KR20000064714A - 지정스위치-매개dna뵌재조합 - Google Patents
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Abstract
면역글로불린 (Ig) 유전자에서 유래한 스위치 영역은 (1) 프로모터 및 스위치 영역 (S1)을 포함하는 표적화 제작물, 및 (2) 프로모터, 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열을 최소한 포함하는 표적 유전자좌 (target locus) 사이의 재조합을 지정하는데 사용된다.
Description
척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 (Ig)의 구조적 단위는 동일한 폴리펩티드 경쇄 (약 23 kDa) 두 개 및 동일한 중쇄 (약 53 내지 70 kDa) 두 개로 이루어져 있다. 네 개의 쇄는 이황화 결합을 통해 Y자 입체 구조로 결합되어 있으며, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 B 세포 하이브리도마 또는 다른 세포 유형에 의해 생성되었을 때 공유결합성 이황화 결합에 의해 결합되어 있다.
일반적인 항체 구조의 개략도는 도 1에 도시되어 있다. 경쇄 및 중쇄는 각각 N 말단의 가변영역 및 C 말단의 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄에서 가변 영역 ("VLJL"로 명명)은 불변 영역 (CL)에 결합 영역 (JL)을 통해 연결되어 있는 가변 영역 (VL)으로 이루어진다. 중쇄에서 가변 영역 ("VHDHJH"로 명명)은 불변 영역 (CH)에 다양성 영역 (diversity region; DH) 및 결합 영역 (JH)의 조합을 통해 연결된 가변 영역 (VH)으로 이루어진다. 경쇄 및 중쇄 각각의 VLJL및 VHDHJH영역이 Y자의 첨단에서 연합하여 항체의 항원 결합 부위를 형성하고 항원 결합 특이성을 결정한다.
CH영역은 항체의 이소타입 즉, 그의 클래스 또는 서브클래스를 정의한다. 상이한 이소타입의 항체는 보체를 활성화시키는 능력과 광범위한 세포 유형, 교차 점막벽 및 태반벽에 존재하는 특이적 수용체 (예를 들면, Fc 수용체)에 대한 결합, 및 기본 4쇄 IgG 분자의 중합체 형성 등의 이들 작용인자 (effector) 기능에 있어서 상당히 다르다.
항체는 면역글로불린 (IgM, IgG, IgD, IgE 또는 IgA)에 이용되는 CH유형에 따라서 "클래스"로 분류된다. CH유전자는 적어도 5 가지 유형이 있고 (Cμ, Cγ, Cδ, Cε 및 Cα), (사람을 비롯한) 일부 종은 다수의 CH아형 (예를 들면, 사람에게는 Cγ1, Cγ2, Cγ3및 Cγ4)을 갖는다. 사람의 반수체 게놈에는 총 9 개의 CH유전자가 있고, 생쥐 및 쥐는 8개, 많은 다른 종에게는 그 보다 더 적은 수가 존재한다. 반대로, 경쇄 불변 영역 (CL)은 일반적으로 두 가지 유형, 카파 (κ) 및 람다 (λ)이 있을 뿐이며, 이들 불변 영역 중 하나만이 단일 경쇄 단백질에 존재한다 (즉, 생산된 모든 VLJL에 대한 가능한 경쇄 불변 영역은 오직 하나이다). 특정 클래스 내의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 항원 특이성을 변화시키는 것은 아니지만 (예를 들면, IgG 항체는 항상 항체의 항원 특이성과 무관하게 Cγ 중쇄 불변 영역을 갖는다), 각각의 중쇄 클래스는 경쇄 클래스 중 하나와 연합할 수 있다 (예를 들면, CHγ 영역이 κ 또는 λ 경쇄로서 동일한 항체에 존재할 수 있다)
중쇄 및 경쇄의 V, D, J 및 C 영역 각각은 다른 게놈 서열에 의해 코딩된다. 항체 다양성은 중쇄의 상이한 VH, DH및 JH유전자 구획 및 경쇄의 상이한 VL및 JL유전자 구획 사이의 재조합에 의해 발생한다. 다른 VH, DH및 JH유전자의 재조합은 B 세포 분화시에 DNA 재조합에 의해 이루어진다. 간단하게 말하자면, 중쇄 서열은 우선 DHJH복합체를 형성하도록 재조합된 후, 두번째 재조합이 일어나 VHDHJH복합체가 생성된다. 기능적 중쇄는 전사된 후, RNA 전사체 (transcript)가 스플라이싱되어 생성된다. 기능적 중쇄의 생성으로, 경쇄 서열의 재조합이 촉발되어 재배열된 VLJL영역이 생기고, 이것이 기능적 VLJLCL영역, 즉 기능적 경쇄를 형성한다.
B 세포 분화 과정에서, 단일 B 세포의 자손은 가변 영역에 의해 결정된 항원 특이성을 변화시키지 않으면서, IgM 내지 IgG의 발현된 면역글로불린 이소타입 또는 다른 클래스의 면역글로불린을 스위칭할 수 있다. 면역글로불린 클래스-스위칭으로 알려져 있는 이 현상은 각 CH유전자 (Cγ은 제외)의 5' 말단에 위치한 스위치 (S)영역들 사이에서 일어나는 DNA 재배열에 의해 이뤄진다 (Honjo (1983) Annu. Rev. Immunol. 1:499-528, 및 Shimizu & Honjo (1984) Cell 36: 801-803). S-S 재조합은 동일한 염색체 상에 위치하는 개재된 CH유전자의 결실에 의해 발현되는 CH유전자에 인접한 VHDHJH엑손을 발생시킨다. 클래스-스위칭 메커니즘은 사이토킨에 의해 유도된다 (Mills 등, (1995) J. Immunol. 155:3021-3036). 스위치 영역은 크기가 1 kb (Sε) 내지 10 kb (Sγ1)로 다양하며, 길이 및 서열 모두가 다른 직렬 반복부 (tandem repeat)들로 이루어진다 (Gritzmacher (1989) Crit. Rev. Immunol. 9: 173-200). 각종 스위치 영역은 쥐의 Sμ, Sε, Sα, Sγ3, Sγ1, Sγ2b 및 Sγ2a 스위치 영역 및 사람 Sμ 스위치 영역을 비롯한 각종 스위치 영역이 분석되어 있다 (Mills 등 (1995) 위의 책, Nikaido 등 (1981) Nature 292: 845-8; Marcu 등 (1982) Nature 298: 87-89; Takahashi 등 (1982) Cell 29: 671-9; Mills 등 (1990) Nucleic Acids Res. 18 : 7305-16; Nikaido 등 (1982) J. Biol. Chem. 257 : 7322-29; Stanton 등 (1982) Nucleic Acids Res. 10 : 5993-6006, Gritzmacher (1989) 위의 책; Davis 등 (1980) Science 209: 1360; Obata 등 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2437-41; Kataoka 등 (1981) Cell 23: 357; Mowatt 등 (1986) J. Immunol. 136: 2674-83; Szurek 등 (1985) J. Immunol. 135: 620-6; 및 Wu 등 (1984) EMBO J. 3 : 2033-40).
단일 B 세포가 그의 표면에 동시에 하나 이상의 이소타입을 발현할 수 있다는 사실은 클래스-스위칭 메카니즘에 의해 설명되지 않는데, 왜냐하면 S-S 재조합은 염색체내의 재조합으로 제한되어 교환된 CH유전자의 결실을 일으키기 때문이다. 두번째 메카니즘은 소위 트랜스-스플라이싱으로서, 상이한 염색체로부터 발생된 두 개의 전사체가 결합되어 하나의 연속 전사체를 형성하는 것으로 설명된 바 있다 (Shimizu 등 (1991) J. Exp. Med. 173: 1385-1393). 생쥐의 IgH 유전자좌 외부에 통합된, 재배열된 발현가능한 VHDHJH중쇄 μ 유전자를 보유한 형질전환 생쥐는, 내인성 CH영역으로 정확하게 스플라이싱되는 트랜스유전자의 VHDHJH영역을 갖는 mRNA를 생성하는 것으로 발견되었다. S-S 재조합으로 인해, 트랜스-스플라이싱의 빈도는 낮은데, 두 메카니즘을 조절하는 인자는 잘 밝혀져 있지 않다.
진단제 또는 치료제로서 항체의 가치 및 잠재력은 당업계에서 오래전부터 인식되었다. 불행히도 각 분야는, 목적하는 특이성을 갖는 항체를 다량 생산하는데 필요한 느리고 지루한 과정에 때문에 구속되어 있다. 고전적인 세포 융합 기술로, 항체를 생산하는 B세포와 죽지 않는 세포주를 융합시켜 단일 항체를 충분히 생산할 수 있게 되었다. 생성된 세포주는 하이브리도마 세포주라고 불리운다. 그러나, 대부분의 이들 단일클론 항체들은 쥐의 계에서 생성되며, 사람의 면역계에서는 "외래" 단백질로 인식된다. 따라서, 환자의 면역계는 이 항체들에 대한 반응을 유도해내고, 그 결과, 항체 중화 및 일소, 및(또는) 항-항체 면역 반응과 관련된 잠재적으로 심각한 부작용을 유발한다.
이 문제에 대한 한 가지 접근 방식은 사람 또는 "인간화된" 즉, 외래 에피토프로 쉽게 "인식되지" 않는 단일클론 항체를 개발하여, 환자의 항-항체 면역 반응을 피하는 것이다. 사람 B 세포 하이브리도마-생산 단일클론 항체를 응용하는 것은 암, 미생물 및 바이러스 감염, 비정상적으로 낮은 항체 생산과 관련된 B 세포 면역결핍, 자기면역 질환, 염증, 이식 거부 및 다른 면역계 장애 및 기타 질환의 치료에 유망한 잠재력을 갖고 있다. 그러나, 각종 장애물이 그러한 사람 단일클론 항체의 개발에 남아있다. 예를 들면, 많은 사람 종양 항원은 사람에게서 면역원성이 없을 수 있으며, 따라서, 사람 항원에 대한 항체를 생성하는 사람 B 세포를 단리하기가 어려울 수 있다.
사람 치료를 위한 항체와 관련된 문제를 해결하기 위한 시도들은 재조합 DNA 기술을 사용했다. 이런 대부분의 노력은 사람 CH영역 및 비사람 (예를 들면, 쥐) 항원 결합 (가변) 영역을 갖는 키메라 항체의 생산에 초점이 맞춰졌다. 이들 키메라 항체는, 일반적으로 목적하는 항체 가변 영역 및(또는) 불변 영역을 클로닝하고, 목적하는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 기능적 기메라 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 단일 제작물로 클로닝된 서열을 결합시키고, 이 제작물을 항체를 발현할 수 있는 세포내로 도입하고, 안정적으로 키메라 항체를 발현하는 세포를 선별함으로써 생산된다. 또한, 키메라 항체는, 목적하는 가변 영역 또는 불변 영역을 클로닝하고, 이 제작물을 항체 생산 세포로 도입하고, 목적하는 가변 영역 및 내인성 가변 영역, 또는 목적하는 불변 영역 또는 내인성 불변 영역 사이의 상동 재조합으로 생겨난 키메라 항체 생산 세포를 선별함으로써 생산한다. 키메라 항체를 생산하는 상기한 바와 같은 재조합 DNA 기술의 예는 PCT 공개 제WO 86/01533호 (Neuberger 등) 및 U.S. 특허 제4,816,567호 (Cabilly 등) 및 제5,202,238호 (Fell 등)에 기재되어 있다. 이들 방법은 하나의 세포로부터 다른 세포로 DNA를 옮겨서 DNA의 천연 유전자좌로부터 DNA를 제거할 필요가 있으며, 따라서, 주의깊은 이 DNA의 시험관내 조작을 통해 최종 항체 코딩 제작물이 기능적인지 (예를 들면, 전사 및 목적하는 유전자 생성물의 번역이 가능한가)를 확인할 필요가 있다.
종래의 상동 재조합 보다 더욱 효율적으로, 여러 클로닝 단계를 필요로하지 않고 하이브리도마 세포로 수행할 수 있는, 목적하는 단백질 또는 항체의 생산 방법에 대한 당분야의 뚜렷한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 면역글로불린 (Ig) 유전자로부터 유래된 스위치 (S) 영역을 사용하여 하나의 DNA 서열을 다른 서열로 대체하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 임의의 DNA 두 조각이 "스위칭"되거나 또는 외인성 DNA 한 조작이 천연 또는 인공 S 영역을 포함하는 장소로 삽입되도록 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 지정 재조합이 일어나도록 하며, 현행 재조합 DNA 방법에 필요한 많은 클로닝 단계를 제거한다.
본 발명의 방법에서, 지정 재조합은 표적화 제작물 (targeting construct) 및 표적 유전자좌 (target locus)사이에서 일어난다. 핵산 표적화 제작물은 최소한 스위치 영역 및 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 (operably linked) 프로모터로 이루어진다. 또한, 목적하는 재조합성 생성물에 따라, 표적화 제작물은 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 변형 서열, 및 프로모터 및 스위치 영역 사이, 예를 들면 스위치 영역의 5' 및 프로모터 영역의 3' 사이에 다른 DNA 서열을 포함할 수 있다. 특별한 관심의 대상은, 이소타입 스위칭, 예를 들면 항체 중쇄 유전자 (표적 서열) 내의 내인성 불변 영역 (CH)을 다른 아형, 이소타입 또는 기원 종의 CH(변형 서열)로의 치환을 용이하게 하는, Ig 중쇄를 갖는 표적화 제작물의 사용이다. 예를 들면, 항체 경쇄 또는 중쇄의 불변 또는 가변 영역을 코딩하는 외인성 DNA는 내인성 서열의 불변 또는 가변 영역과 스위칭되어 상이한 불변 또는 가변 영역을 갖는 항체를 코딩하는 서열을 제조할 수 있다. 더 넓은 의미에서, 본 발명의 방법은 비항체 폴리펩티드 (예를 들면, 검출가능한 폴리펩티드 표지 또는 목적하는 활성을 갖는 폴리펩티드)에 연결된 목적하는 가변 영역을 갖는 키메라 항체의 생산을 포함해서, 목적하는 단백질 또는 단백질 구성요소의 생산을 위한 DNA 서열 조작에 광범위하게 적용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 a) 최소한 프로모터 및 스위치 영역으로 이루어진 표적 유전자좌를 갖는 세포 내로, 최소한 프로모터 및 스위치 영역으로 이루어지며 추가의 변형 서열을 포함할 수 있는 표적화 제작물을 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하여 표적 유전자좌 및 표적화 제작물의 전사를 가능케 함으로써, 표적 유전자좌 스위치 영역 및 표적화 제작물 스위치 영역과의 재조합을 촉진하는 단계, c) 최소한 스위치 영역으로 이루어진 (표적 유전자좌 스위치 영역 및 표적화 제작물 스위치 영역 하나 또는 둘 모두의 DNA 서열로 이루어진) 목적하는 재조합된 DNA 생성물 서열을 포함하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 지정 스위치-매개 재조합 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특정 태양에서는, 표적화 제작물 (P1-S1)은 프로모터 (P1) 및 스위치 영역 (S1)으로 이루어지며, 표적 유전자좌 (P2-S2-T)는 프로모터 (P2), 자연발생 또는 인공 삽입된 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)로 이루어진다. S-S 영역 사이의 지정 S-S 재조합 결과, 표적화 제작물의 P1프로모터, S1및 S2영역 하나 또는 둘 다의 DNA 서열을 포함하는 스위치 영역, 및 T 서열을 갖는 DNA 서열 (P1-S1/S2-T)이 생성된다. 이 태양에서는, 표적 서열은 표적 유전자좌 프로모터의 조절로부터 벗어나 목적하는 P1프로모터의 조절을 받는 위치에 놓이게 된다. 목적하는 DNA 서열을 포함하는 세포는 서던 블럿 분석 또는 PCR 등의 당분야에 공지된 방법으로 선별된다.
또다른 태양에서, 표적화 제작물 (P1-S1-M)은 최소한 프로모터 (P1), 스위치 영역 (S1) 및 변형 서열 (M)으로 이루어지며, 표적 유전자좌 (P2-S2-T)는 프로모터 (P2), 자연발생 또는 인공 삽입된 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)로 이루어진다. S-S 영역 사이의 지정 S-S 재조합 결과, 두 개의 가능한 재조합 생성물 서열, 즉 표적화 제작물의 P1프로모터, S1및 S2영역 하나 또는 둘 다의 DNA 서열을 포함하는 스위치 영역 및 T 서열을 갖는 DNA 서열 (P1-S1/S2-T), 및 P2프로모터, S1및 S2영역 하나 또는 둘 다의 DNA 서열을 포함하는 스위치 영역 및 M 서열을 갖는 두번째 DNA 서열 (P1-S1/S2-M)이 생성된다. 이 태양에서는, M 서열을 발현하는 세포는 서던 또는 노던 블럿 분석 등의 당분야에 공지된 방법으로 선별된다.
제3 태양에서, 표적화 제작물 (P1-Z-S1)은 프로모터 (P1), 스위치 영역 5'의 DNA 서열 (Z) 및 스위치 영역 (S1)으로 이루어진다. 표적 유전자좌 (P2-S2-T)는 프로모터 (P2), 자연발생 또는 인공 삽입된 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)로 이루어진다. 스위치 영역 사이의 지정 S-S 재조합 결과, 표적화 제작물의 P1 프로모터, Z DNA 서열, 스위치 영역 하나 또는 둘 모두의 DNA 서열을 포함하는 스위치 영역, 및 T 서열을 포함하는 DNA 서열이 생긴다 (P1-Z-S1/S2-T).
표적 유전자좌는 스위치 영역을 갖는 DNA 서열로서 천연, 자연발생 서열 (예를 들면 항체 생산 세포의 Ig 유전자좌), 재배열된 Ig 유전자좌, 또는 목적하는 장소에 인공 삽입된 재조합 생성 DNA 서열일 수 있다. 표적 유전자좌는 염색체외 성분 또는 안정하게 통합된 염색체 성분일 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자좌라는 항체 중쇄 유전자를 코딩한다. 표적화 제작물은 염색체외 성분 또는 안정하게 통합된 염색체 성분이다. 표적 유전자좌가 항체 중쇄 유전자인 경우, 표적화 제작물의 변형 서열은 바람직하게는 상이한 또는 변형된 중쇄 불변 영역 또는 관심있는 비항체 서열 (예를 들면, 검출가능한 폴리펩티드 표지, 효소, 독소 또는 성장 호르몬)을 코딩한다.
본 발명은 지정 S-S 재조합에 의해 DNA 서열을 변형하는 방법을 제공한다. 본 발명은 S 영역이 인공 삽입된 장소를 비롯해서, 자연발생 스위치 영역 또는 합성 스위치 영역을 포함하는 임의의 장소로 지정된 DNA 재조합을 가능케 한다.
본 발명은, 표적 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 단리하고 표적 서열을 절제하고 표적 서열 대신에 변형 서열을 라이게이션시킬 필요가 없는, 제1 DNA 서열 (표적 서열)을 제2 DNA 서열 (변형 서열)로 대체 또는 변형하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열로 폴리펩티드 코딩 서열의 일부를 대체하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 예를 들면, 폴리펩티드에 상이한 기능적 또는 구조적 특징 (예를 들면, 리간드 결합 또는 세포 결합)을 부여하는 두 개의 상이한 구성요소 (예를 들면, N-말단 구성요소 및 C-말단 구성요소)로 이루어진다. 예를 들면, 본 발명은 상이한 이종 아미노산 코딩 서열을 갖는 N-말단부 또는 상이한 이종 아미노산 코딩 서열을 갖는 C-말단부 중 하나를 치환시킨다.
지정 스위치-매개 재조합은, 면역글로불린 중쇄로 제한된 자연 발생 메카니즘에 비해 증대된 효율으로 특이적, 예비 선별된 영역에서의 재조합이 일어나도록 한다. 본 발명의 방법으로 스위치-매개 재조합을 그의 정상적인 조절 환경의 제한으로부터 제거하여 예를 들면, 구성 또는 유도 프로모터의 사용으로 필요에 따라 재조합이 조절될 수 있게 된다.
지정 시험관내 S-매개 재조합을 수행할 수 있다면, 지루하고 시간이 많이 소모되는 종래 재조합 DNA 기술을 사용하는 DNA 조작을 피하고, DNA 서열을 삽입하는 효율성이 높은 방법을 제공한다. 예를 들면, 이 방법은 융합 단백질의 검출가능한 표지부 (예를 들면, β-갈락토시다제)가 상이한 아미노산 서열 (예를 들면, 알칼리성 포스파타제) 대신에 용이하게 교환될 수 있게 한다.
본 발명의 방법의 구체적인 응용에서는, 지정 S-S 재조합을 사용하면, 항체 중쇄 유전자의 광범위한 조작이 필요없이, 항체 중쇄 유전자의 불변 영역을 상이한 또는 변형된 불변 영역으로 대체할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 항체 유전자로 하여금 그 천연 유전자좌에 유지될 수 있게 한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 이점 및 특징은 조성물, 조성물 성분, 방법 및 하기 한 바와 같은 본 발명의 방법 단계의 상세한 사항을 통해 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 재조합 DNA 기술에 사용하기 위한 방법 및 조성물, 특히 항체, 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 서열의 조작 방법에 관한 것이다.
도 1은 기본적인 면역글로불린 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2a는 프로모터 (P2), 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)로 이루어진 표적 유전자좌의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 2b는 프로모터 (P2), 프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'에 위치한 DNA 서열 (Y), 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)로 이루어진 표적 유전자좌의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 3a는 프로모터 (P1) 및 스위치 영역 (S1)으로 이루어진 표적화 제작물의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 3b는 프로모터 (P1), 스위치 영역 (S1) 및 변형 서열로 이루어진 표적화 제작물의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 3c는 프로모터 (P1), 프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'에 위치한 DNA 서열 (Z) 및 스위치 영역 (S1)으로 이루어진 표적화 제작물의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 3d는 선택 마커 유전자 및(또는) 증폭 유전자 등의 추가 구성요소를 포함할 수 있는, 프로모터 (P1), 프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'에 위치한 DNA 서열 (Z), 스위치 영역 (S1) 및 변형 서열으로 이루어진 표적화 제작물의 기본 구성요소를 보여주는 개략도이다.
도 4a는 표적화 제작물 P1-S1및 표적 유전자좌 P2-S2-T 사이의 스위치-매개 재조합을 도시한 개략도이다.
도 4b는 표적화 제작물 P1-S1-M 및 표적 유전자좌 P2-S2-T 사이의 스위치-매개 재조합을 도시한 개략도이다.
도 4c는 표적화 제작물 P1-Z-S1및 표적 유전자좌 P2-S2-T 사이의 스위치-매개 재조합을 도시한 개략도이다.
도 5는 전체 23 kb 사람 γ2 유전자좌 (5' 조절 성분, I 엑손, 스위치 영역, 코딩 서열, 막 및 분비 엑손, 폴리A), 생쥐 3' 인핸서 서열, CMV 프로모터/인핸서 카세트 및 SV2 히그로마이신 선택 마커를 갖는, 본 발명의 지정 표적화 제작물 (pTSW-1.4)의 개략도이다.
도 6은 도 5에 대한 설명에서 기재된 바와 같은 성분을 포함하며, pTSW-1.4.의 것과 반대 방향의 CMV 프로모터/인핸서 카세트를 갖는 본 발명의 표적화 제작물 (pTSW-1.9)의 개략도이다.
도 7은 23 kb 사람 γ2 생식계열 (germline) 클론으로부터 클로닝된 12 kb BamHI 단편 (스위치 영역 및 사람 γ2 오픈 리딩 프레임 포함; I 엑손 및 5' 조절 성분은 포함되지 않음), 스플라이스 공여 위치를 제공하는 CMV 프로모터/인핸서 카세트 및 SV2 히그로마이신 선택 마커를 갖는 본 발명의 표적화 제작물 (pTSW-2)의 개략도이다 (생쥐 3' 인핸서는 포함되지 않음).
도 8은 10 kb의 클로닝된 HindIII-EcoRI 생쥐 γ1 게놈 스위치 단편 (5' 조절 성분, I 엑손 및 생쥐 γ1 스위치 서열), CMV 프로모터 카세트 (pTSW-3.2 류 중의 SFFV 프로모터 카세트), 사람 γ2 오픈 리딩 프레임 및 스플라이스 억셉터의 게놈 클론, SV2 히그로마이신 선택 마커 및 임의로는 생쥐 3' 인핸서 서열을 포함하는 본 발명의 표적화 제작물 (pTSW-3.1)의 개략도이다.
도 9는 7.9 kb의 BglII-EcoRI 생쥐 γ1 게놈 스위치 단편 (I 엑손 및 생쥐 γ1 스위치 서열 포함, 5' 조절 성분은 포함되지 않음), CMV 프로모터 카세트 (pTSW-3.2 류 중의 SFFV 프로모터 카세트), 사람 γ2 오픈 리딩 프레임 및 스플라이스 억셉터의 게놈 클론, SV2 히그로마이신 선택 마커 및 임의로는 생쥐 3' 인핸서 서열을 포함하는 본 발명의 표적화 제작물 (pTSW-3.1BglII)의 개략도이다.
본 발명의 방법 및 조성물을 설명하고 개시하기 전에, 본 발명이 다양하게 기재되었다고 하더라도 기재된 특정 방법 및 조성물로 제한되는 것이 아님이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어법은 특정 실시태양을 기재하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해 제한되므로, 이 용어에 의해 제한되어서는 않된다.
본원의 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단일한 형태 "a", "an", "the"는 명백하게 다른 지시가 없는한, 다수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "a DNA sequence"는 다수의 DNA 서열 및 상이한 유형의 DNA 서열을 포괄한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 물질 또는 방법이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 여기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 문헌이 인용된 관련 특정 정보를 기재하고 개시하기 위해 참고로 본원에 도입된 것이다. 상기한 문헌은 단지 본 출원의 출원일 전에 개시된 것들이다. 발명자에게 종래 발명에 의한 공개내용을 선행하는 권한이 주어지지 않는다는 것을 승인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
<정의>
"인공 제작물" 또는 "인공 스위치 영역" 등에서 사용된 용어 "인공"이란 단리된 자연발생 또는 비자연 발생적 물질, 예를 들면 천연 서열을 융합하거나 천연 서열을 따로따로 화학적으로 합성하는 등 사람이 개입하여 제조한 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"스위치 영역"이란 용어는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 5'에서 자연발생하는 직렬 반복 서열로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 염색체내의 클래스-스위칭, 즉 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 특이적 부위를 코딩하는 DNA 서열의 재조합에서 기능한다. 특이적 스위치 영역 서열의 예는 본원에 참고로 구체적으로 도입된 문헌 (Mills 등 (1995) J. Immunol. 155 : 3021-3036)에 개시되어 있다. "스위치 영역"은 천연 면역글로불린 서열의 전체 길이 스위치 서열 뿐만아니라 천연 면역글로불린 스위치 영역에 대해 변형된 (예를 들면, 뉴클레오타이드 치환, 추가, 돌연변이 및(또는) 다른 변형을 포함) 재조합 및 합성 뉴클레오타이드 서열 모두를 포함하되, 단 스위치 영역은 전사될 때 재조합을 용이하게 하는 그의 기능을 보유한다.
"스위치 매개 재조합" 또는 "지정 S-S 재조합"라는 용어는 스위치 영역에 의해 용이해지는 염색체간, 염색체내, 또는 염색체외 DNA 재조합을 의미하는 것으로 교환가능하게 사용되고 있다. 예를 들면, S-S 재조합은 1) 프로모터의 3' 말단에 위치한 제1 스위치 영역 (표적화 제작물) 및 2) 프로모터의 3' 및 DNA 서열의 5'에 위치한 제2 스위치 영역 (표적 유전자좌)으로부터 생겨난다. 제1 및 제2 스위치 영역의 전사를 활성화시킨 후, 스위치 영역 사이에 재조합이 일어나 표적 유전자좌 DNA 서열이 변이된다. 본 발명의 지정 S-S 재조합은 두 개의 상이한 염색체 상에서, 동일한 염색체 상에서, 염색체와 염색체외 성분 사이에서, 또는 두 염색체외 성분 사이에서 DNA 서열간의 상호작용을 유발한다.
"표적화 제작물"이란 용어는 세포에 도입되어 천연 또는 인공 스위치 영역에서 지정 S-S 재조합을 일으키는 핵산 제작물을 의미한다. 표적화 제작물은 최소한 1) 스위치 영역 및 2) 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 임의로는 표적화 제작물은 또한 3) 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 변형 서열을 추가로 포함할 수 있다. 표적화 제작물은 또한, 4) 스위치 영역 및 프로모터 사이에 하나 이상의 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 실제 사용된 표적화 제작물에 따라서, 생성 mRNA는 스위치 영역, 또는 스위치 영역 및 변형 서열, 또는 스위치 영역 및 스위치 영역 및(또는) 변형 서열 사이의 DNA 서열을 코딩할 것이다.
"표적 유전자좌"라는 용어는 최소한 1) 스위치 영역, 2) 스위치 영역의 3' 말단에 인접한 표적 서열 및 3) 스위치 영역 및 표적 서열을 하나 이상의 번역가능한 mRNA(들)로 전사시키는 표적 유전자좌에 작동가능하게 위치한 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 표적 유전자좌는 또한 스위치 영역의 5' 말단에 인접하게 위치한 추가의 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 그러한 제작물에서, 프로모터는 추가의 DNA 서열, 스위치 영역, 및 표적 서열을 하나 이상의 번역가능한 mRNA(들)로 전사시킨다. "표적 유전자좌들"은 자연발생 (예를 들면, 스위치 영역의 5' 말단에 위치한 재배열된 VDJ 영역 및 CH유전자로 이루어진 면역글로불린 유전자) 또는 재조합에 의해 또는 합성된 것일 수 있으며, 염색체 또는 염색체외에 위치할 수 있다. 전형적인 표적 서열은, 바람직하게는 사람 항체의 불변 영역을 코딩하는 서열인 코딩 서열의 5' 말단에 작동가능하게 위치한 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 위치한 프로모터 서열을 포함한다.
"표적 서열"이란 용어는 지정 S-S 재조합이 일어나는 스위치 영역에 인접한 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 방법의 한 실시태양에서, 표적 서열은 스위치-매개 재조합 후 변형 서열에 의해 대체된다. "표적 서열"은 염색체 서열에 내인성인 자연발생 서열, 또는 염색체외 성분 (예를 들면, 벡터)으로 존재하거나 염색체 서열 내에 안정하게 통합된 성분으로 존재하는 재조합 서열 (즉, 재조합 유전자 조작을 사용하여 생긴 서열)일 수 있다. 표적 서열은, 자연발생 스위치 영역일 수 있거나 재조합 DNA 기술에 의해 목적하는 표적 서열의 5'에 삽입된 스위치 영역일 수 있는 스위치 영역에 인접해 있다. 전형적인 표적 서열은 변형 서열과 다르며, 특정 이소타입, 아형 및(또는) 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다.
"면역글로불린 (Ig) 유전자좌"라는 용어는 자신의 유전자좌로부터 항체 분자의 발현 또는 그의 프로세스를 조절하는 조절 서열의 전체 또는 일부를 포함해, 항체 분자의 불변 영역 및(또는) 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. Ig 유전자좌의 중쇄 유전자는 VH, DH, JH및 불변 영역의 전부 또는 일부 뿐만 아니라 스위치 영역, 인트론 서열 및 중쇄 유전자에 연합된 또는 인접한 측면 서열 (flanking sequence)을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 경쇄를 위한 Ig 유전자좌는 VL, JL및 κ 및 λ 대립유전자 모두의 불변 영역, 인트론 서열 및 경쇄 유전자와 연합된 또는 인접한 측면 서열을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
"변형 표적 유전자좌"란 용어는 변형된 표적 서열이 최소한 비변형 표적 유전자좌 스위치 영역 또는 비변형 표적 유전자좌 및 표적화 제작물 둘다로부터 유래된 스위치 서열로 이루어진 스위치 영역으로 이루어진, 스위치-매개 DNA 재조합에 의해 변형된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 변형된 표적 유전자좌는 비변형 표적 서열의 프로모터, 비변형 표적 서열 (본래의 표적 유전자좌에 존재할 때)의 제1 DNA 및 표적화 제작물의 변형 서열로도 이루어질 수 있다. 프로모터에 의한 전사 활성화로인해, 제1 DNA 서열, 스위치 영역 및 변형 서열이 하나 이상의 번역가능한 mRNA(들)로 전사된다.
"프로모터"라는 용어는 관심있는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 전사를 촉진하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"검출가능한 폴리펩티드 표지"라는 용어는 또다른 아미노산 서열에 공유결합될 경우 용이하게 검출될 수 있는 이종 서열을 제공하는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 폴리펩티드 특이성 항체에 결합하여 또는 이 폴리펩티드의 효소 활성에 의해 또는 화학 시약과 폴리펩티드의 반응에 의해 검출될 수 있다. 전형적인 검출가능한 폴리펩티드 표지로는 β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼록시다제, 이들 효소의 효소활성부 또는 관련된 아미노산 서열에 이종이고 면역검출가능한 임의의 아미노산 서열 등이 있다.
<지정 S-S 재조합 (일반)>
지정 스위치 영역-매개 재조합 방법은 스위치 영역 (예를 들면, 면역글로불린 유전자좌로부터 단리 및 유래된 것들)을 사용하여 특정 핵산 서열에서의 재조합을 용이하게 한다. S-S 재조합이 지정된 핵산 서열은 S 영역을 포함하며, "표적 유전자좌"로 명명하는 한편, S 영역 서열을 포함하는 도입되는 핵산 서열은 "표적화 제작물"이라고 명명한다. 각 S 영역의 전사를 통해 S-S 재조합이 두 예비선택된 DNA 영역 사이에서 일어나게 된다. 선택된 프로모터의 존재는 구성적 또는 유도성 전사를 제공하여 S-S 재조합 발생 빈도를 향상시킨다.
본 발명에 사용하기에 적합한 전형적인 표적 유전자좌의 기본 구성요소는 도 2a에 도시되어 있다. 표적 유전자좌의 최소 구성요소는 (5'에서 3'까지) 1) 프로모터 (P2, 화살표는 전사 방향 지시), 2) 스위치 영역 (S2), 및 3) 표적 서열 (T)이다. 또한 표적 유전자좌는 프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5' 영역에 위치하는 추가의 DNA 서열 (Y)을 포함할 수 있다 (도 2b). 그 조성과 무관하게, 표적 유전자좌 구성요소는 프로모터가 5' DNA 서열 (임의), 스위치 영역, 및 표적 서열 (임의)의 전사를 활성화시킬 수 있도록 배치된다. 표적 유전자좌는 내인성, 자연발생 염색체 서열 (예를 들면 5' DNA 서열이 VHDHJH유전자이고, 표적 서열이 CH유전자인 Ig 중쇄 유전자좌)이거나 또는 염색체외 성분 (예를 들면, 벡터 또는 플라스미드) 또는 안정적인 염색체 통합체로 존재하는 인공 제작된 서열 (즉, 재조합에 의해 생성된 서열 또는 합성된 서열)일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 전형적인 표적화 제작물의 기본 구성요소는 도 3a 내지 3d에 도시되어 있다. 표적화 제작물의 최소 성분은 (5'에서 3'까지) 1) 프로모터 (P1, 화살표는 전사 방향을 지시) 및 2) 스위치 영역 (S)이다 (도 3a). 표적화 제작물은 추가로 3) 스위치 영역의 3' 말단에 변형 서열 (도 3b) 및(또는) 4) 스위치 영역의 5' 말단에 하나 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 또한, 표적화 제작물은 선택 마커를 포함할 수 있다 (도 3d). 표적화 제작물 구성요소는 프로모터가 스위치 영역 및 변형 서열의 전사를 활성화시킬 수 있도록 배치된다. 표적화 제작물은 일반적으로 재조합에 의해 또는 합성되어 생성된 핵산 서열로서, 염색체외 성분 (예를 들면, 플라스미드 또는 벡터)으로서, 또는 안정한 염색체 통합체로서 본 발명의 방법에 사용된다. 전형적인 변형 서열은 이소타입 스위칭 (예를 들면, 상이한 이소타입 또는 아형의 CH유전자에 의한 표적 유전자좌의 CH유전자의 치환)에 사용하기 위한 CH유전자를 포함한다.
염색체내 S-매개 재조합 (S-S 재조합으로도 명명됨)이 클래스-스위치 현상에서 일어나는 정밀한 메커니즘은 충분히 이해되어 있지 않다 (이 문제에 관한 리뷰 논문으로는 문헌 (Coffman 등, 1993, Adv. Immunol. 54: 229-71) 참조). 특정한 이론에 억매이지 않고, 자연발생 S-매개 재조합은 두 개의 염색체내 스위치 영역의 동시 전사에 의해 촉발된다 (Xu & Stavnezer (1990) Develop. Immunol. 1:11-17; Rothman 등 (1990) Mol. Cell Biol. 10:1672-1679; Jung 등 (1993) Science 159: 984-987). 예를 들면, IgM 항체를 생산하는 세포에서, IgM 중쇄 유전자 (VHDHJH영역, 스위치 영역 (Sμ), 및 Cμ 유전자를 포함)는 구성적으로 (constitutively) 전사 및 번역된다. 클래스-스위칭 (예를 들면, IgG의 생산에 대해)은 제2 스위치 영역 (예를 들면, Sγ)이 전사될 때 일어난다. 제2 스위치 영역의 전사는 CH유전자좌의 각각의 스위치 영역과 관련된 조절 성분에 의해 조절받는 것으로 생각된다. 이들 조절 성분 각각은, 일반적으로 미생물 감염 또는 염증 등에서 활성화될 수 있는 사이토킨 (예를 들면 인터루킨, 인터페론 및 종양괴사인자 등의 사이토킨)과 관련된 세포 신호의 상이한 조합 (즉, 하나 이상의 세포 신호)에 의해 활성화된다. 세포 신호의 생산은 감염 및 염증의 특정 유형과 관련되어 있다. 따라서, 감염 또는 염증의 특정 유형은 1) 세포 신호의 특정 조합의 생성이 2) 어떤 스위치 영역 조절 성분이 활성화될 지를 결정하며, 이 결과 3) 어떤 스위치 영역이 전사되어 그와 관련된 CH영역의 재조합을 촉진하여 구성적으로 전사된 Sμ 및 Cμ 영역이 상이한 특이적 항체 이소타입을 형성하게 된다 (Coffman 등, 1993, 앞의 책).
본 발명은 상기한 일반적인 세포 조절 메카니즘에 의해 조절되지 않는 방식으로 관심있는 예비선택한 장소로 재조합을 지정하는 방법을 제공하기 위해 스위치 영역을 사용한다. 도 4a 내지 4c에 도시한 바와 같이, 본 발명의 지정 S-S 재조합은 최소한 스위치 영역 (S1) 및 프로모터 (P1)를 포함하는 표적화 제작물, 및 스위치 영역 (S2) 및 표적 서열 (T)를 프로모터 (P2)의 조절하에 포함하는 표적 유전자좌를 사용하여, 전사에 의해 활성화된 스위치 영역 두 개에 의해 매개되는 스위치-장소 특이적 재조합을 용이하게 한다. 생성된 재조합 생성물은 최소한 하나 또는 둘 모두의 스위치 영역, 예를 들면 S1또는 S1/S2의 서열을 갖는 스위치 영역을 포함할 것이다. 표적화 제작물이 프로모터 P1및 S1을 포함하는 경우, 목적하는 재조합 생성물은 P1프로모터, 스위치 영역 및 표적 서열 (이제 P2대신에 P1의 조절을 받음)로 이루어질 것이다 (도 4a). 목적하는 재조합 생성물은 PCR을 비롯한 당업계의 많은 공지 방법으로 확인된다. P1이 유도 프로모터인 경우, 목적하는 재조합 생성물을 포함하는 세포는 전사를 유도하여 확인할 수 있다. 표적화 제작물이 P1, S1및 변형 서열로 이루어지는 경우, 목적하는 재조합 생성물은 P2프로모터 및 스위치 영역과, 표적 서열 핵산 서열을 대체하는 변형 서열로 이루어질 것이다 (도 4b). 스위치 영역은 스위치 영역 하나 또는 둘 모두, 예를 들면, S1또는 S1/S2의 서열을 포함할 수 있다. 변형 서열이 단백질 또는 펩티드를 코딩할 때, 목적하는 재조합 생성물은 목적하는 생성물의 합성에 의해 확인될 수 있다. 표적화 제작물이 P1, S1의 5' DNA 서열, 및 S1으로 이루어지는 경우, 목적하는 재조합 생성물은 표적 유전자좌로 삽입된 P1및 S1영역의 5' DNA 서열을 포함한다 (도 4c). 목적하는 재조합 생성물은, 5' DNA 서열 및(또는) P1의 존재를 PCR로 검출하거나 또는 면역검출법 등을 비롯한 여러 가지 방법으로 동정할 수 있다.
또한, 표적화 제작물을 사용하여 특정 염색체에 포함된 표적 유전자좌의 3'에 DNA 한 조각을 삽입할 수 있다. 이 실시태양에서, 표적화 제작물은 상동 재조합에 의해 선택된 염색체 내로 삽입이 가능하도록 하는 상동 서열을 보유한다. 생성된 변형된 염색체는 표적 유전자좌의 3'에서 표적화 제작물의 DNA를 포함한다. 이 실시태양은 염색체내 S-매개 재조합의 유도에 사용된다.
<스위치 영역>
처음에 IgM을 발현하는 B 림프구는 성숙기에 IgG, IgA 또는 IgE에 대한 이들의 중쇄 이소타입을 스위칭할 때, 클래스-스위칭 (또는 이소타입 스위칭)이 일어난다. 처음에 VHDHJH영역의 하류에 위치하는 중쇄의 Cμ 불변 영역이 Cγ, Cα 또는 Cε 불변 영역에 의해 대체될 때 결실에 의한 DNA 재조합으로부터 이소타입 스위칭이 야기된다 (Rabbitts 등 (1980) Nature 283: 351; Davis 등 (1980) 앞의 책; Kataoka 등 (1981) 앞의 책).
쥐의 Sμ, Sε, Sα, Sγ3, Sγ1, Sγ2b및 Sγ2a스위치 영역 및 Sμ 및 Sγ4등의 사람 Sμ 스위치 영역을 비롯해서 여러 스위치 영역이 밝혀져 있다 (Mills 등 (1995) J. Immunol. 155: 3021-3036, 본원에 구체적으로 인용됨). 쥐의 Sμ 영역은 약 3 kb로서, 서열 [(GAGCT)nGGGGT]m (여기서 n은 1 내지 7이고, m은 150임)을 갖는 3' 영역 (Nikaido 등 (1981) 앞의 책) 및 이들 두 개의 펜타머가 펜타머 서열 (C/T)AGGTTG (Marcu 등 (1982) 앞의 책)로 흩어진 5' 영역으로 나뉠 수 있다. 사람 Sμ 유전자좌는 헵타머 서열이 영역 전체에 분포하고 있다는 점에서 약간 다르다 (Takahashi 등 (1982) 앞의 책; Mills 등 (1992) 앞의 책). 다른 스위치 영역이 더 복합한 패턴의 반복된 서열을 포함하고 있으나, 모든 스위치 서열은 펜타머 서열 GAGCT 및 GGGGT의 다수의 카피를 포함한다 (Nikaido 등 (1982) 앞의 책; Stanton 등 (1982) 앞의 책). 펜타머 ACCAG, GCAGC 및 TGAGC는 스위치 영역에서 일반적으로 발견된다 (Gritzmacher (1989) 앞의 책). 또한 헵타머 반복부 (C/T)AGGTTG는 스위치 영역 서열에 풍부하게 존재하며, 형질세포증 및 하이브리도마에서 특징분석된, 전부는 아니지만 많은 스위치 재조합 장소 근처에서 발견된다 (Marcu 등 (1982) 앞의 책).
쥐의 Sε 및 Sα 유전자좌는 직렬로 반복되는 40 bp 및 80 bp 서열을 각각 포함한다. 이들 서열은 Sμ, 특히 GAGCT 펜타머를 포함하는 반복부 부위에 상동이다. 사람 및 쥐 Sγ 영역 모두는 Sε 및 Sα 영역보다는 Sμ에 덜 상동이다. 쥐의 Sγ 영역의 Sμ에 대한 상동성은 가변 영역의 3' 거리를 증가시킬수록 감소한다 (Sγ3>Sγ1>Sγ2b>Sγ2a). 쥐 Sγ 영역은, 펜타머 서열인 TGGGG, GCAGC 및 ACCAG가 일반적으로 발견되는 49 bp 또는 52 bp (Sγ2a)의 직렬 반복부로 이루어진다 (Kataoka 등 (1981) 앞의 책; Mowatt 등 (1986) 앞의 책; Nikaido 등 (1982) 앞의 책; Nikaido 등 (1981) 앞의 책; Stanton 등 (1982) 앞의 책; Szurek 등 (1985) 앞의 책; Wu 등 (1984) 앞의 책).
본 발명에 사용하기에 적합한 스위치 영역은 자연발생 서열, 예를 들면 Ig 유전자좌로부터, 바람직하게는 쥐 또는 사람의 Ig 유전자좌로부터 직접 클로닝된 스위치 영역일 수 있다. 또한, 스위치 영역은 합성에 의해 또는 재조합에 의해 제조된 서열일 수 있다. 재조합 스위치 영역은 천연의 자연발생 스위치 영역과 동일한 서열을 가질 수 있거나 또는 천연 스위치 영역에 대해, 스위치 영역이 재조합을 용이하게 그의 기능을 보유하는 한에서 변형된 것일 수 있다 (예를 들면, 뉴클레오타이드 치환, 추가, 돌연변이 및(또는) 다른 변형 등을 포함). 재조합 스위치 영역은 천연 스위치 영역과 동일한 (또는 더 낮지만 허용할 수 있는) 수준 또는 야생형 스위치 영역에 의해 촉진되는 재조합에 비해 향상된 수준으로 스위치-매개 재조합에 필요한 최소한의 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 고안될 수 있다.
본 발명의 스위치-매개 재조합은 자연발생 메카니즘에 비해 S-S 재조합의 효율을 향상시킬 뿐만 아니라 목적하는 단백질의 제조를 위한 광범위한 응용 방법을 제공한다. 이는 표적화 제작물, 표적 유전자좌 또는 표적화 제작물과 표적 유전자좌 둘다의 구성적 또는 유도성 전사을 제공하는 프로모터를 함으로써 일부 달성된다. 본 발명의 스위치-매개 재조합 방법의 효율성 향상으로, 재조합 빈도가 자연적으로 발생하는 수준보다 높아지는데, 즉 1 % 내지 100 % 향상된 효율성, 더욱 바람직하게는 20 % 내지 100 % 향상, 더욱 바람직하게는 50 % 내지 100 % 향상된다.
<표적화 제작물>
상기한 바와 같이, 본 발명의 표적화 제작물은 최소한 1) 스위치 영역 및 2) 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터로 이루어진다. 표적화 제작물의 추가의 임의 구성요소로는 3) 단백질, 선택 마커 및(또는) 조절 성분을 비롯해서 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 변형 서열 및(또는) 4) 프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'의 DNA 서열 등이 있다. 프로모터에 의한 전사 활성화로 하나 이상의 번역가능한 mRNA(들)이 생성된다.
<표적화 제작물 프로모터>
표적화 제작물의 프로모터는 지정 S-S 재조합이 수행되는 세포 유형 (예를 들면, 진핵 세포 또는 원핵 세포)에 따라 선택된다. 지정 S-S 재조합이 표적화 제작물 및 표적 유전자좌의 스위치 영역의 전사에 의존하기 때문에, 표적화 제작물의 프로모터는 구성 또는 유도 프로모터일 수 있다. 원핵 또는 진핵 세포에서 DNA 발현을 위해 적합한 구성 및 강력한 구성 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다. 지정 S-S 재조합이 일어나는 세포가 진핵 세포일 경우, 프로모터는 중쇄 Ig 프로모터 또는 CMV, SV40, 쥐 몰라니 육종 바이러스, 및 지라 병소 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터 등의 바이러스 프로모터, 또는 MMTV 및 α-인히빈 등의 유도 프로모터일 수 있다.
<변형 서열>
변형 서열은 유전자좌에서 표적 서열을 대체하기에 적합한 임의의 핵산 서열일 수 있다. 예를 들면, 변형 서열은 번역 산물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있으며, 표적 서열의 전부 또는 일부를 대체한다. 예를 들면, 표적 서열이 CH유전자인 경우에, 변형 서열은 다른 천연 CH유전자, 변형된 CH유전자 (예를 들면, 야생형 CH유전자에 대해 변형된 작용인자 기능을 코딩하는 유전자) 또는 천연 또는 변형된 경쇄 불변 영역일 수 있다. 또한, 변형 서열은 변형된 표적 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 상에 기능을 부여하는 비항체 유래 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 예를 들면, 변형 서열은 독소, 호르몬, 성장 인자 또는 그의 일부를 코딩할 수 있다. 변형 서열은 또한 링커를 코딩하여 다른 (예를 들면, 유사하게 변형된) 중쇄 유전자 생성물 또는 비항체 폴리펩티드 (예를 들면, 독소, 성장 인자, 호르몬 또는 다른 생물학적으로 중요한 폴리펩티드 또는 다른 분자) 사이의 공유 또는 비공유 결합을 제공한다. 변형 서열의 또다른 예는 검출가능한 폴리펩티드 표지 또는 택 (tag), 예를 들면 β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼록시다제 또는 항체가 결합하여 폴리펩티드 검출 및(또는) 단리를 (예를 들면, 면역친화도 크로마토그래피에 의해) 용이하게 할 수 있는 면역검출가능한 폴리펩티드이다.
또한, 추가로 변형 서열은, 스위치 영역의 3' 위치에 조절 서열을 도입하거나 또는 표적 서열에 이미 존재하는 조절 서열을 대체하는데 사용될 수 있는 조절 서열 (예를 들면, 프로모터, 인핸서 성분, 인트론, 리보솜 결합 장소)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 스위치-매개 재조합은 표적 유전자좌에서 표적 유전자좌 스위치 영역의 3' 또는 5'에 위치하는 약한 프로모터를 강한 프로모터로 대체하는데 사용될 수 있다. Ig 유전자좌의 변형시 특별히 관심을 받는 전형적인 조절 서열로는, 중쇄 인핸서 서열, κ 쇄 인핸서 서열 또는 MMLV, 로우스 육종 바이러스 (RSV), 또는 SFFV에서 유래한 프로모터 등이 있다.
표적화 제작물은 또한 변형된 표적 유전자좌가 스위치-매개 생성물을 증폭시키도록 증폭 유전자를 포함할 수도 있다. 당업계에 알려져 있고 본 발명에 유용한 적당한 증폭 유전자가 많이 있다 (예를 들면, 히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 유전자).
변형 서열은 변형되는 표적 서열 및(또는) 생성된 재조합 생성물에 의도한 진단 또는 치료 용도를 비롯한 각종 요인에 따라 선택된다.
<프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'에 존재하는 추가의 서열>
표적화 제작물은 표적 유전자좌의 프로모터 및 스위치 영역 사이에 작동가능하게 위치한 추가의 전사가능하고 번역가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이 추가의 서열은 표적 유전자좌에 의해 코딩된 폴리펩티드 N-말단 일부를 코딩할 수 있다. 예를 들면, 표적화 제작물은 목적하는 VHDHJH폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 표적 서열에 목적하는 CH유전자를 가진 Ig 중쇄 유전자좌를 코딩하는 표적 유전자좌로 지정 스위치-재조합 될 때, 재조합 생성물은 목적하는 VHDHJH영역 및 목적하는 CH코딩 영역 (그 사이에 스위치 영역이 위치함)을 포함한다.
<다른 구성요소>
표적화 제작물은 당업계에 잘 알려진 시판되는 각종 벡터 (예를 들면, pBR322, pACYC 벡터, 플라스미드, 및 바이러스 벡터)를 기재로 할 수 있다. "벡터"는 목적하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용되는 임의의 DNA 또는 RNA 분자 (자기 복제 또는 아님) 등이 있다. 표적화 제작물은 염색체외 또는 염색체 통합 성분으로서 표적화 제작물을 포함하는 세포의 스크리닝 및 선별을 용이하게 하고(거나) 성공적으로 지정 S-S 재조합된 세포를 선별하는 선택 마커, 예를 들면 변형 서열 이외에 표적 유전자좌내로 재조합되는 변형 서열과 연합된 선택 마커 등의 다른 구성 요소를 포함할 수 있다. 적당한 선택 마커 유전자로는 검출가능한 마커 (예를 들면, β-갈락토시다제)를 코딩하는 유전자, 또는 히그로마이신 내성 (hyg), 구아노신 포스포릴 트랜스퍼라제 (gpt), 네오마이신 내성 (neo), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 푸로마이신 (spt) 및 암피실린 내성 (Amp) 등의 약물 내성 유전자 등이 있다. 제작물은 또한 박테리아 세포에서 제작물의 안정한 복제를 위한 복제 개시점 (바람직하게는 카피수가 높은 복제 개시점), 핵 편재화 신호 (nuclear localization signal), 또는 DNA 제작물, 제작물에 의해 코딩된 단백질, 또는 둘 다의 생산을 용이하게 하는 다른 성분을 포함할 수 있다. 진핵 세포 발현을 위해, 제작물은 또한 증폭 유전자를 포함할 수 있으며, 이 증폭 유전자는 특히 관심있는 DNA가 cDNA (예를 들면, 자연발생 서열의 인트론을 포함하지 않음)인 경우 관심있는 DNA의 발현 수준을 증가시킨다. 당업계에 공지된 DHFR을 비롯한 임의의 각종 증폭 유전자가 사용될 수 있다.
<표적화 제작물과 사용하기 위한 표적>
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 표적 유전자좌는 최소한 1) 스위치 영역, 2) 스위치 영역의 3' 말단에 인접한 표적 DNA 서열 및 3) 제작물에 작동가능하게 위치하여 스위치 영역 및 표적 서열을 mRNA 분자로 전사시키는 프로모터로 이루어진다. 표적 유전자좌는 또한 스위치 영역의 5' 말단에 인접하게 위치한 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 그런 제작물에서, 프로모터는 추가의 DNA 서열, 스위치 영역 및 표적 서열을 하나 이상의 번역가능한 mRNA(들)로 전사시킨다.
일반적으로, 본 발명의 표적화 제작물과 사용하기에 적합한 표적 유전자좌는 스위치 영역이 전사되어 스위치-매개 재조합을 용이하게 할 수 있는 임의의 스위치-포함 서열일 수 있다. 표적 유전자좌는 스위치 영역을 포함하는 임의의 천연, 내인성 염색체 서열 (예를 들면, Ig 중쇄 유전자좌)일 수 있다. 또한, 표적 유전자좌는 염색체외 성분 (예를 들면, 벡터 또는 플라스미드) 또는 염색체에 통합된 성분으로 존재하는 인공적으로, 재조합에 의해 제조된 서열일 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 동일한 염색체 상에서 표적 유전자좌의 3'으로 표적화 제작물의 일부를 삽입하는 것이 바람직한 경우, 표적화 제작물은 표적 유전자좌의 3'에 재조합을 지정하는 상동 서열을 보유한다. S-매개 재조합은 그 다음 염색체내에서 일어나게 되어 염색체내 재조합의 조절된 유도를 일으킨다.
<프로모터>
표적 유전자좌의 프로모터 (P2)는 천연의 자연발생 표적 유전자좌 서열 및(또는) 표적 서열에 존재하는 프로모터, 또는 표적 유전자좌 서열 및(또는) 표적 서열에 이종인 프로모터일 수 있다. S-S 재조합은 스위치 영역의 전사와 관련되어 있으므로, 표적 유전자좌 프로모터는 바람직하게는 적어도 낮은 수준의 발현율, 더욱 바람직하게는 구성 발현 (constitutive expression), 더욱더 바람직하게는 표적 유전자좌의, 구체적으로는 스위치 영역 코딩 DNA의 구성 발현을 높은 수준으로 제공한다. 표적 유전자좌와 연합된 프로모터는 스위치 영역의 전사의 부적합한 수준 또는 바람직하지 못한 낮은 수준을 제공하는 경우, 천연 표적 유전자좌 프로모터는 S-매개 재조합 또는 당업계에 잘 알려진 다른 재조합 방법, 예를 들면 클로닝, 상동 재조합을 사용하여 다른 프로모터로 변형 또는 대체할 수 있다.
<프로모터의 3' 및 스위치 영역의 5'에 존재하는 추가 서열>
상기한 바와 같이, 표적 유전자좌는 표적 유전자좌의 프로모터 및 스위치 영역 사이에 작동가능하게 위치한 추가의 전사가능하고 번역가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가의 서열은 폴리펩티드의 N-말단부를 코딩할 수 있으며, 표적 유전자좌는 폴리펩티드의 C-말단부를 코딩하는 표적 서열을 포함한다. 지정 스위치-매개 재조합 후, 변형된 표적 유전자좌는 폴리펩티드의 N- 및 C-말단부 모두를 포함할 것이다.
<다른 구성요소>
표적 유전자좌는 원핵 및(또는) 진핵 세포의 복제, 진핵세포의 염색체로 제작물의 통합을 용이하게 하는 추가의 성분, 및 제작물을 포함하는 세포를 선별 및(또는) 스크리닝하는데 도움이 되는 마커 (예를 들면, 표적화 제작물에 대해 상기한 검출가능한 마커 및 약물 내성 유전자) 등을 포함할 수 있다. 진핵세포 발현을 위해, 제작물은 바람직하게는 발현될 유전자의 3'에 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 서열은 당업계에 알려진 임의의 각종 폴리아데닐화 신호 서열로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 초기 (early) 폴리아데닐화 신호 서열이다. 표적 유전자좌의 발현은 표적화 제작물에 대해 상기한 바와 같이, 인트론 서열을 포함함으로써 향상될 수도 있다.
본 발명의 전형적인 재조합 표적 유전자좌는 (5'에서 3'까지) 1) 프로모터, 2) 스위치 영역의 5' 말단에 DNA 서열을 삽입을 위한 제1 다수 클로닝 장소, 3) 스위치 영역 및 4) 표적 DNA 서열의 삽입을 위한 제2 다수 클로닝 장소로 이루어진다. 예를 들면, 표적 유전자좌는 재조합 Ig 중쇄 유전자인 경우, VHDHJHDNA 서열은 제1 다수 클로닝 장소에서 스위치 영역의 5' 말단에 삽입되며, 표적 서열은 제2 클로닝 위치 내로 삽입된 CH영역이다.
<본 발명의 방법에 사용하기 적합한 세포주>
관심있는 표적 유전자좌를 발현할 수 있는 임의의 포유동물 세포주가 본 발명에 사용하기 적합하다. 예를 들면, 표적 유전자좌가 Ig 중쇄 유전자일 경우, 세포주는 기능성 항체를 발현할 수 있는 임의의 포유동물 세포주이다. 특별한 관심의 대상은 본 발명의 스위치-매개 재조합 방법을 사용하여 항체 생산 세포 또는 항체 생산 능력이 있는 세포 (예를 들면, 간세포)에서 클래스-스위칭을 용이하게 하는 것이다. 세포주가 예를 들면, 하이브리도마 세포주 발현 사람 항체, 배아 간세포 (예를 들면, 쥐의 배아 간세포), 형질전환 동물 (예를 들면, 형질전환 생쥐)로부터 얻은 B 세포로부터 제조한 하이브리도마 세포주, 또는 중쇄 Ig 유전자좌의 적어도 기능부 또는 경쇄 Ig 유전자좌의 적어도 기능부를 발현할 수 있는 임의의 다른 세포 (일반적으로, 포유동물 세포)일 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 세포주의 일례는 크세노마우스 (Xenomouse)로부터 얻은 B 세포에서 유래한 사람 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주이다 (Green 등 (1994) Nature Genetics 7 : 13 및 PCT 특허공개 제WO94/02602호, 두 문헌 모두 본원에 구체적으로 도입됨). 크세노마우스는 기능적으로 불활성화된 생쥐 중쇄 및 κ 경쇄 대립유전자를 포함할 뿐만 아니라 그의 생식계열로 통합된 사람 중쇄 및 κ쇄 유전자좌의 큰 구획을 보유한다. 크세노마우스는 사람 중쇄 (hμ) 및 사람 κ 경쇄 (mK), 또는 hμ 및 생쥐 (mλ) 경쇄를 발현하는 B 세포를 생산한다. hκ 및 mλ의 동시발현은 일어나지 않는데, 왜냐하면, 한 경쇄의 발현은 다른 것의 발현을 완벽하게 배제하기 때문이다 (Green 등 (1994) 앞의 책). 면역화시에, 크세노마우스는 사람 Ig의 광범위한 성인형 레퍼토리를 생산하며, 항원 특이성 사람 단일클론 항체를 발생시킨다. 크세노마우스는 항원 특이성 사람 단일클론 항체를 만드는 생쥐 하이브리도마를 생성시킨다. 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, Harlow and Lane (편) 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 참조). 사람 또는 "인간화된" 항체를 발현하는 세포주를 제조하는 방법도 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, PCT 특허공개 제94/02602 및 제91/10741호).
세포주가 항체 생산 림프 세포주인 경우, 세포주는 게놈 서열, 변형 서열, 이종 서열 (예를 들면, 다른 종으로부터 얻은 Ig 서열), 변형 이종 서열 또는 키메라 서열 (예를 들면, 쥐 및 사람 Ig 서열 모두를 포함)로부터 항체를 발현할 수 있다. 따라서, 세포주는 예를 들면, 쥐, 사람 또는 키메라 항체를 생산하는 쥐의 하이브리도마 세포주일 수 있다. 하이브리도마 세포주는 예를 들면 사람 Ig 유전자의 발현에 의해 사람 항체를 생산하고 있을 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 사람 Ig 유전자의 발현에 의해 사람 항체를 제조하는 쥐의 림프 세포이다. 한 실시태양의 변형에서, 게놈 서열의 불변 영역 유전자는 사람 불변 (hCH) 영역 유전자, 예를 들면 mu 클래스의 hCH유전자 (hCHμ)이고, 변형 서열은 γ 클래스의 사람 불변 영역 (hCHγ)이다.
<스위치-매개 재조합을 사용한 방법>
본 발명의 제작물(들)을 사용하는 스위치-매개 재조합은 각종 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 1) 표적 유전자좌는 자연발생된 것일 수 있고 (염색체내 위치), 표적화 제작물은 염색체외 또는 염색체에 통합된 성분으로 사용될 수 있거나 또는 2) 표적 유전자좌는 자연발생된 것일 수 있거나 또는 염색체외 또는 염색체에 통합된 요소로서 존재하는 재조합에 의해 제조된 서열일 수 있고, 표적화 제작물은 염색체외 또는 염색체에 통합된 성분으로 사용될 수 있다. 표적화 제작물 및 표적 유전자좌는 모두 염색체 통합된 것인 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 염색체 상에 통합되어 있다.
<염색체 표적 유전자좌 및 염색체에 통합된 표적화 제작물을 사용하는 스위치-매개 재조합>
이 실시태양에서, 지정 스위치-매개 재조합을 수행하는데 사용되는 세포주는 1) 내인성, 자연발생 표적 유전자좌를 포함하거나 또는 2) 염색체에 통합된 재조합 표적 유전자좌를 포함한다. DNA를 숙주로 도입하고, 관심있는 특정 DNA 서열을 포함하는 안정한 염색체 통합체를 선별하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면 문헌 (Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)를 참조, 안정하게 통합된 관심있는 DNA를 포함하고, 관심있는 DNA를 발현하는 형질전환된 세포를 제공하는 재조합 DNA 기술을 위한 방법 및 조성물과 관련하여 참고로 본 명세서에 도입되어 있음).
표적화 제작물은 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제(들)로 소화시켜 선형화할 수 있으며, 선형 DNA는 당업계에 공지된 각종 방법 (예를 들면, 전기이동, 미량주사 (microinjection), 리포솜 융합, 적혈구 고스트 융합, 프로토플라스트 융합, 효모 세포 융합 또는 당업계에 공지된 다른 방법 (예를 들면, Sambrook 등, 앞의 책 참조)) 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 그 다음 선형 벡터는 무작위적으로 또는 지정 상동 재조합에 의해 특이적으로 세포의 게놈으로 통합되며, 안정한 통합체는 예를 들면, 표적화 제작물과 연합된 선택 마커를 발현시켜서 또는 표적화 제작물에서 변형 서열을 발현시켜서 선별한다.
지정 스위치-매개 재조합은 표적 유전자좌 및 표적화 벡터에서 스위치 영역의 동시 전사에 의해 이루어진다. 재조합 생성물, 예를 들면 변형 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 변형된 표적 유전자좌 유전자 생성물을 발현시켜 (예를 들면, ELISA 반응성 또는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)에 의해) 동정 및 선별된다.
<염색체 표적 유전자좌 및 염색체외 표적화 제작물을 사용하는 스위치-매개 재조합>
본 발명의 방법의 이 실시태양에서는 표적화 제작물은 염색체에 통합된 표적 유전자좌를 포함하는 세포로 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 도입된다 (예를 들면, Sambrook 등, 1989, 앞의 책). 바로 위의 방법과 반대로, 표적화 제작물은 표적화 제작물의 스위치 영역의 전사 및 전사적으로 활성인 표적 유전자좌의 스위치 영역과의 재조합에 충분한 시간 동안 염색체외 성분으로 유지된다. 목적하는 재조합 생성물, 예를 들면 변형된 표적 유전자좌를 포함하는 세포는 예를 들면, 통합된 표적 서열과 연합된 선택 마커의 발현에 대한 선별 또는 목적하는 변형된 표적 유전자좌 유전자 생성물을 발현하는 세포의 검출 등 상기한 바와 같이, 동정 및 선별될 수 있다.
<스크리닝 및 선별>
적합하게 재조합된 서열의 검출은 목적하는 재조합 생성물의 성질에 따라 각종 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 선택 마커와 연합된 변형 서열이 변형 서열이 포함된 표적 유전자좌로 재조합되는 경우, 초기 스크리닝은 마커를 발현하는 세포를 선별할 것이다. 제2 스크리닝은 약물 내성 세포가 적합하게 변형된 표적 유전자좌를 발현하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
제2 스크리닝에 사용되는 방법은 표적 유전자좌로 삽입된 변형 서열의 성질에 따라 다양할 것이다. 변형 서열은 탐침으로 변형 서열의 일부를 사용하여 서던 블럿하거나 또는 변형 또는 변형된 영역으로부터 유래된 증폭 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 검출할 수 있다. 적합하게 통합된 변형 서열을 갖고 있는 세포는 또한 기능성 변형 표적 유전자좌 생성물의 발현을 검출, 예를 들면 변형된 항체 중쇄 유전자좌 내의 신규한 CH영역을 면역검출함으로써 동정할 수도 있다. 또한 변형된 표적 유전자좌의 발현 생성물은 생물검정을 통해, 변형 서열에 의해 부여된 특정 작용인자 기능에 대해 시험하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 효소, 독소, 성장 인자 또는 다른 펩티드 등 생물학적으로 활성인 분자를 코딩하는 변형 서열의 발현을 두드러진 생물학적 활성에 대해 분석한다.
표적 유전자좌가 Ig 유전자인 경우, 변형된 표적 유전자좌의 생성물은 당업계에 알려진 임의의 종래 면역학적 스크리닝 방법 (예를 들면, ELISA, FACS, 항체-의존성 세포 세포독성 분석, 또는 면역 침전 분석 등, Harlow 및 Lane, 위의 책 참조)을 통해 적당한 항원 또는 리간드 인식에 대해 시험할 수 있다.
다음의 실시예는 각종 제작물을 제조하고 사용하는 방법 및 본 발명의 각종 방법을 수행하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 당업계의 통상의 숙련자에게 제공하기 위해 기재된 것이며, 발명자가 본 발명이라고 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 다른 지시가 없다면, 부는 중량부이고, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압 또는 그 근사값이다. 사용된 번호 (예를 들면, DNA 서열의 길이, 분자량, 양, 특정 구성요소 등)와 관련하여 정확성을 기하려고 노력했지만, 일부 편차도 감안되어야 할 것이다.
<실시예 1>
스위치-매개 재조합을 위한 표적화 제작물 (pTSW-1.4 및 pTSW-1.9)
생성된 모든 벡터는 낮은 카피수의 pACYC177 플라스미드 (NEB)를 기재로 한 것이었다. 벡터 pTSW-1.4는 완전한 사람 γ2 스위치 영역의 23 kb EcoRI 게놈 단편을 포함하고 있고 사람 태반 게놈 라이브러리에서 단리된 p1bYACδNot 플라스미드로부터 생성되었다. 코딩 서열 2 kb, I 엑손 및 γ2 스위치 영역을 포함하는 상류 서열 12 kb 및 하류 서열 9 kb를 포함했다 (Flanagan & Rabbitts (1982) Nature 300:709-713). 이 플라스미드는 또한 생쥐 3' 인핸서를 포함한다 (Dariavach 등 (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1499-1504). 이 벡터를 변형시켜서 히그로마이신 선택 마커 및 사람 CMV 프로모터-인핸서 카세트를 포함하도록 하며, 그의 3' 말단에 원핵생물의 종결 서열 (terminator sequence)을 포함했다 (하기함). 원핵생물의 종결 서열은 뜻밖의 원핵생물 전사체가 스위치 서열을 활성화시키지 못하도록 막아서 박테리아내에 클로닝시 이들을 탈안정화시키는데 사용했다 (Mowatt & Dunnick (1986) J. Immunology 136 : 2674-2683). 이들 서열은 진핵생물 전사에 거의 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다.
SV40 프로모터에 의해 조정되는 히그로마이신 유전자 (Giordano & McAlliser (1990) Gene 88 : 285-288)를 pUC219.TG76 플라스미드로부터 1.7 kb HindIII-BamHI 단편으로서 클로닝되고 pACYC177내의 HindIII 및 BamHI 장소로 삽입되어 pACYC.hyg 플라스미드를 생성시켰다.
종결 서열은 GCATGCCCGCGGGAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGC GGCTCGA (서열 번호 1)로 합성되었으며, 클로닝을 위해, 3' 말단에 측면 SphI 장소 및 내부 XhoI 장소를 갖고 있었다. 이 서열은 사람 CMV 프로모터-인핸서 서열 하류에 pIK1.1Cat 플라스미드의 SphI 장소로 클로닝되었다.
CMV 발현 카세트는 종결 서열과 함께 900 bp HindIII-XhoI 단편으로서 클로닝되었으며, 이는 상기한 pACYC.hyg 플라스미드 내의 HindIII 및 XhoI 장소내에 위치하게 되며, CMV 전사 방향은 히그로마이신 유전자의 방향과 반대가 된다.
히그로마이신 및 CMV-종결 카세트 모두를 포함하는 2.6 kb 단편을 BamHI 및 XhoI 소화에 의해 pACYC.hyg.CMVt로부터 절제되었다. 이 단편의 양말단은 링커를 사용하여 NotI 장소로 전환되었고, 이 단편은 23 kb 사람 γ2 서열 및 생쥐 3' 인핸서를 포함하는 p1bYACδNot 플라스미드 내의 유일한 NotI 장소로 클로닝되었다. pTSW-1.4 플라스미드 (도 5)는 사람 γ2 코딩 서열의 것과 동일한 방향으로 CMV 전사 방향으로 생성되었다. pTSW-1.9 플라스미드 (도 6)은 사람 γ2 코딩 서열의 것과 반대인 CMV 전사 방향으로 생성되었다.
pTSW-1.4로 명명된 본 발명의 전형적인 표적화 제작물은 도 5에 도시되어 있다. pTSW-1.4는 사람 중쇄 IgG2불변 유전자 (hCHγ2)로 Ig 중쇄 불변 유전자를 스위치-매개 치환하는데 사용하기 위해 제작된다. pTSW-1.4 제작물은 5' 내지 3' 방향으로 사람 IgG2 중쇄 영역 (약 23 kb)에 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 포함하며, 이는 IgG2 중쇄 I 엑손 및 그의 5' 측면 서열, 사람 IgG2 스위치 영역, 완전한 사람 hCHγ2 유전자 및 IgG2 중쇄 영역의 측면 서열을 포함한다. hCHγ2 영역은 hCHγ2 유전자의 3'에 인접하여 위치한 쥐의 인핸서에 연결된다. CMV 프로모터는 강한 구성 프로모터이다. 다른 구성 프로모터를 CMV 프로모터 대신에 사용할 수 있다 (예를 들면, SSFV, MMLV, MCV, RSV, SV40 등). hCHγ2 영역 모두는 클로닝되고 서열화되었다 (Mills 등 (1995) 앞의 책). 쥐의 3' 인핸서도 또한 당업계에 잘 알려져 있다. (Dariavach 등 (1991) 앞의 책).
<실시예 2>
스위치 매개 재조합을 위한 표적화 제작물 (pTSW-2)
pTSW-2 플라스미드를 얻기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 13 kb BamHI 단편을 p1bYACδNot 플라스미드 내의 23 kb EcoRI 사람 γ2 게놈 단편으로부터 클로닝한 후, 클레노우 (Klenow)와 반응시켜 부분적으로 빈자리를 채워, XhoI와 병용할 수 있는 말단을 생성했다. 이 클론을 pACYC.hyg.CMVt 플라스미드 내의 유일한 XhoI 장소내로 삽입하고, 이 또한 클레노우로 부분적으로 채워, BamHI과 병용할 수 있게 했다. 사람 γ2 코딩 서열의 전사 방향이 CMV 프로모터와 동일한 이 클론의 정확한 방향을 선별했다.
pTSW-2로 명명된 본 발명의 또다른 전형적인 표적화 제작물은 도 7에 도시되어 있다. pTSW-1.4와 마찬가지로, pTSW-2는 사람 중쇄 IgG2불변 유전자 (hCHγ2)로 Ig 중쇄 불변 유전자를 스위치-매개 치환하는데 사용하기 위해 제작되었다. pTSW-2 제작물은 5' 내지 3' 방향으로 사람 IgG2 중쇄 영역 (약 13 kb)에 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 사용하여 제조하며, 이는 사람 IgG2 스위치 영역 및 스위치 영역 및 사람 γ2 오픈 리딩 프레임의 200 bp 5' 측면 서열을 포함한다. pTSW-1.4에 존재하는 측면 서열 일부는 pTSW-2에 존재하지 않을 것이다. pTSW-2 제작물은 또한 선택 마커 SV2hyg 및 원핵생물 전사 종결 서열 (스위치 영역을 안정화시킴)을 포함한다. pTSW-2 제작물은 hCHγ2 유전자의 3' 말단에 위치하는 쥐의 인핸서를 포함 또는 불포함하는 상태로 제조될 수 있다.
<실시예 3>
스위치-매개 재조합을 위한 표적화 제작물 (pTSW-3.1)
pTSW-3.1 플라스미드 (도 8)를 얻기 위해, 2 kb 사람 γ2 코딩 서열을 p1bYACδNot으로부터 XhoI-SalI 단편으로서 PCR에 의해 클로닝했다 (실시예 1). 이 단편을 종결 서열의 3', pACYC.hyg.CMVt 플라스미드 내의 유일한 XhoI 장소로 클로닝했다. 생쥐 γ1 스위치 서열을 p-감마-1/EH10.0 플라스미드로부터 10 kb HindIII-EcoRI 단편으로 절제하고 (Mowatt & Dunnick (1986) 앞의 책), 말단을 XhoI 및 SalI 내로 각각 전환했다. 변형된 플라스미드를 pACYC.hyg.CMVt 내의 유일한 XhoI 장소를 통해 사람 γ2 영역의 5'에 클로닝했다. pTSW-3.1dBglII 플라스미드 (도 9)는 7.9 kb BglII-EcoRI 생쥐 γ1 스위치 서열이 포함되었다는 것을 제외하면 pTSW-3.1과 유사하게 생성되었다.
pTSW-3.2는 CMV 프로모터-인핸서 카세트가 지라 병소 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터에 의해 대체되었다는 점을 제외하면, pTSW-3.1에 대해 기재된 바와 같이 제작되었다.
pTSW-3 플라스미드는 유일한 NotI 및 MluI 장소를 포함했다 (유일한 BamHI 장소로부터 링커에 의해 전환됨). HindIII는 3' 인핸서의 선형화 및 클로닝을 위해 사용된다.
pTSW-3.1로 명명된 본 발명의 추가의 전형적인 표적화 제작물은 도 8에 도시했다. pTSW-1.4 및 TSW-2와 마찬가지로, pTSW-3.1은 사람 중쇄 IgG2불변 유전자 (hCHγ2)로 Ig 중쇄 불변 유전자를 스위치-매개 치환하는데 사용하기 위해 제작되었다. pTSW-3.1 제작물은 5' 내지 3' 방향으로 쥐 γ1 스위치 영역에 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 사용하여 제조하며, 이는 또한 쥐의 γ1 I 엑손 및 측면 서열, 및 사람 게놈 불변 hCHγ1, hCHγ2또는 hCHγ4코딩 서열을 포함할 수 있으며, 5' 측면 분지점 (branch point) 및 스플라이스 억셉터 (splice acceptor)를 포함한다. pTSW-3.1 제작물은 mSγ1서열의 5' 말단에 인접해 있는 쥐 γ1 조절 성분 (mIγ1)을 추가로 포함할 수 있다. 또한, γ1 유전자 (hSγ1)의 사람 스위치 영역 및 그의 5' 측면 서열, 예를 들면 I 엑손 (hIγ1)을 mIγ1및 mSγ1대신에 사용할 수 있다. I 엑손을 포함하지 않는 제작물에서, 스플라이스 공여 장소는 프로모터 서열의 3'을 제공받는다. pTSW-3.1 제작물은 또한 임의로는 hCHγ유전자의 하류에 인접해 있는 쥐의 3' 인핸서 및(또는) hCHγ유전자에 인접한 3'에 위치한 3' 진핵생물 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. pTSW-3 제작물의 성분 각각은 당업계에 잘 알려져 있다 (쥐의 Sγ4, Sμ는 Mills 등 (1991) 앞의 책, 쥐의 Sγ1은 Mowatt & Dunnick (1986) 앞의 책, 사람 Sγ은 Mills 등 (1995) 앞의 책, 생쥐 3' 인핸서는 Dariavach 등 (1991) 앞의 책). pTSW-3.1 제작물은 또한 선택 마커 SV2γ2hyg 및 HindIII 선형화 장소를 포함한다. 다른 선택 마커, 예를 들면 피로마이신을 사용할 수 있다.
<실시예 4>
하이브리도마 세포주에서 스위치-매개 재조합
상기한 바와 같이, 사람 단일클론 항체의 생산과 연합된 문제 가운데 하나는 사람 B 세포와 융합된 죽지않는 세포주가 쥐로부터 유래한 것이라는 점이다. 이는 생성된 항체가 사람 가변 영역 (사람 경쇄 및 사람 중쇄 가변 영역 (hVHDHJH))을 갖지만, 쥐 중쇄 불변 영역 (mCHγ)을 갖는 재조합을 유발시킬 수 있다 (도 8 참조). 스위치-매개 재조합을 사용하여 mCHγ유전자를 사람 중쇄 불변 영역 (hCHγ) 유전자로 치환한다.
사람 항원을 비롯한 항원에 대한 단일클론 IgG 항체 (사람 중쇄 가변 영역 (hVHDHJH) 및 쥐 중쇄 불변 영역 (mCHγ)을 가짐)를 발현하는 하이브리도마 세포주는 당업계에 공지된 방법으로 제조했다 (예를 들면, Green 등 (1994) 앞의 책 참조). 스위치 영역 및 hCHγ유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 표적화 제작물은 상기한 바와 같이 제작되었다. 상기 실시예에 기재된 임의의 전형적인 벡터 (pTSW-1.4, pTSW-2 또는 pTSW-3.1)는 이 방법으로 사용하기에 적합하다. 제작물이 선형화되고, 선형 제작물을 예를 들면, 전기이동, 리포펙션 (lipofection), 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 하이브리도마 세포로 도입한다. 제작물의 안정한 통합체를 포함하는 형질전환된 하이브리도마 세포는 히그로마이신에서 증식할 수 있는 능력으로 선별한다. 그 다음 히그로마이신 내성 세포를 배양하여 CMV 프로모터로부터 표적화 제작물이 전사되도록 하여 결과적으로 스위치-매개 재조합이 일어나게 한다. 그 다음 하이브리도마 단일 세포 배양물을 재조합된 항체 메시지를 증폭시켜 또는 샌드위치 ELISA 분석으로 항-사람 IgG2 항체를 사용하여 hCHγ2의 발현에 대해 스크리닝하거나 FACS 분류로 단리한다.
<실시예 5>
사람 항체를 생산하는 형질전환 생쥐에서 스위치-매개 재조합
스위치-매개 재조합은 다음과 같이 형질전환 생쥐의 생체내에서 수행할 수 있다. 표적화 벡터를 트랜스유전자로 사람 항체 생산 생쥐로 도입하고, 생쥐 B 세포 또는 이들에게서 유래된 하이브리도마에 의해 생산된 재조합된 항체를 상기한 바와 같이 스크리닝한다.
본 발명은 가장 실용적이고 바람직한 실시태양이 무엇인지에 대해 보이고, 설명되었다. 그러나, 여기에서 벗어나는 것도 본 발명의 범위에 속할 수 있으며, 이 공개내용을 읽고 당업자가 변형할 수 있다는 점이 인식되어야 한다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 제노테크 인코포레이티드 및 아야 자코보비츠
(ii) 발명의 명칭: 지정 스위치-매개 DNA 재조합
(iii) 서열수: 1
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 피쉬 앤드 리처드슨
(B) 거리: 슈트 100 샌드 힐 로어드 2200
(C) 도시: 멘로 파크
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 94025
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: AscIII
(vi) 본 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(v) 대리인/대리소 정보:
(A) 명칭: 카를 보지세빅
(B) 등록번호: 28,207
(C) 관리번호: 07327/004WO1
(ix) 전자통신 정보:
(A) 전화: (415) 322-5070
(B) 텔레팩스: (415) 854-0875
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 45 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(xi) 서열 설명:
Claims (10)
- a) 스위치 영역 및 b) 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 (operably) 연결된 프로모터를 포함하는 인공 핵산 표적화 제작물.
- 제1항에 있어서, 스위치 영역의 3' 말단에 항체 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 변형 서열이 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 불변 영역이 사람 항체 중쇄의 불변 영역이며, 또한 상기 불변 영역이 Cγ, Cμ, Cα, Cδ 및 Cε로 이루어진 군에서 선택된 것인 표적화 제작물.
- 제1항에 있어서, 스위치 영역의 5' 말단 및 프로모터의 3' 말단 사이에 추가의 DNA 서열을 포함하는 표적화 제작물.
- 제2항에 있어서, 상기 변형 서열이 면역글로불린 가변 영역, 프로모터, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 검출가능한 펩티드 표지 또는 링커 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 코딩하고, 여기서 상기 프로모터가 구성 또는 유도 프로모터로서, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 지라 병소 형성 바이러스 (SFFV), 로우스 육종 바이러스 프로모터 및 SV40 프로모터 또는 쥐의 말로니 바이러스 프로모터인 표적화 제작물.
- 스위치 영역 및 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 외인성 핵산 표적화 제작물을 통해, 지정 스위치-매개 재조합된 게놈을 포함하는 세포주.
- 스위치 영역 및 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된, 사람 항체 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 변형 서열을 추가로 포함하는 외인성 핵산 표적화 제작물을 통해 지정 스위치-매개 재조합된 게놈을 포함하는 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질.
- a) 스위치 영역, 스위치 영역의 3' 말단에 인접한 표적 서열 및 스위치 영역 및 표적 서열을 전사시키는 표적 유전자좌 내에 작동가능하게 위치한 프로모터 (P2)를 포함하는 표적 유전자좌를 포함하는 세포내로, 스위치 영역 및 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 (P1)를 포함하는 표적화 제작물을 도입하는 단계,b) 상기 세포를 배양하여 표적 유전자좌 및 표적화 제작물의 전사를 가능케 함으로써, 표적 유전자좌 스위치 영역 및 표적화 제작물 스위치 영역과의 재조합을 촉진하는 단계, 및c) 표적화 제작물 프로모터 (P1), 스위치 영역 및 표적화 제작물을 포함하며, P1, 스위치 영역 및 표적 서열이 작동가능하게 연결되어 있고, 표적 서열이 P1의 조절을 받는, 변형된 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 지정 스위치-매개 재조합 방법.
- a) 스위치 영역, 스위치 영역의 3' 말단에 인접한 표적 서열, 및 스위치 영역과 표적 서열을 전사시키는 표적 유전자좌내에 작동가능하게 위치한 프로모터 (P2)를 포함하는 표적 유전자좌를 포함하는 세포내로, 스위치 영역, 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터 (P1) 및 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 변형 서열을 포함하는 표적화 제작물을 도입하는 단계,b) 상기 세포를 배양하여 표적 유전자좌 및 표적화 제작물의 전사를 가능케 함으로써, 표적 유전자좌 스위치 영역 및 표적화 제작물 스위치 영역 사이의 재조합을 촉진하는 단계, 및c) 표적화 제작물 프로모터 (P2), 스위치 영역 및 변형 서열을 작동가능하게 연결되어 있는 상태로 포함하는 변형된 표적 유전자좌를 포함하는 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 상기 표적 유전자좌가 항체 중쇄를 코딩하며, 상기 표적화 제작물이 a) 단계 이전에 선형화되고, 표적화 제작물의 안정한 통합체 (integrant)를 포함하는 세포를 b) 단계 전에 선별하고, 상기 표적화 제작물이 염색체외의 것인 지정 스위치-매개 재조합 방법.
- a) 스위치 영역 (S2), 스위치 영역의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 스위치 영역의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 변형 서열을 포함하는 표적화 제작물을, 프로모터, 프로모터의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 항체 중쇄 가변 영역, 이 가변 영역의 3' 말단에 인접한 스위치 영역 (S2) 및 이 스위치 영역의 3' 말단에 인접한 항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 중쇄 유전자좌에 의해 코딩된 항체 중쇄를 발현하는 항체 발현 세포로 도입하는 단계,b) 상기 세포를 배양하여 항체 발현 및 표적화 제작물을 전사시켜, 상기 S1및 S2사이의 스위치-매개 재조합을 촉진하고 상기 중쇄 유전자좌 불변 영역이 표적화 제작물의 변형 서열로 대체되는 단계, 및c) 중쇄 유전자좌 프로모터, 중쇄 가변 영역, 스위치 영역 및 표적화 제작물의 변형 서열을 작동가능하게 연결된 상태로 포함하는 변형된 중쇄 유전자좌를 포함하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 스위치-매개 재조합에 의한 항체 생산 방법.
- 스위치 영역; 스위치 영역의 5' 말단에 인접한, 비표적 서열의 삽입을 위한 제1 클로닝 위치; 스위치 영역의 3' 말단에 인접한, 표적 서열의 삽입을 위한 제2 클로닝 위치; 및 제1 클로닝 위치의 5' 말단에 작동가능하게 연결된 프로모터를 플라스미드 내에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하는, 프로모터의 전사 활성화를 통해 비표적 서열, 스위치 영역 및 표적 서열이 전사되는 핵산 표적 유전자좌.
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