ES2179105T5 - Adyuvantes proteinicos. - Google Patents
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
SE CONSIGUE UNA RESPUESTA INMUNE MODULADA FRENTE UN ANTIGENO MEDIANTE LA CO-ADMINISTRACION A UN HUESPED DEL ANTIGENO Y UNA HOLOTOXINA PERTUSSIS DETOXIFICADA GENETICAMENTE, ESPECIALMENTE UNA QUE MANTENGA SU INMUNOGENICIDAD. LA RESPUESTA INMUNE MODULADA PERMITE FACILITAR COMPOSICIONES INMUNOGENICAS, INCLUYENDO VACUNAS PEDIATRICAS MULTIVALENTES COMO LA DTP, QUE PRODUCEN UNA RESPUESTA INMUNE MODULADA EN AUSENCIA DE ADYUVANTES EXTRINSECOS COMO EL ALUMBRE. EL EFECTO ADYUVANTE CONSEGUIDO POR LA HOLOTOXINA PERTUSSIS DETOXIFICADA GENETICAMENTE PERMITE AL MENOS EL MISMO NIVEL DE EFECTO ADYUVANTE AL CONSEGUIDO CON EL OBTENIDO PREVIAMENTE POR EL ALUMBRE, SIN LOS EFECTOS SECUNDARIOS INDESEABLES DE ESTE.
Description
Adyuvantes proteínicos.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y trata particularmente de adyuvantes proteínicos, es
decir, materiales que modulan respuestas inmunitarias a un
antígeno.
Las vacunas se han usado durante muchos años
para proteger a los seres humanos y los animales contra una variedad
de enfermedades infecciosas. Tales vacunas convencionales consisten
en patógenos atenuados (por ejemplo, poliovirus), patógenos muertos
(por ejemplo, Bordetella pertussis) o componentes
inmunogénicos del patógeno (por ejemplo, toxoide de la difteria).
Algunos antígenos son altamente inmunogénicos y solos son capaces de
provocar respuestas inmunitarias. Otros patógenos, sin embargo, no
inducen, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora o
inducen sólo una respuesta inmunitaria débil.
La inmunogenicidad puede mejorarse
significativamente si los antígenos se
co-administran con adyuvantes. Los adyuvantes
mejoran la inmunogenicidad de un antígeno pero no son necesariamente
inmunogénicos ellos mismos.
Agentes inmunoestimulantes o adyuvantes
extrínsecos se han usado durante muchos años para mejorar las
respuestas inmunitarias del huésped a composiciones inmunogénicas
incluyendo vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son
inmunomoduladores que típicamente están conectados no covalentemente
a antígenos y se formulan para mejorar las respuestas inmunitarias
del huésped. Así, se han identificado adyuvantes que mejoran la
respuesta inmunitaria a antígenos aportados parenteralmente. Sin
embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden provocar
efectos secundarios no deseables, haciéndolos inadecuados para usar
en seres humanos y muchos animales. En efecto, sólo el hidróxido de
aluminio y el fosfato de aluminio (denominados colectivamente
alumbre) se usan habitualmente como adyuvantes en vacunas humanas y
veterinarias. La eficacia del alumbre para incrementar respuestas
de anticuerpos a los toxoides de la difteria y el tétanos está bien
establecida y, más recientemente, se ha usado alumbre como
adyuvante en una vacuna de HBsAg. Aunque la utilidad del alumbre
está bien establecida para algunas aplicaciones, tiene
limitaciones. Por ejemplo, es ineficaz para la vacunación de la
influenza y provoca incongruentemente una respuesta inmunitaria
mediada por células. Los anticuerpos producidos por antígenos en
los que se usa alumbre como adyuvante son principalmente del isotipo
IgG1 en el ratón, lo que puede no ser óptimo para la protección
mediante algunos agentes vacunales.
Por otra parte, los estudios en ratas han
demostrado que el alumbre actúa como un adyuvante de IgE (ref. 1 -
A través de esta solicitud, diversas referencias se indican entre
paréntesis para describir más a fondo el estado de la técnica al
que se refiere la invención. La información bibliográfica completa
de cada cita se encuentra al final de la memoria descriptiva,
precediendo inmediatamente a las reivindicaciones). Los estudios
con vacunas de toxoide de tétanos y difteria también indican que la
adsorción por alumbre de vacunas induce anticuerpos de IgE en seres
humanos (refs. 2, 3, 4). Por lo tanto, aunque la inclusión de una
sal de aluminio en una formulación de vacuna puede mejorar su
inmunogenicidad y potencia, el hecho de que pueda inducir granulomas
locales y anticuerpos de IgE que pueden contribuir a reacciones de
hipersensibilidad garantiza un examen cuidadoso de la práctica de
adsorción por alumbre de vacunas para uso en seres humanos y
animales.
Algunas características de adyuvantes deseables
incluyen:
- (1)
- falta de toxicidad;
- (2)
- capacidad para estimular una respuesta inmunitaria de larga duración;
- (3)
- simplicidad de fabricación y estabilidad en el almacenamiento a largo plazo;
- (4)
- una capacidad para producir respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales a antígenos administrados por diversas rutas, si se requiere;
- (5)
- sinergia con otros adyuvantes;
- (6)
- capacidad de interactuar selectivamente con poblaciones de células que presentan antígeno (APC);
- (7)
- capacidad para producir respuestas inmunitarias específicas para células T_{H}1 o T_{H}2 apropiadas;
- (8)
- capacidad para incrementar selectivamente niveles de isotipo de anticuerpo apropiado (por ejemplo, IgA) contra antígenos; y
- (9)
- que no contribuyan a reacciones de hipersensibilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
De relevancia para la presente invención es un
análisis del desarrollo de vacunas de pertussis presentado más
adelante.
\newpage
Así, la pertussis o tos ferina es una enfermedad
respiratoria grave provocada por la infección del tracto
respiratorio por el organismo gram negativo Bordetella
pertussis. La pertussis es una causa principal de morbidez en
niños y está implicada en 360.000 muertes anualmente (ref. 5). El
método más eficaz para controlar la expansión de la enfermedad ha
resultado ser el uso de programas de inmunización amplios. La vacuna
de pertussis de células enteras, que se observó que tenía eficacia
clínica en los 50, ha sido eficaz para controlar epidemias de
pertussis (refs. 6, 7, 8). El valor de la vacuna se ilustró cuando
Japón, Suecia y Gran Bretaña abandonaron la inmunización habitual
con pertussis en niños. Poco después, estos países experimentaron
epidemias importantes de pertussis (refs. 9, 10, 11, 12).
Aunque la vacuna de pertussis de células enteras
es eficaz para prevenir la incidencia y expansión de la enfermedad,
la aceptación y la toma de la vacuna ha estado limitada debido a
informes de efectos adversos asociados con la vacuna. Por lo tanto,
se creó un impulsó para la creación de una vacuna de pertussis de
componentes acelulares no reactogénica, eficaz y bien definida. Una
de las características clave de la vacuna celular es el componente
de toxina pertussis (PT) químicamente destoxificado. La presencia de
toxina pertussis natural en la vacuna de células enteras ha sido
una fuente de problemas ya que los estudios en modelos animales han
mostrado que puede inducir linfocitosis, sensibilización a
histaminas, potenciación de la anafilaxis y anticuerpos de IgE,
aumento de la secreción de insulina y muchos otros efectos
sistémicos (ref. 13). Las vacunas de pertussis acelulares difieren
con respecto a las combinaciones y cantidades de antígenos de
Bordetella pertussis incluidos en las vacunas, pero los
antígenos clave incluyen los aglutinógenos, pertactina,
hemaglutinina filamentosa (FHA) y toxina pertussis (PT). Aunque se
ha demostrado que la vacuna acelular es inmunogénica y de eficacia
comparable con la vacuna de células enteras, no ha sido tan eficaz
para prevenir la colonización bacteriana (ref. 14). Además, los
resultados de un estudio de campo en Suecia que comparaba las
vacunas de pertussis acelular y de células enteras indicaban que la
toxina pertussis inactivada con formaldehído presente en las
vacunas acelulares mostraba una evidencia de inversión a la
toxicidad (ref. 15). Por lo tanto, se requerían otros métodos para
inactivar la molécula de toxina pertussis.
Para vencer las desventajas de la
destoxificación química, varios grupos desarrollaron moléculas de
holotoxina mutante de pertussis genéticamente destoxificada (refs.
16, 17, 18, 19, 20, 21). Un candidato prometedor era el mutante
K9G129. No sólo se retenía la inmunogenicidad de la molécula, sino
que la toxicidad de esta toxina recombinante se disminuía mucho
(refs. 18, 19, 21). Además, la inmunización con el mutante K9G129
estimulaba las respuestas específicas a antígeno de pertussis tanto
humorales como celulares (ref. 22). Aunque muchos experimentos
clínicos basan la evaluación de la inmunogenicidad de una vacuna
solamente en la respuesta de los anticuerpos después de la
inmunización, los estudios indican un papel importante para la
inmunidad celular en la protección contra esta enfermedad. En
modelos animales, se ha demostrado que la respuesta inmunitaria
celular es importante en la respuesta protectora contra pertussis ya
que la transferencia adoptiva de células de animales convalecientes
en animales irradiados subletalmente confería protección de la
estimulación con organismos de Bordetella pertussis mientras
que la transferencia pasiva de suero inmunitario no lo hacía (refs.
23, 24). Un estudio retrospectivo en seres humanos indicaba que la
inmunidad mediada por células para Bordetella pertussis se
correlacionaba con una historia positiva de pertussis (ref. 25).
Después de la infección con pertussis natural en seres humanos, se
observaba una respuesta inmunitaria tanto de anticuerpos como
celular (ref. 26). Sin embargo, la inmunización con las vacunas de
células enteras o componentes acelulares daba como resultado
respuestas inmunitarias celulares específicas para antígeno de
pertussis variables (refs. 27, 28). Parecía que la destoxificación
química del componente de toxina pertussis destruía su
inmunogenicidad de células T mientras que las respuestas de los
anticuerpos estaban inalteradas (ref. 26). Por lo tanto, sólo la
molécula de toxina pertussis genéticamente destoxificada podía
usarse para estimular una respuesta inmunitaria tanto celular como
humoral.
El uso del mutante de PT recombinante, K9G129,
como un componente de vacuna de pertussis se ha establecido bien.
Se ha sugerido un número de diferentes formas de la vacuna. Dos
formulaciones se han evaluado en seres humanos. La primera
formulación consistía en 15 \mug del mutante de PT que estaba
adsorbido en alumbre con un total de 0,5 mg de alumbre por dosis
(refs. 22, 29), mientras que la otra formulación contenía 7,5 \mug
del mutante K9G129 así como 10 \mug de FHA y 10 \mug de
pertactina y también estaba adsorbido en alumbre (ref. 30). Estos
estudios indicaban que el candidato a vacuna de pertussis
destoxificada genéticamente no sólo era seguro, inmunogénico y
podía inducir una respuesta mediada por células, sino que cuando se
combinaba con los antígenos FHA y pertactina, también proporcionaba
mejor protección en la prueba de estimulación intracerebral que una
vacuna de pertussis de componentes destoxificados químicamente (ref.
30). Otras formulaciones sugeridas incluyen un componente de K9G129
tratado con formaldehído (ref. 31) y una vacuna celular derivada de
una cepa de Bordetella pertussis que produce la molécula de
toxina pertussis K9G129 genéticamente inactivada (ref. 32). El
tratamiento con formaldehído de la molécula de K9G129 alteraba la
inmunogenicidad de la célula ya que se inducían cantidades
inferiores de anticuerpos específicos. La capacidad protectora de la
molécula también se disminuía ya que era menos eficaz en el ensayo
de estimulación intracerebral (ref. 32). Sin embargo, la vacuna
celular recombinante derivada de la cepa que producía K9G129
resultaba ser tan eficaz como la vacuna de pertussis de células
enteras (ref. 32).
Aunque las formulaciones precedentes muestran
las ventajas de seguridad y eficacia mejoradas asociadas con el uso
de una molécula de toxina pertussis genéticamente destoxificada, no
se dirigen a los efectos adversos de la vacunación de DPT
(difteria, pertussis y tétanos) no asociada con el componente de
molécula de pertussis (refs. 33, 46). Todas las formulaciones
indicadas implicaban el uso de 0,3 mg de fosfato de aluminio (ref.
32) o 0,5 mg de hidróxido de aluminio (refs. 29, 30). Se
introdujeron sales de aluminio en las formulaciones de vacuna de DT
y DPT como un adyuvante que potenciaría respuestas fuertes de los
anticuerpos cuando los niveles de los toxoides o los números de
organismos de Bordetella pertussis se disminuyeran para
evitar reacciones adversas (refs. 34, 35) y el alumbre se usa ahora
habitualmente en estas vacunas como un adyuvante. Sin embargo, años
de experiencia de campo con estas vacunas de pertussis adsorbidas y
los estudios (refs. 36, 37) han demostrado que, aunque contienen
menor cantidad de los componentes de vacuna reactogénicos
identificados, sin embargo se precipitaban reacciones locales
(refs. 38, 39, 40, 41, 42). El examen histopatológico de abscesos
locales después de la vacunación revela inclusiones de hidróxido de
aluminio en células gigantes (ref. 38). La investigación de la
frecuencia de tales granulomas indicaba que estaban asociados con el
contenido de aluminio en la vacuna ya que los grupos inmunizados
con placebo que recibían sólo la fracción de aluminio de la vacuna
exhibían formación de abscesos con una velocidad de reacción
similar (ref. 43). Una evidencia adicional para apoyar el papel del
aluminio en estas reacciones locales se derivó de estudios que
comparaban vacunas de cólera y tétanos adsorbidas en adyuvante de
aluminio simples (refs. 44, 45). La inoculación profunda de la
vacuna en el músculo disminuye la incidencia de estos abscesos
pero, aunque técnicas mejoradas pueden prevenir la formación de
abscesos (ref. 39), la potenciación de respuestas de IgE por sales
de aluminio no está afectada.
Sería ventajoso proporcionar composiciones
inmunogénicas que tuvieran respuestas inmunitarias moduladas a los
antígenos constituyentes sin las desventajas de la toxicidad local y
la contribución a la hipersensibilidad de los adyuvantes
extrínsecos de la técnica anterior.
La presente invención se refiere a evitar los
problemas asociados con el uso de alumbre como un adyuvante en
composiciones inmunogénicas empleando una holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada, que puede ser por sí misma
inmunogénica, para efectuar la modulación de una respuesta
inmunitaria a un antígeno no perteneciente al género
Bordetella.
Aunque la eliminación de alumbre de
formulaciones de vacuna podría haber sido un sistema para afrontar a
los problemas asociados con el mismo, según se apunta previamente,
se incluyó alumbre en las formulaciones de vacuna para proporcionar
una respuesta inmunitaria mejorada a los antígenos en la
formulación. Podría esperarse, por lo tanto, que la eliminación de
alumbre condujera a una formulación menos eficaz y sería improbable
que se propusiera.
Sin embargo, la holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada proporciona sorprendentemente una
modulación de la respuesta inmunitaria de un antígeno no
perteneciente al género Bordetella que permite proporcionar
formulaciones de vacuna inyectables y otras composiciones
inmunogénicas que exhiben respuestas inmunitarias al menos
equivalentes a las alcanzadas usando alumbre como adyuvante.
EP-A-0 725 653
(WO 95/09649), relevante bajo el Artículo 54(3) EPC, describe
formas mutantes dobles atóxicas de toxina pertussis en las que
Glu^{129} en la subunidad S1 se ha sustituido por otro aminoácido.
Se describen composiciones adyuvantes, en particular para la
administración a las mucosas, que comprenden la toxina mutante
mencionada anteriormente, como un adyuvante, junto con otro
antígeno.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona el uso de una holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada en la que al menos uno de Arg^{9}, Arg^{13},
Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la
holotoxina se ha retirado o reemplazado, para la fabricación de un
medicamento inyectable que comprende dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada, para proporcionar una respuesta
inmunitaria potenciada por adyuvante a al menos un antígeno no
perteneciente al género Bordetella co-administrado
con dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada mediante
la misma ruta, siendo potenciadora dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada para el suministro de dicha respuesta
inmunitaria potenciada por adyuvante, en ausencia de un adyuvante
extrínseco, y siendo dicho al menos un antígeno no perteneciente al
género Bordetella (i) un antígeno de patógeno viral, (ii) un
antígeno de patógeno bacteriano no perteneciente al género
Bordetella o (iii) un antígeno de patógeno parasitario no
bacteriano y no viral.
La respuesta inmunitaria que es modulada por la
presencia de la holotoxina pertussis genéticamente destoxificada
puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. En
particular, la respuesta inmunitaria modulada puede ser una IgG
mejorada y/o una respuesta celular al otro antígeno.
El antígeno de patógeno viral puede
seleccionarse de una amplia gama de tales patógenos. Representantes
de tales patógenos incluyen paramixovirus, influenza y
hepatitis.
La holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada puede ser ella misma inmunoprotectora pero el efecto
inmunomodulador de la misma puede obtenerse en ausencia de una
respuesta inmunitaria a la holotoxina. El suministro de holotoxinas
pertussis genéticamente destoxificadas se describe en las patentes
de EE.UU. Nº 5.085.862 y 5.221.618, cedidas al presente
cesionario.
El término "genéticamente destoxificada",
según se usa, aquí tiene el mismo significado que en las Patentes
de EE.UU. mencionadas previamente Nº 5.085.862 y 5.221.618, a saber
un mutante de holotoxina pertussis que exhibe una toxicidad
residual de aproximadamente 1% o menos, preferiblemente menor que
aproximadamente 0,5% de la de la toxina natural. La toxicidad
residual se determina mediante ensayo de aglomeración de células
CHO y actividad de
ADP-ribosil-transferasa.
Tal holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada puede formarse mediante la mutagénesis de una
secuencia nucleotídica que codifica la holotoxina, según se
describe en las patentes mencionadas previamente, de modo que el al
menos un aminoácido se retira o reemplaza. También pueden retirarse
o reemplazarse múltiples aminoácidos. El al menos un aminoácido que
se retira o reemplaza está presente en la subunidad S1 y es
específicamente ARG^{9}, ARG^{13}, TRP^{26}, ARG^{58} y
GLU^{129}. Cuando se retiran o reemplazan múltiples aminoácidos,
se prefiere retirar o reemplazar (S1) ARG^{9} y GLU^{129}.
Cuando se efectúa tal mutación, se prefiere reemplazar ARG^{9}
por LYS^{9} y GLU^{129} por GLY^{129}. (Este mutante
específico se representa a veces aquí como K9G129).
Más adelante están las Tablas 1a y 2 que
contienen detalles de varias mutaciones de holotoxina pertussis que
pueden usarse como la holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada en las composiciones inmunogénicas proporcionadas
aquí, a saber los medicamentos cuya fabricación se proporciona
mediante el uso de acuerdo con la invención. (Las Tablas aparecen
al final del texto descriptivo). La Tabla 1b contiene detalles de la
caracterización in vitro de las mutaciones de la Tabla
1a.
Las composiciones inmunogénicas pueden contener
al menos un antígeno de Bordetella adicional, incluyendo
aglutinógenos, FHA y pertactina.
Las composiciones inmunogénicas pueden
formularse en ausencia sustancial de un adyuvante extrínseco como
una vacuna inyectable para administración a seres humanos o
animales. Tal composición de vacuna puede exhibir una respuesta de
IgE disminuida.
En una modalidad de la invención, las
composiciones inmunogénicas pueden formularse en ausencia sustancial
de alumbre como una vacuna multivalente que comprende la holotoxina
pertussis genéticamente destoxificada en una forma y cantidad
inmunoprotectoras junto con toxoide de difteria y toxoide del
tétanos como los otros antígenos, proporcionando de ese modo una
formulación de vacuna de DTP de la que está ausente el alumbre u
otro adyuvante extrínseco. Tales formulaciones de vacuna de DTP
habitualmente también contienen otros antígenos de
Bordetella, incluyendo aglutinógenos, FHA y pertactina.
El medicamento fabricado de acuerdo con el uso
proporcionado por la invención es útil para obtener una respuesta
inmunitaria modulada a un antígeno en un huésped, incluyendo un ser
humano; para tal propósito, el al menos un antígeno no
perteneciente al género Bordetella se administra al huésped,
y una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada se
coadministra al huésped en una cantidad suficiente para modular una
respuesta inmunitaria al otro antígeno en ausencia de un adyuvante
extrínseco.
Según se apunta previamente, la respuesta
inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o celular
y la respuesta inmunitaria modulada puede ser una respuesta
inmunitaria de IgE y/o celular mejorada. La administración de la
holotoxina pertussis y otro antígeno puede efectuarse administrando
al huésped una composición como la descrita previamente y
proporcionada de acuerdo con la invención.
En la presente invención, se coadministran
antígenos y adyuvantes. En esta solicitud, el término
"coadministración" significa administraciones simultáneas o
administraciones en un período de tiempo corto tal como entre varios
minutos u horas y hasta tres días. Las coadministraciones pueden
ser en sitios iguales o diferentes.
La presente invención se entenderá
adicionalmente a partir de la siguiente descripción con referencia a
las figuras. Las figuras 7 a 9 se mencionan junto con el Ejemplo
10, que, según se indica más adelante aquí, no está dentro del
alcance de la invención según se reivindica aquí. En las
figuras:
la figura 1 muestra la potenciación de la
administración de anticuerpo de IgE de suero murino mediante
composiciones inmunogénicas de la presente invención;
la figura 2 muestra la producción de anticuerpos
de IgG mediante las composiciones inmunogénicas de la presente
invención;
la figura 3 muestra la producción de anticuerpos
de IgG mediante vacunas multivalentes de la presente invención;
la figura 4 muestra la inducción de respuestas
inmunitarias celulares mediante vacunas multivalentes de la
presente invención;
la figura 5 muestra los fenotipos de respuesta
inmunitaria T_{h}1 y T_{h}2, según se determina mediante el
perfil de citoquinas en ratones inmunizados con ovalbúmina con PPD y
toxina pertussis PT genéticamente destoxificada (K9G12) como
adyuvante;
la figura 6 muestra los fenotipos de respuesta
inmunitaria T_{h}1 y T_{h}2 según se determina mediante
perfiles de inmunoglobulina IgG2a e IgGE específica para ovalbúmina
en ratones inmunizados con PPD y toxina pertussis genéticamente
destoxificada, PT (K9GK9);
la figura 7 muestra el número de ratones libres
de tumores en experimentos de inmunoterapia efectuados aquí. Se
inmunizaron seis grupos de ratones con cinco ratones por grupo con
medio de cultivo celular como un control y 10^{4} células de
melanoma vivas. La gráfica muestra el número de ratones que no tenía
tumores treinta días después de la estimulación;
la figura 8 muestra los volúmenes de los tumores
el día 30 a partir de dos de los seis grupos de ratones,
representados frente al número de días después de la estimulación
con 10^{5} células de melanoma vivas. Las cajas abiertas con las
líneas punteadas representan los cinco ratones que se inmunizaron
sólo con 10^{4} células irradiadas (grupo 2) y los círculos
cerrados conectados por las líneas sólidas representan los cinco
ratones inmunizados con células irradiadas más 1 \mug de K9G129
(grupo 3); y
la figura 9 muestra los volúmenes de tumores el
día 22. Los ratones se inmunizaron con medio de cultivo celular
como un control y 10^{4} células de melanoma irradiadas solas o
junto con CFA o concentraciones crecientes de K9G129. Los volúmenes
de los tumores de cada uno de los cinco ratones en los seis grupos
se muestran 22 días después de la estimulación con 10^{5} células
de melanoma vivas. Para los tres últimos grupos (ratones que
recibían K9G129), los números junto a las flechas muestran el número
de ratones que estaban libres de tumores.
En referencia a la figura 1, se ilustra la
potenciación de niveles de IgE séricos en ratones inmunizados con
una vacuna de DTP con adyuvante de alumbre, acelular, inactivada
químicamente y una vacuna acelular de rDTP sin adyuvante de
alumbre, que comprende el análogo de PT K9G129 genéticamente
destoxificado. Los resultados indican que los niveles de IgE
séricos en ratones inmunizados con la vacuna acelular de rDTP se
disminuían significativamente (p<0,05) con relación a la vacuna
acelular de DTP que contenía la molécula de toxina pertussis
convertida químicamente en toxoide.
En referencia a las figuras 2 y 3 y la Tabla 3,
se ilustra una comparación de niveles de anticuerpo específico para
antígeno producidos después de la inmunización de ratones con una
vacuna de células enteras de DTP con adyuvante de alumbre, una
preparación de vacuna acelular de DTP con adyuvante de alumbre y una
vacuna de DTP que contiene al análogo de PT genéticamente
destoxificado K9G129 sin adyuvante de alumbre. Los resultados
mostrados en la Tabla 3 indican que la respuesta de IgG
anti-PT y las concentraciones de neutralización de
CHO producidas por la vacuna acelular de DTP con adyuvante de
alumbre y la vacuna acelular de DTP recombinante sin adyuvante de
alumbre son equivalentes. Así, aunque la formulación recombinante
libre de alumbre demostraba una actividad potenciadora de IgE
disminuida, sin embargo retenía su eficacia como una vacuna de
pertussis según se indicaba por estas concentraciones de IgG
anti-toxina pertussis. Una evidencia adicional de la
retención de inmunogenicidad específica para PT se obtuvo a partir
de ensayos de neutralización de células CHO. Significativamente, se
detectaron niveles superiores de anticuerpos de IgG
anti-aglutinógeno 2+3 y anti-69 kD
(pertactina) en las muestras de suero de ratones inmunizados con
formulación recombinante libre de alumbre (p<0,05). Las
respuestas de IgG anti-toxoide de FHA eran
equivalentes en sueros obtenidos de ratones inmunizados con
cualquiera de las vacunas.
La figura 3 muestra los niveles de anticuerpo de
IgG anti-toxoide del tétanos y
anti-toxoide de la difteria en sueros de ratones
inmunizados con la vacuna de pertussis de células enteras, la vacuna
de DTP acelular de componentes definidos que contiene la molécula
de pertussis destoxificada con glutaraldehído o la vacuna de DTP
acelular recombinante libre de alumbre. Los componentes de toxoide
de difteria y tétanos en la última vacuna también estaban
desprovistos de alumbre. Los resultados indican que las
formulaciones acelulares inducen anticuerpos de IgG
anti-toxoide del tétanos y particularmente
anti-toxoide de la difteria significativamente
superiores según se medía mediante este ensayo. Por otra parte, la
formulación recombinante libre de alumbre inducía respuestas de IgG
anti-toxoide del tétanos y la difteria
significativamente superiores con relación a la vacuna DTP de
componentes acelulares.
La capacidad de las formulaciones de vacuna de
DTP para inducir respuestas inmunitarias celulares específicas para
el antígeno se evaluó in vitro y los resultados se muestran
en la figura 4. Esplenocitos derivados de ratones inmunizados con
las vacunas de DTP de células enteras, acelulares o acelulares
recombinantes libres de alumbre se cultivaron en presencia de los
antígenos de vacuna específicos. La vacuna de DTP de células
enteras inducía una respuesta celular anti-toxoide
de la difteria significativa aunque no en el mismo grado que la
generada por la vacuna de DTP de componentes acelulares. La vacuna
de componentes acelulares inducía una respuesta proliferativa
específica de antígeno de pertussis relativamente pobre con la
excepción de las respuestas anti-69 kD y
anti-toxoide de la difteria. Sin embargo, era
significativo el índice proliferativo específico de antígeno
notablemente incrementado inducido por la formulación acelular
recombinante libre de alumbre en respuesta a todos los antígenos
probados. La formulación recombinante inducía claramente los niveles
más altos de respuestas proliferativas específicas para antígeno de
cualquiera de las vacunas probadas.
El medicamento fabricado de acuerdo con el uso
proporcionado por la invención puede en una modalidad de tal
medicamento ser una vacuna de DTP acelular libre de alumbre que
contiene al análogo de PT genéticamente destoxificado K9G129. Así,
aunque la formulación libre de alumbre no contenga un adyuvante
extrínseco (por ejemplo, un mineral) sí contiene sin embargo un
adyuvante ya que el mutante K9G129 actúa no sólo como un antígeno
sino también como un adyuvante (es decir, un adyuvante proteínico).
Esta propiedad es evidente en las respuestas específicas para
antígeno de pertussis medidas mediante inmunoensayo enzimático
(figura 2). Eran evidentes respuestas de IgG
anti-aglutinógeno 2+3 y anti-69 kD
(pertactina) significativamente superiores en las muestras de suero
derivadas de ratones inmunizados con la formulación de vacuna de
pertussis acelular recombinante libre de alumbre mientras que las
respuestas específicas para toxoide de FHA eran equivalentes. Por lo
tanto, la nueva formulación inducía respuestas de anticuerpo
específicas para antígenos de vacuna de pertussis a niveles que
eran comparables a o mayores que los niveles inducidos por la vacuna
de pertussis acelular adsorbida en alumbre.
También se evaluó la actividad del adyuvante
intrínseco general del mutante K9G129 para otros antígenos de
vacuna (tales como los antígenos presentes en vacunas humanas, tales
como vacunas de combinación pediátricas). Se compararon las
respuestas de IgG específicas para toxoides del tétanos y la
difteria en suero obtenido de ratones inmunizados con las vacunas
de pertussis de células enteras o acelular adsorbidas en alumbre o
las vacunas recombinantes libres de alumbre (figura 3). Las
concentraciones de IgG específica para el tétanos y la difteria en
el suero de ratones inmunizados con la vacuna de células enteras
eran significativamente inferiores que las observadas en cualquiera
de los grupos inmunizados con DTP acelular. Aunque la vacuna de DTP
adsorbida en alumbre inducía respuestas específicas para el toxoide
significativamente superiores con relación al grupo inmunizado con
vacuna de células enteras, de todas las formulaciones de vacuna
probadas, la formulación libre de alumbre inducía las
concentraciones más altas de IgG específica para toxoide. Por lo
tanto, la actividad como adyuvante del mutante K9G129 no está
restringida sólo a antígenos de Bordetella. El medicamento
fabricado de acuerdo con el uso proporcionado por la invención puede
ser una vacuna multivalente que contiene antígenos protectores para
una pluralidad de patógenos.
Según se indica previamente, la presente
invención en una modalidad proporciona composiciones inmunogénicas,
adecuadas para usarse como, por ejemplo, vacunas. La composición
inmunogénica provoca una respuesta inmunitaria por el huésped al
que se administra incluyendo la producción de anticuerpos por el
huésped. Las composiciones inmunogénicas incluyen al menos un
antígeno no perteneciente al género Bordetella. Este antígeno
puede ser un patógeno inactivado o una fracción antigénica de un
patógeno, siendo el patógeno un virus o una bacteria particular o
un parásito como los definidos previamente aquí. El patógeno puede
inactivarse mediante un agente químico, tal como formaldehído,
glutaraldehído, \beta-propiolactona, etilenimina y
derivados, u otros compuestos. El patógeno también puede
inactivarse mediante un agente físico, tal como radiación UV,
radiación gamma, "choque térmico" y radiación por rayos
X.
Patógenos virales representativos de los que puede derivarse el antígeno incluyen paramixovirus, influenza y hepatitis.
Patógenos virales representativos de los que puede derivarse el antígeno incluyen paramixovirus, influenza y hepatitis.
Una fracción antigénica de una patógeno puede
producirse por medio de métodos de descomposición químicos o
físicos, seguidos, si se desea, por la separación de una fracción
por medio de cromatografía, centrifugación y técnicas similares. En
general, se obtienen a continuación componentes de bajo peso
molecular que, aunque están purificados, pueden tener baja
inmunogenicidad.
Alternativamente, pueden prepararse antígenos o
haptenos por medio de métodos sintéticos orgánicos, o, en el caso
de, por ejemplo, polipéptidos y proteínas, por medio de métodos de
DNA recombinante.
El medicamento se prepara como productos
inyectables, como soluciones líquidas o emulsiones. Los antígenos y
las composiciones inmunogénicas pueden mezclarse con portadores
fisiológicamente aceptables que son compatibles con los mismos.
Estos pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol,
etanol y combinaciones de los mismos. La vacuna puede contener
además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes o agentes tamponadores del pH, para mejorar
adicionalmente su eficacia. Las vacunas pueden administrarse
mediante inyección subcutáneamente o intramuscularmente.
Estas composiciones pueden tomar la forma de
soluciones, suspensiones, formulaciones de liberación sostenida y
pueden contener de 1 a 95% de las composiciones inmunogénicas de la
presente invención.
Los medicamentos se administran de una manera
compatible con la formulación para dosificación, y en una cantidad
tal para que sean terapéuticamente eficaces, protectores o
inmunogénicos. La cantidad que ha de administrarse depende del
sujeto que ha de inmunizarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad
del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos y,
si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por
células. Las cantidades precisas de antígeno y composición
inmunogénica que han de administrarse dependen del juicio del
médico. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son
fácilmente determinables por los expertos en la técnica y pueden
ser del orden de microgramos a miligramos. Regímenes adecuados para
la administración inicial y las dosis de refuerzo también son
variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida
por administraciones subsiguientes. La dosificación de la vacuna
también puede depender de la ruta de administración y variará de
acuerdo con el tamaño del huésped.
La concentración de antígenos en una composición
inmunogénica que constituye un medicamento cuya fabricación es
proporcionada mediante el uso de acuerdo con la invención es en
general de 1 a 95%. Una vacuna que contiene material antigénico de
sólo un patógeno es una vacuna monovalente. Las vacunas que
contienen material antigénico de varios patógenos son vacunas
combinadas y también pertenecen a la presente invención. Tales
vacunas combinadas o multivalentes contienen, por ejemplo, material
de diversos patógenos o de diversas cepas del mismo patógeno, o de
combinaciones de diversos patógenos.
En una modalidad, la composición inmunogénica es
útil para la generación de anticuerpos específicos para antígeno
que son ellos mismos útiles en la identificación específica de ese
antígeno en un inmunoensayo. Tales inmunoensayos incluyen ensayos
de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), RIAs y otros ensayos
de unión a anticuerpos sin enzimas ligadas o procedimientos
conocidos en la técnica. En ensayos de ELISA, los anticuerpos
específicos para el antígeno se inmovilizan sobre una superficie
seleccionada; por ejemplo, los pocillos de una placa de
microvaloración de poliestireno. Después de lavar para retirar
anticuerpos adsorbidos de forma incompleta, una proteína no
específica, tal como una solución de albúmina de suero bovino (BSA)
o caseína, que se sabe que es antigénicamente neutra con respecto a
la muestra de prueba, puede unirse a la superficie seleccionada.
Esto permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos sobre
la superficie inmovilizadora y así reduce el fondo provocado por
uniones no específicas de antígenos sobre la superficie. La
superficie inmovilizadora se pone a continuación en contacto con
una muestra, tal como materiales clínicos o biológicos, que ha de
probarse de una manera que conduce a la formación de un complejo
inmunitario (antígeno/anticuerpo). Esto puede incluir diluir la
muestra con diluyentes, tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG)
y/o solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. La muestra
se deja incubar a continuación durante de aproximadamente 2 a 4
horas, a temperaturas tales como del orden de aproximadamente 25ºC
a 37ºC. Después de la incubación, la superficie puesta en contacto
con la muestra se lava para retirar material no inmunocomplejado. El
procedimiento de lavado puede incluir lavar con una solución tal
como PBS/Tween o un tampón de borato.
Después de la formación de inmunocomplejos
específicos entre el antígeno en la muestra de prueba y los
anticuerpos específicos para el antígeno unidos, y el lavado
posterior, puede determinarse la presencia, e incluso la cantidad,
de formación de inmunocomplejo sometiendo al inmunocomplejo a un
segundo anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno. Para
proporcionar medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener
una actividad asociada, tal como una actividad enzimática, que
generará, por ejemplo, un desarrollo de color durante la incubación
con un sustrato cromogénico apropiado. La cuantificación puede
alcanzarse a continuación midiendo el grado de generación de color
usando, por ejemplo, un espectrofotómetro del espectro visible.
La descripción previa describe generalmente la
presente invención. Una comprensión más completa puede obtenerse
mediante referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos
ejemplos se describen solamente con propósitos de ilustración y no
pretenden limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios
en la forma y la sustitución de los equivalentes según puedan
sugerir o hacer convenientes las circunstancias. Aunque se han
empleado aquí términos específicos, tales términos están
considerados en un sentido descriptivo y no con propósitos de
limitación.
El Ejemplo 10 no está dentro del alcance de la
invención según se reivindica aquí; de acuerdo con esto, las
figuras 7 a 10, mencionadas aquí, no ilustran la invención
reivindicada.
Este Ejemplo describe la formulación de
vacunas.
La vacuna de células enteras de DTP y una vacuna
acelular compuesta experimental fueron producidas por Connaught
Laboratories Ltd. La vacuna de pertussis acelular compuesta se
adsorbió en alumbre (1,5 mg/dosis) y consistía en 10 \mug de
nitrógeno proteínico de toxina pertussis convertida en toxoide por
glutaraldehído, 5 \mug de nitrógeno proteínico de cada uno de FHA
y los aglutinógenos 2 y 3 y 3 \mug de pertactina junto con 5 Lf
de toxoide del tétanos y 25 Lf de toxoide de difteria por dosis. La
vacuna compuesta recombinante también contenía 5 \mug de
nitrógeno proteínico de cada uno de FHA y los aglutinógenos 2 y 3 y
3 \mug de nitrógeno proteínico de pertactina además de 5 Lf de
toxoide del tétanos y 25 Lf de toxoide de difteria por dosis. Sin
embargo, variaba con respecto a la otra vacuna acelular en que
contenía 20 \mug de nitrógeno proteínico de la holotoxina mutante
de PT recombinante, K9G129, y no estaba adsorbida en alumbre. La
molécula de toxina pertussis K9G129 así como los componentes de FHA
purificados, aglutinógenos 2+3 y pertactina se obtuvieron
individualmente de Connaught Laboratories Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la inmunización de
animales.
Se obtuvieron ratones BALB/c hembra que pesaban
de 15 a 18 gramos de Charles River Canada (St. Constant, Quebec).
Los ratones se alojaron en microaisladores y se usaron de acuerdo
con las pautas establecidas por the Canadian Council of Animal Care
(CCAC). Los animales estaban libres de patógenos específicos y las
habitaciones de alojamiento se controlaron con respecto a brotes
del virus de la hepatitis murina a través del uso de ratones
centinela. Se proporcionó agua a voluntad y la dieta estaba libre de
ovalbúmina. Los ratones fueron inmunizados el Día 0 con las
formulaciones de vacuna en grupos de seis. Una dosis de refuerzo de
vacuna se administró el Día 21. El Día 28 los animales fueron
sangrados a través de laceración de la vena yugular y
esplenectomizados. Las muestras de suero se almacenaron a -20ºC
hasta que se ensayaban.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe inmunoensayos específicos
para antígeno.
Las respuestas de IgG específica para antígeno
de vacuna se determinaron mediante EIA indirecto. Los antígenos de
interés eran toxina pertussis, pertactina, hemaglutinina
filamentosa, aglutinógenos, así como toxoides de difteria y
tétanos. Se revistieron microplacas de alta capacidad de unión
(Nunc) con 4 \mug/ml de cada uno de los antígenos previos en un
volumen de 50 \mul/pocillo de tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6.
Después de una incubación nocturna, las placas se lavaron y se
bloquearon sucesivamente con una solución al 0,1% de albúmina de
suero bovino (Sigma) durante una hora a temperatura ambiente. El
bloqueo en exceso se retiró y las microplacas se lavaron. Las
muestras de suero murino se diluyeron a continuación secuencialmente
en PBS-Tween 20 (0,05%) y se cultivaron en placas
en un volumen de 100 \mul. Las muestras se incubaron durante la
noche a 4ºC. La fracción específica para antígeno de anticuerpos de
IgG se detectó mediante un conjugado de anti-(IgG de ratón) ovina
conjugada a peroxidasa (Jackson Laboratories). Las placas se
revelaron con el sustrato TMB como previamente y se leyeron a
longitudes de onda dobles de 450 nm y 540 nm en el lector de
microplacas Multiskan MCC 340 MkII. Las concentraciones reactivas
se definieron como la dilución a la que la absorbancia de la muestra
de prueba era equivalente a la media más tres desviaciones estándar
de los valores de absorbancia del control negativo. Las medias
geométricas y los intervalos de confianza del 95% se calcularon y
los grupos se compararon usando la prueba t de Student.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la determinación de
perfiles de la subclase de IgG específica para ovalbúmina.
Se midieron las concentraciones de IgG, IgG1 e
IgG2a específicas para ovalbúmina en muestras de suero murino
mediante EIA indirecto. En el ensayo de IgG2a, se revistieron
microplacas de 96 pocillos Nunc Maxisorp (Gibco/BRL) con una
fracción de IgG de anticuerpo policlonal
anti-ovalbúmina de conejo (Cappell Laboratores)
diluida en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6, y se revistieron
durante la noche a temperatura ambiente. Las respuestas de IgG e
IgG1 específicas para ovalbúmina se midieron sobre microplacas
revestidas directamente con ovalbúmina (Sigma) diluida hasta una
concentración de 10 \mug/ml en tampón de carbonato 50 mM. Al día
siguiente, las microplacas se lavaron en PBS-T y se
bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con una solución
de leche desnatada en polvo al 0,1% diluida en
PBS-T. Después de una etapa de lavado adicional, una
solución de 10 \mug/ml de ovalbúmina (Sigma) diluida en tampón de
carbonato 50 mM, pH 9,6, se añadió al ensayo específico para IgG2a.
Este revestimiento de antígeno se incubó durante una hora a
temperatura ambiente y fue seguido por una etapa de lavado.
La siguiente etapa en el ensayo requería la
adición de las muestras de suero murino. En el ensayo de IgG2a, las
muestras de suero se diluyeron en serie tres veces empezando con una
dilución inicial de 1:40 y terminando con una dilución de 1:87480.
Los ensayos de IgG e IgG1 se llevaron a cabo con muestras de suero
diluidas tres veces empezando con una dilución inicial de 1:360 y
acabando con una dilución final de 1:787320. Las muestras de suero
se diluyeron en PBS-T y se añadieron a los pocillos
de las microplacas en volúmenes de 100 \mul. Las placas se
incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, las placas se
lavaron y las subclases de anticuerpos de IgG específica para
ovalbúmina se detectaron con conjugados de anti-(IgG de ratón) de
rata biotinilados específicos para cada subclase de anticuerpo de
IgG (conjugado de IgG2a, derivado del clon R19-15 y
obtenido de Pharmingen, conjugado de IgG1, derivado del clon
LO-MGI-2 y obtenido de Serotec),
mientras que las respuestas de IgG se detectaron con una dilución
de 1:50.000 de una anti-(IgG de ratón) ovina marcada con peroxidasa
(específica para Fc\mu, Jackson Laboratories). Los anticuerpos
monoclonales conjugados se diluyeron hasta una concentración de 2
\mug/ml y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.
Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada a peroxidasa
a cada pocillo de las placas que contenía un conjugado biotinilado
a una concentración de 500 mg/ml. Las placas se incubaron durante
una hora a temperatura ambiente. La IgG específica para el antígeno
unida y los anticuerpos de la subclase de IgG se detectaron mediante
la adición del sustrato de peroxidasa, TMB al 10% (ADI Diagnostics)
diluida en peróxido de hidrógeno al 0,005% (Fisher Scientific). Se
dejó que las reacciones avanzaran durante un período de diez
minutos, en cuyo punto se terminaron mediante la adición de ácido
sulfúrico 1M (Fisher Scientific) a cada pocillo. Las microplacas se
leyeron en un lector de microplacas (Multiskan MCC 340MkII, Flow
Laboratories) a longitudes de onda dobles de 450 nm y 540 nm. Las
concentraciones reactivas se definieron como la última dilución a la
que la absorbancia de la muestra de prueba era equivalente a la
media más tres desviaciones estándar de los valores de absorbancia
del control negativo. Las medias geométricas se calcularon sobre
datos transformados logarítmicamente y se expresaron con intervalos
de confianza del 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe inmunoensayos de IgE
total.
Los niveles de IgE total en suero se
determinaron mediante EIA indirecto. Se revistieron inmunoplacas
Nunc (Gibco/BRL) a temperatura ambiente durante la noche con un
antisuero policlonal anti-(IgE de ratón) ovino (Serotec) diluido en
tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6. Al día siguiente, las placas se
lavaron en PBS que contenía Tween 20 (J.T. Baker) al 0,05% y a
continuación se bloquearon con aminoácidos de caseína (Difco) al
0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Después de que la
solución de bloqueo en exceso se eliminara por lavado de las
placas, las muestras de suero murino se diluyeron en serie tres
veces en el diluyente de ensayo y se dispusieron en placas sobre la
microplaca a 100 \mul por pocillo. Las muestras se incubaron
durante la noche a 4ºC. Para detectar los anticuerpos de IgE unidos,
un anticuerpo monoclonal anti-(IgE de ratón) de rata biotinilado
(Serotec) se añadió a cada pocillo a una concentración hasta 2
\mug/ml y se incubó durante una hora a temperatura ambiente.
Después de lavar, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa
(Dimension Laboratories) a cada pocillo. La cantidad de IgE unida a
los pocillos se determinó añadiendo el sustrato enzimático,
tetrametilbencidina (TMB) (ADI Diagnostics) al 10% en agua con
peróxido de hidrógeno al 0,005% (Fisher Scientific). La reacción se
detuvo después de diez minutos con ácido sulfúrico 1M (Fisher
Scientific). La absorbancia de los pocillos se midió a 450 nm con
una corrección del fondo a 540 nm sobre un lector de microplacas
Multiskan MCC 340 MkII (Flow Laboratories). Los niveles de IgE en
suero se cuantificaron calibrando las absorbancias de la muestra
frente a una curva estándar generada mediante una proteína de
mieloma murino de IgE diluida en serie desarrollada sobre cada
placa. Las medias geométricas y los intervalos de confianza de 95%
se calcularon para cada grupo de tratamiento y los grupos se
compararon usando la prueba t de Student y p<0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe al determinación de
inmunoglobulinas de IgGF específicas para ovalbúmina.
Las concentraciones de IgE específica para
ovalbúmina en los sueros de ratones inmunizados se determinaron
mediante el uso de un EIA de captura de antígeno indirecto.
Brevemente, microplacas Nunc Maxisorp (Gibco/BRL) se revistieron
con una fracción de IgG anti-ovalbúmina de conejo
(Cappell Laboratories). Las placas se incubaron durante la noche a
temperatura ambiente. Al día siguiente, después de lavar en
PBS-T, las placas se bloquearon con una solución de
leche desnatada en polvo al 0,1% diluida en PBS-T
durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, una
solución de ovalbúmina diluida hasta 10 \mug/ml en tampón de
carbonato 50 mM, pH 9,6, se añadió a cada pocillo en volúmenes de
100 \mul. Después de una hora de incubación a temperatura
ambiente, la solución de ovalbúmina se separó por lavado de las
placas. Las muestras de suero murino se diluyeron a continuación en
serie tres veces en PBS-T a una dilución inicial de
1:40 y una dilución final de 1:87480. Se añadieron muestras de 100
ml por pocillo y se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de
lavar al día siguiente, los anticuerpos de IgE específicos para
ovalbúmina unidos a las placas se detectaron usando un anticuerpo
monoclonal anti-(IgE de ratón) de rata (clon
LO-ME-2, Serotec) diluido hasta 2
\mug/ml en PBS-T. Después de una hora más de
incubación a temperatura ambiente, este anticuerpo se separó por
lavado y se añadió estreptavidina conjugada a peroxidasa (Vector
Laboratories) a cada pocillo a una concentración de 500 ng/ml. La
cantidad de IgE específica para ovalbúmina en las muestras de suero
murino se detectó añadiendo el sustrato de peroxidasa,
tetrametilbencidina (TMB) (ADI Diagnostics) al 10% en peróxido de
hidrógeno al 0,005%. Se dejó que se desarrollara el color en los
pocillos durante quince minutos y las reacciones se detuvieron
mediante la adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 1M (Fisher
Scientific). La absorbancia de los pocillos se midió en un lector
de microplacas (Multiskan MCC 340 MkII, Flow Laboratories) a 450 nm
con una lectura a 540 nm para la corrección del fondo. Las
concentraciones reactivas se definieron como la última dilución a la
que el valor de la absorbancia de la muestra de prueba era
equivalente a la media de los valores de absorbancia derivados de
un control de suero negativo más tres desviaciones estándar
(134.139). Las medias geométricas se calcularon sobre datos
transformados logarítmicamente y se expresaron con intervalos de
confianza de 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la determinación de
perfiles de citoquina murina.
Los niveles de IL-4 e
IFN-\gamma se determinaron en un EIA de tipo
sándwich. Brevemente, microplacas Nunc Maxisorp de 96 pocillos
(Gibco/BRL) se revistieron durante la noche a temperatura ambiente
con anticuerpos monoclonales de rata específicos para citoquina.
Estos anticuerpos se obtuvieron de Pharmingen y se derivaban de los
siguientes clones respectivos: IL-4, clon 11B11;
IL-5; IFN-\gamma, clon
R4-6A2. Los anticuerpos monoclonales de diluyeron
hasta una concentración de 2 \mug/ml en tampón de carbonato 50 mM,
pH 9,6. Al día siguiente, las placas se lavaron en
PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) y los
sitios de unión no específica se bloquearon mediante la adición de
una solución de albúmina de suero bovino (Sigma) al 1% diluida en
PBS-T. Después de la incubación durante 1 hora a
temperatura ambiente, el bloqueo en exceso se lavó de las placas y
sobrenadantes de cultivo no diluidos se añadieron a los pocillos
por duplicado. Los patrones recombinantes apropiados para cada
citoquina (IL-4 recombinante obtenida de
Pharmingen, IFN-\gamma recombinante adquirido de
Genzyme) se diluyeron hasta las concentraciones apropiadas
(concentración inicial de 100 mg/ml o 1000 mg/ml para EIA de
IL-10) y se diluyeron en serie tres veces en RMP
1640 (Sigma) que contenía suero bovino fetal (SBS) al 10%. Los
patrones se dispusieron en placas a 100 \mul/pocillo y las
microplacas se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de un
lavado vigoroso en PBS-T, las citoquinas unidas se
detectaron usando un anticuerpo monoclonal biotinilado específico
para cada citoquina y se diluyeron hasta una concentración de 2
\mug/ml en PBS-T. Los anticuerpos se obtuvieron
de Pharmingen y se derivaban de los siguientes clones:
IL-4, clon BVD6-24G2;
IFN-\gamma, clon XMG1.2. Después de una etapa de
incubación de una hora a temperatura ambiente, se añadió una
preparación de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Vector
Laboratories) diluida hasta una concentración de 500 mg/ml. Se
realizó un lavado final después de una incubación de una hora a
temperatura ambiente de la preparación de estreptavidina. Las
placas se desarrollaron mediante la adición del sustrato, TMB al 10%
en agua con peróxido de hidrógeno (Fisher Scientific) al 0,05%. Se
dejó que las reacciones avanzaran hasta que se alcanzaba una
intensidad de color adecuada y se detuvieron mediante la adición de
100 \mul/pocillo de una solución 1M de ácido sulfúrico (Fisher
Scientific). Las absorbancias de los pocillos de reacción se leyeron
a longitudes de onda dobles (450 nm y 540 nm) sobre un lector de
microplacas Multiskan MCC 340 MkII (Flow Laboratories).
Las concentraciones de citoquinas en los
sobrenadantes se cuantificaron calibrando las absorbancias de la
muestra frente a las absorbancias de los patrones de concentraciones
conocidas usando el algoritmo de ajuste de curvas logístico para
ajustar la curva con un coeficiente de correlación mínimo de 99,9.
Se usó el paquete de soporte lógico ELISA+ (Meddata) para
cuantificar las cantidades de citoquinas presentes en los
sobrenadantes basándose en las curvas estándar generadas sobre cada
placa.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe respuestas inmunitarias
celulares específicas para antígeno.
Se obtuvieron esplenocitos murinos de los
ratones BALB/c inmunizados con vacuna el día 28. Los bazos se
disociaron en una suspensión de células simples y se lavaron tres
veces en medio RPMI 1640 (Sigma). Se realizó un conteo de células
usando el método de exclusión con azul de tripano y las células se
ajustaron hasta una concentración de 2x10^{6} células/ml. Los
antígenos (toxoide pertussis, pertactina, FHA, aglutinógenos y
toxoides de difteria y tétanos no adsorbidos en alumbre se
diluyeron hasta una concentración de 5 \mug/ml en medio RPMI 1640
que contenía suero bovino fetal al 10%. Los antígenos se diluyeron a
continuación en serie dos veces hasta una concentración de 78
ng/ml. Las células se añadieron a continuación a cada pocillo a una
concentración final de 1x10^{5} células/pocillo. Los cultivos se
dejaron incubar a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante 72
horas. Al final de este período, las células se sometieron a
impulsos con 0,5 \muCi/pocillo de timidina tritiada (Amersham)
diluida en PBS estéril (Sigma). Después de 18 horas adicionales de
incubación, las células se recogieron sobre papel de filtro de
fibra de vidrio usando un recogedor de 96 pocillos (Canberra
Packard) y los conteos radiactivos se leyeron en un contador beta
Matrix 96 (Canberra Packard). Los resultados se expresaron como
índices de estimulación que se calculaban dividiendo las medias de
los conteos de prueba por las medias de los conteos de fondo en
cada placa. Cada muestra se ensayó por triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la capacidad de
anticuerpos para neutralizar toxina pertussis en el ensayo de
neutralización de células CHO.
La capacidad de los anticuerpos inducidos por
las vacunas de pertussis para neutralizar toxina pertussis se
determinó en el ensayo de células CHO según se describe por
Granstrom y otros (ref. 47). La última dilución de anticuerpo a la
que no podían observarse efectos morfológicos significativos se
definió como la concentración neutralizadora. Los resultados se
expresaron como concentraciones neutralizadoras recíprocas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra el uso de holotoxina
pertussis genéticamente destoxificada para conferir protección
profiláctica contra el desarrollo de tumores.
Así, se usó el modelo de melanoma de ratón B16
(ref. 54) para determinar la eficacia de K9G129 como un adyuvante
en la inmunoterapia del cáncer. Cuando se inyectaban subcutáneamente
ratones C57B1/6 con cepa B16-F1 singeneica viva de
células de melanoma B16, aparecían tumores después de
aproximadamente 10 días y crecían progresivamente de una manera
exponencial. La aparición de tumores era directamente proporcional a
la dosis de células inyectadas, por ejemplo, los tumores se
formaban antes cuando los ratones se inyectaban con 10^{6} células
que con 10^{4} células. Los tumores podían retrasarse inmunizando
los ratones con células de melanoma B16 que se habían irradiado en
primer lugar con 10.000 rads. Este retraso también era dependiente
de la dosis. Inmunizar con 10^{6} células irradiadas provocaba un
retraso mayor en la aparición de los tumores que inmunizar con
10^{5} células irradiadas, cuando los ratones se estimulaban
subsiguientemente con 10^{5} células vivas. Inmunizar con
10^{4} células irradiadas no provocaba un retraso significativo en
el crecimiento del tumor.
La eficacia de K9G129 como un adyuvante se probó
midiendo su capacidad para retrasar el crecimiento de tumores
cuando se combinaba con 10^{4} células irradiadas en un
experimento de inmunización. Seis grupos de ratones con cinco
ratones por grupo se inmunizaron con:
1) medio de cultivo celular (control)
2) 10^{4} células irradiadas
3) 10^{4} células irradiadas + 1 \mug de
K9G129
4) 10^{4} células irradiadas + 5 \mug de
K9G129
5) 10^{4} células irradiadas + 10 \mug de
K9G129
6) 10^{4} células irradiadas + CFA (adyuvante
completo de Freund).
A los ratones se les administró una dosis de
refuerzo de la misma manera dos semanas más tarde y a continuación
dos semanas después del refuerzo se estimularon con 10^{5} células
de melanoma B16 vivas. Se controló la aparición de tumores y el
tamaño de los tumores crecientes se midió con calibres, anotando
tanto la longitud como la anchura. El volumen de los tumores se
calculó aplicando estas medidas a la forma de un elipsoide.
K9G129 era eficaz de una manera dependiente de
la dosis para retrasar el comienzo del crecimiento del tumor.
Treinta días después de la estimulación con 10^{5} células de
melanoma vivas, no había ratones sin tumores en los grupos que no
recibían inmunización (grupo 1), recibían células irradiadas solas
(grupo 2) o células irradiadas con CFA (grupo 6). Tampoco había
ratones libres de tumores en el grupo que había recibido células
irradiadas con 1 \mug de K9G129 (grupo 3). Sin embargo, había dos
y cuatro ratones, respectivamente, que no tenían tumores de los
grupos que habían recibido células irradiadas con 5 \mug y 10
\mug de K9G129 (grupos 4 y 5) (figura 7). Estos resultados
muestran un gran retraso en la aparición de tumores mediado por dos
concentraciones superiores de K9G129.
Incluso la concentración más baja de K9G129
usada provocaba un retraso en la aparición de tumores. Cuatro de
cinco ratones en el grupo 3 (células irradiadas + 1 \mug de
K9G129) tenían tumores aparecidos después de que los tumores
hubieran empezado a crecer en los ratones que se habían inmunizado
con células irradiadas solas (grupo 2) (figura 8). La eficacia de
K9G129 para retrasar el crecimiento de tumores se demuestra
adicionalmente comparando los volúmenes de los tumores de ratones
individuales en los diversos grupos, 22 días después de la
estimulación con células de melanoma vivas. Los tumores son
inexistentes o sus tamaños son generalmente inferiores en ratones
que se inmunizaban con células irradiadas y K9G129 que en ratones
inmunizados con células irradiadas solas o junto con CFA (figura
9).
Estos resultados indican que K9G129 puede actuar
como un adyuvante en la inmunoterapia del cáncer para incrementar
la respuesta inmunitaria hacia células tumorales.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la generación de una
respuesta de Th1 a un inmunógeno con el adyuvante análogo de toxina
pertussis S1 (K9G129).
Uno de los factores clave implicados en la
potenciación de diferentes subclases de inmunoglobulina, incluyendo
IgE, es la presencia de mediadores solubles conocidos como
citoquinas. El control de la producción de IgE es regulado por una
variedad de citoquinas que no sólo posee funciones efectoras
directas tales como la inducción del cambio del isotipo de
inmunoglobulina, sino también actúan para regular cruzadamente la
producción de otras citoquinas. En el ratón, IL-4
actúa no sólo para inducir el cambio de los isotipos IgE e IgG1,
sino también actúa para inhibir la secreción de IgM, IgG3, IgG2b e
IgG2a (ref. 48). Por otra parte, IFN-\gamma actúa
para estimular la producción de IgG2a e IgG3 mientras que inhibe la
síntesis de IgG1, IgG2b e IgE (ref. 48).
En un esfuerzo para organizar y racionalizar los
efectos múltiples y reguladores cruzados de las citoquinas, se ha
descrito un sistema para describir los diversos modelos de secreción
de citoquinas (ref. 49). Mosmann y Coffman (ref. 49) definieron dos
subgrupos distintos de células T CD4^{+} murinas basándose en sus
modelos diferenciales de secreción de citoquinas. Usando clones de
células T a largo plazo, pudieron mostrar que un grupo de células,
definido como Th2, secretaban IL-4,
IL-5 e IL-10, mientras que otro
grupo de células, definido como Th1, secretaba
IL-2, IFN-\gamma y
TNF-\beta. Estos dos perfiles distintos de
citoquinas también se correlacionaban con la producción de
inmunoglobulinas ya que los clones Th1 proporcionaban ayuda a los
linfocitos B para producir IgG2a mientras que los clones Th2
promovían la secreción de IgG1 e IgE por células B (48, 50, 51). Un
trabajo ulterior de Romagnani y colaboradores demostraba la
existencia de estos subgrupos de células T también en seres humanos
(ref. 52).
Aunque la diferenciación inicial de perfiles de
citoquina Th1/Th2 se definió sobre la base de modelos de citoquinas
in vitro de clones de células T individuales, las
definiciones se han ampliado para describir los fenotipos de
citoquina resultantes de la inmunización o la infección (ref. 48,
53). Estos fenotipos no son tan claramente polares como los
observados en el análisis clonal original y se definen mediante una
variedad de citoquinas diferentes. Así, una respuesta fenotípica
Th1 se caracteriza por un incremento significativo en citoquinas de
tipo Th1 (relaciones superiores de
IFN-\gamma:IL-4) con relación a
fenotipos de respuesta inmunitaria Th2. Esta clasificación también
se amplia a los perfiles de subclases de inmunoglobulinas
específicas para antígeno donde los fenotipos Th1 se presentan como
relaciones de IgG2a:IgE superiores con relación a las respuestas
del tipo Th2.
La figura 5 muestra el perfil de citoquinas en
ratones inmunizados con albúmina y potenciados con adyuvante de PPD
y PT(K9G129). PPD es un adyuvante que produce una respuesta
inmunitaria Th1.
Se obtuvieron esplenocitos de ratones
inmunizados con ovalbúmina junto con rPT S1(K9G129) o PPD
como adyuvantes. Las células de bazo de cuatro ratones en cada
grupo de tratamiento se reunieron y a continuación se volvieron a
estimular in vitro con ovalbúmina sola (sin adyuvante). Los
sobrenadantes se recogieron a continuación de estos cultivos y los
niveles de IFN-\gamma e IL-4 se
determinaron mediante EIA. Se obtuvieron relaciones de
IFN-\gamma:IL-4 similares a partir
de cultivos derivados de ratones inmunizados con S1(K9G129) o
PPD como una adyuvante. Según se describe previamente, una relación
superior de citoquinas
IFN-\gamma:IL-4 es característica
de una respuesta inmunitaria Th1.
\newpage
La figura 6 muestra las respuestas de IgG2a e
IgE específicas para ovalbúmina de ratones BALB/c inmunizados con
ovalbúmina y el análogo de PT S1(K9G129) o PTD como
adyuvantes. La gráfica de barras indica que la inmunización con el
análogo de PT S1(K9G129) daba como resultado relaciones de
IgG2a:IgE específicas para ovalbúmina similares a las obtenidas
después de la inmunización con PPD. Según se describe previamente,
una relación de IgG2a:IgE alta es característica de una respuesta
inmunitaria Th1. Los resultados en las figuras 5 y 6 indican así que
el potencial con adyuvante PT(K9G129) produce una respuesta
inmunitaria Th1 en ratones.
Resumiendo esta descripción, la presente
invención proporciona el uso de una holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada, que también puede ser inmunogénica,
como un adyuvante proteínico en lugar de adyuvantes extrínsecos
convencionales, particularmente alumbre, para la fabricación de un
medicamento inyectable para usar para alcanzar una respuesta
inmunitaria modulada a un antígeno no perteneciente al género
Bordetella sin los efectos secundarios adversos del
alumbre.
\vskip1.000000\baselineskip
Notas:
La numeración de aminoácidos corresponde a las
posiciones en las subunidades naturales.
Todas las mutaciones están en la subunidad S1 a
no ser que se especifique que estén en S2, S3 o S4.
II indica el uso de un codón alternativo.
\ding{115} indica un residuo o residuos
suprimidos.
Tipo salvaje se refiere a PT expresada a partir
del operón TOX no mutado en B. parapertussis.
x mutantes cuyo uso no está incluido dentro del
alcance de la invención según se reivindica aquí.
Notas:
La toxicidad residual es la relación de la
concentración de PT aparente determinada mediante el ensayo de
aglomeración de células CHO a la concentración real de mutantes de
PT determinada mediante ELISA expresada como un porcentaje.
La actividad ADPR es la extensión de la
ribosilación por ADP de transducina bovina catalizada por un análogo
de PT, con relación a la catalizada por una concentración igual de
PT de tipo salvaje, expresada como un porcentaje.
El epítopo S1 se refiere a la expresión de un
epítopo S1 inmunodominante reconocido por un anticuerpo monoclonal
específico PS21 (ATCC HB 10299 depositado el 30 de Noviembre de
1989), en comparación con la PT de tipo salvaje (+++++).
ND indica no determinado.
x Mutantes cuyo uso no está incluido dentro del
alcance de la invención según se reivindica aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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1. Uso de una holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada en la que al menos uno de Arg^{9}, Arg^{13},
Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la
holotoxina se ha retirado o reemplazado, para la fabricación de un
medicamento inyectable que comprende dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada, para proporcionar una respuesta
inmunitaria potenciada por adyuvante a al menos un antígeno no
perteneciente al género Bordetella
co-administrado con dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada mediante la misma ruta, siendo
potenciadora dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada
para el suministro de dicha respuesta inmunitaria potenciada por
adyuvante, en ausencia de un adyuvante extrínseco, y siendo dicho
al menos un antígeno no perteneciente al género Bordetella
(i) un antígeno de patógeno viral, (ii) un antígeno de patógeno
bacteriano no perteneciente al género Bordetella o (iii) un
antígeno de patógeno parasitario no bacteriano y no viral.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada es
inmunoprotectora.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que múltiples aminoácidos se retiran y
se reemplazan en dicha holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en
el que dichos múltiples aminoácidos son (S1) ARG^{9},
GLU^{129}.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que dichos múltiples aminoácidos se reemplazan (S1) ARG^{9}
por LYS^{9} y GLU^{129} por GLY^{129}.
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