DE60121462T2

DE60121462T2 - Nukleinsäureimpfstoff bestehend aus einem fusionsprotein, dass eine adjuvanssequenz von einem planzenvirushüllprotein aufweist

Info

Publication number: DE60121462T2
Application number: DE60121462T
Authority: DE
Inventors: c/o Molecular Immunology Group Natalia Tremona Road SAVELYEVA; c/o Molecular Immunology Group Freda Tremona Road STEVENSON
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2021-11-21
Also published as: US7179471B2; AU2002223860A1; EP1337553B1; EP1337553A2; WO2002040513A2; ES2267863T3; US7410643B2; US20040072781A1; PT1337553E; US20070128220A1; DK1337553T3; ATE332920T1; WO2002040513A9; DE60121462D1; GB0028319D0; WO2002040513A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Individuum und neue Zusammensetzungen zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen. Insbesondere – aber nicht ausschließlich – betrifft die vorliegende Erfindung virale pflanzliche Hüllproteine als Adjuvanssequenzen zur Induktion einer Immunantwort.
Hintergrund der Erfindung
Die auf Zelloberflächen-Immunglobulin (Ig) von B-Zell-Lymphomen exprimierten idiotypischen Determinanten können als Tumor-assoziierte Antigene dienen (ein Überblick darüber findet sich bei George und Stevenson, 1989). Als solche stellen sie ein attraktives Therapieziel dar, insbesondere für die Verabreichung von passivem antiidiotypischem Antikörper an Patienten [Miller et al., New Engl. J. Med. 306, 517–522 (1982)]. Murine monoklonale Antikörper (MAbs) gegen idiotypische Determinanten auf Non-Hodgkin-B-Zell-Lymphomen (NHCL) haben sich in therapeutischen Humanversuchen als begrenzt nützlich erwiesen. Es wurden Teil- und Vollantworten beobachtet, doch die murinen MAbs neigen dazu, Human-Effektorfunktionen ineffizient zu rekrutieren, und sind selbst das Ziel einer Human-Anti-Maus-Antikörperantwort. Ferner wurden in Folge von Therapie Auswüchse Ig-negativer Oberflächen-Lymphomzellen beobachtet [Levy et al., J. Immunol. Rev. 96, 43 (1987); Bahler und Levy, PNAS 89, 6770-6774 (1992)], obwohl der komplette Verlust an Ig-Expression selten ist [Meeker et al., New Engl. J. Med. 312, 1658–1665 (1985); Zelentz et al., Ann. Oncol. 2, 115–122 (1990)]. Angesichts dieser Einschränkungen sowie der Kosten und des Aufwands, die mit der Erzeugung von MAbs für einzelne Patienten verbunden sind, wurde diese Vorgangsweise nicht allzu oft gewählt. Allerdings liegt es auf der Hand, dass antiidiotypische Antikörper in Lymphomen therapeutisches Potenzial besitzen.
Eine Alternative zu passiver antiidiotypischer Serotherapie ist aktive Immunisierung, die darauf abzielt, Toleranz zu brechen und eine starke antiidiotypische Antikörper antwort im Patienten hervorzurufen bzw. zu induzieren. Da die Antwort polyklonal ist, ist es für die Ziel-B-Zelle schwieriger, der Selektion zu entkommen, und außerdem ist die Antwort kontinuierlich vorhanden, wodurch sie möglicherweise dazu imstande ist, eine Resterkrankung einzudämmen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt darin, dass sie das Potenzial hat, eine T-Zellen-vermittelte Immunantwort gegen das Lymphom zu stimulieren. Bemühungen, Tumorimmunität unter Verwendung modifizierter Tumorzellvakzinen zu stimulieren, waren bislang nur eingeschränkt erfolgreich, doch die aktive Immunisierung mit idiotypischem Ig vor der Tumorprovokation erwies sich bei der Suppression von B-Zell-Modelltumoren als wirksam [Stevenson und Gordon, J. Immunol. 130, 970–973 (1983); George et al., J. Immunol. 138, 628–634 (1987); Campbell et al., J. Immunol. 139, 2825–2833 (1987)], und zwar in Tieren und zur Behandlung von Tieren, die beginnende Tumoren in sich tragen [George et al., J. Immunol. 141, 2168–2174 (1988)]. Außerdem wurde idiotypische Immunisierung mit Human-Ig, isoliert aus Patienten mit Lymphom, mit Langzeit-Tumorregression assoziiert [Kwak et al., New Engl. J.Med. 327, 1209–1215 (1992)].
Das Problem besteht darin, wie das Antigen (der idiotypische Antikörper) am besten zu präsentieren ist, damit Toleranz gebrochen und eine wirksame Anti-Lymphom-Immunantwort stimuliert wird – dies bleibt nach wie vor eine Herausforderung. Außerdem stellt für Lymphome, die wenig Ig sekretieren, die Herstellung des Idiotyps ein großes Problem dar. Um ausreichend idiotypischen Antikörper für die Immunisierung zu bilden, müssen Heterohybridome durch Fusion mit Mauszelllinien hergestellt und der Antikörper anschließend gereinigt werden [Carroil et al., J. Immunol. Methods 89, 61–67 (1985)]. Die Ausbeute ist allerdings häufig gering, und es muss danach bestätigt werden, dass die Fusion vom Human-B-Zelltumor abstammt.
Dieses Problem konnte nun gelöst werden: Die Anwendung von DNA-Rekombinationstechnologie ermöglicht es, dass die V_H- und V_L-Gene, die für die idiotypische Determinante kodieren, durch PCR und Sequenzieren problemlos in Biopsiematerial aus Patienten identifiziert werden [Hawkins et al., Blood 83, 3279 (1994)]. Diese Gene können als scFv zur Verwendung als DNA-Vakzine zusammengesetzt werden. Dieser Ansatz beruht auf den Daten, die man aus einer Reihe infektiöser Erkrankun gen gewonnen hat; es ist evident, dass für Sequenzen aus Pathogenen kodierende DNA direkt Zellen transfizieren und schützende Immunantworten induzieren kann (Ulmer et al., 1993259, 1745; Davis & Whalen 1995, in: Molecular and Cell Biology of Human Gene Therapeutics, George Dickson (Hrsg.), Chapman & Hall, S. 368).
In früheren Arbeiten wurden in einem Mausmodell für Lymphome die V-Gene des Tumoridiotops kloniert und als Leicht- und Schwerketten-Fusionsproteine in Bakterien exprimiert. Die getrennten Ketten dienten dann als Immunogene. Allerdings waren die getrennten Ketten denaturiert und wurden jedenfalls nicht coexprimiert, um das Paratop des Antikörpers bereitzustellen. Die Autoren stellten fest, dass "zukünftige Arbeiten mit Peptiden mit fixen Konfigurationen, die Epitopen im nativen Protein ähneln, nützlich sein könnten, das Gleiche trifft auf die Co-Expression sowohl von V_H- als auch von V_L-Genen in Bakterien zu, um ein rekombinantes Fv-Protein zu produzieren" [Campbell et al., s.o. (1987)]. Die Autoren legen aber nicht dar, wie die V-Gene des Idiotops zu isolieren und wie die rekombinanten Fv-Fragmente zu einer Vakzine zu kombinieren sind.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung zeigten bereits, dass Nucleinsäurekonstrukte hergestellt werden können, die man in vivo Lebendzellen zuführen kann und die anschließend eine Immunantwort gegen eine idiotypische Determinante auf einer malignen B-Zelle induzieren können. Das Konstrukt kodiert für ein Fusionsprotein, das die idiotypische Determinante und Tetanustoxoid-Fragment C (FrC) umfasst. Die Anmelder zeigten bereits konkret, dass genetische Fusion eines Lymphoms oder eines Myelom-assoziierten Antigens mit dem Adjuvanssequenz-FrC von Tetanustoxin protektive Immunität in Mäusen gegenüber Provokation mit Lymphom oder Myelom induziert (bei Verwendung als DNA-Vakzine).
Allerdings ist die Humanpopulation infolge von Impfung mit Tetanustoxoid immun gegenüber FrC. Daher funktioniert bei Verwendung einer FrC-basierten Vakzine in Patienten dies im Falle bereits existierender Immunität gegenüber FrC. Bislang stellten die Erfinder fest, dass bereits existierende Antikörper die Antwort gegen die DNA- Vakzine nicht reduzieren. Allerdings ist es möglich, dass unterschiedliche Immunwege in einer derartigen Situation aktiviert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Angesichts der oben geschilderten Situation erkannten die Erfinder, dass die Notwendigkeit besteht, neue Adjuvanssequenzen bereitzustellen, die potenzielle Probleme in Zusammenhang mit bereits existierender Immunität gegenüber dem C-Fragment von Tetanustoxoid lösen.
Pflanzliche virale Hüllproteine sind hochimmunogene Moleküle, wenn man sie in Säugetiere injiziert. Sie werden, zusammengesetzt zu viralen Teilchen, als Proteinvakzinen verwendet, um Epitope aus infektiösen Erregern zu präsentieren [Brennan, F.R. et al., Vaccine 17, 1846–1857 (1999)]. Solche Vakzinen können große Mengen an neutralisierenden Antikörpern und in einigen Fällen Schutz gegenüber Provokation mit dem Pathogen induzieren [Haynes, J.R. et al., Bio/Technology 4, 637–641 (1986); Turpen, T.H. et al., Bio/Technology 13, 53–57 (1995)]. Kartoffelvirus X (PVX) diente dazu, ein funktionelles einkettiges Antikörperfragment als Fusion mit PVX-Hüllprotein systemisch Pflanzen zuzuführen [Smolenska, L. et al., FEBS Letters 441, 379–382 (1998)]. Allerdings wurden die PVX-Hüllprotein-basierten Fusionen nie als DNA den Säugetierzellen zugeführt. Für die DNA-Zufuhr wurde Tabak-Mosaikvirus-Hüllprotein verwendet, um Antikörper gegen sich selbst zu bilden [Hinrichs, J. et al., Journal of Virological Methods 66, 195–202 (1997)], doch es wurde nicht als Teil einer Fusion verwendet, um eine Immunantwort gegen ein oder mehrere andere Mitglieder des Fusionskonstrukts zu induzieren.
Die Anmelder steltlen fest, dass das Kartoffelvirus-X-Hüllprotein (PVXCP) als Adjuvans bei der Konstruktion eines DNA-Vakzins zur Induktion protektiver Immunität überraschend gut funktioniert. Genauer gesagt nahmen die Erfinder eine genetische Fusion von PVXCP mit einem Lymphom-assoziierten Antigen (scFv-A31) vor und verwendeten das Konstrukt zur DNA-Impfung von Mäusen. Dies führte zu erhöhten Antikörperantworten und zum Schutz vor Provokation mit A31-Lymphom (siehe Bei spiel 4, 14a). Die Anmelder belegten überdies, dass dieser Schutz sowohl vom Antikörper gegen scFv-A31 als auch von CD4-positiven Zellen vermittelt wurde. Dies steht im Gegensatz zur DNA-Impfung unter Verwendung der Fusion von FrC mit scFv-A31, wo ein solcher Schutz nur durch den Antikörper gegen scFv vermittelt wird. Diese Erkenntnis könnte unter Berücksichtigung der zu behandelnden Krankheit von Bedeutung sein, z.B. wenn der Wirkungsgrad der Behandlung von einer zellulären Reaktion und nicht von einer Antikörperreaktion abhängt.
Die Erfinder fusionierten auch ein Myelom-spezifisches Antigen, scFv-5T33, mit PVXCP. Dieses Konstrukt diente dann zur Impfung von Mäusen. Diese Impfung führte zur Induktion von Antikörperantworten gegen scFv-5T33 und zum Schutz vor Provokation mit 5T33-Myelon (siehe Beispiel 4, 14b). Die Erfinder bestimmten überdies, dass in diesem Beispiel der Schutz vor Myelom durch CD4-positive T-Zellen vermittelt wird.
Somit zeigten die Anmelder überraschenderweise auf, dass das pflanzliche virale Hüllprotein PVXCP als Adjuvans bei der Induktion protektiver Immunität gegenüber Tumorzellen, z.B. Lymphom oder Myelom, fungieren kann.
In einem ersten Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäurekonstrukt zur In-vivo-Zufuhr in Lebendzellen zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten gegen ein Antigen, wobei das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins steuert und das Fusionsprotein das Antigen und das Adjuvans umfasst, worin das Adjuvans PVXCP ist.
In einer Ausführungsform stammt das Antigen der Erfindung aus einem Pathogen, z.B. einem Virus (z.B. Herpes-simplex-Virus, Human-Immunschwächevirus usw.) oder einem Bakterium (z.B. Staphylococcus, Salmonella usw.). Allerdings erkannten die Anmelder, dass sich die Erfindung besonders eignet, wenn das Antigen ein Eigen- oder verändertes Eigenpolypeptid ist oder von einem Eigen- oder veränderten Eigenpolypeptid abstammt. Das Eigen- oder veränderte Eigenpolypeptid kann mit einer Autoimmunkrankheit oder einer Krebsart assoziiert sein. In Bezug auf Krebs ist das Eigen- oder veränderte Eigenpolypeptid ein Tumor-assoziiertes Antigen wie z.B. eine idiotypische Determinante einer Lymphozytenmalignität.
Somit bietet in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung ein Nucleinsäurekonstrukt zur In-vivo-Zufuhr in Lebendzellen zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten gegen ein Eigen- oder verändertes Eigenpolypeptid, wobei das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins steuert, wobei das Fusionsprotein das Eigen- oder veränderte Eigenpolypeptid und ein Adjuvans umfasst, worin das Adjuvans PVXCP ist.
Vorzugsweise fördert das Adjuvans bei Verabreichung an einen Patienten eine Helfer-T-Zellantwort. Noch bevorzugter umfasst das Adjuvans zumindest ein T-Helferzellepitop.
Vorzugsweise umfasst das Fusionsprotein eine Vielzahl an PVXCP-Epitopen (sowohl B- als auch T-Zellen). Typischerweise befindet sich das PVXCP auf der Carboxyseite des Antigens.
Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig, dass die Zusammensetzung, Nucleinsäure- (DNA-) Vakzinen und Verfahren der Erfindung dazu dienen können, die Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen entweder zu steigern oder zu unterdrücken. Wenn das Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen ist, ist es klarerweise wünschenswert, die Immunantwort gegen das Antigen zu steigern, um das Tumorwachstum aufzuhalten oder einzudämmen. Die Steigerung der Immunantwort ist ein bevorzugter Aspekt der Erfindung; vorzugsweise betrifft die Steigerung Tumorassoziierte Antigene im Allgemeinen, aber insbesondere idiotypische Determinanten im auf der Oberfläche von B-Zellmalignitäten exprimierten Ig, idiotypische Determinanten von auf der Oberfläche von T-Zellmalignitäten exprimierten T-Zellrezeptoren (TCR), auf der Tumoroberfläche exprimierte mutierte Onkogene oder andere Eigenpolypeptide sowie onkofötale Antigene.
Aus praktischen Gründen erläutert die nun folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung idiotypische Determinanten. Es ist aber für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig, dass diese ebenso auf Antigen anwendbar ist, z.B. auf Antigen aus Pathogenen wie etwa Viren oder Bakterien, auf Eigen- oder veränderte Eigenpolypeptide und insbesondere auf Tumor-assoziiertes Antigen.
Die idiotypische Determinante ist vorzugsweise im Fusionsprotein in im Wesentlichen der gleichen Konformation vorhanden wie auf der Oberfläche maligner B-Zellen des Patienten; auf diese Weise wird der Wirkungsgrad der durch das Fusionsprotein induzierten antiidiotypischen Immunantwort optimiert. Die Optimierung des Wirkungsgrads der Immunantwort kann günstigerweise durch Expression der idiotypischen Determinante innerhalb des Kontexts eines Abschnitts eines Immunglobulin- (Ig-) Moleküls oder Ig-ähnlichen Moleküls erfolgen – ein Beispiel dafür ist einkettiges Fv- (scFv-) Fragment. Das scFv-Fragment eignet sich besonders, da es die notwendigen strukturellen Merkmale der idiotypischen Determinante mit wenigen externen Aminosäureresten aufweist. Allerdings könnten auf Wunsch zusätzliche Aminosäurereste im Fusionsprotein enthalten sein, z.B. eine oder mehrere Konstantdomänen [siehe z.B. Syrengelas et al., Nature Medicine 2, 1038 (1996)]. Auf diese Weise könnte man die idiotypische Determinante im Kontext eines gesamten Ig-Moleküls exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionsprotein mit einer Leadersequenz (die in Humanzellen erkannt wird) exprimiert, die das Fusionsprotein auf das endoplasmatische Retikulum richtet, wo die Leadersequenz vom Fusionsprotein abgespalten wird. Es sind sehr viele zweckmäßige Leadersequenzen bekannt, z.B. die Leadersequenz (etwa jene für V_H1, siehe unten) am 5'-Ende von Human-V-Genen. Die Anmelder stellten fest, dass solche Leadersequenzen die Immunogenität des Fusionsproteins steigern. Im Prinzip übt wahrscheinlich auch jede andere Leadersequenz einen ebenso vorteilhaften Einfluss aus, doch es ist anzunehmen, dass jene, die der natürlichen Ig-ähnlichen Leadersequenz am meisten ähneln, optimal sind.
Aus praktischen Gründen umfasst das Nucleinsäurekonstrukt vorzugsweise eine Reihe von Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen. Insbesondere können eine oder mehrere derartiger Erkennungsstellen 5' von der Sequenz liegen, die für die idiotypische Determinante kodiert (günstigerweise zwischen der optionalen Leadersequenz und der für die idiotypische Detemrinante kodierenden Sequenz); eine oder mehrere Stellen können 3' von der für die idiotypische Determinante kodierenden Sequenz angeordnet sein (günstigerweise zwischen der für die idiotypische Determinante kodierenden Sequenz und dem bzw. den Epitop(en) aus dem PVXCP). Auf diese Weise kann das gleiche Grundkonstrukt problemlos angepasst werden, um unterschiedliche Fusionsproteine zu exprimieren, in denen die idiotypische Determinante verändert sein kann. Somit können für idiotypische Determinanten kodierende Sequenzen aus unterschiedlichen Patienten problemlos in das Konstrukt eingeführt werden.
In einer bestimmten Ausführungsform bietet die Erfindung eine Vakzinennucleinsäure, die dazu dienen kann, eine Immunantwort gegen transformierte Lymphozyten hervorzurufen, die einen idiotypischen Marker aufweisen, wobei die Nucleinsäure für Proteine kodiert, die die variablen Schwer- und Leichtkettenregionen eines antiidiotypischen Antikörpers umfassen, der sich auf der Oberfläche einer malignen Human-B-Zelle befindet.
In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Erhöhung einer Immunantwort gegen ein Antigen, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für das Antigen kodiert;
(b) Klonieren der Nucleinsäuresequenz; und
(c) Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor ermöglicht, dass das Protein als Fusion mit einem Adjuvans exprimiert wird, worin das Adjuvans PVXCP ist.

Das Antigen kann von einem Pathogen abgeleitet sein, z.B. einem Virus oder Bakterium. Allerdings ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Antigen ein Eigen- oder verändertes Eigenpolypeptid, z.B. ein Tumor-assoziiertes Antigen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Behandlung eines Patienten, der an B-Zellmalignität leidet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für eine idiotypische Determinante kodiert, die an den malignen B-Zellen des Patienten vorhanden ist, durch Analyse einer Probe an vom Patienten stammenden Zellen;
(b) Klonieren dieser Nucleinsäuresequenz, die für die idiotypische Determinante kodiert; und
(c) Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor ermöglicht, dass die idiotypische Determinante als Fusion mit einem Adjuvans exprimiert wird, wobei das Adjuvans PVXCP ist.

Vorzugsweise kann das Adjuvans Helfer-T-Zellantworten in vivo fördern. Noch bevorzugter umfasst das Adjuvans zumindest ein T-Helferzellepitop.
Günstigerweise wird die für die idiotypische Determinante kodierende Nucleinsäure aus einer Probe der Patientenzellen mithilfe von PCR kloniert. Es stehen nunmehr zahlreiche geeignete generische PCR-Primer zur Verfügung, die Nucleinsäuresequenzen gewinnen können, die im Wesentlichen für jede idiotypische B-Zelldeterminante kodieren [Hawkins & Winter, Eur. J. immunol. 22, 876 (1992)]. Typischerweise ist die B-Zellmalignität ein Lymphom oder ein Myelom. Im Allgemeinen entspricht das gemäß dem obigen Verfahren hergestellte Nucleinsäurekonstrukt dem ersten Aspekt der Erfindung.
Ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten kann den Schritt der Verabreichung eines Nucleinsäurekonstrukts an den Patienten gemäß dem oben definierten ersten Aspekt der Erfindung umfassen. Vorzugsweise bildet das Nucleinsäurekonstrukt einen Teil eines Nucleinsäure-Expressionsvektors, so dass das Adju vans und das Antigen im Patienten exprimiert werden können. Die Nucleinsäuresequenz kann im Patienten ohne Eindringen in sein Genom exprimiert werden.
Vorzugsweise bildet das Nucleinsäurekonstrukt der Erfindung ein nackte DNA-Vakzine. Eine derartige DNA-Vakzine dient zur Induktion einer Immunantwort gegen das Proteinprodukt, für das die DNA kodiert.
Die DNA-Impfung wurde in der Vergangenheit erfolgreich als Möglichkeit eingesetzt, um eine Immunantwort zu induzieren; siehe z.B. King et al., Nature Medicine 4, 1381 (1998).
Ein Verfahren zum Impfen eines Patienten zum Schutz vor einer infektiösen Krankheit kann die an den Patienten erfolgende Verabreichung eines Nucleinsäurekonstrukts (gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung) in einem physiologisch annehmbaren Medium umfassen, worin das Antigen von einem mit dieser infektiösen Erkrankung assoziierten Pathogen stammt. Das Verfahren kann mit einem Patienten, der an dieser infektiösen Erkrankung leidet, oder mit einem Probanden, der die infektiöse Erkrankung bekommen könnte, durchgeführt werden.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der Krebs hat oder daran erkranken könnte, kann den Schritt der an diesen Patienten erfolgenden Verabreichung eines Nucleinsäurekonstrukts (gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung) in einem physiologisch annehmbaren Medium umfassen, worin das Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen ist, das mit dem Karzinom assoziiert ist. Das Tumor-assoziierte Antigen kann durchaus aus den eigenen Krebszellen des Patienten abgeleitet sein.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an B-Zellmalignität leidet, und/oder ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen kann die an den Patienten erfolgende Verabreichung eines Nucleinsäurekonstrukts gemäß dem oben definierten ersten Aspekt der Erfindung umfassen, um eine Immunantwort gegen die idiotypische Determinante zu induzieren, die auf der Oberfläche der malignen B-Zellen des Patienten vorhanden ist.
B-Zellen-Lymphome oder -Myelome sind die Leiden, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt behandelt werden.
Vorzugsweise wird die für die idiotypische Determinante kodierende Nucleinsäuresequenz aus Proben kloniert, die man aus dem Individuum erhält, dem sie zugeführt wurde. Praktischerweise wird die Nucleinsäuresequenz in nicht enkapsidierter Form (d.h. nicht in ein virales Teilchen oder eine andere Packung eingeschlossen) zugeführt. Die Nucleinsäure kann jedoch mit der äußeren Oberfläche einer Packung oder eines Teilchens verbunden sein (z.B. eines Liposoms oder eines viralen Teilchens) – dies ermöglicht die Rezeptor-vermittelte Zufuhr der Nucleinsäure.
Das Fusionsprotein kann die Expression der idiotypischen Determinante und des PVXCP alleine steuern. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein außerdem weitere immunmodulierende Polypeptidsquenzen, z.B. andere immunogene Fremdproteine, oder Cytokine umfassen. Es kann auch von Vorteil sein, mehrere antigene Fusionspartner zu verwenden, um das theoretisch auftretende Problem zu lösen, dass die Immunantwort gegen die hochimmunogene Gruppe des Fusionsproteins jegliche Antwort gegen die relativ schwache immunogene idiotypische Determinante letzten Endes "übertönt". Andere Hüllproteine oder eingehüllte Viren und immunogene Zelloberflächen- oder sekretierte Proteine aus jedem beliebigen pathogenen Organismus oder jeder beliebigen pathogenen Nicht-Humanspezies können im Fusionsprotein ebenfalls vorhanden sein.
Eine alternative Modifikation besteht darin, das Nucleinsäurekonstrukt solcherart zu konstruieren, dass die Co-Expression der weiteren immunmodulierenden Polypeptide als getrennte Einheiten und nicht als Fusionen mit der idiotypischen Determinante bzw. dem pflanzlichen viralen Hüllproteinepitop ermöglicht wird. Es ist weniger bevorzugt, im Verfahren der Erfindung ein getrenntes Nucleinsäurekonstrukt vorzusehen, um die zusätzlichen immunmodulierenden Polypeptide zu exprimieren.
Es ist bekannt, dass einige Cytokine Aspekte der Antigenpräsentation verbessern, und die direkte Zufuhr von Cytokin-Gene enthaltenden Expressionsvektoren könnte die Vakzinenwirksamkeit erhöhen. Interferon-γ ist ein dafür nützliches Beispiel, da es die Eigenschaft des Hochregulierens der MHC-Expression besitzt [Gaczynska et al., Nature 365, 2, 264–267 (1993)]. Ein weiteres Polypeptid, das durch die Vakzinennucleinsäure exprimiert werden könnte, ist der Granulozyen-Makrophagen-Koloniestimulierende Faktor (GM-CSF). Das relevante Gen könnte auf dem gleichen oder auf einem getrennten Vektor kodiert und die Menge an exprimiertem Polypeptid unabhängig variiert werden.
Ein Vorteil des genetischen Ansatzes zur Impfung besteht darin, dass die Möglichkeit der wirkungsvollen Nutzung des natürlichen Verfahrens der Antigenpräsentation gegeben ist (somit sollte auch eine große Anzahl an Effektorsystemen zum Einsatz kommen). Außerdem sollten die Manipulation und die Verbesserung der erhaltenen Antwort relativ problemlos sein; beispielsweise ist es möglich, den Wirkungsgrad der Präsentation von Antigen den T-Zellen gegenüber zu steigern, indem Moleküle mit costimulierender Aktivität gemeinsam mit dem Immunogen exprimiert werden. Ein wichtiges an der Co-Stimulation beteiligtes Molekül ist B7, das mit durch T-Zellen exprimiertem CD28 in Wechselwirkung tritt, wodurch Zusatzsignale für die T-Zellenaktivierung ausgesendet werden [Galvin et al., J. Immunol. 12, 3802–2808 (1992)]. Es könnten Vektoren konstruiert werden, die sowohl B7 als auch die Einzeldomänen-Fragment-C-Fusion exprimieren. Sequenzen von Maus- und Human-B7 wurden bereits veröffentlicht [Freeman et al., J. Immunol. 8, 2714–2722 (1989)], und die Gene können problemlos mittels PCR kloniert werden.
Die hierin beschriebenen therapeutischen Verfahren können demnach die Zufuhr einer zweiten Nucleinsäuresequenz zum Individuum umfassen, die die Expression eines weiteren immunmodulierenden Polypeptids zum Zwecke der weiteren Modulation der Immunantwort gegen das Erkrankungsantigen steuert. Diese zweite Nucleinsäuresequenz kann auf dem gleichen Nucleinsäuremolekül wie die erste Nucleinsäuresequenz oder auf einem zweiten Nucleinsäuremolekül vorliegen.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind Verfahren zur Einführung von Nucleinsäurekonstrukten in Lebendzellen in vivo allgemein bekannt. Praktischerweise wird die Nucleinsäure einfach als nackte DNA in den Patienten injiziert (typischerweise erfolgt dies intramuskulär); sie liegt als Gemisch mit einem physiologisch annehmbaren Verdünner wie z.B. Salzlösung vor. Details betreffend einige geeignete Verfahren und bevorzugte Ausführungsformen der Verabreichung des Nucleinsäurekonstrukts an einen Patienten finden sich in den US-Patenten 5.580.859 und 5.589.466. Kompliziertere Verfahren des Gen-Transfers sind die Verwendung viraler Vektoren, das Einkapseln der DNA in Liposomen und das Koppeln von DNA an kationische Liposomen oder an die Außenseite von Viren [ein Überblick darüber findet sich in Miller, Nature 357, 45–46 (1992)]. Diese Alternativen besitzen den Vorteil des höheren Transfer-Wirkungsgrads, doch im Vergleich zur direkten Injektion gereinigter Plasmid-DNA sind diese Verfahren etwas komplizierter und auch vom Standpunkt der Sicherheit problematisch.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher eine Zusammensetzung zur Verwendung im Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer B-Zellmalignität leidet, oder ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen in einem Patienten, wobei die Zusammensetzung ein Nucleinsäurekonstrukt enthält, das die Expression eines Fusionsproteins steuert, umfassend eine idiotypische Determinante oder ein Tumor-assoziiertes Antigen auf den malignen B-Zellen des Patienten und PVXCP, gemeinsam mit einem physiologisch annehmbaren Verdünner oder Träger.
In einer konkreten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Isolierung der V-Gene aus den Tumor-B-Zellen, um das Idiotop (und Paratop) des Tumorantikörpers zu exprimieren. Beginnend mit einer Probe von B-Zellen aus dem Patienten werden somit die umgeordneten V-Gene von Schwer- und Leichtketten unter Einsatz von Polymerase-Kettenreaktion und generischer "universeller" Primer amplifiziert [Orlandi et al., PNAS 86, 3833–3837 (1989); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991); siehe auch Tabelle 1, Seq.-ID Nr. 1–48)]. Die amplifizierten V-Gene werden kloniert und dann sequenziert [Sanger et al., PNAS 74, 5463–5467 (1977)]. Jene aus den malignen B-Zellen werden als dominierende wiederholte V_H- und V_L-Gensequenzen identifiziert. In mehreren Patienten war es – sowohl in Bezug auf die Schwer- als auch in Bezug auf die Leichtkette – möglich, eine gemeinsame wiederholte Sequenz zu identifizieren. Die Kombination der Schwer- und der Leichtketten identifiziert das Idiotop des Tumors (Beispiel 1). Im Prinzip wäre es auch möglich, die umgeordneten V-Gene innerhalb der gleichen Zelle zu amplifizieren und zu verbinden [Embleton et al., Nucl. Acids Res. 20, 3831–3837 (1992)], um eine Hauptkombination von verbundenen Schwer- und Leichtkettensequenzen zu identifizieren, die das Idiotop identifizieren, aber hier werden V_H und V_L getrennt identifiziert und dann mittels PCR miteinander verbunden. Die V_H- und V_L-Gene werden für die Expression beider V-Domänen als funktionelles Antikörperfragment zlleu Vektoren kloniert, z.B. als einkettiges Fv-Fragment (siehe unten).
Idealerweise sollte eine Vakzine in der Lage sein, Antigen-spezifische B-Zellen, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und Helfer-T-Zellen zu stimulieren. Die B-Zellen-Stimulation erfordert, dass sich das Zielantigen mit ausreichend hoher Affinität an spezifische Antigenrezeptoren (Oberflächen-Ig) auf der B-Zellen-Oberfläche bindet. Bestimmte mehrwertige Antigene können die B-Zellen-Proliferation direkt, aber häufiger stimulieren, und um für eine wirkungsvolle anamnetische Antwort zu sorgen, sind zusätzliche Signale der Helfer-T-Zellen erforderlich (siehe unten). In der vorliegenden Erfindung wird die T-Zellen-Hilfe durch Exprimieren der idiotypischen Determinante als Fusionsprotein mit PVXCP rekrutiert.
Die T-Zellen-Rezeptoren (TCR) von CTL erkennen spezifische MHC-Klasse-I-assoziierte Peptide auf der Zielzellenoberfläche. Solche Peptide werden im Allgemeinen durch Verarbeitung größerer Polypeptide oder Proteine, die innerhalb der Zielzelle produziert werden, gewonnen. Für die effiziente CTL-Stimulation sollte das Zielantigen demnach intrazellulär in MHC-Klasse-I-exprimierenden Zellen synthetisiert oder verarbeitet werden, die CTL aktivieren können. Das Ausmaß an Expression sollte hoch genug sein, um ausreichend Peptid zu erzeugen, damit jene Eigenpeptide verdrängt werden können, die normalerweise – und unter Umständen mit höherer Affinität – in der MHC-Peptid-Bindungsfurche gebunden werden [Ohno, PNAS 89, 4683–4647 (1992)]. Ähnlich wie Antigen-spezifische B-Zellen erfordern CTL für die Proliferation und gesteigerte zytotoxische Kapazität zusätzliche Signale (in Form von Cyto kinen) nach der Antigenerkennung; diese Signale werden von Helfer-T-Zellen bereitgestellt.
CD4-positive Helfer-T-Zellen treten über ihre singulären TCR mit spezifischen Zelloberflächen-MHC-Klasse-II-assoziierten Peptiden in Wechselwirkung, wobei solche Peptide im Allgemeinen durch proteolytische Spaltung von Proteinantigenen entstehen, die durch spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen (APC) internalisiert sind. Makrophagen, Dendritenzellen und B-Lymphozyten sind unter jenen Zellen, die Antigen auf diese Weise präsentieren können. Somit internalisieren und verarbeiten B-Lymphozyten Antigen, das an ihre Oberflächen-Ig gebunden ist, und präsentieren anschließend MHC-Klasse-II-assoziierte Peptidderivate. Das Oberflächenpeptid erkennende CD4-positive Helfer-T-Zellen können dann verschiedene immunstimulierende Cytokine freisetzen und weitere B-Zellen-Aktivierung, Proliferation und Antikörperproduktion stimulieren. In ähnlicher Weise können an der Stelle einer lokalen Entzündungsreaktion vorhandene Makrophagen phagocytiertes Antigen verarbeiten und die Cytokinfreisetzung durch T-Helferzellen stimulieren, was zu gesteigerter Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität lokal vorhandener CTL führt.
Das Vakzinenantigen sollte daher idealerweise 1) durch die MHC-Klasse-I-positiven Wirtszellen intrazellulär synthetisiert werden, 2) zu Peptiden führen, die bei Präsentation durch Wirtszellen-Klasse-I-MHC eine Untergruppe von Wirts-CTL über ihre TCR stimulieren können, 3) zu Peptiden führen, die bei Anzeige durch Wirtszellen-Klasse-II-MHC eine Untergruppe von Helfer-T-Wirtszellen über ihre TCR stimulieren können, 4) durch Wirts-APC, umfassend sowohl Makrophagen als auch Antigen-spezifische B-Zellen, internalisiert und verarbeitet werden und 5) in seiner nativen Form für die Wechselwirkung mit Wirts-B-Lymphozyten zur Verfügung stehen.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform bietet die Erfindung die Expression der umgeordneten V_H- und V_L-Gene des Idiotops des Tumorantikörpers innerhalb von Säugetierzellen, was die Produktion von Peptiden für die Präsentation auf der Zelloberfläche in Kombination mit Wirts-MHC sowie für die Präsentation (oder Sekretion) des Paratops (als gefaltetes Antikörperfragment) ermöglicht; auf diese Weise wird die Produktion antiidiotypischer Antikörper ausgelöst. Die Antikörperfragmente könnten durch Infektion mit einem rekombinanten Virus, das für die Antikörperfragmente kodiert, in Säugetierzellen eingeführt werden.
Im Prinzip könnten die Antikörperfragmente mit einer Signalsequenz für ihre Sekretion oder Präsentation auf der Oberfläche der infizierten (transfizierten) Zelle versehen sein. Alternativ dazu können die Fragmente mit einem anderen Protein verbunden sein, das auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird, z.B. mit einem viralen Hüllprotein (siehe Beispiel 2). Die Antikörperfragmente (als einkettige Fv-Fragmente) werden in funktioneller Form an dass Hüllprotein eines Virus gebunden präsentiert – ein Indiz dafür, dass sie auch gefaltet und in nativer Form auf der Oberfläche einer infizierten Zeile vorliegen [Russell et al., Nucl. Acids Res. 21, 1081–1085 (1993)].
Die Antikörperfragmente könnten auch unter Einsatz von für die Antikörperfragmente kodierender Nucleinsäure in Säugetierzellen eingeführt werden. Beispielsweise kann ein für ein Fusionsprotein kodierendes Gen zwischen PVXCP und den Antikörperfragmenten dazu dienen, Mäuse durch direkte Injektion zu immunisieren (z.B. subkutan oder intramuskulär).
Es folgt eine Beschreibung von Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren. Weitere Aspekte und Ausführungsformen sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig. Alle hierin erwähnten Publikationen sind durch Verweis hierin aufgenommen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens der PCR-Konstruktion von scFv exprimierender DNA.
2 zeigt die Sequenz von Vektoren zum Exprimieren und Reinigen von idiotypischem scVFv-Immunglobulin.
3 ist eine schematische Darstelung des Verfahrens zur Produktion von Plasmid pNipenv.
4 ist eine schematische Darstellung der Plasmidkonstrukte pNipenv, pSV2 Nipenv, pSV2 Nip stop env und pSV2 BCL env.
5 veranschaulicht die Sequenz eines HindIII-XbaI-Fragments des Vektors pVAC1.
6 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines in Beispiel 3 beschriebenen Immunisierungsexperiments.
7 zeigt die gesamte Sequenz des Vektors pVAC1.
8 veranschaulicht eine pVAC1-Restriktionskarte.
9 ist eine schematische Darstellung der wesentlichen Merkmale von pVAC1.
10 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse eines in Beispiel 3 erläuterten Immunisierungsexperiments.
Die 11a und 11b zeigen die Ergebnisse der in Beispiel 2 erklärten FACS-Analyse.
12 veranschaulicht die Konstruktion von scFv-PVXCP-Fusionen.
Die 13a–13d sind grafische Darstellungen der Werte von Antikörpern, die in einem in Beispiel 4 beschriebenen Experiment produziert werden.
Die 14a und 14b sind grafische Darstellungen des Schutzes gegen Provokation mit dem A31-Lymphom oder dem 5T33-Myelom nach DNA-Impfung.
15 ist eine grafische Darstellung des Schutzes gegen Provokation mit 5T33-Myelom nach Impfung mit fusionierten und getrennten DNA-Sequenzen.
Die 16a und 16b sind grafische Darstellungen des Schutzes gegen Provokation mit A31-Lymphom in Mäusen, die nach Impfung mit monoklonalen Anti-CD4+-Antikörpern behandelt oder nicht behandelt waren.
17 ist eine grafische Darstellung des Schutzes gegen Provokation mit 5T33-Myelom in Mäusen, die nach Impfung mit monoklonalen Anti-CD4+-Antikörpern behandelt oder unbehandelt waren.
Die 18a und 18b zeigen die Ergebnisse der Analyse von scFv5T33-PVXCP- und PVXCP-Proteinen in in Beispiel 4 erläuterten Versuchen (in 18b war die Grenze = 200 nM).
19 zeigt die Ergebnisse eines in Beispiel 5 beschriebenen Versuchs. Die Grafik stellt den Schutz nach Impfung mit p.scFvBCL1-PVXCP dar (drei Mal geimpft und dann mit 5 × 10⁴ BCL1-Zellen provoziert).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Beispiele
Beispiel 1: Identifikation von V-Genen aus Biopsien von B-Zell-Lymphom
Vorbereitung von Biopsiematerial
Biopsieproben stammten aus fünf Patienten mit pathologisch bestätigtem Follikellymphom. Sie wurden im Rahmen von diagnostischen Routineverfahren gewonnen. Die Leichtketten wurden durch Immunhistochemie als κ oder λ identifiziert. Als nichtmaligne Vergleiche dienten ein Darmlymphknoten aus einem Patienten mit Morbus Crohn und eine Milzprobe aus einem Patienten, der sich einer Splenektomie unter zog. Das Biopsiematerial wurde als Einzelzellsuspension gebildet, und die Zellen wurden anschließend gefroren und bei –70 °C gelagert.
DNA-Vorbereitung für PCR
Für PCR wurde die DNA unter Anwendung eines einfachen Proteinase K/Tween 20-Lyseverfahrens gebildet (Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Academic Press Inc. S. 147). Zusammenfassend gesagt wuden die Zellen durch Zentrifugieren 20 Sekunden lang bei 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Die Zellen wurden anschließend zwei Mal mit 1 ml PBS gewaschen, bevor die Resuspension bei etwa 10⁶/ml in K-Puffer (10 mM Tris.Cl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 % Tween 20, 100 mg/ml Proteinase K) und das Inkubieren bei 56 °C 60 Minuten lang erfolgte, um die Zellen zu lysieren und DNA freizusetzen. Die Proteinase K wurde dann durch Inkubation 30 Minuten lang bei 95 °C inaktiviert. So freigesetzte DNA wurde direkt in den PCR-Reaktionen verwendet oder für die spätere Verwendung bei –20 °C gelagert.
PCR-Primer
PCR-Primer wurden konstruiert, um umgeordnete κ-Schwerketten- und λ-Leichtketten-Gene zu amplifizieren. Die 5'-Primer basieren auf dem Raster 1 der V-Gene. Die VH- und Vk-Primer ähneln den von Marks et al. (1991) beschriebenen. Allerdings stellte sich für die Amplifikation aus genomischer DNA (im Gegensatz zu cDNA) das Produkt als reiner heraus, wenn die um eine Base am 3'-Ende gekürzten Primer verwendet wurden (Daten nicht dargestellt). Außerdem wurde die Anzahl der verwendeten Primer verringert, indem ähnliche Primer zu einem Consensusprimer zusammengefasst wurden. Mit Ausnahme einer Änderung in den JH-Primern zur Einführung einer gemeinsamen BstEII-Stelle erfolgten keine Änderungen zur Einführung von Restriktionsstellen.
Es stand begrenzte DNA-Sequenz-Information zur Verfügung, auf der die Vλ-Primer aufgebaut waren, doch es wurden Primer für die Vλ1-, Vλ2-, Vλ3- und Vλ4-Familien anhand der verfügbaren Sequenzdaten gebildet [Songsivilai et al., Eur. J. Immunol. 20, 2661–2666 (1990); Alexandre et al., Nucl. Acids Res. 17, 3975 (1989); Bernard et al., Nucl. Acids Res. 18, 7139 (1990); Chuchana et al., Eur. J. Immunol. 20, 1317–1325 (1990)]. Es sind andere Familien aus der Literatur bekannt (Chuchana et al., 1990), doch es standen keine Daten betreffend Nucleotidsequenzen zur Verfügung, weshalb keine Primer gebildet wurden. J-Region-Primer wurden so gebildet, dass die komplementär zur genomischen Sequenz der Keimlinien-J-Regionen für die Schwerkette [Ravetch et al., Cell 27, 583–591 (1981)], κ-Kette [Hieter et al., I. Biol. Chem. 257, 1516–1522 (1982)] und λ-Kette [Udey und Blomberg, Immunogenetics 25, 63–70 (1987); Dariavach, PNAS 84, 9074–9078 (1987); Bauer und Blomberg, J. Immunol. 146, 2813–2820 (1991); Combriato und Klobeck, Eur. J. Immunol. 21, 1513–1522 (1991); Frippiat, Nucl. Acids Res. 18, 7134 (1990)] waren. Die Jλ-Gene kombinieren mit ihren jeweiligen Cλ-Genen, und da Cλ4, Cλ5 (Dariavach, 1987) und wahrscheinlich Cλ6 (Bauer und Blomberg, 1991; Combriato und Klobeck, 1991) Pseudo-Gene sind, sollten sie nicht als exprimiertes Protein auftreten. In der Folge wurden keine Primer für diese Jλ-Genen gebildet. Durch Kombinieren von zwei J-Region-Primern wurden in allen drei J1-Primern Jλ, Jλ2/3 und Jλ7 gebildet. Tabelle 1 zeigt die vollständige Liste der in Beispiel 1 verwendeten primären PCR-Primer.
PCR-Amplifikation umgeordneter variabler Immunglobulin-Regionen
Die V-Gen-Familien- und J-Region-Primer wurden als äquimolekulare Gemische der in Tabelle 1 gezeigten einzelnen Primer eingesetzt. VHBACK- und JHFOR-Gemische wurden für die Schwerketten-PCR-Reaktion herangezogen. Man bediente sich ähnlicher Gemische für die κ- oder λ-Ketten-PCR-Amplifikation.
Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem Volumen von 50 ml unter Verwendung des Hybaid Thermal Reactor (von Hybaid). Reaktionsgemische enthielten 20 pmol jedes Primergemisches, 250 mM dNTP (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in 1 × PCR-Puf fer (Promega; 10 mM Tris.Cl, pH 8,8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 % Triton X-100). Um das Kontaminierungsrisiko zu minimieren, wurden umfangreiche Vorkehrungen getroffen. Die Gemische wurden in einem Raum, der eigens für PCR-Reaktionen ausgestaltet war, in einer Laminarbox untergebracht. Die Proben wurden anschließend 5 Minuten lang in einem UV-Ofen (Amplirad, Genetic Research, Dunmow, Großbritannien) UV-behandelt. Das Templat (5 ml) wurde dann zugesetzt, das Reaktionsgemisch mit Mineralöl (Sigma) überlagert und die Probe 5 Minuten lang auf 94 °C erhitzt. Zu diesem Zeitpunkt wurde Taq-DNA-Polymerase (Promega; 2,5 Einheiten) zugesetzt. Die Amplifikation erfolgte mithilfe von 35 Zyklen, 94 °C, 1 min, 65 °C, 1 min Annelieren; 72 °C, 1 min Dehnen.
Amplifizierte variable Regionen wurden auf einem 1,5 % LMP-Agarose/TAE-Gel analysiert und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Bande von Basenpaaren der Größe 320/350 wurde ausgeschnitten und mittels eines GENECLEAN 11-Kits (Bio-101) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Zumindest zwei unabhängige PCR-Amplifikationen von V-Regionen erfolgten mit der Probe jedes Patienten; die PCR von Lymphknoten-DNA fand vor der entsprechenden PCR von Heterohybridomen statt (diese waren ebenfalls erhältlich).
Klonieren und Sequenzieren von PCR-Produkten
Es wurde das von Marchuk beschriebene T-Vektor-Klonierungssystem verwendet [Marchuk et al., Nucl. Acids Res. 19, 1154 (1991)]. Zusammenfassend gesagt wurde der Vektor aus pBluescript II KS+ (Stratagene) durch Verdau mit EcoRV (aus NBL) gebildet, um stumpfe Enden zu schaffen; anschließend erfolgte die Behandlung mit Taq-DNA-Polymerase (Promega) in PCR-Puffer (Promega) mit 2 mM dTTP 2 Stunden lang bei 70 °C. Das gereinigte V-Gen-PCR-Produkt wurde in den T-Vektor ligiert und in den kompetenten E.coli-Stamm TG1 transformiert (Gibson, 1984, Doktorarbeit, University of Cambridge, Großbritannien). Rekombinante Klone wurden durch Blau/Weiß-Auswahl unter Verwendung von Isopropyl-β-thiogalactosidpyranosid (IPTG, Sigma) identifiziert. Rekombinante Zufallsklone wurden selektiert und ssDNA nach Superinfektion mit Helfer-Phage gebildet (MI3KO7, Stratagene) [Vieira und Messing, Methods Enzymol. 153, 3–11 (1987)]. Die Klone wurden nach dem Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., 1977) mithilfe von T7-DNA-Polymerase (Sequenase, USB, Cleveland, USA) sequenziert. Es wurden einige Klone aus jedem Patienten sequenziert und die Sequenzen miteinander verglichen.
Zusammensetzung von Tumor-V-Genen als scFv
Das hier angewendete Konstruktionsverfahren (siehe 1) beruht auf der von Davis et al. beschriebenen Technik [Davis et al., Bio/Technology 9, 165–169 (1991)]. Das Verfahren verwendet eine zweite Gruppe an Primern. Die VHSfiBAK-Primer kodieren für die SfiI-Klonierungsstelle und hybridisieren auch an die ursprüngliche Gruppe von VHBAK-Primern. Die scJHFOR- und scVk/Vλ-BAK-Primer hybridisieren an ihre jeweiligen Anfangsprimer, kodieren aber auch für den sc-Linker, wodurch die Produktion eines scFv ermöglicht wird [Huston et al., PNAS 85, 5879–5883 (1988)].
Die NotJk/IFOR-Primer hybridisieren an ihre jeweiligen Anfangsprimer, enthalten aber auch die NotI-Restriktionsstelle. Diese Primer sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Zusammensetzung erfolgt in zwei Stufen. Zunächst wurden die V-Gene (Schwer- und Leichtketten) aus dem Sequenziertemplat unter Einsatz der neuen Gruppe von Oligonucleotiden amplifiziert. Das PCR-Gemisch wurde wie oben gebildet, doch die verwendeten Primer waren nur die relevanten V-Gen-Familie- und J-Region-Primer (durch vorheriges Sequenzieren identifiziert). Das Templat war 100 ng ssDNA-Sequenziertemplat. Die PCR-Bedingungen waren: 1 min lang bei 94 °C, 1 min lang bei 50 °C, 1 min lang bei 74 °C, wobei 10 Amplifikationszyklen stattfanden. Am Ende der PCR wurden die weiteren dNTP (5 ml 2,5 mM Stammlösung) mit Klenow-Polymerase (Boehringer, 2,5 Einheiten) zugesetzt und dann 15 Minuten lang bei 20 °C inkubiert, um stumpfe Enden zu erhalten.
Nach diesem Schritt wurde das Produkt wie oben gelgereinigt und in 25 ml Wasser resuspendiert. Dann wurden 5 ml aus dem Schwerkettenprodukt und 5 ml aus dem Leichtkettenprodukt für die Konstruktion verwendet. Zu diesem Zweck wurde PCR in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurden keine Primer zugesetzt und die folgen den Zyklen gewählt: 1 min bei 94 °C, 1 min bei 50 °C, 1 min bei 74 °C; dies erfolgte über 7 Zyklen, um die Schwer- und die Leichtkette miteinander zu verbinden. Während der oben beschriebenen sekundären PCR werden die Schwer- und die Leichtkette mit Primern markiert, die für einkettigen Linker kodieren. Dieser Marker enthält 15 Nucleotide jeweils auf der Schwer- und auf der Leichtkette, die zueinander komplementär sind – somit können sie miteinander anneliert werden. Während der Verlängerungsreaktion entstehen aneinander gefügte scFv-Moleküle voller Länge. Am Ende dieser 7 Zyklen wird die Temperatur 3 Minuten lang bei 94 °C gehalten, und es werden die relevanten äußeren Primer (SfiVHBACK/NotJFOR) für die "Durchzugs"-Amplifikation zugesetzt. Diese Amplifikation besteht aus 10 Zyklen (1 min bei 94 °C, 2 min bei 74 °C) und dient zur Amplifikation der kleinen Menge des entstandenen verbundenen Produkts.
Klonieren zur Expression sowie Expression und Reinigung von scFv
Nach der Konstruktion wurde das scFv mit SfiI/NotI verdaut (siehe Marks et al., 1992) und in einen scFv-Expressionsvektor [(Hawkins et al., I. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)] auf der Basis von pUC119 kloniert (Vieira und Messing, 1987). Ein neuer Expressionsvektor, pRH2, in dem der Myc-Marker durch einen Hexahistidin-Marker ersetzt ist, wurde gebildet, um für Reinigung mittels Metallaffinitäts-Chromatographie zu sorgen. Dies erfolgte durch inverse stellengerichtete PCR-Mutagenese [Hemseley et al., Nucl. Acids. Res. 17, 6545–6551 (1989)]. Die Vektoren sind aus 2 ersichtlich (Seq.-ID Nr. 59–62).
Um die Expression von scFv voller Länge zu überprüfen, wurden einzelne Kolonien selektiert und 4 Stunden lang unter ständigem Schütteln in 1 ml 2 × TY/0,1 % Glucose/100 mg/ml Ampicillin bei 30 °C gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt und das Schütteln 18 Stunden lang fortgesetzt. Überstand wurde durch Zentrifugieren bei 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten lang geerntet. Das bakterielle Pellet wurde bei –20 °C zwecks Präparierung von Plasmid-DNA eingefroren und der Überstand durch Western-Blotting unter Verwendung des 9E10-Anti-Myc-Antikörpers analysiert [Ward et al., Nature 341, 544–546 (1989)]. Plasmid-DNA wurde dann aus dem bakteriellen Pellet von Kolonien gebildet, die, wie sich gezeigt hatte, scFv voller Länge exprimierten. Aus diesem Plasmidpräparat wurde das scFv als SfiI/NotI-Fragment in pRH2 subkloniert. 1-l-Bakterienkulturen wurden unter stetem Schütteln in 2-l-Kolben, umfassend 2 × TY/0,1 % Glucose/100 mg/ml Ampicillin, bei 30 °C bis zu A600 nm von 0,9 gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt und die Inkubation weitere 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Bakterien wurden danach durch Zentrifugieren pelletiert und die periplasmatische Fraktion gemäß dem Verfahren von Skerra et al. [Skerra et al., Bio/Technology 9, 273–278 (1991)] präpariert.
Das scFv-Antikörperfragment wurde aus der periplasmatischen Fraktion unter Verwendung des Hexahistidin-Markers gereinigt. Das Verfahren basiert auf dem obigen Verfahren von Skerra et al., doch es stellte sich heraus, dass die Verwendung von sechs Histidinen und Nickel (im Gegensatz zu fünf Histidinen und Zink) vorzuziehen ist (Daten nicht dargestellt). Das periplasmatische Präparat aus 1-l-Kultur wurde auf eine 1-ml-Säule von Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) geladen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers zuvor mit Nickelionen versehen worden war. Die Säule wurde dann mit 10 ml PBS/1 M NaCl (pH 7,2) gewaschen, gefolgt von 5 ml PBS/1 M NaCl/75 mM Imidazol (pH 7,2). Das verbleibende scFv wurde dann mit 5 ml PBS/1 M NaCl/300 mM Imidazol (pH 7,2) eluiert und als 1-ml-Fraktionen gesammelt. Die Peak-Proteinfraktionen wurden durch Bestimmen von A280 nm identifiziert und dann gegen PBS dialysiert, bevor Analyse durch SDS-Page stattfand.
PCR, Klonieren und Sequenzieren von V-Genen aus Follikellymphomen und normalem Lymphknoten
Die PCR-Amplifikation aus der DNA von Biopsieproben war in allen Fällen erfolgreich – bis auf die λ-Leichtkette aus Patient Nr. 5. Es wurde eine Anzahl von Klonen aus jedem Patienten sequenziert. Die Analyse der aus dem reaktiven Lymphknoten und aus der normalen Milz stammenden Sequenzen zeigte, dass es keine wiederholten Sequenzen gab. Von jedem der Tumor-tragenden Lymphknoten gab es einzelne wiederholte Sequenzen. Eine Zusammenfassung der Sequenzierergebnisse ist aus Ta belle 2 ersichtlich. Unter den wiederholten Sequenzen lagen bis zu zwei Basenänderungen vor, die – wie man annahm – das Ergebnis von PCR-Fehlern waren. Trotzdem war klar eine Consensussequenz erkennbar, und in jedem Fall gab es Klone mit dieser Consensussequenz. Um die Sequenz zu bestätigen, wurde eine zweite unabhängige Amplifikation durchgeführt, und es wurden auch weitere V-Gene sequenziert. Man identifizierte die gleiche Consensussequenz. Die wiederholten V-Gen-Sequenzen legen klonale Expansion nahe; auf diese Weise kann das Tumor-V-Gen identifiziert werden. Für drei der fünf hierin analysierten Tumorbiopsien stand ein Heterohybridom zur Verfügung. PCR-Amplifikation, Klonieren und Sequenzieren bestätigten die direkt anhand des Lymphknotens identifizierte Sequenz.
Der absolute Prozentsatz des Tumor-abgeleiteten V-Gens variierte, und dafür wurden verschiedene Gründe ins Treffen geführt. Erstens variieren die Biopsien hinsichtlich des Grads an Tumorinfiltration (obwohl in allen der hierin untersuchten Fälle maligne B-Zellen > 50 % der gesamten vorhandenen Zellen ausmachen). Zweitens variieren die Primer hinsichtlich des Wirkungsgrads, mit dem sie ein bestimmtes Gen amplifizieren – in extremen Fällen, wie bei der λ-Leichtkette in Patient Nr. 4, lässt sich eine Kette überhaupt nicht amplifizieren. Drittens können durch diese Primer einige Pseudo-Gene amplifiziert werden, was den Gesamtprozentsatz von Tumorabgeleiteten V-Genen reduziert.
Assemblierung, Expression und Reinigung
Die Anwendung von PCR-Assemblierung vermeidet die Verwendung mehrerer Restriktionsenzyme, die V-Gene an inneren Stellen möglicherweise schneiden können. Dieses Verfahren scheint wirkungsvoll zu sein und erfordert keine getrennte Herstellung eines Linkerfragments [Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)]. Um das Assemblierungsverfahren zu überprüfen, wurde das verbundene Produkt in einen Expressionsvektor kloniert, der den Myc-Marker enthielt (2). Zufällig ausgewählte Klone wurden gezüchtet und induziert (Hawkins und Winter, 1992). Western-Blotting unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, 9E10, gegen den Myc-Marker (Ward et al., 1989) zeigte, dass 80 % der Klone korrekt exprimierten. Um die Reini gung zu vereinfachen, wurde das scFv-Fragment in den Expressionsvektor pRH2 subkloniert, der einen Hexahistidin-Marker enthielt. Ein Klon aus Patient Nr. 5 wurde in einem 1-l-Volumen des scFv-Fragments (aus dem Periplasma gereinigt) gezüchtet. Die Ausbeute wurde auf 0,5 mg/l/OD600 geschätzt – basierend auf einer A_280nm von 1,4 für eine 1 mg/ml Lösung.
Beispiel 2: Konstruktion eines Fusionsproteins
Plasmidkonstruktion
Das BamHI/ClaI-env-Fragment [nt 6537–7674; nt-Nummerierung von Shinnick et al., Nature 293, 543–548 (1981)] aus pCRIP [freundlicherweise zur Verfügung gestellt von O. Danos, Danos & Mulligan, PNAS 85, 6460–6464 (1988)] wurde in das BamHI/ClaI-Rückgratfragment von pZipNeoSV (X) kloniert [freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. Mulligan, Cepko et al., Cell 37, 1053–1062)], um ein Zwischenplasmid penvBam/Cla zu erzeugen.
Eine SfiI/NotI-Klonierungsstelle wurde über die Leaderpeptidsequenz hinaus zwischen Codons eingeführt, die der sechsten und der siebenten Aminosäure (aus dem N-Terminus) im reifen MoMLV-env-Polypeptid entsprechen. Das Oligonucleotidpaar envNotrev (5'-CTG CAG GAG CTC GAG ATC AAA CGG GCG GCC GCA CCT CAT CAA GTC TAT AAT ATC-3', Seq.-ID Nr. 49, komplementär zu MoMLV env nt 5894–5914 mit einem 33-nt-5'-Überhang, der für eine NotI-Stelle kodiert, und 21 nt, die komplementär zum 5'-Ende von envSfifor sind) und envseq 7 (5'-GCC AGA ACG GGG TTT GGC C-3', Seq.-ID Nr. 50, reverses Komplement von MoMLV env nt 6581–6600) wurde dazu verwendet, die Amplifikation (aus Plasmid pCRIP) eines 739-bp-Fragments stromab von env-Codon 6 zu primen. Ein zweites Oligonucleotidpaar, envSfifor (5'-TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG GGC CGG CTG GGC CGC ACT GGA GCC GGG CGA AGC AGT-3', Seq.-ID Nr. 51, reverses Komplement von MoMLV env nt 5873–5893 mit einem 36-nt-5'-Überhang, der für eine SfiI-Stelle kodiert, und 21 nt, die komplementär zum 5'-Ende von envNotrev sind) und revMLVpol (5'-AAT TAC ATT GTG CAT ACA GAC CC-3', Seq.-ID Nr. 52, komplementär zu MoMLV pol nt 5277–5249) diente dazu, die Amplifikation (aus pCRIP) eines 702-bp-Fragments stromauf vom env-Codon 7 zu primen. Amplifikationen erfolgten unter Verwendung von Vent-Polymerase, und die Reaktionen wurden 15 PCR-Zyklen (1 min bei 94 °C, 1 min bei 60 °C, 1 min bei 72 °C) unterzogen. Die komplementären 21-nt-Enden der 702 und 739 bp großen gelgereinigten PCR-Produkte ermöglichten die PCR-Verbindung, um ein env-Gen-Fragment zu bilden, das an der erwünschten Position eine inkorporierte SfiI/NotI-Klonierungsstelle besitzt. Die zwei Fragmente wurden vermischt und drei PCR-Zyklen unterzogen (1, 1 und 2 min bei 94 °C, 40 °C bzw. 72 °C), gefolgt von weiteren 17 Amplifikationszyklen (1, 1 und 2 min bei 94 °C, 60 °C bzw. 72 °C) – dies nach der Zugabe von Oligonucleotiden envseq7 und Bglenvrev (5'-TAA TCA CTA CAG ATC TAG ACT GAC ATG GCG CGT-3', Seq.-ID Nr. 53, komplementär zu MoMV pol-Nucleotiden 5766–5785, wobei das 5'-Ende eine BglII-Restriktionsstelle inkorporiert).
Das Produkt, ein 905-bp-Fragment, wurde mit BglII und BamHI verdaut und in Vorwärtsorientierung in eine BamHI-Stelle von penvBam/Cla (siehe oben) kloniert, wodurch das Plasmid pSfi/Notenv entstand. Die korrekte Zusammensetzung dieses Plasmids wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxy-Sequenzieren bestätigt [Sanger et al., PNAS 74; 5463–5467 (1977)]. Ein funktioneller B1.8 scFv-Antikörper wurde dann aus prokaryotischem Expressionsvektor [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)] als SfiI/NotI-Fragment in die SfiI/NotI-Klonierungsstelle von pSfi/Not.Env subkloniert, um das Plasmid pNIP.env zu bilden (3). Die Sequenz über die Verbindungsstellen von pNIPenv ist aus 4 ersichtlich (Seq.-ID Nr. 63–66, einschließlich der Translation der Nucleotidsequenz).
Schließlich wurde die modifizierte retrovirale Hüllen-Expressionskassette als HindIII/EcoRI-Fragment in ein modifiziertes pSV2Neo-Plasmid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Ashok Venkitaraman, MRC Centre, Cambridge, Großbritannien) subkloniert, um das Plasmid pSVNIPenv zu erzeugen (4).
Zelltransfektion
NIH3T3-Fibroblasten und die elektrotrope retrovirale Verpackungszelllinie psi2 [Mann et al., Cell 33, 153–159 (1983)] wurden in DMEM/10 % FBS, ergänzt mit 60 μg/ml Benzylpenicillin und 100 μg/ml Streptomycin, bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 CO₂ gehalten. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich unter Verwendung von EDT A ohne Trypsin ausplattiert, um die Monolayer aufzubrechen.
Plasmid pNIPenv wurde durch Calciumphosphat-Fällung mit pDCneo, einem Plasmid, das einen Neomycinresistenzmarker enthält, in psi2-Zellen transfiziert. Kurz gesagt wurden 2 × 10⁵ Zellen in 90-mm-Gewebekulturplatten (Nunc) ausplattiert, über Nacht kultiviert, gewaschen und mit 10 ml neuem Medium ergänzt. 10 μl Plasmid-DNA und 50 μl 2 M CaCl₂ (durch 0,2 μm gefiltert) wurden in sterilem Wasser auf ein Volumen von 400 μl verdünnt. Das Gemisch aus CaCl₂ und DNA wurde zum gleichen Volumen an durch 0,2 μm filtrierter und 2 × mit HEPES gepufferter Salzlösung (280 mM NACl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES, pH mittels 0,5 N NaOH auf 7,05 eingestellt) zugetropft und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Transfektionslösung (800 ml) wurde zu den Zellen zugesetzt, die 16 Stunden lang kultiviert, gewaschen und erneut ergänzt wurden. G418-Selektion (1 mg/ml) begann 24 Stunden später und wurde etwa zwei Wochen lang fortgesetzt.
Transfizierte Kolonien, die einkettigen Oberflächen-B1.8-Antikörper exprimierten, wurden durch Panning mit NIP.BSA-beschichteten Perlen identifiziert. Zusammenfassend gesagt wurden Tosyl-aktivierte paramagnetische Perlen (Dynal, Oslo, Norwegen, Produktnr. 14004) mit NIP10.BSA beschichtet (etwa 10 NIP-Capronat-O-succinimid-Moleküle, gekoppelt an jedes Rinderserumalbumin-Molekül; Hawkins et al., 1992), ausgiebig in PBS gewaschen und mit DMEM/10 % FBS blockiert. 90-mm-Gewebekulturplatten mit bis zu 50 G418-resistenten psi2-Kolonien wurden 1 Stunde lang vorsichtig bei 40 °C geschüttelt, gefolgt von 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 2 × 10⁷ (50 μl) Perlen in 5 ml DMEM/10 % FBS. Nach fünf Waschungen in PBS wurden positive Kolonien (deutlich mit paramagnetischen Perlen überzogen) leicht identifiziert und zwecks weiterer Expansion, Tieftemperatur-Aufbewahrung und Ernten von Zellüberständen individuell übertragen.
Man stellte demnach fest, dass die Spezifität des Antikörpers auf der Oberfläche der Zellen präsentiert wird und dass daher der Antikörper gefaltet ist.
Konstruktion eines löslichen Proteinexpressionsvektors
Um einen löslichen Expressionsvektor zu erzeugen, wurden ein Stoppcodon und eine Rasterverschiebungsmutation zwischen das Antikörper-Gen und den 3'-Abschnitt des MoMLV-Hüllen-Gens insertiert. Das B1.8-scFv-Fragment wurde PCR-amplifiziert (10 Zyklen, 1 min bei 94 °C, 1 min bei 55 °C, 1 min bei 74 °C); dies erfolgte mit SfiVHBAK (5'-TAC TCG CGG CCC AAC CGG CCA TGG CCC AGG TSM ARC TGC AGS AGT C-3', Seq.-ID Nr. 54) und einem Vorwärtsprimer Not.STOP (5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC CTC CTC AGA GGA C-3', Seq.-ID Nr. 55), der für die Nucleotidinsertion kodiert, wodurch ein Stoppcodon und eine Rasterverschiebung 5' von der NotI-Stelle entstehen. Anschließend wurde das Fragment mit SfiI/NotI verdaut und in pSfi/Not.Ev kloniert, so dass das Plasmid pNIPstop entsteht (4). Plasmid pSVBCLenv (4) wurde durch Ersetzen von B1.8 scFv mit einem scFv-Vergleichs-Gen, das aus dem BCL1-Maus-Lymphom PCR-kloniert war, aus pSVNIPenv abgeleitet. VH- und Vλ-Gene wurden PCR-kloniert und aus BCL-abgeleiteter DNA konstruiert (unter Anwendung herkömmlicher Arbeitsvorschriften).
Herstellung von Plasmid-DNA
Plasmide wurden in E. coli-Stamm TG1 (Gibson, 1984) amplifiziert, durch alkalische Lyse extrahiert und unter Anwendung des Promega Magic Maxipreps^TM-DNA-Reinigungssystems (Promega, Madison, WI, USA) säulengereinigt. Die DNA wurde in Wasser eluiert. Die Reinheit des Plasmid-Prep wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und durch Messen des A260 nm/A 280-nm-Verhältnisses bestätigt (das Verhält nis betrug in allen Fällen > 1,7). Das gereinigte Plasmid wurde bei –20 °C gelagert. Vor der Verwendung wurde das Plasmid in 200 mM NaCl auf 160 mg/ml eingestellt.
Herstellung von B1.8 scFv-Protein
Für die bakterielle Expression wurde das B1.8 scFv-Gen als PstI/NotI-Fragment in den Vektor pRH2 kloniert, der ein Ende von sechs Histidinen an den C-Terminus des scFv bindet und durch inverse PCR-Mutagenese abgeleitet wurde. Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stamm TG1 transformiert und das scFv-Protein exprimiert und auf einer NP-Sepharose-Säule gereinigt [Hawkins und Winter, Eur. J. Immunol. 22, 867–870 (1992)]. Es zeigte sich, dass sich das gereinigte Protein stark an NIP-BSA band; dies wurde mittels eines bereits beschriebenen ELISA belegt (Hawkins und Winter, 1992). Als negativer Vergleich wurde scFvD1.3 (Hawkins et al., 1992) in den Expressionsvektor pRH2 kloniert und exprimiert und anschließend – wie von Hawkins et al., 1992, s.o., beschrieben – auf einer Lysozymsäule gereinigt.
Impfschema: 10 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse wurden zur Immunisierung verwendet. Vorimmunisierungs-Blutproben wurden durch Blutabnahme aus den Schwänzen erhalten. Das Blut wurde 2 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min zentrifugiert, um das Serum zu trennen. Danach wurde das Serum für den nachfolgenden Test bei –20 °C gelagert. Zwei Gruppen von Mäusen wurden immunisiert – eine mit DNA und eine mit Protein. Die zwei Gruppen wurden wie folgt immunisiert.

a) Proteinvakzine: B1.8 scFv-Protein wurde auf eine Konzentration von 250 mg/ml in PBS eingestellt und mit dem gleichen Volumen an CFA vermischt. Die Mäuse wurden subkutan mit 100 ml dieser Vakzine (12,5 mg scFv) an zwei getrennten Stellen exponiert. Identische Auffrischungsimpfungen wurden zwei und vier Wochen später verabreicht. 200-ml-Blutproben wurden aus den Schwänzen zehn Tage nach der letzten Auffrischungsimpfung gezogen. Die Blutproben wurden wie oben verarbeitet.
b) DNA-Vakzine: Zwei Gruppen von jeweils drei Mäusen wurden mit 50 ml (8 mg) DNA entweder subkutan (sc) in beide Flanken oder intramuskulär (im) (in den rechten und linken Quadrizeps, Voll-DNA für jede Maus 16 mg) exponiert. Zwei identische Auffrischungsimpfungen erfolgten in einwöchigen Intervallen. 200-ml-Blutproben wurden aus den Schwänzen unmittelbar vor der ersten, zweiten und dritten Provokation sowie eine Woche nach der letzten Auffrischungsimpfung gezogen. Serum wurde wie oben getrennt und gelagert.

Analyse der Immunantwort
Individuelle Näpfe mit flachem Boden in flexiblen 96-Napf-Testplatten (Falcon 3912 MicroTest III) wurden mit B1.8-His- oder Vergleichs- (D1.3.His-Anti-Lysozym) scFv-Protein über Nacht bei 25 mg/ml in PBS bei Raumtemperatur beschichtet. Die Verwendung des mit Histidin markierten scFv zum Beschichten der Platten führte, wie sich zeigte, dazu, dass eine größere Menge des Proteins ihre Antigen-Bindungsfähigkeit beibehielt. Die Platten wurden drei Mal mit PBS gewaschen, 2 Stunden lang bei 37 °C mit 3 % BSA in PBS blockiert und drei Mal in PBS gewaschen. Testserum wurde zugesetzt (1:100 oder 1:1000 verdünnt in PBS/3 % BSA) und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden drei Mal in PBS gewaschen und 1 Stunde lang in Raumtemperatur mit einer zweiten Schicht von HRP-konjugiertem polyklonalem Ziegen-Anti-Maus-Fc-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 (Sigma, Katalognr. AO 168) inkubiert. Die Platten wurden vier Mal in PBS gewaschen und mit ABTS entwickelt; A405 nm wurde nach 30 Minuten mittels eines Thermomax^TM-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, Menlo Park, USA) gemessen.
Ergebnisse
Immunantwort auf Proteinvakzine
Zunächst wurde die Frage geklärt, ob Mäuse bei Provokation mit einem scFv-Maus-Antikörper in CFA eine effektive antiidiotypische humorale Immunantwort entwickeln können. Sechs Mäuse wurden subkutan mit 25 mg des B1.8-Anti-NIP-scFv in CFA exponiert, wobei zwei und vier Wochen später Auffrischungsimpfungen erfolgten. Zehn Tage nach der letzten Provokation enthielt Serum aus diesen Tieren nicht aus reichend Anti-B1.8-Antikörper, um ein positives BLISA-Signal bei 1:100-Verdünnung des Serums zu liefern.
Immunantwort auf DNA-Vakzine
Plasmid pNIPenv (3; siehe Materialien und Verfahren, um mehr Informationen über die Konstruktion zu erhalten) kodiert für ein chimäres Fusionsprotein, bestehend aus dem ecotropen MoMLV-Hüllpolypeptid Pr80env mit einem scFv-Anti-NIP-Antikörperfragment (Kd 4 × 10^–8 M), sechs Aminosäuren vom N-Terminus insertiert. Die aus 33 Aminosäuren bestehende MoMLV-env-Leadersequenz wird ohne Aufbrechen der Leader-Spaltstelle beibehalten. Wie auch die sechs N-terminalen Aminosäuren aus dem MoMLV-Hüllprotein besitzt das scFv weitere sechs Aminosäuren aus dem pelB-Leader, die am N-Terminus verbleiben. Die Expression wird von Promotor/Enhancer-Sequenzen in der langen terminalen Wiederholung (LTR) von 5' MoMLV angetrieben. Die Polyadenylierungs-Signalsequenzen werden durch die 3'MoMLV-LTR bereitgestellt. Beim Transfizieren in Maus-Fibroblasten (siehe oben) stellte sich heraus, dass pNIPenv für stabile Zelloberflächen-Expression von funktionellem B1.8 scFv in Fusion mit dem MoMLVenv-Protein sorgte.
Mäuse wurden auf subkutanem (drei Mäuse) oder intramuskulärem (drei Mäuse) Weg mit 15 mg pSVNIPenv in 200 mM NaCl geprimt, wobei ein und zwei Wochen später Auffrischungsdosen verabreicht wurden. Vergleichsmäuse wurden mit pSVBCLenv geimpft. Serumproben vor der Impfung, vor der Auffrischungsimpfung und eine Woche nach der Impfung wurden durch ELISA auf humorale Antwort gegen B1.8 scFv untersucht. Vor der zweiten Auffrischungsimpfung wurden Anti-B1.8-scFv-Antikörper bei 1:100-Verdünnung des Serums in drei der sechs pSVNIPenv-geimpften Mäuse detektiert (zwei i.m. und eine s.c. geimpft). Eine Woche nach der zweiten Auffrischungsimpfung besaßen alle sechs Mäuse leicht detektierbare Anti-B1.8-scFv-Antikörper, die mit dem D1.3 scFv nicht kreuzreagierten. Seren aus mit dem Vergleich pBCLenv geimpften Mäusen blieben im Anti-B1.8-ELISA negativ.
Anamnetische Antwort auf Proteinvakzine nach DNA-Vakzine
Nach acht Wochen waren die Anti-B1.8-Antikörpertiter in den mit pSVNIPenv immunisierten Mäusen gesunken. Zu diesem Zeitpunkt wurden die drei Mäuse, die ursprünglich intramuskulär mit pNIPenv geimpft worden waren, intravenös mit 20 mg gereinigtem B1.8-scFv-Protein in PBS provoziert. Fünf Tage später enthielt Serum aus diesen Mäusen einen stark gestiegenen Titer von Anti-B1.8-Antikörpern – der durchschnittliche Anstieg war zwölffach, und alle besaßen Antikörper, die bei 1:1000-Verdünnung klar detektierbar waren.
Auffrischen mit löslichem scFv-Expressionsvektor (pNIPstop)
Um zu untersuchen, ob die Auffrischung mit einem löslichen Protein-Expressionsvektor auch den Antikörpertiter steigern würde, wurden Mäuse mit pNIPstop geimpft. Zehn Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die drei s.c. mit pNIPenv immunisierten Mäuse mit 8 mg s.c. und mit 8 mg i.m. in 200 mM NaCl geimpft. Fünf Tage nach der Auffrischung wurden versuchsweise Blutproben gezogen und auf Antikörperaktivität untersucht. Der Serumtiter nahm durchschnittlich um das Zehnfache zu, und alle waren wiederum in einer 1:1000-Verdünnung positiv.
Vergleich von löslichem pNIPstop und pNIPenv bei der Erzeugung primärer Immunantwort
Um die Bedeutung des Fusionsproteins zur Steigerung der Immunantwort zu unterstreichen, führten die Anmelder ein Vergleichsexperiment durch, um den Wirkungsgrad der zwei Vektoren beim Stimulieren einer primären Immunantwort zu vergleichen. Zwei Gruppen von jeweils zwei BALB/c-Mäusen wurden wie oben verwendet. Serum wurde wie oben durch Blutabnahmen am Schwanz erhalten, und die Mäuse wurden wöchentlich drei Mal mit dem geeigneten Plasmid geimpft. 28 Tage nach dem Beginn der Immunisierung wurde Serum wiederum im Zuge von Blutabnahmen am Schwanz erhalten und auf Anti-B1.8-Aktivität untersucht. Zwei von zwei aus der mit dem pNIPenv-Plasmid geimpften Gruppe waren in einer Verdünnung von 1:100 positiv; in der pNIPstop-Gruppe waren ebenfalls zwei von zwei positiv. Klarerweise ist der env-Marker zur Stimulierung einer Immunantwort nicht erforderlich.
Bestätigung, dass Immunantwort das native Antigen erkennt
Eine Gruppe von fünf Mäusen – vier Mal mit DNA (pSV2-BCL1) immunisiert, die für das unfusionierte BCL1-scFvFragment kodiert – rief auch humorale Antworten gegen den Idiotyp hervor; dies wurde durch Bindung an das BCL1-IgM-Fragment in einem ELISA detektiert (Daten nicht dargestellt). Außerdem wurde durch FACS-Analyse aufgezeigt, dass sich diese antiidiotypischen Antiseren – dies ein klarer Beweis für ihre Fähigkeit, natives Antigen in der für die Therapie erforderlichen Form zu erkennen – an Lymphomzellen binden, die Oberflächen-BCL1-Ig tragen. BCL1-Zellen wurden in einer Verdünnung von 1:20 mit Serum vorinkubiert, bevor die Einfärbung mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG (Sigma) erfolgte, gefolgt von FACS-Analyse. Die Immunantwort war mit jener für den BCL1-IgM-Antikörper in CFA vergleichbar (11). Dies stand im Gegensatz zu Antiseren aus Mäusen, die mit pSV2-B1.8 immunisiert waren (hier bestand nur eine schwache Bindung an das BCL1-Lymphom; 11).
Beispiel 3: Konstruktion eines für Humanrezipienten geeigneten Vektors
Vektorkonstruktion
Die in obigem Beispiel 2 verwendeten Anfangsvektoren beruhten auf den Moloney-Maus-Leukämie-Virusvektoren und enthielten große Abschnitte unmodifizierter viraler Sequenzen [Russell et al., Nucl. Acids Res. 21, 1081–1085 (1993)]. Diese Vektoren erwiesen sich als wirkungsvoll bei der Bildung antiidiotypischer Antworten und zeigten in den geimpften Mäusen auch keine unerwünschten Wirkungen. Obwohl es keine Hinweise auf die Gefahren solcher Vektoren für den Menschen gibt, wurde beschlossen, die Vektoren zu modifizieren, damit man allfällige potenzielle Risken ausschließen konnte. Es gab in Bezug auf zwei Merkmale der ursprünglichen Vektoren einige Bedenken: das retrovirale Hüllen-Gen (da es theoretisch zu einem anderen Retrovirus rekombinierbar ist, wodurch es seinen Tropismus ändert) und das Packungssignal (das möglicherweise die Packung der injizierten DNA in bestehende Human-Retroviren ermöglicht). Während der Veränderung des Vektors wurde entschieden, Modifikationen einzubauen, die die Vektoren in Hinblick auf die Verwendung im Menschen verbessern. Der Promotor zum Antrieb der Expression des idiotypischen scFv wurde in den Rous-Sarkom-Virus- (RSV-) Promotor umgeändert, da dies für Expression sorgt, wenn die Injektion direkt in Nicht-Human-Primatenmuskel erfolgt [Jiao et al., Hum. Gene Ther. 3, 21–33 (1992)]. Die Anmelder verwendeten auch einen Vektor, der einen bakteriellen Einzelstrang-Replikationsursprung enthält, damit die Produktion von ssDNA erfolgen kann, die das Sequenzieren des scFv-Abschnitts (spezifisch für den jeweiligen Patienten) des Vektors erleichtert, bevor die Injektion in den Patienten stattfindet. Der verwendete Vektor basiert auf dem im Handel erhältlichen Vektor pRc/RSV (British Biotechnology/Invitrogen).
Um dieses Vektorrückgrat in einen für die genetische Immunisierung geeigneten Vektor umzuwandeln, war es wünschenswert, Leadersequenzen und Terminationssignale einzuführen und die Produktion von Fusionsproteinen zu ermöglichen. Fusionsproteine scheinen für die Produktion antiidiotypischer Antworten nicht notwendig zu sein, doch eine Möglichkeit zur Steigerung der Immunantwort kann die Anbindung zweckmäßiger Proteine sein – möglicherweise von Fremdproteinen oder vielleicht von Cytokinen [Tao und Levy, Nature 362, 755–758 (1993)]. Da Fusionsproteine in Tiermodellen nicht erforderlich waren, wird im ersten Humanversuch nur ein kurzer Peptidmarker verwendet, doch dies ist ein Bereich, in dem die Arbeitsvorschrift in Zukunft möglicherweise umgestaltet wird.
Der Vektor pSfi/Not.Tag1 wurde modifiziert, um den pelB-Leader mit der Human-Ig-VH1-Leadersequenz zu ersetzen, die das Kodieren einer SfiI-Klonierungsstelle ohne Modifikation der Aminosäuresequenz ermöglicht. Es folgte die Einführung mit Oligonucleotiden unter Verwendung der HindIII/PstI-Klonierungsstellen und die Bestätigung durch Sequenzieren.
Dann erfolgte die Klonierung als EcoRI/Blunt-HindIII/Fragment in den NotI/Blunt-HindIII-geschnittenen Vektor pRC/RSV, um die Sequenz (Seq.-ID NR. 56) zwischen den HindIII/XbaI-Stellen zu ergeben, wie dies aus 5 ersichtlich ist. Das scFv für einen individuellen Patienten kann an den durch das Symbol ^ dargestellten Stellen insertiert werden.
Der Vektor wurde danach auf zweierlei Arten untersucht:

(i) scFv B1.8 wurde in den Vektor kloniert und dann das resultierende Konstrukt in zwei Zelllinien transfiziert – NSO (eine Myelomzelllinie) und NIH 3T3 (eine Fibroblastenzelllinie). Unter Verwendung des Neomycinresistenz-Gens in pRC/RSV wurden stabile Transfektanten isoliert und der Überstand auf scFv-B1.8-Antigen-Bindungsaktivität untersucht. In beiden Fällen wurde das Antikörperfragment exprimiert und war an das Hapten NIP gebunden – das vom monoklonalen Antikörper B1.8 erkannte Antigen. Klone wurden aus den NSO-transfizierten Zellen isoliert, und es zeigte sich in verbrauchtem Kulturüberstand, dass sie 1–3 mg/l funktionelles scFv produzierten.
(ii) Das Plasmid wurde in einem genetischen Immunisierungsversuch verwendet und mit psV2-B1.8 verglichen. Sie ergaben vergleichbare Ergebnisse und scheinen gegenüber einem anderen Vektor überlegen zu sein, der für das Fd-Bakteriophagen-Gen-8-Protein zwischen der NotI- und der XbaI-Stelle kodiert (6). Die wahrscheinliche Erklärung liegt darin, dass in Transfektionsexperimenten das Expressionsausmaß für die scFv-B1.8-Gen-8-Fusion 10- bis 100fach geringer war. Andere Forscher stellten eine starke Korrelation zwischen dem Expressionsausmaß und der Immunantwort fest, wenn man mithilfe genetischer Immunisierung Immunantworten gegen virale Proteine hervorruft (G. Rhodes, persönliche Mitteilung).

6 (Immunisierung von Mäusen mit Vektoren unter Verwendung des RSV-Promotors) zeigt die Ergebnisse idiotypischer Immunisierung gegen scFv B1.8. Es sind die Antworten einzelner Mäuse – ermittelt durch ELISA bei einer Serumverdünnung von 1:100 – dargestellt. Die Mäuse wurden in den Wochen 0, 1 und 2 intramuskulär im munisiert. Es ist zu beachten, dass eine Maus mit dem Stoppvektor (pSV2-B1.8) eine schwache Antwort zeigte; auch die Antwort von mit dem Gen-8-Fusionsvektor immunisierten Mäusen war gering (VIII 1 und VIII 2), während beide Mäuse mit dem Peptid-Marker-Vektor zufrieden stellende Antworten lieferten (Tag1 und Tag2).
Die Sequenz (Seq.-ID NR. 58) des Schlussvektors pVAC1 ist in 7 gemeinsam mit einer Karte der einzigartigen Restriktionsstellen zu sehen (8). Die Sequenz in den Kleinbuchstaben in 7 entspricht bis zu den zwei Stoppcodons der in 5 dargestellten Sequenz. Der Vektor pVAC1 ist bei den Anmeldern erhältlich (am Cambridge Centre for Protein Engineering, Cambridge, Großbritannien).
9 ist eine schematische Darstellung des Vektors pVAC1, aus der wichtige Restriktionsstellen und wichtige Gene ersichtlich sind.
10 ist eine grafische Darstellung der O.D. (405 nm) über der Zeit für männliche und weibliche Mäuse, die mittels direkter DNA-Injektion mit dem pVAC-Vektor immunisiert wurden, der B1.8 scFv exprimiert (pVAC1.B1-8). Die Grafik zeigt, dass sich für einzelne Mäuse eine deutliche Zunahme des Titers nach der Immunisierung einstellte.
Obwohl das Neomycinresistenz-Gen zum In-vitro-Testen sinnvoll ist, ist es für die Human-Immunisierung nicht erforderlich. Der zum Antrieb des Neomycinresistenz-Gens verwendete SV40-Promotor ist mit den gleichen Gefahren verbunden wie andere starke Promotoren. In dem für Humanversuche zu verwendenden Plasmid wird somit das Neomycin-Gen durch SfiI/BstBI-Verdau und anschließende Stumpfligation deletiert – dies schaltet alle derartigen Gefahren aus.
Diskussion der Beispiele 1–3
Die Anmelder zeigten, dass eine Plasmidvakzine, das für ein Einketten-Maus-Antikörper/Retrovirenhüllen-Fusionsprotein kodiert, eine starke humorale Immunreaktion gegen die Antikörpergruppe in BALB/c-Mäusen induziert, während die Impfung mit dem gereinigten scFvProtein, gemischt mit komplettem Freundschen Adjuvans, keine detektierbare Antwort liefert. Die Induktion von B-Zellen-Memory-Effekt scheint einzutreten, da die Auffrischung mit löslichem Protein oder einem löslichen scFv-Expressionsvektor einen raschen Anstieg der Antikörpertiter bewirkte.
Die humorale Anti-B1.8-Antwort auf die Plasmidvakzine pNIPenv war gegenüber jener auf gereinigtes B1.8-scFv-Protein, gemischt mit komplettem Freundschen Adjuvans, klar überlegen. Die hierin geoffenbarte Vorgangsweise ist mit zahlreichen Vorteilen verbunden. Nach dem Gen-Transfer findet wahrscheinlich eine kontinuierliche Zufuhr des Zielantigens statt, die im Lauf von Tagen oder Wochen abnimmt, während injiziertes Protein eine sehr kurze Halbwertszeit aufweisen kann. Diese verlängerte Exposition gegenüber neu synthetisiertem Antigen kann für eine optimale Immunantwort entscheidend sein, wobei dieses Argument als Erklärung dafür diente, weshalb lebende virale Vakzinen abgetöteten überlegen sind.
Antigen-spezifische Helfer-T-Zellen können sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten durch direkte Zellwechselwirkung und durch Vorsehen geeigneter stimulierender Cytokine amplifizieren. Es sind mehrere Mechanismen möglich, mithilfe derer die Plasmidvakzine Helfer-T-Zellen effizienter rekrutieren kann.
Ungeachtet der beteiligten Mechanismen lieferte die in dieser Studie angewendete Impfungsstrategie eine starke humorale Immunantwort auf ein schwach immunogenes einkettiges Antikörperfragment und war der Impfung mit gereinigtem Protein plus Adjuvans überlegen. Das in dieser Studie zum Einsatz kommende scFv-Gen könnte mit einer Vielzahl an Genen oder Genfragmenten ersetzt werden, die für andere schwach immunogene idiotypische Determinanten kodieren.
Episomale Vektoren, wie z.B. die auf EBV oder Papovavirus basierenden, besitzen einige Vorteile gegenüber derzeit verwendeten Vektoren. Sie sollten episomale Replikation in hoher Kopieanzahl ermöglichen und wirkungsvoller agieren. Neue Vektoren unter Verwendung des pVAC1-HindIII/XbaI-Inserts wurden mit dem Expressionsplasmid pCEP4 (Invitrogen) konstruiert, das den EBV-Replikationsursprung und BBNA enthält. Diese weisen höhere Expressionswerte und mehr Expressionsstabilität in Zellkulturexperimenten unter Verwendung der Human-Osteosarkomlinie 791T auf und sind in vivo möglicherweise wirkungsvoller, obwohl sie auch zu Sicherheitsüberlegungen bei Verwendung im Menschen führen. Wirkungsvollere Transfektionsverfahren, wie z.B. Liposomen-vermittelte und Rezeptor-vermittelte Zufuhr, können die Effizienz des Verfahrens ebenfalls steigern.
Beispiel 4: Durch CD4+-T-Zellen vermittelte Immunität gegen B-Zellmalignitäten
Assemblierung und Charakterisierung des scFvPVXCP-Konstrukts
12 zeigt die Konstruktion von scFv-PVXCP-Fusionen. Das scFv aus A31-Lymphom und 5T33-Meyelom sowie A31FrC wurden bereits früher konstruiert und in pcDNA3 kloniert [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. ScFv wurden im Raster mit dem vierten Codon von PVXCP (CP4 isoliert) fusioniert; dies erfolgte mittels des aus vier Aminosäuren bestehenden Linkers, der auch in dem mit Fragment C fusionierten scFv verwendet wird (King et al., 1998). PVXCP-cDNA wurde freundlicherweise von Dr. K. Kanyuka (Long Ashton, LACR, Somerset, Großbritannien) zur Verfügung gestellt. A31PVXCP- und 5T33PVXCP-Fusions-Gene wurden durch das zwei Schritte umfassende PCT-Verfahren (Spellerberg, 1997) unter Verwendung des HF-Polymerase-Kits (Clontech, Basingstoke, Großbritannien) gebildet. Für die Konstruktion von A31PVX waren die Gen-Primer wie folgt: Für den ersten Schritt der Amplifikation des A31-Gens war 5' taatacgactcactatagggagae 3' (bezeichnet als T7) vorwärtsgerichtet und 5' ggctggaggtccgggtccacgtttgatctccacctt 3' rückwärtsgerichtet, und für die Amplifikation des PVXCP-Gens war 5' aaacgtggacccggacctccagccaacaccactcaagct 3' vorwärtsgerichtet und 5' accgcggccgctagttatggtgggggtagtgaa 3' rückwärtsgerichtet. T7-Primer entsprach von pcDNA3-Plasmid abgeleiteten Sequenzen. Für den zweiten Schritt wurden T7 als Vorwärtsprimer und ein Rückwärtsprimer für die PVXCP-Gen-Konstruktion als Rückwärtsprimer verwendet.
Für die Assemblierung des 5T33PVXCP-Gens wurde im ersten Schritt für das 5T33-Gen T7 auch als Vorwärtsprimer und 5' ggctggaggtccgggtcctttgatttccagcttggt 3' als Rückwärtsprimer verwendet; für das PCVXCP-Gen wurde 5' atcaaaggacccggacctccagccaacaccactcaagct 3' als Vorwärtsprimer verwendet, und der Rückwärtsprimer war der gleiche wie für die A31PVXCP-Gen-Konstruktion. Für das Nur-PVXCP-Gen-Konstrukt (nachstehend als Nur-PVXCP bezeichnet) wurde 5' ccgaagcttgcaccatgaagttgtggctgaactggattttccttgtaacacttttaaatggtatccagtgtccagccaacaccactcaagct 3' als Vorwärtsprimer verwendet, und der Rückwärtsprimer war der gleiche wie für die Fusionskonstrukte. Der Vorwärtsprimer enthielt eine Ig-Leadersequenz (die gleiche wie wie im A31 scFv). Die zusammengesetzten Konstrukte wurden unter Verwendung von HindIII- und NotI-Restriktionsstellen in pcDNA3-Plasmid (Invitrogen BV, Leek, Niederlande) kloniert. Die Expression der zusammengesetzten Konstrukte wurde mittels TNT (Promega) und durch Transfektion der Plasmide in COS-1-Zellen überprüft.
Überstände wurden durch ELISA unter Verwendung eines polyklonalen Anti-PVX-IgG-Beschichtungsantikörpers und eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten polyklonalen Anti-PVX-IgG-Detektionsantikörpers auf PVXCP untersucht, wobei dies gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bioreba, Peterborough, Großbritannien) erfolgte. Alle PVXCP enthaltenden Konstrukte produzierten detektierbares Protein in den Überständen, wohingegen Konstrukte ur mit scFv negativ waren. Es wurde SDS-PAGE mit Western-Blotting durchgeführt, und es fand die Sondierung mit Antiserum abgeleitet aus mit p.scFv5T33-PVXCP geimpften Mäusen (Verdünnung 1:100), mit anschließender Inkubation mit Anti-Maus-HRP-Konjugat (Binding Site, Birmingham, Großbritannien) und Entwicklung unter Einsatz von ECL plus Reagens statt.
Impfung und Tumorprovokation
Mäuse wurden im Alter von sechs bis zehn Wochen – sofern nicht anders angegeben – an den Tagen 0, 21 und 42 mit 50 μg Plasmid-DNA in Salzlösung an zwei Stellen im Quadrizepsmuskel geimpft. Das A31-Lymphom wurde, wie bereits früher beschrieben, passagiert [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Das 5T33-Myelom wurde durch intravenöse Injektion in C57B/KaLwRiJ-Mäusen passagiert. Die Provokation erfolgte am Tag 63 durch intravenöse Injektion mit 10⁴ 5T33-Zellen oder mit 5 × 10⁴ A31-Zellen.
Depletionsversuch
Die Mäuse wurden drei Mal mit p.scFv5T33-PVXCP oder p.scFvA31-PVXCP gemäß dem oben beschriebenen Verfahren geimpft. Am Tag 56 wurde den Mäusen Blut abgenommen, und die Seren wurden auf die Gegenwart von Anti-5T33- oder Anti-A31-Antikörper untersucht. An Tag –7, –4 und –1 vor der Provokation und an Tag +2 und +5 erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von 100 μg Anti-CD4- (YTS 191.1.2) oder Anti-CD8- (YTS 169.4.2.1) Antikörper [Cobbold, S.P., Jayasuriya, A., Nash, A., Prospero, T.D. und Waldmann, H., Therapy with monoclonal antibodies by elimination of T-cell subsets in vivo, Nature 312, 548–551 (1984)] oder normalem Ratten-IgG als Vergleich. An Tag –1 oder an Tag +6 nach der Provokation wurden mononukleare periphere Blutzellen gesammelt und mit Anti-CD4/Anti-CD3 oder Anti-CD8/Anti-CD3 doppelgefärbt, um die Depletion zu analysieren, und durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren analysiert. Es wurde auch kontrolliert, dass keiner der depletierenden Antikörper das Verhalten der Tumoren beeinflusste. Die Tiere wurden auf ihr Überleben beobachtet.
Antikörperantworten
Antiidiotypische Antikörperwerte in Serum gegen IgM aus dem A31-Lymphom oder IgG aus dem 5T33-Myelom wurden gemäß einem bereits beschriebenen Verfahren gemessen [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Für Anti-PVXCP-Antikörper wurde PVXCP, isoliert aus CsCl-Gradient-gereinigten Virionen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. S.M. Angel), unter Anwendung des LiCl-Verfahrens von Goodman et al. [Goodman, R.M., Horne, R.W., und Hobart, J.M., Reconstitution of potato virus X in vitro, Virology 68, 299–308 (1975)] mit 10 μg/ml unter den gleichen ELISA-Bedingungen beschichtet. Die Messung von IgG1- und IgG2a-Subklassen in Mausserum-Antikörpern wurde bereits beschrieben [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Um Seren aus normalen menschlichen Individuen auf Anti-PVXCP-Antikörper zu testen, fand ein ähnlicher ELISA statt, wobei hier Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Sigma, Poole, Großbritannien), in einer Verdünnung von 1:2000 zur Detektion verwendet wurde.
Elektronenmikroskopie
Immunosorptions-Elektronenmikroskopie wurde mit Rastern eingesetzt, die mit Anti-PVX-IgG (Bioreba) beschichtet waren. Die Raster wurden dann mit 1 % (w/v) Uranylacetat negativ eingefärbt und unter Verwendung eines JEOL-Mikroskops mit 12000-facher Vergrößerung untersucht.
Impfung mit dem DNA-Fusionskonstrukt (scFv-PVCXP) fördert die Anti-Id-Antikörperproduktion im Lymphom- (A31-) und Myelom- (5T33-) Modell
Die scFv aus dem Maus-Lymphom (A31) oder -Myelom (5T33) enthaltenden Konstrukte wurden in syngenen Mäusen entweder alleine (p.scFv) oder fusioniert mit PVXCP-Sequenz (p.scFv-PVXCP) getestet. In jedem Fall konnte die scFv-Sequenz alleine keine signifikanten Werte an Anti-Id induzieren, der Voll-Ig erkennen kann (13a und 13b). Allerdings induzierten die scFv-PVXCP-Fusionsgene Anti-Id-Antikörper in beiden Modellen (a, b). Die Mengen variierten – nur 30–50 % der Mäuse reagierten im A31-Lymphommodell, aber 90–100 % im 5T33-Modell. Diese Ergebnisse waren in wiederholten Versuchen dieselben. Wie erwartet konnte das Vergleichsplasmid, das nur PVXCP-Sequenz enthielt, Anti-Id-Antikörper nicht induzieren. Konstrukte, die die PVXCP-Sequenz entweder alleine oder als Fusion enthielten, induzierten Antikörper gegen PVXCP (13c und 13d), wobei die p.scFv5T33-PVXCP-Fusion durchwegs am effizientesten war (d), was möglicherweise mit einem höheren Expressionsausmaß zusammenhing. Es fand nach der zweiten Injektion an Tag 21 jedenfalls eine Steigerung der Antikörpermenge statt, und ein weiterer kleiner Anstieg wurde nach der dritten Injektion an Tag 42 verzeichnet. Die Analyse gepoolter Seren für Ig-Subklassen von Antikörpern entweder gegen scFv oder PVXCP zeigte eine Dominanz von IgG2a und nur sehr geringe Mengen an IgG1. Im A31-Modell konnte IgG1 nicht detektiert werden, und im 5T33-Modell betrugen die Verhältnisse zwischen IgG1 und IgG2a für Anti-Id oder Anti-PVXCP 0,08:1 bzw. 0,02:1.
DNA-Fusionskonstrukte induzieren protektive Immunität gegen Lymphome und Myelome
Die Impfung von syngenen Mäusen mit den p.scFv-PVXCP-Fusionskonstrukten induziert protektive Immunität gegen Lymphome (A31) wie auch gegen Myelome (5T33) (14a und 16b). In jedern Fall war p.scFv alleine ineffektiv, und der p.PVXCP-Vergleich war negativ. Betreffend das Lymphom, in dem Anti-Id-Antikörper bei nur etwa 50 % der Mäuse detektiert wurden, gab es in allen Tieren Hinweise auf Schutz – ein Indikator für die Notwendigkeit von sehr wenig oder überhaupt keinem Antikörper. Schutzexperimente wurden drei Mal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Im A31-Modell entwickelten einige Mäuse in einem späteren Stadium (> 90 Tage) Lymphome, aber es bestand keine eindeutige Korrelation zwischen Langzeitüberleben und Antikörpermengen zum Zeitpunkt der Provokation. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Fluchtmechanismus in diesem späten Stadium zu bewerten. In beiden Modellen konnte die Injektion getrennter Plasmide, die für scFv oder PVXCP kodierten, keinen Schutz induzieren, was die Notwendigkeit der Fusion unterstreicht (Daten für das 5T33-Modell sind in 15 dargestellt).
Schutz vor Lymphomen und Myelomen umfasst CD4+-T-Zellen
Betreffend das A31-Lymphom sorgte die Depletion von CD4+-T-Zellen nach der Impfung durch wiederholte Injektion des monoklonalen Anti-CD4-Antikörpers für ein völliges Verschwinden des Schutzes (16a). Dies steht im Gegensatz zu Ergebnissen, die mit einem Konstrukt erzielt wurden, das eine scFv-Sequenz enthält, die mit einer für das Fragment C von Tetanustoxin kodierenden Sequenz fusioniert ist (scFv-FrC). Wie bereits früher beschrieben wurde [King et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)] und nunmehr in 16b bestätigt wird, induziert dieses Konstrukt Schutz gegen A31-Lymphome. Allerdings wird dieser Schutz durch die Depletion von CD4+-T-Zellen nicht aufgehoben (16b) und hängt daher wahrscheinlich von Antikörpern ab. Offenbar sind Antikörper für den durch scFv-PVXCP induzierten Schutz weniger entscheidend. Im Myelommodell wurde der durch das scFv-PVXCP-Konstrukt induzierte Schutz wiederum durch die Depletion von CD4+-T-Zellen aufgehoben (17). Dieses Ergebnis stimmt mit der Wirkungslosigkeit von Anti-Id-Antikörpern in Bezug auf den Schutz gegen Oberflächen-Ig-ve-Tumoren und mit der Beteiligung eines zellulären Mechanismus überein. Es gab keinen Einfluss auf den Schutz gegen Myelome, wenn eine Depletion an CD8+-Zellen stattfand (17). Die Rolle von CD8+-T-Zellen beim Schutz gegen A31-Lymphome war schwieriger zu beurteilen, da sich im Gegensatz zu 5T33 die Depletion auf das Wachstum des A31-Tumors auswirkte.
scFv-PVXCP-Fusionsprotein bildet selbstaggregierende Partikel
Um die molekulare Beschaffenheit des exprimierten scFv-PVXCP-Fusionsproteins zu untersuchen, wurden Konstrukte in COS-1-Zellen transfiziert und Überstände gesammelt. Das Fusionsprotein aus dem 5T33-Myelom wurde mit dem höchsten Wert (etwa 50 ng/ml) exprimiert und daher für die weitere Untersuchung ausgewählt. Unter Anwendung von ELISA zur Detektion von PVXCP-Protein stellten die Anmelder fest, dass durch das Zentrifugieren mit 40.000 U/min (135.000 × g) 2 Stunden lang die gesamte detektierbare PVXCP-Reaktivität sedimentierte – ein Indikator dafür, dass das Fusionsprotein eine hohe Molekülgröße aufwies. Ein ähnliches Ergebnis wurde unter Verwendung nur des pflanzlichen PVXCP erzielt. Da das Fusionsprotein oder das freie PFXCP durch SDS-AGE in Monomere der erwarteten Größe von 54 kD bzw. 24 kD aufgelöst werden konnte (18a) müssen die exprimierten Proteine Selbstaggregation – vermutlich durch die PVXCP-Komponente vermittelt – erfahren. Die exprimierte scFv-PVXCP- oder PVXCP-Proteine umfassenden Überstände wurden durch Elektronenmikroskopie mittels Immunotrapping mit Anti-PVX-IgG untersucht. Die Aggregate waren detektierbar (18b), wobei ihr Aussehen jenem von aus Viruspartikeln isoliertem PVXCP ähnelte – dies belegt die allgemein bekannte Tendenz von Potexvirus-Hüllproteinen zur Selbstaggregation. Unter physiologischen Bedingungen bildet PVXCP Aggregate, umfassend Doppellagenscheiben mit neun Untereinheiten pro Lage sowie Stapel davon [Goodman, R.M., Horne, R.W. und Hobart, J.M., Reconstitution of potato virus X in vitro, Virology 68, 299–308 (1975); Erikson, J.W., Bancroft, J.B. und Stillman, M.J., Circular dichroism studies of papaya mosaic virus coat protein and its polymers, J. Mol. Biol. 147, 337–349 (1981)]. Offenbar verändert die Fusion von scFv die Form oder die Größe der Aggregate nicht, und offen bar präsentiert das mit PVXCP fusionierte scFv mehrere Kopien auf den PVXCP-Aggregaten. Wie erwartet bilden unter den Expressionsbedingungen in Abwesenheit viraler RNA die PVXCP-Untereinheiten keine Virus-ähnlichen Helices.
Diskussion von Beispiel 4
DNA-Konstrukte bieten eine Plattform zur Manipulation von aus Tumoren abgeleiteten Genen, wobei das Ziel darin besteht, die Präsentation des kodierten Antigens gegenüber dem Immunsystem zu optimieren [Gurunathan, S., Klinman, D.M., und Seder, R.A., DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu. Rev. Immunol. 18, 927–974 (2000)]. In Bezug auf Krebs ermöglichen DNA-Vakzinen die rasche Untersuchung der Fähigkeit ausgewählter Sequenzen, Effektormechanismen zu induzieren, die Tumorwachstum in Modelsystemen supprimieren können. In Bezug auf idiotypische Antigene von B-Zelltumoren war es bereits vorher offenkundig, dass einfache Konstrukte nur mit scFv nicht in der Lage sind, signifikante Anti-Id-Antworten zu induzieren [Stevenson, F.K. et al., Idiotypic DNA vaccines against B-cell lymphoma. Immunol. Rev. 145, 211–228 (1995)], dass aber die Fusion der FrC-Sequenz von Tetanustoxin zur Steigerung protektiver Immunität gegenüber Lymphomen und Myelomen führt [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Allerdings besitzen die meisten Patienten bereits existierende Immunität gegenüber Tetanustoxin, und obwohl dies offenbar nicht die Induktion von Immunität gegenüber dem scFv-FrC-Fusions-Gen verhindert [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)], könnten die induzierten Wege dadurch beeinflusst werden. Die Anmelder entschieden sich demzufolge, ein alternatives verstärkendes Gen zu untersuchen, das aus einem pflanzlichen viralen Hüllprotein stammt (PVXCP). Im Gegensatz zu FrC wurde in Humanseren kein Antikörper gegen PVXCP detektiert (Daten nicht dargestellt). Daher wäre im Primingstadium kein bereits existierender Antikörper vorhanden, obwohl sich ein derartiger Antikörper nach der Impfung entwickeln kann. Unabhängig von der Tatsache, dass es sich hier um ein primäres Antigen in Menschen handelt, stellten die Erfinder jedoch fest, dass das scFv-PVXCP-Fusions-Gen einen distinktiven CD4+-T-Zellen-vermittelten Schutzmechanismus gegen B-Zelltumoren herbeiführt.
Das Erfordernis der Fusion der scFv- und PVXCP-Proteine zur Förderung einer spezifischen T-Zellantwort scheint ein Beispiel für die "verbundene T-Zellhilfe" zu sein. Dieses Phänomen, wonach eine immunologisch stille Determinante immunogen gemacht werden kann, wenn sie mit einem dominanten, von einem Pathogen stammenden Antigen verbunden ist, wurde für ein Mucin- (MUC-1-) Peptid beschrieben, das mit einem Parasiten-abgeleiteten Peptid verbunden ist, das innerhalb eines Voll-Ig-Moleküls zugeführt wird [Gerloni, M. et al., Functional cooperation between T helper cell determinants. PNAS USA 97, 13269–13274 (2000)]. Obwohl in diesem Modell beide Epitope Fremdepitope waren und Tumorschutz nicht bewertet wurde, wurde klar die Aktivierung der CD4+-T-Zellen durch Verknüpfung aufgezeigt, wobei der Mechanismus wahrscheinlich das Hochreglieren der co-stimulierenden Fähigkeit von Antigen-präsentierenden Zellen umfasst [Gerloni, M. et al., Functional cooperation between T helper cell determinants. PNAS USA 97, 13269–13274 (2000)]. Hier zeigten die Anmelder, dass CD4+-T-Zellen gegen ein verbundenes autologes Tumorantigen auch durch diesen Mechanismus gestärkt werden können. Die CD4+-T-Zellpopulation scheint zum Schutz gegen Lymphome fähig zu sein, und es liegt auf der Hand, dass sie für den Schutz gegenüber Oberflächen-Ig-ve-Myelome von entscheidender Bedeutung ist.
Ein Merkmal des exprimierten scFv-PVXCP-Fusionsproteins besteht darin, dass es Aggregate bildet, z.B. Strukturen übereinander gestapelter Scheiben [Goodman, R.M., Horne, R.W. und Hobart, J.M., Reconstitution of potato virus X in vitro. Virology 68, 299–308 (1975)]. Es ist bekannt, dass die Aktivierung der Immunantwort durch die Molekülform des Antigens beeinflusst wird, wobei große Aggregate besonders immunogen sind – vermutlich da Pathogene üblicherweise diese Struktur aufweisen [Zinkernagel, R.M., Immunology and autoimmunity studied with viruses, in: The Molecular basis of cellular defence mechanisms 105–129, Wiley, Chichester (1997)]. In Bezug auf DNA-Vakzinen ist es noch nicht bekannt, ob die wesentliche In-vivo-Präsentationsroute den Export aus transfizierten Muskelzellen umfasst [Ulmer, J.B., Deck, R.R., DeWitt, C.M., Donnely, J.J. und Liu, M.A., Generation of MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes by expression of a viral protein in muscle cells: antigen presentation by non-muscle cells. Immunology 89, 59–67 (1996); Corr, M., von Damm, A., Lee, D.L. und Tighe, H., In vivo priming by DNA occurs predominantly by antigen transfer. J. Immunol. 163, 4721–4727 (1999)] oder die direkte Präsentation durch transfizierte APC vorsieht [Condon, C., Watkins, S.C., Celluzzi, C.M., Thompson, K. und Falo, L.D. Jr., DNA-based immunization by in vivo transfecton of dendritic cells. Nature Medicine 2, 1122–1128 (1996); Casares, S., Inaba, K., Brumeanu, T.D., Steinman, R.M. und Bona, C.A., Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope. J. Exp. Med. 186, 1481–1486 (1997)]. Alle diese Konstrukte besitzen eine Leadersequenz, und Fusionsproteine können aus COS-1-Zellen exportiert werden. Allerdings erzielt die Fusion von PVXCP ein anderes Immunergebnis als Fragment C von Tetanustoxin. In Bezug auf scFv-PVXCP betrifft die Anti-Id-Antikörperantwort fast zur Gänze die IgG2a-Subklasse, während die Fusion von scFv-FrC einen hohen Wert an IgG1 induziert [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Im 5T33-Modell induzierte die PVXCP-Fusion Anti-Id mit einem Verhältnis zwischen IgG1 und IgG2a von 0,08:1, was sich deutlich vom durch scFv-Frc induzierten Verhältnis von 28:1 unterscheidet [King, C.A. et al., Nature Medicine 4, 1281–1286 (1998)]. Dies legt nahe, dass das aggregierte Antigen die T_H1-dominierte Antwort amplifiziert, die bereits durch die mittels DNA-Injektion geschaffene Cytokinumgebung aktiviert wurde [Roman, M. et al., Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants. Nature Medicine 3, 849–854 (1997)]. Die Induktion einer IgG2a-dominanten Antwort wurde auch unter Verwendung von mit chimären Viruspartikeln verbundenen Peptiden festgestellt [McInerney, T.L., Brennan, F.R., Jones, T.D. und Dimmock, N.J., Analysis of the ability of five adjuvants to enhance immune responses to a chimeric plant virus displaying an HIV-1 peptide. Vaccine 17, 1359–1368 (1999)].
Die Prinzipien der Amplifikation von Immunantworten gegen Tumorantigene durch genetische Verknüpfung können auf viele Bereiche angewendet werden. In Bezug auf DNA-Vakzinen zeigten die Erfinder bereits, dass die Förderung von Antikörperantworten gegen verschiedene Tumorantigene, z.B. MUC-1 und karzinoembryonales Antigen, durch Fusion mit FrC 30 erreicht werden kann. [Stevenson, F.K, et al., Genetic vaccination against defined tumour antigens of B-cell malignancies. Rev. Clin. Exp. Hematol. 9, 2–21 (1999)]. Offenbar ist PVXCP beim Amplifizieren von CD4+-T-Zellantworten gegen verbundene Tumorantigene überlegen; diese sind derzeit Gegenstand von Untersuchungen. Die Stärkung der CD8+-T-Zellantwort kann auch über Verbindung erfolgen, und obwohl die Maus-scFv-Sequenzen wenige oder keine Kandidaten für MHC-Klasse-I-bindende Peptide enthalten [Zhu, D. et al., Immunoglobulin V_H gene sequence analysis of spontaneous murine immunoglobulinsecreting B-cell tumours with clinical reatures of human disease. Immunology 93, 162–170 (1998)], findet man sie in anderen Tumorantigenen. Es ist klar, dass es zahlreiche Effektorwege gibt, die gegen Krebszellen wirken könnten, und dass man Fusions-Gene auswählen kann, um die für das Zielantigen geeignetsten zu aktivieren.
Zusammenfassend gesagt nahmen die Erfinder eine genetische Fusion von PVXCP mit einem Lymphom-assoziierten Antigen vor (scFv-A31) und verwendeten das Konstrukt für die DNA-Impfung von Mäusen. Dies führte zu erhöhten Antikörperantworten und zum Schutz gegenüber der Provokation mit A31-Lymphom. Außerdem zeigten die Anmelder, dass dieser Schutz durch CD4-positive Zellen vermittelt wurde. Dies steht im Gegensatz zur DNA-Impfung unter Verwendung einer Fusion von FrC mit scFv-A31, wo ein solcher Schutz nur durch Antikörper gegen scFv vermittelt wird. Die Erfinder fusionierten auch ein Myelom-spezifisches Antigen scFv-5T33 mit PVXCP und impften anschließend Mäuse mit dem Konstrukt. Dies hatte die Induktion von Antikörperantwort gegen scFv-5T33 und den Schutz vor Provokation mit 5T33-Myelom zur Folge. Die Erfinder bestimmten überdies, dass ein derartiger Schutz gegen Myelome durch CD4-positive T-Zellen vermittelt wird. Diese Depletion wurde durch Verwendung von Anti-CD4+-Antikörpern erzielt, um Zellen vor der Provokation durch den Tumor zu entfernen.
Die Anmelder zogen den Schluss, dass pflanzliche virale Hüllproteine, z.B. PVXCP, als Adjuvanssequenz für die Induktion protektiver Immunität zumindest gegen Lymphome und Myelome wirken können. Sie beobachteten außerdem, dass es – sowohl hinsichtlich der Molekülstruktur als auch hinsichtlich der durch die DNA-Impfung induzierten Immunitätspfade – einige Unterschiede zwischen PVXCP und FrC gibt.
Beispiel 5: Immunogene Eigenschaften einer PVXCP-Fusionsvakzine im BCL1-Lymphommodell
Die Erfinder evaluierten die immunogenen Eigenschaften von DNA-Vakzinen auf PBXCP-Basis in einem weiteren BCL1-Lymphommodell, das dem A31-Lymphommodell aus Beispiel 4 ähnelt und auch ein Tumor-spezifisches Ig auf der Zelloberfläche aufweist.
ScFv aus BCL1-Tumor-Ig wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 mit PVXCP fusioniert. Mäuse wurden mit der resultierenden p.scFvBCL-1-PVXCP-Vakzine geimpft, und es wurden dadurch Antikörperantworten gegen BCL1-Ig und Schutz der Mäuse vor Provokation mit BCL1-Tumor hervorgerufen. Die Ergebnisse sind aus 19 ersichtlich.

Claims

Nucleinsäurekonstrukt zur In-vivo-Zufuhr in lebende Zellen zur Induktion einer Immunantwort in einem Patienten gegen ein Antigen, wobei das Konstrukt die Expression eines Fusionsproteins steuert und das Fusionsprotein das Antigen und ein Adjuvans umfasst, worin das Adjuvans ein Kartoffelvirus-X-Hüllprotein (PVXCP) ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, worin das Adjuvans eine Helfer-T-Zellantwort fördert.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Adjuvans ein Helfer-T-Zellepitop umfasst.
Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Antigen ein Eigen- oder verändertes Eigenpolypeptid des Patienten ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das Eigen- oder veränderte Eigenpolypeptid ein Tumor-assoziiertes Antigen ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 5, worin das Tumor-assoziierte Antigen eine idiotypische Determinante eines T-Zellrezeptors ist, der an der Oberfläche einer malignen T-Zelle exprimiert wird.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, worin das Tumor-assoziierte Antigen eine idiotypische Determinante einer malignen B-Zelle ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die idiotypische Determinante als ein Einketten-Fv-Fragment exprimiert wird.
Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Antigen von einem Pathogen abgeleitet ist.
Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, worin das Pathogen ein Virus ist.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Erhöhung einer Immunantwort gegen ein Antigen, worin das Verfahren folgende Schritte umfasst: Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für das Antigen kodiert; Klonieren der Nucleinsäuresequenz; und Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor er möglicht, dass das Antigen als eine Fusion mit einem Adjuvans exprimiert wird, worin das Adjuvans PVXCP ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Antigen ein Eigen- oder verändertes Eigenpolypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Antigen von einem Pathogen abgeleitet ist.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleinsäurekonstrukts zur Behandlung eines Patienten, der an B-Zellmalignität leidet, worin das Verfahren folgende Schritte umfasst: Identifikation einer Nucleinsäuresequenz, die für eine idiotypische Determinante kodiert, die an den malignen B-Zellen des Patienten vorhanden sind, durch Analyse einer Probe an vom Patienten stammenden Zellen; Klonieren dieser Nucleinsäuresequenz, die für die idiotypische Determinante kodiert; und Einführen der klonierten Nucleinsäure in einen Vektor, wobei der Vektor ermöglicht, dass die idiotypische Determinante als eine Fusion mit einem Adjuvans exprimiert wird, worin das Adjuvans PVXCP ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, worin das Pflanzenvirus-Hüllprotein ein Helfer-T-Zellepitop umfasst.
Nucleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung in einem Verfahren medizinischer Behandlung.
Verwendung eines Nucleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Herstellung einer Vakzine zur Behandlung oder Prävention eines Erkrankungszustandes, der mit dem Antigen in Verbindung steht.
Verwendung nach Anspruch 18 in Verbindung mit Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die idiotypische Determinante aus Proben kloniert wurden, die dem Patienten entnommen wurden, dem die Vakzine zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin die Nucleinsäure nicht enkapsidiert ist.