FI104233B - Menetelmä stabiilien, interleukiineja sisältävien rokotekoostumusten valmistamiseksi - Google Patents

Description

104233

Menetelmä stabiilien, interleukiineja sisältävien rokote-koostumusten valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä stabiilin rokote-5 koostumuksen valmistamiseksi sekä menetelmä interleukiinin stabiloimiseksi koostumuksessa.

Tausta

On usein toivottavaa parantaa antigeenin immunogee-nista tehoa, jotta saadaan aikaan voimakkaampi immuunivas-10 te immunisoitavassa organismissa ja voimistetaan isännän vastustuskykyä antigeeniä sisältävän taudinaiheuttajan suhteen. Ainetta, joka edistää kanssansa injektoitavan antigeenin immunogeenisuutta, kutsutaan adjuvantiksi. Yksi melko tehokas adjuvantti on Freundin adjuvantti, vesi öl-15 jyssä -emulsio. Freundin adjuvantti on tehokkaimmillaan suspendoitaessa eläviä tai tapettuja mykobakteereja emulsioon (Freundin täydellinen adjuvantti) yhdessä antigeenin kanssa. Emulsion antokohtien ympärille kehittyvä voimakas krooninen tulehdus estää kuitenin tämän adjuvantin käytön 20 ihmiselle. Emulsiot, joista puuttuvat mykobakteerit (epätäydellinen Freundin adjuvantti), ovat vähemmän ärsyttäviä, ja niitä on käytetty ihmiselle. Yksi toinen adjuvant-tityyppi on suspensio, joka sisältää mineraaleja, joille antigeeni adsorboidaan.

25 Tietyillä lymfokiineillä on osoitettu olevan adju- vanttivaikutus, ja siten ne voimistavat immuunivastetta antigeeniin. Esimerkiksi Good et ai. ovat osoittaneet, että alumiiniyhdisteelle adsorboidun yhdistelmäihmis-IL-2:n (rhIL-2) käyttö voimistaa immuunivastetta malariaan 30 liittyvään antigeeniin. Tämä koostumus valmistettiin ja 4 * käytettiin välittömästi eikä sen stabiiliutta ajan kulues sa ole varmistettu [Good, M. F. et ai., J. Immunol. 141 (1988) 972 - 977]. Nakamura et ai. ovat osoittaneet, että gamma-interferoni indusoi kaksin- - viisinkertaisen vasta-35 ainetuotannon muutamia antigeenejä vastaan [Nakamura et 2 104233 al., Nature 307 (1984) 381 - 382]. Myös interleukiinien on osoitettu voimistavan immuunivastetta joihinkin muihin antigeeneihin. [Nancioni et ai., J. Immunol. 139 (1987) 800 - 804; Howard et ai., EP-julkaisu 285 441].

5 Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee menetelmää stabiilin inter-leukiinia sisältävän rokotekoostumuksen valmistamiseksi, jotka sisältää seosta, joka koostuu antigeenistä ja adju-vanttimäärästä interleukiinia, adsorboituna suspensiossa 10 olevalle mineraalille. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Seos voi sisältää säilytettä. Interleukiineja, kuten interleukiini-ΐα:aa, interleukiini-lS:aa, interleukiini-2 :a, interleukiini-3:a, interleukiini-4:ää, interleukiini-15 5:ä, interleukiini-6:a ja interleukiini-7:ää, voidaan käyttää adjuvantteina yhdessä antigeenin (erityisesti gly-kokonjugaattien) kanssa adsorboituina suspendoidulle mineraalille, kuten alumiiniyhdisteelle (esimerkiksi alumiinihydroksidille tai -fosfaatille), antigeeniin kohdistuvan 20 immuunivasteen moduloimiseksi. Näitä rokotekoostumuksia voidaan säilyttää. Keksinnön mukaiselle menetelmälle in-terleukiinin stabiloimiseksi rokotekoostumuksessa on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa II esitetään. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • 25 Valmistettavat rokotekoostumukset sisältävät adju vant timäärän interleukiinia yhdessä antigeenin kanssa adsorboituna suspensiossa olevalle mineraalille ja säilytettä. Mineraali on edullisesti alumiiniyhdiste (esimerkiksi alumiinihydroksidi tai alumiinifosfaatti) , joka on suspen-30 doitu vesipohjaiseen väliaineeseen.

·' Interleukiini toimii antigeeniin kohdistuvaa immuu nivastetta moduloivasti, kun taas alumiiniyhdiste stabiloi interleukiinin biologista aktiivisuutta. Alumiiniyhdisteen poissa ollessa interleukiinien puoliintumisajat ovat ly-35 hyitä. Niinpä tässä kuvattuja rokotekoostumuksia voidaan 104233 3 säilyttää aikoja, jotka muuten johtaisivat interleukiinin stabiiliuden menetykseen. Stabilointi pidentää suuresti aikaan, joka on käytettävissä rokoteformuloiden valmistukseen, kuljetukseen ja varastointiin ennen rokoteformulan 5 antoa.

Voidaan käyttää useita eri interleukiineja. Niihin kuuluvat interleukiini-l«, interleukiini-ΐβ, interleukii-ni-2, interleukiini-3, interleukiini-4, interleukiini-5, interleukiini-6, interleukiini-7 ja niiden seokset. Inter-10 leukiinien osia, joilla on immuunimodulaatiovaikutus, voi daan myös käyttää. Edullinen interleukiini on interleukii-ni-2.

Interleukiini voidaan hankkia mistä tahansa sopivasta lähteestä. Niitä voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-15 menetelmin. Muutamia ihmisen interleukiineja koodittavia geenejä on esimerkiksi kloonattu ja saatettu ilmentymään erilaisissa isäntäjärjestelmissä, mikä antaa mahdollisuuden tuottaa suuria määriä puhdasta ihmisen interleukiinia. Lisäksi tietyt T-lymfosyyttilinjat tuottavat suuria määriä 20 interleukiinia ja tarjoavat siten käyttöön interleukiini- lähteen.

Säilyte voi olla mikä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävä säilyte. Niihin kuuluvat timerosaali, fenoli, m-kresoli, bentsyylialkoholi, metyyli- tai etyyliparabeeni 25 ja 2-fenoksietanoli.

Interleukiinia voidaan käyttää adjuvant tina monille eri antigeenityypeille. Yleisesti ilmaistuna antigeenit voivat olla hiukkasmaisia antigeenejä, kuten bakteereita, viruksia ja solujen makrokomponentteja, ja liukoisia anti-30 geenejä, kuten proteiineja, peptidejä, glykoproteiineja ja hiilihydraatteja. Erityisen kiintoisia antigeenejä ovat virus- tai bakteeriantigeenit, allergeenit, autoimmuni-teettiin liittyvät antigeenit, kasvaimiin liittyvät antigeenit, onkogeenituotteet, loisantigeenit, sieniantigeenit 35 ja niiden fragmentit. Antigeenit voivat olla peräisin 104233 4 luonnon lähteistä tai niitä voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-menetelmin tai muilla keinotekoisilla tavoilla.

Kiintoisiin bakteeriantigeeneihin kuuluvat antigeenit, jotka liittyvät ihmiselle patogeenisiin bakteereihin, 5 mukaan luettuina esimerkiksi tyypitettävissä oleva tai tyypittymätön Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Corynebacteriä diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Borde-10 telia pertussis, Pseudomonas aerugiosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae ja Clostridium tetani. Erityisiin bakteeriantigeeneihin kuuluvat bakteerien (esimerkiksi Haemophilus influenzaen, Neisseria meningitidis in, Neisseria gonorrhoeaen tai Branhamella catarrhal isin) pin-15 ta- ja ulkokalvoproteiinit ja bakteerien pintaproteiinit (esimerkiksi Streptococcus pyogenesin M-proteiini).

Patogeenisiin virusantigeenilähteisiin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, ihmisen immuunikatovirus (tyypit I ja II), ihmisen T-soluleukemiavirus 20 (tyypit I, II ja III), hengitysteiden synkytiaalivirus, A-hepatiitti-, B-hepatiitti-, C-hepatiitti- ja ei-A- ja ei-B-hepatiittivirus, herpes simplex -virus (tyypit I ja II) , sytomegalovirus, inluenssavirus, parainfluenssavirus, poliovirus, rotavirus, coronavirus, vihurirokkovirus, tuhka-25 rokkovirus, vesirokkovirus, Epstein Barr -virus, adenovirus, papilloomavirus ja keltakuumevirus.

Näiden patogeenisten virusten erityisiin virusanti-geeneihin kuuluvat hengitysteiden synkytiaaliviruksen (RSV:n) F-proteiini [erityisesti antigeenit, jotka sisäl-30 tävät F-peptidiä 283 - 315, jota kuvataan WO-patenttijulkaisussa 89/02935 (Paradiso, P. et ai., Respiratory Syncytial Virus; Vaccines and Diagnostic Assays)] ja N- ja G-proteiinit, rotaviruksen VP4- (aiemmin VP3-), VP6- ja VP7-polypeptidit, ihmisen immuunikatoviruksen vaippaglyko- 5 104233 proteiinit, B-hepatiittiviruksen S- ja pre-S-antigeenit ja herpesglykoproteiinit B ja D.

Kiintoisia ovat myös erilaiset autoimmuunisairauksiin, kuten reumatoidiseen artriittiin ja punahukkaan, 5 liittyvät antigeenit.

Erityisen kiintoisia rokotteessa käytettäviksi ovat patogeenisten bakteereiden tuottamat kapselipolymeerit (CP:t). Kapselipolymeerejä ovat sokeripitoiset polymeerit, kuten sokereiden, sokerihappojen, aminosokereiden, poly-10 hydristen alkoholien ja sokerifosfaattien polymeerit. Muutamat kapselipolymeerit ja -oligomeerit ovat käyttökelpoisia rokotteina.

Kapselipolymeerit (CP:t) voivat olla peräisin monista eri bakteerityypeistä. Näihin tyyppeihin kuuluvat 15 Haemophilus influenzae, Streptococcus-lajit, mukaan luet tuina pneumoniae (erityisesti serotyypit l, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F), pyogenes ja agalactiae, Neisseria meningitidis (kuten seroryhmät a, b ja c), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ja Staphylococcus au-20 reus.

Muita kuin bakteeripolymeerejä voidaan saada hiivoista ja sienistä, esimerkiksi Cryptococcus neoformansis-ta, tai syöpäsoluilla esiintyvistä ainutlaatuisista tai allergeenien yhteydessä esiintyvistä hiilihydraattipitoi-• 25 sista yksiköistä.

Antigeenejä voidaan käyttää herättämään antigeenin kohdistuva immuunivaste selkärankaisessa (kuten nisäkä-sisännässä). Eläimelle annetaan immunologisesti vaikuttava annos rokotekoostumusta, joka sisältää seosta, joka koos-30 tuu antigeenistä ja adjuvanttimäärästä interleukiinia, adsorboituna suspensiossa olevalle mineraalille ja lisättyä säilytettä. Nämä rokotekoostumukset ovat käyttökelpoisia mikrobi-infektioiden estämisessä. Antigeenejä voidaan antaa farmaseuttisesti hyväksyttävässä vehikkelissä, kuten 35 fysiologisessa suolaliuoksessa tai etanolipolyoleissa (ku- 104233 6 ten glyserolissa tai propyleeniglykolissa). Rokotekoostu-mus voi mahdollisesti sisältää muita adjuvantteja, kuten kasviöljyjä tai niiden emulsioita, pinta-aktiivisia aineita, esimerkiksi heksadekyyliamiinia, oktadekyyliaminohap-5 poestereitä, oktadekyyliamiinia, lysolesitiiniä, dimetyy- lidioktadekyyliammoniumbromidia, N,N-dioktadekyyli-N',N'-bis(2-hydroksietyylipropaaniamiinia), metoksiheksadekyyli-glyserolia tai pluronipolyoleja; polyamiineja, esimerkiksi pyraania, dekstraanisulfaattia, poly-IC:tä tai karbopolia; 10 peptidejä, esimerkiksi muramyylidipeptidiä, dimetyyligly- siiniä tai tuftsiinia; immunostimuloivia komplekseja (ISCOM:iä); öljyemulsioita; ja mineraaligeelejä. Antigeenejä voidaan myös sisällyttää liposomeihin tai ISCOM:-iin. Täydentäviä aktiivisia aineosia voidaan myös käyttää. 15 Rokotteita voidaan antaa ihmiselle tai eläimelle erilaisin tavoin. Niihin kuuluvat ihonsisäinen, transder-maalinen (kuten käyttämällä hitaasti vapauttavia polymeerejä) , lihaksensisäinen, vatsaontelonsisäinen, laskimon-sisäinen, ihonalainen, oraalinen ja nenänsisäinen anto-20 reitti. Tällaisessa rokotteessa käytettävä antigeenimäärä vaihtelee käytettävän antigeenin mukaan. Perinteisten kantaja-antigeenien yhteydessä käytettävien vakiintuneiden annostusalueiden säätäminen ja manipulointi soveltuviksi keksinnön mukaisiin rokotteisiin kuuluu ammattimiesten • 25 taitojen piiriin. Tässä kuvatut rokotteet on tarkoitettu käytettäviksi sekä keskenkasvuisten että täyskasvuisten vaihtolämpöisten eläinten ja erityisesti ihmisen hoidossa. Kuvatun koostumuksen käyttö ei myöskään rajoitu ennaltaehkäisyyn; myös terapeuttinen käyttö (esimerkiksi AIDSin 30 ehkäisy ja hoito) on mahdollinen.

·* Interleukiinin adjuvanttivaikutuksella on joukko tärkeitä seurauksia: interleukiinin adjuvanttivaikutus voi suurentaa antigeeniä vastaan syntyneiden suojäävien vasta-aineiden pitoisuutta rokotetussa organismissa. Tämän seu-35 rauksena voidaan saavuttaa tehokas (ts. suojaava) rokotus 104233 7 normaalisti tarvittavaa pienemmällä antigeenimäärällä. Tämä tarvittavan antigeenimäärän pieneminen voi johtaa vaikeasti tai kalliisti valmistettavien rokotteiden laajempaan käyttöön. Tämä pätee erityisesti kehitysmaihin, 5 joilla on hyvin rajoitetut terveydenhoitobudjetit ja joita kohtaavat hengityselinsairaus-, ripulisairaus- ja malaria-epidemiat. Se voi tarjota myös käyttöön turvallisemman rokotuksen, kun antigeeni on myrkyllinen tehokkaan immunisoinnin normaalisti vaatimana pitoisuutena. Pienentämällä 10 antigeenimäärää vähennetään toksisen reaktion’vaaraa.

Interleukiinit voivat immunomodulaatioaktiivisuu-tensa kautta auttaa herättämään suojaavan immuunivasteen marginaalisesti immunogeenisiin tai ei-immunogeenisiin antigeeneihin. Tällä tavalla rokotekoostumuksista, jotka 15 sisältävät suurempien proteiinien fragmentteja, synteettisiä antigeenejä tai yhdistelmä-DNA-tekniikan tuotteita, voidaan tehdä tehokkaampia sekoittamalla niitä interleu-kiineihin.

Rokotusohjelmat vaativat tyypillisesti antigeenin 20 antamista viikkoja tai kuukausia kestävän jakson ajan "suojaavan" immuunivasteen stimuloimiseksi. Suojaava immuunivaste on immuunivaste, joka riittää suojaamaan immunisoidun isännän tai kohteen tautiin johtavalta infektiolta, jonka aiheuttaa yksi tai useampi määrätty patogeeni, 25 johon rokote kohdistuu. Interleukiini voi annettuna yhdessä antigeenin kanssa ja adsorboituna suspensiossa olevalle mineraalille nopeuttaa suojaavan immuunivasteen syntymistä. Tämä voi lyhentää tehokkaiden rokotusohjelmien kestoa. Se voi joissakin tapauksissa johtaa suojaavan immuunivas-30 teen syntymiseen yhdellä annoksella. Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistetut rokoteformulat ovat riittävän stabiileja lämpötilassa 4 °C mahdollistaakseen rokoteformuloiden valmistuksen, kuljetuksen ja varastoinnin.

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavin esimerkein. 35 104233

Esimerkit

Esimerkki 1: rhIL-l:n tai rhIL-2:n adjuvanttivaikutus alumiiniyhdisteen läsnä ollessa HbOC-antigeeni-rokotteen yhteydessä 5 Formuloitiin alhainen annos (0,1 /zg/hiiri) Haemo- philus-tyypin b CRM-(ristireagoiva materiaali)konjugaattia (HbOC) yhdessä alumiiniyhdisteen (100 μg/hiiri) kanssa tai ilman sitä käyttämällä erilaisia rhIL-2-, rhIL-la- tai rhIL-lS-pitoisuuksia, jotka olivat alueella 1 *102 - 5 *105 10 yksikköä/hiiri. Kaikki rokotteet valmistettiin immunisoin-tipäivänä ja pidettiin lämpötilassa 4 °C injektointiin asti. Rokotteiden valmistuksessa käytetyt interleukiinit joko saatettiin käyttövalmiiseen muotoon formulointipäivä-nä tai otettiin talteen laimennetusta varastoseoksesta 15 (25 μg/ml), joka pidettiin lämpötilassa -70 °C. Ryhmiin

Swiss-Webster-hiiriä (Tatonic Farms, Germantown, NY) injektoitiin lihaksensisäisesti (i.m.) viikoilla 0 ja 2 0,1 ml rokoteformuloita. Seeruminäytteitä otettiin eri taulukoissa esitetyllä tavalla.

20 A. rhIL-2 adjuvanttina

Taulukossa 1 esitetään tulokset, joita saatiin annettaessa rhIL-2:a adjuvanttina rokotettaessa hiiri sekä alumiiniyhdisteen poissa ollessa [palstat, joiden otsikkona on (-)] että yhdistettynä alumiiniyhdisteeseen [pals-· 25 tat, joiden otsikkona on (+)]. Vasta-ainepitoisuudet il moitetaan käyttämällä yksikköä μg/ml ja ne määritettiin viikoilla 2, 4 ja 6 antigeenin (0,1 μg) annon jälkeen.

Näissä tutkimuksissa käytetty antigeeni oli HbOC. Annetut rhIL-2-annokset olivat alueella 1 -103 - 1 *105 yksikköä/hii-30 ri.

9 TAULUKKO 1 104233

HbOC rhIL Viikko 2 Viikko 4 Viikko 6 (Hi) iYlSsikköä)^(Ό (*) ( + ) (*) (+) (-) 5 Sarja 1: 0,1 103 A,70 0,28 7,89 3,46 8,16 3,62 0,1 10* 2,25 0,51 9,39 5,01 17,77 5,83 0,1 105 0,37 0,55 A,71 3,0A 5,31 2,91 0,1 -* 0 ,A6 <0,10 3; 5 3 0,42 5,46 3,53 10

Sarja 2: 0,1 102 1,02 0,AO 6,32 A,21 5,90 3,32 0,1 103 0,54 0,75 5,77 4,73 5,60 4,61 0,1 104 1,68 <0,10 12,99 1,95 19,06 1 , 25 15 0,1 105 0,25 <0,10 5,94 5,46 3,91 3,82 0,1 -- 0,53 0,30 7,09 2,64 8,30 2,82

Kuten on nähtävissä yllä olevista palstoista (-), 20 rhIL-2:lla on ilman alumiiniyhdistettä vasta-ainetuotantoa stimuloiva vaikutus. Kahdessa erillisessä kokeessa vertai-lunäytteissä läsnä oleva vasta-ainepitoisuus oli esimerkiksi 0,42 pg/ml ja 2,62 pg/ml.

Tulokset, jotka saatiin sisällytettäessä alumiini-25 yhdistettä yhdessä rhIL-2:n kanssa adjuvanttiseokseen, esitetään taulukossa 1 palstoilla (+). Tässäkin tapauksessa havaitaan merkittävä stimuloiva vaikutus. Alumiiniyh-disteen läsnä ollessa vasta-ainereaktio on kuitenkin merkittävästi voimakkaampi kuin reaktio, joka havaitaan muu-, 30 ten samanlaisten, alumiiniyhdistettä sisältämättömien näytteiden (rokotusten) yhteydessä.

Tarkasteltaessa ajanhetkeä 4 viikkoa on havaittavissa, että alumiiniyhdisteen läsnä ollessa (+) vasta-ainepitoisuudet ovat jopa yli kymmenkertaiset vastaaviin, 35 ilman alumiiniyhdistettä (-) saavutettuihin vasta-ainepi- 104233 10 toisuuksiin nähden. Lisäksi havaitaan ilmeinen riippuvuus rhIL-2-pitoisuudesta, jota ei esiinny alumiiniyhdistettä sisältämättömissä näytteissä (-). Tarkemmin määriteltynä havaittu korrelaatio oli sellainen, että vasta-ainepitoi-5 suus kasvoi, kun rhIL-2-pitoisuus laski arvon 1 -105 alapuolelle. rIL-2:n ja alumiiniyhdisteen yhdistelmän ollessa kyseessä, annos, joka näytti stimuloivan voimakkaimman vasta-ainetuotannon, oli noin 1-104 yksikköä/hiiri.

B. rhIL-1 adjuvanttina 10 Taulukoissa 2 ja 3 esitetään tulokset, joita saa tiin immunisoinneissa, joissa käytettiin adjuvanttina rhIL-la:aa ja vastaavasti rhIL-lS:aa. Taulukossa 2 esitetään tulokset, joita saatiin anti-PRP-vasta-ainemäärityk-sissä (pitoisuuksien yksikkönä /ig/ml) kahden viikon välein 15 immunisoinnin jälkeen. Tälläkin kerralla kokeita tehtiin joko käyttämällä alumiiniyhdistettä (+) tai ilman sitä (-> .

TAULUKKO 2 20

HbOC rhlL^la Viikko 2 Viikko 4 Viikko 6 (££) (yksikköä)(+) (*) (+) (*) (+) (*)

Sarja 1: 0,1 103 1,96 1,02 IA,63 4,9A 13,25 4,93 0,1 10A 0,70 2,54 7,16 5,11 12,44 11,17 25 0,1 105 0,33 1,49 4,69 7,02 6,14 8,73 0,1 -IL 0,46 <0,10 3,53 0,42 5,46 3,53

Vertailunäyte

Sarja 2: 30 0,1 102 <0,10 1,02 3,68 4,36 4,07 3,00 0,1 103 1 ,06 1,17 12,31 5,54 8,74 3,08 0,1 10A 0,47 1,47 4,73 8,97 5,98 6,55 0,1 105 0,34 1,00 8,55 16,74 7,77 16,29 0,1 -IL 0,53 0,30 7,09 2,64 8,30 2,82

Vertailunäyte 104233 11 rhIL-la- ja rhIL-16-adjuvanttiseoksilla saadut tulokset olivat kokonaisuutena tarkasteluina samanlaisia kuin rhIL-2-sarjassa saadut. Taulukko 2 osoittaa esimerkiksi, että annettaessa rhIL-la:aa adjuvanttina ilman alu-5 miiniyhdistettä ilmenee stimuloiva vaikutus verrattuna muuten samanlaiseen, lymfokiiniä sisältämättömään rokotteeseen. Kuten palstoilla () esitetään, havaittiin taipumus vasta-ainetuotannon laskuun rhll-la:n määrän adjuvant-tiseoksessa aletessa arvosta 1·105 arvoon 1·102 yksikköä/-10 hiiri.

Alumiiniyhdisteen läsnä ollessa rhIL-la:lla oli myös stimuloiva vaikutus. rhIL-la:lla oli yllättävästi kasvava kyky stimuloida immuunivastetta pitoisuutensa aletessa. Optimaalinen rhIL-la-adjuvanttimäärä oli alumiini-15 yhdisteen läsnä ollessa noin 1·103. Vasta-ainepitoisuuksien havattiin olevan tällaisten pitoisuuksien vallitessa kaksin- - kolminkertaisia muuten samanlaisiin, alumiiniyhdis-tettä sisältämättömiin näytteisiin (-) nähden.

Samanlaisia tuloksia saatiin käytettäessä rhlL-20 IB:aa adjuvanttina, kuten esitetään taulukossa 3. Taulu kossa 3 esitetyt tulokset ovat yhteenveto vasta-ainepitoi-suusmääritykeistä, joita tehtiin viikoilla 2, 4 ja 6, käytettäessä vaihtelevia rhIL-lB-adjuvanttipitoisuuksia joko yhdistettyinä alumiiniyhdisteeseen tai ilman sitä. 6:a 25 koeryhmää lukuunottamatta kaikissa 21 koeryhmässä alumii-niyhdistettä sisältävä rokote (+) johti suurempaan vasta-ainepitoisuuteen kuin alumiiniyhdistettä sisältämätön rokote (-).

12 104233 TAULUKKO 3

HbOC rhIL-1/ί Viikko 2 Viikko 4 Viikko 6 (££) (+) (·) (+) (-) (+) (-) _ Sarja 1: 5 3 0,1 10 0,41 0,96 5,27 4,09 8,32 5,22 0,1 10A 0,90 0,62 4,13 3,39 8,15 6,39 0,1 105 1,46 0,46 13,35 1,77 8,60 1,06 0,1 -IL 0,46 <0,10 3,53 0,42 5,46 3,53 ^ Vertailunäyte

Sarja 2: 0,1 102 0,85 0,16 8,76 0,04 6,66 1,91 0,1 103 0,30 0,40 4,57 0,68 6,87 10 33 15 0,1 10U 1,08 0,36 5,75 5,15 5,17 4,47 0,1 105 0,19 0,36 2,34 3,0 4,98 3,92 0,1 -IL 0,53 0,30 7,09 2,64 8,30 2,82

Vertailunäyte 1

Esimerkki II: rhIL-la:n, rhIL-lB:n, rhIL-2:n ja niiden seosten adjuvanttivaikutus RSV-F-proteiini-rokotteeseen

Sen määrittämiseksi, voidaanko interleukiineja käyttää edistämään vasta-ainereaktiota proteiinirokottee-v 25 seen, formuloitiin erilaisia hengitysteiden synkytiaalivi ruksen (RSV.) F-proteiinipitoisuuksia yhdessä alumiiniyh-disteen kanssa (lopullinen määrä 100 pg/hiiri) ja käyttämällä rhIL-2:a tai rhIL-la:aa 1·104 tai 1*105 yksikköä/hii-ri tai jättäen rhIL-2 ja rhIL-Ια pois. Swiss-Webster-hii-30 riryhmät (5 eläintä/ryhmä) immunisoitiin lihaksensisäises-1 ti viikoilla 0 ja 2. Eläimistä otettiin verinäytteitä tau lukossa 4 esitetyllä tavalla.

RSV-F-proteiinia annettiin kolmena annoksena (1, 0,1 ja 0,01 pg/hiiri). Niistä vain annos 0,01 pg oli opti-35 maalista alhaisempi käytettyissä olosuhteissa. Vertaamalla 13 104233 vastetta, joka havaittiin ryhmissä, jotka saivat erilaisia interleukiineja sisältäviä rokotteita, vertailuryhmään, joka sai 0,01 μg proteiinia yhdistettynä pelkkään alumii-niyhdisteeseen, ei havaittu rhIL-2:n tai rhIL-la:n merkit-5 sevää vaikutusta (ero pitoisuuksissa nelinkertainen) F-proteiinin herättämään vasta-ainereaktioon. rhIL-2:lla käsitellyissä ryhmissä vasteet olivat kuitenkin voimakkaampia kuin vertailuryhmissä annoksen ollessa 11404 yksik-köä/hiiri, mikä vastaa HbOC-tutkimuksissa saatuja tulok-10 siä. IL-la:n ollessa kyseessä kumpikin annos näyttää parantavan jonkin verran vasta-ainereaktioita vertailuryhmiin nähden. Kiintoisaa on, ettei seoksilla, jotka sisälsivät 1 -104 yksikköä/hiiri rhIL-2:a ja rhIL-la:aa, esiintynyt mitään merkkejä synergismistä, vaan vaste ennemminkin 15 hieman heikkeni suhteessa vertailukokeisiin, mikä viittaa interleukiinien mahdolliseen antagonistiseen vuorovaikutukseen .

TAULUKKO 4 14 104233 rhIL-2:n adjuvanttivaikutus RSV-F-proteiinirokotteeseen F-proteiini Yksik- 5 (£3^ rh IL köä___Viikko_2 Viikko_4 Viikko_6

0,1 -IL

Vertailunäyte -- 141 657 2 341 756 2 454 512 01 IL-2 104 191 935 2 045 327 2 101 951 5 10 0,1 IL-2 10 309 797 2 275 311 2 311 326

0,01 -IL

Vertailunäyte -- 68 627 802 611 687 334 0,01 IL-2 10* 145 467 1 580 552 1 699 135 15 0,01 IL-2 105 60 134 722 396 815 351

0,1 -IL

Vertailunäyte -- 141 657 2 341 756 2 454 512 0,1 IL-lo 10A 123 446 1 861 917 1 771 952 20 0?1 IL-Ια 105 79 386 1 185 475 1 214 008

0,01 - IL

Vertailunäyte -- 68 627 802 611 687 334 0 01 IL-lo 10Λ 54 081 1 003 110 1 094 459 ' 5 : 25 0,01 IL-lo 10 59 566 708 009 1 178 056

0,1 -IL

Vertailunäyte -- 141 657 2 341 756 2 451 512 0fl Seos 10* 207 410 2 593 957 2 353 912 30

: 0,01 -IL

Vertailunäyte -- 68 627 802 611 687 334 0,01 Seos 104 15 947 367 224 532 050 1(0 -- -- 211 662 2 269 615 2 899 079 15 104233

Esimerkki III: Rokotus yhdellä annoksella Taulukossa 1 esitetään koetulokset, joista ilmenee immuunivaste HbOC:hen käytettäessä rhIL-2:a yhdessä alu-miiniyhdisteen kanssa ja ilman sitä. rhIL-2-määrän ollessa 5 1 ♦ 103 yksikköä HbOC stimuloi alumiiniyhdisteen läsnä olles sa yhden annon jälkeen vasta-ainereaktion, joka johti pitoisuuteen 4,7 pg/ml. Tällainen vasta-ainepitoisuus on korkeampi kuin rajapitoisuus, jota yleisesti pidetään välttämättömänä suojauksen kannalta.

10 Esimerkki IV: Adjuvantin stabiilius A. rhIL-2:n stabiiliuden määrittäminen in vitro Alumiiniyhdistettä sisältävässä koostumuksessa olevan rhIL-2:n stabiiliuden tutkimiseksi sekoitettin HbOC-antigeenia (2,5 pg/hiiri) ja 104 yksikköä rhIL-2:a, adsor-15 boitiin seos alumiinifosfaatille ja varastoitiin tuotetta lämpötilassa 4 eC. Taulukossa 5 esitetään in vitro -sta-biiliusmäärityksessa saadut tulokset. Määrityksessä viljeltiin 5·103 CTLL-2-solua (CTLL = cytotoxic T lymphocyte lysis, sytotoksinen T-lymfosyyttihajotus) erilaisten rhlL-20 2-standardi- ja HbOC-rokotepitoisuuksien läsnä ollessa. Soluja inkuboitiin Roswell Park Memorial Institute -alustassa (RPMI), joka sisälsi 10 % FBS:ää, lämpötilassa 37 eC 24 tuntia ja käsiteltiin 16 tuntia [3H]-tymidiinillä (1,0 pCi/syvennys). Alumiiniyhdisteelle adsorboituneen .. 25 rhIL-2-määrän arvioimiseksi valmiste sentrifugoitiin, jol loin alumiiniyhdiste pelletoitui, ja määritettiin superna-tantista rhIL-2-aktiivisuus. Määrityksen mukaan noin 2/3 rhlL-2:sta adsorboituu alumiiniyhdisteelle. Kuten taulukossa 5 esitetään, mittaamalla rhIL-2-aktiivisuus eri 30 ajanhetkinä alumiinifosfaatille adsorboinnin jälkeen to-·. dettiin, että lymfokiini säilytti aktiivisuutensa korkein- taan 2 viikkoa.

m 16 104233 TAULUKKO 5 rhIL-2:n stabiiliuden määritys in vitro ([3H]-tymidiinin sisällys IL-2-pitoisuudella 1,0 ky/ml pulssia/min ± SD)

Viikko_0 Viikko_l Viikko_2 ^ Perusviiva:

Alusta (pulssia/min) 303 ± AI 1 540 ± 67 135 ± 49

Interleukiini-2: 10 BM:n 161791491 100561689 1332311428 tuote

Cetusin 28 300 1 2250 25 681 1 135 25 992 1 868 tuote

HbOC-rokotteet rhIL-2 24 188 1 783 31 989 1 2252 36 312 1 3102

Alumiiniyhdiste/ rhIL-2 19 419 1 1330 28 785 1 1691 35 091 1 690

Alumiiniyhdiste/ 20 rhlL-2 supc 4 460 1 205 5 716 + 211 13 460 1 1231 rhlL- 2 + 50/jg

Alumiiniyhdis- ND ND 35 627 1 2503 tettä B. RhIL-2:n stabiiliuden määrittäminen in vivo 25 Suunniteltiin in vivo -määritys rhIL-2:n stabiiliu den tutkimiseksi. Hiiret immunisoitiin HbOC-alumiiniyhdis-te-IL-2-rokotteella, jota oli säilytetty edellä kuvatulla tavalla. Neljä kahden DBA/2-hiiren ryhmää immunisoitiin käyttämällä 10 μg (proteiinimäärä) HbOCrtä CFA:ssa, alu- 30 miiniyhdisteessä, rhIL-2:ssa/alumiiniyhdisteessä tai rhlL-: 2:ssa 3 peräkkäisenä viikkona. Otettiin imusolmukenäyttei- tä viikon kuluttua injektoinnista ja valmistettiin yksit-täissolususpensio. 3 *105 imusolmukesolua viljeltiin mito-geenien ja erilaisten DT-, CRM- ja TT-pitoisuuksien läsnä 35 ollessa. Soluja inkuboitiin RPMI-alustassa, joka sisälsi 1,0 % NMS:ää, lämpötilassa 37 °C 3 vrk, käsiteltiin 16 17 104233 tuntia [3H]-tymidiinillä (1,0 pCi/syvennys) ja otettiin talteen laskennan tekemiseksi LS-laskurissa. HbOC-CFA-ryh-mässä havaittiin merkittävä T-soluvaste. Viikoilla 2 ja 3 rhIL-2 indusoi kuitenkin voimistuneen T-soluvasteen. Li-5 säksi jopa pelkkä HbOC näyttää suojaavan rhIL-2:a hajoamiselta.

Vastineet

Ammattimiehet havainnevat tai pystynevät korkeintaan rutiinikokein löytämään monia vastineita tässä kuva-10 tun keksinnön erityissuoritusmuodoille. Tällaiset vastineet on tarkoitettu kuuluviksi seuraavien patenttivaatimusten piiriin.

104233 18 TAULUKKO 6 IL-2:n stabiilius in vivo HbOC-rokotteen yhteydessä, sisällytetyn 1¾]-tymidiinin maksimimäärä (SI ± SD) g Viikko 1 HbOC-rokotteen adjuvantti: Käsittely Alumiini- IL-2/alumii- _in_vitro_________CFA ____s t_e * nij£hd is te _ _ 11..;«

Alusta (x cp») 434 + 22 190 ±19 366 ±33 12 3 ± 6 CA 1.0/ig/Bl 4 3,3 + 3,9 69,7± 3,9 58(4± 5,1 1 3 6 , 9 ± 2,4 LPS 50/jg/ol 129,4+ 8,7 1 89,9+ 7,7 69,0+ 4 , 5 103,9± 6,6 DT 17,5± 1,2 4,4± 0,04 1,4+ 0,3 1,8+ 0,1 CRH 162,0+ 14,9 9,8+ 0,3 0,8+ 0,1 0,8+ 0,1 TT_______________0X8± 0X07____0χ4 + _0χ0 3____2-ti±_2.t2_____0χ6± 0χ0 5

Viikko 2

Alusta 1 185 ±175 590 ±42 552 +48 187 ±11 15 CA l.Opg/nl 4 0,6+ 3 , 4 57 , 5+ 1,8 5 3 , 1± 0,9 165,1+11,5 LPS 50pg/n>l 71 , 5± 1 , 2 89,9± 3,7 14 2 , 1 i 8,7 203,51 1 7 ,8 DT 16,5+ 0,4 1,1± 0,0 1,3+ 0,2 2,9+ 0,0 CRH, 50,6± 0,5 1,31 0,0 10,5+ 0,3 1,6+ 0,0 TT 06+ 0.1 0,11 0,0 0,11 0X0 0,4+ 0X0

Alusta Viikko 3 519 ± 59 416 ± 9 442 ±63 966 +51 CA l.Opg/nl 45,91 0,3 41,01 2,6 46,41 0,9 27,5+ 2,1 LPS 50>ig/n.l 1 2 9,21 7 , 6 1 1 9,41 5,3 1 26,51 6 , 3 8 1 , 9+ 3 ,1

·: 25 DT 5,61 0,8 HA 2,21 0,2 NA

CRH 98,11 8,1 17,91 1,4 25,21 1,6 31,4+ 2,6 TT_____ ________ox4i oxi_____2j.2±_o+o_____2-i.li_o.tO_____2t,ii_2*2_ •Nämä ryhmät saivat 2,0 % NMS:ää 1,0 %:n sijasta «

Claims (11)

104233

1. Menetelmä stabiilin rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sekoitetaan 5 antigeeni adjuvanttimäärän kanssa interleukiinia, joka on esim. interleukiini-ΐα, interleukiini- 1β, interleukiini-2, interleukiini-3, interleukiini-4, interleukiini-5, inter-leukiini-6, interleukiini-7 tai niiden seos, adsorboituna vesisuspensiossa olevalle alumiiniyhdisteelle kuten 10 alumiinihydroksidille tai alumiinifosfaatille farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa mahdollisessa adjutantissa ja mahdollisessa farmaseuttisesti hyväksyttävässä säilytteessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa antigeeni valitaan bakteerien, virusten, solujen makrokomponenttien, proteiinien, peptidien, glykopro-teiinien, hiilihydraattien, parasiittien, sienten, onko-geenituotteiden ja syöpäsolujen joukosta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa antigeeni on bakteeriantigeeni, joka valitaan bakteerin kapselipolymeerien tai -oligomeerien tai sellaisten fragmenttien ja bakteerin pinnan tai ulkokalvon 25 proteiinien joukosta.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa bakteeriantigeeni on peräisin patogeenisestä bakteerista, joka valitaan joukosta Haemophilus influenzae,

30 Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus I. pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Corynebacteriä diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aerugiosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae ja Clostridium 35 tetani. « 104233

5 Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae. Pseudomonas aeruginosa tai Staphylococcus aureus.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa bakteerin kapselipolymeerin tai -oligomeerin tai sellaisen fragmentin lähteenä on Haemophilus influenzae,

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, 10 jossa antigeeni on kytketty kurkkumätä-, jäykkäkouristusta! hinkuyskäbakteerin toksiiniin, ristireagoivaan materiaaliin (CRM) tai niiden toksoidiin glykokonjugaatin muodostamiseksi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa glykokonjugaatti sisältää polyribosyyliribitoli- fosfaattia ja kurkkumätätoksiinin CRMi97:ää.

8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, 20 jossa bakteerin pinnan tai ulkokalvon proteiinin lähteenä on Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae tai Branhamella catarrhalis.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, 25 jossa bakteerin pinnan proteiini on Streptococcus pyogenesin M-proteiini.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, jossa virusantigeeni valitaan joukosta hengitysteiden 30 synkytiaaliviruksen F-proteiini, hengitysteiden synky-tiaaliviruksen N-proteiini, hengitysteiden synkytiaaliviruksen G-proteiini, rotaviruksen VP4-polypeptidi, rotaviruksen VP6-polypeptidi, rotaviruksen VP7-polypeptidi, ihmisen immuunikatoviruksen vaippaglykoproteiinit, herpes- 104233 glykoproteiinit B ja D ja hepatiitti B:n S- ja pre-S-antigeenit.

11. Menetelmä interleukiinin stabiloimiseksi rokotekoostumuksessa, tunnettu siitä, että 5 sekoitetaan antigeeni adjuvanttimäärän kanssa inter-leukiinia, joka on esim. interleukiini-ΐα, interleukiini- 1β, interleukiini-2, interleukiini-3, interleukiini-4, inter-leukiini-5, interleukiini-6, interleukiini-7 tai niiden seos, adsorboituna vesisuspensiossa olevalle alumiiniyhdis-10 teelle kuten alumiinihydroksidille tai alumiinifosfaatille interleukiin stabiloimiseksi varastointiolosuhteissa. • · 22 104233