JPH029371A - ヒトがん胎児性抗原に対するキメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 不発明は、ヒトがん胎児性抗原に対するモノクローナル
抗体に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、
インビトロまたはインビナでの利用のためのヒトかん胎
児性抗原に対する新規なモノクローナル抗体、および該
抗体をコードしているＤＮＡ構築物に関するものである
。

［従来技術とその課題］ モノクローナル抗体は、インビトロにおいてはイムノア
ッセイでの利用、インビボにおいては疾患の診断および
治療にますます重要性を増しつつある。ヒトがん胎児性
抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体は、結腸直
腸がんや乳がんなどのある種のがんに伴う腫瘍のインビ
ボイメージ形成および治療にとくに有用である。臨床面
への適用に応じて、これらのモノクローナル抗体は、一
般に放射性核種、薬物またはトキシン（毒素）と結合（
フンシュゲート）させる。

しかしながら、最も利用可能なモノクローナル抗体はネ
ズミ、即ちマウスのハイブリドーマから導かれたもので
ある。インビトロでのイムノアッセイへのネズミ抗体の
適用には、血清成分とネズミ免疫グロブリンとの反応に
よる偽陽性に関連した問題が起こり得る。しかしながら
、さらに重要なことは、ネズミ抗体のヒト用医薬中への
インビボ適用は、それに固有の免疫原性によってしばし
ば制限されるということである。ネズミ抗体の適用は、
多くの患者で免疫応答を誘導し、多数回投与治療の間に
抗体の効果が徐々に減少してしまう。

効果の減少は、少なくとも、部分的には循環系からの迅
速なりリアランス（清掃）、または患者の免疫応答によ
るネズミ抗体の薬物動態学的性質の変化に帰することが
できる。したがって、不ズミモノクローナル抗体は関連
の免疫原性により、長期的な複数回投与から除外される
こととなり、実質上、その潜在的な治療上の価値は打撃
を受ける。

ヒトモノクローナル抗体を臨床使用すると、不ズミモノ
クローナル抗体の使用に伴う制限を克服し得ることが示
唆された。しかしながら、腫瘍関連抗原、たとえばヒト
がん胎児性抗原に対する所望の特異性および親和性を有
するヒトモノクローナル抗体の製造は技術的に困難であ
る。

［課題を解決するための手段］ １つの種から導かれた抗体の結合または可変領域と、他
の種から導かれた抗体の不変領域とが結合しているキメ
ラ抗体が、組換えＤＮＡ法で構築されている。キメラ抗
体は、たとえば、ヨーロッパ特許公開第１７３４９４号
；ショーら（Ｓｈａｖ）、ジャーナル・オブ・イムノ、
（Ｊ、１ｍ１ｌｕｎ、）、１３８：４５３４（１９８７
）；サンら（Ｓｕｎ　Ｌ、に、）、プロンーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイ
ズ（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ　１．　Ａ　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８４：２１４　２１８　（１９８７
）；　＝、−バーガーら（Ｎ　ｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ
　、　Ｓ　、　）、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３
１４：２６８（１９８５）：ブリアンら（Ｂｏｕｌｉａ
ｎｎｅ、　Ｇ、　Ｌ、）、ネイチャー３１２：６４３−
６４６（１９８４）；およびモリフンら（Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ、　Ｓ　、　Ｌ、　）、プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、８
１：６８５１−６８５５（１９８４）、に記載されてい
る。通常は、ネズミ抗体の可変領域とヒト抗体の不変領
域とが結合されている。そのようなキメラ抗体の大部分
はヒト成分であるために、実質上、ネズミ抗体よりも免
疫原性が低いと考えられる。したがって、インビボでの
適用にはキメラモノクローナル抗体が極めて望ましい。

キメラ抗体に関する一般的な概念に関する記述はあるが
、特定の興味ある抗原、とりわけヒト胎児性がん抗原に
特異的であって、アミノ酸配列が定義されている（分か
っている）可変領域を有する新規なキメラモノクローナ
ル抗体の開発が必要とされている。さらに、軽鎖および
重鎖可変領域をコードする定義されたＤＮＡ配列を有す
る新規なキメラ抗体を含むＤＮＡ構築物であって、真核
性細胞内でこれらの新規な牛メラタンパク質を発現する
ことができるＤＮＡ構築物の開発が要望されている。本
発明は、これらの要望に応えるものである。

本明細書に開示し、特許請求する発明の目的に従い、下
記のとおり略語を定義する。

アミノ酸　　　　　三文字略語 アラニン　　　　　　Ａｌａ アルギニン　　　　　　Ａｒｇ アスパラギン　　　　　Ａｓｎ アスパラギン酸　　　　Ａｓｐ システィン　　　　　　Ｃｙｓ グルタミン酸　　　　　　Ｇｌｕ グルタミン グリノン アミノ酸 ヒスチジン イソロイシン ロイノン リンノ メチオニン フェニルアラニン プロリン セリン スレオニン トリブトファン チロシン バリン 核　　酸 デオキシアデニル デオキシグアニル デオ牛ノ／チジル ｌｎ ａｙ 三文字略語 ｉｓ ｒｅ ｅｕ ｙｓ ｅｔ ｈｅ Ｐｒ。

ｃｒ ｈｒ ｒｐ ｙｒ ａＪ チミジル　　　　　　　　Ｔ 本発明は、ヒト胎児性かん抗原（ＣＥＡ）に対する新規
なキメラモノクローナル抗体を提供するものである。本
発明に関しては「キメラ抗体」という語句は、第１の鼎
乳頒種から導かれた抗原特異的可変領域と、第２の他の
浦乳頌種から導かれた不変領域からなる抗体を指すもの
とする。したがって、本発明のキメラ抗体はＣＥ　Ａに
特異的な可変領域と、天然状態では該可変領域に伴って
いない予め定められた構造および生理特性を有する不変
領域とをコードしている融合遺伝子の所産物である。

本明細書中、「可変領域」という語句は、ＣＥＡに結合
することができる、軽鎖および重鎖抗体分子領域を指す
。可変領域のアミノ酸配列はそれが結合する抗原決定基
および抗原決定基の認識の仕方によって様々に変化する
。この多様性は可変領域をコードしている、遺伝子のエ
クソン配列に関係がある。

本明細書中、「不変領域」という語句は、構造安定性お
よびその他の生物学的機能を与えるが、ＣＥＡとの結合
には無関係な、軽鎖および重鎖抗体分子領域を指す。不
変領域のアミノ酸配列および対応する遺伝子中のエクソ
ン配列はそれが導かれた種に依存するが、アミノ酸配列
の変化は、１つの棟内での特定の不変領域に関しては比
較的限定されている。

また、本発明は、ＣＥＡに対するキメラ抗体の軽鎖およ
び重鎖を含有するキメラポリペプチドのための新規なり
　Ｎ　Ａ構築物を提供するものである。

し１こがって、本発明の［）　Ｎ　Ａ構築物は、それぞ
れ、キメラポリペプチドの可変領域をコードしている第
１ＤＮＡ配列を含有している。便宜上、本明細、寸には
、２本鎖ＤＮＡの暗号鎖のみを示した。本発明のＤＮＡ
構築物はキメラポリペプチドの不変領域をコードしてい
る第２ＤＮＡ配列をも念汀しているう 本発明においては、ＣＥＡに対するキメラ抗体の軽鎖領
域のためのＤＮＡ構築物は、実質上、式：％式％ で示される配列と同一の軽鎖可変領域をコードする第１
　ＤＮＡ配列を含有している。

また、本発明においては、ＣＥＡに対するキメラ抗体の
重鎖領域ためのＤＮＡ構築物は、実質上、式： ％式％ ＴＡＣ−ＴＡＣ−ＧＣＴ　−ＡＡＣ−ＡＡＣ−ＴＡＣ−
ＴＧＧ　−ＴＡＣ−ＴＴＣＧＡＴ　−ＧＴＣ−ＴＧＧ　
−ＧＧＣ−ＧＣＡ　−ＧＧＧ　−ＡＣＣ−ＡＣＧ　−Ｇ
ＴＣＡＣＣ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＣＡ　−ＧＣＣで示さ
れる配列と同一の重鎖可変領域をコードする第１　ＤＮ
Ａ配列を含有している。

軽鎖および重鎖可変領域をコードしている第１ＤＮＡ配
列は、これらのポリペプチドが真核性宿主則胞によって
発現されるために、リーダーペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列をも含有していることが好ましい。本明細書中に
は、便宜上、２本漬Ｄ　Ｎ　Ａの暗号績のみを示した。

可変軽鎖ポリペプチドのリーダーペプチドをコードする
ＤＮＡ配列は、実質上、式： ％式％ で示されるＤＮＡ配列と同一であることが好ましい。

可変重鎖ポリペプチドの発現のためには、リーダーペプ
チドのＤＮＡ配列は、実質上、式：％式％ で示されるＤＮＡ配列と同一であることが好ましい。

開示したリーダーペプチドのＤＮＡ配列は翻訳開始シグ
ナル、すなわち、機能的なポリペプチドの翻訳を開始す
るＤＮＡ配列をも含んでいる。当業者ならば、リーダー
ペプチドはＣＥＡとの結合に機能しないので、他の真核
性リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ配列も本発
明における使用に適していることを認めるであろう。し
たがって、本発明は特定の真核性リーダーペプチドの使
用に限定されない。

また、当業者ならば、本発明のＤ　Ｎ　Ａ　ｆＲ構築物
含まれる第１　ＤＮＡ暗号配列を、たとえば部位特異的
突然変異誘発により改変し、実質上、同等のＤＮＡ構築
物を得ることができることを認めるであろう。これらの
修飾されたＤＮＡ暗号配列は、本明細書に記載のものと
実質上、同一のキメラポリペプチドに翻訳されるならば
、本発明の範囲内に包含される。ある場合には、突然変
異誘発の使用によって得られたキメラポリペプチドは、
ＣＥＡに対する親和性に変化を来しているかもしれない
。

本発明のＤＮＡ構築物の第１　Ｄ　Ｎ　Ａ暗号配列は、
ＣＥＡに対するモノクローナル抗体を発現するネズミハ
イブリドーマに由来するゲノムＤＮＡから導かれること
か好ましい。ＣＥＡに対する所望の特異性および親和性
を有する抗体を発現する、ＯＥＭ２３ｉ、６．７と命名
されたネズミハイブリドーマを用いることがとくに好ま
しい。ネズミハイブリドーマＣＥＭ２３１．６．７は、
１９８８年１月、アメリカ／・タイプ・カルチャー・コ
レンヨン、ロックビレ、メリーランド（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、
受託番号ΔＴＣＣＨＢ９６２０の下、寄託された。しか
しながら、可変軽鎖および重鎖領域は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列
および翻訳後のアミノ酸配列が実質上、本発明で開示し
た配列と同等のものであれば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウ
シ、およびヒト以外の霊長類などの他の補乳類種から得
ることらでき本発明に用いるゲノムＤＮＡは、通常の方
法および様々な方法で得、クローニングすることができ
る。そのような方法は、デイビス（Ｌ、Ｇ、ＤａｖｉＳ
）、デイブナ−（Ｍ、　Ｄ　、　Ｄ　１ｂｎｅｒ）およ
びバッチイー編（Ｊ　、　Ｆ　、　Ｂ　ａｔｔｅｙｌベ
イシック・メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、エルスピア−（Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ）発行、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、（
１９８６）；フェダーら（Ｆ　ｅｄｅｒ、　Ｊ　、　）
、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジェ不
テイックス（Ａ　ｍ、　Ｊ　、　Ｈｕｍ、　Ｇ　ｅｒ＋
ｅｔ　１ｃｓ）、３７：６３５−６４９（１９８５）；
およびステ７ｙ　−（Ｓ　ｔｅｆＴｅｒ、　Ｄ、）、ウ
ィンバーブら（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、）、セル
（Ｃｅ１１）、１５：１Ｏ０３−１０１０（１９７８）
、に記載されている。たとえば、ハイブリドーマ細胞の
ＤＮＡは標準的な方法、すなわち、制限エンドヌクレア
ーゼによりゲノムＤＮＡを断片化して制限断片とし、得
られた断片を適当な組換え［）ＮＡクローニングベクタ
ーにクローニングし、放射性標識または酵素標識プロー
ブを用いて、本発明で開示したＤＮＡ配列の存在に関し
てスクリーニングすることにより、単離される。本明細
書中、１−制限断片」という語句は、１またはそれ以上
の制限工、ンドヌクレアーゼ酵素の作用によって生じＴ
こ線状Ｄ　Ｎ　Ａ配列を指す。不明１ｌｌＩ１１グ中、
「組換えＤＮＡクローニングベクター」という語句は、
ｌまたはそれ以−ＬのＤＮＡセグメントを付加すること
かできる、あるいは既に付加されている自律的に復製可
能な物質であって、プラスミドおよびフプージを倉むが
それらに限定されない。ゲノムＤ　Ｎ　Ａから得られた
ＤＮＡ配列はポリペプチドをコードしていない介在配列
または１′ントロンをも含んでいる。これらの配列は、
次いで、標準的な方法によるヌクレオチドの欠失または
置換により、改変することができる。例えば、クラマー
ら（Ｋ　ｒａｔａｅｒ。

Ｗ、）、ニュークレイツク・ア・ノシズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　ｒ〜ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、１２：９４
４１（１９８４）：およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ、　
Ｔ、　Ａ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・す１”エンス、８２：４８８（１
９８５）参照。

本発明のＤＮＡ購築物の内、キメラ抗体の可変軽鎖およ
び重鎖領域であるポリペプチドをコードしている第１Ｄ
ＮＡ配列はｃＤＮＡから得ることもできる。ｃＤＮＡを
得、クローニングする方法は周知であり、オカヤマ（Ｏ
ｋａｙａｍａ、　Ｈ、）およびバーブら（Ｂ　ｅｒｙ、
、　Ｐ　、　）、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオｏ　／−（Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ　Ｂ　ｉｏｌ、　）
、２１６１（ｉ　９８２）：キュブラー（Ｇ　ｕｂｌｅ
ｒ、　Ｈ、）およびホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｂ
、　Ｊ、）、ンエ−７（Ｇｅｎｅ）、２５：２６３（１
９８３）、によって記・威されている。したがって、１
２Ｗ的な方法てｃＤＮＡをクローニングし、得られたク
ロー／を不明ｆｌｉＪ書中に明示した可変領域をコート
シているｃＤＮｔ〜に関して適当なプローブでスクリー
ニングする。

所望のクローンを単離したのち、基本的にはゲ７ムＤＮ
Ａと同じ方法でｃＤＮＡを処理することができる。

別法として、ＣＥＡに特異的な可変軽鎖および重鎖領域
について必要な遺伝情報を含有し−でいる第１ＤＮＡ配
列は、常法により合成的に１２３ｆｉすることもてきる
。Ｄ　Ｎ　！’、　合成法は、シナら（Ｓｈｉｎａ。

Ｎ、Ｄ、）、二、、Ｌ−クレイツク・アノシズ・リサー
チ、１２：４３５９（１９８４）；およびボカージュ（
Ｂ　ｅａｕｃａｇｓ、　Ｓ　、　Ｌ　、　）、カルザー
ズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｍ、Ｈ，）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔ　ｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０：１８５９（１
９８１）、によって記載されている。したがって、軽鎖
および重鎖可変領域をコードしている第１ＤＮＡ配列は
、通常のＤ　Ｎ　Ａ合成法により、本明細書に記載のポ
リペプチドとＸＴ！Ｊ上同−のポリペプチドに翻訳され
得るＤ　Ｎ　Ａ暗号配列をヌクレオチドモノマーから合
成することによって合成することができる。この合成り
ＮＡ配列は、縮重コドンで元のコドンが置換されていて
も、翻訳された時に同じアミノ酸をコードしている限り
、クローニングした遺伝子と同一である必要はない。

本発明のＤ　Ｎ　Ａ構築物のキメラ抗体の不変軽鎖およ
び重鎖領域をコードしている第２　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、
ゲノムＤ　Ｎ　Ａおよびｃ　Ｄ　Ｎ　Ａからクローニン
グすることができ、あるいは合成することかできる。不
変領域ポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列ｉｔ、
ヒトリンパ細胞、たとえば末梢血リンパ細胞から導かれ
ることが好ましい。ヒト不変領域をコードしているＤＮ
／〜配列を使用することにより、免疫原性を最小にする
キメラ軽鎖および重鎖ポリペプチドが得られると予測さ
れる。とくに好ましいのは、ヒト軽鎖（カッパ）遺伝子
およびヒト重鎖（ガンマ、または池のクラス、およびそ
の様々なアイソタイプまたはアロタイプ）遺伝子から導
かれたＤＮＪＡ記列、とりわけガンマ−１遺伝子から導
かれたＤ　Ｎ　Ａ配列の使用である［）＼イターら（）
（ｅｉｔｅｒ、　Ｐ　、　Ａ　、　）、セル、２２：１
９７−２０７（１９８０）およびタカ／％シら（Ｔ　ａ
ｋａｈａｓｈ　ｉＮ、）、　セ　Ｉし、　　２９：６７
　１−６７９（＋　　９８２）ｉ　　。

しかしながら、本発明は、軽鎖および重鎖キメラポリペ
プチドのためのヒト不変領域をコードしている特定の第
２０　Ｎ　７”ｌ配列によって制限されるものではない
。また、当業音ならば、選択した種か可変領域を１４だ
種と異なるならば、不変領域遺伝子は池の補乳類種から
導かれたものであってよいということを理解し得るであ
ろう。たとえば、不変領域は、抗体がインビトロまたは
インビボ適用のいずれであるかにより、ウサギ、ヤギ、
ウシ。

ウマ、ブタおよび非ヒト霊長類から導かれ得る。

本発明のキメラＤ　Ｎ　Ａ構築物を調製し、適当な組換
えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現
ベクターに導入するのに必要な組換えＤＮＡ技術は、今
日では当業者周知であり、数多くの文献に記載されてい
る。グラズマン編（亡Ｇ　１ｕｚＩｌｌａｎ）、ユーカ
リティック・バイラル・ベクター（Ｅｕｋａｒｙｔｉｃ
　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリーズ（ＣａｒｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）発行、ニ
ューヨーク（１９８２）：グラズマン編、ユーカリティ
ック・トランスクリプション（Ｅ　ｕｋａｒｙｏｔ　ｉ
ｃ　Ｔ　ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）発行、ニューヨーク（１９８５）；カレンダ
ー　（Ｒ，Ｃａｌｅｎｄａｒ）およびゴールドｍ（Ｌ、
Ｇｏｌｄ）、セキュエンス・スペシフィンティー・イン
・トランスクリブション・アンド・トランスレーション
（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　＆Ｔ　ｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ）、アラン・アール・リス、インフーポレーテッド
（Ａ　ｌ１ａｎ　Ｒ，Ｌ　ｉｓｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）発
行、ニューヨーク（１９８５）；レズニコフ（Ｗ、　Ｒ
ｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールドｍ（Ｌ、Ｇｏｌｄ）
、マキシマイジング・ジェーン・エクスプレッション（
Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）、バターワーシイーズ（Ｂ　ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ）発行、ニューヨーク（１９８６）；およびシリー編
（Ｗ、　Ｇ、　Ｔｈ１ｌｌｙ）、バターワーシイーズ発
行、二ニーヨーク（１９８６）参照。本明細書中、「＃
１換えＤＮＡ発現ベクターＪという語句は、ＤＮＡのＲ
ＮＡへの転写を指令するプロモーター配列、並びにＲＮ
Ａからポリペプチドへの翻訳の開始および終止のための
適当な調節配列を含有しているクローニングベクターを
指す。本発明においては、軽鎖および重鎖ポリペプチド
をコードしているＤＮＡ構築物を発現ベクターの一部と
して適当な真核性宿主細胞に導入する。これらの構築物
は単一の真核性発現ベクターとして含有させることがで
きるが、−個のキメラ遺伝子構築物を含有する別々の発
現ベクターとして分けて維持してもよい。しかしながら
、キメラポリペプチドの発現のためには、選択した真核
性宿主細胞内で機能的な転写および翻訳調節配列を含有
していることが必要である。したがって、キメラ遺伝子
は、５′および３°非翻訳領域並びにイントロン（介在
）配列を含有し、すべて真核性宿主細胞内で機能する、
プロモーター、、エンハンサー１およＣｆ　ｌｉ写ター
ミネータ−並びにポリアデニル化部位（ｐｏｔＹＡ部位
）等のホモローガスな調節配列を包含する大きいＤＮＡ
断片から単離することができる。

本明細書中、「プロモーターＪおよび「、エンハンサー
Δという語句は、それぞれ、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を
指令するＤＮＡ配列、およびＤＮＡからＲＮＡへの転写
を促進するＤＮＡ配列を指す。「転写ターミネータ−」
という語句は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を終了させるＤ
ＮＡ配列を指す。ｒｐｏｌｙ八部位」へいう語句は、ｐ
ｏｌｙ−Ａテール配列の付加位置を指示するＤＮＡ配列
を指す。あるいは、ウィルス性プロモーター、、エンハ
ンサー１転写ターミネータ−およびｐｏｌｙＡ部位を含
有する周知のＳＶ４０およびＨｅｒｐｅｓ　Ｔ　Ｋ　（
ヘルペスＴＫ）ウィルス配列などの様々なヘテロローガ
ス（異種の）調節領域とキメラ遺伝子とを組換えて結合
させてもよい。キメラ遺伝子構築物はまた、それらの要
素が真核性宿主細胞内で機能的であり、該キメラ遺伝子
と適切に融合するかぎり、合成調節要素と結合させるこ
とができる。ｃＤＮＡクローンまたは合成遺伝子も、ポ
リペプチドとして発現されるために、ホモローガスまた
はへテロローガス、いずれかの調節配列と結合させるこ
とができる。ゆえに、当業者ならば、本発明のキメラ遺
伝子の発現のためには、ホモローガス、ヘテロローガス
または合成調節配列を相互変換可能に用い得ることを理
解するであろう。

広範囲におよぶ組換え発現ベクターが周知であり、それ
らを本発明に用いることができる。ｐＳ■２型ベクター
の使用が好ましい。ｐｓｖｚ型べフターは、ＳＶ４Ｑゲ
ノムの、明確にされている真核性転写単位を構成するセ
グメントを含有しており、哺乳類および他の真核性宿主
細胞の宿主細胞染色体ＤＮＡに組み込むことにより、こ
れらの細胞を形質転換する。ＳＶ４０プロモーターによ
って挿入遺伝子の転写か指令される様々なプラスミドｐ
ｓｖ２型ベクター、たとえばプラスミドｐＳＶ２−ｇｐ
ｔ、　ｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏ、　ｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆ
ｒ、　ｐｓ　Ｖ　２β−グロビンが構築されている［グ
ラズマン編、ユーカリティック・バイラル・ベクター、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ発行
、コールド・スプリング・ハーバ−ニューコーク（＋９
８２）参照コ。これらのベクターは、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクンヨン（ＡＴＣＣ）、ロックビ
レ、メリーランドおよびノーイン・リージョナル・ラボ
ラトリ−ペオリア、イリノイス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、
　　Ｐｅｏｒｉａ、　　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）から入手す
ることができる。あるいは、ウシ乳頭腫ウィルスに基（
発現ベクターおよびエプスタイン−バールウィルス発現
ベクターのごとくエビソーム的にｉ［ｌ持される、すな
わち染色体外で維持され得る発現ベクターを選択するこ
ともできる。グラズマン編、ユーカリティック・バイラ
ル・ベクター、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリーズ発行、コールド・スプリング・ハーバ−ニュ
ーヨーク（１９８２）；ハウリー（Ｐ、Ｍ、　Ｈｏｔｖ
ｌｅｙ）およびブローカーｌ（Ｔ　、　Ｒ、Ｂ　ｒｏｋ
ｅｒ）、バピロマビラシイズ（Ｐａｐｉ　Ｉｌｏｍａｖ
ｉｒｕｓｅｓ）、アラン・アール・リス、インコーボレ
ーテンド発行、ニューヨーク（］　９８５）サノデンら
（Ｓ　ｕｇｄｅｎ、　Ｂ、　）、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、５：４１０−４１３　（１
９８５）：および牛オーシスら（Ｋｉｏｏｓｉｓ。

Ｄ、）、エンボ（ＥＭＢＯ）、６：３５５−３６１（１
９８７）参照。

ｐＳ　ｖ　ｚクラスのベクターから構築された発現ベク
ターからＳＶ４０エンハンサーを除去することにより、
より高レベルの発現を達成することができる。殆どすべ
てのゲノム性免疫グロブリン遺伝子が、エンハンサー配
列を含有している。ネズミのカッパ可変領域遺伝子はほ
ぼ３００塩基対のヒト力、パエンハンサー配列と結合し
てプラスミドｐＧＣＥＭＫ上に見いだされ、ネズミのガ
ンマ可変領域は、はぼ１８０塩基対の不ズミエンノ＼ン
サー配列と結合してプラスミドｐＮＣＥＭＧｌ上に見い
だされる。当業者ならば、免疫グロブリン鎖を産生ずべ
くトランスフェクトされた細胞の能力を変化させること
な（、これらの、エンハンサー配列を発現ベクター上、
種々の部位に移動させ得ることを理解し得るであろう。

しかしながら、発現ベクターｐＧＣＥＭＫまたはｐＮＣ
ＥＭＫからＳＶ・１０、エンハンサーを除去すると、Ｓ
　Ｐ　２１０細胞からのキメラＣＥＭ抗体の発現レベル
が顕著に増大する。

プラスミドｐＧＣＥＭＫ上に見いだされるＣＥＮｊカッ
パプロモーターもまた、ヘテロローガス免疫グロブリン
鎖の発現レベルを増大するのに有用である。たとえば、
ＣＨＡ２５５はインジウムのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａキレートを
持巽的に認識するモアクローナル抗体である。ネズミハ
イブリドーマＣＨＡ　２５５由来のラムダおよびガンマ
可変領域をコードしている遺伝子がクローニングされて
いる［たとえば、ジョンソン（Ｍ、　Ｊ　、　Ｊ　ｏｈ
ｎｓｏｎ）、キメリックアンチボディーズ・ブイレフテ
ッド・アゲインスト・メタル・キレート（Ｃｈｉｌｌｅ
ｒｉｃ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＤｉｒｅｃｔｅｄ　Ａｇ
ａｉｎｓｔ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌａｔｅｓ）、同日出
願の米国特許出願筒２７４，１０６号（１９８８年１１
月１７日）参照］。ＳＶ４０、エンハンサー含有ベクタ
ー上のＣＥＭカッパプロモーターによって作動（ドライ
ブ）されるネズミラムダＣＨＡ可変領域とヒト不変領域
とを含有するプラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　−２は実施
例７記載の方法に従って構築すした。ＳＶ４０エンハン
サーを欠如するベクター内のＣＥＭプａモーターによっ
て作動される不ズミラムタＣＨＡ可変領域とヒト不変領
域とを含有するプラスミドｐＧＣＨＡＫ−３も、実施例
７記載の方法に従って構築された。これらのプラスミド
のいずれか一方でトランスフェクトしたのち、ヒトガン
マ不変領域と結合したネズミＣＨＡガンマ可変領域をコ
ードしているベクターでトランスフエクトした５Ｐ２１
０細胞は、ＣＨＡラムダプロモーターを含有するベクタ
ーでトランスフェクトされた細胞より、はるかに高い発
現レベルを示した。事実、これらの、ＣＨＡキメラ遺伝
子を発現させるＯＥＭカッパプロモーターを含有スるＳ
Ｖ４０エンハンサー欠如ベクターでトランスフェクトさ
れた細胞は、カッパ発現レベルにおいて、ＣＨＡラムダ
プロモーターによって発現されるＣ１−ＩＡ牛メラ遺伝
子を含有するＳＶ４０、エンハンサー（プラス、含有）
ベクターでトランスフェクトされた細胞の１０倍増を示
した。次いで、これらのカッパ高産生細胞をキメラ重鎖
遺伝子を含有するベクターでトランスフェクトすると、
それに対応して全抗体生産は、カッパ鎖ベクター内でＣ
ＨＡプロモーターを用いる細胞よりも増加した。最も発
現率の高い細胞をサブクローニングし、次いでこれらの
高発現サブクローンを明確に定義された血清不含培地で
培養することにより、より高い発現レベルが達成され得
る。高発現クローンの培養にはＨＨ２ハイブリテ１り・
インフーポレイテソド、サンジエゴ、カリフォルニア（
Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、　　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇ
ｏ、　ＣＡ）あるいは広範囲におよぶ市販品（Ｖｅｎｔ
ｒｅｘ　Ｉ　ｎｃ、またはＧｉｂｃｏ　ｒ　ｎｃ、）か
ら人手可能な培地すべてを用いることができる。

このことから、ＣＥＭカッパプロモーターはホモローガ
ス（ＯＥＭ）配列およびヘテロローガス（ＣＨＡその他
）配列の両者を高レベルに発現させる特異的機能を有す
ることが明らかである。実施例７の方法では約２．２ｋ
ｂ　Ｃ１ａＩ／５ｓｐｌ制限断片上にＣＥＭカッパプロ
モーターが存在しているが、当業者にとって、カッパプ
ロモーター配列の誘導は容易なことである。

本発明に用いられる真核性宿主細胞としては、ハイブリ
ドーマ、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好まし
い。しかしながら、哺乳類宿主細胞がキメラ遺伝子の発
現のための転写および翻訳ＤＮＡ配列を認識し、リーダ
ーペプチドをプロセッシングしてリーダー配列を切断し
、キメラタンパク質を分泌させ、キメラタンパク質の翻
訳後修飾（例、グリコジル化）を行うことができるるな
らば、他の真核性宿主細胞も使用に適する。

したがって、本発明は、本明細書に開示したキメラ遺伝
子構築物を含有する組換え発現ベクターで形質転換され
た真核性宿主細胞であって、本発明のキメラタンパク質
を発現することができる宿主細胞を提供するものである
。本明細書中、「形質転換」という語句は、ＤＮＡを受
容細胞に導入することにより宿主細胞のゲノムに変化を
もたらすことをいう。したがって、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞は、本明細書に記載のキメラ軽鎖および重
鎖遺伝子、および軽鎖および重鎖をコードするＤ　Ｎ　
Ａ配列に関し、これらのキメラタンパク質を発現させる
ような位置にある転写および翻訳配列とを含有する少な
くとも１個のＤＮＡ構築物を含有している。

本発明の宿主細胞は、当業者周知の標準的なトランスフ
ェクション法を用い、様々な方法で形質転換することが
できる。標準的なトランスフェクション法の内、電気穿
孔法、プロトプラスト融合法、およびりん酸力ルソウム
沈澱法を用いることができる。そのような方法は、以下
の文献に記載されている。ト不グッゾーら（Ｔ　ｏｎｅ
ｇｕｚｚｏ、　Ｆ　、　）、モレキュラー・アンド・セ
ルラーΦバイオロジー６：７０３−７０６（１９８６）
；チョーら（Ｃｈｕ。

Ｇ、）、二ニークレイツク・アッシズ・リサーチ、１５
：１３１１−１３２５（１９８７）；ライスら（Ｒｉｃ
ｅ、Ｄ、）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、７９ニア８６２−
７８６５（１９７９）；およびオイら（Ｏｉ、　ｖ、）
、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシイズ、８０：８２５−８２９（１９
８３）。

本発明のキメラ構築物を含有する組換え発現ベクターで
、宿主細胞を連続的にトランスフェクトすることが好ま
しい。たとえば、宿主細胞をまず、キメラ軽鎖Ｄ　Ｎ　
Ａ構築物でトランスフェクトし、キメラ軽鎖ポリペプチ
ドを発現する形質転換宿主細胞を当業者周知の方法で選
択する［エングボール（Ｅ　ｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、）お
よびパールマンら（Ｐ　ｅｒｌｍａｎｐ、）、イムノケ
ミストリー（ｒ　ｍｍｕｎｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ）
、８°８７１−８７４（１９７１）コ。その後、選択し
た宿主細胞を、キメラ軽鎖Ｄ　ＮＡ構築物を金白゛する
発現ベクターでトランスフェクトする。しかしなから、
キメラ軽鎖および重鎖発現ベクターを同時に宿主細胞に
導入してもよいことは、認められるであろう。別法とし
て、両キメラ遺伝子構築物を宿主細胞のトランスフェク
ションに用いる単一の発現ベクター上に結合することも
できる。トランスフェクションおよび選択の後、標準的
な分析を行い、ＣＥＡに対する抗体を検出し、本発明に
より明確にされたキメラ軽鎖および重鎖遺伝子の両方を
発現する宿主細胞を同定する。

本発明の新規なキメラ抗体を含有する牛メラボＪペプチ
ドのアミノ酸配列は、本明細書で開示したＤ　Ｎ　、Ａ
、配列から推定される。したがって、ＣＥＡに対する新
規なキメラ抗体は、下記の式で示されるアミノ酸配列と
実質上同一のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域を含有
するものである。

Ａｓｐ　−１１ｅ　−Ｖａｌ　−Ｍｅｃ−Ｔｈｒ　−Ｇ
ｉｎ　−Ｓｅｔ　−ＧｌｎＰｈｅ　　−Ｍｅｃ　−Ｓｅ
ｒ　　−Ｔｈｒ　　−Ｓｅｒ　　−Ｖａｌ　　−ＧＬｙ
　　−ＡｓｐＶａｌ　−Ｓｅｒ　−１１ｅ　−Ｔｈｒ　
−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ａｌａ　−５ｅｒＡｓｎ　−Ｖ
ａＬ　−Ａｒｇ　−Ｔｈｒ　−ＡＬａ　−Ｖａｌ　−Ａ
ｌａ　−ＴｒｐＧｉｎ　−Ｇｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ
　−Ｇｌｙ　−Ｇｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｐｒ。

Ａｌａ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−
Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−ＡｓｎＴｙｒ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌ
ｙ　−Ｖａｌ　−Ｐ’ｒｏ　−Ａｓｐ　−Ａｒｇ　−Ｐ
ｈｅＧｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ
　−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−ＰｈｅＬｅｕ　−Ｔｈｒ　−
１１ｅ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ｇｉｎ　−
５ｅｒＡｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ａｓｐ　−Ｔｙ
ｒ　−Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−ＬｅｕＨｉｓ　−Ｔｒｐ　
−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　
−１’ｈｅＡｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−
Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−［、ｙｓさらに、ＣＥ
　Ａに特異的な新規なキメラ抗体は下３己の式で示され
る７−／酸配列と実質上、同一のアミノ酸配列を汀する
可変重鎖領域を含ａする。

Ａｓｐ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−
Ｇｌｕ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−ＧｌｙＧｌｙ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｖａｌ　−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌ
ｙ　−Ｓｅｒ　−Ａｒｇｆ、ｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｓｅｒ
　−Ｃｙｓ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ
　−ＰｈｅＴｈｒ　−Ｐｈｅ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｏ　−
Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ　−Ｍｅｔ、　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐｌ
ｌｅ　−Ａｒｇ　−Ｇ１ｒ＋　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−
Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ　−ＬｅｕＧｌｕ　−Ｔｒ
ｐ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｇｌｙ　−ＧｌｙＳｅｒ　　−Ｓｅｒ　　−丁ｈ
ｒ　　−１１ｅ　　−Ｔｙｒ　　−Ｔｙｒ　　−Ａｌａ
　　−Ａｓｐ　　−ＴｂｒＶａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ
　−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ　−Ｔｈｒ　−１１ｅ　−Ｓｅｒ
　−ＡｒｇＡｓｐ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−
Ａｓｎ　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−ＬｅｕＧｉ
ｎ　−Ｍｅｔ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ、−Ａｒ
ｇ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ　−ＡｓｐＴｈｒ　−Ａｌａ　
−Ｍｅｔ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ａｌａ　
−Ａｒｇ　−ＡｓｐＴｙｒ　−Ｔｙｒ　−Ａｌａ　−Ａ
ｓｎ　−Ａｓｎ＋τｙｒ　−Ｔｒｐ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈ
ｅＡｓｐ　　−Ｖａｌ　　−Ｔｒｐ　　−Ｇｌｙ　　−
Ａｌａ　　−Ｇｌｙ　　−Ｔｈｒ　　−丁ｈｒ　　−Ｖ
ａｌＴｈｔ　−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ａｌａ
上記のごとく、可変軽鎖および重鎖領域は、真核性リー
ダー配列を含有していることもある。可変ＩＩ重鎖領域
ためのリーダー配列のアミノ酸配列は、下記の式で示さ
れるアミノ酸配列と実藺上同−であることが好ましい。

Ｍｅｃ　−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ｇｉｎ　−Ｔｈｒ　−
Ｇｉｎ　−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−ＶａｌＰｈｅ　−Ｖａ
ｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｇｌｙ　−ＶａｌＡｓｐ　−Ｇｌｙ 可変重鎖領域のだめのリーダーペプチドのアミノ酸配列
は、実質上、式 ％式％ で示される配列と同一であることが好ましい。

しかしながら、当業者ならば、池の分泌性タンパ７質か
ら導かれるペプチドなど、本発明で明らかにした可生軽
消および重鎖領域のためのリーダー配列として機能する
別のアミノ酸配列も本発明に用いるのに適することを理
解するであろう。

さらに、本発明で開示したキメラボ゛５１ペプチドのア
ミノ酸配列を僅かに修飾し、ＣＥＩ〜との結合において
実質上、同等の可変領域を得ることかできることが分か
るであろう。これらの修飾は、必要なＣＥＡに対する特
異性が保持されるかぎり、本発明の範囲内に包含される
。

本発明によって提供される新規なキメラ抗体は、インビ
ボおよび１′ンビトロの両方に適用可能である。たとえ
ば、本発明のキメラ抗体をＣＥ　Ａの検出お上びｌ！Ｉ
Ｉｉ瘍関連抗原の監視（例、治療中）のためのインビト
ロイム、／アッセイに用いることかできる１、また、実
質的な免疫原性の低下が子側さ１１るので、本Ｒ１ｉＥ
Ｉのキメラモノクローナル抗体は、診断および治療への
インビボ適用に極めて好ましい９したかイＬ　ｓ　”’
Ｆ　発明によって提供されるキメラモノクローナル抗体
は、胃腸管、肺、卵巣、およびすい臓などの呻瘍と同様
、結腸直腸かんや乳がんに関連した腫瘍のイメーノ形成
お、よひ治療に実質」二、インビボで用いることかでき
る。本発明のキメラ抗体は、：１子飾されていない抗体
として、東たはインビボのイメーン形ｌ戊または１台療
のために２凶当な放射性核種、薬物または毒素と結合（
コンジュゲート）させて用い得る。さらに、本発明の＋
メラ抗体の基本的な発見機能を保持している抗体断片、
または抗体含有混合物を、本発明の特定の臨床適用にし
たがって利用することができる。

以下に実施例および図面にしたがって本発明の詳細な説
明する。これら実施例および図面は本発明を例示するこ
とを目的とするものであり、いかなる意味においても発
明の範囲を限定するものではない。

第１図ニブラスミドルＭＬＣＥ−１０およびプラスミド
ｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図。

本発明の目的から、図面は等尺で描かれていない。

第２図ニブラスミドｐＨＫＣＥ−１０およびプラスミド
ｐＧＣＥＭＫの制限部位および機能地図。

第３図ニブラスミドルＭＩＣＥ−３０およびプラスミド
ｐＨＧＩＺの制限部位および機能地図。

第４図ニブラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０およびプラスミ
ドｐＮＣＥＭＧｌの制限部位および機能地図。

第５図ニブラスミドルｉ　９ＨＡＮＣＨの構築模式図。

第６図ニブラスミドルｃ　ＣＨＡ　Ｋ　−３の制限部位
および機能地図。

第７図ニブラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ　−ＩＡ、　ｐＨ
Ｇｌ−ＣＨＡおよびｐＮｃＨＡＧｌの制限部位および機
能地図。

第８図；プラスミドｐＭＬＣＨ−Ｌ　ｐＭＬＣＨｌｄＢ
およびｐＧＣＨＡＫの制限部位および機能地図。

実施例 下記実施例では、可変軽鎖および重鎖可変領域を得るた
めにゲノムＤＮＡを誘導し、クローニングするのにＯＥ
Ｍ２３１．６．７と命名されたネズミハイブリドーマ細
胞を用いた。ネズミハイブリドーマＣＥＭ２３１．６．
７は、１９８８年１月７日にアメリカン・タイプ・カル
チャー・フレクシジン、ロックビレ、メリーランドに寄
託１号Ａ　Ｔ　ＣＣＨＢ　９６２０の下に寄託されてい
る。ネズミハイブリドーマＯＥＭ２３１．６．７からク
ローニングしたゲノムＤＮＡおよびヒト抹消血リンパ細
胞をキメラ遺伝子の構築に用いた。

キメラ遺伝子のトランスフェクションは実質上、トネグ
ノゾーら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー、６：７０３−７０６（１９８６）；およびチコー
ら、二ニークレイツク・アッシズ・リサーチ、１５．：
１３１１−１３２５（１９８７）に記載の方法に従い、
電気穿孔法で行った。宿主細胞Ｓ　Ｐ　２１０−Ａｇｌ
　４ハイブリドーマ細胞をキメラ遺伝子の受容細胞とし
た。用いたＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロ
ックビレ、メリーランドに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　　
１５８１から入手可能である。

（以下余白） 実施例Ｉ Ａ、ＯＥＭ２３１．６．７、ネズミハイブリドーマから
のＤＮＡの単離 実質上、ペルサーら（Ｐ　ｅｌｌｅｃｅｒ）、セル、４
１二１３３（１９７８）の記載に従いＯＥＭ２３１．６
゜７からゲノムＤＮＡを単離した。遠心（１０分間、８
００ｒｐｉ［ＥＣクリニカル遠心機）して約１×１０’
ＩＩＥｌ胞を収穫した。次いで、細胞をりん酸緩衝化食
塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、細胞を、１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ８，０）、２ｍＭＥＤ
ＴＡ、４０ｍＭ　ＮａＣ１２（Ｔ　Ｅ　Ｎ）４２＆に再
懸濁し、１ｏ％ＳＤＳ　　２００μＱおよびプロテアー
ゼＫ（シグマケミカルス、Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ
ｉｓｓｏｕｒｉ）４２μＱを加えて２０Ｒ９／ｘＱとし
た。試料を３７℃で一夜インキユベートした。等容量の
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールｉｉ
＆（２５：２４：１）で２回抽出し、ｉｏ＋ｌ１ｌＶＩ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）、１＋ｎＭ　　ＥＤ
ＴＡ（ＴＥバッファー）に対して一夜透析した。次いで
、ＤＮＡをＲＮＡ５ｅＡ（シグマケミカルス、Ｓ　ｔ、
　ＬｏｕｉｓＳＭｉｓｓｏｕｒｉ）により５０μｇ／＝
Ｑで２時間処理した後、２００μｑ、ｌ’、＝ｕ）プＯ
ｆ７−ゼＫにより、３７°Ｃで１時間処理した。Ｌで詳
述した如くにしてＤＮＡを抽出し、−夜透析した。透析
の後、１／１０、容量の２Ｍ酢酸ナトリウムと２容量の
９５％エタノールとを加えてＤ　Ｎ　Ａを沈、殿させた
。−２０℃で３０分間放置した後、８０００　ｒｐｍで
３０分間遠心した。

ペレットをＴＥバッファーに、ｎｔ４ｆＸ　９５５μ９
７／１Ｑで再懸濁した。

Ｂ、ＣＥＭ２３１．６．７のためのゲノムライブラリー
の構築 ＣＥＭ２３１ゲ／ムＤＮＡ　　１０μ７をＴＥバッフｙ
−１１μＱ５水２０μρ、１０、Ｘコア（Ｃｏｒｅ）制
限消化バッファー（５００！ｔＭ　ｐＨ８，０，１００
ｌｌ１Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　！、５００ｍＭ　ＮａＣ４り
　ｌ　５　Ｉｌｌにとり、試験管に分注することにより
、ＤＮＡの部分消化を行った。容管に制限酵素ＭｂｏＩ
をＯ０Ｏ３８単位から０．５単位／′μａに増加させな
がら加え、３７°Ｃで１時間、放置した。次いで、試料
の一部をとり、０７％Ｔ　Ｂ　Ｅ　Ｃ８９ｒｎＭ　Ｔｒ
ｉｓ、　３９ｍＭホウ酸塩、２ｍＭＥＤＴＡ）アガロー
スケルにより、４０ポルトで一夜電気泳動させた。

このゲルの写真から、正しい分子量域（１２−２４ｋｂ
）のＤＮＡを倉をする消化断片を決定した。次いで、上
記の実験で定義したＭｂｏｌ　　ｌ単位（２０倍にスケ
ールアップ）を用い、３７°Ｃで一夜インキユベートす
ることによりゲノムＤ　Ｎ　Ａ　２００μ９を消化した
。このＤＮＡを用い、ストラノタ／−ン・インコーボレ
ーテ、ド（Ｓ　ｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉ　ｎｃ、　）（
Ｌ　ａＪｏｌｌａ、　　Ｃａ）から購入可能なＥＭＢＬ
−３フアージＤ　Ｎ　Ａをストラノタシーン（Ｓ　ｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）教示のプロトコールに従って使用して
ＥＭＢ！、−３フアージライブラリーを構築した。この
ストラ、タジーンのプロトコールは、幾つかの実Ｍ手引
［例、分子生物学の基本的操作（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、デイビス（Ｌ、Ｃ，Ｄａｖｉｓ）、デイブナ−（Ｍ、
　Ｄ　、　Ｄ　１ｂｎｅｒ）およびパティ−（Ｊ。

Ｆ　、　Ｂ　ａｔｔｅｙ）、Ｅｌｓｖｉｅｒ、　Ｎｅｖ
Ｙｏｒｋ（１９８６）］記載の方法に従っている。ショ
糖勾配により単離した後、大きい分子量のＣＥＭ２３１
．６．７ＤＮＡ　（１２−２４ｋｂ）を、ＤＮＡ１００
ｎ９、予め単離しておいたＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　−３フアー
ジアーム１００ｒ＋９．１０Ｘリガーゼバッフｙ−（５
００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣジ（ｐＨ８，０）、７　ｔ）
＋ａＭ　ＭｇＣｆ１！ｔ、ｌ０ｍＭ　　ジチすスレイト
ール（ｄｔｔ））およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（２単
位）を用い、４℃で一夜、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　−３フアー
／アームとライゲート（結合）させた。パッケージング
はストラノタジーンから購入可能なギガバック−ゴール
ド（Ｇ　ｉｇａｐａｃｋ　−Ｇ　ｏｌｄ）インビトロバ
ノケージングンステムを製品プロトコールに従って使用
し、ストラ１、クジーン供給の宿主細胞大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）株Ｐ２．３９２、Ｇ　ｉｇａｐａｃｋ　−Ｇｏ
ｌｄバノケージングミノクスおよびライゲートしたファ
ージ５μジを２２°Ｃで２時間インキコベートすること
により、行った。ファージ希釈バッファー（ＩＲ中にＮ
ａＣ！！　５．８９．　ＭｇＳＯ４６Ｈ２０２９、ＩＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！、ｐＨ７，５（５０ｚ（）、２
％ゼラチン５虞の０．５ｙ（！を加えた。次いで、標準
的な手法「分子クローニング（八１ｏｌｅｃｕｌａｒ　
ＣＩｏｎｉｎｇ）、マニアティス＜Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ’）、フリ、チ、（Ｅ、ＦＦ　ｒｉｔｓｃｈ）およ
、びサンブロック（Ｊ　、　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ）ら、
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔＯｒｉｅｓ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　ＮｅｖＹｏｒｋ（１９８２）コでファージの力価
を検定した。検定の後、ファージライブラリーをＰ２．
３９２細胞を用い、密度２０．０００プラ一ク／ｌｏｏ
ｍＭプレートで３７℃にて一夜平板培養した。

Ｃ，ネズミＣＥＭ２３１．６．７Ｖカッパ遺伝子を含有
している組換えファージφＭＬＣＥ−１０の同定および
単離 ＣＥ〜１２３１　６　７軽鎖（カッパ）を得るために、
ストラノタジーン　Ｉｎｃ、（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ
Ａ）から購入可能な大腸菌Ｐ２．３９２中の４．８Ｘ１
０５の組換えファージを分子クローニング（前掲）の記
載に従ってスクリーニングした。この操作は、マーク・
７ユルマ／博±［（Ｄｒ、Ｍａｒｃ　Ｓｈｕｌｍａｎ）
、トロント大学、トロント、カナタ］から人手したネス
゛ミカノパブローフ゛およびネズミＪＬブローフあるい
はジェネラルパンクチ゛−タベース（Ｇ　ｃｎｅｒａ！
　Ｂａｎｋ　ＤａｔａＢａｓｅ、　　Ｎ　Ｉ　ＨＡｃｃ
ｅｓｓｉｏｎ　＃　Ｊ００５４５）から得た配列を有す
る合成プローブを用いて行われた。用いたカッパオリゴ
ヌクレオチドプローブは、式： ％式％ で示され、モレキュラー・パイオンステムズ、インコー
ポレーテノド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ。

Ｉｎｃ、）、サン・ディエゴ、カリフォルニア（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、　　ＣＡ）によって合成されたものである
。

重複フィルターリフトを作り、モレキュラークローニン
グ（前掲）記載の方法に従い、３２Ｐ放射性標識したネ
ズミカッパおよびＪＬプローブによるブロービングによ
って、両プローブとハイブリライズ（雑種形勢）するフ
ァージを分析した。ノ＼イブリザイゼーシコンは、分子
クローニング（前掲）記載の方法で行った。軽鎖可変領
域遺伝子がＣカッパ遺伝子領域と直接、隣接した位置に
再配列されたことを示す、両プローブとのハイブリライ
ズに基いて単一のＯＥＭ２３１．６．７フアージクロー
ンを選択した。この組換えファージをφＭ　Ｌ　ＣＥ１
０、と命名した。

Ｄ、ＣＥＭ２３１．６．７不ズミＶカツパ遺伝子を含有
している組換えプラスミドｐＭＬＣＥ　　ＩＱの構築 φＭＬＣＥ−１０ＤＮＡを単離し、その２０μ２をギブ
コ（Ｇ　１ｂｃｏ　−Ｂ　ＲＬ、　　Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｅｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）供給の反応バッフｙ−
（Ｒｅａｃｔ　ＢｕｆＴｅｒ）＃３を用い、全ｆｆ１２
２０　ｔｔ（ｌとしてＢａｍＨＩ（Ｉ単位／μｇ）で消
化した。ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを、臭化エチジウム０．
５μＬｉ／ｘ（ｌを含んだ０．７５％ＴＢＥアガロース
ゲルにより、４０Ｖで一夜電気泳動することによってｌ
　Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を単離した。ＵＶ透過光ボッ
クス上で観察し、１ｏｋｂ断片をＤＥＡＥ８１ろ紙上に
電気泳動し［シライヒャ−（Ｓ　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）
およびシニエル（Ｓ　ｃｈｕｅｌ　ｌ）、牛−ン（Ｋ　
ｅｅｎｅ）、二ニー牽ハンプシャー（Ｎｅｗ　Ｈａｍｐ
ｓｈｉｒ６）］、次いで、１ＭＮａＣ４で溶離し、エタ
ノール沈殿に付した。次いで、溶出断片をＴＥバッファ
ー６μａに再懸濁した。断片を、実施例ＩＢ記載のごと
（、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　　１．ｃｌ（５０ｒ＋９）、
ＢａｍＨＩ　　１０ｋｂフアージＤＮＡリガーゼ６μ１
２（３００ｎ９）を用い、ＢａｍＨＩ消化ｐＢ　Ｒ３２
２ＤＮΔ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレツ／
ａ　７（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ。

ｎ）からＡＴＣＣ受託番号３１３４４の下で入手可能）
５０ｎｇとライゲートした。ギブコーＢＲＬ（Ｇ　ａｉ
ｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可
能な、大ｉｍＨＢｔｏ＋コンピテント細胞を標準的な手
法で形質転換した。まず、ＨＢＩＯＩ細胞を水の上で解
凍し、ライゲーション反応物１０μｅを細胞２００μＱ
と混合し、水上で３０分間インキュベートした。次いで
、細胞を、４２°Ｃで４５秒間熱／ヨ、りに付し、２分
間、水上に戻した。ＬＢグロス（１（中、ＮａＣＱＩ０
９、酵母工牛ス　５２、トリプトン　ｌｏ９）１ｍ（を
加え、Ｎ　ｅｖ　Ｂ　ｒｕｎｓｗｉｃｋ空気振ｄ賎中で
１時間、細胞をインキュベートした（２２５　ｒｐＩｌ
ｌ、３７°Ｃ）。次いで、２００μＱをアンピシリン（
５０μ９／ｉ＆）含仔ＬＢ−アガロース上で３７°Ｃで
一夜インキユベートすることにより平板培養した。分子
クローニング（前掲）、およびグルンンユタイン（Ｇ　
ｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　）およびホブ不ス（Ｈｏｇ
ｎｅｓｓ、　Ｄ、　）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７２：３９６１（１９７５）に詳
しく記載されているコロニースクリーニング法でアンピ
シリン耐性コロニーをスクリーニングした。再びＪＬお
よびカッパネズミブローブを用いて組換えｐＢＲ３２２
プラスミド（ｐＭＬＣＥ−１０と命名）を同定し、ブダ
ペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに１９８８年３月４日（Ａ　Ｔ　ＣＣ受
託番号＃６７６３９）に寄託した。プラスミドｐＭＬＣ
Ｅ−１０の制限部位および機能地図を添付の第１図に示
す。

Ｅ、ヒトＤＮＡの単離 ヒトガンマハブロタイブｆｂｎおよびａｚｇにホモ接合
性の個体から、３０３１１２の全血試料を採取した。

ソーボール（Ｓｏｒｖａｌｌ）　ＧＩＣ−２Ｂ中、２５
００ｒｐＩＱにおいて、２２℃で遠心することにより血
液試料からバフイー（Ｂｕ４ｆｙ）コート細胞を収穫し
た。

パスツールピペットでバフィーコート細胞を取り、ＰＢ
Ｓで１回洗浄した。細胞ペレットをｌｏｍＭＴｒｉｓ−
Ｈｃｉ２（ｐＨ８，０）５００μＣ１４０ｍＭＮａＣＣ
に再懸濁し、１０％ＳＤＳ　　３０μＱと２０πり／′
７ｇプロテアーゼＫ（／グマケミカルス、ｓ　ｔ、　Ｉ
又Ｕｉｓ、　Ｍ　１ｓｓｏｕｒｉ）　６　ｔｔ　ｉ２を
加えて溶解した。試料を３７°Ｃで１５時間インキュベ
ートした。ＤＮＡを等容量のフ二／−ル：クロロホルム
：イソアミルアルコール（２５：２４　：　Ｉ　’）混
液で２回抽出し、さらにクロロホルム：イソアミルアル
コール（２４：ｌ）混液て２回抽出したのち、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨｃＯ。

（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡに対して透析した。

次いで、Ｄ　Ｎ　Ａを５０μｙ／ｘｃのＲＮＡ５ｅＡ（
シグマケミカルス）で２時間処理し、２００μｇ／ｙＱ
Ｏ）プロテアーゼにで１時間再調化した。上記の如くＤ
ＮＡを抽出し、透析し、ＯＤ、。でａ度測定を行った結
果１００−２００η／スσであった。

Ｆ、ヒトゲノムファージライブラリーの構築ｒｂｎハブ
ロタイブのヒトＤＮＡ（実施例ＩＥで単離した２１０μ
ｇ）をＭｂｏＩで部分消化し、分子量域１２−２４ｋｂ
の断片を単離し、実施例ＩＢ！ａ載のごとくにしてＥＭ
ＢＬ−３フアージにクローニングした。

Ｇ、組換えプラスミドｐＨＫ　Ｆ　−１の単離ヒトカッ
バネ変領域遺伝子を単離するために、実施例ＩＢ記載の
ごと（、ヒーター博士（Ｄｒ、　　Ｈｉｅｔｅｒ）（ジ
ョン・ホブ牛ンス大学、バルチモア、メリーランド）か
ら提供されたヒトカッパプローブ（その配列はＮ　Ｉ　
Ｈデーターベースから受託番号ＪＯＯ２４１の下で入手
可能）を用いてＥＭＢＬ−３ライブラリーをスクリーニ
ングした。実施例Ｉ　Ｃ記載のごとくにして、合計５Ｘ
１０、’ｆｆｌの組換えファージをスクリーニングした
。単一のクローンを単離し、φＨＫ　Ｆ−１と命名した
。φＨＫＦ−ＩＤＮＡ　　１５μｆｆを反応バッファー
（Ｒｅａｅｔ　Ｂ　ｕｆｆｅｒ）　＃　３　（Ｇ　１ｂ
ｃｏ　−Ｂ　ＲＬ　、ガイザーズバーグ、メリーランド
）中、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩＩで消化した。Ｄ
ＥＡＥ８１ろ紙上で５．２ｋｂ断片を単離し、実施例Ｉ
Ｄ記載のごとく、クローニングベクターｐＢ　Ｒ３２２
とライゲートした。ヒト力。

パブローブを用いてアンピノリン耐性組換えコロニーを
同定し、単一のクローンを単離し、ｐＨＫＦ−１と命名
した。ｐＨＫＦ−１は、ブダペスト条約め規定に従い、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨンに１９
８８年３月４日、ＡＴＣＣ受託番号＃６７６３７で寄託
された。プラスミドｐＨＫｔ−１の制限部位および機能
地図を添付の第１図に示す。

）（、ＣＥＭ２３１．６．７　Ｖｉ、カッパ遺伝子およ
び１：＝Ｉ−Ｃカッパ遺伝子を含有しているプラスミド
ｐ１−ｆ　Ｋ　ＣＥ　−１０の構築 全ＣＥｆ’ｖ１２３１．６．７可変カッパ領域を含有す
るｐＭＬＣＥ−ＩＱから得た３、　８　ｋｂ　Ｈ１ｎｄ
ｌｌ！断片を、実施例ＩＤ記載の方法に従い、実施例Ｉ
Ｅ記械のプラスミドｐｉ−Ｉ　Ｋ　Ｆ　−１のＨｉｎｄ
１１１部位にサブクローニングし、ヒト不変カッパ領域
遺伝子と融合したネズミＣＥＭ２３１．６゜７可変軽蹟
領域を有するキメラプラスミドを構築した。ｐＭ　Ｌ　
ＣＥｌｏ　　ＤＮＡ　　ｌ１１９を反応バッフｙ−（Ｒ
ｅａｃｔＢ　ｕｆＩ’ｅｒ）　＃　２　（Ｇ　１ｂｃｏ
　−Ｂ　ＲＬ　、ガイザーズバーグ、メリーランド）を
用い、ｌＵ／′ｕ９でＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＨＫＦ
−１をも同様に消化した。ｐＭ　Ｌ　ＣＥ１０消化Ｄ　
Ｎ　Ａを上記の如く電気泳動にかけ、ＤＥＡＥ８］ろ紙
上で３．８　ｋｂ　Ｈｒｎｄｍｒ！ｆｆ片を単離し、Ｔ
Ｅ　　５μρで溶出した。ＩＯＸライゲージコンバッフ
ァー、ｉｏ＋ｎＭＡＴＰ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２
単位の存在下、全量１０μｇとして、［（ｉｎｄＩＩ［
消化ｐＭＬＣＥ−１０１μｙ（２μ＆）とＨｉｎｄＩＩ
［消化ｐＨＫＦ−１（６００ｎｙ）とをライゲートした
。１２°Ｃで一夜うイゲーンヨンを行い、実施Ｐ＋４記
載のごとく、再度、ＢＲＬ供給のＨＢＩＯｌコンピテン
ト細胞をプラスミドで形質転換り、ｆ：。

プラスミドＤ　Ｎ　Ａの制限マツピングによってｐＨＫ
ＣＥ−１０と命名されたプラスミドを同定した。

プラスミドｐｉ−（ＫＣＥ−１０の制限部位および機能
地図を第２図に示す。

１、キメラ軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有しているプ
ラスミドｐＧＣＥＭＫの構築 ヒトカッパ遺伝子に融合したネズミＶ＋ｊｉｉ域を含有
する真核性発現ベクターをベクターｐＳＶ２ｇｐｔ（ア
メリカン・タイプ・カルチャー・フレ７シゴン、Ａ　Ｔ
　ＣＣ番号＃３７１４５）を用いて構築した。反応バッ
フｙ−＃３（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ガイザ−ズバーグ、
メリーランド）中、ｒ）ＳＶ２ｇｐｔＤＮＡｌμｙを、
制限酵素ＥｃｏＲＩをＩＵ／μｇＤＮＡの割合で用いて
消化した。次いで、各５ｍＭの４種のデオキシリボヌク
レオチド類、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡ
ＴＰ１０μＱ、フレノウ酵素２単位およびＩＯＸバッフ
ァ　−（０，５Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨｃＱ（ｐＨ７、５
）、Ｏ，ＩＭ　　ＭｇＣ（ｈ、１１０ｌ１１ジチオスレ
イトール）中、全量５０μＱとなるように加え、分子ク
ローニング（前掲）記載の方法でＥｃｏＲＩ末端を平滑
末端化した。室温で３０分間反応させたのち、ライゲー
ジコン反応を行い、りん酸化Ｃ１ａｒリンカ−（２μ９
′）（二ニー・イングランド・バイオラボ、ベバリー、
マサチューセッツ）をＥａｏＲＩ平滑末端化ｐＳ　Ｖ　
２ｇｐｔ　５００ｎ９とライゲートし、本発明のキメラ
ベクターを得るために、新しいＣｌａｌ部位を創造した
。Ｃ１ａｌリンカ−配列はｄ（ｐＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）
である。ライゲーション反応は、実施例ＩＢ記載の方法
に従って行なわれた。ライゲーションの後、ＤＮＡを電
気泳動に付して過剰のリンカ−を除去し、実施例ＩＤ記
載のごとくにして線状ｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ−Ｃ１ａ断片
をＤＥＡＥ８１ろ紙上に単離した。実施例ＩＢ記載の試
薬を用いて単離したＤＮＡを自己ライゲーションさせた
。ＨＢＩＯＩコンピテント細胞を実施例ＩＤ記載のごと
くにして形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを制限
酵素消化によって分析した。

次いで、得られたベクターｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−Ｃ
ＩａをＣ１ａｒおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した（
１単位／μ９ＤＮＡ）。これらの２制限酵素でキメラベ
クターｐＨＫＣＥ−１０をも消化した。実施例１Ｄ記載
のごとく、ｐＳＶ２ｇｐｔの４．５ｋｂＣＩａ−Ｂａｍ
断片とｐＨＫＣＥ−１０の９　ｋｂＣｌａ　−Ｂ　ａｍ
断片をＤＥＡＥ８１ろ紙で単離した。９ｋｂ断片挿入体
ＤＮＡ３７５ｒ＋９と４．５ｋｂベクターＤＮＡ２００
ｎ９を用い、上記のごとくにして標準的なライゲーショ
ン反応を行った。ＨＢＩＯＩの形質転換に続いて、ｐＧ
ＣＥＭＫと命名した組換えプラスミドをプラスミドＤＮ
Ａの制限マツピングによって同定した。ＣＥＭキメラ軽
鎖ポリペプチドの製造に用いる発現ベクターである、こ
のプラスミドの制限部位を添付の第２図に示す。

Ｊ、ＣＥＭ２３１．６．７Ｖｈ遺伝子を含有している組
換えファージφＭＨＣＥ−３０の単離ＣＥＭ２３１．６
．７ガンマ鎖の同定のために、実施例ＩＢ記載のＥＭＢ
Ｌ−３ライブラリーを２個のネズミ重鎖プローブでスク
リーニングした。

プローブの内、１ｍはＪｈ３　４ＳＪ域を示し、フィル
・タッカ−博士（Ｄｒ、　Ｐｈ１ｌ　Ｔａｕｃｋｅｒ）
、（テキサス大学、ダラス、テキサス）から提供された
。

もう１個はネズミガンマーｌ遺伝子配列を示す。

後者のプローブは、ジェネラルバンクデータベース（Ｇ
ｅｎｅｒａｌ　Ｂａｎｋ　Ｄａｔａ　Ｂａ５ｅ）（Ｎ　
Ｉ　Ｈ受託番号ＪＯＯ４５３）によって決定された式：
％式％ で示される配列を有し、モレキュラー・バイオシステム
社（サンジエゴ、ＣＡ）によって合成されたものである
。合計４．８ＸＩＯ５１のａｍえファージプラークを、
これらの２種のプローブを用いて重複スクリーニングし
、Ｊｈ領領域ガンマ領域の両方を含有するクローンを同
定した。これもまたカッパクローンを有するので、これ
らの２領域の配列を含有するファージは、ＤＮＡが再配
列されていることを示し、かくして細胞系統（セルライ
ン）ＯＥＭ２３１．６．７内で発現された免疫グロブリ
ン遺伝子が同定された。再配列に基づいて１個のＣＥＭ
２３１．６．７クローンを選択し、φＭＨＣＥ−３０と
命名した。

Ｋ、ＣＥＭ２３１．６．７Ｖｈ遺伝子を含有しているｐ
ＭＨＣＥ−３０の構築 重鎖可変領域配列とネズミ重鎖、エンハンサーを包含す
る大きいイントロンとを含有するφＭＨＣＥ−３０の５
．６ｋｂＳｓｔＩ断片を制限マツピングによって同定し
た。この断片をプラスミドでサブクローニングするため
に、ファージＤＮＡｌ０μ７を、反応バッフｙ−＃２（
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ガイザーズバーグ、メリーランド
）中、制限酵素５ｓＬＩで消化し、実施例ＩＤ記載のＤ
ＥＡＥ８１法で電気泳動することにより、５．６ｋｂ断
片を単離した。

ストラソタジーン（う・ジョーク、ＣＡ）から購入可能
なり　Ｉｕｅｓｃｒｉｌ）ｔベクターＩＶ１１３−ＳＫ
＋を５ｓｔｌ消化した。実施例ＩＢに詳述したように、
ベクターと単離した５、６ｋｂ挿入体ＤＮＡとを、１１
０の比率で、全量１０μρとしてライゲートさせた。Ｈ
ＢＩＯＩコンピテント細胞の形質転換の後、制限消化マ
ツピングし、適切な組換体を同定し、ｐＭＨＣＥ　　３
０と命名した。ｐＭＨＣＥ−３０は、ブダペスト条約の
規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・フレク
ションに１９８８年３月４日、ＡＴＣＣ受託番号＃６７
６４０で寄託された。プラスミドｐＭＨＣＥ−３０の制
限部位および機能地図を添付の第３図に示す。

Ｌ、ヒトＤＮＡの単離 上記実施例ＩＥ記載のごとくにしてヒ）ＤＮＡを単離し
た。

Ｍ、ヒトプラスミドライブラリーの構築ａｚｇハブロタ
イブのヒトＤＮＡ各１０μ７を制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩｌを用い、リアクション
・バッファー＃　３　（Ｇ　１ｂｃｏ　−ＢＲＬ、ガイ
ザーズバーグ、メリーランドＸ５０１ＭＴｒｉｓ−Ｈｃ
Ｑ、　ｐＨ３，Ｑ、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＱ２．１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ（り中、全ｆｆ１２００　ｔｔＱとし、制限
酵素ＢａｒＱＨＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ各３０単位で消
化した。エタノール沈殿により、消化断片を２０μａに
濃縮し、０．６％低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ）ゲ
ルを用い、５０＋ｎＡｍｐ（ミリアンペア）で１５分間
泳動させた。６−７　ｋｂの大きさのＤ　Ｎ　Ａ断片を
ゲルから切り取った。クローニングベク９−ｐＵＣ１８
［ヤニノシュ・ペロンら（Ｙ　ａｎｉｓｃｈ　−Ｐ　ｅ
ｒｒｏｎ、　Ｃ、）、Ｇｅｎｅ　３３：１０３（１９８
５月も上記の如＜　ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで
消化した。３０＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃ（１，ｐＨ７
，６、ｌ　ＯＩＩＩＭ　ＭｇＣＱｔ、５ｍＭ　ジチオス
レイトール、１ｍＭＡＴＰ、およびｌμＱＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（２単位）をａｍする全量４００μＱの反応溶液
中で１５°Ｃで７２時間、ｐＵｃ１８ベクター（５０ｒ
＋ｙＸ二ニー・イングランド・バイオラボ、ベバリー、
マサチューセ、ツ）にヒトＤＮＡ断片（１５０ｎ９）を
ライゲートした。

ライゲートしたＤＮＡ試料の半！（１００ｎ９）を用い
、新しく調製したコンピテントな大腸１１Ｍｌ５細胞５
００μρを形質転換し、得られた形質転換体をＸ−ｇａ
ｌ、Ｉ　ＰＴＧ、ＡＭＰプレー）（４μｙ／ｘＱ　Ｘ−
ｇａＬ　２ｕ９／ｚ（ｌ　Ｉ　ＰＴＧ、１００ｕｖ／１
１２アンピシリン）で平板培養した。

Ｎ９組換えプラスミドｐＨＧＩＺの単離ホンジヨウ（Ｔ
、　ＨｏｎｊｏＸ大阪大学、日本）から提供されたヒト
ガンマ２プローブを用イ、タカハンら（Ｔ　ａｋａｈａ
ｓｈＬ　Ｎ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）、２９　：５７ｌ
−６７９（１９８２）記載のごとくにして組換体ヒトＤ
　Ｎ　Ａを含有するアンピシリンｉ性ｐＵｃ１８コロニ
ーをスクリーニングした。ヒトガンマ１遺伝子にｔ目当
する７、５ｋｂ挿入体を含有するクローンを同定し、Ｈ
ｙＨＧｌと命名した。次いで、実施例ＩＧ記載の方法を
用い、ヒトガンマ不変領域遺伝子を含有するこの同じ７
．５ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　−ＢａｇＩＨＩ断片をｐＢ
Ｒ３２２に再クローニングした。ヒトガンマ１遺伝子を
含有するｐＢ　Ｒ３２２ベクターをｐＨＧＩＺと命名し
、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・
カルチャー・フレクションに１９８８年３月４日、ＡＴ
ＣＣ受託番号＃６７６３８で寄託した。プラスミドｐＨ
ＧＩＺの制限部位および機能地図を添付の第３図に示す
。

０、ＣＥＭ２３１．６．７Ｖ、遺伝子およびヒトガンマ
−１遺伝子を含有しているｐＨＧＣＥＭ−３０の構築 次のようにしてネズミ可変重鎖領域をヒトガンマ−１遺
伝子と融合させた。ｐＡ４ＨＣＥ−３０（１０μｇ）を
Ｃ１ａｌ（１単位／μｙ）　テ消化Ｌ、次イテ、Ｈｉｎ
ｄ［で部分消化し、Ｖｈおよび大きいイントロンを含ん
だ５．３ｋｂ断片を得た。Ｄ　Ｎ　Ａの部分消化はわず
か０．ｌｌｎ位／μ９を用い、３７°Ｃで１時間の消化
時間を要して行った。また、ヒトガンマ１遺伝子を含有
する実施例ＩＮ記載のプラスミドｐＨＧＺ−１の１μ９
をＣ１ａｌおよびＨｉｎｄｕで消化した。実施例ＩＤ記
載のＤＥＡＥ８１プロトフールを使用し、ＴＢＥゲルか
らｐＭＨＣＥ−３Ｑの５．３ｋｂ断片を単離した。この
断片を、挿入体５００　ｎｙとベクターＤＮＡ２００ｎ
９を用い、全量１ＯｕＱＯ’）ライゲーショ７　’ｒｎ
　合物中、ｐＨＧＺ−１のＣ１ａ−Ｈｉｎｄ部位にライ
ゲートした。ライゲーション反応は、実施例ＩＢの記載
に従って行った。

ＨＢＩＯｌの形質転換の結果、生成された紐換えプラス
ミドを制限消化マツピングによって分析し、ヒトガンマ
ｌ遺伝子と融合したネズミ■ゎ領域を含有するプラスミ
ドを同定し、ｐＨＧＣＥＭ−３０と命名した。プラスミ
ドｐＨＧＯＥＭ−３０の制限部位および機能地図を添付
の第４図に示す。

Ｐ、キメラ重鎖免疫グロブリンを含有しているｐＮＣＥ
ＭＣＩの構築 実質上、実施例ＩＨ記載の方法に従い、真核性発現ベク
ターにキメラｒｇ遺伝子を挿入した。用いたベクターは
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
人手可能なｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（ＡＴＣＣ番号＃３７
１４９）である。プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔに関して記
載したと全く同様にして、このベクターにＣｌａｌ部位
を付加した。次いで、ｐＳＶ２ｎｅｏ−Ｃ１ａ　ＤＮＡ
を酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｇＨｌを１単位／μｇＤＮＡ
の割合で用いて消化した。プラスミドｐＨＧＯＥＭ−３
０をＣ１ａｆで消化した後、ＢａｍＨＩ（０，１単位／
μいで部分消化し、キメラＶｈおよびガンマ１領域を含
有する１２．７ｋｂ断片を得た。この断片をＤＥＡＥ８
１ろ紙上で単離しＴＥバッファー　１０μＱで溶出した
。

ライゲーションは、ベクターＤＮＡ　　５０ｎｇ、１２
．７ｋｂ挿入体ＤＮΔ　４００ｎｇ、ＩＯＸライゲーシ
ョンバッファー、ｌＱｍＭＡＴＰ、およびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用い、実施例ＩＢ記載のごとくにして１２°Ｃ
で一夜行った。ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換し、キメラ発
現ベクターｐＮＣＥＭＧ］を構成する適正な組換えプラ
スミドを同定した。キメラ重鎖免疫グロブリン遺伝子の
発現に用いられる組換え発現ベクターを構成するプラス
ミドｐＮＣＥＭＧＩの制限部位および機能地図を第４図
に示す。

Ｑ、プラスミドｐＮＣＥＭＫの構築 プラスミドｐＮＣＥＭＫは、プラスミドｐＨＫＣＥ−１
０（実施例」Ｉで単＃）の約９．０ｋｂＣＩａｌ／Ｂａ
ｍＨＩ断片をＣｌａＩ　／　ＢａｍＨＩ消化プラスミド
ルＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−Ｃｌａにライゲートするほか
は、プラスミドｐＮＣＥＭＧｌと実質上、同一の方法で
構築された。

Ｒ，プラスミドｐＧｃＥＭＧ１の構築 プラスミドｐＧｃＥＭＧ１は、プラスミドｐＨＧＣＥＭ
−３０（実施例５Ｃ参照）の約１２．７ｋｂＣ１ａ　Ｉ
　／　Ｂａ１ｌＩＨＩ　（部分）制限断片をＣ１ａｌ／
ＢａｍＨ１１肖化プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−
Ｃｌａにライゲートするほかは、実質上、プラスミドｐ
ＧＣＥＭＫ（実施例ＩＩ参照）と同一の方法で構築され
た。

実施例２　クローニングした遺伝子のＤＮＡ配列決定 クローニングした可変軽鎖および重鎖遺伝子の配列決定
は、配列決定キット、Ｓ　ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ　、　
Ｓ　。

バイオケミカルス、クリーブランド、オハイオから購入
可能）、ならびにＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ／　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列決定ンステム（ストラッタジーン社、う・ジョー
ク、ＣＡから購入可能）に示されたプロトコールを用い
、１本鎖および２本鎖の両鋳型のための標準的手法によ
り行われた。クローニングしたＣＥＭ可変軽鎖および重
鎖領域遺伝子に関して得られたＤＮＡ配列から、コンピ
ューター・ソフトウェア−・プログラム、ＭＡＰＳＥＱ
（ＤＮＡＳｔａｒ。

マディフン、ライスコンシンから購入可能）により、コ
ードされているポリペプチドのアミノ酸配列を推定した
。

実施例３ Ａ、キメラ構築物ｐＧＣＥＭＫを用いるキメラ軽鎖遺（
ｍ　子のトランスフェクション 上記実施例１記載のごとく、トランスフェクンヨンに用
いた軽鎖免疫グロブリンプラスミドはｐＧＣＥ　Ｍ　Ｋ
である。ヒトカッパ遺伝子と融合したキメラ可変軽鎖（
Ｖｋ）ＣＥＭ遺伝子を含有するｐＧＣＥＭＫプラスミド
を、まず上記の電気穿孔法により、５Ｐ２１０ハイブリ
ドーマ細胞にトランスフェクトした。Ｓ　Ｐ２１０−Ａ
ｇｌ　４細胞を５％ＦＣ８含有培地で培養し、電気穿孔
法適用前３日間、増殖の対数期に保持した。プラスミド
ベクターｐＧＣＥＭＫ　２０　ｔｔ９を制限酵素Ｐｖｕ
ｆ（ｌｕ／μｇ）およびリアクション・バッフｙ　　＃
　７　（Ｇ　１ｂｃｏ　−ＢＲＬ、ガイザーズバーグ、
メリーランド）で線核化した。トランスフェクションに
際しては、■ＥＣクリニカル遠心１（８００ｒｐｍ、　
　Ｉ　０分間、室温）により、５Ｐ２１０細胞を採取１
７た。次いで、【Ｉ胞を、６ｎ〜１デキストロースを含
んたＨ　ａｎｋの援ｉｉｉ化食塩水（Ｇ　１ｂｃｏ　Ｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ゲランドア、イランド、ニ
ューヨーク）を用いて３回洗浄し、終４ｍ閥　０ＸＩＯ
’細胞／ｚ（ｌで再懸濁した。キュヘノトニ細胞０．３
ｘＮを７ａ度Ｉ　Ｘ　１０’１０．３ｍ＆で分注し、線
状化ＤＮＡを加えた。混合物を水上にＩＯ分間装いた。

０，８ズ肩ギヤノブの電極（Ｐ／　Ｎ　４７２　）およ
びＢＴＸｌｏｏ）ランスフエフター（ＢＴＸ　　Ｉｎｃ
、サンジエゴ、ＣＡ）を用いて電気穿孔を行った。条件
は、３００ボルトで、１００μｓｅｃごとに３パルスで
ある。次いで、電気穿孔した細胞を濃度２Ｘ１０’／ｚ
ｆｆ（Ｔ７５フラスコ中）で培地に７２時間、再浮遊さ
せた（３７°Ｃ１５％Ｃｏ、）。次いで、細胞を、２４
ウエル中の適当な抗生物質に、密度５Ｘ１０’／２ｉ２
でプレートし、ｐＧＣＥＭＫを含有する５Ｐ２１０細胞
をＨＭＡＸ　ｌ　Ｏ培地（５０ｎ９／ｊｌ＆　ヒボキサ
ンチン、２５０　ｎｙ／　ｚ（ｌマイコフェ／−ル酸お
よび５０ｔｎ／ｒＱキサンチン、シグマ、セントルイス
、ミゾノーから入手可能）に１μ９／ｒ、Ｑでプレート
した。

）（Ｍ　ＡＸ耐性コロニーを含有する各ウェルから上清
２００μＱを収集した。次いで、この上清を、ｐＧＣＥ
ＭＫのキメラ免疫グロブリン遺伝子の発現を示唆する、
ヒトカッバネ変領域遺伝子の存在に関して分析した。

（以下余白） Ｂ、キメラＣＥＭ２３１．６．７を分泌する５Ｐ２１０
細胞の同定 キメラＣＥＭヒトカッパ遺伝子を発現するトランスフェ
クトされた５Ｐ２１０細胞を、エングバルおよびバール
マン［Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｐｅｒ１ｍａ
ｒ＋ｎ、　Ｐ、、　　Ｉ　＋ｕ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　　８　：　８７１　８７４　（１９７１）］記
ａのごとく、ヒトカッパを対象とする標・店的な酵素結
合イムノアブソーパントアノセイ（イライザ、ＥＬＩＳ
Ａ）により、同定した。

このアッセイの目的は、ネズミハイブリドーマＣＥＭ２
３１．６．７からＣ１０離し、ヒトガンマ１遺伝子と融
合させたネズミ可変領域から溝築されたｐ　ＧＣＥ　Ｍ
　ｋプラスミドベクターによってコードされているキメ
ラカッパ鎖ポリペプチドを分泌する細胞を同定すること
にある。１０　ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７−８）中
、ヤギ抗−ヒトカノパ鎖（Ｔａｇｏ　＃　４１０６）の
５μｙ／ｘ＆溶液を調製した。

９６ウエルプレートの各ウェルをこの溶液５０μジで層
っだ。次いで、プレートを３７°Ｃで一夜イ７・キユヘ
ートした。次いで、プレートを水およびＰＢＳ＋Ｑ、１
％Ｔ　ｗｅｅｎ（ｗ　／　ｖ　）中でよく洗浄した。土
浦画分５０μｇを各ウェルに入れ、室温で２時間インキ
ュベートした。上で詳述したように、プレートを再度洗
浄した。上清物質の培地と同じ培地でヤギ抗−ヒトカノ
バ鎖アルカリホスファターセ結合物（コンジュゲート、
Ｔａｇｏ＃２４９６）を１／１０００希釈した。ウェル
あたり１００μＱを加え、室ぶて１時間インキュベート
した。上記のごとくにしてプレートを洗浄した。包装容
器の指示に従い、アルカリホスファターセの基質をＡ製
し、各ウェルに、錠剤１個あたりに留水３１とこの基質
１５０μｅとを加え、３７°Ｃて３０分間インキュベー
トした。３００ｍＭ　　ＥＤＴＡ（５０μのを加えて反
応を停止（クエンチ）し、４０５ｎ〜１の吸光度を測定
した。最高レベルのカッパ発現を示す−Ｌ清を同定し、
対応するウェルから細胞を分取し、キメラ構築物ｐＮＣ
ＥＭＧ１の誘導のために増殖させた。

Ｃ中鎖キメラ構築物ｐＮＣＥＭＧｌによるキメラカ、バ
産生剛胞のトランスフェク／ヨン実施例１に詳述した構
築物から導かれた重鎖免疫グロブリンプラスミド、ｐＮ
ＣＥＭＧｌを用いて５Ｐ２１０細胞をトランスフェクト
した。次いで、分取した牛メラＣＥＭ−ヒトカッパ遺伝
子を発現する細胞集団（ポピユレーション）をキメラＣ
ＥＭ重鎖遺伝子を含有するプラスミド構築物と一緒に電
気穿孔に付した。カッパ遺伝子の電気穿孔については、
５Ｐ２１０キメラカツパ産生細胞（ＳＰ２１０−Ｋ）を
電気穿孔処理の前、３日間対数増殖期に維持しておいた
。プラスミドＤＮＡ、ｐＮＣＥＭＣＩ（２０μｇ）をリ
アクトバッファー＃６（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、　　Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）中、酵素
ＰｖｕＩで線状化した。細胞を集め、洗浄し、実施例２
Ａに詳述したように、密度３Ｘ１０’細胞／１１ｅで再
懸濁した。ＤＮＡを加え、電気穿孔の前に、混合物を氷
上に１０分間放置した。条件は、ｌパルス／　５１ｓｅ
ｃ、２５０■である。細胞を、密度２．５Ｘ１０’細胞
／ｘＱで、ＨＭＡＸ　１．０を添加した５％ＦＣＳを含
有するＨＨ２などの哺乳類の組ｍ培養培地（その他、Ｄ
ＭＥＭまたはＲＰＭｌなトテモヨイ）中、３７°Ｃで５
％ｃｏ、存在下、７２時間培養した。次いで、これらの
細胞を、ＨＭＡＸｌ、０および有効濃度５００μ９／ス
ＱのＧ４１８抗生物質（ジｘ’ｌ−テシン、Ｇ　１ｂｃ
ｏ　−Ｂ　ＲＬ。

Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋　Ｍａｒｙｌａｎｄ）を
含有する２４ウエルのプレートに５Ｘ１０’／［１２で
プレートした。

１４日間、選択を維持した時点で、以後の分析のために
ＨＭＡＸ／Ｇ４１８耐性コロニーを同定した。

実施例４　　ＣＥＭ牛メラメラ抗体泌するキメラ抗体５
Ｐ２１０細胞の同定および分析 Ａ、抗原結合 キメラＣＥＭ軽鎖および重鎖の両方の免疫グロブリン遺
伝子を発現し、ＣＥＡと結合する抗体を発現するトラン
スフェクトされたＳＰ２／１１胞を同定するためにスク
リーニングアッセイを行った。ＣＥＡ抗体の検出に用い
たアッセイは、ウオンら（Ｗａｎｇ、　Ｒ、）　Ｉ　ｍ
ｍｕｎｏｌ、　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ、１８：１５７−１６
４（１９７７）が詳細に示した標準的な固相ラジオイム
ノアッセイである。

マイクロタイタープレートのウェルに以下の試薬を加え
、撹拌しながら、室温で一夜インキユベートシた。細胞
培養上清２５μＱ、”’Ｉ−ＣＥＡ（アフィニティー精
製）５０μｅ１セフアロ一ス結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ２
０μρおよび細胞培養培地２５μＱ０セファロース−抗
−ヒトＩｇＧと結合した免疫コンプレックスをろ紙上に
採取した。ろ紙をガンマカウンターで計数した。ラジオ
イムノア、。

セイの結果、キメラ抗ＣＥＡ特異抗体が同定され、それ
をＸＣＥＭ４４９と命名した。

Ｂ、抗体アフィニティー キメラ抗体ＸＣＥＭのＣＥＡに対するＫａを求めるため
にアフィニティーアッセイを行った。キメラ抗体ＸＣＥ
ＭのＣＥＡに対する親和性を実施例４Ａ記載の標準的な
ラジオイムノア、ッセイおよびスキャッチャード分析（
Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ｇ、、　　Ａｎｎ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、（１９４９
））ｌこよって１１１１定した。

抗原結合アッセイは実施例４Ａ記載のごとくにして行っ
た。阻害曲線の作成のために、各反応混合物に細胞培養
培地２５μｅの代わりにＣＥＡ２５μｅを加えた。競合
物質の添加量はｌｌ−１Ｏ０ｎである。スキャッチャー
ド分析を行うためには結合／遊離を結合抗原に対してプ
Ｃｌノ）し、線の傾きのメガティプ（ｍｅｇａＬｊｖｅ
）から、アフィニティ一定数を算出した。キメラ抗体の
親和性は少なくとも本発明のキメラ抗体を誘導するのに
用いたネズミ抗体対応物と適合していた。

当業者にとって、本発明の思想および範囲から逸脱する
ことなく、本発明を修飾あるいは変化させることが出来
るということは自明である。後述の特許請求の範囲は、
そのような修飾および変化のすべてを包含すべ（意図し
たものである。

実施例５　　ＳＶ４０エンハンサー不含クローニングシ
ステムの構築 Ａ、プラスミドｐｓＶ２ｇ＋）む（Ｅ−）の構築ブ５ス
ミ）’ｐＳＶ２ｇｐｔ−Ｃｌａ（実施ｆＩＩＩｒでｆｉ
ｔ築）約２０　μ＆（１０μｙ）を水２１　ａＯ，、Ｇ
ｉｂｃｏ反応バッファー＃６（５μＱ）、制限酵素Ｐｖ
ｕＵ２μｇおよび制限酵素５ｐｈｌＩ２μＱと混合し、
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、反応混
合物を０．５％ＴＢＥゲル電気泳動にかけ、実質上、実
施例ＩＤ記載の方法に従ってＤＥＡＥ８１ペーパーから
約４．９ｋｂ　Ｐｖｕｌｌ／５ｐｈｌＩ消化ベクター断
片を精製した。これら制限部位の３′突出部を充填する
ために、ＰｖｕＩＩ／５ｐｈＩｌ消化ｐＳＶ２ｇＰｔＣ
１ａベクター約２０ａＱを、１ＯＸＴ４ポリメラーゼバ
ッフｙ−（７００ｉ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、１
００ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ、５０ｍＭ　ＤＴＴ）３μＣ，
ｄＮＴＰ混合物（各０．５ａ＋ｒｖｉのｄＡＴＰＳｄＴ
ＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｐＨ７，０）３μ＆、水３μｇお
よびＴ４ＤＮΔポリメラーゼ（Ｂ　ＲＬ）ｌ　ｔｔｇ（
５［Ｊ）と混合した。得られた混合物を３７℃で１５分
間インキュベートしたのち、７０℃で１０分間加熱した
。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、Ｄ　Ｎ　
ＡをＴＥバ、ファー５μｅに再懸濁した。このＤＮＡ断
片約ｌμｅ（約５００　ｎｇ）を水　１０μＱ、５ｘラ
イゲーシヨンバツフアー　５μｆｆ、１００μＭＡＴＰ
２μＱ、およびＴ４リガーゼ２μａと混合した。室温で
２時間インキュベートしたのち、実質上、実施例ＩＰの
方法に従って、ライゲーション混合物で大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉ細胞を形質転換した。

形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、〜０゜２ｋ
ｂのＳＶ４０、エンハンサー領域の適切な欠失ヲ示すプ
ラスミドをプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ　−）と
命名した。

Ｂ　プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（Ｅ−）の構築５
ｖ４０エンハンサー不含ｐＳＶ２ｎｅｏをも構築した。

プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−Ｃｌａ（実施例Ｉ
Ｐで構築）約２０　ｔｔ　（（１０μｇ）をＧｉｂｃｏ
反応ハソファー＃３中、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄｌＩ［により、実質上、上記と同様にして消化した
。電気泳動にかけたのち、ネオマイシン耐性付与遺伝子
を含有する約２．３　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｆ［［／　Ｂａｍ
ＨＩ断片をＤＥＡＥ８１ペーパーから単離、精製した。

同様に、プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ−）を、
制限酵素ＢａｇＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、電
気泳動にかけて大きいベクター断片を精製した。次いで
、実質上、上記の節に記載の方法に従ってプラスミドｐ
ＳＶ２ｎｅｏ−Ｃ１ａの約２．３　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＩＩ
Ｉ／　ＢａｍＨＩ　ｎｅ。

含有断片をプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ（Ｅ−）の
ＨｉｎｄＩ１１／ＢａｍＨＩ消化ベクター断片とライゲ
ートさせた。大腸菌ＦｉＢｔｏｕｓ胞を形質転換し、プ
ラスミドＤＮＡを単離したのち、プラスミドｐＳＶ２ｎ
ｅｏ−Ｃ１ａの約２．３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ／Ｂａ１
ＨＥｎｅｏ含有断片がプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（
Ｅ−）ベクターバ。

クボーンと結合してなるこれらのプラスミドをｐＳＶ２
ｎｅｏ（Ｅ−）と命名した。

Ｃ，プラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）およびｐＧＣＥＭ
Ｇ（Ｅ−）の溝蘂 ブラフ、　ミＦｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ　　）Ｄ　Ｎ　
Ａ約Ｉｏｎ（２ｔ）μｊ）を水４　μｉ！、　Ｇｉｂｃ
ｏ反応バッファー＃１（１２μｆり、制限酵素Ｃ１ａｌ
　　２μ（ｌおよび制限酵素ＢａｍＨＩ　　２μ＋２と
混合し、３７℃で一夜インキユベートした。ＤＥＡＥ３
１ペーパーに電気泳動したのち、大きいベクター断片を
精製し、ＴＥ１０μぐに再び濁した。プラスミドｐＨＫ
ＣＥ−１０（実施例ＩＨで構築）約２０μＱ（５μｇ）
を水２３ｔｔＱ、　Ｇｉｂｃｏ反応バッファ　　　＃Ｂ
５μの、制限酵素Ｃ１ａ１２μＱと混合した。３７°Ｃ
で５時間経過したのち、反応混合物をフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱に付した。次いで、消
化したＤＮＡを水２５μｅに再懸濁し、Ｇｉｂｃ。

反応バッファー＃３（３μのおよび、制限酵素ＢａＩＩ
ＩＩ（１２μρと混合した。３７°Ｃで２時間インキュ
ベートしたのち、消化ＤＮＡを電気泳動にかけ、約９．
０ｋｂのネズミ可変、ヒト不変カッパをコードしている
Ｃ１ａｌ／Ｂａ１Ｈｒ制限断片をＤＥＡＥ８１ベーパー
から精製した。次いで、この約９゜Ｏｋｂ断片を上記の
ごとく、Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＳ　Ｖ
　２　ｇｐｔ（Ｅ−）とライゲートさせ、大腸菌細胞に
導入した。プラスミドを単離したのち、正しい制限地図
を有するプラスミドをプラスミドｐＧＣＥ〜４Ｋ（Ｅ−
）と命名した。

同様に、プラスミドｐＨＧＣＥ−３０（実施例１Ｏで構
築）約４０μＱ（５μｇ）を水３μＬ　Ｇｉｂｃ。

反応バッファー＃ｌ（５μの、制限酵素ＣＩａｍ）μジ
と混合した。３７°Ｃで５時間経過したのち、反応、昆
合物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノ−ル沈
澱に付した。次いで、消化したＤＮＡを水２６μＣに再
懸濁し、Ｇｉｂｃｏ反応バッファー＃３　（３μｅ）お
よび、制限酵素ＢａｍＨＩｌμａとａ合した。３７℃で
２分間経過後、反応混合物Ｌ５ａ（ｌをとり、２５０μ
Ｍ　　ＥＤＴＡ　　Ｉμｆ２と混合した。３７°Ｃで５
分間経過後、反応混合物の残余１５μＱをとり、２５０
μＭ　ＥＤＴＡ　　ｌμＱと混合した。このＢａｍＨ１
部分消化により、すべての可能なＣ１ａｌ／Ｂａ１ＨＩ
制限断片が得られた。

０．５％ＴＢＥゲル電気泳動にかけ、約１２．７ｋｂＣ
１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限断片をＤＥＡＥ３１ペーパーか
ら精製した。この制限断片は、ネズミ可変、ヒト不変ガ
ンマをコードしている遺伝子を含有している。次いで、
ＣＩａＩ／ＢａｍＨＩ制限断片をＤＥＡＥ８１ペーパー
から精製した。次いで、約１２．７ｋｂ　Ｃ１ａｌ／Ｂ
ａａＨＩ（部分）制限断片をＣ１ａ１／ＢａｍＨ夏消化
プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ　−）とライゲート
させ、大腸菌細胞に導入した。再度、単離し、制限部位
のマツピングを行い、適正な制限地図を有するプラスミ
ドをプラスミドｐＧＣＥＭＧ（Ｅ−）と命名した。

Ｄ、プラスミドｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）およびｐＮＣＥＭ
ＧＩ（Ｅ−）の構築 実質上、実施例５Ｃ記載の方法に従い、ブラスミ　ドｐ
Ｓ　Ｖ　２ｎｅｏ（Ｅ−）ＤＮＡ　　約１０μ９（１０
０μｅ）を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨＩで消化し
、ベクター断片を単離し、精製した。次いで、ネズミ可
変、ヒト不変カッパをコードしている遺伝子を含有する
プラスミドｐＨＫＣＥ−１０（実施例５Ｃで単離）の約
９．０ｋｂ　Ｃ１ａＩ／ＢａｍＨＩ制限断片を、実質上
、実施例５Ｃ記載の方法に従い、プラスミドｐＳ　Ｖ　
２　ｎｅｏ（Ｅ−）のＣＩａＩ／ＢａｍＨＩ消化ベクタ
ー断片にライゲートさせ、プラスミドｐＮＣＥＭＫ（Ｅ
−）を構築した。また、実施例５Ｃの記載に従い、プラ
スミドｐＨＧＣＥ−３０の約１２．７ｋｂ　Ｃ１ａｌ／
ＢａｍＨＩ（部分）制限断片をプラスミドｐＳ　Ｖ　２
　ｎｅｏ（Ｅ　　）のＣ１ａｌ／ＢａｍＨＩ消化ベクタ
ー断片にライゲートすることによりプラスミドｐＮＣＥ
ＭＧ１（Ｅ−−）を構築した。したがってプラスミドｐ
ＮＣＥＭＧ　１（Ｅ−）はネズミ可変、ヒト不変ガンマ
をコードする遺伝子をＳＶ４０エンハンサー不含発現ベ
クター上に含有するものである。

実施例６　　ＳＶ４０エンハンサー不含全不含発現ベク
ターキメラ軽鎖および重鎖遺伝子のトランスフェクショ
ン 実質上、実施例３Ａ記載の方法に従い、５ｖ４０工ンハ
ンサー不含発現ベクター類（ｐＧ　ＣＥ　Ｍ　Ｋ（Ｅ−
）、ｐＧＣＥＭＧ（Ｅ−）、ｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）およ
びｐＮＣＥＭＧ１（Ｅ−　　）を用い、電気穿孔法でＳ
　Ｐ　２１０ハイブリドーマ細胞をトランスフェクトし
た。各プラスミドを単独で、あるいは同時に細胞にトラ
ンスフェクトしてよいが、カンパ鎖とｇｐｔマーカーと
を含有するベクターで細胞をまずトランスフェクトし、
次いでガンマ鎖とｎｅｏマーカーとを含有するベクター
で第２のトランスフェクションを行うと、最良の結果が
得られる。ＦＣ８５％を含有するＨＨ２または任意の市
販の培地を用いて培養したのち、適当な抗生物質（ｇｐ
ｔベクター含有細胞についてはＨＭＡＸＳｎｅｏベクタ
ー含有細胞についてはＧ４１８）を用いて選択し、実質
上、実施例３記載の方法に従い、細胞をカッパ鎖分泌に
関して分析した。これらの分析結果を表１に示す。

表−↓　ＳＶ４０エンハンサーを含有する、または含有
しないクローン（宿主：５Ｐ２１０）における平均のカ
ッパ鎖産生レベル プラスミド　　　　μｙ／１０’細胞 ｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）　　　　　２０ ｐＧＣＥＭＫ　　　　　　　　１０ ｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）　　　　　　５ ｐＮＣＥＭＫ　　　　　　　　　２ 最も高レベルに全キメラ抗−ＣＥＡ抗体を産生ずるトラ
ンスフェクシント・セルラインを証明するための分析を
も行った。これらの分析は、実質上、実施例４記載の方
法に従って行われた。結果を表２に示す。

表　２　ＳＶ４０エンハンサーを含Ｈするおよび含有し
ないクローン（宿主：　Ｓ　Ｐ　２１０）における平均
のヒトＩｇＧ産生レベル プラスミド ｐＮＣＥＭＫおよびｐＧｃＥＭＧｌ ｐＧＣＥＭＫおよびｐＮＣＥＭＧｌ ｐＮＣＥＭＫおよびｐＧＣＥＭＧ（Ｅ−）ｐＧＣＥＭＫ
およびｐＮＣＥＭＧ１（Ｅ−−）ｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）
およびｐＧｃＥＭＧｌｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）およびｐＮ
ＣＥＭＧｌｐＮｃＥＭＫ（Ｅ−）およびｐＧＣＥＭＧ（
Ｅ−）ｐＧＣＥＭＫ（Ｅ　−）およびｐＮＣＥＭＧ１（
Ｅ−−）μ９／ｉｏ”細胞 １．８ ２．０ ０．８ １．７ ２．８ ４．２ ２．５ ３．９ 実掩例７ ヘテロローガスな免疫グロブリン鎖の発現のための高レ
ベル発現システムの構築 Ａ、プラスミドｐｉ　９ＨＡＮＣＨの構築まず、式： ％式％ で示されるＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドポリ
リンカーを製造することにより、中間体プラスミドｐｉ
　９ＨＡＮＣＨを構築した。上記のリンカ−は、当業者
周知の方法で１本鎖デオキシオリゴヌクレオチドから合
成された。１本鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、バイ
オサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７００　ＤＮＡ６成
装置ＥＢ　１ｏｓｅａｒｃｈ社供給、Ｓａｎ　Ｒａｐｈ
ａｅｌ　ＣＡコのような、ホスホラミダイトの化学を利
用する市販の装置を用いて合成することができる。ＤＮ
Ａ合成の他の方法も当業者には既知である。１本鎖ＤＮ
Ａ合成のための、伝統的な改良ホスホトリエステル法は
、イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ）、サイエンス（Ｓ　ｃ
ｉｅｎｃｅ）、１９８：１０５６（１９７７）およびフ
レアら（Ｃｒｅａ）、プロシーディングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、７５：５
７６５（１９７８）により示された。加えて、特に好ま
しいＤＮＡ合成法は、ヒスイングら（Ｈｓｉｕｎｇ）、
ニュークレイツク・アノンズ・リサーチ、１１：３２２
７（１９８３）およびナラシら（Ｎｒａｎｇ）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８：９０（１９８０）によ
り開示された。約２，５μ９の２つのオリゴヌクレオチ
ド鎖を２×ア二一リノグバソフ７　　　（０，２Ｍ　Ｎ
ａＣＱ、２ＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，８）　
、および２ｍＭＥＤＴＡ）５０μｅおよび水５０μジと
混合した。反応混合物を７０℃で５分間加熱したのち、
２本の一本鎖がアニールして一本のリンカ−セグメント
となるよう、室温まで徐々に放冷する。プラスミドｐＵ
Ｃ１９（二ニー・イングランド・バイオラボ）約１μ９
を、実質上、既述の方法に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。約２．６ｋｂのベクタ
ー断片を精製したのち、Ｅ　ｃｏＲＩ　／Ｈ１ｎｄｌｌ
ｌ消化プラスミドｐＵｃ１９に合成ポリリンカーをライ
デートさせた。大腸菌を形質転換し、再度、プラスミド
を単離し、リンカ−領域内に適切な１（＋ｎｄｌ、５ｓ
ｐｌ、Ｐｓｔｌ、５ｓｔＵおよびＥｃｏＲＩ部位を有す
るプラスミドをプラスミドｐｉ　９ＨＡＮと命名した。

プラスミド５（−）ＣＨＡＶＬを構築するにあたり、最
初にＢ　ＩｕｅｓｃｒｉｐＬベクター、Ｍ　１３　（−
）ＳＫ（ストラッタジーン）を制限酵素ＢａｍＨＩおよ
び５ｓｔｌで消化し、実質上、既述の方法に従い、大き
いベクター断片を単離した。次いで、プラスミドｐＭＬ
ＣＨ−１を制限酵素ＢａｍＨｌおよび５ｓｔｌで消化し
、ネズミｃＨＡ可変領域をコードしている遺伝子を含有
する約１１００ｂｐ断片を単離した。

プラスミドｐＭＬＣＨ−１は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ＋　　ｌ　８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ　　５ｔｒｅｅｔ、　　Ｐｅｏｒｉａ、　　Ｉ　Ｌ　
　６１６０４に１９８８年１１月１４日、寄託されその
永久保ａカル千ヤーフレクンヨンの一部を構成する大腸
ｍＫ１２　ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬｃＨ−１から好都合に単
離することができる。大腸菌に１２　　ＨＢＩｏ　１／
ｐＭＬＣＨ−１は受託番号ＮＲＲＬＢ−１８４３２の下
で入手可能である。プラスミドｐＭＬＣＨ−１の約１１
００ｂｐ　ＢａｍＨＩ／５ｓｔｌ制限断片をＢａｍ１（
Ｉ　／　Ｓ　ｓｔ　Ｉ消化ベクター断片３（−）ＳＫと
ライゲートさせ、得られたプラスミドで実質上、上の実
施例記載の方法に従い、大腸菌を形質転換した。再単離
および制限マツピングの後、適正な約１１００ｂｐのＢ
ａａ＋）ＩＩ／５ｓｔｌ断片を含有するプラスミドをプ
ラスミド５（−）ＣＨＡＶＬと命名した。実質上、既述
の方法に従い、プラスミド５（−）ＣＨＡＶＬ約１μ９
を制限酵素Ｐｓｔｌで消化した。ネズミＣＩＡ可変領域
を含有する約９００ｂｐＰｓｔｒ制限断片を単離し、制
限酵素Ｐｓｔｒでポリリンカー領域に切断を施しておい
たプラスミドｐ１９ＨＡＮとライゲートさせた。形質転
換、再単離および制限マツピングにより、ポリリンカー
のＨｉｎｄＩ［［部位と最も近接してＣＨＡ遺伝子のＪ
領域を含有しているプラスミドをプラスミドｐｉ　９Ｈ
ＡＮＣＨと命名した。プラスミドｐ１９ＨＡＮＣＨの構
築模式図を第５図に示す。

Ｂ１発現ベクターｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　−２およびｐＧＣ
ＨＡＫ−３の構築 実質上、既述の方法に従い、プラスミドｐＧＣＥＭＫ（
実施例１で構築）約５μ９を制限酵素Ｃ１ａｒおよびＳ
　ｓｐ　Ｉで消化し、ＯＥＭカッパプロモーターを含有
する約２．２ｋｂ　Ｃ１ａｌ／５ｓｐｌ制限断片を精製
した。この約２．２ｋｂ　Ｃ１ａｒ／５ｓｐｌ制限断片
はＣＥＭカッパプロモーターを含有する。ＯＥＭカッパ
プロモーター領域のＤＮＡ配列を以下に示す。

ＣＣＭ ＴＡＧＡＣＴｒＧＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＡＴ
ＧＡＣＴＡｍＴＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴｒＴＡＴＡＡＡ
ＣＣＡＴＧＴ ＣＴｒＴＧＣＡＧＴＡＧＡ丁ＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡτＣ
ＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡτＣＡＡＧ別の反応で
、プラスミドｐＧＣＥＭＫを制限酵素Ｃ１ａＩおよび５
ｓｔＩＩで消化し、約９．４ｋｂベクタ一断片を単離し
た。さらに、プラスミドｐ１９ＨＡＮＣＨを制限酵素Ｓ
ｓｐ！および５ｓｔＩＩで消化し、ネズミカッパＣＩＡ
可変領域をコードする遺伝子を含有している約９３１ｂ
ｐ制限断片を単離した。３成分ライゲーンシコン反応に
より、プラスミドｐＧＣＥＭＫの約９．４ｋｂ　Ｃ１ａ
Ｔ／５ｓｔＵベクタ一断片、プラスミドｐＧＣＥＭＫの
ＣＥＭプロモーター含有約２．２ｋｂ　Ｃ１ａｌ／５ｓ
ｐＩ制限断片、およびネズミカッパＣＨＡ可変領域をコ
ードする遺伝子を含有しているプラスミドｐ１９ＨＡＮ
ＣＨの約９３１ｂｐ　５ｓｐｌ　／５ｓｔｌＩ制限断片
のすべてを一緒に、同時にライゲートさせ、実質上、既
述の方法に従い、大腸菌を形質転換した。プラスミドを
単離し、制限マツピングに付した後、制限断片のサイズ
が適切であるプラスミドをプラスミドｐＧｃＨＡＫ−２
と命名した。

同様の方法でプラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）（実施例
５Ｃで構築）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｔＩＩで消
化し、約９．２ｋｂ制限断片（ＳＶ４０、エンハンサー
不含）を単離した。次いで、この断片をプラスミドｐＧ
ＣＥＭＫのＣＥＭカッパプロモーターを含有する約２．
２ｋｂ　Ｃ１ａｌ／５ｓｐｒ制限断片わよびプラスミド
ｐｉ　９ＨＡＮＣＨの約９３１ｂｐＳｓｐｌ／５ｓＬＩ
Ｉ制限断片とライゲートさせ、プラスミドｐＧｃＨＡＫ
−３を構築した。プラスミドｐＧＣＨＡＫ−３とプラス
ミドｐＧＣＨＡＫ−２とは、プラスミドｐＧＣＨＡＫ−
３がＳＶ４０エンハンサーを欠如している点でのみ異な
る。プラスミドｐＧＣＨＡＫ−３の制限部位および機能
地図を第６図に示す。

Ｃ，プラスミドｐＮｃＨＡＧＩの構築 プラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＬＡは、重金属結合モノ
クローナル抗体ＣＨＡ２５５．５のネズミ可変領域をコ
ードする遺伝子を含有している。プラスミドｐＵＣＶＨ
Ｉｎｃ−］　ＡはＮＲＲＬのパーマネント・ストック・
カルチャー・コレクションの一部として１９８８年１１
月１４日に寄託されており、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１８４３３の下で人手可能な大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　１
０１／ｐＵＣＶＨｒｎｃ−ＩＡから通常の方法で単離で
きる。プラスミドｐＨＧＩＺはヒトガンマ遺伝子を含有
しており、ＡＴＣＣから、受託番号ＡＴＣＣ６７６３８
の下で入手可能である。プラスミドｐＵＣＶＨｒｎｃ　
　ＩＡ約１μ９を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［で消化し、約
３．４ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ制限断片を単離した。

プラスミドｐＨＧＩＺ約１μ７を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌで消化し、当業者周知の方法で細菌のアルカリホスフ
ァターゼで処理した。次いで、プラスミドｐＵＣＶＨ１
ｎｃ−ＩＡの約３．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌＩＩ制限断片
を、Ｈｉｎｄ［Ｉ消化し、ホスファターゼ処理したプラ
スミドｐＨＧ　Ｉ　Ｚの断片とライゲートし、プラスミ
ドｐＨＧｌ−ＣＨＡを溝築した。

プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−Ｃｌａ（実施例１
で構築）を制限酵素ＣｈｉおよびＢａｍＨＩで消化し、
約５０ｋｂ　Ｃ１ａｌ／　ＢａｍＨＩ制限断片を単離し
た。同様の方法で、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＩＡを制限
酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍ１（Ｉで消化し、約１０．５
ｋｂの制限断片を単離した。プラスミドｐＳ　Ｖ　２　
ｎｅ。

−Ｃ１ａの約５．０ｋｂ　Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限断
片をプラスミドｐＨ０ｌ−ＣＨＡの約１０．５ｋｂｃ＋
ａ１／ＢａｍＨＩ制限断片とライゲートさせ、プラスミ
ドｐＮｃＨＡＧｌを構築した。プラスミドｐＵＣＶＨＩ
ｎｃ−ＩＡ、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡおよびプラス
ミドｐＮｃＨＡＧ１の制限部位および機能地図を第７図
に示す。

Ｄ、プラスミドｐＧＣ，ＨＡＫおよびｐＧＣＨＡＫ（Ｅ
−）の溝築 プラスミドｐＭＬＣＨ−１（実施例７Ａ記載）約１μ７
を制限酵素Ｂａ１Ｈ［で３分間消化した。エタノール沈
、殿ののち、４種頌の５ｍＭデオキ７リホヌクレオチド
（ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ）　　１０
μａ、フレノウ酵素２単位および１０Ｘバッフｙ−（０
，５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７゜５）、Ｏ，Ｌ
Ｍ　ＭｇＣＧ、およびｌｏａ＋ＭＤＴＴ）５μＱを加え
、全反応容量５０μρ中で平滑末端化した。３７℃で３
０分間経過後、フェ／−ル、クロロホルム抽出によって
反応を止め、ＤＮＡを自己ライゲートさせ、大腸菌細胞
を形質転換した。

構造遺伝子の５′側にあるＢａａ８１部位の欠失を示す
プラスミドをプラスミドｐＭＬｃＨ１ｄＢｌｉ名した。

プラスミドｐＭＬＣＨ−１およびｐＭ　Ｌ　ＣＨｌｌｄ
Ｂの制限部位および機能地図を第８図に示す。

次いで、プラスミドｐＭＬｃＨ１ｄＢを制限酵素Ｂａ１
ＨＩおよびＨｉｎｄｕで消化し、約５．７５ｋｂのＣＨ
Ａラムダ遺伝子領域を単離した。この断片をＨｉｎｄ［
Ｉ／　Ｂ　ａｍＨＩ　ｉ肖化プラスミドｐＢＲ３２２１
こうイゲートさせてプラスミドｐＭＬＣＨ２を構築した
。次いで、プラスミドｐＭ　Ｌ　ＣＨ２を制限酵素Ｃｏ
ａｌおよびＢａＩＩＩＨＩで消化し、約５．７５ｋｂ制
限断片を単離し、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−
ＣＩａ（実施例１で構築）の約４．６ｋｂ　Ｃ１ａｌ／
ＢａｍＨＩ消化ベクター断片にライゲートしてプラスミ
ドｐＧＣＨＡを構築した。

プラスミドｐＧＣＨＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、
約１１．２ｋｂの制限断片を単離した。プラスミド、）
ＨＫＦＩ（ＡＴＣＣから受託番号６７６３７の下で入手
可能）を制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩで消化し、フレノウで
充填し、りん酸化ＢａｍＨＩリンカ−（ＮＥＢ）を加え
、ベクターをＢａｍＨＩで切断し、約５．２ｋｂの制限
断片を単離した。このプラスミドｐＨＫＦＩの５．２ｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＧＣＨＡＫの約１１
．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片とライゲートさせ、ヒトガン
マ領域をコードする遺伝子と結合した、不ズミラムダＣ
ＨＡ可￥領域をコードする遺伝子を含有しているプラス
ミドｐｃ　ＣＨＡＫを構築した。プラスミドｐｃ　ＣＨ
Ａ　Ｋの制限部位および機能地図を第８図に示す。

プラスミドｐＧＣＨＡＫ（Ｅ　　）は、プラスミドｐｓ
Ｖ２ｇｐｔ−Ｃ１ａ（Ｅ−Ｘ実施例５Ｃで構築）を用い
る外は実質上、プラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）の構築
方法に準じて構築された。

実施例８　　ＯＥＭプロモーターを使用した、ヘテロロ
ーガスなＣＨＡ抗体の発現 実質上、実施例３記載の方法に従い、様々なＣＩ−（Ａ
構菓物で５Ｐ２１０細胞をトランスフェクトし、実買上
、実施例４記載の方法に従い、抗体特異性および親和性
を測定した。ＨＭ　Ａ　Ｘを選択に用いるプラスミドｐ
Ｇ　Ｃ８７〜Ｋによる最初のトランスフェクション、お
よびＨＭＡＸ、：ＧＧ４１８の雨音を選択に用いるプラ
スミドｐＮｃＨＡＧｌによる第２トランスフエク／ヨン
の結果、上清に低しヘルのキメラＣＨＡ抗体が分泌され
た。プラスミドρＧ　ＣＨ、〜に２による初期トランス
フエフ／３ンの後、プラスミドｐＮｃＨＡＧｌでトラン
スフエクトすることにより、高レベルの抗体産生が認め
られた。このデータはプラスミドｐＧＣＥＭＫから単離
されたプロモーターはヘテロローガスな免疫グロブリン
を高レベルに発現させるのに有用であるということを示
している。さらに、ｐＧＣＨＡＫ−３によるトランスフ
ェクションの結果、ｐＧＣＨＡＫによるトランスフェク
ションの１０倍高いレベルでカッパが発現された。した
がって、プラスミドｐＧＣＥＭＫ由来のＣＥＭＫプロモ
ーターは、最初に用いる発現ベクターがＳＶ４０、エン
ハンサーを含有しない場合、最もよくヘテロローガスな
免疫グロブリン配列を発現′させることができる。

組換え２機能性キメラ抗体の発現に関する本発明の実施
態様は、同日出願の米国特許出願第０７／２７４，１０
５［ジョンソン（Ｍ、　Ｊ　、　Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）お
よびフエルプス（Ｊ　、　Ｌ、　Ｐｈｅｌｐｓ）、２機
能性キメラ抗体（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈｉｍ
ｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｅｉｅｓ）］を参照されたい
。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＬＣＥ　　ＩＱおよびプラスミ
ドｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図、第２図はプ
ラスミドｐＨＫＣＥ−１０およびプラスミドｐＧＣＥＭ
Ｋの制限部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＭ
ＨＣＥ−３０およびプラスミドｐＨＧＩＺの制限部位お
よび機能地図、第４図はプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０
およびプラスミドｐＮＣＥＭＧｌの制限部位および機能
地図、第５図はプラスミドｐｉ　９ＨＡＮＣＨの構築模
式図、第６図はプラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　−３の制
限部位および機能地図、第７図はプラスミドｐＵＣＶＨ
Ｉｎｃ−ＩＡ、ｐＨＧ１−ＣＨＡおよびｐＮＣＨＡＧＩ
の制限部位および機能地図、第８図はプラスミドｐＭＬ
ＣＨ−１およびｐＧ　ＣＨＡ　Ｋの制限部位および機能
地図である。 特許出願人　ハイプリチック・インコーポレイテッド代
理人弁理士青山　葆（外２名） ）＋− 」 手続補正書 Ｉる戎 １年持許願第 ５７６７３号 発明の名称 ヒ１−がん胎児性抗原に対するキメラ抗体３、補正をす
る者 事件との関係　特許８願人 乙ｌａｐ ハイブリチック・インコーポレイテノド４、代理人 住所　〒５４０ 大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号６、補正の対
象二図面の全図 ｐＭＬＣＥ・１０ ２．８ ＨＫＦ−１ 手続補正書 平成 １年特許願第 ５７６７３号 ２゜ 発明の名称 ヒトがん胎児性抗原に対するキメラ抗体３゜ 補正をする者 事件との関係 特許畠願人 名称 ハイブリチック・インコーボレイテ７・ド４、代理人 住所　〒５４０ 大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号６゜ 補正の対象 二図面の全図 ｐＨＫＣＥ−１０ Ｆ’／Ｌｌｌ　　（、！ｒ＄１人Ｉｃｒ）ｐＧＣεＭＫ 第３図 ρＭＨＣＥ、３０ ＨＧ１ｚ 第５図 第４図 ρＮＣＥＭＧ１ 第６図 ρＧＣＨＡＫ−３ 第７図 ｐＬＩｃＶＨｌｎｃ−１＾ ｐＮｃＨＡＧ＋ 第８図 ＭＬＣＨ１ ＧＣＨＡＫ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、キメラモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコード
   している第１ＤＮＡ配列であって、式：【アミノ酸配列
   があります】 で示されるアミノ酸配列と実質上同一のアミノ酸配列を
   コードしている第１ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物
   。 ２、第１ＤＮＡ鎖暗号配列が、実質上、式：【アミノ酸
   配列があります】 で示されるＤＮＡ配列と同一である請求項１記載のＤＮ
   Ａ構築物。 ３、第１ＤＮＡ鎖暗号配列が真核性リーダーペプチドを
   コードするＤＮＡ配列をも含有しているものである請求
   項１または２記載のＤＮＡ構築物。 ４、キメラモノクローナル抗体の軽鎖不変領域をコード
   している第２ＤＮＡ鎖配列をも含有する請求項１、２ま
   たは３記載のＤＮＡ構築物。 ５、リーダーペプチドをコードするＤＮＡ鎖配列が、実
   質上、式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるものである請求項３記載のＤＮＡ構築物。 ６、キメラモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコード
   している第１ＤＮＡ配列であって、式：【アミノ酸配列
   があります】 で示されるアミノ酸配列と実質上同一のアミノ酸配列を
   コードしている第１ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物
   。 ７、第１ＤＮＡ鎖暗号配列が、実質上、式：【アミノ酸
   配列があります】 で示されるＤＮＡ配列と同一である請求項６記載のＤＮ
   Ａ構築物。 ８、キメラモノクローナル抗体の重鎖不変領域をコード
   している第２ＤＮＡ鎖配列をも含有する請求項６または
   ７記載のＤＮＡ構築物。 ９、第１ＤＮＡ鎖暗号配列が真核性リーダーペプチドを
   コードするＤＮＡ配列をも含有しているものである請求
   項６記載のＤＮＡ構築物。 １０、リーダーペプチドをコードするＤＮＡ鎖配列が、
   実質上、式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるものである請求項９記載のＤＮＡ構築物。 １１、第１ＤＮＡ鎖暗号配列がネズミハイブリドーマか
   ら導かれたものである請求項１〜１０のいずれかに記載
   のＤＮＡ構築物。 １２、ネズミハイブリドーマがＣＥＭ２３１．６．７で
   ある請求項１１記載のＤＮＡ構築物。 １３、第２ＤＮＡ鎖暗号配列がヒトリンパ細胞から導か
   れたものである請求項４または８に記載のＤＮＡ構築物
   。 １４、キメラ抗体の軽鎖をコードしている請求項１〜５
   項のいずれかに記載のＤＮＡ構築物と、軽鎖をコードす
   るＤＮＡ配列に対して、軽鎖の発現を指令する関係をも
   って位置する転写および翻訳用ＤＮＡ配列とを含有して
   いる、キメラモノクローナル抗体を発現し得る真核性宿
   主細胞。 １５、第２ＤＮＡ構築物が、または第１ＤＮＡ構築物が
   さらに、キメラ抗体の重鎖をコードする請求項６〜１０
   のいずれかに記載の構築物と、重鎖をコードするＤＮＡ
   配列に対して、重鎖の発現を指令する関係をもって位置
   する転写および翻訳用ＤＮＡ配列とを含有している、請
   求項１４記載の真核性宿主細胞。 １６、実質上、式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
   軽鎖可変領域を含有するキメラモノクローナル抗体。 １７実質上、式： 【アミノ酸配列があります】 で示されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する
   重鎖可変領域を含有するキメラモノクローナル抗体。 １８、請求項１６記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変
   領域と、請求項１７記載のアミノ酸配列を有する重鎖可
   変領域とを含有するキメラモノクローナル抗体。 １９、鎖の可変領域がネズミハイブリドーマから導かれ
   たものである請求項１６、１７または１８記載のキメラ
   モノクローナル抗体。 ２０、ネズミハイブリドーマがＣＥＭ２３１．６．７．
   である請求項１９記載のキメラモノクローナル抗体。 ２１、抗体の不変領域がヒトリンパ細胞から導かれたも
   のである請求項１６〜２０のいずれかに記載のキメラモ
   ノクローナル抗体。 ２２、抗体がＸＣＥＭ４４９である請求項１６〜２１の
   いずれかに記載のキメラモノクローナル抗体。 ２３、第１図記載のプラスミドｐＭＬＣＥ−１０または
   第２図記載のプラスミドｐＨＫＣＥ−１０である請求項
   １または２記載のＤＮＡ構築物。 ２４、第２図記載のプラスミドｐＧＣＥＭＫである請求
   項４記載のＤＮＡ構築物。 ２５、第３図記載のプラスミドｐＭＨＣＥ−３０または
   第４図記載のプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０である請求
   項６記載のＤＮＡ構築物。 ２６、第４図記載のプラスミドｐＮＣＥＭＧ１である請
   求項１０記載のＤＮＡ構築物。 ２７、トランスフェクトされた細胞内でのキメラ抗体の
   発現を増加させる方法であって、ａ）ＳＶ−４０ベクタ
   ーを基に、免疫グロブリン鎖をコードする１またはそれ
   以上の遺伝子を含有しているが、ＳＶ−４０エンハンサ
   ーを含有していない組換えＤＮＡ発現ベクター構築し、 ｂ）該ベクターで哺乳類宿主細胞をトランスフェクトし
   、 ｃ）該宿主細胞を、該免疫グロブリン遺伝子の発現に適
   した条件下で培養する工程からなる方法。 ２８、エンハンサーを含有しないベクターが、実施例５
   Ｃ記載のプラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）、実施例５Ｄ
   記載のプラスミドｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）、実施例５Ｃ記
   載のプラスミドｐＧＣＥＭＧ１（Ｅ−）、または実施例
   ５Ｄ記載のプラスミドｐＮＣＥＭＧ１（Ｅ−）である請
   求項２７記載の方法。 ２９、プラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）、プラスミドｐ
   ＮＣＥＭＫ（Ｅ−）、プラスミドｐＧＣＥＭＧ１（Ｅ−
   ）、またはプラスミドｐＮＣＥＭＧ１（Ｅ−）。 ３０、プラスミドｐＧＣＥＭＫの約２．２ｋｂＣｌａＩ
   ／ＳｓｐＩＣＥＭカッパプロモーター含有制限断片。 ３１、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＣＥＭカッパプロモー
   ター。 ３２、ヌクレオチド配列が、式： 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を含有するものである請求項３１記載の
   ＣＥＭカッパプロモーター。