DE69333375T2

DE69333375T2 - Verbesserungen in oder bezogen auf modifikationen der immunantwort

Info

Publication number: DE69333375T2
Application number: DE69333375T
Authority: DE
Inventors: Robert Edward Hawkins; Stephen James Russell; Freda Katherine Stevenson; Gregory Paul Winter
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-04
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2013-10-05
Also published as: EP0663008A1; AU685399B2; GB9220808D0; DE69333375D1; WO1994008008A1; AU4832493A; JPH08501699A; JP4011105B2; CA2145064A1; CA2145064C; EP0663008B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung der Immunreaktion eines Individuums und neue Zusammensetzungen zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung und Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen.
Hintergrund der Erfindung
Es sind mehrere Publikationen erschienen, welche die Einführung von in retrovirale Vektoren verpackter DNA in Säugetierwirte beschreiben. In neuerer Zeit beschrieben Wolff et al., Science 297, 1465–1468 (1990), Experimente, in denen (Reportergene, wie z. B. Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Luciferase und β-Galactosidase, tragende) RNA- und DNA-Expressionsvektoren ohne Verwendung eines Virusverpackungsvektors in Maus-Skelettmuskel initiiert wurden. Verschiedene Tests zeigten, dass die Reportergene in manchen der Muskelzellen exprimiert wurden.
Danach überdachten Felgner und Rhodes, Nature 349, 351–352 (1991), die Ergebnisse verschiedener Experimente, welche die Verwendung initiierter DNA (verpackt sowie „nackt") umfassten, um die Expression fremder Gene zu lenken, und schlugen das Konzept vor, injizierte DNA zum Zwecke der Immunregulation zu verwenden. Im Speziellen erklärten sie, dass „manche dieser Konzepte durch Verwendung eines Plasmids getestet worden sind, welches das Gen für eine sekretierte Form des Human-Immundefizienz-Virus-gp120-Protein enthält und vom Cytomegalovirus-(CMV-) Promotor angetrieben wird". Sie entdeckten, dass eine einzige Injektion der DNA einen hohen IgG-Titer gegen das fremde Protein induzierte.
1992 entwickelten Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992), das Konzept der „genetischen Immunisierung" weiter. Diese Wissenschaftler verwendeten mit Plasmid-DNA beschichtete Gold-Mikroteilchen, um ein für die Expression von Humanwachstumshormon (hGH) kodierendes Gen unter der Kontrolle des Human-β-Actins oder des CMV-Promotors in Mäuse einzuführen. Es erwies sich später, dass die Mäuse eine Serumantikörperreaktion gegen hGH entwickelten.
A. J. T. George und F. K. Stevenson, Intern. Rev. Immund. 4, 271–310 (1989), lehren die Verwendung eines von einer Tumorzelle hergeleiteten idiotypischen Antikörpers zur Verwendung bei der Impfung des Tumor-beherbergenden Wirts. Sie veranschaulichen den Erfolg der Verwendung solcher Selbst-Proteine für Immunisierungen.
D. Tang et al., Nature 356, 12. März 1992, offenbaren die Verwendung eines fremden Antigens (hGH) als DNA-Vakzinen. Sie berichten, dass das für ein Protein kodierende direkt in einem Wirt eingeführt werden kann und dass das kodierte Protein eine Immunreaktion auslöst.
Zusammenfassend ist gezeigt worden, dass es möglich ist, genetische Immunisierung zu verwenden, um in Mäusen eine Immunreaktion gegen stark immunogene fremde Proteine hervorzurufen. Es ist bisher nicht vorgeschlagen oder für möglich gehalten worden, dass solche Verfahren zur Regulation der Immunreaktion gegen im Wesentlichen nichtimmunogene "Selbst"- oder „veränderte Selbst"-Polypeptide verwendet werden könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Immunmodulationszusammensetzung zur Modulation der Immunreaktion gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen bereit, wobei die Zusammensetzung eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Expression des Tu mor-assoziierten Antigens in eine Form lenkt, die mit dem Immunsystem des Individuums in Wechselwirkung tritt.
Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz eine die extrazellulär kloniert worden ist.
Ein solches Tumor-assoziiertes Gen könnte beispielsweise die idiotypische Determinante eines Immunglobulins sein (exprimiert an der Oberfläche eines B-Zellen-Lymphoms).
Ein Tumor-assoziiertes Gen leitet sich in einem Individuum aus einem Selbst-Polypeptid durch in vivo auftretende Prozesse her, welche die für das besagte Polypeptid kodierende Nucleinsäuresequenz verändern. Solche Prozesse umfassen üblicherweise zum Beispiel Deletionen, Additionen, Substitutionen und Translokationen.
Vorzugsweise wird die Nucleinsäuresequenz aus Proben kloniert, die vom Individuum erhalten werden, an das dieses abgegeben wird.
Vorzugsweise wird die Nucleinsäuresequenz in nichtcapsidierter Form (d. h., nicht in ein Virusteilchen oder in einer anderen Verpackung eingeschlossen). Die Nucleinsäure kann jedoch mit der äußeren Oberfläche einer Verpackung oder eines Teilchens (z. B. eines Liposoms) assoziiert sein.
Nach der Abgabe an das Individuum, kann das Tumor-assoziierte Antigen isoliert exprimiert werden. Bevorzugter jedoch wird das Tumor-assoziierte Antigen coexprimiert oder als Fusion mit einem weiteren Immunmodulationspolypeptid exprimiert.
Es ist folglich eine bevorzugte Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, dass die Immunmodulationszusammensetzung weiters eine zweite Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Expression eines weiteren Immunmodulationspolypeptids zum Zwecke der weiteren Modulation der Immunantwort auf das Tumor-assoziierte Antigen lenkt. Diese zweite Nucleinsäuresequenz kann auf demselben Nucleinsäuremolekül wie die erste Nucleinsäuresequenz oder auf einem zweiten Nucleinsäuremolekül vorliegen.
Das weitere Immunmodulationspolypeptid kann beispielsweise ein Zytokin oder ein fremdes Polypeptid (z. B. ein Virushüllprotein) sein.
Wenn sowohl die erste als auch die zweite Nucleinsäuresequenz auf demselben Nucleinsäuremolekül vorliegen, können die Sequenzen so angeordnet werden, dass sie für die Expression eines Fusionspolypeptids sorgen, das sowohl das Tumor-assoziierte Antigen als auch das weitere Immunmodulationspolypeptid umfasst.
Wenn das erste und das zweite Nucleinsäuremolekül auf verschiedenen Molekülen vorliegen, erfolgt die Anordnung vorzugsweise derart, dass das Tumor-assoziierte Antigen bei Einführung in das Individuum coexprimiert wird. Weiters kann die Anordnung so erfolgen, dass das Tumor-assoziierte Antigen und das weitere Immunmodulationspolypeptid bei Expression in demselben Individuum (indirekt oder direkt) assoziieren können. Typischerweise ist die Nucleinsäuresequenz eine Desoxyribonucleinsäuresequenz.
Dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die Immunmodulationszusammensetzung der vorliegenden Erfindung genutzt werden könnte, um die Immunreaktion auf ein bestimmtes Tumor-assoziiertes Antigen entweder zu verstärken oder zu unterdrücken. Es ist klarerweise erwünscht, die Immunantwort auf ein Antigen zu verstärken, so dass das Wachstum des Tumors vermindert: oder zum Stillstand gebracht wird. Es kann die Verstärkung der Immunantwort auf die folgenden Tumor-assoziierten Gene erwünscht sein: idiotypische Determinanten am Immunglobulin, die an der Oberfläche von B-Zellen-Malignitäten exprimiert werden; idiotypische Determinanten von B-Zellen-Rezeptoren (TCRs), die an der Oberfläche von T-Zellen-Malignitäten exprimiert werden; mutierte Onkogene oder andere Selbst-Polypeptide, die an der Oberfläche von Tumoren exprimiert werden; sowie onkofötale Antigene.
Es können jedoch auch Situationen überlegt werden, in denen gewünscht wird, die Immunantwort auf ein bestimmtes Selbst-Polypeptid oder verändertes Selbst-Polypeptid abzuschwächen. Beispielsweise können Selbst-Polypeptide der Grund für eine inadäquate Immunantwort sein, die in einer schädigenden Autoimmunerkrankung resultiert (z. B. primärchronische Polyarthritis, multiple Sklerose, Diabetes). Alternativ dazu können Patienten eine Immunreaktion auf therapeutische Proteine (z. B. Antikörper, an Diabetiker verabreichtes Insulin, an Bluter verabreichter Faktor VIII) aufbauen, die daher die Wirksamkeit der Behandlung herabsetzen. Eine weitere Möglichkeit wäre die Unterdrückung von Immunantworten auf MHC-Antigene, wodurch Probleme mit der Transplantatabstoßung vermindert werden, was die Transplantation über MHC-Inkompatibilitätsbarrieren hinweg ermöglicht. Vom Zytokin Interleukin –10 (IL-10) ist gezeigt worden, dass es eine immunsuppressive Wirkung ausübt und folglich könnte die Coexpression eines Selbst-Polypeptids oder veränderten Selbst-Polypeptids mit IL-10 in einem Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung ein wünschenswerter Ansatz sein.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Immunmodulationszusammensetzung bereit, um die Immunreaktion auf ein Tumor-assoziiertes Antigen zu modulieren, das Folgendes umfasst: Identifizieren der für das Tumorassoziierte Antigen kodierenden Nucleinsäuresequenz durch Analyse einer geeigneten Probe aus einem Patienten und extrazelluläres Klonen daraus; insertieren der Nucleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor und Verabreichen des Vektors an einen Patienten, um die Expression des Krankheitsmarkers in eine Form zu bewirken, die mit dem Immunsystem wechselwirkt.
Typischerweise wird die für das Tumor-assoziierte Antigen kodierende Nucleinsäure mittels PCR aus dem Patienten kloniert.
Typischerweise ist das Tumor-assoziierte Antigen eine idiotypische Determinante aus einem Immunglobulin, das an der Oberfläche einer B-Zellen-Malignität exprimiert wird, oder eine idiotypische Determinante aus einem T-Zellen-Rezeptor, der an der Oberflä che einer T-Zellen-Malignität exprimiert wird. Alternativ dazu ist das Tumor-assoziierte Antigen ein onkofötales Antigen.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Abgabe an lebende Zellen in vivo zur Modifizierung der Immunantwort eines Individuums auf ein Tumor-assoziiertes Antigen bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, welche die Expression eines Tumor-assoziierten Antigens in eine Form lenkt, die mit dem Immunsystem des Individuums wechselwirkt.
Die Erfindung stellt weiters die Verwendung einer Immunmodulationszusammensetzung gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Modifizierung der Immunreaktion eines Individuums bereit, worin die Modifikation das Abgeben der Nucleinsäuresequenz, die die Expression des Tumor-assoziierten Antigens in eine Form lenkt, die mit dem Immunsystem des Individuums wechselwirkt, an lebende Zellen des Individuums in vivo umfasst.
In einer speziellen Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Vakzinen-Nucleinsäure bereit, die verwendet werden kann, um eine Immunreaktion gegen transformierte Human-Lymphozyten auszulösen, die einen idiotypischen Marker präsentieren, der für Proteine kodiert, welche die variablen Schwer- und Leichtkettenregionen eines idiotypischen Antikörpers umfassen, der an der Oberfläche einer malignen Human-B-Zelle präsentiert wird.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die folgenden Abbildungen näher beschrieben:
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens der PCR-Assemblierung der scFv exprimierenden DNA;
2 zeigt die Sequenz der Vektoren, die verwendet wurden, um idiotypisches scFv-Immunglobulin zu exprimieren und zu reinigen.
3 ist eine schematische Darstellung des zur Produktion des Plasmids pNipenv angewendeten Verfahrens;
4 ist eine schematische Darstellung der Plasmidkonstrukte pNipenv, pSV2 Nipenv, pSV2 Nip Stopp env und pSV2 BCL env;
5 zeigt die Sequenz eines HindIII-Xbal-Fragments des Vektors pVAC1;
6 ist eine Grafik, die die Ergebnisse eines Immunisierungsexperiments zeigt;
7 zeigt die gesamte Sequenz des Vektors pVAC1;
8 zeigt eine pVAC1-Restriktionskarte;
9 zeigt eine schematische Darstellung der Haupteigenschaften von pVAC1;
10 ist eine Grafik, die die Ergebnisse eines Immunisierungsexperiments zeigt; und
11 (a, b) zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse.
Die idiotypischen Determinanten von Oberflächen-Immunglobulinen, die an gewissen Typen von B-Zellen-Nicht-Hodgkin-Lymphomen (NHL) exprimiert werden, sind einzigartige tumorspezifische Antigene. An sich sollten sie geeignete Ziele für verschiedene immuntherapeutische Anti-Lymphom-Strategien sein. Monoklonale Maus-Antikörper (MAbs) gegen idiotypische Determinanten an B-Zellen-NHLs haben in therapeutischen Menschenversuchen begrenzten Nutzen gezeigt. Partielle und vollständige Antworten sind beobachtet worden, jedoch neigen Maus-MAbs dazu, Human-Effektorfunktionen ineffizient zu rekrutieren und sind selbst das Ziel einer Human-Anti-Maus-Antikörperantwort. Weiters ist ein Auswuchs negativer Ig-Lymphomzellen im Anschluss an die Therapie beobachtet worden. Angesichts dieser Einschränkungen gepaart mit den Kosten und der Schwierigkeit der Erzeugung MAbs für individuelle Patienten ist der Ansatz nicht breit angewendet worden. Es ist jedoch klar, dass anti-idiotypische Antikörper therapeutisches Potential bei B-Zellen-NHL haben.
Eine der Alternativen zu passiver anti-idiotypischer Serotherapie ist eine aktive Immunisierung, die das Ziel hat, die Toleranz zu brechen und eine starke antiidiotypische Antikörperreaktion im Patienten zu induzieren. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes ist, dass er auch das Potential aufweist, T-Zellen-vermittelte Immunantworten auf das Lymphom zu stimulieren. Das Problem dabei ist es, wie das Antigen (der idiotypische Antikörper) am besten zu präsentieren ist, um die Toleranz zu brechen und eine wirksame Anti-Lymphom-Immunantwort zu stimulieren. Bemühungen zur Tumorimmunitätsstimulierung unter Verwendung modifizierter Tumorzellenvakzinen waren nur eingeschränkt erfolgreich. Spezifische Vakzinen auf Basis der Verwendung von chemisch an höchst immunogene Trägerproteine gekoppeltem idiotypischem Immunglobulin erwiesen sich in Tiermodellen als erfolgreicher und liefern sowohl Schutz, als auch therapeutische Wirkung (George und Stevenson, Intern. Rev. Immunol. 4, 271–310 (1989)).
Für Lymphome, die wenig Immunglobulin sekretieren, ist die Herstellung des Idiotyps das Hauptproblem. Die Erfinder haben verschiedene Strategien zur Entwicklung einfacher, wirksamer Vakzinen erforscht, die an auf Basis eines individuellen Patienten mittels PCR- und DNA-Sequenzierungsverfahren hergestellt werden können, um die Gene des idiotypischen Immunglobulins zu identifizieren.
In einer speziellen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nucleinsäurevakzine bereit, die verwendet wird, um eine Immunreaktion gegen Human-Lymphozyten auszulösen, die einen idiotypischen B- oder T-Zellen-Marker, Antikörper oder TCR, präsentieren und in dem die Nucleinsäure für Polypeptide kodiert, die beide variablen Regionen (VH/VL; Va/Vb; Vg/Vd) umfassen.
Die am Zelloberflächen-Immunglobulin (Ig) von B-Zellen-Lymphomen exprimierten idiotypischen Determinanten können als Tumor-assoziierte Antigene agieren (für einen Überblick siehe George und Stevenson (1989)). Desgleichen könnte Zelloberflächen-TCR ebenfalls als Tumor-assoziiertes Antigen in T-Zellen-Lymphomen agieren (Janson et al., Cancer Immunol. Immunother. 28, 225–232 (1989)). An sich stellen sie ein attraktives Ziel für die Therapie dar, vor allem für die Verabreichung passiver anti-idiotypischer Antikörper an Patienten (Miller et al., New Engl. J. Med. 306, 517–522 (1982)). Obgleich die somatische Mutation der malignen Ziel-B-Zelle in einem Ausbrechen des Ziels aus dem anti-idiotypischen Antikörper resultieren kann (Levy et al., J. Immunol. Rev. 96, 43-(1987); Bahler und Levy, PNAS 89, 6770–6774 (1992)), ist der vollständige Verlust der Immunglobulinexpression selten (Meeker et al., New Engl. J. Med. 312, 1658–1665 (1985); Zelentz et al., Ann. Oncol. 2, 115–122 (1990)). Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung der idiotypischen Determinanten für aktive Immuntherapie, dass heißt, die Immunisierung des Tumor-tragenden Wirts mit idiotypischem Ig aus den Tumorzellen, wodurch eine autologe antiidiotypische Antwort hervorgerufen wird (siehe George und Stevenson (1989)). Da die Antwort polyklonal ist, ist es für die Ziel-B-Zelle schwieriger, der Selektion entgehen und darüber hinaus wird die Antwort kontinuierlich vorhanden sein und könnte daher in der Lage sein, den Rest der Krankheit zu kontrollieren. Tatsächlich erwies sich die aktive Immunisierung mit idiotypischem Ig vor der Tumorexposition als wirksam bei der Suppression von B-Zellen-Modelltumoren (Stevenson und Gordon, J. Immunol. 130, 970–973 (1983); George et al., J. Immunol. 138, 628–634 (1987); Campbell et al., J. Immunol. 139, 2825–2833 (1987)) in Tieren, um entstehende Tumoren tragende Tiere zu behandeln (George et al., J. Immunol. 141, 2168–2174 (1988)). Darüber hinaus ist die idiotypische Immunisierung mit aus Patienten mit Lymphomen isoliertem Human-Ig mit anhaltender Tumorregression in Verbindung gebracht worden (Kwak et al., New Engl. J. Med. 327, 1209–1215 (1992)). Es ist jedoch schwierig und zeitaufwändig, den idiotypischen Human-Antikörper zu isolieren, da das Nicht- Hodgkin-Lymphom betreffend, obgleich es sich an der Oberfläche der Lymphozyten befindet, wenig Immunglobulin sekretiert wird. Um genügend idiotypischen Antikörper zur Immunisierung herzustellen, müssen Heterohybridome durch Fusion mit Maus-Zelllinien hergestellt und der Antikörper dann gereinigt werden (Carroll et al., J. Immunol. Methods 89, 61–67 (1985)). Die Ausbeute ist häufig niedrig und es muss anschließend nachgewiesen werden, dass sich die Fusion vom Human-B-Zellen-Tumor herleitet.
In einer speziellen Ausführungsform führt die Erfindung zur Isolierung der V-Gene aus den Tumor-B-Zellen, um das Idiotop (und Paratop) des Tumor-Antikörpers zu exprimieren. Demnach werden beginnend mit eine Proben von B-Zellen aus dem Patienten die umgeordneten V-Gene der Schwer- sowie Leichtketten unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion und „universellen" Primern amplifiziert (Orlandi et al., PNAS 86, 3833–3837 (1989); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991); siehe auch Tabelle 1, Seq.-ID Nr. 1–48). Die amplifizierten V-Gene werden kloniert und dann sequenziert (Sanger et al., PNAS 74, 5463–5467 (1977)). Jene aus den malignen B-Zellen werden als repetierte VH- und VL-Gensequenzen identifiziert. In mehreren Patienten und für Schwer- sowie Leichtketten war es möglich, eine gemeinsame repetierte Sequenz zu identifizieren. Diese Sequenzen wurden anschließend im Fall von drei Patienten durch Sequenzierung der Gene aus Heterohybridomen bestätigt. Die Kombination der Schwer- und Leichtketten identifiziert das Idiotop des Tumors (Beispiel 1). Im Prinzip wäre es auch möglich, die umgeordneten V-Gene innerhalb derselben Zelle zu amplifizieren und zu verbinden (Embleton et al., Nucl. Acids Res. 20, 3831–3837 (1992)), um eine Hauptkombination verbundener Schwer- und Leichtkettensequenzen zu identifizieren, die das Idiotop identifizieren, jedoch werden hier VH und VL getrennt identifiziert und dann mittels PCR-Assemblierung verbunden. Die VH- und VL-Gene werden zur Expression beider V-Domänen als funktionelles Antikörperfragment, beispielsweise als verbundenes Einzelketten-Fv-Fragment (siehe unten) in Vektoren kloniert.
In früheren Arbeiten wurden in einem Mausmodell für Lymphome die V-Gene des Tumor-Idiotops kloniert und als Leicht- und Schwerketten-Fusionsproteine in Bakterien exprimiert. Die gesonderten Ketten wurden dann als Immunogene verwendet. Jedoch wurden die gesonderten Ketten denaturiert und jedenfalls nicht coexprimiert, um das Paratop des Antikörpers zu liefern. In der Tat schlugen die Autoren vor, dass „zukünftige Arbeiten an Peptiden mit festgelegten Konfigurationen ähnlich den im nativen Protein vorhandenen Epitopen sich als nützlich erweisen könnten, sowie auch die Coexpression der VH- sowie VL-Gene in Bakterien, um ein rekombinantes Fv-Protein herzustellen" (Campbell et al. (1987), oben zitiert). Die Autoren lehrten jedoch nicht, wie man die V-Gene des Idiotops isolieren kann. Die Autoren lehrten auch nicht, wie man die rekombinanten Fv-Fragmente in eine Vakzine kombinieren kann. Idealerweise sollte eine Vakzine in der Lage sein, Antigen-spezifische B-Zellen, zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) und Helfer-T-Zellen zu stimulieren. Die B-Zellen-Stimulierung erfordert, dass das Zielantigen mit ausreichend hoher Affinität an spezifische Antigenrezeptoren (Oberflächen-Ig) an der B-Zellen-Oberfläche bindet. Bestimmte multivalente Antigene können die B-Zellen-Proliferation direkt stimulieren, jedoch besteht häufiger, auch um für eine wirksame anamnestische Reaktion zu sorgen, die Notwendigkeit für zusätzliche Signale, die von Helfer-T-Zellen bereitgestellt werden (siehe unten).
Die T-Zellen-Rezeptoren (TCRs) von CTLs erkennen spezifische MHC-Klasse-I-assoziierte Peptide, die an der Zielzellenoberfläche exprimiert werden. Solche Peptide leiten sich im Allgemeinen von der Prozessierung größerer Polypeptide oder Proteine her, die innerhalb der Zielzelle hergestellt werden. Folglich sollte das Zielantigen für die wirksame CTL-Stimulierung intrazellulär in MHC-Klasse-I-exprimierenden Zellen synthetisiert werden. Die Expressionsstärke sollte hoch genug sein, um ausreichend Peptid zu erzeugen, um jene Selbst-Peptide zu verdrängen, die normalerweise (möglicherweise mit höherer Affinität) in der MHC-Peptidbindungsfurche gebunden werden (Ohno, PNAS 89, 4643–4647 (1992)). Ähnlich wie Antigen-spezifische B-Zellen erfordern CTLs zur Proliferation und erhöhten zytotoxischen Fähigkeit zusätzliche Signale (in Form von Zytokinen) nach der Antigenerkennung, und diese werden von Helfer-T-Zellen bereitgestellt. Helfer-T-Zellen sind für optimale B-Zellen- und CTL-Antworten erforderlich. CD4-positive Helfer-T-Zellen wechselwirken (über ihre einzigartigen TCRs) mit spezifischen MHC- Klasse-II-assoziierten Zelloberflächenpeptiden und solche Peptide leiten sich im Allgemeinen von der proteolytischen Spaltung von Proteinantigenen her, die von spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) internalisiert werden. Makrophagen, Dendritenzellen und B-Lymphozyten gehören zu den Zellen, die Antigen auf diese Weise präsentieren können. Demnach internalisieren und prozessieren B-Lymphozyten an ihre Oberfläche gebundenes Ig und präsentieren anschließend MHC-Klasse-II-assoziierte Peptidderivate. das Oberflächenpeptid erkennende CD4-positive T-Helferzellen können dann verschiedene immunstimulierende Zytokine freisetzen und weitere B-Zellen-Aktivierung, Proliferation und Antikörperproduktion stimulieren. Gleichermaßen können an der Stelle einer lokalen Entzündungsreaktion vorhandene Makrophagen phagozytiertes Antigen prozessieren und die Zytokinfreisetzung durch T-Helferzellen stimulieren, was die verstärkte Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität lokal angesiedelter CTLs bewirkt.
Das Vakzinen-Antigen sollte daher idealerweise 1) intrazellulär von MHC-Klasse-I-positiven Wirtszellen synthetisiert werden, 2) Peptide hervorrufen, wenn sie von Wirtszellen-Klasse-I-MHC präsentiert werden, eine Untergruppe von Wirts-CTLs über ihre TCRs stimulieren können, 3) Peptide hervorrufen die, wenn sie von Wirtszellen-Klasse-II-MHC präsentiert werden, eine Untergruppe von Wirts-Helfer-T-Zellen über ihre TCRs stimulieren können, 4) von Wirts-APCs, einschließlich Makrophagen sowie antigenspezifischen B-Zellen internalisiert und prozessiert werden, 5) in seiner nativen Form zur Wechselwirkung mit Wirts-B-Lymphozyten verfügbar sein.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform sorgt die Erfindung für die Expression der umgeordneten VH- und V-Gene des Idiotyps des Tumorantikörpers in Säugetierzellen, was die Produktion von Peptiden zur Präsentation an der Zelloberfläche in Kombination mit Wirts-MHC ermöglicht, und sorgt für die Präsentation (oder Sekretion) des Paratops (als gefaltetes Antikörperfragment), um die Produktion anti-idiotypischer Antikörper auszulösen. Die Antikörperfragmente könnten durch Infektion mit einem für die Antikörperfragmente kodierenden rekombinanten Virus in Säugetierzellen eingeführt werden. Im Prinzip könnten die Antikörperfragmente mit einer Signalsequenz für ihre Sekretion oder Präsentation an der Oberfläche der infizierten (transfizierten) Zelle bereitgestellt werden. Alternativ dazu könnten die Fragmente an ein anderes, an die Oberfläche der Zelle präsentiertes Protein, zum Beispiel ein Virushüllprotein wie in Beispiel 2 beschrieben gebunden werden. Die Antikörperfragmente (als Einzelketten-Fv-Fragmente) werden in funktioneller Form an das Hüllprotein eines Virus gebunden präsentiert, was darauf hinweist, dass sie auch gefaltet sind und sich in einer nativen Form an der Oberfläche einer infizierten Zelle befinden (Russell et al., Nucl. Acids Res. 21, 1081–1085 (1993)). Die Antikörperfragmente könnten auch unter Verwendung von Nucleinsäure, die für die Antikörperfragmente kodiert, in Säugetierzellen eingeführt werden. Beispielsweise wurde ein Gen, das für ein Fusionsprotein zwischen einem Virushüllprotein (wie oben) und den Antikörperfragmenten kodiert, verwendet, um Mäuse durch direkte Injektion (subkutan oder intramuskulär, siehe Beispiel 3) zu immunisieren.
Obgleich die Beispiele (siehe unten) sich in erster Linie mit der Isolation idiotypischer Marker in Lymphozyten-Malignitäten befassen, sollte es ebenfalls möglich sein, gegen B- und T-Zellen-Idiotypen, die an der Autoimmunerkrankung beteiligt sind, unter der Voraussetzung in derselben Weise zu immunisieren, dass es möglich ist, die V-Gen-Paarungen zu identifizieren. Es sind sicherlich monoklonale Antikörper mit Reaktivitäten gegen Selbst-Antigene aus den B-Zellen von Autoimmunpatienten hergestellt worden. Vermutlich wird das Verbinden von Schwer- und Leichtketten miteinander innerhalb von B-Zellen (Embleton et al. (1992)), gefolgt von der Klonierung in Phagen (McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1992)) und die anschließende Selektion auf Phagen mit Selbst-Spezifitäten die Identifizierung von beteiligten Antikörpern erleichtern und ihre Verwendung für anti-idiotypische Therapie ermöglichen. Für andere Autoimmunerkrankungen sind bestimmte TCR-Familien bekanntermaßen überrepräsentiert (Marguerie et al., Immunol. Today 13, 336–338 (1992)) und daher sollte PCR-Assemblierung in der Zelle, gefolgt von Sequenzierung die Identifizierung der beteiligten Rezeptoren und ihre anschließende Verwendung für anti(TCR)-idiotypische Immunisierung ermöglichen.
Beispiele
Beispiel 1 – Identifizierung von V-Genen B-Zellen-Lymphom-Biopsien
Herstellung des Biopsie-Materials
Biopsie-Proben wurden aus fünf Patienten mit pathologisch bestätigtem Follikel-Lymphom erhalten. Sie wurden während routinemäßiger Diagnoseverfahren erhalten. Die Leichtketten wurden mittels Immunhistochemie als Kappa und Lambda identifiziert. Als nicht-maligne Kontrollen wurden ein Darm-Lymphknoten aus einem Patienten mit Morbus Crohn und eine Milzprobe aus einem Patienten, der Splenektomie unterzogen wurde, erhalten. Das Biopsie-Material wurde als eine Einzelzellensuspension hergestellt und die Zellen anschließend bei –70°C eingefroren und gelagert.
Präparierung von DNA für die PCR
Für die PCR wurde DNA unter Verwendung eines einfachen Proteinase K/Tween 20-Lyseverfahrens (Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., S. 147 (1990)) präpariert. Zusammenfassend wurden die Zellen mittels Zentrifugation für 20 Sekunden bei 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit 1 ml PBS gewaschen, bevor sie zu ungefähr 10⁶/ml in K-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5% Tween 20, 100 mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bei 56°C für 60 Minuten inkubiert wurden, um die Zellen zu lysieren und DNA freizusetzen. Die Proteinase K wurde dann durch Inkubation für 30 Minuten bei 95°C inaktiviert. Auf diese Weise freigesetzte DNA wurde direkt in den PCR-Reaktionen verwendet oder für spätere Verwendung bei –20°C gelagert.
PCR-Primer
Es wurden PCR-Primer konstruiert, um umgeordnete Schwerketten-Kappa- und Lambda-Leichtketten-Gene zu amplifizieren. Die 5'-Primer basieren auf das Gerüst 1 der V-Gene. Die VH- und Vk-Primer sind jenen von Marks et al. (1991) beschriebenen ähnlich. Jedoch erwies sich zur Amplifikation aus genomischer DNA (im Gegensatz zu cDNA) das Produkt als reiner, wenn am 3'-Ende um eine Base verkürzte Primer verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Außerdem wurde die Anzahl verwendeter Primer durch Kombinieren ähnlicher Primer zu einem Konsens-Primer vermindert. Mit der Ausnahme einer Änderung in den JH-Primern zur Einführung einer gemeinsamen BstEII-Stelle keine Änderungen durchgeführt, um Restriktionsstellen einzuführen. Es waren nur beschränkte DNA-Sequenz-Informationen als Basis für die Vλ-Primer verfügbar, jedoch wurden Primer zu den Vλ1-, Vλ2-, Vλ3- und Vλ4-Familien aus den verfügbaren Sequenzdaten hergestellt (Songsivilai et al., Eur. J. Immunol. 20, 2661–2666 (1990); Alexandre et al., Nucl. Acids Res. 17, 3975 (1989); Bernard et al., Nucl. Acids Res. 18, 7139 (1990); Chuchana et al., Eur. J. Immunol 20, 1317–1325 (1990)). Andere Familien kommen bekanntermaßen vor (Chuchana et al (1990)), jedoch waren keine Nucleotidsequenzdaten vorhanden und daher wurden keine Primer hergestellt. J-Region-Primer wurden so hergestellt, dass sie komplementär zur genomischen Sequenz der Keimbahn-J-Regionen für die Schwerkette (Ravetch et al., Cell 27, 583–591 (1981)), Kappakette (Nieter et al., J. Biol. Chem. 257, 1516–1522 (1982)) und Lambdakette (Udey und Blomberg, Immunogenetics 25, 63–70 (1987); Dariavach, PNSA 84, 9074–9078 (1987); Bauer und Blomberg, J. Immunol. 146, 2813–2820 (1991); Combriato und Klobeck, Eur. J. Immunol. 21, 1513–1522 (1991); Frippiat, Nucl. Acids Res. 18, 7134 (1990)) waren. Die Jλ-Gene kombinieren mit ihren entsprechenden Cλ-Genen und da Cλ4, Cλ5 (Dariavach (1987)) und wahrscheinlich Cλ6 (Bauer und Blomberg (1991); Combriato und Klobeck (1991)) Pseudogene sind, sollte sie folglich nicht als exprimiertes Protein auftreten. Als Ergebnis wurden keine Primer zu diesen Jλ-Genen hergestellt. Durch Kombinieren von zwei J-Region-Primern wurden insgesamt drei J1-Primer, Jλ1, Jλ2/3, Jλ7 hergestellt. Tabelle 1 zeigt eine vollständige Liste der primären PCR-Primer.
PCR-Amplifikation umgeordneter variabler Immunglobulin-Regionen
Die V-Genfamilie und J-Region-Primer wurden als äquimolare Gemische der einzelnen in Tabelle 1 gezeigten Prirner verwendet. VHBACK- und JHFOR-Gemische wurden für die Schwerketten-PCR-Reaktion verwendet. Die PCR-Amplifikation wurde in einem Volumen von 50 μl unter Verwendung eines Hybaid Thermal Reactor (Hybaid) durchgeführt. Reaktionsgemische enthielten 20 pmol jedes Primergemisches, 250 μl dNTPs (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in 1 × PCR-Puffer (Promega, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100). Um jedes Risiko einer Kontamination zu minimieren, wurden umfangreiche Vorsichtsmaßnahmen getroffen. Die Gemische wurden in einer Laminarwerkbank angesetzt, die speziell zum Ansetzen von PCR-Reaktionen vorgesehen war. Die Proben wurden dann für 5 Minuten in einem UV-Ofen (Amplirad, Genetic Research, Dunmow, UK) UV-behandelt. Das Templat (5 μl) wurde dann zugesetzt, das Reaktionsgemisch dann mit Mineralöl (Sigma) überschichtet und die Probe für 5 Minuten auf 94°C erhitzt. In diesem Stadium wurden 2,5 Units Taq-DNA-Polymerase (Promega) zugegeben. Die Amplifikation wurde unter Anwendung von 33 Zyklen, 94°C 1 Minute, 65°Cm 1 Minute Annelierung; 72°C, 1 Minute Elongation durchgeführt. Amplifizierte variable Regionen wurden an einem 1,5% LMP-Agarose/TAE-Gel analysiert und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Bande der Größe 320/350 Basenpaare wurde herausgeschnitten und mittels GENECLEAN 11-Set (Bio101) gemäß der Anleitungen des Herstellers gereinigt. Zumindest zwei unabhängige PCR-Amplifikationen von V-Regionen wurden aus jeder Probe von jedem Patienten durchgeführt und die PCR von Lymphknoten-DNA wurde vor der entsprechenden PCR aus den Heterohybridomen durchgeführt.
Klonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten
Das von Marchuk (Marchuk et al., Nucl. Acids Res. 19, 1154 (1991)) beschriebene T-Vektor-Klonierungssystem wurde verwendet. Zusammenfassend wurde der Vektor aus pBluescript II KS+ (Stratagene) durch Verdau mit EcoRV (von NBL) zur Herstellung stumpfer Enden und anschließende Behandlung mit Taq-DNA-Polymerase (Promega) in 2 mM dTTP enthaltendem PCR-Puffer (Promega) bei 70°C für 2 Stunden hergestellt. Das gereinigte V-Gen-PCR-Produkt wurde in den T-Vektor ligiert und in den kompetenten E. coli-Stamm TG1 (Gibson, Dissertation, University of Cambridge, United Kingdom (1984)) transformiert. Rekombinante Klone wurde mittels Blau/Weiß-Selektion mittels Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG, Sigma) identifiziert. Es wurden Klone zufällig entnommen und ssDNA nach Superinfektion mit Helfer-Phage (M13KO7, Stratagene) (Vieira und Messing, Methods Enzymol. 153, 3–11 (1987)) hergestellt. Die Klone wurden mittels Didesoxy-Verfahren (Sanger et al. (1977)) unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (Sequenaee, USB, Cleveland, USA) sequenziert. Eine Anzahl von Klonen aus jedem Patienten wurde kloniert und die Sequenzen verglichen.
Assemblierung von Tumor-V-Genen als scFv
Das in 1 illustrierte Assemblierungsverfahren basiert auf dem von Davis et al., Bio/Technology 9, 165–169 (1991) beschriebenen. Der Assemblierungsprozess verwendet einen zweiten Primer-Satz. Die VHSfiBAK-Primer kodieren für die SfiI-Klonierungsstelle und hybridisieren auch an den ursprünglichen Satz von VHBAK-Primern. Die scJHFOR- und scVk/Vλ-BAK-Primer hybridisieren an ihre entsprechenden Anfangsprimer, kodieren jedoch auch für den sc-Linker, um die Produktion eines Einzelketten-Fv (scFv) zu ermöglichen (Huston et al., PNAS 85, 5879–5883 (1988)). Die NitJk/IFOR-Primer hybridisieren an ihre entsprechenden Anfangsprimer, umfassen jedoch auch die NotI-Restriktionsstelle. Diese Primer sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Assemblierung wird in zwei Stufen durchgeführt. Zuerst wurden die V-Gene (Schwer- und Leichtketten) aus den Sequenzierungstemplat unter Verwendung eines neuen Satzes von Oligonucleotiden amplifiziert. Das PCR-Gemisch wurde wie oben angesetzt, jedoch waren die verwendeten Primer ausschließlich die in der vorhergehenden Sequenzierung identifizierten relevanten V-Gen-Familie- und J-Region-Primer. Das Templat waren 100 ng ssDNA-Sequenzierungstemplat. Die PCR-Bedingungen waren 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute, 74°C für 1 Minute mit 10 Amplifikationszyklen. Nach Beendigung der PCR wurden die weiteren dNTPs (5 μl einer 2,5 mM Stammlösung) mit Klenow-Polymerase (Boehringer, 2,5 Units) zugegeben und bei 20°C für 15 Minuten inkubiert, um stumpfe Enden herzustellen. Im Anschluss an diesen Schritt wurde das Produkt wie oben gelgereinigt und in 25 μl Wasser resuspendiert. Danach wurden 5 μl des Schwer- und 5 μl des Leichtkettenprodukts in der Assemblierung verwendet. Für diesen Prozess wurde die PCR-Reaktion in zwei Schritten durchgeführt. Anfänglich wurden keine Primer zugegeben und die folgenden Zyklen angewendet: 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute, 74°C für 1 Minute für 7 Zyklen, und die Schwer und Leichtketten zu verbinden. Während der sekundären oben beschriebenen PCR werden die Schwerkette und Leichtkette mit Primern markiert, die für den Einzelkettenlinker kodieren. Dieser Marker enthält 15 Nucleotide an jeder der zueinander komplementären Schwer- und Leichtketten und ermöglicht folglich die gegenseitige Annelierung. Während der Extensionsreaktion werden verbundene Volllängen-scFv-Moleküle gebildet. Am Ende der 7 Zyklen wird die Temperatur für 3 Minuten bei 94°C gehalten und es werden die passenden äußeren Primer (SfiVHBACK/NotJFOR) für die „Pull-through"-Amplifikation zugegeben. Diese Amplifikation besteht aus 10 Zyklen: 94°C für 1 Minute, 74°C für 2 Minuten und dient der Amplifikation der kleinen Menge des gebildeten verbundenen Produkts.
Klonierung zur Expression, und Expression und Reinigung von scFv
Nach der Assemblierung wurde das scFv wie beschrieben (Marks et al. (1992)) mit SfiI/NotI verdaut und in einen scFv-Expressionsvektor (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)) auf Basis von pUC119 (Vieira und Messing (1987)) kloniert. Ein neuer Expressionsvektor, pRH2, in dem der Myc-Marker durch einen Hexahistidin-Marker ersetzt ist, wurde hergestellt, um die Reinigung mittels Metallaffinitätschromatographie zu ermöglichen. Dies wurde durch stellengerichtete Mutagenese mittels Umkehr-PCR bewerkstelligt (Hemsley et al., Nucl. Acids Res. 17, 6545–6551 (1989)). Die Vektoren sind in 2 (Seq.-ID Nr. 59–62) gezeigt.
Um auf die Expression von Volllängen-scFv zu prüfen, wurden einzelne Kolonien entnommen und für vier Stunden unter dauerndem Schütteln in 1 ml 2 × TY/0,1% Glucose/100 mg/ml Ampicillin bei 30°C gezüchtet. In diesem Stadium wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und das Schütteln für 18 Stunden fortgesetzt. Der Überstand wurde durch Zentrifugation bei 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten geerntet. Das Bakterienpellet wurde bei –20°C zur Herstellung von Plasmid-DNA eingefroren und der Überstand mittels Western-Blotting unter Verwendung des 9E10-Anti-Myc-Antikörpers analysiert (Ward et al., Nature 341, 544–546 (1989)). Aus demjenigen Bakterienpellet, von dem auf diese Weise die Expression von Volllängen-scFv nachgewiesen werden konnte, wurde dann Plasmid-DNA hergestellt. Aus diesem Plasmidpräparat wurde scFv als ein SfiI/NotI-Fragment in pRH2 subkloniert. Ein-Liter-Bakterienkulturen wurden unter dauerndem Schütteln bei 30°C auf eine A600 nm von 0,9 in 2-Liter-Kolben gezüchtet, die 2 × TY/0,1% Glucose/100 mg/ml Ampicillin enthielten. In diesem Stadium wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und die Periplasma-Fraktion wurde wie von Skerra et al., Bio/Technology 9, 273–278 (1991) beschrieben hergestellt.
Das scFv-Antikörperfragment wurde dann aus der periplasmatischen Fraktion unter Nutzung des Hexahistidin-Markers gereinigt. Das Verfahren basiert auf jenem von Skerra et al. (Skerra et al., oben zitiert) beschriebenen, jedoch wurde gefunden, dass die Verwendung von sechs Histidinen und Nickel anstelle von fünf Histidinen und Zink zu bevorzugen war (Daten nicht gezeigt). Das Periplasma-Präparat aus einer 1-Liter-Kultur wurde auf eine 1 ml-Säule von Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) geladen, die vorher gemäß den Anleitungen des Herstellers vorher mit Nickel-Ionen gekoppelt worden war. Die Säule wurde dann mit 10 ml PBS/1M NaCl (pH 7,2), gefolgt von 5 ml PBS/1 M NaCl/75 mM Imidazol (pH 7,2) gewaschen. Das zurückgehaltene scFv wurde dann mit 5 ml PBS/1 M NaCl/300 mM Imidazol (pH 7,2) eluiert und als 1-ml-Fraktionen gesammelt. Die Peak-Proteinfraktionen wurden durch Bestimmung der A280 nm identifiziert und diese wurden dann vor Analyse mittels SDS-PAGE gegen PBS dialysiert.
PCR, Klonierung und Sequenzierung von V-Genen aus Follikel-Lymphom und normalem Lymphknoten
Die PCR-Amplifikation aus DNA von Biopsie-Proben war abgesehen von der Lambda-Leichtkette vom Patienten Nummer 5 erfolgreich. Eine Anzahl von Klonen aus jedem Patienten wurde sequenziert. Die Analyse von Sequenzen, die sich vom reaktiven Lymphknoten und von normaler Milz herleiteten, offenkrarte, dass keine repetitiven Sequenzen vorhanden waren. In jedem der Tumor-tragenden Lymphknoten waren repetitive Einzelsequenzen vorhanden. Eine Zusammenfassung der Sequenzierungsergebnisse ist in Tabelle 2 gezeigt. Unter den repetitiven Sequenzen waren bis zu zwei Basenänderungen, von denen angenommen wurde, dass sie aus PCR-Fehlern resultierten. Trotzdem war eine Konsenssequenz leicht feststellbar und in allen Fällen waren Klone mit dieser Konsenssequenz vorhanden. Um die Sequenz zu bestätigen, wurde eine zweite unabhängige Amplifikation durchgeführt und weitere V-Gene sequenziert. Es wurde dieselbe Konsenssequenz identifiziert. Die repetitiven V-Gen-Sequenzen weisen auf eine klonale Expansion hin und identifiziert damit das Tumor-V-Gen. Für drei der fünf hierin analysierten Tumor-Biopsien war ein Heterohybridom verfügbar. PCR-Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung bestätigten die direkt aus dem Lymphknoten identifizierte Sequenz.
Der absolute Prozentanteil des Tumor-hergeleiteten V-Gens variierte, und es gibt mehrere Gründe dafür. Erstens variieren die Biopsien hinsichtlich ihres Grades an Tumorinfiltration (obgleich in allen hier untersuchten Fällen maligne B-Zellen > 50% der insgesamt vorhandenen Zellen umfassen). Zweitens variieren die Primer üblicherweise hinsichtlich ihrer Effizienz, mit der sie irgendein bestimmtes Gen amplifizieren – in extremen Fällen, wie in Falle der Lambda-Leichtkette im Patient 4, amplifiziert eine Kette möglicherweise überhaupt nicht. Drittens können einige Pseudogene durch diese Primer amplifiziert werden und dies kann den prozentuellen Gesamtanteil Tumor-hergeleiteter V-Gene vermindern.
Assemblierung, Expression und Reinigung
Die Anwendung der PCR-Assemblierung vermeidet die Verwendung multipler Restriktionsenzyme, die V-Gene an inneren Stellen schneiden könnten. Dieser hierin verwendete Prozess scheint effizient zu sein und erfordert nicht die getrennte Herstellung eines Linkerfragments (Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)). Um den Assemblierungsprozess zu überprüfen, wurde das verbundene Produkt in einen Expressionsvektor kloniert, der den Myc-Marker umfasste (2). Zufällig gewählte Klone wurden herangezüchtet und wie früher beschrieben induziert (Hawkins und Winter (1992)). Western-Blotting unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, 9E10, gegen den Myc-Marker (Ward et al. (1989)) bewies, dass 80% der Klone korrekt exprimierten. Zur Erleichterung der Reinigung wurde das scFv-Fragment in den einen Hexahistidin-Marker enthaltenden Expressionsvektor pRH2 subkloniert. Ein Klon aus Patient 5 wurde in einem Volumen von 1 Liter herangezüchtet und das scFv-Fragment aus dem Periplasma gereinigt. Die Ausbeute wurde auf Basis einer A280 nm von 1,4 für eine Lösung von 1 mg/ml auf 0,5 mg/L/OD600 geschätzt.
Beispiel 2 – Konstruktion eines Fusionsproteins
Plasmidkonstruktion
Das BamHI/ClaI-env-Fragment (Nucleotide 6537–7674, Nucleotid-Nummerierung von Shinnick et al., Nature 293, 543–548 (1981)) aus pCRIP (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von O. Danos, Danos und Mulligan, PNAS 85, 6460–6464 (1988)) wurde in das BamHI/ClaI-Gerüstfragment von pZipNeoSV(X) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. Mulligan, Cepko et al., Cell 37, 1053–1062 (1984)) kloniert, um ein intermediäres Plasmid penvBam/Cla zu erzeugen.
Eine SfiI/NotI-Klonierungsstelle wurde jenseits der Leaderpeptidsequenz zwischen Codons eingeführt, die der 6. und 7. Aminosäure (vom N-Terminus) im reifen MoMLV-env-Polypeptid entsprechen. Das Oligonucleotidpaar envNotrev (5'-CTG CAG GAG CTC GAG ATC AAA CGG GCG GCC GCA CCT CAT CAA GTC TAT AAT ATC-3', Seq.-ID Nr. 49, komplementär zu MoMLV-env-Nucleotiden 5894–5914 mit einem 33 nt-5'-Überhang, der für eine NotI-Stelle kodiert, und 21 zum 5'-Schwanz von envSfifor komplementären Nucleotiden) und envseq7 (5'-GCC AGA ACG GGG TTT GGC C-3', Seq.-ID Nr. 50, reverses Komplement der MoMLV-env-Nucleotide 6581–6600) wurde verwendet, um die Amplifikation (aus Plasmid pCRIP) eines 739 bp-Fragments stromab des env-Codons 6 zu primen. Ein zweites Oligonucleotidpaar, envSfifor (5'-TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG GGC CGG CTG GGC CGC ACT GGA GCC GGG CGA AGC AGT-3', Seq.-ID Nr. 51, reverses Komplement von MoMLV-env-Nucleotiden 5873.5893 mit einem 36 nt-5'-Überhang, der für eine SfiI-Stelle kodiert, und 21 zum 5'-Schwanz von envNotrev komplementären Nucleotiden) und revMLVpol (5'-AAT TAC ATT GTG CAT ACA GAC CC-3', Seq.-ID Nr. 52, komplementär zu MoMLV-pol-Nucleotiden 5277–5249) wurde verwendet, um die Amplifikation (aus pCRIP) eines 702 bp-Fragments stromauf des env-Codons 7 zu primen. Amplifikationen wurden unter Verwendung von Vent-Polymerase durchgeführt und die Reaktionen 15 PCR-Zyklen bei 94°C für 1 Minute, 60°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute unterzogen. Die komplementären 21 nt-Schwänze der gelgereinigten PCR-Produkte von 702 und 739 bp erlaubte die PCR-Verbindung, um ein env-Gen zu erzeugen, das eine SfiI/NotI-Klonierungsstelle an der gewünschten Position enthielt. Die beiden Fragmente wurden gemischt und drei PCR-Zyklen (94, 40, 72 für 1,1 bzw. 2 Minuten) unterzogen, gefolgt von 1 7 weiteren Amplifikationszyklen (94°, 60°, 72° für 1,1 bzw. 2 Minuten) nach Zugabe der Oligonucleotide envseq7 und Bglenvrev (5'-TAA TCA CTA CAG ATC TAG ACT GAC ATG GCG CGT-3', Seq.-ID Nr. 53, komplementär zu MoMLV-pol-Nucleotiden 5766 bis 5785 mit dem 5'-Schwanz, der eine BglII-Restriktionsstelle enthält). Das Produkt, ein 905 bp-Fragment, wurde mit BglII und BamHI verdaut und in Vorwärtsausrichtung in die BamHI-Stelle von penvBam/Cla (siehe oben) kloniert, um das Plasmid pSfi/Notenv zu liefern. Die korrekte Assemblierung dieses Plasmids wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxysequen zierung (Sanger et al., PNAS 74, 5463–5467 (1977)) bestätigt. Ein funktioneller B 1.8 scFv-Antikörper wurde dann aus einem prokaryotischen Expressionsvektor (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889–896 (1992)) als ein SfiI/NotI-Fragment in die SfiI/NotI-Klonierungsstelle von pSfi/Not.Env subkloniert, um das Plasmid pNIP.env zu erzeugen (3). Die Sequenz über die Verbindungspunkte von pNIPenv hinweg ist in 4 gezeigt (Seq.-ID Nr. 63–66, einschließlich Translation der Nucleotidsequenz).
Schließlich wurde die modifizierte Retrovirus-Hüllexpressionskassette als HindIII/EcoRI-Fragment in ein modifiziertes pSV2Neo-Plasmid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Ashok Venkitaraman, MRC Centre, Cambridge) subkloniert, um das Plasmid pSVNIPenv zu erzeugen (4).
Zelltransfektion
NIH3T3-Fibroblasten und die wirtsspezifische Retrovirus-Verpackungs-Zelllinie psi2 (Mann et al., Cell 33, 153–159 (1983)) wurden in mit 60 μg/ml Benzylpenicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänztem DMEM/10%FBS bei 37°C und 5% CO₂-Atmosphäre gehalten. Die Zellen wurden zweimal die Woche neu ausplattiert, und zwar mit EDTA ohne Trypsin, um die Monoschicht zu zerstören.
Das Plasmid pNIPenv wurde mittels Calciumphosphatpräzipitation in psi2-Zellen transfiziert (mit pDCneo, einem Plasmid, das einen Neomycin-Resistenzmarker enthält). Zusammenfassend wurden 2 × 10⁵ Zellen in 90 mm-Gewebekulturplatten (Nunc) ausplattiert, über Nacht kultiviert, gewaschen und mit 10 ml neuem Medium versorgt. 10 μl Plasmid-DNA und 50 μl 2 M CaCl₂ (0,2 μm-filtriert) wurden in sterilem Wasser auf ein Volumen von 400 μl verdünnt. Das CaCl₂/DNA-Gemisch wurde tropfenweise einem gleichen Volumen von 0,2 μm-filtrierter HEPES-gepufferter Salzlösung (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na₂PO₄·2H₂O, 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES, pH mit 0,5 N NaOH auf 7,05 gestellt) zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Transfektionslösung (800 ml) wurde den Zellen zugegeben, die für 16 Stun den kultiviert, gewaschen und mit neuem Medium versorgt wurden. Die G418-Selektion (1 mg/ml) wurde 24 Stunden später begonnen und für ungefähr 2 Wochen fortgesetzt.
Oberflächen-B1.8-Einzelkettenantikörper exprimierende transfektierte Klone wurden durch Panning mit NIP.BSA-beschichteten Perlen identifiziert. Zusammenfassend wurden Tosyl-aktivierte paramagnetische Perlen (Dynal, Oslo, Norwegen, Prod.-Nr. 14004) mit NIP10.BSA (ungefähr 10 an jedes Rinderserumalbuminmolekül gekoppelte NIP-capronat-O-succinimid-Moleküle, Hawkins et al. (1992)) beschichtet, gründlich mit PBS gewaschen und mit DMEM/10%FBS geblockt. 90 mm-Gewebekulturplatten, die bis zu 50 G418-resistente psi2-Kolonien enthielten, wurden für 1 Stunde bei 40°C sanft geschwenkt, gefolgt von 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 2 × 10⁷ (50 μl) Perlen in 5 ml DMEM/10%FBS. Nach fünf Waschvorgängen in PBS wurden positive Kolonien (dicht mit paramagnetischen Perlen belegt) leicht identifiziert und wurden für die weitere Expansion, Kryo-Konservierung und Ernte von Zellüberständen einzeln transferiert.
Daher wurde gezeigt, dass die Spezifität des Antiköpers an der Oberfläche der Zellen präsentiert wird und der Antikörper daher gefaltet ist.
Konstruktion eines löslichen Proteinexpressionsvektors
Um einen löslichen Expressionsvektor zu erzeugen, wurde ein Stop-Codon und eine Rasterverschiebungsmutation zwischen das Antikörper-Gen und den 3'-Abschnitt des MoMLV-Hüllgens insertiert. Das B1.8-scFv-Fragment wurde unter Verwendung von Sfi-VHBAK (5'-TAC TCG CGG CCC AAC CGG CCA TGG CCC AGG TSM ARC TGC AGS AGT C-3') und eines Vorwärts-Primers Not.STOP (5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC CTC CTC AGA GGA C-3'), die für die Nucleotidinsertion kodieren, PCR-amplifiziert (10 Zyklen, 94°C 1 Minute, 55°C 1 Minute, 74°C 1 Minute), um ein Stop-Codon und eine Rasterverschiebung 5' der NotI-Stelle zu erzeugen. Das Fragment wurde dann mit SfiI/NotI verdaut und in pSfi/Not.Env kloniert, um das Plasmid pNIPstop zu erzeugen (4). Das Plasmid pSVBCLenv (4) wurde von pSVNIPenv hergeleitet, indem B1.8-svFv durch ein aus dem BCL1-Maus-Lymphom PCR-kloniertes Kontroll-scFv-Gen ersetzt wurde. VH- und Vλ-Gene wurden PCR-kloniert und aus BCL-hergeleiteter DNA unter Verwendung von Standardprotokollen assembliert.
Herstellung von Plasmid-DNA
Plasmide wurden in E. coli-Stamm TG1 (Gibson 1984)) amplifiziert, mittels alkalischer Hydrolyse extrahiert und unter Verwendung des Promega Magic Maxipreps^TM DNA-Reinigungssystems (Promega, Madison, WI, USA) an einer Säule gereinigt. Die DNA wurde in Wasser eluiert. Die Reinheit des Plasmid-Präparats wurde mittels Agarosegelelektrophorese und durch Messen des A260 nm/A280 nm-Verhältnisses (in allen Fällen betrug das Verhältnis > 1,7) bestätigt. Das gereinigte Plasmid wurde bei –20°C gelagert. Vor der Verwendung wurde das Plasmid in 200 mM NaCl auf 160 mg/ml eingestellt.
Herstellung des B1.8-scFv-Proteins
Für die bakterielle Expression wurde das B1.8-scFv-Gen als PstI/NotI-Fragment in den Vektor pRH2 kloniert, der einen Schwanz von sechs Histidinen an den C-Terminus des scFv bindet und durch inverse PCR-Mutagenese hergeleitet wurde. Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stamm TG1 transformiert und das scFv-Protein wie früher beschrieben (Hawkins und Winter, Eur. J. Immunol. 22, 867–870 (1992)) exprimiert und an einer NP-Sepharose-Säule gereinigt. Das gereinigte Protein erwies sich unter Verwendung eines früher beschriebenen ELISA (Hawkins und Winter (1992)) als stark an NIP-BSA bindend. Als negative Kontrolle wurde scFvD1.3 (Hawkins et al. (1992)) in den Expressionsvektor pRH2 kloniert und exprimiert und dann an einer Lysozym-Säule wie von Hawkins et al. (1992, früher zitiert) beschrieben gereinigt.
Impfschema
Männliche, 10 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden für die Immunisierung verwendet. Prä-Immunisierungsblutproben wurden am Schwanz abgenommen. Das Blut wurde bei 13.000 U/min für 2 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um das Serum abzutrennen. Das Serum wurde dann bei –20°C für nachfolgende Tests gelagert. Zwei Gruppen von Mäusen wurden immunisiert, einige mit DNA und einige mit Protein. Die beiden Gruppen wurden wie unten beschrieben immunisiert.

a) Proteinvakzine: B1.8-scFv-Protein wurde auf eine Konzentration von 250 μg/ml in PBS eingestellt und mit einem gleichen Volumen CFA gemischt. Die Mäuse wurden subkutan mit 100 ml dieser Vakzine (12,5 μg scFv) an zwei gesonderten Stellen exponiert. Identische Boosts wurden zwei und vier Wochen später verabreicht. 10 Tage nach dem letzen Boost wurden 200 μl Blut am Schwanz abgenommen. Die Blutproben wurden wie oben verarbeitet.
b) DNA-Vakzine: Zwei Gruppen von drei Mäusen wurden mit 50 μl (8 μg) DNA entweder subkutan (sc) in beide Flanken oder über den intramuskulären (im) Weg (rechter und linker Quadrizeps-Muskel, Gesamt-DNA für jede Maus 16 μg) exponiert. Zwei identische Booster-Impfungen wurden in einwöchigen Intervallen verabreicht. 200 μl Blut wurden unmittelbar vor der ersten, zweiten und dritten Exposition und eine Woche nach dem letzten Boost am Schwanz abgenommen. Das Serum wurde wie oben abgetrennt und gelagert.

Analyse der Immunantwort
Einzelne Näpfe in flexiblen 96-Napf-Testplatten (Falcon 3912 MicroTest III) mit flachem Boden wurden mit B1.8.His oder Kontroll-(D1.3.His.Anti-Lysozym) scFv-Protein mit 25 μg/ml über Nacht in PBS bei Raumtemperatur beschichtet. Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Histidin-markiertem scFv zur Beschichtung der Platten bewirkte, dass ein höherer Anteil des Proteins seine Antigenbindungsfähigkeit beibehielt. Die Platten wurden 3 Mal mit PBS gewaschen, für 2 Stunden bei 37°C mit 3% BSA in PBS geblockt und 3 Mal in PBS gewaschen. Testserum wurde zugegeben (1 : 100 oder 1 : 1000 in PBS/3%BSA verdünnt) und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 3 Mal in PBS gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer zweiten Schicht von HRP-konjugiertem polyklonalem Ziege-Anti-Maus-Fc-Antikörper (Sigma Kat.-Nr. A0168) in einer Verdünnung 1 : 1000 inkubiert. Die Platten wurden 4 × in PBS gewaschen, mit ABTS entwickelt und die A405 nm nach 30 Minuten mit einem Thermornax^TM-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, USA) gemessen.
Ergebnisse
Immunreaktion auf Proteinvakzine
Es wurde zunächst angestrebt festzustellen, ob Mäuse bei Exposition mit einem MausscFc-Antikörper in CFA eine wirksame Anti-idiotypische humorale Immunantwort aufbauen können. Sechs Mäuse wurden subkutan mit 25 μg des B1.8-Anti-NIP-scFv in CFA mit Booster-Dosierungen zwei und vier Wochen später exponiert. Zehn Tage nach der letzten Exposition enthielt Serum aus diesen Tieren ungenügend Anti-B1.8-Antikörper, um ein positives ELISA-Signal bei einer 1 : 100-Verdünnung des Serums zu liefern.
Immunreaktion auf DNA-Vakzine
Das Plasmid pNIPenv (3, siehe Materialien und Verfahren bezüglich Einzelheiten der Konstruktion) kodiert für ein chimäres Fusionsprotein, bestehend aus dem wirtsspezifischen MoMLV-Hüllpolypeptid Pr80env mit einem 6 Aminosäuren vom N-Terminus insertierten scFv-Anti-NIP-Antikörperfragment (Kd 4 × 10^–8 M). Die MoMLV-env-Leadersequenz von 33 Aminosäuren wird ohne Zerstörung der Leaderspaltstelle beibehalten. Sowie auch die 6 N-terminalen Aminosäuren aus dem MoMLV-Hüllprotein weist das scFv ebenfalls weitere 6 vom am N-Terminus verbleibenden pe1B-Leader hergeleitete Aminosäuren auf. Die Expression wird von Promotor/Enhancer-Sequenzen in der langen terminalen Wiederholung (LTR) von 5'-MoMLV angetrieben. Polyadenylierungssequenzen werden vom 3'-MoMLV-LTR bereitgestellt. Bei Transfektion in Maus-Fibroblasten (oben beschrieben) wurde gefunden, dass pNIPenv eine stabile Zelloberflächenexpression von funktionellem B1.8-scFv in Fusion mit dem MoMLVenv-Protein lieferte.
Mäuse wurden über den subkutanen (drei Mäuse) oder intramuskulären (drei Mäuse) Weg mit 16 μg pSVNIPenv in 200 mM NaCl geprimt, wobei eine und zwei Wochen später Boosterdosierungen verabreicht wurden. Kontrollmäuse wurden pSVBCLenv-geimpft. Prä-Vakzinations-, Prä-Booster-Serumproben und Serumproben eine Woche nach der Impfung wurden mittels ELISA auf humorale Antwort auf B1.8scFv getestet. Vor dem zweiten Boost wurden Anti-B1.8-scFv-Antikörper in einer 1 : 100-Verdünnung des Serums in drei der sechs pSVNIPenv-vakzinierten Mäuse, wovon zwei im und eine sc geimpft wurden, detektiert. Eine Woche nach dem zweiten Booster wiesen alle Mäuse leicht detektierbare Anti-B1.8-scFv-Antikörper auf, die nicht mit D1.3-scFv kreuzreagierten. Seren aus Kontroll-pBCLenv-vakzinierten Mäusen blieben im Anti-B1.8-ELISA negativ.
Anamnestische Antwort auf Proteinvakzine nach DNA-Vakzine
Nach 8 Wochen waren die Anti-B1.8-Antikörpertiter in den pSVNIPenv-immunisierten Mäusen abgefallen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die ursprünglich intramuskulär mit pNIPenv geimpften Mäuse intravenös mit 20 μg gereinigtem B1.8-scFv-Protein in PBS exponiert. Fünf Tage später enthielt Serum aus diesen Mäusen einen stark erhöhten Titer von Anti-B1.8-Antikörpern – die mittlere Erhöhung war um das 12fache und alle wiesen Antikörper auf, die in einer Verdünnung von 1 : 1000 eindeutig detektierbar waren.
Boosten mit löslichem scFv-Expressionsvektor (pNIPstop)
Um zu testen, ob Boosten mit einem löslichen Expressionsvektor auch den Antikörpertiter erhöhen würde, wurden Mäuse mit pNIPstop geimpft. Zehn Wochen nach der Pri märimmunisierung wurden die drei subkutan mit pNIPenv immunisierten Mäuse mit 8 μg sc und 8 μg im in 200 mM NaCl geimpft. Fünf Tage nach dem Boosten wurden Blutproben abgenommen und auf Antikörper getestet. Der Serumtiter erhöhte sich im Mittel um das 10fache, und wiederum waren nun alle bei einer Verdünnung von 1 : 1000 positiv.
Vergleich von löslichem pNIPstop und pNIPenv beim Hervorrufen einer primären Immunantwort
Um die Bedeutung des Fusionsproteins zur Verstärkung der Immunantwort nachzuweisen, führten die Erfinder ein Kontrollexperiment durch, um die Wirksamkeit von zwei Vektoren zum Stimulieren einer primären Immunantwort zu vergleichen. Zwei Gruppen, die beide aus je zwei BALB/c-Mäusen bestanden, wurden wie vorher verwendet. Serum wurde wie vorher aus Blut, das am Schwanz abgenommen wurde, erhalten und die Mäuse anschließend wöchentlich 3 × mit dem geeigneten Plasmid geimpft. Achtundzwanzig Tage nach dem Beginn der Immunisierung wurde wiederum Serum nach Blutabnahme am Schwanz erhalten und auf Anti-B1.8-Aktivität getestet. 2/2 aus der mit dem pNIPenv-Plasmid geimpften Gruppe waren bei einer 1 : 100-Verdünnung positiv und 2/2 in der pNIPstop-Gruppe waren positiv. Der env-Marker ist eindeutig nicht erforderlich, um eine Immunantwort zu stimulieren.
Bestätigung, dass die Immunantwort das native Antigen erkennt
Eine Gruppe von fünf Mäusen, die vier Mal mit der für das unfusionierte BCL1-scFv-Fragment kodierenden DNA (pSV2-BCL1) immunisiert worden waren, zeigten ebenfalls humorale Antworten auf den Idiotyp, die durch Bindung; an das BCL1-IgM-Fragment in einem ELISA detektiert wurden (nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde als eindeutiger Beweis ihrer Fähigkeit, natives Antigen in der zur Therapie benötigten Form zu erkennen, mittels FACS-Analyse gezeigt, dass diese idiotypischen Antisera an Oberflächen-BCL1-Ig tragende Lymphomzellen binden. BCL1-Zellen wurden mit Serum in einer Ver dünnung von 1 : 20 vorinkubiert, bevor sie mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG (Sigma) gefärbt und danach mittels FACS analysiert wurden. In der Tat war die Immunantwort mit jener für den BCL1-IgM-Antikörper in CFA vergleichbar (11). Dies stand im Gegensatz zu Antiseren, die sich von mit pSV2-B1.8-Antikörper immunisierten Mäusen herleiteten, die nur schwach an BCL1-Lymphom banden (11).
Beispiel 3 – Konstruktion eines zur Verwendung in Human-Rezipienten geeigneten Vektors
Vektorkonstruktion
Die in Beispiel 2 verwendeten anfänglichen Vektoren basierten auf Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Vektoren und enthielten lange Abschnitte unmodifizierter Virussequenzen (Russel et al., Nucl. Acids Res. 21, 1081–1085 (1993)). Diese Vektoren erwiesen sich als wirksam in der Erhöhung anti-idiotypischer Antworten und übten keine ungünstigen Einflüsse in den geimpften Mäusen aus. Obgleich es keinen Nachweis einer Gefahr für den Menschen durch solche Vektoren gibt, wurde entschieden, die Vektoren zu modifizieren, um jegliche möglichen Risiken zu vermeiden. Es bestanden einige Bedenken über zwei Eigenschaften der ursprünglichen Vektoren: das Retrovirus-Hüllgen (da es theoretisch in einen anderen Virus rekombiniert werden könnte, wodurch sein Tropismus verändert wird) und das Verpackungssignal (das die Verpackung der initiierten DNA in bestehende Human-Retroviren ermöglichen könnte). Während dem Ändern des Vektors wurde entschieden, Änderungen einzubauen, die die Vektoren zur Verwendung im Menschen verbessern: Der zum Antrieb der Expression des idiotypischen scFv verwendete Promotor wurde zum Rous-Sarcom-Virus-(RSV-)Promotor geändert, da von diesem gezeigt worden ist, dass er bei direkter Injektion in nicht-humanen Primatenmuskel eine Expression liefert (Jiao et al., Hum. Gene Ther. 3, 21–33 (1992)). Die Erfinder verwendeten auch einen Vektor, der einen bakteriellen Einzelstrang-Replikationsstartpunkt enthält, um die Produktion von ssDNA zu ermöglichen, die üblicherweise die Sequenzie rung des scFv-Abschnitts (der für den einzelnen Patienten spezifisch ist) des Vektors vor der Injektion in einen Patienten erleichtert. Der verwendete Vektor basiert auf einen im Handel erhältlichen Vektor, pRc/RSV (British Biotechnology/Invitrogen).
Um dieses Vektor-Gerüst in einen für genetische Immunisierung geeigneten Vektor umzuwandeln, war es wünschenswert, Leadersequenzen und Terminationssignale einzuführen und die Produktion von Fusionsproteinen zu ermöglichen. Fusionsproteine scheinen für die Hervorrufung von Anti-Idiotyp-Antworten nicht erforderlich zu sein, jedoch könnte die Anbindung geeigneter Proteine – möglicherweise fremde Proteine oder möglicherweise Zytokine (Tao und Levy, Nature 362, 755–758 (1993)) – einer der Wege zur Verstärkung der Immunantwort sein. Da Fusionsproteine in Tiermodellen nicht erforderlich waren, verwendet der anfängliche Humanversuch nur einen kurzen Peptid-Marker, jedoch ist dies eines der Gebiete für zukünftige mögliche Modifizierungen der Vorschrift.
Der Vektor pSfi/Not.Tag1 wurde modifiziert, um den pe1B-Leader durch die Human-Immunglobulin-VH1-Leadersequenz zu ersetzen, die die Kodierung einer Sfi I-Klonierungsstelle ohne Modifikation der Aminosäuresequenz ermöglicht. Diese wurde mit Oligonucleotiden unter Verwendung der HindIII/Pst I-Klonierungsstellen eingeführt und durch Sequenzierung bestätigt.
Dieses wurde dann als EcoRI/Blunt-HindIII-Fragment in den Not I/-Blunt-HindIII-geschnittenen Vektor pRc/RSV kloniert, um die Sequenz (Seq.-ID Nr. 56) zwischen den HindIII/Xbal-Stellen wie in 5 gezeigt zu liefern. Das scFv für einen einzelnen Patienten kann an den durch das Symbol A gekennzeichneten Stellen insertiert werden.
Der Vektor wurde dann auf zwei Arten getestet:

(i) scFv-B1.8 wurde in den Vektor kloniert und das resultierende Konstrukt dann in zwei Zelllinien, NSO (eine Myelom-Zelllinie) und NIH 3T3 (eine Fibroblasten-Zelllinie), klo niert. Unter Nützung des Neomycin-Resistenzgens in pRc/RSV wurden stabile Transfektanten isoliert und der Überstand auf scFv-B1.8-Antigenbindungsaktivität getestet. In beiden Fällen wurde das Antikörperfragment exprimiert und an das Hapten NIP, das vom monoklonalen Antikörper B1.8 erkannte Antigen, gebunden. Klone wurden aus den NSO-transfizierten Zellen isoliert und es wurde gezeigt, dass sie 1–3 mg/l funktionelles scFv im verbrauchten Kulturüberstand produzierten.
(ii) Das Plasmid wurde in einem genetischen Immunisierungsexperiment verwendet und mit pSV2-B1.8 verglichen. Sie lieferten vergleichbare Ergebnisse und scheinen einem weiteren Vektor überlegen zu sein, der für das Fd-Bakteriophagen-Gen-8-Protein zwischen der Not I- und Xba I-Stelle kodiert (6). Die wahrscheinliche Erklärung ist, dass die Expressionsstärke in Transfektionsexperimenten für die scFv-B1.8-Gen-8-Fusion um das 10- bis 100fache niedriger war. Andere Forscher haben eine starke Korrelation der Expressionsstärke und Immunantwort gefunden, wenn genetische Immunisierung angewendet wurde, um Immunantworten auf Virusproteine hervorzurufen (G. Rhodes, persönliche Mitteilung). Es scheint folglich so zu sein, dass kurze Peptidmarker ausreichen, um eine anti-idiotypische Immunantwort hervorzurufen und die Erfinder schlagen daher vor, einen solchen Peptidmarker in den Versuchen der Erfinder zu verwenden. Der Marker wird auch zweckdienlich sein, um auf Expression in Zellkultur zu testen. Die zur Zeit verwendeten Marker sind entweder von Viren oder vom Menschen hergeleitet und es ist unklar, ob sie essentiell sind und es besteht zwischen ihnen sicherlich kein Unterschied. Um jegliche möglichen Gefahren zu vermeiden, werden die Erfinder einen synthetischen Marker verwenden, der so hergeleitet ist, dass er Streptavidin bindet, da dies auch zur Detektion der Expression in vitro zweckdienlich sein könnte (Schmidt und Skerra, Protein Engineering 6, 109–122 (1993)). Wie oben festgestellt, kann diese eine Eigenschaft leicht modifiziert werden, um bei Notwendigkeit andere Proteine, wie z. B. Zytokine zu umfassen.

6 (Immunisierung von Mäusen mit Vektoren, die den RSV-Promotor einsetzen) zeigt die Ergebnisse idiotypischer Immunisierung gegen das scFc B1.8. Die mittels ELISA bei einer Serumverdünnung von 1 : 100 ermittelte Antwort für einzelne Mäuse ist gezeigt. Die Mäuse wurden intramuskulär zu den Wochen 0, 1 und 2 immunisiert. Man beachte, dass eine Maus mit dem Stop-Vektor (pSV2-B1.8) eine dürftige Antwort zeigte und dass die Antwort von mit dem Gen-8-Fusionsvektor immunisierten Mäusen dürftig war (VIII1 und VIII2), wogegen die beiden mit dem Peptidmarker-Vektor gute Antworten zeigten (Marker1 und Marker2).
Die Sequenz (Seq.-ID Nr. 58) des endgültigen Vektors pVAC1 ist in 7 gemeinsam mit einer Karte der einzigartigen Restriktionsstellen angegeben (8). Die Sequenz in Kleinbuchstaben in 7 entspricht der in 5 gezeigten Sequenz bis zu den beiden Stop-Codons. Der Vektor pVAC1 ist von den Erfindern erhältlich (am Cambridge Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom).
9 zeigt eine grafische Darstellung des Vektors pVAC1, die die wichtigen Restriktionsstellen und wichtigen Gene kennzeichnet.
10 ist eine Grafik der O. D. (405 nm) gegen die Zeit für männliche und weibliche Mäuse, die mit dem B1.8scfv (pVAC1.B1-8) exprimierenden pVAC-Vektor immunisiert (durch direkte Injektion von DNA) wurden. Die Grafik zeigt dass für einzelne Mäuse nach der Immunisierung ein eindeutiger Titeranstieg auftrat.
Obgleich das Neomycin-Resistenzgen für das In-vitro-Testen zweckdienlich ist, ist es für die Human-Immunisierung unnötig. Der zum Antrieb des Neomycin-Resistenzgens verwendete SV40-Promotor ist ebenfalls mit denselben Risiken wie andere starke Promotoren verbunden. Im für Humanversuche zu verwendenden Plasmid ist das Neomycin-Gen daher durch einen SfiI/Bst BI-Verdau deletiert und anschließende stumpfe Ligation deletiert. Dies verhindert alle derartigen Risiken.
Diskussion
Die Erfinder haben nachgewiesen, dass eine für ein Einzelketten-Maus-Antikörper/Retrovirus-Hüllfusionsprotein kodierende Plasmid-Vakzine eine starke humorale Antwort auf die Antikörpergruppierung in BALB/c-Mäusen induziert, wogegen die Vakzination mit dem gereinigten scFv-Protein im Gemisch mit Freund'schem Adjuvans keine messbare Antwort liefert. Die Induktion des B-Zellen-Gedächtnisses scheint zu erfolgen, da Boosten entweder mit löslichem Protein oder einem löslichen scFv-Expressionsvektor für die Hervorrufung eines schnellen Anstiegs des Antikörpertiters wirksam war.
Die humorale Immunantwort auf Protein, das von der Plasmid-Vakzine kodiert wird, bedeutet, dass Aufnahme in die Zelle und Expression des Plasmids in vivo aufgetreten sein müssen. Die Expression von Genen, die direkt in Muskel geimpft wurden, ist früher nachgewiesen worden (Wolff et al. (1990), vorher zitiert), jedoch ist dies nach dem Wissen der Erfinder der erste Beweis für eine Immunantwort auf ein Selbst- oder verändertes Selbst-Polypeptid nach direkter Injektion nackter DNA. Die Zellaufnahme und Expression von Genen wird erhöht, wenn die DNA auf Goldteilchen beschichtet und mit einer Partikelkanone in die Gewebe eingeschleust wird (Tang et al. (1992), vorher zitiert). Aufwändigere Gentransfer-Verfahren umfassen die Verwendung von Virusvektoren, Einkapseln von DNA in Liposomen, Koppeln von DNA an kotionische Liposomen oder an der Außenseite von Viren (für einen Überblick siehe Miller, Nature 357, 45–46 (1992)). Diese haben der Vorteil erhöhter Transfereffizienz, jedoch sind diese alternativen Ansätze im Vergleich zur direkten Injektion gereinigter DNA etwas aufwändiger und lassen mehr Sicherheitsfragen aufkommen.
Die humorale Anti-B1.8-Antwort auf das Plasmid-Vakzin pNIPenv war dem gegen gereinigtes B1.8-scFv-Protein im Gemisch mit Freund'schem Adjuvans hergestellten klar überlegen. Der hierin offenbarte Ansatz hat mehrere Vorteile. Nach dem Gentransfer wird wahrscheinlich eine kontinuierliche Versorgung mit dem Zielantigen vorliegen, die über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen abnimmt, wogegen initiiertes Protein eine sehr kurze Halbwertzeit haben kann. Bei Verwendung der Plasmid-Vakzine wird das B1.8-scFv zumindest teilweise an der Zelloberfläche verankert und ist wahrscheinlich in oligomere env-Proteinstrukturen eingebaut. Die Assoziation zwischen den beiden Komponenten von MoMLV-env (p15TM und p15TM) wird hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert und gp70SU kann von p15TM dissoziieren. Nach dem Gentransfer wird das Fusionsprotein daher dem Immunsystem als oligomeres, polyvalentes (mehrfache Kopien je Zelle) zellassoziiertes Antigen oder als lösliches Antigen präsentiert. Diese anhaltende Exposition mit neu synthetisiertem Antigen kann für eine optimale Immunantwort wichtig sein und dieses Argument ist verwendet worden, um die Überlegenheit lebender im Vergleich zu abgetöteten Virus-Vakzinen zu erklären.
Antigen-spezifische T-Helferzellen können humorale sowie zelluläre Immunantworten durch direkte Zellwechselwirkung und durch Bereitstellen geeigneter stimulierender Zytokine verstärken. Es sind mehrere Mechanismen vorstellbar, durch die die Plasmid-Vakzine Helfer-T-Zellen effizienter rekrutieren könnte, jedoch verdient einer davon besondere Erwähnung: Antigen-spezifische T-Helferzellenaktivierung und Proliferation werden durch MHC-Klasse-II-assoziierte, an der Oberfläche von B-Lymphozyten präsentierte Lymphozyten, Makrophagen und andere Antigen-präsentierende Zellen ausgelöst. Die MHC-Klasse-II-assoziierten Peptide sind vom aufgenommenen Antigen hergeleitet. B-Zellen, die spezifisch Epitope an B1.8-scFv erkennen, werden das Antigen internalisieren und prozessieren, um Peptide zur Oberflächenpräsentation zu erzeugen. Mit der Fusion von B1.8-scFv an ein Virushüllprotein werden alle B1.8-spezifischen B-Zellen mehr Raum für die Erzeugung von Peptiden haben (wovon viele vom höchst immunogenen env-Protein hergeleitet sein werden), die Helfer-T-Zellen rekrutieren können. Eine Sorge mit einem solchen Ansatz ist es, dass sich das T-Zellen-Gedächtnis für das schwach immunogene B1.8 nicht entwickelt, was in einer schwachen oder fehlenden anamnestischen humoralen Immunantwort resultiert. Dies war jedoch kein Problem, da sowohl intravenös verabreichtes lösliches scB1.8-Fv-Protein, als auch der lösliche Plasmid-Expressionsvektor pNIPstop einen schnellen Anstieg des Antikörpertiters hervorriefen.
Zytotoxische T-Zellen könnten bei der Zell-vermittelten Immunität gegen Tumoren und Viren von Bedeutung sein (im Überblick behandelt von Greenburg und Riddell, J. Natl. Cancer Inst. 84, 1059–1061 (1992)) und hier bestehen wiederum potentiell bedeutsame Unterschiede zwischen den in dieser Studie untersuchten Protein-basierten und Plasrnid-Vakzinen. Ebenso wie sie das Fusionsprotein in verschiedenen Formen exprimieren (siehe oben), präsentieren die MHC-Klasse-I-positiv transduzierten Zellen üblicherweise auch eine Reihe von B1.8-scFv- und/oder env-hergeleiteten MHC-Klasse-I-assoziierten Peptiden, die von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt werden. Dies sollte die Stimulierung einer wirksamen Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Zellen-Antwort unterstützen.
Unabhängig vom beteiligten Mechanismus ergab die in dieser Studie eingesetzte Impfstrategie eine starke humorale Immunantwort auf ein schwach immunogenes Einzelketten-Antikörperfragment und war der Vakzination mit gereinigtem Protein plus Adjuvans überlegen. Das in dieser Studie verwendete scFv-Gen könnte durch eine Vielzahl von Genen oder Genfragmenten ersetzt werden, die für schwach immunogene Selbst- oder modifizierte Selbst-Proteine kodieren. Geeignete Ausgangs-Zielantigene für eine solche Therapie sind Patienten-spezifische Vakzine gegen einzigartige Oberflächen-Immunglobuline und T-Zellen-Rezeptoren, die von bestimmten B-Zellen- und T-Zellen-Malignitäten exprimiert werden. Die schnelle PCR-Klonierung und Assemblierung von Antikörper-VH- und VL-Genen aus Oberflächen-Immunglobulin-positivem Human-B-Zellen-Lymphomgewebe ist bereits demonstriert worden. Einzelketten-T-Zellen-Rezeptoren sind ebenfalls kloniert und exprimiert worden (Soo Hoo et al., PNAS 89, 4759–4763 (1992)), und daher könnte ein solcher Ansatz auch auf T-Zellen-Malignitäten angewendet werden. Die Erweiterung auf nicht-maligne Krankheiten wären möglich, wenn bestätigt wird, dass der T-Zellen- und vielleicht B-Zellen-Rezeptor-Nutzung in Autoimmunerkrankungen, wie z. B. multipler Sklerose und primärchronischer Polyarthritis eingeschränkt ist (für einen Überblick siehe Marguerie et al., Immunol. Today 13, 336–338 (1992)). Es könnte dann möglich sein, unter Anwendung von In-cell-PCR-Assemblierung (Embleton et al., Nucl. Acids Res. 20, 3831–3837 (1992)) die oligoklonale Nutzung von B/T-Zellen-Rezeptoren zu identifizieren und somit geeignete Vakzinen herzustellen. Der Ansatz könnte auch für die schnelle Erzeugung stammspezifischer Vakzinen gegen höchst mutierbare Viren, wie z. B. HIV-1- und Influenza-Virus brauchbar sein.
Die Erzeugung zytotoxischer T-Zellen-Antwort auf das Antigen sollte theoretisch mit diesem Ansatz möglich sein und ist Gegenstand fortlaufender Untersuchungen. Wenn sich dies als möglich erweisen sollte, könnten weitere Verwendungen ins Auge gefasst werden. Immer mehr Wachstumsregulationsproteine finden sich in mutierten Formen oder als (aus Translokationen resultierende) Fusionsproteine in malignen Zellen (für einen Überblick siehe Urban und Schreiber, Ann. Rev. Immunol. 10, 617–644 (1992)). Solche abnormalen intrazellulären Proteine sind mögliche tumorspezifische Ziele für zytotoxische T-Zellen (für einen Überblick siehe Greenburg und Riddell (1992), oben zitiert). Häufig findet sich ein Spektrum von Veränderungen, häufig mit mehr als einem, in einem beliebigen individuellen Tumor beeinflussten Onkogen. Folglich kann die PCR-Klonierung der mutierten Gene und die Verwendung eines z. B. hierin beschriebenen Vektors ein praktikables Verfahren zur Erzeugung tumorspezifischer T-Zellen-Immunität auf Basis eines individuellen Patienten sein.
Es gibt Möglichkeiten, die hierin beschriebenen Konstrukte zu verbessern. In dieser Untersuchung wurde die Fusion an das MoMLV-env-Protein verwendet, jedoch ist es wahrscheinlich, dass ersatzweise andere immunogene Proteine als Fusionspartner verwendet werden könnten. Hüllproteine anderer komplexer Viren und immunogene Zelloberflächenproteine oder sekretierte Proteine, die von irgendeinem pathogenen Organismus oder irgendeiner nicht-humanen Spezies hergeleitet sind, können geeignete Alternativen darstellen. In der Tat kann es nützlich sein, mehrere antigene Fusionspartner zu verwenden, um zur Vermeidung des theoretischen Problems beizutragen, dass die Immunantwort auf die höchst immunogene Gruppierung des Fusionsproteins letztendlich jegliche Antwort auf das eigentliche (schwach immunogene) Ziel-Antigen verdrängen könnte.
Einer der Vorteile des genetischen Ansatzes der Vakzination ist es, dass er eventuell den effizienten Nutzung des natürlichen Verfahrens der Antigenpräsentation ermöglicht, die daher einen weites Spektrum von Effektorsystemen umfassen sollte. Darüber hinaus sollte die Manipulation und Verbesserung der erhaltenen Antwort relativ einfach sein: beispielsweise kann es möglich sein, die Effizienz zu verbessern, mit der T-Zellen Antigen präsentiert wird, indem Moleküle mit co-stimulierender Aktivität gemeinsam mit dem Immunogen exprirniert werden. Eines der wichtigen, an der Co-Stimulierung beteiligten Moleküle ist B7, das mit dem von T-Zellen exprimierten CD28 wechselwirkt, wodurch Hilfssignale für die T-Zellen-Aktivierung bereitgestellt werden (Galvin et al., J. Immunol. 12, 3802–3808 (1992)). Es werden neue Vektoren konstruiert, die sowohl B7, als auch idiotypisches Ig exprimieren. Sequenzen von Maus- sowie Human-B7 sind publiziert (Freeman et al., J. Immunol. 8, 2714–2722 (1989)) und die Gene werden mittels PCR kloniert werden. Eine Expressionskassette wird dann in vier der Vektoren der Erfinder insertiert werden, die idiotypische Sequenzen exprimieren.
Eine Reihe von Zytokinen verbessern bekanntermaßen Aspekte der Antigenpräsentation und die direkte Abgabe von Expressionsvektoren, die Zytokin-Gene enthalten, könnte die Vakzinen-Wirksamkeit verstärken. Interferon Gamma ist eines der Beispiele, das wegen der Eigenschaft der Up-Regulation der MHC-Expression nützlich sein könnte (Gaczynska et al., Nature 365, 264–267 (1993)). Das Gen könnte auf einem gesonderten Vektor kodiert und due Menge unabhängig davon variiert werden.
Episomale Vektoren wie z. B. jene, die auf EBV oder Papova-Virus basieren, könnten Vorteile gegenüber gegenwärtigen Vektoren aufweisen. Diese sollten eine episomale Replikation in hoher Kopieanzahl ermöglichen und könnten wirksamer sein. Neue Vektoren, die das pVAC1-HindIII/SXbal-Insert nützen, sind mit dem Expressionsplasmid pCEP4 (Invitrogen) konstruiert worden, das den EBV-Replikationsstartpunkt und EBNA enthält. Diese lieferten erhöhte Expressionsstärken und höhere Stabilität der Expression in Zellkulturexperimenten unter Verwendung der Human-Osteosarkom-Linie 791T und könnten in vivo wirksamer sein, obgleich sie auch neue Sicherheitsfragen für die Verwendung im Menschen aufwerfen. Effektivere Transfektionsverfahren, wie z. B. Liposomvermittelte und Rezeptor-vermittelte Abgabe kann die Effizienz des Prozesses ebenfalls verbessern.
Die Flexibilität und Einfachheit der direkten DNA-Abgabe vereinfacht üblicherweise das schnelle Testen einer Vielzahl der oben vorgeschlagenen Strategien. In Kombination mit den anhaltenden Fortschritten im Verständnis der Antigenpräsentation sollte dies unser Vermögen, eine aktive Anti-Tumor-Immunität zu erzeugten, erhöhen. Dieser Ansatz ist eindeutig sehr flexibel und kann für das Immunisieren mit vielen anderen Tumor-Antigenen brauchbar sein. Diese könnten die am Zervikalkarzinom beteiligten Human-Papilloma-Virus-E6/E7-Proteine; an vielen Krebsformen beteiligtes mutiertes p53/ras und möglicherweise onkofötale Antigene, wie z. B. karzinoembryonales Antigen umfassen. Zusätzlich kann der hier dargelegte Ansatz für Viren, wie z. B. HIV zweckdienlich sein, der eine hohe In-vivo-Mutationsrate aufweist, was eine signifikante Variation der kodierten Antigene unter Individuen bewirkt.
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung eine einfache, wirksame Impfstrategie zur Immunisierung mit schwach immunogenen Selbst- oder veränderten Selbst-Proteinen bereit. In speziellen Ausführungsformen folgt der PCR-Amplifikation (und Assemblierung) des Ziel-Gens die Restriktion und Klonierung des PCR-Produkt in das geeignet verdaute Expressionsplasmid. Eine Herstellung der resultierenden Plasmid-DNA im Großmaßstab wird dann direkt für die Impfung verwendet. Das Expressionsplasmid kann einen Krankheitsmarker in Fusion oder in Verbindung mit anderen immunmodulierenden Polypeptiden produzieren, um die Immunantwort zu modulieren, um ein therapeutisches Ziel zu erreichen. Die Notwendigkeit für eine kostspielige In-vitro-Proteinexpression und Reinigung wird umgangen und wird die Entwicklung von Vakzinen für eine Vielzahl von Krankheiten erleichtern, insbesondere jene, für die sie für Individuen oder Untergruppen von Patienten maßgeschneidert werden müssen.
Die obigen Seq.-ID Nr. 49–66 sind im nachstehenden zweiten Sequenzprotokoll als Seq.-ID Nr. 1–18 gezeigt.
SEQUENZPROTOKOLL
Tabelle 2: Ergebnisse der Sequenzanalyse von Patientenproben
Anm.:

*: bezeichnet Sequenzen, die durch Sequenzierung der V-Gene eines Heterohybrodims bestätigt wurden.
**: Die Leichtkette dieses Patienten versagte.
+: Verwendete Probe war Peripherblut.
NLN: Normaler Lymphknoten,
SPL: Milz,
ND: nicht durchgeführt.

Claims

Immunmodulationszusammensetzung, um die Immunreaktion auf ein Tumorassoziiertes Antigen zu modulieren, wobei die Zusammensetzung eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Expression des Tumor-assoziierten Antigens in eine Form lenkt, die mit dem Immunsystem des Individuums wechselwirkt, worin das Tumorassoziierte Antigen aus einer idiotypischen Determinante, die auf der Oberfläche einer B- oder T-Zellen-Malignität exprimiert wird, einem Onkogenprodukt oder einem onkofötalen Antigen ausgewählt ist.
Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Tumorassoziierte Antigen eine idiotypische Determinante ist, die auf der Oberfläche einer B- oder T-Zellen-Malignität exprimiert wird.
Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nucleinsäure in nichtcapsidierter Form vorliegt.
Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, die weiters eine zweite Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Expression eines weiteren Immunmodulationspolypeptids lenkt, um die Immunreaktion des Individums auf das Tumorassoziierte Antigen weiter zu modulieren.
Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 4, worin die zweite Nucleinsäuresequenz auf demselben Nucleinsäuremoiekül vorliegt wie die Nucleinsäuresequenz aus Anspruch 1.
Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, worin das Tumor-assoziierte Antigen und das weitere Immunmodulationspolypeptid im Individuum coexprimiert oder als Fusionspeptid exprimiert werden.
Immunmodulationszusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin das weitere Immunmodulationspolypeptid ein Cytokin oder eine fremde Aminosäuresequenz umfasst.
Immunmodulationszusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die Nucleinsäuresequenz oder die zweite Nucleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die bewirkt, dass das Tumor-assoziierte Antigen und/oder das weitere Immunmodulationspolypeptid Membran-assoziiert werden.
Immunmodulationszusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, worin die Nucleinsäuresequenz und/oder die zweite Nucleinsäuresequenz DNA umfassen.
Vektor, der eine Nucleotidsequenz aus den Nucleotiden 606 bis 716 der in 7 gezeigten Sequenz umfasst.
Vektor nach Anspruch 10, der eine Nucleotidsequenz aus den Nucleotiden 606 bis 780 der in 7 gezeigten Sequenz umfasst.
Vektor, der eine Nucleotidsequenz aus den Nucleotiden 775 bis 1 (in 5'→ 3'-Richtung) der in 7 gezeigten Sequenz umfasst.
Vektor nach einem der Ansprüche 10, 11 oder 12, der die in 7 gezeigte Nucleotidsequenz von pVAC1 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Immunmodulationszusammensetzung gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte des Identifizierens der Nucleinsäuresequenz, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, durch Analyse einer geeigneten Probe von einem Patienten; des davon ausgehenden extrazellulären Klonierens des Tumor-assoziierten Antigens; und des Insertierens der Nucleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Nucleinsäuresequenz, die für das Tumorassoziierte Antigen kodiert, mittels PCR von einem Patienten kloniert wird.
Verwendung einer Immunmodulationszusammensetzung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zum Modifizieren der Immunreaktion eines Individuums, worin die Modifikation die Abgabe der Nucleinsäuresequenz, die die Expression des Tumor-assoziierten Antigens in eine Form lenkt, die mit dem Immunsystem des Individuums wechselwirkt, in lebende Zellen in vivo umfasst.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die Nucleinsäuresequenz extrazellulär ausgehend von vom Individuum erhaltenen Proben kloniert wird.
Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, worin die Nucleinsäure in nichtcapsidierter Form abgegeben wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, die weiters die Abgabe der zweiten Nucleinsäuresequenz an das Individuum umfasst, um die Expression eines weiteren Immunmodulationspolypeptids zu lenken, um die Immunreaktion des Individuums auf Tumor-assoziiertes Antigen weiter zu modulieren.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die zweite Nucleinsäuresequenz auf demselben Nucleinsäuremolekül vorliegt wie die Nucleinsäuresequenz aus Anspruch 16.
Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, worin das Tumor-assoziierte Antigen und das weitere Immunmodulationspolypeptid im Individuum coexprimiert oder als Fusionspolypeptid exprimiert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 21, worin das weitere Immunmodulationspolypeptid ein Cytokin oder eine fremde Aminosäuresequenz umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, worin die Nucleinsäuresequenz oder die zweite Nucleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die bewirkt, dass das Tumor-assoziierte Antigen und/oder das weitere Immunmodulationspolypeptid Membran-assoziiert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, worin die Nucleinsäuresequenz und/oder die zweite Nucleinsäuresequenz DNA umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, worin das Tumor-assoziierte Antigen Folgendes umfasst: eine idiotypische Determinante eines auf B-Zellen-Oberflächen präsentierten Immunglobulinmoleküls; eine idiotypische Determinante eines T-Zellen-Rezeptors; ein Onkogen-Produkt; oder ein onkofötales Antigen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 25, worin die Immunreaktion eines Individuums auf ein Tumor-assoziiertes Antigen verstärkt wird.