PT1107989E

PT1107989E - Expresso e exportaão de angiostatina e endostatina na forma de imunofusinas

Info

Publication number: PT1107989E
Application number: PT99942468T
Authority: PT
Inventors: Stephen D Gillies; Kin-Ming Lo; Yue Li
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2010-07-02
Also published as: JP2013128490A; WO2000011033A2; EP1107989B1; CZ2001643A3; JP2002523036A; US8703908B2; CN1326467A; US8206718B2; NO20010918D0; NO20010918L; JP2009273478A; CN100422332C; CZ302303B6; CA2339331A1; AU761027B2; RU2240328C2; EP1107989A2; PL202057B1; CN101386651A; AU5583699A

Description

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DESCRIÇÃO

"EXPRESSÃO E EXPORTAÇÃO DE ANGIOSTATINA E ENDOSTATINA NA FORMA DE IMUNOFUSINAS"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se genericamente a métodos e composições para preparar e utilizar proteínas de fusão contendo um inibidor da angiogénese. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos e composições para preparar e utilizar proteínas de fusão, denominadas imunofusinas, que contêm uma região Fc de imunoglobulina e uma proteína-alvo que tem a actividade inibidora da angiogénese da endostatina e é um fragmento do colagénio XVIII.

Contexto da Invenção

Foram descobertos dois inibidores potentes da angiogénese, angiostatina (0'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315) e endostatina (0'Reilly et al. (1997) Cell 8_8: 277), tendo-se verificado que são geradas naturalmente por tumores primários. As duas proteínas são inibidores específicos da proliferação de células endoteliais e inibem o crescimento tumoral por bloqueio da angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos que alimentam tumores. Estudos mostraram que estes inibidores da angiogénese são não tóxicos mesmo a doses muito elevadas e podem suprimir o crescimento de metástases, e tumores primários podem regredir para um estado microscópico dormente. Os dois inibidores foram identificados como sendo fragmentos proteolíticos de moléculas intactas muito maiores. Verificou-se que a angiostatina é um fragmento do plasminogénio e a endostatina é um fragmento do colagénio XVIII. 2

Estas duas proteínas geraram muito interesse na área do cancro porque demonstraram suprimir o crescimento de muitos tipos diferentes de tumores em ratinhos, sem efeitos secundários óbvios nem resistência a fármacos. A quimioterapia tradicional conduz geralmente a resistência adquirida a fármacos, causada principalmente pela instabilidade genética de células cancerígenas. Em vez de abordar selectivamente células cancerígenas, as terapias que empregam inibidores da angiogénese abordam selectivamente as células endoteliais normais, que suportam o crescimento do tumor. Uma vez que as células endoteliais são geneticamente estáveis, é possível que terapias com inibidores da angiogénese possam originar menor resistência a fármacos. Estudos indicam que não ocorreu desenvolvimento de resistência a fármacos em ratinhos expostos a dormência tumoral prolongada e sem recorrência de tumores depois de a terapia ter sido descontinuada (Boehm et al. (1997) Nature 390: 404) .

Apesar dos resultados promissores em ratinhos, não foi possível produzir angiostatina e endostatina activas, solúveis e de qualidade clínica em quantidades comerciais utilizando sistemas de expressão de E. coli, baculovírus, levedura e mamífero. A expressão em E. coli originou agregados proteicos insolúveis de composição indefinida, que não podiam ser injectados em humanos. Outros métodos de produção, como sistemas de expressão de baculovírus e mamífero, originaram níveis muito baixos das proteínas recombinantes (0'Reilly et al. (1997) Cell 8_8: 277).

Os baixos rendimentos dos sistemas de expressão até à data podem ser explicados por a angiostatina e a endostatina serem fragmentos internos de proteínas muito maiores. As proteínas truncadas podem não ser apropriadamente dobradas na ausência dos resíduos que são clivados das moléculas precursoras. Por exemplo, a 3 angiostatina tem 26 resíduos cisteína que formam numerosas ligações dissulfureto. A expressão da angiostatina por si própria pode não proporcionar o ambiente óptimo para que estas numerosas ligações dissulfureto sejam formadas correctamente na via secretora. Além disso, a proteína endostatina recombinante produzida em E. coli precipitou durante a diálise, possivelmente devido à hidrofobicidade da endostatina (0'Reilly et al. (1997) Cell 8_8: 277).

Um obstáculo importante à utilização de angiostatina e endostatina nas suas formas presentes é a necessidade de injectar quantidades relativamente grandes de proteínas diariamente durante semanas até meses para se obter o resultado clínico desejado. Por exemplo, nos modelos correntes de ratinho, são necessárias dosagens de 20 mg/kg/dia de endostatina para se obter uma eficácia óptima (Boehm et al. (1997) Nature 390: 404). Uma vez que há uma necessidade urgente de testar clinicamente a endostatina e angiostatina, é importante dispor de um método de produção que consiga gerar grandes quantidades de material de qualidade clinica.

Um sistema de expressão que tem sido utilizado para produzir um nivel de expressão elevado de proteínas de fusão em células de mamífero é uma construção de DNA que codifica uma sequência de sinal, uma região Fc de imunoglobulina e uma proteína-alvo. O produto de fusão desta construção é geralmente denominado "imunofusina". Várias proteínas-alvo foram expressas com êxito na forma de imunofusinas, que incluem: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, βΙΘ-H3, Receptor de IgE, PSMA e gpl20. Estas construções de expressão são divulgadas na Patente U.S. N° 5,541,087 e Patente U.S. N° 5,726,044.

Um objectivo importante da expressão de proteínas de fusão recombinantes em células de mamífero foi tentar conferir às moléculas híbridas propriedades novas ou úteis, 4 por exemplo, dobramento apropriado, solubilidade aumentada, abordagem selectiva de uma citoquina ou toxina in vivo, ligação de receptores de Fc, fixação do complemento, ligação de proteína A, tempo de semivida aumentado na circulação e capacidade aumentada para atravessar a barreira hematoencefálica. Exemplos de proteínas de fusão recombinantes produzidas em células de mamífero incluem imunoconjugados de citoquinas (Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 1428/ Gillies et al. (1993) Bioconjugate Chemistry _4: 230), imunoadesinas (Capon et al. (1989) Nature 337: 525), imunotoxinas (Chaudhary et al. (1989) Nature 339: 394) e um conjugado do factor de crescimento dos nervos (Friden et al. (1993) Science 259: 373) .

Um objectivo da invenção é proporcionar novos DNAs que codifiquem para proteínas de fusão com actividade inibidora da angiogénese e facilitem a produção e secreção eficientes de inibidores da angiogénese numa variedade de células-hospedeiro de mamífero.

Sumário da Invenção A presente invenção apresenta métodos e composições úteis na preparação e utilização de proteínas de fusão compreendendo uma região Fc de imunoglobulina e uma proteína-alvo que tem a actividade inibidora da angiogénese da endostatina e é um fragmento do colagénio XVIII. As proteínas de fusão podem facilitar um nível de expressão elevado de proteínas inibidoras da angiogénese biologicamente activas. As proteínas inibidoras da angiogénese podem então ser clivadas da proteína de fusão e combinadas com um transportador farmaceuticamente aceitável antes da administração a um mamífero, por exemplo, um humano. 5

Num aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos, por exemplo, moléculas de DNA ou RNA, que codificam uma proteína de fusão da invenção. A molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de sinal, uma região Fc de imunoglobulina e pelo menos uma proteína-alvo, também referida aqui como proteína inibidora da angiogénese, em que a referida pelo menos uma proteína-alvo é endostatina ou um fragmento do colagénio XVIII com actividade da endostatina. Numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codifica, em série no sentido 5' para 3', a sequência de sinal, a região Fc de imunoglobulina e a sequência da proteína-alvo. Noutra forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codifica, em série no sentido 5' para 3', a sequência de sinal, a sequência alvo e a região Fc de imunoglobulina.

Noutra forma de realização preferida, a região Fc de imunoglobulina compreende uma região conectora de imunoglobulina e compreende, preferivelmente, pelo menos uma região pesada constante de imunoglobulina, por exemplo, um domínio pesado constante 2 (CH2) de imunoglobulina, um domínio pesado constante 3 (CH3) de imunoglobulina e, dependendo do tipo de imunoglobulina utilizada para gerar a região Fc, opcionalmente um domínio da região pesada constante 4 (CH4) de imunoglobulina. Numa forma de realização mais preferida, a região Fc de imunoglobulina compreende uma região conectora, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em certas circunstâncias, a região Fc de imunoglobulina não tem, preferivelmente, pelo menos o domínio CHi. Apesar de as regiões Fc de imunoglobulina poderem basear-se em qualquer classe de imunoglobulinas, por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, são preferidas regiões Fc de imunoglobulinas à base de IgG.

Noutra forma de realização, o ácido nucleico da invenção pode ser incorporado, em associação operativa, num 6 vector de expressão replicável, que então pode ser transfectado numa célula-hospedeiro de mamífero. Noutra forma de realização preferida, a invenção proporciona células-hospedeiro que alojam essas sequências de ácidos nucleicos da invenção.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo uma região Fc de imunoglobulina ligada, directamente através de uma ligação polipeptídica ou então por intermédio de um agente de ligação polipeptídico, a pelo menos uma proteína-alvo que tem a actividade inibidora da angiogénese de um fragmento do colagénio XVIII com actividade de endostatina. A proteína-alvo pode ser fundida, via a sua extremidade C-terminal, a uma extremidade N-terminal da região Fc de imunoglobulina. No entanto, numa forma de realização mais preferida, a proteína-alvo é fundida, via a sua extremidade N-terminal, a uma extremidade C-terminal da região Fc de imunoglobulina.

Noutra forma de realização, a proteína de fusão pode compreender uma segunda proteína-alvo seleccionada do grupo que consiste em angiostatina, endostatina, um fragmento do plasminogénio com actividade de angiostatina e um fragmento do colagénio XVIII com actividade de endostatina. Neste tipo de construção, a primeira e a segunda proteínas-alvo podem ser proteínas iguais ou diferentes. Por exemplo, numa forma de realização preferida, a proteína de fusão compreende uma primeira proteína-alvo de angiostatina, uma região Fc de imunoglobulina e uma segunda proteína-alvo de endostatina. A primeira e a segunda proteínas-alvo podem ser ligadas entre si, directamente ou por intermédio de um agente de ligação polipeptídico.

Alternativamente, as duas proteínas-alvo podem ser ligadas, directamente ou via um agente de ligação polipeptídico, à região Fc de imunoglobulina. No último 7 caso, a primeira proteina-alvo é ligada a uma extremidade N-terminal da região Fc de imunoglobulina e a segunda proteina-alvo é ligada a uma extremidade C-terminal da região Fc de imunoglobulina.

Noutra forma de realização, duas proteínas de fusão podem associar-se, de modo covalente, por exemplo, por uma ligação dissulfureto ou peptídica, ou não covalente, para dar origem a uma proteína multimérica. Numa forma de realização preferida, duas proteínas de fusão associam-se de modo covalente por intermédio de uma ou mais ligações dissulfureto através de resíduos cisteína, preferivelmente localizados em regiões conectoras de imunoglobulina dispostas nas regiões Fc de imunoglobulina de ambas as cadeias.

Numa forma de realização preferida, a proteina-alvo compreende um fragmento do colagénio XVIII com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 4.

Além disso, a proteina-alvo pode ser angiostatina ou endostatina completa ou respectivos fragmentos bioactivos. A fonte da proteina-alvo na geração de certas proteínas de fusão dependerá da utilização pretendida da proteina-alvo. Por exemplo, se a proteina-alvo se destinar a ser administrada a um humano, a proteina-alvo é, preferivelmente, de origem humana.

Noutro aspecto, a invenção proporciona métodos de produção de uma proteína de fusão compreendendo uma região Fc de imunoglobulina e uma proteina-alvo, como especificado acima e nas reivindicações. 0 método compreende os passos de (a) proporcionar uma célula de mamífero contendo uma molécula de DNA que codifica essa proteína de fusão, com ou sem uma sequência de sinal, e (b) cultivar a célula de mamífero para produzir a proteína de fusão. A proteína de fusão resultante pode então ser recolhida, novamente dobrada, se necessário, e purificada 8 utilizando técnicas convencionais de purificação bem conhecidas e utilizadas na área. Presumindo que a proteina de fusão compreende um sitio de clivagem proteolitica disposto entre a região Fc de imunoglobulina e a proteina-alvo, o alvo pode ser clivado da proteina de fusão, utilizando enzimas proteoliticas convencionais, e, se necessário, purificado antes da utilização.

Os objectivos, caracteristicas e vantagens anteriores e outros da presente invenção tornar-se-ão mais claros a partir da descrição pormenorizada, figuras e reivindicações que se seguem.

Descrição Breve das Figuras

As Figuras 1C-1F são ilustrações esquemáticas de proteinas de fusão inibidoras da angiogénese exemplificativas construídas de acordo com a invenção (ver Exemplos 10-15). As Figuras representam, respectivamente: Figura 1C, Fc-Endostatina-agente de ligação GlySer-"Kringle" interno 1 da Angiostatina; Figura 1D, Fc-Endostatina-agente de ligação GlySer-"Kringle" 1 da Angiostatina; Figura 1E, Fc-Endostatina-agente de ligação GlySer-Angiostatina; Figura 1F, Angiostatina-Fc-

Endostatina. As linhas verticais representam ligações dissulfureto opcionais que ligam resíduos cisteína (C) dispostos numa região conectora da molécula Fc.

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção proporciona proteinas de fusão, aqui referidas como imunofusinas, que foram úteis na produção de quantidades comerciais de inibidores da angiogénese de qualidade clinica. Os inibidores da angiogénese podem ser clivados das construções de proteinas imunofusinas antes da 9 utilização. No entanto, é contemplado que as imunofusinas ou ácidos nucleicos que codificam as imunofusinas possam ser administrados directamente a mamíferos necessitados de tratamento com um inibidor da angiogénese.

Assim, a invenção proporciona proteínas de fusão compreendendo uma região Fc de imunoglobulina e pelo menos uma proteína-alvo, referida aqui como inibidor da angiogénese. O inibidor da angiogénese é preferivelmente seleccionado do grupo que consiste em angiostatina, endostatina, um fragmento do plasminogénio com actividade da angiostatina, um fragmento do colagénio XVIII com actividade da endostatina. No entanto, é contemplado que outros polipéptidos com actividade inibidora da angiogénese, agora conhecidos ou posteriormente descobertos, possam ser expressos como proteínas de fusão do tipo descrito aqui.

Quatro formas de realização exemplificativas de construções de proteínas que implementam a invenção estão ilustradas nas Figuras 1C-1F. Uma vez que são preferidas construções diméricas, estão todas ilustradas na forma de dímeros reticulados por um par de ligações dissulfureto entre cisteínas em subunidades adjacentes. Nas figuras, as pontes dissulfureto estão representadas ligando as porções de duas regiões Fc de imunoglobulinas via uma região conectora de imunoglobulina e, assim, são características das formas nativas destas moléculas. Não obstante construções incluindo a região conectora de Fc serem preferidas e ter sido mostrado que são promissoras como agentes terapêuticos, a invenção contempla que a reticulação noutras posições possa ser escolhida consoante o desejado. Além disso, nalgumas circunstâncias, dímeros ou multímeros úteis na prática da invenção podem ser produzidos por associação não covalente, por exemplo, por interacção hidrófoba. 10

Uma vez que construções homodiméricas são formas de realização importantes da invenção, a Figura 1 ilustra essas construções.

As Figuras 1C até 1E ilustram várias formas de realização das construções de proteínas da invenção, que incluem, como proteína-alvo, inibidores da angiogénese plurais dispostos em série e ligados por um agente de ligação. Na Figura 1C, a proteína-alvo compreende uma endostatina completa 4, um agente de ligação polipeptídico 5 e o anel interno do "Kringle" um da angiostatina 3. A Figura 1D ilustra uma proteína compreendendo uma região Fc igual à da Figura IA e uma proteína-alvo compreendendo uma endostatina completa 4, um agente de ligação polipeptídico 5 e uma região "Kringle" um completa da angiostatina (anéis interno e externo) 2. A Figura 1E difere da construção da Figura 1D por o domínio proteico mais C-terminal compreender uma cópia completa da angiostatina 7.

Apesar de as Figuras 1C-1E representarem construções do tipo Fc-X, em que X é a proteína-alvo, é contemplado que construções do tipo X-Fc também possam ser úteis na prática da invenção. Além disso, é contemplado que proteinas úteis da invenção também possam ser representadas pela fórmula X-Fc-X, em que os Xs podem representar proteínas-alvo iguais ou diferentes. A Figura 1F ilustra uma dessas construções, que compreende, no sentido N- para C-terminal, angiostatina humana completa 7, uma região Fc de imunoglobulina humana 6 incluindo uma região conectora e domínio completo da endostatina humana 4. O termo "inibidor da angiogénese", tal como é utilizado aqui, refere-se a qualquer cadeia polipeptídica que reduz ou inibe a formação de novos vasos sanguíneos num mamífero. Relativamente à terapia de cancro, o inibidor da angiogénese reduz ou inibe a formação de novos vasos sanguíneos no interior ou sobre um tumor, preferivelmente 11 no interior ou sobre um tumor sólido. É contemplado que inibidores da angiogénese úteis possam ser identificados utilizando uma variedade de ensaios bem conhecidos e utilizados na área. Esses ensaios incluem, por exemplo, o ensaio de proliferação de células endoteliais capilares bovinas, o ensaio da membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) ou o ensaio da córnea de ratinho. Todavia, é preferido o ensaio CAM (ver, por exemplo, 0'Reilly et ai. (1994) Cell 79: 315-328 e 0'Reilly et ai. (1997) Cell 8_8: 277-285). Em resumo, embriões com gemas intactas são removidos de ovos brancos fertilizados com três dias de idade e são colocados numa placa de Petri. Após incubação a 37°C, 3% de C02, durante três dias, um disco de metilcelulose contendo o inibidor da angiogénese putativo é aplicado na membrana corioalantóica de um embrião individual. Após incubação durante cerca de 48 horas, as membranas corioalantóicas foram observadas ao microscópio quanto a evidências de zonas de inibição.

Inibidores da angiogénese preferidos úteis na prática da invenção incluem, por exemplo, angiostatina (0'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315-328 e Patentes U.S. N°s 5,733,876; 5,837,682, e 5,885,795) e endostatina (0'Reilly et al. (1997) Cell 8_8: 277-285 e Patente U.S. N° 5, 854,205). Como afirmado previamente, a angiostatina e a endostatina são inibidores específicos da proliferação de células endoteliais e são capazes de inibir o crescimento tumoral por bloqueio da angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos que alimentam tumores. A angiostatina foi identificada como sendo um fragmento proteolítico do plasminogénio (0'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315-328 e Patentes U.S. N°s 5,733,876; 5,837,682, e 5,885,795). Especificamente, a angiostatina é um fragmento interno de 38 kDa do plasminogénio que contém pelo menos três das regiões "Kringle" do plasminogénio. A endostatina 12 foi identificada como sendo um fragmento proteolítico do colagénio XVIII (0'Reilly et ai. (1997) Cell 88_: 277-285). Especificamente, a endostatina é um fragmento C-terminal de 20 kDa do colagénio XVIII. Os termos "angiostatina" e "endostatina", tal como são utilizados aqui, referem-se não só às proteínas completas mas também a respectivas variantes e fragmentos bioactivos, bem como a fragmentos bioactivos do plasminogénio e colagénio XVIII, respectivamente. O termo fragmento bioactivo, relativamente à angiostatina, refere-se a qualquer fragmento proteico do plasminogénio ou angiostatina que tem pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 70% e muito preferivelmente pelo menos 90% da actividade da angiostatina completa, determinada pelo ensaio CAM. O termo fragmento bioactivo, relativamente à endostatina, refere-se a qualquer fragmento proteico do colagénio XVIII ou endostatina que tem pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 70% e muito preferivelmente pelo menos 90% da actividade da endostatina completa, determinada pelo ensaio CAM. O termo "variantes" inclui especifica e variantes alélicas, bem como outras variantes de ocorrência natural ou ocorrência não natural, por exemplo, geradas por protocolos convencionais de engenharia genética, que são pelo menos 70% semelhantes ou 60% idênticas, mais preferivelmente pelo menos 75% semelhantes ou 65% idênticas, e muito preferivelmente 80% semelhantes ou 70% idênticas a qualquer uma das sequências de ocorrência natural da endostatina ou angiostatina divulgadas aqui.

Para determinar se um polipéptido candidato tem a percentagem de semelhança ou identidade requerida com um polipéptido de referência, a sequência de aminoácidos candidata e a sequência de aminoácidos de referência são primeiramente alinhadas utilizando o algoritmo de programação dinâmica descrito em Smith e Waterman (1981), 13 J. Mol. Biol. 147: 195-197, em combinação com a matriz de substituição BLOSUM62 descrita na Figura 2 de Henikoff e Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad Sei. USA 8_9: 10915-10919. Para a presente invenção, um valor apropriado para a penalidade de inserção de hiato é -12 e um valor apropriado para a penalidade de extensão de hiato é -4. Programas computacionais que efectuam alinhamentos utilizando o algoritmo de Smith-Waterman e a matriz BLOSUM62, como o conjunto de programas do GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Inglaterra), estão comercialmente disponíveis e são extensamente usados pelos profissionais.

Depois de efectuado o alinhamento entre as sequências candidata e de referência, pode calcular-se uma pontuação da percentagem de semelhança. Os aminoácidos individuais de cada sequência são comparados sequencialmente de acordo com a sua semelhança entre si. Se o valor na matriz BLOSUM62 correspondente aos dois aminoácidos alinhados for zero ou um número negativo, a pontuação da semelhança do par é zero; de outro modo, a pontuação da semelhança do par é 1,0. A pontuação de semelhança em bruto é a soma das pontuações de semelhança dos pares dos aminoácidos alinhados. A pontuação em bruto é, então, normalizada dividindo-a pelo número de aminoácidos da menor das sequências candidata ou de referência. A pontuação em bruto normalizada é a percentagem de semelhança. Alternativamente, para calcular uma percentagem de identidade, os aminoácidos alinhados de cada sequência são novamente comparados sequencialmente. Se os aminoácidos não forem idênticos, a pontuação da identidade do par é zero; de outro modo, a pontuação da identidade do par é 1,0. A pontuação de identidade em bruto é a soma dos aminoácidos alinhados idênticos. A pontuação em bruto é, então, normalizada dividindo-a pelo número de aminoácidos da menor 14 das sequências candidata ou de referência. A pontuação em bruto normalizada é a percentagem de identidade. Inserções e deleções são ignoradas para calcular a percentagem de semelhança e de identidade. Em conformidade, penalidades de hiato não são utilizadas neste cálculo, apesar de serem utilizadas no alinhamento inicial.

As proteínas-alvo divulgadas aqui são expressas na forma de proteínas de fusão com uma região Fc de uma imunoglobulina. Como é conhecido, cada região constante de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina é compreendida por quatro ou cinco domínios. Os domínios são denominados sequencialmente do modo seguinte: CH1-conectora-CH2-CH3 (-CH4) . As sequências de DNA dos domínios de uma cadeia pesada têm homologia cruzada entre as classes de imunoglobulinas, por exemplo, o domínio CH2 da IgG é homólogo ao domínio CH2 da IgA e IgD e ao domínio CH3 da IgM e IgE.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "região Fc de imunoglobulina" significa a porção do terminal carboxilo de uma região constante de uma cadeia de imunoglobulina, preferivelmente uma região constante de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina, ou respectiva porção. Por exemplo, uma região Fc de imunoglobulina pode compreender 1) um domínio CHi, um domínio CH2 e um domínio CH3, 2) um domínio CHi e um domínio CH2, 3) um domínio CHi e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3 ou 5) uma combinação de dois ou mais domínios e uma região conectora de imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, a região Fc utilizada na construção de DNA inclui pelo menos uma região conectora de imunoglobulina, um domínio CH2 e um domínio CH3 e, preferivelmente, não tem pelo menos o domínio CHi.

A classe presentemente preferida de imunoglobulinas de onde é derivada a região constante da cadeia pesada é IgG 15 (IgY) (subclasses γ 1, 2, 3 ou 4) . Podem ser utilizadas outras classes de imunoglobulinas, IgA (Iga), IgD (Igõ), IgE (Igs) e IgM (Igp) . A escolha de regiões constantes de cadeias pesadas de imunoglobulinas apropriadas é discutida em pormenor nas Patentes U.S. N°s 5,541,087 e 5,726,044. Considera-se que a escolha de sequências de regiões constantes de cadeias pesadas de imunoglobulinas particulares de certas classes e subclasses de imunoglobulinas para se obter um resultado particular pertence ao âmbito do profissional. A porção da construção de DNA que codifica a região Fc de imunoglobulina compreende, preferivelmente, pelo menos uma porção de um dominio conector e preferivelmente pelo menos uma porção de um dominio CH3 de Fcy ou domínios homólogos em qualquer uma das IgA, IgD, IgE ou IgM.

Dependendo da aplicação, podem utilizar-se genes de regiões constantes de espécies diferentes da humana, por exemplo, ratinho ou rato. A região Fc utilizada como parceiro de fusão na construção de DNA de imunofusina pode provir, em geral, de qualquer espécie de mamífero. Quando for indesejável induzir uma resposta imunológica na célula ou animal hospedeiro contra a região Fc, a região Fc pode ser derivada da mesma espécie da célula ou animal hospedeiro. Por exemplo, pode utilizar-se Fc humana quando o animal ou célula hospedeiro é de humano; da mesma forma, pode utilizar-se Fc murina quando o animal ou célula hospedeiro for de ratinho. Além disso, também pode ser útil a substituição ou deleção de construções destas regiões constantes, em que um ou mais resíduos de aminoácidos dos domínios de regiões constantes são substituídos ou deletados. Um exemplo consiste em introduzir substituições de aminoácidos na região 0¾ superior para criar uma variante de Fc com afinidade reduzida para receptores de Fc (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). O profissional 16 poderá preparar essas construções utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular. A utilização de FcyI humana como sequência da região Fc tem várias vantagens. Por exemplo, se a proteina de fusão com inibidor da angiogénese e Fc se destinar a ser utilizada como agente biofarmacêutico, o domínio FcyI pode conferir à proteína de fusão as actividades de funções efectoras. As actividades de funções efectoras incluem as actividades biológicas como fixação do complemento, citotoxicidade celular dirigida a anticorpos, transferência placentária e tempo de semivida no soro aumentado. 0 domínio Fc também proporciona detecção por ELISA anti-Fc e purificação por ligação à proteina A de Staphylococcus aureus ("Proteína A") . No entanto, em certas aplicações, poderá ser desejável remover da região Fc funções efectoras especificas, como ligação a receptores de Fc ou fixação do complemento. clivadas

No caso de imunofusinas inibidoras da angiogénese, uma função do parceiro de fusão Fc de imunoglobulina é facilitar o dobramento apropriado da proteina inibidora da angiogénese, para dar origem a uma proteína inibidora da angiogénese activa e para conferir solubilidade às fracções activas, pelo menos no meio extracelular. Uma vez que o parceiro de fusão Fc é hidrófilo, a imunofusina inibidora da angiogénese já é solúvel, ao contrário, por exemplo, da endostatina recombinante produzida em E. coli (0'Reilly (1997) Cell 8_8: 277) . Em todos os Exemplos divulgados aqui obtiveram-se níveis elevados de produção das imunofusinas. As imunofusinas inibidoras da angiogénese foram segregadas para os meios em concentrações tipicamente de cerca de 30 até 100 pg/mL, e foi possível purificá-las facilmente até à homogeneidade por cromatografia com Proteína A. Adicionalmente, as imunofusinas inibidoras da angiogénese puderam ser clivadas e adicionalmente purificadas 17 utilizando protocolos convencionais de purificação, empregando, por exemplo, purificação com heparina sefarose, lisina sefarose ou por afinidade.

Para além dos niveis de expressão elevados, as proteinas de fusão da invenção também exibem tempos de semivida no soro maiores, presumivelmente devido às suas maiores dimensões moleculares. Por exemplo, Fc humana-angiostatina humana tem um tempo de semivida no soro de 33 horas no ratinho, em comparação com 4-6 horas para a angiostatina humana (0'Reilly et al. (1996) Nature Medicine 2_: 689) . Crê-se que a angiostatina, com um peso molecular de 40 kD, e a endostatina, com um peso molecular de 20 kD, são suficientemente pequenas para serem eliminadas eficientemente pela filtração renal. Em contraste, as formas diméricas de Fc-angiostatina e Fc-endostatina dimérica têm 145 kD e 100 kD, respectivamente, pois há duas regiões Fc de imunoglobulina ligadas a duas moléculas de angiostatina ou duas moléculas de endostatina. Essa estrutura bivalente pode exibir maior afinidade de ligação para o receptor da angiostatina ou endostatina. Se a actividade inibidora da angiogénese for mediada por receptores, as proteínas de fusão com Fc são potencialmente mais eficazes para suprimir tumores do que a angiostatina monovalente ou endostatina monovalente por si própria. Além disso, se a angiostatina e/ou endostatina pertencerem a uma classe de ligandos proteicos diméricos, a restrição física imposta pela Fc na angiostatina ou endostatina torna a dimerização num processo intramolecular, desse modo desviando o equilíbrio em favor do dímero e aumentando a sua ligação ao receptor. Resíduos cisteína também podem ser introduzidos no monómero, por tecnologia comum de DNA recombinante, em locais apropriados para estabilizar o dímero por formação de ligações dissulfureto covalentes. 18

Tal como é utilizado aqui, o termo "multivalente" refere-se a uma molécula recombinante que incorpora dois ou mais segmentos biologicamente activos. Os fragmentos proteicos que formam a molécula multivalente podem ser ligados através de um agente de ligação peptídico de polipéptido, que liga as partes constituintes sem causar um deslocamento do quadro de leitura e permite que cada uma funcione independentemente.

Tal como é utilizado aqui, o termo "bivalente" refere-se a uma molécula recombinante multivalente com duas proteinas-alvo numa construção de fusão da invenção, por exemplo, uma molécula Fc-X, em que X é independentemente seleccionado de angiostatina, endostatina ou respectiva variante. Uma vez que há duas fracções X fundidas a uma região Fc de imunoglobulina (que tipicamente é um dimero dos fragmentos da cadeia pesada incluindo pelo menos uma porção da região conectora e dominio CH3, e opcionalmente o domínio CH2) , a molécula é bivalente. Se a construção de fusão da invenção tiver a forma Fc-X-X, a molécula dimérica de Fc resultante é tetravalente. As duas proteínas que formam a molécula Fc-X-X podem ser ligadas através de um agente de ligação peptídico. Uma molécula bivalente pode aumentar a afinidade de ligação aparente entre a molécula e o seu receptor. Por exemplo, se uma fracção de endostatina de uma Fc-endostatina conseguir ligar-se a um receptor numa célula com uma certa afinidade, a segunda fracção de endostatina da mesma Fc-endostatina poderá ligar-se a um segundo receptor na mesma célula com avidez (afinidade aparente) muito maior. Isto deve-se à proximidade física da segunda fracção de endostatina ao receptor depois de a primeira fracção de endostatina já estar ligada. No caso da ligação de um anticorpo a um antigene, a afinidade aparente é aumentada em pelo menos 104. 19

Tal como são utilizados aqui, os termos "multímero" e "multimérico" referem-se à associação estável de duas ou mais cadeias polipeptídicas, de modo covalente, por exemplo, através de uma interacção covalente, por exemplo, por uma ligação dissulfureto, ou de modo não covalente, por exemplo, por interacção hidrófoba. Pretende-se que o termo multímero abranja homomultímeros, em que os polipéptidos são iguais, bem como heteromultímeros, em que os polipéptidos são diferentes.

Tal como é utilizado aqui, o termo "dimérico" refere-se a uma molécula multimérica específica na qual duas cadeias polipeptídicas de proteínas estão associadas de modo estável através de interacções covalentes ou não covalentes. Deve entender-se que o próprio fragmento Fc da região Fc de imunoglobulina é, tipicamente, um dímero dos fragmentos da cadeia pesada, incluindo pelo menos uma porção da região conectora e domínio CH3, e opcionalmente o domínio CH2. É conhecido que muitos ligandos proteicos se ligam aos seus receptores na forma de um dímero. Se um ligando proteico X dimerizar naturalmente, a fracção X numa molécula Fc-X irá dimerizar em muito maior extensão, uma vez que o processo de dimerização depende da concentração. A proximidade física das duas fracções X ligadas por uma região Fc de imunoglobulina associada torna a dimerização num processo intramolecular, desviando grandemente o equilíbrio em favor do dímero e aumentando a sua ligação ao receptor.

Deve entender-se que a presente invenção explora metodologias convencionais de DNA recombinante para gerar as proteínas de fusão com Fc úteis na prática da invenção. As construções de fusão com Fc são preferivelmente geradas ao nível do DNA, e os DNAs resultantes são integrados em vectores de expressão e são expressos para produzir as imunofusinas. Entende-se que o termo "vector, tal como é 20 aqui utilizado, significa qualquer ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos competente para ser incorporada numa célula-hospedeiro e para ser recombinada e integrada no genoma da célula-hospedeiro, ou para se replicar de forma autónoma como um epissoma. Esses vectores incluem ácidos nucleicos lineares, plasmideos, fagemideos, cosmideos, vectores de RNA, vectores virais e afins. Exemplos não limitadores de um vector virai incluem um retrovirus, um adenovirus e um virus adeno-associado. Entende-se que o termo "expressão genética" ou "expressão" de uma proteina-alvo, tal como é utilizado aqui, significa a transcrição de uma sequência de DNA, tradução do transcrito de mRNA e secreção de um produto de proteína de fusão com Fc.

Um vector de expressão útil é pdCs (Lo et al. (1988) Protein Engineering 1_1: 495) , no qual a transcrição do gene Fc-X emprega o intensificador/promotor do citomegalovírus humano e o sinal de poliadenilação do SV40. A sequência intensificadora e promotora do citomegalovírus humano utilizada foi derivada dos nucleótidos -601 até +7 da sequência apresentada em Boshart et al., 1985, Cell 41: 521. O vector também contém o gene da di-hidrofolato redutase mutante como marcador de selecção (Simonsen e Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 8_0: 2495) .

Uma célula-hospedeiro apropriada pode ser transformada ou transfectada com a sequência de DNA da invenção e utilizada para a expressão e secreção de uma proteína-alvo. Células-hospedeiro presentemente preferidas para utilização na invenção incluem células imortalizadas de hibridoma, células de mieloma NS/O, células 293, células de ovário de hamster chinês, células HeLa e células COS.

As proteínas de fusão da invenção são preferivelmente geradas por metodologias convencionais de DNA recombinante. As proteínas de fusão são preferivelmente produzidas por 21 expressão, numa célula-hospedeiro, de uma molécula de DNA que codifica uma sequência de sinal, uma região Fc de imunoglobulina e uma proteina-alvo (também referida aqui como inibidor da angiogénese). Construções preferidas podem codificar, no sentido 5' para 3', a sequência de sinal, a região Fc de imunoglobulina e a proteina-alvo. Alternativamente, as construções podem codificar, no sentido 5' para 3', a sequência de sinal, a proteina-alvo e a região Fc de imunoglobulina.

Entende-se que o termo "sequência de sinal", tal como é aqui utilizado, designa um segmento peptídico que dirige a secreção da proteína imunofusina inibidora da angiogénese e depois é clivada após tradução na célula-hospedeiro. A sequência de sinal da invenção é um polinucleótido que codifica uma sequência de aminoácidos que inicia o transporte de uma proteína através da membrana do reticulo endoplasmático. Sequências de sinal que serão úteis na invenção incluem sequências de sinal de cadeias leves de anticorpos, por exemplo, anticorpo 14.18 (Gillies et al., 1989, Jour. of Immunol. Meth., 125: 191-202), sequências de sinal de cadeias pesadas de anticorpos, por exemplo, a sequência de sinal da cadeia pesada do anticorpo MOPC141 (Sakano et al., 1980, Nature 286: 5774), e quaisquer outras sequências de sinal conhecidas na área (ver, por exemplo, Watson, 1984, Nucleic Acids Research 1_2: 5145) .

As sequências de sinal foram bem caracterizadas na área e é conhecido que contêm, tipicamente, 16 até 30 resíduos de aminoácidos, e podem conter mais ou menos resíduos de aminoácidos. Um péptido de sinal típico consiste em três regiões: uma região N-terminal básica, uma região hidrófoba central e uma região C-terminal mais polar. A região hidrófoba central contém 4 até 12 resíduos hidrófobos que procedem à ancoragem do péptido de sinal através da bicamada lipídica membranar durante o transporte do 22 polipéptido nascente. Após a iniciação, o péptido de sinal é habitualmente clivado no lúmen do retículo endoplasmático por enzimas celulares conhecidas como peptidases de sinal. Os sítios de clivagem potencial do péptido de sinal seguem, em geral, a "regra (-3, -1)". Assim, um péptido de sinal típico tem pequenos resíduos de aminoácidos neutros nas posições -1 e -3 e não tem resíduos prolina nesta região. A peptidase de sinal irá proceder à clivagem desse péptido de sinal entre os aminoácidos -1 e +1. Assim, a porção do DNA que codifica a sequência de sinal pode ser clivada do terminal amino da proteína imunofusina durante a secreção. Isto origina a secreção de uma proteína imunofusina que consiste na região Fc e na proteína-alvo. Uma discussão pormenorizada de sequências de péptidos de sinal é apresentada por von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14: 4683.

Como será claro para o profissional, determinar a conveniência de uma sequência de sinal particular para utilização na invenção poderá requerer alguma experimentação de rotina. Essa experimentação inclui determinar a capacidade da sequência de sinal para dirigir a secreção de uma imunofusina e também determinar a configuração óptima, genómica ou de cDNA, da sequência a ser utilizada para se obter uma secreção eficiente de imunofusinas. Adicionalmente, o profissional é capaz de criar um péptido de sinal sintético seguindo as regras apresentadas por von Heijne, referido acima, e testar a eficácia dessa sequência de sinal sintética por experimentação de rotina. Uma sequência de sinal também pode ser denominada "péptido de sinal", "sequência líder" ou "péptido líder". A fusão da sequência de sinal e da região Fc de imunoglobulina é, por vezes, referida aqui como cassete de secreção. Uma cassete de secreção exemplificativa útil na 23 prática da invenção é um polinucleótido que codifica, no sentido 5' para 3' , uma sequência de sinal de um gene de uma cadeia leve de imunoglobulina e uma região FcyI do gene γΐ de imunoglobulina humana. A região FcyI do gene FcyI de imunoglobulina inclui, preferivelmente, pelo menos uma porção do dominio conector e pelo menos uma porção do dominio CH3 ou, alternativamente, pelo menos porções do dominio conector, dominio CH2 e dominio CH3. 0 DNA que codifica a cassete de secreção pode estar na sua configuração genómica ou na sua configuração de cDNA.

Noutra forma de realização, a sequência de DNA codifica um sitio de clivagem proteolitica interposto entre a cassete de secreção e a proteina inibidora da angiogénese. Um sitio de clivagem proporciona a clivagem proteolitica da proteina de fusão codificada, desse modo separando o dominio Fc da proteina inibidora da angiogénese. Tal como é aqui utilizado, entende-se que "sitio de clivagem proteolitica" significa sequências de aminoácidos que são preferencialmente clivadas por uma enzima proteolitica, ou outros agentes de clivagem proteolitica. Sitios de clivagem proteolitica úteis incluem sequências de aminoácidos que são reconhecidas por enzimas proteolíticas, como tripsina, plasmina ou enteroquinase K. São conhecidos muitos pares de sitio de clivagem/agente de clivagem. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5,726,044. Quando a sequência da proteína-alvo for uma molécula precursora da angiostatina, endostatina ou respectiva variante activa, o produto proteico desejado pode ser produzido por clivagem com a enzima proteolitica endógena, como elastina ou plasmina ou uroquinase. A presente invenção também abrange proteínas de fusão contendo diferentes combinações de angiostatina e endostatina recombinantes, ou respectivos fragmentos, que podem ser produzidas em grandes quantidades. Apesar da 24 eficácia demonstrada na supressão do crescimento tumoral, o mecanismo do bloqueio da angiogénese pela angiostatina e endostatina ainda não é completamente conhecido. A angiostatina tem várias estruturas "Kringle" e a endostatina tem diferentes motivos estruturais, e cada um deles pode ser o único responsável ou auxiliar a ligação das proteínas a células endoteliais e exercer um efeito anti-angiogénico. Em conformidade, esta invenção inclui proteinas-alvo que são fragmentos bioactivos da angiostatina, como "Kringle" 1, "Kringle" 2, "Kringle" 3, e suas combinações, e endostatina que exibem um comportamento fisiologicamente semelhante à angiostatina e endostatina completas de ocorrência natural.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona construções hibridas bifuncionais de inibidores da angiogénese. Tal como é utilizado aqui, uma molécula ou construção híbrida bifuncional significa uma proteína produzida por combinação de duas subunidades proteicas, em que as duas subunidades podem ser derivadas de diferentes proteínas. Cada subunidade proteica tem a sua própria função independente, de modo que, na molécula híbrida, as funções das duas subunidades podem ser aditivas ou sinergéticas. Essas proteínas híbridas funcionais permitirão explorar o efeito sinergético da angiostatina e endostatina em modelos animais. Um híbrido bifuncional preferido pode compreender pelo menos dois inibidores da angiogénese diferentes ligados em série, directamente ou através de um agente de ligação polipeptídico. Por exemplo, numa forma de realização preferida, a sequência alvo codifica pelo menos uma porção da angiostatina ligada na estrutura a pelo menos uma porção da endostatina, e os dois domínios de angiostatina e endostatina exibem actividade anti-angiogénese ou inibição da angiogénese. As duas 25 unidades podem ser ligadas por um agente de ligação polipeptidico.

Entende-se que o termo "agente de ligação polipeptidico", tal como é utilizado aqui, significa uma sequência peptídica que pode ligar duas proteínas ou uma proteína e uma região Fc. 0 agente de ligação polipeptidico compreende, preferivelmente, uma pluralidade de aminoácidos, como glicina e/ou serina. Preferivelmente, o agente de ligação polipeptidico compreende uma série de péptidos de glicina e serina com cerca de 10-15 resíduos de comprimento. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5,258,698. No entanto, é contemplado que o comprimento e composição de aminoácidos óptimos do agente de ligação podem ser determinados por experimentação de rotina.

Quando diferentes partes da angiostatina são expressas como moléculas de fusão com Fc, verifica-se que se obtêm níveis de expressão elevados, presumivelmente porque a porção Fc actua como transportador, ajudando o polipéptido, no terminal C, a ser dobrado correctamente. Adicionalmente, a região Fc pode ser glicosilada e estar altamente carregada ao pH fisiológico e, assim, a região Fc pode ajudar a solubilizar proteínas hidrófobas. A presente invenção também proporciona métodos para a produção de angiostatina e endostatina de espécies não humanas na forma de proteínas de fusão. Proteínas de fusão não humanas inibidoras da angiogénese são úteis para estudos pré-clínicos de inibidores da angiogénese, pois devem ser realizados estudos de eficácia e toxicidade de um fármaco proteico em sistemas de modelos animais antes do teste em humanos. Uma proteína humana pode não funcionar num modelo de ratinho porque a proteína pode induzir uma resposta imunológica e/ou exibir uma farmacocinética diferente, desse modo deturpando os resultados dos testes. Em consequência, a proteína de ratinho equivalente é o 26 melhor substituto da proteína humana para a realização de testes num modelo de ratinho. 0 modelo padrão do carcinoma pulmonar de Lewis em ratinhos (0'Reilly et al. (1997) Cell 8_8: 277) foi utilizado para comparar os sistemas solúveis huFc-huAngiostatina, huFc-huEndostatina, muFc-muAngiostatina, muFc-muEndostatina com as proteínas insolúveis produzidas num sistema de expressão de E. coli. As proteínas de fusão com Fc solúveis foram mais eficazes na supressão do crescimento tumoral no modelo pulmonar de Lewis do que as proteínas correspondentes produzidas em E. coli. Além disso, os ratinhos de laboratório são consanguíneos e os seus tumores são induzidos, não são espontâneos. Em consequência, a eficácia num modelo de ratinho pode não estar correlacionada com uma eficácia provável contra tumores humanos. Estudos pré-clínicos em cães fornecerão informações mais precisas acerca da eficácia destes inibidores da angiogénese em tumores espontâneos, pois há numerosos tumores caninos espontâneos de ocorrência natural. Os métodos de produção de Fc murina (mu Fc)-mu angiostatina, muFc-mu endostatina e Fc canina (ca Fc)-ca angiostatina, caFc-ca endostatina da presente invenção irão facilitar estudos pré-clínicos de inibidores da angiogénese em sistemas murinos e caninos. A presente invenção proporciona métodos de tratamento de um estado mediado pela angiogénese por administração do DNA, RNA ou proteínas da invenção. Estados mediados pela angiogénese incluem, por exemplo: tumores sólidos; tumores de origem sanguínea, metástases tumorais, tumores benignos, incluindo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogénicos; artrite reumatóide; psoríase; doenças oculares angiogénicas (retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, degenerescência macular, rejeição de enxerto corneano, glaucoma 27 neovascular), fibroplasia retrolental, rubeose, Síndroma de Osler-Webber; angiogénese do miocárdio; neovascularização de placas; telangiectasia; articulações de hemofílicos; angiofibroma, e granulação de feridas, e estimulação excessiva ou anormal de células endoteliais, adesões intestinais, arterosclerose, esclerodermia e cicatrizes hipertróficas, isto é, quelóides.

As construções de DNA divulgadas aqui podem ser úteis em procedimentos de terapia genética nos quais o gene da endostatina ou angiostatina é distribuído numa célula por um de vários meios, por exemplo, DNA nativo associado a um promotor ou DNA num vector virai. Uma vez dentro da célula, o gene ou fragmento genético da angiostatina e/ou endostatina é expresso e a proteína é produzida in vivo para desempenhar a sua função biológica normal. A construção de DNA da presente invenção origina níveis elevados de expressão da proteína de fusão. As proteínas de fusão da presente invenção também podem ser úteis no tratamento de estados mediados pela angiogénese e podem ter maior eficácia clínica do que inibidores da angiogénese nativos e outros inibidores da angiogénese recombinantes, pois as imunofusinas inibidoras da angiogénese da presente invenção têm um tempo de semivida no soro maior do que os outros inibidores da angiogénese recombinantes ou inibidores da angiogénese nativos isoladamente. As formas bivalentes e diméricas da presente invenção devem ter maior afinidade de ligação devido à estrutura bivalente e dimérica. As moléculas híbridas bifuncionais da presente invenção podem ter maior eficácia clínica devido a possíveis efeitos sinergéticos dos dois inibidores da angiogénese diferentes ligados pela região Fc fundida ou um agente de ligação polipeptídico flexível.

As composições da presente invenção podem ser administradas a um animal por qualquer meio adequado, de 28 forma directa (por exemplo, localmente, tal como por injecção, implantação ou administração tópica no locus de um tecido) ou sistémica (por exemplo, por via parentérica ou oral) . Quando a composição se destinar a ser administrada parentericamente, tal como por administração intravenosa, subcutânea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intra-orbital, intracerebral, intracraniana, intra-espinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal ou por aerossol, a composição compreende, preferivelmente, parte de uma suspensão ou solução fluida aquosa ou fisiologicamente compatível. Assim, o transportador ou veiculo é fisiologicamente aceitável de modo que, para além de distribuir a composição desejada no paciente, não afecta adversamente o equilíbrio de electrólitos e/ou volúmico do paciente. Assim, o meio fluido para o agente pode compreender solução salina fisiológica normal (por exemplo, NaCl aquoso 9,85%, 0,15 M, pH 7-7,4).

Dosagens preferidas das imunofusinas por administração situam-se na gama de 50 ng/m2 até 1 g/m2, mais preferivelmente 5 pg/m2 até 200 mg/m2 e muito preferivelmente 0,1 mg/m2 até 50 mg/m2. Dosagens preferidas de ácidos nucleicos que codificam as imunofusinas por administração situam-se na gama de 1 pg/m2 até 100 mg/m2, mais preferivelmente 20 pg/m2 até 10 mg/m2 e muito preferivelmente 400 pg/m2 até 4 mg/m2. No entanto, é contemplado que os modos de administração e dosagens óptimos sejam determinados por experimentação de rotina no âmbito da pericia do profissional. A invenção é suplementarmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitadores. 29

EXEMPLOS

Exemplo 1. Expressão de huFc-huEndostatina A endostatina humana foi expressa na forma de uma proteína de fusão Fc humana-endostatina humana (huFc-huEndo) de acordo com os ensinamentos de Lo et al. (1998) Protein Engineering 1_1: 495. Fc refere-se ao fragmento Fc da imunoglobulina gama humana (sequência de DNA apresentada na ID SEQ NO: 1, sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 2). Utilizaram-se reacções em cadeia de polimerase (PCR) para adaptar o cDNA da endostatina (ID SEQ NO: 3, cuja sequência de aminoácidos é divulgada na ID SEQ NO: 4) para expressão numa proteína de fusão Fc-Endo. 0 "primer" directo foi 5' - CG CCO OOT AAACAC AGCCACCOC QAC TTCC (ID SEQ NO: 5; aminoácidos codificados divulgados na ID SEQ NO: 6) ou 5' -C AAG CTT CAC AGC CAC CGC 0AC TTC C (ID SEQ NO: 7 ; aminoácidos codificados divulgados na ID SEQ NO: 8), em que o sítio Xmal ou o sítio HindIII foi seguido de uma sequência que codifica o terminal N da endostatina. O "primer" com o sítio Xmal adaptou o cDNA da endostatina para ligação ao sítio Xmal no final do domínio CH3 da região Fc de IgG. 0 "primer" com o sítio HindIII adaptou o cDNA da endostatina para ligação ao sítio HindIII do vector pdCs-Fc(D4K) , que contém o sítio de reconhecimento de enteroquinases Asp4-Lys (LaVallie et al. (1993) J. Biol.

Chem. 268: 23311-23317) na junção da proteína de fusão. 0 "primer" reverso foi 5' -CCTC GAGCTACTTGGAGGC AGTCATG (ID SEQ NO: 9), que foi concebido para colocar um codão de TERMINAÇÃO da tradução (anticodão, CTA) imediatamente após o terminal C da endostatina, a que se seguiu um sítio Xhol. Os produtos de PCR foram clonados e sequenciados e o fragmento Xmal-Xhol foi ligado ao vector pdCs-Fc resultante digerido com Xmal e Xhol. De modo semelhante, o fragmento 30

HindIII-Xhol que codifica a endostatina foi ligado no vector pdCs-huFc(D4K) apropriadamente digerido. Obtiveram-se clones estáveis que expressam Fc-endo ou Fc(D4K)-endostatina por electroporação de células NS/0, seguido de selecção em meio de crescimento contendo metotrexato 100 nM. O nivel de expressão de proteínas foi avaliado por ELISA anti-Fc humano (Exemplo 3) e foi confirmado por SDS-PAGE, que revelou um produto proteico de ~52 kD. Os melhores clones produtores foram subclonados por diluições limitantes.

Exemplo 2. Cultura e transfecção de células

Para a transfecção transitória, o plasmideo foi introduzido em células 293 de rim humano por coprecipitação de DNA plasmidico com fosfato de cálcio (Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY) ou por lipofecção utilizando LipofectAMINE Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo do fornecedor.

Para se obterem clones transfectados de forma estável, o DNA plasmidico foi introduzido nas células NS/0 de mieloma de ratinho por electroporação. As células NS/0 cresceram em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com soro fetal de bovino 10%. Cerca de 5 x 106 células foram lavadas uma vez com PBS e foram ressuspensas em 0,5 mL de PBS. Em seguida incubaram-se 10 pg de DNA plasmidico linearizado com as células numa Cuvete do Gene Pulser (hiato dos eléctrodos 0,4 cm, BioRad, Hercules, CA) em gelo durante 10 minutos. A electroporação foi realizada utilizando um Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) com os parâmetros 0,25 V e 500 pF. Deixaram-se as células recuperar durante 10 minutos em gelo, após o que foram ressuspensas em meio de crescimento e depois foram 31 plaqueadas em duas placas de 96 cavidades. Os clones transfectados de forma estável foram seleccionados por crescimento na presença de metotrexato (MTX) 100 nM, que foi introduzido dois dias pós-transfecção. As células foram nutridas de 3 em 3 dias mais três vezes, e clones resistentes ao MTX apareceram em 2 até 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones foram avaliados por ELISA anti-Fc, para identificar os grandes produtores. Os clones grandes produtores foram isolados e propagados em meio de crescimento que continha MTX 100 nM.

Exemplo 3. Procedimentos de ELISA

Utilizaram-se três ELISAs diferentes para determinar as concentrações de produtos proteicos nos sobrenadantes de clones resistentes ao MTX e outras amostras de teste. Utilizou-se ELISA anti-Fc humana (huFc) para medir a quantidade de proteínas que continham Fc humana. Os anticorpos anti-Fc murina (muFc) e anti-Fc canina (caFc) foram utilizados em ELISAs para medir a quantidade de proteínas que continham Fc murina e Fc canina, respectivamente. O procedimento para ELISA anti-huFc é aqui descrito abaixo em pormenor. A. Revestimento de placas

As placas de ELISA foram revestidas com anti-IgG Humano de Cabra AffiniPure (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a 5 pg/mL em PBS e 100 pL/cavidade em placas de 96 cavidades (Nunc-Immuno plate MaxiSorp™, Nalge Nunc International, Rochester, NY) . As placas revestidas foram tapadas e incubadas a 4°C durante a noite. Em seguida, as placas foram lavadas 4 vezes com Tween 20 0,05% em PBS e foram bloqueadas com BSA 1%/Soro de Cabra 1% em PBS, 200 pL/cavidade. Após incubação com o tampão de bloqueio a 37°C durante 2 horas, as placas foram 32 lavadas 4 vezes com Tween 0,05% em PBS e foram secas com pancadas leves em toalhas de papel. B. Incubação com amostras de teste e anticorpo secundário

Diluíram-se amostras de teste para as concentrações apropriadas num tampão de amostra que continha BSA 1%/Soro de Cabra 1%/Tween 0,05% em PBS. Preparou-se uma curva padrão com um anticorpo quimérico (com uma Fc humana) cuja concentração era conhecida. Para preparar uma curva padrão fizeram-se diluições em série no tampão de amostra, para construir uma curva padrão desde 125 ng/mL até 3,9 ng/mL. As amostras diluídas e os padrões foram adicionados à placa, 100 pL/cavidade, e a placa foi então incubada a 37°C durante 2 horas. Após a incubação, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. A cada cavidade adicionaram-se 100 pL de anticorpo secundário, anti-IgG humano conjugado com peroxidase de rábano bravo (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA), diluído cerca de 1:120 000 em tampão de amostra. Foi necessário determinar a diluição exacta do anticorpo secundário para cada lote do Anti-IgG Humano conjugado com HRP. Após incubação a 37°C durante 2 horas, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. C. Desenvolvimento

Preparou-se uma solução de substrato dissolvendo 30 mg (1 pastilha) de dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD) em 15 mL de ácido cítrico 0,025 M/tampão de Na2HP04 0,05 M, pH 5, contendo 0,03% de H2O2 adicionada de fresco. A solução de substrato foi adicionada à placa a 100 pL/cavidade. Deixou-se a cor desenvolver durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. O tempo do desenvolvimento pode ser sujeito a alterações, dependendo da variabilidade entre lotes das placas revestidas, anticorpo secundário, etc. Terminou-se a reacção por adição de H2S04 4 N, 100 pL/cavidade. A placa foi lida num leitor de placas, 33 ajustado para 490 e 650 nm, e foi programado para subtrair a OD do fundo a 650 nm da OD a 490 nm. O procedimento para ELISA anti-muFc foi semelhante, com a excepção da placa de ELISA ter sido revestida com anti-IgG murino de Cabra AffiniPure (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a 5 pg/mL em PBS e 100 pL/cavidade, e o anticorpo secundário foi Fcy anti-muIgG de cabra conjugado com peroxidase de rábano bravo (Jackson ImmunoResearch West Grove, PA), utilizado numa diluição de 1 em 5000. De modo semelhante, para ELISA anti-caFc, a placa de ELISA foi revestida com Fragmento Fc especifico de Coelho anti-IgG de cão AffiniPure (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a 5 pg/mL em PBS e 100 pL/cavidade, e o anticorpo secundário foi fragmento Fc especifico de coelho anti-IgG de cão AffiniPure conjugado com peroxidase de rábano bravo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , utilizado numa diluição de 1 em 5000.

Exemplo 4. Expressão de muFc-mu-Endostatina

Endostatina murina (sequência de DNA apresentada na ID SEQ NO: 17; sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 18) e Fc murina (sequência de DNA apresentada na ID SEQ NO: 19; aminoácidos codificados apresentados na ID SEQ NO: 20) foram expressas na forma de uma proteína de fusão Fc murina-endostatina murina (muFc-muEndo) essencialmente como descrito no Exemplo 1. Utilizou-se PCR para adaptar o cDNA da endostatina (ID SEQ NO: 4) para expressão no vector pdCs-muFc(D4K) . O "primer" directo foi 5'- GCCC AAG CITCAT ACTCATCAiOGAC ITT C (ID SEQ NO: 21; aminoácidos codificados divulgados na ID SEQ NO: 22), em que o sítio HindIII foi seguido de uma sequência que codifica o terminal N da endostatina. O "primer" reverso foi 5'-CCCCTCOAG €TATrT'OCÍAGAAACÍ(AGOTC (ID SEQ NO: 23), que foi 34 concebido para colocar um codão de TERMINAÇÃO da tradução (anticodão, CTA) imediatamente após o terminal C da endostatina, a que se seguiu um sitio Xhol. 0 produto de PCR foi clonado e sequenciado e o fragmento HindIII-Xhol resultante que codifica a endostatina foi ligado no vector pdCs-huFc (D4K) . Clones NS/0 estáveis que expressam muFc(D4K)-muEndo foram seleccionados e avaliados (ELISA anti-muFc) como descrito nos Exemplos 2 e 3.

Exemplo 5. Expressão de Fc canina (caFc)

Utilizaram-se células monociticas do sangue periférico (PBMCs) caninas isoladas de sangue de cão para preparar mRNA. Após a síntese do primeiro filamento de cDNA com transcriptase reversa e oligo(dT), efectuou-se PCR para amplificar a Fc canina (Kazuhiko et al., (1992) JP 1992040894-Al) utilizando o "primer" directo 5'-CC TTA AGC ΟΛΑ AA? βΟ A AQA OTT CCT COC (ID SEQ NO: 2 9; ami no ácidos codificados divulgados na ID SEQ NO: 30), no qual um sítio AflII foi introduzido imediatamente a montante da sequência que codifica a região conectora da Fc canina, e o "primer" reverso 5'- C CTC OAO TCA ITT ACC CQG GOA ATO GOA GAG OOA ΤΠ m (ID SEQ NO: 31), no qual um sítio Xhol foi introduzido após o codão de TERMINAÇÃO da tradução (anticodão, TCA) da Fc canina. O "primer" reverso também introduziu uma mutação silenciosa para criar um sítio de restrição Xmal, que facilita a construção do vector pdCs-caFc(D4K) através de um agente de ligação-adaptador e ligação a construções de DNA que codificam endostatina ou angiostatina canina. De modo semelhante à construção de pdCs-huFc, que foi descrita em pormenor em Lo et al. (Lo et al., Protein Engineerlng (1998) 11: 495), o vector de expressão para pdCs-caFc foi construído do modo seguinte. O fragmento AflII-Xhol que codifica a Fc canina foi ligado ao fragmento Xbal-AflII que 35 codifica o péptido de sinal da cadeia leve e o vector pdCs digerido com Xbal-Xhol. Em seguida, o vector de expressão pdCs-caFc resultante foi utilizado para transfectar células 293. Cerca de 3 dias pós-transfecção, o sobrenadante foi purificado por cromatografia com Proteina A. A expressão de Fc de cão (sequência de DNA apresentada na ID SEQ NO: 32; sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 33) foi confirmada por SDS-PAGE, seguida de análise de coloração "Western" utilizando um fragmento Fc especifico de Coelho anti-IgG de Cão conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Exemplo 6. Expressão de caFc-caEndostatina

A sequência codificadora para a endostatina canina (sequência de DNA apresentada na ID SEQ NO: 34; sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 35) foi adaptada a um fragmento HindIII-Xhol para expressão na forma de uma proteina de fusão com Fc essencialmente como descrito no Exemplo 5. Na extremidade 3' introduziu-se um codão de TERMINAÇÃO, por exemplo, por PCR, imediatamente após o codão que codifica o residuo lisina C-terminal, a que se seguiu o sitio de restrição NotI. No entanto, na extremidade 5' havia um sitio de restrição DralII conveniente para reconstrução. Um duplex oligonucleotidico, consistindo em extremidades coesivas HindIII e DralII, foi sintetizado quimicamente e utilizado para ligação ao fragmento de restrição DralII-Xhol, que codifica o resto do cDNA da endostatina canina. 0 duplex utilizado está apresentado abaixo:

HindIII 5’ ACCTT CAC ACC CAC CAG GAC TTC CaG CCG GTG CTG CAC CTG (ID SEQ HO : 36) A GTG TGG GTG GTC CTG A AG GTC GGC CAC GAC GTG-5’ (ID SEQ HO: 38)

DralII 36 0 primeiro CAC do duplex codifica o residuo histidina N-terminal da endostatina canina. Assim, foi possivel ligar o fragmento HindIII-Xhol que codifica a endostatina canina completa ao vector pdCs-caFc digerido com HindIII-Xhol (ver Exemplo 7) para expressão. Clones NS/0 estáveis que expressam caFc-caEndo foram seleccionados e avaliados por ELISA anti-caFc, como descrito nos Exemplos 2 e 3. 0 produto proteico foi analisado por SDS-PAGE e confirmado por análise de coloração "Western".

Exemplo 7. Expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-Kl interno de muAngio A molécula híbrida muFc-muEndo-Kl interno compreende muFc-muEndo ligadas, por um agente de ligação polipeptídico que contém resíduos glicina e serina, ao laço interno do primeiro "Kringle" da angiostatina murina. A construção de DNA foi montada do modo seguinte. Há um sítio BspHI na extremidade 3' do cDNA da endostatina murina. Para introduzir um agente de ligação flexível de resíduos glicina e serina no terminal C da endostatina murina, um fragmento HindIII-BspHI de 540 pares de bases que codifica a endostatina foi ligado a um duplex oligonucleotídico sobreposto formado pelos oligonucleótidos divulgados na ID SEQ NO: 46 e ID SEQ NO: 48. O agente de ligação de aminoácidos codificado pela ID SEQ NO: 46 é divulgado na ID SEQ NO: 47. O fragmento HindIII-BamHI que codifica a endostatina murina e o agente de ligação Gly-Ser foram subclonados num vector de clonagem padrão. Em seguida, o sítio BamHI foi utilizado para introduzir o fragmento BamHI-Xhol que codifica o Kl interno do Exemplo 11. O fragmento HindIII-Xhol resultante, que codifica muEndo-agente de ligação GlySer-Kl interno, foi ligado ao vector pdCs-muFc (D4K) para 37 expressão. Obtiveram-se níveis elevados de expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-Kl interno em expressão transitória e estável, analisadas por ELISA anti-muFc e SDS-PAGE.

Exemplo 8. Expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-Kl de muAngio A molécula híbrida muFc-muEndo-Kl compreende muFc-muEndo ligadas, por um agente de ligação polipeptídico que contém resíduos glicina e serina, ao primeiro "Kringle" da angiostatina murina. A construção de DNA foi montada do modo seguinte. A extremidade BamHI do fragmento HindIII-BamHI que codifica muEndo-agente de ligação GlySer (Exemplo 12) foi ligada ao fragmento HindIII-Xhol que codifica o "Kringle" 1 da angiostatina murina (Exemplo 10) via o adaptador seguinte:

BamHI 5’QATCCTCAGGCC <ID SEQ H0: 49) GAGTCCGGTCGA (ID SEQ HO: 50)

Hindin O adaptador tem uma extremidade coesiva HindlII' que, por ligação, não regenera o sítio HindlII. Assim, o fragmento HindIII-Xhol resultante, que codifica muEndo-agente de ligação GlySer-"Kringle" 1, foi ligado ao vector pdCs-muFc(D4K) para expressão. Obtiveram-se níveis elevados de expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-Kl em expressão transitória e estável, analisadas por ELISA anti-muFc e SDS-PAGE. 38

Exemplo 9. Expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-muAnqio A molécula híbrida muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-muAngio compreende muFc-muEndo ligada, por um agente de ligação polipeptídico que contém resíduos glicina e serina, à angiostatina murina. A construção de DNA foi montada essencialmente do modo seguinte. A extremidade BamHI do fragmento HindIII-BamHI que codifica muEndo-agente de ligação GlySer (Exemplo 12) foi ligada ao fragmento HindIII-Xhol que codifica a angiostatina murina via o adaptador descrito no Exemplo 13. 0 fragmento HindIII-Xhol resultante, que codifica muEndo-agente de ligação GlySer-muAngio, foi ligado ao vector pdCs-muFc(D4K) para expressão. Obtiveram-se níveis elevados de expressão de muFc-muEndo-agente de ligação GlySer-muAngio em expressão transitória e estável, analisadas por ELISA anti-muFc e SDS-PAGE.

Exemplo 10. Expressão de huAngio-huFc-huEndo A molécula híbrida huAngio-huFc-huEndo compreende angiostatina humana ligada, por uma ligação peptídica, a huFc-huEndo. A construção de DNA foi montada do modo seguinte. Um fragmento HindIII-Xhol, que codifica a angiostatina humana sem um codão de TERMINAÇÃO, foi primeiramente gerado por PCR, de modo que o codão para o último resíduo de aminoácido da angiostatina foi imediatamente seguido de CTCGAG do sitio Xhol. O HindIII na extremidade 5' foi ligado a um fragmento Xbal-AflII do péptido de sinal da cadeia leve (Lo et al., Protein Engineering (1998) 1_1: 495) via um adaptador AflII-HindlII': 39

Aflll 5' ΤΓΑ AGC OGC C (ID SEQ MO: 51) CGCGGOTCGA (ID SEQ HO: 52) HíndíII’ A extremidade coesiva HindlII' do adaptador, por ligação, não regenera um sitio HindlII. Na extremidade 3', o sitio Xhol foi ligado ao sitio Aflll do fragmento AflII-Xhol que codifica huFc-hu-Endo via o seguinte adaptador Xhol'-Aflll: ΧϊιοΓ 5’TC GAC ICC GGC (ID SEQ HO: 53) G AGC CCG AATT (ID SEQ HO: 54)

Aflll A extremidade coesiva Xhol do adaptador, por ligação, nãi regenera um sitio Xhol. O fragmento Xbal-Xhol resultante, que codifica péptido de sinal-angiostatina humana-huFc-endostatina humana, foi clonado no vector pdCs para expressão. Obtiveram-se niveis elevados de expressão em expressão transitória e estável, analisadas por ELISA anti-muFc e SDS-PAGE.

Exemplo 11. Farmacocinética

Num conjunto de estudos farmacocinéticos, ratinhos C57/BL6 com tumores pulmonares de Lewis implantados a 100-200 mm3 foram injectados na veia da cauda com 720 pg de huFc-huAngio por ratinho. A dimensão dos tumores e a dosagem utilizada de huFc-huAngio neste estudo foram escolhidos de modo a simular o protocolo de tratamento real descrito por 0'Reilly (0'Reilly et al. (1996) Nature Medicine 2: 689). Recolheu-se sangue por hemorragia retro-orbital às 1/2, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas pós-inj ecção. As amostras de sangue foram analisadas por ELISA anti-huFc, seguida de coloração "Western". Verificou-se que huFc- 40 huAngio tem um tempo de semivida na circulação de cerca de 32 horas no ratinho, e a análise "Western" revelou que mais de 90% da hu-Fc-huAngio permaneceu na circulação na forma de uma molécula intacta.

Também se repetiram os estudos farmacocinéticos em ratinhos Suiços com tumores a uma dosagem de 200 pg/ratinho. Neste caso verificou-se que huFc-huAngio tem um tempo de semivida na circulação de cerca de 33 horas.

Equivalentes A invenção pode ser implementada noutras formas especificas sem sair do seu espirito ou caracteristicas essenciais. Em consequência, as formas de realização anteriores devem ser consideradas ilustrativas, em todos os aspectos, e não limitadoras da invenção aqui descrita. Assim, o âmbito da invenção é indicado pelas reivindicações adjuntas e não pela descrição anterior e, consequentemente, pretende-se que todas as alterações no âmbito do significado e gama de equivalência das reivindicações estejam aqui abrangidas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Lo, Kin-Ming

Li, Yue

Gillies, Stephen D. <120> Expressão e Exportação de Inibidores da

Angiogénese na Forma de Imunofusinas

<130> LEX-006PC <140> <141> 41 <15Ο> US 60/097,883 <151> 1998-08-25 <16 0 > 54 <170> Patentln Versão 2.0 <210 > 1 <211> 696

<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(696) <223> Fragmento Fc da imunoglobulina gama humana <4 0 0> 1 asa test tet aaa set c&e «eâ egè CCS. ceg :cc CCS gCí3 48 ísXm Sssr Ser ÃSp !.ys Tíií sis TSsr Cys Iro Cys sVõ Ãl« 1 5 .10 15 CCt etc CSçt 39« CCg fcc.a gtc íte esc tte ccc eca aaa Ci?C 90 Prss Glti Us» C..I >· si.y 9ίΰ Sãr Vai KSg teu Obe Oiftj bs* Lys .30 2S 30 asg soe etc ísig ate t*e «99 acc eet gss gtc aca t ·:«. VUs gtg 14 4 asp tjsjt i.a:.: ÍIs s$í Atg Ths: Prc Slii Vai ths.· 0 yft Vsl Vai 3S <0 45 gtq Çãõ. èet gag gte iteg tte AÃ* tgg tas gtg 193 V&1 Vai Saí Ais êitó k:-;xy Prw Giu Vai L’/a íSi© ASifi '?ivp Vyr Vál SO SS 60 gsc m*· 9*9 cat saí. çec aag aca asg oçç «90 9'«0 *PÕ Cãg 240 Giy Vai Vai HXs Asíi Ma Lyst Titr Ly.s Ρτΰ srg (Uy< Gh> ei» 06 30 ?:5 09 tse &?3C age 3.C!££' tsc egs «tg gte a.·;;:;. «ΐΰ ete Sòc gtc etg cse gag 39S íys A&íi Set Thr tys: Arg Vai vwl >:-s.r Vai :L©« Thr Vai Leu His Sln as 90 S5 gssc <st$ 99« sag w tae ssg tqc aag gtç tcc e.as SÃS gee 336 ASp Scp :.<?u ftsii dy i-.va eia Tyr Uva CVS i.ys Vai Sesr Rsis ÒVÃ Ais im 1.05 110 Ctc cea Ocç eee .ate 9*3 a.as set ate tce sas sas ggo ca g ECC 354 42

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<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(549) <223> endostatina <4 0 0> 3 cac sçc cac <5§<s gae tte e-ssg èi-g gtg cfcc es* é tg g t. et.» ssc 4.S sis Ssr Lis &¥.q &sfi Ffc® Gin Pxcj Vai Lev Sás Lee Vai Ala i<ea ASti 1 5 10 15 ®íjc ac.··: ®t§ te® 30« 30« atg cgg 00« etc ege ggç cec ?*« táe 95 Ser Fre Lee Ser Siy Siy Srg Si y o« A*'f íòiy Ala âsj> Pisa Òáís FF 25 3» t«gre ttc e«§ eag geg cgg goc 773 G3S ctg çeg gge aee v. te eg:G: gee 14 4 Õps Fbe iUfi Glft Ala Ar-g Ala Vfsl Gly Leu Ala ái·,· Tht fhe Ârg Âla 35 40 45 tt-c ctg tsc teg ege: eag çac elg t.*er age ate gtg CÇie e®?: gee 132 Fhss L<sa Ser S«¥ Arg Lee Gin Ssp I.e« Tyr Ses ii® Vai Arg hx-9 Al a 50 55 &0 srys gc® gee gt«r eec ate Si··" ase etc eag «"K· çeg etg et§ ttt 34 0 hi:() Alá Ala Pí» :í U< v«l <\art Leu Ly;j Asy Oív 3®v i>©e Fhe «5 70 75 80 ccc age tgg S*0 «ct «•«j ttc tça gg® fcat gag ggt ceg ctg asg (ter 28 S Fr» Ser íU« Ala Lev PO® Ser C-iy S®r Gie Gly Fró Lea Lys Pro es 50· 53

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ISO 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" directo para Fc-Endo humana <22 0> <221> CDS <222> (3) . . (29) <4 0 0> 5

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Descrição da Sequência Artificial: directo para Fc-endo humana 46 <22 0> <221> CDS <222> (2)..(25) <4 0 0> 7 ύ àay ctt C8ÍC câc egc gâc ttc c 2$

Lys H.is $ 3 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 8 Lys> ít.is í ' 1 ytt.t Ris Arç Ã*;p D <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" reverso para Fc-Endo humana <4 0 0> 9 sctcgsgatís e-s gíííscg gg <210> 10 <211> 1089 <212> DNA <213> <22 0> Homo sapiens 47

<221> CDS <222> (D . . (1089) <223> angiostatina <400> 10 àãe 9t<3 tat ete tca 9«9 S9C **9 *et 999 eat: 99* aag aac t-.se aga m 1 V*1 Tyr &eu S*r 5 ai« Cys í-ys Tfc* 91y 1.0 Ase Síy JiJfS A«ÍS Tyx iS Arg 999 aeg «tg t cc. ««« «CS «as «St ggc ate acc tgt caa asa *99 eot. »s Sly Th* mt sísí 2(5 m Ttxt: &S'* A8XÍ Qly 2S 11» Tísr. Çys Gle í-.ye 39 ttp Set tce áct tct ÍSC« esc sg« cct *9« tt*: te® tièt gfit eea cac ccc tea ií<S Ser Tttox Ses £*» 35 His 3Ví?g £Ts> A*9 yfee 40 ser fjrs? Aí a 'i'èr íâ ifia ?s» Ser 9« 3 99« cfcg gast 9*9 ssc tac tg= a-99 sas c*a q«e a«e gat ccç eag tsa Clv Le* Slvs 50 91 e Ãâ.rs 9yr SS Cys Arg Ase P*o Àsp 6S A»n ASp P-.ro G.Í.» 995 esc tgg tçe tât act set 9»t ©ca gaa Sãg ags tat gac: tat tge 230 Sly ss Pr* TtP Cya Tys Thr 10 Th.* Ásp ?s& elo Lva í.3 Arg Ty* Aap Tyr CVS *0 att '···· 9&9 *9>- «tas 9«9 gaa tgt atg cet i'9t *9S· 99« g«s «se as» Asp Π* L<su SXa Cys S5 SA« au> 61a Cys Mst 90 «is Cya Ser «ly Si* 9S S«R tat ati. tcç sag «ee s.tg tct 593 ctg 93a t?c esg gee 33« fyr Gly Lys n* Ser tys li'.;:· «et Set Siy Í.»(J Cys Slft Ãla 48 3-08 ;u.:$ 5Hi

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<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" directo para Fc-Angio humana <22 0>

<221> CDS <222> (3)..(29) <4 0 0> 12 «s K«g ggt ass gtg tat etc tc® gag 29 íU y L-y-y Lys V'ái Tyr Leia Ser v<; 1 5 <210> 13 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 13

Fro Sly Lys .Lyg vai ?γε &>m S®s· Glw X * <210> 14 <211> 28

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" directo para Fc-Angio humana <22 0> 51 <221> CDS <222> (2) . . (28) <4 0 0> 14 ctt gt-g; tvt ctc gag 28 cs Lycs líssu Lys Vai Tvs Ui$y Qlu

Jt 5' <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 15 Fí.'* ry:-: MSU rys vr&J Çyt Iieu Ser OXxí <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" reverso para Fc-Angio humana <4 0 0> 16 βΟ£€Χβ9»§« fcaesjcttíitij tfccct-gsgca <210> 17 <211> 552 <212> DNA <213> Mus musculus <22 0> <221>

CDS 52 <222> (1)..(552) <223> endostatina <4 0 0> 17 eafc aci. CSt. eag SâC tt® cag cca gíg CSC CSC ctg gfcg g&a seg 48 ais ihx; ais Gin As» Pke Gin Pró Vai LAta Sis Lee Vai Ala Aan J 5 10 15 Í3CC etg tct 99« 99« afcg *9« 99*· egí W» ««« çat tte C-SQ M Thr PiO ;.*y §** Giv filv Ksfi Arg Gly a« Aíf« Gly M» Eh» 20 25: 30. tgé ttcc cãg £&A φΧ£ cga gee 9t<3 999 «*g *«9 99* aec tse cg§ get UA Cv» E:he Sln Gin Ala Arg Ala Vai Gly Í.6SA Sat Gly Tfcs Fha Ar9 &X& 35 49 45 tv<2 cí.g tc?í «fc m® '"IO 589 etc tàt age ate gto ege egt 9*t \$2 Wh» Sei' Ser hsq Lsu Asp Leu Tyr Ssr Xia vai Asrg Ary Ala £0 55 sa qsc ggs tcfc gsg ccc ate gtc aac etq S:a$ gsc 9*9 9S9 cts 240 Ssp A#g Giy .S-gx vai Ets as vai Asm hm Lys Ã&p Glv Vai Íí»SS Ser «5 ?s 75 80 *9« tgg t; cv; etg t&t fcct 99« t£C tag ggt caa 9t9 GÁ& cc-c ífci S>sr Tx"CJ Asja Ser t«a Eha Set Siy* Ser S's ts Sly Glts Vai Gin Aro 85 59 95 999 ccs ίΧΪ£3 ate ttt. tçfc fcfct 9«c 99« sqís 9»fc gt··.·. eto *9» C&C CC& 230 Gly Ala Arg Ile PAe S«r i-h<? Asp Siy Arg Asp Vai Χ,-sv Afcfc Ois A.Í.-Í IÕD iás UO qcç «99 ««9 cag aag ^9C gt« «99 cac 99« teg Çj&ç* crc agt 9S9 egg 3S4 Ma 'Trp CA·!’, ty® Ser vai. Ms Gly 08# ASf» Etíj Ser Giy Ar§ :us 120 3.S1 sgg ccg *t§ â.g® fcee UJV. g»g a-r.-a tos «g-a ãÇfc. 9«s açfc SCfc 999 432 Arg L«Sí mt Gin Sé»*· n? Cys 61« iíir Trp Arg Thr Giu Tííí; Gly iâO $35 140 9« scs 99« 9cr· tse tec «9 ctg tea 99* sgg crc Cl 9 saa câs? 420 Ala %r £51 y SIts &la Ser Ser iec Leii Sesr óiy Asg Lati Leu Gin Gin 145 ISO 155 100 get: age f.ge CSC â&c age fcáe ate gts étç tgc atfc «at 528 i-ys Áia Ais S«r Cys HiS Ser Tys.· IlSÍ Vai Leu Cys Ii« Giu Aar;. tm 170 i?s fcte **9 ÍK-C tcfc t;fcc t:cc 552 Ser 'ΐ&χ Ser Haa Ser lyss <210 > <211> <212> <213> 18 184

PRT

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<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" directo para Fc-Endo de ratinho <220>

<221> CDS <222> (2)..(28) 56 56 <4 0 0> 21 O CCS 8(S« Psrõ ÍjVSí I ett e*t íset ««' ».is f&3? «is Oà 5 $ tRt € » AS$í iPh» <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 22 P.£'s> Ly^t :í,-í 1 sy. Mis Kís <5iR <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" reverso para Fc-Endo de ratinho <4 0 0> 23 <210> 24 <211> 1086

<212> DNA <213> Mus musculus <22 0>

<221> CDS <222> (1) .. (1086) <223>

Angiostatina 57 <400> 24 tas ««$ tesa <5&& tge »*9 SCSI SS<5 afcc ss® esc 6§s fc.ac m» osa «0 «si Ty* 5-«« Sér Siu €ys Lys Sfctf Giy 11* Sly As· 5 Giy ?yr Arg Giy 1 S 10 15 acc atg tce *9« aes 00« gee «ÇÇ. a a? sgg mt §«c Oí ISu:· fiei Ser Ar:«j Vísr iy* S*f O.ly Vai Ala Çy» Gin Oys Vip f»y Ála 26 25 30 ac-1 tte C«ft Ca* 0»·* eeft >ia<; Cscs teí *&e »0« aca «as C'l”K, saí 0*0 144 fhjf ί%* Pr* eis VrSl Pr* A&a Tyr S>?r Pro Ser Thr Sis Pr* As» Si* 3S 00 <55 Qíia et» gaa S»S ASC t»«r aOS s«c GC» goo aat sat *aa Cia SOS 192 àiy Lfiu Siu SI ií ÃSSl ?yr Cyr Ãa« Oro Asp &s* Aap Slu ei» siy 50 Sb 60 CC.i i«N3 !§« ta s; set acs >3»í cc§ sjas «*S ag« tssi gee vac «9* £40 Ps:<3 Trp Cys Tyr TOr: Thr Aííp Pr o Âsp I.ys &sg Tyx A«p iyr õya As* 65 76 05 00 àtt cCt tjaa w S«s> s»s SS* t«c ats ise toe agt SÕ» §aa aag tat 2m Ilé Pfô tllu Cys Slw Slis dlu Cys mt Tyr Cys Ser Sly SlLS Lys ?yr Sb 90 Sb «8« »** 3Í* fccs **« ae» atg tct 90* «li: g»«. rge «a 9 gee tgg ôM Glw 01 y l'VS 11* Se* uys Thf Pet sít Siy te» A*p Cys Glss Ma Orp 100 ios U(> gst tet «sef &m c«s est get i*t ca»: st* cct ge« SOI t.ti «ea M4 MjS Gin S«r Ρϊώ RiS Ãln His Giy Tyr 11« Pra Ala i.ys Pba Pr* U5 120 125 ââfc aas ctg *»S &«t tas «SV CSC ase ect ««« SOS SàS pfta 4.32 Ser As» A*ts íteC Ma ty* Cys Ris Ask Pro Sly Sla í‘rc 130 13S 140 ££C t$g t^c ctc a«a aca çsç ees «ee saa ege sgg gaa CSC rgr 400

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<210> 25 <211> 362 <212> PRT <213>

Mus musculus <400> 25 59 VM tyr i,eu 5 S«x Si. a Cys 5 Lys Th» fêet $®r Ârg Tbr 2S Sei Xhi· Pb* í'ro 3S Sis Vai ASS 61 y i<e« so SIvs 6:1«. Asa Tyr £y* 55 Pr& Trp Ôv«s 0$ •ryc í"hr TH» Asip 7 CS Ii« Ate 61 is CyS SiUs SS Qlu Gia S4* Gly Z,y» Ik 1.06 S«s l«y» fhr Asp 8«s iiin US S«E fíi s Aià Séí 3ty» i30 &Sxs lea Lys a»t Ãsv> iSS Α*·« Ψτο tsp Cvs MS P3MS ?í'i;· 556 «se &s;S: lie Pr® Ai'Oi CVS xh Tnr Shr òis· Gyss bm im Gly Ãrç Siy Thr Vai. 8·** Siy lys 193 $h» Cy* k?q ais 210 as« a.tg Thr 9ra «ia 215 Asn Tyr 225 Cys Asa Pm Asp S36 Thr Asp Set «irs Asa 34$ ΐχρ Ser Sc r Ma Ser isa ΪΤ» &Sp SÍ.E5 Si« ÍAf ?»e 235 VaJ Vai Qift eia Ά*9 6Xy TH* 280 Sés Ser Thr TH» 335 Ala Atei 305 Èfet gfcs Pra Sis 3 IS Ã»S Asp Ma 65 V líStt Cia .325 Mst Asp Siy Ptft Ttp CfS MÇ Tyt TH» Tfer Aá« Lçip Lys Ax'« «ys 355 Se» «ia <210> 26 <211> 31

6Sy lie Gly Ã*s Siy Ty* feg Gly 50 iS

Vai Ala CVS CiA hy* itp 61 y Me 85 30 §e» í'ro sat Vhr «4» Pt® liSTS Oia 4S Asa y»» Asp Asa Asp Ç.lií Cits 61V m Asp 5<y$ Ar§ 7’/? Asp tys: Cys &Sfi 35 80 Msst fy» Cya Ser C-lv 6.1« Ty.v sà 85 Se» Gly Lea Ssp Cys 61« Âle Trp 165 no siy Tys Tie PE® Ala Lys ?he »ro 525 fíys- 8 is &ΒΏ Pro Ãsp •Via Gls.1 Pfp 14 S £»© Tht l»ys Ttp Cio. Tyr Cys 155 16Ô Sre Pro ί'ϊ Ptq Set Vire TA:í: "Vt .170 115 Asa Tyt &εΐϊ Siy Tii» vai S®» 185 ISO A»t ftp Set Cia Gl A Th* Pra ala. 205 PHé cy* iy.s A.-i* LíAÍ- 6ia 61« 230 Cia TiiS A1& Pr* Trp Cys T iff TPr 235 £40 Ty» CVS 65 a 11« Pt* Ser cy* Glá 250 255 Ãsp Se» Set Vsi Pro Pro 61a 61U 265 230 Tyt « ia §*» Asp 71.y Sla Aer Tyr 285 THr «iy iys iys Cy» «ia Sé» Trp 300 Se* 1-Vís Tht Pr« Cia A8ÍB Phã Aso 355 320 cy* Ato Asa Pfã Asp Giy ASp Lys 330 33 S Sr» Sat Vèi Arv Vrp Cia Ty» Cys 34.5 350 61y sijf

DNA <212> 60 60 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: directo para Fc-Angio de ratinho <22 0> <221> CDS <222> (2) . . (49) <4 0 0> 26 C -CCÇ CÇ. t gtg tafc t«a gaa t-gç asg 31 Si'.:'.· l.y:í u Vai Tyr <s»x SI a Çy.s 1 6 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 27 Src- Lys lew Vai Ty.¥ las» S«íf Slii Cys L-ys "Primer" $ is <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> "Primer" <223> Descrição da Sequência Artificial: reverso para Fc-Angio de ratinho <4 0 0> 28 61 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" directo para Fc canina <22 0> <221> CDS <222> (3) . . (29) <4 0 0> 29 cs tis 8 aaS *§8 íígè »§« s:s

Lew OJa As-n Çly fixg V«J ?*\> * <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 30 3<si' <5| a í i tS» íUy Axçs Vãl Ãrg !> <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" reverso para Fc canina 62 <4 Ο 0> 31 t^tacccggg gaatgggaga gggatttctg 4-0 <210> 32 <211> 702

<212> DNA <213> Canis familiaris <22 0>

<221> CDS <222> (1) . . (702) <223> Fc <4 0 0> 32 »5* gtt cce CCS cefc get t-gs ccc asa tgc CCS §;ec Si a 1 Asn Sly Ayg V«.i 5 PíO Fie PfÇí &&p CVS 1« ?V« õyS Cya Prg IS Ria c*;: gss Stg Ctg g>ga ggg êct tcg gfcc ttc 8tC ttt ccc ceg see Pro eJLkS ««1 Sly se Qiy Sc.i· Vai 2$ ile S5h® ί'ΐ'ο FíC 39 £-ys Fco aâg gsc isç-q etc ttÇ JStt §'«<? ««» »8* «et g-íiÇi $£* sw égí ytg gtg 63 63 Aya Asp Thr L©k5 itsu lia Ala Axg 'ΪΪ7Χ. ?rs Í5.1» Vai 'Tfi.l- Cys ¥.3,1 Va.l 3S 40 46 St-3 §S5 etg $fJ5 <*a <y«e cet «3« fiag stc sg* tsç tt.c gtg 192 Vai ASP iíSXÍ 01 y íro Âãf Pt* Glo vai Glà lie ssc t*p Fhs Val 50 SS m gsc Sf*· asg cag atg ca a aes gcc aag set «»« er.r. c<.yi' çag OS'3 cag 290 Asp 6iy Lys «Sr» Wít S I A TÇf Âia iy»? The (Sift Fec Arg Glii Siu È1.K 65 70 75 m *«© aat: «K5* SCC t»c cgt gtg giís *Sfc gts ctc cee *t« «s« eae ••17 ÍSS 3?iv» Arssl Oly Thr 5’yr Arg Vai vai Ser vai 0-3ÍS Sss 11» ?51v his Gl.c S5 30 S5 tgs çtç ggg aa« C3« ctc ae« Í4à* qtc 8¾¾ ase asa gc« 336 Asp ίϊ,ρ &*ut i$& ai.y «$r» &ln Pha Ths. Cys 14'« Vsl Asrs fers lys Ala 100 iès 11» •srte teo «cg stc gag *m ac« ate r.ce asg gee agcí ggg esg gee S84 Aoc Pre S«ss P.S* lie Slu Axç Thr ÚC Sés· *v* Ala. Aeg Siy OiK Ãia US . IX δ 12§ C-íit çag cçe açt. gr.<s tst: gte ct« cè§ CCA icc e«« 0*0 «ag teg age 932 Síis Sia Prõ Sfír V«1 Tys Vai Lcá pse 1¾¾ Os*· Ãrss 0.1« 01« lAf« S«r 130 135 l^Õ «MS« «ca «*«s a®= 4t5 acíA ««o ctg ate asa ga>5 ttc tto C!2S çat. 4 se vys Ass fhx Vai S*r J*»* TAt' Cys Lsa 11« i<ys Asp Píif; SAe Pew Fro US IS» «S iio «ac affc gac. a*« «a« *«« csaq aqe aài 00® «ag esg gag cct 7«7 *g:c .ws Asp HC ASp vai Sici Trp <Sls s»r As» Oiy ΰΐπ (s.Ití si» Fro Gits S«K i€5 1?» 175 A«S tae ogs M;§ soo «cg ®ce ca « Çf Bi «»« gac ovo t«c tac tto 576 Lys fyr Arg ftf Τίιϊ ?"íS Pk« Siíí Sicsi ACJS «1c Asp 01V Sar 1’yr FhS: us» ISO iso CtÇ tac sg« aa® etc tct giy gsc age ege t«« «Ag eg« «gs gac 624 Leu ?>··'-· SAP i.y« &e« §** Vai Aiõp i<ys Ser Arg Trp Sls^i Aí?« Sly Asp 1SS soo 0«6 st© At» tgt 9©S S«t stf «At gsa gct «tá CSC «A« ^aes tac aça «72 Ths- FAS· JH Oves Ala Vai Hei Sis gic Âla lo«« Sis Ase &XS Tyr Tílt 210: 215 SSS aag- aas tcc C-t& ««« c>-it ccí C(S§ ggt asa 702 Gin **s 3«K LteU ser sis Ser PK8 Siy tys 32£ 230 <210> <211 > <212> <213> 33 234

PRT

Canis familiaris <4 Ο 0> 33

Oiu Ase SJy Arg Vaí pró &r« i^c· Pro Asp Cya Pí'0 fcys Cyss Pro Mí 64 1 5 10 1$ ?rc* Giíi Hat I.©» ôiy Ciy Pr» S«r Va.l las 5 iss Fria Pro lys Fr» ao 25 30 l»ys Aap ThT- te» te a He Ã1A A*V Th.t; Pvo GSsi Vai T3K cys Vai Vai 35 40 43 Vai Asp L>S'j Sly Fr© GI» Aa;p Pr© Gi» Vai nS.ri íi? Ser Vrp F&e Vai 50 55 «0 &sp Siy Lys Sl« «6t GÍS5 Tòr Ais Lys ihr G Vn. Fr* SI:» Gl» Gin S5 79 05 SO W» ÃSft <M y Tiir tys Ar§ Vtò Vai Ser vai Leu Pro He Gly ais Gin 85 00 35 I 1 .Lèa í-ys «í.y Uí* Gin Ffce TÍ43C Cy* vm vai Aso Arsn tys Ala 500 165 L10 &®ϊ! Pr© Seí Pi·» He ex« Arg ?Ar Us Ser Lys Ala Ar* «ly oin Ala 11S 530 525 His Gin Pre ser Vai Tyr Vai lea Pr© Pr* Ser Arg Gia «la Lea Ser: 5.30 135 148 S>yss Asn %r Vai Ser is» Th sr Cys iea Hé Lyás Asp Pha Fha vro Fr© 145 150 153 ISO Ά&ρ 11© Asp Vai Gin ?!'© Gin set A*n Sly Qin Sln Gie iro Gin mx 133 170 17 S Lys Tyr RrO Th.;~ Tísr Fr© Pr o Gin l«a Asp Gla Asjs Giy ser 'Pyr Phe Í80 105 100 te a t;yr Se r ;·>·« Uns Ser vai Asp Lys S«ir Ar-g Gin Ar* C-iy •P«P 505 300 205 'fhr Phe 11« Cy* Ai a Vai Het Bis Gin Ais teu 9is Asn ais Tyr «ir 2.1« 2t%

Gl» J*ys 8** Xe» 3*sr HIs S®r Sre Gly les 225 239 <210> 34 <211> 552

<212> DNA <213> Canis familiaris <220>

<221> CDS <222> (1)..(552) <223> Endostatina <400> 34 eac *ce «*< c*g $*c tts ea<3 ecç gfcg etg ca« «to otg çc* cty aac 46

aqc «cg sag CCQ SSC ggc atg sga 99« >sí:c cgg 95* gcg tcc çag 96 Ser Fr© Gin iro Giy eiy N«st Arg Qy n* Rrs «iy Aie Asp Fíié SiSÍ 2S 25 30 íerc tse C3® Câg geg ege 0«« <m ws etg gee ggs âec SÍC sgg 1<N Cys Sl.ã Cin AIS Astg Ais Ala My te* Ais wiy Thr s%* Árg Ais 35 45 tt:™ etg teg *«g «99 Cí9 c«g gae ete *ee *9« *K-c gt:g C3g© ç<gç 9«c isi Fhss Ley Ser Sesr ΛΚ9 ts» ei» Asp leu tyr Se* lie Vai Arg A*g Ais ss ss 60 gsc íí*Çj S5. scc ggg gtg ccc gt.o gtc aac cie agg •gae gag gsg etc ttc 24 δ MÇS TAí Gl.y Vai. Fr* Vsl Vai AS» xSii Are Asj> eie vai i.«« E^ô «.& 70 ?é S6 ccc a-3C tg9 gag gee «a ttc tssg gge SCC V*« 99« «®y ôtg aag 986 Pr© Ser ΐ?ρ· ;-Vl!-! Ais isa !P&e Ser Qly Se? Sic «iy GIí» Loa. Lys &JTÍS 65 ?» 95 W ««© cgs RtC í vi tsst tfec gee 99c *9* gst sis ccg «*9 CSC COj" 51* aif Ais Arg n® Ph* S®r shs Asp C*iy Ar§ A*P Vai Lee <11» Si* PfO ioe 185 113 gcc t>39 ccc cgg aag aqc stg tg§ ca« 99« tc·. :^iS£í CÇÍC sgs 959 ege 384 A.U Τ,ϊτρ St s Lys Ser Vai Vrp Bis eiy Ser Asp Sr© Ser ííly Sr5 US 120 1.25 ««« «g «ca g.sc «9« *»« Sf« W9 *®8 «gg s«g «*g gc® ccg gçg 43S Jiísw Thr Asy, Ser Tyr cys Silí ti.r Ttp Arg 'TSwr Sle Ala Src Ais UC m 14* gcQ açe 99¾ ©eg gcg s«3 etg «tg geg 99« *gg «tg et,g q»3 cag 460 Âla 19u Sly Gin Ala s«r Ser Lsw Leu ku oiy Aíg loa *1« Gi« 145 150 155 ISO 9*9' 9«c ««* «9« tg« «3« CSC 3'ce ttc <ftg «tc tg« átc gsg ase 596 ex« Me Ala se* Cys feg «is .Ais Ft»s Vsl v*i Lssc Cys iia fila Asn 1SS ne 175 *9« gte erg Sii-e í.Cti fcte tcc aeç 552 Ser: v.sl Sfet Tár Ser Pt: ® Ser Lys ISO <210> 35 <211> 184 <212> PRT <213> Canis familiaris <4 0 0> 35 51s Thr 1 Sis 3 I 1 1 Ϊ5>ν1 í 9 laíC 19 Sis Usa vai Ria Lee A&ss IS Sax .í-ro Çln Fr© Gly Ciy Met kxq Clv 2:0 ’ 25 Us Ar« Giy Rio Aap 30 Fh« SI» Cys FAs sm Ci!l Alo ftxg Alã Alã gly Loa Ala Giy ihr Sás Arq Ma 66 S*r A8f Gin Assp ln»« Tyr Sex lie Vai Rrg Ãrg Ala 5« 55 60 AiSp Arg Thr Giy Vai Vai Vai Aso 6«a Ata ASfJ Sis Vai I-eu Pas 6S τδ n SO Sasf Trf> Giv Ala L*si Pli* S«i Cly Ser Ua Giy Sis Lea isVS Ffó 3$ 36 7¾ Sis AíÇ Ue Fne FSe Asj> Oiy Arg ksç- vai ic«SV SI a His Ff» 105 16S na F.:. a Tfp ?*··«· Arçj Í4fs S*r Vai Trp Si i s Gly Sas *®p Fro ser Kly Aí:g 116 iia 12s Arsç x*®« Thrr asp Sár Tyr Cys Gl« Thr Trp Arg "írç ÇS-if AI$* F*s> A.lã 130 «6 140 Ala thr Siy 01« &1-ÍS Ser Sai US« U«H) A le 61 y ftrg Leu t«e GÀe Gi* 145 ISO ISS ISO 61a Ãia Ala ser Cys Arg Sis Ala ?fce vai Vai Lee C$?§ Glv> Aen 1SS 175 Í?S SCÍ Vai Ser Fhe Lys 136 <210> 36 <211> 41

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: agente de ligação HindIII/DralII: filamento superior <220>

<221> CDS <222> (3)..(41) <4 0 0> 36 ctt esc *ec esc cag tcc c«9 gtç ctg cac ctg 4i IAsU HÍ« *8wr ais Sln L·» 5¾¾ 63« *** V*1 lesa Sis Leu I 5 *6 <210> 37 <211> 13

<212> PRT

Sequência Artificial <213> 67 <4 0 0> 37 Ííêa S.is J 1 íl® Gisfi Âsp .5 SXú VãI Ley <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: agente de ligação HindiII/DralII: filamento inferior <4 0 0> 38 íjgctgçjâsgt «itggtgggs ctg* 34 <210> 39 <211> 1077 <212> DNA <213> Canis familiaris <22 0> <221> CDS <222> (1)..(1077) <223> angiostatina <4 0 0> 39 68

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<210> 41 <211> 12 <212> DNA 71 <213> Sequência Artificial <22 0>

agente de TERMINAÇÃO <223> Descrição da Sequência Artificial: ligação palindrómico em que o codão de TGA é seguido de um sitio Xhol <4 0 0> 41 iISSs 1? <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: mutagénico para angiostatina murina <22 0> <221> CDS <222> (D · · (21) <4 0 0> 42 ÇW ç«:fc 6: V ÍXO Típ Ser Tyr- Thr s; π <2 1 0> 43 <2 1 1> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 43 «iy SUo Txp Ty£ Thf.' ^hs: "Primer" 44 72 44 72 <210> <211 > <212> <213> <22 0> <223> <22 0> <221> <222> <4 Ο 0> <210 > <211> <212> <213> <4 Ο 0> 1 <210 > <211> <212> <213> 34

DNA

Sequência Artificial

Descrição da Sequência Artificial: "primer" utilizado para introduzir HindIII em angiostatina murina

CDS (9) . . (32) 44 : S8Ç5 ctt sgt scs cãt eôe aat tsãg çg 3$

Lys teu Ses: íhr Sis S»ro Asm Slts

l S 45 8

PRT

Sequência Artificial 45

&?£ Tbr Sj i í» g.ro ASrs SIu S 46 59

DNA

Sequência Artificial <22 0> 73 <223> Descrição da Sequência Artificial: agente de ligação BspHI/BamHI: filamento superior <22 0> <221> CDS <222> (2) .. (58) <4 0 0> 46 e stg aec tae TJ*r §sse 1 t.«« te© aaa s«g ag© gw ggc age ggg ggc gga gg« ·»?© 43 jv^S: Síts.í Gly G-ly Ses: âly GXy Gly G.ty S-ftíC $ 10 íi «gc ggg gg© g G.í,y "Sy Sly $0 <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <4 0 0> 47 Ths Ssx 8«x Lys S®x Sex Sly Gly Ssx eiy siy siy «ly s>

Siy siy «ly S 10 3d <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: agente de ligação BspHI/BamHI: filamento inferior <4 0 0> 48 g»te«g©a©« eg< eegctgee te©g©©eeeg ©tgccocogc tegattxgga g&a&gaggt S§ <210> 49 74 74 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência ligação BamHI/HindIII: fi <22 0> <221> CDS <222> (3) .. (11) <4 0 0> 49 ÍJv* tCC íSCC-cS ggc c O.ív <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência ligação BamHI/HindIII: fi <4 0 0> 50 <210> 51 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial

Artificial: agente lamento superior

Artificial: agente lamento inferior t? de de <22 0> 75 <223> Descrição da Sequência Artificial: agente ligação AflII/HindIII: filamento superior <22 0> <221> CDS <222> (D · · (9) <4 0 0> 51 tc* L&íí .:¾¾ r 6Xy 1 e ΐΰ <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: agente ligação Af111/HindIII: filamento inferior <4 0 0> 52 50 <210> 53 <211> 11 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: agente ligação Xhol/AflII: filamento superior <22 0> <221> CDS <222> (3) .. (11) 76 76 53 <4 Ο 0> tc

Asp §**· í. <210> 54 <211> 11

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223>

Descrição da Sequência Artificial: agente de ligação Xhol/AflII: filamento inferior <4 0 0> ttáâgeâcigíís g 54 :s.i

Lisboa, 25 de Junho de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão homodimérica com actividade inibidora da angiogénese compreendendo uma região Fc de imunoglobulina e uma proteína-alvo, em que a região Fc compreende uma região conectora, um domínio CH2 e um domínio CH3, e a proteína-alvo tem a actividade inibidora da angiogénese da endostatina e é um fragmento do colagénio XVIII, e está ligada às extremidades N-terminais ou às extremidades C-terminais da referida região Fc de imunoglobulina.

2. Proteína de fusão homodimérica da reivindicação 1, em que a proteína-alvo é endostatina ou respectivo fragmento bioactivo.

3. Proteína de fusão homodimérica de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína-alvo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 4.

4. Proteína de fusão homodimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a proteína-alvo está ligada à extremidade C-terminal da região Fc.

5. Proteína de fusão homodimérica de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, que também compreende uma segunda proteína-alvo que é um fragmento do plasminogénio ou um fragmento do colagénio XVIII e tem a actividade inibidora da angiogénese da angiostatina ou endostatina.

6. Proteína de fusão homodimérica da reivindicação 5, em que a referida segunda proteína-alvo é endostatina ou angiostatina ou respectivo fragmento bioactivo. 2 Proteina de fusão homodimérica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a referida segunda proteina-alvo está ligada, por um agente de ligação polipeptidico, à referida primeira proteina-alvo • Proteina de fusão homodimérica de acordo com a reivindicação 7, em que a referida primeira proteina-alvo está ligada às extremidades N-terminais da região Fc e a referida segunda proteina-alvo está ligada às extremidades C-terminais da região Fc.

9. Proteina de fusão homodimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, em que a referida primeira proteina-alvo é endostatina e a referida segunda proteina-alvo é angiostatina ou respectivo fragmento bioactivo.

10. Proteina de fusão homodimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a imunoglobulina é IgGl.

11. Molécula de DNA que codifica para uma sequência de sinal e uma proteina de fusão como especificada em qualquer uma das reivindicações 1-10.

12. Vector de expressão replicável para a transfecção de uma célula de mamifero compreendendo um DNA da reivindicação 11. Método para homodimérica reivindicações seguintes: a produção de uma proteina como especificada em qualquer 1-10, que compreende os 1-10, de fusão uma das passos 13. 3 (a) transfectar uma célula de mamífero com o vector da reivindicação 12, (b) cultivar a célula de mamífero para produzir a referida proteína de fusão e (c) isolar a referida proteína de fusão. Lisboa, 25 de Junho de 2010