JPH04506663A - インターロイキン含有安定ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン含有安定ワクチン組成物背景 免疫化すべき有機体内のより強い免疫応答を得る目的で、そして抗原含有剤に対 する宿主の耐性を強化する目的で、抗原の免疫原性能力を増強することがしばし ば望まれている。注入される抗原の免疫原性を増強する物質はアジュバントと呼 ばれている。最も有効なアジュバントの１つはフロイントのアジュバント、即ち 油中水エマルジョンである。抗原と一緒のエマルジョン（フロイント完全アジュ バント）内に生存もしくは死滅ミコバクテリアを懸濁させたとき、フロイントの アジュバントが最も有効である。しかしながら、このエマルジョンが付着した回 りに激しい慢性の炎症を生じるため、ヒトに対するこのアジュバントの使用は排 除されている。ミコバクテリアが入っていないエマルジョン（不完全フロインド アジュバント）は刺激性が低いため、ヒトに対して用いられてきた。もう１つの 種類のアジュバントは、抗原をその上に吸着させた鉱物の懸濁液である。

特定のリンフアカイン類がアジュバント活性を有し、それが抗原に対する免疫応 答を増強する、ことが示された。例えば、Ｇｏｏｄ他は、マラリア関連抗原に対 する免疫応答を増強させるための、ミョウバン上に吸着させた組換えヒトＩＬ− ２（ｒｈＩＬ−２）の使用を示している。この組成物は製造した後直ちに使用さ れ、そして長時間に渡る安定性は確立されていなかった。Ｇｏｏｄ、　Ｍ、Ｆ、 、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１：　９７２−９７７　（１９８８）。

Ｎａｋａｍｕｒａ他は、インターフェロン−ガンマがいくつかの抗原に対して２ 〜４倍から成る抗体生成の増強を誘発したことを示した。Ｎａｋａｍｕｒａ他、 Ｎａｔｕｒｅ　３０７：　３８１−３８２　（１９８４）、インターロイキン類 は他の抗原に対する免疫応答を増強することも示された。Ｎｅｎｃｉｏｎｉ他、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９：８００−８０４　（１９８７）　；　Ｄｏｔａ ｒｄ他、ＥＰ２８５４４１゜発明の要約 本発明は、懸濁液内の鉱物上に吸着させた抗原とアジュバント量のインターロイ キンと、の混合物から成る、安定なインターロイキン含有ワクチン組成物に関す る。この混合物は防腐剤を含有し得る。抗原に対する免疫応答を調節するため、 ミョウバン（例えば水酸化もしくは燐酸アルミニウム）の如き鉱物懸濁物上に吸 着させた抗原（特に糖液合体）と−緒に、アジュバントとしてインターロイキン 類、例えばインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキ ン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５ 、インターロイキン−６およびインターロイキン−７が使用できる。このワクチ ン組成物は貯蔵できる。

発明の詳細な説明 本発明のワクチン組成物は、懸濁液内の鉱物上に吸着させた抗原と共にアジュバ ント量のインターロイキンおよび防腐剤から成る。好適には、この、鉱物は、水 系媒体内に懸濁しているミョウバン（例えば水酸化アルミニウムまたは燐酸アル ミニウム）である。

このインターロイキンは、抗原の免疫応答を調節し、一方ミヨウパンは、このイ ンターロイキンの生物学的活性を安定化させる働きをする。

ミョウバンが存在していない場合、インターロイキン類は短い半減期を有する。

従って、本発明のワクチン組成物は長期間貯蔵でき、そしてもしそれがなければ 該インターロイキンの不安定化をもたらす。安定化により、ワクチン調剤を投与 するに先立つこのワクチン調剤の製造、輸送および貯蔵許容時間を太き（延長す る。

いくつかの異なるインターロイキン類が使用できる。これらには、インターロイ キン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキ ン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６ 、インターロイキン−７、或はこれらの混合物が含まれる。免疫調節活性を有す るインターロイキン類の一部もまた使用できる。好適なインターロイキンはイン ターロイキン−２である。

インターロイキンはいかなる適切な給源からも得られる。これらは組換えＤＮＡ 方法によって製造され得る。例えば、いくつかのヒトのインターロイキン類をコ ード化する遺伝子をクローン化した後、種々の宿主系内で発現させることで、純 粋なヒトのインターロイキンを多量に生産することができる。更に、特定のＴリ ンパ球系は高レベルのインターロイキンを生産し、従ってこのインターロイキン の給源と成り得る。

この防腐剤は薬学的に許容されるいかなる防腐剤であってもよい。これらには、 チメロサール、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルもし くはエチルパラベン、および２−フェノキシエタノールが含まれる。

インターロイキンは数多くの異なる種類の抗原のためのアジュバントとして使用 できる。一般に、これらの抗原は、バクテリア、ウィルスおよび細胞微細成分の 如き粒子状抗原、蛋白質、ペプチド、糖蛋白質および炭水化物の如き可溶抗原で あり得る。特に興味の持たれている抗原は、ウィルスもしくはバクテリアの抗原 、アレルゲン、自己免疫関連抗原、腫瘍関連抗原、オンコジーン生産物、寄生虫 抗原、菌・カビ抗原、或はこれらのフラグメントである。これらの抗原は、天然 の給源から得られるか、或はこれらは、組換えＤＮＡ技術または他の人工手段に よって製造できる。

興味の持たれているバクテリア抗原の中には、ヒトのバクテリア病原体に関連し たものがあり、これらには例えば、分類可能および分類不可能なインフルエンザ 菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｆ）　、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓ）　、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ）　、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ） 、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｆｓ）　、コレラ ｍ　ＣＶｉｂｒｉａ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ ｔｅｒｉａ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）　、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇ。

ｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉ ｓ）　、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、黄色ぶ どう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　、化膿連鎖球菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　、肺炎かん菌（Ｋｌｅｂｓ ｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕＩＩｌｏｎｉａｅ）および破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ ｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）が含まれる。いくつかの特異的バクテリア抗原には、バク テリア表面および外膜蛋白質（例えばインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌または カタル球菌からの）およびバクテリア表面蛋白質（例えば化膿連鎖球菌からのＭ 蛋白質）が含まれる。

病原性ウィルスからのウィルス抗原には、これに限定されるものではないが、ヒ ト免疫不全ウィルス（タイプＩおよびＩ　Ｉ）　、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ タイプ■、ＩＩおよびＩ　Ｉ　Ｉ）　、呼吸シンシチウムウイルス、Ａ型肝炎、 Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ型および非Ｂ型肝炎ウィルス、単純ヘルペスウィルス （タイプ■およびＩＩＬシトメガロウイルス、インフルエンザウィルス、バライ ンフルエンザウィルス、ポリオウィルス、ロタウィルス、コロナウィルス、風疹 ウィルス、麻疹ウィルス、水痘、エプスタイン・バールウィルス、アデノウィル ス、乳頭腫ウィルスおよび黄熱病ウィルスが含まれる。

これらの病原性ウィルスのいくつかのの特異的ウィルス抗原には、呼吸シンシチ ウムウィルス（ＲＳ　Ｖ）のＦ蛋白質［特に、Ｐａｒａｄｉｓｏ、　Ｐ、他の、 表題が１呼吸シンンチウムウィルス：ワクチンおよび診断方法Ｊ　（Ｒｅｓｐｉ ｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　Ｖｉｒｕｓ：　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ 　ＤＬａｇｎｏｓｔｉｃ　Ａｓ５ａｙｓ）のＷＯ３９１０２９３５内に記述され ているＦペプチド２８３＝３１５を含有している抗原］、ＮおよびＧ蛋白質、ロ タウィルスのＶＦ６　（、従来ｖＰ３として知られている）　、ｖｐ６およびＶ Ｐ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウィルスのエンベロープ糖蛋白質、Ｂ型肝炎の ＳおよびプレＳ抗原、そしてヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤが含まれる。

また、興味の持たれているものは、自己免疫病、例えばリウマチ様関節炎および 紅斑性ろうそう、に関連した種々の抗原である。

ワクチンにおける使用で特に興味の持たれているものは、バクテリア病原体によ って生産される皮膜ポリマー類（ＣＰ）である。皮膜ポリマー類は、糖含有ポリ マー類、例えば糖類、糖酸、アミノ糖類、多価アルコール類および燐酸糖類のポ リマー類である。いくっがの皮膜ポリマー類およびオリゴマー類がワクチンとし て有益である。

これらの皮膜ポリマー類（ＣＰ）は数多くの異なる種類のバクテリアから誘導さ れ得る。これらの種類には、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌（特に加納型１． ４．５．６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４．１８Ｃ，１９Ｆおよび２３Ｆ）、化膿連鎖球 菌およびＳ、　ａｇａｌａｃｔｉａｅを含む連鎖法菌属の種、髄膜炎（例えばセ ログループａ、　ｌ）およびｃ）、肺炎かん菌、緑１ＩＩｌ菌および黄色ぶどう 球菌が含まれる。

非バクテリアポリマー類は、酵母および菌・カビ、例えばクリプトコックス０ネ オホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）　、或は癌 細胞上にユニークに見いだされる炭水化物含有単位、或はアレルゲンに関連して 見いだされるもの、から誘導され得る。

？　本発明の抗原類は、を椎動物（例えば哺乳動物宿主）内の抗原に対する免疫 応答を引き出すために使用され得る。この方法は、懸濁液内の鉱物上に吸着させ た抗原およびアジュバント量のインターロイキンと、添加防腐剤と、の混合物か ら成るワクチン組成物の免疫学的有効量を動物に投与することから成る。このワ クチン組成物は微生物感染の予防に対して有益である。これらの抗原は、薬学的 に許容される媒体、例えば生理食塩水、或はエタノールポリオール類（例えばグ リセロールまたはプロピレングリコ−ノリ中に入れて投与され得る。このワクチ ン組成物は、任意に、他のアジュバント、例えば植物油もしくはそれらのエマル ジョン、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステ ル、オクタデシルアミン、リソレシチン、臭化ジメチル−ジオクタデシルアンモ ニウム、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’　、　Ｎ’　ビス（２−ヒドロキシエチ ル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニ ック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール類；ポリアミン類、例えばビラン、デキス トランスルフェート、ポリＩＣ１カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）　：ペプチド 類、例えばムラミル（ｍｕｒａｍｙｌ）ジペプチド、ジメチルグリジン、ツフッ シン（ｔｕｆｔｓｉｎ）　；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；オイルエマルジ ョン；そして鉱物ゲルを含んでいてもよい。本発明の抗原はまた、リポワーム類 またはｌＳＣ０Ｍ５に組み込まれていてもよい。補助的活性材料も利用され得る 。

これらのワクチン類は、種々の方法でヒトもしくは動物に投与され得る。これら には、皮肉、経皮（例えば徐放ポリマー類の使用による）、筋肉内、腹膜内、静 脈内、皮下、経口および鼻孔内投与ルートが含まれる。上記ワクチンで用いられ る抗原量は、使用される抗原の識別に応じて変化し得る。本ワクチン類に適合さ せるための古典的担体抗原と一緒に用いられる確立された服用範囲を調節および 操作することは、本分野の技術者の能力の範囲内である。、本発明のワクチン類 は、未成熟および成熟両方の温血動物、特にヒトの治療における使用を意図した ものである。また、本組成物の使用は、予防用途に限定されるものでなく、治療 用途もまた意図したものである（例えばエイズの予防および治療）。

インターロイキンのアジュバント活性は次のような数多くの重要な意味を有して いる：インターロイキンのアジュバント活性は、予防接種した有機体内の抗原に 対して生産される保護抗体の濃度を上昇させ得る。

その結果として、有効な（即ち保護する）予防接種が、通常必要とされるよりも 少ない量の抗原を用いて達成され得る。抗原に関するこの必要量の減少は、製造 が困難でありそしてコストのかかるワクチン類使用の拡大をもたらす可能性を有 している。このことは特に、健康管理予算が非常に限定されておりそして呼吸病 、下痢病およびマラリアが流行している発展途上国において事実である。これは また、この抗原が有効な免疫化に通常必要とされている濃度では毒性を示す場合 、より安全な予防接種を提供し得る。抗原の量を減少させることによって、毒性 を示す反応の危険性が減少する。

インターロイキン類は、それらが有する免疫調節活性により、免疫原性外もしく は非免疫原性抗原に対する保護免疫応答を引き出す補助を与える。このようにし て、より大きい蛋白質、合成抗原、或は組換えＤＮＡ技術の生産物、のフラグメ ントを含有しているワクチン組成物は、それらをインターロイキン類と混合する ことによって、より活性のあるものにされ得る。

典型的に、予防接種食餌法は、「保護」免疫応答を刺激するために数週間から数 カ月の期間に渡る抗原投与を必要としている。保護免疫応答は、ワクチンに対し て特異性を示す特別な病原体もしくは病原体類による生産力のある感染から、免 疫化した宿主もしくは被験者を保護するに充分な免疫応答である。インターロイ キンは、これを抗原と一緒に投与しそして懸濁液内の鉱物上に吸着させたとき、 保護免疫応答の発生を促進し得る。このことにより、有効な予防接種食餌期間を 減少させることができる。ある場合には、これにより、１回の服用で保護免疫応 答を生じさせることができる。更に、本発明のワクチン調剤は４℃で充分に安定 であり、このワクチン調剤の製造、輸送および貯蔵を可能にする。

以下に示す実施例により本発明を更に説明する。

ＩＬ−１またはｒｈＩＬ−２のアジュバント効果ヘモフィルス属（■ａｅｍｏｐ ｈｉｌｕｓ）のタイプｂ　ＣＲＭ接合体（ＨｂＯＣ）の低服用量（０，１μｇ／ マウス）物を、ミョウバン（１００μｇ／マウス）の有り無し、そして１ｘｌＯ ”〜５ｘ２０’単位／マウスから成る種々の濃度のｒｈＩＬ−２、ｒｈＩＬ−１ ａまたはｒｈＩＬ−１βを用いて調合した。全てのワクチン類は、免疫化するそ の日に製造して、注射するまで４℃で保持した。これらのワクチンの製造で用い たインターロイキン類は、その調合日に再構成するか、或は−７０℃に保持した 希釈ストック（２５μｇ／ｍＬ）から回収した。５ｗ１ｓｓ−ｆｅｂｓｔｅｒマ ウス（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、　Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、　ＮＹ）のグル ープに、０週および２週目に、Ｑ、１ｍＬのワクチン調剤を筋肉内（１，Ｍ、） 注射した。種々の表の中に示されているように、血清サンプルを採取した。

Ａ、アジュバントとしてのｒｈｌＬ−２表１は、ミョウバン無し［（−）で示さ れているコラム］およびミョウバンとの組み合わせ［（＋）で示されているコラ ムコの両方で、マウスの予防接種におけるアジ、バンドとしてｒｈｌＬ−２を投 与し、たとき観察された結果を示している。抗体濃度はμｇ／ｍＬとして表され ており、そして抗原を１１μｇ投与した後２．４および６週間目に測定した。こ れらの試験で用いた抗原はＨｂＯＣであった。投与したｒｈｌＬ−２の用量範囲 は１ｘｌＯ’〜１ｘｌＯ’単位／マウスの範囲であった。

表１ ＨｂＯＣ単位　２週　４週　６週 ｕｇ　功旦　（リ　（−）　（＋）　（−＞　（＋）　（−）１組： ０．１　１，０３　４．７０　０．２８　７．８９　３．４６　８．１６　３． ６２０．１　１０’　２．２５　０．５１　９．３９　５．０１　１７．７７　 ５．８３０．１　１０’　０．３７　０．５５　４．７１　３．０４　５．３１ 　２．９１０．１−０．４６　＜０．１０　３．５３　０．４２　５，４６　３ ．５３２組： ０．１　１０”　１．０２　０．４０　６．３２　４．２１　５．９０　３．３ ２０．１　１０”　０．５４　０．７５　５．７７　４．７３　５．６０　４． ６１０．１　１０’　１．６８　＜０．１０　１２．９９　１．９５　１９．０ ６　１．２５０．１　１０’　０．２５　＜０．１０　５．９４　５．４６　３ ．９１　３．８２０．１−０．５３　０．３０　７．０９　２．６４　ｇ、３０ 　２．８２上に（−）で示したコラムで見られるように、ミョウバン無しのｒｈ ＩＬ−２は抗体生産に対して刺激効果を有している。例えば、２つの異なる実験 において、対照サンプル内に存在している抗体濃度は０．４２μｇ／ｍＬおよび ２．６２μｇ／ｍＬであった。

このアジュバント混合物にｒｈｌＬ−２と共にミョウバンが含まれているとき観 察された結果が、表１の（＋）で表されているコラムに示されている。再び、有 意な刺激効果が見られる。しかしながら、ミョウバンが存在していると、この抗 体応答の大きさは、ミョウバン無しの同一サンプルで見られる応答よりも有意に 上昇している（予防接種）。

４週の時点を再び考慮すると、ミョウバンが入っている（＋）抗体濃度は相当す るミョウバンが入っていない（−）抗体濃度よりも１０倍大きいことが分かる。

更に、明らかなｒｈｌＬ−２濃度依存性が存在しているが、これは、ミョウバン が入っていない（−）サンプルには見られない。特に、観察された相関関係は、 このｒｈｌＬ−２濃度がｌＸ１０５未満に減少したとき抗体濃度が上昇すること であった。ミョウバンと一緒に用いたｒｈｌＬ−２の場合、最大の抗体生産を刺 激すると見られる用量はマウス当たりおおよそ１ｘｌＯ’単位であった。

Ｂ、アジュバントとしてのｒｈｌＬ−１表２および３は、それぞれｒｈＩＬ−１ αおよびｒｈＩＬ　１βをアジュバントとして用いた免疫化から得られる結果を 示している。表２は、２週間の間隔での後免疫化で、抗ＰＲＰ抗体測定（μｇ／ ｍＬで表す）から得られたデータを表している。再び、ミョウバン有り（＋）ま たは無しく−）で行った。

表２ １組： ０．１　１０３１．．９６　１．０２　１４．６３　４．９４　１３．２５　４ ．９３０、ｌ　１０’　０．７０　２．５４　７．１６　５．１１　１２．４４ 　１１．１７０．１　１０５０．３３　１．４９　４．６９　７．０２　６．１ ４　８．７３０．１　−ＩＬ　（１，４６＜０．１０　３．５３　０．４２　５ ．４６　３．５３対照 ２組： ０．１　１０２　＜０．１０　１，０２　３．６８　４．３６　４．０７　３． ０００．１　１０”　］、、０６　１．１７　１２．３１　５．５４　８．７４ 　３．０８０．１　１０’　０．４７　１４７　４．７３　ｇ、９７　５．９８ 　６．５５０．１　１０５０．３４　１．００　８．５５　１６．７４　７．７ ７　１６．２９０．１−ＩＬＯ１５３０，３０７，０９２，６４８，３０２，８ ２対照 ｒｈＩＬ−１αおよびｒｈＩＬ−１βアジユノ（シト混合物から観察された結果 は、全体として、該ｒｈｌＬ−２の組で観察されたのと同様である。例えば表２ は、ｒｈＩＬ−１αをミョウバン無しでアジュバントとして投与したとき、リン フォカイン無しの同一ワクチンと比較して刺激効果が有ることを示している。（ −）で表されているコラムに示されているように、このアジュバント混合物内の ｒｈｌＬ−１αの量をマウス当たり１ｘｌＯ’から１ｘｌＯ”単位に減少させる と抗体生産を減少させる傾向が観察された。

ミョウバンの存在下、ｒｈｌＬ−１αもまた刺激効果を有していた。

驚（べきことに、ｒｈｌＬ−１αはその濃度を減少させたとき免疫応答を刺激す る能力が上昇することが示された。ミョウバン存在下でのｒｈＩＬ−１αの最適 アジュバント量は約１ｘｌＯ’であった。上記濃度での抗体濃度は、ミョウバン 無しく−）の同一サンプルよりも２〜３倍大きいことが見いだされた。

表３に示されているように、ｒｈｌＬ−１βをアジュバントとして用いたときも 同様の結果が観察された。表３のデータは、ミョウバンの有り無しで、アジュバ ントとしてのｒｈｌＬ−１βの濃度を変化させたときの、２．４および６週目に 行った抗体濃度測定の結果を要約したものである。２１個の実験グループの中で ６を除く全てにおいて、ミョウバンを用いた（＋）ワクチンは、ミョウバン無し く−）のワクチンよりも高い抗体濃度を生じさせた。

表３ １組： ０．１　１０３０．４１　０，９６　５．２７　４．０９　ｇ、３２　５．２２ ０．１　１０’　０．９０　０．６２　４．１３　３．３９　８．１５　６．３ ９０．１　１０５１．４６　０．４６　１３．３５　１．．７７　８，６０　１ ．．０６０．１．　−ＩＬ　０１４６　＜０．１０　３．５３　０．４２　５． ４６　３．５３対照 ２組： ０．１　１０２０．８５　０．１６　８．７６　０．０４　６．６６　１．９１ ０．１　１０３０．３０　０．４０　４．５７　０．６８　６．８７　１０．３ ３０．１　１０’　１．０８　０Ｊ６　５．７５　５．１５　５．１７　４．４ ７０．１　ｔｏ’　０．１９　０，３６　２．３４　３．０　４．９８　３，９ ２０．１　−ＩＬ　Ｏ，５３０，３０７，０９２，６４８，３０２，８２対照 実施例１１：Ｒ８ＶＦ蛋白質ワクチンに対するｒｈＩＬ−１α、工ｈＩＬ−１β 、ｒｈＩＬ−２およびそれらの混合物のアジュバント効果インターロイキン類を 用いて蛋白質ワクチンに対する抗体応答を増強させ得るか否かを測定するため、 種々の濃度の呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）のＦ蛋白質を、１ｘｌＯ’も しくは１ｘ１０５単位／マウスのｒｈｌＬ−２もしくはｒｈＩＬ　１α有り無し で、ミョウバン（最終的に１００　ｔｔ　ｇ／マウス）と−緒に調合した。５ｗ １ｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスのグループ（グループ当たり５匹の動物）を０週 および２週目に筋肉内注射で免疫化させた。表４に示されているようにして動物 から採血した。

３種の服用量から成るＲＳＶ　Ｆ蛋白質（１，０，１および０．０１μｇ／マウ ス）を投与した。これらの中で、０．０１μｇのみが使用した条件下で最適以下 であった。ミョウバン上独で領　０１μｇの蛋白質が与えられた対照グループに 対して、種々のインターロイキン類を含有しているワクチンを与えたグループで 見られた応答を比較したとき、Ｆ蛋白質への抗体応答に対するｒｈＩＬ−２もし くはｒｈｌＬ　１αの有意な効果（タイターで４倍の差）が見られた。しかしな がら、このｒｈＩＬ−２で処理したグループにおける応答は、１ｘｌＯ’単位／ マウス用量の対照よりも高く、これはＨｂＯＣにおける試験で得られた結果と同 様である。ＩＬ−１αを用いたとき、両方の用量共、対照に比較していくらか改 良された抗体応答を示しているように見られる。興味の持たれることには、１ｘ ｌＯ’単位／マウスから成るｒｈＩＬ−２およびｒｈｌＬ−１αの混合物は、い かなる相乗効果も示すことなくむしろ、対照に比較していくらか減少した応答を 示していたが、これは、これらのインターロイキン類の起こり得る拮抗相互作用 を示唆している。

表４ ＲＳＶ　Ｆ蛋白質ワクチンに対するｒｈｌｌ、−２のアジュバント効果表１は、 ミョウバン有り無しでｒｈｌＬ−２を用いたときの、ＨｂＯＣに対する免疫応答 を示す実験結果を示している。ミョウバン存在下での１ｘｌＯ３単位濃度のｒｈ ｌＬ−２では、単−投与後、ＨｂＯＣを基としたワクチンは４．７μｇ／ｍＬか ら成る抗体応答を刺激した。上記抗体濃度は、保護に必要な量として一般的に許 容される閾レベル以上である。

ミョウバン含有組成物内でのｒｈｌＬ−２安定性を試験する目的で、ＨｂＯＣ抗 原（２，５μｇ／ｖウス）を、１０４単位のｒｈＩＬ−２と混合し、燐酸アルミ ニウム上に吸着させた後４℃で保存した。表５はインビトロ安定性分析で観察さ れた結果を示している。この分析において、種々の濃度のｒｈＩＬ−２標準およ びＨｂＯＣワクチンと一緒に５ｘ１０３個のＣＴＬＬ−２細胞を培養した。１０ ％のＦＢＳが入っているＲＰＭＩ培地内で細胞を３７℃で２４時間培養した後、 ウェル当たり１゜０μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１６時間標識した。ミョウノく ンに吸着したｒｈｌＬ−２の量を見積もる目的で、この調合物を遠心分離してミ ョウバンをベレット化し、そしてｒｈＩＬ−２活性に関して上澄み液を分析した 。ミョウバン上に該ｒｈｌＬ−２の約２７３が吸着されていることが確認された 。表５に示されるように、燐酸アルミニウム吸収の後でｒ　ｈ、　Ｉ　Ｌ−２活 性を試験したとき、このリンフ才力インはその活性を２週間に渡って保持してい ることが認められた。

表５ ｒｈＩＬ−２安定性に関するインビトロ分析（１，ＯＵ／ｍＬ　ＩＬ−２Ａ＋Ｃ ＰＭ±ＳＤの［３Ｈ］チミジン組み込み）Ｂ、ｒｈＩＬ−２安定性に関するイン ビボ分析ｒｈＩＬ−２の安定性に関するインビボ分析を設計した。上述したよう にして予め保存したＨｂＯＣ／ミョウバン／ＩＬ−２ワクチンを用いてマウスを 免疫化した。２匹のＤＢＡ／２マウスから成る４つのグループを、連続して３週 間、ＣＦＡ、ミョウバン、ｒｈＩＬ−２／ミヨウバン、またはｒｈｌＬ−２、内 の１０μｇ　（蛋白質）ＨｂＯＣで免疫化した。注射後１週間でリンパ節を取り 出した後、１つの細胞懸濁液を得た。

分裂促進因子および種々の濃度のＤＴ、ＣＲＭおよびＴＴと一緒に３Ｘ１０５の ＬＮＧを培養した。１．０％のＮＭＳが入っているＲＰＭＩ培地内で細胞を３７ ℃で３日間培養し、ウェル当たり１．０μＣｊの［３Ｈ］チミジンで１６時間標 識した後、ＬＳカウンターを用いて数を数えるために収穫した。ＨｂＯＣ−ＣＦ Ａグループで有意なＴ細胞応答が観察された。しかしながら、２週および３週目 で、ｒｈｌＬ−２は増大したＴ細胞応答を誘発した。更に、Ｈｂ　ＯＣ単独でも 明らかにｒｈＩＬ−２を劣化から保護している。

同等物 常規以下の実験を用いることで、本分野の技術者は、本文中に記述した本発明の 特異的具体例に対する数多（の同等物を認識するか、或は確かめることができる であろう。上記同等物は、以下の請求の範囲に包含されるものと解釈される。

表６ ＨｂＯＣワクチンを用いたＩ　Ｌ、−２のインビボ安定性ＳＩ±ＳＤとしての最 大組み込み［３Ｈ］チミジンシンＯＣ開始１週目： 培地（ｘ　ｃｐｍ）　４５４　±２２　１９０　±１９　３８６　±３５　１２ ５　±８培地　１．１８５　±１７５　５９０　±４２　５５２　±４８　１８ ７　±１１ＤＴ　１６．５±０．４　１．１±０．０１．３±０．２　２．９± ０．ＯＣＲＭ　５０．６±０．５　１．３±０．０　１０．５±０．３　１．６ ±０．ＯＤＴ　５．６±０．８　８Ａ　２．２±０．２　ＮＡＣＲＭ　９８．１ ±８．１　１７．９±１．４　２５．２±１．６　３１．４±２，６ＴＴ　０． ４±０．１　０．２±０．０　０．５１　０．０　０．１±０．０＊　これらの グループは、１．０％の代わりに２０％のＮＭＳが与えられている。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条平成４年１月９日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．懸濁液内の鉱物上に吸着させた抗原およびアジュバント量のインターロイキ ンと、薬学的に許容される防腐剤と、の混合物から成る安定なワクチン組成物。
2. ２．該インターロイキンが、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β 、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、イン ターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、或はこれら の混合物から成る群から選択される請求の範囲１のワクチン組成物。
3. ３．該インターロイキンがヒトのインターロイキン−２である請求の範囲２のワ クチン組成物。
4. ４．該鉱物懸濁液がミョウバンの水懸濁液である請求の範囲１のワクチン組成物 。
5. ５．該抗原が、バクテリア、ウイルス、細胞微細成分、蛋白質、ペプチド、糖蛋 白質、炭水化物、寄生虫、菌・カビ、オンコジーン生産物、および癌細胞から成 る群から選択される抗原である請求の範囲１のワクチン組成物。
6. ６．該バクテリア抗原がバクテリア病原体からのものである請求の範囲５のワク チン組成物。
7. ７．該バクテリア病原体が、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃ ａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフ テリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、淋菌（ Ｎｃｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）、黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ） 、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎かん 菌（Ｋｌｅｂｓｉｏｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および破傷風菌（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）から成る群から選択される請求の範囲６のワク チン組成物。
8. ８．該抗原がバクテリア皮膜ポリマー、オリゴマー、或はそれらのフラグメント である請求の範囲１のワクチン組成物。
9. ９．該バクテリア皮膜ポリマー、オリゴマー、或はそれらのフラグメントが、イ ンフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎かん菌、緑膿菌または黄色ぶど う球菌である請求の範囲８のワクチン組成物。
10. １０．．該抗原が糖接合体に連成させられている請求の範囲１のワクチン組成物 。
11. １１．該糖接合体がジフテリア、破傷風、百日咳またはＣＲＭのバクテリアトキ シン、或はそれらのトキソイドから成る請求の範囲１０のワクチン組成物。
12. １２．該糖接合体がポリリボシルリボトールホスフェートそしてジフテリアトキ シンのＣＲＭ１９７から成る請求の範囲１０のワクチン組成物。
13. １３．該バクテリア抗原がバクテリア表面もしくは外膜蛋白質である請求の範囲 １のワクチン組成物。
14. １４．該バクテリア表面もしくは外膜蛋白質が、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、 淋菌またはカタル球菌のものである請求の範囲１３のワクチン組成物。
15. １５．該バクテリア表面蛋白質が化膿連鎖球菌から得られるＭ蛋白質である請求 の範囲１３のワクチン組成物。
16. １６．該ウィルス抗原が、呼吸シンシチウムウィルスのＦ蛋白質、呼吸シンシチ ウムウィルスのＮ蛋白質、呼吸シンシチウムウィルスのＧ蛋白質、ロタウィルス のＶＰ４ポリペプチド、ロタウィルスのＶＰ６ポリペプチド、ロタウィルスのＶ Ｐ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウィルスのエンベロープ糖蛋白質、ヘルペス糖 蛋白質ＢおよびＤ、そしてＢ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原から成る群から選択さ れる請求の範囲５のワクチン組成物。
17. １７．該防腐剤がチメロサール、フェノール、ベンジルアルコール、メチルもし くはエチルパラベン、２−フェノキシエタノール、或はｍ−クレゾールである請 求の範囲１のワクチン組成物。
18. １８．懸濁液内の鉱物上に吸着させたところの、抗原およびアジュバント量のイ ンターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インタ−ロイキン−２、イン ターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロ イキン−６またはインターロイキン−７の混合物から成る安定なワクチン組成物 。
19. １９．更に防腐剤を含む請求の範囲１８のワクチン組成物。
20. ２０．該防腐剤がチメロサール、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコ ール、メチルもしくはエチルパラベン、或は２−フェノキシエタノールである請 求の範囲１９のワクチン組成物。
21. ２１．該鉱物懸濁液がミョウバンの水懸濁液である請求の範囲１８のワクチン組 成物。
22. ２２．該抗原が、バクテリア、ウィルス、細胞微細成分、蛋白質、ペプチド、糖 蛋白質、炭水化物、寄生虫、菌・カビ、オンコジーン生産物、および癌細胞から 成る群から選択される抗原である請求の範囲１８のワクチン組成物。
23. ２３．該バクテリア抗原がバクテリア病原体からのものである請求の範囲２２の ワクチン組成物。
24. ２４．該バクテリア病原体が、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉ ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、髄膜炎 菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　 ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏ１ｅｒａｅ）、ジ フテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、淋菌 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅ ｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ）、黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎か ん菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および破傷風菌（Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）から成る群から選択される請求の範囲２３のワ クチン組成物。
25. ２５．該抗原がバクテリア皮膜ポリマー、オリゴマー、或はそれらのフラグメン トである請求の範囲１８のワクチン組成物。
26. ２６．該バクテリア皮膜ポリマー、オリゴマー、或はそれらのフラグメントが、 インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎かん菌、緑膿菌または黄色ぶ どう球菌である請求の範囲２５のワクチン組成物。
27. ２７．該抗原が糖接合体に連成させられている請求の範囲１８のワクチン組成物 。
28. ２８．該糖接合体がジフテリア、破傷風、百日咳またはＣＲＭのバクテリアトキ シン、或はそれらのトキソイドから成る請求の範囲２７のワクチン組成物。
29. ２９．該糖接合体がポリリボシルリボトールホスフェートそしてジフテリアトキ シンのＣＲＭ１９７から成る請求の範囲２８のワクチン組成物。
30. ３０．該バクテリア抗原がバクテリア表面もしくは外膜蛋白質である請求の範囲 １８のワクチン組成物。
31. ３１．該バクテリア表面もしくは外膜蛋白質が、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、 淋菌またはカタル球菌のものである請求の範囲３０のワクチン組成物。
32. ３２．該バクテリア表面蛋白質が化膿連鎖球菌から得られるＭ蛋白質である請求 の範囲３０のワクチン組成物。
33. ３３．該ウィルス抗原が、呼吸シンシチウムウィルスのＦ蛋白質、呼吸シンシチ ウムウィルスのＮ蛋白質、呼吸シンシチウムウィルスのＧ蛋白質、ロタウィルス のＶＰ４ポリペプチド、ロタウィルスのＶＰ６ポリペプチド、ロタウィルスのＶ Ｐ７ポリペプチド、ヒト免疫不全ウィルスのエンベロープ糖蛋白質、ヘルペス糖 蛋白質ＢおよびＤ、そしてＢ型肝炎のＳおよびプレＳ抗原から成る群から選択さ れる請求の範囲２２のワクチン組成物。
34. ３４．薬学的に許容される媒体および任意のアジュバント内の、懸濁液および薬 学的に許容される防腐剤内の鉱物上に吸着させた抗原とアジュバント量のインタ ーロイキンとの混合物から成る有効量の安定ワクチン組成物を脊椎動物宿主に投 与することから成る、抗原に対する免疫応答を引き出す方法。
35. ３５．該インターロイキンが、インターロイキン−１α、インターロイキン−１ β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、イ ンターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、或はそれ らの混合物から成る群から選択される請求の範囲３４の方法。
36. ３６．該鉱物懸濁液がミョウバンの水懸濁液である請求の範囲３４の方法。
37. ３７．該抗原が、バクテリア、ウイルス、細胞微細成分、蛋白質、ペプチド、糖 蛋白質、炭水化物、寄生虫、菌・カビ、オンコジーン生産物、および癌細胞から 成る群から選択される抗原である請求の範囲３４の方法。
38. ３８．薬学的に許容される媒体および任意のアジュバント内の、懸濁液内の鉱物 上に吸着させた抗原とアジュバント量のインターロイキン−１α、インターロイ キン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン −４、インターロイキン−５、インターロイキン−６またはインターロイキン− ７との混合物から成る安定なワクチン組成物の有効量を脊椎動物宿主に投与する ことから成る、抗原に対する免疫応答を引き出す方法。