JP3789486B2 - 指向性スイッチ媒介ｄｎａ組換え - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、一般的に組換えDNA技術において用いられる方法および組成物、特に、抗体、蛋白質、またはその一部をコードするDNA配列の操作法に関する。
発明の背景
脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン(Ig)構造単位は、２つの同一な「軽」ポリペプチド鎖（約23 kDa）、および２つの同一な「重」鎖（約53〜70 kDa）からなる。４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」の字型に結合され、２つの重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンがB細胞ハイブリドーマまたはその他の細胞タイプのいずれかによって産生される場合、ジスルフィド共有結合によって結合される。
一般的な抗体構造の概要を図１に示す。軽鎖および重鎖はそれぞれ、N末端の可変領域とC末端の定常領域とからなる。軽鎖では、可変領域（「VLJL」と呼ぶ）は、定常領域(CL)との結合領域(JL)を通じて結合される可変(VL)領域からなる。重鎖では、可変領域(VHDHJH)は、多様性(DH)領域と定常領域(CH)との結合(JH)領域との結合を通じて連結する可変(VH)領域からなる。軽鎖および重鎖のVLJLおよびVHDHJH領域はそれぞれ、Ｙ字の先端で会合して抗体の抗原結合部分を形成し、抗原結合特異性を決定する。
(CH)領域により抗体のアイソタイプ、すなわちそのクラスまたはサブクラスが決定される。異なるアイソタイプの抗体は、補体の活性化能、広範な細胞タイプに存在する特異的受容体（例えば、Fc受容体）との結合能、粘膜および胎盤通過能、および基本的な４つの鎖のIgG分子のポリマー形成能など、それらのイフェクター機能が有意に異なる。
抗体は、免疫グロブリンにおいて用いられるCHタイプに従って「クラス」に分類される（IgM、IgG、IgD、IgE、またはIgA)。少なくとも５つのタイプのCH遺伝子（Cμ、Cγ、Cδ、Cε、およびCα)が存在し、いくつかの種（ヒトを含む）は、多数のCHサブタイプ（例えば、ヒトではCγ1、Cγ2、Cγ3およびCγ4）を有する。ヒトの半数体ゲノムには全部で９個のCH遺伝子、マウスおよびラットでは８個、およびその他の多くの種ではそれよりも少ない数が存在する。対照的に、軽鎖定常領域(CL)には通常、２つのタイプ、カッパ(κ)およびラムダ(λ)しか存在せず、これらの定常領域の一つのみが１本の軽鎖蛋白質に存在する（すなわち、産生されるあらゆるVLJLについて起こりうる軽鎖定常領域は一つのみである）。あるクラスにおいては、重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原の特異性によって変化しないが（例えば、IgG抗体は常に、抗体の抗原特異性にかかわりなく、Cγ重鎖定常領域を有する）、各重鎖クラスは軽鎖クラスのいずれかと関連することが可能である（例えば、CHγ領域は、κまたはλ軽鎖のいずれかとして同じ抗体に存在することが可能である）。
重鎖および軽鎖のV、D、JおよびC領域のそれぞれは、個別のゲノム配列によってコードされる。抗体の多様性は、重鎖の異なるVH、DH、およびJH遺伝子セグメントと、軽鎖のVLおよびJL遺伝子セグメントとの間の組換えによって生じる。異なるVH、DH、およびJH遺伝子の組換えは、B細胞分化の間のDNA組換えによって生じる。簡潔に述べると、重鎖配列をまず、DHJH複合体を生じるように組換えて、次に第二の組換え事象によりVHDHJH複合体が生じる。機能的重鎖は、転写に基づいて産生され、その後RNA転写物のスプライシングが起こる。機能的重鎖が産生されると、軽鎖配列の組換えが誘発されて再配列VLJL領域が生じ、これにより今度は機能的VLJLCL領域、すなわち機能的軽鎖が形成される。
B細胞分化の過程において、単一のB細胞の前駆体は、可変領域によって決定される抗原特異性を変化させることなく、発現される免疫グロブリンアイソタイプをIgMからIgGまたは免疫グロブリンの他のクラスへと変換することができる。免疫グロブリンクラススイッチングとして知られるこの現象は、各CH遺伝子(Cγを除く）の5'に位置するスイッチ(S)領域の間に起こるDNA再配列を伴う（ホンジョ(Honjo)(1983)Annu.Rev.Immunol.1:499〜528、およびシミズ＆ホンジョ(Shimizu and Honjo)(1984)Cell 36:801〜803参照）。S-S組換えは、同じ染色体上に位置する介在CH遺伝子の欠失によって、VHDHJHエキソンを、発現されるべきCH遺伝子の近位にもたらす。クラススイッチメカニズムは、サイトカインによって指示される（ミルズら(Mills)(1995)J.Immunol.155:3021〜3036）。スイッチ領域の大きさは１ kb(Sε)から10 kb(Sγ1)に及び、長さおよび配列が共に異なるタンデムリピートを含む（グリッツマッヒャー(Gritzmacher)(1988)Crit.Rev.Immunol.9:173〜200）。マウスSμ、Sε、Sα、Sγ3、Sγ1、Sγ2bおよびSγ2aスイッチ領域およびヒトSμスイッチ領域を含む、いくつかのスイッチ領域の特徴付けがなされている（ミルズ(Mills)(1995)前記；ニカイドウら(Nikaido)(1981)Nature 292:845〜8；マルクら(Marcu)(1982)Nature298:87〜89；タカハシら(Takahashi)(1982)Cell 29:671〜9；ミルズら(Mills)(1990)Nucleic Acids Res.18:7305〜16；ニカイドウら(Nikaido)(1982)J.Biol.Chem.257:7322〜29；スタントンら(Stanton)(1982)Nucleic Acids Res.10:5993〜6006；グリッツマッヒャー(Gritzmacher)(1989)前記；デービスら(Davis)(1980)Science 209:1360；オバタら(Obata)(1981)、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.78:2437〜41；カタオカら(Kataoka)(1981)Cell 23:357；モワットら(Mowatt)(1986)、J.Immunol.136:2674〜83；スジュレクら(Szurek)(1985)J.Immunol.135:620〜6；およびウら(Wu)(1984)EMBO J.3:2033〜40）。
S-S組換えは染色体内組換えに限定され、その結果交換されたCH遺伝子の欠失が起こるため、単一のB細胞が一つ以上のアイソタイプを同時にその表面に発現することができるという所見は、クラススイッチメカニズムでは説明がつかない。異なる染色体から生じた２つの転写物が結合して１つの連続した転写物を形成する、トランススプライシングと呼ばれる第二のメカニズムが記述されている（シミズら(Shimizu)(1991)、J.Exp.Med.173:1385〜1393）。マウスIgH座の外側に組み込まれる再配列された発現可能なVHDHJH重鎖μ遺伝子を有するトランスジェニックマウスでは、内因性CH領域に正確にスプライシングされる導入遺伝子のVHDHJH領域を有するmRNAが産生されることが判明している。S-S組換えに関しては、トランススプライシングの発生率は低く、両メカニズムを制御する因子は十分に理解されていない。
診断および治療試薬としての抗体の価値および可能性は、当技術分野において、長い間認められてきた。残念なことに、この分野は、望ましい特異性の抗体の大量製造に必要な、遅く長たらしいプロセスによって妨害されている。古典的な細胞融合技術により、抗体を産生するB細胞を無限増殖細胞株と融合させることによってモノクローナル抗体の効率的な製造が可能となった。得られた細胞株はハイブリドーマ細胞株と呼ばれる。しかし、これらのモノクローナル抗体のほとんどがマウス系にて製造されており、ヒト免疫系によって「異物」蛋白質として認識される。したがって、患者の免疫系により抗体に対する応答が誘発され、その結果、抗体の中和およびクリアランス、および／または抗原-抗体免疫応答に関連する重篤となりうる副作用が起こる。
この問題に対する一つのアプローチは、異物エピトープとして容易に「認識」されず、患者における抗原-抗体免疫応答を回避するようなヒトまたは「ヒト化」のモノクローナル抗体を開発することであった。ヒトB細胞ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体の施用は、癌、微生物およびウイルス感染症、異常に低い抗体産生に関連したB細胞免疫不全症、自己免疫疾患、炎症、移植の拒絶および免疫系のその他の障害、ならびにその他の疾患の治療において有望な可能性を有する。しかし、そのようなヒトモノクローナル抗体の開発にはいくつかの障害が残っている。例えば、多くのヒト腫瘍抗原はヒトにおいて免疫誘発性ではない可能性があり、したがってヒト抗原に対して抗体を産生するヒトB細胞を単離することが難しいかも知れない。
ヒトの治療剤としての抗体に関連した問題に取り組む試みの中で、組換えDNA技術が用いられている。こうした努力のほとんどは、ヒトCH領域および非ヒト（例えば、マウス）抗原結合（可変）領域を有するキメラ抗体の製造に焦点があてられていた。これらのキメラ抗体は、一般に、望ましい抗体可変領域および／または定常領域をクローニングし、クローニングした配列を、望ましい可変および定常領域を有する機能的キメラ抗体の全てまたは一部をコードする単一の構築物に結合させ、抗体を発現することが可能な細胞に構築物を導入し、かつキメラ抗体を安定に発現する細胞を選択することによって製造される。または、キメラ抗体は、望ましい可変領域または定常領域をクローニングし、構築物を抗体産生細胞に導入し、望ましい可変領域と内因性可変領域、または望ましい定常領域と内因性定常領域との間の相同的組換えに起因するキメラ抗体産生細胞の選択によって製造する。キメラ抗体を製造するための上記のような組換えDNA技術による技術の例は、国際公開公報第86/01533号（ニューバーガーら(Neuberger)）ならびに米国特許出願第4,816,567号（キャビリーら(Cabilly)）および第5,202,238号（フェルら(Fell)）に記述されている。これらの方法は、DNAを一つの細胞からもう一つの細胞へと移し、それにより該DNAをその天然の座から除去する必要があり、最終的な抗体コード構築物が確実に機能的（例えば、望ましい遺伝子産物の転写および翻訳が可能）であるためには、DNAの注意深いインビトロ操作を必要とする。
この分野では、従来の相同的組換えよりも効率的で、多数のクローニング段階を必要とせず、かつハイブリドーマ細胞において実施できる、望ましい蛋白質または抗体を製造する方法が明らかに必要とされている。
発明の概要
本発明は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子に由来するスイッチ(S)領域を用いて、一つのDNA配列を別の配列に置換する方法を特徴とする。本発明の方法により、いかなる２つのDNAも「変換される」ことが可能となり、または１片の外因性DNAを天然または人工的S領域を含む部位に挿入することが可能となる。このように、本発明の方法により、指向性組換えを起こすことが可能となり、現在の組換えDNA技術に必要とされる多くのクローニング段階を省略することが可能となる。
本発明の方法において、指向性組換えは標的構築物と標的座との間で起こる。核酸標的構築物は、最小でも、スイッチ領域と、スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーターとを含む。またさらに、所望の組換え産物に応じて、標的構築物は、スイッチ領域に機能的に結合する修飾配列およびスイッチ領域の3'、およびプロモーターとスイッチ領域との間のその他のDNA配列、例えば、スイッチ領域の5'およびプロモーター領域の3'を含むことができる。特に重要なことは、アイソタイプスイッチング、例えば抗体重鎖遺伝子における内因性定常領域(CH)（標的配列）を異なるサブタイプ、アイソタイプ、または起源となる種のCH（修飾配列）への置換を容易にするために、Ig重鎖を有する標的構築物を使用することである。例えば、異なる定常または可変領域を有する抗体をコードする配列を作製するために、抗体の軽鎖または重鎖の定常または可変領域をコードする外因性DNAを、内因性配列の定常または可変領域と置換することができる。より広い意味で、本発明の方法は、非抗体ポリペプチドに結合した所望の可変領域を有するキメラ抗体の製造を含む（例えば、検出可能なポリペプチド標識、または望ましい活性を有するポリペプチド）、望ましい蛋白質または蛋白質成分の製造のためのDNA配列の操作に広く適用可能である。
一つの局面において、本発明は、a)標的座が、最小でもプロモーター、スイッチ領域、および標的配列を含むものであり、標的構築物が最小でもプロモーターとスイッチ領域とを含み、さらに修飾配列を含みうるものである、標的構築物を、標的座を有する細胞に導入する段階、b)細胞を培養して標的座および標的構築物の転写を可能にし、それによって標的座および標的構築物のスイッチ領域の組換えを促進させる段階、およびc)最小でもスイッチ領域を含む（標的座スイッチ領域および標的構築物スイッチ領域の１つまたは双方からのDNA配列を含む）、望ましい組換えDNA産物を含む細胞を選択する段階を含む方法による、指向性スイッチ媒介組換え法を特徴とする。
本発明の特殊な態様において、標的構築物(P1-S1)はプロモーター(P1)とスイッチ領域(S1)とを含み、標的座(P2-S2-T)はプロモーター(P2)、天然のまたは人工的に挿入したスイッチ領域(S2)と標的配列(T)とを含む。S-S領域間の指向性S-S組換えにより、標的構築物のP1プロモーター、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域、およびT配列を有するDNA配列(P1-S1/S2-T)を生じる。この態様において、標的配列は標的座プロモーターの調節から外れ、望ましいP1プロモーターの調節下に入る。所望のDNA配列を含む細胞は、サザンブロット分析またはPCRを含む当技術分野で公知の方法によって選択される。
もう一つの態様において、標的構築物(P1-S-M)は、プロモーター(P1)、スイッチ領域(S1)、および修飾配列(M)を含み、標的座(P2-S2-T)は、プロモーター(P2)、天然または人工的に挿入されたスイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む。S-S領域の間の指向性S-S組換えにより、可能な２つの組換え産物の配列が生じ、１つは標的構築物のP1プロモーターと、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域と、T配列(P1-S/S2-T)とを有し、第二の配列は、P2プロモーターと、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域と、M配列とを有する(P1-S1/S2-M)。この態様において、M配列を発現している細胞は、サザンブロットまたはノザンブロット分析を含む、当技術分野で既知の方法によって選択される。
第三の態様において、標的構築物(P1-Z-S1)は、プロモーター(P1)、スイッチ領域の5'のDNA配列(Z)およびスイッチ領域(S1)を含む。標的座(P2-S2-T)は、プロモーター(P2)、天然または人工的に挿入されたスイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む。スイッチ領域間の指向性S-S組換えにより、標的構築物のP1プロモーター、Z DNA配列、および１つまたは双方のスイッチ領域からのDNA配列を含むスイッチ領域、およびT配列を有するDNA配列(P1-Z-S1/S2-T)が得られる。
標的座はスイッチ領域を有するDNA配列で、本来の天然の配列（例えば、抗体産生細胞のIg座）、再配列Ig座、または望ましい部位に人工的に挿入して組換え的に産生されたDNA配列であってもよい。標的座は、染色体外エレメントであっても安定的に組み込まれた染色体エレメントのいずれであってもよい。標的座が抗体の重鎖遺伝子である場合、標的構築物の修飾配列は、関係する異なるまたは修飾された重鎖定常領域または非抗体配列（例えば、検出可能なポリペプチド標識、酵素、毒素、または増殖因子）をコードすることが好ましい。
本発明は、指向性S-S組換えによりDNA配列を修飾する方法を提供する。本発明により、S領域が人工的に挿入された部位を含む、天然のスイッチ領域または合成スイッチ領域を含むいかなる部位へのDNA組換えの指向も可能となる。
本発明は、標的配列を含むヌクレオチド配列の単離、標的配列の摘出、および標的配列の部位での修飾配列のライゲーションを必要とすることなく、第二のDNA配列（修飾配列）によって第一のDNA配列（標的配列）を置換または修飾する方法を提供する。本発明はまた、ポリペプチドが、例えばポリペプチドに対して明確な機能的または構造的特徴（例えば、リガンド結合または細胞結合）を付与する２つの別個の成分（例えば、N末端成分とC末端成分）を含む場合、異種アミノ酸配列によってポリペプチドコード配列の一部を置換する方法を提供する。例えば、本発明により、異なる異質のアミノ酸コード配列によるN末端部分の置換、または異なる異質なアミノ酸コード配列によるC末端部分の置換のいずれかが可能となる。
指向性スイッチ媒介組換えにより、免疫グロブリン重鎖に限定された天然に起こるメカニズムと比べて、より効率的に、特定の予め選択した領域で組換えを起こすことが可能となる。本発明の方法は、スイッチ媒介組換えをその正常な制御的環境の制約から外し、例えば、構成的または誘発可能なプロモーターを用いる際に必要とされるように、組換えの調節を可能にする。
指向性インビトロS-媒介組換えを実施できれば、非常に効率の良いDNA配列の挿入法を提供しながら、従来の組換えDNA技術を用いた退屈で時間を浪費するDNA操作が不要となる。例えば、本方法により、融合蛋白質の検出可能な標識部分（例えば、β-ガラクトシダーゼ）を異なるアミノ酸配列（例えば、アルカリフォスファターゼ）に容易に交換することが可能となる。
本発明の方法の特殊な応用において、指向性S-S組換えを用いて、抗体重鎖遺伝子のさらなる操作を必要とすることなく、抗体重鎖遺伝子の定常領域を、異なるまたは修飾した定常領域に置換する。さらに、本発明の方法は、抗体遺伝子をその本来の座において維持することを可能にする。
本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、以下に述べる本発明の組成物、組成物成分、方法および方法段階の詳細により当業者には明らかとなると思われる。
【図面の簡単な説明】
図１は、免疫グロブリンの基本構造を示す概略図である。
図２Aは、プロモーター(P2)、スイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む標的座の基本成分を示す概略図である。
図２Bは、プロモーター(P2)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列(Y)、スイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む標的座の基本成分を示す概略図である。
図３Aは、プロモーター(P1)およびスイッチ領域(S2)を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Bは、プロモーター(P1)、スイッチ領域(S1)、および修飾配列を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Cは、プロモーター(P1)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列(Z)、およびスイッチ領域(S1)を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Dは、選択可能なマーカー遺伝子および／または増幅遺伝子のようなさらなる成分を含んでもよい、プロモーター(P1)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5に位置するDNA配列(Z)、スイッチ領域(S1)および修飾配列を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図４Aは、標的構築物P1-S1と標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図４Bは、標的構築物P1-S1-Mと標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図４Cは、標的構築物P1-Z-S1と標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図５は、23 kbヒトγ2遺伝子座全体（5'コントロールエレメント、Iエキソン、スイッチ領域、コード配列、膜および分泌エキソン、ポリA）、マウス3'エンハンサー配列、CMVプロモーター／エンハンサーカセット、およびSV2ヒグロマイシン選択可能マーカーを有する本発明の指向性標的構築物(pTSW-1.4)の概略図である。
図６は、図５の説明文に記述のエレメント、pTSW-1.4とは反対方向のCMVプロモーター／エンハンサーカセットを有する本発明の標的構築物(pTSW-1.9)の概略図である。
図７は、23 kbヒトγ2生殖系列クローン（スイッチ領域およびヒトγ2オープンリーディングフレーム；Iエキソン、および5'制御エレメントは含まない）からクローニングした12 kbのBamHI断片、スプライシングドナー部位を提供するCMVプロモーター／エンハンサーカセット、およびSV2ヒグロマイシン選択可能マーカー；マウス3'エンハンサーは含まない、を有する本発明の標的構築物(pTSW-2)の概略図である。
図８は、クローニングしたHindIII-EcoRIマウスγ1ゲノムスイッチ断片（5'制御エレメント、Iエキソン、およびマウスγ1スイッチ配列）、CMVプロモーターカセット（pTSW-3.2シリーズのSFFVプロモーターカセット）、ヒトγ2オープンリーディングフレームおよびスプライシングアクセプターのゲノムクローン、SV2ヒグロマイシン選択可能マーカー、および選択的にマウス3'エンハンサー配列を有する本発明の標的構築物(pTSW-3.1)の概略図である。
図９は、7.9 kbのBglII-EcoRIマウスγ1ゲノムスイッチ断片（Iエキソン、およびマウスγ1スイッチ配列；5'制御エレメントは含まない）、CMVプロモーターカセット（pTSW-3.2シリーズのSFFVプロモーターカセット）、ヒトγ2オープンリーディングフレームおよびスプライシングアクセプターのゲノムクローン、SV2ヒグロマイシン選択可能マーカー、および選択的にマウス3'エンハンサー配列を有する本発明の標的構築物(pTSW-3.1BglII)の概略図である。
詳細な説明
本発明の方法および組成物について記述および開示する前に、本発明は、当然改変される可能性があるように記述された特定の方法および組成物に限定されないことを理解されたい。同様に、本明細書で用いられる用語は、本発明の範囲が添付の請求の範囲によってのみ制限されるため、特定の態様を記述することのみを目的としており、制限を意味するものではない。
本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」は、本文に明確にそれ以外の意味であることを述べていない限り、複数を示すものを含むことに注意しなければならない。したがって例えば、「一つのDNA配列(a DNA sequence)」と言及する場合、複数のDNA配列および異なるタイプのDNA配列を含む。
別途定義していなければ、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記述されたものと同等または同一のいかなる材料または方法も、本発明の実践または試験において用いることができ、好ましい方法および材料について本明細書に記述する。本明細書で言及した全ての出版物は、それに関連して出版物が引用される特定の情報を記述および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。上記の出版物は、本出願の提出日以前にそれらが開示された場合に限りに提供される。本明細書のいかなるものも、本発明者に、先行発明の開示に先立つ権利を与えるための認可であると解釈されるべきではない。
定義
「人工的構築物」または「人工的スイッチ領域」等のように用いられる「人工的」という用語は、単離された天然または非天然に生じる材料、例えば、ヒトの介入、例えば、天然の配列を共に融合する、または天然の配列を単独で化学的に合成することによって製造されたヌクレオチド配列を意味する。
「スイッチ領域」という用語は、本来免疫グロブリン重鎖定常領域の5'に生じ、染色体内クラススイッチ、すなわち免疫グロブリン重鎖定常領域の特定の部分をコードするDNA配列の組換えにおいて機能する。タンデムリピート配列を含むヌクレオチド配列を意味する。特定のスイッチ領域配列の例は、参照として特に本明細書に組み入れられる、ミルズら(Mills)(1995)、J.Immunol.155:3021〜3036に開示される。「スイッチ領域」には、スイッチ領域が転写の際に組換えを容易にするという機能を保持する限り、本来の免疫グロブリン配列の完全鎖長の両スイッチ配列と共に、本来の免疫グロブリンスイッチ領域と比較して修飾された（例えば、ヌクレオチド置換、付加、変異、および／またはその他の修飾を含む）組換えおよび合成ヌクレオチド配列が含まれる。
「スイッチ媒介組換え」または「指向性S-S組換え」という用語は、スイッチ領域によって容易となった染色体間、染色体内、または染色体外のDNA組換えを意味するよう互換可能に用いられる。例えば、S-S組換えは、1)プロモーターの3'に位置する第一のスイッチ領域（標的構築物）と、2)プロモーターの3'およびDNA配列の5'に位置する第二のスイッチ領域（標的座）との相互作用によって生じる。第一および第二のスイッチ領域の転写の活性化後、スイッチ領域間で組換えが起こり、その結果標的座DNA配列が変化する。本発明の指向性S-S組換えにより、２つの異なる染色体上、同じ染色体上のDNA配列間、１つの染色体と１つの細胞外染色体エレメントとの間、または２つの染色体外エレメントの間に相互作用が起こる。
「標的構築物」という用語は、天然または人工的スイッチ領域において指向性S-S組換えを生じさせるために細胞に導入される核酸構築物を意味する。標的構築物は最小でも：1)スイッチ領域と、2)スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーターとを含む。選択的に、標的構築物はさらに、3)スイッチ領域に機能的に結合され3'に位置する修飾配列を含む。標的構築物はまた、4)スイッチ領域とプロモーターとの間の１つ以上のDNA配列を含んでいてもよい。用いる実際の標的構築物に応じて、得られるmRNAは、スイッチ領域、またはスイッチ領域と修飾配列、またはスイッチ領域とスイッチ領域および／もしくは修飾配列の間のDNA配列をコードする。
「標的座(target locus)」という用語は、最小でも1)スイッチ領域、2)スイッチ領域に隣接し、3'に位置する標的配列、および3)１つ以上の翻訳可能mRNAとして、スイッチ領域および標的配列が転写されるよう、標的座に機能的に位置するプロモーターを含む核酸配列を意味する。標的座はさらに、スイッチ領域に隣接して5'に位置するさらなるDNA配列を含むことができる；そのような構築物において、プロモーターは、１つ以上の翻訳可能mRNAとしてさらなるDNA配列、スイッチ領域、および標的配列の転写を可能にする。「標的座(target loci)」は、天然に生じるものでも（例えば、スイッチ領域の5'に位置する再配列VDJ領域およびCH遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子）、または組換えもしくは合成のいずれにより産生されるものであってもよく、かつ染色体または染色体外のいずれに位置していてもよい。具体例としての標的配列は、好ましくはヒト抗体の定常領域をコードするコード領域の5'に機能的に位置するスイッチ領域の5'に機能的に位置するプロモーター配列を含む。
「標的配列」という用語は、指向性S-S組換えが起こるスイッチ領域に隣接する核酸配列を意味する。本発明の方法の一つの態様において、標的配列は、スイッチ媒介組換え後の修飾配列によって置換される。「標的配列」は、染色体配列に対して内因性である天然の配列であっても、または染色体外エレメントとして（例えば、ベクター）もしくは染色体配列の中に安定に組み込まれたエレメントとして存在する組換え配列（すなわち組換え遺伝子操作を用いて産生された配列）であってもよい。標的配列は、天然のスイッチ領域であってもよく、または組換えDNA技術によって所望の標的配列の5'に挿入されるスイッチ領域であってもよいスイッチ領域に隣接する。具体例としての標的配列は、修飾配列とは異なり、特定のアイソタイプ、サブタイプ、および／または起源の免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする配列を含む。
「免疫グロブリン(Ig)座」という用語は、その座またはそのプロセスからの抗体分子の発現を制御する調節配列の全てまたは一部を含む、抗体分子の定常領域および／または可変領域の全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列を意味する。Ig座の重鎖遺伝子は、スイッチ領域、イントロン配列、および重鎖遺伝子に関連する隣接配列または重鎖遺伝子の隣接配列と共に、VH、DH、JHおよび定常領域の全てまたは一部を含むがこれに制限されない。軽鎖のIg座は、カッパおよびラムダ対立遺伝子の双方のVL、JL、および定常領域、イントロン配列、ならびに軽鎖遺伝子に関連する隣接配列または軽鎖遺伝子の隣接配列を含むがこれに制限されない。
「修飾標的座」という用語は、修飾標的配列が、最小でも非修飾標的座スイッチ領域、または非修飾標的座と標的構築物との双方に由来するスイッチ配列を含むスイッチ領域を包含するように、スイッチ媒介DNA組換えによって修飾された核酸配列を意味する。本発明の一つの態様において、修飾された標的座もまた、非修飾標的配列のプロモーター、非修飾標的配列の第一のDNA配列（もとの標的座に存在する場合）、および標的構築物の修飾配列を含む。プロモーターによる転写活性化の結果、１つ以上の翻訳可能なmRNAにおいて、第一のDNA配列、スイッチ領域、および修飾配列の転写が起こる。
「プロモーター」という用語は、関係するDNA配列に機能的に結合すると、そのDNA配列の転写を促進するヌクレオチド配列を意味する。
「検出可能なポリペプチド標識」という用語は、別のアミノ酸配列と共有結合すると、容易に検出できる異質な配列を提供するアミノ酸配列を意味する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド特異的抗体の結合によって、ポリペプチドの酵素活性により、またはポリペプチドと化学試薬との反応によって検出することができる。具体例としての検出可能なポリペプチド標識には、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、これらの酵素の酵素的に活性な部分、または免疫検出可能で関連するアミノ酸配列と異質ないかなるアミノ酸配列も含まれる。
指向性S-S組換え（全般）
指向性スイッチ領域媒介組換え法は、特定の核酸配列における組換えを容易にするために、スイッチ領域（例えば、免疫グロブリン座から単離および由来するもの）を用いる。S-S組換えが指向される核酸配列は、S領域を含み、「標的座」と呼ばれるが、S領域配列を含む導入された核酸配列は「標的構築物」と呼ばれる。各S領域の転写により、２つの予め選択したDNA領域の間にS-S組換えが起こることが可能となる。選択したプロモーターが存在すれば、構成的または誘導可能な転写が得られ、それによって、S-S組換えの発生頻度が増強する。
本発明での使用に適した具体例としての標的座の基本成分を図２Aに図示する。標的座の最小成分は（5'から3'）：１）プロモーター（P2、矢印は転写の方向を示す）、２）スイッチ領域(S2)、および３）標的配列(T)である。または、標的座はさらに、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するさらなるDNA配列(Y)を含むことができる（図２B）。その組成物にかかわらず、標的座成分は、プロモーターが5'DNA配列（選択的）、スイッチ領域、および標的配列（選択的）の転写を活性化するように位置する。標的座は、内因性の天然に起こる染色体配列（例えば、5'DNA配列がVHDHKH遺伝子で標的配列がCH遺伝子であるIg重鎖座）、または染色体外エレメント（例えば、ベクターまたはプラスミド）または安定な染色体組み込み物のいずれかとして存在する人工的に構築された配列（すなわち組換え的に産生された配列または合成配列）のいずれかであることができる
本発明において用いられる具体例としての標的構築物の基本成分を図３A〜３Dに図示する。標的構築物の最小成分（5'から3'）は：１）プロモーター（P1、矢印は転写の方向を示す）および２）スイッチ領域(S)（図３A）である。標的構築物はさらに、３）Sの3'に位置する修飾配列（図３B）、および／または４）Sの5'に位置する１つ以上のDNA配列（図３C）を含むことができる。さらに、標的構築物は選択可能マーカー（図３D）を含むことができる。標的構築物成分は、プロモーターがスイッチ領域および修飾配列の転写を活性化するように位置する。標的構築物は通常、組換え的または合成的に生じた核酸配列で、染色体外エレメント（例えば、プラスミドまたはベクター）または安定な染色体組み込み体のいずれかとして、本発明の方法において用いることができる。具体例としての修飾配列は、アイソタイプスイッチングにおいて用いられるCH遺伝子を含む（すなわち標的座のCH遺伝子を、異なるアイソタイプまたはサブタイプのCH遺伝子に置換）。
それを通じて染色体内S-媒介組換え（S-S組換えとも呼ばれる）がクラススイッチ現象において起こる正確なメカニズムは、十分にはわかっていない（この問題の総説に関しては、コフマンら(Coffman)、1993、Adv.Immunol.54:229〜71参照）。特定の理論に拘束されることなく、天然に起こるS-媒介組換えは２つの染色体内スイッチ領域の同時転写によって誘発される（ス＆スタブネザー(Xu and Stavnezer)(1990)Develop.Immunol.1:11〜17；ロスマンら(Rothman)(1990)Mol.Cell.Biol.10:1672〜1679；ユングら(Jung)(1993)Science 159:984〜987）。例えば、IgM抗体を産生する細胞において、IgM重鎖遺伝子（VHDHJH領域、スイッチ領域(Sμ)、およびCμ遺伝子を含む）は、構成的に転写および翻訳される。クラススイッチング（例えば、IgGの産生への）は、第二のスイッチ領域（例えばSγ）が転写されると起こる。第二のスイッチ領域の転写は、CH座のスイッチ領域のそれぞれに関連する調節エレメントによって制御されると思われる。これらの調節エレメントのそれぞれは、通常、例えば、微生物感染症または炎症において活性化することができるサイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子）に関連する細胞性シグナルの異なる組み合わせ（すなわち、１つ以上の細胞シグナル）によって活性化される。次には、細胞シグナルの産生もまた、特定のタイプの感染症および炎症に関連している。このように、特定のタイプの感染症または炎症の結果：１）細胞性シグナルの特定の組み合わせの産生が起こり、これが次には２）どのスイッチ領域調節エレメントが活性化されるかを決定し、その結果として３）異なる、特異的抗体アイソタイプを生じるために（コフマンら(Coffman)1993、前記）、スイッチ領域がその会合するCH領域と、構成的に転写されたSμおよびCμ領域との組換えを促進するように転写される。
本発明は、上記の正常な細胞制御メカニズムによる調節を受けないような方法で、関係する予め選択された部位への組換えを指向する方法を提供する。図４A〜４Cに図示するように、本発明の指向性S-S組換えは、２つの転写的に活性化されたスイッチ領域によって媒介されるスイッチ部位特異的組換えを容易にするために、最小でもスイッチ領域(S1)およびプロモーター(P1)、およびスイッチ領域(S2)を含む標的座ならびにプロモーター(P2)の調節下にある標的配列(T)を含む標的構築物を用いる。得られた組換え産物は、最小でも、１つまたは双方のスイッチ領域、例えば、S1、またはS1/S2からの配列を有するスイッチ領域を含むだろう。標的構築物がP1およびS1を含む場合、望ましい組換え産物は、P1プロモーター、スイッチ領域、および今度はP2の代わりにP1の調節下にある標的配列、を含むと思われる（図４A）。望ましい組換え産物は、PCRを含む当技術分野に既知の多くの方法において認識される。P1が誘発可能なプロモーターである場合、望ましい組換え産物を含む細胞は転写の誘導によって認識することができる。標的構築物がP1、S1および修飾配列を含む場合、望ましい組換え産物は、P2プロモーター、スイッチ領域、および標的配列と置換する修飾配列を含むと思われる（図４B）。スイッチ領域は、１つまたは双方のスイッチ領域、例えばS1またはS1/S2からの配列を含んでもよい。修飾配列が蛋白質またはペプチドをコードする場合、望ましい組換え産物は、望ましい産物の合成によって認識することができる。標的構築物がP1、S1の5'のDNA配列、およびS1を含む場合、望ましい組換え産物はP1および標的座に挿入されたS1領域の5'に位置するDNA配列を含む（図４C）。望ましい組換え産物は、5'DNA配列および／またはP1の存在のPCRによる検出、または免疫検出技術を含む様々な方法において同定することができる。
さらに、標的構築物を用いて、特殊な染色体に含まれる標的座の3'にDNA片を挿入することができる。この態様において、標的構築物は、相同組換えによって、選択された染色体への挿入を可能にする相同配列を有する。得られた修飾染色体は、標的座の3'部位において標的構築物のDNAを含む。この態様は、染色体内S-媒介組換えの誘導に有用である。
スイッチ領域
クラススイッチング（またはアイソタイプスイッチング）は、最初IgMを発現しているBリンパ球が、変異に基づいてその重鎖アイソタイプをIgG、IgA、またはIgEにスイッチする場合に起こる。アイソタイプスイッチングは、最初、VHDHJH領域の下流に位置した重鎖のCμ定常領域がCγ、Cα、またはCε定常領域に置換される、欠失的DNA組換えイベントに起因する（ラビッツら(Rabbitts)(1980)Nature 283:351；デービスら(Davis)(1980)前記；カタオカら(Kataoka)(1981)、前記）。
マウスSμ、Sε、Sα、Sγ3、Sγ1、Sγ2bおよびSγ2aスイッチ領域およびSμおよびSγ4のようなヒトSμスイッチ領域を含む、いくつかのスイッチ領域の特徴付けがなされている（ミルズら(1995)J.Immunol.155:3021〜3036、参照として特に本明細書に組み入れられる）。マウスSμ領域は約３ kbで、n＝１〜７およびm＝150である[(GAGCT)nGGGGT]mの配列を有する3'領域（ニカイドウら(Nikaido)(1981)、前記）、および５量体配列(C/T)AGGTTGを有し、これらの２つの５量体が散在している5'領域（マルクら(Marcu)(1982)、前記）に分けることができる。ヒトSμ座は、７量体配列が領域全体に分布しているという点において、わずかに異なる（タカハシら(Takahashi)(1982)前記；ミルズら(1990)前記）。その他のスイッチ領域はより複雑な繰り返し配列のパターンを含むが、全てのスイッチ配列は、５量体配列GAGCTおよびGGGGT（ニカイドウら(Nikaido)1982）前記；スタントンら(Stanton)(1982)前記）の多数のコピーを含む。５量体ACCAG、GCAGC、およびTGAGCもまた、スイッチ領域に一般に認められる（グリッツマッヒャー(1989)前記）。さらに、７量体リピート(C/T)AGGTTGはスイッチ領域配列に豊富に存在し、プラスマ細胞腫およびハイブリドーマにおいて特徴付けがなされている、全てではないがほぼ多くのスイッチ組換え部位に認められる（マルクら(Marcu)(1982)前記）。
マウスSεおよびSα座はそれぞれ、タンデムリピートである40 bpおよび80 bpの配列を有する。これらの配列は、特にGAGCT５量体を含むリピートの領域においてSμと相同である。ヒトおよびマウスSγ領域はいずれも、SεおよびSαに比べてSμに対する相同性がはるかに低い。Sμに対するマウスSγ領域の相同性は、可変領域の3'の距離が増加すれば減少する(Sγ3＞Sγ1＞Sγ2b＞Sγ2a)。マウスSγ領域は、49 bpまたは52 bp(Sγ2a)のタンデムリピートを含み、その中にTGGGG、GCAGC、およびACCAGの５量体配列が一般的に見られる（カタオカら(Kataoka)(1981)前記；モワットら(1986)前記；ニカイドウら(Nikaido)(1982)前記、ニカイドウら(Nikaido)(1981)前記；スタントンら(Stanton)(1982)前記；スジュレクら(Szurek)(1985)前記；ウら(Wu)(1984)前記）。
本発明において使用に適したスイッチ領域は、天然に起こる配列、例えば、Ig座、好ましくはマウスまたはヒトIg座から直接クローニングしたスイッチ領域であることができる。または、スイッチ領域は合成的にまたは組換え的に産生された配列であることができる。組換えスイッチ領域は、本来の天然に起こるスイッチ領域と同じ配列を有することができ、またはスイッチ領域が組換えを容易にするというその機能を保持する限り、本来のスイッチ領域と比較して修飾することができる（例えば、ヌクレオチド置換、付加、変異、および／またはその他の修飾を含む）。組換え型スイッチ領域は、本来のスイッチ領域と同じ（またはこれより低いが許容可能な）レベル、または野生型スイッチ領域によって促進される組換えと比較して増強されたレベルでの、スイッチ媒介組換えに必要な最小のヌクレオチド配列を有するようにデザインすることができる。
本発明のスイッチ媒介組換えは、天然に起こるメカニズムより有効性が改善したS-S組換えを提供すると共に、望ましい蛋白質を産生する広い応用法を提供する。これは、一部、標的構築物、標的座、または標的構築物と標的座の双方の構成的または誘導可能な転写を提供するプロモーターを用いることによって行われる。本発明のスイッチ媒介組換え法の改善された有効性は、天然に起こる場合より高いレベルで、すなわち１％〜100％の改善した効率で；より好ましくは20％〜100％の改善；およびより好ましくは50％〜100％の改善レベルでの組換え頻度を提供する。
標的構築物
上記のように、本発明の標的構築物は最小でも、１）スイッチ領域および２）スイッチ領域に機能的に結合して5'に位置するプロモーターを含む。標的構築物のさらなる選択的な成分は、３）蛋白質、選択可能マーカー、および／または調節エレメントを含む、スイッチ領域に機能的に結合して3'に位置する修飾配列、および／または４）プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列を含む。プロモーターの転写活性化の結果、１つ以上の翻訳可能なmRNAが産生される。
標的構築物プロモーター
標的構築物のプロモーターは、その中で指向性S-S組換えが行われる細胞タイプ（例えば、真核生物または原核生物細胞、通常真核生物細胞）に従って選択される。指向性S-S組換えは、標的構築物と標的座のスイッチ領域の転写に依存するため、標的構築物のプロモーターは構成的または誘導可能なプロモーターであることができる。原核生物または真核生物におけるDNA発現に適した構成的および強い構成的プロモーターは、当技術分野で周知である。その中で指向性S-S組換えが起こる細胞が真核生物細胞である場合、プロモーターは重鎖IgプロモーターまたはCMV、SN40、マウスモロニー肉腫ウイルス(MMLV)、および脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーターのようなウイルスプロモーター、またはMMTVおよびα-インヒビンのような誘導可能なプロモーターであることができる。
修飾配列
修飾配列は、標的座における標的配列の置換に適したいかなる核酸配列であることもできる。例えば、修飾配列は、標的配列の全てまたは一部を置換するために翻訳産物をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、標的配列がCH遺伝子である場合、修飾配列は、異なる本来のCH遺伝子、修飾されたCH遺伝子（例えば、野生型のCH遺伝子と比較して変化したイフェクター機能をコードする）、または本来もしくは修飾された軽鎖定常領域であることができる。または、修飾配列は、修飾された標的配列によってコードされるポリペプチドに対して機能を付与する非抗体由来ポリペプチドをコードすることができる。例えば、修飾配列は、毒素、ホルモン、増殖因子、またはその一部をコードすることができる。修飾配列はまた、その他の（例えば、同様に修飾された）重鎖遺伝子産物または非抗体ポリペプチド（例えば、毒素、増殖因子、ホルモンまたはその他の生物学的に重要なポリペプチドもしくはその他の分子）の間の共有または非共有結合を提供するリンカーをコードすることができる。修飾配列のさらにもう一つの例は、ポリペプチドの検出および／または単離を容易にするために（例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィー）、検出可能なポリペプチド標識またはタグ、例えば、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはそれに対して抗体が結合することができる免疫検出可能なポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列である。
またはもしくはさらに、修飾配列はスイッチ領域の3'位に制御配列を導入する、または標的配列に既に存在する制御配列を置換するために用いることができる制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーエレメント、イントロン、またはリボゾーム結合部位）を含むことができる。例えば、弱いプロモーターが標的座スイッチ領域の3'または5'に位置する場合、スイッチ媒介組換えを用いて、標的座における弱いプロモーターを強いプロモーターに置換することができる。Ig座の修飾において特に重要な具体例としての制御配列は、重鎖エンハンサー配列、カッパ鎖エンハンサー配列、またはMMLV、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、もしくはSFFVに由来するプロモーターを含む。
標的構築物はまた、修飾された標的座を増幅したスイッチ媒介産物にすることが可能な増幅遺伝子を含んでもよい。当技術分野に既知の本発明に適したおよび有用な多くの増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子がある。
修飾配列は、修飾を受けるべき標的配列を含む様々な要因、および／または得られた組換え産物に対して予定される診断的または治療的利用に従って選択する。
プロモーターの3'とスイッチ領域の5'に存在するさらなる配列
標的構築物は、標的座のプロモーターとスイッチ領域の間に機能的に位置するさらなる転写および翻訳可能DNA配列を含むことができる。このさらなる配列は、標的座によってコードされるポリペプチドのN末端部分をコードすることができる。例えば、標的構築物は望ましいVHDHJHポリペプチドをコードすることができる。標的配列において望ましいCH遺伝子を有するIg重鎖座をコードする標的座による望ましいスイッチ組換えに基づき、組換え産物は、その間に位置するスイッチ領域と共に、望ましいVHDHJH領域および望ましいCHコード領域を含む。
その他の成分
標的構築物は、当技術分野に周知で、市販されている多様ないかなるベクター（例えば、pBR322、pACYCベクター、プラスミド、およびウイルスベクター）にも基づくことができる。「ベクター」は、望む細胞を形質転換またはトランスフェクトさせるために用いることができるいかなるDNAまたはRNA分子（自己複製型、またはそうでないもの）も含む。標的構築物は、染色体外または染色体に組み込まれたエレメントとして標的構築物を含む細胞のスクリーニングおよび選択を容易にするために、および／または指向性S-S組換えを行って成功する細胞を選択するために、選択可能なマーカーのようなその他の成分、例えば、修飾配列に加えて標的座に組換えられる修飾配列に関連した選択可能なマーカー、を含むことができる。適した選択可能なマーカー遺伝子は、検出可能なマーカー（例えば、β-ガラクトシダーゼ）または薬物耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性(hyg)、グアノシン燐酸トランスフェラーゼ(gpt)、ネオマイシン耐性(neo)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ピューロマイシン(spt)およびアンピシリン耐性(Amp)）をコードする遺伝子を含む。構築物はまた、細菌細胞における構築物の安定な複製のための複製起点（高コピー数の複製起点が好ましい）、核移動シグナル、またはDNA構築物、それによってコードされる蛋白質、もしくはその双方の産生を容易にするその他のエレメントを含むことができる。真核生物の発現のためには、構築物は、特に、関係するDNAがcDNAである場合（例えば、天然に起こる配列のイントロンを含まない）、関係するDNAの発現レベルを増加させることができる増幅遺伝子を含んでもよい。DHFRを含む、当技術分野で既知の多様ないかなる増幅遺伝子も用いてもよい。
標的構築物を用いるための標的
上記のように、本発明の方法において使用に適した標的座は、最小でも１）スイッチ領域、２）スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的DNA配列、および３）mRNA分子としてスイッチ領域と標的配列の転写を提供するために構築物に機能的に位置するプロモーターを含む。標的座はさらに、スイッチ領域に隣接して5'に位置するさらなるDNA配列を含むことができる；そのような構築物では、プロモーターは、１つ以上の転写可能mRNAとして、さらなるDNA配列、スイッチ領域および標的配列の転写を提供する。
一般に、本発明の標的構築物の使用に適した標的座は、その中でスイッチ領域が転写され、スイッチ媒介組換えを容易にすることができるいかなるスイッチ含有配列であってもよい。標的座は、スイッチ領域を含むいかなる本来の内因性染色体配列（例えば、Ig重鎖座）であることも可能である。または、標的座は、染色体外エレメント（例えば、ベクターまたはプラスミド）または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして存在する、人工的に組換え的に産生された配列であることができる。本発明の特殊な態様において、同じ染色体上の標的座の3'に標的構築物の一部を挿入することが望ましい場合、標的構築物は標的座の3'の部位での組換えを指向する相同配列を運ぶ。そうすれば、S-媒介組換えは染色体内で起こり、このようにして、染色体内組換えの調節された誘導が可能となる。
プロモーター
標的座のプロモーター(P2)は、本来の、天然に起こる標的座配列および／または標的配列に存在するプロモーター、または標的座配列および／または標的配列と異質なプロモーターであることができる。S-S組換えはスイッチ領域の転写に関連するため、標的座プロモーターは、少なくとも低レベルの発現を提供することが好ましく、構成的な発現を提供することがより好ましく、標的座、特にスイッチ領域コードDNAの高レベルの構成的な発現を提供することがより一層好ましい。標的座に関連するプロモーターが、スイッチ領域の不適当なレベルの、または望ましくない低レベルの転写を提供する場合、本来の標的座プロモーターはS-媒介組換えまたは、当技術分野で周知の、例えばクローニング、相同組換えのようなその他の組換え法を用いて、異なるプロモーターで修飾または置換することができる。
プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に存在するさらなる配列
上記のように、標的座は標的座のプロモーターとスイッチ領域の間に機能的に位置する、さらなる、転写可能および翻訳可能なDNA配列を含むことができる。例えば、さらなる配列は、ポリペプチドのN末端部分をコードしてもよく、標的座はポリペプチドのC末端部分をコードする標的配列を含んでもよい。指向性スイッチ媒介組換えの後、修飾標的座は、ポリペプチドのN-およびC末端部分の双方を含むだろう。
その他の成分
標的座は、原核生物および／または真核生物細胞における複製、構築物の真核生物染色体への組み込みを容易にするためのさらなる成分、および構築物を含む細胞の選択および／またはスクリーニングに役立つマーカー（例えば、標的構築物に関して上記の検出可能なマーカーおよび薬物耐性遺伝子）を含むことができる。真核生物の発現に関しては、好ましくは構築物は、発現すべき遺伝子の3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含むべきである。ポリアデニル化シグナル配列は当技術分野に既知の多様なポリアデニル化シグナル配列のいかなるものから選択してもよい。ポリアデニル化シグナル配列は、SV40早期ポリアデニル化シグナル配列であることが好ましい。標的座の発現はまた、標的構築物に関して上記のように、イントロン配列を含めることによって増強することができる。
具体例としての本発明の組換え標的座は、（5'から3'）：１）プロモーター、２）DNA配列をスイッチ領域の5'に挿入するための第一の多クローニング部位、３）スイッチ領域、および４）標的DNA配列の挿入のための第二の多クローニング部位を含む。例えば、標的座が組換え型Ig重鎖遺伝子である場合、VHDHJH DNA配列は第一の多クローニング部位のスイッチ領域の5'に挿入され、標的配列は、第二のクローニング部位に挿入されたCH領域である。
本発明の方法での使用に適した細胞株
関係する標的座を発現することが可能ないかなる哺乳類細胞株も、本発明での使用に適している。例えば、標的座がIg重鎖遺伝子である場合、細胞株は機能的抗体を発現することが可能ないかなる哺乳類細胞であってもよい。特に重要なのは、抗体産生細胞または抗体産生能を有する細胞（例えば、幹細胞）におけるクラススイッチを容易にするために、本発明のスイッチ媒介組換え法を利用することである。例えば、細胞株は、例えば、ヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞株、胎児幹細胞（例えば、マウス胎児幹細胞）、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）のB細胞から生じたハイブリドーマ細胞株、または重鎖Ig座の少なくとも機能的部分、または軽鎖Ig座の少なくとも機能的部分を発現することができるその他の細胞（通常、哺乳類細胞）であることができる。本発明の方法において有用な細胞株の一例は、ゼノマウスからのB細胞に由来するヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞株である（グリーンら(Green)Nature Genetics ７：13および国際公開公報第94/02602号、その両者が参照として本明細書に組み入れられている）。ゼノマウスは、機能的に不活化されたマウス重鎖およびカッパ軽鎖対立遺伝子を含むと共に、ヒト重鎖の大きいセグメントおよびその生殖系列に組み込まれたK鎖座を有する。ゼノマウスは、ヒト重鎖(hμ)およびヒトK軽鎖(mK)、またはhμおよびマウスラムダ(mλ)軽鎖を発現するB細胞を産生する。一つの軽鎖が発現されればその他の発現は完全に妨害されるため、hκとmλの同時発現は起こらない（グリーンら(Green)(1994)前記）。免役すると、ゼノマウスは広い、成人様範囲のヒトIgを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生する。ゼノマウスは、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマの産生を可能にする。ハイブリドーマ細胞株を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、ハーロウ＆レーン（Harlow and Lane)編、1988、抗体：実験マニュアル(Antibody:A Laboratory Manual)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY参照）。ヒト、または「人体に適合させた」抗体を発現する細胞株の産生法も、当技術分野において周知である（例えば、国際公開公報第94/02602号および国際公開公報第91/10741号参照）。
細胞株が抗体産生リンパ様細胞株である場合、細胞株はゲノム配列、修飾された配列、異種配列（例えば、別の種からのIg配列）、修飾された異種配列、またはキメラ配列（例えば、マウスとヒトIg配列の双方を含む）のいずれかからの抗体を発現することができる。このように、細胞株は例えば、マウス、ヒト、またはキメラ抗体のいずれかを産生するマウスハイブリドーマ細胞株であることができる。ハイブリドーマ細胞株は、例えば、ヒトIg遺伝子の発現によってヒト抗体を産生することができる。一つの態様において、細胞はヒトIg遺伝子の発現によってヒト抗体を産生するマウスリンパ様細胞である。態様の一つの変法において、ゲノム配列の定常領域遺伝子は、ヒト定常(hCH)領域遺伝子、例えば、ミュークラス(hCHμ)のhCH遺伝子で、修飾配列はガンマクラス(hCHγ)ヒト定常領域である。
スイッチ媒介組換えを用いる方法
本発明の構築物を用いるスイッチ媒介組換えは、多様な方法によって行うことができる。例えば、１）標的座は天然に起こる（染色体に位置する）ものであることが可能で、標的構築物は染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして用いることができる；または２）標的座は天然に起こる配列、または染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして存在する組換え的に産生された配列であることができ、標的構築物は染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして用いることができる。標的構築物および標的座がいずれも染色体に組み込まれる場合、それらは、同じまたは異なる染色体に組み込まれる。
染色体標的座および染色体に組み込まれた標的構築物を用いたスイッチ媒介組換え
この態様において、指向性S-媒介組換えを実施するために用いられる細胞株は：１）内因性の天然に起こる標的座を含む、または２）染色体に組み込まれた組換え標的座をのいずれか含む。DNAを宿主細胞に導入し、関係する特異的DNA配列を含む安定な染色体組込み体を選択する方法は、当技術分野で周知である（例えば、サムブルックら(Sambrook)1989、分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY；本明細書に、関係する安定に組み込まれたDNAを含む形質転換細胞および関係するDNAの発現を提供する組換えDNA技法のための方法および組成物に関する参照として組み入れられる）。
標的構築物は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって直線にすることができ、直線DNAは、当技術分野で既知の多様な方法のいかなるもの（例えば、電気穿孔、微量注射、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、プロトプラスト融合、酵母細胞融合、または当技術分野に既知のその他のいかなる方法（例えば、サムブルックら(Sambrook)前記、参照））を用いても宿主細胞に導入することができる。次に、直線ベクターを、指向性相同組換えによって細胞のゲノムにランダムまたは特異的に組み込み、例えば、標的構築物に関連した選択可能なマーカーの発現、または標的構築物における修飾配列の発現によって、安定な組み込み体を選択する。
指向性スイッチ媒介組換えは、標的座および標的ベクターにおけるスイッチ領域の同時転写によって得られる。組換え産物、例えば、修飾された標的座を含む細胞を、修飾標的座遺伝子の発現によって同定および選択する（例えば、ELISA反応性または蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)）。
染色体標的座および染色体外標的構築物を用いるスイッチ媒介組換え
本発明の方法のこの態様において、標的構築物は、当技術分野に周知の方法によって染色体組込み標的座を含む細胞に導入される（例えば、サムブルックら(Sambrok)、1989、前記参照）。この上記方法とは対照的に、標的構築物は、標的構築物のスイッチ領域の転写および標的座の転写的活性化スイッチ領域による組換えに十分な時間、染色体外エレメントとして維持される。望ましい組換え産物、例えば修飾された標的座を含む細胞は、上記のように、例えば組み込まれた標的配列に関連する選択可能なマーカーの発現の選択、または望ましい修飾された標的座遺伝子産物を発現する細胞の検出によって、同定および選択することができる。
スクリーニングおよび選択
適切に組換えられた配列の検出は、望みの組換え産物の特性に応じて様々な方法によって行うことができる。例えば、選択可能マーカーに関連する修飾配列が修飾配列を有する標的座において組換えられる場合、最初のスクリーニングにより、マーカーを発現する細胞が選択されるだろう。第二のスクリーニングを用いて、薬物耐性細胞が適切に修飾された標的座を発現するか否かを決定することができる。
第二のスクリーニングで用いられる方法は、標的座に挿入される修飾配列の特性によって変化する。修飾配列は、修飾配列の一部をプローブとして用いるサザンブロットによって、または修飾領域および修飾された領域に由来する増幅プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、検出することができる。適切に組み込まれた修飾配列を有する細胞はまた、機能的に修飾された標的座産物の発現を検出することによって、例えば、修飾された抗体重鎖座における新しいCH領域の免疫検出によっても同定することができる。または、修飾された標的座の発現産物は、修飾配列によって与えられた特定のイフェクター機能を調べるバイオアッセイを用いて検出することができる。例えば、酵素、毒素、増殖因子、またはその他のペプチドのような生体活性分子をコードする修飾配列の発現を、特殊な生物活性に関してアッセイする。
標的座がIg遺伝子の場合、修飾された標的座の産物もまた、当技術分野に既知のいかなる従来の免疫学的スクリーニング法、例えば、ELISA、FCAS、抗体依存的細胞障害性アッセイ、または免疫沈降アッセイ（例えば、ハーロウ＆レーン(Harlow and Lane)前記参照）によって適当な抗原またはリガンド認識に関して試験することができる。
実施例
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の様々な構築物の作製法および利用法ならびに本発明の様々な方法の実施法を完全に開示および記述するために提出し、本発明者がその発明の範囲と見なすものを制限することを意図していない。それ以外であることを示していなければ、割合は重量での割合、温度はセ氏温度、および圧力は大気圧または大気圧に近い。用いた数値（例えば、DNA配列の長さ、分子量、量、特定の成分等）に関しては正確性を保証するよう努力したが、何らかのずれがあれば説明がなされる。
実施例１．スイッチ媒介組換えの標的構築物（pTSW-1.4およびpTSW-1.9）
生じた全てのベクターは、低コピー数のpACYC177プラスミド(NEB)に基づいた。ベクターpTSW-1.4は、ヒト胎盤ゲノムライブラリから単離された完全なヒトγ2スイッチ領域の23 kb EcoRIゲノム断片を含むp1bYACδNotプラスミドから産生した。この断片は２ kbのコード配列、Iエキソンおよびγ2スイッチ領域を含む12 kbの上流配列、および９ kbの下流配列を含む（フラナガン＆ラビッツ(Flanagan and Rabbitts)(1982)、Nature 300:709〜713)。このプラスミドはまた、マウス3'エンハンサー（ダリアバックら(Dariavach)(1991)、Eur.J.Immnol.21:1499〜1504）を含む。ベクターは、ヒグロマイシン選択可能マーカーおよびヒトCMVプロモーター-エンハンサーカセットを含むように修飾され、その3'末端に原核生物ターミネーター配列が含まれた（下記）。原核生物ターミネーター配列は、スイッチ配列の活性化による偶然の原核生物転写物を停止させるために用い、このようにして、細菌におけるクローニングの際にそれらを脱安定化させた（モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)、J.Immunol.136:2674〜2683)。これらの配列は、真核生物転写に対してほとんど影響を及ぼさないことが確認された。
SV40プロモーターによって駆動されるヒグロマイシン遺伝子（ギオルダノ＆マックアリスター(Giordano and McAllister)(1990)Gene 88:285〜288)は、pUC219.TG76プラスミドからの1.7 kb HindIII-BamHI断片としてクローニングされ、pACYC177のHIndIIIおよびBamHI部位に挿入されて、pACYC.hygプラスミドを生じた。
ターミネーターは、GCATGCCCGCGGGAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGCGGCTCGA（配列番号：１）として、クローニングのために、隣接SphI部位および3'末端での内部XhoI部位と共に合成された。この配列を、ヒトCMVプロモーター-エンハンサー配列の下流にあるpIK1.1CatプラスミドのSphI部位にクローニングした。
CMV発現カセットは、ターミネーター配列と共に、900 bpのHindIII-XhoI断片としてクローニングされ、これを上記のpACYC.hygプラスミドのHindIIIおよびXhoI部位に置いて、CMV転写方向がヒグロマイシン遺伝子の方向と反対であるpACYC.hyg.CMVtを産生する。
ヒグロマイシンおよびCMVターミネーターカセットの双方を含む2.6 kb断片を、BamHIおよびXhoI消化によって、pACYC.hyg.CMVtから切除した。この断片の両端をリンカーを用いてNot I部位に変換し、断片を23 kbヒトγ2配列およびマウス3'エンハンサーを含むp1bYACδNotプラスミドの独自のNot I部位にクローニングした。pTSW-1.4プラスミド（図５）は、ヒトγ2コード配列と同じ方向のCMV転写方向により産生した。pTSW-1.9プラスミド（図６）は、ヒトγ2コード配列の方向とは反対方向のCMV転写方向により産生した。
pTSW-1.4として命名される、具体例としての本発明の標的構築物を図５に示す。pTSW-1.4は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子(hCHγ2)によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換(hCHγ2)に用いられるように構築された。pTSW-1.4構築物は、IgG2重鎖Iエキソンおよびその5'隣接配列、ヒトIgG2スイッチ領域、完全なヒトhCHγ2遺伝子、およびIgG2重鎖領域に隣接する配列を含む、ヒトIgG2重鎖領域（約23 kb）に5'から3'方向へ、機能的に結合するCMVプロモーターを含む。hCHγ2領域は、hCHγ2遺伝子に隣接して3'に位置するマウスエンハンサーに結合している。CMVプロモーターは強力な構成的プロモーターである。その他の構成的プロモーター（例えば、SSFV、MMLV、MCV、RSV、SV40等）をCMVプロモーターの代わりに用いることができる。hCHγ2領域はいずれも、クローニングおよびシークエンシングされている（ミルズら(Mills)(1995)前記）。マウス3'エンハンサーもまた、当技術分野で周知である（ダリアバックら(Dariavach)(1991)前記）。
実施例２．スイッチ媒介組換えのための標的構築物(pTSW-2)
pTSW-2プラスミドを産生するために、13 kbのBamHI断片を、実施例１に記述のように、p1bYACδNotプラスミドの23 kb EcoRIヒトγ2ゲノム断片からクローニングし、その後クレノウ(Klenow)による部分的フィルイン反応を行って、XhoI部位と適合性の断片末端を産生した。このクローンを、BamHIと適合する部位を作製するために、既にクレノウ反応によって部分的に満たされているpACYC.hyg.CMVyプラスミドの独自のXhoI部位に挿入した。ヒトγ2コード配列の転写方向がCMVプロモーターと同じである、正確な方向性のクローンを選択した。
もう一つの具体例としても本発明の標的構築物は、pTSW-2として命名され、図７に示す。pTSW-1.4と同様に、pTSW-2は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換(hCHγ2)において用いるために構築される。pTSW-2構築物は、ヒトIgG2スイッチ領域およびスイッチ領域の200 bp 5'隣接配列およびヒトγ2オープンリーディングフレームを含む、ヒトIgG2重鎖領域（約13 kb）に5'から3'方向へ、機能的に結合したCMVプロモーターを用いて調製する。pTSW-1.4に存在するいくつかの隣接配列はpTSW-2では存在しない。pTSW-2構築物もまた、選択可能なマーカーSV2hygおよび原核生物転写ターミネーター（スイッチ領域を安定化するため）を含む。pTSW-2構築物はhCHγ2遺伝子の3'に位置するマウスエンハンサーと共に、または伴わずに調製することができる。
実施例３．スイッチ媒介組換えのための標的構築物(pTSW-3.1)
pTSW-3.1プラスミド（図８）を産生するために、２ kbのヒトγ2コード配列をXhoI-SalI断片としてp1bYACδNotからのPCRによってクローニングした（実施例１）。この断片を、ターミネーター配列の3'に存在するpACYC.hyg.CMVtプラスミドの独自のXhoIにクローニングした。マウスγ1スイッチ配列は、p-γ-1/EH10.0プラスミド（モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)前記）から10 kb HindIII-EcoRI断片として摘出し、末端をそれぞれXhoIおよびSalIに変換した。修飾されたプラスミドを、pACYC.hyg.CMVtの独自のXhoI部位を通じて、ヒトγ2領域の5'にクローニングした。pTSW-3.1dBglIIプラスミド（図９）は、7.9 kbのBglII-EcoRIマウスγ1スイッチ配列を含むことを除いては、pTSW-3.1と同様にして産生した。
pTSW-3.2は、CMVプロモーター-エンハンサーカセットを脾臓フォーカス形成ウイルス(SSFV)プロモーターに置換したことを除いては、pRSW-3.1に記述のように構築した。
pTSW-3プラスミドは、独自のNotIおよびMluI部位を含んだ（独自のBamHI部位からリンカーによって変換した）。HindIIIは、直線化および3'エンハンサーのくローニングに用いる。
さらなる具体例としての本発明の標的構築物は、pTSW-3.1と命名され、図８に示す。pTSW-1.4およびpTSW-2と同様に、pTSW-3.1は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子(hCHγ2)によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換に用いられるために構築される。pTSW-3.1構築物は、同様にマウスγ1 Iエキソンおよび隣接配列、および5'隣接分岐点およびスプライシングアクセプターを含むヒトゲノム定常hCHγ1、hCHγ2、またはhCHγ4コード配列を含んでもよいマウスγ1スイッチ領域に、5'から3'方向に機能的に結合したCMVプロモーターを用いて調製される。pTSW-3.1構築物は選択的にさらに、mSγ1配列に隣接して5'に位置するマウスγ1調節エレメント(mIγ1)を含むことができる。またはγ1遺伝子(hSγ1)のヒトスイッチ領域およびIエキソン(hIγ1)のようなその5'隣接配列は、mIγ1およびmSγ1の代わりに用いることができる。Iエキソンを含まない構築物では、スプライシングドナー部位がプロモーター配列の3'に提供される。pTSW-3.1構築物はさらに、選択的にhCHγ遺伝子に隣接して下流に位置するマウス3'エンハンサーおよび／またはhCHγ遺伝子の3'に隣接して位置する3'真核細胞転写ターミネーターを含んでもよい。pTSW-3構築物の各エレメントは当技術分野で周知である（マウスSγ4、Sμ、ミルズら(Mills)(1991)前記；マウスSγ1、モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)前記；ヒトSγ、ミルズら(Mills)(1995)前記；マウス3'エンハンサー、ダリアバックら(Dariavach)(1991)前記）。pTSW-3.1構築物はまた、選択可能なSV2γ2hygおよびHindIII直線化部位を含む。例えば、ピューロマイシンのようなその他の選択可能なマーカーを用いてもよい。
実施例４．ハイブリドーマ細胞株におけるスイッチ媒介組換え
上記のように、ヒトモノクローナル抗体の産生に関連する一つの問題は、ヒトB細胞を融合させた無限増殖細胞株がマウス起源であるという点である。これにより、得られた抗体がヒト可変領域（ヒト軽鎖およびヒト重鎖可変領域(hVHDHJH)）を有するが、マウス重鎖定常領域(mCHγ)を有する組換えイベントが起こる（図８参照）。スイッチ媒介組換えは、mCHγ遺伝子をヒト重鎖定常領域(hCHγ)遺伝子に置換するために用いられる。
ヒト抗原を含む抗原に対してモノクローナルIgG抗体を発現し、ヒト重鎖可変領域(hVHDHJH)およびマウス重鎖定常領域(mCHγ)を有するハイブリドーマ細胞株は、当技術分野に周知の方法を用いて産生される（例えば、グリーンら(Green)参照）。スイッチ領域に機能的に結合したプロモーターおよびhCHγ遺伝子を含む標的構築物は上記のように構築する。上記実施例に記述した具体例としてのベクターのいかなるもの（pTSW-1.4、pTSW-2、またはpTSW-3.1）もこの方法での使用に適している。構築物を直線化し、直線構築物をハイブリドーマ細胞に、例えば、電気穿孔、リポフェクション、または当技術分野に既知のその他の方法によって導入する。構築物の安定な組み込み体を含むトランスフェクトさせたハイブリドーマ細胞を、ヒグロマイシンでの増殖能によって選択する。次に、ヒグロマイシン耐性細胞をさらに培養すると、CMVプロモーターによる標的構築物の転写が可能となり、スイッチ媒介組換えイベントが起こる。次に、ハイブリドーマ単細胞培養を、組換え抗体メッセージの増幅によって、またはサンドイッチELISAアッセイにおいて抗ヒトIgG2抗体を用いて、hCHγ2の発現に関してスクリーニングするか、またはFACSソーティングによって単離する。
実施例５．ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスにおけるスイッチ媒介組換え
スイッチ媒介組換えは以下のように、インビボでトランスジェニックマウスにおいて行ってもよい。標的ベクターをトランスジーンとしてヒト抗体産生マウスに導入し、マウスB細胞によって産生された組換え抗体またはそれらが由来するハイブリドーマを記述のようにスクリーニングする。
本発明は、最も実践的であると思われることおよび好ましい態様について本明細書に示し、記述する。しかし、本発明の範囲内にある出発材料をそこから作製してもよいこと、およびこの開示に関して当業者に対し、修飾が起こるであろうと認識される。
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人： Aya Jakobovits
(ii)発明の名称： DIRECTED SWITCH-MEDIATED DNA RECOMBINATION
(iii)配列数： 1
(iv)文書通信情報：
(A)宛名： Fish & Richardson
(B)街路名： 2200 Sand Hill Road,Suite 100
(C)市名： Menlo Park
(D)州名： California
(E)国名： USA
(F)郵便番号： 94025
(v)コンピューター読み取りフォーム：
(A)メディア形式： Floppy disk
(B)コンピューター： IBM PC compatible
(C)運転システム： PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア： AscIII
(vi)現出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)氏名： Valeta Gregg
(B)登録番号： 35,127
(C)参照／明細書番号： 07327/004001
(ix)電気通信情報：
(A)電話： (415)322-5070
(B)ファックス： (415)854-0875
(2)配列番号：１の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ： 45塩基対
(B)配列の型： 核酸
(C)鎖の数： 一本鎖
(D)トポロジー： 直鎖状
(ii)配列の種類： cDNA
(xi)配列の記載：配列番号：１：
本発明は、一般的に組換えDNA技術において用いられる方法および組成物、特に、抗体、蛋白質、またはその一部をコードするDNA配列の操作法に関する。
発明の背景
脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン(Ig)構造単位は、２つの同一な「軽」ポリペプチド鎖（約23 kDa）、および２つの同一な「重」鎖（約53〜70 kDa）からなる。４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」の字型に結合され、２つの重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンがB細胞ハイブリドーマまたはその他の細胞タイプのいずれかによって産生される場合、ジスルフィド共有結合によって結合される。
一般的な抗体構造の概要を図１に示す。軽鎖および重鎖はそれぞれ、N末端の可変領域とC末端の定常領域とからなる。軽鎖では、可変領域（「VLJL」と呼ぶ）は、定常領域(CL)との結合領域(JL)を通じて結合される可変(VL)領域からなる。重鎖では、可変領域(VHDHJH)は、多様性(DH)領域と定常領域(CH)との結合(JH)領域との結合を通じて連結する可変(VH)領域からなる。軽鎖および重鎖のVLJLおよびVHDHJH領域はそれぞれ、Ｙ字の先端で会合して抗体の抗原結合部分を形成し、抗原結合特異性を決定する。
(CH)領域により抗体のアイソタイプ、すなわちそのクラスまたはサブクラスが決定される。異なるアイソタイプの抗体は、補体の活性化能、広範な細胞タイプに存在する特異的受容体（例えば、Fc受容体）との結合能、粘膜および胎盤通過能、および基本的な４つの鎖のIgG分子のポリマー形成能など、それらのイフェクター機能が有意に異なる。
抗体は、免疫グロブリンにおいて用いられるCHタイプに従って「クラス」に分類される（IgM、IgG、IgD、IgE、またはIgA)。少なくとも５つのタイプのCH遺伝子（Cμ、Cγ、Cδ、Cε、およびCα)が存在し、いくつかの種（ヒトを含む）は、多数のCHサブタイプ（例えば、ヒトではCγ1、Cγ2、Cγ3およびCγ4）を有する。ヒトの半数体ゲノムには全部で９個のCH遺伝子、マウスおよびラットでは８個、およびその他の多くの種ではそれよりも少ない数が存在する。対照的に、軽鎖定常領域(CL)には通常、２つのタイプ、カッパ(κ)およびラムダ(λ)しか存在せず、これらの定常領域の一つのみが１本の軽鎖蛋白質に存在する（すなわち、産生されるあらゆるVLJLについて起こりうる軽鎖定常領域は一つのみである）。あるクラスにおいては、重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原の特異性によって変化しないが（例えば、IgG抗体は常に、抗体の抗原特異性にかかわりなく、Cγ重鎖定常領域を有する）、各重鎖クラスは軽鎖クラスのいずれかと関連することが可能である（例えば、CHγ領域は、κまたはλ軽鎖のいずれかとして同じ抗体に存在することが可能である）。
重鎖および軽鎖のV、D、JおよびC領域のそれぞれは、個別のゲノム配列によってコードされる。抗体の多様性は、重鎖の異なるVH、DH、およびJH遺伝子セグメントと、軽鎖のVLおよびJL遺伝子セグメントとの間の組換えによって生じる。異なるVH、DH、およびJH遺伝子の組換えは、B細胞分化の間のDNA組換えによって生じる。簡潔に述べると、重鎖配列をまず、DHJH複合体を生じるように組換えて、次に第二の組換え事象によりVHDHJH複合体が生じる。機能的重鎖は、転写に基づいて産生され、その後RNA転写物のスプライシングが起こる。機能的重鎖が産生されると、軽鎖配列の組換えが誘発されて再配列VLJL領域が生じ、これにより今度は機能的VLJLCL領域、すなわち機能的軽鎖が形成される。
B細胞分化の過程において、単一のB細胞の前駆体は、可変領域によって決定される抗原特異性を変化させることなく、発現される免疫グロブリンアイソタイプをIgMからIgGまたは免疫グロブリンの他のクラスへと変換することができる。免疫グロブリンクラススイッチングとして知られるこの現象は、各CH遺伝子(Cγを除く）の5'に位置するスイッチ(S)領域の間に起こるDNA再配列を伴う（ホンジョ(Honjo)(1983)Annu.Rev.Immunol.1:499〜528、およびシミズ＆ホンジョ(Shimizu and Honjo)(1984)Cell 36:801〜803参照）。S-S組換えは、同じ染色体上に位置する介在CH遺伝子の欠失によって、VHDHJHエキソンを、発現されるべきCH遺伝子の近位にもたらす。クラススイッチメカニズムは、サイトカインによって指示される（ミルズら(Mills)(1995)J.Immunol.155:3021〜3036）。スイッチ領域の大きさは１ kb(Sε)から10 kb(Sγ1)に及び、長さおよび配列が共に異なるタンデムリピートを含む（グリッツマッヒャー(Gritzmacher)(1988)Crit.Rev.Immunol.9:173〜200）。マウスSμ、Sε、Sα、Sγ3、Sγ1、Sγ2bおよびSγ2aスイッチ領域およびヒトSμスイッチ領域を含む、いくつかのスイッチ領域の特徴付けがなされている（ミルズ(Mills)(1995)前記；ニカイドウら(Nikaido)(1981)Nature 292:845〜8；マルクら(Marcu)(1982)Nature298:87〜89；タカハシら(Takahashi)(1982)Cell 29:671〜9；ミルズら(Mills)(1990)Nucleic Acids Res.18:7305〜16；ニカイドウら(Nikaido)(1982)J.Biol.Chem.257:7322〜29；スタントンら(Stanton)(1982)Nucleic Acids Res.10:5993〜6006；グリッツマッヒャー(Gritzmacher)(1989)前記；デービスら(Davis)(1980)Science 209:1360；オバタら(Obata)(1981)、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.78:2437〜41；カタオカら(Kataoka)(1981)Cell 23:357；モワットら(Mowatt)(1986)、J.Immunol.136:2674〜83；スジュレクら(Szurek)(1985)J.Immunol.135:620〜6；およびウら(Wu)(1984)EMBO J.3:2033〜40）。
S-S組換えは染色体内組換えに限定され、その結果交換されたCH遺伝子の欠失が起こるため、単一のB細胞が一つ以上のアイソタイプを同時にその表面に発現することができるという所見は、クラススイッチメカニズムでは説明がつかない。異なる染色体から生じた２つの転写物が結合して１つの連続した転写物を形成する、トランススプライシングと呼ばれる第二のメカニズムが記述されている（シミズら(Shimizu)(1991)、J.Exp.Med.173:1385〜1393）。マウスIgH座の外側に組み込まれる再配列された発現可能なVHDHJH重鎖μ遺伝子を有するトランスジェニックマウスでは、内因性CH領域に正確にスプライシングされる導入遺伝子のVHDHJH領域を有するmRNAが産生されることが判明している。S-S組換えに関しては、トランススプライシングの発生率は低く、両メカニズムを制御する因子は十分に理解されていない。
診断および治療試薬としての抗体の価値および可能性は、当技術分野において、長い間認められてきた。残念なことに、この分野は、望ましい特異性の抗体の大量製造に必要な、遅く長たらしいプロセスによって妨害されている。古典的な細胞融合技術により、抗体を産生するB細胞を無限増殖細胞株と融合させることによってモノクローナル抗体の効率的な製造が可能となった。得られた細胞株はハイブリドーマ細胞株と呼ばれる。しかし、これらのモノクローナル抗体のほとんどがマウス系にて製造されており、ヒト免疫系によって「異物」蛋白質として認識される。したがって、患者の免疫系により抗体に対する応答が誘発され、その結果、抗体の中和およびクリアランス、および／または抗原-抗体免疫応答に関連する重篤となりうる副作用が起こる。
この問題に対する一つのアプローチは、異物エピトープとして容易に「認識」されず、患者における抗原-抗体免疫応答を回避するようなヒトまたは「ヒト化」のモノクローナル抗体を開発することであった。ヒトB細胞ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体の施用は、癌、微生物およびウイルス感染症、異常に低い抗体産生に関連したB細胞免疫不全症、自己免疫疾患、炎症、移植の拒絶および免疫系のその他の障害、ならびにその他の疾患の治療において有望な可能性を有する。しかし、そのようなヒトモノクローナル抗体の開発にはいくつかの障害が残っている。例えば、多くのヒト腫瘍抗原はヒトにおいて免疫誘発性ではない可能性があり、したがってヒト抗原に対して抗体を産生するヒトB細胞を単離することが難しいかも知れない。
ヒトの治療剤としての抗体に関連した問題に取り組む試みの中で、組換えDNA技術が用いられている。こうした努力のほとんどは、ヒトCH領域および非ヒト（例えば、マウス）抗原結合（可変）領域を有するキメラ抗体の製造に焦点があてられていた。これらのキメラ抗体は、一般に、望ましい抗体可変領域および／または定常領域をクローニングし、クローニングした配列を、望ましい可変および定常領域を有する機能的キメラ抗体の全てまたは一部をコードする単一の構築物に結合させ、抗体を発現することが可能な細胞に構築物を導入し、かつキメラ抗体を安定に発現する細胞を選択することによって製造される。または、キメラ抗体は、望ましい可変領域または定常領域をクローニングし、構築物を抗体産生細胞に導入し、望ましい可変領域と内因性可変領域、または望ましい定常領域と内因性定常領域との間の相同的組換えに起因するキメラ抗体産生細胞の選択によって製造する。キメラ抗体を製造するための上記のような組換えDNA技術による技術の例は、国際公開公報第86/01533号（ニューバーガーら(Neuberger)）ならびに米国特許出願第4,816,567号（キャビリーら(Cabilly)）および第5,202,238号（フェルら(Fell)）に記述されている。これらの方法は、DNAを一つの細胞からもう一つの細胞へと移し、それにより該DNAをその天然の座から除去する必要があり、最終的な抗体コード構築物が確実に機能的（例えば、望ましい遺伝子産物の転写および翻訳が可能）であるためには、DNAの注意深いインビトロ操作を必要とする。
この分野では、従来の相同的組換えよりも効率的で、多数のクローニング段階を必要とせず、かつハイブリドーマ細胞において実施できる、望ましい蛋白質または抗体を製造する方法が明らかに必要とされている。
発明の概要
本発明は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子に由来するスイッチ(S)領域を用いて、一つのDNA配列を別の配列に置換する方法を特徴とする。本発明の方法により、いかなる２つのDNAも「変換される」ことが可能となり、または１片の外因性DNAを天然または人工的S領域を含む部位に挿入することが可能となる。このように、本発明の方法により、指向性組換えを起こすことが可能となり、現在の組換えDNA技術に必要とされる多くのクローニング段階を省略することが可能となる。
本発明の方法において、指向性組換えは標的構築物と標的座との間で起こる。核酸標的構築物は、最小でも、スイッチ領域と、スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーターとを含む。またさらに、所望の組換え産物に応じて、標的構築物は、スイッチ領域に機能的に結合する修飾配列およびスイッチ領域の3'、およびプロモーターとスイッチ領域との間のその他のDNA配列、例えば、スイッチ領域の5'およびプロモーター領域の3'を含むことができる。特に重要なことは、アイソタイプスイッチング、例えば抗体重鎖遺伝子における内因性定常領域(CH)（標的配列）を異なるサブタイプ、アイソタイプ、または起源となる種のCH（修飾配列）への置換を容易にするために、Ig重鎖を有する標的構築物を使用することである。例えば、異なる定常または可変領域を有する抗体をコードする配列を作製するために、抗体の軽鎖または重鎖の定常または可変領域をコードする外因性DNAを、内因性配列の定常または可変領域と置換することができる。より広い意味で、本発明の方法は、非抗体ポリペプチドに結合した所望の可変領域を有するキメラ抗体の製造を含む（例えば、検出可能なポリペプチド標識、または望ましい活性を有するポリペプチド）、望ましい蛋白質または蛋白質成分の製造のためのDNA配列の操作に広く適用可能である。
一つの局面において、本発明は、a)標的座が、最小でもプロモーター、スイッチ領域、および標的配列を含むものであり、標的構築物が最小でもプロモーターとスイッチ領域とを含み、さらに修飾配列を含みうるものである、標的構築物を、標的座を有する細胞に導入する段階、b)細胞を培養して標的座および標的構築物の転写を可能にし、それによって標的座および標的構築物のスイッチ領域の組換えを促進させる段階、およびc)最小でもスイッチ領域を含む（標的座スイッチ領域および標的構築物スイッチ領域の１つまたは双方からのDNA配列を含む）、望ましい組換えDNA産物を含む細胞を選択する段階を含む方法による、指向性スイッチ媒介組換え法を特徴とする。
本発明の特殊な態様において、標的構築物(P1-S1)はプロモーター(P1)とスイッチ領域(S1)とを含み、標的座(P2-S2-T)はプロモーター(P2)、天然のまたは人工的に挿入したスイッチ領域(S2)と標的配列(T)とを含む。S-S領域間の指向性S-S組換えにより、標的構築物のP1プロモーター、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域、およびT配列を有するDNA配列(P1-S1/S2-T)を生じる。この態様において、標的配列は標的座プロモーターの調節から外れ、望ましいP1プロモーターの調節下に入る。所望のDNA配列を含む細胞は、サザンブロット分析またはPCRを含む当技術分野で公知の方法によって選択される。
もう一つの態様において、標的構築物(P1-S-M)は、プロモーター(P1)、スイッチ領域(S1)、および修飾配列(M)を含み、標的座(P2-S2-T)は、プロモーター(P2)、天然または人工的に挿入されたスイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む。S-S領域の間の指向性S-S組換えにより、可能な２つの組換え産物の配列が生じ、１つは標的構築物のP1プロモーターと、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域と、T配列(P1-S/S2-T)とを有し、第二の配列は、P2プロモーターと、S1およびS2領域の１つまたは双方からのDNA配列を含むスイッチ領域と、M配列とを有する(P1-S1/S2-M)。この態様において、M配列を発現している細胞は、サザンブロットまたはノザンブロット分析を含む、当技術分野で既知の方法によって選択される。
第三の態様において、標的構築物(P1-Z-S1)は、プロモーター(P1)、スイッチ領域の5'のDNA配列(Z)およびスイッチ領域(S1)を含む。標的座(P2-S2-T)は、プロモーター(P2)、天然または人工的に挿入されたスイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む。スイッチ領域間の指向性S-S組換えにより、標的構築物のP1プロモーター、Z DNA配列、および１つまたは双方のスイッチ領域からのDNA配列を含むスイッチ領域、およびT配列を有するDNA配列(P1-Z-S1/S2-T)が得られる。
標的座はスイッチ領域を有するDNA配列で、本来の天然の配列（例えば、抗体産生細胞のIg座）、再配列Ig座、または望ましい部位に人工的に挿入して組換え的に産生されたDNA配列であってもよい。標的座は、染色体外エレメントであっても安定的に組み込まれた染色体エレメントのいずれであってもよい。標的座が抗体の重鎖遺伝子である場合、標的構築物の修飾配列は、関係する異なるまたは修飾された重鎖定常領域または非抗体配列（例えば、検出可能なポリペプチド標識、酵素、毒素、または増殖因子）をコードすることが好ましい。
本発明は、指向性S-S組換えによりDNA配列を修飾する方法を提供する。本発明により、S領域が人工的に挿入された部位を含む、天然のスイッチ領域または合成スイッチ領域を含むいかなる部位へのDNA組換えの指向も可能となる。
本発明は、標的配列を含むヌクレオチド配列の単離、標的配列の摘出、および標的配列の部位での修飾配列のライゲーションを必要とすることなく、第二のDNA配列（修飾配列）によって第一のDNA配列（標的配列）を置換または修飾する方法を提供する。本発明はまた、ポリペプチドが、例えばポリペプチドに対して明確な機能的または構造的特徴（例えば、リガンド結合または細胞結合）を付与する２つの別個の成分（例えば、N末端成分とC末端成分）を含む場合、異種アミノ酸配列によってポリペプチドコード配列の一部を置換する方法を提供する。例えば、本発明により、異なる異質のアミノ酸コード配列によるN末端部分の置換、または異なる異質なアミノ酸コード配列によるC末端部分の置換のいずれかが可能となる。
指向性スイッチ媒介組換えにより、免疫グロブリン重鎖に限定された天然に起こるメカニズムと比べて、より効率的に、特定の予め選択した領域で組換えを起こすことが可能となる。本発明の方法は、スイッチ媒介組換えをその正常な制御的環境の制約から外し、例えば、構成的または誘発可能なプロモーターを用いる際に必要とされるように、組換えの調節を可能にする。
指向性インビトロS-媒介組換えを実施できれば、非常に効率の良いDNA配列の挿入法を提供しながら、従来の組換えDNA技術を用いた退屈で時間を浪費するDNA操作が不要となる。例えば、本方法により、融合蛋白質の検出可能な標識部分（例えば、β-ガラクトシダーゼ）を異なるアミノ酸配列（例えば、アルカリフォスファターゼ）に容易に交換することが可能となる。
本発明の方法の特殊な応用において、指向性S-S組換えを用いて、抗体重鎖遺伝子のさらなる操作を必要とすることなく、抗体重鎖遺伝子の定常領域を、異なるまたは修飾した定常領域に置換する。さらに、本発明の方法は、抗体遺伝子をその本来の座において維持することを可能にする。
本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、以下に述べる本発明の組成物、組成物成分、方法および方法段階の詳細により当業者には明らかとなると思われる。
【図面の簡単な説明】
図１は、免疫グロブリンの基本構造を示す概略図である。
図２Aは、プロモーター(P2)、スイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む標的座の基本成分を示す概略図である。
図２Bは、プロモーター(P2)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列(Y)、スイッチ領域(S2)、および標的配列(T)を含む標的座の基本成分を示す概略図である。
図３Aは、プロモーター(P1)およびスイッチ領域(S2)を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Bは、プロモーター(P1)、スイッチ領域(S1)、および修飾配列を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Cは、プロモーター(P1)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列(Z)、およびスイッチ領域(S1)を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図３Dは、選択可能なマーカー遺伝子および／または増幅遺伝子のようなさらなる成分を含んでもよい、プロモーター(P1)、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5に位置するDNA配列(Z)、スイッチ領域(S1)および修飾配列を含む標的構築物の基本成分を示す概略図である。
図４Aは、標的構築物P1-S1と標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図４Bは、標的構築物P1-S1-Mと標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図４Cは、標的構築物P1-Z-S1と標的座P2-S2-Tの間のスイッチ媒介組換えを図示する概略図である。
図５は、23 kbヒトγ2遺伝子座全体（5'コントロールエレメント、Iエキソン、スイッチ領域、コード配列、膜および分泌エキソン、ポリA）、マウス3'エンハンサー配列、CMVプロモーター／エンハンサーカセット、およびSV2ヒグロマイシン選択可能マーカーを有する本発明の指向性標的構築物(pTSW-1.4)の概略図である。
図６は、図５の説明文に記述のエレメント、pTSW-1.4とは反対方向のCMVプロモーター／エンハンサーカセットを有する本発明の標的構築物(pTSW-1.9)の概略図である。
図７は、23 kbヒトγ2生殖系列クローン（スイッチ領域およびヒトγ2オープンリーディングフレーム；Iエキソン、および5'制御エレメントは含まない）からクローニングした12 kbのBamHI断片、スプライシングドナー部位を提供するCMVプロモーター／エンハンサーカセット、およびSV2ヒグロマイシン選択可能マーカー；マウス3'エンハンサーは含まない、を有する本発明の標的構築物(pTSW-2)の概略図である。
図８は、クローニングしたHindIII-EcoRIマウスγ1ゲノムスイッチ断片（5'制御エレメント、Iエキソン、およびマウスγ1スイッチ配列）、CMVプロモーターカセット（pTSW-3.2シリーズのSFFVプロモーターカセット）、ヒトγ2オープンリーディングフレームおよびスプライシングアクセプターのゲノムクローン、SV2ヒグロマイシン選択可能マーカー、および選択的にマウス3'エンハンサー配列を有する本発明の標的構築物(pTSW-3.1)の概略図である。
図９は、7.9 kbのBglII-EcoRIマウスγ1ゲノムスイッチ断片（Iエキソン、およびマウスγ1スイッチ配列；5'制御エレメントは含まない）、CMVプロモーターカセット（pTSW-3.2シリーズのSFFVプロモーターカセット）、ヒトγ2オープンリーディングフレームおよびスプライシングアクセプターのゲノムクローン、SV2ヒグロマイシン選択可能マーカー、および選択的にマウス3'エンハンサー配列を有する本発明の標的構築物(pTSW-3.1BglII)の概略図である。
詳細な説明
本発明の方法および組成物について記述および開示する前に、本発明は、当然改変される可能性があるように記述された特定の方法および組成物に限定されないことを理解されたい。同様に、本明細書で用いられる用語は、本発明の範囲が添付の請求の範囲によってのみ制限されるため、特定の態様を記述することのみを目的としており、制限を意味するものではない。
本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」は、本文に明確にそれ以外の意味であることを述べていない限り、複数を示すものを含むことに注意しなければならない。したがって例えば、「一つのDNA配列(a DNA sequence)」と言及する場合、複数のDNA配列および異なるタイプのDNA配列を含む。
別途定義していなければ、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記述されたものと同等または同一のいかなる材料または方法も、本発明の実践または試験において用いることができ、好ましい方法および材料について本明細書に記述する。本明細書で言及した全ての出版物は、それに関連して出版物が引用される特定の情報を記述および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。上記の出版物は、本出願の提出日以前にそれらが開示された場合に限りに提供される。本明細書のいかなるものも、本発明者に、先行発明の開示に先立つ権利を与えるための認可であると解釈されるべきではない。
定義
「人工的構築物」または「人工的スイッチ領域」等のように用いられる「人工的」という用語は、単離された天然または非天然に生じる材料、例えば、ヒトの介入、例えば、天然の配列を共に融合する、または天然の配列を単独で化学的に合成することによって製造されたヌクレオチド配列を意味する。
「スイッチ領域」という用語は、本来免疫グロブリン重鎖定常領域の5'に生じ、染色体内クラススイッチ、すなわち免疫グロブリン重鎖定常領域の特定の部分をコードするDNA配列の組換えにおいて機能する。タンデムリピート配列を含むヌクレオチド配列を意味する。特定のスイッチ領域配列の例は、参照として特に本明細書に組み入れられる、ミルズら(Mills)(1995)、J.Immunol.155:3021〜3036に開示される。「スイッチ領域」には、スイッチ領域が転写の際に組換えを容易にするという機能を保持する限り、本来の免疫グロブリン配列の完全鎖長の両スイッチ配列と共に、本来の免疫グロブリンスイッチ領域と比較して修飾された（例えば、ヌクレオチド置換、付加、変異、および／またはその他の修飾を含む）組換えおよび合成ヌクレオチド配列が含まれる。
「スイッチ媒介組換え」または「指向性S-S組換え」という用語は、スイッチ領域によって容易となった染色体間、染色体内、または染色体外のDNA組換えを意味するよう互換可能に用いられる。例えば、S-S組換えは、1)プロモーターの3'に位置する第一のスイッチ領域（標的構築物）と、2)プロモーターの3'およびDNA配列の5'に位置する第二のスイッチ領域（標的座）との相互作用によって生じる。第一および第二のスイッチ領域の転写の活性化後、スイッチ領域間で組換えが起こり、その結果標的座DNA配列が変化する。本発明の指向性S-S組換えにより、２つの異なる染色体上、同じ染色体上のDNA配列間、１つの染色体と１つの細胞外染色体エレメントとの間、または２つの染色体外エレメントの間に相互作用が起こる。
「標的構築物」という用語は、天然または人工的スイッチ領域において指向性S-S組換えを生じさせるために細胞に導入される核酸構築物を意味する。標的構築物は最小でも：1)スイッチ領域と、2)スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーターとを含む。選択的に、標的構築物はさらに、3)スイッチ領域に機能的に結合され3'に位置する修飾配列を含む。標的構築物はまた、4)スイッチ領域とプロモーターとの間の１つ以上のDNA配列を含んでいてもよい。用いる実際の標的構築物に応じて、得られるmRNAは、スイッチ領域、またはスイッチ領域と修飾配列、またはスイッチ領域とスイッチ領域および／もしくは修飾配列の間のDNA配列をコードする。
「標的座(target locus)」という用語は、最小でも1)スイッチ領域、2)スイッチ領域に隣接し、3'に位置する標的配列、および3)１つ以上の翻訳可能mRNAとして、スイッチ領域および標的配列が転写されるよう、標的座に機能的に位置するプロモーターを含む核酸配列を意味する。標的座はさらに、スイッチ領域に隣接して5'に位置するさらなるDNA配列を含むことができる；そのような構築物において、プロモーターは、１つ以上の翻訳可能mRNAとしてさらなるDNA配列、スイッチ領域、および標的配列の転写を可能にする。「標的座(target loci)」は、天然に生じるものでも（例えば、スイッチ領域の5'に位置する再配列VDJ領域およびCH遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子）、または組換えもしくは合成のいずれにより産生されるものであってもよく、かつ染色体または染色体外のいずれに位置していてもよい。具体例としての標的配列は、好ましくはヒト抗体の定常領域をコードするコード領域の5'に機能的に位置するスイッチ領域の5'に機能的に位置するプロモーター配列を含む。
「標的配列」という用語は、指向性S-S組換えが起こるスイッチ領域に隣接する核酸配列を意味する。本発明の方法の一つの態様において、標的配列は、スイッチ媒介組換え後の修飾配列によって置換される。「標的配列」は、染色体配列に対して内因性である天然の配列であっても、または染色体外エレメントとして（例えば、ベクター）もしくは染色体配列の中に安定に組み込まれたエレメントとして存在する組換え配列（すなわち組換え遺伝子操作を用いて産生された配列）であってもよい。標的配列は、天然のスイッチ領域であってもよく、または組換えDNA技術によって所望の標的配列の5'に挿入されるスイッチ領域であってもよいスイッチ領域に隣接する。具体例としての標的配列は、修飾配列とは異なり、特定のアイソタイプ、サブタイプ、および／または起源の免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする配列を含む。
「免疫グロブリン(Ig)座」という用語は、その座またはそのプロセスからの抗体分子の発現を制御する調節配列の全てまたは一部を含む、抗体分子の定常領域および／または可変領域の全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列を意味する。Ig座の重鎖遺伝子は、スイッチ領域、イントロン配列、および重鎖遺伝子に関連する隣接配列または重鎖遺伝子の隣接配列と共に、VH、DH、JHおよび定常領域の全てまたは一部を含むがこれに制限されない。軽鎖のIg座は、カッパおよびラムダ対立遺伝子の双方のVL、JL、および定常領域、イントロン配列、ならびに軽鎖遺伝子に関連する隣接配列または軽鎖遺伝子の隣接配列を含むがこれに制限されない。
「修飾標的座」という用語は、修飾標的配列が、最小でも非修飾標的座スイッチ領域、または非修飾標的座と標的構築物との双方に由来するスイッチ配列を含むスイッチ領域を包含するように、スイッチ媒介DNA組換えによって修飾された核酸配列を意味する。本発明の一つの態様において、修飾された標的座もまた、非修飾標的配列のプロモーター、非修飾標的配列の第一のDNA配列（もとの標的座に存在する場合）、および標的構築物の修飾配列を含む。プロモーターによる転写活性化の結果、１つ以上の翻訳可能なmRNAにおいて、第一のDNA配列、スイッチ領域、および修飾配列の転写が起こる。
「プロモーター」という用語は、関係するDNA配列に機能的に結合すると、そのDNA配列の転写を促進するヌクレオチド配列を意味する。
「検出可能なポリペプチド標識」という用語は、別のアミノ酸配列と共有結合すると、容易に検出できる異質な配列を提供するアミノ酸配列を意味する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド特異的抗体の結合によって、ポリペプチドの酵素活性により、またはポリペプチドと化学試薬との反応によって検出することができる。具体例としての検出可能なポリペプチド標識には、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、これらの酵素の酵素的に活性な部分、または免疫検出可能で関連するアミノ酸配列と異質ないかなるアミノ酸配列も含まれる。
指向性S-S組換え（全般）
指向性スイッチ領域媒介組換え法は、特定の核酸配列における組換えを容易にするために、スイッチ領域（例えば、免疫グロブリン座から単離および由来するもの）を用いる。S-S組換えが指向される核酸配列は、S領域を含み、「標的座」と呼ばれるが、S領域配列を含む導入された核酸配列は「標的構築物」と呼ばれる。各S領域の転写により、２つの予め選択したDNA領域の間にS-S組換えが起こることが可能となる。選択したプロモーターが存在すれば、構成的または誘導可能な転写が得られ、それによって、S-S組換えの発生頻度が増強する。
本発明での使用に適した具体例としての標的座の基本成分を図２Aに図示する。標的座の最小成分は（5'から3'）：１）プロモーター（P2、矢印は転写の方向を示す）、２）スイッチ領域(S2)、および３）標的配列(T)である。または、標的座はさらに、プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するさらなるDNA配列(Y)を含むことができる（図２B）。その組成物にかかわらず、標的座成分は、プロモーターが5'DNA配列（選択的）、スイッチ領域、および標的配列（選択的）の転写を活性化するように位置する。標的座は、内因性の天然に起こる染色体配列（例えば、5'DNA配列がVHDHKH遺伝子で標的配列がCH遺伝子であるIg重鎖座）、または染色体外エレメント（例えば、ベクターまたはプラスミド）または安定な染色体組み込み物のいずれかとして存在する人工的に構築された配列（すなわち組換え的に産生された配列または合成配列）のいずれかであることができる
本発明において用いられる具体例としての標的構築物の基本成分を図３A〜３Dに図示する。標的構築物の最小成分（5'から3'）は：１）プロモーター（P1、矢印は転写の方向を示す）および２）スイッチ領域(S)（図３A）である。標的構築物はさらに、３）Sの3'に位置する修飾配列（図３B）、および／または４）Sの5'に位置する１つ以上のDNA配列（図３C）を含むことができる。さらに、標的構築物は選択可能マーカー（図３D）を含むことができる。標的構築物成分は、プロモーターがスイッチ領域および修飾配列の転写を活性化するように位置する。標的構築物は通常、組換え的または合成的に生じた核酸配列で、染色体外エレメント（例えば、プラスミドまたはベクター）または安定な染色体組み込み体のいずれかとして、本発明の方法において用いることができる。具体例としての修飾配列は、アイソタイプスイッチングにおいて用いられるCH遺伝子を含む（すなわち標的座のCH遺伝子を、異なるアイソタイプまたはサブタイプのCH遺伝子に置換）。
それを通じて染色体内S-媒介組換え（S-S組換えとも呼ばれる）がクラススイッチ現象において起こる正確なメカニズムは、十分にはわかっていない（この問題の総説に関しては、コフマンら(Coffman)、1993、Adv.Immunol.54:229〜71参照）。特定の理論に拘束されることなく、天然に起こるS-媒介組換えは２つの染色体内スイッチ領域の同時転写によって誘発される（ス＆スタブネザー(Xu and Stavnezer)(1990)Develop.Immunol.1:11〜17；ロスマンら(Rothman)(1990)Mol.Cell.Biol.10:1672〜1679；ユングら(Jung)(1993)Science 159:984〜987）。例えば、IgM抗体を産生する細胞において、IgM重鎖遺伝子（VHDHJH領域、スイッチ領域(Sμ)、およびCμ遺伝子を含む）は、構成的に転写および翻訳される。クラススイッチング（例えば、IgGの産生への）は、第二のスイッチ領域（例えばSγ）が転写されると起こる。第二のスイッチ領域の転写は、CH座のスイッチ領域のそれぞれに関連する調節エレメントによって制御されると思われる。これらの調節エレメントのそれぞれは、通常、例えば、微生物感染症または炎症において活性化することができるサイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子）に関連する細胞性シグナルの異なる組み合わせ（すなわち、１つ以上の細胞シグナル）によって活性化される。次には、細胞シグナルの産生もまた、特定のタイプの感染症および炎症に関連している。このように、特定のタイプの感染症または炎症の結果：１）細胞性シグナルの特定の組み合わせの産生が起こり、これが次には２）どのスイッチ領域調節エレメントが活性化されるかを決定し、その結果として３）異なる、特異的抗体アイソタイプを生じるために（コフマンら(Coffman)1993、前記）、スイッチ領域がその会合するCH領域と、構成的に転写されたSμおよびCμ領域との組換えを促進するように転写される。
本発明は、上記の正常な細胞制御メカニズムによる調節を受けないような方法で、関係する予め選択された部位への組換えを指向する方法を提供する。図４A〜４Cに図示するように、本発明の指向性S-S組換えは、２つの転写的に活性化されたスイッチ領域によって媒介されるスイッチ部位特異的組換えを容易にするために、最小でもスイッチ領域(S1)およびプロモーター(P1)、およびスイッチ領域(S2)を含む標的座ならびにプロモーター(P2)の調節下にある標的配列(T)を含む標的構築物を用いる。得られた組換え産物は、最小でも、１つまたは双方のスイッチ領域、例えば、S1、またはS1/S2からの配列を有するスイッチ領域を含むだろう。標的構築物がP1およびS1を含む場合、望ましい組換え産物は、P1プロモーター、スイッチ領域、および今度はP2の代わりにP1の調節下にある標的配列、を含むと思われる（図４A）。望ましい組換え産物は、PCRを含む当技術分野に既知の多くの方法において認識される。P1が誘発可能なプロモーターである場合、望ましい組換え産物を含む細胞は転写の誘導によって認識することができる。標的構築物がP1、S1および修飾配列を含む場合、望ましい組換え産物は、P2プロモーター、スイッチ領域、および標的配列と置換する修飾配列を含むと思われる（図４B）。スイッチ領域は、１つまたは双方のスイッチ領域、例えばS1またはS1/S2からの配列を含んでもよい。修飾配列が蛋白質またはペプチドをコードする場合、望ましい組換え産物は、望ましい産物の合成によって認識することができる。標的構築物がP1、S1の5'のDNA配列、およびS1を含む場合、望ましい組換え産物はP1および標的座に挿入されたS1領域の5'に位置するDNA配列を含む（図４C）。望ましい組換え産物は、5'DNA配列および／またはP1の存在のPCRによる検出、または免疫検出技術を含む様々な方法において同定することができる。
さらに、標的構築物を用いて、特殊な染色体に含まれる標的座の3'にDNA片を挿入することができる。この態様において、標的構築物は、相同組換えによって、選択された染色体への挿入を可能にする相同配列を有する。得られた修飾染色体は、標的座の3'部位において標的構築物のDNAを含む。この態様は、染色体内S-媒介組換えの誘導に有用である。
スイッチ領域
クラススイッチング（またはアイソタイプスイッチング）は、最初IgMを発現しているBリンパ球が、変異に基づいてその重鎖アイソタイプをIgG、IgA、またはIgEにスイッチする場合に起こる。アイソタイプスイッチングは、最初、VHDHJH領域の下流に位置した重鎖のCμ定常領域がCγ、Cα、またはCε定常領域に置換される、欠失的DNA組換えイベントに起因する（ラビッツら(Rabbitts)(1980)Nature 283:351；デービスら(Davis)(1980)前記；カタオカら(Kataoka)(1981)、前記）。
マウスSμ、Sε、Sα、Sγ3、Sγ1、Sγ2bおよびSγ2aスイッチ領域およびSμおよびSγ4のようなヒトSμスイッチ領域を含む、いくつかのスイッチ領域の特徴付けがなされている（ミルズら(1995)J.Immunol.155:3021〜3036、参照として特に本明細書に組み入れられる）。マウスSμ領域は約３ kbで、n＝１〜７およびm＝150である[(GAGCT)nGGGGT]mの配列を有する3'領域（ニカイドウら(Nikaido)(1981)、前記）、および５量体配列(C/T)AGGTTGを有し、これらの２つの５量体が散在している5'領域（マルクら(Marcu)(1982)、前記）に分けることができる。ヒトSμ座は、７量体配列が領域全体に分布しているという点において、わずかに異なる（タカハシら(Takahashi)(1982)前記；ミルズら(1990)前記）。その他のスイッチ領域はより複雑な繰り返し配列のパターンを含むが、全てのスイッチ配列は、５量体配列GAGCTおよびGGGGT（ニカイドウら(Nikaido)1982）前記；スタントンら(Stanton)(1982)前記）の多数のコピーを含む。５量体ACCAG、GCAGC、およびTGAGCもまた、スイッチ領域に一般に認められる（グリッツマッヒャー(1989)前記）。さらに、７量体リピート(C/T)AGGTTGはスイッチ領域配列に豊富に存在し、プラスマ細胞腫およびハイブリドーマにおいて特徴付けがなされている、全てではないがほぼ多くのスイッチ組換え部位に認められる（マルクら(Marcu)(1982)前記）。
マウスSεおよびSα座はそれぞれ、タンデムリピートである40 bpおよび80 bpの配列を有する。これらの配列は、特にGAGCT５量体を含むリピートの領域においてSμと相同である。ヒトおよびマウスSγ領域はいずれも、SεおよびSαに比べてSμに対する相同性がはるかに低い。Sμに対するマウスSγ領域の相同性は、可変領域の3'の距離が増加すれば減少する(Sγ3＞Sγ1＞Sγ2b＞Sγ2a)。マウスSγ領域は、49 bpまたは52 bp(Sγ2a)のタンデムリピートを含み、その中にTGGGG、GCAGC、およびACCAGの５量体配列が一般的に見られる（カタオカら(Kataoka)(1981)前記；モワットら(1986)前記；ニカイドウら(Nikaido)(1982)前記、ニカイドウら(Nikaido)(1981)前記；スタントンら(Stanton)(1982)前記；スジュレクら(Szurek)(1985)前記；ウら(Wu)(1984)前記）。
本発明において使用に適したスイッチ領域は、天然に起こる配列、例えば、Ig座、好ましくはマウスまたはヒトIg座から直接クローニングしたスイッチ領域であることができる。または、スイッチ領域は合成的にまたは組換え的に産生された配列であることができる。組換えスイッチ領域は、本来の天然に起こるスイッチ領域と同じ配列を有することができ、またはスイッチ領域が組換えを容易にするというその機能を保持する限り、本来のスイッチ領域と比較して修飾することができる（例えば、ヌクレオチド置換、付加、変異、および／またはその他の修飾を含む）。組換え型スイッチ領域は、本来のスイッチ領域と同じ（またはこれより低いが許容可能な）レベル、または野生型スイッチ領域によって促進される組換えと比較して増強されたレベルでの、スイッチ媒介組換えに必要な最小のヌクレオチド配列を有するようにデザインすることができる。
本発明のスイッチ媒介組換えは、天然に起こるメカニズムより有効性が改善したS-S組換えを提供すると共に、望ましい蛋白質を産生する広い応用法を提供する。これは、一部、標的構築物、標的座、または標的構築物と標的座の双方の構成的または誘導可能な転写を提供するプロモーターを用いることによって行われる。本発明のスイッチ媒介組換え法の改善された有効性は、天然に起こる場合より高いレベルで、すなわち１％〜100％の改善した効率で；より好ましくは20％〜100％の改善；およびより好ましくは50％〜100％の改善レベルでの組換え頻度を提供する。
標的構築物
上記のように、本発明の標的構築物は最小でも、１）スイッチ領域および２）スイッチ領域に機能的に結合して5'に位置するプロモーターを含む。標的構築物のさらなる選択的な成分は、３）蛋白質、選択可能マーカー、および／または調節エレメントを含む、スイッチ領域に機能的に結合して3'に位置する修飾配列、および／または４）プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に位置するDNA配列を含む。プロモーターの転写活性化の結果、１つ以上の翻訳可能なmRNAが産生される。
標的構築物プロモーター
標的構築物のプロモーターは、その中で指向性S-S組換えが行われる細胞タイプ（例えば、真核生物または原核生物細胞、通常真核生物細胞）に従って選択される。指向性S-S組換えは、標的構築物と標的座のスイッチ領域の転写に依存するため、標的構築物のプロモーターは構成的または誘導可能なプロモーターであることができる。原核生物または真核生物におけるDNA発現に適した構成的および強い構成的プロモーターは、当技術分野で周知である。その中で指向性S-S組換えが起こる細胞が真核生物細胞である場合、プロモーターは重鎖IgプロモーターまたはCMV、SN40、マウスモロニー肉腫ウイルス(MMLV)、および脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーターのようなウイルスプロモーター、またはMMTVおよびα-インヒビンのような誘導可能なプロモーターであることができる。
修飾配列
修飾配列は、標的座における標的配列の置換に適したいかなる核酸配列であることもできる。例えば、修飾配列は、標的配列の全てまたは一部を置換するために翻訳産物をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、標的配列がCH遺伝子である場合、修飾配列は、異なる本来のCH遺伝子、修飾されたCH遺伝子（例えば、野生型のCH遺伝子と比較して変化したイフェクター機能をコードする）、または本来もしくは修飾された軽鎖定常領域であることができる。または、修飾配列は、修飾された標的配列によってコードされるポリペプチドに対して機能を付与する非抗体由来ポリペプチドをコードすることができる。例えば、修飾配列は、毒素、ホルモン、増殖因子、またはその一部をコードすることができる。修飾配列はまた、その他の（例えば、同様に修飾された）重鎖遺伝子産物または非抗体ポリペプチド（例えば、毒素、増殖因子、ホルモンまたはその他の生物学的に重要なポリペプチドもしくはその他の分子）の間の共有または非共有結合を提供するリンカーをコードすることができる。修飾配列のさらにもう一つの例は、ポリペプチドの検出および／または単離を容易にするために（例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィー）、検出可能なポリペプチド標識またはタグ、例えば、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはそれに対して抗体が結合することができる免疫検出可能なポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列である。
またはもしくはさらに、修飾配列はスイッチ領域の3'位に制御配列を導入する、または標的配列に既に存在する制御配列を置換するために用いることができる制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーエレメント、イントロン、またはリボゾーム結合部位）を含むことができる。例えば、弱いプロモーターが標的座スイッチ領域の3'または5'に位置する場合、スイッチ媒介組換えを用いて、標的座における弱いプロモーターを強いプロモーターに置換することができる。Ig座の修飾において特に重要な具体例としての制御配列は、重鎖エンハンサー配列、カッパ鎖エンハンサー配列、またはMMLV、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、もしくはSFFVに由来するプロモーターを含む。
標的構築物はまた、修飾された標的座を増幅したスイッチ媒介産物にすることが可能な増幅遺伝子を含んでもよい。当技術分野に既知の本発明に適したおよび有用な多くの増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子がある。
修飾配列は、修飾を受けるべき標的配列を含む様々な要因、および／または得られた組換え産物に対して予定される診断的または治療的利用に従って選択する。
プロモーターの3'とスイッチ領域の5'に存在するさらなる配列
標的構築物は、標的座のプロモーターとスイッチ領域の間に機能的に位置するさらなる転写および翻訳可能DNA配列を含むことができる。このさらなる配列は、標的座によってコードされるポリペプチドのN末端部分をコードすることができる。例えば、標的構築物は望ましいVHDHJHポリペプチドをコードすることができる。標的配列において望ましいCH遺伝子を有するIg重鎖座をコードする標的座による望ましいスイッチ組換えに基づき、組換え産物は、その間に位置するスイッチ領域と共に、望ましいVHDHJH領域および望ましいCHコード領域を含む。
その他の成分
標的構築物は、当技術分野に周知で、市販されている多様ないかなるベクター（例えば、pBR322、pACYCベクター、プラスミド、およびウイルスベクター）にも基づくことができる。「ベクター」は、望む細胞を形質転換またはトランスフェクトさせるために用いることができるいかなるDNAまたはRNA分子（自己複製型、またはそうでないもの）も含む。標的構築物は、染色体外または染色体に組み込まれたエレメントとして標的構築物を含む細胞のスクリーニングおよび選択を容易にするために、および／または指向性S-S組換えを行って成功する細胞を選択するために、選択可能なマーカーのようなその他の成分、例えば、修飾配列に加えて標的座に組換えられる修飾配列に関連した選択可能なマーカー、を含むことができる。適した選択可能なマーカー遺伝子は、検出可能なマーカー（例えば、β-ガラクトシダーゼ）または薬物耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性(hyg)、グアノシン燐酸トランスフェラーゼ(gpt)、ネオマイシン耐性(neo)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ピューロマイシン(spt)およびアンピシリン耐性(Amp)）をコードする遺伝子を含む。構築物はまた、細菌細胞における構築物の安定な複製のための複製起点（高コピー数の複製起点が好ましい）、核移動シグナル、またはDNA構築物、それによってコードされる蛋白質、もしくはその双方の産生を容易にするその他のエレメントを含むことができる。真核生物の発現のためには、構築物は、特に、関係するDNAがcDNAである場合（例えば、天然に起こる配列のイントロンを含まない）、関係するDNAの発現レベルを増加させることができる増幅遺伝子を含んでもよい。DHFRを含む、当技術分野で既知の多様ないかなる増幅遺伝子も用いてもよい。
標的構築物を用いるための標的
上記のように、本発明の方法において使用に適した標的座は、最小でも１）スイッチ領域、２）スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的DNA配列、および３）mRNA分子としてスイッチ領域と標的配列の転写を提供するために構築物に機能的に位置するプロモーターを含む。標的座はさらに、スイッチ領域に隣接して5'に位置するさらなるDNA配列を含むことができる；そのような構築物では、プロモーターは、１つ以上の転写可能mRNAとして、さらなるDNA配列、スイッチ領域および標的配列の転写を提供する。
一般に、本発明の標的構築物の使用に適した標的座は、その中でスイッチ領域が転写され、スイッチ媒介組換えを容易にすることができるいかなるスイッチ含有配列であってもよい。標的座は、スイッチ領域を含むいかなる本来の内因性染色体配列（例えば、Ig重鎖座）であることも可能である。または、標的座は、染色体外エレメント（例えば、ベクターまたはプラスミド）または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして存在する、人工的に組換え的に産生された配列であることができる。本発明の特殊な態様において、同じ染色体上の標的座の3'に標的構築物の一部を挿入することが望ましい場合、標的構築物は標的座の3'の部位での組換えを指向する相同配列を運ぶ。そうすれば、S-媒介組換えは染色体内で起こり、このようにして、染色体内組換えの調節された誘導が可能となる。
プロモーター
標的座のプロモーター(P2)は、本来の、天然に起こる標的座配列および／または標的配列に存在するプロモーター、または標的座配列および／または標的配列と異質なプロモーターであることができる。S-S組換えはスイッチ領域の転写に関連するため、標的座プロモーターは、少なくとも低レベルの発現を提供することが好ましく、構成的な発現を提供することがより好ましく、標的座、特にスイッチ領域コードDNAの高レベルの構成的な発現を提供することがより一層好ましい。標的座に関連するプロモーターが、スイッチ領域の不適当なレベルの、または望ましくない低レベルの転写を提供する場合、本来の標的座プロモーターはS-媒介組換えまたは、当技術分野で周知の、例えばクローニング、相同組換えのようなその他の組換え法を用いて、異なるプロモーターで修飾または置換することができる。
プロモーターの3'およびスイッチ領域の5'に存在するさらなる配列
上記のように、標的座は標的座のプロモーターとスイッチ領域の間に機能的に位置する、さらなる、転写可能および翻訳可能なDNA配列を含むことができる。例えば、さらなる配列は、ポリペプチドのN末端部分をコードしてもよく、標的座はポリペプチドのC末端部分をコードする標的配列を含んでもよい。指向性スイッチ媒介組換えの後、修飾標的座は、ポリペプチドのN-およびC末端部分の双方を含むだろう。
その他の成分
標的座は、原核生物および／または真核生物細胞における複製、構築物の真核生物染色体への組み込みを容易にするためのさらなる成分、および構築物を含む細胞の選択および／またはスクリーニングに役立つマーカー（例えば、標的構築物に関して上記の検出可能なマーカーおよび薬物耐性遺伝子）を含むことができる。真核生物の発現に関しては、好ましくは構築物は、発現すべき遺伝子の3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含むべきである。ポリアデニル化シグナル配列は当技術分野に既知の多様なポリアデニル化シグナル配列のいかなるものから選択してもよい。ポリアデニル化シグナル配列は、SV40早期ポリアデニル化シグナル配列であることが好ましい。標的座の発現はまた、標的構築物に関して上記のように、イントロン配列を含めることによって増強することができる。
具体例としての本発明の組換え標的座は、（5'から3'）：１）プロモーター、２）DNA配列をスイッチ領域の5'に挿入するための第一の多クローニング部位、３）スイッチ領域、および４）標的DNA配列の挿入のための第二の多クローニング部位を含む。例えば、標的座が組換え型Ig重鎖遺伝子である場合、VHDHJH DNA配列は第一の多クローニング部位のスイッチ領域の5'に挿入され、標的配列は、第二のクローニング部位に挿入されたCH領域である。
本発明の方法での使用に適した細胞株
関係する標的座を発現することが可能ないかなる哺乳類細胞株も、本発明での使用に適している。例えば、標的座がIg重鎖遺伝子である場合、細胞株は機能的抗体を発現することが可能ないかなる哺乳類細胞であってもよい。特に重要なのは、抗体産生細胞または抗体産生能を有する細胞（例えば、幹細胞）におけるクラススイッチを容易にするために、本発明のスイッチ媒介組換え法を利用することである。例えば、細胞株は、例えば、ヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞株、胎児幹細胞（例えば、マウス胎児幹細胞）、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）のB細胞から生じたハイブリドーマ細胞株、または重鎖Ig座の少なくとも機能的部分、または軽鎖Ig座の少なくとも機能的部分を発現することができるその他の細胞（通常、哺乳類細胞）であることができる。本発明の方法において有用な細胞株の一例は、ゼノマウスからのB細胞に由来するヒト抗体を発現するハイブリドーマ細胞株である（グリーンら(Green)Nature Genetics ７：13および国際公開公報第94/02602号、その両者が参照として本明細書に組み入れられている）。ゼノマウスは、機能的に不活化されたマウス重鎖およびカッパ軽鎖対立遺伝子を含むと共に、ヒト重鎖の大きいセグメントおよびその生殖系列に組み込まれたK鎖座を有する。ゼノマウスは、ヒト重鎖(hμ)およびヒトK軽鎖(mK)、またはhμおよびマウスラムダ(mλ)軽鎖を発現するB細胞を産生する。一つの軽鎖が発現されればその他の発現は完全に妨害されるため、hκとmλの同時発現は起こらない（グリーンら(Green)(1994)前記）。免役すると、ゼノマウスは広い、成人様範囲のヒトIgを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生する。ゼノマウスは、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマの産生を可能にする。ハイブリドーマ細胞株を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、ハーロウ＆レーン（Harlow and Lane)編、1988、抗体：実験マニュアル(Antibody:A Laboratory Manual)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY参照）。ヒト、または「人体に適合させた」抗体を発現する細胞株の産生法も、当技術分野において周知である（例えば、国際公開公報第94/02602号および国際公開公報第91/10741号参照）。
細胞株が抗体産生リンパ様細胞株である場合、細胞株はゲノム配列、修飾された配列、異種配列（例えば、別の種からのIg配列）、修飾された異種配列、またはキメラ配列（例えば、マウスとヒトIg配列の双方を含む）のいずれかからの抗体を発現することができる。このように、細胞株は例えば、マウス、ヒト、またはキメラ抗体のいずれかを産生するマウスハイブリドーマ細胞株であることができる。ハイブリドーマ細胞株は、例えば、ヒトIg遺伝子の発現によってヒト抗体を産生することができる。一つの態様において、細胞はヒトIg遺伝子の発現によってヒト抗体を産生するマウスリンパ様細胞である。態様の一つの変法において、ゲノム配列の定常領域遺伝子は、ヒト定常(hCH)領域遺伝子、例えば、ミュークラス(hCHμ)のhCH遺伝子で、修飾配列はガンマクラス(hCHγ)ヒト定常領域である。
スイッチ媒介組換えを用いる方法
本発明の構築物を用いるスイッチ媒介組換えは、多様な方法によって行うことができる。例えば、１）標的座は天然に起こる（染色体に位置する）ものであることが可能で、標的構築物は染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして用いることができる；または２）標的座は天然に起こる配列、または染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして存在する組換え的に産生された配列であることができ、標的構築物は染色体外または染色体に組み込まれたエレメントのいずれかとして用いることができる。標的構築物および標的座がいずれも染色体に組み込まれる場合、それらは、同じまたは異なる染色体に組み込まれる。
染色体標的座および染色体に組み込まれた標的構築物を用いたスイッチ媒介組換え
この態様において、指向性S-媒介組換えを実施するために用いられる細胞株は：１）内因性の天然に起こる標的座を含む、または２）染色体に組み込まれた組換え標的座をのいずれか含む。DNAを宿主細胞に導入し、関係する特異的DNA配列を含む安定な染色体組込み体を選択する方法は、当技術分野で周知である（例えば、サムブルックら(Sambrook)1989、分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY；本明細書に、関係する安定に組み込まれたDNAを含む形質転換細胞および関係するDNAの発現を提供する組換えDNA技法のための方法および組成物に関する参照として組み入れられる）。
標的構築物は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって直線にすることができ、直線DNAは、当技術分野で既知の多様な方法のいかなるもの（例えば、電気穿孔、微量注射、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、プロトプラスト融合、酵母細胞融合、または当技術分野に既知のその他のいかなる方法（例えば、サムブルックら(Sambrook)前記、参照））を用いても宿主細胞に導入することができる。次に、直線ベクターを、指向性相同組換えによって細胞のゲノムにランダムまたは特異的に組み込み、例えば、標的構築物に関連した選択可能なマーカーの発現、または標的構築物における修飾配列の発現によって、安定な組み込み体を選択する。
指向性スイッチ媒介組換えは、標的座および標的ベクターにおけるスイッチ領域の同時転写によって得られる。組換え産物、例えば、修飾された標的座を含む細胞を、修飾標的座遺伝子の発現によって同定および選択する（例えば、ELISA反応性または蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)）。
染色体標的座および染色体外標的構築物を用いるスイッチ媒介組換え
本発明の方法のこの態様において、標的構築物は、当技術分野に周知の方法によって染色体組込み標的座を含む細胞に導入される（例えば、サムブルックら(Sambrok)、1989、前記参照）。この上記方法とは対照的に、標的構築物は、標的構築物のスイッチ領域の転写および標的座の転写的活性化スイッチ領域による組換えに十分な時間、染色体外エレメントとして維持される。望ましい組換え産物、例えば修飾された標的座を含む細胞は、上記のように、例えば組み込まれた標的配列に関連する選択可能なマーカーの発現の選択、または望ましい修飾された標的座遺伝子産物を発現する細胞の検出によって、同定および選択することができる。
スクリーニングおよび選択
適切に組換えられた配列の検出は、望みの組換え産物の特性に応じて様々な方法によって行うことができる。例えば、選択可能マーカーに関連する修飾配列が修飾配列を有する標的座において組換えられる場合、最初のスクリーニングにより、マーカーを発現する細胞が選択されるだろう。第二のスクリーニングを用いて、薬物耐性細胞が適切に修飾された標的座を発現するか否かを決定することができる。
第二のスクリーニングで用いられる方法は、標的座に挿入される修飾配列の特性によって変化する。修飾配列は、修飾配列の一部をプローブとして用いるサザンブロットによって、または修飾領域および修飾された領域に由来する増幅プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、検出することができる。適切に組み込まれた修飾配列を有する細胞はまた、機能的に修飾された標的座産物の発現を検出することによって、例えば、修飾された抗体重鎖座における新しいCH領域の免疫検出によっても同定することができる。または、修飾された標的座の発現産物は、修飾配列によって与えられた特定のイフェクター機能を調べるバイオアッセイを用いて検出することができる。例えば、酵素、毒素、増殖因子、またはその他のペプチドのような生体活性分子をコードする修飾配列の発現を、特殊な生物活性に関してアッセイする。
標的座がIg遺伝子の場合、修飾された標的座の産物もまた、当技術分野に既知のいかなる従来の免疫学的スクリーニング法、例えば、ELISA、FCAS、抗体依存的細胞障害性アッセイ、または免疫沈降アッセイ（例えば、ハーロウ＆レーン(Harlow and Lane)前記参照）によって適当な抗原またはリガンド認識に関して試験することができる。
実施例
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の様々な構築物の作製法および利用法ならびに本発明の様々な方法の実施法を完全に開示および記述するために提出し、本発明者がその発明の範囲と見なすものを制限することを意図していない。それ以外であることを示していなければ、割合は重量での割合、温度はセ氏温度、および圧力は大気圧または大気圧に近い。用いた数値（例えば、DNA配列の長さ、分子量、量、特定の成分等）に関しては正確性を保証するよう努力したが、何らかのずれがあれば説明がなされる。
実施例１．スイッチ媒介組換えの標的構築物（pTSW-1.4およびpTSW-1.9）
生じた全てのベクターは、低コピー数のpACYC177プラスミド(NEB)に基づいた。ベクターpTSW-1.4は、ヒト胎盤ゲノムライブラリから単離された完全なヒトγ2スイッチ領域の23 kb EcoRIゲノム断片を含むp1bYACδNotプラスミドから産生した。この断片は２ kbのコード配列、Iエキソンおよびγ2スイッチ領域を含む12 kbの上流配列、および９ kbの下流配列を含む（フラナガン＆ラビッツ(Flanagan and Rabbitts)(1982)、Nature 300:709〜713)。このプラスミドはまた、マウス3'エンハンサー（ダリアバックら(Dariavach)(1991)、Eur.J.Immnol.21:1499〜1504）を含む。ベクターは、ヒグロマイシン選択可能マーカーおよびヒトCMVプロモーター-エンハンサーカセットを含むように修飾され、その3'末端に原核生物ターミネーター配列が含まれた（下記）。原核生物ターミネーター配列は、スイッチ配列の活性化による偶然の原核生物転写物を停止させるために用い、このようにして、細菌におけるクローニングの際にそれらを脱安定化させた（モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)、J.Immunol.136:2674〜2683)。これらの配列は、真核生物転写に対してほとんど影響を及ぼさないことが確認された。
SV40プロモーターによって駆動されるヒグロマイシン遺伝子（ギオルダノ＆マックアリスター(Giordano and McAllister)(1990)Gene 88:285〜288)は、pUC219.TG76プラスミドからの1.7 kb HindIII-BamHI断片としてクローニングされ、pACYC177のHIndIIIおよびBamHI部位に挿入されて、pACYC.hygプラスミドを生じた。
ターミネーターは、GCATGCCCGCGGGAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGCGGCTCGA（配列番号：１）として、クローニングのために、隣接SphI部位および3'末端での内部XhoI部位と共に合成された。この配列を、ヒトCMVプロモーター-エンハンサー配列の下流にあるpIK1.1CatプラスミドのSphI部位にクローニングした。
CMV発現カセットは、ターミネーター配列と共に、900 bpのHindIII-XhoI断片としてクローニングされ、これを上記のpACYC.hygプラスミドのHindIIIおよびXhoI部位に置いて、CMV転写方向がヒグロマイシン遺伝子の方向と反対であるpACYC.hyg.CMVtを産生する。
ヒグロマイシンおよびCMVターミネーターカセットの双方を含む2.6 kb断片を、BamHIおよびXhoI消化によって、pACYC.hyg.CMVtから切除した。この断片の両端をリンカーを用いてNot I部位に変換し、断片を23 kbヒトγ2配列およびマウス3'エンハンサーを含むp1bYACδNotプラスミドの独自のNot I部位にクローニングした。pTSW-1.4プラスミド（図５）は、ヒトγ2コード配列と同じ方向のCMV転写方向により産生した。pTSW-1.9プラスミド（図６）は、ヒトγ2コード配列の方向とは反対方向のCMV転写方向により産生した。
pTSW-1.4として命名される、具体例としての本発明の標的構築物を図５に示す。pTSW-1.4は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子(hCHγ2)によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換(hCHγ2)に用いられるように構築された。pTSW-1.4構築物は、IgG2重鎖Iエキソンおよびその5'隣接配列、ヒトIgG2スイッチ領域、完全なヒトhCHγ2遺伝子、およびIgG2重鎖領域に隣接する配列を含む、ヒトIgG2重鎖領域（約23 kb）に5'から3'方向へ、機能的に結合するCMVプロモーターを含む。hCHγ2領域は、hCHγ2遺伝子に隣接して3'に位置するマウスエンハンサーに結合している。CMVプロモーターは強力な構成的プロモーターである。その他の構成的プロモーター（例えば、SSFV、MMLV、MCV、RSV、SV40等）をCMVプロモーターの代わりに用いることができる。hCHγ2領域はいずれも、クローニングおよびシークエンシングされている（ミルズら(Mills)(1995)前記）。マウス3'エンハンサーもまた、当技術分野で周知である（ダリアバックら(Dariavach)(1991)前記）。
実施例２．スイッチ媒介組換えのための標的構築物(pTSW-2)
pTSW-2プラスミドを産生するために、13 kbのBamHI断片を、実施例１に記述のように、p1bYACδNotプラスミドの23 kb EcoRIヒトγ2ゲノム断片からクローニングし、その後クレノウ(Klenow)による部分的フィルイン反応を行って、XhoI部位と適合性の断片末端を産生した。このクローンを、BamHIと適合する部位を作製するために、既にクレノウ反応によって部分的に満たされているpACYC.hyg.CMVyプラスミドの独自のXhoI部位に挿入した。ヒトγ2コード配列の転写方向がCMVプロモーターと同じである、正確な方向性のクローンを選択した。
もう一つの具体例としても本発明の標的構築物は、pTSW-2として命名され、図７に示す。pTSW-1.4と同様に、pTSW-2は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換(hCHγ2)において用いるために構築される。pTSW-2構築物は、ヒトIgG2スイッチ領域およびスイッチ領域の200 bp 5'隣接配列およびヒトγ2オープンリーディングフレームを含む、ヒトIgG2重鎖領域（約13 kb）に5'から3'方向へ、機能的に結合したCMVプロモーターを用いて調製する。pTSW-1.4に存在するいくつかの隣接配列はpTSW-2では存在しない。pTSW-2構築物もまた、選択可能なマーカーSV2hygおよび原核生物転写ターミネーター（スイッチ領域を安定化するため）を含む。pTSW-2構築物はhCHγ2遺伝子の3'に位置するマウスエンハンサーと共に、または伴わずに調製することができる。
実施例３．スイッチ媒介組換えのための標的構築物(pTSW-3.1)
pTSW-3.1プラスミド（図８）を産生するために、２ kbのヒトγ2コード配列をXhoI-SalI断片としてp1bYACδNotからのPCRによってクローニングした（実施例１）。この断片を、ターミネーター配列の3'に存在するpACYC.hyg.CMVtプラスミドの独自のXhoIにクローニングした。マウスγ1スイッチ配列は、p-γ-1/EH10.0プラスミド（モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)前記）から10 kb HindIII-EcoRI断片として摘出し、末端をそれぞれXhoIおよびSalIに変換した。修飾されたプラスミドを、pACYC.hyg.CMVtの独自のXhoI部位を通じて、ヒトγ2領域の5'にクローニングした。pTSW-3.1dBglIIプラスミド（図９）は、7.9 kbのBglII-EcoRIマウスγ1スイッチ配列を含むことを除いては、pTSW-3.1と同様にして産生した。
pTSW-3.2は、CMVプロモーター-エンハンサーカセットを脾臓フォーカス形成ウイルス(SSFV)プロモーターに置換したことを除いては、pRSW-3.1に記述のように構築した。
pTSW-3プラスミドは、独自のNotIおよびMluI部位を含んだ（独自のBamHI部位からリンカーによって変換した）。HindIIIは、直線化および3'エンハンサーのくローニングに用いる。
さらなる具体例としての本発明の標的構築物は、pTSW-3.1と命名され、図８に示す。pTSW-1.4およびpTSW-2と同様に、pTSW-3.1は、ヒト重鎖IgG2定常遺伝子(hCHγ2)によるIg重鎖定常遺伝子のスイッチ媒介置換に用いられるために構築される。pTSW-3.1構築物は、同様にマウスγ1 Iエキソンおよび隣接配列、および5'隣接分岐点およびスプライシングアクセプターを含むヒトゲノム定常hCHγ1、hCHγ2、またはhCHγ4コード配列を含んでもよいマウスγ1スイッチ領域に、5'から3'方向に機能的に結合したCMVプロモーターを用いて調製される。pTSW-3.1構築物は選択的にさらに、mSγ1配列に隣接して5'に位置するマウスγ1調節エレメント(mIγ1)を含むことができる。またはγ1遺伝子(hSγ1)のヒトスイッチ領域およびIエキソン(hIγ1)のようなその5'隣接配列は、mIγ1およびmSγ1の代わりに用いることができる。Iエキソンを含まない構築物では、スプライシングドナー部位がプロモーター配列の3'に提供される。pTSW-3.1構築物はさらに、選択的にhCHγ遺伝子に隣接して下流に位置するマウス3'エンハンサーおよび／またはhCHγ遺伝子の3'に隣接して位置する3'真核細胞転写ターミネーターを含んでもよい。pTSW-3構築物の各エレメントは当技術分野で周知である（マウスSγ4、Sμ、ミルズら(Mills)(1991)前記；マウスSγ1、モワット＆ダニック(Mowatt and Dunnick)(1986)前記；ヒトSγ、ミルズら(Mills)(1995)前記；マウス3'エンハンサー、ダリアバックら(Dariavach)(1991)前記）。pTSW-3.1構築物はまた、選択可能なSV2γ2hygおよびHindIII直線化部位を含む。例えば、ピューロマイシンのようなその他の選択可能なマーカーを用いてもよい。
実施例４．ハイブリドーマ細胞株におけるスイッチ媒介組換え
上記のように、ヒトモノクローナル抗体の産生に関連する一つの問題は、ヒトB細胞を融合させた無限増殖細胞株がマウス起源であるという点である。これにより、得られた抗体がヒト可変領域（ヒト軽鎖およびヒト重鎖可変領域(hVHDHJH)）を有するが、マウス重鎖定常領域(mCHγ)を有する組換えイベントが起こる（図８参照）。スイッチ媒介組換えは、mCHγ遺伝子をヒト重鎖定常領域(hCHγ)遺伝子に置換するために用いられる。
ヒト抗原を含む抗原に対してモノクローナルIgG抗体を発現し、ヒト重鎖可変領域(hVHDHJH)およびマウス重鎖定常領域(mCHγ)を有するハイブリドーマ細胞株は、当技術分野に周知の方法を用いて産生される（例えば、グリーンら(Green)参照）。スイッチ領域に機能的に結合したプロモーターおよびhCHγ遺伝子を含む標的構築物は上記のように構築する。上記実施例に記述した具体例としてのベクターのいかなるもの（pTSW-1.4、pTSW-2、またはpTSW-3.1）もこの方法での使用に適している。構築物を直線化し、直線構築物をハイブリドーマ細胞に、例えば、電気穿孔、リポフェクション、または当技術分野に既知のその他の方法によって導入する。構築物の安定な組み込み体を含むトランスフェクトさせたハイブリドーマ細胞を、ヒグロマイシンでの増殖能によって選択する。次に、ヒグロマイシン耐性細胞をさらに培養すると、CMVプロモーターによる標的構築物の転写が可能となり、スイッチ媒介組換えイベントが起こる。次に、ハイブリドーマ単細胞培養を、組換え抗体メッセージの増幅によって、またはサンドイッチELISAアッセイにおいて抗ヒトIgG2抗体を用いて、hCHγ2の発現に関してスクリーニングするか、またはFACSソーティングによって単離する。
実施例５．ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスにおけるスイッチ媒介組換え
スイッチ媒介組換えは以下のように、インビボでトランスジェニックマウスにおいて行ってもよい。標的ベクターをトランスジーンとしてヒト抗体産生マウスに導入し、マウスB細胞によって産生された組換え抗体またはそれらが由来するハイブリドーマを記述のようにスクリーニングする。
本発明は、最も実践的であると思われることおよび好ましい態様について本明細書に示し、記述する。しかし、本発明の範囲内にある出発材料をそこから作製してもよいこと、およびこの開示に関して当業者に対し、修飾が起こるであろうと認識される。
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人： Aya Jakobovits
(ii)発明の名称： DIRECTED SWITCH-MEDIATED DNA RECOMBINATION
(iii)配列数： 1
(iv)文書通信情報：
(A)宛名： Fish & Richardson
(B)街路名： 2200 Sand Hill Road,Suite 100
(C)市名： Menlo Park
(D)州名： California
(E)国名： USA
(F)郵便番号： 94025
(v)コンピューター読み取りフォーム：
(A)メディア形式： Floppy disk
(B)コンピューター： IBM PC compatible
(C)運転システム： PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア： AscIII
(vi)現出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)氏名： Valeta Gregg
(B)登録番号： 35,127
(C)参照／明細書番号： 07327/004001
(ix)電気通信情報：
(A)電話： (415)322-5070
(B)ファックス： (415)854-0875
(2)配列番号：１の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ： 45塩基対
(B)配列の型： 核酸
(C)鎖の数： 一本鎖
(D)トポロジー： 直鎖状
(ii)配列の種類： cDNA
(xi)配列の記載：配列番号：１：
Claims (25)
- a)単一のスイッチ領域、b)スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置する異種のプロモーターおよびc)スイッチ領域に機能的に結合され３'に位置する異種の修飾配列とを含み、ここで修飾配列がヒト抗体重鎖の定常領域をコードし、該定常領域が、Cγ、Cμ、Cα、Cδ、およびCεからなる群より選択される、人工的核酸標的構築物。
- スイッチ領域の5'およびプロモーターの3'に位置する付加的なDNA配列をさらに含む、請求項１記載の標的構築物。
- 異種のプロモーターが構成的プロモーターである、請求項1記載の標的構築物。
- 異種のプロモーターが誘導可能なプロモーターである、請求項1記載の標的構築物。
- プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーター、脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、SV40プロモーター、およびマウスモロニーウイルスプロモーターより選択される、請求項1記載の標的構築物。
- a)標的構築物をＢ細胞またはＢ細胞ハイブリドーマ細胞に導入する段階、ここで標的構築物が、単一の標的構築物スイッチ領域と、標的構築物スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーター(P1)とを含み、
細胞が、標的座スイッチ領域および標的配列が転写されるよう、標的座スイッチ領域、標的座スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的配列、および標的座内に機能的に位置するプロモーター(P2)を含む標的座を有するものである、
b)標的座および標的構築物の転写を可能にするように細胞を培養し、それによって標的座のスイッチ領域と標的構築物のスイッチ領域との間の組換えが促進される段階、および
c)P1、スイッチ領域および標的配列が機能的に結合されており、標的配列がP1の制御下にある、標的構築物プロモーターP1、スイッチ領域、および標的配列を含む修飾標的座を有する細胞を選択する段階
を含む、指向性スイッチ媒介組換え法。 - a)標的構築物をＢ細胞またはＢ細胞ハイブリドーマに導入する段階、
ここで標的構築物が、単一の標的構築物スイッチ領域と、標的構築物スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーター(P1)と、標的構築物スイッチ領域に機能的に結合され3'に位置する修飾配列とを含み、
細胞が、標的座スイッチ領域および標的配列が転写されるよう、標的座スイッチ領域、標的座スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的配列、および標的座内に機能的に位置するプロモーター(P2)を含む標的座を有するものである、
b)標的座および標的構築物の転写を可能にするように細胞を培養し、それによって標的座のスイッチ領域と標的構築物のスイッチ領域との間の組換えが促進される段階、および
c)標的座プロモーターP2、スイッチ領域、および修飾配列が機能的に結合されており、
該P2、該スイッチ領域、および該修飾配列を含む、修飾標的座を有する細胞を選択する段階
を含む、指向性スイッチ媒介組換え法。 - a)標的構築物をＢ細胞またはＢ細胞ハイブリドーマに導入する段階、
ここで標的構築物が、単一の標的構築物スイッチ配列(S 1 )、標的構築物スイッチ領域に機能的に結合され5'に位置するプロモーター、および標的構築物スイッチ領域に機能的に結合され3'に位置する修飾配列を含み、
細胞が抗体重鎖を発現しており、細胞によって発現される抗体重鎖が、抗体重鎖座プロモーター、プロモーターに機能的に結合され3'に位置する抗体重鎖可変領域、可変領域に隣接して3'に位置するスイッチ領域(S2)、およびスイッチ領域に隣接して3'に位置する抗体重鎖定常領域を含む抗体重鎖座によってコードされるものである、
b)該S1とS2との間に起こるスイッチ媒介組換えが促進され、該抗体重鎖座定常領域が標的構築物の修飾配列と置換される、標的構築物の抗体発現および転写を可能にするように細胞を培養する段階、および
c)重鎖座プロモーター、重鎖可変領域、スイッチ領域、および標的構築物の修飾配列を含み、該重鎖座プロモーター、該抗体重鎖可変領域、該スイッチ領域および該修飾配列が機能的に結合されている、修飾された重鎖座を有する細胞を選択する段階
を含む、スイッチ媒介組換えによる抗体製造法。 - 単一のスイッチ領域、スイッチ領域に隣接して5'に位置する非標的配列、スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的配列および非標的配列の5'に位置するプロモーターを含み、該プロモーター、該非標的配列、該スイッチ領域および該標的配列が機能的に結合し、該標的配列が抗体重鎖定常領域を含む標的座を含む核酸。
- 標的構築物および標的座が染色体に組み込まれている、請求項６記載の方法。
- 標的座が抗体重鎖をコードする、請求項６記載の方法。
- 標的座が、標的座プロモーターと標的座スイッチ領域との間に位置する非標的配列をさらに含む、請求項６記載の方法。
- 標的構築物が導入段階の前に線状化され、該標的構築物の安定的な組み込み体を含む細胞が培養段階の前に選択されて標的座の転写が可能となる、請求項６記載の方法。
- 標的構築物が染色体外にある、請求項６記載の方法。
- 標的構築物スイッチ領域と標的座スイッチ領域との組換えが、該標的構築物スイッチ領域と該標的座スイッチ領域との間に位置する核酸の欠失に関与する、請求項１０記載の方法。
- 非標的配列がヒト抗体重鎖可変領域をコードし、標的配列がマウス抗体重鎖定常領域をコードする、請求項１２記載の方法。
- 標的座がマウス抗体重鎖をコードし、標的構築物の修飾配列がヒト抗体重鎖定常領域をコードする、請求項７記載の方法。
- 標的座が、標的座プロモーターと標的座スイッチ領域との間に位置する非標的配列をさらに含む、請求項７記載の方法。
- 標的構築物が導入段階の前に線状化され、該標的構築物の安定的な組み込み体を含む細胞が培養段階の前に選択されて標的座の転写が可能となる、請求項７記載の方法。
- 標的構築物が染色体外にある、請求項７記載の方法。
- 標的構築物および標的座が染色体に組み込まれている、請求項７記載の方法。
- 非標的配列がヒト抗体重鎖可変領域をコードし、標的配列がマウス抗体重鎖定常領域をコードし、標的構築物の修飾配列がヒト抗体重鎖定常領域をコードする、請求項１８記載の方法。
- 標的構築物スイッチ領域と標的座スイッチ領域との組換えが、該標的構築物スイッチ領域と該標的座スイッチ領域との間に位置する核酸の欠失に関与する、請求項２１記載の方法。
- 以下の段階を含む、スイッチ媒介組換えによる修飾された抗体重鎖の生産方法：
a)スイッチ媒介組換えを容易にする単離B細胞またはB細胞由来ハイブリドーマに標的構築物を導入する段階であって、該標的構築物が、機能的に結合された、標的構築物プロモーター、抗体重鎖可変領域配列、および単一のスイッチ領域(S1)を5'から3'方向に順に含み、該細胞によって発現される抗体重鎖が、機能的に結合された、標的座プロモーター、標的座抗体重鎖可変領域、スイッチ領域(S2)、および抗体重鎖定常領域を5'から3'方向に順に含む抗体重鎖標的座にコードされる段階；
b)該標的構築物が転写されるよう該細胞を培養する段階であって、S1とS2とのスイッチ媒介組換えが促進される段階；ならびに
c)機能的に結合された、標的構築物プロモーター、標的構築物重鎖可変領域、スイッチ領域、および標的座抗体重鎖定常領域を5'から3'方向に順に含む修飾標的座を含有する細胞を選択する段階であって、該修飾抗体重鎖が生産される段階。 - a)標的構築物をＢ細胞またはＢ細胞ハイブリドーマ細胞に導入する段階、ここで標的構築物が、単一の標的構築物スイッチ領域(S 1 )と、スイッチ領域の5'およびプロモーターの3'に位置する付加的なDNA配列(Z)と、プロモーター(P 1 )とを含み、
細胞が、標的座スイッチ領域および標的配列が転写されるよう、少なくとも、標的座スイッチ領域、標的座スイッチ領域に隣接して3'に位置する標的配列、および標的座内に機能的に位置するプロモーター(P 2 )を含む標的座を有するものである、
b)標的座および標的構築物の転写を可能にするように細胞を培養し、それによって標的座のスイッチ領域と標的構築物のスイッチ領域との間の組換えが促進される段階、および
c)P 1 、Z、スイッチ領域および標的配列が機能的に結合されており、標的配列がP 1 の制御下にある、標的構築物プロモーターP 1 、Z、スイッチ領域、および標的配列を含む修飾標的座を有する細胞を選択する段階
を含む、指向性スイッチ媒介組換え法。
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