TW201627318A - 膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種靶向CETP之細胞外而非細胞內形式之抗原肽，以降低LDL(包括oxLDL及LDL其他衍生物)之含量並增加HDL之含量。因此，本發明提供一種CETP疫苗，其用於克服CETP之低免疫原性及CETP活性之長期抑制，以便預防或治療oxLDL或其他LDL衍生物相關疾病/症狀。

Description

膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用
本發明係關於一種用於選擇性抑制血漿膽固醇酯轉運蛋白(CETP)，但不抑制細胞膽固醇酯轉運蛋白之抗原肽、一種包含該抗原肽之融合蛋白及一種用於引發CETP抗體來降低LDL含量且增加HDL含量之方法。特定言之，該抗原肽為來源於CETP之B細胞抗原決定基。
HDL因為其含量與心血管疾病之風險呈負相關而持續受到關注。此負相關性可以歸因於其不同的潛在抗動脈粥樣硬化特性，諸如逆向膽固醇轉運、抗炎性、抗氧化及抗血栓作用。臨床研究已顯示，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中亦發現低HDL-C。NASH與動脈粥樣硬化共享若干特徵，包括脂質累積、炎症及巨噬細胞浸潤。NASH之發病機制涉及清道夫受體(scavenger receptor)介導ox-LDL在肝臟中由巨噬細胞吸收。
膽固醇酯轉運蛋白(CETP)視作用於增加HDL-C之治療目標。由於在攜帶純合缺陷型CETP基因之日本人中觀察到高HDL-C及低LDL-C，此等日本人儘管患有高膽固醇血症，但未顯顯示早熟性動脈粥樣硬化之跡象，所以開始關注CETP作為治療目標。此CETP主要結合至HDL粒子且將膽固醇酯自HDL轉移至富含三酸甘油酯之脂蛋白。 CETP活動導致非HDL脂蛋白之CE富集，這會造成動脈粥樣硬化。處於不同臨床發展階段之小分子CETP抑制劑抑制CETP活性且顯著增加HDL-C，該等抑制劑包括達塞曲匹(dalcetrapib)、伊特普(evacetrapib)及安特普(anacetrapib)。然而，托徹普(torcetrapib)在3期臨床試驗中由於化合物特異性脫靶效應而失敗，且達塞曲匹在3期臨床試驗中由於不太有意義之結果而失敗。其他兩種CETP抑制劑伊特普及安特普仍在臨床試驗中。誘導針對特異性自體肽之免疫反應可能有益於治療某些疾病。基於肽之免疫之缺點包括自體肽之低免疫原性、化學結合之低效率及抗原製劑之不均勻性質。
US 7074407 B1提供一種用於藉由刺激抑制CETP功能之免疫反應來增加哺乳動物體內之HDL膽固醇之方法。US 6284533 B1提供一種基於質粒之疫苗，該疫苗基於編碼膽固醇酯轉運蛋白(CETP)之一或多個B細胞抗原決定基及一或多個大範圍輔助T細胞抗原決定基之DNA片段之組合。US20090104211提供一種CETP模擬抗原決定基，其胺基酸序列完全不同於CETP或CETP片段之胺基酸序列。US 6410022 B1係關於肽，該等肽包含輔助T細胞抗原決定基部分及用於引發針對內源性膽固醇酯轉運蛋白(CETP)活性之免疫反應的B細胞抗原決定基部分，用於預防或治療心血管疾病，諸如動脈粥樣硬化。WO2014003531提供一種由CETP肽免疫原之羧基末端組成之微胞奈米粒子之新穎疫苗組合物，用於鼻內投藥以便治療及/或預防由循環脂質之異常代謝引起之動脈粥樣硬化疾病或非酒精性脂肪肝。雖然研發出大量抗原，但其免疫原性及效率仍然不夠。
因此，仍然存在研發具有有益免疫原性之CETP肽免疫原之需要。
本發明係關於產生選擇性抑制血漿CETP之活動以藉由降低LDL (包括oxLDL及LDL之其他衍生物)之含量且增加HDL之含量來產生健康益處的療法。治療性組合物中之一種為有效疫苗，其中至少五個一致B細胞抗原決定基經配置為用於活化B細胞之串聯重複序列。本發明亦關於呈串聯重複序列結構形式之多價抗原及其用於研發針對CETP之對健康有益之疫苗的用途。
本發明提供一種用於引發CETP抗體之經分離抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID NO：1)組成之胺基酸序列之至少一個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。經分離抗原肽之實施例包括(但不限於)以下各者：包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之至少二、三、四或五個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽的經分離抗原肽；及包含2至10個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽的經分離抗原肽；包含4至8個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽的經分離抗原肽。較佳地，經分離抗原肽包含5至7個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。更佳地，經分離抗原肽包含6個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
本發明亦提供一種用於引發CETP抗體之抗原融合蛋白，其包含如下抗原融合蛋白，該抗原融合蛋白包含融合至用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域之本發明抗原肽或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。在一些實施例中，用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域選自包括以下之組：IgG之Fc片段、IgM之Fc片段及IgA之Fc片段。較佳地，該結構域為IgG之Fc片段。更佳地，該結構域為人類或兔IgG之Fc片段。
本發明亦提供一種治療劑，該治療劑係藉由選擇性抑制血漿CETP而非細胞CETP來降低LDL(包括oxLDL及LDL其他衍生物)之含量並增加HDL之含量。在一個實施例中，該治療劑為可結合至本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白之抗體。在一些實施例中，該抗體為多 株抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
本發明進一步提供一種醫藥製劑或組合物，其包含本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。在一個實施例中，該醫藥製劑或組合物為疫苗組合物。
本發明進一步提供一種用於引發或活化個體體內之CETP抗體之方法，其包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白。所引發之CEPT抗體靶向CETP之細胞外而非細胞內形式，以便降低LDL(包括oxLDL及LDL其他衍生物)之含量並且增加HDL之含量。另一方面，本發明提供本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體之用途，其用於製造供引發或活化個體體內之CETP抗體之藥劑。
在一個實施例中，本發明提供一種用於降低個體體內之LDL含量及增加HDL含量之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。因此，本發明提供一種用於治療或預防oxLDL或LDL衍生物相關疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。另一方面，本發明提供本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體之用途，其用於製造供減少個體體內之LDL含量並且增加HDL含量用之藥劑。另外，本發明提供本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體之用途，其用於製造供治療或預防個體之oxLDL或LDL衍生物相關疾病用之藥劑。
圖1 (A)及(B)顯示Fc-CETP6疫苗之製備。(A)Fc-CETP6之示意圖。(B)轉接子PCR之產物。(C)經His標記之Fc-CETP6免疫原之純度。
圖2 (A)及(B)顯示抗CETP抗體在用Fc-CETP6免疫之兔體內之表徵(實驗1)。(A)針對CETP之血漿抗體效價。(B)血漿CETP活性。
圖3 (A)至(E)顯示，用Fc-CETP6進行疫苗接種減少主動脈病變及 炎症(實驗1)。(A)在第24週結束時，代表性蘇丹(Sudan)IV染色之主動脈樣本。(B)主動脈病變面積之定量。(C)來自正常兔、對照兔及Fc-CETP6兔之主動脈之NF-κB及RAM-11之表現(放大倍數，×200)。(D)主動脈之RAM-11及NF-κB陽性面積之定量。
圖4 (A)至(E)顯示用Fc-CETP6進行疫苗接種減弱高HFC飲食誘發之脂肪變性及NASH。(A)、(B)用H&E染色之代表性肝臟切片(放大倍數，×200)。(C)來自對照兔及Fc-CETP6兔之肝臟之RAM-11之表現(放大倍數，上圖×100且下圖×400)。(D)來自對照兔及Fc-CETP6兔之肝臟之NF-κB之表現(放大倍數，上圖×100且下圖×400)。(E)對照兔(黑條)及Fc-CETP6兔(白條)體內之炎症相關基因之表現。
圖5 (A)及(B)顯示，用Fc-CETP6進行疫苗接種減少炎症相關基因及纖維化相關基因表現譜(實驗2)。(A)用馬森三色染色(Masson's trichrome stain)進行染色且針對活化之星狀細胞及肌纖維母細胞之標誌物α-SMA進行免疫組織化學染色的代表性肝臟切片。(B)對照兔(黑條)及Fc-CETP6兔(白條)體內之纖維化相關基因之表現。
本發明至少部分地基於靶向CETP之細胞外形式，但不靶向CETP之細胞內形式之抗原肽來降低LDL(包括oxLDL及LDL之其他衍生物)之含量及增加HDL之含量。因此，本發明提供一種CETP疫苗，其用於克服CETP之低免疫原性及CETP活性之長期抑制，以便預防或治療oxLDL或其他LDL衍生物相關疾病/症狀。
定義
在以下描述中，使用大量術語且提供以下定義來促進對所主張之主題之理解。在本文中未進行明確定義之術語根據其常見之及普通含義使用。
應注意，除非上下文另外清楚地指示，否則如本說明書及所附 申請專利範圍中所用，單數形式「一個/一種(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對「一個肽」之提及包括兩個或兩個以上此類肽之混合物，及其類似者。
如本文中所用，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。在多項附屬項之情況下，使用「或」只能以擇一方式引用前述獨立項或附屬項。
應注意，在本發明中且尤其在申請專利範圍及/或段落中，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprised)」、「包含(comprising)」及其類似者之術語可以意謂「包括(includes)」、「包括(included)」、「包括(including)」及其類似者；且諸如「基本上由......組成(consisting essentially of)」及「基本上由......組成(consists essentially of)」之術語考慮到未明確敍述之要素，但不包括先前技術中所發現的或影響本發明之基本或新穎特徵之要素。
如本文中所用，當提及多肽時，術語「經分離」意謂，所指示之分子與天然存在該分子之整個生物體分離且獨立，或存在該分子，但基本上不存在相同類型之其他生物大分子。術語「經分離」就聚核苷酸而言為完全或部分不含通常在自然界中與其有關之序列的核酸分子；或以其天然狀態存在，但具有與其相連之異源序列之序列；或自染色體脫離下來之分子。
如本文中所用，術語「抗原」係指含有抗原決定基(線性抗原決定基、構形抗原決定基或兩者)之分子，諸如蛋白質、多肽或其片段，該抗原決定基將刺激宿主之免疫系統作出體液及/或細胞抗原特異性反應。該術語可與術語「免疫原」互換地使用。諸如抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody)或其片段之抗體及可以模擬抗原或抗原決定子之合成肽模擬抗原決定基亦包括在如本文中所用之抗原之定義中。類似地，活體內表現抗原或抗原決定子(諸如在DNA免疫應用中)之寡 核苷酸或聚核苷酸亦包括在本文中之抗原之定義中。
如本文中所用，術語「抗原決定基」泛指抗原上由T細胞受體及/或抗體識別之位點。較佳地，其為來源於蛋白質抗原或作為蛋白質抗原之一部分之短肽。單個抗原分子可以攜帶若干不同抗原決定基。術語「抗原決定基」亦包括刺激識別整個生物體之反應之經修飾胺基酸序列。
如本文中所用，「免疫原性」蛋白質、多肽或肽意謂包括一或多個抗原決定基且因此可以調變免疫反應之分子。此類肽可以使用任何數目之此項技術中熟知之抗原決定基定位技術來鑑別，例如Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press,Totowa,N.J.。
如本文中所用，對組合物或疫苗之「免疫反應」為在宿主體內發展出對相關組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，「免疫反應」包括(但不限於)以下作用中之一或多者：產生特異性地針對相關組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將展現治療性或保護性免疫反應，使得對新感染之抗性將得到增強及/或疾病之臨床嚴重程度下降。該保護將藉由以下得到證實：感染宿主通常所展現之症狀及/或臨床疾病徵象減少或缺乏、恢復時間加快及/或感染宿主體內之病毒效價降低。
如本文中所用，術語「肽」係指胺基酸殘基藉由肽鍵彼此連接之聚合物分子。
術語「多肽」及「蛋白質」係指胺基酸殘基之聚合物且不限於產物之最小長度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物及其類似者均包括在該定義內。全長蛋白質及其片段均由該定義涵蓋。該術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似者。此 外，出於本發明之目的，「多肽」係指包括對天然序列之修飾之蛋白質，該等修飾諸如缺失、添加及取代，只要蛋白質維持所要活性即可。此等修飾可以為故意的，如藉由定點誘變；或可以為偶然的，諸如藉由產生該等蛋白質之宿主之突變或由於PCR擴增所引起之錯誤。
如本文中所用，術語「疫苗」可與「免疫保護性組合物」互換地使用且係指在接種至宿主生物體內後可以誘導出針對病原體之完全或部分免疫性或可以減少與病原體相關之疾病之影響的免疫原。
如本文中所用，術語「病狀」、「疾病」、「症狀」及「病症」可互換地使用。
如本文中所用之術語「投與(administer)」、「投與(administering)」或「投與(administration)」係指將本發明之藥劑或其醫藥組合物吸收、攝入、注射、吸入或以其他方式引入個體體內或個體上。
如本文中所用，「治療有效量」意謂免疫原/抗原/抗原決定基將誘導出免疫反應之量。
如本文中所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」係指預防疾病或病症或其一或多種症狀之發作、復發或擴散。在某些實施例中，該等術語係指在存在或不存在一或多種其他額外活性劑之情況下，在症狀發作之前，尤其對具有本文中所提供之疾病或病症之風險之患者而言，用抗原或蛋白質或抗體治療或投與抗原或蛋白質或抗體。該等術語涵蓋特定疾病之症狀之抑制或減少。在這點上，術語「預防」可以與術語「預防性治療」互換地使用。
如本文中所用，術語「個體」定義為包括動物，諸如哺乳動物，包括(但不限於)靈長類動物(例如，人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠及其類似者。在特定實施例中，個體為 人類。術語「個體」及「患者」在本文中在例如提及哺乳動物個體(諸如人類)時可互換地使用。
抗原肽及抗原融合蛋白
在一個態樣中，本發明提供一種用於引發CETP抗體之經分離抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID NO：1)組成之胺基酸序列之至少一個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
在一個實施例中，經分離抗原肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之至少二、三、四或五個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。在一些實施例中，經分離抗原肽包含2至10個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。在另一實施例中，經分離抗原肽包含4至8個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。較佳地，經分離抗原肽包含5至7個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。更佳地，經分離抗原肽包含6個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
在另一態樣中，本發明提供一種用於引發CETP抗體之抗原融合蛋白，其包含融合至用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域之本發明抗原肽或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。在一些實施例中，用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域選自包括以下之組：IgG之Fc片段、IgM之Fc片段及IgA之Fc片段。在另一實施例中，該結構域為IgG之Fc片段。較佳地，該結構域為人類或兔IgG之Fc片段。
人類IgG之Fc片段之聚核苷酸序列(SEQ ID NO：2)：
人類IgG之Fc片段之多肽序列(SEQ ID NO：3)：
兔IgG之Fc片段之聚核苷酸序列(SEQ ID NO：4)
兔IgG之Fc片段之多肽序列(SEQ ID NO：5)：
在一些實施例中，抗原融合蛋白包含融合至包含至少二、三、四或五個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列的Fc片段或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。在一些實施例中，抗原融合蛋白包含融合至包含2至10個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列的Fc片段或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。在另一實施例中，抗原融合蛋白包含融合至包含4至8個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列的Fc片段或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。較佳地，抗原融合蛋白包含融合至包含5至7個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列的Fc片段或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。更佳地，抗原融合蛋白包含融合至包含6個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列的Fc片段(Fc-CEPT6)或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。在一些實施例中，抗原融合蛋白包含融合至包含6個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之兔IgG的Fc片段(rFc-CETP6)或融合至包含6個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之人類IgG的Fc片段(hFc-CETP6)。rFc-CETP6及hFc-CETP6之聚核苷酸序列如下所述。
hFc-CETP 6 之聚核苷酸序列(SEQ ID NO：6)
粗體：限制酶切割位點
rFc-CETP 6 之聚核苷酸序列(SEQ ID NO：7)
粗體：限制酶切割位點
因此，抗原融合蛋白包含由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7編碼之序列。
一般而言，已知，肽中一或多個胺基酸之修飾不影響肽之功能，或在一些情況下，甚至增強初始蛋白質之所要功能。實際上，已知道，經修飾肽(亦即，由藉由使初始參考序列取代、缺失、插入或添加一個、兩個或若干個胺基酸殘基來加以修飾之胺基酸序列組成的肽)仍保留初始肽之生物活性(Mark等人，Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller及Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland等人，Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，根據本發明之一個實施例，本發明之用於引發CETP抗體之抗原肽包含由SEQ ID NO：1組成之胺基酸序列之至少一個重複序列，在該序列中係經添加、缺失、插入及/或取代一個、兩個或甚至兩個以 上胺基酸。
一般技術者將認識到，對胺基酸序列所作之更改單個胺基酸或整個胺基酸序列之一小部分之單獨修飾(亦即，缺失、插入、添加或取代)促成初始胺基酸側鏈之特性之保守；因此，其稱為「保守取代」或「保守修飾」，其中蛋白質之更改產生具有類似功能之蛋白質。提供功能上類似之胺基酸之保守取代表在此項技術中為熟知的。胺基酸側鏈特性之實例為疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)及具有以下官能基或共同特徵之側鏈：脂族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基側鏈(S、T、Y)；含硫原子側鏈(C、M)；含羧酸及醯胺之側鏈(D、N、E、Q)；含鹼基側鏈(R、K、H)；及含芳族基之側鏈(H、F、Y、W)。此類經保守修飾之肽亦視作本發明之抗原肽。然而，本發明肽不限於此等且可以包括非保守修飾，只要所得經修飾肽保留初始未修飾肽之CETP抗體引發功能即可。
本發明之抗原肽或抗原融合蛋白可以使用熟知技術製備。舉例而言，該等肽或蛋白質可以藉由重組DNA技術或化學合成，以合成方式製備。本發明之肽或蛋白質可以單獨地或以包括兩個或兩個以上肽之較長多肽形式合成。該等肽或蛋白質可以經分離，亦即經純化或經分離成基本上不含其他天然存在之宿主細胞蛋白及其片段或任何其他化學物質。
本發明之肽或蛋白質可以藉由肽或蛋白質技術之普通技術人員已知的若干技術中之任一種進行化學合成。一般而言，此等方法採用向正在生長之肽鏈依序添加一或多個胺基酸。通常，藉由適合保護基保護第一個胺基酸之胺基或羧基。隨後可以藉由在允許形成醯胺鍵之條件下，在互補基團(胺基或羧基)適當地加以保護之序列中添加下一個胺基酸，使經保護或衍生之胺基酸連接至惰性固體載體或用於溶液 中。隨後移除新添加之胺基酸殘基之保護基且隨後添加下一個胺基酸(適當地加以保護)，以此類推。在已按恰當序列連接所要胺基酸之後，依序或並行地移除任何其餘保護基(及任何固體載體，若使用固相合成技術)，得到最終多肽。藉由簡單修改此通用程序，有可能向生長鏈一次性添加一個以上胺基酸，例如藉由使受保護之三肽與恰當地加以保護之二肽偶合(在不會使對掌性中心外消旋之條件下)，從而在脫除保護基之後形成五肽。參見例如J.M.Stewart及J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.1984)；及G.Barany及R.B.Merrifield,The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology，編者E.Gross及J.Meienhofer，第2卷，(Academic Press,New York,1980)，第3-254頁，關於固相肽合成技術；及M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,(Springer-Verlag,Berlin 1984)及E.Gross及J.Meienhofer編，The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology，第1卷，關於經典溶液合成。
或者，本發明肽或蛋白質可以藉由改編任何已知用於產生肽或蛋白質基因工程方法(例如，重組表現、自細胞培養物純化、化學合成等)且以各種形式(例如，天然的、突變體、融合體等)獲得。用於製備該等肽及蛋白質之方式在此項技術中為熟知的。較佳地以實質上純的形式(亦即實質上不含其他宿主細胞或非宿主細胞蛋白質)製備肽及蛋白質(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss及Curtiss,Methods in Enzymology(Wu等人編)1983,101：347-62)。舉例而言，首先，製備具有編碼該肽或蛋白質之聚核苷酸之呈可表現形式(例如，對應於啟動子序列之調控序列之下游)之適合載體且將其轉型至適合宿主細胞中；該等載體及宿主細胞亦由本發明提供。隨後培養宿主細胞，產生相關的肽或蛋白質。該肽或蛋白質亦可以藉由採用活體外翻譯系統活體外產生。
本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白為來源於CETP之外顯子9之多肽的B細胞抗原決定基。本發明經分離抗原肽可以選擇性地阻斷血漿CETP之活動，但不阻斷細胞CETP之活動，且因此比阻斷CETP之兩種形式之活動之藥劑有效。
抗體
在另一態樣中，本發明提供一種用於藉由選擇性抑制血漿CETP但不抑制細胞CETP來降低LDL(包括oxLDL及LDL之其他衍生物)之含量且增加HDL之含量的治療劑。
在一個實施例中，本發明提供一種結合至本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白之抗體。本發明抗體可以按任何形式使用，諸如單株抗體或多株抗體，且包括藉由用本發明肽使諸如兔之動物免疫獲得的抗血清、所有種類之多株抗體及單株抗體、藉由基因重組產生之人類抗體及人類化抗體。如本文中所用，抗體為與CEPT肽之全長或片段反應之蛋白質。在一較佳實施例中，本發明抗體識別CETP之外顯子9上之片段肽；較佳地，具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之CEPT之片段。用於合成寡肽之方法在此項技術中為熟知的。在合成之後，肽可以在用作免疫原之前視情況加以純化。在本發明中，寡肽可以與用於藉由抗原呈現細胞增加吸收之結構域結合或連接或融合至該結構域來增強免疫原性。用於使該結構域及肽結合之方法在此項技術中為熟知的。
任何哺乳動物均可以用抗原進行免疫。一般而言，使用嚙齒目、兔形目或靈長類動物。嚙齒目動物包括例如小鼠、大鼠及倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長類動物包括例如狹鼻猴(舊大陸猴)，諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恆河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)及黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原對動物進行免疫之方法在此項技術中為熟知的。抗原之 腹膜內注射或皮下注射為哺乳動物免疫之標準方法。更特定言之，抗原可以經稀釋且懸浮於恰當量之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、生理鹽水等中。必要時，可以將該抗原懸浮液與恰當量之標準佐劑(諸如弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant))混合，製成乳液且隨後向哺乳動物投與。較佳地，緊接著每4至21天投與跟恰當量之弗氏不完全佐劑混合之抗原若干次。亦可以使用恰當載劑進行免疫。如上免疫之後，藉由標準方法檢查血清中所要抗體之量的增加情況。
針對本發明之肽或蛋白質之多株抗體可以藉由自經檢查血清中之所要抗體增加之經免疫哺乳動物採集血液，且藉由任何習知方法自血液中分離出血清來製備。多株抗體可以包括含有多株抗體之血清，含有多株抗體之部分亦可以自血清中分離出來。免疫球蛋白G或M可以自僅識別本發明肽之部分如下製備：使用例如與本發明肽偶合之親和柱，且使用蛋白A或蛋白G柱進一步純化此部分。
為製備單株抗體，自如上所述用抗原免疫且經檢查血清中之所要抗體之含量增加之哺乳動物採集免疫細胞，且使該等免疫細胞經歷細胞融合。用於細胞融合之免疫細胞較佳地自脾細胞或骨髓瘤細胞獲得。以上免疫細胞及骨髓瘤細胞可以根據已知方法(例如Milstein等人(Galfre及Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981)之方法)融合。藉由細胞融合獲得之所得融合瘤可以藉由在標準選擇培養基中對其進行培養來加以選擇。隨後，執行標準有限稀釋法，篩選且選殖出產生所要抗體之融合瘤細胞。
由此獲得之單株抗體亦可以使用基因工程技術(參見例如Borrebaeck及Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies，由MacMillan Publishers LTD在英國(the United Kingdom)出版(1990))以重組方式製備。舉例而言，可以自免疫細胞(諸如產生抗體之融合瘤或經免疫淋巴細胞)選殖編碼抗體之DNA，將其插入恰當載體中，且 引入宿主細胞中，從而製備出重組抗體。本發明亦提供如上所述製備之重組抗體。此外，本發明抗體可以為抗體或經修飾抗體之片段，只要其結合至本發明肽中之一或多者即可。舉例而言，抗體片段可以為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H鏈及L鏈之Fv片段藉由恰當連接子接合(Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。
或者，本發明抗體可以按介於來源於非人類抗體之可變區與來源於人類抗體之恆定區之間的嵌合抗體形式或以人類化抗體形式獲得，該人類化抗體包含來源於非人類抗體之互補決定區(CDR)、來源於人類抗體之構架區(FR)及恆定區。此類抗體可以根據已知技術製備。人類化可以藉由用人類抗體之CDR或CDR序列取代嚙齒動物之對應序列來進行(參見例如Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988))。因此，該等人類化抗體為嵌合抗體，其中實質上不到完整的人類可變結構域業經來自非人類物種之對應序列取代。
亦可以使用除人類構架區及恆定區之外的包含人類可變區之完全人類抗體。該等抗體可以使用此項技術中已知之各種技術產生。舉例而言，活體外方法涉及使用展示於噬菌體上之人類抗體片段之重組文庫(例如，Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991))。
如上獲得之抗體可以經純化為均質的。舉例而言，可以根據用於一般蛋白質之分離及純化方法執行抗體之分離及純化。舉例而言，可以藉由經過恰當選擇及組合使用之柱層析來分開及分離抗體，該等柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電點聚焦(Antibodies：A Laboratory Manual.Harlow及David Lane編，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此。
含有該等肽或蛋白質或抗體作為活性成分之醫藥製劑或組合物
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥製劑或組合物，其包含本 發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。
本發明之肽或蛋白質或抗體可以按醫藥製劑或組合物形式直接投與，或必要時，可以藉由習知調配方法調配。在調配過程中，除本發明肽之外，適當時亦可以不受特定限制地包括載劑、賦形劑及常用於藥物之物質。
待投與之醫藥製劑或組合物可以按醫藥學上可接受之溶液形式提供，諸如水溶液，常常為生理鹽水或緩衝溶液，或者其可以按粉末形式提供。存在本發明醫藥組合物之各種適合調配物(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker，第1-3卷(1998)；Remington's Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)及類似出版物)。適用於口服之調配物可以由以下各者組成：(a)液體溶液，諸如有效量之重組細菌懸浮於稀釋劑中，該等稀釋劑諸如緩衝水、生理鹽水或PEG 400；(b)膠囊、藥囊或錠劑，各自含有預定量之活性成分，呈凍乾粉末、液體、固體、顆粒或明膠形式；(c)在恰當液體中之懸浮液；及(d)適合乳液。錠劑形式可以包括以下各者中之一或多者：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、黃蓍、微晶纖維素、阿拉伯膠(acacia)、明膠、膠態二氧化矽、交聯羧甲纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑及藥理學上相容之載劑。口含錠形式可以包含活性成分於調味劑中，該調味劑通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍，片劑亦包含活性成分於諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠乳液、凝膠及其類似者之惰性基質中，除活性成分之外亦含有此項技術中已知之載劑。應認識到，減毒疫苗在經口投與時，必須防止其消化。這通常藉由使疫苗與組合物複合而使得其對酸性水解及酶促水解具有抵抗性或藉由將疫苗包裝在諸如脂質體或腸溶包衣膠囊 之具恰當抗性之載劑中來實現。防止減毒細菌消化之方式在此項技術中為熟知的。醫藥組合物可以囊封在例如脂質體中或囊封在提供活性成分之緩釋之調配物中。
本發明之肽或蛋白質或抗體可以按組合形式製備，該組合包括本發明之肽、蛋白質或抗體中之兩者或兩者以上。組合中之肽或蛋白質或抗體可以相同或不同。肽或蛋白質或抗體可以呈混合物形式，或在肽或蛋白質之情況下，本發明之肽或蛋白質可以使用標準技術彼此結合。藉由投與本發明之肽或蛋白質，該等肽或蛋白質在APC上以高密度呈現。
該等醫藥製劑或組合物可以用於藉由選擇性抑制血漿CETP，但不抑制細胞CETP來降低LDL(包括oxLDL及LDL之其他衍生物)之含量且增加HDL之含量，該等醫藥製劑或組合物包括任何本發明肽作為活性成分。在另一實施例中，該等醫藥製劑或組合物可以另外包括佐劑，使得將有效地建立細胞免疫性，或其可以與其他活性成分一起投與。已知適合佐劑之實例包括明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁及MF59(4.3% w/v角鯊烯、0.5% w/v Tween 80、0.5% w/v Span 85)、弗氏佐劑、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1',2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)及RIBI、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)於2%角鯊烯/Tween 80乳液中或卡介苗(Bacille Calmette-Guerin；BCG)。佐劑之有效性可以藉由量測針對免疫原性抗原之抗體之量來測定。
必要時，本發明之醫藥製劑或組合物可以視情況包括第二活性成分，只要第二成分可以降低LDL含量或增加HDL含量即可。舉例而 言，第二活性成分為士他汀(statin)(諸如阿托伐他汀(atorvastatin)(立普妥(Lipitor))、氟伐他汀(fluvastatin)(來適可(Lescol))、洛伐他汀(lovastatin)(美降之(Mevacor)、艾托可(Altocor))、匹伐他汀(pitavastatin)(洛瓦洛(Livalo))、普伐他汀(pravastatin)(普拉固(Pravachol))、羅素他汀(rosuvastatin)(可定(Crestor))及辛伐他汀(simvastatin)(舒降之(Zocor)))或菸酸(諸如肌醇及菸酸鹽)。本發明之肽或蛋白質亦可以與第二活性成分依序或並行地投與。
本發明之醫藥製劑或組合物之量視例如所用醫藥組合物之類型、待治療之疾病及投藥之療程及途徑而定。
一般技術者將容易認識到，考慮到所討論之調配物之類型(例如，賦形劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑等)，除本文中特別提及之成分之外，本發明之醫藥製劑或組合物可以進一步包括此項技術中之其他習知物質。
本發明之肽、蛋白質或抗體之使用方法或用途
在另一態樣，本發明提供一種用於引發或活化個體體內之CETP抗體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白。所引發之CEPT抗體靶向CETP之細胞外形式，但不靶向CETP之細胞內形式，以便降低LDL(包括oxLDL及LDL之其他衍生物)之含量且增加HDL之含量。
在一個實施例中，本發明提供一種用於降低個體體內之LDL含量且增加HDL含量之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。
因此，本發明提供一種用於治療或預防oxLDL或LDL衍生物相關疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明經分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。
oxLDL或LDL衍生物相關疾病包括(但不限於)神經退化性疾病、 心血管疾病、膽固醇代謝相關症狀、炎症性疾病、肝病及腎病、哮喘、脊髓損傷及創傷性腦損傷。在一些實施例中，代謝相關症狀為高血壓、脂肪肝或糖尿病；炎症性疾病為關節炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；且心血管疾病為中風。
在一些實施例中，本發明方法中所用之個體選自包括以下各者之組：人類、狗、貓、牛、兔及豬。
本文中所述之本發明實施例選擇性地阻斷血漿CETP之活動，但不阻斷細胞CETP之活動，因此其比阻斷CETP之兩種形式之活動的藥劑有效。因此，本文中所述之實施例可以降低LDL含量且增加HDL含量，從而治療或預防oxLDL或其他LDL衍生物相關疾病/症狀。
實例 材料及方法
構造出用於編碼人類CETP抗原決定基之6個重複序列之DNA片段，緊接著使其與兔Fc融合且在大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中表現融合蛋白。
如先前所描述(Hsu等人2000,Cancer Res.60：3701-3705)，藉由模板重複聚合酶鏈式反應(TR-PCR)產生用於編碼人類CETP抗原決定基肽PEHLLVDFLQSL(Gaofu等人2004,Vaccine 22：3187-3194)之6個重複序列之DNA片段(圖1)。隨後使用轉接子引子(表1)使TR-PCR產物經歷轉接子PCR以在5'端及3'端形成限制位點，從而促進進一步次選殖。將200-300bp轉接子PCR產物(圖1B)溶離出來且選殖至T-Easy載體(Promega)中。藉由定序且在編碼兔IgG之Fc結構域之區域的3'端次選殖至經修飾之質粒pET21b載體(Novagen)中來鑑別含有CETP抗原決定基之6個複本之純系。藉由定序且引入大腸桿菌BL21(DE3)中證實所得質粒pFc-CETP6，且藉由His結合柱(Novagen)層析純化經表現之融合蛋白(Fc-CETP6)。
分析抗CETP抗體效價
使GST及GST-CETP蛋白在大腸桿菌Top10(Invitrogen)中表現，且藉由親和層析純化。使用塗有GST-CETP或作為標記對照之GST之培養盤應用ELISA，從而測定CETP之血漿抗體效價。效價定義為在405nm下光密度為1.0之血漿稀釋度。
動物實驗
執行兩個動物研究；在兩個研究中，使16週齡之雌性新西蘭白兔(New Zealand White rabbit)(約2kg)適應2週時間，且隨後進行如下處理。
在第一實驗中，將該等兔隨機地分成正常組(n=4)、對照組(n=7)或Fc-CETP6組(n=8)。正常組中之兔喂以常規飼料，而對照組及Fc-CETP6組中之兔喂以HFC飼料(補充有5%豬油及0.25%膽固醇之食物)。在研究期期間，各動物每天喂以100g飼料且允許其開放攝取自來水。Fc-CETP6組中之兔在第1天及在第2週、第4週、第6週及第8週結束時皮下注射0.1mg Fc-CETP6(第一次注射完全弗氏佐劑且其他全部注射不完全弗氏佐劑)，而喂以HFC飼料之對照組用含PBS之佐劑經歷相同注射時程。在第1週、第8週、第12週、第20週及第24週結束時採集血漿樣品且量測CETP活性及抗CETP抗體之效價。在第24週，使該等兔禁食隔夜，且次日早晨藉由吸入異氟烷麻醉且亦採集兔之主動脈進行動脈粥樣硬化病變分析。
在第二實驗中，除Fc-CETP6組兔(n=8)在第24週及第28週結束時 接受含0.1mg Fc-CETP6之不完全弗氏佐劑之強化注射且在第52週結束時殺死之外，如第一實驗中一般處理該等兔。在禁食隔夜之後，如上所述使兔麻醉且在灌注生理鹽水之後移出其肝臟。隨後獲得三個右葉樣品(各約1cm3)，固定在4%多聚甲醛中，且包埋在石蠟中。
有關研究動物之照護及使用之所有程序遵照行政院衛生署之臺灣食品及藥物管理局動物中心(the animal center of the Taiwan Food and Drug Administration,Department of Health,Executive Yuan)之指南，且得到該動物中心之批准。
偵測CETP活性
使用CETP活性分析套組(BioVision)，根據製造商之指南，量測血漿CETP活性。資料按佔治療前含量之百分比形式呈現。
分離脂蛋白部分且量測膽固醇含量
用於分離脂蛋白部分之程序先前已有描述(Chang等人2004,J.Lipid Res.45：2116-2122)。簡言之，藉由在4℃下低速離心製備血漿，隨後藉由密度梯度超速離心法分離VLDL、LDL及HDL，且根據製造商之指南，以酶促方式(Randox)測定血漿及脂蛋白部分中之膽固醇濃度。
主動脈中之動脈粥樣硬化病變之定量
用冰冷PBS灌注主動脈20分鐘，且隨後用冷甲醛-蔗糖溶液(10%中性福爾馬林(formalin)、5%蔗糖、20mM丁基化羥基甲苯及2mM EDTA，pH 7.4)加壓固定。隨後將整個主動脈切開且縱向打開主動脈，在70%乙醇中簡單地沖洗，且用蘇丹IV(0.5%蘇丹IV於35%乙醇/50%丙酮中)染色，且用80%乙醇脫色5分鐘。隨後將各主動脈安裝在平坦表面上且使用數位相機獲得其表面之影像。用蘇丹IV染色之面積(脂質斑塊)表示為佔主動脈總表面積之百分比。
免疫組織化學分析
所用程序先前已有描述(Chiang等人2012,Vaccine 30：7573-7581)。簡言之，藉由免疫組織化學染色，使用小鼠抗NF-κB及抗RAM-11抗體(Dako)測定NF-κB及RAM-11在主動脈及肝臟組織中之表現量。自各動物之截面及在顯微鏡(Olympus，BX60)下拍攝之各截面之十個隨機視野(放大倍數，×200)分析主動脈。自各動物之三個右葉組織切片及在顯微鏡(Olympus，BX60)下拍攝之各切片之十個隨機視野(放大倍數，×200)分析肝臟組織。
肝臟組織學及肝臟中之脂肪變性及纖維化之定量
用蘇木精及曙紅(H&E)及馬森三色染色對肝臟切片(4μm)進行染色。病理學專家用非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)之組織學評分系統評定組織學脂肪變性及纖維化階段(Kleiner等人2005,Hepatology 41：1313-1321)。分析來自各動物之三個組織切片及在顯微鏡(Olympus，BX60)下拍攝之各切片之十個隨機視野(放大倍數，×200)。
量測血漿ApoA-I及氧化之LDL含量
根據製造商之指南，使用分別來自CUSABIO(CSB-E09804Rb)及Mercodia(10-1158-01)之夾心ELISA套組，量測血漿ApoA-I及血漿ox-LDL。
統計分析
所有資料都以平均值±SEM形式呈現。藉由柯爾莫哥羅夫-斯米爾諾夫檢驗(Kolmogorov-Smirnov test)檢查正態性，且當資料呈常態分佈時，用獨立t檢驗及單因子變異數分析(1-way ANOVA)且藉由使用SPSS統計程序，版本17進行相關與回歸分析來評定差異之統計顯著性。當資料不呈常態分佈時，應用曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test)。在所有分析中，認為P<0.05之值為統計顯著的。
實例1 產生Fc-CETP6疫苗
產生編碼CETP抗原決定基之6個重複序列之DNA且在大腸桿菌菌 株BL21(DE3)中誘導及表現融合蛋白，如圖1中所示。藉由在His結合柱上之親和層析法純化融合蛋白Fc-CETP6。藉由庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色及西方墨點法(Western blotting)檢查Fc-CETP6融合蛋白之純度，該純度達95%。經His結合純化之Fc-CETP6之純度。泳道1至3分別顯示流通部分、洗滌部分及溶離液之庫馬斯藍染色結果，而泳道4顯示使用抗兔IgG(Fc)抗體之溶離液之西方墨點分析(圖1C)。
實例2. 在餵以HFC飼料之兔中，Fc-CETP 6 疫苗引發針對CETP之抗體且降低CETP活性
為證實產生抗CETP抗體且該等抗體與循環中之CETP反應，量測血漿抗CETP效價及血漿CETP活性。圖2A顯示，在Fc-CETP6組中自第12週開始偵測到抗CETP抗體且效價一直增加直至在第24週研究結束為止。圖2B顯示，在兩個餵以HFC飼料之組中，血漿CETP活性均以時間依賴性方式增加，但在Fc-CETP6組中，血漿CETP活性明顯較低。此等結果顯示，注射Fc-CETP6誘導產生針對CETP之抗體，該等抗體隨後降低CETP活性。
實例3. Fc-CETP 6 疫苗對總膽固醇及HDL膽固醇之血漿含量之影響
用Fc-CETP6進行疫苗接種對總C及HDL-C之含量及體重之影響概述在表2中。在體重方面，在對照組與Fc-CETP6之間無顯著差異。兩組中之總C及HDL-C之含量均以時間依賴性方式增加。在第12週及第24週，Fc-CETP6組中之總C含量明顯低於對照組，且HDL-C含量明顯高於對照組。另外，在第12週及第24週，Fc-CETP6組中之非HDL-C/HDL-C比率低於對照組。此等結果顯示，Fc-CETP6免疫引起致動脈粥樣硬化脂蛋白譜減少。
表2 在餵以HFC飼料之兔中，在存在或不存在疫苗接種之情況下，體重及血漿總膽固醇及HDL-C之改變.
對照n=7；Fc-CETP6 n=8。1值為平均值±SEM。*同時相比於對照，p<0.05
實例4. Fc-CETP 6 增加ApoA-I含量且降低ox-LDL含量
ApoA-I為HDL中之主要蛋白質且已知具有消炎作用(Navab等人2005,Trends Cardiovasc.Med.15：158-161)；已顯示，高含量之ApoA-I減慢動脈粥樣硬化之進展且甚至誘導消退，指示ApoA-I直接預防動脈粥樣硬化(Smith JD 2010,Curr.Opin.Investig.Drugs 11：989-996)。另外，ox-LDL在動脈中由巨噬細胞吸收且將其轉化成富含膽固醇之泡沫細胞，該等泡沫細胞已顯示為參與NASH之發展(Chalasani等人2004,Am.J.Gastroenterol.99：1497-1502)。因此，吾人量測兔體內之ApoA-I及ox-LDL之血漿含量(表3)且發現，Fc-CETP6組中之ApoA-I含量明顯高於對照組，且ox-LDL含量明顯低於對照組。另外，免疫螢光染色顯示，Fc-CETP6組中之肝臟靜脈區域周圍之ox-LDL之表現量明顯低於對照組(資料未顯示)。此等結果可以幫助解釋用Fc-CETP6進行疫苗接種為何緩解HFC飼料誘發之動脈粥樣硬化及NASH之發展。
實例5. Fc-CETP 6 改善主動脈中之HFC飼料誘發之動脈粥樣硬化病變及炎症
為檢查用Fc-CETP6進行疫苗接種是否可以改善動脈粥樣硬化斑塊之形成，自各兔中分離出主動脈且用蘇丹IV染色。各組之代表性蘇丹IV染色之主動脈示出在圖3A中，且整個主動脈中之動脈粥樣硬化之程度使用影像分析系統定量，示出在圖3B中。在正常兔中，僅約1%之主動脈表面積經蘇丹IV染色。相比之下，維持HFC飼料持續24週之兔在對照組中發展出覆蓋62.9±4.3%之主動脈表面之動脈粥樣硬化病變，但在Fc-CETP6組中僅28.5±6.2%(圖3B)。因為動脈粥樣化形成涉及長期炎症且巨噬細胞視作主動脈局部炎症之關鍵介導者(Libby P 2002,Nature 420：868-874)，所以執行免疫組織化學分析來偵測主動脈中炎症標誌物NF-κB及巨噬細胞標誌物RAM-11之存在情況。圖3C顯示，在正常兔之主動脈中未偵測到NF-κB或RAM-11染色，然而在對照組中，HFC飼料引起內膜中強烈的RAM-11及NF-κB染色。藉由用Fc-CETP6進行疫苗接種，兩種影響均顯著減小(圖3D)(圖3E)。總而言之，吾人之結果顯示，用Fc-CETP6進行免疫降低主動脈炎症及巨噬細胞浸潤之程度，且因此減小對兔主動脈中動脈粥樣硬化進展之易感性。
實例6. Fc-CETP 6 緩解HFC飼料誘發之NASH及纖維化
NASH之特徵在於肝脂質累積及炎症，其可以最終進展成肝硬化。在經設計用於檢查該疫苗是否能夠緩解HFC飼料誘發之動脈粥樣硬化之第一實驗中，吾人觀察到，對照組之肝臟之顏色為淺色，而正常組及Fc-CETP6組之肝臟之顏色為紅色，表明Fc-CETP6注射緩解HFC誘發之非酒精性脂肪性肝病。Ogawa等人發現，藉由餵以補充有0.75%膽固醇及12%玉米油之飼料，在兔中誘發出人類型NASH與晚期纖維化(Ogawa等人2010,Am.J.Pathol.177：153-165)。在第二實驗中，為測試Fc-CETP6疫苗是否可以減小餵以HFC飼料之兔中之NASH及纖維化之易感性，吾人藉由用H&E及馬森三色對肝臟切片進行染 色，檢查在餵12個月之HFC飼料之後之兔中Fc-CETP6疫苗對肝脂質累積及NASH之影響。如圖4B中所示，對照組之肝臟切片顯示實質性脂質累積、伴隨著靜脈周圍區域中之氣脹變性(ballooning degeneration)之小泡型脂肪變性、炎症細胞浸潤及馬洛氏小體(Mallory hyaline)之證據(圖4B)，然而Fc-CETP6組之肝臟切片顯示僅具有輕度脂肪累積之肝細胞，且正常組之肝臟切片未顯示脂肪變性之證據。為進一步評估Fc-CETP6對肝臟炎症之影響，使用針對識別活化之庫普弗細胞(kupffer cell)(Buyssens等人1996,Hepatology 24：939-946)之RAM-11及炎症標誌物NF-κB之抗體來執行免疫組織化學染色。相比於對照兔之肝臟，Fc-CETP6之肝臟顯示，在中央靜脈區域周圍在其中肝細胞之脂肪變性明顯之位點處，RAM-11陽性細胞之數目減少。正常組顯示為RAM-11陰性對照(圖4C)。在較高放大倍數下，大RAM-11陽性細胞含有液泡(脂滴)。此外，對照兔肝臟中之中央靜脈區域周圍之細胞進行NF-κB染色，且在Fc-CETP6組中，NF-κB染色細胞明顯減少。正常組顯示為NF-κB陰性對照(圖4D)。炎症及纖維化之改變藉由偵測促炎性細胞因子及與纖維化相關之基因之肝臟mRNA表現量得到進一步證實。圖4E顯示，Fc-CETP6組中之腫瘤壞死因子α(TNFα)及介白素-6(IL-6)之mRNA含量明顯低於對照組；然而(介白素1β)IL-1β在兩個組之間沒有不同。此等結果支持Fc-CETP6減少餵以HFC飼料之兔中之肝臟炎症。
對照組之肝臟切片顯示陽性三色染色，顯著之橋接纖維化，其中纖維帶自靜脈周圍區域延伸至細胞周圍區域，然而Fc-CETP6組顯示減少或無橋接纖維化。纖維化間隔由α-SMA陽性細胞構成，α-SMA為活化星狀細胞及肌纖維母細胞之標誌物(圖5A)；然而Fc-CETP6組顯示限於中央靜脈區域中之減少的橋接纖維化。且Fc-CETP6兔肝臟中之纖維化相關基因轉化生長因子β1(TGF-β1)、膠原蛋白1A1(Col1A1)、 3A1(Col3A1)及金屬蛋白酶-1之組織抑制劑(TIMP-1)之肝臟mRNA含量全都明顯低於對照兔肝臟中(圖5B)。此等結果支持Fc-CETP6減少餵以HFC飼料之兔中之肝纖維化。
脂肪變性及纖維化之級別概述在表3中。就脂肪變性而言，結果顯示，對照組之肝臟樣本中沒有0級或1級，7%為2級且93%為3級，然而Fc-CETP6組之值中12%為0級，56%為1級，32%為2級，且沒有3級。就纖維化而言，在對照組中，沒有0級或1級，同時25%為2級，62.5%為3級，且12.5%為4級，然而在Fc-CETP6組中，14%之肝臟樣本未展現纖維化，同時29%為1a級，43%為1b級，14%為2級，且沒有3級或4級(參見表4)。
*肝性脂肪變性之嚴重程度之等級劃分如下：<5%(0)；5%-33%(1)；34%-66%(2)；且>66%(3)。
†肝纖維化之嚴重程度之等級劃分如下：沒有(0)；竇周(1a)；門靜脈周(1b)；門靜脈周及竇周(2)；橋接纖維化(3)；且肝硬化(4)。
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<400> 11

Claims (25)

  1. 一種用於引發CETP抗體之經分離抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID NO：1)組成之胺基酸序列之至少一個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
  2. 如請求項1之經分離抗原肽，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：1之至少二、三、四或五個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
  3. 如請求項1之經分離抗原肽，其包含2至10個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
  4. 如請求項1之經分離抗原肽，其包含5至7個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
  5. 如請求項1之經分離抗原肽，其包含6個重複序列或其用於引發CETP抗體之經修飾肽。
  6. 一種用於引發CETP抗體之抗原融合蛋白，其包含：抗原融合蛋白，該抗原融合蛋白包含融合至用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域的如請求項1之抗原肽，或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。
  7. 如請求項6之抗原融合蛋白，其中該用於藉由抗原呈現細胞(APC)增加吸收之結構域選自包括以下之組：IgG之Fc片段、IgM之Fc片段及IgA之Fc片段。
  8. 如請求項6之抗原融合蛋白，其中該結構域為IgG之Fc片段。
  9. 如請求項6之抗原融合蛋白，其中該結構域為人類或兔IgG之Fc片段。
  10. 如請求項6之抗原融合蛋白，其包含融合至包含至少兩個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之Fc片段，或其用於引發 CETP抗體之經修飾蛋白質。
  11. 如請求項6之抗原融合蛋白，其包含融合至包含2至10個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之Fc片段，或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。
  12. 如請求項6之抗原融合蛋白，其包含融合至包含5至7個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之Fc片段，或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。
  13. 如請求項6之抗原融合蛋白，其包含融合至包含6個胺基酸序列SEQ ID NO：1之線性重複序列之Fc片段(Fc-CEPT6)，或其用於引發CETP抗體之經修飾蛋白質。
  14. 如請求項6之抗原融合蛋白，其包含由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7編碼之序列。
  15. 一種抗體，其結合至如請求項1之經分離抗原肽或如請求項6之經分離融合蛋白。
  16. 如請求項15之抗體，其為多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  17. 一種醫藥製劑或組合物，其包含如請求項1之經分離抗原肽或如請求項6之抗原融合蛋白或如請求項15之抗體。
  18. 如請求項17之醫藥製劑或組合物，其為包含如請求項1之經分離抗原肽或如請求項6之抗原融合蛋白之疫苗組合物。
  19. 如請求項17之醫藥製劑或組合物，其進一步包含佐劑。
  20. 如請求項17之醫藥製劑或組合物，其進一步包含第二活性劑。
  21. 一種用於引發或活化個體中之CETP抗體之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1之經分離抗原肽或如請求項6之抗原融合蛋白。
  22. 一種用於降低個體中LDL含量及增加HDL含量之方法，其包含向 該個體投與有效量之如請求項1之經分離抗原肽、或如請求項6之抗原融合蛋白或如請求項15之抗體。
  23. 一種用於治療或預防oxLDL或LDL衍生物相關疾病之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1之經分離抗原肽、或如請求項6之抗原融合蛋白或如請求項15之抗體。
  24. 如請求項23之方法，其中該oxLDL或LDL衍生物相關疾病為神經退化性疾病、心血管疾病、膽固醇代謝相關症狀、炎症性疾病、肝病及腎病、哮喘、脊髓損傷及創傷性腦損傷。
  25. 如請求項24之方法，其中該代謝相關症狀為高血壓、脂肪肝或糖尿病；該炎症性疾病為關節炎或非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis；NASH)；且該心血管疾病為中風。
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