KR102481455B1 - 헬리코박터 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피험체 내에서 HtrA를 발현하는 박테리아에 의해 유발된 염증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 질병의 치료 또는 예방을 위한, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물뿐만 아니라, 치료적 및/또는 예방적 백신에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 치료제{HELICOBACTER THERAPEUTIC}

본 발명은 피험체 내 염증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물뿐만 아니라, 질병을 치료 또는 예방하기 위한 치료 백신 및/또는 예방 백신에 관한 것이다.

헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)는 인간 위의 주요 병원체인 그람 음성 박테리아이다. 감염은 통상 유년기에 발생하며, 대부분 아마도 구강-구강 경로를 통해 전염될 것이다. 일단 감염이 발생하여 확립되면, 실질적으로 모든 감염은 평생 겪게 되고, 세계 인구의 절반가량이 이러한 박테리아로 감염되는 것으로 추산된다.

에이치. 파일로리 감염은, 일부 개체들에서는 위궤양, 십이지장 궤양, 위 MALT 림프종 및 위 선암종을 포함하여 다양한 병상으로의 발달에 있어서 주요 병인론적 원인인 만성 위염을 유발한다. 위 선암종은 폐암 및 간암 다음으로 악성 종양으로 말미암은 전 세계 주요 사망 요인 제3 위를 차지하고 있다. 이러한 에이치. 파일로리 연관 질병의 발달은 만성 위염의 직접적인 결과이고, 염증이 더 심해질수록 이러한 병상이 발달할 가능성이 더 많아진다는 것이 전적으로 받아들여지고 있다.

에이치. 파일로리 감염은 현재 병용 항생제 치료법으로 치료된다. 그러나, 항생제 내성의 점진적인 발달은 심각한 문제가 되고 있다. 첫 번째 치료의 실패율이 20%이고, 두 번째 치료의 실패율이 25%이면, 2 회차 치료 이후의 전체 실패율은 5%가 된다. 내성률이 증가하는 것으로 보아, 이 내성률은 다가오는 해들에도 계속 증가할 것으로 예측된다.

에이치. 파일로리의 발견 이후로, 에이치. 파일로리 감염에 대한 방어를 목표로 하는 효과적인 백신을 개발하고자 많은 노력이 행하여져 오고 있다. 지금까지 이러한 노력은 완전히 성공적이지 못하였다. 효과적인 백신 개발에 있어서 걸림돌이 되는 주된 문제는, 멸균 면역성(sterilising immunity)이 신뢰할 수 있을 정도로 발생할 수 없음에 있다. 동물 모델 내에서 에이치. 파일로리 집락화(colonisation)를 감소시킬 백신 접근법 다수가 존재하지만, 에이치. 파일로리를 완전히 근절할 접근법은 존재하지 않는다. 마우스 백신화(예방적 백신화 또는 치료적 백신화 중 어느 하나)는 통상 박테리아 수에 있어서 1 내지 2 대수 감소를 초래하지만, 임상 실험들은 아직까지 어떠한 효능에 관한 증거도 나타내지 않았다.

더군다나, 마우스에 있어서 예방적 백신화에 의해 유도되는 방어적 면역성은 보통 위염(후 면역 위염(post-immunisation gastritis)이라 칭하여짐) 심각성의 증가와 연관되어 있으나, 이러한 심각성 증가는 치료적 백신화에 대하여는 보고된 바 없다.

따라서, 에이치. 파일로리에 의해 유발된 질병 및 염증의 효과적인 예방적 치료 및 치료적 치료에 대한 필요가 여전히 남아있다.

본 발명자들은, 피험체를 HtrA 폴리펩티드로 백신화시키는 것이, 백신화 이후에도 계속되는 박테리아 감염에도 불구하고, 박테리아 유발 염증 및 질병의 발달을 감소 또는 예방한다는 것을 발견하였다.

따라서 제1 양태는, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편, 및/또는 박테리아 HtrA와 결합하는 항체를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체 내에서 박테리아 유발 염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

제1 양태의 하나의 구현예에서, 본 방법은 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

제2 양태는, 피험체 내에서 박테리아 유발 염증을 치료 또는 예방함에 있어서, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편, 및/또는 이 박테리아 HtrA와 결합하는 항체의 용도를 제공한다.

제3 양태는, 피험체 내에서 박테리아 유발 염증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조함에 있어서, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편, 및/또는 박테리아 HtrA와 결합하는 항체의 용도를 제공한다.

제1 양태 내지 제3 양태의 하나의 구현예에서, 염증은 장 병원성 박테리아에 의해 유발되고, HtrA 폴리펩티드는 장 병원성 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편이다. 하나의 특정 구현예에서, 장 병원성 박테리아는 헬리코박터 파일로리, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 선택되고/선택되거나, 장 병원성 박테리아 HtrA는 헬리코박터 파일로리, 에스케리치아 콜라이, 쉬겔라 플렉스네리 및 캄필로박터 제주니 HtrA로부터 선택된다.

제1 양태 내지 제3 양태의 다른 구현예에서, 염증은 헬리코박터 파일로리에 의해 유발되고, HtrA 폴리펩티드는 헬리코박터 파일로리 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편이다.

제1 양태 내지 제4 양태의 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 서열 번호 1 내지 6 중 임의의 하나 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태 내지 제3 양태의 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 서열 번호 7 내지 36 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태 내지 제3 양태의 다른 구현예에서, 박테리아 유발 염증은 위염 및/또는 십이지장염이다.

제1 양태 내지 제3 양태의 또 다른 구현예에서, 염증은 위축성 위염이다.

제4 양태는, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편, 및/또는 박테리아 HtrA와 결합하는 항체를 포함하고, 피험체 내 박테리아 유발 염증의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.

제4 양태의 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함한다.

제4 양태의 다른 구현예에서, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 헬리코박터 파일로리 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편이다.

제4 양태의 다른 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 6 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함한다.

제4 양태의 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 서열 번호 7 내지 36 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제4 양태의 다른 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함한다.

제4 양태의 또 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신이다. 하나의 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 치료 백신이다.

제5 양태는 박테리아 HtrA 폴리펩티드와 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게 항체는 HtrA에 특이적으로 결합한다.

하나의 구현예에서, 항체는 헬리코박터 파일로리 HtrA 폴리펩티드와 결합한다.

제5 양태의 다른 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, Fab, F(ab')₂ 또는 scFv이다.

제6 양태는 박테리아 유발 염증의 치료 또는 예방을 위한 의약품의 제조에 있어서, 본원에 기술된 면역원성 조성물, 본원에 기술된 약학 조성물, 또는 박테리아 HtrA와 결합하는 항체의 용도를 제공한다.

제6 양태의 하나의 구현예에서, 박테리아 유발 염증은 헬리코박터 파일로리 유발 염증이다.

제6 양태의 다른 구현예에서, 박테리아 유발 염증은 위염 및/또는 십이지장염이다. 하나의 특정 구현예에서, 염증은 위축성 위염이다.

제7 양태는, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

제7 양태의 하나의 구현예에서, 방법은 HtrA 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, HtrA 폴리펩티드는 재조합 HtrA 폴리펩티드이다.

제7 양태의 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신이다.

제8 양태는, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체 내에서 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 유발된 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

제8 양태의 하나의 구현예에서, 방법은 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 약학 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.

제7 양태 또는 제8 양태의 하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 헬리코박터 파일로리 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편이다.

제7 양태 또는 제8 양태의 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 6 중 임의의 하나 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제7 양태 또는 제8 양태의 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편은 서열 번호 7 내지 36 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제8 양태의 하나의 구현예에서, 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함한다.

제8 양태의 다른 구현예에서, 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 유발되는 질병은 염증, 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 위암 및/또는 점막 연관 림프 조직(MALT) 림프종이다.

제1 양태 및 제8 양태의 하나의 구현예에서, 방법은 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함하는 약독화된 박테리아 또는 바이러스를 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.

제3 양태 내지 제7 양태의 하나의 구현예에서, 조성물 또는 의약품은 피험체에 대한 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함하는 약독화된 박테리아 또는 바이러스를 포함한다.

제9 양태는 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 포함하는 약독화된 박테리아 또는 바이러스를 제공한다.

하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 헬리코박터 파일로리 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편이다.

다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 6 중 임의의 하나 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구현예에서, HtrA 폴리펩티드의 단편은 서열 번호 7 내지 36 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

제10 양태는, 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 백신을 제공한다.

하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 내지 36 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 암호화한다.

다른 구현예에서, DNA 백신이 피험체에 투여될 때 폴리펩티드는 발현되고, 이 폴리펩티드에 대한 면역 반응이 발생한다.

명백해질 바와 같이, 본 발명의 하나의 양태의 바람직한 특색들과 특징들은 본 발명의 다수의 기타 다른 양태들에도 적용될 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 용어 "포함하다" 또는 이의 변형어, 예를 들어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 진술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 함축하되, 기타 다른 임의의 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군은 배제되지 않는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명은 첨부된 도면들을 참고로 하여 하기 비제한적 실시예들에 의해 기술된다.

도 1. 재조합체 HtrA가 사용되는 예방적 백신화는 에이치. 파일로리 면역공격에 대해 약간의 방어를 유도한다. 마우스 군(n = 6)들은 사멸된 에이치. 파일로리 + 콜레라 독소(CT) 보조제(양성 대조군) 또는 HtrA + CT로 비 내 경로를 통해 2 회 백신화되었다. 음성 대조군은 PBS로 가 투여되었다(n = 5). 제2 회차 투여후 4 주 경과시 모든 마우스는 생 에이치. 파일로리 균주 SS1으로 면역공격되었다. 마우스 위 내 박테리아 양은 집락 형성 검정법에 의해 4 주 경과시에 평가되었다. 백신화는 음성 대조군과 비교하였을 때 박테리아 집락화를 감소시켰다(**p<0.01, ***p<0.001; ANOVA).
도 2. 재조합체 HtrA가 사용되는 예방적 백신화는 후 면역 위염을 유발하지 않는다. 마우스 유래 위는 위염에 대해 조직학적으로 평가되었다. 예상된 바와 같이, 면역공격받기 전에, 사멸된 에이치. 파일로리 + CT로 백신화된 마우스에 있어서 위염의 심각성은 음성 대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하였다(*Mann-Whitney). 그러나, HtrA + CT로 백신화된 마우스에 있어서의 위염은 음성 대조군에 있어서의 위염과 분별이 되지 않았다. 다시 말하면, 도 1에 나타낸 방어적 면역성에도 불구하고, 이 마우스에서는 후 면역 위염의 발달이 방지되었다.
도 3. 재조합체 HtrA(rHtrA)가 사용되는 예방적 백신화는 에이치. 파일로리 감염에 대응하여 위내 시토카인 수준을 억제한다. 도 1에 도시된 마우스의 위 조직 내 시토카인 수준은 ELISA에 의해 정량되었다. 예상된 바와 같이, 감염 대조군 마우스(PBS)와, 양성 대조군 백신(에이치. 파일로리 + CT)이 투여된 마우스로부터 유래하는 위 조직은, 전염증성이 큰 것으로 공지된 시토카인(IFNγ 및 IL-17A) 수준을 포함하여 높은 시토카인 수준을 제시하였다. 예상 외로 HtrA + CT에 의한 백신화는 감염된 마우스 내에서 이러한 시토카인의 수준을 매우 낮은 수준 또는 검출되지 않을 정도의 수준까지 유의적으로 억제하였다(**p<0.01, ***p<0.001; ANOVA).
도 4. 재조합체 HtrA가 사용되는 예방적 백신화는 효소 중화 항체 응답을 유도한다. 실험의 종료시(에이치. 파일로리 면역공격 후 4 주 경과시) 백신화된 마우스/면역공격된 마우스(도 1에 나타냄)로부터 혈청이 수집되었다. 이러한 혈청은 HtrA와 혼합된 다음, HtrA의 카세인 단백 분해 절단이 측정되었다. HtrA로 백신화된 이후 에이치. 파일로리로 면역공격된 마우스로부터 유래하는 혈청은, 기타 다른 군으로부터 유래하는 혈청과 대조적으로, HtrA 프로테아제가 이 단백질 기질을 절단하는 능력을 억제하였다(***ANOVA).
도 5. HtrA가 사용되는 백신화는 HtrA에 대한 혈청 항체를 유도한다. C57BL/6 마우스 군(n = 8)은 rHtrA + CT로 비 내 백신화되었다. 3 주 간격으로 백신화가 3 회 이루어졌다. 대조군은 PBS로 가 처리되었다. 마지막 백신화 이후 1 주일 경과시 마우스는 사멸되었고, 혈청이 수집되었다. rHtrA에 대한 항체는 ELISA에 의해 측정되었다.
도 6. HtrA + 백반이 주사되어 이루어진 치료적 백신화는 에이치. 파일로리에 의한 집락화를 감소시키지 않는다. C57BL/6 마우스 군(n = 7/8)은, 백반 보조제 단독(음성 대조군), rHtrA 및 백반, 또는 rHtrA^sa 및 백반 중 어느 하나가 4 회의 주 1 회 용량으로 피하 주사되기 전 4 주 동안 에이치. 파일로리로 감염되었다. 마지막 백신화 후 4 주 경과시 위는 제거되었으며, 박테리아 집락화는 집락 형성 검정법에 의해 정량되었다.
도 7a 및 7b. HtrA + 백반이 주사되어 이루어진 치료적 백신화는 에이치. 파일로리 유발 위염에 대해 방어한다. (도 6에 도시된 바와 같이) 치료적으로 백신화된 마우스의 위 내 위염의 심각성은 조직학적으로 정량되었다. 도 7a) 별개로 나타낸 rHtrA 군 및 rHtrA^sa 군. 도 7b) 합하여 나타낸 2 개의 rHtrA 군들. 백분율은 가시적 세포 침윤, 화생 또는 위축이 없었던 마우스의 비율을 나타낸다. 집락화에 어떠한 영향도 없었음에도 불구하고(도 6), 활성 rHtrA 또는 비활성 rHtrA^sa 중 어느 하나에 의한 백신화는, 에이치. 파일로리 유발 위축성 위염의 발달에 대해 방어 효능을 초래하였다.
도 8. HtrA + 백반이 주사되어 이루어진 치료적 백신화는 위 내 시토카인의 유의적 증가를 초래하지 않고 에이치. 파일로리 유발 위염에 대해 방어한다. (도 6에 도시된 바와 같이) HtrA로 치료적으로 백신화된 마우스 유래 위 균질화물 중 시토카인 수준은 ELISA에 의해 정량되었다. rHtrA 군들 중 어느 하나에 의한 백신화는, 특히 백반 단독으로 백신화된 주요 음성 대조군의 경우와 비교하였을 때, 위내 핵심 시토카인의 유의적 증가를 초래하지 않았다.
도 9. HtrA + 백반이 주사되어 이루어진 치료적 백신화는 원산 HtrA에 대한 장내 항체 생성을 유도한다. 도 6에 도시된 바와 같은 마우스로부터 장을 긁어낸 시료들이 수집되었다. 에이치. 파일로리 HtrA와 결합하는 항체는 웨스턴 블럿으로 검출되었다. 블럿은, 음성 대조군 마우스(감염되지 않았거나 백신화되지 않은 상태로 남아 있는 마우스, 또는 감염된 후 백반만이 단독 주사된 마우스) 또는 rHtrA 및 백반 또는 rHtrA^sa 및 백반으로 백신화된 에이치. 파일로리 감염 마우스로부터 나타내어진다. 래인들은 개별 마우스로부터 유래하는 혈청으로 프로빙된 블럿들을 나타낸다.
[발명을 실시하기 위한 구체적 내용]
서열 목록에 대한 핵심
서열 번호 1 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: DAA34967).
서열 번호 2 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: EJC53274).
서열 번호 3 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: EJC13564).
서열 번호 4 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: EJC10337).
서열 번호 5 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: EJC09766).
서열 번호 6 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열(유전자 은행 등록번호: EJC07480).
서열 번호 7 내지 30 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열.
서열 번호 31 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드 트립신 도메인의 아미노산 서열.
서열 번호 32 내지 35 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드 PDZ1 도메인의 아미노산 서열.
서열 번호 36 - 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드 PDZ2 도메인의 아미노산 서열.
서열 번호 37 내지 40 - 올리고뉴클레오티드 프라이머들.
상세한 설명
일반적 기법 및 정의
특별히 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 업계(예를 들어, 면역학, 미생물학 및 생화학 업계)에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가지는 것으로 간주되어야 한다.
달리 지정되지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 유전학적 기법, 생화학적 기법 및 면역학적 기법은, 당업자들에게 널리 공지된 표준적인 방법들이다. 이와 같은 기법들은 문헌[J, Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook and Russell., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)], [R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3^rd edn, Springer (1994)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996)], [F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 업데이트된 모든 내용을 포함함)], [Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지 업데이트된 모든 내용을 포함함)과 같은 출처의 문헌 전반에 걸쳐 기술 및 설명되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는 것", "치료하다" 또는 "치료"는, 피험체에서 HtrA를 발현하는 박테리아에 의해 유발된 염증의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 없애기 위하여, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편, HtrA 폴리펩티드와 결합하는 항체, 또는 본원에 기술된 바와 같은 조성물이나 백신을 투여하는 것에 대한 언급을 포함한다.
용어 "예방하는 것"은, HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아에 노출될 수 있거나 이에 감염될 수 있는 피험체 내에서 박테리아 유발 염증의 적어도 하나의 증상이 발달하는 것을 방지하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "투여하는 것"은, 넓게 해석되며, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 치료제를 피험체 또는 환자에 투여하는 것뿐만 아니라, 예를 들어 환자에게 전구 약물을 제공함으로써 조성물 또는 치료제를 세포에 제공하는 것을 포함한다.
용어 "특이적으로 ~와 결합하다", "~에 특이적으로 결합하다", "특이적 결합"은, 항체가 표적 분자 종과 결합하는 능력, 바람직하게는 항체가 특이적 결합 제제 및 표적 분자 종과 혼합되는 기타 다른 분자 종과 결합하는 능력을 지칭한다.
HtrA 세린 프로테아제
HtrA는, 헬리코박터 파일로리, 에스케리치아 콜라이, 쉬겔라 플렉스네리 및 캄필로박터 제주니를 포함하여 다수의 장 병원성 박테리아 종에 있어서의 세린 프로테아제 및 원형질 막 주위 샤프론이다. 그러므로 용어 "HtrA 폴리펩티드" 또는 "HtrA 폴리뉴클레오티드"는, 유전자 또는 단백질 서열 데이터베이스, 예를 들어 유전자 은행(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 또는 EMBL(http://www.ebi.ac.uk/)을 기반으로 HtrA로 분류되었거나, HtrA로서 동정되었거나 또는 HtrA로 예측되는 박테리아 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 서열 데이터베이스를 기반으로 하였을 때 헬리코박터 파일로리, 에스케리치아 콜라이, 쉬겔라 플렉스네리 및 캄필로박터 제주니 중 임의의 하나의 게놈에 속하는 서열이다. 바람직한 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 에이치. 파일로리 HtrA 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(즉, 에이치. 파일로리의 게놈 중 HtrA 서열인 것으로서 서열 데이터베이스를 기반으로 동정된 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편)이다.
HtrA는 에이치. 파일로리에 의해 생성되는 것으로서, 지금까지 유일하게 동정된 세린 프로테아제이다. 이는 약 55 kDa의 단백질로서, 박테리아 표면 상에 발현될 뿐만 아니라, 분비도 된다. 이는 시험관 내 성장을 위해서조차도 박테리아 생존에 필수적이다. HtrA 폴리펩티드의 아미노산 서열의 비제한적 예들은 유전자 은행 등록 번호 DAA34967(서열 번호 1), EJC53274(서열 번호 2), EJC13564(서열 번호 3), EJC10337(서열 번호 4), EJC09766(서열 번호 5) 및 EJC07480(서열 번호 6)을 포함한다.
본 발명의 방법과 조성물에 사용된 HtrA 폴리펩티드는 당업계의 표준적 기법들을 사용하여 상기 HtrA 폴리펩티드의 기원이 되는 박테리아로부터 직접 정제되어 분리된 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 폴리펩티드는 재조합체 폴리펩티드이다. 폴리펩티드에 관한 맥락에 있어서 용어 "재조합체"는, 자체의 원산 상태와 비교하였을 때 변경된 양 또는 변경된 속도로 세포에 의해 생성될 때의 폴리펩티드뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드를 자연 생성하지 않는 세포 내에서 생성되는 폴리펩티드에 대한 언급을 포함한다. 용어 "재조합체"는 또한 무 세포 발현 계 내에서 생성되는 폴리펩티드를 지칭한다.
폴리펩티드의 동일성 %는 갭 형성 페널티가 5이고, 갭 연장 페널티가 0.3인 GAP(Needleman and Wunsch(1970)) 분석(GCG 프로그램)에 의해 측정된다. 질의 서열(query sequence)은 길이가 적어도 100 개 아미노산이고, GAP 분석은 적어도 100 개의 아미노산으로 이루어진 영역에 대해 2 개의 서열을 할당한다. 하나의 예에서, 질의 서열은 길이가 적어도 200 개 아미노산이고, GAP 분석은 적어도 200 개의 아미노산으로 이루어진 영역에 대해 2 개의 서열을 할당한다. 하나의 예에서, GAP 분석은 서열들 자체들의 전체 길이에 대해 2 개의 서열을 할당한다.
한정된 폴리펩티드와 관련하여, 상기 제공된 수치보다 큰 동일성 % 수치는 바람직한 구현예들을 포함할 것임이 이해될 것이다. 따라서 최소 동일성 % 수치에 비추어 보았을 때 적용 가능한 경우, 폴리펩티드는 지명된 관련 서열 번호의 서열과 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 91%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 93%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 95%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 97%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 더 바람직하게 적어도 99.1%, 더 바람직하게 적어도 99.2%, 더 바람직하게 적어도 99.3%, 더 바람직하게 적어도 99.4%, 더 바람직하게 적어도 99.5%, 더 바람직하게 적어도 99.6%, 더 바람직하게 적어도 99.7%, 더 바람직하게 적어도 99.8%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, HtrA 폴리펩티드의 단편을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신도 본 발명의 범주에 포함된다. 하나의 구현예에서, 단편은 HtrA 폴리펩티드의 "면역원성 단편"이다.
하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드의 단편은 길이가 적어도 8 개 아미노산이고, 더 바람직하게 길이가 9 개 아미노산이며, 또는 더 바람직하게 길이가 적어도 10 개 아미노산이다. 대안적으로 단편은 길이가 적어도 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개 또는 100 개, 또는 그 이상의 아미노산이다. HtrA 폴리펩티드의 단편들의 비제한적 예들은 서열 번호 7 내지 36으로서 제공된다. 따라서 하나의 구현예에서, 피험체에 투여된 HtrA 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 36의 서열들 중 임의의 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대한 면역 응답을 유도할 수 있다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 면역원성 조성물, 약학 조성물 및/또는 백신은 HtrA 폴리펩티드의 도메인, 예를 들어 트립신 도메인, PDZ1 도메인 또는 PDZ2 도메인을 포함할 수 있다. HtrA 폴리펩티드 도메인의 예시적 아미노산 서열들은 서열 번호 31(트립신 2 도메인), 서열 번호 32 내지 35(PDZ1 도메인) 및 서열 번호 36(PDZ2 도메인)으로서 제공된다.
면역원성 조성물 및 백신
헬리코박터 파일로리는 염증과, 위 궤양 및 십이지장 궤양의 발달과 강력하게 연계되어 있으며, 에이치. 파일로리의 근절은 궤양 형성을 예방할 수 있는 것으로 나타났다. 이미 궤양이 발생한 환자들에서 에이치. 파일로리를 근절하는 것은 궤양성 질병을 치유하고, 이 질병의 재발을 거의 완전히 예방할 수 있으므로, 실제로 궤양이 발생한 환자들은 에이치. 파일로리에 대해 시험이 실시된 후 치료되어야 한다. 위 선암종은 전 세계 주요 암 사망 요인 제3 위를 차지하고, 에이치. 파일로리가 위암 발달에 기여한다는 강력한 증거가 존재한다. 기타 다른 요인들, 예를 들어 과일/채소 섭취가 적은 것과 같은 식습관, 흡연, 연령 및 고 염분 섭취량도 또한 위암 발생 위험을 증가시키지만, 에이치. 파일로리 감염이 위암과 가장 밀접하게 연관되어 있다. 에이치. 파일로리 감염은 또한 위암의 한 종류인 MALT 림프종으로 공지된 병태의 발달을 초래할 수도 있다. 에이치. 파일로리 감염의 치료 및 근절은 상기 MALT 림프종의 퇴행을 사례의 75% 이하로 초래할 수 있다.
에이치. 파일로리 감염에 대한 종래의 치료법은, 항생제 활성을 증강시키기 위한 산 억제제와 함께, 박테리아를 사멸하기 위한 항생제 2 가지, 즉 아목시실린 및 클라리트로마이신을 포함하는 삼제 치료법이라고 칭하여지는, 의약품 7 일 투여 과정이다. 다양한 병태가 발병한 매우 많은 환자들을 치료하기 위한 항생제가 사용될 때, 항생제 내성 균주의 발생률이 증가함으로 말미암아 에이치. 파일로리를 치료하기 더 어려워진다. 결과적으로 환자들의 25% 이하는 제1선 치료법에서 실패를 거두게 된다.
에이치. 파일로리 감염에 대한 종래의 치료법의 실패를 고려하여, 본 발명자들은, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편이 사용되는 피험체의 백신화가 박테리아에 의해 유발되는 감염 및/또는 질병의 발달을 감소 또는 예방한다는 것을 발견하였다. 임의의 특정 이론에 의해 국한되기 바라지는 않지만, HtrA에 대한 백신화는 감염 동안 HtrA 활성을 차단하는 중화 항체를 유도한다는 가설이 세워진다. HtrA 활성의 상실은 세포 접합부의 개방 및 상피 장벽의 파열을 예방하므로, 박테리아 성분이 위 조직 내로 이동하는 것이 예방되며, 이로써 염증이 유발되는 것이 억제된다.
따라서 본 발명은 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아로 피험체가 감염됨으로써 유발되는 염증 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물과 백신을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 조성물"은 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 면역 응답을 유도하는 조성물을 지칭한다. 용어 "면역원성 조성물"은 또한 "백신"에 대한 언급을 포함한다. 용어 "백신"은 표적화된 병원체에 의해 유발되는 염증 및/또는 질병에 대해 적어도 부분적으로 방어적이거나, 또는 병원체를 효과적으로 억제하고/억제하거나 병원체에 의한 집락화 또는 감염을 감소시키는 면역 응답을 유도하는 임의의 조성물을 포함한다. "적어도 부분적으로 방어적인" 면역 응답을 유도한다고 하는 것은, 백신이 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아에 의한 박테리아 유발성 염증, 감염 및/또는 집락화를 감소 또는 예방하는 것, 또는 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아에 의한 감염에 의해 유발되는 증상 적어도 하나를 감소시키는 것을 의미한다. 면역원성 조성물은 기억 B 세포 및 T 세포를 포함하는 면역계의 세포들을 선택, 활성화 또는 증식시켜, 예를 들어 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 기타 다른 면역 조정 인자의 생성을 가능하게 만들 수 있다.
당업계에서 이해되는 바와 같이, 용어 "백신화"는 백신을 사람에게 투여하는 과정을 지칭하는 한편, 용어 "면역화"는 백신화 이후 면역계를 자극하여 적어도 부분적으로 방어적인 면역 응답을 일으키는 것을 지칭한다.
용어 "항원" 및 "항원성"은 당업계에 널리 이해되고 있으며, 면역계의 구성 성분, 예를 들어 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 거대 분자의 일부를 지칭한다. 용어 "항원"은, 숙주 내에서 면역 응답을 유도할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 기타 다른 거대 분자를 지칭한다. 따라서 본 발명의 방법은 HtrA 폴리펩티드의 항원성 단편을 이용할 수 있다. 바람직하게 항원성 단편은 박테리아 병원체, 예를 들어 헬리코박터 속 박테리아(헬리코박터 파일로리를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아님)에 대하여 면역 응답을 유발할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항원은 HtrA 폴리펩티드의 에피토프이다. 하나의 구현예에서, 항원성 단편은 길이가 6 개 아미노산이고, 더 바람직하게는 길이가 7 개 아미노산이며, 더 바람직하게는 길이가 8 개 아미노산이고, 더 바람직하게 길이가 9 개 아미노산이며, 더 바람직하게 길이가 적어도 10 개 아미노산이다. 대안적으로, 항원성 단편은 길이가 적어도 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개 또는 이 이상의 아미노산이다. 하나의 구현예에서, 항원이 피험체에 투여될 때, 이 항원은 HtrA 폴리펩티드에 대한 면역 응답을 유도할 수 있다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 임의의 적합한 전달 경로, 예를 들어 진피내, 점막, 예를 들어 비 내, 경구, 근육 내 또는 피하 전달 경로에 의해 투여될 수 있다. 기타 다른 전달 경로는 당업계에 널리 공지되어 있다. 백신 제조는 일반적으로 문헌[Vaccine Design, "The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.)(1995) Plenum Press, New York]에 기술되어 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 근육 내 전달 경로에 의해 투여된다. 근육 내 투여는 넓적다리 또는 상박에 대해 이루어질 수 있다. 주사는 통상 바늘(예를 들어, 피하 주사기 바늘)을 통하여 이루어지지만, 무 바늘 주사가 대안적으로 사용될 수 있다. 통상의 근육 내 용량은 0.5 ㎖이다.
보다 최근에는 피부 안으로 또는 피부를 통과하여 액체 제제가 투여되도록 특별히 디자인된 디바이스, 예를 들어 WO 99/34850 및 EP 1092444에 기술된 디바이스뿐만 아니라, 예를 들어 WO 01/13977에 기술된 제트 주사 디바이스가 기술되어 있다. 백신 제조물의 진피 내 투여에 관한 대안적 방법은, 종래의 시린지 및 바늘이 사용되는 방법, 또는 고체 백신이 탄도 전달(ballistic delivery)되도록 디자인된 디바이스, 또는 경피 패치, 또는 피부의 표면에의 적용(경진피 또는 경피 전달 방법)을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물이 피부, 더 구체적으로는 진피에 투여될 때, 백신은 작은 액체 용적, 특히 약 0.05 ㎖ 내지 0.2 ㎖의 용적으로 투여된다. 또 다른 적합한 투여 경로는 피하 경로이다. 임의의 적합한 디바이스, 예를 들어 고전적인 바늘은 피하 전달에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 무 바늘 제트 주사기 서비스, 예를 들어 WO 02/34317에 공개된 것이 사용된다. 본 발명의 다른 양태에서, 디바이스는 액체 백신 제형으로 예비 충전된다.
하나의 구현예에서, 백신은 비 내 투여된다. 통상적으로 백신은 비인두 영역에 국부 투여된다. 본 발명에 따른 백신의 비 내 투여용으로 바람직한 다비아스는 분사 디바이스이다. 적합한 시판 비 내 분사 디바이스는 Accuspray™(Becton Dickinson)를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물 및/또는 백신은 치료적 또는 예방적 조성물 또는 백신의 형태를 가질 수 있다. 면역원성 조성물 또는 백신의 예방적 투여는 바람직하게 HtrA 폴리펩티드를 포함하는 박테리아로 감염되었을 때 유발될 염증 및/또는 질병의 발달로부터 수용자를 보호하거나, 또는 이와 같은 염증 및/또는 질병의 발달을 지연시킨다. 예방적 조성물 또는 백신은 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아, 예를 들어 에이치. 파일로리로 감염되었음이 공지되지 않은 환자 또는 이와 같은 박테리아로 인한 감염이 발생하지 않은 것으로 공지된 환자, 또는 상기 박테리아에 아직 노출되지 않은 환자에게 투여된다. 대안적으로 치료적 면역원성 조성물 및/또는 백신은 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아에 감염된 것으로 공지되었거나 이미 감염되었을 것으로 예상되는 피험체, 그리고 이 박테리아 감염에 의하여 유발된 염증 및/또는 질병의 징후 또는 증상을 이미 보일 수 있는 피험체에 투여된다. 치료적 조성물 및/또는 백신은 박테리아 감염에 의해 유발되는 염증 및/또는 질병의 진행을 억제하거나, 지연시키거나, 아니면 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아 감염에 의해 유발되는 염증 및/또는 질병의 징후 또는 증상을 감소시킨다.
보조제는 면역 응답을 개선하고/개선하거나 백신 제조물의 안정성을 증가시키는 데에 유용하다. 보조제는 통상 면역계의 비 특이적 자극 인자로서 기술되지만, 또한 면역계의 특정 암(arm)들을 표적화하는 데에도 유용할 수 있다. 이러한 활성을 가지는 화합물 하나 이상은 백신에 첨가될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 특정 백신들은 보조제를 추가로 포함한다. 적합한 백신 보조제는 알루미늄 염(알루미늄 인산염 또는 알루미늄 수산화물), 모노포스포릴 지질 A(예를 들어, 3D-MPL), 사포닌(예를 들어, QS21), 수중 오일 에멀젼, 그람 음성 박테리아 균주(예를 들어, WO 02/09746에 교시된 바와 같은 균주)로부터 유래하는 물집 또는 외막 소포 제조물, 지질 A 또는 이의 유도체, 알킬 글루코사미드 인산염, 또는 이러한 보조제들 중 2 개 이상의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구현예에서, 보조제는 알루미늄 인산염이다. 추가의 구현예에서, 보조제는 인간 용량당 알루미늄 인산염으로서 100 ㎍ 내지 750 ㎍, 150 ㎍ 내지 600 ㎍, 200 ㎍ 내지 500 ㎍, 250 ㎍ 내지 450 ㎍, 300 ㎍ 내지 400 ㎍ 또는 약 350 ㎍의 알루미늄을 포함한다. 추가의 구현예에서, 보조제는 알루미늄 수산화물이다.
"ISCOM 유사 보조제"는, 자체의 기능에 기여하는 독특한 구형의 케이지 유사 구조를 가지는, 특징적인 케이지 유사 입자를 함께 형성하는 사포닌, 콜레스테롤 및 인지질로 구성된 면역 자극 복합체(immune stimulating complex; ISCOM)를 포함하는 보조제이다. 이 용어는 하나의 항원으로 생성된 ISCOM 보조제 둘 다를 포함하고, ISCOM 입자 및 ISCOM 매트릭스 보조제, 즉 속이 빈 ISCOM형 보조제로서 항원 없이 생성된 것 내에 항원을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물 및/또는 백신은 ISCOM 매트릭스 입자 보조제, 예를 들어 항원 없이 제조된 ISCOMATRIX™(ISCOM™ 및 ISCOMATRIX™는 CSL Limited(Parkville, Austrailia)의 등록된 상표명임)를 포함한다.
특정 구현예들에서, 보조제는 시토카인이다. 본 발명의 특정 조성물은 하나 이상의 시토카인, 케모카인, 또는 시토카인 및 케모카인의 생성을 유도하는 화합물, 또는 하나 이상의 시토카인, 케모카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 시토카인 및 케모카인의 생성을 유도하는 화합물을 포함한다. 시토카인의 예들은 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 7(IL-7), 인터루킨 8(IL-8), 인터루킨 9(IL-9), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 11(IL-11), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 13(IL-13), 인터루킨 14(IL-14), 인터루킨 15(IL-15), 인터루킨 16(IL-16), 인터루킨 17(IL-17), 인터루킨 18(IL-18), 인터페론 알파(IFNα), 인터페론 베타(IFNβ), 인터페론 감마(IFNγ), 인터페론 오메가(IFNω), 인터페론 토우(IFNτ), 인터페론 감마 유도 인자 I(IGIF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), RANTES(활성화에 따라서 조절되고, 정상적인 T 세포 발현되며, 아마도 분비되는 케모카인), 대식세포 염증 단백질(예를 들어, MIP-1 알파 및 MIP-1 베타), 리슈마니아 연장 개시 인자(LEIF) 및 Flt-3 리간드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 박테리아 톡소이드, 예를 들어 디프테리아, 파상풍, 이.콜라이(예를 들어, 열 불안정 독소), 콜레라, 에이치. 파일로리 또는 기타 다른 병원체로부터 유래하는 톡소이드에 접합될 수 있다. 더욱이 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 박테리아 다당체, 예를 들어 네이세리아(Neisseria) 종, 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 또는 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) b형 박테리아로부터 유래하는 협막 다당체에 접합될 수 있다.
부형제는 유효한 활성 성분들을 함유하는 제형을 증량(bulking-up)시키기 위해 의약품의 활성 성분과 함께 제형화되는 비활성 물질("API")이다(따라서 이는 종종 "증량제", "충전제" 또는 "희석제"라고도 칭하여짐). 증량은 투여형이 생성될 때 약물 물질의 편리하고도 정확한 분배를 가능하게 한다. 부형제는 또한 다양한 치료 향상 목적, 예를 들어 약물의 흡수 또는 용해를 용이하게 하거나, 또는 기타 다른 약력학적 고려사항으로 사용될 수 있다. 부형제는 또한 제조 공정에서 시험관 내 안정성을 돕는 것, 예를 들어 기대 유통 기간 동안에 변성되는 것을 예방하는 것 이외에도, 예를 들어 분말의 유동성 또는 비 고착 특성을 용이하게 함으로써, 관련된 활성 물질의 취급을 돕는 데에 유용할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 적절한 부형제의 선택은 또한 투여 경로와 투여형뿐만 아니라, 활성 성분 및 기타 다른 요인들에 따라서 다르다.
종종 면역 자극제라고도 지칭되어 온 기타 다른 적합한 보조제는 시토카인, 성장 인자, 케모카인, 림프구의 세포 배양액으로부터 유래하는 상청액, 단핵구, 림프양 기관으로부터 유래하는 세포, 식물, 박테리아 또는 기생체(스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 리포다당체 제조물)로부터 유래하는 세포 제조물 및/또는 추출물, 또는 미토겐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 추가의 양태는, HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편과, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 보조제를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법이다.
HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 또한 폴리펩티드를 특정 조직, 예를 들어 림프 조직으로 표적화하거나, 또는 감염된 세포로 선택적으로 표적화하고, 또한 폴리펩티드 조성물의 반감기를 증가시키는데 사용되는 리포좀 운반체를 통하여 투여될 수 있다. 리포좀은 에멀젼, 소포, 미셀, 불용성 단일층, 액정, 인지질 분산액, 층판상 층들 등을 포함한다. 이러한 제조물에 있어서, 전달될 폴리펩티드는 리포좀의 일부로서 단독으로 혼입되거나, 또는 리포좀의 일부로서 림프양 세포들 가운데 널리 산재되어 있는 수용체와 결합하는 분자(예를 들어, CD45 항원 또는 기타 다른 상호 자극 인자와 결합하는 모노클로날 항체)와 함께, 또는 기타 다른 치료적 조성물 또는 면역원성 조성물과 함께 혼입된다. 따라서 원하는 폴리펩티드로 충전되거나 장식된 리포좀은 림프양 세포 위치로 인도될 수 있으며, 이후 리포좀은 여기에 폴리펩티드 조성물을 전달한다. 본 발명에 따라서 사용될 리포좀은, 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질과 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들어 리포좀 크기, 리포좀의 혈류 중 산 불안정성 및 안정성이 고려되어 이루어진다. 리포좀을 제조하기 위해 다양한 방법들이 당업계에서 이용 가능하다. HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 함유하는 리포좀 현탁액은 무엇보다도 투여 방식, 전달되는 폴리펩티드, 그리고 치료되는 질병의 병기에 따라서 달라지는 용량으로 정맥 내, 국부, 국소 등으로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물 및/또는 백신은 박테리아 감염의 치료를 위한 종래의 치료법에 덧붙여, 또는 이와 같은 종래의 치료법과 함께, 또는 이와 같은 종래의 치료법과 병행되어 투여된다. 예를 들어, 종래의 치료법은 유기체 특이적 항생제가 사용되는 방법일 수 있다. 에이치. 파일로리 감염의 경우, 종래의 치료법은 항생제와 산 억제제 및/또는 위 보호제의 병용법일 수 있다. 에이치. 파일로리 감염을 치료하기 위해 사용되어 온 약물은 아목시실린, 클라리트로마이신, 리파부틴, 비스무트 서브살리실산염 푸라졸리돈, 락토페린, 니타족사나이드 및 레보플록사신을 포함한다. 에이치. 파일로리 감염을 치료하기 위해 사용되어 온 병용 약물은 오메프라졸(200 ㎎ bd), 아목시실린(1000 ㎎ bd) 및 클라리트로마이신(500 ㎎ bd)을 포함한다.
약독화된 박테리아
하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편은 약독화된 박테리아(예를 들어, 살모넬라 종(Salmonella sp.)) 또는 바이러스 백신 운반체(예를 들어, MVA)에 의해 발현된다. 박테리아 병원체의 병독성을 약독화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로 유전자를 결실 또는 비활성화하는 돌연변이가 박테리아 게놈에 도입되면 독소 또는 기타 다른 병독성 유전자의 발현이 예방 또는 감소된다. 몇몇 경우들에서, 유전자의 기능은 완전히 녹아웃(knocked-out)된다. 이는, 유전자로부터 임의의 폴리펩티드의 합성을 완전히 무력화하거나, 또는 비 기능성 폴리펩티드의 합성을 초래하는 돌연변이를 일으킴으로써 달성될 수 있다. 폴리펩티드 합성을 무력화하기 위하여 전체 유전자 또는 일부, 예를 들어 5' 말단이 결실될 수 있다. 암호화 서열 내 유전자의 결실 또는 삽입은 비 기능성 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 단백질의 N-단 서열만을 함유하는 폴리펩티드)만을 합성하는 유전자를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 독소 유전자의 경우, 돌연변이는 유전자 생성물을 무독성으로 만들 수 있다.
따라서 본 개시내용은 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 발현하는 약독화 박테리아 또는 바이러스 백신 운반체를 포함하는 조성물을 포함한다. HtrA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은, 예를 들어 상동성 재조합이나 게놈 편집(조작된 뉴클레아제가 사용되는 게놈 편집(genome editing with engineered nuclease; GEEN))에 의해 벡터 내에 있을 수 있거나, 또는 숙주 운반체 게놈 내에 통합될 수 있다. 게놈 편집에 적합한, 조작된 뉴클레아제의 예들은 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease; TALEN) 및 CRISPR/Cas계를 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 백신 조성물은 살모넬라 병원성 유전자 군 2 영역 내 약독화 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 약독화 돌연변이(예를 들어, aroA, aroC 또는 sod 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이) 및 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는, 약독화된 살모넬라 백신 운반체를 포함한다. 본 발명의 약독화된 생 백신 조성물은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 운반체, 희석제 및/또는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
항체 치료법
예방적 및 치료적 백신화 이외에도 본 발명은 또한 박테리아 유발 염증 및/또는 질병이 발병하였거나 발병하였음이 의심되는 환자의 치료를 위한 항체 치료법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 치료법"은 피험체에 항체를 투여하는 것을 포함하는, 치료 프로토콜 또는 치료 계획에 대한 언급을 포함한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이 용어 "항체 치료법"은 수동적 면역치료법 및 수동적 면역예방법 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 표적, 예를 들어 박테리아 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편과 결합할 수 있는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 유사 분자를 지칭한다. 따라서 용어 "항체"는 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편과 결합할 수 있는, 비변형 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 이종접합체 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체(비변형 분자뿐만 아니라, 이것들의 단편들, 예를 들어 Fab, Fab′, F(ab′)2, Fv, 그리고 scFv를 포함함)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"(mAb)는, 이 항체를 생성하는 방법으로부터 유도되는 것이 아니라, 예를 들어 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 복사체 또는 클론로부터 유도되는 항체를 지칭한다. 본 발명에 사용된 mAb는 바람직하게 동종인 모집단 또는 실질적으로 동종인 모집단에 존재한다. 완전 mAb는 중쇄 2 개 및 경쇄 2 개를 함유한다. 따라서 이와 같은 모노클로날 항체의 단편은, 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂, 단일 사슬 Fv 단편, 그리고 경쇄 및 중쇄를 포함하는 원-암 항체(one-armed antibody)를 포함한다. 모노클로날 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 재조합체 기술, 파아지 전시 기술, 합성 기술, 예를 들어 CDR 그래프팅(CDR grafting), 또는 이와 같은 기술들의 조합, 또는 기타 다른 당업계에 공지된 기술들에 의해 생성될 수 있다.
원하는 기능적 특성, 즉 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편과 결합하는 특성을 나타내는 항체는 종래의 방법들에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 마우스는 HtrA 폴리펩티드 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있으며, 이때 생성된 항체는 회수 및 정제될 수 있고, 이 항체가 원하는 결합 특성 및 기능적 특성을 가지는지 여부의 측정은 공지의 방법들이 사용되어 평가될 수 있다. 항원 결합 단편은 또한 종래의 방법들에 의해 제조될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편을 제조 및 정제하기 위한 방법들은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2]에서 발견될 수 있다.
어구 "인간화된 항체"는, 비 인간 항체로부터 유래하는 CDR 이외에 나머지가 실질적으로 인간의 것이거나 완전히 인간의 것인 구조틀 영역(framework region)을 가지는 모노클로날 항체 및 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. "구조틀 영역" 또는 "구조틀 서열"은, 구조틀 영역 1 내지 4 중 임의의 하나를 지칭한다. 인간화된 항체 및 항원 결합 단편은, 구조틀 영역 1 내지 4 중 임의의 하나 이상이 실질적으로 또는 완전히 인간의 것인 분자, 즉 실질적으로 또는 완전히 인간의 것인 구조틀 영역 1 내지 4 각각의 가능한 조합들 중 임의의 것이 존재하는 분자를 포함한다. 예를 들어, 이는 구조틀 영역 1 및 구조틀 영역 2, 구조틀 영역 1 및 구조틀 영역 3, 구조틀 영역 1, 2 및 3 등이 실질적으로 인간의 것이거나 완전히 인간의 것인 분자를 포함한다. 실질적으로 인간의 구조틀은 공지된 인간 생식 계열 구조틀 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 약 80%인 구조물이다. 바람직하게 실질적 인간의 구조틀은 공지된 인간 생식 계열 구조틀 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%이다.
완전 인간 구조틀은 공지의 인간 생식 계열 구조틀 서열과 동일한 구조틀이다. 인간 구조틀 생식 계열 서열은 ImMunoGeneTics(IMGT)(웹 사이트 www.imgt.org) 또는 The Immunoglobulin FactsBook(Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351)로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 생식 계열 경쇄 구조틀은 A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, O12, O2 및 O8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 생식 계열 중쇄 구조틀 영역은 VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 및 VH5-5I로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
인간화 항체는 몇 가지 상이한 방법이 사용되어 생성될 수 있다. 하나의 접근법에서, 모 항체 화합물 CDR은 모 항체 화합물 구조틀과의 서열 동일성이 높은 인간 구조틀에 그래프팅된다. 새로운 구조틀의 서열 동일성은 일반적으로 모 항체 화합물 내 상응하는 구조틀의 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 동일할 것이다. 100 개 보다 적은 아미노산 잔기를 가지는 구조틀의 경우, 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 잔기가 변경될 수 있다. 이러한 그래프팅은 모 항체의 결합 친화성과 비교하였을 때 결합 친화성의 감소를 초래할 수 있다. 만일 이러한 경우라면, 구조틀은 Queen 등(1991)에 의해 개시된 바와 같은 특정 기준을 바탕으로 하였을 때 특정 위치들에서 모 구조틀로 역 돌연변이될 수 있다. 마우스 항체를 인간화하는데 유용한 방법을 기술한 추가의 참고문헌은 미국 특허 번호 4,816,397; 5,225,539; 및 5,693,761; 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD(문헌[Levitt (1983)]에 기술된 바와 같음); 및 Winter 및 공동 연구자의 방법(Jones et al., 1986)을 포함한다.
항체 또는 항체 단편, 또는 이러한 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역원성 조성물 또는 약학 조성물은 비 경구 경로(예를 들어, 피하, 정맥 내, 복막 내, 근육 내 또는 경피)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단독으로 또는 약학적으로 허용 가능한 운반체 및/또는 부형제와 함께 단일 용량 또는 복수 용량으로 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.]), 본원에 개시된 바와 같은 항체와, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 운반체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, HtrA 폴리페티드, 이의 단편 또는 에피토프와 결합하는 항체 하나 또는 이러한 항체들의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물이 제공된다. 약학 조성물은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995]에 개시된 것과 같은 종래의 기법들에 따라서 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 희석제, 그리고 임의의 기타 다른 공지된 보조제 및 부형제와 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 또한 병용 치료법, 즉 기타 다른 제제와 함께 투여되는 치료법으로 투여될 수 있다. 예를 들어 병용 치료법은 적어도 하나의 항 HtrA 항체 및 소염제와의 조성물을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이와 같은 소염제는 스테로이드 약물 또는 NSAID(비 스테로이드 소염 약물)를 포함한다. 제제의 예들은 아스피린 및 기타 다른 살리실산염, Cox-2 억제제, 예를 들어 로페콕시브(Vioxx) 및 셀레콕시브(Celebrex), NSAID, 예를 들어 이부프로펜(Motrin, Advil), 페노프로펜(Nalfon), 나프록센(Naprosyn), 설린닥(Clinoril), 디클로페낙(Voltaren), 피록시캄(Feldene), 케토프로펜(Orudis), 디플루니살(Dolobid), 나부메톤(Relafen), 에토돌락(Lodine), 옥사프로진(Daypro) 및 인도메타신(Indocin)을 포함한다.
하나의 구현예에서, HtrA 폴리펩티드와 결합하는 항체는 박테리아 감염을 치료하기 위하여 종래의 치료법에 덧붙여, 또는 이와 같은 종래의 치료법과 함께, 또는 이와 같은 종래의 치료법과 병행되어 투여된다.
DNA 백신
DNA 백신화는 피험체 조직의 세포에 의한 항원 발현을 위하여 항원을 암호화하는 DNA를 피험체 세포 및/또는 조직으로 직접 생체 내 도입하는 것을 수반한다. 이와 같은 백신은 본원에서 "DNA 백신" 또는 "핵산 기반 백신"이라 지칭된다. DNA 백신의 예들은 US 5,939,400, US 6,110,898, WO 95/20660 및 WO 93/19183에 기술되어 있다. 항원을 암호화하는, 직접 주사된 DNA의 방어적 면역 응답을 유도하는 능력은 다수의 실험 계에서 입증되었다.
DNA 면역화에 의해 유도되는 면역 응답에 영향을 미치는 것으로 공지된 요인은 DNA 전달 방법인데, 예를 들어 비 경구 경로는 낮은 유전자 전달률을 초래할 수 있고, 유전자 발현의 상당한 가변성을 달성할 수 있다. 유전자 총이 사용된 플라스미드의 고속 접종은 아마도 DNA 형질감염의 더 큰 효율과 수지상 세포에 의한 더 효율적인 항원 제시로 말미암아 마우스의 면역 응답을 향상시켰다. 본 발명의 핵산 기반 백신을 함유하는 벡터는 또한 당업계에 공지된 기타 다른 방법들, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미세주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 인산염 침전, 리포펙션(리소좀 융합) 또는 DNA 벡터 운반자에 의해 원하는 숙주에 도입될 수 있다.
질병의 치료
본 발명자들은, HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아 감염으로 말미암은 질병 및/또는 박테리아 유발 염증을 치료 또는 예방하기 위하여, 본원에 기술된 바와 같은 HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편, HtrA 폴리펩티드 또는 적어도 10 개의 아미노산으로 이루어진 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 면역원성 조성물, 약학 조성물 및/또는 백신을 피험체, 바람직하게는 인간 피험체에 투여할 수 있음을 확인하였다. 본 발명자들은, 본 치료가 HtrA 폴리펩티드를 발현하는 박테리아 감염을 근절 또는 예방하지 못함에도 불구하고, 이와 같은 박테리아의 감염에 의해 유발되는 염증 및/또는 질병의 징후 또는 증상의 발달을 감소 또는 지연시킨다는 것을 발견하였다.
당업계에서 이해될 바와 같이, 용어 "박테리아 유발 염증"은, 박테리아로부터의 유해한 자극에 대한 조직의 생체 응답을 지칭하고, 급성 및 만성 염증 둘 다를 포함한다. 급성 염증의 과정은 이미 모든 조직 내에 존재하는 선천적 면역 세포, 주로 상주 대식세포, 수지상 세포, 조직구, 쿠퍼(Kupffer) 세포 및 비만세포의 활성화에 의하여 개시될 수 있다. 이러한 세포들은, 병원체에 의해 광범위하게 공유되지만, 병원체 연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern; PAMP)이라 총칭되는 숙주 분자들과는 식별되는 분자를 인지하는 수용체로서, 이들 세포 자체의 특정 표면 수용체(패턴 인지 수용체(PRR)라 칭하여짐) 상에 존재한다. 감염이 발생할 때, 세포는 활성화를 수행할 수 있고(세포의 PRR들 중 하나가 PAMP를 인지할 수 있고), 염증의 임상 징후들 발현에 관여하는 염증 매개 인자들을 방출할 수 있다. 그 다음, 선천적 면역 응답의 활성화는, 특히 T-헬퍼(Th) 림프구가 수반되는 후천적 면역 응답의 활성화를 지지한다. 에이치. 파일로리 위염은 전 염증성 시토카인 IFNγ 및 IL-17 각각에 의해 특징지어지는 혼합형 Th1형 및 Th17형 면역 응답을 수반한다. 이러한 응답들에 의해 유발되는 위염의 심각성은 면역억제성 IL-10의 생성에 의해 조절된다. 예를 들어 IL-13은 또한 Th2형 응답과 같은 응답을 억제한다. 혈관 확장 및 이로 말미암은 혈류량 증가는 홍조(발적)를 일으키고, 열(발열)을 증가시켰다. 혈관의 증가된 투과성은 혈장 단백질의 삼출(누출) 및 조직으로의 유입(부종)을 초래하는데, 이는 종창(종양)으로서 발현된다. 방출된 매개 인자들 중 일부, 예를 들어 브래디키닌은 통증에 대한 감수성을 증가시킨다(통각과민, 동통). 매개 인자 분자들은 또한 혈관이, 백혈구, 주로 호중구가 혈관 외부로부터 조직으로 이동하는 것(혈관외유출)을 허용하도록 변경시킨다. 호중구는 손상 위치에 도달하기 위하여 현지 세포들에 의해 형성되는 주화성 구배를 따라서 이동한다.
세포 유래 매개 인자 이외에, 예비 형성된 혈장 단백질들로 이루어진 몇몇 비 세포 생화학 케스케이드 계는 염증 응답을 개시 및 전파하도록 동시에 작동된다. 이러한 계는 박테리아에 의해 활성화되는 보체 계를 포함한다. 삼출성 성분은 중요한 단백질, 예를 들어 피브린 및 면역글로불린(항체)을 함유하는 혈장 액이, 염증이 발생한 조직으로 이동하는 것을 수반한다. 이러한 이동은 혈관의 화학적으로 유도된 확장 및 증가된 투과성을 통해 달성되며, 이는 혈장의 순손실(net loss)을 초래한다. 유체의 조직으로의 증가된 수집은 조직의 팽창(부종)을 유발한다. 이러한 혈관외유출된 유체는 림프관에 의해 국부 림프 소절로 이동하고, 이에 따라서 에이치. 파일로리 항원에 노출된 세포들도 플러싱(flushing)되어 적응 면역계의 인지 및 면역공격 단계가 개시된다.
급성 염증은 다양한 염증 매개 인자들의 작동에 의해 유도되는, 혈관확장, 증가된 투과성 및 증가된 혈류량을 포함하여 눈에 띄는 혈관 변화에 의해 특징지어진다. 혈관확장은 처음에 세동맥 수준으로 발생하여, 모세 혈관 수준으로 진행된 다음, 현존하는 혈액량의 순 증가를 초래하고, 이로 말미암아 염증에 의한 홍조 및 열을 발생시킨다. 혈관들의 증가된 투과성은 혈액 중 세포들의 농도 증가로 말미암은 정체(세포로 팩킹되어 확장된 혈관들에 의해 특징지어지는 상태)와 함께, 혈장의 조직으로의 이동을 초래한다. 정체는 백혈구가 조직으로 공급되는 데에 중요한 과정인, 백혈구가 내피 세포 가장자리를 따라 이동하는 것(이동)을 허용한다.
상피 표면 상에 염증이 발생할 때 또는 회농성 박테리아가 수반될 때와 같이, 체 내에 조성되는 특정한 상황 하에서 급성 및 만성 염증의 특이 패턴이 보인다.
1) 육아종성 염증: 육아종 형성에 의해 특징지어지는 것으로서, 무엇보다도 결핵, 한센병, 유육종증 및 매독을 포함하는, 제한적이되 다수인 질병들의 결과이다.
2) 섬유소성 염증: 혈관 투과성의 많은 증가를 초래하는 염증으로서, 피브린이 혈관들을 통과하는 것을 허용함. 만일 적절한 전응고 자극, 예를 들어 암 세포가 존재하면, 섬유소성 삼출물이 침착된다. 이는 통상, 섬유소성 삼출물이 흉터로 전환되는 것이 장액을 담는 막들의 기능을 제한하면서 이 장액을 담는 막들 사이에서 일어날 수 있는 장막 강에서 보인다. 침착물은 종종 위막 판을 형성한다. 장의 염증이 일어나는 동안(위막성 대장염), 위막성 관이 형성될 수 있다.
3) 화농성 염증: 호중구, 죽은 세포 및 유체로 이루어진 다량의 고름을 초래하는 염증. 발열원 박테리아, 예를 들어 스타필로코커스에 의한 감염은 이러한 종류의 염증의 특징을 이룬다. 주변 조직에 의해 둘러싸이는 고름의 편재화된 다량의 수집체는 농양이라 칭하여진다.
4) 장액성 염증: 일반적으로 장액을 담는 막의 중피 세포에 의해 생성되긴 하지만, 혈장으로부터도 유래될 수 있는 비점성 장액 유체의 엄청난 양의 삼출에 의해 특징지어짐. 피부의 수포가 본 염증 패턴을 예시한다.
5) 궤양성 염증: 상피 세포 근처에서 발생하는 염증으로서, 표피로부터 조직의 괴사성 손실이 초래되면서 피하층이 노출될 수 있다. 이어서 발생하는 상피의 파임(excavation)은 궤양으로서 알려져 있다.
하나의 구현예에서, "박테리아 유발성" 염증은 위염(즉, 위 내막의 염증) 또는 십이지장염(즉, 십이지장의 염증)이다. 미란성 위염은 점막 방어 기전이 손상됨으로 인해 유발되는 위 점막 미란이다. 만성 위염은 위 조직의 여러 가지 문제들을 지칭한다.
헬리코박터 파일로리에 의한 감염 또는 집락화에 의해 유발되는 위염의 경우, 급성 감염은 복부 통증(위통) 또는 메스꺼움을 동반하는 급성 위염으로서 나타날 수 있다. 급성 위염이 만성 위염으로 발달하는 경우, 만일 증상이 있다면 이러한 증상으로서는 종종 비 궤양성 소화불량 증상들, 예를 들어 복통, 메스꺼움, 복부팽창, 트림, 그리고 때때로 구토 또는 흑변이 있다. 에이치. 파일로리로 감염된 개체는 소화성 궤양으로 발달할 생애 위험률이 10% 내지 20%이고, 위암으로 진행될 위험률은 1% 내지 2%이다. 유문동의 염증은 십이지장 궤양으로 진행되기가 더 쉬운 한편, 위의 코퍼스(위체)의 염증은 위 궤양 및 위 선암종으로 진행되기가 더 쉽다.
점액선 화생, 즉 분화된 세포가 가역적으로 바뀌는 것은 위선의 심각한 손상 환경에서 일어나는 현상으로서, 이후 쇄약해져서(위축성 위염) 점액선으로 계속 바뀐다. 위 궤양이 발달할 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 박테리아 유발 염증은 위축성 위염이다.
하나의 구현예에서, 피험체 내에서 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 유발되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 에이치. 파일로리 감염에 의해 유발되는 질병은 염증, 위염, 십이지장염, 위축성 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 위암 및/또는 점막 연관 림프 조직(MALT) 림프종이다.
실시예
실시예 1. HtrA 항원의 제조 및 백신화
재조합체 HtrA(돌연변이체 포함)를 Lower 등(2008)에 의해 기술된 바와 같이 생성하였다. 유전자 hp1018은 Pfx DNA 중합효소(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)가 사용되는 표준 PCR에 의해 에이치. 파일로리 균주 26695의 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 이하 프라이머들을 사용하였다: hp1018 정방향r: 5′-GGC TAT GGA TAA GGA TCA ACG C-3′(서열 번호 37), hp1018 역방향: 5′-CCA CCG CCT TAA TAG AGT CCT T-3′(서열 번호 38). 추산 길이가 333 개 염기인 PCR 생성물은 상업적 공급자(GENterprise, Mainz, Germany)에게 서열결정을 위해 제공하였다.
구조체 Hp1018/19Dsp는 프라이머 5′-aaggatccggcaatatccaaatccagagcatg-3′(서열 번호 39) 및 5′-aagaattcgacccacccctatcatttcacc-3′(서열 번호 40)를 사용하여 Pfx DNA 중합효소와 함께 26 PCR Enhancer(Invitrogen)가 공급된 완충액 중에서 에이치. 파일로리 균주 26695의 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 이후, 증폭된 BamH1/EcoR1 측접 PCR 생성물은 pGEM-T Easy 플라스미드(Promega)에 결찰시켜, pGEX-6P-1 플라스미드 DNA(GE Healthcare Life Sciences)로 서브클로닝하였으며, 이.콜라이 BL21에서 형질전환시켰다. 프로테아제 비활성 Hp1018/19DspS205A 단백질 구성시, 세린 205는 제조자의 지침에 따라서 QuikChangeH Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 알라닌으로 돌연변이시켰다. GST-Hp1018/19Dsp의 이종 과발현 및 정제를 위해서, 형질전환된 이.콜라이는 TB 배지 500 ㎖중에서 OD₅₅₀이 0.6이 될 때까지 생육시켰고, 여기에 0.1 mM 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 박테리아 배양액을 30 분 동안 4000 g에서 펠릿화시켰으며, 초음파 처리에 의해 PBS 25 ㎖ 중에서 용해시켰다. 용해물은 원심분리에 의해 제거하였으며, 상청액은 글루타치온 세파로스(GE Healthcare Life Sciences)와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 융합 단백질은 10 mM의 환원된 글루타치온과 함께 실온에서 10 분 동안 용리시키거나, 또는 4℃에서 16 시간 동안 180 U의 Prescission Protease(GE Healthcare Life Sciences)로 절단하였다. 용리 및 절단 생성물은 SDS PAGE 및 자이모그래피에 의해 분석하였다.
Veterinary Science 동물용 하우스(University of Melbourne, Parkville) 내에서 육종된, 특이적인 무 병원체 연령 매칭 암컷 C57BL/6 마우스를 재조합체 HtrA 항원(서열 번호 1)으로 2 회 백신화하였다(비 내 경로에 의해 3 주 간격). 비 내 백신화를 위하여, 용적 30 ㎕인 백신을 의식이 있는 마우스의 외비공에 천천히 적용하였다. 마우스는 포르말린 고정 에이치. 파일로리 100 ㎍, 백반 100 ㎍ 또는 HtrA 10 ㎍ + 백반 100 ㎍으로 피하 면역화하였다.
실시예 2. 에이치. 파일로리 배양 및 마우스의 면역공격
에이치. 파일로리 균주 SS1은 37℃의 미호기성 조건 하에서 5% 말 혈청(JRH Biosciences, USA), 0.02% 암포테리신 B 및 Skirrow 선택적 보충물을 함유하는 뇌 심장 주입 원액(BHI; Oxoid, Basingstoke, UK) 중에서 배양하였다.
박테리아에 0.1 ㎜ 유리 비드(Daintree Scientific, St. Helens, TAS, Australia)를 첨가하고 나서, 박테리아가 용해될 때까지 30 초 주기로(주기와 주기 사이에는 얼음 상 항온처리가 이루어짐) FastPrep FP120(Thermo Savant, Waltham, MA, USA)을 사용하여 60 m/s로 펄싱(pulsing)함으로써 에이치. 파일로리 용해물(HpL)을 제조하였다. 말 혈액 아가 평판 상에서의 배양을 통해 멸균도를 확인하였다. 단백질 수준은 BCA Protein Assay Kit(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다.
백신화를 위한 포르말린 고정을 위해서, 박테리아를 PBS 중 0.01 M 포름알데히드에 현탁하였으며, OD₆₀₀은 1.5로 맞추었다. 박테리아는 37℃에서 2 시간 동안 가볍게 진탕한 후, 실온에서 밤새 진탕하였으며, PBS 중에서 3 회 세정한 다음, 10⁸ 박테리아/㎖로 재현탁하였다.
이러한 연구에 사용된 C57BL/6 마우스는 멜버른 소재 월터-엘리자 홀 연구소로부터 구한 연령 매칭 암컷들이었다. 모든 동물 실험은 멜버른 대학 동물 윤리 위원회(University of Melbourne Animal Ethics Committee)의 승인을 받았다.
마우스는 BHI 0.1 ㎖ 중에 현탁된 10⁷ 개 에이치. 파일로리 균주 SS1로 1 회 위내 감염시켰다. 실험 완료시, 마우스는 CO₂ 질식에 의해 안락사시켰고, 위는 내부 곡면을 따라서 개방한 다음 2 개의 부분으로 이등분하였다. 이 2등분체 중 한쪽 부분은 집락 형성 검정법에 의해 박테리아 수준을 정량하는 데 사용하였다. 다른 한쪽 부분은 위염의 조직학적 평가를 위해 중성의 완충 포르말린 중에 고정하였다.
실시예 3. 집락 형성 검정법
면역공격 후 4 주 경과시 위는 내부 곡면을 따라서 개방한 다음, 2 개의 부분으로 이등분하였다. 이 2등분체 중 한쪽 부분은 BHI 원액 중에 넣은 다음, 균질화하였다(GmbH Polytron^ㄾ homogeniser, Kinematica, Switzerland). BHI 원액 중 10 배 연속 희석액을 제조하였으며, 분취액들을 Glaxo 선택적 보충 아가 평판(Blood Agar Base No. 2; 5% 말 혈액, 3.75 ㎍/㎖ 암포스타트 B, 12 ㎍/㎖ 반코마이신, 0.4 ㎍/㎖ 폴리믹신 B, 20 ㎍/㎖ 바시트라신 및 1.3 ㎍/㎖ 날리딕신산 함유) 상에 도말하였다. 배양한지 5 일 경과 후 콜로니들을 계수하였으며, 위 당 콜로니 형성 단위의 수를 산정하였다.
실시예 4. 위의 병리학
위염을 이미 기술된 바와 같이 조직학적으로 평가하였다(Sutton et al., 2001). 각각의 위의 제2 절반부들을 10% 중성 완충 포르말린 중에 고정한 다음, 파라핀에 매립한 후, 4 ㎛의 두께의 절편으로 절단하였다. 위염의 평가를 위해 절편들은 H&E로 염색하였으며, 광학 현미경 하에서 블라인드 스코어링(blind scoring)을 실시하였다. 2 개의 별도 조직 절편들을 대상으로 염증을 평가하였는데, 이때 각각의 동물들에 대해서는 3 개의 매개변수를 사용하였다. (1) 0 등급에서 6 등급(0 = 비 발생; 1 = 경증의 다병소성; 2 = 경증의 범발성; 3 = 경증의 범발성 및 중등도의 다병소성; 4 = 중등도의 범발성; 5 = 중등도의 범발성 및 중증 다병소성; 그리고 6 = 중증의 범발성)에 이르기까지의 세포 침윤(림프구 및 호중구의 점막 고유층으로의 이동); (2) "점액 화생" (위 코퍼스 내 대형의 창백한 구형 세포들); 그리고 (3) "위축"(체벽 세포 및 주 세포의 소실). 화생 및 위축은 0 등급에서 3 등급(0 = 비 발생; 1 = 경증; 2 = 중등도; 3 = 중증)으로 등급을 매겼다.
실시예 5. 위 시토카인
세포 파편은, ELISA 이전에 원심분리와, BCA 단백질 검정 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량된 상청액 중 단백질 농축에 의해 위 균질화물로부터 제거하였다. 시토카인 농도는 96 웰 Maxisorp 평판(Nunc, Roskilde, Denmark)을, 정제된 항 마우스 IL-13(50 ng/웰; eBioscience, San Diego, CA, USA), IL-10(100 ng/웰; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), IFN■(100 ng/웰; BD Biosciences) 또는 IL-17A(50 ng/웰; eBioscience)로 중탄산염 코팅 완충액(pH 9.6) 중에서 밤새 코팅함으로써 측정하였다. 평판은 PBS(블로킹제) 중에서 1 시간 동안 1% BSA(Sigma)로 블로킹(blocking)시킨 다음, 여기에 실온에서 3 시간 동안 또는 4℃에서 밤새 시료를 2 회 첨가하였다. 이후 포착된 시토카인은 블로킹제 중에서 1 시간 동안 바이오틴화된 항 마우스 IL-13(25 ng/웰; eBioscience), IL-10(50 ng/웰; BD Bio-sciences), IFN■(50 ng/웰; BD Biosciences) 또는 IL-17A(25 ng/웰; eBioscience)로 표지화한 다음, 여기에 30 분 동안 블로킹제 중 호오스래디시 퍼옥시다아제 접합 스트렙타비딘(Pierce) 1/5000 50 ㎕를 첨가하였다. DMSO 중 10 ㎎/㎖ TMB(Sigma) 0.1%와, 인산염-시트르산염 완충액(pH 5.0) 중 과산화수소 0.006%로서 제조된 TMB 용액 100 ㎕로 색을 발색시켰으며, 같은 부피의 2 M 황산으로 반응을 중지시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 시료 농도는 재조합체 IL-10, IFN■(BD Biosciences), IL-13 및 IL-17A(eBioscience)의 표준 곡선에 대해 측정하였다.
실시예 6. HtrA 혈청 억제 검정
EnzChek^ㄾ 펩티다아제/프로테아제 검정 키트(E33758)를 상기 백신화된 마우스 유래 혈청이 HtrA의 단백분해 활성을 블로킹하는 능력을 측정하는 데 사용하였다. 백신화/감염된 마우스로부터 유래하는 혈청(면역공격 후 4 주 경과시 수집)은 1:5로 희석하였으며, 30 분 동안 펩티다아제 키트의 성분 B(분해 완충액)를 사용하여 HtrA 또는 PBS(대조군) 중 어느 하나와 혼합하였다. 이후 HtrA의 단백분해 활성은 60 분 동안 항온처리 후 기질 절단 여부를 측정하여 (키트 권장사항에 따라서) 평가하였다. 흡광도는 502 ㎚/528 ㎚에서 TECAN Infinite M200Pro 판독기를 사용하여 판독하였으며, 데이터는 Magellan 7.1 SPI 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
실시예 7. 감염에 대한 항체 응답의 정량
혈청은 심장 천자에 의해 수집하였다. 개방된 소장의 세로 방향으로 10 ㎝ 아래 장 점막을 메스 칼날로 긁어낸 시료를 계량한 다음, 완전 미니 무 EDTA 프로티나아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 함유하는 같은 부피의 PBS와 혼합하였다. 항 헬리코박터 항체 수준은 직접 ELISA로 측정하였다. Maxisorp 면역평판(Nunc, Denmark)은 중탄산염 완충액(pH 9.6) 중 에이치. 파일로리 용해물 50 ㎍/웰로 밤새 코팅하였다. 평판은 RT에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 시료는 연속으로 블로킹제 중 1/10로 희석하여, 웰 2 개에 50 ㎕씩이 첨가한 후, RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 포착된 항체는 블로킹제 중 RT에서 1 시간 동안 호오스래디시 퍼옥시다아제 접합 염소 항 마우스 IgG(4 ng/웰; Pierce), 염소 항 마우스 IgG1(8 ng/웰, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 또는 IgA(10 ng/웰, Southern Biotech)로 표지화하였다. 색을 발색시키고, 상기와 같이 판독하였으며, 종말점 역가들을 산정하였다.
실시예 8. 웨스턴 블럿팅
에이치. 파일로리 용해물(20 ㎍/레인)을 8% SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 다음, 니트로셀룰로스 막(Amersham Biosciences)으로 옮겼다. 막은 5% 탈지유로 블로킹하였으며, 1/1,000으로 희석된, 장을 긁어낸 시료로 프로빙하였다. 결합된 1차 항체는 호오스래디시 퍼옥시다아제 접합 항 마우스 항체(Dako)로 검출하였다. 표지화된 단백질은 이 막을 ECL Prime 시약(Amersham Biosciences) 중에 항온처리하고, ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)을 사용하여 가시화하였다. 모든 겔은 10 초 동안 노출시켰다.
실시예 9. 통계학
Social Sciences 소프트웨어(21.0 버전)에 대한 Statistical Package를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
실시예 10. 결과
HtrA를 사용한 예방적 백신화는 최소한의 방어 효능을 유도한다
마우스 군들은 사멸된 에이치. 파일로리 + 콜레라 독소(CT) 보조제(양성 대조군), 또는 HtrA + CT로 비 내 경로를 통해 2 회 백신화하였다. 음성 대조군들은 PBS로 가 투여하였다. 마지막 투여 후 4 주 경과시 모든 마우스는 생 에이치. 파일로리 균주 SS1으로 면역공격하였다. 마우스 위 내 박테리아 양은 4 주 후에 집락 형성 검정법으로 평가하였다. 백신화는 음성 대조군과 비교하였을 때 박테리아 집락화를 감소시켰다(도 1; **p<0.01, ***p<0.001; ANOVA).
후 면역 위염
도 1에 언급된 마우스로부터 유래하는 위를 위염에 대해 조직학적으로 평가하였다. 예상되는 바와 같이, 사멸된 에이치. 파일로리 + CT로 백신화한 마우스(면역공격 전)는 음성 대조군과 비교하였을 때 위염의 심각성(증가한 위축 및 화생, 위염 핵심 판독정보)이 유의적으로 증가하였다(*Mann-Whitney, 도 2). 그러나, HtrA + CT로 백신화된 마우스에서의 위염은 음성 대조군의 위염과 분별되지 않았다. 다시 말해서, 도 1에 나타낸 방어적 면역성에도 불구하고, 이 마우스는 후 면역 위염이 발달하지 않았다.
이는, HtrA + CT 군에서 관찰되는 방어 수준이 양성 대조군의 방어 수준과 비교하였을 때 약간 낮은 것과 관련되어 있을 것 같지 않았으며; 본 발명자는 재조합체 항원을 사용하여 유사한 실험들, 즉 에이치. 파일로리 백신을 시험하되 이전에는 볼 수 없었던 실험들을 무수히 많이 수행하였다. 에이치. 파일로리 집락화는 위염의 심각성과 상관되지 않음이 문헌에 널리 인식되어 있다.
면역화 이후 위 시토카인 수준 억제
에이치. 파일로리 감염은 마우스와 인간 둘 다의 위 조직에서 혼합형 Th1 및 Th17 응답을 유도한다. IL-10은 에이치. 파일로리 유발 위염의 중요한 억제제인 것으로 공지되어 있다. IL-13은 Th2형 응답을 측정하기 위해 사용되는 주요 마커이다. 이러한 감소한 위염을 더 연구하기 위해, 상기 마우스의 위 균질화물 중 시토카인을 ELISA에 의해 정량하였다.
예상된 바와 같이, 감염 대조군(PBS)과, 양성 대조군 백신(에이치. 파일로리 + CT) 군으로부터 유래하는 위 조직은 Th1(IFNγ) 및 Th17(IL-17A) 시토카인의 높은 수준을 나타내었다. 이러한 특정의 실험은 감염되지 않은 대조군은 포함하지 않았지만, 수년간의 실험들은, 이러한 시토카인이 위 균질화물 중에서 보통 용이하게 검출되지 않음을 나타낸다. IL-10 및 IL-13도 또한 증가하였는데; 이러한 시토카인은 Th1형 시토카인 및 Th17형 시토카인에 의해 유도되는 염증 신호를 억제하도록 증가되므로, 이 또한 예상되는 바이다.
전혀 예상치 못했던 관찰은, HtrA + CT에 의한 백신화는 감염된 마우스 내에서 이러한 시토카인의 수준을 매우 낮은 수준 또는 검출되지 않을 정도의 수준으로 유의적으로 억제했다는 것이다(**p<0.01, ***p<0.0001; ANOVA)(도 3). 이는, 백신이 에이치. 파일로리 유발 위염을 억제하는 것으로 처음 입증된 결과이다.
재조합체 HtrA(rHtrA) 백신화는 중화 항체 응답을 유도한다
본 발명자들은, 백신이 HtrA 활성을 중화하는 항체를 유도함으로써 위염 및 위 시토카인 수준을 억제 및 낮추었다는 가설을 세웠다. 이를 시험하기 위해 HtrA 활성에 대한 시험관 내 분석법을 개발하였으며, 이에 의해 상기 마우스로부터 유래하는 혈청의 억제 능을 평가하였다. 도 4의 결과들은, HtrA로 백신화된 다음 에이치. 파일로리로 면역공격받은 마우스로부터 유래한 혈청이, HtrA 프로테아제가 표적 기질을 절단하는 능력을 실제로 억제하였음을 나타낸다(***ANOVA). 이는 기타 다른 군들로부터 유래하는 혈청의 경우와는 대조적이었다.
재조합체 HtrA(rHtrA) 백신화는 HtrA에 대한 항체를 유도한다
일군의 마우스는 비 내 경로를 통해 rHtrA + CT로 3 회 백신화하였다. 음성 대조군들은 PBS로 가 투여하였다. 백신화된 마우스로부터 유래한 혈청은 HtrA를 특이적으로 검출하는 항체를 함유하였다(도 5).
주사 경로에 의한 치료적 HtrA 백신화
마우스 군들을 에이치. 파일로리로 감염시킨 다음, 백반 보조제 단독(음성 대조군), rHtrA 및 백반, 또는 rHtrA^sa 및 백반 중 어느 하나를 피하 주사하였다(rHtrA^sa는 세린에서 알라닌으로의 단일 아미노산 치환(효소를 비활성으로 만듦)이 일어났다는 것을 제외하고는 rHtrA와 동일함). 마지막 백신화 후 4 주 경과시 위를 제거하였으며, 박테리아 집락화는 집락 형성 검정법에 의해 정량하였다. 임의의 군들 가운데 에이치. 파일로리 집락화 수준에는 차이가 없었다(도 6).
주사 경로에 의한 치료적 HtrA 백신화는 에이치. 파일로리 유발 위염에 대해 방어 효능을 나타내지 않는다
도 6에 도시된 바와 같이 치료적으로 백신화된 마우스의 위들에 있어서 위염의 심각성을 조직학적으로 정량하였다. 집락화에 어떠한 효과도 나타내지 않았음에도 불구하고(도 6), 활성 rHtrA 또는 비활성 rHtrA^sa 중 어느 하나에 의한 백신화는 에이치. 파일로리 유발 위축성 위염의 발달에 대해 방어 효능을 초래하였다(도 7).
주사 경로에 의한 치료적 HtrA 백신화는 위 시토카인을 현저하게 증가시키지 않고 에이치. 파일로리 유발 위염에 대한 방어 효능을 나타낸다
도 6에 도시된 마우스로부터 유래하는 위 균질화물 중 시토카인의 수준을 ELISA에 의해 정량하였다. rHtrA 군 중 어느 하나의 군으로 인한 백신화는, 특히 백반 단독으로 백신화된 주요 음성 대조군의 경우와 비교하였을 때, 핵심 위 시토카인의 상당한 증가를 초래하지 않았다(도 8).
주사 경로에 의한 치료적 rHtrA 백신화는 위장관 내에서 원산 HtrA에 특이적인 항체를 유도한다
도 6에 도시된 마우스로부터 얻어진, 장을 긁어낸 시료들을 HtrA에 대한 항체의 존재에 대해 시험하였다. 장을 긁어낸 시료의 에이치. 파일로리 용해물에 대한 웨스턴 블럿 분석은, rHtrA로 치료적으로 백신화된, 감염된 마우스만이 HtrA에 대하여 검출 가능한 항체를 가졌음을 나타내었다(도 9). 중요한 점은, 이는 또한 재조합체 HtrA에 의한 백신화가 에이치. 파일로리 HtrA에 대해 점막 항체를 유도하였음도 입증한다는 점이다.
특정 구현예에 나타낸 바와 같이, 광범위하게 기술된 바와 같은 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 다수의 변경 및/또는 변형이 본 발명에 대해 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러므로 본 발명의 구현예들은 모든 점에서 예시적이되 제한적이지 않은 것으로 고려되어야 한다.
본원에 논의 및/또는 인용된 모든 간행물들은 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
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참고문헌
Jones et al. (1986) Nature 321:522-525
Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620
Lower et al. (2008) PLos One; 3:e3510
Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol, 48(3):443-453
Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869
Sutton et al. (2001) Gut, 49:467-473

SEQUENCE LISTING <110> Murdoch Childrens Research Institute <120> Helicobacter therapeutic <130> P97130.PCT <150> AU 2014902493 <151> 2014-06-30 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 475 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 1 Met Lys Lys Thr Leu Phe Ile Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ser Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Asn Ile Gln Ile Gln Ser Met Pro Lys Val Lys Glu Arg Val 20 25 30 Ser Val Pro Ser Lys Asp Asp Thr Ile Tyr Ser Tyr His Asp Ser Ile 35 40 45 Lys Asp Ser Ile Lys Ala Val Val Asn Ile Ser Thr Glu Lys Lys Ile 50 55 60 Lys Asn Asn Phe Ile Gly Gly Gly Val Phe Asn Asp Pro Phe Phe Gln 65 70 75 80 Gln Phe Phe Gly Asp Leu Gly Gly Met Ile Pro Lys Glu Arg Met Glu 85 90 95 Arg Ala Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Ser Lys Asp Gly Tyr Ile Val 100 105 110 Thr Asn Asn His Val Ile Asp Gly Ala Asp Lys Ile Lys Val Thr Ile 115 120 125 Pro Gly Ser Asn Lys Glu Tyr Ser Ala Thr Leu Val Gly Thr Asp Ser 130 135 140 Glu Ser Asp Leu Ala Val Ile Arg Ile Thr Lys Asp Asn Leu Pro Thr 145 150 155 160 Ile Lys 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Gly Leu Val Gly Ile 130 135 <210> 32 <211> 88 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 32 Gly Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gln Asp Leu Ser Gly Asp Leu Gln Asn 1 5 10 15 Ser Tyr Asp Asn Lys Glu Gly Ala Val Val Ile Ser Val Glu Lys Asp 20 25 30 Ser Pro Ala Lys Lys Ala Gly Ile Leu Val Trp Asp Leu Ile Thr Glu 35 40 45 Val Asn Gly Lys Lys Val Lys Asn Thr Asn Glu Leu Arg Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ser Met Leu Pro Asn Gln Arg Val Thr Leu Lys Val Ile Arg Asp 65 70 75 80 Lys Lys Glu Arg Thr Phe Thr Leu 85 <210> 33 <211> 88 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 33 Gly Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gln Asp Leu Ser Gly Asp Leu Gln Asn 1 5 10 15 Ser Tyr Asp Asn Lys Glu Gly Ala Val Val Ile Ser Val Glu Lys Asp 20 25 30 Ser Pro Ala Lys Lys Ala Gly Ile Leu Val Trp Asp Leu Ile Thr Glu 35 40 45 Val Asn Gly Lys Lys Val Lys Asn Thr Asn Glu Leu Arg Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ser Met Leu Pro Asn Gln Arg Val Thr Leu Lys Val Ile Arg Asp 65 70 75 80 Lys Lys Glu Arg Ala Phe Thr Leu 85 <210> 34 <211> 88 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 34 Gly Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gln Asp Leu Ser Gly Asp Leu Gln Asn 1 5 10 15 Ser Tyr Asp Asn Lys Glu Gly Ala Val Val Ile Ser Val Glu Lys Asp 20 25 30 Ser Pro Ala Lys Lys Ala Gly Ile Leu Val Trp Asp Leu Ile Thr Glu 35 40 45 Val Asn Gly Lys Lys Val Lys Asn Thr Asn Glu Leu Arg Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ser Met Leu Pro Asn Gln Arg Val Thr Leu Lys Ile Ile Arg Asp 65 70 75 80 Lys Lys Glu Arg Thr Phe Thr Leu 85 <210> 35 <211> 88 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 35 Gly Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gln Asp Leu Ser Gly Asp Leu Gln Asn 1 5 10 15 Ser Tyr Asp Asn Lys Glu Gly Ala Val Val Ile Ser Val Glu Lys Asp 20 25 30 Ser Pro Ala Lys Lys Ala Gly Ile Leu Val Trp Asp Leu Ile Thr Glu 35 40 45 Val Asn Gly Lys Lys Ile Lys Asn Thr Asn Glu Leu Arg Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ser Met Leu Pro Asn Gln Arg Val Thr Leu Lys Val Ile Arg Asp 65 70 75 80 Lys Lys Glu Arg Thr Phe Thr Leu 85 <210> 36 <211> 77 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 36 Gly Leu Gln Val Glu Asp Leu Thr Gln Lys Thr Lys Arg Ser Met Arg 1 5 10 15 Leu Ser Asp Asp Val Gln Gly Val Leu Val Ser Gln Val Asn Glu Asn 20 25 30 Ser Pro Ala Glu Gln Ala Gly Phe Arg Gln Gly Asn Ile Ile Thr Lys 35 40 45 Ile Glu Glu Ile Glu Val Lys Ser Val Ala Asp Phe Asn His Ala Leu 50 55 60 Glu Lys Tyr Lys Gly Lys Pro Lys Arg Phe Leu Val Leu 65 70 75 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 37 ggctatggat aaggatcaac gc 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 38 ccaccgcctt aatagagtcc tt 22 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 39 aaggatccgg caatatccaa atccagagca tg 32 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 40 aagaattcga cccaccccta tcatttcacc 30

Claims (29)

1. 박테리아 HtrA 폴리펩티드 포함하는, 피험체 내에서 헬리코박터 파일로리 감염을 근절 또는 예방하지 않고 헬리코박터 파일로리 유발 염증을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 HtrA 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 헬리코박터 파일로리 유발 염증은 위염, 십이지장염, 또는 이들의 조합인 면역원성 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 염증은 위축성 위염인 면역원성 조성물.
4. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 보조제, 또는 이들의 조합을 포함하는 면역원성 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 백신인 면역원성 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 치료적 백신인 면역원성 조성물.
7. HtrA 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 부형제, 보조제, 또는 이들의 조합과 혼합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서,
   상기 HtrA 폴리펩티드는 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 백신인 방법.
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