JP2812726B2 - 特異的キャリア分子を有する主要組織適合性複合体クラスｉ抗原の抗原構造物、その調製および使用 - Google Patents
特異的キャリア分子を有する主要組織適合性複合体クラスｉ抗原の抗原構造物、その調製および使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、主要組織適合性複合体（MHC）クラスＩ抗
原と特異的キャリア分子との連結によって作出される抗
原構造物に関する。
原と特異的キャリア分子との連結によって作出される抗
原構造物に関する。
組織拒絶反応は、Ｔ細胞を介して起きる最も強力な既
知の免疫応答である。これらの反応は、同種の個体間に
おける、クラスＩおよびクラスII MHC抗原の同種異質遺
伝子型の（allogenic）相違によって起きる。臓器移植
においては、例えば、ドナー（供与者）組織に存在する
MHC抗原のいかなる同種異質遺伝子型決定因子（allogen
ic determinants）もレシピエント（被移植者）のアロ
特異性（allospecific）Ｔ細胞によって異物として認識
される。Ｔ細胞免疫応答反応が誘起されて、免疫抑制療
法が開始されていない限り、またはそのような療法が不
十分であるとわからない場合には、拒絶反応が起きる。
知の免疫応答である。これらの反応は、同種の個体間に
おける、クラスＩおよびクラスII MHC抗原の同種異質遺
伝子型の（allogenic）相違によって起きる。臓器移植
においては、例えば、ドナー（供与者）組織に存在する
MHC抗原のいかなる同種異質遺伝子型決定因子（allogen
ic determinants）もレシピエント（被移植者）のアロ
特異性（allospecific）Ｔ細胞によって異物として認識
される。Ｔ細胞免疫応答反応が誘起されて、免疫抑制療
法が開始されていない限り、またはそのような療法が不
十分であるとわからない場合には、拒絶反応が起きる。
さらに、MHCクラスＩ抗原は、すべての有核（nucleat
ed）細胞の表面において表現される糖タンパク質である
ことが知られている。これらは、MHCクラスＩ遺伝子に
よってコードされる重鎖、および重鎖と非共有結合で会
合（associate）しているβ２−ミクログロブリン、軽
鎖、からなる。重鎖の細胞外の部分は三つのドメインに
折り畳まれている。これらドメインの最初の二つ（アル
ファ１およびアルファ２）は、種々の個体からのこれま
でに知られていたクラスI MHC抗原のアミノ酸配列を比
較してみると著しい多形性を示す、これらは、抗原の提
示（presentation）を助け、同種異質遺伝子型決定因子
を有している。三つ目の細胞外ドメインは、より定常的
な（conserved）配列を有している。β２−ミクログロ
ブリンとの会合は、重鎖の正しい折り畳みおよび分子の
細胞表面への輸送に必須である。
ed）細胞の表面において表現される糖タンパク質である
ことが知られている。これらは、MHCクラスＩ遺伝子に
よってコードされる重鎖、および重鎖と非共有結合で会
合（associate）しているβ２−ミクログロブリン、軽
鎖、からなる。重鎖の細胞外の部分は三つのドメインに
折り畳まれている。これらドメインの最初の二つ（アル
ファ１およびアルファ２）は、種々の個体からのこれま
でに知られていたクラスI MHC抗原のアミノ酸配列を比
較してみると著しい多形性を示す、これらは、抗原の提
示（presentation）を助け、同種異質遺伝子型決定因子
を有している。三つ目の細胞外ドメインは、より定常的
な（conserved）配列を有している。β２−ミクログロ
ブリンとの会合は、重鎖の正しい折り畳みおよび分子の
細胞表面への輸送に必須である。
マウスの突然変異MHCクラスＩ抗原の単離および特徴
付けによって、ドナーおよびレシピエント間のアルファ
１およびアルファ２領域の僅か２、３個のアミノ酸の違
いによって拒絶反応が起きることが示された（Nathenso
nら:Ann.Rev.Immunol.、1986、４、471−502）。さら
に、ヒトにおいても、ドナーとレシピエント間の僅かな
違いが移植拒絶反応を引き起こすことが示された（J.Da
usset、F.T.Rapaport、L.Legrand、J.Colombani、A.Mar
celli−Barge:Skin allograftsurvival in 238 human s
ubjects:Role of specific relationships at the four
gene sites of the first and the second HL−A loc
i、Histocompatibility Testing（1970）381−397、Ter
asaki P.I.（編者））。上記の研究は、組織拒絶反応に
おける細胞免疫応答の特異的誘起性および強度を用い
て、選択された標的細胞を損傷または破壊するものであ
る。
付けによって、ドナーおよびレシピエント間のアルファ
１およびアルファ２領域の僅か２、３個のアミノ酸の違
いによって拒絶反応が起きることが示された（Nathenso
nら:Ann.Rev.Immunol.、1986、４、471−502）。さら
に、ヒトにおいても、ドナーとレシピエント間の僅かな
違いが移植拒絶反応を引き起こすことが示された（J.Da
usset、F.T.Rapaport、L.Legrand、J.Colombani、A.Mar
celli−Barge:Skin allograftsurvival in 238 human s
ubjects:Role of specific relationships at the four
gene sites of the first and the second HL−A loc
i、Histocompatibility Testing（1970）381−397、Ter
asaki P.I.（編者））。上記の研究は、組織拒絶反応に
おける細胞免疫応答の特異的誘起性および強度を用い
て、選択された標的細胞を損傷または破壊するものであ
る。
標的細胞特異的キャリア、例えば、好ましくはモノク
ローナル抗体（mAb）、さらに細胞上のレセプターに結
合するポリクローナル抗体または分子、を、不利な方法
でこの同種異質遺伝子型決定因子を変えることなく同種
異質遺伝子MHCクラスＩ分子のＮまたはＣ末端に結合さ
せることができることが見出された。この標的細胞特異
的キャリアを用いることによって、MHCクラスＩ分子
は、特異的に標的細胞に運ばれ、これによって、アロ特
異性Ｔ細胞が活性化されて、アロ特異性細胞毒性Ｔ細胞
によって標的細胞を破壊する。同種異質遺伝子型決定因
子を保ちながら標的細胞特異的キャリアがMHCクラスＩ
分子のＮまたはＣ末端にうまく結合される一つの説明
は、MHCクラスＩ分子のＮ末端が細胞に向っているアル
ファ１およびアルファ２を領域部位に位置しており、同
種異質遺伝子型決定因子が細胞から離れる方向に向いて
いるアルファ１およびアルファ２領域部位に位置してい
ることである（第１図、第34図）。
ローナル抗体（mAb）、さらに細胞上のレセプターに結
合するポリクローナル抗体または分子、を、不利な方法
でこの同種異質遺伝子型決定因子を変えることなく同種
異質遺伝子MHCクラスＩ分子のＮまたはＣ末端に結合さ
せることができることが見出された。この標的細胞特異
的キャリアを用いることによって、MHCクラスＩ分子
は、特異的に標的細胞に運ばれ、これによって、アロ特
異性Ｔ細胞が活性化されて、アロ特異性細胞毒性Ｔ細胞
によって標的細胞を破壊する。同種異質遺伝子型決定因
子を保ちながら標的細胞特異的キャリアがMHCクラスＩ
分子のＮまたはＣ末端にうまく結合される一つの説明
は、MHCクラスＩ分子のＮ末端が細胞に向っているアル
ファ１およびアルファ２を領域部位に位置しており、同
種異質遺伝子型決定因子が細胞から離れる方向に向いて
いるアルファ１およびアルファ２領域部位に位置してい
ることである（第１図、第34図）。
ヒトの場合では、MHCクラスＩ抗原の著しい多形性の
ために、選択される二つの異なるMHCクラスＩ分子、例
えば、HLA B27wおよびHLA B27k、を用いるだけでもほと
んど100％の確率で拒絶反応が起きる可能性がある。HLA
B27wおよびHLA B27kは、細胞毒性Ｔリンパ球によって
決定される血清学的に定義されたHLA B27特異性の二つ
のサブタイプである。コーカソイド人（caucasoid popu
lation）の場合は、約７％がHLA B27wで、約１％がHLA
B27kを表現する。例えば、本発明によるアロジェニゼー
ション（allogenization、同種異質遺伝子型化）におい
て両HLA B27サブタイプの使用は、コーカソイド人のほ
ぼ100％の治療を可能にする。しかしながら、本発明に
よれば、上記の抵抗が関連のレシピエントにおいてアロ
特異性Ｔ細胞の活性化およびそれに続く標的細胞の損傷
または破壊を起こさないとすれば、関連の特異的キャリ
アにいかなる所望のMHCクラスＩ抗原を連結することも
可能である。標的細胞は、例えば、腫瘍細胞のような、
生体において望まれないおよび／または病原性の細胞と
みなされるかもしれない。本発明の抗原構造物は、した
がって、腫瘍の治療に適している。しかしながら、本発
明のMHCクラスＩ抗原構造物を用いて、細胞またはその
産生物によって引き起こされ、それら細胞の排除が好ま
しい影響を及ばすような他の疾患を治療することも可能
である。例グループＩおよびIIに記載のハイブリド分子
の作用は、抗体部分の特異性のために、これらが細胞上
の抗原に結合することができるという事実に由来する。
融合分子のHLA B27部分によって、同種異質遺伝子型MHC
クラスＩ分子を有する標的細胞の表面をマスクする結果
となる。これらの同種異質遺伝子型クラスＩ分子は、次
いで、共通遺伝子型（syngeneic）アロ特異性細胞毒性
Ｔ細胞によって認識されて、その結果、アロ特異性細胞
毒性Ｔ細胞によって標的細胞が破壊される。したがっ
て、本発明は、次のことに関する。
ために、選択される二つの異なるMHCクラスＩ分子、例
えば、HLA B27wおよびHLA B27k、を用いるだけでもほと
んど100％の確率で拒絶反応が起きる可能性がある。HLA
B27wおよびHLA B27kは、細胞毒性Ｔリンパ球によって
決定される血清学的に定義されたHLA B27特異性の二つ
のサブタイプである。コーカソイド人（caucasoid popu
lation）の場合は、約７％がHLA B27wで、約１％がHLA
B27kを表現する。例えば、本発明によるアロジェニゼー
ション（allogenization、同種異質遺伝子型化）におい
て両HLA B27サブタイプの使用は、コーカソイド人のほ
ぼ100％の治療を可能にする。しかしながら、本発明に
よれば、上記の抵抗が関連のレシピエントにおいてアロ
特異性Ｔ細胞の活性化およびそれに続く標的細胞の損傷
または破壊を起こさないとすれば、関連の特異的キャリ
アにいかなる所望のMHCクラスＩ抗原を連結することも
可能である。標的細胞は、例えば、腫瘍細胞のような、
生体において望まれないおよび／または病原性の細胞と
みなされるかもしれない。本発明の抗原構造物は、した
がって、腫瘍の治療に適している。しかしながら、本発
明のMHCクラスＩ抗原構造物を用いて、細胞またはその
産生物によって引き起こされ、それら細胞の排除が好ま
しい影響を及ばすような他の疾患を治療することも可能
である。例グループＩおよびIIに記載のハイブリド分子
の作用は、抗体部分の特異性のために、これらが細胞上
の抗原に結合することができるという事実に由来する。
融合分子のHLA B27部分によって、同種異質遺伝子型MHC
クラスＩ分子を有する標的細胞の表面をマスクする結果
となる。これらの同種異質遺伝子型クラスＩ分子は、次
いで、共通遺伝子型（syngeneic）アロ特異性細胞毒性
Ｔ細胞によって認識されて、その結果、アロ特異性細胞
毒性Ｔ細胞によって標的細胞が破壊される。したがっ
て、本発明は、次のことに関する。
ａ）特異的キャリアにＮまたはＣ末端で結合したMHCク
ラスＩ抗原であって、結合は、好ましくは共有結合、し
かし、非共有結合、例えば、ビオチン−アビジン架橋
（biotin−avidin bridge）、でもよく、特異的キャリ
アは、標的細胞に選択的に結合し、好ましくはモノクロ
ーナル抗体であって、しかし、ポリクローナル抗体でも
よく、しかし、ごく一般的には、特定の細胞レセプター
に結合するレセプター結合性分子でもよい。
ラスＩ抗原であって、結合は、好ましくは共有結合、し
かし、非共有結合、例えば、ビオチン−アビジン架橋
（biotin−avidin bridge）、でもよく、特異的キャリ
アは、標的細胞に選択的に結合し、好ましくはモノクロ
ーナル抗体であって、しかし、ポリクローナル抗体でも
よく、しかし、ごく一般的には、特定の細胞レセプター
に結合するレセプター結合性分子でもよい。
ｂ）MHCクラスＩ抗原構造物の調製法。
ｃ）ａ）およびｂ）に記載のMHCクラスＩ抗原構造物
の、標的細胞の損傷または排除のための使用。
の、標的細胞の損傷または排除のための使用。
本発明は、以下の諸例および特許請求の範囲にさらに
記載されている通りであるが、それらは発明を限定する
ものではない。
記載されている通りであるが、それらは発明を限定する
ものではない。
以下の例１〜17は、本発明の構造物を詳述するもので
あって、ニトロフェノール（NP）特異性マウスmAb B/1
−8VH遺伝子（１）、ヒトIgG C F（ab′）２遺伝子
（２）およびHLA B27w遺伝子（３）からなる。（１）お
よび（２）はここでは特異的キャリア部分の例であり、
この場合はNPに対するmAbである。一方、（３）はHLAク
ラスＩ抗原を表す。
あって、ニトロフェノール（NP）特異性マウスmAb B/1
−8VH遺伝子（１）、ヒトIgG C F（ab′）２遺伝子
（２）およびHLA B27w遺伝子（３）からなる。（１）お
よび（２）はここでは特異的キャリア部分の例であり、
この場合はNPに対するmAbである。一方、（３）はHLAク
ラスＩ抗原を表す。
上記の構造物は、適当な形質転換の後、ヒトβ２−ミ
クログロブリンおよび免疫グロブリン軽鎖を含み、その
Ｖ遺伝子はVHB/1−８とともにNP結合部位を形成する。
例えば、マウスミエローマ細胞J558L（V.T.Oi、S.L.Mor
rison、L.A.Herzenberg、P.Berg:Immunoglobulin gene
expression in transformed Iymphoid cells.Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 1983、80、825）などのミエローマ細胞
によって発現されて分泌される。重鎖のVH遺伝子の交換
および適当な軽鎖の使用によって、特異的または選択的
mAbが存在する、所望の特異性を有するmAb/HLA B27w融
合産物を提供することが可能である。
クログロブリンおよび免疫グロブリン軽鎖を含み、その
Ｖ遺伝子はVHB/1−８とともにNP結合部位を形成する。
例えば、マウスミエローマ細胞J558L（V.T.Oi、S.L.Mor
rison、L.A.Herzenberg、P.Berg:Immunoglobulin gene
expression in transformed Iymphoid cells.Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 1983、80、825）などのミエローマ細胞
によって発現されて分泌される。重鎖のVH遺伝子の交換
および適当な軽鎖の使用によって、特異的または選択的
mAbが存在する、所望の特異性を有するmAb/HLA B27w融
合産物を提供することが可能である。
例 Ｉ 例１〜13は、モノクローナル抗体の３′末端にHLA
B27部分を有するHLA B27/mAb融合遺伝子の構築を示す。
B27部分を有するHLA B27/mAb融合遺伝子の構築を示す。
Ａ） mAb C遺伝子部分の調製（IgG3C遺伝子） 例１ ヒトIgG3C遺伝子をEMBL3ファージのヒト遺伝子バンク
（A.−M.Frischauf、H.Lehrach、A.Proustka、N.Murra
y:Lambda replacement vectors carrying polylinker s
equences.J.Mol.Biol.1983、170、827−842およびG.H.
A.Seemann、R.S.Rein、C.S.Brown、H.L.Ploegh:Gene co
nversion−like mechanisms may generate polymorphis
m in human class I genes.The EMBO Journal 1986、
５、547−552）から単離して、3.1kbの大きさのHind II
I/Sph IフラグメントとしてプラスミドベクターpUC19に
サブクローニングした（クローン54.1.24）（第２
図）。
（A.−M.Frischauf、H.Lehrach、A.Proustka、N.Murra
y:Lambda replacement vectors carrying polylinker s
equences.J.Mol.Biol.1983、170、827−842およびG.H.
A.Seemann、R.S.Rein、C.S.Brown、H.L.Ploegh:Gene co
nversion−like mechanisms may generate polymorphis
m in human class I genes.The EMBO Journal 1986、
５、547−552）から単離して、3.1kbの大きさのHind II
I/Sph IフラグメントとしてプラスミドベクターpUC19に
サブクローニングした（クローン54.1.24）（第２
図）。
とくに記載がない限り、本例および以下の諸例に用い
る方法はすべてH.LehrachおよびA.−M.Frischauf:Labor
atory Manual EMBL（1982）、Heidelberg、T.Maniati
s、E.F.Fritsch、およびJ.Sambrook:Molecular Clonin
g、A laboratory mannual（1982）、Cold Spring Harbo
r Laboratoryから採用した。
る方法はすべてH.LehrachおよびA.−M.Frischauf:Labor
atory Manual EMBL（1982）、Heidelberg、T.Maniati
s、E.F.Fritsch、およびJ.Sambrook:Molecular Clonin
g、A laboratory mannual（1982）、Cold Spring Harbo
r Laboratoryから採用した。
例２ 54.1.24クローンをHind IIIで完全消化、Pst Iで部分
消化した。その結果、中でも、CH1エクソンおよび１、
２または３個のヒンジエクソンを含む制限フラグメント
が得られる。これらフラグメントをアガロースゲルから
切り出して、Hind IIIおよびPst Iで切断したpUC19ベク
ターにクローニングした（第３図）、 次いで、CH1および３個のヒンジエクソンを含むプロ
スミドクローン（Ｆ（ab′）23H）をBamH IおよびAsp71
8で切断して、切断部位をT4リガーゼで埋填して再連結
させた（第４図）。これによって、Xba IとSst I切断部
位間のpUC19ポリリンカーが削除される。
消化した。その結果、中でも、CH1エクソンおよび１、
２または３個のヒンジエクソンを含む制限フラグメント
が得られる。これらフラグメントをアガロースゲルから
切り出して、Hind IIIおよびPst Iで切断したpUC19ベク
ターにクローニングした（第３図）、 次いで、CH1および３個のヒンジエクソンを含むプロ
スミドクローン（Ｆ（ab′）23H）をBamH IおよびAsp71
8で切断して、切断部位をT4リガーゼで埋填して再連結
させた（第４図）。これによって、Xba IとSst I切断部
位間のpUC19ポリリンカーが削除される。
I B） HLA B27遺伝子の調製 例３ HLA B27w遺伝子をEMBL3バクテリオファージにクロー
ニングされたゲノム遺伝子バンク（A.−M.Frischauf:前
出およびG.H.A.Seemann:前出）から単離して、制限酵素
地図作出およびヌクレオチド配列分析によって特徴付け
を行った。（A.Maxam、W.Gilbert:Sequencing end−1ab
eled DNA with base specific chemical cleavage.Met
h.Enzymol.1980、65、499−560、およびF.Sanger、S.Ni
cklen、A.R.Coulson:DNA sequencing with chain termi
nating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977、7
4、5463−5471i）（第５図）。
ニングされたゲノム遺伝子バンク（A.−M.Frischauf:前
出およびG.H.A.Seemann:前出）から単離して、制限酵素
地図作出およびヌクレオチド配列分析によって特徴付け
を行った。（A.Maxam、W.Gilbert:Sequencing end−1ab
eled DNA with base specific chemical cleavage.Met
h.Enzymol.1980、65、499−560、およびF.Sanger、S.Ni
cklen、A.R.Coulson:DNA sequencing with chain termi
nating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977、7
4、5463−5471i）（第５図）。
次いで、HLA B27w遺伝子を制限酵素Sst IおよびBgl I
Iで消化して、pUC19のSst IおよびBamH I切断部位にサ
ブクローニングした。サブフラグメントＡ、ＢおよびＣ
（第５図）を含むプラスミドクローンを単離した。
Iで消化して、pUC19のSst IおよびBamH I切断部位にサ
ブクローニングした。サブフラグメントＡ、ＢおよびＣ
（第５図）を含むプラスミドクローンを単離した。
例４ サブフラグメントＡを有するプラスミドをSst Iで完
全に、Sma Iで部分的に切断して、アガロースゲル上で
の分画の後にフラグメントＡ′（第６図）をHinc IIお
よびSst Iで切断したpUC19プラスミドにクローニングし
た。
全に、Sma Iで部分的に切断して、アガロースゲル上で
の分画の後にフラグメントＡ′（第６図）をHinc IIお
よびSst Iで切断したpUC19プラスミドにクローニングし
た。
例５ サブフラグメントＢを有するプラスミドをXba Iで消
化して、得られるXba I挿入物（Ｂ′）をXba Iで切断し
たpUC19プラスミドにクローニングした（第７図）。
化して、得られるXba I挿入物（Ｂ′）をXba Iで切断し
たpUC19プラスミドにクローニングした（第７図）。
例６ サブフラグメントＣを有するプラスミドをHind IIIで
完全に、Sst Iで部分的に切断して、HLA B27w遺伝子に
おいてフラグメントＡに連なったフラグメント（Ｃ′）
を、アガロースゲル上での分画の後に単離して、Hind I
IIおよびSst Iで切断したBluescript KS+プラスミドベ
クター（Stratagene、LaJolla、CA、USA）にクローニン
グした（第８図）。
完全に、Sst Iで部分的に切断して、HLA B27w遺伝子に
おいてフラグメントＡに連なったフラグメント（Ｃ′）
を、アガロースゲル上での分画の後に単離して、Hind I
IIおよびSst Iで切断したBluescript KS+プラスミドベ
クター（Stratagene、LaJolla、CA、USA）にクローニン
グした（第８図）。
例７ 一本鎖ファージをKS+プラスミドベクターＣ′からVCS
−M13ヘルパーファージ（Stratagene、カタログ＃20025
1）による感染によって調製して、精製した（Stratagen
e:Bluescript Exo/Mung DNA sequencing system:Instru
ction Manual）。合成オリゴヌクレオチド（Ｉ＝５′CC
TTACCTCATCTCAGG3′）をこれらの一本鎖とハイブリダイ
ズさせて、残る第二鎖をクレノウポリメラーゼを用いて
合成した。このようにして作り出した二本鎖プラスミド
でXLブルー細菌を形質転換させて、ヘルパーファージに
よる感染によって、得られるプラスミドクローンから一
本鎖ファージを再び作出して、ヌクレオチド配列をオリ
ゴヌクレオチドプライマーII（５′TGAGGGCTCCTGCTT
3′）（F.Sangerら：前出）を用いて決定した。アルフ
ァ３エクソンの３′末端のコドンTGG（アミノ鎖274）が
停止コドン（TGA）に突然変異しているクローンを同定
した（Ｃ″）（第９図）。
−M13ヘルパーファージ（Stratagene、カタログ＃20025
1）による感染によって調製して、精製した（Stratagen
e:Bluescript Exo/Mung DNA sequencing system:Instru
ction Manual）。合成オリゴヌクレオチド（Ｉ＝５′CC
TTACCTCATCTCAGG3′）をこれらの一本鎖とハイブリダイ
ズさせて、残る第二鎖をクレノウポリメラーゼを用いて
合成した。このようにして作り出した二本鎖プラスミド
でXLブルー細菌を形質転換させて、ヘルパーファージに
よる感染によって、得られるプラスミドクローンから一
本鎖ファージを再び作出して、ヌクレオチド配列をオリ
ゴヌクレオチドプライマーII（５′TGAGGGCTCCTGCTT
3′）（F.Sangerら：前出）を用いて決定した。アルフ
ァ３エクソンの３′末端のコドンTGG（アミノ鎖274）が
停止コドン（TGA）に突然変異しているクローンを同定
した（Ｃ″）（第９図）。
例８ フラグメントＡ′を有するプラスミドをSst Iで切断
して、プラスミドクローンＣ″をHind IIIにより完全に
Sst Iにより部分的に切断してアガロースゲル上で分画
した後に単離して得ておいたＣ″フラグメントと連結さ
せた。14℃で30分間連結させた後、非連結末端をT4ポリ
メラーゼで埋填して、次いで再度連結させた。制限酵素
地図を作出して、アルファ２エクソン中のSst I切断部
位を介してフラグメントＡ′がフラグメントＣ″に連結
しているプラスミドＤ（第10図）を同定した。
して、プラスミドクローンＣ″をHind IIIにより完全に
Sst Iにより部分的に切断してアガロースゲル上で分画
した後に単離して得ておいたＣ″フラグメントと連結さ
せた。14℃で30分間連結させた後、非連結末端をT4ポリ
メラーゼで埋填して、次いで再度連結させた。制限酵素
地図を作出して、アルファ２エクソン中のSst I切断部
位を介してフラグメントＡ′がフラグメントＣ″に連結
しているプラスミドＤ（第10図）を同定した。
例９ フラグメントＤを有するプラスミドをXba Iで切断し
て、プラスミドＢ′からXba Iで切り出してアガロース
ゲル上での分画の後に精製しておいたフラグメントＢ′
と連結させた（第11図）。ヌクレオチド配列分析（17）
を用いて、Ｂ′フラグメントが正しい５′−３′位置方
向でフラグメントＤに連結されているプラスミド（Ｅ）
を同定した。
て、プラスミドＢ′からXba Iで切り出してアガロース
ゲル上での分画の後に精製しておいたフラグメントＢ′
と連結させた（第11図）。ヌクレオチド配列分析（17）
を用いて、Ｂ′フラグメントが正しい５′−３′位置方
向でフラグメントＤに連結されているプラスミド（Ｅ）
を同定した。
Ｃ） 修飾されたHLA B27w遺伝子のIgG3CF（ab′）23H
遺伝子フラグメントとの融合 例10 EcoR IおよびHind IIIによる切断によってプラスミド
ＥからフラグメントＥを切り出して、末端をT4ポリメラ
ーゼで埋填して、アガロースゲル上での分画の後に精製
した。次いで、この精製フラグメントＥを、切断してか
らXba I末端をT4ポリメラーゼで埋填しておいたIgG3F
（ab′）23Hフラグメントを含むプラスミドと、連結さ
せた（第12図）。制限酵素地図を作出して、プラスミド
Ｆを含むクローンを同定した。これには修飾されたHLA
B27w遺伝子が正しい５′−３′位置方向でＦ（ab′）23
H遺伝子に融合されている。
遺伝子フラグメントとの融合 例10 EcoR IおよびHind IIIによる切断によってプラスミド
ＥからフラグメントＥを切り出して、末端をT4ポリメラ
ーゼで埋填して、アガロースゲル上での分画の後に精製
した。次いで、この精製フラグメントＥを、切断してか
らXba I末端をT4ポリメラーゼで埋填しておいたIgG3F
（ab′）23Hフラグメントを含むプラスミドと、連結さ
せた（第12図）。制限酵素地図を作出して、プラスミド
Ｆを含むクローンを同定した。これには修飾されたHLA
B27w遺伝子が正しい５′−３′位置方向でＦ（ab′）23
H遺伝子に融合されている。
例11 フラグメントＦの５′末端の前方にポリンカーを位置
するために、フラグメントＦをHind IIIおよびEcoR Iで
切断した。Hind IIIおよびXba I末端をT4ポリメラーゼ
で埋填して、Sst Iで切断してからそのSst I末端をT4ポ
リメラーゼで埋填しておいたpUC19にクローニングし
た。制限酵素分析を用いて、フラグメントＦからのpUC1
9ポリリンカー５′を有するプラスミドＧを含むクロー
ンを同定した（第13図）。
するために、フラグメントＦをHind IIIおよびEcoR Iで
切断した。Hind IIIおよびXba I末端をT4ポリメラーゼ
で埋填して、Sst Iで切断してからそのSst I末端をT4ポ
リメラーゼで埋填しておいたpUC19にクローニングし
た。制限酵素分析を用いて、フラグメントＦからのpUC1
9ポリリンカー５′を有するプラスミドＧを含むクロー
ンを同定した（第13図）。
例12 プラスミドＧをHind IIIおよびEcoR Iで切断して、Ig
G F（ab′）2HLA B27w融合遺伝子を含む挿入物を単離し
て、Hind IIIおよびEcoR Iで切断したBluescript KS+プ
ラスミドベクター（Stratagene:Bluescript Exo/Mung D
NA sequencing system:Instruction Manual）でクロー
ニングした（第14図）。
G F（ab′）2HLA B27w融合遺伝子を含む挿入物を単離し
て、Hind IIIおよびEcoR Iで切断したBluescript KS+プ
ラスミドベクター（Stratagene:Bluescript Exo/Mung D
NA sequencing system:Instruction Manual）でクロー
ニングした（第14図）。
例13 次いで、このクローニングから得られるプラスミドＨ
をBamH Iで切断して、挿入物を真核発現ベクターpEV
H（T.Simon、K.Rajepsky:Nucl.Acids Res.1988,16、34
5）でクローニングした。このベクターは、IgG Hプロモ
ーター／エンハンサー配列およびBamH Iで切断しておい
た、NP−特異性マウスmAb B/1−８に由来するVH遺伝子
を含むものである。（第15図）（M.N.Neuberger:EMBO J
ournal 1983、２、1375−1378）。制限酵素分析を用い
て、IgG 3F（ab′）2HLA B27w融合遺伝子が正しい５′
−３′位置方向でVH遺伝子の後方にクローニングされて
いるプラスミドＩを同定した。
をBamH Iで切断して、挿入物を真核発現ベクターpEV
H（T.Simon、K.Rajepsky:Nucl.Acids Res.1988,16、34
5）でクローニングした。このベクターは、IgG Hプロモ
ーター／エンハンサー配列およびBamH Iで切断しておい
た、NP−特異性マウスmAb B/1−８に由来するVH遺伝子
を含むものである。（第15図）（M.N.Neuberger:EMBO J
ournal 1983、２、1375−1378）。制限酵素分析を用い
て、IgG 3F（ab′）2HLA B27w融合遺伝子が正しい５′
−３′位置方向でVH遺伝子の後方にクローニングされて
いるプラスミドＩを同定した。
ここで、mAb/HLA B27w融合遺伝子は、真核細胞におけ
る発現に必要なすべてのシグナルを含むもとのままの
（intact）５′および３′末端を有している。導入部で
記載したように、構造物は、ヒトβ２−ミクログロブリ
ンおよび免疫グロブリンの軽鎖を含み、そのＶ遺伝子は
VHB/1−８とともにNP結合部位を形成する。いかなるミ
エローマ細胞中でも発現されて分泌される。これには、
例えばマウスミエローマ細胞J558L（V.T.Oi、S.L.Morri
son、L.A.Herzenberg、P.Berg:Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1883、80、825）などがある。
る発現に必要なすべてのシグナルを含むもとのままの
（intact）５′および３′末端を有している。導入部で
記載したように、構造物は、ヒトβ２−ミクログロブリ
ンおよび免疫グロブリンの軽鎖を含み、そのＶ遺伝子は
VHB/1−８とともにNP結合部位を形成する。いかなるミ
エローマ細胞中でも発現されて分泌される。これには、
例えばマウスミエローマ細胞J558L（V.T.Oi、S.L.Morri
son、L.A.Herzenberg、P.Berg:Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1883、80、825）などがある。
II 例14〜17は、モノクローナル抗体の５′末端でHLA
B27部分と融合したHLA B27/mAb融合遺伝子の構築を示
す。
B27部分と融合したHLA B27/mAb融合遺伝子の構築を示
す。
Ａ） HLA B27遺伝子の調製 例14 HLA B27w遺伝子をEMBL3バクテリオファージにおいて
クローニングされたゲノム遺伝子バンク（Frischauf
ら：前出およびG.H.A.Seemannら：前出）から単離し
て、制限酵素地図作出およびヌクレオチド配列分析によ
って特徴付けを行った（Maxamら：前出およびSanger
ら：）（第５図）。
クローニングされたゲノム遺伝子バンク（Frischauf
ら：前出およびG.H.A.Seemannら：前出）から単離し
て、制限酵素地図作出およびヌクレオチド配列分析によ
って特徴付けを行った（Maxamら：前出およびSanger
ら：）（第５図）。
HLA B27w遺伝子を、次いで、制限酵素Sst IおよびBgl
IIで消化して、pUC19のSst IおよびBamH I切断部位に
サブクローニングした。サブフラグメントＡ、Ｂおよび
Ｃ（第５図）を含むプラスミドクローンを単離した。
IIで消化して、pUC19のSst IおよびBamH I切断部位に
サブクローニングした。サブフラグメントＡ、Ｂおよび
Ｃ（第５図）を含むプラスミドクローンを単離した。
HLA B27サブクローンＣを有するプラスミドをPst Iで
部分的に切断した。Pst I切断部位の突出３′末端をdGT
Pを加えてT4ポリメラーゼで除去して、T4リガーゼで再
連結させた。制限酵素分析を用いて、アルファ２とアル
ファ３エキソン間のイントロン中にPst I切断部位を含
まないプラスミドクローンＣを同定した（第16図）。
部分的に切断した。Pst I切断部位の突出３′末端をdGT
Pを加えてT4ポリメラーゼで除去して、T4リガーゼで再
連結させた。制限酵素分析を用いて、アルファ２とアル
ファ３エキソン間のイントロン中にPst I切断部位を含
まないプラスミドクローンＣを同定した（第16図）。
プラスミドクローンC1をSst Iで部分的に、Hind III
で完全に切断して、C1′フラグメントを単離して、Sst
IおよびHind IIIで切断した二本鎖M13mp18ベクターにク
ローニングした。C1′フラグメントを有するM13クロー
ンC1′を、挿入物の核酸配列決定によって同定した（第
17図）。
で完全に切断して、C1′フラグメントを単離して、Sst
IおよびHind IIIで切断した二本鎖M13mp18ベクターにク
ローニングした。C1′フラグメントを有するM13クロー
ンC1′を、挿入物の核酸配列決定によって同定した（第
17図）。
Bio−Rad Muta−Gene M13突然変異生成キット（mutag
enesis kit）の使用説明に従って、細菌株CJ236におい
てC1′M13mp18ファージから、ウラシルを含む一本鎖フ
ァージを単離した。配列５′GCGCGCTGGAGCGTCTC3′を有
するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドIII）を
これら一本鎖ファージとハイブリダイズさせて、第二鎖
をT4ポリメラーゼ、dNTPおよびT4リガーゼを加えて合成
した。
enesis kit）の使用説明に従って、細菌株CJ236におい
てC1′M13mp18ファージから、ウラシルを含む一本鎖フ
ァージを単離した。配列５′GCGCGCTGGAGCGTCTC3′を有
するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドIII）を
これら一本鎖ファージとハイブリダイズさせて、第二鎖
をT4ポリメラーゼ、dNTPおよびT4リガーゼを加えて合成
した。
細菌株MV1190感染の後、突然変異させたクローンC2
を、M13mp18二本鎖DNAの制限酵素分析で同定して、核酸
配列分析によって確認した（第18図）。突然変異生成の
結果、解読枠またはコードされるアミノ酸配列を変える
ことなく、アルファ２エクソンのPst I制限酵素切断部
位が破壊された。
を、M13mp18二本鎖DNAの制限酵素分析で同定して、核酸
配列分析によって確認した（第18図）。突然変異生成の
結果、解読枠またはコードされるアミノ酸配列を変える
ことなく、アルファ２エクソンのPst I制限酵素切断部
位が破壊された。
一本鎖ファージを、次いで、細菌株CJ236においてM13
クローンC2から産出して、オリゴヌクレオチドIV（オリ
ゴヌクレオチドIV＝５′GGGGACGGTGGAATTCGAAGACGGCTC
3′）とハイブリダイズさせた。第二鎖をT4ポリメラー
ゼ、T4リガーゼおよびdNTPを加えて合成した。細菌株MV
1190での形質転換の後、M13mp18クローンC2′を制限酵
素分析で同定して、突然変異が正しいことを核酸配列分
析によって確認した（第19図）。この突然変異生成の結
果、HLA B27遺伝子のTMエクソン中にEcoR IおよびAsu I
I切断部位が導入され、アミノ酸279がグルタミンからア
スパラギンに変換された（第20図）。
クローンC2から産出して、オリゴヌクレオチドIV（オリ
ゴヌクレオチドIV＝５′GGGGACGGTGGAATTCGAAGACGGCTC
3′）とハイブリダイズさせた。第二鎖をT4ポリメラー
ゼ、T4リガーゼおよびdNTPを加えて合成した。細菌株MV
1190での形質転換の後、M13mp18クローンC2′を制限酵
素分析で同定して、突然変異が正しいことを核酸配列分
析によって確認した（第19図）。この突然変異生成の結
果、HLA B27遺伝子のTMエクソン中にEcoR IおよびAsu I
I切断部位が導入され、アミノ酸279がグルタミンからア
スパラギンに変換された（第20図）。
例15 サブフラグメントＢを有するプラスミドクローンをXb
a Iで消化して、得られたXba I挿入物（Ｂ′）をXba I
で切断したpUC19プラスミドでクローニングした（第７
図）。
a Iで消化して、得られたXba I挿入物（Ｂ′）をXba I
で切断したpUC19プラスミドでクローニングした（第７
図）。
フラグメントＡを有するプラスミドクローンをHind I
Iで完全に、Sma Iで部分的に切断して、再連結させた。
制限酵素分析を用いて、pUC19ポリリンカーの一部が欠
落しているクローンＡ′を同定した（第21図）。
Iで完全に、Sma Iで部分的に切断して、再連結させた。
制限酵素分析を用いて、pUC19ポリリンカーの一部が欠
落しているクローンＡ′を同定した（第21図）。
プラスミドクローンＡ′をSst Iで部分消化して、プ
ラスミドクローンC2をSst Iで切断して生じたフラグメ
ントをアガロースゲル上で分画後に単離して得たC2フラ
グメントと連結させた。制限酵素地図作出を用いて、フ
ラグメントＡがアルファ２エクソンのSst I切断部位を
介してフラグメントC2に連結している、プラスミドD1
（第22図）を同定したHLA B27w遺伝子の５′末端をこの
ようにして完成させる。
ラスミドクローンC2をSst Iで切断して生じたフラグメ
ントをアガロースゲル上で分画後に単離して得たC2フラ
グメントと連結させた。制限酵素地図作出を用いて、フ
ラグメントＡがアルファ２エクソンのSst I切断部位を
介してフラグメントC2に連結している、プラスミドD1
（第22図）を同定したHLA B27w遺伝子の５′末端をこの
ようにして完成させる。
リンカーの構築： 二つのオリゴヌクテオチドを合成した： 二つのオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリダイズさ
せた。その結果、一方の末端にEcoR I制限酵素切断部位
を有し、他の末端にPst I制限酵素切断部位を有する、
二本鎖DNAフラグメントが得られた。これらのフラグメ
ントをEcoR IおよびPst Iで切断して、EcoR IおよびPst
Iで切断したpUC19プラスミドベクターにクローニング
した（第23図）。プラスミドクローンＬを制限酵素分析
によって同定して、ヌクレオチド配列分析によって確認
した。
せた。その結果、一方の末端にEcoR I制限酵素切断部位
を有し、他の末端にPst I制限酵素切断部位を有する、
二本鎖DNAフラグメントが得られた。これらのフラグメ
ントをEcoR IおよびPst Iで切断して、EcoR IおよびPst
Iで切断したpUC19プラスミドベクターにクローニング
した（第23図）。プラスミドクローンＬを制限酵素分析
によって同定して、ヌクレオチド配列分析によって確認
した。
免疫グロブリンＶ遺伝子を、オリゴヌクレオチドを用
いてP.T.Jonesらの方法（P.T.Jones、P.E.Dear、J.Foot
e、M.S.Neuberger、G.Winter:Nature 1986,321,552）に
て合成した。これはクローンの５′領域にPst I制限酵
素切断部位を含み、Hind III/BamH Iフラグメントとし
て、Pst I切断部位を切断、突出末端の除去および再連
結によって破壊しておいたM13mp8ベクターにクローニン
グされる（第24図）。
いてP.T.Jonesらの方法（P.T.Jones、P.E.Dear、J.Foot
e、M.S.Neuberger、G.Winter:Nature 1986,321,552）に
て合成した。これはクローンの５′領域にPst I制限酵
素切断部位を含み、Hind III/BamH Iフラグメントとし
て、Pst I切断部位を切断、突出末端の除去および再連
結によって破壊しておいたM13mp8ベクターにクローニン
グされる（第24図）。
II B） mAb C遺伝子部分の調製 例16 ヒトIgG 3 C遺伝子をEMBL3ファージのヒト遺伝子バン
ク（Frischaufら：前出およびSeemannら：前出）から単
離して、3.1kbの大きさのHind III/Sph Iフラグメント
としてプラスミドベクターpUC19でサブクローニングし
た（クローン54.1.24）（第２図）。
ク（Frischaufら：前出およびSeemannら：前出）から単
離して、3.1kbの大きさのHind III/Sph Iフラグメント
としてプラスミドベクターpUC19でサブクローニングし
た（クローン54.1.24）（第２図）。
プラスミドクローン54.1.24をHind IIおよびAsp718で
切断して、Asp718切断部位の突出末端をT4ポリメラーゼ
で除去して、T4リガーゼで再連結させた。制限酵素分析
および核酸配列決定を用いて、ヒトIgG 3C遺伝子の制限
酵素切断部位３′のSph I、Pst I、Sst IおよびEcoR I
以外はもはや含まない、クローン54.1.24デルタPolを同
定した（第25図）。
切断して、Asp718切断部位の突出末端をT4ポリメラーゼ
で除去して、T4リガーゼで再連結させた。制限酵素分析
および核酸配列決定を用いて、ヒトIgG 3C遺伝子の制限
酵素切断部位３′のSph I、Pst I、Sst IおよびEcoR I
以外はもはや含まない、クローン54.1.24デルタPolを同
定した（第25図）。
プラスミドクローン54.1.24デルタPolをBgl IIおよび
Sph Iで消化した。突出末端をT4ポリメラーゼで除去し
て、T4リガーゼで再連結させた。制限酵素分析および核
酸配列決定を用いて、いまヒトIgG 3C遺伝子のCH1エク
ソンのみを含むクローンＩを同定した（第26図）。
Sph Iで消化した。突出末端をT4ポリメラーゼで除去し
て、T4リガーゼで再連結させた。制限酵素分析および核
酸配列決定を用いて、いまヒトIgG 3C遺伝子のCH1エク
ソンのみを含むクローンＩを同定した（第26図）。
プラスミドクローンＩをPst Iで切断して、突出末端
をT4ポリメラーゼで除去した。Xba Iで切断してからT4
ポリメラーゼで埋填して平滑末端にしておいたＢ′挿入
物を、得られた平滑末端に連結させた。制限酵素分析お
よび核酸配列決定を用いて、ヒトIgG3CH1エクソンおよ
びHLAクラスＩ遺伝子の３′末端を含む、クローンＫ
（第27図）を同定した。
をT4ポリメラーゼで除去した。Xba Iで切断してからT4
ポリメラーゼで埋填して平滑末端にしておいたＢ′挿入
物を、得られた平滑末端に連結させた。制限酵素分析お
よび核酸配列決定を用いて、ヒトIgG3CH1エクソンおよ
びHLAクラスＩ遺伝子の３′末端を含む、クローンＫ
（第27図）を同定した。
プラスミドクローンＫをHind IIIおよびEcoR Iで切断
して、突出末端を除去して、挿入物を、同様に末端を平
滑にしておいたSst I切断pUC19プラスミドに、連結し
た。CH1エクソンからのpUC19ベクター５′のポリリンカ
ーを有するクローンＬを同定した（第28図）。
して、突出末端を除去して、挿入物を、同様に末端を平
滑にしておいたSst I切断pUC19プラスミドに、連結し
た。CH1エクソンからのpUC19ベクター５′のポリリンカ
ーを有するクローンＬを同定した（第28図）。
プラスミドクローンＬをEcoR IおよびHind IIIで切断
して、挿入物を精製して、Hind IIIおよびEcoR Iで切断
したKS+ベクター（Stratagene:Bluescript Exo/Mung DN
A Sequencing System）に連結した。このベクターのPst
I切断部位は、Pst Iによる切断、T4ポリメラーゼ処理
および再連結によって予め破壊しておいた。クローンＭ
を同定した（第29図）。このクローンからBamH I切断に
よってHLAクラスI3′末端を含むヒトCH1エクソンを切り
出すことができる。
して、挿入物を精製して、Hind IIIおよびEcoR Iで切断
したKS+ベクター（Stratagene:Bluescript Exo/Mung DN
A Sequencing System）に連結した。このベクターのPst
I切断部位は、Pst Iによる切断、T4ポリメラーゼ処理
および再連結によって予め破壊しておいた。クローンＭ
を同定した（第29図）。このクローンからBamH I切断に
よってHLAクラスI3′末端を含むヒトCH1エクソンを切り
出すことができる。
例17 二本鎖DNAをM13mp8クローンＶから調製して、BamH I
で切断した。KS+クローンＭをBamH Iで切断して、挿入
物Ｍを精製した。ＭフラグメントをBamH Iで切断したク
ローンＶに連結させて、核酸配列決定を用いて、もとの
ままのIgG3遺伝子を含むM13クローンＮを同定した（第3
0図）。
で切断した。KS+クローンＭをBamH Iで切断して、挿入
物Ｍを精製した。ＭフラグメントをBamH Iで切断したク
ローンＶに連結させて、核酸配列決定を用いて、もとの
ままのIgG3遺伝子を含むM13クローンＮを同定した（第3
0図）。
二本鎖DNAをM13クローンＮから調製して、EcoR Iで切
断して、挿入物を精製した。プラスミドクローンD1をEc
oR Iで切断して、フラグメントＮと連結させた。フラグ
メントＮがクローンD1に正しい位置方向でクローニング
されるファージクローンＯを単離した（第31図）。
断して、挿入物を精製した。プラスミドクローンD1をEc
oR Iで切断して、フラグメントＮと連結させた。フラグ
メントＮがクローンD1に正しい位置方向でクローニング
されるファージクローンＯを単離した（第31図）。
プラスミドクローンＯをPst Iで完全切断およびEcoR
Iでの部分切断に供して、EcoR IおよびPst Iでプラスミ
ドベクターＬから切り出したリンカー断片と連結させ
た。プラスミドクローンＰは完全なHLA B27w mAb融合遺
伝子を含む（第32図、第33図）。この融合遺伝子は、発
現細胞もまた免疫グロブリン軽鎖を含むとすれば、ヒト
細胞単独でまたはマウスの細胞で、ヒトβ２ミクログロ
ブリン遺伝子とともに、発現分泌することができる。
Iでの部分切断に供して、EcoR IおよびPst Iでプラスミ
ドベクターＬから切り出したリンカー断片と連結させ
た。プラスミドクローンＰは完全なHLA B27w mAb融合遺
伝子を含む（第32図、第33図）。この融合遺伝子は、発
現細胞もまた免疫グロブリン軽鎖を含むとすれば、ヒト
細胞単独でまたはマウスの細胞で、ヒトβ２ミクログロ
ブリン遺伝子とともに、発現分泌することができる。
第１図は、MHCクラスＩ抗原と標的細胞を図示する、説
明図である。図中、α１およびα２およびα３は、クラ
スI MHC抗原鎖の領域を示す。矢印は、アロ決定因子（a
llodeterminants）を有するアルファヘリックスを指
す、CMは、細胞膜、Ｃは細胞を表す。 第２〜33図は、本発明のHLA融合遺伝子の構築を図示す
る、説明図である。図中、EcoR I等の記載は特異的制限
エンドヌクレアーゼまたは対応する切断部位を表し、棒
線による打ち消し文字は埋填の後に再連結によって破壊
された制限酵素切断部位を表す。TMは、トランスメンブ
ラン（transmembrane）領域を表す。３′NTは３′非翻
訳（non−translated）、IgH p/Eは免疫グロブリン重鎖
プロモーター／エンハンサー、＊は不完全消化、DS−DN
Aは二本鎖DNA、SS−DNAは一本鎖DNAを各々表す。 第34図は、抗原構造物の作用機序を図示する、説明図で
ある。図中、s.CTLは、共通遺伝子型の細胞毒性Ｔリン
パ球（syngeneic cytotoxic Tlymphocyte）、TcRはＴ−
細胞レセプター、a.MHCクラスＩは同種異質遺伝子型MHC
クラスＩ抗原、t.a.a.は腫瘍関連抗原（tumor−associa
ted antigen）、a.t.c.は、共通遺伝子型の腫瘍細胞（s
yngeneic tumor cell）を表す。
明図である。図中、α１およびα２およびα３は、クラ
スI MHC抗原鎖の領域を示す。矢印は、アロ決定因子（a
llodeterminants）を有するアルファヘリックスを指
す、CMは、細胞膜、Ｃは細胞を表す。 第２〜33図は、本発明のHLA融合遺伝子の構築を図示す
る、説明図である。図中、EcoR I等の記載は特異的制限
エンドヌクレアーゼまたは対応する切断部位を表し、棒
線による打ち消し文字は埋填の後に再連結によって破壊
された制限酵素切断部位を表す。TMは、トランスメンブ
ラン（transmembrane）領域を表す。３′NTは３′非翻
訳（non−translated）、IgH p/Eは免疫グロブリン重鎖
プロモーター／エンハンサー、＊は不完全消化、DS−DN
Aは二本鎖DNA、SS−DNAは一本鎖DNAを各々表す。 第34図は、抗原構造物の作用機序を図示する、説明図で
ある。図中、s.CTLは、共通遺伝子型の細胞毒性Ｔリン
パ球（syngeneic cytotoxic Tlymphocyte）、TcRはＴ−
細胞レセプター、a.MHCクラスＩは同種異質遺伝子型MHC
クラスＩ抗原、t.a.a.は腫瘍関連抗原（tumor−associa
ted antigen）、a.t.c.は、共通遺伝子型の腫瘍細胞（s
yngeneic tumor cell）を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 １，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．161［５ ］（1985）ｐ935−952 ２，ＥＭＢＯ ｊ．５［３］（1986) ｐ．547−552 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】Ｔ細胞刺激性の主要組織適合性複合体（MH
C）クラスＩ抗原を含んでなる抗原構造物であって、Ｔ
細胞を活性化するアロエピトープを有し、そのＣ−また
はＮ−末端において特異的キャリア分子に結合し、該特
異的キャリア分子がCD4領域またはモノクローナル抗体
であることを特徴とする抗原構造物。 - 【請求項２】モノクローナル抗体が重鎖の定常部におい
て短縮されている、請求項１に記載の抗原構造物。 - 【請求項３】MHCクラスＩ抗原がHLA B27wまたはHLA B27
kである、請求項１に記載の抗原構造物。 - 【請求項４】MHCクラスＩ抗原がキャリア分子に共有結
合で結合している、請求項１に記載の抗原構造物。 - 【請求項５】MHCクラスＩ抗原がキャリア分子にアビジ
ン／ビオチンを介して結合している、請求項１に記載の
抗原構造物。 - 【請求項６】抗原構造物をコードするDNAの融合による
遺伝子操作によって調製する、請求項１に記載の抗原構
造物。 - 【請求項７】必要な部分の遺伝子をそれらのDNAの形で
融合させて、それに適当な調節配列を整備して、適当な
発現系（system）で発現させることからなる、請求項１
に記載の抗原構造物の製造法。
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| EP0352761A2 (de) | 1990-01-31 |
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