CN105859837A

CN105859837A - 胆固醇酯转运蛋白抗原肽和融合蛋白以及其组合物和应用

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Publication number: CN105859837A
Application number: CN201510687752.4A
Authority: CN
Inventors: 黃昭莲
Original assignee: Taipei Medical University TMU
Current assignee: Taipei Medical University TMU
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: US20160145312A1; US9944684B2; TW201627318A; CN105859837B

Abstract

本发明提供一种靶向CETP的细胞外形式，但不靶向CETP的细胞内形式的抗原肽，用于降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平。因此，本发明提供一种CETP疫苗，其用于克服CETP的低免疫原性和CETP活性的长期抑制，以便预防或治疗oxLDL或其它LDL衍生物相关疾病/症状。

Description

胆固醇酯转运蛋白抗原肽和融合蛋白以及其组合物和应用

技术领域

本发明涉及一种用于选择性抑制血浆胆固醇酯转运蛋白(CETP)，但不抑制细胞胆固醇酯转运蛋白的抗原肽、一种包含所述抗原肽的融合蛋白以及一种用于引发CETP抗体来降低LDL水平并且增加HDL水平的方法。具体来说，所述抗原肽是来源于CETP的B细胞表位。

背景技术

HDL因为其水平与心血管疾病的风险呈负相关而持续受到关注。这种负相关性可以归因于其不同的潜在抗动脉粥样硬化特性，例如逆向胆固醇转运、抗炎性、抗氧化以及抗血栓作用。临床研究已经显示，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中也发现了低HDL-C。NASH与动脉粥样硬化共享若干特征，包括脂质累积、炎症以及巨噬细胞浸润。NASH的发病机制涉及清道夫受体介导ox-LDL在肝脏中被巨噬细胞吸收。

胆固醇酯转运蛋白(CETP)被认为是用于增加HDL-C的治疗目标。由于在携带纯合缺陷型CETP基因的日本人中观察到了高HDL-C和低LDL-C，这些日本人尽管患有高胆固醇血症，但是未显示出早熟性动脉粥样硬化的迹象，所以开始关注CETP作为治疗目标。这种CETP主要结合到HDL粒子并且将胆固醇酯从HDL转移到富含三酸甘油酯的脂蛋白。CETP活动导致非HDL脂蛋白的CE富集，这会造成动脉粥样硬化。处于不同临床发展阶段的小分子CETP抑制剂抑制CETP活性并且显着增加HDL-C，所述抑制剂包括达塞曲匹(dalcetrapib)、伊特普(evacetrapib)和安特普(anacetrapib)。然而，托彻普(torcetrapib)在3期临床试验中由于化合物特异性脱靶效应而失败，并且达塞曲匹在3期临床试验中由于不太有意义的结果而失败。其它两种CETP抑制剂伊特普和安特普还在临床试验中。诱导针对特异性自体肽的免疫反应可能有益于治疗某些疾病。基于肽的免疫的缺点包括自体肽的低免疫原性、化学结合的低效率以及抗原制剂的不均匀性质。

US 7074407 B1提供了一种用于通过刺激抑制CETP功能的免疫反应来增加哺乳动物体内的HDL胆固醇的方法。US 6284533 B1提供了一种基于质粒的疫苗，所述疫苗基于编码胆固醇酯转运蛋白(CETP)的一或多个B细胞表位和一或多个大范围辅助T细胞表位的DNA片段的组合。US20090104211提供了一种CETP模拟表位，其氨基酸序列完全不同于CETP或CETP片段的氨基酸序列。US 6410022 B1涉及肽，所述肽包含辅助T细胞表位部分和用于引发针对内源性胆固醇酯转运蛋白(CETP)活性的免疫反应的B细胞表位部分，用于预防或治疗心血管疾病，例如动脉粥样硬化。WO2014003531提供了一种由CETP肽免疫原的羧基末端组成的胶束纳米粒子的新颖疫苗组合物，用于鼻内投药以便治疗和/或预防由循环脂质的异常代谢引起的动脉粥样硬化疾病或非酒精性脂肪肝。虽然研发出了大量抗原，但是其免疫原性和效率仍然不够。

因此，仍然存在研发具有优越免疫原性的CETP肽免疫原的需要。

发明内容

本发明涉及产生选择性抑制血浆CETP的活动以通过降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平来产生健康益处的疗法。治疗性组合物中的一种是有效疫苗，其中至少五个一致B细胞表位被安排为用于活化B细胞的串联重复序列。本发明还涉及呈串联重复序列结构形式的多价抗原和其用于研发针对CETP的对健康有益的疫苗的用途。

本发明提供一种用于引发CETP抗体的经分离抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID NO:1)组成的氨基酸序列的至少一个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。经分离抗原肽的实施例包括(但不限于)以下各者：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少两个、三个、四个或五个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽的经分离抗原肽；包含2个到10个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽的经分离抗原肽；包含4个到8个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽的经分离抗原肽。优选地，经分离抗原肽包含5个到7个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。更优选地，经分离抗原肽包含6个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

本发明还提供一种用于引发CETP抗体的抗原融合蛋白，其包含如下抗原融合蛋白，所述抗原融合蛋白包含融合到用于通过抗原递呈细胞(APC)增加吸收的结构域的本发明抗原肽或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。在一些实施例中，用于通过抗原递呈细胞(APC)增加吸收的结构域选自包括以下的群组：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段和IgA的Fc片段。优选地，所述结构域是IgG的Fc片段。更优选地，所述结构域是人类或兔IgG的Fc片段。

本发明还提供一种治疗剂，所述治疗剂通过选择性抑制血浆CETP，但不抑制细胞CETP来降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平。在一个实施例中，所述治疗剂是结合到本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白的抗体。在一些实施例中，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

本发明进一步提供一种药剂或组合物，其包含本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。在一个实施例中，所述药剂或组合物是疫苗组合物。

本发明进一步提供一种用于引发或活化个体体内的CETP抗体的方法，其包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白。所引起的CEPT抗体靶向CETP的细胞外形式，但不靶向CETP的细胞内形式，以便降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平。另一方面，本发明提供本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体用于制造医药的用途，所述医药用于引发或活化个体体内的CETP抗体。

在一个实施例中，本发明提供一种用于降低个体体内的LDL水平并且增加HDL水平的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。因此，本发明提供一种用于治疗或预防oxLDL或LDL衍生物相关疾病的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。另一方面，本发明提供本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体用于制造医药的用途，所述医药用于降低个体体内的LDL水平并且增加HDL水平。此外，本发明提供本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体用于制造医药的用途，所述医药用于治疗或预防个体内oxLDL或LDL衍生物相关疾病。

附图说明

图1(A)及(B)示出了Fc-CETP₆疫苗的制备。(A)Fc-CETP₆的示意图。(B)接头PCR的产物。(C)经His标记的Fc-CETP₆免疫原的纯度。

图2(A)及(B)示出了抗CETP抗体在用Fc-CETP₆免疫的兔体内的表征(实验1)。(A)针对CETP的血浆抗体滴度。(B)血浆CETP活性。

图3(A)至(E)示出了，用Fc-CETP6进行疫苗接种减少了主动脉病变和炎症(实验1)。(A)在第24周结束时，代表性苏丹(Sudan)IV染色的主动脉样本。(B)主动脉病变面积的定量。(C)来自正常兔、对照兔和Fc-CETP₆兔的主动脉的NF-κB和RAM-11(放大倍数，×200)的表达。(D)主动脉的RAM-11和NF-κB阳性面积的定量。

图4(A)至(E)示出了用Fc-CETP₆进行疫苗接种减弱了高HFC饮食诱发的脂肪变性和NASH。(A)、(B)用H&E染色的代表性肝脏切片(放大倍数，×200)。(C)来自对照兔和Fc-CETP₆兔的肝脏的RAM-11(放大倍数，上图×100并且下图×400)的表达。(D)来自对照兔和Fc-CETP₆兔的肝脏的NF-κB(放大倍数，上图×100并且下图×400)的表达。(E)对照兔(黑条)和Fc-CETP₆兔(白条)体内的炎症相关基因的表达。

图5(A)及(B)示出了，用Fc-CETP6进行疫苗接种减少了炎症相关基因和纤维化相关基因表达谱(实验2)。(A)用马森三色染色(Masson's trichrome stain)进行染色和针对活化的星形细胞和肌成纤维细胞的标志物α-SMA进行免疫组织化学染色的代表性肝脏切片。(B)对照兔(黑条)和Fc-CETP6兔(白条)体内的纤维化相关基因的表达。

具体实施方式

本发明至少部分地基于靶向CETP的细胞外形式，但不靶向CETP的细胞内形式的抗原肽来降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平和增加HDL的水平。因此，本发明提供一种CETP疫苗，其用于克服CETP的低免疫原性和CETP活性的长期抑制，以便预防或治疗oxLDL或其它LDL衍生物相关疾病/症状。

定义

在以下描述中，使用了大量术语并且提供以下定义来促进对所要求的主题的理解。在本文中未进行明确定义的术语根据其常见的和普通的含义使用。

应注意，除非上下文另外清楚地指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，举例来说，对“一个肽”的提及包括两个或两个以上这类肽的混合物等。

如本文中所用，除非另外说明，否则使用“或”意味着“和/或”。在多项从属权利要求的情况下，使用“或”只能以择一的方式引用前述独立权利要求或从属权利要求。

应注意，在本发明中并且尤其是在权利要求书和/或段落中，例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等术语可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且例如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”的术语考虑到未明确叙述的要素，但不包括现有技术中所发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。

如本文中所用，当术语“经分离”提及多肽时，意指所指示的分子与天然存在所述分子的整个生物体分离并且独立，或存在所述分子，但基本上不存在相同类型的其它生物大分子。术语“经分离”就多核苷酸来说是完全或部分不含通常在自然界中与其有关的序列的核酸分子；或以其天然状态存在，但具有与其相连的异源序列的序列；或从染色体脱离下来的分子。

如本文中所用，术语“抗原”是指含有表位(线性表位、构象表位或两者)的分子，例如蛋白质、多肽或其片段，所述表位将刺激宿主的免疫系统作出体液和/或细胞抗原特异性反应。所述术语可与术语“免疫原”互换地使用。例如抗独特型抗体(anti-idiotype antibody)或其片段的抗体以及可以模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位也包括在如本文中所用的抗原的定义中。类似地，体内表达抗原或抗原决定簇(例如在DNA免疫应用中)的寡核苷酸或多核苷酸也包括在本文中的抗原的定义中。

如本文中所用，术语“表位”泛指抗原上由T细胞受体和/或抗体识别的位点。优选地，其为来源于蛋白质抗原或作为蛋白质抗原的一部分的短肽。单个抗原分子可以携带若干不同表位。术语“表位”还包括刺激识别整个生物体的反应的经修饰的氨基酸序列。

如本文中所用，“免疫原性”蛋白质、多肽或肽意指包括一或多个表位并且因此可以调变免疫反应的分子。这类肽可以使用任何数量的本领域中众所周知的表位作图技术来鉴别。例如表位作图方案(Epitope Mapping Protocols)分子生物学方法(Methods inMolecular Biology),第66卷(格伦E.莫里斯(Glenn E.Morris)编,1996)胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州特图瓦市(Totowa,N.J.)。

如本文中所用，对组合物或疫苗的“免疫反应”是在宿主体内发展出对相关组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括(但不限于)以下作用中的一或多者：产生特异性地针对相关组合物或疫苗中所包括的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将展现治疗性或保护性免疫反应，使得对新感染的抗性将得到增强和/或疾病的临床严重程度下降。所述保护将通过以下得到证实：被感染的宿主通常所展现的症状和/或临床疾病征象减少或缺乏、恢复时间加快和/或被感染的宿主体内的病毒滴度降低。

如本文中所用，术语“肽”是指氨基酸残基通过肽键彼此连接的聚合物分子。

术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物并且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在所述定义内。全长蛋白质和其片段均由所述定义涵盖。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰的蛋白质，所述修饰例如缺失、添加和取代，只要蛋白质维持所要活性即可。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变；或可以是偶然的，例如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增所引起的错误。

如本文中所用，术语“疫苗”可与“免疫保护性组合物”互换地使用并且是指在接种到宿主生物体内后可以诱导出针对病原体的完全或部分免疫性或可以减少与病原体相关的疾病的影响的免疫原。

如本文中所用，术语“病状”、“疾病”、“症状”和“病症”可互换地使用。

如本文中所用的术语“投与(administer)”、“投与(administering)”或“投与(administration)”是指将本发明的药剂或其药物组合物吸收、摄入、注射、吸入或以其它方式引入个体体内或个体上。

如本文中所用，“治疗有效量”意指免疫原/抗原/表位将诱导出免疫反应的量。

如本文中所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指预防疾病或病症或其一或多种症状的发作、复发或扩散。在某些实施例中，所述术语是指在存在或不存在一或多种其它额外活性剂的情况下，在症状发作之前，尤其是对有本文中所提供的疾病或病症的风险的患者来说，用抗原或蛋白质或抗体治疗或投与抗原或蛋白质或抗体。所述术语涵盖特定疾病的症状的抑制或减少。在这点上，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换地使用。"

如本文中所用，术语“个体”被定义为包括动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)灵长类动物(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在特定实施例中，个体是人类。术语“个体”和“患者”在本文中在例如提及哺乳动物个体(例如人类)时可互换地使用。

抗原肽和抗原融合蛋白

一方面，本发明提供一种用于引发CETP抗体的经分离抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID NO:1)组成的氨基酸序列的至少一个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

在一个实施例中，经分离抗原肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少两个、三个、四个或五个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。在一些实施例中，经分离抗原肽包含2个到10个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。在另一个实施例中，经分离抗原肽包含4个到8个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。优选地，经分离抗原肽包含5个到7个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。更优选地，经分离抗原肽包含6个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

另一方面，本发明提供一种用于引发CETP抗体的抗原融合蛋白，其包含融合到用于通过抗原递呈细胞(APC)增加吸收的结构域的本发明抗原肽或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。在一些实施例中，用于通过抗原递呈细胞(APC)增加吸收的结构域选自包括以下的群组：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段和IgA的Fc片段。在另一个实施例中，所述结构域是IgG的Fc片段。优选地，所述结构域是人类或兔IgG的Fc片段。

人类IgG的Fc片段的多核苷酸序列(SEQ ID NO:2):

atggcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc

gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgg

gaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctc

caacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg

ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag

ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggca

gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggatcccct

tgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatg

ctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgc

ggatgcaagcttcatcaccaccatcaccatgagcttcatcatcatcatcatcattaa

人类IgG的Fc片段的多肽序列(SEQ ID NO:3):

M A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V SH E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V VS V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A KG Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I AV E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K SR W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K G S P C CG C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G C GC P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C K L H H HH H H E L H H H H H H stop

兔IgG的Fc片段的多核苷酸序列(SEQ ID NO:4):

gccccctcgacaagc agcaagcccacgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat

cttccccccaaaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggacgtgagccagg atgaccccga

ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgcaccgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt

ggtcagcaccctccccatca cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac cgagaaaacc atctccaaag

ccagagggca gcccctggagccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctgacctgcatga

tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacgggaaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg

acagcgacgg ctcctacttcctctacaaca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgctccgtgatgc

acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccgggtaaa

兔IgG的Fc片段的多肽序列(SEQ ID NO:5):

A P S T S S K P T C P P P E L L G G P S V F I F P P K P K D T L M I S R T P EV T C V V V D V S Q D D P E V Q F T W Y I N N E Q V R T A R P P L R E Q QF N S T I R V V S T L P I T H Q D W L R G K E F K C K V H N K A L P A P I EK T I S K A R G Q P L E P K V Y T M G P P R E E L S S R S V S L T C M I N GF Y P S D I S V E W E K N G K A E D N Y K T T P A V L D S D G S Y F L Y NK L S V P T S E W Q R G D V F T C S V M H E A L H N H Y T Q K S I S R S PG K G S P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C P CC G C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G C G C P C C G C C G CG C K L R S G H H H H H H G R S G H H H H H H G

在一些实施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含至少两个、三个、四个或五个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。在一些实施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含2个到10个氨基酸序列SEQID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。在另一个实施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含4个到8个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。优选地，抗原融合蛋白包含融合到包含5个到7个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。更优选地，抗原融合蛋白包含融合到包含6个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段(Fc-CEPT₆)或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。在一些实施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含6个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的兔IgG的Fc片段(rFc-CETP₆)，或融合到包含6个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的人类IgG的Fc片段(hFc-CETP₆)。所述rFc-CETP₆及hFc-CETP₆的多核苷酸序列描述如下。

hFc-CETP ₆ 的多核苷酸序列(SEQ ID NO:6):

GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGCGGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGCGGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGATGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGCAGA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CAT CAC GGT AGA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CATCAC GGT TAA

粗体:限制酶切位

rFc-CETP ₆ 的多核苷酸序列(SEQ ID NO:7):

GCCCCCTCGACAAGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCACGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAACAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA

粗体:限制酶切位

因此，所述抗原融合蛋白包含由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7编码的序列。

一般来说，我们知道，肽中一或多个氨基酸的修饰不影响肽的功能，或在一些情况下，甚至增强初始蛋白质的所要功能。实际上，已经知道，经修饰肽(即，由通过使初始参考序列取代、缺失、插入或添加一个、两个或若干个氨基酸残基来加以修饰的氨基酸序列组成的肽)保留了初始肽的生物活性(马克(Mark)等人,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)1984,81:5662-6；佐勒(Zoller)和史密斯(Smith),核酸研究(Nucleic Acids Res)1982,10:6487-500；达尔巴蒂·麦克法兰(Dalbadie-McFarland)等人,美国国家科学院院刊1982,79:6409-13)。因此，根据本发明的一个实施例，本发明的用于引发CETP抗体的抗原肽包含由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列的至少一个重复序列，在所述序列中，添加、缺失、插入和/或取代了一个、两个或甚至更多个氨基酸。

本领域的普通技术人员将认识到，对氨基酸序列所作的更改单个氨基酸或整个氨基酸序列的一小部分的单独修饰(即，缺失、插入、添加或取代)促成了初始氨基酸侧链的特性的保守；因此，其被称为“保守取代”或“保守修饰”，其中蛋白质的更改产生了具有类似功能的蛋白质。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在本领域中众所周知。氨基酸侧链特性的实例是疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)以及具有以下官能团或共同特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺的侧链(D、N、E、Q)；含碱基侧链(R、K、H)；以及含芳香族基的侧链(H、F、Y、W)。这类经保守修饰的肽也被认为是本发明的抗原肽。然而，本发明肽不限于这些并且可以包括非保守修饰，只要所得经修饰肽保留初始未修饰肽的CETP抗体引发功能即可。

本发明的抗原肽或抗原融合蛋白可以使用众所周知的技术制备。举例来说，所述肽或蛋白质可以通过重组DNA技术或化学合成，以合成方式制备。本发明的肽或蛋白质可以单独地或以包括两个或两个以上肽的较长多肽形式合成。所述肽或蛋白质可以经分离，即经纯化或经分离成基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白和其片段或任何其它化学物质。

本发明的肽或蛋白质可以通过肽或蛋白质领域的普通技术人员已知的若干技术中的任一种进行化学合成。一般来说，这些方法采用向正在生长的肽链依序添加一或多个氨基酸。通常，通过合适的保护基保护第一个氨基酸的氨基或羧基。然后可以通过在允许形成酰胺键的条件下，在具有互补基团(氨基或羧基)的适当地加以保护的序列中添加下一个氨基酸，使被保护或衍生的氨基酸连接到惰性固体载体或用于溶液中。然后去除新添加的氨基酸残基的保护基并且然后添加下一个氨基酸(适当地加以保护)，以此类推。在已经按恰当序列连接所要氨基酸之后，依序或并行地去除任何其余保护基(和任何固体载体，如果使用了固相合成技术)，得到最终多肽。通过简单修改这个通用程序，有可能一次性向生长链添加一个以上氨基酸，例如通过使受保护的三肽与恰当地加以保护的二肽偶合(在不会使手性中心外消旋的条件下)，从而在脱除保护基之后形成五肽。参见例如J.M.斯图尔特(J.M.Stewart)和J.D.杨(J.D.Young),固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)(皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.),伊利诺斯州罗克福德(Rockford,Ill.)1984)；以及G.巴拉尼(G.Barany)和R.B.梅里菲尔德(R.B.Merrifield),肽：分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology),编者E.格罗斯(E.Gross)和J.门恩费尔(J.Meienhofer),第2卷,(学术出版社(Academic Press),纽约(New York),1980),第3-254页,关于固相肽合成技术；以及M.博丹斯基(M.Bodansky),肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis),(施普林格出版社(Springer-Verlag),柏林(Berlin)1984)；以及E.格罗斯和J.门恩费尔编,肽：分析、合成、生物学,第1卷,关于经典的溶液合成。

或者，本发明肽或蛋白质可以通过改编任何已知用于产生肽或蛋白质基因工程方法(例如，重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)并且以各种形式(例如，天然的、突变体、融合体等)获得。用于制备所述肽和蛋白质的方式在本领域中众所周知。优选地以实质上纯的形式(即实质上不含其它宿主细胞或非宿主细胞蛋白质)制备肽和蛋白质。(例如，莫里森J(Morrison J),细菌学杂志(J Bacteriology)1977,132:349-51；克拉克·寇蒂斯(Clark-Curtiss)和寇蒂斯(Curtiss),酶学方法(Methods in Enzymology)(吴(Wu)等人编)1983,101:347-62)。举例来说，首先，制备具有编码所述肽或蛋白质的多核苷酸的呈可表达形式(例如，对应于启动子序列的调控序列的下游)的合适载体并且将其转型到合适的宿主细胞中。所述载体和宿主细胞也由本发明提供。然后培养宿主细胞，产生相关的肽或蛋白质。所述肽或蛋白质还可以采用体外翻译系统于体外产生。

本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白是来源于CETP的外显子9的多肽的B细胞表位。本发明的经分离抗原肽可以选择性地阻断血浆CETP的活动，但不阻断细胞CETP的活动，并且因此比阻断CETP的两种形式的活动的药剂有效。

抗体

另一方面，本发明提供一种用于通过选择性抑制血浆CETP但不抑制细胞CETP来降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平的治疗剂。

在一个实施例中，本发明提供一种结合到本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白的抗体。本发明的抗体可以按任何形式使用，例如单克隆抗体或多克隆抗体，并且包括通过用本发明的肽使例如兔的动物免疫获得的抗血清、所有种类的多克隆抗体和单克隆抗体、通过基因重组产生的人类抗体和人类化抗体。如本文中所用，抗体是与CEPT肽的全长或片段反应的蛋白质。在一个优选实施例中，本发明的抗体识别CETP的外显子9上的片段肽；优选地，具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的CEPT的片段。用于合成寡肽的方法在本领域中众所周知。在合成之后，肽可以在用作免疫原之前任选地加以纯化。在本发明中，寡肽可以与用于通过抗原递呈细胞增加吸收的结构域结合或连接或融合到所述结构域来增强免疫原性。用于使所述结构域和肽结合的方法在本领域中也是众所周知的。

任何哺乳动物都可以用抗原进行免疫。一般来说，使用啮齿目、兔形目或灵长类动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长类动物包括例如狭鼻猴(旧大陆猴)，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesusmonkey)、狒狒(sacred baboon)以及黑猩猩(chimpanzee)。

用抗原对动物进行免疫的方法在本领域中是已知的。抗原的腹膜内注射或皮下注射是哺乳动物免疫的标准方法。更具体来说，抗原可以经稀释并且悬浮于恰当量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。必要时，可以将所述抗原悬浮液与恰当量的标准佐剂(例如弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant))混合，制成乳液并且然后向哺乳动物投与。优选地，紧接着每4到21天投与跟恰当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原若干次。还可以使用恰当载剂进行免疫。如上免疫之后，通过标准方法检查血清中所要抗体的量的增加情况。

针对本发明的肽或蛋白质的多克隆抗体可以通过从经检查血清中的所要抗体增加的经免疫哺乳动物采集血液，并且通过任何常规方法从血液中分离出血清来制备。多克隆抗体可以包括含有多克隆抗体的血清，含有多克隆抗体的部分也可以从血清中分离出来。免疫球蛋白G或M可以从仅识别本发明肽的部分如下制备：使用例如与本发明肽偶合的亲和柱，并且使用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化这个部分。

为了制备单克隆抗体，从如上所述用抗原免疫并且经检查血清中的所要抗体的水平增加的哺乳动物采集免疫细胞，并且使所述免疫细胞经历细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选地从脾细胞或骨髓瘤细胞获得。以上免疫细胞和骨髓瘤细胞可以根据已知方法(例如米尔斯坦(Milstein)等人(加尔弗(Galfre)和米尔斯坦,酶学方法(MethodsEnzymol)73:3-46(1981)的方法)融合。通过细胞融合获得的所得杂交瘤可以通过在标准选择培养基中对其进行培养来加以选择。然后，执行标准有限稀释法，筛选并且克隆出产生所要抗体的杂交瘤细胞。

由此获得的单克隆抗体也可以使用基因工程技术(参见例如波勒柏克(Borrebaeck)和拉里克(Larrick),治疗性单克隆抗体(Therapeutic Monoclonal Antibodies),由麦克米伦出版公司(MacMillan Publishers LTD)在英国出版(1990))以重组方式制备。举例来说，可以从免疫细胞(例如产生抗体的杂交瘤或经免疫淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将其插入到恰当载体中，并且引入宿主细胞中，从而制备出重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。此外，本发明抗体可以是抗体或经修饰抗体的片段，只要其结合到本发明肽中的一或多者即可。举例来说，抗体片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)，其中来自H链和L链的Fv片段通过恰当连接子接合(休斯顿(Huston)等人,美国国家科学院院刊85:5879-83(1988))。

或者，本发明抗体可以按介于来源于非人类抗体的可变区与来源于人类抗体的恒定区之间的嵌合抗体形式或以人类化抗体形式获得，所述人类化抗体包含来源于非人类抗体的互补决定区(CDR)、来源于人类抗体的框架区(FR)和恒定区。这类抗体可以根据已知技术制备。人类化可以通过用人类抗体的CDR序列取代啮齿动物的对应序列来进行(参见例如韦荷恩(Verhoeyen)等人,科学(Science)239:1534-1536(1988))。因此，所述人类化抗体是嵌合抗体，其中实质上不到完整的人类可变结构域已经被来自非人类物种的对应序列取代。

还可以使用除了人类框架区和恒定区之外还包含人类可变区的完全人类抗体。所述抗体可以使用本领域中已知的各种技术产生。举例而言，体外方法涉及使用展示于噬菌体上的人类抗体片段的重组文库(例如，霍根布姆(Hoogenboom)和温特(Winter),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227:381(1991)。

如上获得的抗体可以被纯化为均质的。举例来说，可以根据用于一般蛋白质的分离和纯化方法执行抗体的分离和纯化。举例来说，可以通过经过恰当选择和组合使用的柱色谱，例如亲和色谱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及等电点聚焦来分开和分离抗体(抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual).哈洛(Harlow)和大卫·莱恩(David Lane)编,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))，但所述柱色谱不限于此。

含有所述肽或蛋白质或抗体作为活性成分的药剂或组合物

另一方面，本发明提供一种药剂或组合物，其包含本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。

本发明的肽或蛋白质或抗体可以按药剂或组合物形式直接投与，或必要时，可以通过常规调配方法调配。在调配过程中，除了本发明的肽之外，适当时还可以不受特定限制地包括载剂、赋形剂以及常用于药物的物质。

待投与的药剂或组合物可以按药物学上可接受的溶液形式提供，例如水溶液，常常是生理盐水或缓冲溶液，或者所述药剂或组合物可以按粉末形式提供。存在本发明药物组合物的各种合适的调配物。参见例如利伯曼(Lieberman),药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms),马塞尔·德克尔出版社(Marcel Dekker),第1-3卷(1998)；雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Science),第17版,马克出版公司(Mack Publishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)(1985)以及类似出版物。适用于口服的调配物可以由以下各者组成：(a)液体溶液，例如有效量的重组细菌悬浮于稀释剂中，所述稀释剂例如缓冲水、生理盐水或PEG 400；(b)胶囊、药囊或片剂，各自含有预定量的活性成分，呈冻干粉末、液体、固体、颗粒或明胶形式；(c)在恰当液体中的悬浮液；以及(d)合适的乳液。片剂形式可以包括以下各者中的一或多者：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄蓍胶、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药理学上兼容的载剂。口含片形式可以包含活性成分于调味剂中，所述调味剂通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶，片剂也包含活性成分于例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等惰性基质中，除了活性成分之外还含有本领域中已知的载剂。应认识到，减毒疫苗在经口投与时，必须防止其消化。这通常通过使疫苗与组合物复合而使得其对酸性水解和酶促水解具有抵抗性或通过将疫苗包装在例如脂质体或肠溶包衣胶囊的具恰当抗性的载剂中来实现。防止减毒细菌消化的方式在本领域中众所周知。药物组合物可以例如封装在脂质体中或封装在提供活性成分的缓释的调配物中。

本发明的肽或蛋白质或抗体可以按组合形式制备，所述组合包括本发明的肽、蛋白质或抗体中的两者或两者以上。组合中的肽或蛋白质或抗体可以相同或不同。肽或蛋白质或抗体可以呈混合物形式，或在肽或蛋白质的情况下，本发明的肽或蛋白质可以使用标准技术彼此结合。通过投与本发明的肽或蛋白质，所述肽或蛋白质在APC上以高密度递呈。

所述药剂或组合物可以用于通过选择性抑制血浆CETP，但不抑制细胞CETP来降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平，所述药剂或组合物包括任何本发明肽作为活性成分。在另一个实施例中，所述药剂或组合物可以另外包括佐剂，使得将有效地建立细胞免疫性，或其可以与其它活性成分一起投与。已知合适的佐剂的实例包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝和MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温(Tween)80、0.5％w/v斯潘(Span)85)、弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(CGP11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1',2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)以及RIBI、海藻糖二霉菌酸酯以及细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)于2％角鲨烯/吐温80乳液中或卡介苗(Bacille Calmette-Guerin；BCG)。佐剂的有效性可以通过测量针对免疫原性抗原的抗体的量来测定。

必要时，本发明的药剂或组合物可以任选地包括第二活性成分，只要第二成分可以降低LDL水平或增加HDL水平即可。举例来说，第二活性成分是史他汀类药物(statins)(例如：阿托伐他汀(atorvastatin；立普妥(Lipitor))、氟伐他汀(fluvastatin；益脂可(Lescol)、洛伐他汀(lovastatin；美降脂(Mevacor)，Altocor)、匹伐他汀(pitavastatin；力清之(Livalo))、普伐他汀(pravastatin；美百乐(Pravachol))、瑞舒伐他汀(rosuvastatin；冠脂妥(Crestor))及辛伐他汀(simvastatin；舒降之(Zocor)))或烟碱酸类(例如肌醇及烟碱酸盐(nicotinate))。本发明的肽或蛋白质还可以与第二活性成分依序或并行地投与。

本发明的药剂或组合物的量取决于例如所用药物组合物的类型、待治疗的疾病以及投药的疗程和途径。

本领域的技术人员将容易认识的，考虑到所讨论的调配物的类型(例如，赋形剂、填充剂、粘合剂、稀释剂等)，除了本文中特别提到的成分之外，本发明的药剂或组合物可以进一步包括本领域中的其它常规物质。

本发明的肽、蛋白质或抗体的使用方法

另一方面，本发明提供一种用于引发或活化个体体内的CETP抗体的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白。所引起的CEPT抗体靶向CETP的细胞外形式，但不靶向CETP的细胞内形式，以便降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平。

在一个实施例中，本发明提供一种用于降低个体体内的LDL水平并且增加HDL水平的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。

因此，本发明提供一种用于治疗或预防oxLDL或LDL衍生物相关疾病的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的经分离抗原肽或抗原融合蛋白或抗体。

oxLDL或LDL衍生物相关疾病包括(但不限于)神经变性病、心血管疾病、胆固醇代谢相关症状、炎症性疾病、肝病和肾病、哮喘、脊髓损伤以及创伤性脑损伤。在一些实施例中，代谢相关症状是高血压、脂肪肝或糖尿病；炎症性疾病是关节炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；并且心血管疾病是中风。

在一些实施例中，本发明方法中所用的个体选自包括以下各者的群组：人类、狗、猫、牛、兔和猪。

本文中所述的本发明实施例选择性地阻断血浆CETP的活动，但不阻断细胞CETP的活动，因此其比阻断CETP的两种形式的活动的药剂有效。因此，本文中所述的实施例可以降低LDL水平并且增加HDL水平，以便治疗或预防oxLDL或其它LDL衍生物相关疾病/症状。

实例

材料和方法

构造出用于编码人类CETP表位的6个重复序列的DNA片段，紧接着使其与兔Fc融合并且在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中表达融合蛋白。

如先前所描述(许(Hsu)等人2000,癌症研究(Cancer Res.)60:3701-3705)，通过模板重复聚合酶链式反应(TR-PCR)产生用于编码人类CETP表位肽PEHLLVDFLQSL(高福(Gaofu)等人2004,疫苗(Vaccine)22:3187-3194)的6个重复序列的DNA片段(图1)。然后使用接头引物(表1)使TR-PCR产物经历接头PCR以在5'端和3'端形成限制位点，从而促进进一步亚克隆。将200-300bp接头PCR产物(图1B)洗脱出来并且克隆到T-Easy载体(普洛麦格(Promega))中。通过测序并且在编码兔IgG的Fc结构域的区域的3'端亚克隆到经修饰的质粒pET21b载体(诺瓦根(Novagen))中来鉴别含有CETP表位的6个拷贝的克隆体。通过测序并且引入大肠杆菌BL21(DE3)中证实所得质粒pFc-CETP₆，并且通过His结合柱(诺瓦根)色谱纯化所表达的融合蛋白(Fc-CETP₆)。

表1用于构造中的引子

分析抗CETP抗体滴度

使GST和GST-CETP蛋白在大肠杆菌Top10(英杰公司(Invitrogen))中表达，并且通过亲和色谱纯化。使用涂有GST-CETP或作为标记对照的GST的培养板应用ELISA，从而测定CETP的血浆抗体滴度。滴度被定义为在405nm下的光密度为1.0的血浆稀释度。

动物实验

执行两个动物研究；在两个研究中，使16周龄的雌性新西兰白兔(约2kg)适应2周时间，并且然后进行如下处理。

在第一个实验中，将所述兔随机地分成正常组(n＝4)、对照组(n＝7)或Fc-CETP6组(n＝8)。正常组中的兔喂以常规饲料，而对照组和Fc-CETP₆组中的兔喂以HFC饲料(补充有5％猪油和0.25％胆固醇的食物)。在研究期期间，每只动物每天喂以100g饲料并且允许其开放摄取自来水。Fc-CETP₆组中的兔在第1天以及在第2周、第4周、第6周和第8周结束时皮下注射0.1mg Fc-CETP₆(第一次注射完全弗氏佐剂并且其它的全部注射不完全弗氏佐剂)，而喂以HFC饲料的对照组用含PBS的佐剂经历相同的注射时程。在第1周、第8周、第12周、第20周和第24周结束时采集血浆样品并且测量CETP活性和抗CETP抗体的滴度。在第24周，使所述兔禁食过夜，并且次日早晨通过吸入异氟烷麻醉并且还采集兔的主动脉进行动脉粥样硬化病变分析。

在第二个实验中，除了Fc-CETP6组兔(n＝8)在第24周和第28周结束时接受含0.1mg Fc-CETP6的不完全弗氏佐剂的强化注射并且在第52周结束时杀死之外，如第一个实验中那样处理所述兔。在禁食过夜之后，如上所述使兔麻醉并且在灌注生理盐水之后移出其肝脏。然后获得三个右叶样品(每个约1cm³)，固定在4％多聚甲醛中，并且包埋在石蜡中。

有关研究动物的照护和使用的所有程序都是根据行政院卫生署的台湾食品和药物管理局动物中心(the animal center of the Taiwan Food and Drug Administration,Department of Health,Executive Yuan)的指南，并且得到所述动物中心的批准。

检测CETP活性

使用CETP活性分析试剂盒(生物视野(BioVision))，根据制造商的指南，测量血浆CETP活性。数据按占治疗前水平的百分比形式呈现。

分离脂蛋白部分并且测量胆固醇水平

用于分离脂蛋白部分的程序先前已有描述(常(Chang)等人2004,脂质研究杂志(J.Lipid Res.)45:2116-2122)。简单来说，通过在4℃下低速离心制备血浆，然后通过密度梯度超速离心法分离VLDL、LDL和HDL，并且根据制造商的指南，以酶促方式(朗道(Randox))测定血浆和脂蛋白部分中的胆固醇浓度。

主动脉中的动脉粥样硬化病变的定量

用冰冷的PBS灌注主动脉20分钟，并且然后用冷的甲醛-蔗糖溶液(10％中性福尔马林(formalin)、5％蔗糖、20mM丁基化羟基甲苯以及2mM EDTA，pH 7.4)加压固定。然后将整个主动脉切开并且纵向打开主动脉，在70％乙醇中简单地冲洗，并且用苏丹IV(0.5％苏丹IV于35％乙醇/50％丙酮中)染色，并且用80％乙醇脱色5分钟。然后将每个主动脉安装在平坦表面上并且使用数码相机获得其表面的图像。用苏丹IV染色的面积(脂质斑块)表示为占主动脉总表面积的百分比。

免疫组织化学分析

所用程序先前已有描述(蒋(Chiang)等人2012,疫苗30:7573-7581)。简单来说，通过免疫组织化学染色，使用小鼠抗NF-κB和抗RAM-11抗体(达科(Dako))测定NF-κB和RAM-11在主动脉和肝脏组织中的表达水平。从每只动物的截面和在显微镜(奥林巴斯(Olympus)，BX60)下拍摄的每个截面的十个随机视野(放大倍数，×200)分析主动脉。从每只动物的三个右叶组织切片和在显微镜(奥林巴斯，BX60)下拍摄的每个切片的十个随机视野(放大倍数，×200)分析肝脏组织。

肝脏组织学和肝脏中的脂肪变性和纤维化的定量

用苏木精和曙红(H&E)以及马森三色染色对肝脏切片(4μm)进行染色。病理学专家用非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的组织学评分系统评定组织学脂肪变性和纤维化阶段(克莱纳(Kleiner)等人2005,肝脏病学(Hepatology)41:1313-1321)。分析来自每只动物的三个组织切片和在显微镜(奥林巴斯，BX60)下拍摄的每个切片的十个随机视野(放大倍数，×200)。

测量血浆ApoA-I和氧化的LDL水平

根据制造商的指南，使用分别来自华美生物(CUSABIO)(CSB-E09804Rb)和麦可蒂亚(Mercodia)(10-1158-01)的夹心ELISA试剂盒，测量血浆ApoA-I和血浆ox-LDL。

统计分析

所有数据都以平均值±SEM形式呈现。通过柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)检查正态性，并且当数据呈正态分布时，用独立t检验和单向方差分析并且通过使用SPSS统计程序，版本17进行相关与回归分析来评定差异的统计显着性。当数据不呈正态分布时，应用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)。在所有分析中，认为P<0.05的值为统计显着的。

实例1产生Fc-CETP6疫苗

产生编码CETP表位的6个重复序列的DNA并且在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中诱导和表达融合蛋白，如图1中所示。通过在组氨酸(His)结合柱上的亲和色谱法纯化融合蛋白Fc-CETP6。通过考马斯蓝(Coomassie Blue)染色和蛋白质印迹法(Westernblotting)检查Fc-CETP6融合蛋白的纯度，所述纯度达到95％。所述经组氨酸结合纯化的Fc-CETP₆的纯度:道1至3分别显示考马斯蓝对于流经(flow-through)、清洗及洗出(elutes)划分的染色结果，而道4显示洗出液使用抗-兔IgG(Fc)的蛋白质印迹法分析(图1C)。

实例2.在喂以HFC饲料的兔中，Fc-CETP₆疫苗引发针对CETP的抗体并且降低CETP活性

为了证实产生了抗CETP抗体并且所述抗体与循环中的CETP反应，测量血浆抗CETP滴度和血浆CETP活性。图2A显示，在Fc-CETP₆组中从第12周开始检测到抗CETP抗体并且滴度一直增加直到在第24周研究结束为止。图2B显示，在两个喂以HFC饲料的组中，血浆CETP活性均以时间依赖性方式增加，但在Fc-CETP₆组中，血浆CETP活性明显更低。这些结果显示，注射Fc-CETP₆诱导产生针对CETP的抗体，所述抗体然后降低了CETP活性。

实例3.Fc-CETP₆疫苗对总胆固醇和HDL胆固醇的血浆水平的影响

用Fc-CETP₆进行疫苗接种对总C和HDL-C的水平以及体重的影响汇总在表2中。在体重方面，在对照组与Fc-CETP₆之间无显着差异。两个组中的总C和HDL-C的水平均以时间依赖性方式增加。在第12周和第24周，Fc-CETP₆组中的总C水平明显低于对照组，并且HDL-C水平明显高于对照组。另外，在第12周和第24周，Fc-CETP₆组中的非HDL-C/HDL-C比率低于对照组。这些结果显示，Fc-CETP₆免疫引起致动脉粥样硬化脂蛋白谱减少。

表2.在喂以HFC饲料的兔中，在存在或不存在疫苗接种的情况下，体重以及血浆总胆固醇和HDL-C的改变.

对照n＝7；Fc-CETP₆n＝8。¹值是平均值±SEM。^*同时相比于对照，p<0.05

实例4.Fc-CETP₆增加了ApoA-I水平并且降低了ox-LDL水平

ApoA-I是HDL中的主要蛋白质并且已知具有消炎作用(纳瓦布(Navab)等人2005,心血管医学趋势(Trends Cardiovasc.Med.)15:158-161)；已经显示，高水平的ApoA-I可减慢动脉粥样硬化的进展并且甚至诱导消退，指示ApoA-I可直接预防动脉粥样硬化(史密斯JD(Smith JD)2010,研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)11:989-996)。另外，ox-LDL在动脉中被巨噬细胞吸收并且将其转化成富含胆固醇的泡沫细胞，所述泡沫细胞已经显示为参与了NASH的发展(察拉沙尼(Chalasani)等人2004,美国胃肠病学杂志(Am.J.Gastroenterol.)99:1497-1502)。因此，我们测量了兔体内的ApoA-I和ox-LDL的血浆水平(表3)并且发现，Fc-CETP₆组中的ApoA-I水平明显高于对照组，并且ox-LDL水平明显低于对照组。另外，免疫荧光染色显示，Fc-CETP₆组中的肝脏静脉区域周围的ox-LDL的表达水平明显低于对照组(数据未示出)。这些结果可以帮助解释用Fc-CETP₆进行疫苗接种为何缓解了HFC饲料诱发的动脉粥样硬化和NASH的发展。

表3.ApoA-I和ox-LDL的血浆水平.

对照n＝7；Fc-CETP₆n＝8。¹值是平均值±SEM。*相比于对照，p<0.05。

实例5.Fc-CETP₆改善了主动脉中的HFC饲料诱发的动脉粥样硬化病变和炎症

为了检查用Fc-CETP₆进行疫苗接种是否可以改善动脉粥样硬化斑块的形成，从每只兔中分离出主动脉并且用苏丹IV染色。每个组的代表性苏丹IV染色的主动脉示出在图3A中，并且整个主动脉中的动脉粥样硬化的程度使用图像分析系统定量，示出在图3B中。在正常的兔中，仅约1％的主动脉表面积被苏丹IV染色。相比之下，维持HFC饲料持续24周的兔在对照组中发展出了覆盖62.9±4.3％的主动脉表面的动脉粥样硬化病变，但在Fc-CETP6组中仅28.5±6.2％(图3B)。因为动脉粥样化形成涉及长期炎症并且巨噬细胞被认为是主动脉局部炎症的关键介导者(莉比P(Libby P)2002,自然(Nature)420:868-874)，所以执行免疫组织化学分析来检测主动脉中炎症标志物NF-κB和巨噬细胞标志物RAM-11的存在情况。图3C显示，在正常兔的主动脉中未检测到NF-κB或RAM-11染色，然而在对照组中，HFC饲料引起了内膜中强烈的RAM-11和NF-κB染色。通过用Fc-CETP₆进行疫苗接种，两种影响均显着减小(图3D)(图3E)。总而言之，我们的结果显示，用Fc-CETP₆进行免疫降低了主动脉炎症和巨噬细胞浸润的程度，并且因此减小了对兔主动脉中动脉粥样硬化进展的易感性。

实例6.Fc-CETP₆缓解HFC饲料诱发的NASH和纤维化

NASH的特征在于肝脂质累积以及炎症，其可以最终进展成肝硬化。在被设计成用于检查所述疫苗是否能够缓解HFC饲料诱发的动脉粥样硬化的第一个实验中，我们观察到，对照组的肝脏的颜色是浅色，而正常组和Fc-CETP₆组的肝脏的颜色是红色，表明Fc-CETP₆注射缓解了HFC诱发的非酒精性脂肪性肝病。小川(Ogawa)等人发现，通过喂以补充有0.75％胆固醇和12％玉米油的饲料，在兔中诱发出了人类型NASH与晚期纤维化(小川等人2010,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)177:153-165)。在第二个实验中，为了测试Fc-CETP₆疫苗是否可以减小喂以HFC饲料的兔中的NASH和纤维化的易感性，我们通过用H&E和马森三色对肝脏切片进行染色，检查了在喂了12个月的HFC饲料之后的兔中Fc-CETP₆疫苗对肝脂质累积和NASH的影响。如图4B中所示，对照组的肝脏切片显示出了实质性脂质累积、伴随着静脉周围区域中的气球样变性的小泡型脂肪变性、炎症细胞浸润以及马洛氏小体(Mallory hyaline)的证据(图4B)，然而Fc-CETP₆组的肝脏切片显示仅具有轻度脂肪累积的肝细胞，并且正常组的肝脏切片未显示脂肪变性的证据。为了进一步评估Fc-CETP₆对肝脏炎症的影响，使用针对识别活化的库普弗细胞(kupffer cell)(巴桑(Buyssens)等人1996,肝脏病学(Hepatology)24:939-946)的RAM-11和炎症标志物NF-κB的抗体来执行免疫组织化学染色。相比于对照兔的肝脏，Fc-CETP₆的肝脏显示，在中央静脉区域周围在其中肝细胞的脂肪变性明显的位点处，RAM-11阳性细胞的数量减少。正常组显示为RAM-11阴性对照(图4C)。在更高的放大倍数下，大RAM-11阳性细胞含有液泡(脂滴)。此外，NF-κB给对照兔肝脏中的中央静脉区域周围的细胞进行染色，并且在Fc-CETP₆组中，NF-κB染色细胞明显减少。正常组显示为NF-κB阴性对照(图4D)。炎症和纤维化的改变通过检测促炎性细胞因子和与纤维化相关的基因的肝脏mRNA表达水平得到进一步证实。图4E显示，Fc-CETP₆组中的肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素-6(IL-6)的mRNA水平明显低于对照组；然而(白介素1β)IL-1β在两个组之间没有不同。这些结果支持Fc-CETP₆减少喂以HFC饲料的兔中的肝脏炎症。

对照组的肝脏切片显示阳性三色染色，显着的桥接纤维化，其中纤维带从静脉周围区域延伸到细胞周围区域，然而Fc-CETP₆组显示减少的或无桥接纤维化。纤维化间隔由α-SMA阳性细胞构成，α-SMA是活化星形细胞和肌成纤维细胞的标志物(图5A)；然而Fc-CETP₆组显示限于中央静脉区域中的减少的桥接纤维化。并且Fc-CETP₆兔肝脏中的纤维化相关基因转化生长因子β1(TGF-β1)、胶原蛋白1A1(Col1A1)、3A1(Col3A1)以及金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂的肝脏mRNA水平全都明显低于对照兔肝脏中(图5B)。这些结果支持Fc-CETP₆减少喂以HFC饲料的兔中的肝纤维化。

脂肪变性和纤维化的级别汇总在表3中。就脂肪变性来说，结果显示，对照组的肝脏样本中没有0级或1级，7％是2级并且93％是3级，然而Fc-CETP₆组的值中12％是0级，56％是1级，32％是2级，并且没有3级。就纤维化来说，在对照组中，没有0级或1级，同时25％是2级，62.5％是3级，并且12.5％是4级，然而在Fc-CETP₆组中，14％的肝脏样本未展现纤维化，同时29％是1a级，43％是1b级，14％是2级，并且没有3级或4级(参见表4)。

表4.在52周，Fc-CETP6疫苗对肝脏组织学的影响

*肝性脂肪变性的严重程度的等级划分如下：<5％(0)；5％-33％(1)；34％-66％(2)；并且>66％(3)。

肝纤维化的严重程度的等级划分如下：没有(0)；窦周(1a)；门静脉周(1b)；门静脉周和窦周(2)；桥接纤维化(3)；并且肝硬化(4)。

Claims

1.一种用于引发CETP抗体的经分离抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ IDNO:1)组成的氨基酸序列的至少一个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

2.根据权利要求1所述的经分离抗原肽，其包含所述氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少两个、三个、四个或五个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

3.根据权利要求1所述的经分离抗原肽，其包含2个到10个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

4.根据权利要求1所述的经分离抗原肽，其包含5个到7个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

5.根据权利要求1所述的经分离抗原肽，其包含6个重复序列或其用于引发CETP抗体的经修饰肽。

6.一种用于引发CETP抗体的抗原融合蛋白，其包含如下抗原融合蛋白，所述抗原融合蛋白包含融合到用于通过抗原递呈细胞APC增加吸收的结构域的根据权利要求1所述的抗原肽或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。

7.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述用于通过抗原递呈细胞APC增加吸收的结构域选自包括以下的群组：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段以及IgA的Fc片段。

8.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述结构域是IgG的Fc片段。

9.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述结构域是人类或兔IgG的Fc片段。

10.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含至少两个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。

11.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含2个到10个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。

12.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含5个到7个氨基酸序列SEQ ID NO:1的线性重复序列的Fc片段或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。

13.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含6个氨基酸序列SEQ IDNO:1的线性重复序列的Fc片段(Fc-CEPT₆)或其用于引发CETP抗体的经修饰蛋白质。

14.根据权利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7编码的序列。

15.一种抗体，其结合到根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的经分离融合蛋白。

16.根据权利要求15所述的抗体，其为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

17.一种药剂或组合物，其包含根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的抗原融合蛋白或根据权利要求15所述的抗体。

18.根据权利要求17所述的药剂或组合物，其为包含根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的抗原融合蛋白的疫苗组合物。

19.根据权利要求17所述的药剂或组合物，其进一步包含佐剂。

20.根据权利要求17所述的药剂或组合物，其进一步包含第二活性剂。

21.一种用于引发或活化个体中的CETP抗体的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的抗原融合蛋白。

22.一种用于降低个体中的LDL水平并且增加HDL水平的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的抗原融合蛋白或根据权利要求15所述的抗体。

23.一种用于治疗或预防oxLDL或LDL衍生物相关疾病的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据权利要求1所述的经分离抗原肽或根据权利要求6所述的抗原融合蛋白或根据权利要求15所述的抗体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述oxLDL或LDL衍生物相关疾病是神经变性病、心血管疾病、胆固醇代谢相关症状、炎症性疾病、肝病和肾病、哮喘、脊髓损伤以及创伤性脑损伤。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述代谢相关症状是高血压、脂肪肝或糖尿病；所述炎症性疾病是关节炎或非酒精性脂肪性肝炎NASH；并且所述心血管疾病是中风。