KR20230123500A - 면역사이토카인 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230123500A
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antigen
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KR1020237024473A
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엘렌 우
샤오윤 우
존 웨이크필드
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이뮤노웨이크 인크.
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Abstract

본 출원은 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, 또는 항체 단편)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

면역사이토카인 및 이의 용도
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 23일자 출원된 미국 특허 가출원 제63/130,339호의 우선권 이익을 주장하며, 이의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 상의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 하기의 제출의 내용은 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다: 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 754392000640SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2021년 12월 23일, 크기: 1,037,246 바이트).
기술분야
본 발명은 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치하거나, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체 또는 항체 단편)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
사이토카인은 면역 세포가 서로 소통할 수 있게 하는 선천 및 적응 면역계의 주요 조절자이다. 암 환자의 면역계를 활성화시키기 위한 사이토카인 치료법은 계속적인 임상 암 연구의 주요 관심 분야이다. 사이토카인 단일치료법을 위한 유의미한 과제는 치료-제한 독성을 야기하지 않고 효과적인 항-종양 반응을 달성하는 것이다. 이 딜레마는 IL-2 및 IL-12 치료법의 낮은 반응률 및 악명 높은 독성에 의해 잘 예시된다. 고 용량의 IL-2는 혈관 누출 증후군(VLS), 활성화-유도 세포 사멸(AICD)에 의해 야기되는 종양 내성 및 조절 T 세포(Treg)의 활성화에 의해 야기되는 면역억제를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이들 심각한 부작용은 종종 최적의 IL-2 투여를 제한하며, 이는 치료법에 성공적으로 반응할 환자의 수를 제한한다. IL-12는 임상 시험에서 보통의 항-종양 반응을 나타내지만 종종 독성에 관한 유의미한 문제를 동반한다(문헌[Lasek et al., Cancer Immunol Immunother., 2014]). IL-12 치료는 전신-독감 유사 증상(예를 들어, 열, 오한, 피로, 피부홍통증 및 두통), 및 골수 및 간에 대한 독성 효과와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 투여 연구는, 환자가 치료적 유효 용량보다 훨씬 낮은 1 μg/kg 미만의 IL-12만 용인할 수 있었음을 보여주었다. 단일치료법으로서 또는 다른 작용제와 조합하여 사용되는 IL-12는 임상 시험에서 강력한 지속적인 치료적 효능을 나타내지 못하였다((문헌[Lasek et al., 2014]).
사이토카인 단일치료법에 관한 문제를 극복하기 위하여 몇몇의 접근법을 취하였다. 최근에, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 컨쥬게이트된 재조합 인간 IL-2("IL-2-PEG")인 NKTR-214는 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었다. IL-2-PEG는 2가지 이점을 제공한다. 먼저, PEG의 입체 장애는 면역억제 Treg의 활성화를 담당하는 IL-2 수용체 α(IL-2Rα) 서브유닛과 상호작용하는 IL-2 상의 영역을 차폐시켜, 종양 사멸 CD8+ T 세포를 향해 활성을 편향시킨다(문헌[Charych et al., Clin Cancer Res., 2016]). 두번째로, PEG의 컨쥬게이션은 혈장 반감기 및 단백질분해-안정성을 크게 개선시키고, 면역원성 및 간 흡수를 감소시킨다(문헌[Chaffee et al., J Clin Invest., 1992]; 문헌[Pyatak et al., Res Commun Chem Pathol Pharmacol., 1980]). 국소 주사에 의한 또는 면역사이토카인(항체, 항체 단편 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질에 융합된 사이토카인)의 이용에 의한 종양 부위로의 사이토카인(예를 들어, IL-12)의 표적화된 전달도 또한 사이토카인 치료법의 부작용을 극복하기 위하여 개발되었다. 면역사이토카인은 사이토카인을 관심 세포 또는 조직, 예컨대 종양 세포 또는 면역 이펙터 세포에 표적화할 수 있다(문헌[Klein et al., Oncoimmunology, 2017]; 문헌[King et al., J Clin Oncol., 2004]).
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 이로써 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원의 일 양태는 a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 제공하며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 항체 단편, 리간드 또는 수용체), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N-말단에, 이의 C-말단에 또는 이의 내부에) 위치한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나만큼) 증가한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 오직 1개의 항원-결합 폴리펩티드만이 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α, 예컨대 IFN-α2b)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)이다. 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 하나의 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 다른 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 사이토카인 또는 이의 변이체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 사이토카인 또는 이의 변이체는 상이하다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 단일특이적 항원-결합 단백질(예를 들어, 단일특이적 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적 항원-결합 단백질(예를 들어, 다중특이적 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)이다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 표적 항원은 TIGIT, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD123, CD25 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, VEGF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, IL-10, IL-12, IL-23, IFN-α 및 IFN-γ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 L18, Q22, F24, K35, R38, F42, K43, E61, P65, Q126 및 S130으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 L18R, Q22E, F24A, R38D, K43E, E61R, P65L, Q126T 및 S130R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 R38D/K43E/E61R 돌연변이, L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이, R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이, L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이 또는 L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R/Q126T/S130R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2 및 251 내지 254 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-α 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 R22, L26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, F36, S68, T79, K83, Y85, Y89, R120, K121, Y122, Q124, Y129, K131, E132, R144 및 E146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A, K31A, D32A, R33A, H34A 및 D35A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체는 SEQ ID NO: 4 내지 9 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-γ 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 V5, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, H111 및 Q115로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A, D21A, D21K, V22A, A23S, A23E, A23Q, A23V, D24A, D24E, N25A, N25K 및 H111D로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A/D21A, D21K, V22A/A23S, D24A/N25A, A23E/D24E/N25K, A23Q 및 A23V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 11 내지 17 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 A23V 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-10 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 N21, M22, R24, D25, L26, R27, D28, A29, F30, S31, R32, H90 및 S93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A, L26A, R27A, D28A, A29S, F30A, S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A/L26A, R27A, D28A/A29S, F30A/S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 21 내지 26 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 R27A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 33의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36, 275, 331 또는 332의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-23 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 194 내지 242 중 어느 하나, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역 내에 위치한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분은 노브-인투-홀(knobs-into-holes; KIH) 돌연변이를 포함한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항체는 하기를 포함하는 항-HER2 항체이다: i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 156의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 157의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 158의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 159의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 160의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 161의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 하기를 포함하는 항-CD3 항체이다: i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 97의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 101의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 109의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 113의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 하기를 포함하는 항-CD4 항체이다: i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 81의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CD8 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 121의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CTLA-4 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 131의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 132의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 133의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 134의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 135의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 136의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 하기를 포함하는 항-PD-L1 항체이다: i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 145의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 146의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 147의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 148의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 149의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CD25 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 169의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 170의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 171의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 172의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 173의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 174의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄는 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 니볼루맙에 비해 감소된(적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 1000배 이상 감소된) PD-1에 대한 결합 친화성을 갖는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-PD-1 항체이며, VH-CDR3은 SEQ ID NO: 102와 비교하여 하기의 돌연변이 중 어느 하나를 포함한다: D100N, D100G, D100R, N99G, N99A 또는 N99M. 일부 실시형태에서, 항체는 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 268 내지 273 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, (i) 항원-결합 단편은 리간드이고, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이거나; (ii) 항원-결합 단편은 수용체이고, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, 리간드 또는 수용체는 IL-2, IL-2Rα(CD25), PD-1, PD-L1, PD-L2, NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 PD-L2이다. 일부 실시형태에서, 리간드는 SEQ ID NO: 176의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, (i) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하거나; (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 182의 서열을 포함하거나; (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 183의 서열을 포함하거나; (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 184의 서열을 포함하거나; (v) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 186의 서열을 포함하거나; (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 275의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 274의 서열을 포함하거나; (vii) 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이고, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 187의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 제2 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 178, 179, 181 및 185 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리간드는 PD-L1의 세포외 도메인이거나, 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PD-L1 리간드는 야생형 PD-L1에 비하여 증가된(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100, 100배 이상 중 어느 하나만큼 증가된) PD-1로의 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-L1 리간드는 SEQ ID NO: 249와 비교하여 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 포함한다: I54Q, E58M, R113T, M115L, S117A 및 G119K. 일부 실시형태에서, PD-L1 리간드는 SEQ ID NO: 249와 비교하여 하기의 돌연변이 중 어느 하나를 포함한다: E58M/R113T/M115L/S117A/G119K, I54Q/E58M/R113T/M115L/S117A/G119K, I54Q/R113T/M115L/S117A/G119K, I54Q/E58M/M115L/S117A/G119K, I54Q/E58M/R113T/S117A/G119K, I54Q/E58M/R113T/M115L/G119K, 또는 I54Q/E58M/R113T/M115L/S117A. 일부 실시형태에서, PD-L1 리간드는 SEQ ID NO: 255 내지 261 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 277의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역에 또는 Fc 단편의 C'에 위치한 제2 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 사이토카인 또는 변이체는 본원에 기재된 임의의 사이토카인 또는 변이체, 예컨대 IL-2 또는 IFN-γ 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역에 위치한 제2 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 제2 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 285 내지 288 및 327 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 리간드는 PD-L2의 세포외 도메인이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PD-L2 리간드는 야생형 PD-L2에 비하여 증가된(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100, 100배 이상 중 어느 하나만큼 증가된) PD-1로의 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-L2 리간드는 SEQ ID NO: 176과 비교하여 임의의 돌연변이 또는 이의 조합을 포함한다: T56V, S58V, Q60L 또는 T56V/S58V/Q60L. 일부 실시형태에서, PD-L2 리간드는 SEQ ID NO: 262 내지 265 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 293의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 힌지 영역 또는 Fc 단편의 C'에 위치한 제2 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 사이토카인 또는 변이체는 본원에 기재된 임의의 사이토카인 또는 변이체, 예컨대 IL-2 또는 IFN-γ 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 리간드는 CD155의 세포외 도메인이거나, 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CD155 리간드는 SEQ ID NO: 267의 서열을 포함한다.
본 출원은 또한, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체, 예컨대 본원에 기재된 HC-CDR3 돌연변이를 갖는 항-PD-1 항체를 제공한다.
본 출원은 또한, 본원에 기재된 임의의 면역사이토카인, 예컨대 힌지 영역에서의 사이토카인의 단일 쇄 융합, 힌지 영역에서의 (동일한 또는 상이한) 사이토카인(cytokein)의 이중 쇄 융합 또는 하나의 쇄의 힌지 영역에 융합된 하나의 사이토카인 및 다른 쇄의 Fc의 C'에 융합된 다른 사이토카인을 포함하는, 실시예에 기재된 임의의 작제물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 본원에 기재된 임의의 사이토카인 또는 변이체, 예컨대 IL-2, IL-12, IFN-γ 등이다.
또한, (예를 들어, Fc 단편의 C'에서) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질의 C'에 융합된 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질; 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 것)를 포함하며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 항-PD-1, PD-L1 또는 PD-L2), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분의 C'에 위치한다.
또한, a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질; b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2 또는 IFN-γ) 또는 이의 변이체 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-12) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 본원에 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드로서, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에 위치한 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드로서, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에 위치한 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다.
또한, a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질; b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2 또는 IFN-γ) 또는 이의 변이체 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-12) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 본원에 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드로서, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에 위치한 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드로서, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체가 Fc 도메인의 C'에 위치한 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다.
본 출원의 또 다른 양태는 유효량의 면역사이토카인을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체 내의 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 선택적인 활성화 방법으로서, 면역사이토카인이 a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 항체 단편, 리간드 또는 수용체), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 리간드/수용체-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N-말단에, 이의 C-말단에 또는 이의 내부에) 위치하며, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합 시에 선택적으로 활성화되는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 출원은 유효량의 상기 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체 내의 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 선택적인 활성화 방법으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합 시에 선택적으로 활성화되는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, (i) 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이거나; (ii) 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다.
본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 인코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포) 및 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나의 생성 방법이 추가로 제공된다.
또한, 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물), 키트 및 제조 물품이 제공된다. 유효량의 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물) 중 어느 하나를 사용한 개체에서의 질병 또는 장애(예를 들어, 암, 감염, 자가면역 질병, 알레르기, 이식편 거부 또는 이식편대숙주병(GvHD))의 치료 방법도 또한 제공된다.
도 1a는 전장 항체 구조를 도시한 것이다. 도 1b는 부모 전장 항체의 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합된 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이다. 도 1c는 부모 전장 항체의 중쇄의 C-말단에 융합된 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이다. 도 1d는 부모 전장 항체의 중쇄 가변 도메인(VH)의 N-말단에 융합된 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이다. 도 1e는 부모 전장 항체의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 융합된 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이다. 연회색으로 칠한 부분은 부모 항체 백본을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2d는 본 발명의 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이며, 하나 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체(또는 이의 서브유닛)는 부모 전장 항체의 하나 또는 둘 모두의 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 도 2a는 부모 전장 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, 또는 IFN-α)를 도시한 것이다. 도 2b는 단일 쇄로 발현되고 부모 전장 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 이량체(동종이량체 또는 이종이량체) 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)를 도시한 것이다. 도 2c는 부모 전장 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체를 도시한 것이다. 도 2d는 부모 전장 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역에 각각 위치한 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 각각의 서브유닛이 부모 전장 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 이량체(동종이량체 또는 이종이량체) 사이토카인 또는 이의 변이체를 도시한 것이다. 연회색으로 칠한 부분은 부모 항체 백본을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 대안적인 예시적 면역사이토카인 구조를 도시한 것이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 (예를 들어, Fab 또는 scFv 내의) VH와 Fc 단편의 하나의 서브유닛 사이에 위치한다. 연회색 부분은 부모 항체 백본을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 예시적인 면역사이토카인 구조를 도시한 것이며, 하나 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체(또는 이의 서브유닛)는 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질의 하나 또는 둘 모두의 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한다. 도 4a는 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질의 하나의 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2 또는 IFN-α)를 도시한 것이다. 도 4b는 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질의 하나의 폴리펩티드의 힌지 영역에 각각 위치한 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 각각의 서브유닛이 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질의 하나의 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한 이량체(동종이량체 또는 이종이량체) 사이토카인 또는 이의 변이체를 도시한 것이다. 도 4c는 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질의 하나의 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한, 단일 쇄로 발현되는 이량체(동종이량체 또는 이종이량체) 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 탠덤으로 융합된 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체를 도시한 것이다. 연회색 부분은 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질 백본을 나타낸다.
도 5는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48), IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(E59A/F60A)/IL-2(R38D/K43E/E61R)/항-PD-1 면역사이토카인(#54) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 4T1 동계 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다.
도 6은 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48), IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29), IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#11) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 EMT6 동계 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30), PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리되는 CT26 동계 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다. 도 7a는 표기된 IL-12 면역사이토카인 또는 대조군을 제공한 모든 마우스에 대한 평균 종양 체적을 보여준다. 처음 치료를 시행한 때의 각각의 군의 평균 종양 크기(±STD)가 괄호 안에 나타나 있다. 도 7b는 표기된 IL-12 면역사이토카인을 제공한 개별 마우스에 대한 종양 체적을 보여준다.
도 8은 CT26 종양에 대하여 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 또는 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34)으로 이전에 처리된 다음, 우측 옆구리에서 CT26 쥣과 결장암 세포 및 좌측 옆구리에서 EMT6 쥣과 유방암 세포(대조군으로서)로 재-시험감염(challenge)된 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다.
도 9는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29) 또는 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)으로 처리된 후기 CT26 동계 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다. 처음 치료를 시행한 때의 각각의 마우스의 종양 크기가 괄호 안에 나타나 있다.
도 10은 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(작제물 #30)으로 처리된 후기 CT26 동계 종양 마우스 모델에서의 종양 크기의 퇴행을 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30), IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 EMT6 동계 유방 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다. 도 11a는 모든 마우스 군의 평균 종양 체적을 보여주며, 처음 치료를 시행한 때의 평균 종양 크기(±STD)가 괄호 안에 나타나 있다. 도 11b는 표기된 IL-12 면역사이토카인을 제공한 개별 마우스에 대한 종양 체적을 보여준다.
도 12는 EMT6 종양에 대하여 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 또는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48)으로 이전에 처리된 다음, 우측 옆구리에서 EMT6 쥣과 유방암 암세포 및 좌측 옆구리에서 CT26 쥣과 결장암 세포(대조군으로서)로 재시험감염된 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다.
도 13은 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc(#30), 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 마우스의 유선 지방 패드로부터 추출된 4T1 쥣과 유방암 종양을 보여준다.
도 14는 유선 지방 패드에서 4T1 세포를 주사하고, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc(#30), 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 마우스에서 폐로 전이된 4T1 쥣과 유방암 세포를 도시한 것이다.
도 15a 및 도 15b는 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30), PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 B16 흑색종 동계 종양 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다. 도 15a는 모든 마우스 군의 평균 종양 체적을 보여주며, 처음 치료를 시행한 때의 평균 종양 크기(±STD)가 괄호 안에 나타나 있다. 도 15b는 표기된 IL-12 면역사이토카인을 제공한 개별 마우스에 대한 종양 체적을 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30), PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 또는 PBS(음성 대조군)로 처리된 LL2 폐암 동계 마우스에서의 종양 체적을 도시한 것이다. 흑색 화살표는 주사 일을 나타낸다. 도 16a는 모든 마우스 군의 평균 종양 체적을 보여주며, 처음 치료를 시행한 때의 평균 종양 크기(±STD)가 괄호 안에 나타나 있다. 도 16b는 표기된 IL-12 면역사이토카인을 제공한 개별 마우스에 대한 종양 체적을 보여준다.
사이토카인은 선천 및 적응 면역의 주요 매개체이다. 그러나, (예를 들어, 암을 치료하기 위한) 사이토카인 치료법은 치료적 유효 용량보다 훨씬 더 낮게 투여량을 제한하는 심각한 독성으로 인하여 제한된 성공을 나타낸 바 있다. 항체, 항원-결합 단편, 리간드-Fc 융합 단백질 또는 수용체-Fc 융합 단백질(하기에서 집합적으로 "리간드/수용체-Fc 융합 단백질" 또는 "리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질"로 지칭됨)에 융합된 사이토카인을 갖는 작제물인 면역사이토카인은 면역사이토카인 내의 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 항체 단편, 리간드, 또는 수용체)에 의한 표적 항원의 인식을 사용하여 표적 세포(예를 들어, 종양 세포 또는 면역 이펙터 세포) 또는 조직에 사이토카인을 전달할 수 있으며, 이는 비특이적인(표적외) 사이토카인 활성 및/또는 관련 독성(예를 들어, 건강한 세포 또는 조직에 대한 독성) 둘 모두를 감소시키면서, 사이토카인 치료 효과를 표적 부위(예를 들어, 질병 부위)에 집중시킬 수 있다. 면역사이토카인의 활성화는 종양 세포 상의 표적 항원으로의 항체 또는 항원-결합 단편의 특이적인 결합을 필요로 하는 트랜스-활성화(trans-activation); 또는 면역 세포 상의 표적 항원으로의 항체 또는 항원-결합 단편의 특이적인 결합을 필요로 하는 시스-활성화(cis-activation)를 통해 발생할 수 있다. 요즘 개발된 대부분의 면역사이토카인은 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합된(예컨대 Hu14.8-IL2, NHS-IL2LT, NHS-IL12, BC1-IL12; 예를 들어, 도 1c 내지 도 1e 참조) 또는 항원-결합 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합된(예를 들어, 디아바디, scFv, 예컨대 L19-IL2 또는 F16-IL2) 사이토카인 모이어티를 가지며, 그래서, 사이토카인-수용체 결합/활성화는 심지어 항체-항원 인식의 부재 하에서도 여전히 발생하여, 표적외 독성을 야기할 수 있다.
본 발명은 현행의 사이토카인/면역사이토카인 치료법이 직면한 문제를 해결하는 독특한 입체배치를 갖는 면역사이토카인을 제공한다. 특히, 본 발명의 면역사이토카인은 사이토카인 모이어티(예를 들어, 사이토카인 또는 이의 변이체)를 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2-CH3 단편, 또는 오직 CH2만 또는 오직 CH3만) 사이의 힌지 영역에, 예를 들어, scFv와 Fc 도메인 서브유닛 사이의 힌지 영역에(예를 들어, VH-VL-사이토카인-Fc 서브유닛 또는 VL-VH-사이토카인-Fc 서브유닛을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드), 전장 항체의 Fab와 Fc 도메인 사이의 힌지 영역에(예를 들어, VH-CH1-사이토카인-Fc 서브유닛을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드) 또는 리간드(또는 수용체)와 Fc 도메인 서브유닛 사이의 힌지 영역에(예를 들어, 리간드-사이토카인-Fc 서브유닛 또는 수용체-사이토카인-Fc 서브유닛을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드) 위치시킴으로써 사이토카인의 비특이적인 활성(즉, 항체 또는 항원-결합 단편-독립적 결합)을 감소시키고, 특이적인 활성(즉, 항체 또는 항원-결합 단편-의존적 결합)을 증가시킨다. 이론에 결부시키지 않고, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab) 및 Fc 도메인 또는 이의 부분의 입체 장애는 항원-결합 단편에 의한 표적 항원 결합의 부재 하에서, 이의 수용체로의 사이토카인 또는 이의 변이체의 접근성을 감소시키거나, 사이토카인 또는 이의 변이체가 이의 수용체에 결합하는 것을 "차폐"시키는 것으로 여겨진다. 반면, 표적 항원의 결합 시에, 사이토카인은 활성화된다. 놀랍게도, 이의 N-말단 또는 C-말단에서 사이토카인 모이어티를 "노출시키는" 다른 면역사이토카인 설계와 달리, 본 발명의 특유한 면역사이토카인 입체배치는 이의 수용체로의 사이토카인 모이어티의 결합이 발생할 수 있기 이전에, 먼저 이의 표적 항원으로의 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합을 필요로 하여, 사이토카인 수용체 활성화가 전적으로 표적 항원-결합 의존적(표적내)인 것을 보장한다. 이 향상된 표적화 특이성 설계로, 사이토카인은 안전하게 표적 부위(예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포)로 전달되어, 치료 효과를 달성할 수 있다.
추가로, 본 출원의 발명자들은 예컨대, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 수용체- 또는 리간드-Fc 융합 단백질) 및 면역 반응의 조절에서 반대 효과를 갖는 사이토카인 모이어티로 작제된, 특정 면역사이토카인이 유의미하게 더 나은 독성 프로필 및 치료 효능을 나타낸 것을 발견하였다. 예를 들어, IL-12 사이토카인(염증-유발성)을 PD-L2 세포외 도메인-힌지-Fc 융합 단백질의 힌지 영역에 위치시키는 경우, 생성되는 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 IL-12 활성(예를 들어, IL-12 수용체로의 결합의 활성 및/또는 IL-12 염증-유발성 활성)을 PD-1+ 표적 세포에 특이적으로 표적화시킬 뿐만 아니라, PD-L2-PD-1 결합을 통해 PD-1 저해 면역 관문 신호전달을 자극하여, 이에 따라, IL-12의 면역자극 활성에 대하여 "균형을 이루는" 면역억제 신호를 생성하였다(하기에서 "균형 면역사이토카인"로도 지칭됨). (예를 들어, 저해성 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4로의 결합에 의해) 면역억제 신호전달 경로를 활성화시키거나 자극할 수 있는 임의의 효능제 항체 또는 리간드(예를 들어, PD-L2, PD-L1, CD80 또는 CD86), 또는 (예를 들어, 예를 들어, 자극성 면역 관문 분자, 예컨대 CD27 또는 CD28, 또는 면역자극 수용체, 예컨대 IL-2R로의 결합에 의해) 면역자극 신호전달 경로를 감소시키거나 차단할 수 있는 임의의 길항제 항체, 리간드 또는 수용체를 면역자극 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IL-12 또는 IL-23)와 조합하여 사용하여, 본원에 기재된 면역사이토카인 입체배치 중 어느 하나를 갖는 균형 면역사이토카인을 작제할 수 있다. (예를 들어, 저해성 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4로의 결합에 의해) 면역억제 신호전달 경로를 감소시키거나 차단할 수 있는 임의의 길항제 항체, 리간드 또는 수용체, 또는 (예를 들어, 예를 들어, 자극성 면역 관문 분자, 예컨대 CD27 또는 CD28, 또는 면역자극 수용체, 예컨대 IL-2R로의 결합에 의해) 면역자극 신호전달 경로를 활성화시키거나 자극할 수 있는 임의의 효능제 항체 또는 리간드(예를 들어, CD70, CD80, CD86 또는 IL-2)를 면역억제 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35, TGF-β)와 조합하여 사용하여, 본원에 기재된 면역사이토카인 입체배치 중 어느 하나를 갖는 균형 면역사이토카인을 작제할 수 있다. 면역 반응 설계의 이러한 "균형"은 이들의 특유한 표적화 특이성 설계에 더하여, 본원에 기재된 면역사이토카인의 생물활성 및 독성을 미세 조정하기 위하여 추가의 조절 층을 부가한다.
본원에 기재된 면역사이토카인은 또한 다양한 진행성 및/또는 난치성 암 유형(예를 들어, TNBC, 흑색종, 폐암)을 치료하여, 암 전이를 저해하고/하거나, 현행의 면역치료법(예를 들어, 항-PD-1 치료법, 항-CTLA-4 치료법 또는 이의 조합 치료법)에 저항성인 암 유형을 치료하거나 이의 종양 진행을 지연시키고/시키거나, 이러한 환자의 수명을 연장시킬 수 있다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 C' Fc 융합과 같은 다른 면역사이토카인 형식에 비해 부작용이 유의미하게 감소된 뛰어난 안전성 프로필을 갖는다.
이 특유한 면역사이토카인 구조 설계와 조합하여, 다양한 사이토카인 변이체를 생성하고 힌지 영역에 위치시켜, 표적 항원-결합의 부재 하에 활성(예를 들어, 사이토카인 수용체로의 결합의 활성 및/또는 사이토카인 생물학적 활성)이 거의 없거나, 전혀 없지만, 표적 항원-결합의 존재 하에 "구제되는" 또는 "드러나는" 증가된 활성을 갖는 사이토카인 변이체를 스크리닝하였다. 사이토카인(예를 들어, IFN-α2b, IL-12, IL-23, IL-10 또는 IFN-γ) 활성을 표적 세포(예를 들어, PD-1+ 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포)에 대해 특이적으로 표적화할 수 있고, 비-표적 세포(예를 들어, PD-1- 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포)에 대하여 최소의 사이토카인 활성을 갖거나, 사이토카인 활성을 갖지 않는 다양한 면역사이토카인을 수득하였다.
따라서, 본 출원의 일 양태는 a) 표적 항원(예를 들어, 세포 표면 항원, 수용체 또는 리간드)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 제공하며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3, 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다.
일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(즉, 본원에 기재된 면역사이토카인을 작제하기 위해 사용되는 항원-결합 단백질 백본)은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체); 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 제공하며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 VH 도메인, 선택적인 제1 CH1, 힌지 영역에서의 사이토카인 모이어티 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 VH 도메인, 선택적인 제2 CH1, 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드; (c) N-말단에서 C-말단으로, 제1 VL 도메인 및 선택적인 제1 CL을 포함하는 제3 항원-결합 폴리펩티드; 및 (d) N-말단에서 C-말단으로, 제2 VL 도메인 및 선택적인 제2 CL을 포함하는 제4 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 제1 VH 및 제1 VL 및 선택적으로 제1 CH1 및 제1 CL은 제1 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, Fab)을 형성하며; 제2 VH 및 제2 VL 및 선택적으로 제2 CH1 및 제2 CL은 제2 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 도메인(예를 들어, Fab)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 scFv-힌지-Fc 융합 폴리펩티드이다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, (제1 VH 도메인 및 제1 VL 도메인) 또는 (제1 VL 도메인 및 제1 VH 도메인), 힌지 영역에서의 사이토카인 모이어티 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 (b) N-말단에서 C-말단으로, (제2 VH 도메인 및 제2 VL 도메인) 또는 (제2 VL 도메인 및 제2 VH 도메인), 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며; 제1 VH 및 제1 VL은 제1 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv)을 형성하며; 제2 VH 및 제2 VL 및은 제2 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 VHH-힌지-Fc 융합 폴리펩티드이다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 VHH, 힌지 영역에서의 사이토카인 모이어티 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 VHH, 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며; 제1 VHH는 제1 표적 항원을 특이적으로 인식하고; 제2 VHH는 제2 표적 항원을 특이적으로 인식한다.
일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 VHH이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 a) 표적 항원(예를 들어, 세포 표면 항원, 수용체 또는 리간드)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질; 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 제공하며, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에, 또는 이의 내부에) 위치한다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 힌지 영역에서의 사이토카인 모이어티 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며; 제1 항원-결합 단편은 제1 표적 항원(예를 들어, 세포 표면 항원, 수용체 또는 리간드)을 특이적으로 인식하며; 제2 항원-결합 단편은 제2 표적 항원(예를 들어, 세포 표면 항원, 수용체 또는 리간드)을 특이적으로 인식한다.
또한, 이러한 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 이러한 면역사이토카인의 생성 방법, 이러한 면역사이토카인을 포함하는 약제학적 조성물 및 제조 용품, 이러한 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물을 사용한 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 선택적인 활성화 방법 및 이러한 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물을 사용한 질병(예를 들어, 암, 바이러스 감염, 자가면역 질병)의 치료 방법이 제공된다.
I. 정의
본 발명의 실시는 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내의 통상적인 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법의 방법을 사용할 것이며, 이 중 다수는 예시를 위하여 하기에 기재된다. 이러한 기법은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009)]; 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1995]; 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]; 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (D. Glover, ed.)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985)]; 문헌[Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984)]; 문헌[Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986)]; 문헌[Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 및 다른 유사 참고문헌을 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "면역사이토카인"은 사이토카인 분자에 융합된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체 또는 항체 단편)) 형식을 지칭한다. 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체 또는 항체 단편)) 형식은 본원에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있으며, 사이토카인은 직접적으로, 또는 링커 또는 화학적 컨쥬게이션 수단에 의해 항원-결합 단백질 형식에 융합될 수 있다.
"사이토카인 캐스케이드" 또는 "고사이토카인혈증(hypercytokinemia)"으로도 알려져 있는 용어 "사이토카인 폭풍"은 고도로 상승된 수준의 다양한 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-6, CCL2 등)을 갖는, 전형적으로 사이토카인과 면역 세포 간의 양성 피드백 루프로 이루어진 잠재적으로 치명적인 면역 반응이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 또는 리간드)이 표적 항원(예를 들어, 수용체 또는 면역 관문 분자)의 "길항제"로 지칭되는 경우, 이는 표적 항원 결합 시에, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 또는 리간드)이 표적 항원의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나, 감소시키는(예를 들어, 수용체 신호전달을 차단하는) 것을 의미한다. 예를 들어, 항-PD-1 길항제 항체는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단하는 항체이다. 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 또는 리간드)이 표적 항원(예를 들어, 수용체 또는 면역 관문 분자)의 "효능제"로 지칭되는 경우, 이는 표적 항원 결합 시에, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 또는 리간드)이 표적 항원의 생물학적 활성을 자극하거나, 활성화시키거나, 향상시키는(예를 들어, 수용체 신호전달을 활성화시키는) 것을 의미한다. 예를 들어, 야생형 PD-L2 리간드(예를 들어, 세포외 도메인)는 PD-1 신호전달을 활성화시키는 효능제이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 질병으로부터 초래되는 하나 이상의 증상의 경감, 질병의 정도의 약화, 질병의 안정화(예를 들어, 질병의 악화의 예방 또는 지연), 질병의 확산(예를 들어, 전이)의 예방 또는 지연, 질병의 재발의 예방 또는 지연, 질병의 진행의 지연 또는 둔화, 병태의 개선, 질병의 (부분적 또는 전체) 차도의 제공, 질병을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 의약의 용량의 감소, 질병의 진행의 지연, 삶의 질의 증가 및/또는 생존의 연장. 또한, 질병의 병리학적 결과의 감소가 "치료"에 의해 포괄된다. 본 발명의 방법은 이들 치료의 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다. 예를 들어, 비제한적으로, 감염성 바이러스의 증식을 감소시키고/시키거나(또는 이를 파괴하고/하거나), 질병으로부터 초래되는 증상(예를 들어, 사이토카인 폭풍)을 감소시키고/시키거나, 질병을 앓고 있는 개체의 삶의 질을 증가시키고/시키거나, 질병을 치료하는 데 필요한 다른 의약의 용량을 감소시키고/시키거나, 개체의 생존을 연장시키는 것을 포함하여, 바이러스 감염과 연관된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거된다면, 개체는 성공적으로 "치료"된다.
용어 "예방하다", 및 유사한 단어, 예컨대 "예방된", "예방하는" 등은 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 예방하거나, 저해하거나, 이의 재발 가능성을 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 이는 또한, 질병 또는 질환의 재발을 지연시키거나 질병 또는 질환의 증상의 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어는 또한 질병 또는 질환의 재발 이전에 질병 또는 질환의 세기, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 질병의 발생을 "지연시키는" 것은 질병의 발생을 유예하고/하거나, 방해하고/하거나, 둔화시키고/시키거나, 저지시키고/시키거나, 안정화시키고/시키거나 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은, 치료 중인 개체 및/또는 질병의 이력에 따라, 다양한 기간일 수 있다. 질병의 발생을 "지연시키는" 방법은, 당해 방법을 사용하지 않는 것과 비교하는 경우, 주어진 기간에 질병 발생의 확률을 감소시키고/시키거나 주어진 기간에서 질병의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는, 전형적으로 통계적으로 유의미한 수의 개체를 사용하는 임상 연구에 기초한다. 암 발생은, 비제한적으로, 컴퓨터화 단층 촬영(CAT Scan), 자기 공명 영상화(MRI), 복부 초음파, 응고 시험, 동맥조영술 또는 생검을 포함하는 표준 방법을 사용하여 검출 가능할 수 있다. 발생은 또한, 초기에 검출 불가능할 수 있는 질병(예를 들어, 암) 진행을 지칭할 수 있고, 출현, 재발 및 발병을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은, 특정 장애, 질환 또는 질병을 치료하는 데, 예컨대 이의 증상 중 하나 이상을 개선시키고/시키거나, 완화하고/하거나, 경감시키고/시키거나, 지연시키는 데 충분한, 작용제 또는 작용제의 조합의 양을 지칭한다. 암과 관련하여, 유효량은 종양이 수축되게 하는 데 및/또는 종양의 성장 속도를 감소시키는 데(예컨대 종양 성장을 억제하는 데) 또는 다른 원치않는 세포 증식을 예방하거나 지연시키는 데 충분한 양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유효량은 발생을 지연시키는 데 충분한 양이다. 일부 실시형태에서, 유효량은 재발을 예방하거나 지연시키는 데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 약물 또는 조성물의 유효량은 (i) 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; (ii) 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; (iii) 주변 기관으로의 암 세포 침윤을 다소 저해, 저지, 둔화, 바람직하게는 중단시킬 수 있고/있거나; (iv) 종양 전이를 저해(즉, 다소 둔화 및 바람직하게는 중단)할 수 있고/있거나; (v) 종양 성장을 저해할 수 있고/있거나; (vi) 종양의 출현 및/또는 재발을 예방하거나 지연시킬 수 있고/있거나; (vii) 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 다소 완화시킬 수 있고/있거나; (viii) 예를 들어, 면역 반응을 위하여, 예컨대 사이토카인(들)을 생성하기 위하여, 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화를 위하여 면역 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 자극하거나 활성화시키고/시키거나; (ix) 염증유발성 사이토카인 분비를 저해하는 것과 같이 염증 또는 자가면역 반응을 예방, 감소 또는 제거할 수 있다. 바이러스 감염의 경우에, 유효량의 작용제는 바이러스 활성을 저해(즉, 다소 감소, 바람직하게는 폐지)할 수 있고/있거나; 상기 바이러스 병원체에 의해 유도되는 염증 또는 사이토카인 폭풍을 제어 및/또는 약화 및/또는 저해할 수 있고/있거나; 상기 바이러스 감염으로부터 발생하거나 그와 연관된, 상기 대상체 또는 상기 대상체의 기관 또는 조직에 대한 상기 바이러스 감염 또는 손상의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방, 정지 및/또는 개선시킬 수 있고/있거나; 감염된 및/또는 비-감염된 조직 및/또는 기관에서 세포 괴사를 제어, 감소 및/또는 저해할 수 있고/있거나; 감염된 또는 비-감염된 조직 및/또는 기관에서 염증성 세포(예를 들어, NK 세포, 세포독성 T 세포, 호중구)의 침윤을 제어, 개선 및/또는 예방할 수 있고/있거나; 예를 들어, 면역 반응을 위하여, 예컨대 사이토카인(들)을 생성하기 위하여, 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화를 위하여 면역 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 자극하거나 활성화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "대상체"는, 비제한적으로, 인간, 소과, 말, 고양잇과, 갯과, 설치류 또는 영장류를 포함하는, 포유동물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 개체는 인간이다.
용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 용어 "항체"는 종래의 4-쇄 항체, 단일-도메인 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
기본 4-쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 유닛으로 이루어지고, 10개의 항원-결합 부위를 함유하는 반면, IgA 항체는 J 쇄와 조합하여 다가 집합체를 형성하도록 중합할 수 있는 2 내지 5개의 기본 4-쇄 유닛을 포함한다. IgG의 경우에, 4-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유적 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로에 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에서, α 및 γ 쇄의 각각에 대하여 가변 도메인(VH)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 아이소타입에 대하여 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서, 가변 도메인(VL)에 이어서 이의 타단에 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH 및 VL의 쌍형성은 단일의 항원-결합 부위를 함께 형성한다. 항체의 상이한 부류의 구조 및 특성에 대하여, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다. 임의의 척추동물 종 유래의 L 쇄는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다로 불리는, 2개의 분명히 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 이들의 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입으로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 부류가 존재한다: 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능의 상대적으로 미소한 차이에 기초하여 하위부류로 추가 분류되고, 예를 들어, 인간은 하기의 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
"단리된" 항체(또는 작제물)는 이의 생성 환경(예를 들어, 천연 또는 재조합)의 성분으로부터 확인되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수된 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 이의 생성 환경 유래의 모든 다른 성분과의 회합이 없다. 이의 생성 환경의 오염 성분, 예컨대 재조합 트랜스펙션된 세포로부터 초래되는 것은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료적 용도를 전형적으로 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드는 (1) 예를 들어, 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정되는 바와 같이 95중량% 초과의 항체로, 일부 실시형태에서, 99중량% 초과로; (2) 회전 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마씨 블루 또는 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 비-환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체(또는 작제물)는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 원위치 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 작제물은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일한 부류의 다른 항체와 비교하여) 항체의 최대 가변성 부분이고 항원 결합 부위를 함유한다. 낙타과 종 유래의 중-쇄 단독 항체만이 "VHH"로 지칭되는 단일의 중쇄 가변 영역을 갖는다. 따라서, VHH는 VH의 특별한 유형이다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 중에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신에, 이는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역(HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭된다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 베타-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에, 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 대부분 베타-시트 입체배치를 채용하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄 유래의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원으로의 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로널 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 모노클로널 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원 부위에 대해 유도된다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로널 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로널 항체는 항원 상의 단일의 결정기에 대해 유도된다. 이들의 특이성에 더하여, 모노클로널 항체는 이들이, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은, 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로널"은 항체의 실질적으로 균질한 모집단으로부터 수득된 것으로서 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로널 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법(예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975)]; 문헌[Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; 문헌[Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술(예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]), 및 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하기 위한 기술(예를 들어, 제WO 1998/24893호; 제WO 1996/34096호; 제WO 1996/33735호; 제WO 1991/10741호; 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; 문헌[Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; 문헌[Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; 문헌[Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; 문헌[Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 문헌[Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함하는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 또는 "전체 항체"는, 항체 단편과 대조적으로, 이의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 구체적으로, 전장 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것들을 포함한다. 전장 중-쇄 단독 항체는 중쇄 가변 도메인(예컨대 VHH) 및 Fc 영역만을 포함한다. 불변 도메인은 고유 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 고유 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다. 본 발명을 위하여, "전장 항체"에 대한 언급이 또한 힌지 영역이 그 내에 위치한 사이토카인 모이어티를 갖는 전장 항체 백본 또는 부모 전장 항체(예를 들어, 전장 4-쇄 항체, 또는 전장 중쇄 단독 항체)를 포함하는 것이 이해되어야 한다(예를 들어, 도 2a 내지 도 2d 참조).
"항체 단편", "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; 문헌[Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조); 단일-쇄 항체(scFv) 분자; 단일-도메인 항체(예컨대 VHH), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 표기인, 잔류 "Fc" 단편을 생성하였다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 도메인(VH), 및 1개 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대하여 1가이며, 즉, 이는 단일의 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 해당하고 항원에 여전히 가교 결합할 수 있는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 제공한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시-말단에 소수의 추가의 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 원래 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 알려져 있다. 본 발명을 위하여, "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 단편"에 대한 언급이 또한 표적 수용체 또는 표적 리간드를 특이적으로 인식할 수 있는 수용체를 특이적으로 인식할 수 있는 리간드를 포함하는 것이 이해되어야 한다.
용어 "불변 도메인"은, 항원-결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비하여 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인(집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL(또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체(면역글로불린)의 "중쇄"는 3개의 기능적 영역으로 나뉠 수 있다: Fd 영역, 힌지 영역 및 Fc 영역(결정화 가능한 단편). Fd 영역은 VH 및 CH1 도메인을 포함하며, 경쇄와 조합하여, Fab - 항원-결합 단편을 형성한다. Fc 단편은 예를 들어, 이펙터 세포의 동족 Fc 수용체로의 결합 및 보체 고정을 포함하는 면역글로불린 이펙터 기능을 담당한다. IgG, IgA 및 IgD 면역글로불린 부류에서 관찰되는 힌지 영역은 Fab 부분이 Fc 영역에 비하여 공간에서 자유롭게 이동하도록 하는 유연성 스페이서로서 작용한다. 불변 영역과 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 면역글로불린 부류 및 하위부류 간에 서열 및 길이 둘 모두가 다양하다. 중쇄 단독 항체에 있어서, "중쇄"는 중쇄 가변 도메인(예컨대 VHH), 힌지 영역 및 Fc 영역을 포함한다. 본 발명을 위하여, "중쇄"에 대한 언급이 또한, VH 도메인, 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, VL-VH-힌지-Fc 도메인 서브유닛, 또는 VH-VL-힌지-Fc 도메인 서브유닛)을 포함하는 중쇄 및 힌지 영역에 위치한 사이토카인 모이어티를 포함하는 중쇄(예를 들어, 전장 4-쇄 항체의 중쇄, VH-힌지-Fc-함유 항체, 또는 중쇄 단독 항체의 중쇄)를 포함하는 것이 이해되어야 한다(예를 들어, 도 2a 내지 도 3c 참조).
임의의 포유동물 종 유래의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 2개의 분명히 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 치밀하게 비-공유적으로 회합된 1개의 중-쇄 및 1개의 경-쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 기여하고, 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(각각 H 및 L 쇄로부터 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 심지어 단일의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화성이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일-쇄 Fv"는 단일의 폴리펩티드 쇄로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv의 검토를 위하여, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 쇄내가 아닌 쇄간 쌍형성이 달성되도록 VH와 VL 도메인 사이에 짧은 링커(약 5 내지 10개 잔기)를 갖는 sFv 단편(선행 단락 참조)을 작제하고, 이에 의해 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 초래함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에서 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들어, 제EP 404,097호; 제WO 93/11161호; 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에서 더 상세히 기재된다.
본원에서 모노클로널 항체는 구체적으로, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래된 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 및 이러한 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위세트로 사용된다.
"인간화된" 형태의 비-인간(예를 들어, 라마 또는 낙타과) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체는 수여자의 (하기에서 정의된) CDR 유래의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 낙타, 라마, 알파카 또는 비-인간 영장류의 CDR 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크("FR") 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수여자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린 서열의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이지만, FR 영역은 항체 성능, 예컨대 결합 친화성, 이성질체화, 면역원성 등을 개선하는 하나 이상의 개별 FR 잔기 치환을 포함할 수 있다. FR 내의 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6개 이하이고, L 쇄에서 3개 이하이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 상세사항에 있어서, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; 문헌[Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; 문헌[Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체의 임의의 제조 기법을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 인간 항체는, 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 인간 모노클로널 항체의 제제에 또한 이용가능한 것은 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 문헌[Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법이다. 또한, 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었지만, 이의 내인성 유전자좌가 불능화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 면역화된 제노마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관하여 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는, 본원에서 사용된 경우, 서열이 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 단일-도메인 항체는 3개의 HVR(또는 CDR): HVR1(또는 CDR1), HVR2(또는 CDR2) 및 HVR3(또는 CDR3)을 포함한다. HVR3(또는 CDR3)은 3개의 HVR 중 최대 다양성을 나타내고, 항체에 미세 특이성을 부여하는 데 특유한 역할을 한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; 문헌[Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 카바트 체계에 의해 정의된 바와 같이 초가변 영역을 지칭하는 데 사용된다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Preteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]을 참조한다.
다수의 HVR 설명(delineation)이 사용중이고 본원에서 포괄된다. 카바트 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기초하고 가장 흔하게 사용된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 초티아는 대신에 구조적 루프의 위치를 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR는 카바트 HVR과 초티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 이들 HVR 유래의 잔기는 하기 표 A에 언급된다.
[표 A]
HVR은 하기와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL 내의 24 내지 36 또는 24 내지 34(L1), 46 내지 56 또는 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97 또는 89 내지 96(L3) 및 VH 내의 26 내지 35(H1), 50 내지 65 또는 49 내지 65(H2) 및 93 내지 102, 94 내지 102 또는 95 내지 102(H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의의 각각에 대하여 상기 문헌[Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.
표현 "카바트에서와 같은 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산-위치 넘버링" 및 이의 변형은 상기 문헌[Kabat et al.]에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 체계를 지칭한다. 이 넘버링 체계를 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일의 아미노산 삽입물(카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열의 상동성의 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
본원에서 달리 나타나지 않는 한, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기의 넘버링은 상기 문헌[Kabat et al.]에서와 같이 EU 인덱스의 것이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
"인간 공통 프레임워크" 또는 "수여자 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 하위군이다. 예는 VL에 대한 것을 포함하며, 하위군은 상기 문헌[Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV일 수 있다. 추가로, VH에 대하여, 하위군은 문헌[Kabat et al.]에서와 같은 하위군 I, 하위군 II 또는 하위군 III일 수 있다. 대안적으로, 인간 공통 프레임워크는, 공여자 프레임워크 서열을 다양한 인간 프레임워크 서열의 집합물과 정렬함으로써 공여자 프레임워크에 대한 이의 상동성에 기초하여 인간 프레임워크 잔기가 선택되는 경우와 같이, 특정 잔기에서 상기로부터 유래될 수 있다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수여자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기존의 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다.
"친화성-성숙된" 항체는, 이들 변경(들)을 보유하지 않는 부모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화성에서 개선을 초래하는 이의 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 일부 실시형태에서, 친화성-성숙된 항체는 표적 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화성-성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH- 및 VL-도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙이 기재된다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어 하기에 의해 기재된다: 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; 문헌[Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; 문헌[Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; 문헌[Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 문헌[Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
용어 "에피토프"는 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab 등)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지고, 통상 특이적인 3차원 구조 특징 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자로의 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다" 또는 "에 특이적이다"는, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종 모집단의 존재 하에서 표적(또는 사이토카인)의 존재를 결정하는, 측정 가능한 및 재현 가능한 상호작용, 예컨대 표적과 항원-결합 단백질(또는 사이토카인과 사이토카인 수용체) 간의 결합을 지칭한다. 예를 들어, (에피토프일 수 있는) 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(예컨대 Fab)은 이것이 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더욱 용이하게 및/또는 더 오랜 기간으로 이 표적에 결합하는 항원 결합 단백질이다. 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 사이토카인은 이것이 다른 사이토카인 수용체에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더욱 용이하게 및/또는 더 오랜 기간으로 이 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 관련없는 표적(또는 관련없는 사이토카인 수용체)로의 항원 결합 단백질(또는 사이토카인)의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정되는 바와 같이 표적으로의(또는 측정되는 바와 같이 사이토카인 수용체로의) 항원 결합 단백질(또는 사이토카인)의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시형태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(또는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 사이토카인)은 ≤10-5 M, ≤10-6 M, ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M, ≤10-10 M, ≤10-11 M, 또는 ≤10-12 M의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단백질(또는 사이토카인 수용체)은 상이한 종 유래의 단백질 간에 보존되는 단백질(또는 사이토카인) 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 특이적인 결합은 배타적인 결합을 포함할 수 있지만, 이를 요구하지 않는다. 항원-결합 단백질(또는 사이토카인과 사이토카인 수용체)의 결합 특이성은 당업계에서 공지된 임의의 단백질 결합 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIACORETM -시험 및 펩티드 스캔을 포함한다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 선택적인 인식을 지칭한다. 천연 항체는, 예를 들어, 단일특이적이다. 본원에서 사용되는 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질이 폴리에피토프 특이성을 갖는(즉, 하나의 생물학적 분자 상의 2개, 3개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 2개, 3개 이상의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 것을 나타낸다. 본원에 사용되는 "이중특이적"은 항원 결합 단백질이 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 것을 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 항원이 열거된 이중특이적 항체에 의해 결합되는 순서는 임의적이다. 즉, 예를 들어, 용어 "항-CD3/HER2", "항-HER2/CD3", "CD3×HER2" 및 "HER2×CD3"은 CD3 및 HER2 둘 모두에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "단일특이적"은 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항원 결합 단백질을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "가"는 항원 결합 단백질 내의 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 천연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며, 2가이다. 이와 같이, 용어 "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 각각 항원 결합 단백질 내의 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항체 이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 그들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. "감소된 또는 최소화된" 항체 이펙터 기능은 야생형 또는 미변형된 항체로부터 적어도 50%(대안적으로 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)로 감소된 것을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 결정은 당업계의 통상적인 기술 중 하나에 의해 용이하게 결정 가능하고 측정 가능하다. 바람직한 실시형태에서, 보체 결합, 보체 의존적 세포독성 및 항체 의존적 세포독성의 항체 이펙터 기능은 영향을 받는다. 일부 실시형태에서, 이펙터 기능은 당화를 제거한 불변 영역에서의 돌연변이, 예를 들어, "이펙터 결여(effectorless) 돌연변이"를 통해 제거된다. 일부 실시형태에서, 이펙터 결여 돌연변이는 CH2 영역 내의 N297A 또는 DANA 돌연변이(D265A+N297A)이다. 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9):6591-6604 (2001)]. 대안적으로, 감소된 또는 제거된 이펙터 기능을 초래하는 추가의 돌연변이는 하기를 포함한다: K322A 및 L234A/L235A(LALA). 대안적으로, 이펙터 기능은 생성 기법, 예컨대 당화하지 않는(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 또는 이펙터 기능 촉진에 효과가 없거나 덜 효과적인 변경된 당화 패턴을 초래하는 숙주 세포에서의 발현을 통해 감소되거나 제거될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003]).
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 ADCC는 특정한 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 중성구 및 대식구)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합되어 있는 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시키고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포의 "팔을 형성하고(arm)", 이 메커니즘에 의한 표적 세포의 사멸에 필요하다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인, NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 한편, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 Fc 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]의 464쪽의 표 2에서 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 동물 모델, 예컨대 문헌[Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것에서 평가될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 이들의 동족 항원에 결합된 (적절한 하위부류의) 항체로의 보체계의 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가된 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 항체 변이체는 미국 특허 제6,194,551B1호 및 제WO99/51642호에 기재된다. 이들 특허 공보의 내용은 특별히 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
본원에서 용어 "Fc 영역", "단편 결정화 가능 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc 도메인"은, 고유-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Cys226 위치에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터, 이의 카복실-말단까지 신장하도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 체계에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체 또는 Fc-융합 단백질의 생성 또는 정제 동안, 또는 항체 또는 Fc-융합 단백질의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 재조합으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 모집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 모집단, 및 K447 잔기를 갖는 또는 이를 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 모집단을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 면역사이토카인에 사용하기 위한 적합한 고유-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본원에 이용되는 용어 IgG "아이소타입" 또는 "하위부류"는 이들의 불변 영역의 화학적 및 항원적 특징에 의해 정의되는 면역글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 널리 알려져 있고, 일반적으로 예를 들어, 문헌[Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 기재되어 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체 또는 Fc-융합 단백질의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 고유 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이고(감마 수용체), FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하고, FcγRII 수용체는 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반의 저해 모티프(ITIM)를 함유한다. (문헌[M. Daron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]을 참조한다). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]; 문헌[Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 문헌[de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 검토된다. 장래에 확인될 것들을 포함하는, 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포괄된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 태아로의 모계 IgG의 전달을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다. 문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)]. FcRn으로의 결합을 측정하는 방법이 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997)]; 문헌[Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997)]; 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004)]; 제WO 2004/92219호(Hinton et al.) 참조). 인간 FcRn 고-친화성 결합 폴리펩티드의 생체내에서의 FcRn으로의 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스펙션된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 검정될 수 있다. 제WO 2004/42072호(Presta)에는 FcR으로의 결합을 개선하거나 감소시킨 항체 변이체가 기재된다. 또한, 예를 들어, 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편(예컨대 리간드, 수용체, VHH, scFv 등) 또는 사이토카인)의 단일의 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원(예컨대 세포 표면 분자, 수용체, 리간드 등) 또는 사이토카인 수용체) 간의 비-공유적 상호작용의 세기의 총합을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 결합 친화성은 Kd, Koff, Kon 또는 Ka로 표시될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "Koff"는, s-1의 단위로 표현된, 동력학적 선택 설정으로부터 결정되는 바와 같은, 항체(또는 항원-결합 단편)/항원 복합체(예를 들어, 리간드-수용체 복합체)로부터 항체(또는 항원-결합 단편)의 해리에 대한 오프(off)-속도 상수, 또는 사이토카인/사이토카인 수용체 복합체로부터 사이토카인의 해리에 대한 오프 속도 상수를 지칭하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 "Kon"은 M-1s-1의 단위로 표현된, 항체(또는 항원-결합 단편)/항원 복합체를 형성하기 위한 항원으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 회합에 대한 온(on)-속도 상수, 또는 사이토카인/사이토카인 수용체 복합체를 형성하기 위한 사이토카인 수용체로의 사이토카인의 회합에 대한 온 속도 상수를 지칭하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 평형 해리 상수 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체(또는 항원-결합 단편)-항원 상호작용(또는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용)의 해리 상수를 지칭하고, 항체(또는 항원-결합 단편) 분자(또는 사이토카인 수용체)의 용액에 평형으로 존재하는 모든 항체-결합 도메인(또는 항원-결합 단편)의 절반을 차지하는 데 필요한 항원(또는 사이토카인)의 농도를 기재하고, M의 단위로 표현된, Koff/Kon과 같다. Kd의 측정은 모든 결합 작용제가 용액 중에 존재하는 것을 전제한다. 항체(또는 항원-결합 단편)가 세포 벽에 테더링되는 경우에, 예를 들어, 효모 발현 시스템에서, 상응하는 평형 속도 상수는, Kd의 양호한 근사치를 제공하는, EC50으로서 표현된다. 친화성 상수, Ka는 M-1의 단위로 표현된, 해리 상수 Kd의 역수이다. 해리 상수(KD 또는 Kd)는 항원 대한 항체(또는 항원-결합 단편)의(또는 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의) 친화성을 보여주는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 다양한 마커 작용제로 표시된 항체(또는 항원-결합 단편)를 이용하는 스캐차드(Scatchard) 방법에 의해, 뿐만 아니라 키트에 첨부된 사용자의 매뉴얼 및 실험 운영 방법에 따라, 처방전 없이 살 수 있는 측정 키트, 또는 유사한 키트인, BIACORETM X(아머샴 바이오사이언스즈(Amersham Biosciences)에 의해 제조됨)를 사용함으로써 용이한 분석이 가능하다. 이들 방법을 사용하여 도출될 수 있는 KD 값은 M(Mol)의 단위로 표현된다. 표적(또는 사이토카인 수용체)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(또는 사이토카인)은, 예를 들어, ≤10-5 M, ≤10-6 M, ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M, ≤10-10 M, ≤10-11 M 또는 ≤10-12 M의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다.
절반 최대 저해 농도(IC50)는 특정 생물학적 또는 생화학적 기능의 저해에서의 물질(예컨대 항체 또는 항원-결합 단편)의 유효성의 척도이다. 이는 얼마나 많은 특정 약물 또는 다른 물질(저해제, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편)이 주어진 생물학적 프로세스를 절반만큼 저해하는 데 필요한지를 나타낸다. 값은 전형적으로 몰 농도로서 표현된다. IC50은 효능제 약물 또는 다른 물질(예컨대 항체, 항원-결합 단편 또는 사이토카인)에 대한 "EC50"과 유사하다. EC50은 또한 생체내에서 최대 효과의 50%를 수득하는 데 필요한 혈장 농도를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "IC50"은 시험관내에서 항원 생물활성의 50%를 중화시키는 데 필요한 항체 또는 항원-결합 단편의 유효 농도를 나타내는 데 사용된다. IC50 또는 EC50은 생물검정, 예컨대 FACS 분석(경쟁 결합 검정), 세포-기반의 사이토카인 방출 검정, 또는 증폭된 발광 근접 동종 검정(AlphaLISA)에 의한 리간드 결합의 저해에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "공유 결합"은 하나 이상의 전자를 공유하는 2개의 원자 간의 안정한 결합을 지칭한다. 공유 결합의 예는 비제한적으로 펩티드 결합 및 디술피드 결합을 포함한다. 본원에 사용된 "펩티드 결합"은 아미노산의 카복실 기와 인접 아미노산의 아민 기 간에 형성된 공유 결합을 지칭한다. 본원에 사용된 "디술피드 결합"은 2개의 황 원자 간에 형성된 공유 결합, 예컨대 하나 이상의 디술피드 결합에 의한 2개의 Fc 단편(또는 사이토카인 서브유닛)의 조합을 지칭한다. 하나 이상의 디술피드 결합은 2개의 단편에서 티올 기를 연결함으로써 2개의 단편 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 디술피드 결합은 2개의 Fc 단편의 하나 이상의 시스테인 사이에 형성될 수 있다. 디술피드 결합은 2개의 티올 기의 산화에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공유적 연결은 공유 결합에 의해 직접적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 공유적 연결은 펩티드 결합 또는 디술피드 결합에 의해 직접적으로 연결된다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 관하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)" 및 "상동성"은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하도록 갭을 도입한 후에, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않고, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNATAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는, 비교 중인 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 폴리펩티드의 "C 말단"은 이의 아민 기를 공여하여 이의 인접 아미노산 잔기의 카복실 기와 펩티드 결합을 형성하는 폴리펩티드의 마지막 아미노산 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 폴리펩티드의 "N 말단"은 이의 카복실 기를 공여하여 이의 인접 아미노산 잔기의 아민 기와 펩티드 결합을 형성하는 폴리펩티드의 첫번째 아미노산을 지칭한다.
본원에 기재된 작제물, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생성되었던 환경에서 보통 회합되어 있는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생성 환경과 연관된 모든 성분과의 회합이 없다. 본원에 기재된 작제물, 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 형태로 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 세포 내에서 천연적으로 존재하는 본원에 기재된 작제물, 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 핵산과 구별된다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 이의 천연의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서의 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능성 관계에 놓인 경우 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프레서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레단백질로서 발현되면 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 위치되면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 해독기인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 접근이 용이한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레티드 어댑터 또는 링커는 종래의 실시에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 당해 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에 사용되는 용어 "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 프로세스를 지칭한다. "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되거나, 형질전환되거나, 형질도입된 것이다. 당해 세포는 일차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환 가능하게 사용되고, 이러한 세포의 자손을 포함하는, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는, 일차 형질전환된 세포 및 계대의 수와 무관하게 그로부터 유래된 자손을 포함하는, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 내용물이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
용어 "약제학적 제형" 또는 "약제학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 하기 위한 형태로 존재하고, 제형이 투여될 대상체에게 허용 불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 멸균성이다. "멸균" 제형은 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 없다.
본원에 기재된 본 발명의 실시형태가 실시형태"로 이루어지는" 및/또는 이"로 본질적으로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 이 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변화를 포함한다(그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아닌" 것에 대한 언급은 값 또는 파라미터 "이외"를 일반적으로 의미하고 설명한다. 예를 들어, 본 방법이 유형 X의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 당해 방법이 X 이외 유형의 암을 치료하는 데 사용되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형("a," "or," 및 "the")은 문맥에서 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수의 참조대상을 포함한다.
II. 면역사이토카인
본 발명은 일 양태에서, 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체 또는 항체 단편)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 제공한다. 본원에 기재된 면역사이토카인을 작제하기 위한 백본으로서 제공되는 부모 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편 형식, 예컨대 전장 4-쇄 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)에 융합된 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, Fab)의 것일 수 있다. 본원에 기재된 면역사이토카인을 작제하기 위한 백본으로서 제공되는 부모 항원-결합 단백질은 또한, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 또는 수용체), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3, 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, Fab)); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 VH 도메인, 선택적인 제1 CH1, 제1 힌지 영역에서의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체(예를 들어, 사이토카인 모이어티는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 힌지 영역의 C-말단과 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 사이에, 또는 힌지 영역의 내부에 존재함), 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3, 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 VH 도메인, 선택적인 제2 CH1, 제2 힌지 영역, 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3, 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드; (c) N-말단에서 C-말단으로, 제1 VL 도메인 및 선택적인 제1 CL을 포함하는 제3 항원-결합 폴리펩티드; 및 (d) N-말단에서 C-말단으로, 제2 VL 도메인 및 선택적인 제2 CL을 포함하는 제4 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며; 제1 VH 및 제1 VL, 및 선택적으로 제1 CH1 및 제1 CL은 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, Fab)을 형성하며; 제2 VH 및 제2 VL, 및 선택적으로 제2 CH1 및 제2 CL은 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 도메인(예를 들어, Fab)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 전장 부모 항체(하기에 "전장 항체 면역사이토카인"으로도 지칭됨)를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질(하기에서 상응하는 면역사이토카인은 "Fc-융합 단백질 면역사이토카인"으로도 지칭됨), 예컨대 scFv-힌지-Fc 융합 단백질, VHH-힌지-Fc 융합 단백질, 리간드-힌지-Fc 융합 단백질 또는 수용체-힌지-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 작제하기 위한 백본으로 사용되는 부모 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 제1 힌지 영역에서의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체(예를 들어, 사이토카인 모이어티는 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 힌지 영역의 C-말단과 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 사이에, 또는 힌지 영역의 내부에 존재함), 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH 또는 scFv), 제2 힌지 영역 및 Fc 도메인 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며; 제1 항원-결합 단편은 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하며; 제2 항원-결합 단편은 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체), 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체(예를 들어, 전장 항체, 또는 Fc 도메인 또는 이의 부분에 융합된 항원 결합 단편)는 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 오직 하나의 중쇄만이 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 오직 하나의 항원-결합 폴리펩티드만이 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 각각의 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체(예를 들어, 전장 항체, 또는 Fc 도메인 또는 이의 부분에 융합된 항원 결합 단편)는 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상)의 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-2 또는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-α2c)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10 또는 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-12 또는 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 하나의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 다른 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 상이하다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 다중특이적이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, 에리트로포이에틴, VEGF, 트롬보포이에틴, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, VHH, 리간드, 수용체)의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄는 불변 영역 1(CH1)을 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항체의 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질)의 힌지 영역의 C-말단과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)의 힌지 영역의 내부에 위치한다(예를 들어, 힌지 영역의 내측 부분을 대체하거나, 힌지 영역 내에 삽입되고, 하나 이상의 추가의 힌지 또는 링커 아미노산을 도입하거나, 힌지 영역 아미노산의 결실 없이 힌지 영역 내에 삽입된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질), 예컨대 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분은 노브-인투-홀(KIH) 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 각각의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 전장 항체의 중쇄)는 KIH 돌연변이를 포함한다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 (예를 들어, 표적 세포 상의 저해성 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4로의 결합에 의해) 면역억제 신호전달 경로를 활성화시키거나 자극할 수 있는 효능제 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 또는 리간드(예를 들어, PD-L2, PD-L1, CD80 또는 CD86)이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 면역자극 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IL-12 또는 IL-23)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 (예를 들어, 자극성 면역 관문 분자, 예컨대 CD27 또는 CD28, 또는 면역자극 수용체, 예컨대 IL-2R로의 결합에 의해) 면역자극 신호전달 경로를 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 리간드 또는 수용체이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 면역자극 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IL-12 또는 IL-23)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 (예를 들어, 저해성 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4로의 결합에 의해) 면역억제 신호전달 경로를 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 리간드 또는 수용체이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 면역억제 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35, TGF-β)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 (예를 들어, 자극성 면역 관문 분자, 예컨대 CD27 또는 CD28, 또는 면역자극 수용체, 예컨대 IL-2R로의 결합에 의해) 면역자극 신호전달 경로를 활성화시키거나 자극할 수 있는 효능제 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 또는 리간드(예를 들어, CD70, CD80, CD86 또는 IL-2)이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 면역억제 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35, TGF-β)이다.
일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하며; 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하며; 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12, 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하며; 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체), 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체), 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가하며; 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체), 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 전장 항체의 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 전장 항체의 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 전장 항체의 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가하며; 표적 항원으로의 항체(또는 항원 결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가하며; 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다.
일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체는 제1 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하며, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 제2 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체는 항체의 제1 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 항체의 제2 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 제1 힌지 영역에서의 제1 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하며; 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 제2 힌지 영역에서의 제2 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 제1 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 제2 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체의 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 제1 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 단편(예를 들어, 제1 Fab)을 형성하며, 항체의 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 제2 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 단편(예를 들어, 제2 Fab)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합(예를 들어, 제1 표적 항원으로의 제1 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드의 결합, 및/또는 제2 표적 항원으로의 제2 항원-결합 단편, 예컨대, 예컨대 Fab 또는 리간드의 결합)의 존재 하에서, 제1 및/또는 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재(예를 들어, 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드 중 어느 것도 표적 항원에 결합하지 않음) 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재(예를 들어,항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드 중 어느 것도 표적 항원에 결합하지 않음) 하에서, 각각의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치한 제1 및/또는 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 제1 및/또는 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체는 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 2)이다. 일부 실시형태에서, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 36)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다.
일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체, 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체, 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 제1 사이토카인 또는 이의 변이체, 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), 제2 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; b) 제1 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체, 및 c) 제2 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체, 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 제1 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질)의 힌지 영역에 위치한 제1 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 제1 및 제2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개의 사이토카인 또는 이의 변이체는 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 2)이다. 일부 실시형태에서, 제2 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 36)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10 또는 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-12 또는 IL-23이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 [이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛, 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛], CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치한 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체는 이량체 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 이량체 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 이량체 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10 또는 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-12 또는 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다.
일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며; 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 제1 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하고, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 제2 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 제1 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 제2 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 제1 힌지 영역에서의 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하며, 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 제2 힌지 영역에서의 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 전장 항체의 제1 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 전장 항체의 제2 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체의 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 제1 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 단편(예를 들어, 제1 Fab)을 형성하며, 항체의 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 제2 표적 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 단편(예를 들어, 제2 Fab)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합(예를 들어, 제1 표적 항원으로의 제1 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드의 결합 및/또는 제2 표적 항원으로의 제2 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드의 결합)의 존재 하에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재(예를 들어, 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드 중 어느 것도 표적 항원에 결합하지 않음) 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재(예를 들어, 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 또는 리간드 중 어느 것도 표적 항원에 결합하지 않음) 하에서, 각각의 서브유닛이 각각의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치한 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 이량체 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 이량체 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10 또는 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-12 또는 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 항-IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 IL-2 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 L18, Q22, F24, K35, R38, F42, K43, E61 및 P65로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 F24A, R38D, K43E, E61R 및 P65L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 R38D/K43E/E61R 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IL-2 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IL-2의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 156의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 156의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 79의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 119의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 131의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 131의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-2 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 169의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 169의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 하나의 중쇄, 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-2 면역사이토카인("IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IL-2 또는 이의 변이체는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 180의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 179의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-2 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 R22, L26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, F36, S68, T79, K83, Y85, Y89, R120, K121, Y122, Q124, Y129, K131, E132, R144 및 E146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A, K31A, D32A, R33A, H34A 및 D35A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 4 내지 9 중 어느 하나의 서열을 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A 돌연변이를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IL-2/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 157의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 157의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IL-2/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 97의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 97의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 109의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 109의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 132의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 132의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 145의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 145의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-α 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 170의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 170의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나)를 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 면역사이토카인("IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IFN-α 또는 이의 변이체는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 182의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 182의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 181의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-α 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-γ 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 [IFN-γ 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나), 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), IFN-γ 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)], CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 V5, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, H111 및 Q115로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A, D21A, D21K, V22A, A23S, A23E, A23Q, A23V, D24A, D24E, N25A, N25K 및 H111D로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A/D21A, D21K, V22A/A23S, D24A/N25A, A23E/D24E/N25K, A23Q 및 A23V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 11 내지 17 중 어느 하나의 서열을 포함하며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 A23V 돌연변이를 포함하는 IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함하며, IFN-γ 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IFN-γ 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IFN-γ의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 158의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 158의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 98의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄, 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 81의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 81의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 121의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 121의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 133의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 133의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 146의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 146의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 171의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 171의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IFN-γ 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 18 또는 19)를 포함하는 IFN-γ 면역사이토카인("IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IFN-γ 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 10 내지 17 중 어느 하나)은 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 183의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 183의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 181의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IFN-γ 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-10 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 [IL-10 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나), 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), IL-10 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)], CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 N21, M22, R24, D25, L26, R27, D28, A29, F30, S31, R32, H90 및 S93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A, L26A, R27A, D28A, A29S, F30A, S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A/L26A, R27A, D28A/A29S, F30A/S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 21 내지 26 중 어느 하나의 서열을 포함하며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 R27A 돌연변이를 포함하는 IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하며, IL-10 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, IL-10 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IL-10 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IL-10의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 159의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 159의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 99의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 111의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 134의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 134의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 147의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 147의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 또는 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이)에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 172의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 172의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IL-10 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 27 또는 28)를 포함하는 IL-10 면역사이토카인("IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IL-10 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 20 내지 26 중 어느 하나)은 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 184의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 184의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 181의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-10 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 [IL-12 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛(예를 들어, p40, 예컨대 SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나), 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), IL-12 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛(예를 들어, p35, 예컨대 SEQ ID NO: 29)], CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함하며, IL-12 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함하는 IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하며, IL-12 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IL-12 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IL-12의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 160의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 160의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36); 및 c) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-12/IL-2 면역사이토카인("IL-12/IL-2/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄)의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며), IL-2 또는 이의 변이체는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄)의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 2개의 중쇄를 포함하는 PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36); 및 c) IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)를 포함하는 IL-12/IL-2/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며; IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 제1 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); IL-2 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 2)는 전장 항체의 제2 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하며; 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체) 또는 항원-결합 단편의 결합(예를 들어, PD-1로의 제1 항원-결합 단편의 결합 및/또는 PD-1로의 제2 항원-결합 단편의 결합)의 존재 하에서, IL-12 및/또는 IL-2(또는 이의 변이체)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재(예를 들어, 항원-결합 단편 중 어느 것도 PD-1에 결합하지 않음) 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체) 또는 항원-결합 단편의 결합의 부재(예를 들어, 항원-결합 단편 중 어느 것도 PD-1에 결합하지 않음) 하에서, 각각의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-Fc 폴리펩티드)의 힌지 영역에 위치한 IL-12 및/또는 IL-2(또는 이의 변이체)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 및/또는 IL-2(또는 이의 변이체)의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 효능제 또는 길항제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 83의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 123의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 135의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 135의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 148의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 148의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 또는 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에), 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 173의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 173의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IL-12 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 35 또는 36)를 포함하는 IL-12 면역사이토카인("IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IL-12 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p35 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 29) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p35 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 29)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p35). 일부 실시형태에서, p35 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p35-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 186의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 186의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 185의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 33의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 275의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 274의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 274의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 185의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-12 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-23 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체)이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드는 항체의 중쇄이며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드이며, 표적 항원은 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 수용체이며, 표적 항원은 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드이다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 [IL-23 또는 이의 변이체의 제1 서브유닛(예를 들어, p40, 예컨대 SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나), 선택적으로 링커(예를 들어, 펩티드 링커), IL-23 또는 이의 변이체의 제2 서브유닛(예를 들어, p19, 예컨대 SEQ ID NO: 37)], CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함하며, IL-23 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함하는 IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하며, IL-23 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체를 포함하는 IL-23 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 IL-23 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 IL-23의 활성의 약 80% 이하이다(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 길항제이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-HER2 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-HER2 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) HER2를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-HER2 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-HER2 항체는 i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-HER2 항체는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 161의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-HER2 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 161의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, HER2로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD3 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-CD3 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD3을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-CD3 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD3 항체는 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 101의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-CD3 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 101의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD3으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-PD-1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-PD-1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-PD-1 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-1 항체는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 113의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-PD-1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 113의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-CD4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-CD4 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD4 항체는 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD4 항체는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-CD4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-CD8 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-CD8 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD8을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-CD8 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD8 항체는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-CD8 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD8로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CTLA-4 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CTLA-4를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CTLA-4 항체는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 136의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 136의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) PD-L1을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-PD-L1 항체는 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 149의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 149의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-L1으로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항-CD25 항체이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/항-CD25 면역사이토카인")이 제공되며, 항체는 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)을 포함하는 중쇄를 포함하며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에), 또는 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, a) CD25를 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23/항-CD25 면역사이토카인이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치하며(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결되며); 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항-CD25 항체는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 174의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/항-CD25 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 174의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 하나의 중쇄. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, CD25로의 항체(또는 항원-결합 단편)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 효능제 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서, a) N'에서 C'으로, PD-1을 특이적으로 인식하는 PD-L2(예를 들어, SEQ ID NO: 176), 힌지 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드; 및 b) IL-23 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 38 또는 39)를 포함하는 IL-23 면역사이토카인("IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인")이 제공되며, IL-23 또는 이의 변이체의 둘 모두의 p19 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 37) 및 p40 서브유닛(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)은 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 PD-L2의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, p40 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 30 내지 34 중 어느 하나)는 p19 서브유닛 또는 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 37)의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p40-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p19). 일부 실시형태에서, p19 서브유닛 또는 이의 변이체는 p40 서브유닛 또는 이의 변이체의 N-말단에 존재한다(예를 들어, p19-선택적인 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)-p40). 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 187의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하기를 포함하는 IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인이 제공된다: SEQ ID NO: 187의 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 185의 서열을 포함하는 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 존재 하에서, IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 PD-1로의 PD-L2 리간드의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, PD-1로의 PD-L2 리간드의결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 IL-23 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 자극하거나 향상시킬 수 있는 효능제이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 모이어티는 PD-1 신호전달을 감소시키거나 차단할 수 있는 길항제이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 전장 부모 항체를 포함하지 않는다(하기에서 "부분 항체 면역사이토카인" 또는 "부분 Fc-융합 면역사이토카인"으로도 지칭된다). 예를 들어, 도 3a 내지 도 3c의 연회색 부분을 참조한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 또한, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv(VH-VL 또는 VL-VH 입체배치), 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, 힌지 영역의 내부, 또는 제1 scFv의 C'과 힌지 영역의 N' 사이)에서의 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 및 Fc 도메인(예를 들어, IgG1, IgG4 또는 이펙터 결여 IgG1) 또는 이의 부분(예를 들어, CH2)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; 및 (b) N-말단에서 C-말단으로, 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv(VH-VL 또는 VL-VH 입체배치), 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 또는 이의 부분의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인을 제공한다. 예를 들어, 도 3a를 참조한다. 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 scFv(VH-VL 또는 VL-VH 입체배치), 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, 힌지 영역의 내부 또는 scFv의 C'과 힌지 영역의 N' 사이)에서의 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 및 Fc 도메인(예를 들어, IgG1, IgG4 또는 이펙터 결여 IgG1) 또는 이의 부분(예를 들어, CH2)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, VH, CH1, 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나) 및 Fc 도메인 또는 이의 부분의 제2 서브유닛을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드; 및 (c) N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL을 포함하는 제3 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며; 제2 항원-결합 폴리펩티드의 VH 및 CH1, 및 제3 항원-결합 폴리펩티드의 VL 및 CL은 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 Fab를 형성한다. 예를 들어, 도 3b를 참조한다. 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, VH, CH1, 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에서의 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 및 Fc 도메인(예를 들어, IgG1, IgG4 또는 이펙터 결여 IgG1) 또는 이의 부분(예를 들어, CH2)의 제1 서브유닛을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드로서, 제1 항원-결합 폴리펩티드의 VH 및 CH1, 및 제2 항원-결합 폴리펩티드의 VL 및 CL이 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 Fab를 형성하는 제2 항원-결합 폴리펩티드, 및 (c) N-말단에서 C-말단으로, 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 scFv(VH-VL 또는 VL-VH 입체배치), 힌지 영역 또는 이의 부분 및 Fc 도메인 또는 이의 부분의 제2 서브유닛을 포함하는 제3 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인이 제공된다. 예를 들어, 도 3c를 참조한다. 일부 실시형태에서, (a) N-말단에서 C-말단으로, VH, CH1, 힌지 영역 또는 이의 부분(예를 들어, SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나)에서의 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 및 Fc 도메인(예를 들어, IgG1, IgG4 또는 이펙터 결여 IgG1)의 제1 서브유닛의 부분(예를 들어, CH2)을 포함하는 제1 항원-결합 폴리펩티드; (b) N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL을 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드; (c) N-말단에서 C-말단으로, VH, CH1, 힌지 영역 또는 이의 부분 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 부분(예를 들어, CH2)을 포함하는 제3 항원-결합 폴리펩티드; 및 (d) N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL을 포함하는 제4 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인이 제공되며; 제1 항원-결합 폴리펩티드의 VH 및 CH1, 및 제2 항원-결합 폴리펩티드의 VL 및 CL은 제1 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제1 Fab를 형성하며, 제3 항원-결합 폴리펩티드의 VH 및 CH1, 및 제4 항원-결합 폴리펩티드의 VL 및 CL은 제2 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 제2 Fab를 형성한다. 사이토카인 또는 이의 변이체가 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2 세포외 도메인, 수용체, 항체 단편, 예컨대 VHH)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 항원-결합 단편의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에, 또는 힌지 영역의 C-말단과 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 사이에) 위치한 다른 면역사이토카인 형식도 또한 본원에서 고려된다. "전장 항체 면역사이토카인"에 대해 기재된 사이토카인 모이어티 및 힌지 입체배치 중 임의의 것은 본원에 기재된 "부분 항체 면역사이토카인" 또는 "부분 Fc-융합 면역사이토카인" 중 어느 하나에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 면역사이토카인의 항원-결합 단백질 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질 또는 항원 결합 단편의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 면역사이토카인의 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 오직 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 각각의 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 이상)의 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 하나의 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-2 또는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-α2c)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10 또는 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-12 또는 IL-23이다. 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛은 하나의 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 탠덤으로 위치한다(예를 들어, 선택적인 펩티드 링커를 통해 연결된다). 일부 실시형태에서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛은 하나의 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛은 다른 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체는 상이하다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 표적 항원 결합에 관하여 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 표적 항원 결합에 관하여 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, VEGF, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 CH1, scFv 또는 리간드/수용체의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역의 C-말단과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역의 내부에 위치한다(예를 들어, 힌지 영역의 내측 부분을 대체하거나, 힌지 영역 아미노산의 결실 없이 힌지 영역 내에 삽입되거나, 힌지 영역의 내부에 삽입되고 하나 이상의 아미노산을 도입한다). 일부 실시형태에서, Fc 도메인 또는 이의 부분은 노브-인투-홀(KIH) 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 동종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 이종이량체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질)은 효능제이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 길항제이다.
사이토카인 또는 이의 변이체
사이토카인(상호교환 가능하게 "사이토카인 분자" 또는 "사이토카인 단백질"로도 지칭됨)은 면역계의 세포의 활성을 조절하는 분비된 단백질이다. 사이토카인의 예에는 인터류킨, 인터페론, 케모카인, 림포카인, 종양 괴사 인자, 면역 세포 전구체에 대한 콜로니-자극 인자 등이 포함된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 야생형 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 천연적으로 존재하는 사이토카인 종 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 천연적으로 존재하는 사이토카인 하위유형이다. 본원에서, "사이토카인 변이체"는 천연적으로 존재하지 않는 임의의 사이토카인 분자, 예컨대 이의 사이토카인 활성 단편(예를 들어, 전장 사이토카인의 적어도 약 10%의 생물학적 활성 또는 사이토카인 수용체 결합 활성을 보유하는 사이토카인 단편), 돌연변이체 또는 유도체를 지칭한다. "사이토카인 또는 이의 변이체"는 또한, 사이토카인 분자, 또는 이의 종 변이체, 하위유형, 활성 단편, 돌연변이체 또는 유도체일 수 있는 "사이토카인 모이어티"로서 본원에서 상호교환 가능하게 지칭된다.
본원에 사용되는 "이종이량체 사이토카인" 또는 "사이토카인 이종이량체"는 2개의 별개의 단백질 서브유닛으로 이루어진 사이토카인을 지칭한다. 현재는, IL-12 과(IL-12, IL-23, IL-27 및 IL-35 포함)는 알려져 있는 유일한 자연 발생 이종이량체 사이토카인 과이다. 그러나, 인공 이종이량체 사이토카인이 작제될 수 있다. 예를 들어, IL-6 및 IL-6R의 용해성 단편을 조합하여, CNTF 및 CNTF-R 알파가 할 수 있는 바와 같이, 이종이량체 사이토카인을 형성할 수 있다(문헌[Trinchieri (1994) Blood 84:4008]). 본원에서 "동종이량체 사이토카인" 또는 "사이토카인 동종이량체"는 2개의 동일한 단백질 서브유닛, 예컨대 IFN-γ 또는 IL-10으로 이루어진 사이토카인을 지칭한다. "단량체 사이토카인" 또는 "사이토카인 단량체"는 하나의 단위의 사이토카인 분자로 이루어진 사이토카인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 동종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 이종이량체 사이토카인 또는 이의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 전장 사이토카인 분자이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 전장 사이토카인 분자의 일부(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%) 또는 완전한 생물학적 활성 및/또는 사이토카인 수용체 결합 활성을 생성할 수 있는 사이토카인 분자의 기능적 단편이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 전구체 사이토카인 분자이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 성숙 사이토카인 분자(예를 들어, 신호 펩티드 부재)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 야생형 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 천연적으로 존재하는 사이토카인 종 변이체이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 천연적으로 존재하는 사이토카인 하위유형이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 사이토카인 변이체, 예컨대 야생형 사이토카인의 일부(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%) 또는 완전한 생물학적 활성 및/또는 사이토카인 수용체 결합 활성을 생성할 수 있는 돌연변이 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 변형된 사이토카인, 예컨대 글리코실화 사이토카인이다. 본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체는 다양한 공급원으로부터, 예컨대 인간 조직 유형으로부터 또는 또 다른 공급원으로부터 단리되거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 사이토카인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 재조합 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티는 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 염소, 고양이, 개, 당나귀 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이 또는 침팬지), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 거빌 및 햄스터)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유기체, 예컨대 포유동물로부터 유래된 사이토카인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 인간 사이토카인, 예컨대 재조합 인간 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 쥣과 사이토카인, 예컨대 재조합 쥣과 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 성숙 인간 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 모이어티는 사이토카인 분자의 N-말단에 신호 펩티드를 포함하며, 신호 펩티드는 상이한 분자 유래의 것 또는 동일한 사이토카인 분자 유래의 것이다.
사이토카인 변이체는 적어도 어느 정도(예를 들어, 적어도 약 10%)의 부모 사이토카인 활성(사이토카인 수용체 결합 활성 및/또는 생물학적 활성)을 유지하는 절단된 버전, 번역후 변형된 버전, 하이브리드 변이체, 펩티드 모방체, 생물학적 활성 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체일 수 있다. 본원에 기재되는 "부모 사이토카인" 또는 "모체 사이토카인"은 사이토카인 변이체가 조작되거나, 변형되거나, 유래된 사이토카인 기준 서열을 지칭한다.
대상 발명의 면역사이토카인이 2개 이상의 상이한 사이토카인(및 선택적으로 추가의 단백질 모이어티 포함)을 함유하는 것으로 기재되는 경우, 이는 면역사이토카인이 (2개 이상의 상이한 사이토카인 서브유닛보다는) 2개 이상의 상이한 사이토카인 분자를 함유하는 것을 의미한다. 예를 들어, 동종이량체 사이토카인(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-5, IL-8 등)은 본원에서 단일의 사이토카인 분자로 지칭된다. 예를 들어, (동일한 폴리펩티드 쇄 상에 단일-쇄 융합으로서, 또는 상이한 폴리펩티드 쇄 상에) 2개의 IL-5 단량체/서브유닛을 포함하는 면역사이토카인은 오직 하나의 사이토카인 분자, 즉, IL-5를 함유하는 것으로 여겨진다. 유사하게, 이종이량체 사이토카인, 예컨대 IL-12는 이것이 상이한 서브유닛을 함유하지만, 단일의 사이토카인이다. 예를 들어, (동일한 폴리펩티드 쇄 상에 단일-쇄 융합으로서, 또는 상이한 폴리펩티드 쇄 상에) p35 서브유닛 및 p40 서브유닛을 포함하는 면역사이토카인은 오직 하나의 사이토카인 분자, 즉, IL-12만을 함유하는 것으로 여겨진다. 또한, 보통 동종이량체 사이토카인의 2개의 대립형질의 또는 보통 동종이량체 사이토카인의 이종이량체 형태, 예컨대 MCP-1/MCP-2 이종이량체(예를 들어, 문헌[Zhang, J. Biol. Chem. [1994] 269:15918-24])는 단일 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인의 하나의 폴리펩티드 상의 사이토카인 서브유닛(예를 들어, IL-12의 p35)은 동일한 폴리펩티드 쇄 상의 또는 동일한 면역사이토카인 내의 상이한 폴리펩티드 상의 쌍형성 사이토카인 서브유닛(예를 들어, p40)과 이량체화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인의 사이토카인 서브유닛(예를 들어, IL-12의 p35)은 근처의 면역사이토카인의 쌍형성 사이토카인 서브유닛(예를 들어, p40)과 이량체화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 제2 유형의 수용체를 발현하는 세포의 활성화에 비한 제1 유형의 수용체를 발현하는 세포의 활성화의 비로서 측정되는, 제2 유형의 상응하는 사이토카인 분자의 수용체(예를 들어, 이량체 수용체 또는 친화성이 더 약한 수용체)에 비하여 제1 유형의 수용체(예를 들어, 삼량체 수용체 또는 친화성이 더 높은 수용체)에 대한 선택성을 초래하는 돌연변이 또는 변형(예를 들어, 번역후 변형)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 IL-2Rαβγ에 비하여 더 강한 친화성(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 중 어느 하나만큼 더 강한 친화성)으로 IL-2Rβγ에 결합하거나, IL-2Rαβγ를 발현하는 것보다 IL-2Rβγ를 발현하는 세포를 더 활성화시키는(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 활성화 중 어느 하나); 또는 그 역도 그러한, 돌연변이 IL-2(또는 번역후 변형된 IL-2)이다. 일부 실시형태에서, 치료할 질병 유형에 따라, 바람직한 돌연변이 또는 변경은 면역 이펙터 세포(예를 들어, 암을 치료하기 위한 CD8+ T 세포)의 사이토카인 모이어티의 활성화를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 IL-2Rαβγ 수용체를 발현하는 세포의 IL-2 변이체의 활성화에 비하여 IL-2Rβγ 수용체를 발현하는 세포의 IL-2 변이체의 활성화를 감소시키는 돌연변이(또는 번역후 변형)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체의 돌연변이 또는 변형은 이러한 사이토카인 모이어티에 대한 돌연변이 또는 변형이 없는 면역사이토카인에 비하여 차등적인 효과를 야기한다(예를 들어, 예컨대 감소된 결합 또는 세포 활성화). 일 양태에서, 차등적인 효과는 성장을 위해 사이토카인(예를 들어, IL-2)에 의존하는 세포 또는 세포주의 증식 반응에 의해 측정된다. 면역사이토카인에 대한 이 반응은 용량 반응 곡선을 플롯팅하고, 절반-최대 반응을 초래하는 단백질 농도를 결정하는 것으로부터 수득되는 EC50 값으로 표현된다. 일부 실시형태에서, 기준 면역사이토카인(예를 들어, 동일한 입체배치의 IL-2 야생형 면역사이토카인)에 대한 EC50 값의 비에 비한 본 발명의 면역사이토카인(예를 들어, IL-2 변이체 면역사이토카인)에 대한 제1 수용체 유형(예를 들어, IL-2Rβγ 수용체)을 발현하는 세포 대 제2 수용체 유형(예를 들어, IL-2Rαβγ 수용체)을 발현하는 세포에 대하여 수득되는 EC50 값의 비는 면역사이토카인에 대한 차등적인 효과의 척도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 기준 면역사이토카인(예를 들어, 동일한 입체배치의 IL-2 야생형 면역사이토카인)에 대한 EC50 값에 비한 본 발명의 면역사이토카인(예를 들어, IL-2 변이체 면역사이토카인)에 대하여 수득되는 EC50 값은 면역사이토카인에 대한 차등적인 효과의 척도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 부모 사이토카인 분자(예를 들어, 성숙 야생형 사이토카인)의 하나 이상의 아미노산에 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 사이토카인 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 사이토카인 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산의 결실 또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 사이토카인 내에 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, VEGF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF, 또는 이의 천연 변이체 또는 하위유형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항-염증성 또는 면역억제 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-10, IL-27, IL-35, TGF-β 및 VEGF이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 염증-유발성 또는 면역자극 사이토카인 또는 이의 변이체, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, IL-10, IL-12, IL-23, IFN-α(예를 들어, IFN-α2 또는 IFN-α2b) 및 IFN-γ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-12이며, 사이토카인 서브유닛은 p35 및 p40이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-23이며, 사이토카인 서브유닛은 p40 및 p19이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-27이며, 사이토카인 서브유닛은 엡스타인-바 바이러스-유도된 유전자 3(Epstein-Barr virus-induced gene 3; EBI3) 및 IL-27p28이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-35이며, 사이토카인 서브유닛은 IL-12α(p35) 및 IL-27β이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 상이한 사이토카인 유래의 2개 이상의 서브유닛의 단일 쇄 융합이다.
IL-2
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2 또는 이의 변이체이다. T 세포 성장 인자(TCGF)로도 알려져 있는 인터류킨-2(IL-2)는 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중요한 역할을 수행하는 15.5 kDa 단량체 단백질이다. 이는 미생물 감염에 대한 신체의 자연 반응 및 "자가"와 "비-자가"를 구별하는 데 관여한다. IL-2는 인터류킨이며, 이는 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함하는 사이토카인 과에 속한다. IL-2는 림프구 상에 발현되는 IL-2 수용체(IL-2R)로의 결합에 의해 이의 효과를 매개한다. 활성화된 CD4+ T 세포 및 활성화된 CD8+ T 세포는 IL-2의 주요 공급원이다. 림프구 모집단을 증량시키고 이들 세포의 이펙터 기능을 증가시키는 이의 능력은 IL-2를 암에 대한 매력적인 치료법이 되게 한다. IL-2는 급성 골수성 백혈병(AML), 비호지킨 림프종(NHL), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 유방암 및 방광암을 치료하기 위해 제안되었다.
IL-2 수용체(IL-2R)는 3개의 쇄, α(CD25, p55), β(CD122, p75) 및 γ(CD132, p65)로 이루어진 복합체이다. γ 쇄는 모든 IL-2 사이토카인 과 구성원에 의해 공유된다. 중등-친화성 이량체 CD122/CD132 IL-2R(IL-2Rβγ, Kd 약 10-9 M) 또는 고-친화성 삼량체 CD25/CD122/CD132 IL-2R(IL-2Rαβγ, Kd 약 10-11 M)에 대한 IL-2 결합은 신호 전달을 야기할 수 있는 한편, 단독의 CD25로의 결합은 그럴 수 없다. β 쇄는 야누스 키나제 1(Janus kinase 1; JAK1)과 복합체화된다. γ 쇄는 JAK3과 복합체화된다. IL-2R로의 IL-2 결합 시에, JAK1 및 JAK3은 활성화되고, 포스페이트 기를 분자에 부가하여, 이에 따라, 3개의 세포내 신호전달 경로를 개시할 수 있다: MAP 키나제 경로, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K) 경로 및 JAK-STAT 경로. 이량체 IL-2Rβγ는 기억 CD8+ T 세포, NK 세포 및 B 세포에 의해 발현되는 한편, 높은 수준의 삼량체 IL-2Rαβγ는 조절 T 세포(Treg) 및 활성화된 T 세포에 의해 발현된다.
재조합 인간 IL-2인 알데스류킨(aldesleukin)(Proleukin®)은 처음의 암 면역치료법이며, 1992년도에 FDA에 의해 승인된 처음의 재조합 단백질 중 하나이다. 현재, 알데스류킨은 정맥내 주입에 의해 전이성 신장 세포 암종(mRCC) 및 전이성 흑색종(mM)의 치료를 위하여 사용된다. 다수의 투여에 걸친 빈번한 정맥내 주입의 필요 때문에, 알데스류킨의 투여는 임상 환경에서 일어난다. 알데스류킨은 전이성 흑색종 및 신장암에 대해 치료되는 환자의 약 10%에서 완전한 암 퇴행을 나타내었다(문헌[Klapper et al., Cancer, 2008]; 문헌[Rosenberg, Sci Transl Med., 2012]; 문헌[Smith et al., Clin Cancer Res., 2008]). 완전한 반응을 갖는 환자의 대략 70%는 치유되어, 초기 치료 후 25년 넘게 완전한 퇴행을 유지하였다(문헌[Atkins et al., J Clin Oncol., 1999]; 문헌[Klapper et al., Cancer, 2008]; 문헌[Rosenberg, Sci Transl Med., 2012]; 문헌[Rosenberg et al., Ann Surg., 1998]; 문헌[Smith et al., Clin Cancer Res., 2008]). 그러나, 고 용량의 IL-2는 혈관 누출 증후군(VLS), 활성화-유도된 세포사(AICD)에 의해 야기된 종양 내성 및 Treg의 활성화에 의해 야기되는 면역억제를 유도할 수 있다. 전신 IL-2 치료의 추가의 우려는 심각한 심혈관, 폐 부종, 간, 위장(GI), 신경학적 및 혈액학적 사건을 포함하는 정맥내 투여 시의 심각한 부작용과 관련된다(Proleukin(알데스류킨) 의약품설명서(Summary of Product Characteristics)[SmPC]: http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC). 심각한 부작용은 종종 최적의 IL-2 투여를 제한하며, 이는 치료법에 성공적으로 반응하는 환자의 수를 제한한다. 장래의 더욱 일반적인 적용을 위하여, IL-2의 독성 및 짧은 반감기 우려를 해결해야 한다.
고유 인간 IL-2 전구체 폴리펩티드는 153개 아미노산 잔기로 이루어진 한편(아미노산 1 내지 20은 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 133개 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 1)로 이루어진다. 일부 실시형태에서, IL-2 모이어티는 인간 성숙 IL-2이다. 일부 실시형태에서, IL-2 모이어티는 예를 들어, SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-2 모이어티는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IL-2 모이어티는 글리코실화된다.
일부 실시형태에서, IL-2 모이어티는 알데스류킨이다(또는 본질적으로 이로 이루어진다)(예를 들어, Proleukin®; 예를 들어, https://www.drugbank.ca/drugs/DB00041 참조). 알데스류킨(데스알라닐-1, 세린-125 인간 인터류킨-2)은 FDA에 의해 승인되는 항신생물(항암) 생물 반응 변경제이다. 이는 대략 15.3 kDa의 분자량 및 동의어 재조합 인터류킨-2 인간, 인터류킨-2 알데스류킨, 125-L-세린-2-133-인터류킨 2(인간 환원형) 또는 인터류킨-2(2-133),125-ser을 갖는다. 알데스류킨은 재조합 IL-2이며, 이는 하기의 방식으로 고유 IL-2와 상이하다: a) 알데스류킨은 이것이 이. 콜라이(E. coli)로부터 생성되기 때문에 글리코실화되지 않고; b) 알데스류킨은 N-말단 알라닌(A)을 갖지 않고; c) 알데스류킨은 위치 125에 시스테인에서 세린으로의 치환(C125S)을 갖고; d) 알데스류킨의 응집 상태는 고유 IL-2의 응집 상태와 상이할 가능성이 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 인간 IL-2 성숙 형태로부터 위치 125에서 시스테인에서 세린으로의 치환(C125S)을 포함한다.
문헌[K. Sauv et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88(11):4636-4640)]에서 야생형 IL-2의 아미노산 잔기 K35, R38, F42 및 K43이 IL-2 수용체 결합(IL-2Rα, 낮은 친화성 형태)에 결정적이고, R38A 및 F24A 돌연변이가 실질적인 IL-2 생물학적 활성을 보유하였음이 관찰되었다. 문헌[R. Vazquez-Lombardi et al. (Nat Commun. 2017;8:15373)]에서는, IL-2에서의 R38D, K43E 및 E61R 돌연변이가 야생형 IL-2에 비하여 Treg의 최소의 확대와 함께 CD25- 세포독성 하위세트의 강력한 확대를 유도하는 것이 관찰되었다. IL-2에서의 P65L 돌연변이는 야생형 IL-2에 비하여 감소된 전신 독성 및 더 큰 항종양 효능을 갖는 것으로 관찰되었다(문헌[Chen et al., Cell Death Dis. 2018;9(10):989]).
일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2에 비하여 F24, K35, R38, F42, K43, E61 및 P65로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2에 비하여 F24A, R38D, K43E, E61R 및 P65L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2에 비하여 R38D/K43E/E61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다.
IFN-α
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-α 또는 이의 변이체, 예컨대 IFN-α2 또는 이의 변이체, 또는 IFN-α2b 또는 이의 변이체이다. 인간 I형 인터페론(IFN)은 면역계의 활성의 조절에 도움을 주는 IFN의 큰 그룹이다. 이들은 IFNAR1 및 IFNAR2 쇄로 이루어진 IFN-α 수용체(IFNAR)로 알려져 있는 특이적인 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다. 포유동물 I형 IFN은 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 및 IFN-ζ(리미틴(limitin)으로도 알려져 있음)을 함유한다.
IFN-α 단백질은 형질세포양 수지상 세포(pDC)에 의해 주로 생성되고, 바이러스 감염에 대한 선천 면역에 주로 관여한다. IFN-α 단백질은 암 및 바이러스 질병, 예컨대 B형 및 C형 간염의 치료를 위해 광범위하게 사용되는 19 내지 26 kDa 단량체 단백질이다. 13개의 IFN-α 하위유형의 합성을 담당하는 13개의 유전자가 존재한다: IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21.
인간 IFN-α2a, IFN-α2b 및 IFN-α2c는 동일한 유전자의 대립형질 변이체를 나타낸다. IFN α2a 및 IFN-α2b는 각각 성숙 단백질의 위치 23에 라이신 및 아르기닌을 갖는다. 인간 IFN-α2a 및 IFN-α2b는 (Thr106 상에) O-글리코실화 부위를 갖는 유일한 IFN-α 하위유형이다. 인터페론 알파-2a(IFN-α2a; 호프만-라 로슈(Hoffmann-La Roche)에 의해 Roferon-A®로 시판됨) 및 인터페론 알파-2b(IFN-α2b, IFN-α2의 재조합 형태; 쉐링-프라우(Schering-Plough)에 의해 Intron-A®로 시판됨)는 모양 세포 백혈병, 흑색종, 여포성 림프종, 신장 세포 암종, AIDS-관련 카포시 육종 및 만성 골수성 백혈병의 치료를 위해 승인되었다(문헌[M. Ferrantini et al., Biochimie. Jun-Jul 2007;89(6-7):884-893]). 최근 연구에서는 T 세포 및 수지상 세포에 대한 활성을 포함하는 IFN-α의 새로운 면역조절 효과가 강조되었으며, 이는 지속적인 항종양 반응의 생성을 야기할 수 있다. 그러나, 임상 종양학에서의 IFN-α의 사용은 여전히 일반적으로 이들 사이토카인의 항증식 및 항혈관신생 활성의 활용에 기초한다. 면역 반응 및 종양 면역의 조절제로서의 IFN-α의 역할의 완전한 활용은, 이들 사이토카인의 이용에서 신규한 접근법을 필요로 할 것이다.
hIFN-α2b는 위치 106에 O-글리코실화된 트레오닌과 함께 166개 아미노산으로 이루어진 당단백질이다. 각각의 rhIFN-2b는 루프 AB, BC, CD 및 DE에 의해 연결된 5개의 α 나선(나선 A 내지 E로 지칭됨)으로 이루어진다. 수용체 결합에 중요한 잔기는 AB 루프(Arg22, Leu26, Phe27, Leu30, Lys31, Arg33 및 His34), 나선 B(Ser68), 나선 C(Thr79, Lys83, Tyr85 및 Tyr89), D 나선(Arg120, lys121, Gln124, Lys131 및 Glu132) 및 나선 E(Arg144 및 Glu146)이다. 생물학적 활성에 중요한 아미노산 잔기는 Leu30, Lys31, Arg33, His34, Phe36, Arg120, Lys121, Gln124, Tyr122, Tyr129, Lys131, Glu132, Arg144 및 Glu146이다(문헌[Ratih Asmana Ningrum, Scientifica (Cairo). 2014; 2014:970315]).
일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 IFN-α2이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 IFN-α2a이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 IFN-α2b이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 IFN-α2c이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 성숙 IFN-α이다. 고유 인간 IFN-α2b 전구체 폴리펩티드는 188개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 23은 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 165개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 3). 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 예를 들어, SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IFN-α 모이어티는 글리코실화된다.
일부 실시형태에서, IFN-α 변이체(예를 들어, IFN-α2b 변이체)는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α(예를 들어, IFN-α2b)에 비하여 R22, L26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, F36, S68, T79, K83, Y85, Y89, R120, K121, Y122, Q124, Y129, K131, E132, R144 및 E146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체(예를 들어, IFN-α2b 변이체)는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α에 비하여 L30A, K31A, D32A, R33A, H34A 및 D35A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체(예를 들어, IFN-α2b 변이체)는 SEQ ID NO: 4 내지 9 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체(예를 들어, IFN-α2b 변이체)는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α에 비하여 L30A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α 변이체(예를 들어, IFN-α2b 변이체)는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다.
IFN-γ
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IFN-γ 또는 이의 변이체이다. 인터페론 감마(IFNγ)는 인터페론의 II형 부류의 유일한 구성원인 이황화-연결된 이량체화 가용성 사이토카인이다. IFN-γ는 맞물리는 α 나선의 비정상 패턴 주위에 작제된 3차 폴드를 갖는 약 25 kDa의 동종이량체이다. 이는 다양한 염증성 또는 면역 자극에 대한 반응으로 T 세포 및 NK 세포에 의해 주로 생성된다. IFN-γ는 면역계 활성화자 및 억제제 둘 모두로서 역할을 할 수 있다. 연구는, 암 면역치료법(체크포인트 저해제)이 부분적으로 IFN-γ 발현의 증가를 통해 작용하여, 암 세포의 제거를 야기하는 것을 보여주었다. 면역치료법에 대한 내성은 IFN-γ 신호전달의 결함에 기인한다. 그러나, IFN-γ는 또한 종양형성 및 혈관신생을 촉진하고, PD-L1과 같은 관용 분자의 발현을 유도하고 항상성 프로그램을 유도함으로써 암 회피에 기여할 수 있다. IFN-γ는 면역계에서의 이의 반대 및 경쟁 효과로 인해, 악성 골다공증의 경우를 제외하고는 암 환자를 치료하기 위해 FDA에 의해 승인받지 못했다(문헌[L. Ni and J. Lu, Cancer Med. 2018; 7(9):4509-4516]).
단량체 고유 인간 IFN-γ(hIFN-γ) 프레-프로-폴리펩티드는 166개 아미노산 잔기로 이루어지며(아미노산 1 내지 23은 신호 펩티드임); 단량체 성숙 폴리펩티드는 프레-프로 폴리펩티드의 아미노산 24 내지 161에 상응하는 138개 아미노산 잔기로 이루어지며(SEQ ID NO: 10); 아미노산 162 내지 166은 프레-프로-폴리펩티드의 프로펩티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 단량체 IFN-γ 모이어티는 단량체 성숙 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 단량체 IFN-γ 모이어티는 예를 들어, SEQ ID NO: 10에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티(또는 서브유닛)는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티(또는 서브유닛)는 글리코실화된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티는 2개의 동일한 IFN-γ 단량체/서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티는 2개의 상이한 IFN-γ 단량체/서브유닛을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티는 하나의 야생형 IFN-γ 단량체 및 하나의 IFN-γ 변이체 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티는 예컨대 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) 또는 화학적 링커를 통해 함께 연결된 2개의 IFN-γ 단량체(예를 들어, 2개의 IFN-γ 변이체 또는 야생형 단량체)를 포함한다.
IFN-γ 아미노산 잔기 S20, A23, H111 및 Q115는 수용체 결합에 중요하며; 아미노산 잔기 V5, S20, A23, G26 및 H111은 IFN-γ 생물학적 활성에 중요하다(문헌[M. Randal and A. A. Kossiakoff, Structure. 2001;9(2):155-63]). 문헌[Lander et al. (J Mol Biol. 2000;299(1):169-79)]에서는, 2개의 단량체 IFN-γ를 7-아미노산 잔기 링커와 연결하고, 제1 IFN-γ 단량체 내의 His111을 아스파르트산 잔기로 변경시킴으로써 hIFN-γ(IFN-γSC1)의 생물학적 활성 단일 쇄 변이체를 개발하였다. H111D 돌연변이로 인하여, IFN-γSC1은 하나의 IFN-γRα에만 결합할 수 있고, 세포 증식, MHC 부류 I 유도 및 항-바이러스 검정에서 이의 생물학적 활성을 완전히 보유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단량체 IFN-γ는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛에 비하여 V5, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, H111 및 Q115로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛에 비하여 S20A, D21A, D21K, V22A, A23S, A23E, A23Q, A23V, D24A, D24E, N25A, N25K 및 H111D로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛에 비하여 S20A/D21A, D21K, V22A/A23S, D24A/N25A, A23E/D24E/N25K, A23Q 및 A23V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 11 내지 17 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛에 비하여 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 A23V 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 변이체는 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ의 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-γ 모이어티는 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 것과 같은, 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 2개의 야생형 IFN-γ 서브유닛을 포함하는 재조합 "야생형" IFN-γ이다.
IL-10
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-10 또는 이의 변이체이다. 인터류킨 10(IL-10)은 인간 사이토카인 합성 저해 인자(CSIF)로도 알려져 있는 약 37 kDa의 비-공유적으로 연결된 동종이량체로서 발현되는 α-나선 사이토카인이다. 이는 관용의 유도 및 유지에서 중요한 역할을 수행한다. IL-10은 JAK-STAT 복합체를 통해 신호전달한다. IL-10 수용체(IL-10R)는 2개의 서브유닛, 면역 세포, 특히 가장 높은 발현을 갖는 단핵구 및 대식구 상에서 주로 발현되는 α 서브유닛 및 편재하여 발현되는 β 서브유닛을 갖는다. IL-10은 주로 단핵구, 및 더 적은 정도로, II형 T 헬퍼 세포(TH2), 비만 세포, CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포의 하위세트를 포함하는 림프구에 의해 생성된다. 수지상 세포 및 NK 세포는 또한, IL-10을 생성할 수 있다. IL-10은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12와 같은 염증-유발성 사이토카인 및 Th1 사이토카인, 예컨대 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 억제하며, 대식구, B-세포 및 T-세포의 분화 및 증식을 제어한다(문헌[Glocker, E. O. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1246, 102-107 (2011)]; 문헌[Moore, K. W. et al., Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765 (2001)]; 문헌[R. de Waal Malefyt et al., J. Exp. Med. 174, 915-924 (1991)]; 문헌[Williams, L. M. et al., Immunology 113, 281-292 (2004)]). 또한, 이는 MHC II 발현 및 동시-자극 분자 CD80 및 CD86의 상향조절을 저해하는 항원 제시의 강력한 저해제이다(문헌[Mosser, D. M. & Zhang, X. Immunological Reviews 226, 205-218 (2008)]). IL-10이 존재하지 않거나, 기능성이지 않다면, 염증은 제어될 수 없다. 이는 IL-10을 자가면역 질병을 위한 매력적인 치료적 후보물질이 되게 한다. 그러나, IL-10을 이용한 임상 시험 및 재조합 IL-10(일로데카킨(ilodecakin), TENOVIL®, 미국 뉴저지주 케닐워스 소재의 쉐링-프라우 리서치 인스티튜트(Schering-Plough Research Institue))의 개발은 효능의 결여로 인하여 중단되었다. 최근의 연구에 의해, 종양 치료에서의 IL-10의 잠재적인 역할에 대해 밝혀졌다(문헌[Fujii et al., (October 2001). "Interleukin-10 promotes the maintenance of antitumor CD8(+) T-cell effector function in situ".　Blood.　98(7):2143-51]).
단량체 고유 인간 IL-10 전구체 폴리펩티드는 178개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 18은 신호 펩티드임), 단량체 성숙 IL-10 폴리펩티드는 160개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 20). 일부 실시형태에서, 단량체 IL-10 모이어티는 단량체 성숙 IL-10이다. 일부 실시형태에서, 단량체 IL-10 모이어티는 예를 들어, SEQ ID NO: 20에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티(또는 서브유닛)는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티(또는 서브유닛)는 글리코실화된다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티는 2개의 동일한 IL-10 단량체/서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티는 2개의 상이한 IL-10 단량체/서브유닛을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티는 하나의 야생형 IL-10 단량체 및 하나의 IL-10 변이체 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티는 예컨대 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) 또는 화학적 링커를 통해 함께 연결된 2개의 IL-10 단량체(예를 들어, 2개의 IL-10 변이체 또는 야생형 단량체)를 포함하며, 예를 들어, 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US20130316404호에서의 생물학적 활성 단일 쇄 IL-10을 참조한다.
IL-10 아미노산 잔기 N21, M22, R24, R32, H90, S31 및 S93은 IL-10 수용체 결합에 중요하며; 잔기 R24는 IL-10 생물학적 활성에 중요하다(문헌[Yoon et al., J Biol Chem. 2006;281(46):35088-35096]; 문헌[E. S. Acuner-Ozbabacan et al. BMC Genomics. 2014;15 Suppl 4(Suppl 4):S2]).
일부 실시형태에서, 단량체 IL-10은 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛에 비하여 N21, M22, R24, D25, L26, R27, D28, A29, F30, S31, R32, H90 및 S93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛에 비하여 R24A, D25A, L26A, R27A, D28A, A29S, F30A, S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛에 비하여 R24A, D25A/L26A, R27A, D28A/A29S, F30A/S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 21 내지 26 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛에 비하여 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 R27A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-10 변이체는 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10의 둘 모두의 서브유닛은 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-10 모이어티는 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 것과 같은, 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 2개의 야생형 IL-10 단량체를 포함하는 재조합 "야생형" IL-10이다.
IL-12
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 또는 이의 변이체이다. IL-12는 2개의 공유적으로(디술피드 결합) 연결된 p35(IL-12A) 및 p40(IL-12B) 서브유닛으로 이루어진 70 kDa 이종이량체 단백질이다. p40 서브유닛은 IL-12와 IL-23 간에 공유된다. p40의 활성 이종이량체("p70"으로 지칭됨) 및 동종이량체는 단백질 합성 후에 형성된다. IL-12는 IL-12, IL-23, IL-27 및 IL-35를 포함하는, 이종이량체 사이토카인을 포함하는 유일한 과인 IL-12 과에 속하는 인터류킨이다. IL-12는 항원 자극에 반응하여 수지상 세포, 대식구, 호중구 및 인간 B-림프아구성(lymphoblastoid) 세포(NC-37)에 의해 생성된다. IL-12는 IL-12Rβ1과 IL-12Rβ2에 의해 형성된 이종이량체 수용체인 IL-12 수용체(IL-12R)로의 결합과 차례로 JAK-STAT 경로 활성화의 야기에 의해 기능한다. IL-12는 Th1 반응의 발생을 촉진시키고, T 및 NK 세포에 의한 IFNγ 생성을 크게 유도한다. 선천(NK 세포) 및 적응(세포독성 T 림프구) 면역 둘 모두를 활성화시키는 IL-12의 능력은 이것이 암 면역치료법을 위한 유망한 후보물질이 되게 한다. 동물 시험으로부터의 긍정적인 결과에도 불구하고, IL-12는 임상 시험에서 중등의 항-종양 반응을 보였을 뿐이며, 종종 독성에 관한 유의미한 문제를 동반하였다(문헌[Lasek et al., Cancer Immunol Immunother., 2014]). IL-12를 사용하는 치료는 전신 독감-유사 증상(발열, 오한, 피로, 피부홍통증, 또는 두통) 및 골수 및 간에서의 독성 효과와 관련이 있었다. 투여 연구는, 환자가 치료 용량보다 훨씬 더 낮은 1 μg/kg 미만의 용량을 견딜 수 있었을 뿐임을 보여주었다. 결과는 - 단일치료법으로서 사용되거나, 다른 작용제와 조합된 - IL-12를 사용한 임상 시험이 강력한 지속적인 치료 효능을 나타내지 못하였다는 것이다(문헌[Lasek et al., Cancer Immunol Immunother., 2014]).
고유 인간 p35(IL-12A) 전구체 폴리펩티드는 219개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 22는 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 197개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 29). 고유 인간 p40(IL-12B) 전구체 폴리펩티드는 328개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 22는 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 306개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 30). 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티(또는 IL-12 서브유닛)는 성숙 IL-12(또는 성숙 서브유닛)이다. 일부 실시형태에서, IL-12A(p35) 서브유닛 또는 이의 변이체는 예를 들어, SEQ ID NO: 29에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-12B(p40) 서브유닛 또는 이의 변이체는 예를 들어, SEQ ID NO: 30에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-12(또는 서브유닛) 또는 이의 변이체는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IL-12(또는 서브유닛) 또는 이의 변이체는 글리코실화된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 하나의 야생형 서브유닛(예를 들어, wt p35) 및 하나의 돌연변이 서브유닛(예를 들어, 변이체 p40)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 2개의 변이체 서브유닛(p35 변이체 및 p40 변이체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 합성 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) 또는 화학적 링커를 통해 함께 연결되는 2개의 야생형 서브유닛(예를 들어, wt p35 및 p40)을 포함한다.
p40 서브유닛 내에서, IL-12 수용체 결합에 중요한 아미노산 잔기는 C177, E45, E59 및 D62이다(문헌[Luo et al. J Mol Biol. 2010;402(5):797-812]). 연구에 의해, p40 서브유닛의 접근 가능한 N 말단이 IL-12 생물활성에 중요한 것이 뒷받침되었다. Lieschke 등은 단일 쇄 IL-12(scIL-12)를 작제하였으며, 서브유닛의 순서가 IL-12 생물학적 활성에 영향을 미치는 것이 보고되었다: p35 서브유닛이 p40 서브유닛의 N-말단에 존재하는 경우, IL-12 활성은 크게 감소하였으며; p40 서브유닛이 p35 서브유닛의 N-말단에 존재하는 경우, scIL-12는 rIL-12와 유사한 생물학적 활성을 가졌다(문헌[Lieschke et al. Nat Biotechnol. 1997;15(1):35-40]).
일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 야생형 p35 서브유닛(SEQ ID NO: 29)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 변이체 p35 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 야생형 p40 서브유닛(SEQ ID NO: 30)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 변이체 p40 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 야생형 또는 변이체 p35 서브유닛 및 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 또는 변이체 p35 서브유닛. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 또는 변이체 p35 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 33의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛은 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 SEQ ID NO: 36 또는 275의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-12 모이어티는 예컨대 SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 것과 같이, 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 야생형 p35 서브유닛 및 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 재조합 "야생형" IL-12이다.
IL-23
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-23 또는 이의 변이체이다. IL-12 사이토카인 과에 속하는 인터류킨-23(IL-23)은 IL12B(p40) 서브유닛(IL-12와 공유됨) 및 IL23A(p19) 서브유닛으로 이루어진 이종이량체 사이토카인이다. IL-23은 IL-12R β1 및 IL-23R로 구성된 IL-23 수용체에 결합하여(p19 서브유닛은 IL-23R에 결합하는 한편, p40 서브유닛은 IL-12Rβ1에 결합함), 야누스 키나제 2 및 티로신 키나제 2 키나제 동원, 및 STAT3 및 STAT4의 인산화를 초래하여, 유전자 활성화를 야기하는 것을 통해 기능한다. STAT3은 핵심적인 Th17 발생 특징, 예컨대 RORγt 발현, 또는 진균 및 박테리아에 대한 보호를 매개하고, 장벽 면역에 참여하는 Th17 사이토카인, 예컨대 IL-17, IL-21, IL-22 및 GM-CSF의 전사를 담당한다. IL-23은 항원 자극에 의해 자극된, 활성화된 수지상 세포, 대식구 또는 단핵구에 의해 주로 분비된다. IL-23 수용체는 Th17 및 NK 세포 상에서 발현된다. 자가면역 및 암성 질병이 IL-23 불균형 및 증가와 관련이 있는 것이 관찰되었다. IL-23의 가장 중요한 기능은 이펙터 Th17 세포의 발생 및 분화에서의 이의 역할이다. 만성 염증의 맥락에서, 활성화된 DC 및 대식구는 IL-23을 생성하며, 이는 Th17 세포의 발생을 촉진시킨다. 자가면역 질병, 예컨대 건선, 크론병, 류마티스 관절염 또는 다발성 경화증은 IL-23 수용체-발현 TH-17 및 다른 림프구 하위세트에 의해 촉진되는 IL-23-매개된 신호전달과 관련이 있는 것으로 최근에 밝혀졌다.
고유 인간 p19(IL-23A) 전구체 폴리펩티드는 189개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 19는 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 170개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 37). 고유 인간 p40(IL-12B) 전구체 폴리펩티드는 328개 아미노산 잔기로 이루어지는 한편(아미노산 1 내지 22는 신호 펩티드임), 성숙 폴리펩티드는 306개 아미노산 잔기로 이루어진다(SEQ ID NO: 30). 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티(또는 IL-23 서브유닛)는 성숙 IL-23(또는 IL-23 성숙 서브유닛)이다. 일부 실시형태에서, IL-23A(p19) 또는 이의 변이체는 예를 들어, SEQ ID NO: 37에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-12B(p40) 서브유닛 또는 이의 변이체는 예를 들어, SEQ ID NO: 30에 대하여 적어도 약 85%(예컨대 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나) 아미노산 서열 동일성을 갖는, SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, IL-23(또는 서브유닛) 또는 이의 변이체는 글리코실화되지 않는다. 일부 실시형태에서, IL-23(또는 서브유닛) 또는 이의 변이체는 글리코실화된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 하나의 야생형 서브유닛(예를 들어, wt p19) 및 하나의 돌연변이 서브유닛(예를 들어, 변이체 p40)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 2개의 변이체 서브유닛(p19 변이체 및 p40 변이체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 합성 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) 또는 화학적 링커를 통해 함께 연결된 2개의 야생형 서브유닛(예를 들어, wt p19 및 p40)을 포함한다. p40 서브유닛 내에서, IL-23 수용체 결합에 중요한 아미노산 잔기는 C177, E45, E59 및 D62이다(문헌[Luo et al. J Mol Biol. 2010;402(5):797-812]).
일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 야생형 p19 서브유닛(SEQ ID NO: 37)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 변이체 p19 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 야생형 p40 서브유닛(SEQ ID NO: 30)을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 변이체 p40 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 펩티드 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 야생형 또는 변이체 p19 서브유닛 및 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 또는 변이체 p19 서브유닛. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 또는 변이체 p19 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 또는 변이체 p40 서브유닛. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛은 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛은 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-23 변이체는 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-23 모이어티는 예컨대 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 것과 같은, 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나)에 의해 연결된 야생형 p35 서브유닛 및 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 재조합 "야생형" IL-23이다.
IL-17
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-17 또는 이의 변이체이다. IL-17 과는 IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E(IL-25로 알려져 있음) 및 IL-17F를 포함한다. 인터류킨 17A(IL-17A 또는 IL-17)는 디술피드-연결된, 동종이량체, 약 35 kDa의 분자량을 갖는 분비된 당단백질이다. 동종이량체의 각각의 서브유닛은 대략 15 내지 20 KDa이다. IL-17A는 IL-23으로의 이들의 자극에 반응하여, T 헬퍼 17(Th17) 세포에 의해 생성되는 염증-유발성 사이토카인이다. IL-17은 IL-17R과 상호작용하며, 차례로 케모카인의 유도를 야기하는 몇몇의 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 이들 케모카인은 화학유인물질로서 작용하여, 면역 세포, 예컨대 단핵구 및 호중구를 염증 부위에 동원한다.
사이토카인 또는 이의 변이체의 활성
본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체의 "활성"은 상응하는 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체의 결합 친화성; 및/또는 사이토카인 또는 이의 변이체의 생물학적 활성(또는 생물활성), 예컨대 사이토카인/사이토카인 수용체 결합 시의 신호 전달의 유도 또는 저해, 세포 증식, 분화 및/또는 활성화의 유도 또는 저해, 영향을 미치는 사이토카인(들)(예를 들어, 염증-유발성 사이토카인)의 분비의 유도 또는 저해 등을 포함한다. 이들 생물학적 활성은 또한, 본원에서 직접적인 생물학적 활성으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 생물학적 활성은 또한 간접적인 생물학적 활성, 예컨대 직접적인 생물학적 활성으로부터 초래되는 임의의 생물학적 활성을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생물학적 활성은 또한, 분비된 영향을 미치는 사이토카인, 예컨대 염증성 마커 IL-6, MIP-2(GRO-β)/CXCL2, G-CSF/CSF3, TIMP-1, KC(GRO-α)/CXCL1 등으로 인하여 종양 부위에 유인되는 면역 세포에 의한 암 세포 사멸을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편의 결합의 부재 하의 활성의 적어도 약 2배(예컨대 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100배 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한, 도 2a 내지 도 4c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다.
일부 실시형태에서, "상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체"는 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체와 동일하지만, 상이한 상태 하에서 또는 상이한 위치에서 발현된다. 본원에서 "유리 상태"의 사이토카인 또는 이의 변이체는 임의의 모이어티, 예컨대 세포막 또는 또 다른 분자(예를 들어, Fc 단편, 또는 전장 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 N-말단 또는 C-말단)로의 부착이 없는, 용해성 형태의 사이토카인 또는 이의 변이체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한, 도 2a 내지 도 4c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이며; 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지 Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 전장 항체의 VH의 N-말단, ii) 전장 항체의 VL의 N-말단, iii) 전장 항체의 중쇄의 C-말단, iv) 전장 항체의 CL의 C-말단, 및 v) 전장 항체의 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 3a 내지 도 3c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VH의 N-말단, ii) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VL의 N-말단, iii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단, iv) 항원 결합 단편(Fab)의 CL의 C-말단, 및 v) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 결합의 부재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 4a 내지 도 4c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 N-말단, ii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단 및 iii) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 존재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 전장 항체의 VH의 N-말단, ii) 전장 항체의 VL의 N-말단, iii) 전장 항체의 중쇄의 C-말단, iv) 전장 항체의 CL의 C-말단, 및 v) 전장 항체의 Fc 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대, 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 3a 내지 도 3c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VH의 N-말단, ii) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VL의 N-말단, iii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단, iv) 항원 결합 단편(Fab)의 CL의 C-말단, 및 v) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 결합의 존재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 4a 내지 도 4c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 N-말단, ii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단 및 iii) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 부재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 전장 항체의 VH의 N-말단, ii) 전장 항체의 VL의 N-말단, iii) 전장 항체의 중쇄의 C-말단, iv) 전장 항체의 CL의 C-말단 및 v) 전장 항체의 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이며; 표적 항원으로의 전장 항체의 결합의 존재 하에서, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 전장 항체의 VH의 N-말단, ii) 전장 항체의 VL의 N-말단, iii) 전장 항체의 중쇄의 C-말단, iv) 전장 항체의 CL의 C-말단, 및 v) 전장 항체의 Fc 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대, 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 3a 내지 도 3c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VH의 N-말단, ii) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VL의 N-말단, iii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단, iv) 항원 결합 단편(Fab)의 CL의 C-말단 및 v) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이며; 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VH의 N-말단, ii) 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 VL의 N-말단, iii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단, iv) 항원 결합 단편(Fab)의 CL의 C-말단 및 v) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 결합의 부재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한(도 4a 내지 도 4c 참조) 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 N-말단, ii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단, 및 iii) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 50% 이하(예컨대 약 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이며; 표적 항원으로의 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 결합의 존재 하에서, 항원 결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 i) 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, 리간드 또는 수용체)의 N-말단, ii) Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분)의 C-말단 및 iii) Fc 도메인 서브유닛의 N-말단 중 어느 하나에서 발현되는 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 적어도 약 70%(예컨대 적어도 약 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나)이다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대, 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성과 동일하거나 유사하다(예컨대, 약 ±20% 차이 이내).
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대, 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한), 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한) 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 동일한 영역에 위치한 상응하는 야생형 사이토카인(또는 동일한 형식으로 발현되지만 야생형 서브유닛을 포함하는 상응하는 재조합 "야생형" 사이토카인)의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IL-12 변이체는 N-말단에서 C-말단으로, 변이체 p40 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 p35 서브유닛을 포함하며, 상응하는 재조합 "야생형" IL-12는 N-말단에서 C-말단으로, 야생형 p40 서브유닛 - 링커(예를 들어, SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나) - 야생형 p35 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 IL-2 변이체이며, 상응하는 야생형 사이토카인은 "야생형" IL-2이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한) 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 동일한 영역에 위치한 상응하는 야생형 사이토카인(또는 동일한 형식으로 발현되지만 야생형 서브유닛을 포함하는 상응하는 재조합 "야생형" 사이토카인)의 활성의 적어도 약 1%(예컨대 적어도 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 이상 중 어느 하나)이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한) 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 동일한 영역에 위치한 상응하는 야생형 사이토카인(또는 동일한 형식이지만 야생형 서브유닛을 포함하는 상응하는 재조합 "야생형" 사이토카인)의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이며; 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한) 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 동일한 영역에 위치한 상응하는 야생형 사이토카인(또는 동일한 형식이지만 야생형 서브유닛을 포함하는 상응하는 재조합 "야생형" 사이토카인)의 활성의 적어도 약 1%(예컨대 적어도 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 이상 중 어느 하나)이다.
결합 친화성
분자(예를 들어, 사이토카인 모이어티, 또는 사이토카인 모이어티를 포함하는 면역사이토카인)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛)의 결합 친화성은 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 리간드 결합 검정 또는 항체/항원 결합 검정, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 샌드위치 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) 전기화학발광, 비드 기반의 멀티플렉스 면역검정(MIA), RIA, 표면 플라스마 공명(SPR), ECL, IRMA, FACS, EIA, 비아코어(Biacore) 검정, 옥텟(Octet) 분석, 펩티드 스캔 등에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 또는 이의 변이체, 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인, 또는 다양한 마커 작용제로 표시된 이의 상응하는 수용체 또는 이의 서브유닛을 사용함으로써, 뿐만 아니라 키트에 첨부된 사용자의 매뉴얼 및 실험 운영 방법에 따라, 처방전 없이 살 수 있는 측정 키트, 또는 유사한 키트인, 비아코어X(아머샴 바이오사이언스즈에 의해 제조됨)를 사용함으로써 용이한 분석이 가능하다.
일부 실시형태에서, 상응하는 사이토카인 수용체에 대한 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 상호작용, 기능 및 활성을 대규모로 분석하기 위해 단백질 마이크로어레이가 사용된다. 단백질 칩은 다양한 포획 단백질(예를 들어, 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛)이 결합된 지지체 표면을 갖는다. 이어서, 형광 표지된 프로브 분자(예를 들어, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인)를 어레이에 첨가하여, 결합된 포획 단백질과의 상호작용 시에, 형광 신호가 방출되고, 레이저 스캐너에 의해 판독한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인과 이의 상응하는 사이토카인 수용체(또는 이의 서브유닛)의 결합 친화성은 SPR(비아코어 T-200)을 사용하여 측정된다. 예를 들어, 항-인간 항체는 (예를 들어, EDC/NHS 화학을 사용하여) CM-5 센서 칩의 표면에 커플링된다. 이어서, 인간 사이토카인 수용체-Fc 융합 단백질(예를 들어, IL-2Rα-Fc, IL-2Rβ-Fc, IL-2Rγ-Fc)은 이 표면에 걸쳐 포획된 리간드로서 사용된다. 사이토카인 모이어티(예를 들어, IL-2 변이체)를 포함하는 면역사이토카인의 단계 희석액이 포획된 리간드에 결합하게 하고(유리 상태 IL-2 변이체를 대조군으로 제공함), 면역사이토카인 농도에 대하여 반응 유닛(RU)을 플롯팅하여, EC50 값을 결정하거나, 시간에 대하여 플롯팅하여, 사이토카인 수용체-Fc로의 면역사이토카인의 결합 및 해리를 실시간으로 모니터링할 수 있다. 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 운동 분석을 수행함으로써 평형 해리 상수(KD) 및 해리 속도 상수를 결정할 수 있다. 사이토카인 수용체에 대한 각각의 시험 면역사이토카인의 결합 친화성을 상응하는 유리 상태 사이토카인 모이어티의 결합 친화성에 비한 백분율로서 계산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 상에 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-2R)를 발현하는 세포주를 본원에 기재된 사이토카인 모이어티(예를 들어, IL-2 변이체)를 포함하는 면역사이토카인과 인큐베이션시키고, 인큐베이션 후에, 세포를 세척한 다음, 형광 단백질(예를 들어, APC)과 컨쥬게이트된 항-IgG를 첨가하여, 예컨대 FACS에 의해 세포에 대한 면역사이토카인의 결합 친화성을 검출한다.
일부 실시형태에서, 유리 상태의 사이토카인 또는 이의 변이체와 이의 상응하는 사이토카인 수용체(또는 이의 서브유닛) 간의 결합의 KD는 약 ≤ 10-5 M, ≤ 10-6 M, ≤ 10-7 M, ≤ 10-8 M, ≤ 10-9 M, ≤ 10-10 M, ≤ 10-11 M, 또는 ≤ 10-12 M 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 부재 하에서, 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치한(예컨대, 항체(예를 들어, 전장 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한, 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한) 사이토카인 또는 이의 변이체와 이의 상응하는 사이토카인 수용체(또는 이의 서브유닛) 간의 결합의 KD는 검출 가능하지 않거나(예를 들어, 결합 부재), 또는 KD는 표적 항원으로의 본원에 기재된 면역사이토카인의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합의 존재 하의 KD보다 더 크다(즉, 이보다 더 약하게 결합한다).
생물학적 활성
본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 면역사이토카인의 생물학적 활성(또는 생물활성)을 결정하기 위한 다양한 방법, 예컨대 생물검정은 당업계에 설명되어 있다. 당업계에 알려져 있는 임의의 사이토카인 검정을 조정하여, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성을 시험할 수 있다.
생물검정은 사이토카인의 생물학적 활성에 초점을 두고, 이를 판독물로 사용한다. 생물검정에서, 시료의 활성을 감수성 세포주(예를 들어, 시험 시료에 좌우되고/되거나 반응성인 일차 세포 배양물 또는 시험관내 조정된 세포주)에서 시험하고, 이 활성의 결과(예를 들어, 세포 증식)를 표준 사이토카인 제제와 비교한다. 사이토카인의 생물학적 활성의 다른 양태는 추가의 사이토카인 분비의 유도, 사멸의 유도, 항바이러스 활성, 탈과립화, 세포독성, 주화성 및 콜로니 형성의 촉진을 포함한다. 모든 이들 활성을 측정하기 위한 시험관내 검정이 이용 가능하다. 예를 들어, 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 eBioscience®로부터의 "Cytokine Bioassays" of Bioassays - BestProtocols®(http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cytokine-bioassays.pdf)을 참조한다.
예를 들어, 사이토카인-유도된 증식 검정에서, 시료(예를 들어, IL-2 모이어티 또는 IL-2 면역사이토카인) 및 표준물질(예를 들어, 유리 상태의 IL-2)을 배양 배지로 채워진 검정 플레이트에서 단계 희석을 통해 희석하고, 지표 세포(예를 들어, CTLL-2, 또는 항-CD3 Ab로 자극된 PBMC)를 세척하고, 배양 배지 중에 재현탁화시킨 다음, 각각의 웰에 첨가한다. 세포를 가습 인큐베이터 내에 37℃, 5% CO2에서 충분한 시간(예를 들어, 24시간 이상) 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 세포 생존력 시험 작용제(예를 들어, 레자주린, MTT 검정 작용제)를 플레이트에 첨가하고, 충분한 인큐베이션을 가능하게 한 다음, 분광광도계로 판독할 수 있다. 이어서, 세포 증식에 대한 EC50 값(최대 반응의 50%를 나타내는 데 필요한 시험 시료의 농도)을 용량-반응 곡선의 비-선형 회귀 분석으로부터 수득할 수 있다. 또한, 세포 수를 현미경 하에서 계수하고, 표준물질 또는 대조군으로 처리된 것과 비교할 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 사이토카인-유도된 사이토카인 생성 검정에서, 시료(예를 들어, IL-12 또는 IL-23 모이어티, 또는 IL-12 또는 IL-23 면역사이토카인) 및 표준물질(예를 들어, 유리 상태의 IL-12 또는 IL-23)을 배양 배지로 채워진 검정 플레이트에서 단계 희석을 통해 희석하고, 지표 세포(예를 들어, 비장세포, 활성화된 CD4+ T 세포, 또는 활성화된 CD8+ T 세포)를 세척하고, 배양 배지 중에 재현탁화시킨 다음, 각각의 웰에 첨가한다. 세포를 가습 인큐베이터 내에 37℃, 5% CO2에서 충분한 시간(예를 들어, 24 내지 48시간) 동안 인큐베이션시킨 다음, 관심 표적 사이토카인(예를 들어, IFN-γ)을 위한 ELISA 프로토콜에 따라, ELISA에 의한 사이토카인 발현의 결정을 위해 상청액을 수집한다. 또 다른 예에 있어서, 사이토카인-유도된 세포 표면 마커 발현 검정에서, 시료(예를 들어, IFN-γ 모이어티, 또는 IFN-γ 면역사이토카인) 및 표준물질(예를 들어, 유리 상태의 IFN-γ)을 배양 배지로 채워진 검정 플레이트에서 단계 희석을 통해 희석하고, 지표 세포(예를 들어, HEK-Blue™ IFN-γ 세포)를 세척하고, 배양 배지 중에 재현탁화시킨 다음, 각각의 웰에 첨가한다. 세포를 가습 인큐베이터 내에 37℃, 5% CO2에서 충분한 시간(예를 들어, 24 내지 48시간) 동안 인큐베이션시킨 다음, 바이오마커(예를 들어, PD-L1)의 세포 표면 발현을 ELISA 또는 FACS에 의해 검출하고(예를 들어, 항-인간 PD-L1 APC-컨쥬게이트된 항체 이용) 측정할 수 있다. 또한, 예시적인 방법에 대하여 실시예 1, 5 및 11을 참조한다.
본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성은 또한 생체내 또는 생체외 실험에 의해, 예를 들어, 지표 세포의 증식(예를 들어, IL-2 모이어티 또는 IL-2 면역사이토카인을 투여한 후에, CD8+ 세포, NK 세포, 또는 Treg의 증식)을 측정함으로써; 사이토카인 분비의 유도 또는 저해를 측정함으로써; 본원에 기재된 시험 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인을 주사한 후에, 종양 이종이식 마우스에서 종양 체적 감소를 측정함으로써; 또는 자가면역 점수를 측정함으로써 반영될 수 있다.
또한, 세포 신호전달 검정을 사용하여, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 신호전달에 관여하는 효소 반응 동안 생성되는 분석물, 예컨대 ADP, AMP, UDP, GDP 및 성장 인자를 검출하기 위한 다양한 세포 신호전달 검정 키트, 또는 전체 및 인산화된 형태의 신호전달 단백질을 정량화하기 위한 포스파타제 검정이 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 세포를 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인과 인큐베이션시킨 후에, 특정 키나제가 활성인지를 결정하기 위하여, 세포 용해물을 방사성 포스페이트의 존재 하에 효소에 대한 알려져 있는 기질에 노출시킨다. 생성물을 (면역침전과 함께 또는 이것 없이) 전기영동에 의해 분리한 다음, 겔을 x-선 필름에 노출시켜, 단백질이 동위원소를 혼입하였는지의 여부를 결정한다. 일부 실시형태에서, 세포 상의 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성을 면역조직화학에 의해 측정하여, 신호전달 단백질의 위치를 결정한다. 예를 들어, 이들의 활성화된 상태의 신호 단백질 또는 신호 단백질 자체에 대한 항체를 사용할 수 있다. 이들 항체는 포스페이트 또는 다른 활성화 입체형태를 포함하는 인식 에피토프를 갖는다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질 유전자, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)을 연구될 단백질을 인코딩하는 유전학적 벡터 내로 혼입시킴으로써 특정 신호전달 단백질의 이동(예를 들어, 신호전달 분자의 핵 전좌)을 추적할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포에 대한 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성을 웨스턴 블롯에 의해 시험한다. 예를 들어, 모든 티로신-인산화된 단백질(또는 다른 인산화된 아미노산, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌)을 시간적 순서로 자극 후에 수득된 세포 용해물의 웨스턴 블롯에서 항-포스포티로신 항체(또는 다른 인산화된 아미노산에 대한 항체)로 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포에 대한 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 생물활성을 면역침전에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호전달 단백질 또는 모든 티로신-인산화된 단백질에 대한 일차 항체를 비드에 교차-결합시킨다. 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인과 인큐베이션시킨 후에, 세포를 프로테아제 저해제를 함유하는 완충제 중에 용해시킨 다음, 항체-코팅된 비드와 인큐베이션시킨다. 단백질을 SDS 전기영동을 사용함으로써 분리한 다음, 단백질을 웨스턴 블롯에 대하여 기재된 절차를 사용함으로써 확인한다. 일부 실시형태에서, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 결합, 또는 "풀-다운(pull-down)" 검정도 또한 사용할 수 있으며, 이는 직접적인 단백질-단백질(예를 들어, 신호전달 단백질) 상호작용을 결정한다. 세포-기반의 신호 전달 검정도 또한 사용할 수 있다. 요약하여, 시험 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 상응하는 수용체, 사이토카인 신호전달 경로의 상응하는 신호전달 인자(예를 들어, STAT, JAK) 및 사이토카인 신호전달 경로-유도성 리포터(예를 들어, 형광 단백질, 또는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제)를 안정하게 발현하는 리포터 세포주(예를 들어, HEK-Blue™)를 충분한 시간(예를 들어, 24 내지 48시간) 동안 CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 시험 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인의 존재 하에 배양한 다음, 예컨대 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 비색 효소 검정(예를 들어, QUANTI-Blue™)을 사용하여 세포 배양 배지 중 분비된 배아 알칼리성 포스파타제를 검출하기 위하여 또는 형광 단백질에 대한 현미경검사 또는 FACS를 사용하여 리포터를 검출할 수 있다. 또한, 예시적인 방법에 대하여 실시예 1, 4, 7, 9, 10 및 12를 참조한다.
일 예로서 IL-2를 사용하여, STAT5 및 ERK1/2 신호전달을 측정하여, 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 STAT5 및 ERK1/2의 인산화를 측정함으로써, IL-2 모이어티 또는 면역사이토카인 생물활성을 반영할 수 있다. 예를 들어, 유세포측정 분석과 조합하여 인산화된 버전의 이들 분자에 특이적인 항체를 사용하여 STAT5 및 ERK1/2 인산화를 측정할 수 있다. 예를 들어, 신선하게 단리된 PBMC를 37℃에서 IL-2 또는 이의 변이체, 또는 IL-2 면역사이토카인과 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후에, 세포를 (예를 들어, 사이토픽스(Cytofix) 완충제를 사용하여) 바로 고정하여, 인산화 상태를 보존하고, (예를 들어, 포스플로우 펌(Phosflow Perm) 완충제 III을 사용하여) 투과화시킨다. 인산화된 STAT5 또는 ERK1/2에 대한 형광단-표지된 항체를 사용하여 세포를 염색하고, 유세포측정에 의해 분석한다. 대안적으로, 시험 시료(예를 들어, 본원에 기재된 IL-2 사이토카인 모이어티 또는 IL-2 면역사이토카인)를 마우스 내로 복강내 주사한 다음, 전체 비장세포를 단리하고, 바로 고정하고(예를 들어, 포스플로우™ 용해/고정 완충제), 빙냉 PBS로 세척하고, 항-CD4 및 항-CD25 항체를 사용하여 염색한 다음, 투과화시킬 수 있다(예를 들어, 포스플로우 펌 완충제 III). 이어서, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 세척하고, 항-FoxP3으로 염색하고, 빙냉 FACS 완충제로 세척하고, 실온에서 형광단-표지된 항-포스포-STAT5로 염색한다. 세포를 FACS 완충제로 세척한 다음, 데이터를 FACS 세포측정기에서 획득하고 분석할 수 있다. PI 3-키나제 신호전달을 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정하여, IL-2 생물활성도 반영할 수 있다. 예를 들어, 유세포측정 분석과 함께, 포스포-S6 리보솜 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 PI 3-키나제 신호전달을 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있으며, 예컨대, 시험 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 IL-2 모이어티 또는 IL-2 면역사이토카인) 의존적 면역 세포(예를 들어, PBMC, NK 세포, CD8+ T 세포, Th17 세포) 증식, 분화 및/또는 활성화, 사이토카인 분비를 유도할 수 있고/있거나, 신호 전달을 활성화(예를 들어, STAT5 인산화, ERK1/2 인산화를 유도하거나, PI 3-키나제 신호전달을 자극)할 수 있고/있거나, 면역 세포가 종양 세포 또는 감염된 세포를 사멸시키도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티 또는 면역사이토카인은 면역 세포를 저해할 수 있으며, 예컨대 면역 세포로부터의 사이토카인(예를 들어, 염증-유발성 사이토카인) 생성, 항원 제시 또는 MHC 분자 발현을 저해할 수 있거나, 신호 전달을 저해하거나 개선시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 단핵구, 수지상 세포, 대식구, B 세포, 살해 T 세포(Tc, 세포독성 T 림프구 또는 CTL), 헬퍼 T 세포(Th), 조절 T 세포(Treg), γδ T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 면역 세포의 활성화/저해에서의 활성은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성과 동일하거나 유사하다(예컨대 약 ±20% 차이 이내). 일부 실시형태에서, 사이토카인 변이체는 유리 상태이거나, 본원에 기재된 면역사이토카인의 표적 항원-항체 결합의 부재 하의 경우, 야생형 사이토카인에 비하여 면역 세포의 활성화/저해에서의 이의 활성을 감소시키는(예를 들어, 야생형 사이토카인의 생물활성의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하) 돌연변이 또는 변형(예를 들어, 번역후 변형)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인의 표적 항원-항체 결합의 존재 하에서, 사이토카인 변이체의 면역 세포의 활성화/저해에서의 활성은 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 적어도 약 1%(예컨대 적어도 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200% 중 어느 하나)이다.
항원-결합 단백질, 항원-결합 폴리펩티드, 항체 및 항원-결합 단편
본원에 기재된 "부모" 항원-결합 단백질은 표적 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)이며, 본원에 기재된 면역사이토카인을 작제하기 위한 백본으로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 부모 항원-결합 단백질)은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab, VH 또는 VL), 선택적인 링커(예컨대 본원에 기재된 임의의 펩티드 링커), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 부모 항원-결합 단백질)은 동종이량체 항원-결합 폴리펩티드, 즉, 2개의 동일한 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드(예컨대 PD-L2) 또는 이의 부분, 수용체(예컨대 PD-1) 또는 이의 부분, VHH, scFv, VH 또는 VL), 선택적인 링커, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 부모 항원-결합 단백질)은 이종이량체 항원-결합 폴리펩티드, 즉, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, VH 또는 VL), 선택적인 링커, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 중 하나 이상이 상이한 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 2개의 항원-결합 폴리펩티드는 상이한 항원-결합 단편을 포함한다(예를 들어, 동일한 표적 에피토프 또는 상이한 표적 에피토프에 결합한다). 일부 실시형태에서, 2개의 항원-결합 폴리펩티드는 예를 들어, 이종이량체 쌍형성 목적을 위하여, 상이한 힌지 영역 및/또는 상이한 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41의 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함하며, 쌍형성 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함하며, 쌍형성 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 쌍형성 항원-결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질)은 2개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab, VH 또는 VL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 2개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, 탠덤으로 융합된 2개 이상의 리간드 및/또는 수용체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 항원-결합 단편은 동일하다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 항원-결합 단편은 상이하며, 예를 들어, 하나는 Fab이고, 다른 하나는 scFv이고; 하나는 리간드이고, 다른 하나는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 2개 이상의 항원-결합 단편은 (동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원 상의) 2개 이상의 표적 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질 또는 2개 이상의 항원-결합 단편은 하나의 표적 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질, 항원-결합 폴리펩티드, 또는 항원-결합 도메인은 단일특이적이고 다가(예를 들어, 2가)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질, 항원-결합 폴리펩티드, 또는 항원-결합 도메인은 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이고 다가(예를 들어, 2가)이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인은 단일특이적이고 1가이며, 즉, 사이토카인 모이어티는 항원-결합 단편(예를 들어, Fab, scFv, VHH, 리간드 또는 수용체)과 Fc 도메인(또는 이의 부분)의 하나의 서브유닛 사이의 힌지 영역에 위치하며, Fc 도메인(또는 이의 부분)의 다른 서브유닛은 또 다른 항원-결합 단편과 융합되지 않거나; 사이토카인 모이어티는 하나의 항원-결합 단편(예를 들어, Fab, scFv, VHH, 리간드 또는 수용체)과 단량체 Fc 서브유닛(또는 이의 부분) 사이의 힌지 영역에 위치한다.
본 발명에 있어서, "항원-결합 단백질", "항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질", "리간드-힌지-Fc 융합 단백질" 또는 "수용체-힌지-Fc 융합 단백질"에 대한 언급이 i) 항원-결합 단백질 백본(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체), 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질 백본, 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질 백본(예를 들어, 도 2a 내지 도 4c 연회색 부분 참조); 또는 ii) 부모 항원-결합 단백질, 부모 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 또는 부모 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질을 포함하며, 이의 힌지 영역이 그 내에에 위치한 사이토카인 모이어티를 갖는 것을 이해해야 한다(예를 들어, 도 2a 내지 도 4c 참조). 또한, 본 발명에 있어서, "항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드", "리간드-힌지-Fc 융합 폴리펩티드" 또는 "수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드"에 대한 언급이 i) 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 백본(예를 들어, 항체 중쇄) 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 백본(예를 들어, 도 2a 내지 도 4c에서 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 연회색 부분 참조), 또는 ii) 부모 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하며, 이의 힌지 영역 그 내에 위치한 사이토카인 모이어티를 갖는 것을 이해해야 한다(예를 들어, 도 2a 내지 도 4c에서 사이토카인-Fc-함유 폴리펩티드 쇄 참조).
일부 실시형태에서, "부모" 항원-결합 단백질은 2개의 항원-결합 단편-선택적인 링커-힌지-Fc 폴리펩티드를 포함하는(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진) 항원-결합 단편-선택적인 링커-힌지-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, "부모" 항원-결합 단백질은 2개의 리간드 또는 이의 부분-선택적인 링커-힌지-Fc 폴리펩티드를 포함하는(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진) 리간드 또는 이의 부분-선택적인 링커-힌지-Fc 융합 단백질이다(도 4a 내지 도 4c 연회색 부분 참조). 일부 실시형태에서, "부모" 항원-결합 단백질은 2개의 수용체 또는 이의 부분-선택적인 링커-힌지-Fc 폴리펩티드를 포함하는(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진) 수용체 또는 이의 부분-선택적인 링커-힌지-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 리간드 또는 수용체 이의 부분은 리간드 또는 수용체의 세포외 도메인이다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 PD-L2 세포외 도메인-선택적인 링커-힌지-Fc 융합 단백질이다. 하나 이상의 사이토카인 모이어티(또는 사이토카인 서브유닛)는 부모 항원-결합 단편-힌지-Fc 폴리펩티드의 하나 또는 둘 모두의 힌지 영역에 위치한다(예를 들어, 도 4a 내지 도 4c의 진회색 또는 패턴으로 채워진 타원 참조). 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 이의 사이토카인 수용체로의 사이토카인 모이어티의 결합이 항원-결합 단편(들)의 표적 항원(들) 결합의 부재 하에 감소되는 한, 예를 들어, 표적 항원(예를 들어, 상응하는 수용체 또는 리간드) 결합 없이, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(사이토카인 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)을 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하가 되도록 감소시키는 당업계에 알려져 있는 또는 임의의 적합한 리간드 또는 수용체로부터 유래된 임의의 리간드 또는 수용체(또는 이의 부분, 예컨대 세포외 도메인)일 수 있다. 예를 들어, 리간드 또는 수용체는 하기 "세포 표면 리간드 또는 수용체" 하위섹션 내의 임의의 리간드 또는 수용체로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 항체 단편, 예컨대 Fab, scFv, VHH 등)이다. 본원에 기재된 "부모" 항체 또는 항원-결합 단편은 면역사이토카인을 작제하기 위한 백본으로 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인의 부모 항체는 전장 항체이다. 예를 들어, 도 1a 내지 도 2d에서 연회색으로 칠해진 부분을 참조한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인의 부모 항체는 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 도 3a 내지 도 3c에서 연회색 부분을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인의 서브유닛의 N-말단에 각각 융합된 2개의 scFv를 포함한다(도 3a 연회색 부분 참조). 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 부분(예를 들어, CH2)의 서브유닛의 N-말단에 각각 융합된 2개의 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 부분(예를 들어, CH2)의 서브유닛의 N-말단에 각각 융합된 2개의 Fab를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인의 하나의 서브유닛의 N-말단에 융합된 하나의 scFv 및 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인의 다른 서브유닛의 N-말단에 융합된 하나의 Fab를 포함한다(도 3b 및 도 3c 연회색 부분 참조). 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 부분(예를 들어, CH2)의 하나의 서브유닛의 N-말단에 융합된 하나의 scFv 및 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 부분(예를 들어, CH2)의 다른 서브유닛의 N-말단에 융합된 하나의 Fab를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항체는 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 또는 이의 부분의 하나의 서브유닛의 N-말단에 융합된 제1 VHH 및 힌지 또는 이의 부분을 통해 Fc 도메인 또는 이의 부분의 다른 서브유닛의 N-말단에 융합된 제2 VHH를 포함한다(도 4a 내지 도 4c 연회색 부분을 참조하고, "리간드" 또는 "수용체"를 VHH로 대체한다). 하나 이상의 사이토카인 모이어티(또는 사이토카인 서브유닛)는 부모 항체(예를 들어, 전장 항체) 또는 항원-결합 단편 중 어느 하나의 힌지 영역에 위치한다(예를 들어, 도 2a 내지 도 4c에서 진회색 또는 패턴으로 채워진 타원 참조).
항원-결합 단편은 이의 사이토카인 수용체로의 사이토카인 모이어티의 결합이 항원-결합 단편(들)의 표적 항원(들) 결합의 부재 하에 감소되는 한, 예를 들어, 표적 항원 결합 없이, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(사이토카인 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)을 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하가 되도록 감소시키는, 당업계에 알려져 있거나, 임의의 적합한 항체로부터 유래된 임의의 형식의 것일 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 scFv, VH, VL, scFv-scFv, Fv, Fab, Fab', (Fab')2, 미니바디, 디아바디, 도메인 항체 변이체(dAb), 단일 도메인 항체(sdAb), 예컨대 낙타과 항체(VHH) 또는 VNAR, 피브로넥틴 3 도메인 변이체, 안키린 반복 변이체 및 다른 단백질 스캐폴드로부터 유래된 다른 항원-특이적 결합 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 제1 폴리펩티드 쇄 유래의 VH 및 제2 폴리펩티드 쇄 유래의 VL에 의해 형성된다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 인간이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 키메라이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 마우스, 랫트, 원숭이 또는 토끼 등의 모노클로널 항체로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 항원-결합 단편은 선택적인 링커(들)를 통해 탠덤으로 연결된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, Fab1 - 선택적인 링커1 - Fab2 - 선택적인 링커2 - (선택적인 힌지 또는 이의 부분 - 사이토카인 모이어티 - 선택적인 힌지 또는 이의 부분) - Fc 서브유닛을 포함한다. 예를 들어, Fab1의 CH1 또는 CL은 선택적인 링커 1을 통해 Fab2의 VH 또는 VL에 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, scFv1(또는 sdAb1) - 선택적인 링커1 - scFv2(또는 sdAb2) - 선택적인 링커 2 - (선택적인 힌지 또는 이의 부분 - 사이토카인 모이어티 - 선택적인 힌지 또는 이의 부분) - Fc 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, 리간드1 - 선택적인 링커1 - 리간드2 - 선택적인 링커 2 - (선택적인 힌지 또는 이의 부분 - 사이토카인 모이어티 - 선택적인 힌지 또는 이의 부분) - Fc 서브유닛을 포함한다. 괄호 안의 사이토카인 모이어티는 다른 쌍형성 면역사이토카인 쇄에 대하여 부재일 수 있다. 예를 들어, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, scFv1(또는 sdAb1) - 선택적인 링커1 - scFv2(또는 sdAb2) - 선택적인 링커2 - 사이토카인 모이어티 - 힌지 또는 이의 부분 - Fc 서브유닛1을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄; 및 N'에서 C'으로, scFv3(또는 sdAb3) - 선택적인 링커3 - scFv4(또는 sdAb4) - 선택적인 링커4 - 힌지 또는 이의 부분 - Fc 서브유닛2의 제2 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다.
항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, Fab, VHH, 리간드 또는 수용체)과 이의 표적 항원의 결합 친화성은 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 항체/항원 결합 검정 또는 다른 단백질 결합 검정(예를 들어, 리간드-수용체 결합), 예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, MSD 전기화학발광, 비드 기반의 MIA, RIA, SPR, ECL, IRMA, EIA, 비아코어 검정, 옥텟 분석, 펩티드 스캔, FACS 등에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 또한, 예시적인 방법에 대하여 상기 "결합 친화성" 하위섹션을 참조한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편과 이의 표적 항원 간의 결합의 Kd는 약 ≤ 10-5 M, ≤ 10-6 M, ≤ 10-7 M, ≤ 10-8 M, ≤ 10-9 M, ≤ 10-10 M, ≤ 10-11 M, 또는 ≤ 10-12 M 중 어느 하나이다.
항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열 변이체는 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이 내로의 삽입 및 이 내의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있되, 단, 최종 작제물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv, Fab, VHH, 리간드 또는 수용체)은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 항체 또는 항원-결합 단편의 HVR(또는 CDR) 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 B에 나타나 있다. 더 실질적인 변경이 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 B에, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기에 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환을 관심 항원-결합 단편에 도입하고, 원하는 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성에 대해 생성물을 스크리닝할 수 있다.
[표 B]
아미노산은 일반적인 측쇄 특성: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe에 따라 그룹으로 나뉠 수 있다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
하나의 유형의 치환 변이체는 부모 항체의 하나 이상의 HVR 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 초래되는 변이체(들)는 부모 항체에 비해 소정의 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 가질 것이고/이거나, 부모 항체의 소정의 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기법, 예컨대 본원에 기재된 것들을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화성-성숙된 항체이다. 요약하여, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이하며, 특정 생물학적 활성(예를들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다.
일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체 또는 항원-결합 도메인의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿" 또는 CDR 외측에 존재할 수 있다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙 프로세스 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조) 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL에 대해서는 결합 친화성 시험이 수행된다. 2차 라이브러리를 작제하고, 그로부터 재선택함에 의한 친화성 성숙은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 설명되어 있다. 친화성 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성이 다양한 방법(예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발) 중 어느 하나에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 몇몇의 HVR 잔기(예를 들어, 한꺼번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화되는 HVR-지정 접근법을 포함한다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기를 특이적으로 확인할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 이 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 그룹(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환을 도입할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 스크리닝하여, 이들이 원하는 특성을 함유하는지를 결정할 수 있다.
표적 항원
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용되는 "표적 항원" 또는 "표적 에피토프"는 본원에 기재된 항원-결합 단백질, 항원-결합 폴리펩티드 또는 항원-결합 단편에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 종양 항원 또는 에피토프, 병원체 항원 또는 에피토프, 자가면역 질병, 알레르기 및/또는 이식편 거부에 관여하는 항원 또는 에피토프, 리간드 또는 수용체 또는 이의 부분(예를 들어, 리간드/수용체의 세포외 도메인), 면역 세포 표면 항원 또는 에피토프 등을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 1가이고 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다가(예를 들어, 2가)이고 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 다가(예를 들어, 2가)이고 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)이다. 본원에서 항원-결합 단백질의 결합가 및 특이성은 면역사이토카인의 항원-결합 단편(들)(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)의 결합가 및 특이성을 지칭하며, 사이토카인 또는 이의 변이체의 결합가 및 특이성을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 세포 표면 수용체(예를 들어, PD-1)를 특이적으로 인식하는 리간드(예를 들어, CD155, PD-L1 또는 PD-L2 세포외 도메인)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 리간드(예를 들어, CD155, PD-L1 또는 PD-L2)를 특이적으로 인식하는 수용체(예를 들어, TIGIT 또는 PD-1 세포외 도메인)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는 2개 이상(예컨대 2개)의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 N'에서 C'으로, 예를 들어, 탠덤으로 융합된 2개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드 또는 수용체), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함한다. 2개 이상의 항원-결합 단편은 동일하거나 상이할 수 있으며, 동일한 표적 에피토프 또는 (동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원 상의) 상이한 표적 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 단편은 제1 수용체 또는 이의 에피토프(예를 들어, 제1 수용체의 세포외 도메인)를 특이적으로 인식하는 제1 리간드(예를 들어, 제1 리간드의 세포외 도메인)로부터 유래되며, 또 다른 항원-결합 단편은 제2 리간드 또는 이의 에피토프(예를 들어, 제2 리간드의 세포외 도메인)를 특이적으로 인식하는 제2 수용체(예를 들어, 제2 수용체의 세포외 도메인)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 하나의 항원-결합 단편은 제1 수용체 또는 이의 에피토프(예를 들어, 제1 수용체의 세포외 도메인)를 특이적으로 인식하는 제1 리간드(예를 들어, 제1 리간드의 세포외 도메인)로부터 유래되며, 또 다른 항원-결합 단편은 제2 수용체 또는 이의 에피토프(예를 들어, 제2 수용체의 세포외 도메인)를 특이적으로 인식하는 제2 리간드(예를 들어, 제2 리간드의 세포외 도메인)로부터 유래된다. 제1 및 제2 수용체(또는 이의 에피토프)는 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 및 제2 리간드(또는 이의 에피토프)는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 단편(리간드 또는 수용체)은 표적 항원의 동일한 에피토프(각각 상응하는 수용체 또는 리간드)를 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 단편(리간드 또는 수용체)은 동일한 표적 항원의 상이한 에피토프(각각 상응하는 수용체 또는 리간드)를 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 단편(리간드 또는 수용체)은 상이한 표적 항원(예를 들어, 상이한 표적 항원의 상이한 에피토프, 예컨대 각각 상응하는 수용체 또는 리간드)을 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 이중특이적이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 항체 또는 이의 부분이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 2개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, scFv 또는 Fab)을 포함한다. 전장 항체의 2개의 항원-결합 도메인(Fab), 또는 항체의 2개 이상의 항원-결합 단편(예를 들어, VHH, scFv 또는 Fab)은 동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 표적 에피토프 또는 (동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원 상의) 상이한 표적 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 하나 이상의 표적 에피토프(동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원 상에 존재할 수 있음)를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 항원-결합 도메인(예를 들어, scFv 또는 Fab)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 제1 표적 에피토프를 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, VHH, scFv 또는 Fab) 및 제2 표적 에피토프를 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 도메인(예를 들어, VHH, scFv 또는 Fab)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적 에피토프는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 표적 에피토프는 상이하다(예를 들어, 동일한 표적 항원 상의 상이한 에피토프, 또는 상이한 표적 항원의 상이한 에피토프). 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 표적 항원의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 단일특이적이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 동일한 표적 항원의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 상이한 표적 항원(예를 들어, 상이한 표적 항원의 상이한 에피토프)을 특이적으로 인식하며, 즉, 면역사이토카인은 2가이고 이중특이적이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 항원은 면역 세포 표면 항원이며, 제2 표적 항원은 종양 항원이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 세포 표면 분자(예를 들어, 수용체/리간드의 세포외 도메인)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 특별한 병태와 연관된 표적 세포(예를 들어, 종양 세포, 면역 세포) 상의 세포 표면 마커로서 작용한다. 항원-결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 표적 항원(예를 들어, 종양 항원, 수용체/리간드의 세포외 도메인)은 질병을 갖는 단일 세포 상의 항원 또는 각각이 질병의 원인이 되는 상이한 세포 상에 발현되는 항원일 수 있다. 항원-결합 도메인(들)에 의해 특이적으로 인식되는 표적 항원은 질병에 직접적으로 또는 간접적으로 관여할 수 있다.
종양 항원
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 종양 항원 또는 에피토프이다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개된 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 세포에 의해 생성된 단백질이다. 본 발명의 표적화된 항원의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 따라 달라질 것이다. 예시적인 종양 항원은 예를 들어, 신경교종-연관 항원, BCMA(B-세포 성숙 항원), 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파-태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장내 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서비빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 및 메소텔린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직-특이적 항원, 예컨대 흑색종에서의 MART-1, 티로시나제 및 gp100 및 전립선암에서의 전립선산 포스파타제(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 표적 분자는 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환-관련 분자의 그룹에 속한다. 표적 항원의 또 다른 그룹은 암배아 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 특유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B-세포 분화 항원, 예컨대 CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-연관 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 특유하고 체 내의 다른 세포에서 발생하지 않는다. TAA는 종양 세포에 특유하지 않고, 대신에 항원에 대한 면역학적 관용 상태를 유도하지 못하는 조건 하에 정상 세포 상에서도 발현된다. 종양 상의 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있게 하는 조건 하에 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하고, 반응할 수 없는 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나, 정상 세포 상에서 극도로 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만, 종양 세포 상에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다. TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예컨대 MART-1/멜란A(MART-I), gp 100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통 항원, 예컨대 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아 항원, 예컨대 CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자, 예컨대 p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전위로부터 초래되는 특유한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 대형, 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4(TPBG), 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 FIXa, FX, DLL3, DLL4, Ang-2, 넥틴(Nectin)-4, FOLRα, GPNMB, CD56(NCAM), TACSTD2(TROP-2), 조직 인자, ENPP3, P-카드헤린(cadherin), STEAP1, CEACAM5, 뮤신(Mucin) 1(시알로글리코토프(Sialoglycotope) CA6), 구아닐릴 사이클라제 C(GCC), SLC44A4, LIV1(ZIP6), NaPi2b, SLITRK6, SC-16, 피브로넥틴, 엑스트라-도메인 B(EDB), 내피 수용체 ETB, ROBO4, 콜라겐 IV, 페리오스틴(Periostin), 테나신(Tenascin) c, CD74, CD98, 메소텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터류킨-11 수용체 a(IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2(CD309), LewisY, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타(PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(HER2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서비빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 파열점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장내 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 및 IGLL1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 BCMA, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸(Glypican)-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70(TNFSF7), CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EpCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2, IL11Ra, IL13Ra2, KDR, Lewis-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, VEGFR2, 암배아 항원 및 HMW-MAA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Shim H. (Biomolecules. 2020 Mar; 10(3): 360)] 및 문헌[Diamantis N. and Banerji U. Br J Cancer. 2016; 114(4): 362-367]에 기재된 예시적인 종양 항원을 참조한다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 HER2이다. 일부 실시형태에서, HER2를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 트라스투주맙(trastuzumab)(예를 들어, Herceptin®), 퍼투주맙(pertuzumab)(예를 들어, Perjeta®), 마제툭시맙(margetuximab) 또는 7C2로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, HER2를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 트라스투주맙, 퍼투주맙, 마제툭시맙 또는 7C2 중 어느 하나의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 또는 6개의 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, HER2를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 트라스투주맙, 퍼투주맙, 마제툭시맙 또는 7C2의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-HER2 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 152 또는 153의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다(즉, 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함함). 일부 실시형태에서, 항-HER2 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
병원체 항원
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 병원체 항원 또는 에피토프, 예컨대 진균, 바이러스, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 항원 또는 에피토프이다.
일부 실시형태에서, 진균 항원은 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 칸디다(Candida)로부터의 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 진균 항원은 예를 들어, 칸디다 진균 항원 성분; 아스페르길루스 진균 항원; 히스토플라스마(histoplasma) 진균 항원, 예컨대 열 충격 단백질 60(HSP60) 및 다른 히스토플라스마 진균 항원 성분; 크립토코커스 진균 항원, 예컨대 협막 다당류 및 다른 크립토코커스 진균 항원 성분; 콕시디오이데스(coccidioides) 진균 항원, 예컨대 구상체 항원 및 다른 콕시디오이데스 진균 항원 성분; 및 백선 진균 항원, 예컨대 트리코피틴 및 다른 콕시디오이데스 진균 항원 성분을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 면역사이토카인과 함께 사용하기 위한 박테리아 항원은 예를 들어, 박테리아 항원, 예컨대 백일해 독소, 사상 헤마글루티닌, 퍼택틴, FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 다른 백일해 박테리아 항원 성분; 디프테리아 박테리아 항원, 예컨대 디프테리아 독소 또는 톡소이드 및 다른 디프테리아 박테리아 항원 성분; 파상풍 박테리아 항원, 예컨대 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 다른 파상풍 박테리아 항원 성분; 스트렙토코커스 박테리아 항원, 예컨대 M 단백질 및 다른 스트렙토코커스 박테리아 항원 성분; 그람-음성 바실러스 박테리아 항원, 예컨대 지질다당류 및 다른 그람-음성 박테리아 항원 성분, 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 박테리아 항원, 예컨대 마이콜산, 열 충격 단백질 65(HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질, 항원 85A 및 다른 마이코박테리아 항원 성분; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 박테리아 항원 성분; 폐렴 박테리아 항원, 예컨대 뉴모라이신, 폐렴균 협막 다당류 및 다른 폐렴 박테리아 항원 성분; 헤모필러스 인플루엔자(haemophilus influenzae) 박테리아 항원, 예컨대 협막 다당류 및 다른 헤모필러스 인플루엔자 박테리아 항원 성분; 탄저 박테리아 항원, 예컨대 탄저 예방 항원 및 다른 탄저 박테리아 항원 성분; 리케치아 박테리아 항원, 예컨대 rompA 및 다른 리케치아 박테리아 항원 성분을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본원에 기재된 박테리아 항원에는 임의의 다른 박테리아, 마이코박테리아, 마이코플라즈마, 리케치아 또는 클라미디아 항원이 포함된다. 또한, 부분 또는 전체 병원체는 헤모필러스 인플루엔자; 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 나이세리아 메닌지티디스(neisseria meningitidis); 스트렙토코커스 뉴모니아(streptococcus pneumoniae); 나이세리다 고노레아(neisseria gonorrhoeae); 살모넬라 혈청형 티피(salmonella serotype typhi); 시겔라(shigella); 비브리오 콜레라(vibrio cholerae); 뎅기열; 뇌염; 일본 뇌염; 라임병; 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis); 웨스트 나일(west nile) 바이러스; 황열; 야토병; 간염(바이러스, 세균); RSV(호흡기 세포융합 바이러스); HPIV 1 및 HPIV 3; 아데노바이러스; 천연두; 알레르기 및 암일 수 있다.
원핵생물 및 다른 기생충 항원의 예에는, 예를 들어, 플라스모듐 팔시파룸 항원, 예컨대 분열소체 표면 항원, 포자소체(sporozoite) 표면 항원, 환상포자소체(circumsporozoite) 항원, 생식세포/생식자 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA 및 다른 말라리아원충 항원 성분; 톡소플라스마(toxoplasma) 항원, 예컨대 SAG-1, p30 및 다른 톡소플라스마 항원 성분; 주혈흡충 항원, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신 및 다른 주혈흡충 항원 성분; 레슈마니아 메이져(leishmania major) 및 다른 리슈마니아 항원, 예컨대 gp63, 리포포스포글리칸 및 이의 관련 단백질 및 다른 리슈마니아 항원 성분; 및 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi) 항원, 예컨대 75 내지 77 kDa 항원, 56 kDa 항원 및 다른 트리파노소마 항원 성분이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 단순포진 바이러스(HSV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 메타뉴모바이러스(hMPV), 리노바이러스, 파라인플루엔자(PIV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), JC 바이러스(존 커닝햄(John Cunningham) 바이러스), BK 바이러스, HIV, 지카(Zika) 바이러스, 인간 코로나바이러스, 노로바이러스, 뇌염 바이러스 또는 에볼라(Ebola)로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스 및 이의 임의의 하위유형 또는 재편성체(reassortant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 이의 임의의 하위유형 또는 재편성체, 예컨대 인플루엔자 A 바이러스 하위유형 H1N1(H1N1) 또는 인플루엔자 A 바이러스 하위유형 H5N1(H5N1)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 알파 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), 뉴 헤이븐(New Haven) 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63), 베타 코로나바이러스 OC43(HCoV-OC43), 코로나바이러스 HKU1(HCoV-HKU1), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome) 코로나바이러스(MERS-CoV) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 코로나비리대(Coronaviridae) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 에볼라 바이러스(EBOV) 및 마르부르크(Marburg) 바이러스(MARV)로부터 선택되는 필로비리대(Filoviridae) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 지카 바이러스(ZIKV), 웨스트 나일 바이러스(WNV), 뎅기 바이러스(DENV) 및 황열 바이러스(YFV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라비비리대(Flaviviridae) 바이러스이다.
자가면역 질병, 알레르기 및 이식편 거부에 관여하는 항원
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 자가면역 질병, 알레르기 및 이식편 거부에 관여하는 항원 또는 에피토프이다. 예를 들어, 하기의 자가면역 질병 또는 장애 중 임의의 하나 이상에 관여하는 항원은 본 발명에 사용될 수 있다: 당뇨병, 진성당뇨병, 관절염(류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염 포함), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군(쇼그렌 증후군에 이차적인 건성각막결막염 포함), 원형 탈모증(alopecia areata), 절지동물 물림증 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론병, 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기 천식, 피부 홍반 루푸스, 경피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 전환 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌병증, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 재생불량 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스프루, 편평 태선, 크론병, 염증성 장 질병(IBD), 그레이브스 눈병증, 사르코이드증, 원발 담즙성 간경변, 뒤포도막염, 및 사이질 폐 섬유증. 자가면역 질병에 관여하는 항원의 예로는 글루탐산 데카복실라제 65(GAD 65), 고유 DNA, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 단백질지질 단백질, 아세틸콜린 수용체 성분, 티로글로불린 및 갑상선 자극 호르몬(TSH) 수용체를 포함한다. 알레르기에 관여하는 항원의 예로는 일본 삼목 화분 항원, 돼지풀 화분 항원, 호밀풀 화분 항원과 같은 화분 항원, 먼지 진드기 항원 및 고양이 항원과 같은 동물 유래 항원, 조직적합 항원, 및 페니실린 및 기타 치료 약물이 포함된다. 이식편 거부에 관여하는 항원의 예로는 심장, 폐, 간, 췌장, 신장 및 신경 이식편 성분과 같은, 이식편 수여자로 이식되어야 하는 이식편의 항원 성분이 포함된다. 항원은 자가면역 질병의 치료에 유용한 변경된 펩티드 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 CD3, CD4, CD123 또는 CD8이다.
면역 관문 분자
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 면역 관문 분자이다. 면역 관문은 면역계의 조절자이다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 분자는 자극성 면역 관문 분자이다. 일부 실시형태에서, 자극성 면역 관문 분자는 CD27, CD28, OX40, ICOS, GITR, 4-1BB, CD27, CD40, CD3 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 도메인, 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)은 자극성 면역 관문 분자에 의해 매개되는 면역 반응의 세기를 자극하거나, 활성화시키거나, 증가시킬 수 있는 자극성 면역 관문 분자의 활성화자이다. 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 자극성 면역 관문 분자를 활성화시키는 당업계에 알려져 있는 임의의 항체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 예를 들어, 자극성 면역 관문 신호전달을 활성화시킬 수 있는 자극성 면역 관문 분자의 리간드 또는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 도메인, 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)은 자극성 면역 관문 분자에 의해 매개되는 면역 반응의 세기를 감소시키거나 차단할 수 있는 자극성 면역 관문 분자의 길항제이다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 분자는 저해성 면역 관문 분자이다. 일부 실시형태에서, 저해성 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, HHLA2, CD47, CXCR4, CD160, CD73, BLTA, B7-H4, TIGIT 및 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 저해성 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L2, 또는 PD-L1이다. 일부 실시형태에서, 저해성 면역 관문 분자는 CTLA-4이다. 일부 실시형태에서, 저해성 면역 관문 분자는 TIGIT이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 도메인, 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)은 하나 이상의 저해성 면역 관문 분자를 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나, 저해하거나, 이에 간섭하는 면역 관문 저해제이다. 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 도메인은 당업계에 알려져 있는 임의의 항체로부터 유래될 수 있으며, 이는 면역 관문 저해제로서 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 예를 들어, 저해성 면역 관문 신호전달(예를 들어, TIGIT 또는 PD-1 신호전달)을 활성화시키거나 자극할 수 있는 저해성 면역 관문 분자(예를 들어, TIGIT 또는 PD-1)의 리간드(예를 들어, CD155, PD-L2 또는 PD-L1) 또는 수용체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 항원-결합 도메인, 또는 리간드/수용체-Fc 융합 단백질)은 저해성 면역 관문 분자의 효능제이며, 이는 저해성 면역 관문 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 자극하거나, 활성화시키거나, 이의 세기를 증가시킬 수 있다.
PD-1(세포 예정사 단백질 1)은 T-세포 활성화 및 관용을 조절하는 동시-자극 분자의 B7/CD28 과의 일부이며, 따라서, 길항성 항-PD-1 항체 또는 PD-1 리간드-Fc 융합 단백질은 관용을 극복하는 데 유용할 수 있다. PD-1은 B7-4에 대한 수용체로 정의된다. B7-4는 면역 세포 상의 저해성 수용체로의 결합 시에, 면역 세포 활성화를 저해할 수 있다. PD-1/PD-L1 경로의 관여는 T-세포 이펙터 기능, 사이토카인 분비 및 증식의 저해를 초래한다. (문헌[Turnis et al., OncoImmunology 1(7):1172-1174, 2012]). 높은 수준의 PD-1은 고갈된 또는 만성으로 자극된 T 세포와 관련이 있다. 또한, 증가된 PD-1 발현은 암 환자의 생존 감소와 상관관계가 있다. 면역 세포에서 PD-1, B7-4 및 B7-4와 PD-1 저해 신호 간의 상호작용을 하향 조절하기 위한 작용제는 면역 반응의 향상을 초래할 수 있다. 예시적인 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(예를 들어, Keytruda®), 세미플리맙(Libtayo®) 및 니볼루맙(예를 들어, Opdivo®)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, PD-1을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 펨브롤리주맙, 세미플리맙 또는 니볼루맙의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 펨브롤리주맙, 세미플리맙 또는 니볼루맙의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-PD-1 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 104 또는 105의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PD-1 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
PD-L1(세포 예정사-리간드 1)은 또한 분화 클러스터 274(CD274) 또는 B7 동족체 1(B7-H1)로도 알려져 있다. PD-L1은 PD-1에 대한 리간드로서 역할을 하여, 특정 사건, 예컨대 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질병 및 기타 병태, 예컨대 간염 및 암 동안 면역계를 억제하는 데 중요한 역할을 한다. PD-1 수용체/PD-L1 리간드 복합체의 형성은 저해 신호를 전달하며, 이는 림프절에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시킨다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(atezolizumab)(예를 들어, Tecentriq®), 아벨루맙(avelumab)(예를 들어, Bavencio®) 및 더발루맙(durvalumab)(예를 들어, IMFINZI™)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 더발루맙의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 더발루맙의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-PD-L1 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 139의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 140의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 141의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 142의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부모 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분 - 선택적인 펩티드 링커 - 힌지 영역 - Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진) 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, PD-L1은 SEQ ID NO: 249의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 250의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형(예를 들어, 야생형 인간) PD-L1로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 결실, 삽입 또는 대체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형 PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분에 비하여, PD-1에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형 PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 부분에 비하여, PD-1에 대해 감소된 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-L1-힌지-Fc 융합 단백질(예를 들어, 부모 융합 단백질)은 동종이량체 PD-L1-힌지-Fc 융합 단백질이며, 즉, 2개의 PD-L1-힌지-Fc 폴리펩티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, PD-L1-힌지-Fc 융합 단백질(예를 들어, 부모 융합 단백질)은 이종이량체 전장 항체이며, 예를 들어, 하나의 PD-L1-힌지-Fc 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 PD-L1-힌지-Fc 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예컨대 부모 PD-L1-힌지-Fc 융합 단백질 내에서, PD-L1(예를 들어, PD-L1 세포외 도메인) 및 힌지 영역은 펩티드 링커, 예컨대 본원에 기재된 임의의 펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 203, 206 또는 213의 서열을 포함한다.
PD-L2(세포 예정사 1 리간드 2, B7-DC, CD273)는 PD-1의 또 다른 면역 관문 수용체 리간드이다. PD-L2는 적응 면역 반응의 음성 조절에서 역할을 수행한다. PD-L2에 의한 PD-1의 결합은 T 세포 수용체(TCR)-매개된 증식 및 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 현저하게 저해한다. 낮은 항원 농도에서, PD-L2-PD-1 상호작용은 강력한 B7-CD28 신호를 저해한다. 대조적으로, 높은 항원 농도에서, PD-L2-PD-1 상호작용은 사이토카인 생성을 감소시키지만, T 세포 증식을 저해하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질(예를 들어, 부모 항원-결합 단백질)은 PD-L2(예를 들어, 전장 또는 이의 부분)-힌지-Fc 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분 - 선택적인 펩티드 링커 - 힌지 영역 - Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 각각 포함하는(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진) 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, PD-L2는 SEQ ID NO: 175의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 176의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형(예를 들어, 야생형 인간) PD-L2로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 결실, 삽입 또는 대체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형 PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분에 비하여 PD-1에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분은 야생형 PD-L2 세포외 도메인 또는 이의 부분에 비하여 PD-1에 대해 감소된 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질(예를 들어, 부모 융합 단백질)은 SEQ ID NO: 177의 서열을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질(예를 들어, 부모 융합 단백질)은 동종이량체 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질이며, 즉, 2개의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질(예를 들어, 부모 융합 단백질)은 이종이량체 전장 항체이며, 예를 들어, 하나의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예컨대 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질 내에서, PD-L2(예를 들어, PD-L2 세포외 도메인) 및 힌지 영역은 펩티드 링커, 예컨대 본원에 기재된 임의의 펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 203, 206 또는 213의 서열을 포함한다.
세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4, 또는 CD152)는 CD28의 동족체이며, 활성화된 T-세포에서 상향조절되는 저해성 면역 관문 분자로 알려져 있다. CTLA-4는 또한, B7-1 및 B7-2에, 그러나 CD28보다 더 큰 친화성으로 결합한다. B7과 CTLA-4 간의 상호작용은 T 세포 활성화를 약화시키며, 이는 종양 면역 회피의 중요한 메커니즘을 구성한다. 항-CTLA-4 항체 치료법은 수많은 암, 예컨대 흑색종에서 가능성을 보였다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(ipilimumab)(예를 들어, Yervoy®)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 이필리무맙의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CTLA-4를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 이필리무맙의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 127 또는 128의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 중쇄의 VH 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 경쇄의 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인 또는 VSTM3을 갖는 T 세포 면역수용체로도 지칭됨)는 일부 T 세포 및 NK 세포 상의 면역 수용체이다. 예를 들어, TIGIT는 흑색종에서 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포 및 CD8+ 종양 침윤 림프구(TIL)에서 과발현하는 것으로 관찰된다. TIGIT가 종양 세포, 수지상 세포, 대식구 등 상에서 발현되는 이의 리간드 CD155(PVR)에 의해 결합되는 경우, TIGIT는 저해 신호를 T 세포 또는 NK 세포에 보낸다.
세포 표면 리간드 또는 수용체
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 리간드 또는 수용체 또는 이의 부분, 예컨대 리간드/수용체의 세포외 도메인이다. 일부 실시형태에서, 리간드 또는 수용체는 IL-2, IL-2Rα(CD25), IL-3Rα(CD123), PD-1, PD-L1, PD-L2, CD155, NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 BCMA에 결합할 수 있는 APRIL 및/또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 수용체는 FcR이고, 리간드는 Fc-함유 분자이다. 일부 실시형태에서, FcR은 Fcγ 수용체(FcγR)이다. 일부 실시형태에서, FcγR은 FcγRIA(CD64A), FcγRIB(CD64B), FcγRIC(CD64C), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 PD-1, 예컨대 PD-1의 세포외 도메인(또는 이의 부분)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드의 항원-결합 단편은 PD-L2 또는 PD-L1, 예컨대 PD-L2 또는 PD-L1의 세포외 도메인(또는 이의 부분)이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 176의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 250의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드의 항원-결합 단편은 CD155, 예컨대 CD155의 세포외 도메인(또는 이의 부분)이다. 일부 실시형태에서, CD155 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 267의 서열을 포함한다.
IL-2의 수용체, 인터류킨-2 수용체(IL-2R)는 소정의 면역 세포, 예컨대 림프구의 표면 상에 발현되는 이종삼량체 단백질이다. IL-2R은 α 쇄(IL-2Rα, CD25, Tac 항원), β 쇄(IL-2Rβ, CD122) 및 γ 쇄(IL-2Rγ, γc, 공통 감마 쇄 또는 CD132)의 상이한 조합에 의해 생성되는 3가지 형태를 갖는다. 주로 기억 T 세포 및 NK 세포 상에서, IL-2Rα는 낮은 친화성으로 IL-2에 결합하고, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ의 복합체는 중등의 친화성으로 IL-2에 결합한다. 모든 α, β 및 γ 쇄의 복합체는 활성화된 T 세포 및 조절 T 세포(Treg) 상에서 높은 친화성으로 IL-2에 결합한다. CD25(IL-2Rα)는 Treg의 발생 및 유지에서 중요한 역할을 수행하며, 림프절로의 Treg의 유입에 필요한 CD62L의 Treg 발현에서 역할을 수행할 수 있다(문헌[Malek and Bayer, 2004]). CD25는 활성화된 T 세포 및 Treg에 대한 마커이다. 실험 데이터에 의해, 마우스에서 심장 동종이식의(문헌[Kirkman et al., 1985]) 및 비인간 영장류에서 신장 동종이식의(문헌[Reed et al., 1989]) 거부를 유의미하게 지연시키는 항-CD25의 면역억제 능력이 뒷받침되었다. 예시적인 항-CD25 항체는 바실릭시맙(basiliximab)(예를 들어, Simulect®), 다클리주맙(daclizumab)(예를 들어, Zinbryta®)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, CD25를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 바실릭시맙 또는 다클리주맙의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD25를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 바실릭시맙 또는 다클리주맙의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-CD25 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 164의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 165의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 166의 서열을 포함하는 중쇄의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 포함하는 경쇄의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 166의 서열을 포함하는 중쇄의 VH 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 포함하는 경쇄의 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 166의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 167의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CD25 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
면역 세포 표면 항원
일부 실시형태에서, 표적 항원 또는 에피토프는 면역 세포 표면 항원 또는 에피토프이다. 면역 세포는 상이한 세포 표면 분자를 갖는다. 예를 들어, CD3은 T-세포 상의 세포 표면 분자인 한편, CD16, NKG2D 또는 NKp30은 NK 세포 상의 세포 표면 분자이며, CD3 또는 불변의 T-세포 수용체(TCR)는 NKT-세포 상의 세포 표면 분자이다. 면역 세포가 T-세포인 일부 실시형태에서, 활성화 분자는 CD3, 예를 들어, CD3ε, CD3δ 또는 CD3γ; 또는 CD2, CD4, CD8, CD27, CD28, CD40, CD134, CD137, CD278, 저해성 면역 관문 분자(예를 들어, CTLA-4, PD-1, TIM3, BTLA, VISTA, LARG-3 또는 TIGIT) 및 자극성 면역 관문 분자(CD27, CD28, CD137, OX40, GITR 또는 HVEM) 중 하나 이상이다. 면역 세포가 B 세포인 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD19, CD20 또는 CD138이다. 면역 세포가 NK 세포인 다른 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD16, CD56(NCAM), NKp46, NKp44, CD244, CD226, TIGIT, CD96, LAG3, TIM3, PD-1, KLRG1, CD161, CD94/NKG2, KIR, NKG2D 또는 NKp30이다. 면역 세포가 NKT-세포인 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD3 또는 불변 TCR이다. 면역 세포가 골수성 수지상 세포(mDC)인 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD11c, CD11b, CD13, CD45RO 또는 CD33이다. 면역 세포가 형질 수지상 세포(pDC)인 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD123, CD62L, CD45RA, 또는 CD36이다. 면역 세포가 대식구인 일부 실시형태에서, 세포 표면 분자는 CD163 또는 CD206이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 단핵구, 수지상 세포, 대식구, B 세포, 살해 T 세포(Tc, 세포독성 T 림프구 또는 CTL), 헬퍼 T 세포(Th), 조절 T 세포(Treg), γδ T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 항원은 CD3(예를 들어, CD3ε, CD3δ, CD3γ), CD4, CD5, CD8, CD16, CD27, CD28, CD40, CD64, CD89, CD134, CD137, CD278, NKp46, NKp30, NKG2D, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 항원은 CD3, CD4 또는 CD8이다.
CD3은 3개의 상이한 폴리펩티드 쇄(ε, δ 및 γ 쇄)를 포함하며, 세포독성 T 세포(CD8+ 나이브 T 세포) 및 T 헬퍼 세포(CD4+ 나이브 T 세포)를 포함하는 T 세포에 의해 발현되는 항원이다. 3개의 CD3 폴리펩티드 쇄는 TCR 및 ζ-쇄와 회합되어, TCR 복합체를 형성하며, 이는 T 세포에서 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 기능을 갖는다. 현재, 많은 치료 전략은 항-인간 CD3 모노클로널 항체를 사용하여 TCR 신호 전달을 표적화하여 질병을 치료한다. CD3 특이적인 항체 OKT3은 인간 치료적 이용을 위해 승인된 처음의 모노클로널 항체이며, 동종 이식편 거부의 치료를 위한 면역조절제로서 임상적으로 이용된다. 오텔릭시주맙(otelixizumab)(TRX4)은 CD3ε을 특이적으로 표적화하는 모노클로널 항체이며, 1형 당뇨병 및 다른 자가면역 질병의 치료를 위해 개발 중이다. 일부 실시형태에서, CD3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 OKT3 또는 오텔릭시주맙의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 도메인은 OKT3 또는 오텔릭시주맙의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3으로의 결합을 위하여 OKT3 항체와 경쟁하지 않으며, TCR 신호전달을 활성화시킬 수 없다(즉, 비-활성 항-CD3 항체). 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 CD3ε을 특이적으로 인식한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-CD3 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3(예를 들어, CD3ε) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3(예를 들어, CD3ε) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 93의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
CD4는 면역 세포, 예컨대 T 헬퍼 세포(CD4+ T 헬퍼 세포), 단핵구, 대식구 및 수지상 세포의 표면 상에 발현되는 당단백질이다. CD4는 TCR의 공동-수용체이며, 항원-제시 세포와의 소통에서 TCR을 보조한다. 예시적인 항-CD4 항체는 이발리주맙(Ibalizumab)(예를 들어, Trogarzo®), MAX.16H5 및 IT1208을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. MAX.16H5는 자가면역 질병(예를 들어, 류마티스 관절염) 및 신장 동종이식편의 이식 후의 급성 후기-발병 거부의 치료를 위해 임상 시험에서 정맥 내로 적용되는 항-인간 CD4 항체이다. IT1208은 현재 진행성 고형 종양을 치료하기 위한 임상 시험 하에 있는 탈푸코실화된 인간화 항-CD4 고갈 항체이다. 일부 실시형태에서, 이발리주맙을 부모 항-CD4 항체(예를 들어, 전장 항체)로서 사용하였다. 이발리주맙은 HIV 치료에서 FDA에 의해 승인된 비-면역억제 인간화 모노클로널 항체이다. 일부 실시형태에서, CD4를 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인은 이발리주맙, MAX.16H5 또는 IT1208의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD4를 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인은 이발리주맙, MAX.16H5 또는 IT1208의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-CD4 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 75 또는 76의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CD4 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
CD8은 TCR에 대한 공동-수용체로서 역할을 하는 막횡단 당단백질이다. CD8은 MHC 부류 I 단백질에 결합하며, 이에 특이적이다. 가장 흔한 형태의 CD8은 CD8-α 및 CD8-β 쇄로 구성된다. CD8은 세포독성 T 세포의 표면 상에 주로 발현되지만, 자연 살해 세포, 외피 흉선세포 및 수지상 세포에서도 또한 관찰될 수 있다. CD8은 세포독성 T 세포 모집단에 대한 마커이다. CD8은 T 세포 림프모구성 림프종 및 저색소 균상 식육종에서 발현된다. 예시적인 항-CD8 항체는 G10-1, OKT8, YTC182.20, 4B11 및 DK25를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, CD8을 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인은 G10-1, OKT8, YTC182.20, 4B11 또는 DK25 중 어느 하나의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8을 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인은 G10-1, OKT8, YTC182.20, 4B11 또는 DK25 중 어느 하나의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 부모 항-CD8 항체(예를 들어, 전장 항체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체(예를 들어, 부모 전장 항체)는 SEQ ID NO: 116의 서열을 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 117의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체(예를 들어, 부모 항체)는 동종이량체 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-CD8 항체(예를 들어, 부모 항체)는 이종이량체 전장 항체, 예를 들어, KIH 항체이며, 예를 들어, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며, 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
힌지
힌지는 면역글로불린의 중쇄의 Fd 영역(VH 및 CH1 도메인)과 Fc 영역을 연결한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 연결한다. IgG, IgA 및 IgD 면역글로불린 부류에서 관찰되는 힌지 영역은 면역글로불린의 Fab 부분이 Fc 영역에 비하여 공간에서 자유롭게 이동하도록 하는 유연성 스페이서로서 작용한다. 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 면역글로불린 부류 및 하위부류 간에 서열 및 길이 둘 모두가 달라진다. 중쇄는 힌지 영역에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 결정학적 연구에 따라, 면역글로불린 힌지 영역은 구조적으로 및 기능적으로 3개의 영역으로 추가로 세분될 수 있다: 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지. 문헌[Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992)]을 참조한다. 상부 힌지는 CH1의 카복실 말단으로부터 운동을 제한하는 힌지 내의 제1 잔기, 일반적으로 2개의 중쇄 간에 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 제1 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체의 세그먼트 유연성과 상호연관된다. 코어 힌지 영역은 중쇄간 디술피드 가교를 함유한다. 하부 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 단부를 연결하고 CH2 도메인 내의 잔기를 포함한다. 상동. 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 카바트에 기재된 바와 같은 EU 넘버링에 따른 아미노산 216 내지 230에 해당한다. 인간 IgG1의 코어 힌지 영역은 서열 Cys-Pro-Pro-Cys을 함유하며, 이는 디술피드 결합 형성에 의해 이량체화되는 경우, 피봇(pivot)으로 작용하는 것으로 여겨지는 사이클릭 옥타펩티드를 초래함으로써 유연성을 부여한다. 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 서열의 구조 및 유연성에 의해 허용되는 입체형태적 변화는 항체의 Fc 부분의 이펙터 기능에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 영역은 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 함유할 수 있으며, 이는 탄수화물 부착을 위한 다수의 구조적으로 별개의 유형의 부위를 포함한다. 예를 들어, IgA1은 힌지 영역의 17개 아미노산 세그먼트 내의 5개의 글리코실화 부위를 함유하여, 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩티드의 예외적인 내성을 부여하며, 이는 분비성 면역글로불린에 대한 유리한 특성으로 고려된다.
일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 자연 발생 부모 항체에 존재하는 힌지 영역을 포함한다. 예를 들어, 부모 항체는 IgG1 항체이며, 본원에 기재된 면역사이토카인 내의 항체 또는 항원-결합 단편의 힌지 영역은 IgG1-형 힌지 영역이다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 힌지 영역의 변형을 포함한다. 예를 들어, 힌지 영역 또는 이의 부분은 예를 들어, 결실, 삽입 또는 예를 들어, 동일한 부류(예를 들어, IgG, IgA 또는 IgE) 및 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 등)의 자연 발생 항체에 존재하는 힌지 영역과 상이한 힌지 영역 또는 이의 부분으로의 대체에 의해 변형된다. 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3 항체는 IgG4-형 힌지 영역을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역 또는 이의 부분은 쇄간 디술피드 결합(들)이 여전히 형성될 수 있고/있거나, 면역사이토카인이 표적 항원-항원 결합 단편 결합을 보장하도록 유연성을 가져, 표적 항원-항체 결합의 부재 하에 사이토카인 활성을 차폐시키면서, 표적 항원-항체 결합의 존재 하에 사이토카인 활성을 탈차폐시켜, 2개의 사이토카인 서브유닛 또는 2개의 사이토카인 모이어티 간에 유연성 및/또는 충분한 공간을 제공하여, 적절한 사이토카인 활성(결합 친화성 및/또는 생물활성)을 보장하고/하거나, 선택적으로 Fc 부분의 이펙터 기능(들)을 폐지하지 않는 한, 힌지 영역의 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지 중 하나 이상에서, 돌연변이, 예를 들어, 결실, 삽입 또는 대체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지이거나, 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 돌연변이된 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지이다. 일부 실시형태에서, IgG1 하부 힌지 영역 내의 L234 및/또는 L235 돌연변이, 예를 들어, L234A, L234K, L234D, L235E, L235K 및 L235A 돌연변이 중 1개 또는 2개와 같은, 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 결실, 삽입 또는 대체를 힌지 영역의 상부 힌지, 코어 및 하부 힌지 중 하나 이상에 도입하여, Fc 도메인의 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)을 감소시키거나 제거한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 L234K 및 L235K 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 L234D 및 L235E 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역을 절단하거나, 더 적은 시스테인으로 돌연변이시켜, Fc 도메인의 이량체화 동안 디술피드 결합 쌍형성 오류를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 이종이량체 형성을 용이하게 하도록, 하나 이상의 비대칭 하전된 돌연변이(들)를 하부 힌지에 도입하며, 예를 들어, 하나의 폴리펩티드는 IgG1 하부 힌지 영역 내에 L234K+L235K를 포함하는 한편, 쌍형성 폴리펩티드는 IgG1 하부 힌지 영역 내에 L234D+L235E를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO: 40)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 L234K 및 L235K 돌연변이를 포함하는 IgG1 힌지이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 EPKSCDKTHTCPPCPAPEKKGGP(SEQ ID NO: 41)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 L234D 및 L235E 돌연변이를 포함하는 IgG1 힌지이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 EPKSCDKTHTCPPCPAPEDEGGP(SEQ ID NO: 42)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 ERKCCVECPPCPAPPVAGP(SEQ ID NO: 46)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO: 47)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGP(SEQ ID NO: 58)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 EPKSCDKDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO: 43), EPKSCDKDKTHTCPPCPAPEKKGGP(SEQ ID NO: 44), 또는 EPKSCDKDKTHTCPPCPAPEDEGGP(SEQ ID NO: 45) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 EPKSCDKPDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO: 55), EPKSCDKPDKTHTCPPCPAPEKKGGP(SEQ ID NO: 56), EPKSCDKPDKTHTCPPCPAPEDEGGP(SEQ ID NO: 57), 또는 EPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO: 59) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역, 예컨대 힌지 N' 부분은 EPKSCDKP(SEQ ID NO: 54), EPKSCDK(SEQ ID NO: 48), 또는 EPKSC(SEQ ID NO: 49) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 DKTHT(SEQ ID NO: 53)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역, 예컨대 힌지 C' 부분은 DKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO: 50), DKTHTCPPCPAPEKKGGP(SEQ ID NO: 51), 또는 DKTHTCPPCPAPEDEGGP(SEQ ID NO: 52) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역의 N-말단에 위치하고, 즉, 전장 항체의 중쇄의 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 융합 폴리펩티드는 N'에서 C'으로, VH-CH1-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2-CH3 또는 CH2) 사이의 힌지 영역의 N-말단에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, 하기 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함한다: (1) VH-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (2) VL-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (3) VH-선택적인 링커-VL-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (4) VL-선택적인 링커-VH-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (5) VH-CH1-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (6) VH-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (7) VL-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (8) VH-선택적인 링커-VL-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (9) VL-선택적인 링커-VH-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (10) VH-CH1-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (11) 리간드-선택적인 링커-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; (12) 리간드-선택적인 링커-사이토카인 모이어티-힌지-CH2; (13) 수용체-선택적인 링커-사이토카인 모이어티-힌지-CH2-CH3; 또는 (14) 수용체-선택적인 링커-사이토카인 모이어티-힌지-CH2. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 50 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하는 힌지 영역의 N-말단에 위치한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역의 C-말단에 위치하고, 즉, 중쇄 융합 폴리펩티드는 N'에서 C'으로, VH-CH1-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2) 사이의 힌지 영역의 C-말단에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, 하기 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함한다: (1) VH-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (2) VL-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (3) VH-선택적인 링커-VL-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (4) VL-선택적인 링커-VH-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (5) VH-CH1-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (6) VH-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (7) VL-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (8) VH-선택적인 링커-VL-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (9) VL-선택적인 링커-VH-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (10) VH-CH1-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (11) 리간드-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; (12) 리간드-힌지-사이토카인 모이어티-CH2; (13) 수용체-힌지-사이토카인 모이어티-CH2-CH3; 또는 (14) 수용체-힌지-사이토카인 모이어티-CH2. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 40 내지 47, 50 내지 52 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함하는 힌지 영역의 C-말단에 위치한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역 내에 위치하고, 즉, 중쇄 융합 폴리펩티드는 N'에서 C'으로, VH-CH1-힌지 N' 부분-사이토카인 모이어티-힌지 C' 부분-CH2-CH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역의 일부를 대체한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 임의의 힌지 아미노산의 결실 없이, 힌지 영역 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 40 내지 47 및 55 내지 59 중 어느 하나의 서열을 포함하는 힌지 영역 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 SEQ ID NO: 48, 49 및 54 중 어느 하나의 서열을 포함하는 N' 힌지 부분과 SEQ ID NO: 50 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하는 C' 힌지 부분 사이에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 N'에 융합된 펩티드 링커를 갖는 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 C'에 융합된 펩티드 링커를 갖는 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역 내에 삽입된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 힌지-사이토카인 부분은 N'에서 C'으로, 힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 힌지이며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 "EPKSC"(SEQ ID NO: 49)와 "DKTHT"(SEQ ID NO: 53) 사이에 삽입된다. 일부 실시형태에서, N' 펩티드 링커는 DKP(SEQ ID NO: 231) 또는 P(SEQ ID NO: 242)의 아미노산 서열을 포함한다. 그러므로, 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 추가로 도입된 "DKP"와 "DKTHT" 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시형태에서, N' 펩티드 링커는 DKPGS(SEQ ID NO: 232), PGS(SEQ ID NO: 233), 또는 GS(SEQ ID NO: 234)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N' 펩티드 링커는 DKPGSG(SEQ ID NO: 235), PGSG(SEQ ID NO: 236), 또는 GSG(SEQ ID NO: 203)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N' 펩티드 링커는 DKPGSGS(SEQ ID NO: 237), PGSGS(SEQ ID NO: 238), 또는 GSGS(SEQ ID NO: 239)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N' 펩티드 링커는 DKPGSGGGGG(SEQ ID NO: 240), PGSGGGGG(SEQ ID NO: 241), GSGGGGG(SEQ ID NO: 206)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2) 사이의 힌지 영역 내에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 N'에서 C'으로, 하기 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함한다: (1) VH-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (2) VL-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (3) VH-선택적인 링커-VL-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (4) VL-선택적인 링커-VH-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (5) VH-CH1-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (6) VH-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (7) VL-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (8) VH-선택적인 링커-VL-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (9) VL-선택적인 링커-VH-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (10) VH-CH1-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (11) 리간드-선택적인 링커-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; (12) 리간드-선택적인 링커-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2; (13) 수용체-선택적인 링커-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2-CH3; 또는 (14) 수용체-선택적인 링커-힌지 N' 부분-선택적인 N' 펩티드 링커-사이토카인 모이어티-선택적인 C' 펩티드 링커-힌지 C' 부분-CH2.
Fc 도메인
본원에 기재된 면역사이토카인은 C-말단에서 Fc 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. Fc 도메인은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 부분은 CH2 도메인을 포함한다(본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, Fc 도메인 부분은 CH3 도메인을 포함한다(본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다).
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 및 이의 하위유형 중 어느 하나로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CH2 및 CH3을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상)의 디술피드 결합을 통해 이량체화한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 전장 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 N-말단 절단된 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 N-말단에서 절단되며, 예를 들어, 완전한 면역글로불린 Fc 도메인의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산이 결여된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 SEQ ID NO: 60 내지 66 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
Fc 도메인을 통해, 면역사이토카인은 보체를 활성화시키고, Fc 수용체와 상호작용할 수 있다. 이 고유한 면역글로불린 특징은 면역사이토카인이 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 표적화될 수 있기 때문에 불리하게 여겨져 왔다. 또한, 특히 면역글로불린 융합 단백질의 긴 반감기와 함께, 사이토카인 방출을 야기하는 사이토카인 수용체와 Fc 수용체 신호전달 경로의 동시 활성화는, 전신 독성으로 인해 치료 환경에서 이들의 적용을 어렵게 만든다. 따라서, 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체(FcR)에 대한 변경된 결합, 구체적으로 Fcγ 수용체에 대한 변경된 결합 및/또는 변경된 이펙터 기능, 예컨대 변경된(예를 들어, 감소되거나 제거된) 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 조작된다.
Fc 도메인의 존재는 면역사이토카인의 반감기를 연장시키는 데 필수적이지만, 일부 상황에서는, Fc 도메인에 의한 Fc 수용체의 결합과 관련된 이펙터 기능을 제거하는 것이 유리할 것이다. 그러므로, 일부 실시형태에서, Fc 수용체에 대한 변경된 결합 및/또는 이펙터 기능은 감소된 결합 및/또는 이펙터 기능이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체(ADCC 담당)로의 Fc 도메인의 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 아미노산 돌연변이는 FcRn 수용체(반감기 담당)로의 결합을 감소시키지 않는다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 서브유닛은 SEQ ID NO: 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되며, 아미노산 치환 N295A를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG4로부터 유래되며, 힌지 영역에서 아미노산 치환 S228P 및 L235E를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되며, 힌지 영역에서 아미노산 치환 L234A 및 L235A("LALA")를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되며, 힌지 영역에 아미노산 치환 L234A 및 L235A, 및 예를 들어, 이의 서브유닛의 각각에 P329G를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Lo M. et al. J Biol Chem. 2017 Mar 3;292(9):3900-3908]; 문헌[Schlothauer T. et al. Protein Eng Des Sel. 2016 Oct;29(10):457-466]을 참조한다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인(예를 들어, 인간 IgG1), 즉, "이펙터 결여" 또는 "거의 이펙터 결여" Fc 도메인은 하나 이상의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 또는 CDC를 제거하도록 돌연변이된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 (예컨대, 이의 서브유닛의 각각에) 하기의 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 이펙터 결여 IgG1 Fc이다: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S. IgG1에서의 K322A, L234A 및 L235A의 조합은 FcγR 및 C1q 결합을 거의 완전히 폐지하는 데 충분하다(문헌[Hezareh et al. J Virol 75, 12161-12168, 2001]). 메드이뮨(MedImmune)은 3개의 돌연변이 L234F/L235E/P331S의 세트가 매우 유사한 효과를 갖는 것을 확인하였다(문헌[Oganesyan et al., Acta Crystallographica 64, 700-704, 2008]). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 최적의 FcR 상호작용에 필요한 것으로 알려져 있는 IgG1 Fc 도메인의 N297 상의 글리코실화의 변형을 포함한다. Fc 도메인 변형은 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Wang et al. ("IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions," Protein Cell. 2018 Jan; 9(1): 63-73)]에 언급된 임의의 적합한 IgG Fc 조작일 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄(동일한 Fc 서브유닛)를 포함한다. 이러한 Fc 도메인은 또한, 본원에서 "동종이량체 Fc 도메인"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 동종이량체 Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 SEQ ID NO: 60 및 63 내지 66 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 2개의 비-동일한 폴리펩티드 쇄의 이종이량체화를 촉진시키는 변형을 포함한다. 이러한 Fc 도메인은 또한 본원에서 "이종이량체 Fc 도메인"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나에 노브 변형 및 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 홀 변형을 포함하는 노브-인투-홀(KIH) 변형을 포함한다. 임의의 적합한 노브-인투-홀 변형, 예컨대 제1 CH3 도메인의 가닥 B에서 T22>Y(노브 생성) 및 파트너 CH3 도메인의 가닥 E에서 Y86>T(홀 생성)의 아미노산 변경은 본원에 기재된 면역사이토카인에 적용될 수 있다. 또한, 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US20200087414호를 참조한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 하나의 서브유닛은 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 야생형 인간 IgG1 Fc에 비하여 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V 돌연변이 중 하나 이상을 포함하며, Fc 도메인의 다른 서브유닛은 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 야생형 인간 IgG1 Fc에 비하여 T350V, T366L, N390R, K392M, T394W 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인의 하나의 서브유닛은 SEQ ID NO: 61의 서열을 포함하며, Fc 도메인의 다른 서브유닛은 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2017134140호에 기재된 바와 같은 단일 쇄 Fc 도메인이다.
링커
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 내에서, 탠덤으로 연결된 2개 이상의 항원-결합 단편, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 사이토카인 모이어티, CH1 도메인과 사이토카인 모이어티, 탠덤으로 연결된 2개 이상의 사이토카인 모이어티, 탠덤으로 연결된 사이토카인 또는 이의 변이체의 2개 이상의 서브유닛, 사이토카인 모이어티와 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분, 힌지 영역과 CH1 도메인, 힌지 영역과 CH2 도메인, 힌지 영역과 사이토카인 모이어티, Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분과 항원-결합 단편, 및/또는 CH1 도메인과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이는 하나 이상의 선택적인 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 비-펩티드 링커)를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 동일하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 상이하다(예를 들어, 서로 상이하다). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 유연성 링커이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 안정한 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커의 일부는 유연성인 한편, 다른 것들은 안정하다. 일반적으로, 링커는 면역사이토카인의 입체배치에 의해 형성되는 적절한 접힘 및 입체형태에 영향을 미치지 않거나, 유의미하게 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, 링커는 면역사이토카인의 각각의 부분에 유연성 및 공간적 간격(spatial space)을 부여하며, 예컨대 표적 항원-항원 결합 단편을 가능하게 하고, 리간드-수용체 결합을 가능하게 하여, 표적 항원-항체(또는 리간드-수용체) 결합의 부재 하에 사이토카인 활성을 차폐시키는 한편, 표적 항원-항체(또는 리간드-수용체) 결합의 존재 하에 사이토카인 활성을 탈차폐시키고, 2개의 사이토카인 서브유닛 또는 2개의 사이토카인 모이어티 사이에 유연성 및/또는 충분한 공간을 제공하여, 적절한 사이토카인 활성(결합 친화성 및/또는 생물활성) 등을 보장한다.
링커는 임의의 길이의 펩티드 링커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 약 1개 아미노산(aa) 내지 약 10개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 15개 aa 길이, 약 3개 aa 내지 약 12개 aa 길이, 약 4개 aa 내지 약 10개 aa 길이, 약 5개 aa 내지 약 9개 aa 길이, 약 6개 aa 내지 약 8개 aa 길이, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 aa 길이, 약 21개 aa 내지 약 30개 aa 길이, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 20개 aa 길이, 약 10개 aa 내지 약 30개 aa 길이, 약 1개 아미노산 내지 약 50개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 19개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 18개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 17개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 16개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 10개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 14개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 13개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 12개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 11개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 9개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 8개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 7개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 6개 aa 길이, 약 2개 aa 내지 약 5개 aa 길이, 또는 약 6개 aa 내지 약 30개 aa 길이이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 약 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 약 20개 아미노산 길이이다.
펩티드 링커는 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열은 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제WO1996/34103호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 또는 이의 부분이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 돌연변이된 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 또는 이의 부분이다. 일부 실시형태에서, 링커는 유연성 링커이다. 예시적인 유연성 링커는 글리신 폴리머(G)n(SEQ ID NO: 194), 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n(SEQ ID NO: 195), (GGS)n(SEQ ID NO: 196), (GGGS)n(SEQ ID NO: 197), (GGS)n(GGGS)n(SEQ ID NO: 198), (GSGGS)n(SEQ ID NO: 199), (GGSGS)n(SEQ ID NO: 200) 또는 (GGGGS)n(SEQ ID NO: 201) 포함, n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머 및 당업계에 알려져 있는 기타 유연성 링커를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 비구조화되며, 이에 따라, 성분 간의 중성 테더(tether)로서 역할을 할 수 있을 가능성이 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 유의미하게 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992)] 참조). 예시적인 유연성 링커는 GG(SEQ ID NO: 202), GSG(SEQ ID NO: 203), GGSG(SEQ ID NO: 204), GGSGG(SEQ ID NO: 205), GSGGGGG(SEQ ID NO: 206), GSGSG(SEQ ID NO: 207), GSGGG(SEQ ID NO: 208), GGGSG(SEQ ID NO: 209), GSSSG(SEQ ID NO: 210), GGSGGS(SEQ ID NO: 211), SGGGGS(SEQ ID NO: 212), GGGGS(SEQ ID NO: 213), (GA)n(SEQ ID NO: 214, n은 적어도 1의 정수임), GRAGGGGAGGGG(SEQ ID NO: 215), GRAGGG(SEQ ID NO: 216), GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 217), GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 218), GGGSGGSGGS(SEQ ID NO: 219), GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO: 220), GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 221), GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO: 222), GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 229), GGGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO: 223), GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 224), KTGGGSGGGS(SEQ ID NO: 225), GGPGGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 226), GGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 227), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO: 228) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 링커는 ASTKGP(SEQ ID NO: 230)의 서열을 포함한다. 당업자는 면역사이토카인의 설계가 전부 또는 부분적으로 유연성인 링커를 포함할 수 있어서, 링커가 유연성 링커 부분 및 덜 유연성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함하여, 원하는 면역사이토카인 구조 및 기능(예를 들어, 표적 항원-항체 결합의 부재 하에 사이토카인 활성을 차폐시키면서, 표적 항원-항체 결합의 존재 하에 사이토카인 활성을 탈차폐시키거나; 2개의 사이토카인 서브유닛 사이에 유연성 및/또는 충분한 공간을 제공하여, 적절한 사이토카인 활성(결합 친화성 및/또는 생물활성)을 보장하는 것)을 제공할 수 있게 하는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 세린-글리신으로 농축된다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 194 내지 242 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다(또는 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 사이토카인 모이어티는 링커, 예컨대 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나의 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된 2개의 사이토카인 서브유닛(야생형 또는 돌연변이체)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 안정한 링커이다(예를 들어, 프로테아제, 특히 MMP에 의해 절단 가능하지 않다).
본원에 기재된 링커 중 어느 하나 또는 전부는 성분 또는 단편이 이들의 각각의 활성, 즉, 사이토카인 수용체로의 결합, 표적 항원(들)으로의 결합, 리간드 또는 수용체로의 결합, FcR로의 결합, 또는 ADCC를 보유하는 한, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab)과 힌지 영역, 힌지 영역과 사이토카인 모이어티, CH1 도메인과 사이토카인 모이어티, 탠덤으로 연결된 사이토카인 모이어티, 사이토카인 모이어티와 Fc 도메인 서브유닛, 2개의 사이토카인 서브유닛 사이, 항원-결합 단편 사이, 항원 결합 단편과 사이토카인 모이어티 사이, 항원-결합 단편과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분 사이, 및/또는 CH1 도메인과 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 연결할 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이 연결은 많은 화학적 메카니즘, 예를 들어, 공유 결합, 친화성 결합, 인터칼레이션, 배위 결합 및 복합체화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접적인 축합에 의해 또는 외부 가교 분자의 혼입에 의해 달성될 수 있다. 많은 2가 또는 다가 연결제가 단백질 분자를 커플링시키는 데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제는 유기 화합물, 예컨대 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민을 포함할 수 있다. 이 목록은 당업계에 공지된 다양한 부류의 커플링제를 총망라한 것으로 의도되지 않으며, 오히려, 보다 통상적인 커플링제의 예시이다(문헌[Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; 문헌[Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)]; 및 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조).
본 출원에 적용될 수 있는 링커는 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)의 사용을 기재한 문헌[Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 일부 실시형태에서, 본원에 사용된 비-펩티드 링커는 (i) EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT(4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chem. Co.), 카탈로그(21558G); (iii) SPDP(숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트(피어스 케미컬 컴퍼니 카탈로그 #21651G); (iv) 술포-LC-SPDP(술포숙신이미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드] 헥사노에이트(피어스 케미컬 컴퍼니, 카탈로그 #2165-G); 및 (v) EDC에 컨쥬게이트된 술포-NHS(N-하이드록시술포-숙신이미드: 피어스 케미컬 컴퍼니, 카탈로그 #24510)를 포함한다.
상기 기재된 링커는 상이한 속성을 갖는 성분을 함유하여, 이에 따라, 상이한 물리화학적 특성을 갖는 면역사이토카인을 야기할 수 있다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 술포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 술포-NHS 에스테르보다 더 안정하다. NHS-에스테르 함유 링커는 술포-NHS 에스테르보다 덜 가용성이다. 추가로, 링커 SMPT는 입체 장애 디술피드 결합을 함유하고, 증가된 안정성을 갖는 융합 단백질을 형성할 수 있다. 디술피드 연결은 시험관내에서 절단되기 때문에, 디술피드 연결은 일반적으로 다른 연결보다 덜 안정하여, 더 적은 융합 단백질을 이용 가능하게 한다. 술포-NHS는 특히 카보디이미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카보디이미드 커플링(예컨대 EDC)은, 술포-NHS와 함께 사용되는 경우에, 단독의 카보디이미드 커플링 반응보다 가수분해에 대해 더 저항성인 에스테르를 형성한다.
다른 링커 고려사항은 생성된 면역사이토카인의 물리적 또는 약동학적 특성, 예컨대 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성(다소 안정할 뿐만 아니라 계획된 분해), 강성, 유연성, 면역원성, 사이토카인 모이어티/사이토카인 수용체 결합의 조정, 항원-결합 도메인/표적 항원 결합의 조정, 리간드-수용체 결합의 조정, 미셀 또는 리포솜 내로 혼입되는 능력 등에 대한 효과를 포함한다.
면역사이토카인 변이체
글리코실화 변이체
일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 작제물이 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. Fc 도메인에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
포유동물 세포에 의해 생성되는 고유 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297로의 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 이중안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 이중안테나 올리고당 구조의 "스템(stem)"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인 내의 올리고당의 변형은 소정의 개선된 특성을 생성하도록 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 본원에 기재된 면역사이토카인이 제공된다. 예를 들어, 이러한 면역사이토카인에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량분광법에 의해 측정된 바와 같이, Asn 297에 부착된 모든 당구조(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조)의 합과 비교하여 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 도메인 내의 위치 약 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 미소한 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제US 2003/0157108호(Presta, L.); 제US 2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는 하기를 포함한다: 제US 2003/0157108호; 제WO 2000/61739호; 제WO 2001/29246호; 제US 2003/0115614호; 제US 2002/0164328호; 제US 2004/0093621호; 제US 2004/0132140호; 제US 2004/0110704호; 제US 2004/0110282호; 제US 2004/0109865호; 제WO 2003/085119호; 제WO 2003/084570호; 제WO 2005/035586호; 제WO 2005/035778호; 제WO2005/053742호; 제WO2002/031140호; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호, Presta, L; 및 제WO 2004/056312 A1호, Adams 등, 특히 실시예 11) 및 낙아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 낙아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 제WO2003/085107호 참조)를 포함한다.
이펙터 기능 변이체
일부 실시형태에서, 본 출원은 전부는 아니지만 일부 Fc 이펙터 기능을 보유하는 면역사이토카인을 고려하며, 이는 면역사이토카인의 생체내 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예컨대 CDC 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 바람직한 후보가 되게 한다. Fc 도메인 변이체의 일부는 상기에 논의되었다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정을 행하여, 항체가 FcγR 결합을 결여하지만(따라서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있지만), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464페이지의 표 2에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다(예를 들어, 유세포측정법을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지, 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 생체내에서, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 제WO 2006/029879호 및 제WO 2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정이 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc 도메인은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서의 치환을 포함하며, 이는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호). FcR로의 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; 제WO 2004/056312호 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, 제WO 99/51642호 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 CDC를 초래하는 변경이 Fc 도메인에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 반감기를 증가시키고/시키거나 신생아 Fc 수용체(FcRn)로의 결합을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 증가된 반감기 및 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])는 제US2005/0014934A1호(Hinton 등)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn으로의 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제7,371,826호).
또한, Fc 도메인 변이체의 다른 예에 관해서는 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 제WO 94/29351호를 참조한다.
시스테인 조작된 변이체
일부 실시형태에서, 면역사이토카인의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 면역사이토카인, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 실시형태들에서, 치환된 잔기는 면역사이토카인의 접근 가능한 부위에 존재한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 이에 의해, 반응성 티올 기가 면역사이토카인의 접근 가능한 부위에 위치하고, 이를 사용하여 면역사이토카인을 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 컨쥬게이트시켜, 면역사이토카인-컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하기 잔기 중 어느 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 도메인의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 면역사이토카인은 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
면역사이토카인 유도체
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 면역사이토카인은 추가의 치료적 화합물, 예컨대 당업계에 알려져 있는 임의의 치료적 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 부모 항체는 일부 실시형태에서, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)일 수 있다. 예를 들어, 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Shim H. (Biomolecules. 2020 Mar; 10(3): 360)] 및 문헌[Diamantis N. and Banerji U. Br J Cancer. 2016; 114(4): 362-367]에 기재된 임의의 ADC를 참조한다. 일부 실시형태에서, 치료적 화합물은 Fc 도메인 또는 이의 부분에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태에서, 치료적 화합물은 세포독성제, 화학치료제, 성장 저해제 또는 항생제이다.
일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 발색단, 형광단(예를 들어, 쿠마린, 잔텐, 시아닌, 피렌, 보라폴리아자인다센, 옥사진 및 이의 유도체), 형광 단백질(예를 들어, GFP, 피코빌리단백질 및 이의 유도체), 인광 염료(예를 들어, 디옥세탄, 잔텐 또는 카보시아닌 염료, 란타니드 킬레이트), 탠덤 염료(예를 들어, 시아닌-피코빌리단백질 유도체 및 잔텐-피코빌리단백질 유도체), 입자(예를 들어, 금 클러스터, 콜로이드성 금, 미소구체, 양자점), 합텐, 효소(예를 들어, 과산화효소, 포스파타제, 글리코시다제, 루시퍼라제) 및 방사성 동위원소(예를 들어, 125I, 3H, 14C, 32P)로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지를 추가로 포함한다.
III. 면역사이토카인을 인코딩하는 벡터
본 발명은 또한, 본원에 기재된 면역사이토카인(예를 들어, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, 또는 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인) 중 어느 하나를 인코딩하는 단리된 핵산, 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포, COS 세포)가 제공된다.
따라서, 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 항원-결합 단백질은 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 예컨대 PD-L2, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4, 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 항체는 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 항체는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인의 각각의 폴리펩티드는 단일의 단리된 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 하나의 단리된 핵산은 면역사이토카인의 2개 이상의 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포, COS 세포)에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 많은 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종 핵산은 벡터 내로 삽입되고 당업계에 알려진 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 단리하고 시험관내 또는 생체외에서 조작된 포유동물 세포로 전달할 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 많은 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 면역사이토카인 코딩 서열(들)을 운반하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 프로토콜을 사용하여 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 포유동물 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 이들이 전이유전자의 장기적인 안정한 통합 및 자손 세포에서의 이의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 갖고, 비-증식 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty; SB) 트랜스포존 시스템 또는 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 시스템이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어, 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA) 및 폴리 락트산(PLA), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 및 덴드리머를 포함하는 폴리머-기반의 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 양이온성-지질 기반의 비-바이러스 벡터, 예컨대, 양이온성 리포솜, 지질 나노에멀젼 및 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 펩티드-기반의 유전자 비-바이러스 벡터, 예컨대, 폴리-L-라이신이다. 게놈 편집에 적합한 알려져 있는 비-바이러스 벡터 중 임의의 것은 면역사이토카인-인코딩 핵산(들)을 숙주 세포로 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555]; 문헌[Aronovich EL et al. "The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20]; 및 문헌[Zhao S. et al. "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125]을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산 또는 벡터 중 어느 하나 이상은 전기천공법, 초음파천공법, 광천공법, 마그네토펙션(magnetofection), 하이드로포레이션(hydroporation)을 비제한적으로 포함하는 물리적 방법에 의해 숙주 세포(예를 들어, CHO, HEK 293, Hela 또는 COS)에 도입된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 통해 트랜스펙션된 숙주 세포의 모집단으로부터 본원에 기재된 면역사이토카인을 발현하는 세포를 선택하도록, 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유한다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 적절한 조절 서열로 측접하여, 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산 중 어느 하나를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 사용하는 것을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 탐색되었으며, 당업계에 알려진 프로모터 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 프로모터는 구성성 프로모터 또는 조절성 프로모터, 예컨대, 유도성 프로모터로서 대략적으로 범주화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산은 구성성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성성 프로모터는 이종 유전자(전이유전자로도 또한 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 한다. 본원에 고려되는 예시적인 프로모터는 거대세포바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 인간 연장 인자-1 알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 β-액틴 프로모터(CAGG), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제(MC1) 프로모터, 베타 액틴(β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND)" 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 전이유전자 발현의 유도에서의 이러한 구성성 프로모터의 효율은 수많은 연구에서 널리 비교되었다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산은 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절형 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 하나 이상의 조건, 예컨대, 물리적 조건, 숙주 세포의 미세환경, 또는 숙주 세포의 생리학적 상태, 유도제(즉, 유도 작용제) 또는 이의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 숙주 세포에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유도제, 조사(예컨대, 이온화 방사선, 광), 온도(예컨대, 열), 숙주 세포의 산화환원 상태 및 활성화 상태. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 또는 NFκB 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터는 tet-유도성 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 본원에 기재된 면역사이토카인, 예를 들어, 면역사이토카인의 상이한 폴리펩티드를 인코딩하는 1개 초과의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 벡터는 본원에 기재된 면역사이토카인의 2개의 폴리펩티드를 인코딩하는 2개의 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 벡터에서 동일한 프로모터 하에 작동 가능하게 조절된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산은 연결 서열(예를 들어, IRES) 또는 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A를 인코딩하는 핵산 서열을 통해 탠덤으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인의 2개 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 폴리펩티드 인코딩 서열 사이에 연결 서열(들)(예를 들어, IRES) 또는 자가-절단 2A 펩티드(들)(예컨대 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A)를 인코딩하는 핵산 서열(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 벡터 내의 개별 프로모터 하에서 작동 가능하게 조절된다. 일부 실시형태에서, 각각의 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 상이하다. 일부 실시형태에서, 각각의 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 동일하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인은 2개 이상의 벡터에 의해 인코딩되며, 예를 들어, 각각의 벡터는 하나의 중쇄(또는 VH 및 사이토카인 모이어티를 포함하는 하나의 폴리펩티드) 및 하나의 쌍형성 경쇄를 인코딩하거나, 각각의 벡터는 면역사이토카인의 하나의 폴리펩티드를 인코딩한다.
IV. 제조 방법
또한, 본원에 기재된 면역사이토카인(예를 들어, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, 또는 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인) 중 어느 하나의 제조 방법이 제공된다. 따라서, 일부 실시형태에서, (a) 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산 또는 벡터 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 293 세포, Hela 세포 또는 COS 세포)를 인코딩된 면역사이토카인을 발현하기에 유효한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 면역사이토카인을 수득하는 단계를 포함하는 면역사이토카인의 생성 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)의 방법은 본원에 기재된 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 면역사이토카인은 당업계에 알려져 있거나 본원에 기재된 바와 같은 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 예시적인 방법에 대하여 실시예 1, 4, 5, 7, 9, 10 및 12를 참조한다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포를 사용하여 발현된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인은 원핵 세포를 사용하여 발현된다.
1. 원핵 세포에서의 재조합 생성
a) 벡터 작제
본 출원의 면역사이토카인을 인코딩하는 다중핵산 서열은 표준 재조합 기법을 사용하여 수득될 수 있다. 원하는 다중핵산 서열을 항체 또는 면역사이토카인 생성 세포, 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리하고 서열분석할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기법을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 일단 수득하면, 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 당업계에서 이용 가능하고 알려져 있는 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위하여 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환시킬 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 이의 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 이것이 잔류하는 특정 숙주 세포와의 양립 가능성에 따라, 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 원점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 인코딩하는 유전자를 함유하며, 이에 따라, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나, 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 제5,648,237호(Carter 등)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 양립 가능한 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대 GEM™-11은 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 출원의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 둘 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론의 발현을 조절하는, 시스트론의 상류(5')에 위치한 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2가지 부류, 유도성 및 구성성으로 나뉜다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도 변화에 반응하여 이의 제어 하의 시스트론의 증가된 전사 수준을 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 본 출원의 벡터 내로 삽입함으로써, 폴리펩티드를 인코딩하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 고유 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 둘 모두를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 프로모터가 이용되는데, 이는 이들이 일반적으로 고유 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 더 많은 전사 및 더 높은 수율을 가능하게 하기 때문이다.
원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아에서 기능성인 다른 프로모터(예컨대 다른 알려져 있는 박테리아 또는 파지 프로모터)도 또한 적합하다. 이들의 핵산 서열이 공개되었으며, 이에 의해 숙련자는 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 시스트론(문헌[Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269])에 이들이 작동 가능하게 라이게이션되게 한다.
일부 실시형태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 가로지르는 발현된 폴리펩티드의 전위를 유도하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 고유한 신호 서열을 인식 및 가공하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열로 치환된다. 본 출원의 일부 실시형태에서, 발현 시스템의 둘 모두의 시스트론에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 면역사이토카인의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 성분은 발현되고, 폴딩되고, 어셈블되어, 세포질 내에서 면역사이토카인(또는 면역사이토카인의 부분)을 형성한다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 가능하게 한다. 문헌[Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)]을 참조한다.
본 발명은 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적 비를 조절하여, 분비되고 적절하게 어셈블된 본 출원의 면역사이토카인의 수율을 최대화할 수 있는 발현 시스템을 제공한다. 이러한 조절은 적어도 부분적으로 폴리펩티드 성분에 대한 번역 세기를 동시에 조절함으로써 달성된다. 번역 세기를 조절하기 위한 하나의 기법은 미국 특허 제5,840,523호(Simmons 등)에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 영역(TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR에 대해, 다양한 번역 세기를 갖는 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체를 생성하고, 이에 의해 이 인자를 특정 쇄의 원하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이유발 기법에 의해 생성될 수 있지만, 핵산 서열의 침묵 변화가 바람직하다. TIR의 변경은, 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께, 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이 신호 서열을 생성하는 하나의 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변경시키지 않는(즉, 변경이 침묵인) 코딩 서열의 시작부에서의 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변경시킴으로써 달성될 수 있으며; 추가적으로 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 뱅크를 제조하는 데 있어서 복잡성을 부가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이 돌연변이유발 방법은 문헌[Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게는, 내부에 각각의 시스트론에 대한 다양한 TIR 세기를 갖는 벡터의 세트를 생성한다. 이 제한된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 세기 조합 하에서 원하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 세기는 미국 특허 제5,840,523호(Simmons 등)에 상세히 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 결정할 수 있다. 번역 세기 비교에 기초하여, 원하는 개별 TIR은 본 출원의 발현 벡터 작제물에서 조합되도록 선택된다.
b) 원핵 숙주 세포
본 출원의 면역사이토카인의 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리키아(Escherichia)(예를 들어, 이. 콜라이), 바실러스(Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종(예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라, 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 일부 실시형태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명을 위해 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110(문헌[Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 이의 유도체, 유전자형 W3110 AfhuA(AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3을 포함한다(미국 특허 제5,639,635호). 다른 균주 및 이의 유도체, 예컨대 이. 콜라이 294(ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 1776(ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308(ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이러한 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 박테리아의 유도체를 작제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 알려져 있는 플라스미드가 레플리콘을 공급하는 데 사용된 경우에는, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다.
전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 저해제가 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
c) 단백질 생성
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합물에 의해 복제 가능하도록 DNA를 원핵 숙주에 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기법을 이용하여 행해진다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포 벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 대해 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기법은 전기천공법이다.
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합물에 의해 복제 가능하도록 DNA를 원핵 숙주에 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기법을 이용하여 행해진다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포 벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포를 위해 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기법은 전기천공법이다.
본 출원의 면역사이토카인을 생성하는 데 사용되는 원핵 세포를, 당업계에 공지되어 있는, 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 첨가된 루리아 브로쓰(LB)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하도록, 발현 벡터의 작제에 기초하여 선택된 선택 작용제를 함유한다. 예를 들어, 앰피실린은 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다. 원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장의 경우, 예를 들어, 바람직한 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 39℃, 더욱 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 더더욱 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이의 경우, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 출원의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 출원의 일 양태에서, PhoA 프로모터는 폴리펩티드의 전사의 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P. 배지이다(예를 들어, 문헌[Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
본 출원의 발현된 면역사이토카인은 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 삼투 충격, 초음파분해 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 조각(debris) 또는 전세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질을, 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지 내로 수송되고, 그 안에서 단리될 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양물 상청액을 여과하고 농축시켜 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리하고 확인할 수 있다.
대안적으로, 단백질 생성은 발효 프로세스에 의해 대량으로 행해진다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 재조합 단백질의 생성에 이용 가능하다. 대규모 발효는 적어도 1,000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양분, 특히 글루코스(바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 부피 용량이 대략 100 리터 이하이고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있는 발효기 내에서의 발효를 지칭한다.
발효 프로세스 동안, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 원하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지기에 있다. 당업계에 알려져 있고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.
본 출원의 면역사이토카인의 생성 수율 및 질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 폴리펩티드의 적절한 어셈블리 및 폴딩을 개선시키기 위해, 샤페론 단백질, 예컨대 Dsb 단백질(DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 또는 DsbG) 또는 FkpA(샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시-형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌[Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605]; 미국 특허 제6,083,715호(Georgiou 등); 미국 특허 제6,027,888호(Georgiou 등); 문헌[Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; 문헌[Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; 문헌[Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현된 이종 단백질(특히, 단백질분해에 감수성인 단백질)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 공지된 박테리아 프로테아제, 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 조합을 인코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 시행하기 위하여 숙주 세포 균주를 변형시킬 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용 가능하고, 예를 들어, 상기 문헌[Joly et al. (1998)]; 미국 특허 제5,264,365호(Georgiou 등); 미국 특허 제5,508,192호(Georgiou 등); 문헌[Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 출원의 면역사이토카인을 인코딩하는 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
d) 단백질 정제
추가의 검정 및 사용을 위한 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 본원에서 생성된 면역사이토카인을 추가로 정제한다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.
일부 실시형태에서, 고체상에 고정화된 단백질 A는 본 출원의 Fc 영역을 포함하는 면역사이토카인의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 Fc-함유 작제물, 예를 들어, 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 본원에 기재된 항체 또는 면역사이토카인에 높은 친화성으로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 42 kDa 표면 단백질이다. 문헌[Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정화된 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 더욱 바람직하게는 조절 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이다. 일부 적용에서는, 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도로, 컬럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅한다. 이어서, 고체상을 세척하여, 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 마지막으로, 관심 면역사이토카인을 용리에 의해 고체상으로부터 회수한다.
2. 진핵 세포에서의 재조합 생성
진핵 발현을 위하여, 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자 및 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
a) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 인코딩하는 삽입물일 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공된다(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨). 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용 가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA를 리딩 프레임 내에서 본 출원의 면역사이토카인을 인코딩하는 DNA에 라이게이션시킨다.
b) 복제 원점
일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다(SV40 원점은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).
c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 가능한 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다(예를 들어, 유전자는 바실러스에 있어서, D-알라닌 라세마제를 인코딩한다).
선택 계획의 일 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포를 위한 적합한 선택 가능 마커의 또 다른 예는 본 출원의 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 흡수하기에 적격한 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저, 형질전환체 모두를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우에 적절한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 폴리펩티드 인코딩-DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택 가능한 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)로 형질전환되거나, 동시-형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 가능한 마커, 예컨대 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 선택 작용제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상 숙주 유기체에 의해 인식되고 원하는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 사실상 모든 진핵 유전자는, 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단으로의 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 서열 모두는 진핵 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 또한, 상기 "III. 면역사이토카인을 인코딩하는 벡터" 하의 "프로모터" 하위섹션을 참조한다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 폴리펩티드 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 및 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되되, 단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립 가능하다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스 유래의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하의 마우스 세포에서의 인간-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌[Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 또한 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.
e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 본 출원의 면역사이토카인을 인코딩하는 DNA의 전사는 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스 유래의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 원점의 후기 측(100 내지 270 bp) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 향상 요소에 대해서는 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 또한 참조한다. 인핸서는 폴리펩티드 인코딩 서열에 대하여 5' 또는 3'의 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'의 부위에 위치한다.
f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체 유래의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한, 전사의 종결 및 mRNA의 안정화를 위해 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용 가능하다. 이들 영역은 폴리펩티드-인코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 제WO94/11026호 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하는 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 지대 세포(sertoli cell)(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주(Hep G2)가 있다.
숙주 세포를 면역사이토카인 생성을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
h) 숙주 세포의 배양
본 출원의 면역사이토카인을 생성하는 데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 배지, 예컨대 햄스(Ham's) F10(시그마(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (시그마), RPMI-1640(시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지((DMEM), 시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 추가로, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], 문헌[Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; 제WO 90/03430호; 제WO 87/00195호; 또는 미국 특허 Re. 30,985호에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대 HEPES), 뉴클레오티드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 당업자에게 공지되어 있을 적절한 농도로도 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 분명할 것이다.
i) 단백질 정제
재조합 기법을 사용할 때, 면역사이토카인은 세포내에서, 주변세포질 공간 내에서 생성되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 면역사이토카인이 세포내에서 생성되는 경우에, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미립자 조각을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 기재되어 있다. 요약하여, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 조각을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 면역사이토카인이 배지 내로 분비되는 경우에, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 일반적으로, 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 미공 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 저해제, 예컨대 PMSF를 상기 단계들 중 어느 단계에 포함시켜 단백질분해를 저해할 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지할 수 있다.
세포로부터 제조된 단백질 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 면역사이토카인에 존재하는 임의의 면역사이토카인 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 따라 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 1, 2 또는 4개의 중쇄를 함유하는 인간 면역글로불린에 기초한 면역사이토카인, 항원-결합 단편-Fc 융합 단백질 또는 항체를 정제할 수 있다(문헌[Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G가 모든 마우스 아이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다(문헌[Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용 가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌-디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 면역사이토카인이 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABXTM 수지(제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수될 면역사이토카인에 따라, 다른 단백질 정제 기법, 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전도 또한 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 면역사이토카인 및 오염물을 포함하는 혼합물을, 바람직하게는 저염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행되는, pH 약 2.5 내지 4.5의 용리 완충제를 사용한 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거칠 수 있다.
V. 약제학적 조성물
본원에 기재된 면역사이토카인(예를 들어, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, 또는 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인) 중 어느 하나 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다. 원하는 순도를 갖는 본원에 기재된 면역사이토카인을 선택적인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 약제학적 조성물이 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 또한, 본원에 기재된 면역사이토카인 중 어느 하나 또는 이의 약제학적 조성물을 포함하는 암 백신이 제공된다.
재구성된 제형은 동결건조된 본원에 기재된 면역사이토카인을 희석제 중에 용해시켜, 단백질이 도처에 분산되도록 함으로써 제조될 수 있다. 본 출원에 사용하기에 적합한 예시적인 약제학적으로 허용 가능한(인간으로의 투여에 안전하고 비독성인) 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 덱스트로스 용액, 또는 염의 수용액 및/또는 완충제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 균질한 모집단의 본원에 기재된 면역사이토카인을 포함한다. 균질한 모집단은 면역사이토카인이 서로 정확하게 동일한 것, 예를 들어, 동일한 면역사이토카인 입체배치, 동일한 사이토카인 모이어티, 동일한 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 Fab), 존재한다면 동일한 링커, 동일한 힌지 영역 및 동일한 Fc 도메인을 의미한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 내의 면역사이토카인의 적어도 약 70%(예컨대, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)는 균질하다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 안정할 것이며, 본원에서 면역사이토카인은 본질적으로 보관시 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 온전성을 보유한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법은 당업계에서 이용 가능하고, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 문헌[Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 신속한 스크리닝을 위하여, 제형은 2주 내지 1개월 동안 40℃로 유지될 수 있고, 이 시간에 안정성을 측정한다. 제형이 2 내지 8℃로 보관될 경우, 일반적으로 제형은 적어도 1개월 동안 30℃ 또는 40℃에서 안정해야 하고/하거나, 적어도 2년 동안 2 내지 8℃에서 안정해야 한다. 제형이 30℃로 보관될 경우, 일반적으로 제형은 적어도 2년 동안 30℃에서 안정해야 하고/하거나, 적어도 6개월 동안 40℃에서 안정해야 한다. 예를 들어, 보관 동안 응집의 정도는 단백질 안정성의 지표로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재된 면역사이토카인의 안정한 제형은 제형에서 응집물로서 존재하는 약 10% 미만(바람직하게는 약 5% 미만)의 면역사이토카인을 포함할 수 있다.
허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이고, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 나트륨 메타바이술파이트를 포함하는 산화방지제; 보존제, 등장제(예를 들어, 염화나트륨), 안정화제, 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
완충제는, 특히 안정성이 pH 의존적이면, 치료 유효성을 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는 데 사용된다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 출원에 사용하기 위한 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 둘 모두 및 이의 염을 포함한다(예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트). 추가적으로, 완충제는 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예컨대 트리스(Tris)를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되고, 전형적으로 0.2% 내지 1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다회-이용(다중 용량) 제형의 생성을 용이하게 할 수 있다. 본 출원에서 이용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 벤즈에토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
때때로 "안정화제"로 알려져 있는 등장화제는 조성물에서 액체의 장성을 조정 또는 유지하기 위해 존재한다. 큰, 하전된 생물분자, 예컨대 단백질 및 항체와 사용된 경우, 이들은 종종 "안정화제"로 지칭되며, 이는 이들이 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하여, 이에 의해 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 가능성을 경감시킬 수 있기 때문이다. 등장화제는, 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 중량 기준 0.1% 내지 25%, 바람직하게는 1% 내지 5%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가의 부형제는 하기 중 하나 이상으로서 역할을 할 수 있는 작용제를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정화제 및 (4) 및 용기 벽에 대한 부착 또는 변성을 예방하는 작용제. 이러한 부형제는 하기를 포함한다: (상기 열거된) 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등; 유기 당류(organic sugar) 또는 당 알코올, 예컨대 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이노시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들면, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 술페이트; 저분자량 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소과 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류(예를 들면, 자일로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류(예를 들면, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란.
비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 공지됨)는 면역사이토카인의 가용화를 돕기 위해 뿐만 아니라 진탕 유도된 응집에 대해 면역사이토카인을 보호하기 위해 존재하고, 이는 또한 활성 면역사이토카인의 변성 유발 없이 전단 표면 스트레스에 제형이 노출되도록 한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재한다.
적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴록사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로매크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다.
약제학적 조성물이 생체내 투여에 사용되도록 하기 위해, 이들은 멸균이어야 한다. 약제학적 조성물은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 멸균되게 할 수 있다. 본원에서 약제학적 조성물을 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주입 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치한다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 매트릭스가 형상화된 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태인, 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함한다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
본원의 약제학적 조성물은 또한 치료 중인 특정 적응증에 대하여 필요에 따라 1가지 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 가진 것들을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 세포독성제, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제 또는 성장 저해제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서, 각각 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition]에 개시된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단회-이용 바이알, 예컨대 단회-이용 밀봉 바이알에 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다회-이용 바이알에 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 용기에서 벌크로 함유된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결보존된다.
VI. 질병의 치료 또는 사이토카인 활성의 유도 방법
본원에 기재된 면역사이토카인(예를 들어, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, 또는 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인) 및 이의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 다양한 응용, 예컨대 진단, 분자적 검정 및 치료법에 대하여 유용하다. 일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 임의의 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 질병(예를 들어, 암, 감염, 예컨대 바이러스 감염, 자가면역 질병, 알레르기, 이식편 거부 또는 GvHD)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 또한, 유효량의 본원에 기재된 임의의 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간) 내의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)의 활성의 선택적인 활성화 방법이 제공되며, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 면역사이토카인의 결합 시에 선택적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 개체는 암에 대하여 본원에 기재된 임의의 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물로 이전에 치료되었으며, 치료는 개체에서 암 재발을 예방하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 개체가 이전에 암을 가졌든지 그렇지 않든지, 또는 본원에 기재된 면역사이토카인에 의해 치료된 적이 있든지, 그렇지 않든지와 관계 없이, 개체에서 암을 예방하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 또한, 유효량의 본원에 기재된 임의의 면역사이토카인, 이의 약제학적 조성물 또는 암 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 암의 예방 방법이 제공된다.
따라서, 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인; 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 질병(예를 들어, 암, 감염, 예컨대 바이러스 감염, 자가면역 질병, 알레르기, GvHD 또는 이식편 거부)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12, 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인; 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 질병(예를 들어, 암, 감염, 예컨대 바이러스 감염, 자가면역 질병, 알레르기, GvHD 또는 이식편 거부)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인으로서, 항체가 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 면역사이토카인; 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 질병(예를 들어, 암, 감염, 예컨대 바이러스 감염, 자가면역 질병, 알레르기, GvHD 또는 이식편 거부)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치한 면역사이토카인; 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 질병(예를 들어, 암, 감염, 예컨대 바이러스 감염, 자가면역 질병, 알레르기, GvHD 또는 이식편 거부)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인 중 임의의 것 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도하거나, 개체 내의 암 세포에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하고, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도하거나, 개체 내의 암 세포에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도하거나, 개체 내의 암 세포에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, HER2, PD-1, CD123, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도하거나, 개체 내의 암 세포에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암, 간암, 신장암, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 담도암, 편평 세포 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종 및 메르켈 세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, a) 암 세포의 암 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 종양 항원, 예컨대 HER2, 임의의 암 세포 표면 리간드 또는 수용체, 또는 암 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법, 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 암 세포에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 암 세포의 암 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 종양 항원, 예컨대 HER2, 임의의 암 세포 표면 리간드 또는 수용체, 또는 암 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법, 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 암 세포에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인 및 IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법, 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 암 세포에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암, 간암, 신장암, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 담도암, 편평 세포 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종 및 메르켈 세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 HER2+ 암, 예컨대 HER2+ 유방암이다. 일부 실시형태에서, 암은 PD-L1+ 및/또는 PD-L2+ 암이다.
일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 면역 세포 표면 항원, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25, 또는 면역 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 면역 세포 표면 항원, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25, 또는 면역 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체(예를 들어, 인간)에서의 암의 치료 방법 또는 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대한 사이토카인 활성의 선택적인 유도 방법이 제공된다: IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인 및 IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 암은 폐암, 간암, 신장암, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 담도암, 편평 세포 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종 및 메르켈 세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 PD-L1+ 및/또는 PD-L2+ 암이다.
일부 실시형태에서, 암의 치료 방법은 하기의 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는다: (1) 암 세포의 사멸; (2) 암 세포의 증식 저해; (3) 종양에서의 면역 반응의 유도(예를 들어, 종양 부위로의 면역 이펙터 세포의 침윤 유도, 면역 세포 증식, 분화 및/또는 활성화 유도 및/또는 면역 세포에 의한 염증-유발성 사이토카인 분비 유도); (4) 종양 크기 감소; (5) 암을 갖는 개체에서 하나 이상의 증상의 완화; (6) 종양 전이의 저해; (7) 생존 연장; (8) 암 진행까지의 시간 연장; 및 (9) 암의 재발의 예방, 저해 또는 이의 가능성의 감소. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물에 의해 매개되는 암 세포의 사멸 방법은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 중 어느 하나의 종양 세포 사멸률을 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물에 의해 매개되는 종양 크기의 감소 방법은 종양 크기의 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물에 의해 매개되는 종양 전이의 저해 방법은 전이의 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함)를 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물에 의해 매개되는 개체(예를 들어, 인간)의 생존의 연장 방법은 개체의 생존을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 또는 24개월 중 어느 하나만큼 연장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물에 의해 매개되는 암 진행까지의 시간의 연장 방법은 암 진행까지의 시간을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주 중 어느 하나만큼 연장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양에 대한 면역 반응의 유도 방법은 대상체에서 면역 반응 또는 기능을 증가시키거나, 향상시키거나, 자극할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 또는 기능은 대상체에서 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포)를 활성화시키고/시키거나, 이펙터 세포 모집단을 증량(증가)시키고/시키거나, 표적 세포(예를 들어, 표적 종양 세포)를 사멸시킴으로써 증가되고/되거나, 향상되고/되거나, 자극된다. 일부 실시형태에서, 개체 내의 CD4 및/또는 CD8 T 세포는 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물의 투여 이전에 비하여 증가되거나 향상된 감작(priming), 활성화, 증식, 사이토카인 방출 및/또는 세포용해 활성을 갖는다.
본원에 기재된 방법은 고형암 및 액상 암(liquid cancer) 둘 모두를 포함하는 다양한 암을 치료하는 데 적합하다. 당해 방법은 초기 단계 암, 비-전이성 암, 원발성 암, 진행성 암, 국소 진행성 암, 전이성 암, 관해 상태의 암을 포함하는 모든 병기의 암에 적용 가능하다. 본원에 기재된 방법은 당업계에 알려져 있는 다른 유형의 암 치료법, 예컨대 수술, 방사선, 화학치료법, 면역치료법, 호르몬 치료법 또는 이의 조합과 함께 제1 치료법, 제2 치료법, 제3 치료법 또는 조합 치료법으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 이전에 치료된 개체를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 암은 이전의 치료법에 대하여 불응성이다. 일부 실시형태에서, 방법은 이전에 치료되지 않은 개체를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 암은 면역 관문 저해제 단일치료법에 대하여 부분적으로 저항성이다(예를 들어, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체 단일치료법 치료에 대하여 부분적으로 저항성이다).
일부 실시형태에서, 암은 HER2-양성 암이며, 당해 방법은 유효량의 본원에 기재된 임의의 적합한 면역사이토카인, 예컨대 IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인 중 임의의 것을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 암은 유방암 또는 위암이다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 유방암은 초기-병기 유방암이다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 유방암은 전이성 유방암이다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 암은 재발성 암이다. 일부 실시형태에서, 재발성 암은 국소 재발성 암이다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 암은 진행성 암이다. 일부 실시형태에서, HER2-양성 암은 절제 불가능하다.
일부 실시형태에서, 암은 PD-L1 발현 암이며, 당해 방법은 유효량의 본원에 기재된 임의의 적합한 면역사이토카인, 예컨대, IL-2/항-HER2 면역사이토카인, IL-10/항-HER2 면역사이토카인, IL-12/항-HER2 면역사이토카인, IL-23/항-HER2 면역사이토카인, IFN-γ/항-HER2 면역사이토카인, IFN-α/항-HER2 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인, IFN-α/항-CD25 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인 중 임의의 것을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 비제한적인 예로써, 혈액암 및/또는 고형 종양을 포함하는 비정상적인 PD-1 또는 PD-L1/PD-L2 발현(예를 들어, HER2+ 암), 활성 및/또는 신호전달을 갖는 암을 치료하는 데 적합하다. 본 발명의 면역사이토카인을 사용하여 성장이 저해될 수 있는 일부 암은 전형적으로 면역치료법에 대하여 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위한 다른 암의 비제한적인 예는 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장암 및 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암)을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 면역사이토카인을 사용하여 성장이 저해될 수 있는 불응성 또는 재발성 악성종양을 포함한다. 본 발명은 또한, 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다(문헌[Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144]). 일부 실시형태에서, 비정상적인 PD-1 또는 PD-L1/PD-L2 발현, 활성 및/또는 신호전달을 갖는 암은 PD-1 또는 PD-L1 차단에 대하여 부분적으로 저항성이다(예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체 치료에 대하여 부분적으로 저항성이다).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 결장암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 비-소세포 폐암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종(NHL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 내분비계의 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피모양암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경 유발 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형 암을 치료하는 데 적합하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 질환, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 또는 전백혈병 중 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암을 치료하는 데 적합하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 감염, 예를 들어, 진균, 바이러스, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염을 치료하기 위한 것이다. 감염은 "병원체 항원" 하위섹션에서 상기 기재된 임의의 병원체에 의해 야기될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인 및 IFN-α/항-CD25 면역사이토카인 중 임의의 것 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CD123, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CD25, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 표적 항원(예를 들어, CD25, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, CD3, CD4, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에, 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 면역 세포 표면 항원, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25, 또는 면역 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, 임의의 면역 세포 표면 항원, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25, 또는 면역 세포 상에서 발현되는 임의의 면역 관문 분자, 예컨대 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대하여 사이토카인 활성을 선택적으로 유도하는, 개체(예를 들어, 인간)에서의 감염(예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아, 원생동물 또는 다른 기생충 감염)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내 또는 피하 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 감염의 치료 방법은 감염의 치료를 필요로 하는 개체에서 병원체 감염의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방하고/하거나, 이를 저지하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 병원체를 감소시키거나, 제거하고/하거나, 상기 개체 또는 상기 개체의 기관 또는 조직에 대한 손상을 예방하고/하거나, 사망을 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 하기 중 하나 이상을 달성할 수 있다: (a) 바이러스 감염에 의해 유도되는 것과 같은 조직 및/또는 기관 손상 또는 부전을 조절하고/하거나, 개선하고/하거나, 예방하는 것; (b) 세포 괴사, 예컨대 감염된 및/또는 비-감염된 조직 및/또는 기관 내의 괴사를 조절하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 저해하는 것(예컨대, 세포 괴사를 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함) 감소시키는 것); (c) 감염된 조직 및/또는 기관에서 염증성 세포(예를 들어, NK 세포, 세포독성 T 세포, 호중구)의 침윤을 조절하고/하거나 증가시키는 것, 예컨대 염증성 세포 침윤을 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함) 증가시키는 것; (d) 비-감염된 조직 및/또는 기관에서의 염증, 전신 염증 및/또는 사이토카인 폭풍을 조절하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하는 것, 예컨대 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 중 어느 하나 포함) 하향조절하는 것; (e) 병원체 감염과 관련된 사망률을 감소시키는 것 및/또는 사망을 예방하는 것, 예컨대 사망률을 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함) 감소시키는 것; 및 (f) 병원체를 적어도 약 10%(예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 어느 하나 포함) 감소시키거나 제거하는 것.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 면역 질병, 예컨대 자가면역 질병 또는 면역 억제를 치료하기 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 면역 억제를 치료하기 위한 것이다. 면역억제는 면역계의 활성화 또는 효능의 감소 또는 완전한 부재이며, 이는 질병, 예를 들어, 감염성 질병 또는 암과 싸울 면역계의 무능화를 초래한다. 면역억제는 질병의 결과일 수 있거나, 약제 또는 감염에 의해 생성되어, 병원체, 예컨대 박테리아 및 바이러스에 의한 2차 감염에 대한 감수성의 증가를 초래할 수 있다. 많은 질병은 환자에서의 진행성 면역억제의 발생을 특징으로 한다. 악성종양(예를 들어, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종)을 갖는 환자에서의 손상된 면역 반응의 존재가 널리 입증되어 있다. 진행성 면역억제는 또한, 소정의 만성 감염, 예컨대 AIDS, 패혈증, 나병, 사이토메갈로바이러스 감염, 말라리아, 루푸스 등에서 관찰되었다. 면역결핍은 또한 많은 치료적 처치(예를 들어, 방사성치료법 또는 화학치료법)의 잠재적인 유해 효과이다. 예를 들어, 제한 없이, 면역결핍 또는 면역억제와 연관된 질병 및 질환은 하기를 포함한다: 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 저감마글로불린혈증, 혈액 암, 예컨대 백혈병 및 림프종, 임의의 기원의 림프구감소증(림포페니아), 홍반성 루푸스, 악액질, 아편제 남용, 비만세포증, 류마티스성 열, 트리파노소마증 및 알코올 남용. 일부 실시형태에서, 면역억제는 면역 관문 신호전달(예를 들어, PD-1 또는 CTLA-4 신호전달)과 연관된다. 이러한 의도적이지 않은 면역억제 상황에서, 환자는 통상 면역계를 부스팅하기 위해 면역자극제(예를 들어, 사이토카인)로 치료된다. 그러나, 특이성의 결여로 인하여, 이러한 면역자극제는 일반적으로 면역계를 활성화하고, 면역계의 과활성화를 촉발할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 IL-2/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-L1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-23/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-γ/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IFN-α/PD-L2-Fc 면역사이토카인, IL-2/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인, IL-23/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인, IFN-α/항-PD-1 면역사이토카인, IL-2/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-12/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-23/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CTLA-4 면역사이토카인, IFN-α/항-CTLA-4 면역사이토카인, IL-2/항-CD3 면역사이토카인, IL-12/항-CD3 면역사이토카인, IL-23/항-CD3 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD3 면역사이토카인, IFN-α/항-CD3 면역사이토카인, IL-2/항-CD4 면역사이토카인, IL-12/항-CD4 면역사이토카인, IL-23/항-CD4 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인, IFN-α/항-CD4 면역사이토카인, IL-2/항-CD8 면역사이토카인, IL-12/항-CD8 면역사이토카인, IL-23/항-CD8 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD8 면역사이토카인, IFN-α/항-CD8 면역사이토카인, IL-2/항-CD25 면역사이토카인, IL-12/항-CD25 면역사이토카인, IL-23/항-CD25 면역사이토카인, IFN-γ/항-CD25 면역사이토카인 및 IFN-α/항-CD25 면역사이토카인 중 임의의 것 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역자극 또는 염증유발성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 면역 억제의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 면역자극 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역자극 또는 염증유발성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 면역 억제의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 면역자극 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역자극 또는 염증유발성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 면역 억제의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 면역자극 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역자극 또는 염증유발성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 면역 억제의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역 억제의 치료 방법은 면역 반응을 활성화시키거나 향상시키고/시키거나, CD8 대 CD4 비를 증가시키고/시키거나, 면역 세포 증식 및/또는 분화를 촉진시키고/시키거나, 사이토카인 방출(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ)을 유도하거나 향상시키고/시키거나, 면역 억제의 치료를 필요로 하는 개체에서 면역 억제의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방하고/하거나, 저지시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 사망을 예방한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 자가면역 질병을 치료하기 위한 것이다. 자가면역 질병은 자가-항체 반응 및 세포-매개 반응 둘 모두를 포함하는 자가-조직 또는 조직 성분에 대한 면역 반응으로부터 초래되는 질병이다. 본원에 사용되는 용어 "자가면역 질병"은 자가면역 반응이 단일 조직에 대해 유도되는 기관-특이적 자가면역 질병, 예컨대 제I형 진성 당뇨병(T1D), 크론병, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 백반증, 그레이브스병, 하시모토병, 애디슨병 및 자가면역 위염 및 자가면역 간염을 포괄한다. 용어 "자가면역 질병"은 또한, 전신에 걸쳐 여러 기관 또는 많은 기관에 존재하는 성분에 대해 자가 면역 반응이 유도되는 비-기관 특이적 자가면역 질병을 포괄한다. 이러한 자가면역 질병은 예를 들어 류마티스 질병, 전신 홍반성 루푸스, 진행성 전신 경화증 및 변이체, 다발성근염 및 피부근염을 포함한다. 추가의 자가면역 질병은 일부 자가면역 위염, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 혈소판감소증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증 및 건선을 포함하는 악성 빈혈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질병은 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염(류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 포함), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군(쇼그렌 증후군에 이차적인 건성각막결막염 포함), 원형 탈모증, 절지동물 물림증 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론병, 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기 천식, 피부 홍반 루푸스, 경피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 전환 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌병증, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 재생불량 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스프루, 편평 태선, 염증성 장 질병(IBD), 크론병, 그레이브스 눈병증, 사르코이드증, 원발 담즙성 간경변, 뒤포도막염, 및 사이질 폐 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 본 발명의 방법이 필요에 따라, 이들 또는 다른 자가면역 질병에 적용될 수 있음을 이해한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인 및 IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인 중 임의의 것, 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 자가면역 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD4, CD8 또는 CD25)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 자가면역 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, CTLA-4, PD-L1, CD3, CD4, CD123, CD25 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 자가면역 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-1, CD3, CD4, CD123, CD25 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 자가면역 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 자가면역 질병의 치료 방법은 자가면역 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 자가면역 질병의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방하고/하거나, 저지시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 건강한 자가 조직 또는 기관에 대한 손상을 예방하고/하거나, 건강한 자가 조직 및/또는 기관으로의 면역 세포의 침윤, 전신 염증 및/또는 사이토카인 폭풍을 조절하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하고/하거나, 사망을 예방한다.
일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 기재된 IL-10/항-CD4 면역사이토카인, IL-10/항-CD3 면역사이토카인, IL-10/항-CD8 면역사이토카인, IL-10/항-CD25 면역사이토카인, IL-10/항-PD-1 면역사이토카인, IL-10/항-PD-L1 면역사이토카인, IL-10/항-CTLA-4 면역사이토카인 및 IL-10/PD-L2-Fc 면역사이토카인 중 임의의 것, 또는 이의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 이식편 거부 또는 GvHD의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD123 또는 CD25)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 이식편 거부 또는 GvHD의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD3, CD4, CD25, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 이식편 거부 또는 GvHD의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, a) 면역 세포 상의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, CD3, CD4, CD25, CD123 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-27, IL-35 또는 TGF-β) 또는 이의 변이체를 포함하는 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 개체(예를 들어, 인간) 내의 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 골수 DC 세포, 형질 DC 세포, 대식구)에 대해 사이토카인 활성(예를 들어, 면역억제 또는 항-염증성 사이토카인 활성)을 선택적으로 유도함에 의한, 개체(예를 들어, 인간)에서의 이식편 거부 또는 GvHD의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내, 피하 또는 종양내 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg의 양으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이식편 거부의 치료 방법은 이식편 거부의 치료를 필요로 하는 개체에서 이식편 거부의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방하고/하거나, 저지시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나; 공여자/외래 조직 또는 기관에 대한 손상을 예방하고/하거나; 공여자/외래 조직 또는 기관으로의 면역 세포의 침윤, 전신 염증 및/또는 사이토카인 폭풍을 조절하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하고/하거나; Th17 세포 활성화를 감소시키고/시키거나; 이식편 생존을 개선시키고/시키거나; 생존을 연장시키고/시키거나, 생존률을 증가시키고/시키거나 사망을 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 GvHD의 치료 방법은 GvHD의 치료를 필요로 하는 개체에서 GvHD의 적어도 하나의 증상의 악화를 예방하고/하거나, 저지시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나; Th17 세포 활성화를 감소시키고/시키거나; 자가/건강한 조직 또는 기관에 대한 손상을 예방하고/하거나; 자가/건강한 조직 또는 기관으로의 면역 세포의 침윤, 전신 염증 및/또는 사이토카인 폭풍을 조절하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하고/하거나; 이식편 생존을 개선시키고/시키거나; 생존을 연장시키고/시키거나, 생존률을 증가시키고/시키거나, 사망을 예방하고/하거나; 질병 활성 점수를 개선시킨다(예를 들어, 문헌[P.J. Martin, Biol Blood Marrow Transplant. 2009 Jul;15(7):777-784] 참조).
일부 실시형태에서, 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 면역사이토카인이 a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD123, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하며, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv 또는 VH), 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분(예를 들어, CH2+CH3 또는 오직 CH2만)을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 폴리펩티드, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 폴리펩티드)를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에(예를 들어, 이의 N'에, 이의 C'에 또는 이의 내부에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간) 내의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD123, CD25, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)의 선택적인 활성화 방법이 제공되며; 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합 시에 선택적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 면역사이토카인이 a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 중쇄 단독 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하며, 항체가 힌지 영역을 포함하는 중쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간) 내의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)의 선택적인 활성화 방법이 제공되며; 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 항체의 결합 시에 선택적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)으로서, 면역사이토카인이 a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 항체(예를 들어, 전장 항체, 또는 힌지 영역을 통해 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분에 융합된 항원-결합 단편); 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하며, 항체가 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 선택적으로 CH1 도메인, 힌지 영역에서의 사이토카인 또는 이의 변이체, CH2 도메인 및 선택적으로 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간) 내의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)의 선택적인 활성화 방법이 제공되며; 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 항체의 결합 시에 선택적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 유효량의 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)로서, 면역사이토카인이 a) 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 특이적으로 인식하는 전장 항체; 및 b) 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23) 또는 이의 변이체를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에(예를 들어, 힌지 영역의 내부에 또는 CH1의 C-말단과 힌지 영역의 N-말단 사이에) 위치하는 면역사이토카인(또는 이의 약제학적 조성물)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들어, 인간) 내의 표적 항원(예를 들어, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, CD25, CD123, HER2, PD-1, CD3, CD4 또는 CD8)을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-2, IFN-α(예를 들어, IFN-α2b), IFN-γ, IL-10, IL-12 또는 IL-23)의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)의 선택적인 활성화 방법이 제공되며; 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성은 표적 항원으로의 전장 항체의 결합 시에 선택적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질) 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20%(예컨대, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 중 어느 하나 만큼) 증가한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 전장 항체, 또는 항원-결합 단편-힌지-Fc 융합 단백질, 예컨대 리간드/수용체-힌지-Fc 융합 단백질 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 리간드, 수용체, VHH, scFv, Fab)의 결합의 부재 하에서, 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하(예컨대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0% 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성(상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 서브유닛에 대한 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성)은 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하(예컨대 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 하나 이하)이다.
본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물의 투여는 주사 또는 주입에 의한 것들을 포함하여 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 알려진 허용된 방법에 따르며, 예컨대 단일의 또는 다수의 볼루스 또는 주입에 의해 긴 기간에 걸쳐 적합한 방식으로 이루어진다. 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 절내로, 골수내로, 근육내로, 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 주입, 예컨대 정맥내 주입에 의해 개체에게 투여된다. 면역치료법을 위한 주입 기법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)] 참조). 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 피내 또는 피하(즉, 피부 밑) 주사에 의해 개체에게 투여된다. 피하 주사를 위하여, 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물은 주사기를 사용하여 주사될 수 있다. 그러나, 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물의 투여를 위한 다른 디바이스, 예컨대 주사 디바이스; 주사기 펜; 오토-주사기 디바이스, 무바늘 디바이스; 및 피하 패치 전달 시스템이 이용 가능하다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 종양, 또는 림프절 내로 직접 주사된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 종양의 부위에 국소로, 예컨대 직접적으로 종양 세포 내로, 또는 종양 세포를 갖는 조직에 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 지속 방출 또는 연장 방출 방식에 의해 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료법에 대한 유효 용량의 결정을 위한 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 척도는 문헌[Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46]에 의해 정해진 원칙에 따라 수행될 수 있다. 상이한 제형이 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이고, 특정 기관 또는 조직을 치료하도록 의도된 투여가 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 방식의 전달을 필요로 할 수 있음이 본 출원의 범위 내에 있다.
본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물의 생체내 투여가 사용되는 경우, 보통의 투여량은 투여 경로 및 포유동물 유형에 따라 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg(포유동물 체중)로 달라질 수 있다. 상이한 제형이 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이고, 특정 기관 또는 조직을 치료하도록 의도된 투여가 또 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 방식의 전달을 필요로 할 수 있음이 본 출원의 범위 내에 있다. 또한, 투여량은 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 몇일 이상에 걸친 반복 투여를 위하여, 질환에 따라, 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 치료법의 진행은 통상적인 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 예컨대 약 1 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 약 500 μg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 200 μg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 1 mg/kg, 또는 약 500 μg/kg 내지 약 1 mg/kg 중 어느 하나의 양으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 24시간, 20시간, 15시간, 10시간, 8시간, 6시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하 중 어느 하나 이하의 기간에 걸쳐 개체(예를 들어, 인간)에게 투여된다(예를 들어, 주입된다). 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 약 30분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 24시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 20시간, 약 30분 내지 약 10시간, 또는 약 30분 내지 약 24시간 중 어느 하나의 기간에 걸쳐 개체(예를 들어, 인간)에게 투여된다(예를 들어, 주입된다).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 단일 회로 투여된다(예를 들어, 볼루스 주사). 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 다수 회(예컨대 2, 3, 4, 5, 6회 이상 중 어느 하나)로 투여된다. 다수의 투여인 경우, 이들은 동일하거나 상이한 경로에 의해 수행될 수 있으며, 동일한 부위 또는 대안적인 부위에서 일어날 수 있다. 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 매일 내지 매년 1회 투여될 수 있다. 투여 사이의 간격은 약 24시간 내지 1년 중 어느 하나일 수 있다. 간격은 또한, (예를 들어, 종양 진행에 따라) 불규칙적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 일정에 중단이 없다. 특정 환자를 위한 최적의 투여량 및 치료 계획은 질병의 징후에 대하여 환자를 모니터링하고, 이에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 1일마다 1회(매일), 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 1주마다 1회, 10일마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 또는 1년마다 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여 사이의 간격은 약 1주 내지 2주, 2주 내지 1개월, 2주 내지 2개월, 1개월 내지 2개월, 1개월 내지 3개월, 3개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 면역사이토카인 또는 이의 약제학적 조성물은 3주마다 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 분할 용량, 예컨대 약 2, 3, 4, 5회 이상 중 어느 하나의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 분할 용량은 약 1주, 1개월, 2개월, 3개월 이상에 걸쳐 투여된다. 일부 실시형태에서, 용량은 동일하게 분할된다. 일부 실시형태에서, 분할 용량은 총 용량의 약 20%, 약 30% 및 약 50%이다. 일부 실시형태에서, 연속 분할 용량 사이의 간격은 약 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 1개월 이상이다. 몇일 이상에 걸친 반복 투여를 위하여, 질환에 따라, 원하는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 치료는 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 치료법의 진행은 통상적인 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
VII. 제조 물품 및 키트
본원에 기재된 임의의 면역사이토카인을 포함하는 키트, 단위 투여량 및 제조 물품이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재된 임의의 약제학적 조성물을 함유하고 바람직하게는 이의 사용을 위한, 예컨대 본원에 기재된 장애(예를 들어, 암, 감염 또는 자가면역 질병)의 치료에서의 사용을 위한 지침서를 제공하는 키트가 제공된다.
본 발명의 키트는 질병을 치료하기 위한 본원에 기재된 면역사이토카인을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 예를 들어, 지침서는 질병, 예컨대 암을 치료하기 위한 면역사이토카인의 투여의 설명을 포함한다. 키트는 개체가 질병을 갖는지의 여부 및 질병의 병기의 확인에 기초한, 치료에 적합한 개체(예를 들어, 인간)를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함할 수 있다. 면역사이토카인의 이용과 관련된 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)이지만, 기계-판독가능한 지침서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 지침서)가 또한 허용 가능하다. 본 출원의 키트는 적합한 패키징 내에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들면, 밀봉된 마일러 또는 비닐 봉지) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 디바이스, 예컨대 주입 디바이스, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성 작용제는 본원에 기재된 바와 같은 면역사이토카인이다. 용기는 제2 약제학적 활성 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 이와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
따라서, 본 출원은 또한, 바이알(예컨대 밀봉된 바이알), 병, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 이와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 질병 또는 장애(예컨대 암)을 치료하기에 유효한 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체에서 특정 질환을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 개체에게 조성물을 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 것이다. 라벨은 재구성 및/또는 사용을 위한 지침을 나타낼 수 있다. 약제학적 조성물을 보유하는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들어 2 내지 6회 투여)를 허용하는 다회-이용 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 적응증, 이용, 투여량, 투여, 이러한 치료 제품의 사용에 관한 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적인 패키지에 관습적으로 포함된 지침서를 지칭한다. 추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는 상업적이고 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용에 충분한 양으로 패키징된, 다중 단위 용량의 약제학적 조성물 및 사용 지침서를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 전적으로 본 발명의 예시인 것으로 의도되며, 따라서 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 하기 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아니라 예시로 제공된다.
실시예 1: 면역사이토카인 내의 사이토카인 또는 이의 변이체의 위치는 사이토카인 또는 이의 변이체의 생물학적 활성에 영향을 미친다
다양한 형식의 IL-2/항-HER2 면역사이토카인의 작제
트라스투주맙(Herceptin®) VH(SEQ ID NO: 150) 및 VL(SEQ ID NO: 151) 서열을 포함하는 항-HER2 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며(도 1a), 이는 SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. R38D/K43E/E61R 3중 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체(SEQ ID NO: 2)를 사이토카인 변이체로서 사용하였으며, 이는 IL-2Rα(CD25)로의 IL-2의 결합을 차단한다. IL-2 변이체를 다양한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인을 작제하기 위하여 하기의 위치에 위치시켰다: i) IL-2 변이체를 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합시켰으며, 하기에서 "IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 1b 참조); ii) IL-2 변이체를 항-HER2 항체의 중쇄의 C-말단에 융합시켰으며, 하기에서 "Fab-Fc-IL-2 돌연변이-Her2 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 1c 참조); 및 iii) IL-2 변이체를 항-HER2 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켰으며, 하기에서 "Fab-IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조). Fab-IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다.
다양한 형식의 IL-2/항-HER2 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 화학적으로 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하고, 면역사이토카인 발현을 위하여 CHO 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 발현된 면역사이토카인을 상청액으로부터 수집하고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE에서 순도에 대하여 확인하였다.
IL-2 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IL-2 세포(인비보겐(InvivoGen) 카탈로그 번호 hkb-il2) 및 HEK-PD-1-IL-2 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-2 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IL-2 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IL-2 리포터 검정"으로도 지칭되는, 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il2)에 따라, 다양한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인의 IL-2 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-2 리포터 세포는 인간 JAK3 및 STAT5 유전자와 함께, 인간 IL-2 수용체(인간 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ)를 안정하게 발현하여, 완전히 기능성인 IL-2 신호전달 경로를 수득한다. 또한, 이들 리포터 세포는 STAT5-유도 가능한 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자도 또한 보유한다. IL-2 자극 시에, HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-2 리포터 세포는 STAT5의 활성화 및 이후의 SEAP의 분비를 촉발시키며, 이의 수준은 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs) 비색 효소 검정을 사용하여 모니터링될 수 있다.
요약하여, HEK-Blue™ IL-2 세포를 각각의 플레이트 웰 내의 다양한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인(또는 양성 대조군으로서 웰 내의 재조합 인간 IL-2, 음성 대조군으로서 웰 내의 항-HER2 항체 트라스투주맙(Herceptin®))에 첨가하고, 37℃에서 CO2 인큐베이터 내에서 20 내지 24시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 상청액을 신선한 플레이트 웰에 옮기고, QUANTI-Blue™ 용액을 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 30분 내지 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 620 내지 655 nm에서 분광광도계를 사용하여 SEAP 수준을 결정하였다. IL-2 신호전달 경로의 활성화에서의 재조합 인간 IL-2(양성 대조군)의 활성은 10 유닛/ng으로 측정되었으며, 이를 참조물질로서 제공하였다. IL-2/항-HER2 면역사이토카인 판독치를 재조합 인간 IL-2 판독치로 나누어, 다양한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인에 대한 IL-2 신호 전달 퍼센트를 계산하였다.
PBMC 증식 검정
또한, IL-2의 생물학적 활성을 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 증식/생존 검정에 의해 시험할 수 있다. IL-2는 활성화된 T-세포의 증식 및 생존에 필수적이다. 인간 PBMC(80,000개 세포/웰)를 증가하는 농도의 재조합 인간 IL-2("rIL-2"; 0, 0.04, 0.2, 1.0 또는 5.0 ng/mL)의 존재 하에 항-CD3 항체(OKT3, 0.5 μg/mL)에 의해 자극하였다. 1 ng/mL의 rIL-2는 6-일 배양 후의 PBMC 세포 개수(<80,000개 세포/웰) 및 생존력에 기초하여 T-세포 증식에 필요한 최소 농도인 것으로 결정되었다. T-세포 증식에 필요한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인의 최소 농도를 결정하기 위하여, PBMC(80,000개 세포/웰)를 증가하는 농도의 다양한 형식의 IL-2/항-HER2 면역사이토카인(0, 0.32, 1.6, 8, 40, 200 또는 1000 ng/mL)의 존재 하에 항-CD3 항체(OKT3, 0.5 μg/mL)에 의해 자극하였다. 유리 상태 rIL-2를 양성 대조군으로서 제공하였다(0.2 또는 1 ng/mL). rIL-2에 비한 IL-2/항-HER2 면역사이토카인의 T-세포 증식 퍼센트를 상응하는 분자량에 대해 정규화시킴으로써 계산하였다. IL-2/항-HER2 면역사이토카인 및 rIL-2의 분자량은 각각 약 162 kDa 및 12 kDa이며, 따라서, 약 13 ng의 IL-2/항-HER2 면역사이토카인은 동일한 IL-2 몰 농도에 대하여 약 1 ng의 rIL-2와 동등하다.
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, IL-2 변이체가 항-HER2 항체의 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우(IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 IL-2 신호 전달 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 12.0% 생물학적 활성을 보유하였으며, PBMC 증식 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 4.3% 생물학적 활성을 보유하였다. IL-2 변이체가 항-HER2 항체의 중쇄의 C-말단에 융합되는 경우(Fab-Fc-IL-2 돌연변이-Her2 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 IL-2 신호 전달 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 6.3% 생물학적 활성을 보유하였으며, PBMC 증식 검정에 의해 측정되는 바와 같이 약 3.1% 생물학적 활성을 보유하였다. IL-2 변이체가 항-HER2 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치하는 경우(Fab-IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 IL-2 신호 전달 검정에 의해 측정되는 바와 같이 오직 약 2.3% 생물학적 활성만을 보유하였으며, PBMC 증식 검정에 의해 측정되는 바와 같이 모든 생물학적 활성을 소실하였다. 이들 결과는 HER2로의 항-HER2 항원-결합 단편의 결합의 부재 하의 IL-2 변이체 활성을 반영하는 것으로 여겨질 수 있는데, 이는 HEK-IL-2 세포 및 PBMC가 세포 표면 상에서 최소의 HER2 발현을 갖기 때문이다.
그러므로, 표적 항원(예를 들어, HER2)으로의 항체의 결합의 부재 하에서, 전장 항체(예를 들어, 항-HER2 항체)의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인(예를 들어, IL-2 변이체)은 예컨대, 신호 전달 검정 또는 PBMC 증식 검정에 의해 측정하여, 이러한 사이토카인이 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에, 또는 전장 항체의 중쇄의 C-말단에 위치한 경우에 비하여, 더욱 제한된 생물학적 활성을 보였다.
[표 1]
실시예 2: 힌지 영역에 위치한 사이토카인을 갖는 면역사이토카인은 표적 항원 결합-의존적인 사이토카인 활성을 나타낸다
VH(SEQ ID NO: 91) 및 VL(SEQ ID NO: 92) 서열을 포함하는 CD3ε을 특이적으로 인식하는 항-CD3 항체(인-하우스 제조)를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이 항-CD3ε 항체는 CD3으로의 결합을 위하여 OKT3 항체와 경쟁하지 않으며, TCR 신호전달을 활성화시킬 수 없으며(즉, 비-활성 항-CD3 항체), 이에 따라, PBMC 또는 T 세포 증식을 자극할 수 없다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. R38D/K43E/E61R 3중 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체(SEQ ID NO: 2)를 다양한 IL-2/항-CD3 면역사이토카인을 작제하기 위하여 하기의 위치에 위치시켰다: i) IL-2 변이체를 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합시켰으며, 하기에서 "IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 1b 참조); ii) IL-2 변이체를 항-CD3 항체의 중쇄의 C-말단에 융합시켰으며, 하기에서 "Fab-Fc-IL-2 돌연변이-CD3 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 1c 참조); 및 iii) IL-2 변이체를 항-CD3 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켰으며, 하기에서 "Fab-IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab"로 지칭됨(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조). Fab-IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. IL-2/항-CD3 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다. CD3+ T 세포에 대한 상이한 형식의 IL-2/항-CD3 면역사이토카인의 결합 활성을 FACS를 사용하여 입증하였다.
HEK-Blue™ IL-2 세포를 사용한 IL-2 신호 전달 검정 및 PBMC 증식 검정을 다양한 형식의 IL-2/항-CD3 면역사이토카인, rIL-2(양성 대조군), 또는 항-CD3 항체(인-하우스 제조됨; 음성 대조군)를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 행하였다.
[표 2]
HEK-IL-2 세포가 세포 표면 상에 CD3 발현을 갖지 않기 때문에, HEK-IL-2 리포터 세포를 사용한 IL-2 신호 전달 검정은 CD3으로의 항-CD3 항원-결합 단편의 결합의 부재 하의 IL-2 변이체 활성을 반영한다. 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, IL-2 변이체가 항-CD3 항체의 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합된 경우(IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 약 11.0% 생물학적 활성을 보유하였으며; IL-2 변이체가 항-CD3 항체의 중쇄의 C-말단에 융합된 경우(Fab-Fc-IL-2 돌연변이-CD3 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 약 6.7% 생물학적 활성을 보유하였으며; IL-2 변이체가 항-CD3 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 경우(Fab-IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab), 이러한 IL-2 변이체는 오직 약 2.5% 생물학적 활성만을 보유하였다. 이 결과는 IL-2 신호 전달 검정에 의해 측정되는 바와 같이 IL-2/항-HER2 면역사이토카인에 대하여 표 1에 나타낸 것과 일치한다.
PBMC(CD3+ T 세포)에서 CD3으로의 항-CD3 항원-결합 단편의 결합의 존재 하에서, IL-2/항-CD3 면역사이토카인은 전부 CD3 결합이 없는 것에 비하여 훨씬 더 높은 IL-2 생물학적 활성을 나타내었다. 표 2에서 PBMC 증식 검정에 나타낸 바와 같이, IL-2 변이체가 항-CD3 항체의 Fc 단편의 서브유닛의 N-말단에 융합된 경우(IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab), IL-2 변이체의 생물학적 활성은 항-CD3 항체/CD3 결합 시에 약 39.0%로 증가하였으며; IL-2 변이체가 항-CD3 항체의 중쇄의 C-말단에 융합된 경우(Fab-Fc-IL-2 돌연변이-CD3 Ab), IL-2 변이체의 생물학적 활성은 항-CD3 항체/CD3 결합 시에 약 52.0%로 증가하였다. 사이토카인 생물학적 활성의 이러한 증가는 아마도 항원-항체 결합이 사이토카인 모이어티를 이의 수용체 가까이에 오게 하고, 사이토카인-수용체 결합의 가능성을 증가시키기 때문일 것이고/이거나 항체-항원 결합으로부터의 안정화 효과 때문일 것이다. 놀랍게도, 항-CD3 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체는 항-CD3 항체/CD3 결합 시에 IL-2 생물학적 활성을 드러냈으며, 약 45.0%로 증가하였고, 이는 사이토카인 N-말단 융합(IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab)의 활성보다 훨씬 더 강력하였다.
표 1 및 표 2로부터의 결과를 고려하여, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인(예를 들어, IL-2 변이체)의 생물학적 활성은 표적 항원(예를 들어, CD3) 결합-의존적이다. IL-2/항-HER2 면역사이토카인은 형식과 관계 없이, T 세포 또는 HEK-IL-2 세포에 결합할 수 없었다. 특히, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인을 갖는 면역사이토카인에 있어서, 항체 부분에 의한 표적 항원-결합 없이, 이러한 사이토카인의 생물학적 활성은 드러날 수 없다. Fab-IL-2 돌연변이-Fc-Her2 Ab에 대한 표 1의 0.0% PBMC 증식을 참조한다. 대조적으로, CD3을 통해 T 세포에 결합할 수 있는 IL-2/항-CD3 면역사이토카인에 의해, 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인의 생물학적 활성이 드러났다. Fab-IL-2 돌연변이-Fc-CD3 Ab에 대한 표 2의 45.0% PBMC 증식을 참조한다. 이들 결과는 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 사이토카인을 포함하는 면역사이토카인이 표적 특이성을 제공하고, 사이토카인 폭풍을 감소시킬 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 3: 힌지 영역에 위치한 사이토카인을 갖는 면역사이토카인은 먼저 표적 항원-항체(또는 리간드-수용체) 결합에 이어서, 두번째로 사이토카인-사이토카인 수용체 결합에 유리하다
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. R38D/K43E/E61R 3중 돌연변이를 포함하는 IL-2 변이체(SEQ ID NO: 2)를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조), IL-2/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인(또는 "IL-2(R38D/K43E/E61R)/항-PD-1 면역사이토카인")은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 108의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다.
PD-L2-Fc 융합 단백질(N' 절단된 IgG1 힌지(SEQ ID NO: 50)를 통해 Fc 단편의 N-말단에 융합된 PD-L2 세포외 도메인; SEQ ID NO: 177)을 또 다른 부모 작제물로서 사용하여, PD-1에 결합하는 면역사이토카인을 작제하였다. 이종이량체 PD-L2-Fc 융합 단백질을 작제하기 위하여, 하나의 PD-L2-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 52를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 PD-L2-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 51을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인 "리간드-IL-2 돌연변이-PD-L2-Fc" 또는 "IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인"(또는 "작제물 #11")은 N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인 - GGGGS 링커(SEQ ID NO: 213) - IL-2 변이체(SEQ ID NO: 2) - N' 절단된 IgG1 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 단편의 하나의 융합 폴리펩티드(SEQ ID NO: 180), 및 N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인 - GGGGS 링커(SEQ ID NO: 213) - IL-2 변이체(SEQ ID NO: 2) - N' 절단된 IgG1 힌지(SEQ ID NO: 51) - 쌍형성 Fc 단편을 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드(SEQ ID NO: 179)를 포함한다.
Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab 및 리간드-IL-2 돌연변이-PD-L2-Fc를 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다. FACS를 사용하여, Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab 및 리간드-IL-2 돌연변이-PD-L2-Fc 둘 모두가 HEK-PD-1-IL-2 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-2 세포에서 인간 PD-1을 과발현함으로써 인-하우스 생성됨)에 결합하지만, HEK-Blue™ IL-2 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il2)에는 결합하지 않는 것을 확인하였다.
HEK-Blue™ IL-2 세포 및 HEK-PD-1-IL-2 세포를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이, Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab 및 리간드-IL-2 돌연변이-PD-L2-Fc의 IL-2 신호 활성화 활성을 평가하였다. 재조합 인간 IL-2(rIL-2)를 양성 대조군으로서 제공하였다. 항-PD-1 항체 니볼루맙(Opdivo®) 및 부모 PD-L2-Fc 융합 단백질(각각의 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 177을 포함함)을 음성 대조군으로서 제공하였다.
[표 3]
실시예 1 및 2에 나타낸 데이터와 일치하게, 표적 항원(PD-1) 결합의 부재 하에서, 면역사이토카인의 힌지 영역에 위치한 IL-2는 HEK-IL-2 리포터 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 유리 상태 rIL-2(100.0%)에 비하여 생물학적 활성을 거의 보이지 않았다(2.1% 또는 2.4%). 표 3의 HEK-IL-2 리포터 검정과 HEK-PD-1-IL-2 리포터 검정 결과를 비교하여, 세포 표면 상의 PD-1로의 항-PD-1 항원-결합 단편 또는 PD-L2 세포외 도메인의 결합은 IL-2 변이체와 IL-2 수용체의 결합을 크게 촉진시켰다. 다시 말하면, 힌지 영역에 위치한 사이토카인을 갖는 면역사이토카인은 먼저 표적 항원-항체 결합(Fab-IL-2 돌연변이-Fc-PD-1 Ab, 35.2% 대 2.1%) 또는 리간드-수용체 결합(리간드-IL-2 돌연변이-PD-L2-Fc, 43.5% 대 2.4%)에 이어서, 두번째로 사이토카인-사이토카인 수용체 결합에 유리하였다.
실시예 4: 면역사이토카인의 표적 항원-결합의 부재 하에 감소된 생물학적 활성을 갖는 IL-12 변이체의 생성
IL-12 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
IL-12는 공유 결합된 p35 및 p40 서브유닛으로 구성된 이종이량체 사이토카인이다. p40 서브유닛의 위치 56 내지 65의 아미노산을 알라닌 또는 세린으로 대체함으로써, p40 서브유닛에 아미노산 치환을 포함하는 IL-12 변이체를 작제하였으며(표 4 참조), N'에서 C'으로, p40 변이체 서브유닛 - 링커(SEQ ID NO: 228) - p35 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 29)의 단일 쇄 IL-12 변이체를 제조하였다. N'에서 C'으로 p40 야생형 서브유닛 - 링커(SEQ ID NO: 228) - p35 야생형 서브유닛의 단일 쇄 "야생형" IL-12도 또한, 대조군으로서 작제하였으며(SEQ ID NO: 35), 표 4에서 "WT"로 지칭된다.
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 다양한 단일 쇄 IL-12 변이체(또는 단일 쇄 "야생형" IL-12 대조군)를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IL-12/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12 변이체 IL-12B(p40 E59A/F60A)-링커-IL-12A(wt p35)를 포함하는 Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인(또는 "IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인" 또는 "작제물 #48")은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 112의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12 변이체 IL-12B(p40 G64A)-링커-IL-12A(wt p35)를 포함하는 IL-12(G64A)/항-PD-1 면역사이토카인("작제물 #47")은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12(G64A) 변이체(SEQ ID NO: 332)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12 변이체 IL-12B(p40 E59A)-링커-IL-12A(wt p35)를 포함하는 IL-12(E59A)/항-PD-1 면역사이토카인("작제물 #46")은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12(E59A) 변이체(SEQ ID NO: 331)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IL-12 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IL-12 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il12) 및 HEK-PD-1-IL-12 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-12 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IL-12 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IL-12 리포터 검정"으로도 지칭되는 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il12)에 따라, 상이한 IL-12 모이어티를 포함하는 다양한 Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인의 IL-12 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IL-12 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-12 리포터 세포는 인간 STAT4 유전자와 함께, IL-12 수용체 β1(IL-12Rβ1) 및 IL-12Rβ2로 이루어진 인간 IL-12 수용체 복합체를 안정하게 발현하여, 완전히 기능성인 IL-12 신호전달 경로(TyK2/JAK2/STAT4)를 수득한다. 또한, 이들 리포터 세포는 STAT4-유도 가능한 SEAP 리포터 유전자도 또한 보유한다. IL-2 자극 시에, HEK-Blue™ IL-12 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-12 리포터 세포는 STAT4의 활성화 및 이후의 SEAP의 분비를 촉발시키며, 이의 수준은 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs) 비색 효소 검정을 사용하여 모니터링될 수 있다. 실험 절차는 IL-2 신호 전달 검정에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 유사하였다. 유리 상태의 재조합 인간 IL-12(rIL-12)를 양성 대조군으로서 그리고 활성 퍼센트 계산을 위한 참조물질로서 제공하였다.
[표 4]
HEK-IL-12 리포터 검정에서, Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab만이 IL-12 모이어티/IL-12 수용체 상호작용을 통해 HEK-IL-12 세포에 결합할 수 있었다. 항-PD-1 항체의 힌지 영역에 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12를 위치시켜("Fab-IL-12(WT)-Fc-PD-1 Ab"), PD-1 결합의 부재 하에 IL-12 활성을 50.0%로 감소시켰다. 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, p40 서브유닛의 위치 59 및 60은 IL-12 생물학적 활성에 결정적이다. IL-12 p40 서브유닛에 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab("Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab")는 IL-12 신호 전달에 의해 측정되는 바와 같이 거의 완전히 정지된 IL-12 활성을 보였다(0.1%).
HEK-PD-1-IL-12 리포터 검정에서, Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab는 IL-12 모이어티/IL-12 수용체 상호작용 및 항-PD-1 항원-결합 단편/PD-1 상호작용 둘 모두를 통해 HEK-PD-1-IL-12 세포에 결합할 수 있었다. 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, Fab-IL-12-Fc-PD-1 Ab에서 모든 IL-12 변이체(및 "WT" IL-12)의 생물학적 활성은 PD-1 결합의 존재 하에 증가하였다. 특히, Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab의 IL-12 활성은 PD-1/항-PD-1 항체 결합에 의해 5.9%로 구제되었으며, 이는 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 부재 하의 활성(0.1%)의 59배였다.
IL-12 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 이중 돌연변이는 IL-12 p40 서브유닛 내의 다른 돌연변이에 비하여 뛰어난 효과를 나타내었다. 이 IL-12 E59A/F60A 변이체를 항-PD-1 전장 항체의 중쇄의 힌지 영역에 위치시킴으로써, 수득된 Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인은 오직 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 존재 하에서만 IL-12 생물학적 활성을 나타내었지만, 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 부재 하에서는 그렇지 않았으며, 이는 표적화된 특이성을 나타낸다.
실시예 5: CD4+ T 세포에 대해 유도된 IL-12 생물학적 활성을 갖는 IL-12/항-CD4 면역사이토카인(Fab-IL-12-Fc-CD4 Ab)의 생성
Fab-IL-12-Fc-CD4 Ab 면역사이토카인의 작제
이발리주맙(Trogarzo®) VH(SEQ ID NO: 73) 및 VL(SEQ ID NO: 74) 서열을 포함하는 항-CD4 항체를 부모 항-CD4 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이발리주맙은 HIV 치료에서 FDA에 의해 승인된 비-면역억제 인간화 모노클로널 항체이다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 단일 쇄 "야생형" IL-12, 또는 실시예 4에 기재된 바와 같은 p40 서브유닛에 E59A, F60A, 또는 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 IL-12 변이체(SEQ ID NO: 31 내지 33)를 항-CD4 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IL-12/항-CD4 면역사이토카인 "Fab-IL-12-Fc-CD4 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-CD4 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12 변이체(SEQ ID NO: 36)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다. FACS를 사용하여, Fab-IL-12-Fc-CD4 Ab가 CD4+ T 세포에 결합할 수 있었지만, CD8+ T 세포에는 그렇지 않았음을 확인하였다(데이터 미도시).
IL-12 또는 IL-23 생물학적 활성을 측정하기 위한 인터페론-감마 방출 검정(IGRA)
IL-12 또는 IL-23의 생물학적 활성은 활성화된 T 세포로부터 방출된 IFN-γ의 양에 의해 측정될 수 있다. 이의 수용체(IL-12R-β1 및 IL-12R-β2 서브유닛으로 구성된 이종이량체 수용체)로의 IL-12의 결합은 TyK2(티로신 키나제 2), JAK2(야누스 키나제 2) 및 STAT4(신호 전달자 및 전사 활성화자 4)를 수반하는 신호전달 경로를 촉발시키며, 이는 IFN-γ의 생성을 초래한다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 PBMC로부터 단리하고, 5일 동안 재조합 인간 IL-2(30 유닛/mL)의 존재 하에 항-CD3 항체(1 μg/mL OKT3)에 의해 자극하였다. 5일 후에, 활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포(80,000개 세포/웰)를 증가하는 농도의 재조합 인간 IL-12(rIL-12) 또는 재조합 인간 IL-23(rIL-23)(0, 0.62, 1.25, 2.5, 5, 10, 또는 20 ng/mL)의 존재 하에 배양하였다. 다음 날, 세포 배양 배지 내로 방출된 IFN-γ의 양을 ELISA 검정에 의해 측정하였다. IL-12-면역사이토카인 또는 IL-23-면역사이토카인의 판독치를 rIL-12 또는 rIL-23의 판독치로 나눔으로써 IL-12 또는 IL-23 생물학적 활성 퍼센트를 계산하였다.
활성화된 T 세포로부터의 IFN-γ의 방출을 자극하는 데 필요한 rIL-12의 최소 농도는 2.5 ng/ml였던 한편, rIL-23에 있어서, 이는 5 ng/ml였다. 양성 생물학적 반응을 관찰하기 위한 IL-12-면역사이토카인 또는 IL-23-면역사이토카인의 최소 농도를 결정하기 위하여, 활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포(80,000개 세포/웰)를 증가하는 농도의 IL-12-면역사이토카인 또는 IL-23-면역사이토카인(0, 0.32, 1.6, 8, 40, 200, 또는 1000 ng/mL)의 존재 하에 하룻밤 배양하였다. rIL-12(2.5 ng/mL) 또는 rIL-23(5 ng/mL)을 양성 대조군으로서 제공하였다. 상응하는 분자량에 대하여 정규화시킴으로써 상응하는 유리 상태 사이토카인(rIL-12 또는 rIL-23)에 비한 IL-12-면역사이토카인 또는 IL-23-면역사이토카인의 생물학적 활성 퍼센트를 계산하였다. IL-12-면역사이토카인 및 rIL-12의 분자량은 각각 약 220 kDa 및 약 70 kDa이다. IL-23-면역사이토카인 및 rIL-23의 분자량은 각각 약 215 kDa 및 약 65 kDa이다. 그러므로, 약 3 ng의 IL-12-면역사이토카인 또는 IL-23-면역사이토카인은 동일한 IL-12 또는 IL-23 몰 농도에 대하여 약 1 ng의 rIL-12 또는 rIL-23과 동등하다.
[표 5]
표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12의 위치결정은 CD8+ T 세포에서 심지어 표적 항원(CD4)-항체 결합의 부재 하에서도 약 25.0%의 IL-12 활성을 여전히 보유하였다. p40 서브유닛 내의 E59A 및 F60A 돌연변이는 IL-12 활성을 CD4/항-CD4 항체 결합의 부재 하에 약 1.1% 또는 1.5%로 유의미하게 감소시켰으며, 이는 CD4+ T 세포/항-CD4 항체 결합의 존재 하에 약 29.8% 또는 32.2%로 구제되었다. IL-12 p40 서브유닛에 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-12-Fc-CD4 Ab("Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-CD4 Ab")는 CD8+ T 세포와의 교차 반응성 없이(0.0%), CD4+ T 세포 특이적 IL-12 생물학적 활성을 나타내었다(8.2%). 이들 데이터는 사이토카인(예를 들어, IL-12) 생물학적 활성을 CD4+ T 세포를 향해 특이적으로 표적화할 수 있는 항-CD4 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 6: CD8+ T 세포에 대해 유도된 IL-12 생물학적 활성을 갖는 IL-12/항-CD8 면역사이토카인(Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab)의 생성
클론 G10-1 VH(SEQ ID NO: 114) 및 VL(SEQ ID NO: 115) 서열을 포함하는 항-CD8 항체를 부모 항-CD8 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 단일 쇄 "야생형" IL-12, 또는 실시예 4에 기재된 바와 같은 p40 서브유닛에 E59A, F60A, 또는 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 IL-12 변이체(SEQ ID NO: 31 내지 33)를 항-CD8 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IL-12/항-CD8 면역사이토카인 "Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-CD8 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12 변이체(SEQ ID NO: 36)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다. FACS를 사용하여, Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab가 CD8+ T 세포에 결합할 수 있었지만, CD4+ T 세포에는 그렇지 않았음을 확인하였다(데이터 미도시).
활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 증가하는 농도의 rIL-12(양성 대조군) 또는 Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab의 존재 하에 배양함으로써 IFN-γ 방출 검정을 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 행하였다. 다음날, 세포 배양 배지로 방출되는 IFN-γ의 양을 ELISA 검정에 의해 측정하였다. Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab의 판독치를 rIL-12의 판독치로 나눔으로써 IL-12 생물학적 활성 퍼센트를 계산하였다.
[표 6]
표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12의 위치결정은 CD4+ T 세포에서 심지어 표적 항원(CD8)-항체 결합의 부재 하에서도 약 21.0%의 IL-12 활성을 여전히 보유하였다. p40 서브유닛 내의 E59A 및 F60A 돌연변이는 IL-12 활성을 CD8/항-CD8 항체 결합의 부재 하에 약 2.1% 또는 1.2%로 유의미하게 감소시켰으며, 이는 CD8+ T 세포/항-CD8 항체 결합의 존재 하에 약 24.2% 또는 21.9%로 구제되었다. IL-12 p40 서브유닛에 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-12-Fc-CD8 Ab("Fab-IL-12(E59A/F60A)-Fc-CD8 Ab")는 CD4+ T 세포와의 교차 반응성 없이(0.0%), CD8+ T 세포 특이적 IL-12 생물학적 활성을 나타내었다(11.0%). 이들 데이터는 사이토카인(예를 들어, IL-12) 생물학적 활성을 CD8+ T 세포를 향해 특이적으로 표적화할 수 있는 항-CD8 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 7: PD-1-양성 세포에 대해 유도된 IL-23 생물학적 활성을 갖는 IL-23/항-PD-1 면역사이토카인(Fab-IL-23-Fc-PD-1 Ab)의 생성
IL-23 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
IL-23은 p19 서브유닛 및 p40 서브유닛으로 구성된 이종이량체 사이토카인이다. p40 서브유닛은 IL-12와 공유된다. 공유된 p40 서브유닛에서 아미노산 치환을 생성함으로써 IL-23 변이체를 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 작제하였다(표 7 참조). N'에서 C'으로, p40 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 31 내지 34) - 링커(SEQ ID NO: 229) - p19 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 37)의 단일 쇄 IL-23 변이체를 제조하였다. N'에서 C'으로 p40 야생형 서브유닛 - 링커(SEQ ID NO: 229) - p19 야생형 서브유닛의 단일 쇄 "야생형" IL-23도 또한 대조군으로서 작제하였으며(SEQ ID NO: 38), 표 7에서 "WT"로 지칭된다.
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 다양한 단일 쇄 IL-23 변이체(또는 단일 쇄 "야생형" IL-23 대조군)를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IL-23/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IL-23-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-23 변이체 IL-12B(p40 E59A/F60A)-링커-IL-23A(wt p19)를 포함하는 Fab-IL-23(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 113의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-23 변이체(SEQ ID NO: 39)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IL-23 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IL-23 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il23) 및 HEK-PD-1-IL-23 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-23 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IL-23 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IL-23 리포터 검정"으로도 지칭되는 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il23)에 따라, 상이한 IL-23 모이어티를 포함하는 다양한 Fab-IL-23-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인의 IL-23 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IL-23 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-23 리포터 세포는 인간 STAT3 유전자와 함께, IL-12Rβ1 및 IL-23 수용체(IL-23R)로 이루어진 수용체 복합체를 안정하게 발현하여, 완전히 기능성인 IL-23 신호전달 경로(TyK2/JAK2/STAT3)를 수득한다. 또한, 이들 리포터 세포는 STAT3-유도 가능한 SEAP 리포터 유전자도 또한 보유한다. IL-2 자극 시에, HEK-Blue™ IL-23 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-23 리포터 세포는 STAT3의 활성화 및 이후의 SEAP의 분비를 촉발시키며, 이의 수준은 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs) 비색 효소 검정을 사용하여 모니터링될 수 있다. 실험 절차는 IL-2 신호 전달 검정에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 유사하였다. 유리 상태의 재조합 인간 IL-23(rIL-23)을 양성 대조군으로서 그리고 활성 퍼센트 계산을 위한 참조물질로서 제공하였다.
[표 7]
표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 IL-23의 위치결정은 HEK-IL-23 리포터 세포에서 심지어 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 부재 하에서도, 약 70.0%의 IL-23 활성을 보유하였다. p40 서브유닛 내의 E59A 및 F60A 돌연변이는 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 부재 하에 IL-23 활성을 약 6.9% 또는 8.2%로 유의미하게 감소시켰으며, 이는 HEK-PD-1-IL-23 세포에서 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 존재 하에 약 39.0% 또는 46.0%로 구제되었다. IL-23 p40 서브유닛에 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-23-Fc-PD-1 Ab("Fab-IL-23(E59A/F60A)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 교차 반응성 없이(0.0%), PD-1-양성 세포 특이적 IL-23 생물학적 활성을 나타내었다(4.8%). 이들 데이터는 PD-1+ 세포를 향해 사이토카인(예를 들어, IL-23) 생물학적 활성을 특이적으로 표적화할 수 있는 항-PD-1 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 8: CD4+ T 세포에 대해 유도된 IL-23 생물학적 활성을 갖는 IL-23/항-CD4 면역사이토카인(Fab-IL-23-Fc-CD4 Ab)의 생성
이발리주맙(Trogarzo®) VH(SEQ ID NO: 73) 및 VL(SEQ ID NO: 74) 서열을 포함하는 항-CD4 항체를 부모 항-CD4 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 단일 쇄 "야생형" IL-23, 또는 실시예 7에 기재된 바와 같은 p40 서브유닛에 E59A, F60A, 또는 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 IL-23 변이체(SEQ ID NO: 31 내지 33)를 항-CD4 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IL-23/항-CD4 면역사이토카인 "Fab-IL-23-Fc-CD4 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, Fab-IL-23(E59A/F60A)-Fc-CD4 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-23 변이체(SEQ ID NO: 39)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다. FACS를 사용하여, Fab-IL-23-Fc-CD4 Ab가 CD4+ T 세포에 결합할 수 있었지만, CD8+ T 세포에는 그렇지 않았음을 확인하였다(데이터 미도시).
IL-23은 활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 자극하여, IFN-γ를 방출시킬 수 있다. 다양한 Fab-IL-23-Fc-CD4 Ab의 IL-23 생물학적 활성을 실시예 5에 기재된 바와 같은 IFN-γ 방출 검정을 사용하여 측정하였다. rIL-23을 양성 대조군 및 활성 퍼센트 참조물질로서 제공하였다.
[표 8]
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 p40 서브유닛을 포함하는 IL-23의 위치결정은 CD8+ T 세포에서 심지어 표적 항원(CD4)-항체 결합의 부재 하에서도 약 21.0%의 IL-23 활성을 여전히 보유하였다. p40 서브유닛 내의 E59A 및 F60A 돌연변이는 IL-23 활성을 CD4/항-CD4 항체 결합의 부재 하에 약 2.0% 또는 1.5%로 유의미하게 감소시켰으며, 이는 CD4+ T 세포/항-CD4 항체 결합의 존재 하에 약 24.0% 또는 29.0%로 구제되었다. IL-23 p40 서브유닛에 E59A/F60A 이중 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-23-Fc-CD4 Ab("Fab-IL-23(E59A/F60A)-Fc-CD4 Ab")는 CD8+ T 세포와의 교차 반응성 없이(0.0%), CD4+ T 세포 특이적 IL-23 생물학적 활성을 나타내었다(6.8%). 이들 데이터는 사이토카인(예를 들어, IL-23) 생물학적 활성을 CD4+ T 세포를 향해 특이적으로 표적화할 수 있는 항-CD4 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 9: PD-1-양성 세포에 대해 유도된 IL-10 생물학적 활성을 갖는 IL-10/항-PD-1 면역사이토카인(Fab-IL-10-Fc-PD-1 Ab)의 생성
IL-10 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
IL-10은 천연적으로 비-공유 결합된 동종이량체로서 발현된다. 위치 24 내지 32의 아미노산을 알라닌 또는 세린으로 대체함으로써 IL-10 변이체를 작제하였으며(표 9 참조), N'에서 C'으로, IL-10 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 21 내지 26) - 링커(SEQ ID NO: 227) - IL-10 변이체 서브유닛의 단일 쇄 IL-10 변이체를 제조하였다. N'에서 C'으로, IL-10 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 20) - 링커(SEQ ID NO: 227) - IL-10 야생형 서브유닛의 단일 쇄 "야생형" IL-10도 또한 대조군으로서 작제하였으며(SEQ ID NO: 27), 표 9에서 "WT"로 지칭된다.
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 다양한 단일 쇄 IL-10 변이체(또는 단일 쇄 "야생형" IL-10 대조군)를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조), IL-10/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IL-10-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-10 변이체 IL-10(R27A)-링커-IL-10(R27A)을 포함하는 Fab-IL-10(R27A)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 111의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-10 변이체(SEQ ID NO: 28)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IL-10 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IL-10 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il10) 및 HEK-PD-1-IL-10 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-10 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IL-10 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IL-10 리포터 검정"으로도 지칭되는 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-il10)에 따라, 상이한 IL-10 모이어티를 포함하는 다양한 Fab-IL-10-Fc-PD-1 Ab의 IL-10 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IL-10 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IL-10 리포터 세포는 IL-10 수용체 hIL-10Rα 및 hIL-10Rβ 쇄, 인간 STAT3 및 STAT3-유도 가능한 SEAP를 안정하게 발현한다. HEK-Blue™ IL-10 세포 또는 HEK-PD-1-IL-23 리포터 세포의 표면 상의 이의 수용체로의 IL-10의 결합은 JAK1/STAT3 신호전달 및 이후의 SEAP의 생성을 촉발시키며, 세포 배양 상청액 중 이의 수준은 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 실험 절차는 IL-2 신호 전달 검정에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 유사하였다. 유리 상태의 재조합 인간 IL-10(rIL-10)을 양성 대조군, 및 활성 퍼센트 계산을 위한 참조물질로서 제공하였다.
[표 9]
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 IL-10 서브유닛을 포함하는 IL-10의 위치결정은 HEK-IL-10 세포에서 심지어 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 부재 하에서도 약 26.0%의 IL-10 활성을 여전히 보유하였다. 시험된 모든 IL-10 변이체는 IL-10 활성을 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 부재 하에 "야생형" IL-10의 활성에 비하여 감소시켰으며, 이들의 IL-10 활성은 HEK-PD-1-IL-10 세포에서 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 존재 하에 구제되었다. IL-10에 R27A 돌연변이를 포함하는 Fab-IL-10-Fc-PD-1 Ab("Fab-IL-10(R27A)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 최소의 교차 반응성(<0.1%)과 함께, PD-1-양성 세포 특이적 IL-10 생물학적 활성을 나타내었다(21.0%). 이들 데이터는 PD-1-양성 세포를 향해 사이토카인(예를 들어, IL-10) 생물학적 활성을 특이적으로 표적화할 수 있는 항-PD-1 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 10: PD-1-양성 세포에 대해 유도된 IFN-γ 생물학적 활성을 갖는 IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인(Fab-IFN-γ-Fc-PD-1 Ab)의 생성
IFN-γ 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
IFN-γ는 천연적으로 대칭적인 동종이량체로서 발현된다. 위치 20 내지 25의 아미노산을 A, K, S, E, Q, 또는 V로 대체함으로써 IFN-γ 변이체를 작제하였으며(표 10 참조), N'에서 C'으로, IFN-γ 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 11 내지 17) - 링커(SEQ ID NO: 227) - IFN-γ 변이체 서브유닛의 단일 쇄 IFN-γ 변이체를 제조하였다. N'에서 C'으로, IFN-γ 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 10) - 링커(SEQ ID NO: 227) - IFN-γ 야생형 서브유닛의 단일 쇄 "야생형" IFN-γ도 또한 대조군으로서 작제하였으며(SEQ ID NO: 18), 표 10에 "WT"로 지칭된다.
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 다양한 단일 쇄 IFN-γ 변이체(또는 단일 쇄 "야생형" IFN-γ 대조군)를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조), IFN-γ/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IFN-γ-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IFN-γ 변이체 IFN-γ(A23V)-링커-IFN-γ(A23V)를 포함하는 Fab-IFN-γ(A23V)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 110의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IFN-γ 변이체(SEQ ID NO: 19)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IFN-γ 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IFN-γ 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-ifng) 및 HEK-PD-1-IFN-γ 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IFN-γ 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IFN-γ 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IFN-γ 리포터 검정"으로도 지칭되는 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-ifng)에 따라, 상이한 IFN-γ 모이어티를 포함하는 다양한 Fab-IFN-γ-Fc-PD-1 Ab의 IFN-γ 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IFN-γ 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IFN-γ 리포터 세포는 인간 STAT1 유전자 및 STAT1-유도 가능한 SEAP를 안정하게 발현한다. 경로의 다른 유전자는 천연적으로 리포터 세포에서 충분한 양으로 발현된다. HEK-Blue™ IFN-γ 세포 또는 HEK-PD-1-IFN-γ 리포터 세포의 표면 상의 IFNGR1 및 IFNGR2 쇄로 이루어진 이의 이종이량체 수용체로의 IFN-γ의 결합은 JAK1/JAK2/STAT1 신호전달 및 이후의 SEAP의 생성을 촉발시키며, 세포 배양 상청액 중 이의 수준은 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 실험 절차는 IL-2 신호 전달 검정에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 유사하였다. 유리 상태의 재조합 인간 IFN-γ(rIFN-γ)를 양성 대조군, 및 활성 퍼센트 계산을 위한 참조물질로서 제공하였다.
[표 10]
표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에서의 야생형 IFN-γ 서브유닛을 포함하는 IFN-γ의 위치결정은 HEK-IFN-γ 세포에서 심지어 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 부재 하에서도 약 36.0%의 IFN-γ 활성을 보유하였다. A23 잔기는 IFN-γ 생물학적 활성에 결정적인 것으로 보이는데, 이는 A23 돌연변이를 포함하는 모든 IFN-γ 변이체가 IFN-γ 활성을 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 부재 하에 "야생형" IFN-γ의 활성에 비하여 크게 감소시켰고, 이들의 IFN-γ 활성이 HEK-PD-1-IFN-γ 세포에서 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 존재 하에 구제되었기 때문이다. IFN-γ에 A23V 돌연변이를 포함하는 Fab-IFN-γ-Fc-PD-1 Ab("Fab-IFN-γ(A23V)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 최소의 교차 반응성(0.6%)과 함께, PD-1-양성 세포 특이적인 IFN-γ 생물학적 활성을 나타내었다(27.0%). IFN-γ에 A23E/D24E/N25K 3중 돌연변이를 포함하는 Fab-IFN-γ-Fc-PD-1 Ab("Fab-IFN-γ(A23E/D24E/N25K)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 최소의 교차 반응성과 함께(0.2%), PD-1-양성 세포 특이적인 IFN-γ 생물학적 활성을 나타내었다(23.0%). 이들 데이터는 PD-1-양성 세포를 향해 사이토카인(예를 들어, IFN-γ) 생물학적 활성을 특이적으로 표적화할 수 있는 항-PD-1 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 11: CD4+ T 세포에 대해 유도된 IFN-γ 생물학적 활성을 갖는 IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인(Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab)의 생성
이발리주맙(Trogarzo®) VH(SEQ ID NO: 73) 및 VL(SEQ ID NO: 74) 서열을 포함하는 항-CD4 항체를 부모 항-CD4 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 단일 쇄 "야생형" IFN-γ, 또는 실시예 10에 기재된 바와 같은 다양한 돌연변이를 포함하는 IFN-γ 변이체를 항-CD4 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2b 참조), IFN-γ/항-CD4 면역사이토카인 "Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, Fab-IFN-γ(A23V)-Fc-CD4 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IFN-γ 변이체(SEQ ID NO: 19)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IFN-γ는 세포 표면 상에서 PD-L1 발현을 유도할 수 있다. Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab 내의 다양한 IFN-γ 모이어티의 생물학적 활성을 평가하기 위하여, HEK-CD4-IFN-γ 세포를 렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IFN-γ 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-ifng)에서 인간 CD4를 과발현시킴으로써 인-하우스 생성하였다. rIFN-γ를 양성 대조군으로서 제공하였다. 항-PD-1 항체 니볼루맙(Opdivo®) 및 IFN-γ 처리 부재를 음성 대조군으로서 제공하였다. 요약하여, HEK-Blue™ IFN-γ 세포 또는 HEK-CD4-IFN-γ 세포를 배양 배지 단독(IFN-γ 부재), rIFN-γ(20 ng/mL), 항-PD-1 항체(1 μg/mL) 또는 다양한 Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab(1 μg/mL)의 존재 하에, 37℃에서, CO2 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 다음 날, 세포를 항-인간 PD-L1 알로피코시아닌(APC)-컨쥬게이트된 항체(바이오레전드(BioLegend), 카탈로그 번호 374513)로 염색하여, PD-L1 발현을 검출하였다. HEK-Blue™ IFN-γ 세포 또는 HEK-CD4-IFN-γ 세포에 대한 상이한 Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab(또는 대조군)의 결합 활성은 FACS를 사용하여 측정되는 평균 형광 세기(MFI)로서 반영되었다.
[표 11]
표 11로부터 알 수 있는 바와 같이, 리포터 세포의 IFN-γ 처리 부재 또는 항-PD-1 항체(음성 대조군) 처리는 약 15 MFI의 기준선 PD-L1 발현을 보여주었다. 항-CD4 항체의 힌지 영역에서의 야생형 IFN-γ 서브유닛을 포함하는 "WT" IFN-γ의 위치결정은 HEK-IFN-γ 세포에서 표적 항원(CD4)-항체 결합의 부재 하에서, (75 MFI의 유리 상태 rIFN-γ에 비하여) 약 57 MFI의 IFN-γ 활성을 보유하였다. 실시예 10의 데이터와 일치하게, A23 잔기는 IFN-γ 생물학적 활성에 결정적인 것으로 보이는데, 이는 A23 돌연변이를 포함하는 모든 IFN-γ 변이체가 CD4/항-CD4 항체 결합의 부재 하에 "WT" IFN-γ 또는 D24A/N25A IFN-γ 변이체의 활성에 비하여 IFN-γ 활성을 기준선 수준(약 15 MFI)에 가깝게 크게 감소시켰고, 이들의 IFN-γ 활성이 HEK-CD4-IFN-γ 세포에서 CD4/항-CD4 항체 결합의 존재 하에 구제되었기 때문이다. IFN-γ에 A23E/D24E/N25K 3중 돌연변이("Fab-IFN-γ(A23E/D24E/N25K)-Fc-CD4 Ab") 또는 A23V 돌연변이("Fab-IFN-γ(A23V)-Fc-CD4 Ab")를 포함하는 Fab-IFN-γ-Fc-CD4 Ab는 CD4-음성 세포와의 교차 반응성이 거의 없거나 전혀 없는(기준선 또는 그 미만에서 각각 13 MFI 또는 12 MFI), CD4+ 세포 특이적인 IFN-γ 생물학적 활성을 나타내었다(각각 59 MFI 또는 68 MFI). 이들 데이터는 사이토카인(예를 들어, IFN-γ) 생물학적 활성을 CD4-양성 세포를 향해 특이적으로 표적화할 수 있는 항-CD4 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 12: PD-1-양성 세포에 대해 유도된 IFN-α2b 생물학적 활성을 갖는 IFN-α2b/항-PD-1 면역사이토카인(Fab-IFN-α2b-Fc-PD-1 Ab)의 생성
IFN-α2b 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
IFN-α2b(Intron-A®)는 항바이러스 또는 항신생물 약물이다. 이는 재조합 형태의 IFN-α2이다. 위치 30 및 32 내지 34의 아미노산을 알라닌으로 대체함으로써 IFN-α2b 변이체를 작제하였다(SEQ ID NO: 4, 6, 7 및 8; 표 12 참조). 니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 다양한 IFN-α2b 변이체(또는 야생형 IFN-α2b 대조군 "WT")를 항-PD-1 항체의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜(예시적인 구조에 대하여 도 2a 참조), IFN-α2b/항-PD-1 면역사이토카인 "Fab-IFN-α2b-Fc-PD-1 Ab"를 작제하였다. 예를 들어, Fab-IFN-α2b(L30A)-Fc-PD-1 Ab 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 IFN-α2b(L30A) 변이체(SEQ ID NO: 4)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
IFN-α/β 신호 전달 검정
HEK-Blue™ IFN-α/β 세포(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-ifnab) 및 HEK-PD-1-IFN-α/β 세포(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IFN-α/β 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨)를 사용하여, 하기에서 "HEK-IFN-α/β 리포터 검정" 또는 "HEK-PD-1-IFN-α/β 리포터 검정"으로도 지칭되는 인비보겐 사용자 매뉴얼(인비보겐 카탈로그 번호 hkb-ifnab)에 따라, 상이한 IFN-α2b 모이어티를 포함하는 다양한 Fab-IFN-α2b-Fc-PD-1 Ab의 IFN-α2b 신호 활성화 활성을 평가하였다. 인간 STAT2 및 IRF9 유전자를 사용하는 HEK293 세포의 안정한 트랜스펙션에 의해 HEK-Blue™ IFN-α/β 리포터 세포 및 HEK-PD-1-IFN-α/β 리포터 세포를 생성하여, 완전히 활성인 I형 IFN 신호전달 경로 및 IFN-α/β 유도 가능한 ISG54 프로모터의 제어 하에 유도 가능한 SEAP를 수득하였다. 경로의 다른 유전자(IFNAR1, IFNAR2, JAK1, TyK2 및 STAT1)는 이들 세포에 의해 천연적으로 발현된다. IFNAR1 및 IFNAR2 쇄로 이루어진 이의 이종이량체 수용체로의 IFN-α 또는 IFN-β의 결합은 JAK/STAT/ISGF3 신호전달 및 이후의 SEAP의 생성을 촉발시키며, 세포 배양 상청액 중 이의 수준은 QUANTI-Blue™(인비보겐 카탈로그 번호 rep-qbs)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 실험 절차는 IL-2 신호 전달 검정에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 유사하였다. 유리 상태의 IFN-α2b를 양성 대조군, 및 활성 퍼센트 계산을 위한 참조물질로서 제공하였다.
[표 12]
표 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 항-PD-1 항체의 힌지 영역에서의 야생형 IFN-α2b의 위치결정은 HEK-IFN-α/β 세포에서 심지어 표적 항원(PD-1)-항체 결합의 부재 하에서도 약 54.0%의 IFN-α2b 활성을 보유하였다. L30, D32, R33 및 H34 잔기는 전부 IFN-α2b 생물학적 활성에 결정적인 것으로 보이는데, 이는 모든 IFN-α2b 변이체가 IFN-α2 활성을 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 부재 하에 야생형 IFN-α2b의 활성에 비하여 크게 감소시켰고, 이들의 IFN-α2b 활성이 HEK-PD-1-IFN-α/β 세포에서 PD-1/항-PD-1 항체 결합의 존재 하에 구제되었기 때문이다. IFN-α2b에 L30A 돌연변이를 포함하는 Fab-IFN-α2b-Fc-PD-1 Ab("Fab-IFN-α2b(L30A)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 크게 감소된 교차 반응성과 함께(15.0%), PD-1-양성 세포 특이적인 IFN-α2b 생물학적 활성을 나타내었다(110.0%). IFN-α2b에 R33A 돌연변이를 포함하는 Fab-IFN-α2b-Fc-PD-1 Ab("Fab-IFN-α2b(R33A)-Fc-PD-1 Ab")는 PD-1-음성 세포와의 크게 감소된 교차 반응성과 함께(5.0%), PD-1-양성 세포 특이적인 IFN-α2b 생물학적 활성을 나타내었다(25.0%). 이들 데이터는 PD-1-음성 세포를 향한 감소된 사이토카인 생물학적 활성과 함께, PD-1-양성 세포를 향해 사이토카인(예를 들어, IFN-α2b) 생물학적 활성을 특이적으로 표적화할 수 있는 항-PD-1 항체-기반의 면역사이토카인의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 13: IL-2/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 힌지 영역에서의 IL-2 변이체의 배치는 마우스에서의 독성을 유의미하게 감소시킨다
실시예 3에 기재된 바와 유사하게, PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질(SEQ ID NO: 177을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드)을 부모 항원-결합 단백질로서 사용하여, PD-1에 결합하는 면역사이토카인을 작제하였다. 이종이량체 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질을 작제하기 위하여, 하나의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 52를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 PD-L2-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 51을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. IL-2 변이체(R38D/K43E/E61R; SEQ ID NO: 2)를 하나의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치시키거나(하기에서 "IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인" 또는 "작제물 #11"로 지칭됨), 하나의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 C-말단에 융합시켰다(하기에서 "PD-L2-Fc/IL-2(R38D/K43E/E61R) 면역사이토카인"으로 지칭됨). IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 180을 포함하는 하나의 IL-2 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 179를 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드를 포함한다.
25마리의 BALB/c 마우스를 5개의 그룹으로 무작위로 나누었으며(각 그룹에 5마리의 마우스), 200 μg 또는 1000 μg의 IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인, PD-L2-Fc/IL-2(R38D/K43E/E61R) 면역사이토카인, 또는 부모 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질을 대조군으로서 복강내 주사하였다. 각 그룹에 복강내 주사를 제1일 및 제5일에 제공하였다. 마우스를 4가지 파라미터에 대하여 매일 모니터링하였다: i) 모피 질감, ii) 감소된 활동, iii) 병적 상태 및 iv) 10% 초과의 체중 감소.
표 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, IL-2 변이체를 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 C-말단에 배치하는 경우, 5마리의 마우스 중 5마리가 고 및 저 용량 군 둘 모두에서 주사 후 4 내지 6일에 사망하였다. 대조적으로, IL-2 변이체를 힌지 영역에 위치시킨 경우, 심지어 고 용량의 면역사이토카인(1000 μg)으로 투여되는 경우에도 모든 마우스는 생존하였다. 동일한 생존률이 대조군에서 관찰되었다(IL-2 융합이 없는 PD-L2-Fc). 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 갖는 면역사이토카인에 있어서, 용량을 200 μg에서 1000 μg으로 증가시킨 때의 증가된 체중 감소 및 더 크게 감소된 활동에 의해 나타난 바와 같이, 독성은 용량-의존적인 것으로 나타났다.
[표 13]
실시예 14: IL-12/항-PD-1 면역사이토카인의 힌지 영역에서의 IL-12 변이체의 배치는 마우스에서의 독성을 유의미하게 감소시킨다
IL-12 변이체 및 이의 면역사이토카인의 작제
실시예 4에 기재된 바와 유사하게, 3개의 단일 쇄 IL-12 변이체를 생성하였다. "IL-12(F60A)"(SEQ ID NO: 275)는 N'에서 C'으로, p40 F60A 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 33) - 링커(SEQ ID NO: 228) - p35 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 29)을 포함한다. "IL-12(G64A)"는 N'에서 C'으로, p40 F60A 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 34) - 링커 (SEQ ID NO: 228) - p35 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 29)을 포함한다. "IL-12(E59A/F60A)"(SEQ ID NO: 36)는 N'에서 C'으로, p40 E59A/F60A 변이체 서브유닛(SEQ ID NO: 31) - 링커(SEQ ID NO: 228) - p35 야생형 서브유닛(SEQ ID NO: 29)을 포함한다.
실시예 4에 기재된 바와 같이, IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(작제물 #48)은 SEQ ID NO: 106의 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 SEQ ID NO: 112의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역에 위치한 단일-쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36)를 갖는 하나의 중쇄를 포함한다. IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인 내의 단일-쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체를 단일-쇄 IL-12(F60A) 변이체(SEQ ID NO: 275) 또는 단일-쇄 IL-12(G64A) 변이체(SEQ ID NO: 332)로 대체하여, 각각 IL-12(F60A)/항-PD-1 면역사이토카인 및 IL-12(G64A)/항-PD-1 면역사이토카인을 작제하였다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
30마리의 BALB/c 마우스를 6개의 그룹으로 무작위로 나누었으며(각 그룹에 5마리의 마우스), 200 μg 또는 1000 μg의 IL-12(F60A)/항-PD-1 면역사이토카인, IL-12(G64A)/항-PD-1 면역사이토카인, 또는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인을 복강내 주사하였다. 각 그룹에 복강내 주사를 제1일 및 제5일에 제공하였다. 마우스를 4가지 파라미터에 대하여 매일 모니터링하였다: i) 모피 질감, ii) 감소된 활동, iii) 병적 상태 및 iv) 10% 초과의 체중 감소.
표 14로부터 알 수 있는 바와 같이, IL-12(G64A) 변이체를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인은 저 용량 군에서 4/5마리의 마우스의 사망 및 고 용량 군에서 5/5마리의 마우스의 사망에 의해 나타나는 바와 같이 가장 높은 독성을 보였다. 대조적으로, IL-12(F60A) 변이체를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인으로의 처리는 고 용량 군(1000 μg)에서 오직 1건의 사망을 유도하고, 저 용량 군(200 μg)에서 사망을 유도하지 않았으며; IL-12(E59A/F60A) 변이체를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인으로의 처리는 어느 하나의 용량에서 사망을 유도하지 않았다. IL-12 이중 돌연변이 E59A/F60A를 포함하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인은 또한, 독성 증상의 중증도의 차이에 의해 나타나는 바와 같이, IL-12 단일 F60A 돌연변이를 포함하는 것에 비하여 더 적은 독성을 나타내었다.
[표 14]
실시예 15: PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질을 사용하는 항-PD-1 부모 항체의 대체는 IL-12 면역사이토카인의 독성을 유의미하게 감소시킨다
IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 작제
PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질(SEQ ID NO: 177을 각각 포함하는 2개의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드)을 부모 항원-결합 단백질로서 사용하여, PD-1에 결합하는 면역사이토카인을 작제하였다. 이종이량체 PD-L2-힌지-Fc 융합 단백질을 작제하기 위하여, 하나의 PD-L2-힌지-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 52를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 PD-L2-Fc 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 51을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 실시예 14에 기재된 바와 같은 단일 쇄 IL-12 변이체(F60A, G64A, 또는 E59A/F60A)를 하나의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치시키거나(하기에서 "IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인"으로 지칭됨), 하나의 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 C-말단에 융합시켰다(하기에서 "PD-L2-Fc/IL-12 면역사이토카인"으로 지칭됨). 예를 들어, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인("작제물 #29")은 SEQ ID NO: 186을 포함하는 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커 - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다. IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인 내의 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체를 단일-쇄 IL-12(F60A) 변이체(SEQ ID NO: 275) 또는 단일-쇄 IL-12(G64A) 변이체(SEQ ID NO: 332) 중 어느 하나로 대체하여, 각각 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인("작제물 #30") 및 IL-12(G64A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인을 작제하였다. 예를 들어, IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 SEQ ID NO: 274를 포함하는 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 단일 쇄 IL-12(F60A) 변이체(SEQ ID NO: 275) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다. PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인("작제물 #34")은 SEQ ID NO: 276을 포함하는 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61) - GGGGSGGGGSGGGGS 링커(SEQ ID NO: 229) - 단일 쇄 IL-12(F60A) 변이체(SEQ ID NO: 275)); 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하고, 발현시키고, 정제하였다.
50마리의 BALB/c 마우스를 10개의 그룹으로 무작위로 나누고(각 그룹에 5마리의 마우스), 200 μg 또는 1000 μg의 i) IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인, ii) IL-12(G64A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인, iii) IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인, iv) PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(Fc의 C'에 IL-12), 또는 v) PD-L2-Fc/IL-12(E59A/F60A) 면역사이토카인(Fc의 C'에 IL-12)을 복강내 주사하였다. 각 그룹에 복강내 주사를 제1일 및 제5일에 제공하였다. 마우스를 4가지 파라미터에 대하여 매일 모니터링하였다: i) 모피 질감, ii) 감소된 활동, iii) 병적 상태 및 iv) 10% 초과의 체중 감소.
표 15로부터 알 수 있는 바와 같이, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 갖는 면역사이토카인 중에, IL-12(G64A) 변이체를 포함하는 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 저 용량 군에서 3/5마리의 마우스의 사망 및 고 용량 군에서 5/5마리의 마우스의 사망에 의해 나타난 바와 같이, 가장 높은 독성을 보였다. 이는 실시예 14에서의 모든 IL-12 변이체 중의 IL-12(G64A)의 가장 높은 독성 결과와 일치한다. IL-12(F60A) 변이체를 PD-L2-힌지-Fc 폴리펩티드의 C-말단에 배치하는 경우, 고 용량 군에서 5마리 중 2마리의 마우스가 사망하였다. 대조적으로, IL-12(F60A) 변이체를 힌지 영역에 위치시킨 경우, 심지어 고 용량의 면역사이토카인(1000 μg)을 투여하는 경우에도 모든 마우스가 생존하였다. 실시예 14의 결과와 일치하게, 독성 증상의 중증도의 차이에 의해 나타나는 바와 같이, IL-12 변이체가 힌지 영역에 위치하든지 Fc의 C-말단에 위치하든지에 상관 없이, IL-12 이중 돌연변이 E59A/F60A를 포함하는 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 IL-12 단일 F60A 돌연변이를 포함하는 것에 비하여 더 적은 독성을 나타내었다. 용량을 200 μg에서 1000 μg으로 증가시킨 경우, 증가된 독성 증상의 중증도, 예컨대 악화된 모피 질감, 증가된 체중 감소 및/또는 더 큰 감소된 활동에 의해 나타난 바와 같이, 대부분의 면역사이토카인에 대하여 용량-의존적인 독성이 관찰되었다. 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 심지어 고 용량으로 투여되는 경우에도 0의 사망률과 독성 증상의 부재와 함께, 실제로 생체내에서 모든 IL-12/PD-L2-Fc 및 PD-L2-Fc/IL-12 면역사이토카인의 최소의 독성을 나타내었다.
표 14와 표 15를 비교하여, 본 발명자들의 결과는 IL-12-기반의 면역사이토카인에서 항-PD-1 항원-결합 단편을 PD-L2 리간드로 대체하여, 전체 독성을 추가로 감소시킬 수 있는 것을 나타낸다. 예를 들어, IL-12(G64A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 저 용량 군에서의 3/5의 사망률 대 IL-12(G64A)/항-PD-1 면역사이토카인의 저 용량 군에서의 4/5의 사망률을 비교하고; IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 고 용량 군에서의 0의 사망률 대 IL-12(F60A)/항-PD-1 면역사이토카인의 고 용량 군에서의 1/5의 사망률을 비교한다. 실시예 14 및 15에서 각각의 IL-12 변이체 면역사이토카인 간의 독성 증상을 비교하면, PD-L2-Fc 기반의 면역사이토카인이 더 낮은 독성을 갖는다는 것이 명백하게 확인된다. 예를 들어, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(작제물 #29)은 저 또는 고 용량으로 투여되는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(작제물 #48)에 비하여 독성 증상을 완전히 제거하였으며; IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)은 저 또는 고 용량 군에서 IL-12(F60A)/항-PD-1 면역사이토카인의 것에 비하여 더 적은 독성 증상(오직 모피 질감만)을 보였다. PD-L2-Fc 기반의 IL-12 면역사이토카인에서 관찰되는 감소된 독성은 아마도 IL-12의 면역자극/염증-유발성 활성에 대해 "균형을 이루는" 면역억제 신호를 생성하였던 PD-L2-PD-1 결합 시의 자극된 PD-1 저해성 면역 관문 신호전달 때문이었을 것이다.
[표 15]
실시예 16: 4T1 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
IL-12(E59A/F60A)/IL-2(R38D/K43E/E61R)/항-PD-1 면역사이토카인의 작제
실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이, 니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. IL-2 R38D/K43E/E61R 변이체(SEQ ID NO: 2)를 이종이량체 항-PD-1 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켰으며, 단일-쇄 IL-12 E59A/F60A 변이체(SEQ ID NO: 36)를 이종이량체 항-PD-1 항체의 다른 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치시켜, "IL-12(E59A/F60A)/IL-2(R38D/K43E/E61R)/항-PD-1 면역사이토카인"(또는 "작제물 #54")을 작제하였다. 면역사이토카인을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고, 정제하였다.
마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 4T1 쥣과 유방암 세포를 접종하였다. 종양 접종 7일 후에, 종양 크기는 약 50 내지 150 mm3인 것으로 측정되었다. 종양 크기를 측정한 후에, 마우스에 10 mg/kg(약 200 μg)의 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(실시예 4 및 14에서 작제됨; 도 5에서 작제물 #48), 10 mg/kg(약 200 μg)의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 도 5에서 작제물 #29), 5 mg/kg(약 100 μg)의 IL-12(E59A/F60A)/IL-2(R38D/K43E/E61R)/항-PD-1 면역사이토카인(도 5에서 작제물 #54), 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(각각 주사마다 10 mg/kg 또는 5 mg/kg)를 접종 후 제7일, 제13일 및 제19일에 제공하였다(도 5에서 흑색 화살표로 표시됨). 종양 크기를 처음 주사 이후 3일마다 측정하였다. 종양 크기가 2000 mm3 초과에 도달하면, 마우스를 희생시켰다.
4T1 마우스 모델에 의해 반영되는 바와 같은 유방암은 항-PD-1, 항-CTLA-4, 및 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체로의 조합 처리를 포함하는 현행의 면역치료법에 매우 저항성이다. 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 3가지 IL-12 면역사이토카인은 4T1 종양 성장을 유의미하게 저해하였으며, 이는 유망한 생체내 효능을 나타낸다.
추가로, IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(#48) 및 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc(#29)는 동일한 용량으로 투여되는 경우 4T1 종양에 대하여 유사한 세포독성을 보였다(도 5). 실시예 14 및 15로부터의 결과와 조합하여, 이들 데이터는 PD-1 면역억제 신호를 차단하는 항-PD-1 항원-결합 도메인에 비하여, 면역사이토카인 작제물에서 PD-L2 세포외 도메인을 이용하여, 아마도 사이토카인(예를 들어, IL-12)의 면역자극/염증-유발성 활성을 PD-L2/PD-1 신호전달로부터의 면역억제 신호와 균형을 이루게 함으로써, 유사한 항-종양 효과를 달성할 뿐만 아니라 원치 않는 독성을 감소시킬 수 있었음을 추가로 나타낸다.
실시예 17: EMT6 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인 및 IL-2 면역사이토카인의 생체내 효능
마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 EMT6 쥣과 유방암 세포를 접종하였다. 종양 접종 7일 후에, 종양 크기는 약 50 내지 150 mm3인 것으로 측정되었다. 종양 크기를 측정한 후에, 마우스에 10 mg/kg(약 200 μg)의 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(실시예 4 및 14에서 작제됨; 도 6에서 작제물 #48), 10 mg/kg(약 200 μg)의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 도 6에서 작제물 #29), 10 mg/kg(약 200 μg)의 IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 3에서 작제됨; 도 6에서 작제물 #11) 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(주사마다 10 mg/kg)를 접종 후 제7일, 제13일 및 제19일에 제공하였다(도 6에서 흑색 화살표로 표시됨). 종양 크기를 처음 주사 이후 3일마다 측정하였다. 종양 크기가 2000 mm3 초과에 도달하면, 마우스를 희생시켰다.
EMT6 종양 성장은 항-PD-1 면역치료법에 저항성이다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 면역사이토카인은 EMT6 종양 성장을 유의미하게 저해하였으며, 이 중 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 및 IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L2-Fc 면역사이토카인은 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인에 비하여 더 나은 효능을 나타내었다. PD-L2-Fc 기반의 IL-12 면역사이토카인에서 관찰되는 약간 더 낮은 효능은 아마도 IL-12의 면역자극/염증-유발성 활성에 대해 "균형을 이루는" 면역억제 신호를 생성하였던 PD-L2-PD-1 결합 시의 자극된 PD-1 저해성 면역 관문 신호전달 때문일 것이다.
실시예 18: CT26 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 CT26 쥣과 결장암 세포를 접종하였다. 종양 크기가 약 100 내지 200 mm3에 도달하는 경우(접종 후 약 제11일), 마우스에 10 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30; 5마리의 마우스), 10 mg/kg의 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #34; 5마리의 마우스), 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(주사마다 10 mg/kg)를 접종 후 제11일, 제14일 및 제18일에 제공하였다(도 7a 및 도 7b에 흑색 화살표로 표시됨). 시간이 지남에 따라 종양 크기를 기록하였다. 종양 크기가 2000 mm3 초과에 도달하는 경우 마우스를 희생시켰다. 도 7a의 괄호 안의 종양 크기는 처음 치료를 시행한 때, 각각의 군의 평균 종양 크기(± 표준 편차)를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34)은 모든 5마리의 마우스에서 종양 성장을 성공적으로 저해하였으며(100% 치유율), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)은 5마리 중 4마리의 마우스에서 종양 성장을 성공적으로 저해하였다(80% 치유율). 치유된 마우스 중에, 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인의 종양 저해 효능은 유사하였으며, 이는 IL-12 힌지 융합과 C-말단 융합 간에 유의미한 효능 차이가 없음을 뒷받침한다. 이 결과는 시험된 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인이 마우스에서 CT26 동계 결장 종양을 완전히 퇴행시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 19: CT26 종양에 대한 암 백신으로서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
본원에 기재된 면역사이토카인이 암 백신으로서 기능하거나, 암 재발을 예방할 수 있는지를 조사하기 위하여, 종양 재-시험감염을 실시예 18로부터의 모든 치유된 마우스에서 행하였다. 마지막 면역사이토카인 주사 30일 후에, 치유된 마우스에 0.25×106개의 CT26 쥣과 결장암 세포를 우측 옆구리에, 그리고 (대조군으로서) 0.25×106개의 EMT6 쥣과 유방암 세포를 좌측 옆구리에 접종하였다. 종양 크기를 재시험감염 종양 접종 후 4일마다 기록하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, CD26 종양에 대하여 면역사이토카인으로 이전에 치료된 모든 치유된 마우스는 CT26 종양 재-시험감염으로부터 보호되었지만, EMT6으로부터는 보호되지 않았다. IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 및 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34)은 CT26 종양 재-시험감염에 대하여 유사한 보호 효능을 나타내었다. 이들 결과는 항-CT26 종양 기억의 성공적인 생성을 나타내며, 이는 본원에 기재된 면역사이토카인, 예컨대 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 및 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 둘 모두가 마우스에서 (예를 들어, CT26 결장암에 대한) 암 백신으로서 제공될 수 있고/있거나 암 재발을 예방할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 20: 후기 CT26 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
후기 암을 위한 성공적인 치료법은 거대한 임상적인 요구가 충족되지 않고 있다. 본원에 기재된 면역사이토카인이 후기 암을 치료하는 데 효과적인지를 연구하기 위하여, 마우스에 암 세포를 접종하고, 마우스에서 면역치료법으로 치료 불가능한 것으로 여겨지는 250 mm3보다 크게 종양이 성장되게 하였다. 이러한 쥣과 종양 체적은 진행된 후기 인간 암 환자에서의 종양 부담을 모방할 수 있다.
요약하여, 마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 CT26 쥣과 결장암 세포를 접종하였다. 종양 크기가 약 250 내지 400 mm3에 도달한 경우, 마우스에 20 mg/kg의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #29; 7마리의 마우스) 또는 10 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30; 5마리의 마우스)을 주사하였다. 총 5회의 주사를 작제물 #29로 치료되는 마우스에 대해서는 접종 후 제11일, 제15일, 제20일, 제26일 및 30일에, 또는 작제물 #30으로 치료되는 마우스에 대해서는 접종 후 제22일, 제26일, 제30일, 제34일 및 제38일에 제공하였다(도 9에 흑색 화살표로 표시됨). 도 9의 괄호 안의 종양 크기는 처음 치료를 시행한 때의 각각의 마우스의 종양 크기를 나타내며, 이는 250 mm3와 유사하거나, 이보다 컸다. 종양 크기를 시간이 지남에 따라 기록하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)을 제공한 모든 마우스가 유의미하게 감소된 종양 크기를 갖는 한편(100% 치유율); IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29)을 제공한 5/7(71.4% 치유율)마리의 마우스가 유의하게 감소된 종양 크기를 가졌다. 이들은 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인이 후기암(예를 들어, 후기 결장암)을 치료하는 데 효과적임을 나타낸다. 관찰되는 효능 차이는 단일 돌연변이 IL-12(F60A)에 비한 이중 돌연변이 IL-12(E59A/F60A)의 더 낮은 효력(예를 들어, 수용체 결합 및/또는 신호 활성화 능력) 때문이었다. 이러한 효능 차이는 IL-12(E59A/F60A)-기반의 면역사이토카인의 주사마다 더 높은 투여량(예를 들어, 20 mg/kg 대 10 mg/kg) 또는 더 많은 주사(3회에서 5회로의 주사 증가)에 의해 보상될 수 있다.
도 10은 CT26 종양을 접종한 1마리의 예시적인 마우스를 보여주며, 초기 종양 부피는 290.6 mm3인 것으로 측정되었다. IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)의 초기 주사 후 제0일, 제7일 및 제14일에 사진을 찍었으며, 이는 거대한 종양(진행된 후기 인간 암과 동등함)의 성공적인 퇴행을 나타낸다.
실시예 21: EMT6 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 EMT6 쥣과 유방암 세포를 접종하였다. 종양 크기가 약 50 내지 100 mm3에 도달할 때(종양 접종 후 약 7일), 마우스에 10 mg/kg의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #29), 10 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30), 10 mg/kg의 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(실시예 4에서 작제됨; 작제물 #48), 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(주사마다 10 mg/kg)를 접종 후 제7일, 제12일 및 제16일에 제공하였다(도 11a 및 도 11b에 흑색 화살표로 표시됨). 종양 크기를 시간이 지남에 따라 기록하였다. 종양 크기가 1500 mm3 초과에 도달하면, 마우스를 희생시켰다. 도 11a의 괄호 안의 종양 크기는 처음 치료를 시행한 때, 각각의 군의 평균 종양 크기(± 표준 편차)를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b에서 관찰되는 바와 같이, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29)은 3/5마리의 마우스에서 종양 성장을 성공적으로 저해하였으며(60% 치유율); IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 및 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48) 둘 모두는 모든 5마리의 마우스에서 종양 성장을 성공적으로 저해하였다(100% 치유율). IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48)으로 처리된 마우스 군의 초기 평균 종양 크기는 다른 2개의 시험군의 종양 크기의 2배 초과였다. 이들 결과는 시험된 모든 3가지 IL-12 면역사이토카인이 마우스에서 EMT6 동계 유방 종양을 완전히 퇴행시킬 수 있으며, 항-PD-1 기반의 면역사이토카인이 최적의 효능을 갖는 것을 보여준다.
실시예 22: EMT6 종양에 대한 암 백신으로서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
본원에 기재된 면역사이토카인이 암 백신으로서 기능하거나, 암 재발을 예방할 수 있는지를 조사하기 위하여, 종양 재-시험감염을 실시예 21로부터의 모든 치유된 마우스에서 행하였다. 마지막 면역사이토카인 주사 30일 후에, 치유된 마우스에 0.25×106개의 EMT6 쥣과 유방암 세포를 우측 옆구리에, 그리고 (대조군으로서) 0.25×106개의 CT26 쥣과 결장암 세포를 좌측 옆구리에 접종하였다. 종양 크기를 재시험감염 종양 접종 후 4일마다 기록하였다.
도 12에서 관찰된 바와 같이, EMT6 종양에 대하여 면역사이토카인으로 이전에 치료된 모든 치유된 마우스는 EMT6 종양 재-시험감염으로부터 보호되었지만, CT26으로부터는 보호되지 않았다. 또한, 모든 3가지 IL-12 면역사이토카인은 EMT6 종양 재-시험감염에 대하여 유사한 보호 효능을 나타내었다. 이들 결과는 항-EMT6 종양 기억의 성공적인 생성을 나타내며, 이는 본원에 기재된 면역사이토카인, 예컨대 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2 Fc 면역사이토카인(#29), IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 및 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(#48)이 마우스에서 (예를 들어, 유방암(예컨대 EMT6) 종양에 대한) 암 백신으로서 제공될 수 있고/있거나, 암 재발을 예방할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 23: 4T1 3중 음성 유방암(TNBC) 정위 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
4T1은 유방암 전이에 대한 예비임상 연구에서 사용되는 표준 쥣과 유방 종양 모델이다. 4T1은 면역치료법에 대한 불응성 모델이며, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 치료법에 반응하지 않는다. 4T1의 유방 지방 패드 주사는 4T1 유방암-유래 폐 전이를 재현 가능하게 생성할 수 있다.
면역치료법-저항성 암 유형 및 암 전이에 대한 본원에 기재된 면역사이토카인의 치료적 효능을 시험하기 위하여, 마우스(약 20 g 체중)에 #3 유선 지방 패드 내에 0.25×106개의 4T1 쥣과 유방암 세포를 접종하였다. 종양 발생을 대략 21 내지 30일 동안 모니터링하였다. 종양 접종 4일 후에, 마우스에 (주사마다) 20 mg/kg의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #29), (주사마다) 20 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30), (주사마다) 10 mg/kg의 항-PD-1 항체 및 10 mg/kg의 항-CTLA-4 항체의 조합 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 5회의 주사를 4일마다 제공하였다. 마우스를 4주 후에 희생시키고, 원발성 종양을 유방 지방 패드로부터 추출하였다.
도 13에서 관찰되는 바와 같이, PBS 대조군에 비하여, IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)은 시험된 모든 마우스에서 유선 내의 4T1 성장을 저해하였으며, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29)은 시험된 3마리 중 1마리의 마우스에서 유선 내의 4T1 성장을 저해한 한편, 항-PD-1+항-CTLA-4 조합 치료는 시험된 모든 3마리의 마우스에서 유선 내의 4T1 성장을 저해하지 못하였다. 상기 논의된 바와 같이, 효능 차이는 아마도 단일 돌연변이 IL-12(F60A)에 비한 이중 돌연변이 IL-12(E59A/F60A)의 더 낮은 효력(예를 들어, 수용체 결합 및/또는 신호 활성화 능력) 때문일 것이다. 이러한 효능 차이는 IL-12(E59A/F60A)-기반의 면역사이토카인의 주사마다 더 높은 투여량(예를 들어, 40 mg/kg 대 20 mg/kg) 또는 더 많은 주사(예를 들어, 5회에서 7회로의 주사 증가)에 의해 보상될 수 있다.
암 전이에 대한 치료적 효능을 조사하기 위하여, 희생된 마우스로부터 폐를 회수하였다. 폐 조직을 콜라게나제/DNase 용액 중에 재현탁화시키고, 70 μm 셀 스트레이너(cell strainer)를 통해 여과하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 배지 중에 재현탁화시켰다. 4회의 1:10 단계 희석이 이루어졌다. 세포를 37℃에서 14일 동안 7% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 4T1 세포 콜로니의 형성을 가능하게 하였다.
도 14에서 관찰되는 바와 같이, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#29) 및 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30) 둘 모두는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 또는 PBS(음성 대조군)에 비하여 폐에서 4T1 전이를 유의미하게 저해하였다. 이들 결과는 통계적으로 유의미하게 상이하였다(p-값 < 0.001).
이들 데이터는 진행성 및/또는 난치성 유방암(예를 들어, TNBC)의 치료, 암 전이의 저해 및 아마도 현행의 면역치료법에 대하여 저항성인 다른 암 유형의 치료에서의 IL-12 면역사이토카인의 유망한 생체내 효능을 입증한다.
실시예 24: B16 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
B16은 인간 피부암을 위한 모델로서 연구를 위해 사용되는 쥣과 흑색종 종양 세포주이다. B16은 면역치료법에 대한 불응성 모델이며, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 치료법에 반응하지 않는다.
더 많은 면역치료법-저항성 암 유형에 대한 본원에 기재된 면역사이토카인의 치료 효능을 시험하기 위하여, 마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 B16 쥣과 흑색종 세포를 접종하였다. 종양 크기가 약 50 내지 100 mm3에 도달한 때, 마우스에 10 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30), 10 mg/kg의 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨, 작제물 #34), 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(주사마다 10 mg/kg)를 접종 후 제10일, 제13일 및 제16일에 제공하였다(도 15a 및 도 15b에서 흑색 화살표로 표시됨). 종양 크기를 시간이 지남에 따라 기록하였다. 종양 크기가 1000 mm3 초과에 도달하면, 마우스를 희생시켰다. 도 15a의 괄호 안의 종양 크기는 처음 치료를 시행한 때의 각각의 군의 평균 종양 크기(± 표준 편차)를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b에서 관찰된 바와 같이, B16 종양이 접종 후 제13일 이후에 현저하게 성장한 PBS 처리군에 비하여, PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 및 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)은 둘 모두 접종 후 제24일 이후까지 B16 종양 성장을 유의미하게 저해하였으며, 이는 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인이 종양 진행을 둔화시키고/시키거나, 면역치료법-저항성 암(예를 들어, 흑색종)을 갖는 개체의 수명을 연장시킬 수 있음을 나타내며, 이는 유망한 생체내 효능을 입증한다.
실시예 25: LL2 동계 종양 마우스 모델에서의 IL-12 면역사이토카인의 생체내 효능
LL2 쥣과 폐 암종 모델은 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합 치료법에 반응하지 않는 면역치료법에 대한 불응성 모델이다.
더 많은 면역치료법-저항성 암 유형에 대한 본원에 기재된 면역사이토카인의 치료적 효능을 시험하기 위하여, 마우스(약 20 g 체중)에 0.25×106개의 LL2 쥣과 폐암 세포를 접종하였다. 종양 크기가 약 50 내지 100 mm3에 도달한 때(접종 후 약 16일), 마우스에 10 mg/kg의 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨; 작제물 #30), 10 mg/kg의 PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(실시예 15에서 작제됨, 작제물 #34) 또는 PBS(음성 대조군)를 주사하였다. 총 3회의 주사(주사마다 10 mg/kg)를 접종 후 제16일, 제20일 및 제23일에 제공하였다(도 16a 및 도 16b에서 흑색 화살표로 표시됨). 종양 크기를 시간이 지남에 따라 기록하였다. 종양 크기가 1000 mm3 초과에 도달하면, 마우스를 희생시켰다. 도 16a의 괄호 안의 종양 크기는 처음 치료를 시행한 때의 각각의 군의 평균 종양 크기(± 표준 편차)를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b에서 관찰된 바와 같이, LL2 종양이 접종 후 약 20일 이후에 현저하게 성장한 PBS 처리군에 비하여, PD-L2-Fc/IL-12(F60A) 면역사이토카인(#34) 및 IL-12(F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인(#30)은 접종 후 제32일 내지 제35일 이후까지 LL2 종양 성장을 유의미하게 저해하였으며, 이는 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인이 종양 진행을 둔화시키고/시키거나, 면역치료법-저항성 암(예를 들어, 폐암)을 갖는 개체의 수명을 연장시킬 수 있음을 나타내며, 이는 유망한 생체내 효능을 입증한다.
요약하자면, 상기 데이터(예를 들어, 실시예 23 내지 25 참조)는 다양한 진행성 및/또는 난치성 암 유형(예를 들어, TNBC, 흑색종, 폐암)의 치료, 암 전이의 저해, 현행의 면역치료법(예를 들어, 항-PD-1 치료법, 항-CTLA-4 치료법 또는 이의 조합 치료법)에 저항성인 암 유형의 치료 또는 이의 종양 진행의 지연 및/또는 이러한 환자의 수명의 연장에서의 본원에 기재된 면역사이토카인(예를 들어, IL-12/PD-L2-Fc 기반의 면역사이토카인)의 유망한 생체내 효능을 나타낸다.
실시예 26: 면역사이토카인 내의 사이토카인 또는 이의 변이체의 위치는 면역사이토카인의 비-특이적인 활성에 영향을 미친다
2가지 면역사이토카인 설계를 생성하여, 힌지 영역(항원-결합 도메인과 Fc 단편 사이; 숨겨진 형식)에서의 또는 Fc 단편의 C-말단(예를 들어, 항체 중쇄의 C'; 노출된 형식)에서의 사이토카인 또는 이의 변이체의 배치가 사이토카인 또는 이의 변이체의 표적화된 활성에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 시험하였다. 제1 설계는 항-PD-1 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역: CH1과 CH2 사이의 힌지 영역 내부에 사이토카인을 혼입시켰다(면역사이토카인을 "IL-12/항-PD-1"의 형식으로 명명하였음). 제2 설계는 사이토카인을 링커를 통해 항-PD-1 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합시켰으며(면역사이토카인을 "항-PD-1/IL-12"의 형식으로 명명하였음), 이는 현행의 면역사이토카인에서 흔한 설계이다.
니볼루맙(Opdivo®) VH(SEQ ID NO: 102) 및 VL(SEQ ID NO: 103) 서열을 포함하는 항-인간 PD-1 항체를 부모 전장 항체로서 사용하였으며, 이는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다.
이종이량체 항-PD-1 항체의 하나의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 위치한 IL-12 변이체(단일-쇄 N'에서 C'으로 IL-12B(p40 변이체)-링커-IL-12A(wt p35))를 갖는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인(작제물 #48), IL-12(E59A)/항-PD-1 면역사이토카인(작제물 #46) 및 IL-12(G64A)/항-PD-1 면역사이토카인(작제물 #47)을 실시예 4 및 14에 기재된 바와 같이 작제하였다.
중쇄 C' 사이토카인 융합 작제물을 제조하기 위하여, 단일-쇄 IL-12(E59A) 변이체(SEQ ID NO: 331), 단일-쇄 IL-12(G64A) 변이체(SEQ ID NO: 332), 또는 단일-쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36)를 G/S 함유 펩티드 링커를 통해 이종이량체 항-PD-1 항체의 하나의 중쇄의 C'에 융합시켰다. 작제물은 하기에서 각각 항-PD-1/IL-12(E59A)(작제물 #46HC'; 중쇄 사이토카인 융합 폴리펩티드, 중쇄 비-융합 폴리펩티드 SEQ ID NO: 107), 항-PD-1/IL-12(G64A)(작제물 #47HC'; 중쇄 사이토카인 융합 폴리펩티드, 중쇄 비-융합 폴리펩티드 SEQ ID NO: 107) 및 항-PD-1/IL-12(E59A/F60A)(작제물 #48HC'; 중쇄 사이토카인 융합 폴리펩티드, 중쇄 비-융합 폴리펩티드 SEQ ID NO: 107)로 지칭된다.
HEK-Blue™ IL-12 및 HEK-PD-1-IL-12(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-12 세포에서 인간 PD-1을 과발현시킴으로써 인-하우스 생성됨) 세포를 사용한 IL-12 신호 전달 검정을 상기 기재된 2가지 입체배치의 면역사이토카인 및 rIL-12(양성 대조군)를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 행하였다.
[표 16]
HEK-IL-12 리포터 검정에서, 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인 형식은 오직 IL-12 모이어티가 접근 가능하다면(예를 들어, 중쇄 C' 융합 형식), IL-12 모이어티/IL-12 수용체 상호작용을 통해 HEK-IL-12 세포에 결합할 수 있었다. HEK-PD-1-IL-12 리포터 검정에서, 둘 모두의 IL-12 면역사이토카인 형식은 둘 모두의 IL-12 모이어티/IL-12 수용체 상호작용 및 항-PD-1 항원-결합 단편/PD-1 상호작용을 통해 HEK-PD-1-IL-12 세포에 결합할 수 있었다.
표 16에서 관찰되는 바와 같이, 힌지 융합 설계는 중쇄 C-말단 융합 설계에 비하여 유의미하게 감소된 비-특이적인 활성(즉, PD-1 결합의 부재 하의 사이토카인 활성)을 가졌다. PD-1 음성 세포(HEK-IL-12)에서, 작제물 #48은 작제물 #48HC'에 대한 4%와 비교하여, 거의 검출 가능하지 않은 수준의 IL-12 활성(< 0.2%)을 보였다. 작제물 #47 및 작제물 #47HC'에 대하여 유사한 결과가 관찰되었다(각각 15%에 비하여 5%). IL-12 이중 돌연변이 E59A/F60A는 또한 단일 돌연변이 E59A 또는 G64A에 비하여 비-특이적인 활성을 유의미하게 감소시켰다. PD-1 양성 세포(HEK-PD-1-IL-12)에서, IL-12 표적화된 활성은 상응하는 힌지 융합 형식과 중쇄 C-말단 융합 형식 간에 유사하였으며, 이는 힌지 융합 설계가 항원-양성 세포(또는 항원-결합)의 존재 하에서 IL-12 활성을 유의미하게 저해하지 않음을 뒷받침한다. 종합하여, 사이토카인(특히 특정 사이토카인 변이체)의 힌지 배치는 항원-결합 도메인의 결합의 부재 하에 비-특이적인 IL-12 활성을 크게 감소시킬 수 있다.
실시예 27: PD-1에 대하여 감소된 친화성을 갖는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인의 생성
감소된 PD-1 결합 친화성을 갖는 항-PD-1 항체 변이체의 생성
PD-1에 대한 니볼루맙의 높은 결합 친화성 때문에, 야생형 니볼루맙을 부모 항체로서 사용하는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인은 PD-1 발현 수준과 관계 없이, 모든 PD-1 양성 세포에 대하여 IL-12 활성을 유도할 수 있다. 이러한 거대 집단의 PD-1 양성 세포의 활성화는 임의의 PD-1 양성 면역 세포의 활성화로부터 사이토카인 폭풍 또는 기타 유해한 부작용을 초래할 수 있었다.
PD-1 고도 발현 세포(예를 들어, T 세포)만을 표적화하도록 PD-1에 대하여 감소된 결합 친화성을 갖는 항-PD-1 돌연변이체를 생성하기 위하여, 돌연변이를 니볼루맙의 D100 또는 N99 위치에서 HC-CDR3에 도입하였다: HC-CDR3(D100N), HC-CDR3(D100G), HC-CDR3(D100R), HC-CDR3(N99G), HC-CDR3(N99A) 및 HC-CDR3(N99M). 이들 항-PD-1 항체의 친화성을 비아코어 및 세포-기반의 검정에 의해 측정하고, 야생형 니볼루맙 결합 친화성에 의해 보정하였다(표 17 참조). "N/A"는 비-검출된 PD-1 결합을 나타낸다.
항-PD-1 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 중쇄는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 중쇄는 SEQ ID NO: 41을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 2개의 경쇄는 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
[표 17]
PD-1에 대하여 감소된 친화성을 갖는 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인의 작제
단일-쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36)를 상기 기재된 다양한 항-PD-1 돌연변이체의 하나의 중쇄의 힌지 영역의 내부에 배치함으로써, 다양한 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인을 실시예 4에 기재된 바와 같이 생성하였다. 중쇄 사이토카인 융합 폴리펩티드의 서열은 각각의 작제물에 대하여 표 18에 제공되어 있다. 상응하는 쌍형성 비-융합 중쇄는 N'에서 C'으로, VH(상응하는 HC-CDR3 돌연변이를 가짐) - CH1 - 힌지(SEQ ID NO: 41) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62)을 포함한다.
IL-12 신호 전달 검정
IL-12 신호 전달 검정을 HEK-Blue™ IL-12 세포 및 HEK-PD-1-IL-12 세포 상에서 감소된 PD-1 결합 친화성을 갖는 IL-12/항-PD-1(mut) 면역사이토카인(대조군으로서 제공되는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(wt) 및 rIL-12)을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 행하였다. 2가지 변이형의 HEK-PD-1-IL-12 세포를 사용하였다: 높은 PD-1 발현을 갖는 것 "HEK-IL-12-PD-1(고)"(실시예 4에 기재된 바와 같음, PD-1 과발현) 및 30배 더 낮은 PD-1 발현을 갖는 것 "HEK-IL-12-PD-1(저)"(렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK-Blue™ IL-12 세포에서 더 적은 양의 인간 PD-1을 발현시킴으로써 인-하우스 생성됨). 세포를 20 ng/mL의 다양한 IL-12/항-PD-1 면역사이토카인(또는 대조군)과 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
IFN-γ 방출 검정
IFN-γ 방출 검정을 감소된 PD-1 결합 친화성을 갖는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 행하였다. IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(wt) 및 rIL-12를 대조군으로서 제공하였다. 요약하여, PBMC를 항-CD3 항체(OKT3, 100 ng/mL)와 함께 3일 동안 인큐베이션시킴으로써, T 세포를 활성화시켰다. PBMC를 세척하여 항-CD3 항체를 제거하고, 200 ng/mL의 다양한 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인(또는 대조군)과 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 1일 후에, 세포 배양 배지 내로 방출되는 IFN-γ의 양을 측정하였다.
[표 18]
표 18로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험된 모든 면역사이토카인에 있어서, 비-특이적인 IL-12 활성이 항-PD-1 결합의 부재 하에 관찰되지 않았다(HEK-IL-12 열 참조). PD-1 결합의 존재 하에 IL-12 신호를 전달하는 이들의 능력 및 IFN-γ 방출의 유도에서의 이들의 능력은 항-PD-1 결합 친화성이 감소함에 따라 감소하며, 이는 힌지 융합 설계의 항원-결합 의존적인 사이토카인 활성을 나타낸다. 항-PD-1 중쇄에 D100G, D100R 또는 N99G 돌연변이를 갖는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1 면역사이토카인은 고 및 저 PD-1 발현 세포 간에 주목할 만한 결합의 차이를 보였다. 이들 결과는 더 높은 수준의 PD-1을 발현하는 세포가 PD-1에 대하여 감소된 친화성을 갖는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인을 사용하여 특이적으로 표적화될 수 있음을 나타낸다. 이들 작제물에 의해 유도되는 IFN-γ 분비는 또한, IL-12/항-PD-1(wt) 면역사이토카인 및 rIL-12 대조군에 비하여 훨씬 더 낮았다.
그러므로, 본원에 기재된 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인 및 아마도 감소된 항원 결합 친화성을 갖는 항원-결합 도메인에 기초하여 작제된 다른 면역사이토카인을 사용하여, 감소된 표적외 효과 및/또는 사이토카인 폭풍과 함께, 고-항원 발현을 갖는 관심 세포를 특이적으로 표적화할 수 있다.
실시예 28: IL-12/항-PD-1 면역사이토카인에서의 PD-1 결합 친화성의 감소는 마우스에서의 독성을 감소시킨다
(마우스 PD-1 유전자좌의 내부에, 인간 세포외 도메인, 쥣과 막횡단 도메인 및 쥣과 세포내 도메인을 갖는 키메라 PD-1을 삽입함으로써) C57 스트레인(strain)(5 내지 6주령, 20 g 암컷)로부터 유래된 인간화된 PD-1 마우스에, (주사마다) 10 mg/kg 또는 50 mg/kg의 실시예 27에 기재된 다양한 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인을 주사하였다. IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(wt) 면역사이토카인(작제물 #48)을 대조군으로서 제공하였다. 총 4회의 주사를 제0일, 제4일, 제8일 및 제12일에 제공하였다. 마우스를 사망률 및 4가지 독성 증상에 대하여 매일 모니터링하였다: i) 모피 질감, ii) 감소된 활동, iii) 병적상태 및 iv) 체중 감소.
야생형 니볼루맙을 포함하는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(wt) 면역사이토카인을 주사한 마우스는 가장 큰 독성을 보였으며, 그룹 내의 모든 마우스는 심지어 더 낮은 투여량에 대해서도 제2 또는 제3 주사를 제공한 후에 사망하였다. 대조적으로, 감소된 PD-1 결합 친화성을 갖는 항-PD-1을 포함하는 IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(mut) 면역사이토카인을 주사한 마우스는 감소된 독성을 보였으며, IL-12(E59A/F60A)/항-PD-1(D100N)로 처리된 그룹에서만 사망이 관찰되었다. 표 19로부터 알 수 있는 바와 같이, 작제물 중에서, PD-1 결합 친화성이 감소함에 따라 및/또는 용량이 감소함에 따라 독성 증상의 중증도가 감소된다.
[표 19]
PD-1에 대한 야생형 니볼루맙의 높은 결합 친화성(Kd10-8-10-9 M) 때문에, IL-12(E59/F60A)/항-PD-1(WT)이 임의의 PD-1 양성 세포에 결합하고, (사이토카인 활성을 통해) 이를 자극할 가능성이 높다. 이는 활성화된 T-세포 및 NK 세포를 포함할 것이며, 이는 사이토카인 방출 증후군을 초래할 것이다. 대조적으로, hPD-1에 대하여 감소된 결합 친화성을 갖는 IL-12/항-PD-1 기반의 면역사이토카인은 오직 더 작은 집단의 PD-1 양성 세포, 특히 매우 높은 PD-1 발현 수준을 갖는 세포, 예컨대 탈진된 T-세포에만 결합할 수 있다. 여기에 나타낸 데이터는 실시예 27의 시험관내 PBMC IFN-γ 방출 검정으로부터의 데이터와 일치한다. 이들 결과는 항-PD-1 항원-결합 도메인의 PD-1 결합 친화성을 약 10-6 내지 10-7 M의 Kd로 감소시켜(예를 들어, 항-PD-1 중쇄 내의 D100G, D100R, N99G 참조), 치료 효능을 보유하면서, IL-12/항-PD-1 면역사이토카인의 안전성을 크게 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 29: PD-L1 및 PD-L2의 결합 친화성의 증가는 IL-12/PD-L1-Fc 및 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 독성을 증가시키지 않는다
실시예 14 내지 17에 나타낸 바와 같이, IL-12 면역사이토카인에서 항-PD-1 항원-결합 단편을 PD-L2 세포외 도메인으로 대체하여, 독성을 유의미하게 감소시킬 수 있으며, 이는 아마도 IL-12의 면역자극/염증-유발성 활성에 대해 "균형을 이루는" 면역억제 신호를 생성하였던, PD-L2-PD-1 결합 시의 자극된 PD-1 저해성 면역 관문 신호전달 때문일 것이다. 이들 "균형을 이루는" 작제물의 안전성 프로필이 추가로 개선될 수 있는지를 조사하기 위하여, 증가된 PD-1 결합 친화성을 갖는 PD-L1 또는 PD-L2 세포외 도메인을 포함하는 IL-12 면역사이토카인을 PD-1 면역억제 신호를 향상시키기 위하여 작제하였다.
증가된 PD-1 결합 친화성을 갖는 PD-L1 변이체의 생성
야생형 PD-L1은 니볼루맙의 친화성(Kd10-8 내지 10-9 M)보다 더 낮은 약 10-5 내지 10-6 M의 PD-1에 대한 결합 친화성을 갖는다. PD-1에 대한 친화성을 증가시키기 위하여, PD-L1 돌연변이체를 생성하였다. 돌연변이를 SEQ ID NO: 249에 관한 아미노산 위치를 갖는 야생형 PD-L1의 세포외 도메인에 도입하였다. 이어서, 이들 돌연변이 PD-L1 세포외 도메인을 힌지 영역을 통해 Fc 단편에 융합시켜, 부모 PD-L1-Fc 작제물을 작제하였다. PD-L1-Fc 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 52를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 51을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 돌연변이 작제물을 PD-L1(mut)-Fc의 형식으로 명명하였다.
이루어진 돌연변이의 설명 및 PD-1 결합 친화성(PD-L1-Fc 형식으로 측정됨)은 표 20에 나타나 있다. 각각의 PD-L1(mut)-Fc에 대한 결합 친화성을 PD-L1(wt)-Fc 결합 친화성에 기초하여 보정하였다. N/A는 비-검출 가능한 PD-1 결합을 나타낸다. 이들 결과는 모든 PD-L1(mut)이 야생형 PD-L1에 비하여 PD-1 결합 친화성의 약 4 내지 60배 증가를 달성하였음을 나타낸다. 이들 중에서, PD-L1(I54Q/E58M/R113T/M115L/S117A/G119K)(PD-L1(mut2)), PD-L1(I54Q/E58M/R113T/M115L/G119K)(PD-L1(mut6)) 및 PD-L1(I54Q/E58M/R113T/M115L/S117A)(PD-L1(mut7))은 야생형 PD-L1에 비하여 PD-1에 대한 친화성의 가장 높은 배수 증가를 보였다.
[표 20]
증가된 PD-1 결합 친화성을 갖는 PD-L2 변이체의 생성
PD-L2는 니볼루맙의 친화성(Kd10-8 내지 10-9 M)보다 더 낮은 약 10-6 내지 10-7 M의 PD-1에 대한 결합 친화성을 갖는다. PD-1에 대한 친화성을 증가시키기 위하여, PD-L2 돌연변이체를 생성하였다. 돌연변이를 SEQ ID NO: 175에 관한 아미노산 위치를 갖는 야생형 PD-L2의 세포외 도메인에 도입하였다. 이어서, 이들 돌연변이 PD-L2 세포외 도메인을 힌지 영역을 통해 Fc 단편에 융합시켜, 부모 PD-L2-Fc 작제물을 작제하였다. PD-L2-Fc 이종이량체를 작제하기 위하여, 하나의 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 52를 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 61을 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함하며; 다른 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 51을 포함하는 힌지 영역 및 SEQ ID NO: 62를 포함하는 Fc 도메인 서브유닛을 포함한다. 돌연변이 작제물을 PD-L2(mut)-Fc의 형식으로 명명하였다.
이루어진 돌연변이의 설명 및 PD-1 결합 친화성(PD-L2-Fc 형식으로 측정됨)은 표 21에 나타나 있다. 각각의 PD-L2(mut)-Fc에 대한 결합 친화성을 PD-L2(wt)-Fc 결합 친화성에 기초하여 보정하였다. 이들 결과는 모든 PD-L2(mut)가 야생형 PD-L2에 비하여 PD-1 결합 친화성의 약 2 내지 5배 증가를 달성하였음을 나타낸다. 이들 중에서, PD-L2(S58V)(PD-L2(mut2)) 및 PD-L2(T56V/S58V/Q60L)(PD-L2(mut4))는 야생형 PD-L2에 비하여 PD-1에 대한 친화성의 가장 높은 배수 증가를 보였다.
[표 21]
PD-1에 대하여 증가된 친화성을 갖는 IL-12/PD-L1-Fc 및 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 작제
실시예 15에 기재된 바와 유사하게, 본원에 생성된 이종이량체 PD-L1(mut)-Fc 또는 PD-L2(mut)-Fc를 부모 항원-결합 단백질로서 사용하여, PD-1에 결합하는 IL-12 면역사이토카인을 작제하였다. 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체를 부모 PD-L1(mut)-Fc 또는 PD-L2(mut)-Fc 이종이량체 내의 하나의 폴리펩티드 쇄의 힌지의 N'에 배치하였다.
요약하여, IL-12(E59A/F60A)/PD-L2(wt)-Fc 면역사이토카인("작제물 #29")은 SEQ ID NO: 186을 포함하는 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커(SEQ ID NO: 203) - 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체(SEQ ID NO: 36) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2 세포외 도메인(SEQ ID NO: 176) - GSG 링커 - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다. IL-12(E59A/F60A)/PD-L2(mut)-Fc 면역사이토카인은 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2(mut) 세포외 도메인 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L2(mut) 세포외 도메인 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다.
IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(wt)-Fc 면역사이토카인은 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L1(wt) 세포외 도메인(SEQ ID NO: 250) - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L1(wt) 세포외 도메인(SEQ ID NO: 250) - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다. IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut)-Fc 면역사이토카인은 하나의 IL-12 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L1(mut) 세포외 도메인 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 변이체 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)); 및 하나의 쌍형성 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L1(mut) 세포외 도메인 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62))를 포함한다.
PD-1에 대하여 증가된 친화성을 갖는 작제된 IL-12 면역사이토카인의 안전성 프로필을 시험하기 위하여, 야생형 C57 마우스(5 내지 6주령, 20 g 암컷)에 (주사마다) 10 mg/kg 또는 50 mg/kg의 IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut2)-Fc 면역사이토카인 또는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2(mut2)-Fc 면역사이토카인을 주사하였는데, 이는 이들 2가지 작제물이 인간 및 마우스 PD-1 둘 모두에 대하여 유사한 PD-1 결합 친화성(약 10-7 M)을 보였기 때문이다. IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(wt)-Fc 면역사이토카인 또는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2(wt)-Fc 면역사이토카인을 대조군으로서 제공하였다. 총 4회의 주사를 제0일, 제4일, 제8일 및 제12일에 제공하였다. 마우스를 사망률 및 4가지 독성 증상에 대하여 매일 모니터링하였다: i) 모피 질감, ii) 감소된 활동, iii) 병적상태 및 iv) 체중 감소.
표 22로부터 알 수 있는 바와 같이, PD-1에 대한 결합 친화성의 증가는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L1-Fc 면역사이토카인 또는 IL-12(E59A/F60A)/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 안전성 프로필에 유의미하게 영향을 미치지 않는다. 이들 결과는 PD-1에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는 돌연변이 버전의 PD-L1 및 PD-L2를 포함하는 IL-12 면역사이토카인이 야생형 IL-12/PD-L1-Fc 및 IL-12/PD-L2-Fc 면역사이토카인의 안전성 프로필을 보유하는 것을 보여준다. 이는 다른 면역사이토카인(예를 들어, IL-2 면역사이토카인)을 작제하기 위하여, 다른 PD-L1-Fc 또는 PD-L2-Fc 기반의 면역사이토카인에도 적용될 수 있다.
[표 22]
실시예 30: PD-1-양성 세포에 대하여 유도된 IL-2 생물학적 활성을 갖는 IL-2/PD-L1 면역사이토카인의 생성
소정의 사이토카인, 예컨대 IL-12 및 IL-2, IL-12 및 IFN-γ은 상승 작용을 갖는다. IL-2 및 이의 면역사이토카인의 독성을 감소시키기 위하여, 2가지 세트의 IL-2 돌연변이를 생성하였다: IL2Rα(CD25)와 상호작용하는 IL-2 도메인 내의 돌연변이(R38D/K43E/E61R) 및 IL2Rγ(CD132)와 상호작용하는 IL-2 도메인 내의 돌연변이(L18R, Q22E, Q126T, S130R 또는 이들의 임의의 조합). 표 23을 참조한다.
이종이량체 PD-L1(mut2)-Fc를 부모 PD-1 결합 단백질로서 사용하였다. 제1 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 281을 포함하며(N'에서 C'으로, PD-L1(mut2) 세포외 도메인(SEQ ID NO: 256) - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 52) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 61)), 제2 폴리펩티드 쇄는 SEQ ID NO: 283을 포함한다(N'에서 C'으로, PD-L1(mut2) 세포외 도메인(SEQ ID NO: 256) - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62)). IL-2 면역사이토카인을 작제하기 위하여, IL-2 변이체를 PD-L1(mut2) 세포외 도메인과 힌지 사이에 배치하였다. 요약하여, IL-2(mut)/PD-L1(mut2)-Fc 면역사이토카인은 하나의 IL-2 융합 폴리펩티드(N'에서 C'으로, PD-L1(mut2) 세포외 도메인(SEQ ID NO: 256) - GGGSG 링커(SEQ ID NO: 209) - IL-2(mut) 변이체 - GGGGSGGG 링커(SEQ ID NO: 334) - 힌지(SEQ ID NO: 51) - Fc 도메인 서브유닛(SEQ ID NO: 62)); 및 하나의 쌍형성 폴리펩티드 SEQ ID NO: 281을 포함한다.
HEK-Blue™ IL-2 세포 및 HEK-PD-1-IL-2 세포를 사용하여, 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 작제물의 IL-2 신호 활성화 활성을 측정하였다. 표 23으로부터 알 수 있는 바와 같이, CD25 결합 도메인에 IL-2 돌연변이(R38D/K43E/E61R)만을 갖는 IL-2(R38D/K43E/E61R)/PD-L1(mut2)-Fc는 HEK-IL-2 검정에 기초하여 약 16%의 IL-2 활성을 여전히 보유하는 한편(PD-1 결합 부재), CD132 결합 도메인에 IL-2 돌연변이를 추가로 보유하는 IL-2 면역사이토카인은 PD-1 결합의 부재 하에서, HEK-IL-2 검정에 기초하여 IL-2 활성이 유의미하게 감소되었다. 주목할 만한 것은, CD132 결합 도메인 돌연변이를 추가로 보유하는 일부 IL-2 면역사이토카인(SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, 또는 SEQ ID NO: 287 쇄를 포함하는 작제물 참조)의 IL-2 활성은 (HEK-IL-2-PD-1 검정에 기초하여) PD-1에 결합하는 때 부분적으로 구제될 수 있다. 다른 IL-2 돌연변이와 조합하여, CD132 결합 도메인에 S130R 돌연변이를 추가로 보유하는 IL-2 면역사이토카인(SEQ ID NO: 288 쇄를 포함하는 작제물 참조)이 심지어 PD-1 결합의 존재 하에서도 어떠한 IL-2 활성도 나타내지 못했기 때문에, S130은 IL-2 활성에 결정적일 수 있다.
[표 23]
실시예 31: PD-1-양성 세포에 대하여 유도된 IL-2 및 IL-12 생물학적 활성을 갖는 IL-2/IL-12/PD-L1 면역사이토카인의 생성
소정의 사이토카인, 예컨대 IL-12 및 IL-2는 상승 작용을 갖는다. 상기 실시예에 나타낸 바와 같이, IL-12(E59A/F60A)/PD-L1-Fc 면역사이토카인(힌지 영역)은 PD-1 결합 의존적인 IL-12 활성을 보였다. PD-1 결합 의존적인 사이토카인 활성을 보유하면서 상승적 IL-12 및 IL-2 활성을 갖는 면역사이토카인이 작제될 수 있는지를 조사하기 위하여, 상이한 입체배치의 면역사이토카인을 작제하였다. 이종이량체 PD-L1(mut2)-Fc를 (실시예 29에서 작제된) 부모 PD-1 결합 융합 단백질로서 사용하였다. 세트 I: 하나의 폴리펩티드 쇄는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 단일 쇄 IL-12(E59A/F60A) 폴리펩티드를 포함하며(실시예 29에서 작제된 SEQ ID NO: 277 참조); 쌍형성 폴리펩티드 쇄는 IL-2 모이어티를 포함하지 않거나(대조군; 실시예 29에서 작제된 SEQ ID NO: 283), 또는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체(L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 251) 또는 R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이(SEQ ID NO: 252) 중 어느 하나를 가짐)를 포함한다. 이들 면역사이토카인은 IL-2/IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut2)-Fc의 형식으로 명명된다. 세트 II: 하나의 폴리펩티드 쇄는 GGGGSGGG 링커를 통해 PD-L1(mut2)-Fc의 C'에 융합된 IL-12(E59A/F60A)를 포함하며(SEQ ID NO: 279 참조); 쌍형성 폴리펩티드 쇄는 IL-2 모이어티를 포함하지 않거나(대조군; 실시예 29에서 작제된 SEQ ID NO: 283), 또는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체(L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 251) 또는 R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이(SEQ ID NO: 252) 중 어느 하나를 가짐)를 포함한다. 이들 면역사이토카인은 IL-2/PD-L1(mut2)-Fc/IL-12(E59A/F60A)의 형식으로 명명되며, 이는 IL-12 모이어티가 Fc의 C'에 존재함을 나타낸다. 작제물 서열에 대해서는 표 24를 참조한다.
HEK-Blue™ IL-2 세포 및 HEK-PD-1-IL-2 세포를 사용하여, 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이, 작제물의 IL-2 신호 활성화 활성을 평가하였다. HEK-Blue™ IL-12 세포 및 HEK-PD-1-IL-12 세포를 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 작제물의 IL-12 신호 활성화 활성을 평가하였다.
표 24로부터 알 수 있는 바와 같이, IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut2)-Fc(힌지 융합)는 PD-1 결합의 부재 하에 검출 가능한 IL-12 활성을 갖지 않은 한편, PD-1 결합은 IL-12 활성을 24%까지 구제하였다. PD-L1(mut2)-Fc/IL-12(E59A/F60A)로서, IL-12(E59A/F60A)를 Fc의 C'에 배치한 경우, IL-12 활성은 PD-1 결합의 부재 하에 약 1% 내지 2%였으며, IL-12 활성은 추가로 PD-1 결합에 의해 IL-12 힌지 융합과 유사한 정도로 구제되었다(약 25%).
IL-12 힌지 융합 및 C' 융합 형식 둘 모두에 있어서, 힌지 영역에서 쌍형성 쇄 내의 IL-2 상에 부가함으로써, IL-2 활성은 PD-1 결합의 부재 하에 약 2% 내지 4%였지만, PD-1 결합에 의해 약 20% 내지 35%로 구제되었다.
이들 데이터는 IL-12 및 IL-2 둘 모두가 3중특이적 면역사이토카인 형식으로 작제되는 경우, PD-1-결합 의존적 활성을 보유할 수 있음을 나타낸다. 추가로, IL-12 및 IL-2 모이어티는 서로의 활성에 유의미한 부정적인 영향을 갖지 않았다.
[표 24]
실시예 32: 힌지 영역에서의 IL-12 모이어티의 배치는 IL-12/PD-L1-Fc 면역사이토카인 및 IL-2/IL-12/PD-L1-Fc 면역사이토카인의 안전성 프로필을 크게 개선시킬 수 있다
실시예 29에서 작제된 PD-L1(mut2)-Fc를 부모 PD-1 결합 융합 단백질로서 사용하였는데, 이는 이것이 인간 및 마우스 둘 모두에서 유사한 PD-1 결합 친화성을 보였기 때문이다.
생체내에서 안전성 프로필을 시험하기 위하여, p40 서브유닛 및 p35 야생형 서브유닛에 E59A/F60A 돌연변이를 갖는 마우스 단일-쇄 IL-12 변이체(SEQ ID NO: 330)를 본원에 기재된 바와 유사하게 작제하였다: N'에서 C'으로, p40(E59A/F60A)-GGPGGGGSGGGSGGGG 링커(SEQ ID NO: 335)-p35(wt)(인간 IL-12는 마우스에서 기능하지 않는다). 실시예 31과 유사하게, 2개의 세트의 IL-12 융합 폴리펩티드를 작제하였다. 세트 I: 하나의 폴리펩티드 쇄는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 단일 쇄 mIL-12(E59A/F60A) 폴리펩티드를 포함하며(SEQ ID NO: 328 참조); 쌍형성 폴리펩티드 쇄는 IL-2 모이어티를 포함하지 않거나(대조군; 실시예 29에서 작제된 SEQ ID NO: 283), 또는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체(R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 2), L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 251), 또는 R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이(SEQ ID NO: 252)를 가짐)를 포함한다. 이들 면역사이토카인은 IL-2/IL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut2)-Fc의 형식으로 명명된다. 세트 II: 하나의 폴리펩티드 쇄는 GGGGSGGG 링커를 통해 PD-L1(mut2)-Fc의 C'에 융합된 단일-쇄 mIL-12(E59A/F60A)를 포함하며(SEQ ID NO: 279 참조); 쌍형성 폴리펩티드 쇄는 IL-2 모이어티를 포함하지 않거나(대조군; 실시예 29에서 작제된 SEQ ID NO: 283), 또는 PD-L1(mut2)-Fc의 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체(R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 2), L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이(SEQ ID NO: 251)를 가짐)를 포함한다. 이들 면역사이토카인은 IL-2/PD-L1(mut2)-Fc/IL-12(E59A/F60A)의 형식으로 명명되며, 이는 IL-12 모이어티가 Fc의 C'에 존재하는 것을 나타낸다. 작제물 서열에 대하여 표 24를 참조한다. 대조군 세트는 PD-L1(mut2)-Fc로의 어떠한 IL-12 모이어티 융합도 갖지 않았다(SEQ ID NO: 281).
이들 작제물의 안전성 프로필을 시험하기 위하여, 야생형 C57 마우스(5 내지 6주령, 체중 20 g, 암컷)에 PBS(대조군) 또는 본원에 기재된 면역사이토카인(주사마다 10 mg/kg)을 주사하였다. 총 4회의 주사를 4일마다 제공하였다. 마우스를 사망 및 독성 증상, 예컨대 모피 질감, 감소된 활동 및 체중 감소에 대하여 모니터링하였다. 2차 주사 후 48시간에, 혈액을 수집하고, IFN-γ의 혈청 농도를 측정하였다.
표 25에서 관찰되는 바와 같이, CD25 결합 도메인 내의 R38D/K43E/E61R에 더하여 CD132 결합 도메인 내의 IL-2 추가의 돌연변이(L18R/Q22E 또는 Q126T)를 포함하는 면역사이토카인은 IL-12 모이어티가 C'에 존재하든지, 힌지에 존재하든지와 관계 없이, CD132 결합 도메인 돌연변이가 없는 것들(SEQ ID NO: 327 쇄를 포함하는 작제물 참조)과 비교하여 훨씬 더 큰 안전성 프로필을 보였다.
Fc의 C'에 IL-12를 갖는 면역사이토카인, IL-2(mut)/PD-L1(mut2)-Fc/mIL-12(E59A/F60A)는 힌지 영역에 위치한 IL-12(IL-2(mut)/mIL-12(E59A/F60A)/PD-L1(mut2)-Fc)에 비하여 더 높은 독성을 보였다. IL-2(mut)/PD-L1(mut2)-Fc/mIL-12(E59A/F60A)는 또한, IL-12 힌지 융합 설계에 비하여 훨씬 더 높은(20 내지 30배) 사이토카인 방출을 유도하였다(IFN-γ 수준 참조).
종합하여, 본원에 제시된 본 발명자들의 생체내 및 시험관내 데이터는 힌지 영역에 위치한 사이토카인(예를 들어, IL-12 또는 이의 변이체)을 갖는 면역사이토카인이 심지어 상승 작용을 갖는 더 많은 사이토카인이 동일한 작제물에 존재하는 경우(예를 들어, IL-2/IL-12/PD-L1-Fc)에도, 안전성 프로필을 유의미하게 개선시킬 수 있음을 뒷받침하였다. 사이토카인의 활성을 감소시키기 위한 사이토카인 내의 돌연변이 및/또는 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-PD-1 또는 PD-L1, 또는 PD-L2) 내의 돌연변이는 작제물의 안전성 및/또는 치료 효능을 추가로 개선시킬 수 있다.
[표 25]
서열 목록
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNOWAKE INC. <120> IMMUNOCYTOKINES AND USES THEREOF <130> 75439-20006.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/130,339 <151> 2020-12-23 <160> 335 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Ala Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 5 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ala Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 6 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Ala 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 7 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Ala His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 8 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Ala Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Ala Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 10 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <210> 11 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ala Ala Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <210> 12 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Ala Ser Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <210> 13 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Val Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly 130 135 <210> 14 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Ala Ala Ala Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys 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65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Val Ile Pro Val 325 330 335 Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser 355 360 365 Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr 370 375 380 Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser 385 390 395 400 Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu 405 410 415 Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile 420 425 430 Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala 435 440 445 Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met 450 455 460 Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu 465 470 475 480 Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val 485 490 495 Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val 500 505 510 Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala 515 520 <210> 331 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 331 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Ala Phe Gly Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly 145 150 155 160 Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala 165 170 175 Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala 180 185 190 Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg 195 200 205 Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu 210 215 220 Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp 225 230 235 240 Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln 245 250 255 Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr 260 265 270 Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala 275 280 285 Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro 290 295 300 Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp 325 330 335 Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala 340 345 350 Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro 355 360 365 Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr 370 375 380 Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser 385 390 395 400 Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu 405 410 415 Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile 420 425 430 Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala 435 440 445 Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met 450 455 460 Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu 465 470 475 480 Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr 485 490 495 Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 500 505 510 Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 515 520 <210> 332 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 332 Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Ala 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 115 120 125 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln 130 135 140 Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly 145 150 155 160 Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala 165 170 175 Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala 180 185 190 Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg 195 200 205 Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu 210 215 220 Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp 225 230 235 240 Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln 245 250 255 Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr 260 265 270 Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala 275 280 285 Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro 290 295 300 Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp 325 330 335 Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala 340 345 350 Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro 355 360 365 Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr 370 375 380 Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser 385 390 395 400 Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu 405 410 415 Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile 420 425 430 Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala 435 440 445 Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met 450 455 460 Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu 465 470 475 480 Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr 485 490 495 Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 500 505 510 Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 515 520 <210> 333 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 333 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 334 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 334 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 335 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 335 Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15

Claims (134)

  1. a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질; 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인으로서, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에 위치하는 면역사이토카인.
  2. 제1항에 있어서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20% 증가하는 면역사이토카인.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하인 면역사이토카인.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성이 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하인 면역사이토카인.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 오직 1개의 항원-결합 폴리펩티드만이 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 항원-결합 폴리펩티드가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 면역사이토카인.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인이 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체가 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 탠덤으로 위치하는 면역사이토카인.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 단량체 사이토카인 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  10. 제9항에 있어서, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 둘 모두의 서브유닛이 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 탠덤으로 위치하는 면역사이토카인.
  11. 제9항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역을 각각 포함하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 하나의 서브유닛이 하나의 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치하며, 이량체 사이토카인 또는 이의 변이체의 다른 서브유닛이 다른 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역에 위치하는 면역사이토카인.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체가 동일한 면역사이토카인.
  13. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 사이토카인 또는 이의 변이체가 상이한 면역사이토카인.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 단일특이적 항원-결합 단백질인 면역사이토카인.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 다중특이적 항원-결합 단백질인 면역사이토카인.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원이 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD3, CD4, CD8, CD25, CD123 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역사이토카인.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, VEGF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, G-CSF, M-CSF, SCF 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역사이토카인.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-2, IL-10, IL-12, IL-23, IFN-α 및 IFN-γ로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역사이토카인.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-2 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  20. 제19항에 있어서, IL-2 변이체가 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 L18, Q22, F24, K35, R38, F42, K43, E61, P65, Q126 및 S130으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, IL-2 변이체가 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 L18R, Q22E, F24A, R38D, K43E, E61R, P65L, Q126T 및 S130R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2 변이체가 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 야생형 IL-2와 비교하여 R38D/K43E/E61R 돌연변이, L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R 돌연변이, R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이, L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R/Q126T 돌연변이 또는 L18R/Q22E/R38D/K43E/E61R/Q126T/S130R 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2 변이체가 SEQ ID NO: 2 및 251 내지 254 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  24. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IFN-α 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  25. 제24항에 있어서, IFN-α 변이체가 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 R22, L26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, F36, S68, T79, K83, Y85, Y89, R120, K121, Y122, Q124, Y129, K131, E132, R144 및 E146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, IFN-α 변이체가 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A, K31A, D32A, R33A, H34A 및 D35A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-α 변이체가 SEQ ID NO: 4 내지 9 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-α 변이체가 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 IFN-α와 비교하여 L30A 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-α 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  30. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IFN-γ 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  31. 제30항에 있어서, IFN-γ 변이체가 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 V5, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, H111 및 Q115로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, IFN-γ 변이체가 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A, D21A, D21K, V22A, A23S, A23E, A23Q, A23V, D24A, D24E, N25A, N25K 및 H111D로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 변이체가 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 S20A/D21A, D21K, V22A/A23S, D24A/N25A, A23E/D24E/N25K, A23Q 및 A23V로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 SEQ ID NO: 11 내지 17 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 변이체가 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 야생형 IFN-γ 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IFN-γ 서브유닛 내의 A23V 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛이 링커에 의해 연결되는 면역사이토카인.
  38. 제37항에 있어서, IFN-γ 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  39. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-10 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  40. 제39항에 있어서, IL-10 변이체가 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 N21, M22, R24, D25, L26, R27, D28, A29, F30, S31, R32, H90 및 S93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, IL-10 변이체가 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A, L26A, R27A, D28A, A29S, F30A, S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 변이체가 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 R24A, D25A/L26A, R27A, D28A/A29S, F30A/S31A 및 R32A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 SEQ ID NO: 21 내지 26 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 변이체가 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 야생형 IL-10 서브유닛과 비교하여 하나 또는 둘 모두의 IL-10 서브유닛 내의 R27A 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 변이체의 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 또는 이의 변이체의 2개의 서브유닛이 링커에 의해 연결되는 면역사이토카인.
  47. 제46항에 있어서, IL-10 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  48. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-12 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  49. 제48항에 있어서, IL-12 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, IL-12 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛이 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이 또는 F60A 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 변이체의 p40 서브유닛이 SEQ ID NO: 31 또는 33의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛이 링커에 의해 연결되는 면역사이토카인.
  55. 제54항에 있어서, IL-12 변이체가 SEQ ID NO: 36, 275, 331 또는 332의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  56. 제17항 또는 제18항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-23 또는 이의 변이체인 면역사이토카인.
  57. 제56항에 있어서, IL-23 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 E45, Q56, V57, K58, E59, F60, G61, D62, A63, G64, Q65 및 C177로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, IL-23 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 Q56A, V57A, K58A, E59A, F60A, G61A, D62A, A63S, G64A 및 Q65A로 이루어진 군으로부터 선택되는 p40 서브유닛 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛이 SEQ ID NO: 31 내지 34 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, IL-23 변이체가 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 야생형 p40 서브유닛과 비교하여 p40 서브유닛 내의 E59A/F60A 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, IL-23 변이체의 p40 서브유닛이 SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, IL-23 또는 이의 변이체의 p40 서브유닛 및 p19 서브유닛이 링커에 의해 연결되는 면역사이토카인.
  63. 제62항에 있어서, IL-23 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  64. 제37항, 제46항, 제54항 및 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 SEQ ID NO: 227 내지 229 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 항원-결합 폴리펩티드의 힌지 영역 내에 위치하는 면역사이토카인.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분이 노브-인투-홀(knobs-into-holes; KIH) 돌연변이를 포함하는 면역사이토카인.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에 위치하는 면역사이토카인.
  68. 제67항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 항-HER2 항체인 면역사이토카인: i) SEQ ID NO: 188의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 189의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 190의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 191의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 192의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 193의 서열을 포함하는 VL-CDR3.
  69. 제68항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 151의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 156의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 157의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 158의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 159의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 160의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 161의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 155의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  72. 제67항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 항-CD3 항체인 면역사이토카인: i) SEQ ID NO: 85의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 89의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 VL-CDR3.
  73. 제72항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 97의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 101의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  76. 제67항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-PD-1 항체인 면역사이토카인.
  77. 제76항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 109의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 113의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  80. 제67항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 항-CD4 항체인 면역사이토카인: i) SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 69의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 VL-CDR3.
  81. 제80항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 73의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 77의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 81의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  84. 제67항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CD8 항체인 면역사이토카인.
  85. 제84항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 117의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 121의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  88. 제67항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CTLA-4 항체인 면역사이토카인.
  89. 제88항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 125의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 129의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 131의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 132의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 133의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 134의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 135의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 136의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 130의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  92. 제67항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 항-PD-L1 항체인 면역사이토카인: i) SEQ ID NO: 243의 서열을 포함하는 VH-CDR1; ii) SEQ ID NO: 244의 서열을 포함하는 VH-CDR2; iii) SEQ ID NO: 245의 서열을 포함하는 VH-CDR3; iv) SEQ ID NO: 246의 서열을 포함하는 VL-CDR1; v) SEQ ID NO: 247의 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 vi) SEQ ID NO: 248의 서열을 포함하는 VL-CDR3.
  93. 제92항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 137의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 138의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 145의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 146의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 147의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 148의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 149의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 143의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  96. 제67항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-CD25 항체인 면역사이토카인.
  97. 제96항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 162의 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 163의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 면역사이토카인.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 165의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 169의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 170의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 171의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 172의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 173의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 174의 서열을 포함하는
    면역사이토카인.
  99. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄가 SEQ ID NO: 168의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  100. 제67항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 VH의 VH-CDR1 및 VH-CDR2 및 VH-CDR3, 및 SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 항-PD-1 항체이며, VH-CDR3이 SEQ ID NO: 102와 비교하여 D100N, D100G, D100R, N99G, N99A 또는 N99M의 돌연변이 중 어느 하나를 포함하는 면역사이토카인.
  101. 제100항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 중쇄가 SEQ ID NO: 268 내지 273 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  102. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 항원-결합 단편이 리간드이며, 표적 항원이 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이거나;
    (ii) 항원-결합 단편이 수용체이며, 표적 항원이 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드인 면역사이토카인.
  103. 제102항에 있어서, 리간드 또는 수용체가 IL-2, CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역사이토카인.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 리간드가 SEQ ID NO: 176의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  105. 제104항에 있어서,
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 IL-2 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-2 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 180의 서열을 포함하거나;
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 IFN-α 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-α 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 182의 서열을 포함하거나;
    (iii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 IFN-γ 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IFN-γ 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 183의 서열을 포함하거나;
    (iv) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 IL-10 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-10 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 184의 서열을 포함하거나;
    (v) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 186의 서열을 포함하거나;
    (vi) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 275의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 274의 서열을 포함하거나;
    (vii) 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 IL-23 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-23 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 187의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 제2 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 178, 179, 181 및 185 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  107. 제102항 또는 제103항에 있어서, 리간드가 SEQ ID NO: 255 내지 261 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  108. 제107항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 277의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  109. 제108항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역에 위치한 제2 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 제2 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 285 내지 288 및 327 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  110. 제102항 또는 제103항에 있어서, 리간드가 SEQ ID NO: 262 내지 265 중 어느 하나의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  111. 제110항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 IL-12 변이체이며, 힌지 영역에 위치한 IL-12 변이체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 293의 서열을 포함하는 면역사이토카인.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 항원-결합 단백질이 힌지 영역에 위치한 제2 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 면역사이토카인.
  113. 개체 내의 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 선택적인 활성화 방법으로서, 유효량의 면역사이토카인을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 면역사이토카인이 a) 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단백질; 및 b) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하며, 항원-결합 단백질이 N'에서 C'으로, 항원-결합 단편, 힌지 영역 및 Fc 도메인 서브유닛 또는 이의 부분을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함하며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 힌지 영역에 위치하며, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합 시에 선택적으로 활성화되는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 존재 하에서, 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하의 활성에 비하여 적어도 약 20% 증가하는 방법.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 표적 항원으로의 항원-결합 단백질의 결합의 부재 하에서, 힌지 영역에 위치한 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성이 유리 상태의 상응하는 사이토카인 또는 이의 변이체의 활성의 약 70% 이하인 방법.
  116. 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 또는 이의 변이체가 사이토카인 변이체이며, 유리 상태의 사이토카인 변이체의 활성이 유리 상태의 상응하는 야생형 사이토카인의 활성의 약 80% 이하인 방법.
  117. 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단백질이 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체이며, 힌지 영역을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드가 항체의 중쇄이며, 사이토카인 또는 이의 변이체가 중쇄의 힌지 영역에 위치하는 방법.
  118. 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 항원-결합 단편이 리간드이며, 표적 항원이 리간드에 의해 특이적으로 인식되는 수용체이거나;
    (ii) 항원-결합 단편이 수용체이며, 표적 항원이 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 리간드인 방법.
  119. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인을 인코딩하는 단리된 핵산.
  120. 제119항의 핵산을 포함하는 벡터.
  121. 제119항의 핵산 또는 제120항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  122. 제121항에 있어서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 숙주 세포.
  123. 하기를 포함하는 면역사이토카인의 생성 방법: (a) 제119항의 핵산 또는 제120항의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 제121항 또는 제122항의 숙주 세포를 인코딩된 면역사이토카인을 발현하기에 유효한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 면역사이토카인을 수득하는 단계.
  124. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  125. 유효량의 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인 또는 제124항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법.
  126. 제125항에 있어서, 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물이 정맥내 또는 피하 투여되는 방법.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물이 약 1 μg/kg 내지 약 50 mg/kg의 양으로 투여되는 방법.
  128. 제125항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 면역사이토카인 또는 약제학적 조성물이 3주마다 1회 투여되는 방법.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 장애가 암인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 암이 폐암, 간암, 신장암, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 담도암, 편평 세포 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종 및 메르켈 세포암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 개체가 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인 또는 제124항의 약제학적 조성물로 이전에 암 치료를 받았으며, 치료가 개체에서 암 재발을 예방하는 것을 포함하는 방법.
  132. 제129항 또는 제130항에 있어서, 치료가 개체에서 암을 예방하는 것을 포함하는 방법.
    [청구항 132]
    제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 장애가 감염, 자가면역 질병, 알레르기, 이식편 거부 또는 이식편대숙주병(GvHD)인 방법.
  133. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인 또는 제124항의 약제학적 조성물을 포함하는 암 백신.
  134. 유효량의 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항의 면역사이토카인, 제124항의 약제학적 조성물 또는 제133항의 암 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 암의 예방 방법.
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