DE69527202T2

DE69527202T2 - Proteinartige adjuvantien

Info

Publication number: DE69527202T2
Application number: DE69527202T
Authority: DE
Inventors: A. Boux; . Deleted; M. Gajewczyk; H. Klein
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2002-12-05
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: ATE429928T1; DE69527202D1; ATE219686T1; EP1149589A1; ES2325475T3; EP0764029B2; DK0764029T4; DE69527202T3; PT1149589E; AU2876595A; CA2192454A1; DK0764029T3; DK1149589T3; EP0764029B1; ES2179105T3; DE69535943D1; US20030072774A1; US7105161B1; WO1995034323A3; PT764029E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und beschäftigt sich insbesondere mit proteinartigen Adjuvanzien, d. h. Materialien, welche Immunantworten gegen ein Antigen modulieren.
Impfstoffe sind viele Jahre lang verwendet worden, um Menschen und Tiere gegen eine breite Vielfalt von infektiösen Krankheiten zu schützen. Derartige herkömmliche Impfstoffe bestehen aus attenuierten Pathogenen (zum Beispiel Poliovirus), abgetöteten Pathogenen (zum Beispiel Bordetella pertussis) oder immunogenen Komponenten des Pathogens (zum Beispiel Diphtherie-Toxoid). Manche Antigene sind in hohem Maße immunogen und sind allein in der Lage, Immunantworten hervorzurufen. Andere Antigene schlagen jedoch zum Beispiel darin fehl, eine schutzgebende Immunantwort hervorzurufen oder induzieren nur eine schwache Immunantwort.
Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene mit Adjuvanzien zusammen verabreicht werden. Adjuvanzien verstärken die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen.
Immunstimulatorische Mittel oder extrinsische Adjuvanzien sind viele Jahre lang verwendet worden, um die Wirtsimmunantworten gegenüber immunogenen Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, zu verbessern. Extrinsische Adjuvanzien sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent an Antigene gebunden sind und formuliert sind, um die Wirtsimmunantworten zu verstärken. So sind Adjuvanzien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral dargereichte Antigene verstärken. Einige dieser Adjuvanzien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebeneffekte verursachen, was sie zur Verwendung in Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gemeinsam üblicherweise als Alum bzw. Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvanzien in Impfstoffen für Menschen und in der Tiermedizin verwendet. Die Effektivität von Alum bei der Erhöhung von Antikörperantworten gegen Diphtherie- und Tetanustoxoide ist gut etabliert, und noch kürzlicher ist ein HBsAg- Impfstoff mit Alum als Adjuvanz versehen bzw. adjuvantiert worden. Obschon die Nützlichkeit von Alum für manche Anwendungen gut etabliert ist, weist sie Einschränkungen auf. Zum Beispiel ist es unwirksam für Influenza-Impfung und ruft eine zeilvermittelte Immunantwort inkonsistent hervor. Die von Alum adjuvantierten Antigenen hervorgerufenen Antikörper sind in der Maus hauptsächlich vom IgG1-Isotyp, welcher für den Schutz durch manche Impfstoffmittel nicht optimal sein kann.
Darüber hinaus haben Untersuchungen in Ratten gezeigt, daß Alum als ein IgE-Adjuvanz wirkt (Lit. 1 - Überall in dieser Anmeldung wird auf verschiedene Literaturhinweise in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik, welcher die Erfindung angehört, vollständiger zu beschreiben. Die volle bibliographische Information für jedes Zitat findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorausgehend vor den Ansprüchen.) Untersuchungen mit Tetanus- und Diphtherie oxoid-Impfstoffen zeigen ebenfalls, daß die Alumadsorption von Impfstoffen IgE-Antikörper in Menschen hervorruft (Lit. 2, 3, 4). Obwohl der Einschluß eines Aluminiumsalzes in eine Impfstoff-Formulierung ihre Immunogenität und Wirksamkeit verbessern kann, rechtfertigt die Tatsache, daß es örtliche Granulome und IgE-Antikörper hervorrufen kann, welche zu Hyperempfindlichkeitsreaktionen beitragen können, deshalb eine sorgfältige Untersuchung der Ausführung der Alumadsorption von Impfstoffen zur Verwendung bei Mensch und Tier.
Einige Merkmale von wünschenswerten Adjuvanzien schließen ein:
(1) Fehlen von Toxizität;
(2) Fähigkeit zur Stimulierung einer lang-andauernden Immunantwort;
(3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei Langzeit-Aufbewahrung;
(4) Fähigkeit zur Hervorrufung sowohl zellulärer als auch humoraler Immunantworten gegen Antigene, welche auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, falls erforderlich;
(5) Synergie mit anderen Adjuvanzien;
(6) Fähigkeit zur selektiven Wechselwirkung mit Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC);
(7) Fähigkeit, angemessene TH1- oder TH2-Zell-spezifische Immunantworten hervorzurufen;
(8) Fähigkeit, angemessene Antikörperisotyp-Spiegel (zum Beispiel IgA) gegen Antigene selektiv zu erhöhen; und
(9) daß sie nicht zu Hypersensitivitäts-Reaktionen beitragen.
Von Relevanz für die vorliegende Erfindung ist eine Erörterung der Entwicklung von Pertussis-Impfstoffen, welche nachstehend dargestellt wird.
So ist Pertussis oder Keuchhusten eine ernste Atemwegserkrankung, die durch die Infektion des respiratorischen Traktes mit dem gramnegativen Organismus Bordetella pertussis verursacht wird. Pertussis ist eine Hauptursache der Kindesmorbidität und wird jährlich mit 360 000 Todesfällen in Verbindung gebracht (Lit. 5). Die wirksamste Methode zur Bekämpfung der Ausbreitung der Krankheit ist erwiesenermaßen der Einsatz von breit angelegten Impfprogrammen. Der Ganzzell-Pertussis-Impfstoff, von dem in den 1950er-Jahren gezeigt wurde, klinische Wirksamkeit aufzuweisen, ist zur Bekämpfung von Pertussis-Epidemien effektiv gewesen (Lit. 6, 7, 8). Der Wert des Impfstoffs wurde veranschaulicht, als Japan, Schweden und Großbritannien die routinemäßige Kindheits-Pertussis-Impfung abschafften. Kurz danach erlebten diese Länder größere Pertussis-Epidemien (Lit. 9, 10, 11, 12).
Obwohl der Ganzzell-Pertussis-Impfstoff wirksam zur Verhinderung des Auftretens und der Verbreitung der Erkrankung ist, ist die Akzeptanz und Annahme des Impfstoffs aufgrund von Berichten über mit dem Impfstoff assoziierte nachteilige Effekte begrenzt gewesen. Dadurch wurde ein Anstoß für die Erzeugung eines nicht-reaktogenen, effektiven und wohldefinierten azellulären Komponenten-Pertussis-Impfstoffs gegeben. Eines der Schlüsselmerkmale des azellulären Impfstoffs ist die chemisch detoxifizierte Pertussis-Toxin(PT)-Komponente. Das Vorliegen von nativem Pertussis-Toxin in dem Ganzzell-Impfstoff ist ein Anlaß zur Sorge gewesen, weil Untersuchungen in Tiermodellen gezeigt haben, daß es Lymphozytose, Histamin- Sensitivierung, eine Potenzierung von Anaphylaxe und IgE-Antikörpern, die Verstärkung von Insulinsekretion und viele andere systemische Effekte auslösen kann (Lit. 13). Die azellulären Pertussis-Impfstoffe unterscheiden sich hinsichtlich der Kombinationen und Mengen von in den Impfstoffen eingeschlossenen Bordetella pertussis-Antigenen, aber die Schlüssel- Antigene schließen die Agglutinogene, Pertactin, filamentöses Hämagglutinin (FHA) und Pertussis-Toxin (PT) ein. Obwohl von dem azellulären Impfstoff gezeigt worden ist, immunogen und von vergleichbarer Wirksamkeit wie der Ganzzell-Impfstoff zu sein, ist er nicht so effektiv zur Verhinderung einer bakteriellen Kolonisierung gewesen (Lit. 14). Darüber hinaus zeigten Ergebnisse aus einem schwedischen Feldversuch, welcher azelluläre und Ganzzell-Pertussis-Impfstoffe verglich, daß das mit Formaldehyd inaktivierte Pertussis- Toxin, welches in den azellulären Impfstoffen vorhanden war, Anzeichen einer Rückkehr zur Toxizität aufwies (Lit. 15). Deshalb wurden andere Verfahren zur Inaktivierung des Pertussistoxin-Moleküls verlangt.
Um die Nachteile der chemischen Detoxifizierung zu überwinden, entwickelten mehrere Arbeitsgruppen genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin-Mutantenmoleküle (Lit. 16, 17, 18, 19, 20, 21). Ein vielversprechender Kandidat war die Mutante K9G129. Nicht nur wurde die Immunogenität des Moleküls beibehalten, sondern die Toxizität dieses rekombinanten Toxins war in großem Maße vermindert (Lit. 18, 19, 21). Darüber hinaus stimulierte die Immunisierung mit der K9G129-Mutante sowohl humorale als auch zelluläre Pertussis-Antigen-spezifische Antworten (Lit. 22). Obwohl viele klinische Versuche die Bewertung der Immunogenität eines Impfstoffs lediglich auf die Grundlage der Antikörperantwort im Anschluß an die Impfung stellen, geben Untersuchungen Hinweise auf eine bedeutende Rolle der zellulären Immunität beim Schutz gegen diese Krankheit. In Tiermodellen ist gezeigt worden, daß die zelluläre Immunantwort wichtig bei der schutzgebenden Antwort gegen Pertussis ist, da der adoptive Transfer von Zellen aus genesenden Tieren in sublethal bestrahlte Tiere einen Schutz vor der Herausforderung durch Bordetella pertussis-Organismusen vermittelte, wohingegen dies beim passiven Transfer von Immunserum nicht der Fall war (Lit. 23, 24). Eine zurückblickende Untersuchung bei Menschen zeigte, daß die zellvermittelte Immunität gegen Bordetella pertussis mit einer positiven Entwicklungsabfolge von Pertussis korreliert war (Lit. 25). Im Anschluß an eine natürliche Pertussis-Infektion beim Menschen werden sowohl eine Antikörper- als auch eine zelluläre Immunantwort beobachtet (Lit. 26). Die Impfung mit entweder dem Gesamtzell- oder den azellulären Komponenten-Impfstoffen führte jedoch zu variablen für Pertussisantigen spezifischen, zellulären Immunantworten (Lit. 27, 28). Es schien so, daß die chemische Detoxifizierung der Pertussistoxin-Komponente deren T-Zell-Immunogenität zerstörte, obgleich die Antikörperantworten unbeeinträchtigt blieben (Lit. 26). Deshalb konnte nur das genetisch detoxifizierte Pertussistoxin-Molekül verwendet werden, um sowohl eine zelluläre als auch humorale Immunantwort zu stimulieren.
Die Verwendung der rekombinanten PT-Mutante K9G129 als eine Pertussis-Impfstoffkomponente ist gut beschrieben worden. Eine Anzahl unterschiedlicher Formen des Impfstoffs ist vorgeschlagen worden. Zwei Formulierungen sind in Menschen ausgewertet worden. Die erste Formulierung bestand aus 15 ug der PT-Mutante, welche mit insgesamt 0,5 mg Alum pro Dosis alumadsorbiert war (Lit. 22, 29), während die andere Formulierung 7,5 ug der K9G129- Mutante sowie 10 ug FHA und 10 ug Pertactin enthielt und ebenfalls alumadsorbiert war (Lit. 30). Diese Untersuchungen zeigten, daß der genetisch detoxifizierte Pertussis-Impfstoff-Kandidat nicht nur sicher und immunogen war und eine zellvermittelte Antwort induzieren konnte, sondern daß er bei Kombination mit den FHA- und Pertactin-Antigenen auch einen besseren Schutz im intrazerebralen Herausforderungs-Test vorsehen konnte, als ein chemisch detoxifizierter Komponenten-Pertussis-Impfstoff (Lit. 30). Andere vorgeschlagene Formulierungen schließen eine Formaldehyd-behandelte K9G129-Komponente (Lit. 31) und einen zellulären Impfstoff, abgeleitet aus einem Stamm von Bordetella pertussis, welcher das genetisch inaktivierte K9G129-Pertussis-Toxin-Molekül herstellt (Lit. 32), ein. Die Formaldehyd-Behandlung des K9G129-Moleküls veränderte die Immunogenität des Moleküls, da geringere Mengen an spezifischen Antikörpern induziert wurden. Das Schutzgebungsvermögen des Moleküls war ebenfalls verringert, da es weniger effektiv im intrazerebralen Herausforderungs-Test war (Lit. 32). Allerdings erwies sich der aus dem K9G129- produziereriden Stamm abgeleitete, rekombinante zelluläre Impfstoff als ebenso effektiv wie der Ganzzell-Pertussis-Implatoff (Lit. 32).
Obwohl die vorhergehende Formulierungen die Vorteile einer verbesserten Sicherheit und Wirksamkeit, die mit der Verwendung eines genetisch detoxifizierten Pertussistoxin-Moleküls assoziiert sind, aufzeigen, berücksichtigen sie nicht die nachteiligen Effekte von DPT (Diphtherie, Pertussis und Tetanus)-Impfung, welche nicht mit der Pertussis-Molekülkomponente assoziiert sind (Lit. 33, 46). Alle der angegebenen Formulierungen beinhalteten die Verwendung von entweder 0,3 mg Aluminiumphosphat (Lit. 32) oder 0,5 mg Aluminiumhydroxid (Lit. 29, 30). Aluminiumsalze wurden in die DT- und DPT-Impfstoff- Formulierungen als ein Adjuvanz eingebracht, welches starke Antikörperantworten potenzieren würde, wenn man die Spiegel der Toxoide oder die Anzahl von Bordetella nertussis-Organismen verringern würde, um nachteilige Reaktionen zu vermeiden (Lit. 34, 35), und Alum wird jetzt routinemäßig als ein Adjuvanz in diesen Impfstoffen verwendet. Allerdings haben Jahre der Felderfahrung mit diesen adsorbierten Pertussis-Impfstoffen und Untersuchungen (Lit. 36, 37) gezeigt, daß, obwohl sie weniger der identifizierten reaktogenen Impfstoffkomponenten enthielten, nichtsdestotrotz örtliche Reaktionen ausgelöst wurden (Lit. 38, 39, 40, 41, 42). Die histopathologische Untersuchung von im Anschluß an eine Impfung hervorgerufenen lokalen Abszessen enthüllt Aluminiumhydroxid-Einschlüsse in Riesenzellen (Lit. 38). Untersuchungen der Häufigkeit solcher Granulome zeigten, daß sie mit dem Aluminiumgehalt in dem Impfstoff assoziiert waren, weil Plazebo-geimpfte Gruppen, welche lediglich den Aluminium-Anteil des Impfstoff erhielten, eine Abszessbildung mit einer ähnlichen Reaktionsrate zeigten (Lit. 43). Weitere Beweise, welche die Rolle von Aluminium bei diesen lokalen Reaktionen unterstützen, wurden aus Untersuchungen hergeleitet, welche mit Aluminiumadjuvanz adsorbierte und reine Cholera- und Tetanus-Impfstoffe verglichen (Lit. 44, 45). Eine Tiefen-Impfung des Impfstoffs in den Muskel verringert das Aufkommen dieser Abszesse, aber obwohl verbesserte Techniken die Bildung von Abszessen verhindern können (Lit. 39), wird die Potenzierung von IgE-Antworten durch Aluminiumsalze nicht beeinflußt.
Es wäre vorteilhaft, immunogene Zusammensetzungen vorzusehen, welche modulierte Immunantworten auf die Antigenbestandteile, ohne die Nachteile einer lokalen Toxizität und eines Beitrags zur Hypersensitivität, wie bei den extrinsischen Adjuvanzien nach dem Stand der Technik, aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Vermeidung von mit der Verwendung von Alum als Adjuvanz in immunogenen Zusammensetzungen assoziierten Problemen durch Verwenden eines genetisch detoxifizierten Pertussis-Holotoxins, welches selbst immunogen sein kann, um die Modulation einer Immunantwort gegen Nicht-Bordetella-Antigen(e) zu bewirken.
Obgleich die Eliminierung von Alum aus Impfstoff-Formulierungen eine Vorgehensweise gewesen sein könnte, um die damit assoziierten Probleme, wie obenstehend erwähnt, zu behandeln, wurde Alum in Impfstoff-Formulierungen eingeschlossen, um eine verstärkte Immunantwort gegen die Antigene in der Formulierung vorzusehen. Von der Eliminierung des Alum würde man deshalb erwarten, zu einer weniger effektiven Formulierung zu führen, und sie wäre deshalb wahrscheinlich nicht vorgeschlagen worden.
Allerdings stellt das genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin überraschenderweise eine Modulation der Immunantwort eines Nicht-Bordetella-Antigens bereit, was ermöglicht, Impfstoff-Formulierungen und andere immunogene Zusammensetzungen vorzusehen, welche Immunantworten aufzeigen, die zumindest äquivalent zu denjenigen sind, welche durch Adjuvanz-Versetzung mit Alum erzielt werden.
Die gemäß Artikel 54 (3) EPÜ relevante EP-A-0 725 653 (WO 95/09649) offenbart nicht-toxische Doppelmutanten-Formen von Pertussis-Toxin, in welchen Glu¹²&sup9; in der S1-Untereinheit durch eine andere Aminosäure substituiert worden ist. Adjuvanzzusammensetzungen, insbesondere zur Schleimhaut Verabreichung, umfassend das zuvor genannte mutante Toxin als ein Adjuvanz, zusammen mit einem anderen Antigen, werden offenbart.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines genetisch detoxifizierten Pertussis-Holotoxins vorgesehen, in welchem mindestens eines von Arg&sup9;, Arg¹³, Trp²&sup6;, Arg&sup5;&sup8; und Glu¹²&sup9; der Holotoxin-S1-Untereinheit entfernt oder ersetzt worden ist, für die Herstellung eines Medikamentes, umfassend das genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin, zur Bereitstellung einer Adjuvanz-unterstützten Immunantwort gegen mindestens ein Nicht- Bordetella-Antigen, welches gemeinsam mit dem genetisch detoxifizierten Pertussis- Holotoxin auf demselben Weg verabreicht wird, wobei das genetisch detoxifizierte Pertussis- Holotoxin adjuvanzmäßig zur Vorsehung der Adjuvanz-unterstützten Immunantwort in Abwesenheit eines extrinsischen Adjuvanz wirkt, und das mindestens eine Nicht-Bordetella- Antigen (i) ein Antigen eines viralen Pathogens, (ii) ein Antigen eines Nicht-Bordetella- Bakterienpathogens oder (iii) ein Antigen eines nicht-bakteriellen, nicht-viralen Parasiten- Pathogens ist, mit der Maßgabe, daß wenn das Medikament ein genetisch-detoxifziertes Pertussis-Holotoxin umfaßt, welches eine nicht-toxische mutante Form von Pertussis-Toxin ist, in welchem die Glu¹²&sup9;-Aminosäure der Holotoxin-S1-Untereinheit durch eine andere Aminosäure substituiert worden ist, das mutante Pertussis-Toxin und das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen gemeinsam verabreicht werden, und zwar (a) parenteral oder nichtparenteral auf demselben Weg, wenn das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen ein Antigen eines viralen Pathogens oder ein Antigen von Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Haemophilus, Meningococci, Streptococci, Schistosoma oder Trypanosomen umfaßt, wobei das Clostridium tetani-Antigen nicht das C-Fragment von Tetanus- Toxin ist, oder (b) parenteral, wenn das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen nicht wie eben in (a) spezifiziert beschaffen ist.
Die Immunantwort, welche durch die Gegenwart des genetisch detoxifizierten Pertussis-Holotoxins moduliert wird, kann eine humorale und/oder eine zelluläre Immunantwort sein. Insbesondere kann die modulierte Immunantwort eine verstärkte IgG- und/oder zelluläre Antwort auf das andere Antigen sein.
Das Antigen des viralen Pathogens kann aus einer breiten Auswahl derartiger Pathogene gewählt werden. Derartige repräsentative Pathogene schließen Paramyxoviridae, Influenza und Hepatitis ein.
Das genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin kann selbst immunoprotektiv sein bzw. einen Immunschutz gewähren, aber sein immunmodulierender Effekt kann in Abwesenheit einer Immunantwort gegen das Holotoxin erzielt werden. Die Bereitstellung von genetisch-detoxifizierten Pertussis-Holotoxinen wird in den U. S. -Patenten Nr. 5 085 862 und 5 221 618, die an den Rechtsnachfolger hiervon abgetreten wurden, beschrieben.
Der Begriff "genetisch detoxifiziert", wie hierin verwendet, besitzt dieselbe Bedeutung, wie in den zuvor erwähnten U. S. -Patenten Nr. 5 085 862 und 5 221 618, nämlich eine Pertussis-Holotoxin-Mutante, welche eine Resifoxizität von etwa 1% oder weniger, vorzugsweise weniger als etwa 0,5%, von derjenigen des nativen Toxins aufzeigt. Die restliche Toxizität wird mittels des CHO-Zell-Clustering-Assays und der ADP-Ribosyl-Transferase-Aktivität bestimmt.
Ein solches genetisch detoxifiziertes Pertussis-Holotoxin kann durch Mutagenese einer für das Holotoxin codierenden Nukleotidsequenz gebildet werden, wie in den obenstehend erwähnten Patenten beschrieben, so daß die mindestens eine Aminosäure entfernt oder ersetzt wird. Es können auch mehrere Aminosäuren entfernt oder ersetzt werden. Die mindestens eine Aminosäure, welche entfernt oder ersetzt wird, ist in der S1-Untereinheit vorhanden und ist spezifisch ARG&sup9;, ARG¹³, TRP²&sup6;, ARG&sup5;&sup8; und GLU¹²&sup9; Wo mehrere Aminosäuren entfernt oder ersetzt werden, wird es bevorzugt, (S1) ARG&sup9;GLU¹²&sup9; zu entfernen oder zu ersetzen. Wenn eine derartige Mutation bewerkstelligt wird, wird es bevorzugt, ARG&sup9; durch LYS&sup9; und GLU¹²&sup9; durch GLY¹²&sup9; zu ersetzen (diese spezifische Mutante wird hierin machmal als K9G129 angegeben).
Nachfolgend finden sich die Tabellen 1a und 2, enthaltend Details von mehreren Mutationen des Pertussis-Holotoxins, welche als das genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin in den hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden können, nämlich den Medikamenten, deren Herstellung durch die Verwendung gemäß der Erfindung vorgesehen wird (die Tabellen erscheinen am Ende des Beschreibungstextes). Die Tabelle 1b enthält Details der in vitro-Charakterisierung der Mutationen von Tabelle 1a.
Die immunogenen Zusammensetzungen können mindestens ein zusätzliches Bordetella-Antigen, einschließlich Agglutinogenen, FHA und Pertactin enthalten.
Die immunogenen Zusammensetzungen können in der wesentlichen Abwesenheit eines extrinsischen Adjuvanz als ein Impfstoff zur Verabreichung an Mensch oder Tier formuliert werden. Solche Impfstoffzusammensetzungen können eine verringerte IgE-Antwort aufzeigen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die immunogenen Zusammensetzungen bei wesentlicher Abwesenheit von Alum als ein mehrwertiger bzw. multivalenter Impfstoff formuliert werden, umfassend das genetisch detoxifizierte Pertussis-Holotoxin in einer immun-schutzgebenden Form und Menge, zusammen mit Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid als den anderen Antigenen, wodurch eine DTP-Impfstoff-Formulierung vorgesehen wird, bei der Alum oder ein anderes extrinsisches Adjuvanz abwesend ist. Solche DTP- Impfstoffformulierungen enthalten üblicherweise auch andere Bordetella-Antigene, einschließlich Agglutinogenen, FHA und Pertactin.
Das gemäß der von der Erfindung vorgesehenen Verwendung hergestellte Medikament ist nützlich zur Erzielung einer modulierten Immunantwort gegen ein Antigen in einem Wirt, einschließlich einem Menschen; für diesen Zweck wird das mindestens eine Nicht-Bordetella- Antigen an den Wirt verabreicht, und ein genetisch detoxifiziertes Pertussis-Holotoxin wird gemeinsam damit an den Wirt in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um eine Immunantwort gegenüber dem anderen Antigen in Abwesenheit eines extrinsischen Adjuvanz zu modulieren.
Wie obenstehend angegeben, kann die Immunantwort eine humorale und/oder eine zelluläre Immunantwort sein, und die modulierte Immunantwort kann eine verstärkte IgG- und/oder zelluläre Immunantwort sein. Die Verabreichung des Pertussis-Holotoxins und des anderen Antigens kann durch Verabreichen einer Zusammensetzung, wie obenstehend beschrieben und bereitgestellt gemäß der Erfindung, an den Wirt bewerkstelligt werden.
In der vorliegenden Erfindung werden Antigene und Adjuvanzien gemeinsam verabreicht bzw. co-verabreicht. In dieser Anmeldung bedeutet der Begriff "Co-Verabreichung" gleichzeitige Verabreichungen oder Verabreichungen innerhalb einer kurzen Zeitperiode, wie zwischen mehreren Minuten oder Stunden und bis zu 3 Tagen. Die Co-Verabreichungen können an der gleichen oder an unterschiedlichen Stellen erfolgen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die vorliegende Erfindung wird aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren weiter verstanden werden. Auf die Fig. 7 bis 9 wird im Zusammenhang mit Beispiel 10 Bezug genommen, welches, wie hierin nachstehend angezeigt, nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie hierin beansprucht, liegt. In den Figuren: -
zeigt die Fig. 1 die Potenzierung der Mäuseserum-IgE-Antikörper-Herstellung durch immunogene Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung;
Die Fig. 2 zeigt die Herstellung von IgG-Antikörpern durch immunogene Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung;
Die Fig. 3 zeigt die Herstellung von IgG-Antikörpern durch multivalente Impfstoffe der vorliegenden Erfindung;
Die Fig. 4 zeigt die Induktion von zellulären Immunantworten durch multivalente Impfstoffe der vorliegenden Erfindung;
Die Fig. 5 zeigt die Th1- und Th2-Immunantwort-Phänotypen, wie ermittelt durch Cytokin- Profil in Mäusen, immunisiert mit Ovalbumin, Adjuvanz versetzt mit PPD und genetisch detoxifiziertem Pertussis-Toxin PT (K9G129);
Die Fig. 6 zeigt die Th1- und Th2-Immunantwort-Phänotypen, wie bestimmt durch Ovalbumin-spezifrsche IgG2a- und IgGE-Immunglobulin-Profile in Mäusen, geimpft mit PPD und genetisch detoxifiziertem Pertussis-Toxin PT (K9GK9);
Die Fig. 7 zeigt die Anzahl von tumorfreien Mäusen in hierin durchgeführten Immuntherapie-Experimenten. Sechs Gruppen an Mäusen mit je fünf Mäusen pro Gruppe wurden mit Zellkulturmediurn als einer Kontrolle und 10&sup4; lebenden Melanom-Zellen geimpft.
Die Graphik zeigt die Zahl von Mäusen, welche dreißig Tage nach der Herausforderung keinen Tumor aufzeigten;
Die Fig. 8 zeigt die Tumor-Volumina am Tag 30 von zwei der sechs Gruppen der Mäuse, aufgetragen gegen die Zahl von Tagen nach der Herausforderung mit 10&sup5; lebenden Melanomzellen. Die offenen Kästchen mit den gestrichelten Linien repräsentieren die fünf Mäuse, welche mit 10&sup4; bestrahlten Zellen allein immunisiert worden waren (Gruppe 2), und die gefüllten Kreise, verbunden durch die durchgezogenen Linien, repräsentieren die fünf Mäuse, welche mit bestrahlten Zellen plus 1 ug K9G129 immunisiert worden waren (Gruppe 3); und die Fig. 9 zeigt die Tumorvolumina am Tag 22. Mäuse wurden mit Zellkulturmedium als einer Kontrolle und 104 bestrahlten Melanomzellen allein oder zusammen mit CFA oder zunehmenden Konzentrationen von K9G129 immunisiert. Die Tumorvolumina von jeder von fünf Mäusen in den sechs Gruppen sind 22 Tage nach der Herausforderung mit 10&sup5; lebenden Melanomzellen gezeigt. Für die letzten drei Gruppen (Mäuse, welche K9G129 erhielten) zeigen die Zahlen bei den Pfeilen die Anzahl von Mäusen, welche frei von Tumoren waren.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Unter Bezug auf die Fig. 1 wird die Potenzierung von Serum-IgE-Spiegeln in Mäusen veranschaulicht, welche mit einem chemisch inaktivierten azellulären, mit Alum adjuvantierten DTP-Impfstoff und einem azellulären, nicht Alum adjuvantierten rDTP-Impfstoff, umfassend das genetische detoxifizierte K9G129-PT-Analog, immunisiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß die Serum-IgE-Spiegel in mit dem azellulären rDTP-Impfstoff immunisierten Mäusen signifikant verringert (p < 0,05) waren im Verhältnis zum azellulären DTP-Impfstoff, welcher das chemisch detoxoidierte Pertussis-Toxin-Molekül enthielt.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 2 und 3 und die Tabelle 3 wird ein Vergleich von Antigenspezifischen Antikörperspiegeln veranschaulicht, erzeugt im Anschluß an eine Immunisierung von Mäusen mit einem Alum adjuvantierten DTP-Ganzzell-Impfstoff, einer Alumadjuvantierten azellulären DTP-Impfstoff-Präparation und einem DTP-Impfstoff, enthaltend das genetisch detoxifizierte PT-Analog K9G129, welcher nicht mit Alum adjuvantiert war. Die in der Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Anti-PT-IgG-Antwort und die CHO-Neutralisationstiter, erzeugt durch den Alum adjuvantierten azellulären DTP- Impfstoff und den nicht-Alum-adjuvantierten, rekombinanten, azellulären DTP-Impfstoff, gleichwertig sind. Obwohl die alumfreie rekombinante Formulierung eine verringerte IgEpotenzierende Aktivität aufzeigte, behielt sie daher nichtdestoweniger ihre Effktivität als ein Pertussis-Impfstoff bei, wie durch diese Anti-Pertussis-Toxin-IgG-Titer angezeigt wird. Weitere Beweise der Beibehaltung der PT-spezifischen Immunogenität wurden aus CHO- Zell-Neutralisierungs-Assays erhalten. Signifikanterweise wurden höhere Spiegel an Anti- Agglutinogen 2 + 3- und Anti-69-kD(Pertactin)-IgG-Antikörpern in den Serumproben aus Mäusen nachgewiesen, welche mit alumfreier rekombinanter Formulierung immunisiert worden waren (p < 0,05). Die Anti-FHA-Toxoid-IgG-Antworten waren in Seren, welche aus Mäusen erhalten wurden, die mit einem der beiden Impfstoffe immunisiert worden waren, äquivalent.
Die Fig. 3 zeigt die Anti-Tetanus-Toxoid- und Anti-Diphtherie-Toxoid-IgG-Antikörperspiegel in Seren von Mäusen, welche entweder mit dem Ganzzell-Pertussis-Impfstoff, dem aus definierten Komponenten bestehenden azellulären DTP-Impfstoff, der das mit Glutaraldehyd detoxifizierte Pertussis-Molekül enthält, oder dem alumfreien rekombinanten azellulären DTP-Impfstoff immunisiert wurden. Die Diphtherie- und Tetanustoxoid-Komponenten im letztgenannten Impfstoff waren ebenfalls frei von Alum. Die Ergebnisse zeigen, daß die azellulären Formulierungen signifikant höhere Anti-Tetanus-Toxoid- und insbesondere Anti- Diphtherie-Toxoid-IgG-Antikörper induzieren, wie durch diesen Assay gemessen wurde. Darüber hinaus induzierte die Alum-freie, rekombinante Formulierung signifikant höhere Anti-Tetanus- und -Diphtherie-Toxoid-IgG-Antworten im Verhältnis zu dem azellultären Komponenten-DTP-Impfstoff.
Die Fähigkeit der DTP-Impfstoffformulierungen, Antigen-spezifische, zelluläre Immunantworten zu induzieren, wurde in vitro ausgewertet, und die Ergebnisse sind in der Fig. 4 gezeigt. Aus entweder mit den Ganzzell-, azellulären oder alumfreien rekombinanten azellulären DTP-Impfstoffen immunisierten Mäusen abgeleitete Splenozyten bzw. Milzzellen wurden in Gegenwart der spezifischen Impfstoff-Antigene kultiviert. Der Ganzzell-DTP-Impfstoff induzierte eine signifikante zelluläre Anti-Diphtherietoxoid-Antwort, obgleich nicht zum gleichen Ausmaß, wie diejenige, welche von dem azellulären Komponenten-DTP-Impfstoff erzeugt wird. Der azelluläre Komponenten-Impfstoff induzierte eine relativ geringe für Pertussis-Antigen spezifische proliferative Antwort mit Ausnahme der Anti-69kD- und Anti-Diphtherietoxoid-Antworten. Von Bedeutung war jedoch der bemerkenswert erhöhte antigenspezifische proliferative Index, der durch die alumfreie rekombinante azelluläre Formulierung in Antwort auf alle getesteten Antigene induziert wurde. Die rekombinante Formulierung induzierte in deutlicher Weise die höchsten Spiegel der antigenspezifischen proliferativen Antworten von irgendeinem der getesteten Impfstoffe.
Das in Übereinstimmung mit der, von der Erfindung vorgesehenen, Verwendung hergestellte Medikament kann in einer Ausführungsform eines solchen Medikamentes ein alumfreier, azellulärer DPT-Impfstoff sein, der das genetisch detoxifizierte PT-Analog K9G129 enthält.
Obwohl die alumfreie Formulierung kein extrinsisches (z. B. ein mineralisches) Adjuvanz enthält, enthält sie daher nichtsdestoweniger ein Adjuvanz, da die K9G129-Mutante nicht nur als ein Antigen sondern gleichfalls als ein Adjuvanz (d. h. ein proteinartiges Adjuvanz)wirkt. Diese Eigenschaft ist in den durch Enzym-Immunoassay gemessenen Pertussisantigenspezifischen Antworten offensichtlich (Fig. 2). Signifikant höhere Anti-Agglutinogen 2 + 3- und Anti-69-kD(Pertactin)-IgG-Antworten waren in den Serumproben offensichtlich, abgeleitet aus Mäusen, immunisiert mit der alumfreien rekombinanten azellulären Pertussis- Impfstoffformulierung, während die FHA-Toxoid-spezifischen Antworten äquivalent waren. Deswegen induzierte die neue Formulierung für Pertussis-Impfstoff-Antigene spezifische Antikörperantworten bei Spiegeln, welche entweder vergleichbar oder größer als die Spiegel waren, welche von dem Alum-adsorbierten azellulären Pertussis-Impfstoff induziert wurden.
Die allgemeine intrinsische Adjuvanz-Aktivität der K9G129-Mutante für andere Impfstoff- Antigene (wie denjenigen Antigenen, vorhanden in menschlichen Impfstoffen, wie pädiatrischen Kombinations-Impfstoffen) wurde ebenfalls ausgewertet. Die Tetanus- und Diphtherie-Toxoid-spezifischen IgG-Antworten in Serum, erhalten aus Mäusen, immunisiert mit entweder den Alum-adsorbierten Ganzzell- oder azellulären Pertussis-Impfstoffen oder dem alumfreien rekombinanten Impfstoff, wurden verglichen (Fig. 3). Die Tetanus- und Diphtherie-spezifischen IgG-Titer im Serum von Mäusen, immunisiert mit dem Ganzzell- Impfstoff, waren signifikant niedriger als diejenigen, welche in einer der mit azellulärem DTP immunisierten Gruppen beobachtet wurden. Obwohl der Alum-adsorbierte DTP-Impfstoff signifikant höhere Toxoid-spezifische Antworten im Vergleich zu der mit Ganzzell-Impfstoff immunisierten Gruppe induzierte, induzierte von allen getesteten Impfstoffformulierungen die Alum-freie Formulierung die höchsten Titer an Toxoid-spezifischem IgG. Deswegen ist die Adjuvanzaktivität der K9G129-Mutante nicht nur auf Bordetella-Antigene beschränkt. Das gemäß der von der Erfindung vorgesehenen Verwendung hergestellte Medikament kann ein multivalenter Impfstoff sein, welcher schutzgebende Antigene für eine Mehrzahl von Pathogenen enthält.

Impfstoff-Herstellung und -Verwendung

Wie obenstehend angegeben, sieht die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform immunogene Zusammensetzungen vor, welche zum Beispiel zur Verwendung als Impfstoffe geeignet sind. Die immunogene Zusammensetzung ruft eine Immunantwort durch den Wirt hervor, an welchen sie verabreicht wird, einschließlich der Herstellung von Antikörpern durch den Wirt. Die immunogenen Zusammensetzungen schließen mindestens ein Nicht-Bordetella- Antigen ein. Dieses Antigen kann ein inaktiviertes Pathogen oder eine antigene Fraktion eines Pathogens sein, wobei es sich bei dem Pathogen um ein Virus oder ein besonderes Bakterium oder einen Parasiten, wie hierin zuvor definiert, handelt. Das Pathogen kann durch ein chemisches Mittel, wie Formaldehyd, Glutaraldehyd, β-Propiolacton, Ethylenimin und Derivate, oder andere Verbindungen, inaktiviert sein. Das Pathogen kann auch durch ein physikalisches Mittel inaktiviert werden, wie UV-Strahlung, Gamma-Strahlung, "Hitzeschock" und Röntgenstrahlung. Repräsentative virale Pathogene, aus denen das Antigen abgeleitet werden kann, schließen Paramyxoviridae, Influenza und Hepatitis ein.
Eine antigene Fraktion eines Pathogens kann mittels chemischer oder physikalischer Zersetzungsverfahren hergestellt werden, gefolgt, falls gewünscht, von Trennung einer Fraktion mittels Chromatographie, Zentrifugation und ähnlicher Techniken. Im Allgemeinen werden dann niedermolekulare Komponenten erhalten, welche, obwohl gereinigt, eine geringe Immunogenität aufweisen können.
Alternativ dazu können Antigene oder Haptene mittels organischer synthetischer Verfahren oder, beispielsweise im Falle von Polypeptiden und Proteinen, mittels rekombinanter DNA- Verfahren hergestellt werden.
Das Medikament kann in Form von Injektionen, flüssigen Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Die Antigene und immunogenen Zusammensetzungen können mit physiologisch annehmbaren Trägern gemischt werden, welche damit kompatibel sind. D iese können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen hiervon einschließen. Der Impfstoff kann ferner Hilfssubstanzen enthalten, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel oder pH-Pufferungsmittel, um die Effektivität davon weiter zu verbesern. Impfstoffe können durch Injektion subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
Es ist früher bemerkt worden, daß wenn das Medikament ein genetisch detoxifiziertes Pertussis-Holotoxin umfaßt, welches eine nicht-toxische Mutantenform von Pertussis-Toxin ist, in welcher die Glu¹²&sup9;-Aminosäure der Holotoxin-S1-Untereinheit durch eine andere Aminosäure substituiert worden ist, man das mutante Pertussis-Toxin und das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen gemeinsam verabreicht, und zwar (i) parenteral oder nichtparenteral auf dem gleichen Wege, wenn das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen ein virales Pathogen-Antigen oder ein Antigen von Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Haemophilus, Meningococci, Streptococci, Schistosoma oder Trypanosomen umfaßt, wobei das Clostridium tetani-Antigen nicht das C-Fragment von Tetanus-Toxin ist, oder (ii) parenteral, wenn das mindestens eine Nicht-Bordetella-Antigen nicht wie eben in (i) spezifiziert beschaffen ist. Alternativ dazu, aber unterworfen unter diese Beschränkungen, kann das Medikament, dessen Herstellung durch die Verwendung gemäß der Erfindung vorgesehen ist, auf eine Weise zugeführt werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. So kann das Medikament an Schleimhautoberflächen zum Beispiel auf dem nasalen, analen, vaginalen oder oralen (intragastrischen) Weg verabreicht werden. Alternativ dazu können andere Arten der Verabreichung, einschließlich Suppositorien, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglykole und Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise eingesetzte Arzneimittelträger einschließen, wie pharmazeutische Güteklassen von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat.
Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen von verzögerter Freisetzung oder Pulvern einnehmen, und 1 bis 95 % der immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Medikamente werden in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise und in einer solchen Menge, daß sie therapeutisch wirksam, schutzgebend und immunogen sind, verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu impfenden Subjekt, ab, einschließlich zum Beispiel der Kapazität des Immunsystems des Subjekts, Antikörper zu synthetisieren, und, falls benötigt, eine zellvermittelte Immunantwort hervorzubringen. Die genauen, zu verabreichenden Mengen an Antigen und immunogener Zusammensetzung hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche ohne weiteres vom Fachmann feststellbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm bis zu Milligramm liegen. Geeignete Dosierungsschemen zur anfänglichen Verabreichung und für Booster-Dosierungen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen, einschließen. Die Dosierung des Impfstoffs kann auch vom Verabreichungsweg abhängen und wird gemäß der Größe des Wirts variieren.
Die Konzentration von Antigenen in einer immunogenen Zusammensetzung, aufbauend ein Medikament, dessen Herstellung durch die Verwendung gemäß der Erfindung vorgesehen wird, beträgt im allgemeinen 1 bis 95%. Ein Impfstoff, welcher antigenes Material von lediglich einem Pathogen enthält, ist ein monovalenter bzw. einwertiger Impfstoff Impfstoffe, welche antigenes Material von mehreren Pathogenen enthalten, sind kombinierte Impfstoffe und gehören ebenfalls der vorliegenden Erfindung an. Solche kombinierten oder multivalenten Impfstoffe enthalten zum Beispiel Material aus verschiedenen Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen des gleichen Pathogens oder aus Kombinationen verschiedener Pathogene.

Immunoassays

In einer Ausführungsform ist die immunogene Zusammensetzung nützlich für die Erzeugung antigenspezifischer Antikörper, welche ihrerseits bei der spezifischen Identifizierung dieses Antigens in einem Immunoassay nützlich sind. Solche Immunoassays schließen Enzyme- Linked Immunosorbent-Assays (ELISA), RIAs und andere nicht-enzymverknüpfte Antikörperbindungsassays oder im Fachgebiet bekannte Vorgehensweisen ein. In ELISA-Assays werden die antigenspezifischen Antikörper auf einer gewählten Oberfläche immobilisiert; zum Beispiel den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach Waschen zur Entfernung der unvollständig adsorbierten Antikörper kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) oder Kasein, welches bekanntermaßen ein neutrales Antigen bezüglich der Testprobe ist, an die gewählte Oberfläche gebunden werden. Dies gestattet die Blockierung nichtspezifischer Adsorptionsstellen auf der Immobilisienings- Oberfläche und reduziert somit den Hintergrund, welcher von nichtspezifischen Bindungen von Antigenen auf die Oberfläche verursacht wird. Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer Probe kontaktiert, wie klinischen oder biologischen Materialien, welche auf eine Weise getestet werden soll, die auf die Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/- Antikörper) rückschließen läßt. Dies kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie BSA, Rinder-Gammaglobulin (BGG) und/oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween, einschließen. Man läßt die Probe dann etwa 2 bis 4 Stunden lang bei Temperaturen, wie von der Größenordnung von etwa 25º bis 37ºC, inkubieren. Im Anschluß an die Inkubation wird die Proben-kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nichtimmunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschvorgehen kann das Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween, oder einem Boratpuffer einschließen.
Im Anschluß an die Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen dem Antigen in der Testprobe und den gebundenen antigenspezifischen Antikörpern, und das nachfolgende Waschen, können das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplex-Bildung bestimmt werden, indem man den Immunkomplex einem zweiten Antikörper, der Spezifität für das Antigen aufweist, unterwirft. Um ein Nachweismittel vorzusehen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität, wie eine enzymatische Aktivität, aufweisen, welche beispielsweise eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem passenden chromogenen Substrat erzeugen wird. Eine Quantifizierung kann dann durch Messen des Ausmaßes der Farberzeugung erzielt wenden, wobei beispielsweise ein Spektrophotometer für sichtbare Spektren zum Einsatz kommt.

Beispiele

Die obenstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele gewonnen werden. Diese Beispiele sind lediglich aus Zwecken der Veranschaulichung beschrieben, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Änderungen in der Form und die Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wie es die Umstände nahelegen oder als zweckdienlich erscheinen lassen können. Obwohl hierin spezifische Begriffe verwendet werden, sind derartige Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Einschränkung beabsichtigt. Das Beispiel 10 liegt nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie hierin beansprucht; folglich veranschaulichen die Fig. 7 bis 9, auf die darin Bezug genommen wird, nicht die beanspruchte Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Formulierung von Impfstoffen. Der DPT-Ganzzell-Impfstoff und ein experimenteller, azellulärer Komponenten-Impfstoff wurden von Connaught Laboratories Ltd. hergestelltt. Der azelluläre Komponenten-Pertussis-Impfstoff war Alumadsorbiert (1,5 mg/Dosis) und bestand aus 10 ug Protein-Stickstoff von Glutaraldehydtoxoidiertem Pertussis-Toxin, jeweils 5 ug Protein-Stickstoff des FHA und der Agglutinogene 2 und 3, und 3 ug Pertactin, zusammen mit 5 Lf Tetanus-Toxoid und 25 Lf Diphtherie-Toxoid pro Dosis. Der rekombinante Komponenten-Impfstoff enthielt auch jeweils 5 ug Protein- Stickstoff von FHA und der Agglutinogene 2 und 3, und 3 ug Protein-Stickstoff Pertactin zusätzlich zu 5 Lf Tetanus-Toxoid und 25 Lf Diphtherie-Toxoid pro Dosis. Allerelings unterschied er sich von dem anderen azellulären Impfstoff darin, daß er 20 ug Protein- Stickstoff des rekombinanten PT-Mutanten-Holotoxins K9G129 enthielt und nicht Alumadsorbiert war. Das K9G129-Pertussis-Toxin-Molekül sowie die gereinigten FHA-, agg 2 + 3- und Pertactin-Komponenten wurden einzeln von Connaught Laboratories Ltd. erhalten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Immunisierung von Tieren. Weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 15 bis 18 Gramm wurden von Charles River Canada (St. Constant, Quebec) erhalten. Die Mäuse wurden in Mikroisolatoren gehalten und gemäß den Richtlinien verwendet, welche vom Canadian Council on Animal Care (CCAC) aufgestellt wurden. Die Tiere waren spezifisch pathogenfrei, und die Unterbringungsräumlichkeiten wurden hinsichtlich Ausbrüchen des murinen Hepatitis-Virus durch den Einsatz von Überwachungsmäusen überwacht. Wasser wurde nach Belieben gegeben, und die Nahrung war Ovalbumin-frei. Die Mäuse wurden am Tag 0 mit den Impfstoff-Formulierungen in Gruppen zu je sechs geimpft. Eine Booster-Dosis des Impfstoffs wurde am Tag 21 verabreicht. Am Tag 28 entnahrri man den Tieren Blut durch einen Jugularvenen- Einriß und nahm eine Splenektomie vor. Die Serumproben wurden bis zum Assay bei -20ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt antigenspezifische Immungssays.
Die Impfstoffantigen-spezifischen IgG-Antworten wurden durch indirekten EIA bestimmt. Die Antigene von Interesse waren Pertussistoxin, Pertactin, filamentöses Hämagglutinin, Agglutinogene sowie Diphtherie- und Tetanus-Toxoide. Mikroplatten mit hoher Bindungskapazität (Nung) wurden mit jeweils 4 ug/ml der obenstehenden Antigene in einem Volumen von 50 ul 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, pro Vertiefung beschichtet. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Platten gewaschen und sukzessiv mit einer 0,1%igen Lösung von Rinderserumalbumin (Sigma) eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die überschüssige Blockierung wurde entfernt und die Mikroplatten wurden gewaschen. Die Mäuseserumproben wurden dann in PBS-Tween 20 (0,05%) seriell verdünnt und bei einem Volumen von 100 ul ausplattiert. Die Proben wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die antigenspezifische Fraktion von IgG-Antikörpern wurde durch ein Peroxidase-konjugiertes Schaf-Anti-Maus-IgG-Konjugat (Jackson Laboratories) nachgewiesen. Die Platten wurden mit dem TMB-Substrat wie obenstehend entwickelt und bei den zwei Wellenlängen von 450 nm und 540 nm im Multiskan-MCC 340 MkII-Mikroplattenablesegerät abgelesen. Reaktive Titer wurden als die Verdünnung definiert, bei der die Absorption der Testprobe äquivalent zum Mittelwert plus drei Standardabweichungen der Negativkontrollen-Absorptionswerte war. Die geometrischen Mittel und 95%-Konfidenzintervalle wurden berechnet, und die Gruppen wurden unter Anwendung des t-Test nach Student verglichen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Bestimmung von Ovalbumin-spezifischen IgG-Sub-, bzw. Unterklassenprofilen.
Die Ovalbumin-spezifischen IgG-, IgGI- und IgG2a-Titer in Mäuseserumproben wurden durch indirekten EIA gemessen. Im IgG2a-Assay wurden Nung-Maxisorp-96-Vertiefungs- Mikroplatten (Gibco/BRL) mit einer polyklonalen Kaninchen-Anti-Ovalbumin-Antikirper- IgG-Fraktion (Cappell Laboratories), welche in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt war, beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ovalbumin-spezifischera IgG- und IgG1-Antworten wurden auf Mikroplatten gemessen, welche direkt mit Ovalbumin (Sigma), das zu einer Konzentration von 10 ug/ml in 50 mM Carbonatpuffer verdünnt war, beschichtet waren. Am folgenden Tag wurden die Mikroplatten in PBS-T gewaschen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 0,1% Magermilchpulver, verdünnt in PBS-T, geblockt. Nach einem weiteren Waschschritt wurde eine 10-ug/ml-Lösung von Ovalbumin (Sigma), verdünnt in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, zu dem IgG2a-spezifischen Assay hinzugefügt. Diese Antigenbeschichtung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, und darauf folgte ein Waschschritt.
Der nächste Schritt in dem Assay erforderte die Zugabe der Mäuseserumproben. In dem IgG2a-Assay wurden die Serumproben dreifach seriell verdünnt, wobei man mit einer Anfangsverdünnung von 1 : 40 begann und bei einer Verdünnung von 1 : 87480 aufhörte. Die IgG- und IgG1-Assays wurden mit Serumproben ausgeführt, welche dreifach verdünnt waren, beginnend bei einer Anfangsverdünnung von 1 : 360 und endend bei einer Endverdünnung von 1 : 787320. Die Serumproben wurden in PBS-T verdünnt und den Vertiefungen der Mikroplatten in Volumina von 100 ul zugesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten gewaschen, und die Ovalbumin-spezifischen IgG-Unterklassen von Antikörpern wurden mit biotinylierten Ratten-Anti-Maus-IgG-Konjugaten nachgewiesen, welche für jede IgG-Antikörpersubklasse spezifisch waren (IgG2a-Konjugat, abgeleitet aus dem Klon R19-15 und erhalten von Pharmingen, IgGI-Konjugat, abgeleitet aus dem Klon LO-MGI-2 und erhalten von Serotec), wohingegen die IgG-Antworten mit einer 1 : 50000-Verdünnung eines Peroxidase-markierten Schaf-Anti-Maus-IgG (Fcv-speziiisch, Jackson Laboratories) nachgewiesen wurden. Die konjugierten monoklonalen Antikörper wurden zu einer Konzentration von 2 ug/ml verdünnt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde Peroxidase-konjugiertes Streptavidin zu jeder Vertiefung der Platten mit einem biotinylierten Konjugat bei einer Konzentration von 500 ng/ml zugesetzt. Die Platten wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die gebundenen antigenspezifischen IgG- und IgG-Subklassen-Antikörper wurden durch die Zugabe des Peroxidasesubstrates, 10% TBM (ADI Diagnostics), verdünnt in 0,005% Wasserstoffperoxid (Fisher Scientific), nachgewiesen. Man ließ die Reaktionen über eine Dauer von zehn Minuten hinweg voranschreiten, an welchem Punkt sie durch die Zugabe von IM Schwefelsäure (Fisher Scientific) zu jeder Vertiefung beendet wurden. Die Mikroplatten wurden auf einer Mikroplatten-Lesevorrichtung (Multiskan MCC 340MkII, Flow Laboratories) bei zwei Wellenlängen von 450 nm und 540 nm abgelesen. Die reaktiven Titer waren als die letzte Verdünnung definiert, bei der die Absorption der Testprobe äquivalent zum Mittelwert plus drei Standardabweichungen der Negativkontrollen-Absorptionswerte war. Die geometrischen Mittel wurden an Log-transformierten Daten berechnet und mit 5% Konfidenzintervallen ausgedrückt.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt Gesamt-IgE-Immungssays.
Die IgE-Gesamtspiegel des Serums wurden durch indirekten EIA geprüft. Nung-Immunojplatten (Gibco/BRL) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen Schaf-Anti- Maus-IgE-Antiserum (Serotec), verdünnt in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten in PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (J. T. Baker) gewaschen, und dann mit 0,1% Casein-Aminosäuren (Difco) eine Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt. Nachdem die überschüssige Blockierungslösung von den Platten abgewaschen war, wurden die Mäuseserumproben dreifach in dem Assay-Verdünnungsmittel seriell verdünnt und bei 100 ul pro Vertiefung auf die Mikroplatten ausplattiert. Die Proben wurden über Nacht bei 40C inkubiert. Um die gebundenen IgE-Antikörper nachzuweisen, wurde ein biotinylierter monoklonaler Ratten-Anti-Maus-IgE-Antikörper (Serotec) bei einer Konzentration von 2 ug/ml zu jeder Vertiefung zugesetzt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurde Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (Dimension Laboratories) in jede Vertiefung zugegeben. Die Menge von an die Vertiefungen gebundenem IgE wurde durch Zusetzen des Enzymsubstrats, 10% Tetramethylbenzidin (TMB) (ADI Diagnostics) in 0,005% Wasserstoffperoxid-Wasser (Fisher Scientific), bewertet. Die Reaktion wurde nach 10 Minuten mit 1M Schwefelsäure (Fisher Scientific) gestoppt. Die Absorption der Vertiefungen wurde bei 450 nm mit einer Hintergrundkorrektur bei 540 nm auf einem Multiskan MCC 340 MkII-Mikroplatten-Lesegerät (Flow Laboratories) gemessen. Die Serum-IgE-Spiegel wurden durch Kalibrieren der Proben-Absorptionen gegen eine Standardkurve quantifiziert, erzeugt gegen eine Verdünnungsreihe von IgE-Mäuse- Myelomprotein, welche auf jeder Platte ausgeführt wurde. Die geometrischen Mittel und 95 %-Konfidenz-Intervalle wunden für jede Behandlungsgruppe berechnet, und die Gruppen wurden unter Anwendung des t-Test nach Student und bei p < 0,05 verglichen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt die Bestimmung von Ovalbumin-spezifischen IgGF-Immunglobulinen.
Ovalbumin-spezifische IgE-Titer in den Seren von immunisierten Mäusen wurden durch die Anwendung eines indirekten Antigen-Einfang-EIA bestimmt. Kurz gesagt, wurden Nung-Maxisorp-Mikroplatten (Gibco/BRL) mit einer Kaninchen-Anti-Ovalbumin-IgG-Fraktion (Cappel Laboratories) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten nach Waschen in PBS-T mit einer Lösung von 0,1% Magermilchpulver, verdünnt in PBS-T, eine Stunde lang bei Raumtemperatur geblockt. Als Nächstes wurde eine Lösung von Ovalbumin, verdünnt auf 10 ug/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, in Volumina von 100 ul zu jeder Vertiefung zugesetzt. Im Anschluß an eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Ovalbuminlösung von den Platten abgewaschen. Die Mäuseserumproben wurden dann dreimal hintereinander in PBS-T bei einer anfänglichen Verdünnung von 1 : 40 und einer Endverdünnung von 1 : 87480 verdünnt. 100-ml-Proben wurden pro Vertiefung zugesetzt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach Waschen am nächsten Tag wurden die an die Platten gebundenen Ovalbumin-spezifischen IgE-Antikörper unter Verwendung eines biotinylierten monoklonalen Ratten-Anti-Maus-IgE- Antikörpers (Klon LO-ME-2, Serotec), der in PBS-T auf 2 ug/ml verdünnt war, nachgewiesen. Im Anschluß an eine weitere Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde dieser Antikörper abgewaschen und Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (Vector Laboratories) wurde bei einer Konzentration von 500 ng/ml in jede Vertiefung zugegeben. Die Menge an Ovalbumin-spezifischem IgE in den Mäuseserumproben wurde durch Zugeben des Peroxidasesubstrats, 10% Tetramethylbenzidin (TMB) (ADI Diagnostics) in 0,005% Wasserstoffperoxid, nachgewiesen. Man ließ sich die Farbe in den Vertiefungen fünfzehn Minuten lang entwickeln, und die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 100 ul 1M Schwefelsäure (Fisher Scientific) gestoppt. Die Absorption der Vertiefungen wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät (Multiskan MCC 340 MkII, Flow Laboratories) bei 450 nm mit einer Ablesung bei 540 nm für die Hintergrund-Korrektur gemessen. Die reaktiven Titer wurden als die letzte Verdünnung definiert, bei welcher die Absorptionswerte der Testprobe äquivalent zum Mittelwert der Absorptionswerte waren, welcher aus einer Negativ-Serumkontrolle plus drei Standardabweichungen (134,139) abgeleitet wurde. Man berechnete die geometrischen Mittel an 10 g-transformierten Daten und drückte selbige mit 95%-Konfidenz-Intervallen aus.

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt die Bestimmung von Mäuse-Cytokin-Profilen.
Die Spiegel von IL-4 und IFN-γ wurden in einem Sandwich-EIA bestimmt. Kurz gesagt wurden 96-Loch-Nung-Maxisorp-Mikroplatten (Gibco/BRL) über Nacht bei Raumtemperatur mit Cytokin-monospezifischen, monoklonalen Ratten-Antikörpern beschichtet. Diese Antikörper wurden von Pharmingen erhalten und aus den folgenden jeweiligen Klonen abgeleitet: IL-4, Klon 11B11; IL-5, IFN-γ, Klon R4-6A2. Die monoklonalen Antikörper wurden auf eine Konzentration von 2 ug/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt. Am folgenden Tag wurden die Platten in PBS-Tween 20, 0,05% (PBS-T) gewaschen, und nicht-spezüiische Bindungsstellen wurden durch die Zugabe einer 1%igen Rinderserumalbumin-Lösung (Sigma), verdünnt in PBS-T, abgeblockt. Im Anschluß an eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur wurde die überschüssige Blockierung von den Platten abgewaschen, und unverdünnte Kulturüberstände wurden in zweifacher Ausfertigung in die Vertiefungen zugesetzt. Die passenden rekombinanten Standards für jedes Cytokin (rekombinantes IL-4, erhalten von Pharmingen, rekombinantes IFN-γ, erworben von Genzyme) wurden zu den passenden Konzentrationen verdünnt (Anfangskonzentration von 100 ng/ml oder 1000 ng/ml für IL-10- EIA) und seriell dreifach in RPM 1640 (Sigma), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), verdünnt. Die Standards wurden bei 100 ul/Vertiefung ausplattiert, und die Mikroplatten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach gründlichem Waschen in PBS-T wurden die gebundenen Cytokine unter Verwendung eines biotinylierten monoklonalen Antikörpers nachgewiesen, der für jedes Cytokin spezifisch war und in PBS-T auf eine Konzentration von 2 ug/ml verdünnt war. Die Antikörper wurden von Pharmingen erhalten und wurden aus: den folgenden Klonen abgeleitet: IL-4 : Klon BVD6-24G2; IFN-γ : Klon XMG1.2. Nach einem einstündigen Inkubationsschritt bei Raumtemperatur wurde eine Peroxidase-konjugierte Streptavidinpräparation (Veetor Laboratories), verdünnt auf eine Konzentration von. 500 ng/ml, zugesetzt. Eine letzte Waschung wurde im Anschluß an eine einstündige Inkubation der Streptavidin-Präparation bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten wurden durch die Zugabe des Substrates, 10% TMB in 0,05% Wasserstoffperoxid (Fisher Scientific)-Wasser, entwickelt. Die Reaktionen wurden voranschreiten gelassen, bis eine geeignete Farbintensität erreicht war, und wurden durch die Zugabe von 100 ul/Vertiefung einer 1M-Lösung von Schwefelsäure (Fisher Scientific) gestoppt. Die Absorptionen der Reaktionsvertiefungen wurden bei zwei Wellenlängen (450 nm und 540 nm) auf einem Multiskan MCC 340 MkII- Mikroplatten-Lesegerät (Flow Laboratories) abgelesen.
Die Cytokin-Konzentrationen in den Überständen wurden quantifiziert, durch Kalibrieren der Probenabsorptionen gegen die Absorptionen der Standards von bekannten Konzentrationen unter Verwendung des logistischen "Curvefit"-Algorithmus, um die Kurve bei einem Minimum-Korrelationskoeffizienten von 99,9% anzupassen. Das ELISA+-Softwarepaket (Meddata) wurde verwendet, um die in den Überständen vorhandenen Mengen an Cytokinen, basierend auf den auf jeder Platte erzeugten Standard-Kurven, zu quantifizieren.

Beispiel 8

Dieses Beispiel beschreibt antigenspezifische zelluläre Immunantworten.
Mäuse-Milzzellen wurden aus den mit Impfstoff immunisierten BALB/c-Mäusen am Tag 28 erhalten. Die Milzen wurden zu einer Einzelzell-Suspension dissozüert und dreimal in RPMI 1640-Medium (Sigma) gewaschen. Eine Zellzählung wurde unter Anwendung des Trypan- Blau-Ausschlußverfahrens durchgeführt, und die Zellen wurdeh auf eine Konzentration von 2 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt. Die Antigene (Pertussis-Toxoid, Pertactin, FHA, Agglutinogene und nicht-Alum-adsorbierte Diphtherie- und Tetanus-Toxoide) wurden auf eine Konzentration von 5 ug/ml in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, verdünnt. Die Antigene wurden dann einer Zweifach-Verdünnungsreihe bis zu einer Konzentration von 78 ng/ml unterzogen. Die Zellen wurden dann bei einer Endkonzentration von 1 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung jeder Vertiefung zugesetzt. Die Kulturen wurden 72 Stunden lang bei 37ºC in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator inkubieren gelassen. Am Ende dieser Zeitdauer erhielten die Zellen einen Puls mit 0,5 uCi/Vertiefung tritiummarkiertem Thymidin (Amersham), verdünnt in sterilem PBS (Sigma). Nach einer weiteren 18 Stunden langen Inkubation wurden die Zellen auf Glasfaser-Filterpapier abgeerntet, wobei man eine 96-Loch-Erntevorrichtung (Canberra Packard) anwandte, und die Radioaktivitäts-Zählungen wurden auf einem Matrix- 96-Betazähler (Canberra Packard) abgelesen. Die Ergebnisse wurden als Stimulations-Indizes ausgedrückt, welche berechnet wurden durch Dividieren der Mittelwerte der Testzählungen durch die Mittelwerte der Hintergrunds-Zählungen auf der Platte. Jede Probe wurde- in dreifacher Ausführung getestet.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt das Vermögen von Antikörpern, Pertussis-Toxin im CHO-Zell- Neutralisierungs-Assay zu neutralisieren.
Die Fähigkeit der von den Pertussis-Impfstoffen induzierten Antikörper, Pertussis-Toxin zu neutralisieren, wurde im CHO-Zell-Assay überprüft, wie beschrieben von Granstrom et al. (Lit. 47). Die letzte Antikörper-Verdünnung, bei der keine signifikanten morphologischen Auswirkungen ersehen werden konnten, wurde als der Neutralisierungstiter definiert. Die Ergebnisse wurden als Kehrwerte der Neutralisierungstiter ausgedrückt.

Beispiel 10

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von genetisch detoxifiziertem Pertussis-Holotoxin, um einen prophylaktischen Schutz gegen eine Tumorentwicklung zu vermitteln.
Dabei wurde das B16-Maus-Melanom-Modell (Lit. 54) verwendet, um die Effektivität von K9G129 als einem Adjuvanz in der Krebs-Immuntherapie zu überprüfen. Als C57B1/6-Mäuse subkutan mit einem lebenden syngeneischen B16-F1-Stamm von B16-Melanomzellen injiziert wurden, erschienen Tumoren nach etwa zehn Tagen und wuchsen progressiv auf eine exponentielle Weise. Das Tumorauftreten war direkt proportional zu der Dosis an injizierten Zellen, z. B. bildeten sich Tumoren früher, wenn die Mäuse eine Injektion mit 10&sup6; Zellen statt 10&sup4; Zellen erhielten. Die Tumoren konnten durch Immunisieren der Mäuse mit B 16- Melanom-Zellen, welche zuvor mit 10000 rad bestrahlt worden waren, verzögert werden. Diese Verzögerung war ebenfalls dosisabhängig. Eine Immunisierung mit 10&sup6; bestrahlten Zellen verursachte eine größere Verzögerung des Tumorauftretens als ein Immunisieren mit 10&sup5; bestrahlten Zellen, wenn die Mäuse anschließend mit 10&sup5; lebenden Zellen herausgefordert wurden. Ein Immunisieren mit 10&sup4; bestrahlten Zellen verursachte keine signifikante Verzögerung des Tumorwachstums.
Die Effektivität von K9G129 als Adjuvanz wurde durch Messen seiner Fähigkeit getestet, das Tumorwachstum in einem Immunisierungsexperiment bei Kombination mit 10&sup4; bestrahlten Zellen zu verzögern. Sechs Gruppen von Mäusen mit fünf Mäusen pro Gruppe wurden immunisiert mit:
1) Zellkulturmedium (Kontrolle)
2) 10&sup4; bestrahlten Zellen
3) 10&sup4; bestrahlten Zellen + 1 ug K9G129
4) 10&sup4; bestrahlten Zellen + 5 ug K9G129
5) 10&sup4; bestrahlten Zellen + 10 ug K9G129
6) 10&sup4; bestrahlten Zellen + CFA (komplettes Freund'sches Adjuvanz)
Die Mäuse erhielten zwei Wochen später auf die gleiche Weise eine Booster-Injektion, und sie wurden dann zwei Wochen nach der Booster-Gabe mit 10&sup5; lebenden B16-Melanomzellen herausgefordert. Das Auftreten von Tumoren wurde überwacht und die Größe der wachsenden Tumoren wurde mit Dickenmeßgeräten gemessen, wobei sowohl die Länge als auch die Breite aufgezeichnet wurden. Das Volumen der Tumore wurde durch Einsetzen dieser Messungen in die Formel für ein Ellipsoid berechnet.
K9G129 war in einer dosisabhängigen Weise bei der Verzögerung des Ausbruchs des Tumorwachstums wirksam. Dreißig Tage nach der Herausforderung mit 10&sup5; lebenden Melanomzellen gab es keine Mäuse ohne Tumoren in den Gruppen, welche keine Immunisierung (Gruppe 1), bestrahlte Zellen allein (Gruppe 2) oder bestrahlte Zellen mit CFA (Gruppe 6) erhielten. Es gab ebenfalls keine tumorfreien Mäuse in der Gruppe, welche bestrahlte Zellen mit 1 ug K9G129 erhalten hatte (Gruppe 3). Allerdings gab es zwei bzw. vier Mäuse, welche keinen Tumor aufwiesen, aus den Gruppen, welche bestrahlte Zellen mit 5 ug bzw. 10 ug K9G129 erhalten hatten (Gruppen 4 und 5) (Fig. 7). Diese Ergebnisse zeigen eine starke Verzögerung des Tumorauftretens, welche durch die zwei höheren Konzentrationen von K9G129 vermittelt wurde.
Selbst die niedrigste verwendete Konzentration an K9G129 verursachte eine Verzögerung des Tumorauftretens. Bei vier von fünf Mäusen in der Gruppe 3 (bestrahlte Zellen + 1 ug K9G129) erschienen Tumoren, nachdem das Wachstum von Tumoren in Mäusen, welche mit bestrahlten Zellen allein immunisiert worden waren (Gruppe 2), begonnen hatte (Fig. 8). Die Effektivität von K9G129 bei der Verzögerung des Tumorwachstums wird ferner durch Vergleichen der Tumorvolumina einzelner Mäuse in den verschiedenen Gruppen 22 Tage nach der Herausforderung mit lebendigen Melanomzellen gezeigt. Tumoren sind nichtexistent oder ihre Größen sind im allgemeinen niedriger in Mäusen, welche mit bestrahlten Zellen und K9G129 immunisiert worden waren, als in solchen Mäusen, welche mit bestrahlten Zellen allein oder zusammen mit CFA immunisiert worden waren (Fig. 9).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß K9G129 als ein Adjuvanz in der Krebsimmuntherapie wirken kann, um die Immunantwort gegen Tumorzellen zu verstärken.

Beispiel 11

Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung einer Th1-Antwort gegen ein Immunogen, das mit dem S1(K9G129)-Pertussistoxin-Analog als Adjuvanz versetzt war.
Einer der Schlüsselfaktoren, die bei der Potenzierung unterschiedlicher Immunglobulin-Subklassen, einschließlich IgE, beteiligt sind, ist das Vorhandensein von löslichen Mediatoren, welche als Cytokine bekannt sind. Die Steuerung der IgE-Herstellung wird von einer Vielzahl von Cytokinen reguliert, welche nicht nur direkte Effektorfunktionen, wie die Induktion des Immunglobulin-Isotypumschaltens, besitzen, sondern auch dahingehend wirken, die Herstellung anderer Cytokine querzuregulieren. In der Maus wirkt IL-4 nicht nur zur Induktion des IgE- und IgGI-Isotypumschaltens sondern wirkt auch zur Inhibierung der Sekretion von IgM, IgG3, IgG2b und IgG2a (Lit. 48). Andererseits wirkt IFN-γ zur Stimulierung der Herstellung von IgG2a und IgG3, während es die Synthese von IgGI, IgG2b und IgE inhibiert (Lit.48).
Im Bestreben, die vielfachen und quer-regulatorischen Effekte von Cytokinen zu organisieren und rational zu veranschaulichen, ist ein System zur Beschreibung der verschiedenen Muster der Cytokin-Sekretion beschrieben worden (Lit. 49). Mosmann und Coffffian (Lit. 49) definierten zwei getrennte Untergruppen von Mäuse-CD4&spplus;-T-Zellen, basierend auf ihren differentiellen Mustern der Cytokin-Sekretion. Unter Verwendung von langfristigen T-Zell-Klonen waren sie in der Lage, zu zeigen, daß eine Gruppe von Zellen, definiert als Th2, IL-4, IL-5 und IL-10 sezernierte, wohingegen eine andere Gruppe von Zellen, definiert als Th1, IL-2, IFN-γ und TNF-β sezernierte. Diese zwei unterschiedlichen Cytokin-Profile wurden auch mit der Immunglobulinherstellung dahingehend korreliert, daß Th1-Klone eine Hilfe für B- Lymphozyten bereitstellten, um IgG2a herzustellen, wohingegen Th2-Klone die Sekretion von IgG1 und IgE durch B-Zellen förderten (48, 50, 51). Die späteren Arbeiten von Romagnani und seinen Mitarbeitern zeigten die Existenz dieser T-Zell-Unterguppen ebenfalls in Menschen (Lit. 52).
Obwohl die anfängliche Unterscheidung von Th1/Th2-Cytokinprofilen auf der Basis von in vitro-Cytokin-Mustern individueller T-Zellklone definiert worden war, sind die Definitionen erweitert worden, um die Cytokin-Phänotypen zu beschreiben, welche aus einer Immunisierung oder Infektion resultieren (Lit. 48, 53). Diese Phänotypen sind nicht so stark polar, wie diejenigen, welche in der ursprünglichen klonalen Analyse beobachtet wurden, und werden durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Cytokinen definiert. Dabei wird eine Th1- phänotypische Antwort durch einen signifikanten Zuwachs der Cytokine vom Th1-Typ (höhere Verhältnisse von IFN-γ : IL-4) im Verhältnis zu den Th2-Immunantwort-Phänotypen charakterisiert. Diese Klassifizierung erstreckt sich auch auf die antigenspezifischen Immunglobulin-Subklassenprofile, bei denen Th1-Phänotypen sich als höhere IgG2a : IgE- Verhältnisse im Verhältnis zu Th2-Typ-Antworten darstellen.
Die Fig. 5 zeigt das Cytokinprofil in Mäusen, welche mit Ovalbumin immunisiert wurden und PPD und PT(K9G129) als Adjuvanz erhielten. PPD ist ein Adjuvanz, welches eine Th1- Immunantwort hervorruft.
Es wurden Milzzellen aus Mäusen erhalten, welche mit Ovalbumin zusammen mit entweder S1(K9G129)-rPT oder PPD als Adjuvanzien immunisiert worden waren. Die Milzzellen von vier Mäusen in jeder Behandlungsgruppe wurden vereinigt und dann in vitro mit Ovalbumin allein (kein Adjuvanz) erneut stimuliert. Die Überstände wurden dann aus diesen Kulturen abgeerntet, und die Spiegel von IFN-γ und IL-4 wurden durch EIA bestimmt. Man erhielt ähnliche IFN-γ : IL-4-Verhältnisse aus Kulturen, abgeleitet aus Mäusen, immunisiert mit entweder S1(K9G129) oder PPD als einem Adjuvanz. Wie obenstehend beschrieben, ist ein höheres Verhältnis von IFN-γ : IL4-Cytokinen charakteristisch für eine Th1-Immunantwort.
Die Fig. 6 zeigt die Ovalbumin-spezifischen IgG2a- und IgE-Antworten von BALB/c-Mäusen, immunisiert mit Ovalbumin und entweder dem S1(K9G129)-PT-Analog oder PPD als Adjuvanzien. Die Säulengraphik zeigt an, daß die Immunisierung mit dem S1(K9G129)-PT- Analog zu Verhältnissen von Ovalbumin-spezifischen IgG2a : IgE-Verhältnissen führte, welche ähnlich zu denjenigen waren, die im Anschluß an eine Immunisierung mit PPD erhalten wurden. Wie obenstehend beschrieben, ist ein hohes IgG2a : IgE-Verhältnis charakteristisch für eine Th1-Immunantwort. Die Ergebnisse in den Fig. 5 und 6 zeigen daher, daß die Adjuvantierung mit PT(K9G129) eine Th1-Immunantwort in Mäusen hervorruft.

Zusammenfassung der Beschreibung

Als Zusammenfassung dieser Beschreibung sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines genetisch detoxifizierten Pertussis-Holotoxins, welches auch immunogen sein kann, und zwar als ein proteinartiges Adjuvanz anstelle herkömmlicher extrinsischer Adjuvanzien, insbesondere Alum, für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Erzielung einer modulierten Immunantwort gegen ein Nicht-Bordetella-Antigen ohne die nachteiligen Nebenwirkungen von Alum, vor. Tabelle 1a Mutationen, welche in Pertussis-Toxin eingeführt wurden Tabelle 1a (Fortsetzung) Tabelle 1a (Fortsetzung)

Anmerkungen:

Die Aminosäure-Numerierung entspricht den Positionen in den nativen Untereinheiten.
Alle Mutationen liegen in der Untereinheit S1 vor, es sei denn, es wird angegeben, daß sie in S2, S3 oder S4 vorliegen.
II bedeutet die Verwendung eines alternativen Codons.
bedeutet deletierte Rest(e).
Wildtyp bezieht sich auf PT, exprimiert von dem unmutierten TOX-Operon in B. parapertussis.
x Mutanten, deren Verwendung nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie hierin beansprucht, eingeschlossen ist. Tabelle 1b In vitro-Charakterisierung von Pertussis-Toxin-Analogen, erhalten aus rekombinantem B. parapertussis. Tabelle 1b (Fortsetzung)

Anmerkungen:

Die restliche Toxizität ist das Verhältnis der apparenten PT-Konzentration, bestimmt durch den CHO-Zell-Clustering-Assay, zu der tatsächlichen Konzentration der PT-Mutante, bestimmt durch ELISA, welches als Prozentsatz ausgedrückt wird.
Die ADPR-Aktivität ist das Ausmaß der ADP-Ribosylierung von Rinder-Transducin, katalysiert durch ein PT-Analog, im Verhältnis zu demjenigen, katalysiert durch eine gleiche Konzentration an Wildtyp-PT, ausgedrückt als ein Prozentsatz.
S1-Epitop bezieht sich auf die Expression eines immundominanten S1-Epitops, erkannt von einem spezifischen monoklonalen Antikörper PS21 (ATCC HB 10299, hinterlegt am 30. November 1989), im Vergleich zu dem Widtyp-PT (+++++).
ND steht für nicht bestimmt.
x Mutanten, deren Verwendung nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie hierin beansprucht, eingeschlossen ist. Tabelle 2 Funktionelle Aminosäurereste in Pertussis-Toxin für die Mutation Tabelle 3 Immunogenität der Pertussistoxin-Komponente eines azellulären DTP-Impfstoffs und eines azellulären DTP-Impfstoffs, enthaltend ein genetisch detoxifiziertes PT-Analog

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Claims

1. Verwendung eines genetisch entgifteten Pertussis-Holotoxins, in dem wenigstens eine von Arg&sup9;, Arg¹³, Trp²&sup6;, Arg&sup5;&sup8; und Glu¹²&sup9; der Holotoxin S1-Untereinheit entfernt oder ersetzt wurde, zur Herstellung eines Medikaments, umfassend das genetisch entgiftete Pertussis-Holotoxin, um eine adjuvante Immunantwort auf wenigstens ein Nicht-Bordetella- Antigen, das mit dem genannten genetisch entgifteten Pertussis-Holotoxin auf dem gleichen Wege verabreicht wird, zur Verfügung zu stellen, wobei das genetisch entgiftete Pertussis- Holotoxin adjuvant ist für die Bereitstellung der adjuvanten Immunantwort, in Abwesenheit eines extrinsischen Adjuvans und wobei mindestens ein Nicht-Bordetella-Antigen (i) ein virales Pathogen-Antigen, (ii) ein Nicht-Bordetella-bakterielles Pathogen-Antigen oder (iii) ein nicht-bakterielles, nicht-virales parasitäres Pathogen-Antigen ist, unter der Voraussetzung, dass das Medikament ein genetisch entgiftetes Pertussis-Holotoxin umfasst, welches eine nicht-toxische Mutantenform des Pertussis-Toxins ist, indem die Glu¹²&sup9;-Aminosäure der Holotoxin S1-Untereinheit durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, das Mutanten-Pertussis-Toxin und mindestens ein Nicht-Bordetella-Antigen werden zusammen verabreicht (a) parenteral oder nichtparenteral auf demselben Wege, wenn mindestens ein Nicht-Bordetella-Antigen ein virales Pathogen-Antigen oder ein Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Hämophilus, Meningococci, Streptococci, Schistosoma oder Trypanosoma-Antigen ist, wobei das Clostridium tetani-Antigen nicht das C-Fragment des Tetanustoxins ist, oder (b) parenteral wenn das Nicht-Bordetella-Antigen nicht so ist wie in (a) spezifiziert.

2. Verwendung wie in Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genetisch entgiftete Pertussis-Holotoxin immunoprotektiv ist.

3. Verwendung wie in Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Aminosäuren des genetisch entgifteten Pertussis-Holotoxins entfernt oder ersetzt sind.

4. Verwendung wie in Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Aminosäuren (S1) Arg&sup9;, Glu¹²&sup9; sind.

5. Verwendung wie in Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten mehreren Aminosäuren ersetzt sind (S1) Arg&sup9; zu Lys&sup9; und Glu¹²&sup9; zu Gly¹²&sup9;.