ES2342239T3

ES2342239T3 - Expresion y exportacion de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.

Info

Publication number: ES2342239T3
Application number: ES99942468T
Authority: ES
Inventors: Kin-Ming Lo; Yue Li; Stephen D. Gillies
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2010-07-02
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: ZA200101290B; WO2000011033A3; EP1107989A2; WO2000011033A2; JP2009273478A; CN1326467A; JP2002523036A; NO20010918L; RU2240328C2; US20070009538A1; AU5583699A; HK1042503A1; DK1107989T3; PT1107989E; JP2013128490A; US8703908B2; NO20010918D0; HUP0103329A3; ATE462725T1; DE69942207D1

Abstract

Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis, que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina.

Description

Expresión y exportación de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere, de manera general, a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión que contienen un inhibidor de la angiogénesis. De una manera más particular, la invención se refiere a métodos y a composiciones para la producción y para la utilización de proteínas de fusión denominadas inmunofusinas, que contienen una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII.

Fundamento de la invención

Se han descubierto dos potentes inhibidores de la angiogénesis, la angiostatina (O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315) y la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277), y se ha encontrado que son generados de manera natural por los tumores primarios. Ambas proteínas son inhibidores específicos de la proliferación de las células endoteliales y que inhiben el crecimiento de los tumores mediante el bloque de la angiogénesis, que consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos, que alimentan a los tumores. Se ha puesto de manifiesto por medio de estudios que estos inhibidores de la angiogénesis no son tóxicos incluso a dosis muy altas y que éstos pueden suprimir el crecimiento de las metástasis y que los tumores primarios pueden regresar hasta un estado microscópico durmiente. Ambos inhibidores han sido identificados como fragmentos proteolíticos de un gran número de moléculas intactas. Se ha encontrado que la angiostatina es un fragmento de plasminógeno, y que la endostatina es un fragmento del colágeno XVIII.

Estas dos proteínas han provocado un gran interés en el área del cáncer, dado que se ha mostrado que suprimen el crecimiento de un gran número de diversos tipos de tumores en ratones, con efectos laterales o resistencia al fármaco, no obvios. La quimioterapia tradicional conduce, por regla general, a una resistencia adquirida al fármaco, que está provocada originalmente por la inestabilidad genética de las células cancerosas. Las terapias que utilizan inhibidores de la angiogénesis, en lugar de ir dirigidas a las células cancerosas, van dirigidas a las células normales endoteliales, que favorecen el crecimiento del tumor. Puesto que las células endoteliales son genéticamente estables, es posible que las terapias con inhibidores de la angiogénesis puedan dar como resultado una menor resistencia al fármaco. Los estudios realizados indican que la resistencia al fármaco no se desarrolla en ratones expuestos a una dormancia tumoral prolongada y que no se produce una recurrencia de los tumores como consecuencia de una intermisión de la terapia (Boehrn et al. (1997) Nature 390:404).

Independientemente de los resultados prometedores en ratones, no ha sido posible producir angiostatina ni endostatina activa, soluble en grado clínico, en cantidades comerciales empleándose sistemas de expresión en E. coli, en baculovirus, en levaduras y en mamíferos. La expresión en E. coli dio como resultado agregados proteicos insolubles de composición indefinida, que no pudieron ser inyectados en seres humanos. Otros métodos de producción, tales como los sistemas de expresión en baculovirus y en mamíferos, dieron como resultado niveles muy bajos de las proteínas recombinantes (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

Los bajos rendimientos de los sistemas de expresión, hasta la fecha, pueden ser explicados debido a que tanto la angiostatina como la endostatina son fragmentos internos de un gran número de proteínas. Es posible que las proteínas truncadas no sea plieguen adecuadamente en ausencia de los residuos que son escindidos a partir de las moléculas precursoras. Por ejemplo, la angiostatina tiene 26 residuos de cisteína, que forman numerosos enlaces de disulfuro. Es posible que la expresión de la angiostatina no proporcione por si misma el medio óptimo para que se formen correctamente en la vía secretoria estos numerosos enlaces de disulfuro. De igual modo, la proteína de endostatina recombinante, producida en E. coli, se precipita durante la diálisis, posiblemente debido al carácter hidrófugo de la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277).

La barrera principal para la utilización de la angiostatina y de la endostatina en sus formas actuales consiste en las cantidades relativamente grandes de proteínas que deben ser inyectadas diariamente durante semanas o meses para alcanzar el resultado clínico deseado. Por ejemplo, en los modelos actuales con ratones se necesitan dosis de 20 mg/kg/día de endostatina para demostrar una eficacia óptima (Boehm et al. (1997) Nature 390:404). Dado que existe una urgente necesidad de ensayar la endostatina y la angiostatina por vía clínica, es importante un método de producción, que pueda generar grandes cantidades de material de grado clínico.

Un sistema de expresión, que ha sido utilizado para producir la expresión a nivel elevado de proteínas de fusión en células de mamíferos, es un constructo de ADN, que codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana. El producto de la fusión de este constructo se denomina, por regla general, como una "inmunofusina". Se han expresado con éxito diversas proteínas diana como inmunofusinas que incluyen: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, \betaIG-H3, receptor de IgE, PSMA, y gp120. Estos constructos de expresión están descritos en la patente norteamericana número 5,541,087 y en la patente norteamericana número 5,726,044.

Un propuesta principal de expresión de proteínas de fusión recombinantes en células de mamíferos ha consistido en intentar conferir propiedades nuevas o convenientes a las moléculas híbridas, por ejemplo un plegamiento adecuado, un aumento de la solubilidad, una idoneidad para una citocina o para una toxina in vivo, un enlace del receptor Fc, una fijación complemento, un enlace de la proteína A, un aumento de circulación de semivida y una habilidad acrecentada para cruzar la barrera sangre-cerebro. Ejemplos de proteínas de fusión recombinantes producidas en células de mamíferos incluyen los inmunoconjugados de citocina (Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies et al. (1993) Bioconjugate Chemistry 4: 230), inmunoadhesinas (Capon et al. (1989) Nature 337: 525), inmunotoxinas (Chaudhary et al. (1989) Nature 339: 394), y un conjugado del factor del crecimiento de los nervios (Friden et al. (1993) Science 259: 373).

Un objeto de la invención consiste en proporcionar nuevos ADN, que codifican proteínas de fusión con actividad inhibidora de la angiogénesis y que facilitan la producción y la secreción eficientes de inhibidores de la angiogénesis en una variedad de células huésped de mamíferos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones convenientes para la producción y para el empleo de proteínas de fusión, que comprenden una región Fc de inmunoglobulina y a una proteína diana, que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII. Las proteínas de fusión pueden facilitar un elevado nivel de expresión de proteínas inhibidoras de la angiogénesis biológicamente activas. Las proteínas inhibidoras de la angiogénesis pueden ser escindidas a continuación a partir de la proteína de fusión y pueden ser combinadas con un excipiente farmacéuticamente aceptable como paso previo a su administración a un mamífero, por ejemplo a un ser humano.

La invención proporciona, en un aspecto, moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o moléculas de ARN, que codifican una proteína de fusión de la invención. La molécula de ácido nucleico codifica una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y, al menos, una proteína diana, denominada aquí también como la proteína inhibidora de la angiogénesis, siendo dicha proteína diana, al menos única, la endostatina, o un fragmento de colágeno XVIII, que tiene actividad de endostatina. En una realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie, en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la región Fc de inmunoglobulina y la secuencia de la proteína diana. En otra realización preferente, la molécula de ácido nucleico codifica, en serie en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la secuencia diana y la región Fc de inmunoglobulina.

En otra realización preferente, la región Fc de inmunoglobulina comprende una región bisagra de inmunoglobulina y, de manera preferente, comprende, al menos, una región pesada constante de inmunoglobulina, por ejemplo un dominio 2 (CH2) pesado constante de inmunoglobulina, un dominio 3 (CH3) pesado constante de inmunoglobulina y, en función del tipo de inmunoglobulina empleado para generar la región Fc, opcionalmente un dominio 4 (CH4) de región pesada constante de inmunoglobulina. En una realización más preferente, la región Fc de inmunoglobulina comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Bajo ciertas circunstancias, la región Fc de inmunoglobulina carece al menos, de manera preferente, del dominio CH. Aún cuando las regiones Fc de inmunoglobulina pueden estar basadas en cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo la IgA, la IgD, la IgE, la IgG y la IgM, son preferentes las regiones Fc de inmunoglobulina Fc basadas en la IgG.

En otra realización, el ácido nucleico de la invención puede ser incorporado en asociación operativa en un vector de expresión replicable, que puede ser transfectado a continuación a una célula huésped de mamífero. En otra realización preferente, la invención proporciona células huésped, que alojan a dichas secuencias de ácido nucleico de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión, que comprende una región Fc de inmunoglobulina enlazada bien directamente a través de un enlace polipeptídico o por medio de un segmento enlazador polipeptídico con, al menos, una proteína diana que tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de un fragmento de colágeno XVIII, que tiene actividad de endostatina. La proteína diana puede ser fusionada, a través de un extremo C-terminal, con un extremo N-terminal de la región Fc de inmunoglobulina. Sin embargo, en una realización más preferente, la proteína diana es fusionada, a través de su extremo N-terminal, con un extremo C-terminal de la región Fc de inmunoglobulina.

En otra realización, la proteína de fusión puede comprender una segunda proteína diana, seleccionada entre el grupo constituido por la angiostatina, la endostatina, un fragmento plasminógeno que tenga actividad de angiostatina, y un fragmento de colágeno XVIII, que tenga actividad de endostatina. En este tipo de constructo, la primera proteína diana y la segunda proteína diana pueden ser proteínas iguales o diferentes. Por ejemplo, en una realización preferente, la proteína de fusión comprende una primera proteína diana de angiostatina, una región Fc de inmunoglobulina y una segunda proteína diana de endostatina. La primera proteína diana y la segunda proteína diana pueden estar ligadas recíprocamente, bien directamente o bien a través de un segmento enlazador polipeptídico.

De manera alternativa, las dos proteínas diana pueden estar ligadas, bien directamente o a través de un segmento enlazador polipeptídico, con la región Fc de inmunoglobulina. En el último caso, la primera proteína diana está conectada con un extremo N-terminal de la región Fc de inmunoglobulina y la segunda proteína diana está conectada con un extremo C-terminal de la región Fc de inmunoglobulina.

En otra realización, pueden asociarse dos proteínas de fusión, bien de manera covalente, por ejemplo, por medio de un enlace de disulfuro o de un enlace peptídico, o de manera no covalente, para producir una proteína multimérica. En una realización preferente, están asociadas de manera covalente dos proteínas de fusión por medio de uno o más enlaces de disulfuro, a través de residuos de cisteína, preferentemente localizados dentro de las regiones bisagra de inmunoglobulina, que están dispuestas dentro de las regiones Fc de inmunoglobulinas de ambas cadenas.

En una realización preferente, la proteína diana comprende un fragmento de colágeno XVIII que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 4.

Por otra parte, la proteína diana puede ser la angiostatina o la endostatina de longitud completa o pueden estar constituida por fragmentos bioactivos de las mismas. La fuente de la proteína diana para la generación de ciertas proteínas de fusión dependerá de la utilización prevista para la proteína diana. Por ejemplo, si la proteína diana debe ser administrada a un ser humano, la proteína diana será, preferentemente, de origen humano.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la producción de una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, tal como se ha indicado precedentemente y como se indica en las reivindicaciones. Los métodos comprenden las etapas de (a) proporcionar una célula de mamífero que contenga una molécula de ADN, que codifique dicha proteína de fusión, bien con o sin secuencia señal, y (b) el cultivo de la célula de mamífero para producir la proteína de fusión.

La proteína de fusión resultante puede ser alojada, replegada, si es necesario, y purificada por medio de la utilización de técnicas de purificación convencionales, que son perfectamente conocidas y utilizadas en el ramo. Suponiendo que la proteína de fusión comprende un locus de escisión proteolítica, dispuesto entre la región Fc de inmunoglobulina y la proteína diana, la diana puede ser escindida a partir de la proteína de fusión empleándose enzimas proteolíticos convencionales y, si es necesario, puede ser purificada como paso previo a su utilización.

Los objetos, características y ventajas que preceden y otros, de la presente invención, se ponen más claramente de manifiesto por medio de la descripción detallada, de los dibujos y de las reivindicaciones siguientes.

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Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1C-1F son ilustraciones esquemáticas de proteínas de fusión inhibidoras de la angiogénesis, a título de ejemplo, construidas de conformidad con la invención (véanse los ejemplos 10-15). Las figuras representan, de manera respectiva:

la figura 1C, el segmento enlazador Fc-endostatina-GlySer-Kringle interno 1 de angiostatina;

la figura 1D, el segmento enlazador Fc-endostatina-GlySer-Kringle 1 de angiostatina;

la figura 1E, el segmento enlazador Fc-endostatina-GlySer-angiostatina;

la figura 1F, la angiostatina-Fc-endostatina.

Las líneas verticales representan enlaces opcionales de disulfuro, que conectan residuos de cisteína (C) dispuestos dentro de una región bisagra de la molécula Fc.

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Descripción detallada de la invención

La invención proporciona proteínas de fusión, que se denominan aquí como inmunofusinas, que son convenientes para la producción de cantidades comerciales de inhibidores de la angiogénesis en grado clínico. Los inhibidores de la angiogénesis pueden ser escindidos a partir de constructos de proteína de inmunofusina, como paso previo a su utilización. Sin embargo, se contempla el hecho de que las inmunofusinas o los ácidos nucleicos, que codifican las inmunofusinas, puedan ser administrados directamente a los mamíferos cuando sea necesario el tratamiento con un inhibidor de la angiogénesis.

Por consiguiente, la invención proporciona proteínas de fusión, que comprenden una región Fc de inmunoglobulina y, al menos, una proteína diana, que se denomina aquí como inhibidor de la angiogénesis. El inhibidor de la angiogénesis preferente se elige entre el grupo constituido por la angiostatina, la endostatina, un fragmento plasminógeno con actividad de angiostatina, un fragmento de colágeno XVIII, que tenga actividad de endostatina. Sin embargo, se contempla el hecho de que puedan ser expresados como proteínas de fusión, del tipo aquí descrito, otros polipéptidos con actividad inhibidora de la angiogénesis, conocidos ahora o que sean descubiertos más adelante.

En los dibujos se han ilustrado, como figuras 1C-1F, cuatro realizaciones ejemplificativas de constructos proteicos que representan la invención. Puesto que son preferentes los constructos dímeros, todos ellos han sido ilustrados en forma de dímeros reticulados por un par de enlaces de disulfuro entre las cisteínas y las subunidades adyacentes. Los puentes de disulfuro están representados en los dibujos de forma que enlazan recíprocamente las porciones de dos regiones Fc de inmunoglobulina a través de una región bisagra de inmunoglobulina y, de este modo, son características de las formas nativas de estas moléculas. Mientras que son preferentes los constructos, que incluyen la región bisagra de Fc, y se han mostrado prometedores como agentes terapéuticos, la invención contempla el hecho de que pueda elegirse como deseada la reticulación en otras posiciones. Por otra parte, bajo algunas circunstancias, pueden ser producidos dímeros o multímeros, convenientes en la práctica de la invención, por asociación no covalente, por ejemplo por medio de una interacción hidrófuga.

Debido a que los constructos homodiméricos son realizaciones importantes de la invención, la figura 1 ilustra dichos constructos.

Las figuras 1C hasta 1E representan varias realizaciones de los constructos proteicos de la invención, que incluyen, a título de una proteína diana, varios inhibidores de la angiogénesis, que están dispuestos en tándem y que están conectados por medio de un segmento enlazador. En la figura 1C, la proteína diana comprende la endostatina 4 en toda su longitud, un segmento enlazador polipeptídico 5 y un anillo interno de Kringle uno de angiostatina 3. La figura 1D representa una proteína que comprende una región Fc, que es la misma que la de la figura 1A y una proteína diana, que comprende una endostatina 4 en toda su longitud, un segmento enlazador polipeptídico 5 y una región completa de Kringle uno de angiostatina (anillos interno y externo) 2. La figura 1E difiere del constructo de la figura 1D en que el principal dominio proteico C terminal comprende una copia de longitud completa de angiostatina 7.

Aún cuando las figuras 1C - 1E representan constructos de tipo Fc-X, siendo X la proteína diana, se contempla el hecho de que también pueden ser convenientes en la práctica de la invención los constructos de tipo X-Fc. Por otra parte, se contempla el hecho de que las proteínas convenientes de la invención pueden ser representadas también por la fórmula X-Fc-X, pudiendo representar las X proteínas diana iguales o diferentes. La figura 1F representa un constructo de este tipo, que comprende en un sentido N-terminal hacia C-terminal, la angiostatina humana de longitud completa 7, una región Fc de inmunoglobulina humana 6, que incluye una región bisagra, y un dominio de endostatina humana de longitud completa 4.

El término "inhibidor de la angiogénesis", tal como es usado aquí, se refiere a cualquier cadena polipeptídica, que reduzca o que inhiba la formación de nuevos vasos sanguíneos en un mamífero. Con relación a la terapia del cáncer, el inhibidor de la angiogénesis reduce o inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos en o sobre un tumor, preferentemente en o sobre un tumor sólido. Se contempla el hecho de que los inhibidores de la angiogénesis convenientes pueden ser identificados por medio del empleo de una variedad de ensayos perfectamente conocidos y utilizados en el ramo. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, el ensayo de proliferación de células endoteliales capilares bovinas, el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) o el ensayo con córnea de ratón. Sin embargo, es preferente el ensayo CAM (véanse, por ejemplo, las publicaciones de O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315-328 y de O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277-285). En resumen, se retiran embriones con la yema intacta a partir de huevos blancos fertilizados, con una edad de tres días, y se colocan en un disco de petri. Tras incubación a 37ºC, con un 3% de CO_{2} durante tres días, se aplica a la membrana corioalantoidea de un embrión individual un disco de metilcelulosa, que contiene el supuesto inhibidor de la angiogénesis. Tras incubación durante aproximadamente 48 horas, se observaron las membranas corioalantoideas bajo un microscopio para poner de manifiesto las zonas de
inhibición.

Los inhibidores de la angiogénesis preferentes, que son convenientes en la práctica de la invención, incluyen, por ejemplo, la angiostatina (O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315-328, y las patentes norteamericanas números 5,733,876; 5,837,682; y 5,885,795), y la endostatina (O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277-285 y la patente norteamericana número 5,854,205). Tal como se ha indicado precedentemente, la angiostatina y la endostatina son inhibidores específicos de la proliferación de las células endoteliales y son capaces de inhibir el crecimiento tumoral por medio del bloqueo de la angiogénesis, que corresponde a la formación de nuevos vasos sanguíneos, que nutren a los tumores.

La angiostatina ha sido identificada como un fragmento proteolítico de plasminógeno (O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315-328, y patentes norteamericanas números 5,733,876; 5,837,682; y 5,885;795). De manera específica, la angiostatina es un fragmento interno con 38 kDa de plasminógeno, que contiene, al menos, tres de las regiones Kringle de plasminógeno. La endostatina ha sido identificada como un fragmento proteolítico de colágeno XVIII (O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277-285). De manera específica, la endostatina es un fragmento C-terminal de 20 kDa de colágeno XVIII. Los términos "angiostatina" y "endostatina", tal como son empleados en este caso, no solamente se refieren a las proteínas con toda su longitud, sino que se refieren, también, a variantes y a fragmentos bioactivos de las mismas, así como a los fragmentos bioactivos de plasminógeno y de colágeno XVIII, respectivamente. El término fragmento bioactivo, con respecto a la angiostatina, se refiere a cualquier fragmento proteico de plasminógeno o de angiostatina que tenga, al menos, un 30%, de manera más preferente al menos un 70% y, en el caso más preferente, al menos un 90% de la actividad de la angiostatina de longitud completa, tal como se ha determinado por medio del ensayo CAM. El término fragmento bioactivo, con respecto a la endostatina, se refiere a cualquier fragmento proteico de colágeno XVIII o de endostatina que tenga, al menos, un 30%, de una manera más preferente al menos un 70% y, en el caso más preferente, al menos un 90% de la actividad de la endostatina de longitud completa, tal como se ha determinado por medio del ensayo CAM.

El término variantes incluye variantes específicas y alélicas así como otras variantes de origen natural o de origen no natural, por ejemplo generadas por protocolos de ingeniería genética convencional, que tengan, al menos, un 70% de similitud o un 60% de identidad, de una manera más preferente, al menos un 75% de similitud o un 65% de identidad y, en el caso más preferente, un 80% de similitud o un 70% de identidad con respecto a las secuencias de origen natural bien de la endostatina o bien de la angiostatina, aquí descritas.

Con objeto de determinar si un candidato polipéptidico tiene el requisito de porcentaje de similitud o de identidad con respecto a un polipéptido de referencia, la secuencia de aminoácidos candidata y la secuencia de aminoácidos de referencia son alineadas en primer lugar, empleándose el algoritmo de programación dinámico descrito en la publicación de Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147:195-197, en combinación con la matriz de substitución BLOSUM62 descrita en la figura 2 de la publicación de Henikoff y Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915-10919. Para la presente invención, un valor apropiado para la penalización de hueco de inserción es -12, y un valor adecuado para la penalización de hueco de extensión es -4. Se encuentran disponibles en el comercio y son ampliamente utilizados por los técnicos en la materia programas de ordenador, que llevan a cabo alineamientos con la utilización del algoritmo de Smith-Waterman y de la matriz BLOSUM62, tal como el paquete de programas GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Inglaterra).

Una vez que ha sido realizado el alineamiento entre la secuencia candidata y la secuencia de referencia, puede ser calculada una puntuación en porcentaje de similitud. Los aminoácidos individuales de cada secuencia son comparados secuencialmente de acuerdo con su similitud recíproca. Si el valor de la matriz BLOSUM62, que corresponde a los dos aminoácidos alineados, es cero o es un número negativo, la puntuación de similitud por pares es cero; en otro caso la puntuación de similitud por pares es 1,0. La puntuación de similitud en bruto es la suma de las puntuaciones de similitud por pares de los aminoácidos alineados. La puntuación en bruto se normaliza a continuación dividiéndola entre el número de aminoácidos en la secuencia más pequeña de las secuencias candidato o de referencia. La puntuación en bruto normalizada es la similitud en porcentaje. De manera alternativa, para llevar a cabo el cálculo de un porcentaje de identidad, son comparados secuencialmente de nuevo los aminoácidos alineados de cada secuencia. Si los aminoácidos no son idénticos, la puntuación de identidad por pares es cero; en otro caso la puntuación de identidad por pares es 1,0. La puntuación de identidad en bruto es la suma de los aminoácidos alineados idénticos. La puntuación en bruto se normaliza a continuación dividiéndola entre el número de aminoácidos en la secuencia más pequeña de las secuencias candidato o de referencia. La puntuación en bruto normalizada es el porcentaje de identidad. Las inserciones y las supresiones son ignoradas para el propósito de llevar a cabo el cálculo de la similitud y de la identidad en porcentaje. Por consiguiente en este cálculo no son empleadas penalizaciones de hueco, aún cuando son empleadas en la alineación inicial.

Las proteínas diana, aquí descritas, están expresadas como proteínas de fusión con una región Fc de una inmunoglobulina. Como es sabido, cada región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina está constituida por cuatro o cinco dominios. Los dominios son denominados secuencialmente de la manera siguiente: CH_{1}-bisagra-CH_{2}-
CH_{3}(-CH_{4}). Las secuencias de ADN de los dominios de la cadena pesada tienen una homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo el dominio CH_{2} de la IgG es homólogo con el dominio CH_{2} de la IgA y de la IgD, y con el dominio CH_{3} de la IgM y de la IgE.

Tal como se usa aquí, el término "región Fc de inmunoglobulina" se entenderá como la porción carboxi-terminal de la región constante de la cadena de inmunoglobulina, preferentemente una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, o una porción de la misma. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina puede comprender 1) un dominio CH_{1}, un dominio CH_{2}, y un dominio CH_{3}, 2) un domino CH_{1} y un dominio CH_{2}, 3) un dominio CH_{1} y un dominio CH_{3}, 4) un dominio CH_{2} y un dominio CH_{3}, o 5) una combinación de dos o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina. En una realización preferente, la región Fc empleada en el constructo de ADN incluye, al menos, una región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH_{2} y un dominio CH_{3} y, de manera preferente carece, al menos, del dominio CH_{1}.

La clase actualmente preferente de inmunoglobulina, a partir de la cual se deriva la región constante de la cadena pesada, es la IgG (Ig\gamma) (subclases \gamma 1, 2, 3 o 4). Pueden ser empleadas otras clases de inmunoglobulina IgA (Ig\alpha), IgD (Ig\delta), IgE (Ig\varepsilon) e IgM (Ig\mu). La elección de las regiones constantes apropiadas de la cadena pesada de inmunoglobulina se trata en detalle en las patentes norteamericanas números 5,541,087 y 5,726,044. Se considera que se encuentra al alcance del técnico en la materia la elección de secuencias particulares de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina a partir de ciertas clases y subclases de inmunoglobulina. De manera preferente, la porción del constructo de ADN, que codifica la región Fc de inmunoglobulina, comprende al menos una porción de un dominio bisagra y, de manera preferente, comprende al menos una porción de un dominio CH_{3} de la Fc\gamma o los dominios homólogos en cualquiera de las IgA, IgD, IgE o IgM.

En función de la aplicación, pueden ser empleados genes de región constante, procedentes de especies diferentes a los seres humanos, por ejemplo procedentes de ratón o de rata. La región Fc empleada como un participante en la fusión en el constructo de ADN de inmunofusina puede proceder, en general, de cualquier especie mamífera. Cuando no sea deseable inducir una respuesta inmune en la célula o en el animal huésped frente a la región Fc, la región Fc puede derivarse de la misma especie que la célula o que el animal huésped. Por ejemplo, puede ser empleado Fc humano cuando sea humano el animal huésped o cuando sea humana la célula huésped; de la misma manera, puede emplearse Fc murino cuando el animal huésped sea un ratón o cuando la célula huésped sea murina. Por otra parte, sería conveniente, así mismo, la substitución o la supresión de constructos de estas regiones constantes, en las que estén substituidos o suprimidos uno o varios residuos de aminoácidos de los dominios de la región constante. Un ejemplo consistiría en la introducción de substituciones de aminoácidos en la región superior CH_{2} para crear una variante Fc, que reduzca la afinidad de los receptores de Fc (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613). Un técnico medio en la materia puede preparar estos constructos empleando técnicas de biología molecular perfectamente
conocidas.

El empleo de la Fc\gamma1 humana como secuencia de la región Fc tiene varias ventajas. Por ejemplo, si la proteína de fusión Fc inhibidora de la angiogénesis debe ser empleada como un producto biofarmacéutico, el dominio Fc\gamma1 puede conferir las actividades de función efectora a la proteína de fusión. Las actividades de función efectora incluyen las actividades biológicas tales como la fijación del complemento, la citotoxicidad celular dirigida contra el anticuerpo, la transferencia placental y el incremento de la semivida en suero. Así mismo, el dominio Fc proporciona proteína A ("proteína A") para la detección por medio del ensayo ELISA anti-Fc y de la purificación mediante enlace con Staphylococcus aureus. Sin embargo, en ciertas aplicaciones puede ser deseable suprimir funciones efectoras específicas a partir de la región Fc, tal como el enlace de receptor de Fc o la fijación del complemento.

En el caso de las inmunofusinas inhibidoras de la angiogénesis, una función del participante en la fusión Fc de inmunoglobulina consiste en facilitar el plegamiento adecuado de la proteína inhibidora de la angiogénesis para proporcionar una proteína inhibidora de la angiogénesis activa y para imprimir solubilidad a las mitades activas, al menos en el medio extracelular. Puesto que el participante en la fusión Fc es hidrófilo, la inmunofusina inhibidora de la angiogénesis es fácilmente soluble de una manera inusual, por ejemplo, la endostatina recombinante producida en E. coli (O'Reilly (1997) Cell 88:277). En todos los ejemplos, aquí descritos, se obtuvieron elevados niveles de producción de las inmunofusinas. Las inmunofusinas inhibidoras de la angiogénesis fueron secretadas en medios a concentraciones comprendidas, de manera típica, entre aproximadamente 30 y 100 \mug/ml, y pudieron ser purificadas fácilmente hasta homogeneidad mediante cromatografía con proteína A. De manera adicional, las inmunofusinas inhibidoras de la angiogénesis pudieron ser escindidas y pudieron ser purificadas todavía más por medio del empleo de protocolos de purificación convencionales, por ejemplo por medio de heparina sefarosa, de lisina sefarosa o de una purificación por afinidad.

Además de los elevados niveles de expresión, las proteínas de fusión de la invención presentan, así mismo, semividas en suero prolongadas, presumiblemente debido a sus grandes tamaños moleculares. Por ejemplo, el Fc de angiostatina humana tiene una semivida en suero de 33 horas en el ratón, en comparación con 4 a 6 horas para la angiostatina humana (O'Reilly et al. (1996) Nature Medicine 2:689). Se supone que la angiostatina, con un peso molecular de 40 kD, y que la endostatina, con un peso molecular de 20 kD, son suficientemente pequeñas como para ser aclaradas de manera eficiente por medio de la filtración renal. Por el contrario, las formas diméricas del Fc de la angiostatina y del Fc de la endostatina dímérica tienen un tamaño de 145 kD y de 100 kD, respectivamente, puesto que son dos regiones Fc de inmunoglobulina, enlazadas bien con dos moléculas de angiostatina o bien con dos moléculas de endostatina. Dicha estructura bivalente puede presentar una elevada afinidad de enlace con el receptor de angiostatina o con el receptor de endostatina. Si la actividad de inhibición de la angiogénesis está favorecida por el receptor, las proteínas de fusión Fc son potencialmente más efectivas para suprimir tumores que la angiostatina monovalente o que la endostatina monovalente por sí mismas. Por otra parte, si la angiostatina y/o la endostatina pertenecen a una clase de ligandos proteicos diméricos, la solicitación física impuesta por el Fc sobre la angiostatina o sobre la endostatina convertiría la dimerización en un proceso intramolecular, que desplazarían el equilibrio en favor del dímero y que reforzarían su enlace con el receptor. De la misma manera, pueden ser introducidos residuos de cisteína mediante tecnología de ADN recombinante estándar en el monómero en lugares apropiados, para estabilizar al dímero por medio de la formación de enlace de disulfuro covalente.

Tal como se utiliza aquí, el término "multivalente" se refiere a una molécula recombinante, que incorpora dos o más segmentos biológicamente activos. Los fragmentos proteicos, que forman la molécula multivalente, pueden estar ligados a través de un segmento enlazador peptídico polipéptido que enlace las partes constituyentes sin provocar un desplazamiento del marco de lectura y que permita que cada uno funcione de manera independiente.

Tal como se utiliza aquí, el término "bivalente" se refiere a una molécula recombinante multivalente, que tenga dos proteínas diana en un constructo de fusión de la invención, por ejemplo una molécula Fc-X, en la que X se elige independientemente entre la angiostatina, la endostatina o entre una variante de las mismas. Puesto que existen dos mitades X fusionadas con una región Fc de inmunoglobulina (que de manera típica es, a su vez, un dímero de fragmentos de cadena pesada, que incluyen, al menos, una porción de la región bisagra y el dominio CH_{3} y, de manera opcional, el dominio CH_{2}), la molécula es bivalente. Si el constructo de fusión de la invención tiene la fórmula Fc-X-X, la molécula dímera Fc resultante es tetravalente. Las dos proteínas que forman la molécula Fc-X-X pueden estar ligadas a través de un segmento enlazador peptídico. Una molécula bivalente puede incrementar la afinidad aparente de enlace entre la molécula y su receptor. Por ejemplo, si una mitad de endostatina de un FC-endostatina puede enlazarse con un receptor en una célula con una cierta afinidad, la segunda mitad de endostatina del mismo FC-endostatina puede enlazarse con un segundo receptor de la misma célula con una avidez mucho mayor (afinidad aparente). Esto se debe a la proximidad física de la segunda mitad de endostatina con respecto al receptor después de que la primera mitad de endostatina esté ya enlazada. En el caso de un enlace de anticuerpo con un antígeno, la afinidad aparente se incrementa en 10^{4} como mínimo.

Tal como se utilizan aquí, los términos "multímero" y "multimérico" se refieren a la asociación estable de dos o de más cadenas polipeptídicas bien de manera covalente, por ejemplo, a través de interacción covalente, por ejemplo, por un enlace disulfuro, o bien de manera no covalente, por ejemplo, por interacción hidrófuga. Se entiende que el término multímero abarca ambos homomultímeros, siendo idénticos los polipéptidos, así como los heteromultímeros, en los que los péptidos son diferentes.

Tal como se utiliza aquí, el término "dimérico" se refiere a una molécula multimérica específica, en la que dos cadenas polipeptídicas proteicas están asociadas de manera estable a través de interacciones covalentes o no covalentes. Debe entenderse que el propio fragmento Fc de la región Fc de inmunoglobulina es, de manera típica, un dímero de los fragmentos de cadena pesada que incluyen, al menos, una porción de la región bisagra y el dominio CH_{3} y, de manera opcional, el dominio CH_{2}. Se sabe que muchos ligandos proteicos se enlazan con sus receptores en forma de un dímero. Si un ligando proteico X se dimeriza de manera natural, la mitad X en la molécula Fc-X se dimerizará en una extensión mucho mayor puesto que el proceso de dimerización depende de la concentración. La proximidad física de las dos mitades X, conectadas por la región asociada Fc de inmunoglobulina, convertiría la dimerización en un proceso intramolecular, desplazando en gran medida el equilibrio en favor del dímero y reforzando su enlace con el receptor.

Se entiende que la presente invención explota metodologías convencionales de ADN recombinante para generar proteínas de fusión Fc, que son convenientes en la práctica de la invención. Los constructos de fusión Fc son generados, de manera preferente, al nivel del ADN, y los ADN resultantes son integrados en vectores de expresión, y son expresados para producir las inmunofusinas. Tal como se utiliza aquí, el término "vector" debe entenderse que designa cualquier ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos competente para ser incorporada en una célula huésped y para ser recombinada con el genoma de la célula huésped, y para ser integrada en el mismo, o para replicarse de manera autónoma como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y similares. Ejemplos no limitativos de un vector viral incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adeno-asociado. Tal como se utiliza aquí, el término "expresión génica" o "expresión" de una proteína diana debe entenderse que significa la transcripción de una secuencia de ADN, la traducción del transcripto de mARN, y la secreción de un producto de proteína de fusión Fc.

Como vector de expresión es adecuado el pdCs (Lo et al. (1988) Protein Engineering 11:495, en el que la transcripción del gen Fc-X utiliza el reforzador/promotor del citomegalovirus humano y la señal de poliadenilación SV40. La secuencia reforzadora y promotora del citomegalovirus humano empleada se derivó a partir de los nucleótidos -601 hasta +7 de la secuencia indicada en la publicación de Boshart et al., 1985, Cell 41:521. De la misma manera, el vector contiene el gen mutante de dihidrofolato reductasa a modo de un marcador de selección (Simonsen and Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:2495).

Una célula huésped apropiada puede ser transformada o transfectada con la secuencia de ADN de la invención, y puede ser utilizada para la expresión y para la secreción de una proteína diana. Actualmente, las células huésped que son preferentes para la utilización en la invención incluyen a las células de hibridoma inmortal, a las células de mieloma NS/0, a las células 293, a las células de ovario de hámster chino, a las células Hela y a las células COS.

Las proteínas de fusión de la invención son generadas, de manera preferente, por medio de metodologías convencionales de ADN recombinante. Las proteínas de fusión son producidas, de manera preferente, por expresión en una célula huésped de una molécula de ADN, que codifique una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana (que se denomina también aquí como inhibidor de la angiogénesis). Los constructos preferentes pueden codificar en el sentido 5' hacia 3' la secuencia señal, la región Fc de inmunoglobulina y la proteína diana. De manera alternativa, los constructos pueden codificar en el sentido 5' hacia 3', la secuencia señal, la proteína diana y la región Fc de inmunoglobulina.

Tal como se utiliza aquí, el término "secuencia señal" se entiende que indica un segmento peptídico, que dirige la secreción de la proteína inmunofusina inhibidora de la angiogénesis y que, a continuación, es escindida después de la traducción en la traducción en la célula huésped. La secuencia señal de la invención es un polinucleótido, que codifica una secuencia de aminoácidos, que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico. Las secuencias señal que son adecuadas en la invención incluyen secuencias señal de cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo el anticuerpo 14.18 (Gillies et. al., 1989, Jour. of Immunol. Meth., 125:191-202), las secuencias señal de cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo la secuencia señal de cadena pesada de anticuerpo MOPC141 (Sakano et al., 1980, Nature 286:5774) y cualquier otra secuencia señal conocida en el ramo (véase, por ejemplo, la publicación Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12:5145).

Las secuencias señal han sido perfectamente caracterizadas en el ramo y son conocidas por contener, de manera típica, desde 16 hasta 30 residuos de aminoácidos, y pueden contener más o menos residuos de aminoácidos. Un péptido señal, típico, está constituido por tres regiones: una región N-terminal básica, una región hidrófuga central, y una región C-terminal más polar. La región hidrófuga central contiene desde 4 hasta 12 residuos hidrófugos, que anclan al péptido señal a través de la bicapa lípida de la membrana durante el transporte del polipéptido naciente. Después de la iniciación, el péptido señal es usualmente escindido dentro del lumen del retículo endoplásmico por medio de enzimas celulares conocidos como peptidasas señal. De manera general, los locus de escisión potenciales del péptido señal siguen la "norma (-3, -1)". De este modo, un péptido señal típico tiene residuos de aminoácidos neutros, pequeños, en las posiciones -1 y -3 y carece de residuos de prolina en esta región. La peptidasa señal escinde un péptido señal de este tipo entre los aminoácidos -1 y +1. De este modo, la porción del ADN, que codifica la secuencia señal, puede ser escindida durante la secreción, a partir del extremo amino de la proteína inmunofusina. Esto da como resultado la secreción de una proteína inmunofusina que está constituida por la región Fc y por la proteína diana. Se ha proporcionado un tratamiento detallado de las secuencias de péptido señal en la publicación de Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14:4683.

Como será evidente para un técnico en la materia, la idoneidad de una secuencia señal particular para ser empleada en la invención puede requerir alguna experimentación rutinaria. Dicha experimentación incluye la determinación de la aptitud de la secuencia señal para dirigir la secreción de una inmunofusina y, así mismo, una determinación de la configuración óptima, genómica o cADN, de la secuencia que debe ser empleada con objeto de alcanzar una secreción eficiente de inmunofusinas. De manera adicional, el técnico en la materia es capaz de producir un péptido señal sintético siguiendo las normas indicadas en la publicación de Heijne, que ha sido citada precedentemente, y de ensayar la eficacia de dicha secuencia señal sintética por medio de experimentación rutinaria. De la misma manera, una secuencia señal puede ser denominada como un "péptido señal", una "secuencia directriz" o una "péptido director".

La fusión de la secuencia señal y la región Fc de inmunoglobulina se indica a veces aquí como caja de secreción. Una caja de secreción ejemplificativa, que es adecuada en la práctica de la invención, es un polinucleótido que codifica, en el sentido 5' hacia 3', una secuencia señal de un gen de cadena ligera de inmunoglobulina y una región Fc\gammal del gen humano de inmunoglobulina \gamma1. La región Fc\gamma1 del gen Fc\gamma1 de inmunoglobulina incluye, de manera preferente, al menos una porción del dominio bisagra y, al menos, una porción del dominio CH_{3} o, de manera alternativa, al menos porciones del dominio bisagra, del dominio CH_{2} y del dominio CH_{3}. El ADN, que codifica la caja de secreción, puede encontrarse en su configuración genómica o en su configuración cADN.

En otra realización, la secuencia de ADN codifica un locus de escisión proteolítica interpuesto entre la caja de secreción y la proteína inhibidora de la angiogénesis. Un locus de escisión proporciona la escisión proteolítica de la proteína de fusión codificada, separando de este modo el dominio Fc de la proteína inhibidora de la angiogénesis. Tal como se utiliza aquí, se entiende que "locus de escisión proteolítica" indica secuencias de aminoácidos, que son escindidas de manera preferente por un enzima proteolítico o por otro agente de escisión proteolítica. Los locus de escisión proteolítica adecuados incluyen secuencias de aminoácidos, que son reconocidas por enzimas proteolíticos tales como la tripsina, la plasmina o la enterocinasa K. Se conocen muchos pares de locus de escisión/agente de escisión. Véase, por ejemplo, la patente norteamericana número 5,726,044. Cuando la secuencia de proteína diana es una molécula precursora de angiostatina, de endostatina, o una variante activa de las mismas, el producto proteico deseado puede ser producido por escisión con enzima proteolítico endógeno, tal como la elastina o la plasmina o la urocinasa.

La presente invención comprende, así mismo, proteínas de fusión que contienen diferentes combinaciones de angiostatina y de endostatina recombinante, o fragmentos de las mismas, que pueden ser producidos en grandes cantidades. Independientemente de la eficacia demostrada para la supresión del crecimiento de los tumores, no se conoce por completo el mecanismo según el cual la angiostatina y la endostatina bloquean la angiogénesis. La angiostatina tiene varias estructuras de tipo Kringle y la endostatina tiene motivos estructurales diferentes, cada uno de los cuales puede ser, por sí mismo, responsable del enlace, o puede contribuir al enlace, de las proteínas con las células endoteliales y ejercer un efecto anti-angiogénico. Por consiguiente, esta invención incluye proteínas diana, que son fragmentos bioactivos de angiostatina, tales como el Kringle 1, el Kringle 2, el Kringle 3 y combinaciones de los mismos, y endostatina que presenta un comportamiento fisiológico similar al que se presenta de manera natural en la angiostatina y en la endostatina de longitud completa.

Otra realización de la presente invención se refiere a constructos híbridos bifuncionales de inhibidores de la angiogénesis. Tal como se utiliza aquí, una molécula híbrida bifuncional o constructo híbrido bifuncional significa una proteína producida por combinación de dos subunidades proteicas, pudiéndose derivar las dos subunidades a partir de proteínas diferentes. Cada subunidad proteica tiene su propia función independiente de tal manera, que en la molécula híbrida pueden sumarse las funciones de las dos subunidades o pueden ser sinérgicas. Dichas proteínas híbridas funcionales permitirían la exploración del efecto sinérgico de la angiostatina y de la endostatina en modelos animales. Un híbrido bifuncional preferente puede comprender, al menos, dos inhibidores de la angiogénesis diferentes ligados en tándem, bien directamente o bien a través de un segmento enlazador polipeptídico. Por ejemplo, en un realización preferente, la secuencia diana codifica, al menos, una porción de angiostatina ligada en marco de lectura con, al menos, una porción de endostatina y tanto el dominio de angiostatina como, también, el dominio de endostatina exhiben actividad anti angiogénesis o inhibición de la angiogénesis. Las dos unidades pueden estar ligadas a través de un segmento enlazador polipeptídico.

Tal como se utiliza aquí, el término "segmento enlazador polipeptídico" se entiende que indica una secuencia peptídica que puede ligar dos proteínas entre sí o una proteína y una región Fc. El segmento enlazador polipeptídico comprende, de manera preferente, una pluralidad de aminoácidos tales como la glicina y/o la serina. De manera preferente, el segmento enlazador polipeptídico comprende una serie de péptidos de glicina y de serina con una longitud de 10-15 residuos aproximadamente. Véase, por ejemplo, la patente norteamericana número 5,258,698. Sin embargo, se considera el hecho de que la longitud y la composición de aminoácidos del segmento enlazador óptimo pueden determinarse por medio de experimentación rutinaria.

Se ha encontrado que, cuando son expresadas partes diferentes de la angiostatina, en forma de moléculas de fusión Fc, se obtienen elevados niveles de expresión, presumiblemente debido a que la porción Fc actúa como un portador, ayudando a que se pliegue correctamente el polipéptido en el extremo C. Además, la región Fc puede ser glicosilada y puede ser cargada ampliamente a pH fisiológico, con lo que la región Fc puede ayudar a solubilizar las proteínas hidrófugas.

De la misma manera, la presente invención proporciona métodos para la producción de angiostatina y de endostatina de especies no humanas, en forma de proteínas de fusión Fc. Las proteínas de fusión no humanas inhibidoras de la angiogénesis son adecuadas para estudios preclínicos de los inhibidores de la angiogénesis debido a que deben ser llevados a cabo estudios de eficacia y de toxicidad de un fármaco proteico en sistemas de modelo animal como paso previo al ensayo en los seres humanos. Una proteína humana puede no actuar en un modelo murino debido a que la proteína puede inducir una respuesta inmune, y/o puede exhibir farmacocinéticas diferentes que distorsionan los resultados del ensayo. Por consiguiente, la proteína murina equivalente es el mejor representante de la proteína humana para llevar a cabo el ensayo en un modelo murino.

Se utilizó el modelo estándar carcinoma de pulmón de Lewis en ratones (O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277) para llevar a cabo la comparación de huFc-huAngiostatina, de huFc-huEndostatina, de de muFc-muAngiostatina, de muFc-muEndostatina, solubles, con las proteínas insolubles producidas en el sistema de expresión E. coli. Las proteínas de fusión Fc solubles eran más eficaces en cuanto a la supresión del crecimiento de los tumores en el modelo pulmonar de Lewis que las proteínas correspondientes, producidas en E. coli. Así mismo se prepararon ratones de laboratorio endogámicos y sus tumores fueron inducidos y no espontáneos. Por consiguiente, la eficacia en un modelo murino puede que nea correlata con la eficacia probable contra los tumores humanos. Estudios preclínicos en perros proporcionarán una información más precisa sobre la eficacia de estos inhibidores de la angiogénesis en tumores espontáneos, puesto existen numerosos tumores caninos espontáneos, que se presenten de manera natural. Los métodos para la producción de angiostatina murina (mu) Fc-mu, de endostatina muFc-mu y de angiostatina canina (ca) Fc-ca, de endostatina caFc-ca de la presente invención facilitará estudios preclínicos de inhibidores de la angiogénesis tanto en los sistemas murinos como en los sistemas caninos.

La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de una condición favorecida por la angiogénesis por medio de la administración de ADN, de ARN o de proteínas de la invención. Las condiciones favorecidas por la angiogénesis incluyen, por ejemplo: los tumores sólidos; los tumores de origen sanguíneos, las metástasis tumorales, los tumores benignos con inclusión de los hemangiomas, de los neuromas acústicos, de los neurofibromas, de los tracomas y de los granulomas pirogénicos; la artritis reumatoide; la psoriasis; las enfermedades angiogénicas oculares (la retinopatía diabética, la retinopatía de prematuridad, la degeneración macular, el rechazo de injerto de córnea, el glaucoma neovascular), la fibroplasia retrolental, la rubeosis, el síndrome de Osler-Webber; la angiogénesis de miocardio; la neovascularización de placa; la telangiectasia; el angiofibroma de las articulaciones hemofílico; y la granulación de las heridas; y la estimulación excesiva o anormal de células endoteliales, las adhesiones intestinales, la arterosclerosis, las costras esclerodérmicas e hipertróficas, por ejemplo los queloides.

Los constructos de ADN, aquí tratados, pueden ser convenientes en procedimientos de terapia génica en los que el gen de endostatina o de angiostatina es suministrado a una célula por uno o por varios medios, por ejemplo ADN nativo asociado con un promotor o ADN dentro de un vector vírico. Una vez que se encuentra dentro de la célula, el gen de angiostatina y/o de endostatina o el fragmento génico es expresado y la proteína es producida in vivo para llevar a cabo su función biológica normal. El constructo de ADN de la presente invención da como resultado elevados niveles de expresión de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser convenientes, así mismo, para el tratamiento de condiciones favorecida por la angiogénesis y pueden tener una eficacia clínica mayor que los inhibidores nativos de la angiogénesis y que otros inhibidores recombinantes de la angiogénesis debido a que las inmunofusinas inhibidoras de la angiogénesis de la presente invención tienen una semivida en suero más prolongada que los otros inhibidores recombinantes de la angiogénesis o que los inhibidores de la angiogénesis nativos por sí solos. Las formas bivalentes y diméricas de la presente invención tendrían una mayor afinidad de enlace como consecuencia de la estructura bivalente y dimérica. Las moléculas híbridas bifuncionales de la presente invención pueden tener una eficacia clínica mayor como consecuencia de los posibles efectos sinérgicos de dos inhibidores de la angiogénesis diferentes conectados a través de la región Fc fusionada o a través de un segmento enlazador polipeptídico flexible.

Las composiciones de la presente invención pueden ser suministradas a un animal por cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo por vía local, tal como por inyección, por implante o por administración tópica a un locus tisular) o de forma sistémica (por ejemplo por vía parenteral o por vía oral). Cuando la composición deba ser suministrada por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o por medio de una administración en forma de aerosol, la composición comprende, de manera preferente, parte de una suspensión o solución líquida acuosa o fisiológicamente compatible. De este modo, el excipiente o vehículo es fisiológicamente aceptable de tal manera que, además de la administración de la composición deseada al paciente, no tiene cualquier efecto adverso de otro tipo sobre el balance de electrolito y/o de volumen del paciente. El medio líquido para el agente puede comprender, de este modo, suero salino fisiológico normal (por ejemplo NaCl acuoso al 9,85%, 0,15 M, pH 7-7,4).

Las dosis preferentes de las inmunofusinas por administración están situadas en el intervalo comprendido entre 50 ng/m^{2} y 1 g/m^{2}, de una manera más preferente entre 5 \mug/m^{2} y 200 mg/m^{2} y, en el caso más preferente, están comprendidas entre 0,1 mg/m^{2} y 50 mg/m^{2}. Las dosis preferentes de ácidos nucleicos, que codifican las inmunofusinas, por administración están situadas en el intervalo comprendido entre 1 \mug/m^{2} y 100 mg/m^{2}, de una manera más preferente entre 20 \mug/m^{2} y 10 mg/m^{2} y, en el caso más preferente, están comprendidas entre 400 \mug/m^{2} y 4 mg/m^{2}. Sin embargo, se contempla el hecho de que los modos opcionales de administración y las dosis pueden ser perfectamente determinadas por medio de experimentación rutinaria por parte de del técnico en la materia.

La invención se ilustra además por medio de los ejemplos no limitativos siguientes.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Expresión de huFc-huEndostatina

Se expresó endostatina humana en forma de una proteína de fusión de endostatina humana Fc-humana (huFc-huEndo) de conformidad con las técnicas de la publicación de los autores Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495. El Fc se refiere al fragmento Fc de la inmunoglobulina gama humana (secuencia de ADN indicada en la SEQ ID NO:1; secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:2). Se utilizaron reacciones en cadena de polimerasa (RCP) para adaptar el cADN de endostatina (SEQ ID NO:3; cuya secuencia de aminoácidos está descrita en la SEQ ID NO:4), para la expresión en una proteína de fusión Fc-endo. El cebador ascendente fue o bien el 5'-CC CCG GGT AAA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO:5; aminoácidos codificados descritos en la SEQ ID NO:6) o bien el 5'-C AAG CTT CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO:7; aminoácidos codificados descritos en la SEQ ID NO:8), en el que el locus XmaI o el locus HindIII estaba seguido por la secuencia que codifica el extremo N de la endostatina. El cebador con el locus XmaI adapta al cADN de endostatina para la ligadura con el locus XmaI en el extremo del dominio CH_{3} de la región IgGFc. El cebador con el locus HindIII adapta el cADN de endostatina para la ligadura con el locus HindIII del vector pdCs-Fc(D_{4}K), que contiene el locus de reconocimiento de enterocinasa Asp_{4}-Lys (LaVallie et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:23311-23317) en la unión de la proteína de fusión. El cebador descendente fue el 5'-C CTC GAG CTA CTT GGA GGC AGT CAT G (SEQ ID NO:9), que estaba designado para colocar un codón STOP de terminación de la traducción (anticodón, CTA) inmediatamente después del extremo C de la endostatina, y éste estaba seguido por un locus XhoI. Los productos de la RCP se clonaron y se secuenciaron y el fragmento XmaI-XhoI fue ligado con el XmaI resultante y el XhoI se sometió a digestión con el vector pdCs-Fc. De manera similar, el fragmento HindIII-XhoI, que codifica endostatina fue ligado en el vector pdCs-huFc(D_{4}K) sometido apropiadamente a una digestión. Se obtuvieron clones estables que expresan Fc-endo o Fc(D_{4}K)-endostatina mediante electroporación de células NS/0 seguido por selección en medio de crecimiento, que contiene 100 nM de metotrexato. El nivel de expresión de la proteína se ensayó por medio de un ensayo ELISA Fc anti-humano (ejemplo 3) y se confirmó por medio de una electrofóresis en gel de poliacrilamida en dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE, que muestra un producto proteico de aproximadamente 52 kD. Los clones con la mejor producción se subclonaron mediante diluciones limitantes.

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Ejemplo 2

Cultivo celular y transfección

Para la transfección transiente, se introdujo el plásmido en células de riñón humano 293 mediante coprecipitación del ADN plásmido con fosfato de calcio (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) o mediante lipofección empleándose LipofectAMINE Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de conformidad con el protocolo del suministrador.

Con objeto de obtener clones transfectados estables, se introdujo el ADN plásmido en células de mieloma de ratón NS/0 por medio de una electroporación. Las células NS/0 se cultivaron en medio de Eagle modificado según Dulbecco suplementado con un 10% de suero bovino fetal. Se lavaron aproximadamente 5 x 10^{6} células una vez con fosfato salino tamponado PBS y se volvieron a suspender en 0,5 ml de PBS. A continuación se incubaron diez \mug de ADN plásmido linealizado con las células en una cubeta Gene Pulser (distancia entre los electrodos 0,4 cm, BioRad, Hercules, CA) sobre hielo durante 10 minutos. Se llevó a cabo la electroporación con empleo de un dispositivo Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) con ajustes a 0,25 voltios y 500 \muF. Se permitió que las células se regenerasen durante 10 minutos sobre hielo, después de lo cual se volvieron a suspender en medio de crecimiento y a continuación se distribuyeron en dos placas de 96 pocillos. Se eligieron los clones transfectados de manera estable por crecimiento en presencia de 100 nM de metotrexato (MTX), que se introdujo dos días después de la transfección. Las células se alimentaron cada 3 días durante otras tres veces y los clones resistentes al MTX aparecieron al cabo de 2 a 3 semanas. Los sobrenadantes procedentes de los clones se ensayaron por medio del análisis ELISA anti-Fc para identificar productores de alta capacidad. Se aislaron los clones con alta capacidad de producción y se propagaron en medio de crecimiento que contenía 100 nM de MTX.

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Ejemplo 3

Procedimientos ELISA

Se emplearon tres ensayos diferentes ELISA para determinar las concentraciones de productos proteicos en los sobrenadantes de los clones resistentes al MTX y de otras muestras de ensayo. El ensayo ELISA Fc anti-humano (huFc) fue utilizado para medir la cantidad de proteínas que contenían Fc humano. Se emplearon anticuerpos de Fc anti-murino (muFc) y Fc anti-canino (caFc) en los ensayos ELISA para medir la cantidad de proteínas que contenían Fc murino y Fc canino, respectivamente. A continuación se describe en detalle el procedimiento para el ensayo ELISA anti-huFc.

A. Placas de revestimiento

Se revistieron placas para el ensayo ELISA con AffiniPure cabra anti-humano IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) con 5 \mug/ml en PBS, y 100 \mul/pocillo en placas de 96 pocillos (Nunc-Immuno plate MaxiSorp^{TM}, Nalge Nunc International, Rochester, NY). Las placas revestidas se cubrieron y se incubaron a 4ºC durante la noche. A continuación se lavaron las placas 4 veces con 0,05% de Tween 20 en PBS y se bloquearon con 1% de BSA/1% de suero de cabra en PBS, 200 \mul/pocillo. Tras incubación con el tampón de bloqueo a 37ºC durante 2 horas, se lavaron las placas 4 veces con 0,05% de Tween en PBS y se secaron por recalcado sobre toallas de papel.

B. Incubación con muestras de ensayo y con anticuerpo secundario

Se diluyeron las muestras de ensayo a las concentraciones adecuadas en un tampón para muestras, que contenía 1% de BSA/1% de suero de cabra/0,05% de Tween en PBS. Se preparó una curva patrón con un anticuerpo quimérico (con un Fc humano), cuya concentración era conocida. Para preparar una curva patrón, se llevaron a cabo diluciones en serie en el tampón para muestras con objeto de producir una curva patrón, comprendida desde 125 ng/ml hasta 3,9 ng/ml. Las muestras diluidas y los patrones se aportaron a la placa, 100 \mul/pocillo y la placa se incubó a continuación a 37ºC durante 2 horas. Tras la incubación, se lavó la placa 8 veces con un 0,05% de Tween en PBS. A continuación se añadieron, en cada en cada pocillo, 100 \mul de anticuerpo secundario, el conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA), diluido aproximadamente en la proporción de 1:120,000 en tampón para muestras. La dilución exacta del anticuerpo secundario debe ser determinada para cada lote del conjugado HRP IgG Anti-Humano. Tras incubación a 37ºC durante 2 horas, se lavó la placa 8 veces con 0,05% de Tween en PBS.

C. Revelado

Se preparó una solución de substrato por disolución de 30 mg (1 tableta) de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) en 15 ml de tampón de ácido cítrico 0,025 M/Na_{2}HPO_{4} 0,05 M, pH 5, que contenía un 0,03% de H_{2}O_{2} añadido recientemente. Se añadió la solución de substrato a la placa en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Se permitió que el color se revelase durante 30 minutos a la temperatura ambiente en la obscuridad. El tiempo de revelado puede estar sujeto a cambios, en función de la variabilidad de un lote a otro de las placas revestidas, del anticuerpo secundario, etc. La reacción se detuvo por adición de H_{2}SO_{4} 4N, 100 \mul/pocillo. La placa se leyó por medio de un lector de placas, que estaba regulado a 490 y a 650 nm, y programado para substraer la densidad óptica OD de fondo a 650 nm de la densidad óptica OD a 490 nm.

El procedimiento para el ensayo ELISA anti-muFc fue similar, con excepción de que la placa para el ensayo ELISA fue revestida con AffiniPure cabra anti-ratón IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en una cantidad de 5 \mug/ml en PBS, y 100 \mul/pocillo; y que el anticuerpo secundario era conjugado de peroxidasa de rábano cabra anti-muIgG, Fc\gamma (Jackson ImmunoResearch West Grove, PA), empleado en una dilución de 1 en 5.000. De manera similar a la del ensayo ELISA anti-caFc, la placa para el ensayo ELISA fue revestida con AffiniPure conejo anti-perro IgG, específico del fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en una cantidad de 5 \mug/ml en PBS, y 100 \mul/pocillo; y el anticuerpo secundario era conjugado de peroxidasa de rábano AffiniPure conejo anti-perro IgG, específico del fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), empleado en una dilución de 1 en 5.000.

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Ejemplo 4

Expresión de la muFc-mu-Endostatina

Se expresaron endostatina murina (secuencia de ADN indicada en la SEQ ID NO:17; secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:18) y Fc murino (secuencia de ADN indicada en la SEQ ID NO:19; aminoácidos codificados indicados en la SEQ ID NO:20) en forma de una proteína de fusión Fc-murino endostatina murina (muFc-muEndo) esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 1. Se utilizó la RCP para adaptar el cADN de endostatina (SEQ ID NO:4), para la expresión en el vector pdCs-muFc(D_{4}K). El cebador ascendente fue el 5'-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C (SEQ ID NO:21; los aminoácidos codificados están indicados en la SEQ ID NO:22), estando seguido el locus HindIII por la secuencia que codifica el extremo N de la endostatina. El cebador descendente era el 5'-CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGA GGT C (SEQ ID NO:23), que estaba designado para colocar un codón STOP de terminación de la traducción (anticodón, CTA) inmediatamente después del extremo C de la endostatina, y éste estaba seguido por un locus XhoI. El producto de la RCP se clonó y se secuenció, y el fragmento HindIII-XhoI resultante, que codifica endostatina, fue ligado con el vector pdCs-muFc(D_{4}K). Se seleccionaron clones NS/0 estables, que expresan muFc(D_{4}K)-muEndo y se ensayaron (anti-muFc ELISA) como se ha descrito en los ejemplos 2 y 3.

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Ejemplo 5

Expresión de Fc canino (caFc)

Se utilizaron células monocíticas de sangre periférica canina (PBMCs) aisladas a partir de sangre de perro, para a cabo la preparación del mARN. Después de la síntesis de la primera hebra de cADN con transcriptasa reversa y oligo(dT), se llevó a cabo la RCP para amplificar el Fc canino (Kazuhiko et al., (1992) JP 1992040894-A1) empleándose el cebador ascendente 5'-CC TTA AGC GAA AAT GGA AGA GTT CCT CGC (SEQ ID NO:29; aminoácidos codificados descritos en la SEQ ID NO:30), en el que se había introducido un locus AfIII inmediatamente aguas arriba de la secuencia que codifica la región bisagra del Fc canino, y el cebador descendente 5'-C CTC GAG TCA TTT ACC CGG GGA ATG GGA GAG GGA TTT CTG (SEQ ID NO:31), en el que se había introducido un locus XhoI después del codón STOP de terminación de la traducción (anticodón, TCA) del Fc canino. El cebador descendente introdujo, así mismo, una mutación silente con objeto de generar un locus de restricción XmaI, que facilita la construcción del vector pdCs-caFc(D_{4}K) a través de un segmento enlazador-adaptador y ligadura con constructos de ADN, que codifican endostatina o angiostatina canina. De manera similar a lo que ocurre con la construcción del pdCs-huFc, que ha sido descrita en detalle en la publicación de los autores Lo et al. (Lo et al., Protein Engineering (1998) 11:495), el vector de expresión para el pdCs-caFc se construyó de la manera siguiente. Se llevó a cabo la ligadura del fragmento AfIII-XhoI, que codifica el Fc canino, con el fragmento XbaI-AfIII, que codifica el péptido señal de cadena ligera y el vector pdCs sometido a digestión con XbaI-XhoI. El vector de expresión resultante pdCs-caFc se utilizó a continuación para transfectar células 293. El sobrenadante se purificó aproximadamente al cabo de 3 días desde la transfección, por medio de una cromatografía de proteína A. La expresión del Fc canino (secuencia de ADN indicada en la SEQ ID NO:32; secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:33) fue confirmada por medio de una SDS-PAGE seguida de análisis por transferencia de Western, empleándose un conjugado de peroxidasa conejo anti-perro IgG, específico del fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove,
PA).

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Ejemplo 6

Expresión de la caFc-caEndostatina

Se adaptó la secuencia que codifica la endostatina canina (secuencia de ADN indicada en la SEQ ID NO:34; secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:35) a un fragmento HindHI-XhoI para la expresión en forma de una proteína de fusión Fc, esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 5. En el extremo 3' se introdujo un codón STOP de terminación, por ejemplo por medio de RCP, inmediatamente después del codón que codifica el residuo de lisina C-terminal, y éste estaba seguido por el locus de restricción NotI. Sin embargo, en el extremo 5', se encontraba un locus de restricción DraIII conveniente para la reconstrucción. Se sintetizó químicamente un dúplex oligonucleótido constituido por un extremo cohesivo HindIII y por un extremo cohesivo DraIII y se utilizó para efectuar la ligadura con el fragmento de restricción DraIII-XhoI, que codifica el resto del cADN de la endostatina canina. El dúplex empleado era el siguiente:

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1

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El primer CAC en el dúplex codifica el residuo de histidina N-terminal de la endostatina canina. De este modo, el fragmento HindIII-XhoI, que codifica la endostatina canina de longitud completa, pudo ser ligado con el vector pdCs-caFc sometido a digestión con HindIII-XhoI (véase el ejemplo 7) para la expresión. Se seleccionaron clones NS/0 estables, que expresan caFc-caEndo y se ensayaron por medio del ensayo ELISA anti-cafc, como se ha descrito en los ejemplos 2 y 3. El producto proteico se analizó por medio de una SDS-PAGE y se confirmó por medio de un análisis por transferencia de Western.

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Ejemplo 7

Expresión del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-K1 interno de muAngio

La molécula híbrida muFc-muEndo-K1 interno comprende muFc-muEndo unido por medio de un segmento enlazador polipeptídico, que contiene residuos de glicina y de serina, con el bucle interno del primer Kringle de angiostatina murina. El constructo de ADN se ensambló de la manera siguiente.

Existe un locus BspHI en el extremo 3' del cADN de endostatina murina. Para introducir un segmento enlazador flexible de residuos de glicina y de serina en el extremo C de la endostatina murina, se llevó a cabo la ligadura de un fragmento HindIII-BspHI de 540 bp, que codifica endostatina, con un dúplex oligonucleótido solapante, formado por los oligonucleótidos que han sido descritos en las SEQ ID NO:46 y en la SEQ ID NO:48. El segmento enlazador de aminoácidos, codificado por la SEQ ID NO:46, ha sido indicado en la SEQ ID NO:47.

El fragmento HindIII-BamHI, que codifica la endostatina murina y el segmento enlazador Gly-Ser, se subclonó en un vector de clonación estándar. El locus BamHI se utilizó entonce para introducir el fragmento BamHI-XhoI, que codifica el K1 interno en el ejemplo 11. Se llevó a cabo la ligadura del fragmento HindIII-XhoI resultante, que codifica el segmento enlazador muEndo-GlySer-K1 interno, con el vector pdCs-muFc(D_{4}K) para la expresión. Se obtuvieron elevados niveles de expresión de segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-K1 interno en la expresión tanto transiente como en la expresión estable, como ha sido analizado por medio de los ensayos ELISA anti-muFc y SDS-PAGE.

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Ejemplo 8

Expresión del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-K1 de muAngio

La molécula híbrida muFc-muEndo-K1 comprende muFc-muEndo unido por medio de un segmento enlazador polipeptídico, que contiene residuos de glicina y de serina, con el primer Kringle de la angiostatina murina. El constructo de ADN se ensambló de la manera siguiente.

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Se llevó a cabo la ligadura del extremo BamHI del fragmento HindIII-BamHI, que codifica el segmento enlazador muEndo-GlySer (ejemplo 12), con el fragmento HindIII-XhoI, que codifica el Kringle 1 de la angiostatina murina (ejemplo 10) a través del siguiente adaptador:

2

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El adaptador tiene un extremo cohesivo HindIII', que no regeneraría el locus HindIII, una vez efectuada la ligadura. De este modo, se llevó a cabo la ligadura del fragmento HindIII-XhoI resultante, que codifica el segmento enlazador muEndo-GlySer-Kringle 1, con el vector pdCs-muFc(D_{4}K) para la expresión. Se obtuvieron elevados niveles de expresión del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-K1 tanto en la expresión transiente como en la expresión estable, como se ha analizado por medio de los ensayos ELISA anti-muFc ELISA y SDS-PAGE.

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Ejemplo 9

Expresión del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-muAngio

La molécula híbrida del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-muAngio comprende muFc-muEndo unido por medio de un segmento enlazador polipeptídico, que contiene residuos de glicina y de serina, con la angiostatina murina. El constructo de ADN se ensambló esencialmente de la manera siguiente. Se llevó a cabo la ligadura del extremo BamHI del fragmento HindIII-BamHI, que codifica el segmento enlazador muEndo-GlySer (ejemplo 12), con el fragmento HindIII-XhoI, que codifica la angiostatina murina, a través del adaptador descrito en el ejemplo 13. Se llevó a cabo la ligadura del fragmento HindIII-XhoI resultante, que codifica el segmento enlazador muEndo-GlySer-muAngio, con el vector pdCs-muFc(D_{4}K) para la expresión. Se obtuvieron elevados niveles de expresión del segmento enlazador muFc-muEndo-GlySer-muAngio tanto en la expresión transiente como en la expresión estable, como se ha analizado por medio de los ensayos ELISA anti-muFc y SDS-PAGE.

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Ejemplo 10

Expresión de huAngio-huFc-huEndo

La molécula híbrida huAngio-huFc-huEndo comprende angiostatina humana, unida por medio de un enlace peptídico con huFc-huEndo. El constructo de ADN se ensambló de la manera siguiente. En primer lugar se generó por medio de la RCP un fragmento HindIII-XhoI, que codifica angiostatina humana sin un codón STOP de terminación de tal manera, que el codón para el último residuo de aminoácido de la angiostatina iba seguido inmediatamente por CTCGAG del locus XhoI. Se llevó a cabo en el extremo 5' la ligadura del El HindIII con el fragmento XbaI-AfIII del péptido señal de cadena ligera (Lo et al., Protein Engineering (1998) 11:495) a través de un adaptador AfIII-
HindIII':

3

El extremo cohesivo HindIII' del adaptador, una vez llevada a cabo la ligadura, no se regeneraría en un locus HindIII. En el extremo 3', el locus XhoI estaba ligado con el locus AfIII del fragmento AfIII-XhoI, que codifica el huFc-hu-endo a través del adaptador XhoI'-AfIII siguiente:

4

El extremo cohesivo XhoI del adaptador, una vez llevada a cabo la ligadura, no regeneraría un locus XhoI. El fragmento XbaI-XhoI resultante, que codifica el péptido señal-angiostatina humana-huFc-endostatina humana, se clonó en el vector pdCs para la expresión. Se obtuvieron elevados niveles de expresión tanto en la expresión transiente como en la expresión estable, tal como se ha analizado por medio de los ensayos ELISA anti-muFc y SDS-PAGE.

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Ejemplo 11

Farmacocinéticas

En un juego de estudios farmacocinéticos, fueron inyectados ratones C57/BL6, con tumores pulmonares de Lewis implantados, con 100-200 mm^{3}, en la vena de la cola con 720 \mug de huFc-huAngio por ratón. El tamaño de los tumores y la dosificación del huFc-huAngio utilizados en este estudio se eligieron con objeto de similar el protocolo de tratamiento actual descrito por los autores O'Reilly (O'Reilly et al., (1996) Nature Medicine 2:689). Se recogió sangre mediante sangría retro-orbital al cabo de 1/2, de 1, de 2, de 4, de 8, de 24 y de 48 horas tras la inyección. Las muestras de sangre se analizaron por medio del ensayo ELISA anti-huFc seguido por análisis Western. Se encontró que el huFc-huAngio tenía una semivida de circulación de aproximadamente 32 horas en el ratón y el análisis Western mostró que más del 90% del hu-Fc-huAngio permanecía en circulación en forma de molécula intacta.

Los estudios farmacocinéticos se repitieron así mismo en ratones suizos sin tumores a una dosis de 200 \mug/ratón. En este caso, se encontró que el huFc-huAngio tenía una semivida de circulación de aproximadamente 33 horas.

Equivalentes

La invención puede ser realizada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o de las características esenciales de la misma. Las realizaciones precedentes deben ser consideradas, por consiguiente, a todos los fines, como ilustrativas antes que limitativas de la invención aquí descrita. El alcance de la invención está indicado, por consiguiente, por las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción que precede y, por consiguiente, se considera que quedan abarcados por la invención todos los cambios que puedan producirse dentro del espíritu y del campo de las equivalencias de las reivindicaciones.

<110> Lo, Kin-Ming

\hskip1cm

Li, Yue

\hskip1cm

Gillies, Stephen D

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<120> Expresión y exportación de inhibidores de la angiogénesis como inmunofusinas

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<130> LEX-006PC

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/097,883

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-08-25

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 696

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(696)

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<223> Fragmento Fc de la inmunoglobulina gamma humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(549)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> endostatina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ascendente para Fc-endo humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(29)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(25)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador descendente para Fc-endo humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcgagcta cttggaggca gtcatg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1089

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1089)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> angiostatina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ascendente para Fc-angio humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (3)..(29)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(28)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador descendente para Fc-angio humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctcgagc tacgcttctg ttcctgagca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 552

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(552)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> endostatina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(699)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ascendente para Fc-endo murino

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2).. (28)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador descendente para Fc-endo murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctcgagc tatttggaga aagaggtc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1086

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1086)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Angiostatina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ascendente para Fc-angio murino

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(49)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador descendente para Fc-angio murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctcgagc taccctcctg tctctgagca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador ascendente para Fc canino

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(29)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador descendente para Fc canino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcgagtca tttacccggg gaatgggaga gggatttctg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 702

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(702)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 552

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(552)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Endostatina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador HindIII/DraIII: hebra superior

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(41)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador HindIII/DraIII: hebra inferior

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcagcacc ggctggaagt cctggtgggt gtga

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1077

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1077)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> angiostatina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador palindrómico donde el codón de detención

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGA va seguido por un locus XhoI

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactcgagt ca

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador mutagénico para angiostatina murina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador empleado para introducir HindIII en la angiostatina murina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(32)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador BspHI/BamHI: hebra superior

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(58)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador BspHI/BamHI: hebra inferior

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccgcccc cgccgctgcc tccgcccccg ctgcccccgc tcgatttgga gaaagaggt

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador BamHI/HindIII: hebra superior

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(11)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador BamHI/HindIII: hebra inferior

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctggcctg ag

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador AflII/HindIII: hebra superior

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(9)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador AflII/HindIII: hebra inferior

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgggcgc

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador XhoI/AflII: hebra superior

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(11)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: segmento enlazador XhoI/AflII: hebra inferior

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaagccgga g

\hfill

11

Claims

1. Una proteína de fusión homodimérica, que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis, que comprende una región Fc de inmunoglobulina y una proteína diana, comprendiendo la región Fc una región bisagra, un dominio CH_{2} y un dominio CH_{3}, y la proteína diana tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la endostatina y es un fragmento de colágeno XVIII, y está ligada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de dicha región Fc de inmunoglobulina.

2. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 1, en la que la proteína diana es la endostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

3. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 2, en la que la proteína diana comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 4.

4. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína diana está conectada con el extremo C-terminal de la región Fc.

5. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende, además, una segunda proteína diana, que es un fragmento plasminógeno o un fragmento de colágeno XVIII y tiene la actividad inhibidora de la angiogénesis de la angiostatina o de la endostatina.

6. Una proteína de fusión homodimérica de la reivindicación 5, en la que dicha segunda proteína diana es la endostatina o la angiostatina o un fragmento bioactivo de las mismas.

7. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 5 o 6, en la que dicha segunda proteína diana está ligada, a través de un segmento enlazador polipeptídico, con dicha primera proteína diana.

8. Una proteína de fusión homodimérica según la reivindicación 7, en la que dicha primera proteína diana está conectada con el extremo N-terminal de la región Fc y dicha segunda proteína diana está ligada con el extremo C-terminal de la región Fc.

9. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que dicha primera proteína diana es la endostatina y dicha segunda proteína diana es la angiostatina o un fragmento bioactivo de la misma.

10. Una proteína de fusión homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la inmunoglobulina es la IgG1.

11. Una molécula de ADN, que codifica una secuencia señal y una proteína de fusión tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión replicable para la transfección de una célula de mamífero, que comprende un ADN de la reivindicación 11.

13. Un método para la producción de una proteína de fusión homodimérica, tal como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de:

(a): la transfección de una célula de mamífero con el vector de la reivindicación 12,

(b): el cultivo de la célula de mamífero para producir dicha proteína de fusión, y

(c): el aislamiento de dicha proteína de fusión.