DE60121317T2

DE60121317T2 - Materialen und verfahren mit bezug auf immunantworten gegen fusionsproteine

Info

Publication number: DE60121317T2
Application number: DE60121317T
Authority: DE
Inventors: HIT Group Jason Southampton RICE; Molecular Immunology Group Freda Southampton STEVENSON
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2000-04-17
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2021-04-18
Also published as: WO2001079510A1; DE60121317D1; JP4837219B2; ATE332380T1; US20030158136A1; ES2267812T3; EP1274853B1; PT1274853E; DK1274853T3; AU9336801A; GB0009470D0; US7816334B2; JP2003530856A; EP1274853A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Individuum. Insbesondere – aber nicht ausschließlich – betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Vakzinen, umfassend Fragment-C-(FRC-) Domänen als Adjuvans zur Bildung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) gegen Erkrankungspeptidantigene.
Hintergrund der Erfindung
Während azelluläre Vakzinen unweigerlich sicherer sind als auf ganzen Organismen basierende Vakzinen kann eine vollständig wirksame Vakzine normalerweise nicht aus einem einzelnen isolierten Bestandteil eines Mikroorganismus gebildet werden; es ist mittlerweile klar, dass der Grund darin besteht, dass man mehr als einen Zelltyp aktivieren muss, um eine Immunantwort einzuleiten. Eine Folge dieser Erkenntnis war die Entwicklung von Konjugatvakzinen.
Allerdings sind nicht einmal Konjugatvakzinen üblicherweise von sich aus stark immunogen. Die meisten von ihnen erfordern die Zugabe von Adjuvanzien: Substanzen, die die Immunogenität von Antigenen steigern. Man geht davon aus, dass die meisten – wenn nicht sogar alle – Adjuvanzien auf Antigen-präsentierende Zellen (APC) einwirken, wodurch die Bedeutung dieser Zellen zur Einleitung bzw. Induktion von Immunantworten unterstrichen wird. H.-influenzae-Polysaccharide z.B. wurden an Tetanustoxoid konjugiert, da Kleinkinder routinemäßig mit diesem Protein geimpft werden und ihre T-Zellen bereits daregen geprimt sind.
Tetanustoxin wurde bereits ausführlich untersucht. Siehe beispielsweise T.C. Umland et al., Nature Structural Biology, Bd. 4, Nr. 10 (1997). Das Toxin macht sich einen Transportmechanismus zunutze, um die Zufuhr zu seinem zytotoxischen Ziel innerhalb des Zentralnervensystems zu bewerkstelligen. Die Rezeptorbindungs-Untereinheit des Tetanustoxins spielt in diesem Zufuhrprozess eine dominierende Rolle. Diese Rezeptorbindungs-Untereinheit ist als H_c bekannt und besteht aus dem 50.000-Mr-Fragment aus dem C-terminalen Ende der Schwerkette des Tetanustoxins. Traditionell wurde das 50.000-Mr-Fragment als Fragment C (FrC) bezeichnet. Isoliertes FrC behält die Fähigkeit bei, in ähnlicher Weise wie das intakte Tetanustoxin zum ZNS transportiert zu werden.
Tetanustoxoid wird als Trägerprotein zur Induktion von Immunantworten gegen Peptide eingesetzt [Herrington et al., J. Immunol. 149, 717 (1992)]. Es gibt ein umfangreiches Datenmaterial über die Immunantworten gegen Tetanustoxoid und die durch Human-CD4⁺-T-Zellen erkannten Epitope [Valmori et al., J. Immunol. 139, 717 (1992)] sowie über die an der Steigerung der Immunität der zugesetzten Peptide beteiligten Mechanismen [Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19, 2237 (1989); Kumar, J. Immunol. 148, 1499 (1992)]. Es stellte sich heraus, dass das Fragment C (FrC), der 50-kD-carboxyterminale Abschnitt der Schwerkette des Tetanustoxins, protektive Immunität gegen Tetanustoxin induziert, wobei diese größtenteils Antikörper-mediiert ist [Anderson et al., Infect. and Immun. 64, 3168 (1996)]. WO 99/15671 beschreibt die Impfung gegen Hepatitis B mittels eines Fragment C umfassenden Fusionsproteins oder Fragmenten davon, das/die mit der Prä-S2-Region des Virus verbunden ist/sind.
Frühere Arbeiten (C.A. King et al., Nature Medicine 4, 1281 (1998)), die gemeinsam mit einem Miterfinder der vorliegenden Erfindung verfasst wurden, beschreiben die Verwendung und die Produktion von Nucleinsäurekonstrukten zur Induktion einer Immunantwort in einem Säugetier auf ein Erkrankungsantigen, das sich auf einer malignen B-Zelle im Säugetier befindet. Das DNA-Konstrukt steuert die Expression eines Fusionsproteins, das das Tumorantigen und das Tetanustoxin-FrC umfasst. Somit konnte bereits aufgezeigt werden, dass eine Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen durch die Gegenwart von FrC selbst gesteigert werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die T-Zellen-Helfersequenz p30 von Fragment C aus Tetanustoxin besitzt die Fähigkeit, CD4⁺-T-Zellen zu aktivieren, und wurde in Konstrukten eingesetzt, um die Induk tion einer Immunantwort gegen ein Antigen zu unterstützen. Es stellte sich allerdings heraus, dass auf der DNA-Ebene, z.B. der Ebene von DNA-Vakzinen, die isolierte Helfersequenz nicht so wirkungsvoll ist wie erhofft. Der Grund dafür liegt möglicherweise darin, dass die isolierte Helfersequenz nicht ausreicht, um das Immunsystem zu primen oder auch nur von ihm erkannt zu werden. Somit erkannten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass eine wirkungsvolle DNA-Vakzine nicht nur die Helfersequenz, sondern auch eine Sequenz, die zum Primen des Immunsystems fähig ist, umfassen muss. Wie bereits erwähnt, wurden bereits wirksame DNA-Vakzinen mit Tumorantigenen, die an das komplette Fragment C gebunden sind, bereitgestellt. Allerdings stellten die Erfinder nunmehr überraschenderweise fest, dass die Induktion einer Immunantwort gegen ein Erkrankungspeptidantigen durch Verwendung einer bestimmten Komponente des Fragments C – und nicht des gesamten Fragments – verbessert und vereinfacht werden kann.
Die Erfinder konstruierten eine Nucleinsäuresequenz, die für die erste (N-terminate) Domäne von FrC kodiert und Helfersequenzen) wie z.B. p30 enthält, und verknüpften sie mit einer Peptid-kodierenden Sequenz, die die Fähigkeit der Induktion zytotoxischer T-Zellen- (CTL-) Antworten aufweist. Als die Erfinder den Vektor in Mäuse injizierten, beobachteten sie eine sehr rasche Induktion von CTL. Diese Induktion war deutlich schneller, als wenn das Peptid aus seiner natürlichen Umgebungssequenz verarbeitet worden wäre. Die Erfinder verglichen (i) eine DNA-Vakzine mit FrC voller Länge (2 Domänen), gebunden an ein endogenes Tumorantigen, mit (ii) dem Ein-Domänen-FrC-Format, das an ein spezifisches CTL-Epitop aus dem Tumorantigen gebunden ist. Die letztere Vakzine (ii) induzierte höhere CTL-Werte. Diese Werte blieben selbst am Tag 55 nach der Impfung höher als die der 2-Domänen-Vakzine.
Somit ermittelten die Erfinder erstmals eine Konstruktion einer Vakzine, die alle Bestandteile zur Induktion von Immunität enthält, d.h. Helfersequenz und eine aktivierende Sequenz innerhalb der ersten Domäne von FrC, die den Primingprozess einleitet. Die zweite Domäne von Fragment C umfasst eine Anzahl zytotoxischer T-Zellenmotive, und die Erfinder gehen davon aus, dass diese Motive durchaus mit den im Erkrankungsantigen im Fusionsprotein vorhandenen Motiven konkurrieren kön nen. Bei Abwesenheit dieser Motive besitzt die DNA-Vakzine erhöhte Wirksamkeit beim Induzieren von Immunität.
Allgemein formuliert beruht die vorliegende Erfindung demnach auf dem Gedanken, Nucleinsäure zu verwenden, die für die erste Domäne von FrC kodiert, der aber Nucleinsäuresequenz(en) fehlen, die für ein oder mehrere T-Zellenepitope der zweiten Domäne von FrC in einem Nucleinsäurekonstrukt kodiert bzw. kodieren, das für ein auch ein Erkrankungsantigen umfassendes Fusionspolypetpid kodiert. Das Fehlen der zweiten Domäne verbessert die Fähigkeit des Fusionspolypeptids, eine T-Zellenantwort gegen das Erkrankungsantigen zu induzieren. Der Nucleinsäure muss jedoch nicht notwendigerweise eine Sequenz fehlen, die für die gesamte zweite Domäne kodiert. Beispielsweise ist es möglich, dass ein bestimmter Abschnitt der zweiten Domäne vorhanden ist, ohne dadurch die Fähigkeit des Fusionspolypeptids zu beeinträchtigen, eine T-Zellenantwort zu induzieren. Vorzugsweise fehlt zumindest die Nucleinsäure, die für Peptid 1 und/oder Peptid 2 (hierin definiert) kodiert. Da andere T-Zellenepitope in der natürlich vorkommenden zweiten Domäne vorhanden sein können, ist es noch bevorzugter, dass die Nucleinsäure nur für einen kleinen Teil der zweiten Domäne kodiert. Ein kleiner Teil kann weniger als 50 %, weniger als 40 %, weniger als 30 %, 25 %, 15 %, 10 % oder weniger als 5 % der Aminosäuren der natürlich vorkommenden zweiten Domäne von Fragment C umfassen.
Zwar beziehen sich die folgenden Ausführungen häufig auf idiotypische Antigene, doch ist die Erfindung nicht auf derartige Antigene beschränkt – es können alle geeigneten Erkrankungsantigene verwendet werden, insbesondere Tumorantigene (z.B. ein Fragment von CEA), häufig kleine Antigene für die T-Zelleninduktion.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher genauer gesagt ein Nucleinsäurekonstrukt für die Zufuhr in Lebendzellen in vivo, um eine Immunantwort in einem Patienten auf ein Erkrankungspeptidantigen zu induzieren; wobei das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins steuert, das das Erkrankungspeptidantigen/Erkrankungspolypeptidantigen und die erste Domäne von FrC umfasst.
Die erste Domäne des FrC-Fragments umfasst Helfersequenz(en), insbesondere p30. Die FrC-Domäne wirkt als Adjuvans, das das Immunsystem unterstützt, aufbaut oder vorbereitet und es in die Lage versetzt, auf das Erkrankungsantigen durch Induktion von CTL zu reagieren. Der Ausdruck „erste Domäne" bezieht sich hierin vorzugsweise auf eine gesamte natürlich vorkommende erste Domäne von FrC. Allerdings ist es auch möglich, dass geringe Sequenzvariationen eingeführt werden können, ohne dadurch die Fähigkeit des Fusionsproteins signifikant zu beeinflussen, T-Zellenantworten zu induzieren, wobei auch Fusionsproteine, die eine erste Domäne von FrC aufweisen (einschließlich derartiger Variationen), im Schutzumfang der Erfindung enthalten sind. In der vorliegenden Anmeldung werden die Ausdrücke „erste Domäne" und „N-terminale Domäne" austauschbar verwendet. Vorzugsweise besitzt die erste Domäne von FrC, für die die Nucleinsäure der Erfindung kodiert, zumindest 50 %, noch bevorzugter zumindest etwa 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 %, Aminosequenzidentität mit einer natürlich vorkommenden ersten FrC-Domäne [die Identität wird mittels des NCBI-BLAST2-Algorithmus von Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402 (1997), unter Einsatz der Standardparameter bestimmt]. Noch bevorzugter enthält sie eine Aminosäuresequenz mit zumindest 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Aminosäuresequenzidentität mit der p30-Helfersequenz.
Die Erfinder nahmen ursprünglich an, dass das Ein-Domänen-FrC-Vakzinenformat eine höhere Anzahl an CTL induzieren kann als das Zwei-Domänen-Format, wenn die für das Antigen der Wahl kodierende DNA an den 3'-Terminus (Carboxyende des resultierenden Proteins) der Einzeldomäne des FrC fusioniert ist. Doch nach zahlreichen Experimenten kamen die Erfinder nunmehr zum Schluss, dass die beeindruckende CTL-Antwort auch beobachtet werden kann, wenn das Antigen/Epitop an das andere Ende der Vakzine am Start der FrC-Domäne gebunden ist (5'-Terminus der DNA oder Aminoterminus des resultierenden Proteins). Dies ermöglicht es daher, entweder ein Ende oder beide Enden der FrC-Domäne zu verwenden, um es an das Antigen/Epitop zu binden.
Wie in T.C. Umland et al., Nature Structrual Biology, Bd. 4, Nr. 10 (1997), beschrieben, besitzt FrC zwei Hauptdomänen. Die zwei Domänen sind in FrC auf natürliche Weise durch eine verbindende Aminosäuresequenz voneinander getrennt. Die Erfinder stellten fest, dass durch Schneiden dieser verbindenden Aminosäuresequenz auf der DNA-Ebene eine DNA-Sequenz, die für ein Peptid der Wahl kodiert (z.B. ein Tumor- oder Erregerantigen), entweder an den C-Terminus oder an den N-Terminus der ersten Domäne angefügt werden kann, die Helfersequenzen) wie z.B. p30 und Primingsequenz umfasst. Die zwei Domänen werden in der obigen Publikation von Umland et al. identifiziert und sind hierin in 1 dargestellt. Die p30-Helfersequenz kann an Aminosäurepositionen 947 bis 967 gefunden werden.
Das Erkrankungspeptidantigen kann jede beliebige Peptidsequenz sein, die eine oder mehrere für diese Erkrankung charakteristische Epitope umfasst. Beispielsweise kann das Peptid Epitope umfassen, die für eine bestimmte infektiöse Erkrankung, einen Erreger oder Krebs (Tumorantigen) charakteristisch sind. Der Ausdruck „Peptid" soll hierin keinerlei Größeneinschränkung implizieren und kann auch große Polypeptide und Proteine mit bis zu zumindest mehreren hundert Aminosäuren umfassen, z.B. MUC-1 und gp70. Vorzugsweise besitzt aber das Peptid zwischen 5 und 40 Aminosäuren, noch bevorzugter zwischen 5 und 30, noch bevorzugter zwischen 7 und 25, am bevorzugtesten zwischen 7 und 10, Aminosäuren, weiters bevorzugt zwischen 8 und 25 Aminosäuren. Es sind zahlreiche Krebspeptide bekannt und veröffentlicht. Kandidaten aus Melanom wie z.B. MAGE- und Tyrosinase-Antigene oder mutierte Protoonkogene wie z.B. Ras sind Beispiele dafür. Diese Sequenzen wurden alle veröffentlicht, sodass man davon ausgehen kann, dass Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie ohne weiteres erhalten und in den die FrC-Domäne enthaltenden Vektor der Erfindung einsetzen können. R.A. Henderson und O.J. Finn, „Human tumor antigens are ready to fly", Adv. in Immunology 62, 217 (1996), geben einen umfassenden Überblick über einige der Tumorsequenzkandidaten, auf die CTL abgezielt sein können.
Das Peptid kann auch eine idiotypische Determinante sein, die vorzugsweise im Fusionsprotein in im Wesentlichen der gleichen Konformation vorhanden ist wie auf der Oberfläche maligner B-Zellen; auf diese Weise wird der Wirkungsgrad der durch das Fusionsprotein induzierten anti-idiotypischen Immunantwort optimiert. In Bezug auf idiotypische Determinanten kann die Optimierung des Wirkungsgrads der Immunantwort durch Expression der idiotypischen Determinante innerhalb des Kontexts eines Abschnitts eines Immunglobulin- (Ig-) Moleküls oder Ig-ähnlichen Moleküls erfolgen – ein Beispiel dafür ist einkettiges Fv- (scFv-) Fragment. Das scFv-Fragment eignet sich besonders, da es die notwendigen strukturellen Merkmale der idiotypischen Determinante mit wenigen externen Aminosäureresten aufweist. Allerdings könnten auf Wunsch zusätzliche Aminosäurereste im Fusionsprotein enthalten sein, z.B. eine oder mehrere Konstantdomänen [siehe z.B. Syrengelas et al., Nature Medicine 2, 1038 (1996)]. Somit könnte man die idiotypische Determinante im Kontext eines gesamten Ig-Moleküls exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionsprotein mit einer Leadersequenz (in Humanzellen erkannt) exprimiert, die das Fusionsprotein auf das endoplasmatische Retikulum richtet, wo die Leadersequenz vom Fusionsprotein abgespalten wird. Auf diese Weise wird das Fusionsprotein korrekt gefaltet, bevor es die Zelle verlässt. Die korrekte Faltung des Fusionsproteins ist wichtig, da sie sicherstellt, dass die für die betreffende Krankheit charakteristischen Epitope dem Immunsystem gegenüber richtig angezeigt werden. Es sind sehr viele zweckmäßige Leadersequenzen bekannt, einschließlich z.B. der Leadersequenzen (etwa jene für V_H1, siehe unten) am 5'-Ende von Human-V-Genen. Die Erfinder stellten fest, dass solche Leadersequenzen die Immunogenität des Fusionsproteins steigern. Im Prinzip übt wahrscheinlich auch jede andere Leadersequenz einen ebenso vorteilhaften Einfluss aus, doch es ist anzunehmen, dass jene, die der natürlichen Ig-ähnlichen Leadersequenz am meisten ähneln, optimal sind.
Aus praktischen Gründen umfasst das Nucleinsäurekonstrukt vorzugsweise eine Anzahl von Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen. Insbesondere wenn das Konstrukt mit der stromauf von der Erkrankungs-CTL-Epitopsequenz gebundenen FrC-Domäne konstruiert wird, können sich eine oder mehrere derartige Erkennungsstellen 5' von der Sequenz befinden, die für die erste FrC-Domäne kodiert (mögli cherweise zwischen der optionalen Leadersequenz und der für die FrC-Domäne kodierenden Sequenz); eine oder mehrere Stellen können auch 3' von der für das Erkrankungsantigen kodierenden Sequenz positioniert sein. Auf diese Weise kann das gleiche Grundkonstrukt angepasst werden, um unterschiedliche Fusionsproteine zu exprimieren, in denen das Erkrankungsantigen modifiziert sein kann. Somit können Sequenzen, die für Erkrankungsantigen kodieren, z.B. idiotypische Determinanten aus unterschiedlichen Patienten, einfach in das Konstrukt eingeführt werden.
Ein alternatives Verfahren zur Assoziation eines Erkrankungsantigens (insbesondere eines kleinen Antigens) mit der FrC-Domäne ist aus 3, Teil 3, ersichtlich und wird auch unten erläutert.
In einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Vakzinennucleinsäure bereit, die dazu verwendet werden kann, eine Immunantwort gegen transformierte Humanlymphozyten hervorzurufen, die einen idiotypischen Marker aufweisen, wobei die Nucleinsäure für Proteine kodiert, die die variablen Schwer- und Leichtkettenregionen eines anti-idiotypischen Antikörpers umfassen, die sich auf der Oberfläche einer malignen Human-B-Zelle oder -T-Zelle befinden.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten bereit, umfassend:

(a) die Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Erkrankungspeptidantigen kodiert;
(b) das Klonieren der Nucleinsäuresequenz, die für das Erkrankungspeptidantigen kodiert; und
(c) das Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor die Expression des Erkrankungspeptidantigens als ein Fusionprotein mit der ersten Domäne von FrC aus Tetanustoxin ermöglicht.

Der die erste Domäne von FrC umfassende Vektor kann auch günstigerweise eine Leadersequenz zur Assoziation mit dem Fusionsprotein umfassen, z.B. 5' von der FrC-Domäne. Der Vektor kann als Teil des Verfahrens oder im Vorhinein, d.h. bereit, das erwünschte Erkrankungspeptidantigen zu inkorporieren, hergestellt werden. Auf diese Weise können Nucleinsäureprimer konstruiert werden, die im Verlauf eines PCR-Verfahrens die für das Erkrankungsantigen kodierende Nucleinsäure in den Vektor einführen können. Dies wird hierin ausführlich beschrieben. Ein Vektor, der die erste Domäne von FrC und eine Leadersequenz umfasst, bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung, wobei er auch als Teil eines Sets bereitgestellt sein kann. Vorzugsweise umfasst der Vektor Restriktionsstellen, sodass die für das Erkrankungsantigen kodierende Nucleinsäure problemlos in den Vektor insertiert werden kann. In einem alternativen Beispiel kann eine für die Leadersequenz, die FrC-Domäne und das Erkrankungsantigen kodierende Nucleinsäure z.B. mittels PCR hergestellt und als einzelne Fusion (unter Einsatz geeigneter Restriktionsstellen) in einen zweckmäßige Regulatorregionen umfassenden Vektor insertiert werden.
Wie oben erwähnt kann das Erkrankungsantigen jedes beliebige Peptid sein, das für eine bestimmte Krankheit charakteristische Epitope umfasst, z.B. Tumorantigene, Pathogene und idiotypische Determinanten. Aus praktischen Gründen ist im Folgenden der Fall beschrieben, in dem das Erkrankungsantigen eine idiotypische Determinante ist. Allerdings hätten Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung keine Schwierigkeiten dabei, diese Ausführungen auf die Verwendung anderer Erkrankungsantigene anzuwenden; die vorliegende Erfindung ist keinesfalls auf die Verwendung idiotypischer Determinanten beschränkt.
Beispielsweise kann für die idiotypische Determinante kodierende Nucleinsäure aus einer Patientenzellen umfassenden Probe mittels PCR kloniert werden. Es steht mittlerweile eine große Familie geeigneter generischer PCR-Primer zur Verfügung, die Nucleinsäuresequenzen gewinnen können, die im Wesentlichen für jede idiotypische B-Zellen-Determinante kodieren [Hawkins & Winter, Eur. J. Immunol. 22, 876 (1992)]. Typischerweise ist die B-Zellen-Malignität ein Lymphom. Im Allgemeinen entspricht das mittels des obigen Verfahrens erzeugte Nucleinsäurekonstrukt dem ersten Aspekt der Erfindung.
Die erste und die zweite Domäne sind durch eine verbindende Aminosäuresequenz in FrC natürlich voneinander getrennt. Diese verbindende Aminosäuresequenz kann auf DNA-Ebene geschnitten sein, sodass die Nucleinsäuresequenz, die für das das Erkrankungsantigen umfassende Peptid kodiert, an den C-Terminus der ersten Domäne gebunden und die zweite Domäne verworfen werden kann. Das Erkrankungsantigen wird auf DNA-Ebene hinzugefügt und wirksam entweder mit dem C-Terminus oder mit dem N-Terminus der ersten FrC-Domäne verknüpft. Das somit entstehende Nucleinsäurekonstrukt wird dann in einen DNA-Vektor eingesetzt. Das Vektorrückgrat ist vorzugsweise bakterielle DNA mit den geeigneten Steuersequenzen, um Gen-Expression zu lenken. Standard-PCR und Ligationsschritte, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können dann dazu dienen, das DNA-Konstrukt in den Vektor einzuführen. Der DNA-Vektor kann anschließend z.B. über die Muskelzellen in den Patienten injiziiert werden. Die DNA tritt in die Muskelzelle ein, wo das Nucleinsäurekonstrukt, das für das Fusionsprotein kodiert, das die erste Domäne von FrC und das Erkrankungsantigen umfasst, gelesen wird. Nach der Transkription und der Translation wird das Fusionsprotein exprimiert. Da das Protein von seiner Umgebung als fremd betrachtet wird, wird es dann dem Immunsystem zugeführt. Die Aktivierung von Immunität wird durch die Gegenwart von „immunstimulierenden Sequenzen" im bakteriellen DNA-Rückgrat des Vektors unterstützt. Somit ist das Ergebnis, dass das kodierte Protein den Immunzellen des Wirts präsentiert wird.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung des Nucleinsäurekonstrukts gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Erkrankung, z.B. einer infektiösen Erkrankung oder einer Krebserkrankung, bereit.
Im Fall idiotypischer Determinanten wird die für die idiotypische Determinante kodierende Nucleinsäuresequenz vorzugsweise aus Proben kloniert, die aus dem Indivi duum stammen, dem sie zugeführt wird. Günstigerweise wird die Nucleinsäuresequenz in nicht enkapsidierter Form, d.h. nicht in ein virales Teilchen oder eine andere Packung eingeschlossen, zugeführt. Die Nucleinsäure kann allerdings mit der Außenfläche einer Packung oder eines Teilchens (z.B. eines Liposoms oder eines viralen Teilchens) assoziiert sein, wodurch die Rezeptor-mediierte Zufuhr der Nucleinsäure ermöglicht wird.
Das Fusionsprotein kann die Expression des Erkrankungsantigens und der ersten FrC-Domäne alleine steuern. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein zudem weitere immunmodulierende Polypeptidsequenzen umfassen, z.B. andere immunogene Fremdproteine oder Cytokine. Es ist möglicherweise sinnvoll, mehrere antigene Fusionspartner zu verwenden, um das theoretisch auftauchende Problem vermeiden zu helfen, dass die Immunantwort gegen die hochimmunogene Gruppe des Fusionsproteins alle Antworten auf das relativ schwach immunogene Erkrankungsantigen letzten Endes „übertönen" könnte (obwohl das Einzeldomänen-FrC-Antigen-Fusionsformat konstruiert wurde, um dieses Phänomen zu verringern). Hüllproteine eingehüllter Viren und immunogene Zelltoberflächen oder sekretierte Proteine aus einem beliebigen pathogenen Organismus oder einer Nicht-Humanspezies kommen für die Einführung in das Fusionsprotein in Frage. Eine alternative Modifikation sieht vor, das Nucleinsäurekonstrukt so zu gestalten, dass die Co-Expression der weiteren immunmodulierenden Polypeptide als getrennte Einheiten und nicht als Fusionen an das Erkrankungsantigen bzw. die erste FrC-Domäne ermöglicht wird. Es ist weniger bevorzugt, im Verfahren der Erfindung die Verwendung eines getrennten Nucleinsäurekonstrukts vorzusehen, um die weiteren immunmodulierenden Polypeptide zu exprimieren.
Es ist bekannt, dass einige Cytokine Aspekte der Antigenpräsentation verbessern; die direkte Zufuhr von Cytokin-Gene enthaltenden Expressionsvektoren könnte die Wirksamkeit der Vakzine steigern. Interferon-Gamma ist ein geeignetes Beispiel, da es die Eigenschaft der Hochregulierung der MHC-Expression aufweist [Gaczynska et al., Nature 365, 264-267 (1993)]. Ein weiteres Polypeptid, das durch die Vakzinennucleinsäure exprimiert werden könnte, ist Granulozytenmakrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF). Das relevante Gen könnte auf dem gleichen oder einem getrennten Vektor kodiert sein, und die Menge an exprimiertem Polypeptid variierte unabhängig davon.
Ein Vorteil des genetischen Ansatzes zur Impfung besteht darin, dass die Möglichkeit der wirkungsvollen Nutzung des natürlichen Verfahrens der Antigenpräsentation gegeben ist (somit sollte auch eine große Anzahl an Effektorsystemen zum Einsatz kommen). Außerdem sollten die Manipulation und die Verbesserung der erhaltenen Antwort relativ problemlos sein; beispielsweise kann es möglich sein, den Wirkungsgrad der Präsentation von Antigen gegenüber T-Zellen zu steigern, indem Moleküle mit co-stimulierender Aktivität gemeinsam mit dem Immunogen exprimiert werden. Ein wichtiges, an der Co-Stimulation beteiligtes Molekül ist B7, das mit durch T-Zellen exprimiertem CD28 in Wechselwirkung tritt, wodurch Zusatzsignale für die T-Zellenaktivierung bereitgestellt werden [Galvin et al., J. Immunol. 12, 3802-2808 (1992)]. Es könnten Vektoren konstruiert werden, die sowohl B7 als auch die Einzeldomänen-Fragment-C-Fusion exprimieren. Sequenzen von Maus- und Human-B7 wurden bereits veröffentlicht [Freeman et al., J. Immunol. 8, 2714-2722 (1989)], und die Gene können problemlos mittels PCR kloniert werden.
Es ist demnach ein fakultatives Merkmal der Erfindung, dass das Verfahren außerdem die Zufuhr einer zweiten Nucleinsäuresequenz zum Individuum umfasst, die die Expression eines weiteren immunmodulierenden Polypeptids zum Zwecke der weiteren Modulation der Immunantwort gegen das Erkrankungsantigen steuert. Diese zweite Nucleinsäuresequenz kann aus dem gleichen Nucleinsäuremolekül wie die erste Nucleinsäuresequenz bestehen oder auf einem zweiten Nucleinsäuremolekül vorhanden sein.
Es sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung Verfahren zur Einführung von Nucleinsäurekonstrukt in Lebendzellen in vivo allgemein bekannt. Praktischerweise wird die Nucleinsäure einfach als nackte DNA in den Patienten injiziert (typischerweise erfolgt dies intramuskulär); sie liegt als Gemisch mit einem physiologisch annehmbaren Verdünner wie z.B. Salzlösung vor. Details betreffend einiger geeigneter Verfahren und bevorzugte Ausführungsformen der Verabreichung des Nucleinsäurekonstrukts an einen Patienten finden sich in den US-Patenten 5.580.859 und 5.589.466. Kompliziertere Verfahren des Gen-Transfers umfassen die Verwendung viraler Vektoren, das Einkapseln der DNA in Liposomen und das Koppeln von DNA an kationische Liposomen oder an die Außenseite von Viren [ein Überblick darüber findet sich in Miller, Nature 357, 45-46 (1991)]. Diese Alternativen besitzen den Vorteil des höheren Transfer-Wirkungsgrads, doch im Vergleich zur direkten Injektion gereinigter Plasmid-DNA sind diese Verfahren etwas komplizierter und auch vom Standpunkt der Sicherheit problematisch.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung daher eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten, der an einer Krankheit leidet (im Einklang mit dem oben definierten dritten Aspekt der Erfindung), bereit. Die Zusammensetzung umfasst ein Nucleinsäurekonstrukt, das die Expression eines Fusionsproteins steuert, das ein Erkrankungsantigen umfasst, umfassend für diese Krankheit charakteristische Epitope und eine Helfersequenz (vorzugsweise die p30-Helfersequenz) von FrC aus Tetanustoxin, gemeinsam mit einem physiologisch annehmbaren Verdünner oder Träger. Vorzugsweise besteht die Helfersequenz der FrC-Domäne innerhalb der ersten Domäne von FrC, sodass das Fusionsprotein die erste Domäne von FrC gebunden an das betreffende Erkrankungsantigen umfasst. Es stellte sich heraus, dass die erste Domäne von FrC (enthält die p30-Helfersequenz) im an Erkrankungsantigen fusionierten Zustand viel wirkungsvoller dabei ist, eine T-Zellenantwort hervorzurufen (insbesondere zytotoxische T-Zellen) als die p30-Helfersequenz alleine.
Im Idealfall sollte eine Vakzine in der Lage sein, Antigen-spezifische B-Zellen, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und Helfer-T-Zellen zu stimulieren. Die B-Zellen-Stimulation erfordert, dass sich das Zielantigen mit ausreichend hoher Affinität an spezifische Antigenrezeptoren (Oberflächen-Ig) auf der B-Zellen-Oberfläche bindet. Bestimmte mehrwertige Antigene können die B-Zellen-Proliferation direkt, aber häufiger stimulieren, und um für eine wirkungsvolle anamnetische Antwort zu sorgen, sind zusätzliche Signale der Helfer-T-Zellen erforderlich (siehe unten). In der vorlie genden Erfindung wird die T-Zellen-Hilfe durch Exprimieren des Erkrankungsantigens als Fusionsprotein mit der Helfersequenz (vorzugsweise innerhalb der ersten Domäne) von FrC aus Tetanustoxin aktiviert.
Die T-Zellen-Rezeptoren (TCR) von CTL erkennen spezifische MHC-Klasse-I-assoziierte Peptide auf der Zielzellenoberfläche. Solche Peptide werden im Allgemeinen durch Verarbeitung größerer Polypeptide oder Proteine, die innerhalb der Zielzelle produziert werden, gewonnen. Für die effiziente CTL-Stimulation sollte das Zielantigen demnach intrazellulär in MHC-Klasse-I-exprimierenden Zellen synthetisiert oder verarbeitet werden, die CTL aktivieren können. Das Ausmaß an Expression sollte hoch genug sein, um ausreichend Peptid zu erzeugen, damit jene Eigenpeptide verdrängt werden können, die normalerweise – und unter Umständen mit höherer Affinität – in der MHC-Peptid-Bindungsfurche gebunden sind [Ohno, PNAS 89, 4683-4647 (1992)]. Ähnlich wie Antigen-spezifische B-Zellen erfordern CTL für die Proliferation und gesteigertes zytotoxisches Leistungsvermögen zusätzliche Signale (in Form von Cytokinen) nach der Antigenerkennung; diese Signale werden von Helfer-T-Zellen bereitgestellt.
CD4-positive Helfer-T-Zellen treten über ihre einzigartigen TCR mit spezifischen Zelloberflächen-MHC-Klasse-II-assoziierten Peptiden in Wechselwirkung, wobei solche Peptide im Allgemeinen durch proteolytische Spaltung von Proteinantigenen entstehen, die durch spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen (APC) internalisiert sind. Makrophagen, Dendritenzellen und B-Lymphozyten sind unter jenen Zellen, die Antigen auf diese Weise präsentieren können. Somit internalisieren und verarbeiten B-Lymphozyten Antigen, das an ihre Oberflächen-Ig gebunden ist, und präsentieren anschließend MHC-Klasse-II-assoziierte Peptidderivate (sie können auch in Klasse I präsentieren). Das Oberflächenpeptid erkennende CD4-positive Helfer-T-Zellen können dann verschiedene immunstimulierende Cytokine freisetzen und weitere B-Zellen-Aktivierung, Proliferation und Antikörperproduktion stimulieren. In ähnlicher Weise können an der Stelle einer lokalen Entzündungsreaktion vorhandene Makrophagen phagocytiertes Antigen verarbeiten und die Cytokinfreisetzung durch T- Helferzellen stimulieren, was zu gesteigerter Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität lokal vorhandener CTL führt.
Das Vakzinenantigen sollte daher idealerweise 1) durch die MHC-Klasse-I-positiven Wirtszellen intrazellulär synthetisiert werden, 2) zu Peptiden führen, die bei Anzeige durch Wirtszellen-Klasse-I-MHC eine Untergruppe von Wirts-CTL über ihre TCR stimulieren können, 3) zu Peptiden führen, die bei Anzeige durch Wirtszellen-Klasse-II-MHC eine Untergruppe von Wirts-Helfer-T-Zellen über ihre TCR stimulieren können, 4) durch Wirts-APC, umfassend sowohl Makrophagen als auch Antigen-spezifische B-Zellen, internalisiert und verarbeitet werden und 5) in seiner nativen Form für die Wechselwirkung mit Wirts-B-Lymphozyten zur Verfügung stehen.
Es folgt eine Erläuterung von Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mithilfe von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen. Weitere Aspekte und Ausführungsformen sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Topologie von FrC (T.C. Umland et al., Nature Structural Biology, Bd. 4, Nr. 10 (1997)). Diese Abbildung veranschaulicht den N-Terminus bzw. die erste Domäne und den C-Terminus bzw. die zweite Domäne von FrC. Die Helfer-Aminosäuresequenz befindet sich in der ersten Domäne an Positionen 947 bis 967.
2 zeigt eine detaillierte Karte von Plasmid pcDNA3 (Invitrogen).
3 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung eines Vektors, der die erste Domäne von FrC und das Erkrankungsantigen umfasst.
4 stellt die gesamte Sequenz des Vektors pVAC1 dar.
5 zeigt eine pVAC1-Restriktionskarte.
6 ist eine schematische Darstellung der wesentlichen Merkmale von pVAC1.
7 ist ein schematisches Diagramm der DNA-Vakzinen-Konstruktion. Vakzinensequenzen wurden assembliert und in pcDNA3 insertiert; dies erfolgte mithilfe von Hindlll- und Notl-Restriktionsenzymstellen. DNA-Sequenzen umfassten jene, die für die zwei Domänen von FrC voller Länge
oder nur die Aminoterminale Domäne
p30
BCL₁-Leader
T_1287-1294
TT_1162-1196
und CEA_526-533
odieren. Die DNA-Sequenz, die für das T-Helfer-Epitop, p30, kodiert, befindet sich in der p-DOM-Sequenz
die H2-K^b-restringierten CTL-Epitope TT_1287-1294 (Peptid 1) und TT_1162-1169 (Peptid 2) befinden sich in der zweiten Domäne
8 zeigt CTL-Antworten, die durch Impfung mit DNA induziert werden, die für die FrC-Sequenz voller Länge (p.FrC) kodiert; sie sind für zwei H2-K^b-Bindungsoktamere spezifisch. Nach der Impfung mit p.FrC wurden die am Tag 14 entnommenen Splenozyten mit jedem von acht Peptiden mit signifikanter prognostizierter H2-K^b-Bindungsaktivität restimuliert. Nur zwei Peptide induzierten messbare CTL-Aktvitität (gemessen durch ⁵¹Cr-Freisetzungstest). a) CTL-Aktivtität gegen Peptid-geladene EL4-Zellen wurde gegen Peptid 1 (SNWYFNHL) und Peptid 2 (LNIYYRRL) detektiert. Jedes Peptid wurde wechselseitig als Test oder Kontrolle verwendet. b) Die durch einen Stabilisierungstest hervorgerufene Bindungsaktivität an H-2K^b zeigte, dass Peptide 1 und 2 mit der positiven Kontrolle aus Sendai-Virus-Nucleoprotein (SEV) vergleichbar und vom Vergleichs-N-2D^b-Bindungspeptid aus Influenzavirus (ASN) klar unterscheidbar sind.
9 zeigt die Umpositionierung von Peptiden 1 und 2 von der eingebetteten Stelle in der zweiten Domäne an den C-Terminus des ersten Domäne von FrC; diese Verlegung amplifiziert die spezifischen Anti-Peptid-CTL-Antworten. Es erfolgte die Impfung mit DNA, die für Folgendes kodierte: für FrC voller Länge (p.FrC); oder für die erste Domäne, fusioniert an Peptid 1 oder 2, die an den C-Terminus verlegt wurden (p.DOM-Peptid); oder für das p30-Helfer-Epitop von FrC, fusioniert an Peptid-1- oder -2-Sequenz (p.p30-Peptid); oder für Vergleichsplasmid ohne Insert (p.Φ). Am Tag 14 wurden Splenozyten mit Peptid 1 (linke Seite) oder Peptid 2 (rechte Seite) restimuliert, bevor die Messung von CTL-Aktivität durch einen ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Einsatz Peptid-geladener EL4-Zielzellen stattfand. Die Lyse von mit Vergleichspeptid beladenen Zielzellen war in jedem Fall vernachlässigbar (weniger als 2,2 %).
10 zeigt den Vergleich der Fähigkeiten von DNA-Vakzinen mit eingebetteten oderumpositionierten Peptiden, CD8⁺-T-Zellen mit intrazellulärem IFNγ zu induzieren. Es erfolgte die Impfung von DNA, die für Folgendes kodierte: entweder FrC voller Länge (pFrC); oder die erste Domäne, fusioniert an Peptide 1 und 2, die an den C-Terminus verlegt wurden (p.DOM-Peptid); oder für p30-Helfer-Epitop, fusioniert an Peptid-1- oder Peptid-2-Sequenz (p.p30-Peptid). Am Tag 14 wurden Splenozyten mit Peptid 1 oder Peptid 2 wie angegeben restimuliert; die Prozentsätze von CD8⁺-T-Zellen mit intrazellulärem IFNγ sind angegeben. Die relativen Wirkungsgrade der Konstrukte waren analog zu den ⁵¹Cr-Freisetzungstests (9).
11 zeigt die Fähigkeit von CTL, induziert durch DNA-Vakzinen mit p.DOM-Peptidsequenzen, Zieltransfektanten zu töten. Nach der Impfung mit p.DOM-Peptid 1 (a und b) oder p.DOM-Peptid 2 (c und d) wurden Splenozyten am Tag 14 entnommen und mit Peptid restimuliert; dies erfolgte 6 Tage lang in vitro, bevor auf Aktivität gegen ⁵¹Cr-markierte Zielzellen untersucht wurde. Zu den Zielzellen zählten: EL4-Zellen, transfiziert mit Leader-losem FrC (☐) oder mit leerem Vektor (∎); EL4-Zellen alleine
oder beladen mit Peptid 1 (♦) oder Peptid 2 (o).
12a und b zeigen einen Vergleich der Fähigkeiten von DNA-Vakzinen mit eingebettetem oder umpositioniertem Peptid 1, protektive Immunität gegenüber Exposition mit EL4-FrC-transfizierten Tumorzellen zu induzieren. Die Impfung mit DNA – sie kodierte entweder für FrC voller Länge (p.FrC); oder für die erste Domäne, fusioniert an Peptid-1- oder Peptid-2-Sequenz, verlegt auf den C-Terminus (p.DOM-Peptid 1 oder p.DOM-Peptid 2); oder für p30-Helfer-Epitop, fusioniert an Peptid 1 (p.p30-Peptid 1) – erfolgte an Tagen 0 und 21 unter Verwendung von acht Mäusen pro Gruppe. Am Tag 28 wurden 10⁵ Tumorzellen subkutan injiziert und die Mäuse euthanasiert, als die Tumorgröße einen Durchmesser von 1,5 cm erreichte.
13 zeigt die Fähigkeit des p.DOM-Peptid-Konstrukts, eine CTL-Antwort gegen ein Kandidatenpeptid aus karzinoembryonalem Antigen (CEA) zu induzieren. Es erfolgte die Impfung mit DNA (kodiert für p.DOM) mit einer Sequenz, die für das EAQNTTYL-Peptid aus CEA (fusioniert an den C-Terminus) kodiert. Am Tag 14 wurden die Splenozyten mit Peptid restimuliert und untersucht: a) in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Verwendung von EL4-Zielzellen, beladen mit spezifischem Peptid (•) oder Vergleichspeptid (o). Nur mit p.DOM geimpfte Mäuse wurden ebenfalls auf Antworten auf spezifisches Peptid
oder Vergleichspeptid (Δ) untersucht. In b) ist ein paralleler Test des Prozentsatzes reagierender CD8⁺-T-Zellen mit intrazellulärem IFNγ dargestellt.
14 zeigt, dass die Suppression der CTL-Antwort gegen ein Kandidatenpeptid aus CEA unter Verwendung des Zwei-Domänen-FrC-Peptid-Konstrukts durch Verwendung des p.DOM-Peptid-Konstrukts überwunden wird. Die Impfung erfolgte mit (a) für eine erste Domäne von FrC kodierender DNA mit einer Sequenz, die für EAQNTTYL-Peptid aus CEA (fusioniert an den C-Terminus) kodiert (p-DOM-CEA_526-533), (b) DNA, die für die erste Domäne von FrC alleine kodiert (p.DOM), (c, d) DNA, die für FrC voller Länge kodiert, mit der Sequenz, die für das EAQNTTYL-Peptid kodiert (fusioniert an den C-Terminus; p.FrC-CEA_526-533) Am Tag 14 wurden Splenozyten mit CEA_526-533 (a bis c) oder Peptid 1 (d) 6 Tage lang in vitro restimuliert, bevor die Messung von CTL-Aktivität durch einen ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Verwendung von EL4-Zielzellen stattfand, die entweder mit CEA_526-533-Peptid
oder mit Peptid 1 (∎) beladen waren.
15 vergleicht die Fähigkeiten der Zwei-Domänen-FrC-Peptid-Konstruktion und der p.DOM-Peptid-Konstruktion, CD8⁺-T-Zellen mit intrazellulärem IFNγ zu induzieren. Die Impfung erfolgte (a) mit DNA, die für die erste Domäne von FrC kodiert, mit einer Sequenz, die für das EAQNTTYL-Peptid aus CEA kodiert (fusioniert an den C-Terminus; p.DOM-CEA_526-533), (b) DNA, die für die erste Domäne von FrC alleine kodiert (p.DOM), (c, d) DNA, die für FrC voller Länge kodiert, mit der Sequenz, die für das EAQNTTYL-Peptid kodiert (fusioniert an den C-Terminus; p.FrC-CEA_526-533) Am Tag 14 wurden Splenozyten mit Peptid CEA_526-533 (a bis c) oder Peptid 1 (d) 6 Tage lang in vitro vor der FACS-Analyse restimuliert; die Prozentsätze von CD8⁺-T-Zellen mit intrazellulärem IFNγ sind angeführt. Die relativen Wirkungsgrade der Konstruktionen entsprachen den ⁵¹Cr-Freisetzungstests (14).
Tabelle 1 zeigt die PCR-Primersequenzen, die zur Konstruktion der DNA-Vakzinen in den der Erfindung zugrundeliegenden Versuchen herangezogen werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Strategien zur Aktivierung von Immunität gegen Krebs werden derzeit von vielen Forschern untersucht. Die DNA-Impfung bietet eine relativ einfache Vorgangsweise zwischen der Identifizierung genetischer Veränderungen in Tumorzellen und der Herstellung einer Testvakzine. Allerdings ist die Art und Weise, in der das kodierte Protein Zugang zur Maschinerie der Antigenpräsentation und zur Aktivierung effizienter Immunität erhält, noch nicht vollkommen klar. Injizierte Muskelzellen scheinen Antigen nicht direkt den T-Zellen zu präsentieren (1, 2), fungieren aber wahrscheinlich als Antigenreservoir für die indirekte Präsentation (2). Die direkte Transfektion von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kann aus der Muskelzelle erfolgen (3), doch dies geschieht nur in einem sehr geringen Ausmaß (4, 5). Es ergibt sich auch die Frage, welcher Effektorweg für den Angriff auf die Tumorzelle der effektivste ist, wobei dies offenkundig von der Beschaffenheit des exprimierten Antigens abhängt.
Vor der vorliegenden Erfindung wurden DNA-Vakzinen entwickelt, um B-Zellen-Malignitäten zu behandeln; dies erfolgte unter Verwendung der idiotypischen (Id) Determinanten des klonotypischen Ig (dafür kodieren die variablen Genregionen V_H und V_L) als Zielantigen (6, 7). Für Lymphom ist Anti-Id-Antikörper beim Töten von Tumorzellen wirkungsvoll (6, 8, 9), weshalb die DNA-Vakzine solcherart konstruiert wurde, dass es Antikörper induziert. Zunächst erwies sich eine Vakzine, die die V_H- und V_L-Gene, assembliert als einkettiges Fv, alleine enthielt (10), bei der Induktion von Anti-Id in Mäusemodelle als unwirksam (11). Die Fusion eines für FrC von Tetanustoxin kodierenden Gens an die scFv-Sequenz führte zur deutlichen Förderung von Anti körperproduktion und zum Schutz gegenüber Lymphomexposition (12, 13). Diese Konstruktion wird nun in einem klinischen Pilotversuch mit Patienten mit leichtem Follikellymphom untersucht. Die Notwendigkeit der Fusion von für zusätzliche Proteine kodierenden Genen, z.B. für xenogenes Protein (14) oder Chemokine (15), um die Immunantwort gegen Id-Antigene einzuleiten, ist eine allgemeine Erkenntnis. Im vorliegenden Fall unterstützte die Tatsache, dass die Fusion eine absolute Anforderung darstellte und getrennte Plasmide keine fördernde Wirkung entfalteten, die Vorstellung, dass die FrC-spezifischen T-Zellen die Anti-Id sekretierenden B-Zellen möglicherweise unterstützen (12). Interessanterweise konnte aber die gleiche scFv-FrC-Konstruktion protektive Immunität gegenüber einem Ig-sekretierenden, Oberflächen-Ig-negativen Myelommodell induzieren; dies erfolgt offenbar durch Mediation von Effektor-T-Zellen (13), die wahrscheinlich der CD4⁺-Untergruppe angehören (16).
Obwohl sich dieses Konstrukt für die Oberfläche sekretierter Zielantigene eignet, sind zahlreiche Tumorantigen-Kandidaten intrazellulär und nur als Peptide in Assoziation mit MHC-Klasse-I-Molekülen vorhanden (in 17 besprochen). Es taucht daher die Frage auf, ob die Fusion an die FrC-Sequenz zur Induktion von CTL-mediierter Immunität gegen aus Tumoren stammende Kandidatenpeptide notwendig oder nützlich wäre. Die Erfinder hatten bereits festgestellt, dass FrC selbst bei Zufuhr als DNA-Vakzine eine CTL-Antwort induzieren kann, und es war auch ein H2-K^b-restringiertes Peptidmotiv an Position 1287-1294 in der FrC-Sequenz identifiziert worden (13, 18). Das Phänomen der Immundominanz, bei dem sich CD8⁺-T-Zellen nur auf ein oder einige wenige Peptidmotive konzentrieren, tritt in Antworten auf virale Infektion deutlich zutage (19). Die Immundominanz wurde als wesentliches Merkmal der CD8⁺-T-Zellenantworten beschrieben (besprochen in 20). Wenn dies auch auf DNA-Vakzinen zuträfe, wäre dies ein Argument gegen die Fusion einer potenziell konkurrierenden FrC-Sequenz an die Tumorpeptidsequenz, FrC besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen Jelly-Roll-Domäne und einer zweiten β-Trefoil-Domäne (21). Die erste Domäne enthält ein gut dokumentiertes „universelles" Helferepitop, p30 (22, 23), das sich an eine Reihe von Maus- und Human-MHC-Klasse-II-Allele bindet und durch CD4⁺-T-Zellen erkannt wird (24). Die Er finder identifizierten bereits vor der Erfindung ein Epitop, das an der Induktion von CD8⁺-T-Zellen in der zweiten Domäne beteiligt ist (18). Sie identifizierten auch ein weiteres Epitop mit ähnlicher Fähigkeit zur Induktion von CD8⁺-T-Zellen-Antworten (ebenfalls in dieser Domäne). Die Erfinder haben nun zwei Faktoren, die in Bezug auf die Induktion von CTL-Antworten auf mittels DNA präsentierte Kandidatenepitope möglicherweise von Bedeutung sind, untersucht: 1) die Position des Peptidepitops in der DNA-Sequenz; 2) die Rolle der das Helferepitop enthaltenden Domäne bei der Förderung von CTL-Aktivität.
Um die Relevanz der induzierten CTL für den Angriff auf Krebszellen zu untersuchen, transfizierten die Erfinder FrC voller Länge zu EL4-Zellen, in denen verarbeitete Peptide als Ersatz-Zielantigene fungieren können. Um sich dem Krebs anzunähern, zeigten die Erfinder ferner auf, dass eine ähnlich konstruierte Vakzine mit einem bekannten Epitop aus CEA große Mengen an spezifischen CTL induzierte. Unter Verwendung dieses Modells wurde die Notwendigkeit, potenziell konkurrierende Epitope aus der Adjuvans-FrC-Sequenz zu entfernen, bestätigt.
Ergebnisse
Produktion von ΔFrC
Es wurde eine Nucleinsäuresequenz assembliert, umfassend einen ersten Teil, der für die erste Domäne von FrC kodiert, und einen zweiten Teil, der für ein Peptid kodiert, das bekanntermaßen zytotoxische T-Zellen-Antworten induziert. In diesem konkreten Beispiel ist das Peptid in der zweiten Domäne von FrC enthalten. Es ist jedoch für ein Peptid repräsentativ, das zytotoxische T-Zellen-Motive aufweist.
Die Assemblierung des Nucleinsäurekonstrukts erfolgt, wie in 3 dargestellt, unter Einsatz eines Plasmidrückgrats wie pcDNA3 (Invitrogen7; siehe 3). Kurz gesagt umfasst das Ausgangsplasmid das gesamte FrC und eine Leadersequenz (FrC + L). Die 5'-Leadersequenz stammt aus einem Tumor (BCL1). Dieses Ausgangsplasmid wird als pFrC+L bezeichnet.
Dann dienen Primer dazu, die erste Domäne von FrC (ΔFrC) zu isolieren, wie dies aus Teil 2 von 3 ersichtlich ist. Anschließend wird das PCR-Produkt gereinigt, verdaut, um unerwünschte Nucleinsequenz zu entfernen, die z.B. aus den Primern stammt, und mithilfe von Hindlll- und Notl-Stellen zurück in pcDNA3 kloniert. Das resultierende Plasmid enthält somit die erste Domäne von FrC nur an eine Leadersequenz fusioniert (BCL1) mit einem hinzugefügten Stoppcodon am Ende dieser ersten FrC-Domäne.
Produktion von ΔFrC plus Peptidantigen
Um ein Erkrankungsantigen in das Plasmid einzuführen, wird ein Rückwärtsprimer am 3'-Ende von ΔFrC (kodiert auch für das betreffende Erkrankungsantigen) dazu verwendet, diese Sequenz zur ΔFrC-Sequenz hinzuzufügen. Dies ist schematisch in Teil 3 von 3 dargestellt.
Für Erkrankungsantigene, die auf längeren Peptidsequenzen vorhanden sind, kommt eine PCR-Soeing-Technik mit überlappenden Primern zur Anwendung.
2 und 4 bis 6 zeigen Details der Vektoren pcDNA3 und pVAC1, die Beispiele für jene Vektoren sind, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, um das Nucleinsäurekonstrukt zu tragen. Die Erfinder stellten fest, dass es vorzuziehen ist, RSVLTR mit einer Promotorsequenz aus Zytomegalievirus (pCMV) zu ersetzen.
Identifikation von CTL-induzierenden MHC-Klasse-I-Bindungsmotiven in FrC
Die Aminosäuresequenz von FrC wurde auf Peptid-8-mer-Motive mit Potenzial zur Bindung von H2-K^b oder H2-D^b untersucht (31). Unter Verwendung eines Algorithmus, um einen Score basierend auf der geschätzten Dissoziations-Halbwertszeit eines diese Sequenz enthaltenden Moleküls zuzuweisen (31), wurden 8 Peptide mit Werten von > 13 für die Bindung an H2-K^b identifiziert und synthetisiert. Die Top 20 der vorhergesagten Bindungssequenzen ergaben Werte im Bereich von 86,4 bis 1,32. Bekannte immundominante K^b-restringierte CTL-Epitope erzielen einen Score zwischen 132 (RGYVYQGL) und 17 (SIINFEKL). Die aus K^b-bindendem Sendai-Virus-Nucleoprotein stammende Sequenz FAGNYPAL (SEV) erzielte einen Score von 60, während ein Vergleich, D^b-restringiertes Epitop (ASNENMDAM), einen Score von 1 erzielte. FrC-Sequenzen mit einem Score von < 8, z.B. der nur H2-D^b bindende Kandidat, wurden nicht weiter untersucht.
Danach wurden Mäuse mit der DNA-Vakzine geimpft, die das für FrC voller Länge (p.FrC) kodierende Gen enthält. Am Tag 14 nach einer Impfung konnten CTL-Antworten gegen Peptid-beladene EL4-Zellen unter Verwendung von zwei von acht Peptiden nach einer Restimulation in vitro detektiert werden (8a). Weitere Injektionen oder zusätzliche Restimulationen in vitro konnten CTL-Antworten auf die verbleibenden sechs Kandidatenpeptide nicht hervorrufen. Die zwei positiven Peptide, die von den Erfindern als Peptid 1 und Peptid 2 bezeichnet wurden, stammten aus der zweiten Domäne von FrC und befanden sich an Positionen 1287-1294 bzw. 1162-1169.
Die verbleibenden Peptide konnten keine detektierbare CTL-Aktivität stimulieren. Interessanterweise wies von den zwei immunstimulierenden Peptiden Peptid 1 (SNWYFNHL) den niedrigsten Score (13,2) auf, und Peptid 2 (LNIYYRRL) belegte den dritten Rang mit einem Score von 26,4. In einem In-vitro-Bindungsversuch konnten sich sowohl Peptid 1 als auch Peptid 2 gleich gut an H2-K^b und nicht signifikant unterschiedlich an das positive Vergleichspeptid SEV binden (8b). Somit kann zwar der prognostische Algorithmus erfolgreich beide immunstimulierenden Sequenzen identifizieren, doch es liegt möglicherweise geringe Übereinstimmung zwischen der prognostizierten Bindung und der tatsächlichen Fähigkeit zur Bindung an Klasse I und zur Stimulation einer CTL-Antwort vor, wie dies bereits festgestellt wurde (32).
Auswirkung der Umpositionierung der Peptidsequenzen an den C-Terminus der ersten Domäne
Peptide 1 und 2 konnten CTL-Antworten nach Impfung mit FrC-Sequenz voller Länge induzieren, aber die Antwort war relativ schwach – es waren zwei Restimulationen erforderlich, um ein hohes Ausmaß an ⁵¹Cr-Freisetzung zu erzielen. Da Tumorantigene auch niedrige Immunogenität aufweisen können, verwendeten die Erfinder diese Peptide als Modelle, um die immunogene Aktivität mithilfe von DNA-Zufuhr zu steigern. Sie untersuchten zunächst die Auswirkung der Entfernung der Peptidsequenzen aus dem FrC-Rückgrat und ihrer Umpositionierung an den C-Terminus der ersten Domäne (p.DOM). Eine einzelne intramuskuläre Injektion mit p.DOM-Peptid 1 oder p.DOM-Peptid 2 erzeugte rasche und starke CTL-Antworten, die nach einer Invitro-Stimulation detektierbar waren. Der Vergleich mit der ursprünglichen p.FrC-Vakzine ist in 9 dargestellt; ähnliche Ergebnisse wurden in mehreren Versuchen erzielt.
Die zytolytische Aktivität ging Hand in Hand mit Werten an intrazellulärem IFNγ in der CD8⁺-T-Zellen-Population (10a und 10b), wobei die p.DOM-Peptidvakzinen regelmäßig zwei- bis dreifache Zunahmen der Prozentsätze IFNγ-positiver CD8⁺-Zellen im Vergleich zur p.FrC-Vakzine induzierten. Die CTL konnten auch EL4-Zellen lysieren, die mit Leader-losem p.FrC transfiziert waren (11), wobei die für Peptid 1 spezifischen wirksamer sind. Dies zeigt auf, dass die durch Peptid 1 induzierten CDL besser dazu in der Lage sind, die Zieltransfektanten zu töten, als die durch Peptid 2 induzierten. Der Grund dafür ist derzeit unklar, kann aber darin liegen, dass nicht alle Kandidatenpeptide als Ziele geeignet sind.
Obwohl nur geringe Werte spezifischer Lyse für CTL gegen Peptid 2 festgestellt wurden, waren diese doch in wiederholten Experimenten regelmäßig zu beobachten. Im Gegensatz dazu konnte man keine signifikante Lyse von mit leerem Vektor transfizierten EL4-Zellen feststellen. Die Hinzufügung von Peptid zu den Zielzellen sorgte für eine deutliche Erhöhung der spezifischen Lyse – ein Indikator dafür, dass der Transfektant nur geringe Mengen beider Peptide auf endogenem Weg verarbeiten und präsentieren kann (11). Allerdings reichten die Expressionswerte für Effektor-CTL aus, die entweder für Peptid 1 oder 2 spezifisch waren, um den Transfektanten in vivo anzugreifen (siehe nachstehende Ausführungen).
Beitrag von Domäne 1 (p.DOM) zur CTL-Induktion mittels DNA-Impfung
Domäne 1 enthält ein identifiziertes „universelles" Peptid an Position 947-967, das durch Human-T-Zellen (24) oder Maus-T-Zellen (33) in Assoziation mit einer großen Anzahl an MHC-Klasse-II-Molekülen erkannt werden kann. Da dies eine kritische p.DOM-Komponente zur Bereitstellung von T-Zellen-Hilfe sein könnte (34), untersuchten die Erfinder ihre Rolle bei der CTL-Induktion. Sie verglichen die Fähigkeit einer DNA-Vakzine, die nur die p30-Sequenz enthielt, die mit jeder der CTL-Peptidsequenzen verbunden war, mit jener der p.DOM-Peptidvakzine. 9 zeigt, dass p.p30-Peptid 1 bei der Induktion einer CTL-Antwort mangelhaft war; p.p30-Peptid 2 war wirksamer, zeigte aber eine deutlich schlechtere Leistung als p.DOM-Peptid 2 und war auch weniger wirkungsvoll als die ursprüngliche p.FrC-Vakzine. Ein Vergleich der Anzahl an CD8⁺-T-Zellen, die intrazelluläres IFNγ produzieren, wies in die gleiche Richtung (10c). Wiederholte Impfungen und Restimulationen mit den p.p30-Peptidvakzinen konnten CTL erzeugen (Daten nicht dargestellt), was die Integrität der Konstrukte bestätigte, aber Ausdruck ihrer mangelhaften Leistung war.
Die Schlussfolgerung ist, dass p.DOM zusätzliche Sequenzinformation enthält, die für die Induktion einer wirkungsvollen CTL-Antwort gegen angefügte Peptide erforderlich ist.
Beitrag von p.DOM zur CTL-Induktion mittels Peptidimpfung
Die Erfinder gingen dann der Frage nach, ob die Adjuvanswirkung von p.DOM auf die CTL-Induktion mittels DNA-Zufuhr bei Verabreichung mit synthetischen Peptiden evident ist. Peptid 1 wurde mit p.DOM vermischt und in Muskel injiziert.
Es wurde aber keine CTL-Aktivität induziert – nicht einmal nach drei Injektionen an Tagen 0, 21 und 42 und bis zu vier wöchentlichen In-vitro-Restimulationen (Daten nicht dargestellt). Es scheint, als ob die Fusion von p.DOM an die Peptidsequenz erforderlich ist – entweder um die Zufuhr zur gleichen Zelle zu bewerkstelligen oder um sicherzustellen, dass die Synthese der ersten Domäne und die Gegenwart des Peptids zusammenfallen.
Schutz
Die Impfung am Tag 0 und am Tag 21 mit p.DOM-Peptid 1 führte zu signifikantem Schutz gegenüber Exposition mit dem EL4-FrC-Transfektanten am Tag 28 (12), hatte aber auf das Wachstum von mit leerem Vektor (pcDNA3) transfizierten EL4-Zellen keine Auswirkung (Daten nicht dargestellt). Zu diesem relativ frühen Zeitpunkt der Exposition (Tag 28) war p.DOM-Peptid 1 gegenüber dem p.FrC-Plasmid voller Länge überlegen, was mit der raschen Induktion von CTL übereinstimmte. Obwohl aber die p.FrC-Vakzine bis zum Tag 14 keine ausreichende Menge an CTL erzeugen konnte, um den Transfektanten in vitro nach einer Restimulation zu töten, war ein gewisses Maß an Schutz evident (12) – wahrscheinlich die Folge der Vermehrung von CTL durch die zweite Injektion. CTL, die sowohl den Transfektanten in vitro töten können als auch Schutz vor Exposition bieten, konnten durch das Zwei-Domänen-p.FrC nach der dritten Vakzineninjektion induziert werden (Daten nicht dargestellt). Die Impfung mit den Plasmiden, die nur das entweder an Peptid-1- oder Peptid-2-Sequenz fusionierte p30-Helfer-Epitop enthielten, waren in Bezug auf die Bereitstellung von Schutz völlig unwirksam (12), wie man dies anhand der mangelhaften Fähigkeit zur Induktion von CTL erwarten konnte (Daten nicht dargestellt). Abreicherungsexperimente zeigten, dass der gesamte Schutz durch den Schwund von CD8⁺-T-Zellen entfiel (Daten nicht dargestellt). Die Abreicherung von CD4⁺-T-Zellen konnte wegen der Expression von CD4 durch EL4-Zellen nicht durchgeführt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch das umpositionierte Peptid 1 induzierten CTL zum Schutz vor Tumoren beitragen.
p.DOM-Peptid-Konstruktion zur Induktion von CTL gegen ein Peptid aus CEA
Um die Fähigkeit der p.DOM-Peptid-Konstruktion zu untersuchen, CTL gegen ein Tumor-assoziiertes Kandidatenantigen zu induzieren, wurde ein Peptid aus CEA ausgewählt. Peptid EAQNTTYL ist bekannt dafür, dass es als Ziel für CTL fungiert, die durch Impfung von B6-Mäusen mit rekombinantem Vacciniavirus induziert werden (35). Die Kodiersequenz wurde an das 3'-Ende der ersten Domäne gesetzt, um die p.DOM-CEA-Peptidvakzine zu bilden (7). Diese wurde in Mäuse injiziert und die CTL-Aktivität am Tag 14 nach einer In-vitro-Restimulation gemessen. Ein hohes Ausmaß an CTL-Aktivität (13a) wurde mit etwa 20 % IFNγ enthaltenden CD8⁺-T-Zellen (13b) induziert. Der Vergleich, p.DOM-Plasmid alleine, poduzierte eine geringe Menge an CTL-Aktivität und einige wenige (2,4 %) IFNγ-positive CD8⁺-T-Zellen (13b).
Hinweise auf epitope Konkurrenz
Das CEA-Modell diente dazu, die Hypothese zu untersuchen, dass Epitope in der zweiten Domäne von FrC mit gebundenen, aus Tumor stammenden Epitopen konkurrieren. Die CEA-Peptidsequenz wurde an das Carboxylende der Zwei-Domänen-FrC-Sequenz voller Länge gesetzt, um p.FrC-CEA_526-533 zu erzeugen (7). Die Fähigkeit dieses Konstrukts, CEA-spezifische CTL zu induzieren, wurde dann mit jener des Ein-Domänen-p.DOM-CEA_526-533-Konstrukts verglichen, wobei dies mittels einer Injektion und einer In-vitro-Restimulation erfolgte. In wiederholten Versuchen induzierte die Ein-Domänen-Vakzine zwei- bis dreifach höhere Werte an CTL-Aktivität gegen das CEA-Epitop (14a) als das Konstrukt mit dem Zwei-Domänen-FrC (p.FrC-CEA_526-533) (14c). Allerdings konnte das Zwei-Domänen-Konstrukt hohe Werte an CTL-Aktivität gegen das FrC-Peptid induzieren (14d). Dies legt den Schluss nahe, dass der Einschluss potenziell konkurrierender Epitope in der zweiten Domäne von FrC zur Suppression der Induktion von CEA-spezifischer CTL-Aktivität führt.
Zytolytische Aktivität gegen CEA-Peptid ging Hand in Hand mit den Werten an intrazellulärem IFNγ in der CD8⁺-T-Zellen-Population, wobei die p.DOM-CEA_526-533-Vakzine zwei- bis dreifach höhere Werte an 1FNγ-positiven Zellen induzierte als die Zwei-Domänen-Vakzine (15a und 15c). Wie erwartet spiegelte sich die Induktion von hohen Werten an CTL-Aktivität gegen Peptid 1 der zweiten Domäne von FrC in den hohen Werten IFNγ-positiver CD8⁺-T-Zellen wider (15d). Der Ver gleich, p-DOM-Vakzine, produzierte keine signifikante CTL-Aktivität (14b) und sehr geringe Mengen IFNγ-positiver CD8⁺-T-Zellen (15b).
Diese Ergebnisse bestätigen den erwarteten Vorteil der Entfernung der zweiten Domäne von FrC bei der Induktion der Antwort gegen das CEA-Epitop, und sie legen außerdem nahe, dass die p.DOM-Peptid-Konstruktion allgemeine Anwendung im Bereich Tumorantigene finden könnte.
Diskussion
Die erfolgreiche Impfung gegen Krebs erfordert wahrscheinlich die Aktivierung mehrerer Immunitätswege, einschließlich der CTL. Obwohl DNA-Vakzinen CTL-Reaktionen wirkungsvoll hervorrufen können (36), sind Tumorantigene häufig schwach (12), und möglicherweise fand auch die Deletion hochaffiner CD8⁺-T-Zellen statt. Um CTL zu erzeugen, sollten Kandidatenpeptide durch die APC wirkungsvoll verarbeitet und präsentiert werden, vorzugsweise in Abwesenheit konkurrierender Peptide, die die Antwort aufheben könnten (siehe 20). Die Erfidner untersuchten die CTL-Antworten auf die FrC-Sequenz von Tetanustoxin – zunächst aufgrund ihres Interesses, FrC als Adjuvans-„Fremd"-Sequenz zu verwenden und Immunität gegenüber gebundener scFv-Sequenz zu aktivieren (12).
Unter Verwendung ihrer DNA-scFv-FrC-Vakzinen gegen ein Maus-B-Zellen-Lymphom und -Myelom wird protektive Anti-Id-Immunität unter Beteiligung von Antikörper bzw. CD4⁺-T-Zellen gefördert (13). Es wurden keine CTL-Antworten auf scFv detektiert, was möglicherweise auf ein Fehlen an MHC-Klasse-I-Bidnungsmotiven innerhalb der V-Gene zurückzuführen war. Allerdings wurden CTL gegen zwei Peptidmotive in der zweiten Domäne von FrC induziert (13, 18). Die Antworten waren zwar relativ schwach, aber sie besitzen das Potenzial, mit CTL-Motiven aus gebundenen Tumorsequenzen zu konkurrieren (38). Um das Adjuvanspotenzial von FrC-Sequenz für die Induktion von CTL gegen Kandidatenpeptide zu untersuchen, entfernten die Erfinder die zweite Domäne und ließen die erste Domäne zurück, um für T-Zellen-Hilfe mittels des „universellen" Peptids p30 zu sorgen (24, 34).
Der Betrieb der ersten Domäne (p.DOM) als Adjuvans wurde dann unter Einsatz der zwei Peptidmotive aus der zweiten verworfenen Domäne getestet. Die Umpositionierung an den C-Terminus von p.DOM bewirkte eine auffällige Steigerung von CTL gegen jedes Peptid. Die Erfinder hatten bereits zuvor festgestellt, dass CTL gegen FrC wirkungsvoller induziert werden, wenn die Leadersequenz vorhanden ist (18), und deshalb sahen sie den Leader in allen der hierin beschriebenen Konstruktionen vor. Das Vorsehen der Leadersequenz sollte sicherstellen, dass alle Konstrukte von mehr als etwa 60 Aminosäuren co-translational in das ER transportiert werden. Der Effekt der Umpositionierung kann dann die „C-Ende-Regel" widerspiegeln, wonach antigene Peptide bevorzugt aus dem C-Terminus von Vorläuferpeptiden oder -proteinen an der ER-Stelle produziert werden (39). Dies könnte auch für den indirekten Transfer von Peptiden von Muskel in APC über Wärmeschockproteine wie z.B. gp96 oder Calreticulin von Relevanz sein, die sich normalerweise im ER befinden (40).
Der zweite Untersuchungsgegenstand betraf die Bewertung des Beitrags von p.DOM zur Induktion von CTL gegen gebundene Peptidsequenzen. In einem Modellsystem konnte eine DNA-Vakzine, die für das immunogene K^b-restringierte Epitop von OVA kodiert (SIINFEKL), das an die benachbarte I-A^b-restringierte Helfer-Peptidsequenz fusioniert ist, CTL induzieren (34). Dies zeigt an, dass ein Helferepitop und ein CTL-Epitop die einzigen Anforderungen sein können. In diesem konkreten Fall war diese Konstruktion nicht ausreichend, da ein Fusions-Gen, das für die „universelle" Helferpeptidsequenz kodiert, die an eines der CTL-Epitope fusioniert ist, nur ein geringes Ausmaß an CTL-Aktivität bewirkte. Dies kann auf die relative Schwäche der aus FrC abgeleiteten Peptide im Vergleich zum OVA-Peptid zurückzuführen sein, kann aber auch auf ein Problem für Tumorantigene hinweisen. Eine weitere Möglichkeit betrifft den wichtigen Beitrag der Leadersequenz zur immunologischen Wirksamkeit dieser DNA-Vakzine. Die Zufuhr kürzerer Konstrukte zum ER ist möglicherweise unzulänglich, da diese vom post-translationalen und nicht vom co-translationalen Transport abhängen (41), der weniger wirkungsvoll ist und daher zu weniger effizientem Primen führen kann. Es ist trotzdem wahrscheinlich, dass zusätzliche Sequenzen in p.DOM entweder mehr T-Zellen-Hilfe bereitstellen oder zur Peptidpräsentation durch andere Mechanismen beitragen. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die 25-kD-Domäne die Menge des gebundenen Peptids erhöht, indem sie es vor Abbau im Cytosol schützt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die Gegenwart von falsch gefalteter FrC-Domäne im ER die Ladung befestigter Peptide auf Wärmeschockproteine für das Querprimen beeinflusst (42).
Die Erkenntnis, dass p.DOM-Peptid 1 eine rasche CD8⁺-T-Zellen-medüerte protektive Immunität gegen den EL4-FrC-Tumor aktiviert und wirksamer zu sein scheint als die Vakzine mit dem FrC voller Länge (p.FrC), zeigt zwei für die Krebstherapie relevante Merkmale auf. Das erste besagt, dass die Umpositionierung den Wirkungsgrad einer Vakzine steigern kann, die Peptid-spezifische CTL induzieren soll. Natürlich muss das ausgewählte Peptid auch durch die Tumorzelle präsentiert werden, doch die für die Effektorzellen-Erkennung erforderlichen Werte können niedrig sein (20). Das zweite besagt, dass p.DOM aktivierende Signale liefern kann, die für DNA-Vakzinen gegen schwache Peptidantigene erforderlich sind. Interessanterweise befinden sich vier von sechs Kandidaten-HLA-A2-Bindungsmotive auch in der zweiten Domäne von FrC, und frühere Studien haben gezeigt, dass die höchsten funktionellen Mengen auch in dieser Sequenz vorliegen (unveröffentlichte Beobachtungen). Die Daten der Erfinder – erhoben mittels der bekannten aus CEA stammenden Peptidsequenz – zeigen, dass die p.DOM-Peptid-Konstruktion auf andere Krebsantigene anwendbar ist. Unter Verwendung dieses Modells war es auch möglich, den Vorteil der Entfernung der zweiten Domäne von FrC aufzuzeigen, da potenziell kompetitive Epitope innerhalb dieser Domäne in der Lage waren, die Induktion von CEAspezifischen CTL zu unterdrücken. Diese Erkenntnis bestätigt das dieser Konstruktion zugrundeliegende Prinzip. Die Tatsache, dass das erste Kandidatenpeptid aus CEA rasch zahlreiche CTL aus diesem Format erzeugt, ist ermutigend, und die Ergebnisse belegen, dass die p.DOM-Strategie für Humanvakzinen von Relevanz ist.
Materialien und Verfahren
Konstruktion von DNA-Vakzinen
Die Konstruktion der DNA-Vakzine (p.FrC), umfassend das Gen, das für die Zwei-Domänen-Sequenz voller Länge von FrC kodiert [Aminosäuren 865-1216 von Tetanustoxin (TT₈₆₅-₁₃₁₆)]. mit einer Leadersequenz aus dem V_H des IgM des BCL₁-Tumors wurde bereits in der Literatur beschrieben (25, 26). Die DNA-Vakzine, umfassend das für die erste Domäne kodierende Gen (p.DOM) (21), wurde durch PCR-Amplifikation der Amino-terminalen Domänensequenz (TT_865-1120) aus p.FrC unter Verwendung der Vorwärts- und Rückwärtsprimer FrCf1 bzw. FrCr1 (Tabelle 1) vor dem Klonieren in pcDNA3 konstruiert. Dieses Plasmid diente dann als Templat für die Konstruktion von drei ähnlichen Vakzinen, von denen jedes die erste Domäne enthält – allerdings mit einer unterscheidbaren CTL-Epitopsequenz, die an einen Carboxylterminus fusioniert ist. Die Assemblierung von p.DOM-Peptid 1 (kodiert für das TT_1287-1294-Peptid), p-DOM-Peptid 2 (kodiert für das TT_1162-1169-Peptid) oder p.DOM-CEA (kodiert für das CEA_526-533-Peptid) war identisch mit jener von p.DOM alleine, außer dass in jedem Fall ein unterschiedlicher Rückwärtsprimer verwendet wurde (FrCr2, FrCr3 bzw. FrCr4), der mit der p.DOM-Carboxylsequenz überlappte und die CTL-Epitopsequenz von Interesse inkorporierte. Die DNA-Vakzine p.FrC-CEA_526-533 wurde durch PCR-Amplifikation der FrC-Sequenz voller Länge unter Einsatz des Vorwärtsprimers FCf1 gemeinsam mit dem Primer FCr5 konstruiert, der mit der 3'-Sequenz von FrC überlappt und für das CEA-CTL-Epitop (CEA_526-533) kodiert, wodurch die Fusion an den Carboxylterminus von FrC entsteht. Das PCR-Produkt wurde anschließend in pcDNA3 kloniert.
p.p30-Peptid 1 wurde durch Verbinden der für das CTL-Epitop TT_1287-1294 kodierenden DNA-Sequenz mit jener, die für ein „universelles" T-Helfer-Epitop kodiert (p30; TT_947-967; befindet sich in der ersten Domäne von FrC), assembliert (24). Es kam dabei eine aus drei Schritten bestehende PCR-Konstruktionstechnik zur Anwendung: Zunächst wurde die BCL₁-Leadersequenz aus p.FrC unter Verwendung des Vorwärtsprimers PCMVf1 gemeinsam mit dem Rückwärtsprimer BCL₁r1, umfassend die überlappende p30-Sequenz, amplifiziert. Zweitens wurde p30 aus p.FrC mit dem Vorwärtsprimer p30f1 und dem Rückwärtsprimer p30r1, umfassend einen Überhang, der für das CTL-Epitop TT_1287-1294 kodiert, amplifiziert. Drittens wurden diese zwei gelgereinigten PCR-Produkte durch PCR-Soeing unter Einsatz von Primern PCMVf1 und p30r1 kombiniert und assembliert. Die Vakzine p.p30-Peptid 2 wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung des Rückwärtsprimers p30r2, umfassend einen für das CTL-Epitop TT_1162-1169 kodierenden Überhang, assembliert. Alle assemblierten Vakzinen-PCr-Produkte wurden in den Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) unter Verwendung von Hindlll- und Notl-Restriktionsstellen ligiert. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Strukturen der DNA-Vakzinen sind aus 7 ersichtlich. Die Integrität aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzieren bestätigt. Die Expression und die Größe wurden in vitro mithilfe des „TNT^R T7 Coupled Reticulocyte Lysate System" (Promega Corp., Madison, WI, USA) überprüft. Die Expression in Säugetierzellen wurde durch Transfizieren von COS-Zellen und Messen von FrC-enthaltendem Protein im Überstand durch ELISA untersucht (12).
Peptide
Fragment-C- (FrC-) Peptide wurden innerhalb des Unternehmens auf einem Shimadzu-PSSM8-Peptidsynthetisierer unter Anwendung von Fmoc-Chemie synthetisiert, und die Reinheit wurde mittels HPLC überprüft.
Konzentrationen wurden durch einen kolorimetrischen Test (BCA; Pierce, Rockford, IL, USA) gemessen. Die Koordinaten für die H-2^b-restringierten FrC-CTL-Epitop-Sequenzen TT_1287-1294 (SNWYFNHL: Peptid 1) und TT_1162-1169 (LNIYYRRL: Peptid 2) entsprechen der kompletten Tetanustoxin- (TT-) Sequenz. Das CEA_526-533Peptid (EAQNTTYL) wurde bereits in der Literatur beschrieben (27, 28). Es wurde kommerziell synthetisiert und mit einer Reinheit von > 95 % ausgeliefert (Peptide Protein Research Ltd., Southampton, Großbritannien).
Peptidbindungstest
Die Bindung jedes Peptids an H2-K^b erfolgte unter Einsatz des bereits in der Literatur beschriebenen Konstruktionstests (29). Dieser Test beruht auf der Beobachtung, dass in einem Detergenslysat von RMA-S-Zellen K^b-Moleküle instabil sind und nach der Inkubation über Nacht bei 4°C dissoziieren, sofern nicht ein stabilisierendes (K^b-bindendes) Peptid zum Zeitpunkt der Lyse zugesetzt wird. Nur stabilisierte K^b-Moleküle können daher durch Immunfällung mit mAb Y3 nach über Nacht erfolgender Inkubation gewonnen werden. Die Menge an gewonnenem K^b ist direkt proportional zur Menge an gebundenem Peptid, und die Peptidkonzentration, die erforderlich ist, um 50 % maximale Gewinnung zu erzielen, stellt eine ungefähre Bindungsaffinität dar (29). Die Gewinnung von H2-K^b-Schwerketten (HC) wurde nach Immunfällung und SDS-PAGE unter Verwendung von AIDA (Fuji) quantifiziert.
Impfungsarbeitsvorschrift und CTL-Test
In den Labors der Erfinder gezüchtete C57BL/6-Mäuse wurden in einem Alter von 6-10 Wochen mit 50 μg DNA in normaler Salzlösung geimpft, die an zwei Stellen in den Quadrizepsmuskel injiziert wurde. Zur Messung von CTL-Antworten wurden die Mäuse am Tag 14 euthanasiert. Den geimpften Mäusen wurde die Milz entnommen, und Einzelzellsuspensionen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % wärmeinaktiviertem FCS (Life Technologies, Paisley, Großbritannien), 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren (1 % 100 × Stammlösung), 25 mM HEPES-Puffer und 50 μM 2-Mercaptoethanol, gebildet. Splenozyten wurden in 40 ml Medium mit 3×10⁶ Zellen/ml resuspendiert und zu 80-cm²-Kolben gemeinsam mit rekombinantem Human-IL-2 (20 U/ml, Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) und Peptid (5-20 μM) zugesetzt. T-Zell-Kulturen wurden 7 Tage später in 24-Well-Platten restimuliert. T-Zellen (5×10⁵/Well) wurden mit bestrahlten syngenen „Nähr"-Splenozyten (5×10⁶/Well) gemeinsam mit rIL-2 (20 U/ml) und Peptid (5ö20 μM) vermischt. Die zytolytische Aktivität der T-Zell-Kulturen wurde 6 Tage nach einer Invitro-Stimulation durch herkömmliche 4-5 Tage dauernde ⁵¹Cr-Freisetzungstests bewertet, wie dies bereits beschrieben wurde (18). Für die angezeigten Experimente war eine weitere In-vitro-Stimulation vorgesehen. Die Zielzellen waren EL4-Zellen (ATCC; TIB 39), inkubiert mit einem Test- oder Vergleichspeptid, EL4-Zellen alleine oder transfizierte EL4-Zellen (siehe unten). Spezifische Lyse wurde durch die Standardformel berechnet ([Freisetzung durch CTL – Freisetzung durch Ziele alleine]/[Freisetzung durch 4 % NP40 – Freisetzung durch Ziele alleine]×100 %). Die spontane Freisetzung durch die Ziele alleine machte durchwegs weniger als 20 % der Freisetzung durch 4 % NP40 aus.
Intrazellulärer γ-IFN-Test
Lebensfähige Zellen wurden durch Dichtezentrifugation (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) ausgewählt. T-Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37°C in 96U-Wellplatten mit 5×10⁵ Zellen/Well gemeinsam mit 10 U/Well rIL-2, 1 μM Peptid und 1 μl/Well Golgiplug (PharMingen) inkubiert. Die Zellen wurden vor der Markierung mit 1 μg/Well FITC Anti-Maus-CD8b.2 (Ly-3,2, Klon 53-5.8, PharMingen) mit 2 % dekomplmentiertem Mäuseserum (15 Minuten, 4 °C) oder mit einem Isotypvergleich (20 Minuten, 4 °C) blockiert. Nach der Oberflächenmarkierung wurden die Zellen mit 1 % Formaldehyd fixiert (20 Minuten, 4 °C) und dann mit 0,5 % Saponin permeabilisiert (10 Minuten, 4 °C), bevor die intrazelluläre Markierung mit 0,5 μg/Well PE-Ratten-Anti-Maus-γ-IFN (Klon XMG1.2, PharMingen) 20 Minuten lang bei 4 °C stattfand. Nach einer letzten Waschung wurden die Zellen in PBS resuspendiert und sofort durch FACScalibur unter Verwendung der CELLQUEST-Software (Becton Dickinson) analysiert.
Tumorziele
Die Erfinder erzeugten ein Tumormodell, das aus EL4-Tumorzellen bestand, in die sie ein für eine nicht-sekretierte (Leader-lose) Form von FrC kodierendes Plasmid transfizierten (18). Zusammenfassend gesagt wurden 2×10⁶ Zellen in 400 μl Medium mit 10 μg Plasmid-DNA vermischt und bei 300 V, 975 μF elektroporiert (Gene Pulser Cuvette, 0,4 cm Elektrodenabstand, BioRad). Die Zellen wurden in Gegenwart eines selektiven Antibiotikums (Geneticin, 2 mg/ml, Life Technologies Ltd.) gezüchtet und nach der Wiederherstellung einer stabilen Population kloniert und auf Empfindlichkeit für Lyse durch FrC-spezifische CTL untersucht. Dies führte zum Entstehen der Tumorzelllinie EL4-FrC.
Tumorexposition
C57BL/6-Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 1×10⁵ EL4-FrC-Transfektanten oder mit leerem Vektor (pcDNA3) transfizierten EL4-Zellen in die rechte Flanke exponiert. Die Mäuse wurden euthanasiert, als der resultierende Tumor einen Durchmesser von 1,5 cm erreichte – dies erfolgte in Einklang mit den vom „UK Coordinating Committee for Cancer Research" in London ausgearbeiteten „Human Endpoint Guidelines" -, und der Tag des Todes wurde aufgezeichnet. Zellabreicherungsversuche erfolgten in vivo durch intraperitoneale Injektion von 100 μg Ig [Ratten-Anti-Maus-CD8, YTS 169.4.2.1, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. S. Cobbold (30)] alle 2-3 Tage 14 Tage lang, beginnend eine Woche vor der Tumorexposition.
Die hierin beschriebenen Versuche wurden auch in einem anderen Mausstamm (Balb/C) durchgeführt; dabei wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.
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Tabelle 1: Bei der Assemblierung von Vakzinenkonstrukten verwendete Oligonucleotidprimer (5'-3')
Die Restriktionsenzymstellen sind unterstrichen.

Claims

Nucleinsäurekonstrukt für die Zufuhr in Lebendzellen in vivo, um eine Immunantwort in einem Patienten auf ein Erkrankungspeptidantigen zu induzieren; wobei das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins steuert, das aus dem Erkrankungspeptidantigen und der N-terminalen Domäne von Fragment C (FrC) aus Tetanustoxin besteht.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, worin das Erkrankungspeptidantigen ein Tumorantigen ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Erkrankungspeptidantigen eine idiotypische Determinante ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3, worin die idiotypische Determinante ein einkettiges variables Fragment (ScFv-Fragment) ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Erkrankungspeptidantigen zwischen 5 und 30 Aminosäuren aufweist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 5, worin das Erkrankungspeptidantigen zwischen 8 und 25 Aminosäuren aufweist.
Nucleinsäurekonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Fusionsprotein an eine Leadersequenz gebunden ist, die in der Lage ist, das Fusionsprotein auf das endoplasmatische Retikulum zu richten.
Nucleinsäure-Expressionsvektor, der ein Nucleinsäurekonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche umfasst.
Wirtszelle, umfassend einen Nucleinsäure-Expressionsvektor nach Anspruch 8 oder ein Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Nucleinsäure-Vakzine zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einen Nucleinsäure-Expressionsvektor nach Anspruch 8.
Verfahren zur Herstellung eines Nucieinsäurekonstrukts zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten, umfassend (a) die Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Erkrankungspeptidantigen kodiert; (b) das Klonieren der Nucleinsäuresequenz, die für das Erkrankungspeptidantigen kodiert; und (c) das Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor die Expression des Erkrankungspeptidantigens als eine Fusion mit der ersten Domäne von FrC aus Tetanustoxin ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Vektor weiters eine Leadersequenz zur Assoziation mit dem Fusionsprotein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, weiters umfassend den Schritt des Isolierens eines Nucleinsäurekonstrukts aus dem Vektor, wobei das Nucleinsäurekonstrukt die Expression des Fusionsproteins, das aus der ersten Domäne von FrC aus Tetanustoxin und dem Erkrankungspeptidantigen besteht, steuert.
Verfahren nach Anspruch 13, weiters umfassend den Schritt der Herstellung einer Vakzinezusammensetzung, die das Nucleinsäurekonstrukt umfasst.
Verwendung eines Nucleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Nucleinsäure-Expressionsvektors nach Anspruch 8 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 15, worin das Medikament zur direkten Verabreichung in Muskelzellen des Patienten formuliert wird.
Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen physiologisch annehmbaren Verdünner oder Träger.
Zusammensetzung, umfassend einen Nucleinsäure-Expressionsvektor nach Anspruch 8 und einen physiologisch annehmbaren Verdünner oder Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin der Vektor weiters die Expression von immunmodulierenden Polypeptiden steuert.