o anticorpo VHv4/VKv4 B4, expresso nas células YB2/0, com ou sem ciclofosfamida (CPA). Camundongos CB17 SCID de oito semanas de idade (η = 6) foram injetados intravenosamente com cerca de 5 χ 10^6 células de Daudi viáveis no dia 0. Nos dias 8 e 12, os camundongos foram tratados com 100 microgramas de anticorpo ou PBS. No dia 7, os camundongos fo- ram tratados com PBS ou 75 microgramas de CPA por quilo de peso corpo- ral. Os tratamentos foram administrados intraperitonealmente em 0,2 mL. Cerca de uma a duas vezes por semana, os camundongos foram examina- dos para vide qual camundongo tinha se tornado doente o suficiente para requerer a eutanásia.

A figura 41 mostra os resultados de um experimento típico. No grupo de controle tratado nem com anticorpo nem com CPA, todos os ca- mundongos se tornaram doentes em quatro semanas de injeção das células de linfoma. Nos grupos de camundongos individualmente tratados ou com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 ou com CPA, 5 de 6 camundongos foram saudá- veis por pelo menos cinco semanas, porém ficaram doentes em cerca de seis semanas. No grupo de camundongos tratados tanto com anticorpo VHv4/VKv4 B4 quanto com CPA, todos os camundongos permaneceram saudáveis por pelo menos oito semanas.

Exemplo 8: Tratamento de doença disseminada de linfoma com um anticor- po da invenção combinado com quimioterapia.

Em outro grupo de experimentos, células Namalwa foram injeta- das intravenosamente em camundongos conforme descrito no Exemplo an- terior, exceto que 2x10^6 células foram usadas ao invés de 1 χ 10^6 células. A quantidade aumentada de células resulta em um curso de doença mais a- gressivo, conforme indicado por uma comparação dos camundongos trata- dos com PBS na Figura 42, os quais todos se tornaram doentes em três se- manas, ao contrário dos camundongos tratados com PBS na Figura 40, os quais ficaram doentes entre cinco e 10 semanas. Os camundongos (n = 5) foram tratados com 500 microgramas de anticorpo intraperitonealmente ou com PBS nos dias 3, 7 e 11. Os camundongos também foram tratados ou com ciclofosfamida (75 mg/Kg, i.p.) ou vincristina (0,4 mg/Kg, i.v.) ou doxor- rubicina (3 mg/Kg, i.v.) ou PBS (i.v.) nos dias 3, 7 e 11. Os resultados estão mostrados na Figura 42 (a-c). Os resultados indicaram que cada um dos três agentes quimioterapêuticos poderia ser combinado com um anticorpo da invenção.

Exemplo 9. Tratamento de um paciente humano com anticorpos e métodos da invenção.

Os anticorpos anti-CD19 da invenção são usados para tratar do- enças humanas e distúrbios como se segue. Em geral, o método preferido de administração é por infusão intravenosa ou por injeção intravenosa, em- bora a injeção subcutânea, inalação, distribuição oral e outros métodos tam- bém sejam possíveis. A administração de cerca de uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas é usada, embora a freqüência de administração possa variar de- pendendo das necessidades do paciente. Uma dose típica é de cerca de 100 a 800 mg para um ser humano adulto. Pacientes tratados são monitorados por sinais de infécção que podem resultar da imunossupressão.

Por exemplo, um paciente com doença de Castleman é tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 da invenção cerca de uma vez a cada duas semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com administração por infusão por gotejamento por cerca de 1 hora.

Um paciente com artrite reumatóide é tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 cerca de uma vez a cada quatro semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com administração por infusão por gotejamento por cerca de 1 hora. Foi descoberto que a progressão da destruição das jun- tas é significativamente inibida pela monoterapia, mesmo em comparação com fármacos anti-reumáticos modificadores da doença.

Um paciente com doença de Crohn é tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 cerca de uma vez a cada quatro semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com a administração por infusão por gotejamento por cerca de 1 hora.

Um paciente com mieloma múltiplo é tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 cerca de uma vez a cada três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com administração por infusão por gotejamento por cerca de 1 hora. O tratamento com o VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 é combi- nado com um tratamento-padrão de cuidados para mieloma múltiplo confor- me determinado por um clínico conforme apropriado para o paciente.

Um paciente com um Iinfoma de células B é tratado com o anti- corpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 cerca de uma vez a cada três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com a administração por infusão por gote- jamento por cerca de 1 hora, opcionalmente juntamente com um anticorpo tal como Rituxan® em cerca de 375 miligramas por metro quadrado de área superficial corporal, o qual é administrado a cada semana, ou com o anticor- po anti-CD22 epratuzumab. Alternativamente, no caso de um paciente com linfoma refratário, o tratamento com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 é combinado com um radioimunoconjugado tal como Bexxar® ou Zevalin®.

Mais especificamente, um paciente com um Iinfoma de célula B é tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 cerca de uma vez a ca- da três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, com a administração por infusão por gotejamento por cerca de 1 hora, opcionalmente em combi- nação com um regime quimioterapêutico tal como ciclofosfamida mais vin- cristina mais doxorrubicina mais prednisolona ("CHOP") ou CHOP mais ble- omicina, ou CHOP mais etoposídeo, ou mitoxantrona mais vincristina mais tiotepa, ou etoposídeo mais prednisolona mais citarabina mais cisplatina, ou mesna mais ifosfamida mais mitoxantrona mais etoposídeo, ou bendamusti- na, ou fludaribina e 2-CdA.

Em uma estratégia de tratamento alternativa, um paciente com um Iinfoma de células B é inicialmente tratado com o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 em uma dose de cerca de 8 mg/Kg, e é então depois tratado com uma proteína de fusão anti-CD20-IL2 tal como aquela descrita na WO2005/016969. Por exemplo, um paciente é tratado no dia 1 com o anti- corpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 com a administração por infusão por gote- jamento por cerca de 1 hora, e a seguir tratado no dia 2 e no dia 4 com uma proteína de fusão anti-CD20-IL2 em uma dose de cerca de 150 microgramas por Kg com administração por infusão por gotejamento por cerca de 4 horas, e esse ciclo é repetido a cada cerca de 3 semanas. Sem desejar estar ligado pela teoria, o anticorpo VHv4/VKv4 B4 anti-CD19 tem o efeito de limpar a maior parte das células B normais do paciente, de forma que a proteína de fusão anti-CD20-IL2 exerça seus efeitos pela ligação ao restante das células tumorais.

Claims (25)

1. Anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, po- rém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células- alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes regiões de estrutura de cadeia pesada de imunoglobulina: (i) QVQLX5QPGAEVX12KPGASVX19X2oSCX23X24SGYTFT (SEQ ID NO: 22) em que X5 é Q ou E, X12 é V ou K, X19 é R ou K, X20 é L ou V, X23 é Κ, E ou D e X24 é T ou A, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas referidas posições não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos 1 a 30 da SEQ ID NO: -13. (ii) WVX3QX5PX7X8GLEWIG (SEQ ID NO:23) em que X3 é K, X5 é R, A, ou T, X7 é G e X8 é Q ou K, com a condição de que um dos resíduos de aminoácidos na posição X5 ou X8 não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos 36 a 49 da SEQ ID NO: 13. (iii) YNQKFX6GKAX10LTVDKSSSTAYMEVSX26LTX29EDSAX34YYCAR (SEQ ID NO: 24), em que X6 é K, D ou E, X10 é Κ, E ou D, X26 é S, D ou E, X29 é S ou A e X34 é V ou T, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas referidas posições não é o mesmo que o aminoácido na posição corres- pondente nos resíduos de aminoácidos 60 a 98 da SEQ ID NO: 13.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo regiões de estrutura de cadeia pesada (i), (ii) e (iii).

3. Anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, po- rém ainda é competente para se ligar especificamente ao cd19 e às células- alvo expressando cd19, o referido anticorpo modificado compreendendo as seguintes regiões de estrutura de cadeia leve de imunoglobulina: (iv) X1IX3LTQX7PAX10X11SASPGEKX19TMTC (SEX ID NO: 32) em que X1 é Q ou D, X3 é V ou A, X7 é S ou E, Xi0 é I ou T, X11 é M ou L e X19 é V ou A, com a condição de que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições não é o mesmo que o aminoácido na posição correspondente nos resíduos de aminoácidos de 1 a 23 da SEQ ID NO: 25.

4. Anticorpo B4 modificado de acordo com a reivindicação 3; em que X3 é A e X7 é E.

5. Anticorpo B4 modificado de acordo com a reivindicação 3 ou 4; em que Xi é D, X10 é I1 e Xn é L.

6. Anticorpo B4 modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações dè 1 a 5, compreendendo regiões de estrutura de cadeia pe- sada (i), (ii) e (iii) e da região de estrutura de cadeia leve (iv).

7. Anticorpo B4 modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações dé 1 a 6, compreendendo as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da cadeia leve de imunoglobulina: SASS- GANYMH.

8. Anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, po- rém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células- alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variá- vel da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.

9. Anticorpo B4 modificado, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, po- rém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células- alvo expressando CD19, o referido anticorpo modificado compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variá- vel de cadeia leve selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

10. Anticorpo B4 modificado de acordo com as reivindicações 8 e 9, compreendendo pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoá- cidos da região variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 e pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da região variável da cadeia leve selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

11. Anticorpo B4 modificado de acordo com a reivindicação 10, compreendendo as seguintes cadeias pesada e leve selecionadas do grupo: (i) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 14 e da região variá- vel da cadeia leve da SEQ ID NO: 26; (ii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e da região variá- vel da cadeia leve da SEQ ID NO: 27; (iii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 e da região vari- ável da cadeia leve da SEQ ID NO: 28; (iv) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e da região vari- ável da cadeia leve da SEQ ID NO: 29; (v) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e da região variá- vel da cadeia leve da SEQ ID NO: 29; (vi) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 20 e da região vari- ável da cadeia leve da SEQ ID NO: 30; e (vii) da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e da região vari- ável da cadeia leve da SEQ ID NO: 31.

12. Anticorpo B4 modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, compreendendo a seguinte região determinante de complementaridade da cadeia leve de imunoglobulina (CDRs): SASS- GANYMH.

13. Polipeptídeo pelo menos 90% idêntico a uma região variável de cadeia pesada do anticorpo B4, o qual é menos imunogênico do que o anticorpo B4 não-modificado quando administrado a um ser humano, porém que ainda é competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células- alvo expressando CD19, o polipeptídeo compreendendo uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos correspondendo à VaH2, Leu20, Lys23, Thr24, Gly42, Lys38, Lys65, Lys69, Ser85 ou Val93.

14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que o polipeptídeo é pelo menos 95% idêntico a uma região variável de cadeia pe- sada do anticorpo B4.

15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das substituições Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu ou Val93Thr.

16. Polipeptídeo pelo menos 90% idêntico a uma região variável de cadeia leve do anticorpo B4, o qual é menos imunogênico do que o anti- corpo B4 não-mòdificado quando administrado a um ser humano, porém é ainda competente para se ligar especificamente ao CD19 e às células-alvo expressando CD19, o polipeptídeo compreendendo uma substituição de a- minoácidos em um ou mais resíduos correspondendo a Val3, Ser7, Ile10, Meti 1, VaM 9, Val29, Ser51, Leu53, Ala54 ou Ser75.

17. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 16, em que o polipeptídeo é pelo menos 95% idêntico a uma região variável de cadeia Ie- ve do anticorpo B4.

18. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das substituições Glnl Asp, Val3Ala, Ser7Glu, IIeIOThr, Met11Leu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp ou Ser75Glu.

19. Anticorpo B4 modificado compreendendo um polipeptídeo de cadeia pesada como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 15, e um polipeptídeo de cadeia leve como definido em qualquer uma das rei- vindicações 16 a 18.

20. Anticorpo B4 modificado de acordo com as reivindicação 15 e 18 compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo as seguintes substituições de aminoácidos: Gln5Glu, Val12Lys, Arg19Lys, Leu20Val, Lys23Glu, Lys23Asp, Thr24Ala, Lys38Arg, Gly42Asp, Gly42Glu, Lys65Asp, Lys65Glu, Lys69Glu, Lys69Asp, Ser85Asp, Ser85Glu ou Val93Thrm e uma região variável da cadeia leve compreendendo as seguin- tes substituições de aminoácidos: GIn1Asp, Val3Ala, Ser7Glu, IIe10Thr, MetHLeu, Val19Ala, Val29Ala, Ser51Asp, Leu53Thr, Ala54Asp ou Ser75Glu.

21. Molécula de DNA codificando um anticorpo B4 modificado ou polipeptídeo correspondente de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 20.

22. Vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA como definido na reivindicação 21.

23. Célula hospedeira expressando um anticorpo B4 modificado ou um polipeptídeo correspondente conforme especificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

24. Composição farmacêutica adequada para o tratamento do câncer e doenças auto-imunes compreendendo em uma quantidade farma- cologicamente eficaz de um anticorpo ou polipeptídeo conforme especificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, opcionalmente juntamente com um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente acei- tável.

25. Uso de uma composição farmacêutica de acordo com a rei- vindicação 24 para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças auto-imunes ou câncer.