JP5165387B2 - 安定な薬物複合体を調製するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を調製するための方法に関する。

発明の背景
癌の処置は、より効率的に癌細胞を標的化して殺す医薬品の開発とともに大いに進歩してきた。この目的のために、研究者らは、がん細胞によって選択的に発現される細胞表面受容体及び抗原を巧みに利用して、腫瘍特異的又は腫瘍関連抗原と結合する抗体に基づいた薬物を開発してきた。この点で、細菌及び植物毒素のような細胞毒性分子、放射性核種、並びに特定の化学療法薬が、腫瘍特異的又は腫瘍関連細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体と化学的に連結されてきた（例、国際（ＰＣＴ）特許出願公開ＷＯ ００／０２５８７、ＷＯ ０２／０６０９５５、及びＷＯ ０２／０９２１２７、米国特許第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、及び同第６，１７１，５８６号、米国特許出願公開２００３／０００４２１０ Ａ１、並びにＧｈｅｔｉｅら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１２，２６７−２７７（１９８８）参照）。そのような化合物は典型的に、それぞれ毒素「複合体」、放射性核種「複合体」、及び薬物「複合体」と呼ばれる。それらはまたしばしば、免疫複合体、放射性免疫複合体、及び免疫毒素と呼ばれる。腫瘍細胞の死滅が、薬物複合体の腫瘍細胞への結合及びメイタンシノイドの細胞毒性活性の活性化によって起こる。薬物複合体によって与えられる選択性が、正常細胞への毒性を最小限とし、それによって患者における薬物の許容性を増進する。

抗体を、メイタンシノイドのようなスルフヒドリル含有細胞毒性剤へ複合体化させる方法は、以前に説明されている（例、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び同第６，４４１，１６３号参照。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号及び同第５，４１６，０６４号は、抗体−メイタンシノイド複合体を製造する方法であって、米国特許第４，１４９，００３号及び同第４，５６３，３０４号中で説明されているように、抗体が最初にヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）試薬で修飾される方法を開示する。米国特許第５，２０８，０２０号及び同第５，４１６，０６４号はさらに、修飾抗体と過剰なスルフヒドリル含有細胞毒性剤とのｐＨ７での複合体化と、それに続くＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５クロマトグラフィカラム上での精製を説明している。抗体−薬物複合体の、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による精製もまた説明されている（例、Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３，８６１８−８６２３（１９９６）、及びＣｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，１２７−１３１（１９９２）参照）。

国際特許出願公開ＷＯ ０３／０５７１６３は、ｐＨ５．０〜８．０にて抗体を修飾し、接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）によって未反応のリンカーを取り除き、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）及び／又はアセトニトリル中でｐＨ６．０〜６．５にて抗体を複合体化し、かつイオン交換クロマトグラフィ（例、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ））を介して複合体を精製することを説明する。抗体は、増加した濃度の塩化ナトリウムで溶出される。あるいは、米国特許第６，４４１，１６３号は、前もって作られたリンカー−薬物化合物を用いて単一の工程で抗体−薬物複合体化を行うことを説明する。

抗体−薬物複合体を調製することにおける進展にもかかわらず、現在の方法は数個の要素によって制限されている。例えば、二官能性架橋剤の抗体への結合は、当分野で現在用いられている条件下では不均一であり、複合体からの薬物の緩慢な放出及び複合体の不安定性を引き起こす。その上、ヒドロキシサクシミドエステルで作出されるいくつかのタンパク質−２−ピリジルジスルフィド複合体誘導体は、不安定でかつゆっくりと崩壊する。別の制限は、複合体化過程そのものが、高分子量及び低分子量種の複合体並びに沈殿物のような望ましくない分解産物の形成を引き起こすことであり、それはより低い歩留まりという結果をもたらし得る。

したがって、上記を考慮すれば、現在入手可能な薬物複合体組成物よりも安定でかつ高純度である薬物複合体組成物を調製する改良方法への必要性が残る。本発明は、そのような方法を提供する。本発明のこれら及び他の利点、並びにさらなる本発明の特色が、本明細書中で提供される発明の説明から明らかになるであろう。

発明の簡単な要旨
本発明は、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を調製するための新規の方法を提供する。方法は、（ａ）細胞結合剤を、二官能性架橋試薬で修飾し、リンカーを細胞結合剤へ共有結合させ、それによってリンカーが安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製し、（ｂ）第一混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーが結合した細胞結合剤を第一混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第一混合物を調製し、（ｃ）ｐＨが約４．５から約８の溶液中で、リンカーが結合した細胞結合剤を薬物と反応させることによって、薬物をリンカーが結合した細胞結合剤と複合体化させ、（ｉ）リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、並びに（ｉｉｉ）溶媒及び反応副産物、を含む第二混合物を調製し、（ｄ）第二混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤を、第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製し、（ｅ）精製された第二混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）又は吸収クロマトグラフィに任意で供し、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を単離し、かつ（ｆ）混合物を、工程ａ−ｂ、工程ｂ−ｃ、工程ｃ−ｄ、及び工程ｄ−ｅの少なくとも１つの間で保持し、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させること、を含む。

発明の詳細な説明
本発明は、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む安定な複合体の組成物を調製する方法であって、組成物が不安定な複合体を実質的に含まない方法を提供する。そのような組成物は、複合体の安定性及び高純度のために、疾病の処置に利用され得る。メイタンシノイドのような薬物と化学的に共役した抗体のような細胞結合剤を含む組成物は、例えば、米国特許出願公開２００４／０２４１１７４ Ａ１中で説明されている。

当業者は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体（「抗体−薬物複合体」）が典型的には、抗体を精製し、精製された抗体を修飾し、続いて単一工程の精製、複合体化、及び最終精製工程を行うことによって調製されることを理解するであろう。本発明は、最終精製工程の後に、保持工程、並びに望ましくは、膜ベースの接線流ろ過（ＴＦＦ）過程によって達成されるダイアフィルトレーションを含めることによって、そのような方法を改良する。さらに、本発明は、薬物の利用、歩留まり、副反応の減少、及び細胞結合剤−薬物複合体の純度が最適化されるように、複合体化反応の間のｐＨを改変することによって以前の方法を改良する。任意で、方法の間のショ糖の添加が、歩留まりを増加させることが示されている。

この点で、本発明の方法は、（ａ）二官能性架橋試薬で細胞結合剤を修飾し、リンカーを細胞結合剤に共有結合させ、それによってリンカーが安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製し、（ｂ）第一混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーが結合した細胞結合剤を第一混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第一混合物を調製し、（ｃ）ｐＨが約４．５から約８の溶液中で、リンカーが結合した細胞結合剤を薬物と反応させることによって、薬物をリンカーが結合した細胞結合剤と複合体化させ、（ｉ）リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、並びに（ｉｉｉ）溶媒及び反応副産物、を含む第二混合物を調製し、（ｄ）第二混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤を第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製し、（ｅ）精製された第二混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）又は吸収クロマトグラフィに任意で供し、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を単離し、かつ
（ｆ）混合物を、工程ａ−ｂ、工程ｂ−ｃ、工程ｃ−ｄ、及び工程ｄ−ｅの少なくとも１つの間で保持し、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させることを含む。

細胞結合剤は細胞（典型的かつ好ましくは動物細胞（例、ヒト細胞））と結合する任意の適切な剤であり得る。細胞結合剤は好ましくは、ペプチド又はポリペプチドである。適切な細胞結合剤としては、例えば、抗体（例、モノクローナル抗体及びその断片）、リンフォカイン、ホルモン、成長因子、栄養輸送分子（例、トランスフェリン）、並びに細胞の表面上の標的分子と特異的に結合する任意の他の剤又は分子が挙げられる。

「抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖのような任意の免疫グロブリン断片、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、及び三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、又は細胞の表面上の抗原と結合し得る免疫グロブリンキメラ（例、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むもの）、をいう。任意の適切な抗体が、細胞結合剤として利用され得る。当業者は、適当な抗体の選択が、標的化されるべき細胞集団に依存するであろうことを理解するであろう。この点で、特定の細胞集団（典型的に、かつ好ましくは異常細胞集団）において選択的に発現する細胞表面分子（すなわち、抗原）の種類及び数が、本発明の組成物において利用される適当な抗体の選択を支配するであろう。細胞表面発現プロファイルは、腫瘍細胞型を含む幅広い種類の細胞型について公知であり、あるいは、もし未知であれば、慣用的な分子生物学及び組織化学の技術を用いて決定され得る。

抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得るが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書中で用いられる場合、「ポリクローナル」抗体は、典型的には免疫化動物の血清中に含まれる抗体の不均一な集団をいう。「モノクローナル」抗体は、特定の抗原に特異的である抗体分子の均一な集団をいう。モノクローナル抗体は、典型的にはＢリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンによって生産される。モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術（例、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５，５１１−５１９（１９７６）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、並びにＣ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙら（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５^ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）参照）を含む、当業者に公知の種々の技術を用いて取得されてもよい。手短にいえば、モノクローナル抗体を生産するためのハイブリドーマ方法は典型的には、抗原（すなわち、「免疫原」）を、任意の適切な動物、典型的にかつ好ましくはマウス、に注射することを含む。動物は引き続き屠殺され、その脾臓からＢ細胞が単離されてヒト骨髄腫細胞と融合される。インビトロで無制限に増殖し、所望される特異性をもつ高い力価の抗体を持続的に分泌するハイブリッド細胞が生産される（すなわち、「ハイブリドーマ」）。所望される特異性をもつ抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定するには、当分野で公知の任意の適当な方法が用いられ得る。そのような方法としては、例えば、酵素結合性免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット解析、及び放射性免疫測定法が挙げられる。ハイブリドーマの集団は、各々が抗原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離するためにスクリーニングされる。各ハイブリドーマは単一のＢ細胞との融合に由来するクローンであるため、それが生産する全ての抗体分子は、それらの抗原結合部位及びアイソタイプを含む構造において同一である。モノクローナル抗体はまた、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例、Ｈａｓｋａｒｄ及びＡｒｃｈｅｒ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、並びにＲｏｄｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０−６７（１９８６）参照）、バクテリオファージベクター発現系（例、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）参照）、又はＦａｂ及びｓｃＦｖ（単鎖可変領域）のような抗体断片を含むファージディスプレイライブラリ（例、米国特許第５，８８５，７９３号及び同第５，９６９，１０８号、並びに国際特許出願公開ＷＯ ９２／０１０４７及びＷＯ ９９／０６５８７参照）を含む、他の適切な技術を用いて産生されてもよい。

モノクローナル抗体は、任意の適切な動物から単離され得、又は任意の適切な動物中で生産され得るが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、そして最も好ましくはヒトにおいて生産される。マウスにおいて抗体を生産する方法は、当業者に周知であり、本明細書中に記載される。ヒト抗体に関しては、当業者は、ポリクローナル抗体が適切な抗原でワクチン接種又は免疫化されたヒト被験者の血清から単離され得ることを理解するであろう。あるいは、ヒト抗体は、マウスのような非ヒト動物にヒト抗体を生産するための公知の技術を適応することによって産生され得る（例、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開２００２／０１９７２６６ Ａ１参照）。

ヒトにおける治療的な応用には理想的な選択であるものの、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は、典型的にはマウスモノクローナル抗体よりも作出することが困難である。しかしながら、マウスモノクローナル抗体は、ヒトに投与された場合に急速な宿主抗体応答を誘導し、それは抗体−薬物複合体の治療的又は診断的な可能性を減少し得る。これらの問題を回避するため、モノクローナル抗体は好ましくは、ヒト免疫系によって「外来性」として認識されない。この目的のために、抗体を作出するのにファージディスプレイが用いられ得る。この点で、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリが、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術を用いて作出され得る（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）参照）。所望される特異性をもつ可変領域をコードするファージが、所望される抗原との特異的な結合のために選択され、選択された可変ドメインを含む完全なヒト抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体が細胞によって分泌されるように、ハイブリドーマ生産に用いられる骨髄腫細胞のような適切な細胞株中へと導入される（例、Ｊａｎｅｗａｙら，同上、Ｈｕｓｅら，同上、及び米国特許第６，２６５，１５０号参照）。あるいは、モノクローナル抗体は、特異的なヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を導入されたマウスから作出され得る。そのような方法は、当分野において公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙら，同上において説明されている。最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書中で用いられる場合、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループを形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体分子のフレームワーク上へと移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体である。マウス及びヒト抗体のフレームワークの類似性のために、当分野ではこのアプローチが、ヒト抗体と抗原的に同一なモノクローナル抗体であるが、そのＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同一の抗原を結合するモノクローナル抗体、を生産すると一般的に認められている。ヒト化抗体を作出するための方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら，同上、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００ Ｂ１号、並びに英国特許第２１８８６３８号中に詳細に説明されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２３５，９５９−９７３（１９９４）中に説明されている抗体再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術を用いて作出され得る。本発明の組成物の複合体に使用される抗体は、最も好ましくはヒト化モノクローナル抗体であるものの、上記のようなヒトモノクローナル抗体又はマウスモノクローナル抗体もまた、本発明の範囲内である。

少なくとも１つの抗原結合部位を有し、したがって標的細胞の表面上に存在する少なくとも１つの抗原又は受容体を認識して結合する抗体断片もまた、本発明の範囲内である。この点において、インタクトな抗体分子のタンパク質分解切断は、抗原を認識して結合する能力を保持する多様な抗体断片を生産し得る。例えば、プロテアーゼパパインでの抗体分子の限定消化は典型的には３つの断片を生産し、そのうちの２つは同一であり、それらが親抗体分子の抗原結合活性を保持するため、Ｆａｂ断片といわれる。酵素ペプシンでの抗体分子の切断は、通常２つの抗体断片を生産し、そのうちの１つは抗体分子の両抗原結合アームを保持するため、Ｆ（ａｂ’）_２断片といわれる。ジチオスレイトール又はメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ’）_２断片の還元は、Ｆａｂ’断片といわれる断片を生産する。抗体軽鎖のＶドメインと合成ペプチドを介して連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む切断Ｆａｂ断片からなる単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、慣用的な組換えＤＮＡテクノロジー技術を用いて作出され得る（例、Ｊａｎｅｗａｙら，同上参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡテクノロジーによって調製され得る（例、Ｒｅｉｔｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４（１９９４）参照）。しかしながら、本発明の抗体断片は、これらの例示的な型の抗体断片に制限されない。所望される細胞表面受容体又は抗原を認識して結合する任意の適切な抗体断片が、使用され得る。抗体断片はさらに、例えば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１ ２８９５−２９０２（１９８３）、Ｓｐｒｉｎｇら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３，４７０−４７８（１９７４）、及びＮｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９，２３０−２４４（１９６０）において説明されている。抗体−抗原結合は、例えば、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法、及び競合阻害測定法（例、Ｊａｎｅｗａｙら，同上、及び米国特許出願公開２００２／０１９７２６６ Ａ１参照）などの当分野で公知の任意の適切な方法を用いて検定され得る。

さらに、抗体は、キメラ抗体又はその抗原結合断片であり得る。「キメラ」とは、抗体が、少なくとも２つの異なる種から取得された、又は由来する少なくとも２つの免疫グロブリン又はその断片（例、マウス免疫グロブリン可変領域と組み合わされたヒト免疫グロブリン定常領域のような、２つの異なる免疫グロブリン）を含むことを意味する。抗体はまた、例えば、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体（例、Ｄｅｓｍｙｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．，３，７５２，（１９９６）参照）、又は例えば、新抗原受容体（ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＩｇＮＡＲ）のようなサメ抗体（例、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，１６８（１９９５）、及びＳｔａｎｆｉｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５，１７７０−１７７３（２００４）参照）のような、ドメイン抗体（ｄＡｂ）又はその抗原結合断片であり得る。

任意の適切な抗体が、本発明の文脈において用いられ得る。例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）に特異的なマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ，２８３，５８３−５８５（１９８０））、ＣＡＬＬＡを発現する細胞（例、急性リンパ芽球性白血病細胞）を標的化するのに利用され得る。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．，８，５２１（１９８４））、ＣＤ３３を発現する細胞（例、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）を標的化するのに利用され得る。

同様に、モノクローナル抗体抗Ｂ４（また、Ｂ４ともいわれる）は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，２４４−２５０（１９８３））、Ｂ細胞又はＣＤ１９を発現する異常細胞（例、非ホジキンリンパ腫細胞及び慢性リンパ芽球性白血病細胞）を標的化するのに利用され得る。Ｎ９０１は、神経内分泌起源の細胞（小細胞肺腫瘍を含む）上に見られるＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原に結合するマウスモノクローナル抗体であり、神経内分泌起源の細胞へ薬物を標的化するのに、複合体において利用され得る。Ｊ５、ＭＹ９、及びＢ４抗体は好ましくは、複合体の一部としてのそれらの利用に先立って、再表面形成又はヒト化される。抗体の再表面形成又はヒト化は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９１，９６９−７３（１９９４）中に説明されている。

さらに、モノクローナル抗体Ｃ２４２はＣａｎＡｇ抗原に結合し（例、米国特許第５，５５２，２９３号参照）、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び胃癌のようなＣａｎＡｇを発現する腫瘍へ複合体を標的化するのに利用され得る。ＨｕＣ２４２は、ヒト化型のモノクローナル抗体Ｃ２４２である（例、米国特許第５，５５２，２９３号参照）。ＨｕＣ２４２が生産されるハイブリドーマは、ＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲ移植方法論（例、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号参照）、又は再表面形成テクノロジー（例、米国特許第５，６３９，６４１号）を用いて調製され得る。ＨｕＣ２４２は、複合体を、例えば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、及び胃癌の細胞のような、ＣａｎＡｇ抗原を発現している腫瘍細胞へ標的化するのに利用され得る。

卵巣癌及び前立腺癌の細胞を標的化するため、抗ＭＵＣ１抗体が、複合体中の細胞結合剤として用いられ得る。抗ＭＵＣ１抗体としては、例えば、抗ＨＭＦＧ−２（例、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，２８，１７−２１（１９８１）参照）、ｈＣＴＭ０１（例、ｖａｎ Ｈｏｆら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，５１７９−５１８５（１９９６）参照）、又はＤＳ６が挙げられる。前立腺癌細胞はまた、複合結合剤として、Ｊ５９１（例、Ｌｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，３６２９−３６３４（１９９７）参照）のような抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を用いることによって、複合体で標的化され得る。さらに、乳癌、前立腺癌、及び卵巣癌のように、Ｈｅｒ２抗原を発現する癌細胞は、抗体トラスツズマブを用いることによって標的化され得る。インスリン様成長因子受容体に結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体もまた、複合体において用いられ得る。

特に好ましい抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、その例としては、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブ（例、米国特許第５，６３９，６４１号及び同第５，６６５，３５７号、米国特許出願公開２００５／０１１８１８３ Ａ１、国際（ＰＣＴ）特許出願公開ＷＯ ０２／１６４０１、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，同上、Ｒｏｇｕｓｋａら，同上、Ｌｉｕら，同上、Ｎａｄｌｅｒら，同上、Ｃｏｌｏｍｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．，１９，４９−５６（２００１）、Ｈｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ，２３８５−２３９１（１９９５）、Ｗｅｌｔら，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．，１２，１１９３−１２０３（１９９４）、並びにＭａｌｏｎｅｙら，Ｂｌｏｏｄ，９０，２１８８−２１９５（１９９７）参照）が挙げられる。最も好ましくは、抗体はｈｕＮ９０１ヒト化モノクローナル抗体又はｈｕＭｙ９−６ヒト化モノクローナル抗体である。他のヒト化モノクローナル抗体が当分野において公知であり、本発明に関連して用いられ得る。

細胞結合剤は好ましくは抗体であるものの、細胞結合剤はまた非抗体分子であり得る。適切な非抗体分子としては、例えば、インターフェロン（例、α、β、又はγインターフェロン）、リンフォカイン（例、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、又はＩＬ−６）、ホルモン（例、インスリン）、成長因子（例、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ（例、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，５，１５５−１５８（１９８４）参照）、ソマトスタチン、並びにトランスフェリン（例、Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６０，９３２−９３７（１９８５）参照）が挙げられる。例えば、骨髄細胞と結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病細胞を標的化する細胞結合剤として用いられ得る。さらに、活性化Ｔ細胞と結合するＩＬ−２は、移植の移植片拒絶反応の予防、移植片対宿主病の治療及び予防、並びに急性Ｔ細胞白血病の処置に用いられ得る。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、肺癌及び頭頚部癌のような扁平上皮癌を標的化するのに用いられ得る。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫細胞及び他の腫瘍細胞型を標的化するのに用いられ得る。

複合体は、任意の適切な薬物、典型的には細胞毒性剤、を含み得る。「細胞毒性剤」とは、本明細書中で用いられる場合、細胞の死滅をもたらす、細胞死を誘導する、又は細胞生存率を低下させる任意の化合物をいう。適切な細胞毒性剤としては、例えば、メイタンシノイド及びメイタンシノイドアナログ、タキソイド、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５アナログ、並びにドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）及びドラスタチンアナログが挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、細胞毒性剤は、メイタンシノール及びメイタンシノールアナログを含むメイタンシノイドである。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に強く毒性である化合物である。適切なメイタンシノールアナログの例としては、修飾芳香環を有するもの、及び他の位置に修飾を有するものが挙げられる。そのようなメイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、及び同第６，３３３，４１０号中に説明されている。

修飾芳香環を有するメイタンシノイドアナログの例としては、（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２のＬＡＨ還元によって調製される）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス属若しくは放線菌属を用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素反応によって調製される）、及び（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される）が挙げられる。

芳香環以外の位置の修飾を有するメイタンシノールアナログの例としては、（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ_２Ｓ又はＰ_２Ｓ_５との反応によって調製される）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨ又はＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア属から調製される）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同第４，３１５，９２９号）（トゥルイア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）、並びに（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールのチタントリクロリド／ＬＡＨ還元によって調製される）が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態において、複合体は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンとしてもまた知られる、チオール含有メイタンシノイドＤＭ１を細胞毒性剤として利用する。ＤＭ１の構造は、式（Ｉ）によって表される：

本発明の別の好ましい実施形態において、複合体は、Ｎ−２’−デアセチル−Ｎ−２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンとしてもまた知られる、チオール含有メイタンシノイドＤＭ４を細胞毒性剤として利用する。ＤＭ４の構造は、式（ＩＩ）によって表される：

例えば、イオウ原子を持つ炭素原子上にモノ又はジ−アルキル置換を持つチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイドを含む他のメイタンシンが、本発明の方法に関連して用いられてもよい。特に好ましくは、（ａ）Ｃ_１４ヒドロキシメチル、Ｃ_１５ヒドロキシ、又はＣ_２０デスメチル官能基、及び（ｂ）ヒンダード（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）スルフヒドリル基を持つアシル基をもつアシル化アミノ酸側鎖をＣ_３位に有するメイタンシノイドであって、チオール官能基を持つアシル基の炭素原子が１若しくは２の置換基を有し、その置換基がＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらにその置換基の１つがＨであり、かつアシル基がカルボニル官能基とイオウ原子との間に少なくとも３炭素原子の直鎖長を有する。

本発明における利用のためのさらなるメイタンシンとしては、式（ＩＩＩ）で表される化合物が挙げられ：

式中、Ｙ’は、（ＣＲ _７ Ｒ _８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ （Ｃ≡Ｃ） _ｑＡ _ｏ （ＣＲ _５ Ｒ _６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ)_ｓＢ_ｔ（ＣＲ _３ Ｒ _４）_ｎ−ＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、
ここで、Ｒ_１及びＲ_２は各々独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ_２はまたＨであり得、
ここで、Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはシクロアルケニル、単純若しくは置換アリール、又は複素環芳香族、又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ _１０ 、Ｒ_１１、及びＲ_１２は各々独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族、又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、各々独立して０又は１から５の整数であり（ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔの少なくとも２つは、同時に０ではない）、かつ
ここで、ＺはＨ、ＳＲ若しくはＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール又は複素環芳香族、又はヘテロシクロアルキルラジカルである。

式（ＩＩＩ）の好ましい実施形態としては、式（ＩＩＩ）の化合物であって、式中（ａ）Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はメチルかつＺはＨであり、（ｂ）Ｒ_１及びＲ_２はメチルかつＺはＨであり、（ｃ）Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はメチル、かつＺは−ＳＣＨ_３であり、並びに（ｄ）Ｒ_１及びＲ_２はメチル、かつＺは−ＳＣＨ_３である化合物が挙げられる。

そのようなさらなるメイタンシンとしてはまた式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、又は（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）で表される化合物が挙げられ：

式中、Ｙは、（ＣＲ _７ Ｒ _８）_ｌ（ＣＲ _５ Ｒ _６）_ｍ（ＣＲ _３ Ｒ _４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、
ここで、Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル、若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、ここでＲ_２はまたＨであり得、
ここで、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８は、各々独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、ｌ、ｍ、及びｎは、各々独立して１から５の整数であり、さらにｎは０であり得、
ここで、Ｚは、Ｈ、ＳＲ、又はＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、かつ
ここで、Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、若しくはＣ−２０デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドである。

式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、かつＺがＨであるか、（ｂ）Ｒ_１及びＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、かつＺがＨであるか、（ｃ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、かつＺが−ＳＣＨ_３であるか、又は（ｄ）Ｒ_１及びＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、かつＺが−ＳＣＨ_３である、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）及び（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。

好ましくは、細胞毒性剤は、式（ＩＶ−Ｌ）によって表される。

さらなる好ましいメイタンシンとしてはまた、式（Ｖ）によって表される化合物が挙げられ：

式中、Ｙは（ＣＲ _７ Ｒ _８）_ｌ（ＣＲ _５ Ｒ _６）_ｍ（ＣＲ _３ Ｒ _４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、
ここで、Ｒ _１ 及びＲ _２ は、各々独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル、若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、かつここで、Ｒ_２はまた、Ｈであり得、
ここで、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８は各々独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、ｌ、ｍ、及びｎは、各々独立して１から５の整数であり、さらにｎは０であり得、かつ
ここで、ＺはＨ、ＳＲ若しくはＣＯＲであり、ここで、Ｒは、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルである。

式（Ｖ）の好ましい実施形態としては、（ａ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８が各々Ｈであり；ｌ及びｍが各々１であり；ｎが０であり；かつＺがＨであるか、（ｂ）Ｒ_１及びＲ_２がメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり；ｎが０であり；かつＺがＨであるか、（ｃ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが各々１であり、ｎが０であり、かつＺが−ＳＣＨ_３であるか、又は（ｄ）Ｒ_１及びＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、かつＺが−ＳＣＨ_３である、式（Ｖ）の化合物が挙げられる。

さらにいっそう好ましいメイタンシンとしては、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、又は（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）によって表される化合物が挙げられ：

式中、Ｙ_２は（ＣＲ _７ Ｒ _８）_ｌ（ＣＲ _５ Ｒ _６）_ｍ（ＣＲ _３ Ｒ _４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を表し、
ここで、Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、かつここでＲ_２はまたＨであり得、
ここで、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８は各々独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖環状アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、ｌ、ｍ、及びｎは、各々独立して、１から５の整数であり、さらにｎは０であり得、
ここで、Ｚ_２はＳＲ若しくはＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール又は複素環芳香族又はヘテロシクロアルキルラジカルであり、かつ
ここでＭａｙはメイタンシノイドである。

さらなる好ましいメイタンシンとしては、式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられ：

式中、Ｙ_２’は（ＣＲ _７ Ｒ _８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ _ｏ （ＣＲ _５ Ｒ _６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ） _ｓ Ｂ _ｔ （ＣＲ _３ Ｒ _４）_ｎＣＲ _１Ｒ_２ＳＺ _２ を表し、
ここで、Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖分枝又はアルキル又はアルケニル、３から１０の炭素原子を有する環状アルキル若しくはアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらにＲ_２はＨであり得、
ここで、Ａ、Ｂ、及びＤは、各々独立して３から１０の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはシクロアルケニル、単純若しくは置換アリール、又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ _１０ 、Ｒ_１１、及びＲ_１２は、各々独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ここで、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、各々独立して０又は１から５の整数であり（ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔの少なくとも２つは、同時に０ではない）、かつ
ここで、Ｚ_２はＳＲ又は−ＣＯＲであり、ここで、Ｒは、１から１０の炭素原子を有する直鎖アルキル若しくはアルケニル、３から１０の炭素原子を有する分枝若しくは環状アルキル若しくはアルケニル、又は単純若しくは置換アリール又は複素環芳香族若しくはヘテロシクロアルキルラジカルである。

式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態としては、Ｒ_１がＨでありかつＲ_２がメチルである、式（ＶＩＩ）の化合物が挙げられる。

メイタンシノイドに加えて、複合体において用いられる細胞毒性剤は、タキサン又はその誘導体であり得る。タキサンは、細胞毒性天然物であるパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、及び半合成誘導体のドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標））（両者とも、癌の処置に広く用いられている）を含む化合物のファミリーである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死をもたらす、紡錘体毒である。ドセタキセル及びパクリタキセルは、癌の処置には有用な剤であるものの、それらの抗腫瘍活性は、それらの正常細胞への非特異的毒性のために、制限される。さらに、パクリタキセル及びドセタキセルのような化合物自体は、細胞結合剤の複合体において用いられるには、十分に強力ではない。

細胞毒性複合体の調製における使用のために好ましいタキサンは、式（ＶＩＩＩ）のタキサンである：

本発明の複合体において用いられ得るタキサンを合成するための方法は、抗体のような細胞結合剤へタキサンを複合体化させる方法とともに、米国特許第５，４１６，０６４号、同第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、同第６，４３６，９３１号、同第６，５９６，７５７号、同第６，７０６，７０８号、及び同第６，７１６，８２１号、並びに米国特許出願公開番号２００４／００２４０４９ Ａ１中に詳細に説明されている。

細胞毒性剤はまた、ＣＣ−１０６５又はその誘導体であり得る。ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンクリスチンのような通常用いられる抗癌薬より、ｉｎ ｖｉｔｒｏで約１０００倍強力である（Ｂｈｕｙａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７（１９８２））。ＣＣ−１０６５及びそのアナログは、米国特許第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，３４０，７０１号、及び同第６，３７２，７３８号中に開示されている。ＣＣ−１０６５の細胞毒性効力は、そのアルキル化活性及びそのＤＮＡ結合又はＤＮＡインターカレート活性と相関付けられている。これらの２つの活性は、分子の別々の部分に存在する。この点において、アルキル化活性は、ＣＣ−１０６５のシクロプロパピロロインドール（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ）（ＣＰＩ）サブユニットに含まれ、ＤＮＡ結合活性は、ＣＣ−１０６５の２つのピロロインドールサブユニットに存在する。

数個のＣＣ−１０６５アナログが当分野において公知であり、また複合体における細胞毒性剤として用いられ得る（例、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，３１，５９０−６０３（１９８８）参照）。一連のＣＣ−１０６５アナログが開発され、そこではＣＰＩ部分はシクロプロパベンズインドール（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｂｅｎｚｉｎｄｏｌｅ）（ＣＢＩ）部分によって置換されている（Ｂｏｇｅｒら，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，５５，５８２３−５８３３（１９９０）、及びＢｏｇｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．，１，１１５−１２０（１９９１））。これらのＣＣ−１０６５アナログは、マウスにおいて遅延毒性を起こすことなく、親薬物の高いｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を保つ。ＣＣ−１０６５と同様に、これらの化合物は、ＤＮＡの副溝に共有結合して細胞死を起こすアルキル化剤である。

ＣＣ−１０６５アナログの治療有効性は、腫瘍部位への標的化送達を通してｉｎ ｖｉｖｏ分布を変化させることによって大いに改善され得、非標的化組織へのより低い毒性、したがって、より低い全身への毒性という結果をもたらす。この目的のために、ＣＣ−１０６５のアナログ及び誘導体と、腫瘍細胞を特異的に標的化する細胞結合剤との複合体が作出されてきた（例、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、及び同第５，８４６，５４５号参照）。これらの複合体は典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて高い標的特異的細胞毒性を提示し、かつマウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を提示する（例、Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５，４０７９−４０８４（１９９５）参照）。

ＣＣ−１０６５アナログを合成するための方法は、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，５３４，６６０号、同第６，５８６，６１８号、及び同第６，７５６，３９７号並びに米国特許出願公開２００３／０１９５３６５ Ａ１中に詳細に説明されている。

メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、チューブリジン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）及びチューブリジンアナログ、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）及びデュオカルマイシンアナログ、ドラスタチン及びドラスタチンアナログのような薬物もまた、本発明の方法にしたがって用いられ得る。ドキサルビシン（ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）及びダウノルビシン化合物（例、米国特許第６，６３０，５７９号参照）もまた、薬物として用いられ得る。

薬物複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏな方法によって調製され得る。薬物又はプロドラッグを抗体と連結させるためには、連結基が用いられる。適切な連結基は、当分野において周知であり、ジスルフィド基、酸解離性（ａｃｉｄ ｌａｂｉｌｅ）基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基、及びエステラーゼ解離性基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基である。例えば、複合体は、抗体と薬物又はプロドラッグとの間のジスルフィド交換反応を利用して作成され得る。薬物分子はまた、血清アルブミンのような中間担体分子を通じて、細胞結合剤と連結され得る。

本発明の方法にしたがって、細胞結合剤は、二官能性架橋試薬と細胞結合剤とを反応させることによって修飾され、それによって細胞結合剤とリンカー分子との共有結合をもたらす。本明細書中で用いられる場合、「二官能性架橋試薬」は、細胞結合剤を、本明細書中に説明されている薬物のような薬物と共有結合させる、任意の化学的部分である。本発明の好ましい実施形態において、連結部分の一部分が、薬物によって提供される。この点において、薬物は、細胞結合剤を薬物とつなぐのに用いられる、より大きなリンカー分子の一部である連結部分を含む。例えば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するには、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基における側鎖が、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾される。このメイタンシンのチオール化型は、複合体を形成するために、修飾された細胞結合剤と反応し得る。したがって、最終リンカーは、２つの成分から組み立てられ、その１つは架橋試薬によって提供され、他方はＤＭ１からの側鎖によって提供される。

リンカー試薬がそれぞれ薬物の治療特徴（例、毒性）及び細胞結合剤の標的化特徴の維持を提供する限り、任意の適切な二官能性架橋試薬が本発明と関連して用いられ得る。好ましくは、リンカー分子は、薬物と細胞結合剤とが互いに化学的に共役される（例、共有結合される）ように、化学結合（上記のような）を通じて薬物を細胞結合剤へとつなぐ。好ましくは、連結試薬は切断可能なリンカーである。より好ましくは、リンカーは、穏和な条件下（すなわち、細胞内における、薬物の活性が影響を受けない条件下）で切断される。適切な切断可能なリンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸解離性リンカー、光解離性リンカー、ペプチダーゼ解離性リンカー、及びエステラーゼ解離性リンカーが挙げられる。ジスルフィド含有リンカーは、生理条件下で起こり得るジスルフィド交換を通じて切断可能なリンカーである。酸解離性リンカーは、酸性ｐＨにて切断可能なリンカーである。例えば、エンドソーム及びリソソームのような一定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸解離性リンカーを切断するのに適切な条件を提供する。光解離性リンカーは、体表面及び光にアクセス可能な多くの体腔にて有用である。さらに、赤外光は、組織を透過し得る。ペプチダーゼ解離性リンカーは、細胞内又は外の一定のペプチドを切断するのに用いられ得る（例、Ｔｒｏｕｅｔら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７９，６２６−６２９（１９８２）、及びＵｍｅｍｏｔｏら，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，４３，６７７−６８４（１９８９）参照）。

好ましくは、薬物は、ジスルフィド結合を通じて細胞結合剤と連結されている。リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応のために好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらに、リンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基、を含む。特に好ましいリンカー分子としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例、Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１７３，７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（例、米国特許第４，５６３，３０４号参照）及びＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）が挙げられる。

好ましくは切断可能なリンカーが、本発明の方法において用いられるものの、切断不可能なリンカーもまた、上記の複合体を作出するために用いられ得る。切断不可能なリンカーは、安定で、共有結合的な様式で、メイタンシノイド、タキサン、又はＣＣ−１０６５アナログのような薬物を、細胞結合剤と連結させることができる任意の化学的部分である。したがって、切断不可能なリンカーは、薬物又は細胞結合剤が活性を保つ条件下にて、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断、及びジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性である。

薬物と細胞結合剤との間に切断不可能なリンカーを形成する適切な架橋試薬は、当分野において周知である。切断不可能なリンカーの例としては、細胞結合剤との反応のためのＮ−スクシンイミジルエステル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、並びに薬物との反応のためのマレイミド−又はハロアセチルベースの部分を有するリンカーが挙げられる。マレイミドベースの部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」アナログ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロアート）、κ−マレイミドウンデカン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチルベースの部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル ３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。

切断不可能なリンカーを形成するイオウ原子を欠く他の架橋試薬がまた、本発明の方法において用いられ得る。そのようなリンカーは、ジカルボン酸ベースの部分に由来し得る。適切なジカルボン酸ベースの部分としては、一般式（ＩＸ）のα，ω−ジカルボン酸が挙げられるが、それに制限されず：

式中、Ｘは、２から２０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基であり、Ｙは、３から１０の炭素原子を持つシクロアルキル又はシクロアルケニル基であり、Ｚは、６から１０の炭素原子を持つ置換若しくは非置換芳香族基、又は置換若しくは非置換複素環基であり、そこにおいてヘテロ原子はＮ、Ｏ又はＳから選択され、ｌ、ｍ、及びｎは各々０又は１である（ただし、ｌ、ｍ、及びｎは同時に全て０ではない）。

本明細書中に開示される切断不可能なリンカーの多くは、米国特許出願公開２００５／０１６９９３３ Ａ１中に詳細に説明されている。

本発明の方法にしたがって、リンカーが安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤、並びに反応物及び他の副産物を含む混合物が生産される。リンカーと細胞結合剤との間の共有結合が、通常の保存条件下で、ある期間（それは数ヶ月から数年まで及び得る）にわたって実質的に弱められたり切り離されたりしない場合に、リンカーは細胞結合剤に「安定に」結合している。反対に、リンカーと細胞結合剤との間の共有結合が、通常の保存条件下で、ある期間（それは数ヶ月から数年まで及び得る）にわたって実質的に弱められたり切り離されたりする場合に、リンカーは細胞結合剤に「不安定に」結合している。修飾された細胞結合剤の、反応物及び副産物からの精製は好ましくは、混合物をＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂クロマトグラフィ又は類似の非吸収性クロマトグラフィ工程に供することによって実行される。適切なクロマトグラフィ樹脂の例としては、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例、Ｓ−２００及びＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５及びＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、及びＰ−１００）、並びに当業者に公知の他の物が挙げられるが、それらに制限されない。

修飾された細胞結合剤は、ｐＨ約４．５から約８までにわたるｐＨを有する溶液中で、修飾された細胞結合剤を薬物と反応させることによって、薬物（例、メイタンシノイド）と複合体化され、ここで、複合体化工程は、安定な細胞結合剤−薬物複合体、不安定な細胞結合剤−薬物複合体、非複合体化薬物（すなわち、「遊離」薬物）、反応物、及び副産物の混合物の形成をもたらす。さらなる精製は、非複合体化薬物、反応物、及び副産物を取り除き、かつ細胞結合剤−薬物複合体を実質的に保有するよう、精製工程（例、上記のＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５又は類似の非吸着性クロマトグラフィ樹脂上で）を繰り返すことによって実行され得る。

本発明の方法はさらに、二官能性架橋試薬で細胞結合剤を修飾した後の保持工程を含む。保持工程は、溶液を適切な温度にて適切な期間保ち、安定に結合したリンカーを細胞結合剤から実質的に放出させずに、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させることを含む。望ましくは、保持工程は、少なくとも約１２時間から３０日以上までの期間、溶液を約２℃から約８℃の温度にて保つことを含む。あるいは、保持工程の持続期間は、上昇させた温度（最高温度は細胞結合剤−薬物複合体の安定性によって制限される）にて、保持工程を行うことによって実質的に減少され得る。例えば、抗体−薬物複合体では、保持工程は最高で約３７℃にて、最高で約４週間、好ましくは２から４週間の間、よりいっそう好ましくは、１から２週間の間、そして最も好ましくは約１週間以下（例、２時間から約６日間）行われ得る。保持工程のための好ましいｐＨ値は、約６〜１０にわたる。最も好ましいｐＨ値は、約６．５と８．５との間である。好ましくは、保持工程は、修飾された細胞結合剤を含む混合物を４℃にて、ｐＨ６．５にて、少なくとも約１２時間から４週間インキュベートすることを含む。より好ましくは、保持工程は、修飾された細胞結合剤を含む混合物を２０〜３０℃間の範囲にて、ｐＨ６．５にて、約１２時間から約１週間インキュベートすることを含む。保持工程は、細胞結合剤が薬物と複合体化される前又は後に行われ得る。好ましくは、保持工程は、二官能性架橋試薬での細胞結合剤の修飾の直後に行われる。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、二官能性架橋試薬での細胞結合剤の修飾後で、かつ複合体化の前に、保持工程を含む。保持工程は、溶液を適切な温度にて適切な期間保ち、安定に結合したリンカーを細胞結合剤から実質的に放出させずに、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させることを含む。望ましくは、保持工程は、溶液を約２℃から約８℃の温度にて、少なくとも約５時間から最大で５日間以上（例えば３０日）までの期間、保つことを含む。あるいは、保持工程の持続期間は、上昇させた温度（最高温度は細胞結合剤−薬物複合体の安定性によって制限される）にて、保持工程を行うことによって実質的に減少され得る。例えば、抗体−薬物複合体では、保持工程は最高で約３７℃にて、最高で約４週間、好ましくは２から４週間の間、よりいっそう好ましくは、１から２週間の間、そして最も好ましくは約１週間以下（例、２時間から約６日間）行われ得る。保持工程のためのｐＨ値は好ましくは、約４以上であるが、約６未満（例、４〜５．９）である。保持工程のためのｐＨ値はより好ましくは、約５以上であるが、約６未満（例、５〜５．９）である。好ましくは、保持工程は、修飾された細胞結合剤を含む混合物を４℃にて、ｐＨ５にて、少なくとも約５時間から最大５日間以上（例えば１０日）インキュベートすることを含む。より好ましくは、保持工程は、修飾された細胞結合剤を含む混合物を２０〜３０℃間の範囲にて、ｐＨ約５にて、約５時間から約１から３日間（好ましくは１日）インキュベートすることを含む。細胞結合剤の修飾後、保持工程前及び／又は保持工程後であるが、複合体化工程以前に、精製工程を行ってもよい。非吸着又は吸着クロマトグラフィのような、そのような精製工程は、当業者に周知である。

１つの実施形態において、保持工程の持続期間は、求核試薬の添加によって実質的に減少され得る。求核試薬は、複合体化工程の間に添加され得、保持工程は、複合体化と同時に行われ得る。本発明の文脈において、求核試薬は水性溶液中で、修飾された細胞結合剤上のエステル基及びイミダゾールアミドと反応し得る化学的部分である。適切な求核試薬は、当分野において公知であり、例えば、一級アミン（すなわち、Ｒがアルキル若しくは芳香族基であるＲＮＨ_２）；又は二級アミン（すなわち、Ｒ及びＲ’がアルキル若しくは芳香族基であるＲＲ’ＮＨ）が挙げられる。アミンはまた、アミノ酸、リジンアミノ酸を含むペプチド、α−アミノ若しくは非天然二級アミノ基を含むペプチド、又は水溶性アミンであり得る。求核試薬は、溶液、重合状態、又は固相試薬として固定化された形態であり得る。適切な溶液中の求核試薬の例としては、グリシルグリシン、グリシン、タウリン（２−アミノエタンスルホン酸ナトリウム）、エタノールアミン、ジエタノールアミン、リジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、イミダゾール、ヒスチジン、エチルアミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパン−ジオール及び４−アミノ−１−ブタノールが挙げられるが、それらに限定されない。可溶性求核試薬の適当な濃度は、約０．１ｍＭからその特定の求核試薬の溶解度の限界までにわたる。重合状態にある求核試薬の例としては、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−リジン、並びにリジンアミノ酸をもつペプチド及びα−アミノ又は非天然二級アミノ基を含むペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。固相試薬として固定化された形態の求核試薬の例としては、ＥＡＨ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂのような固相連結アミン及びアミノメチルポリスチレンビーズが挙げられるが、それらに限定されない。固相求核試薬では、固相アミンのモル濃度量は、細胞結合剤に結合した架橋剤の量を超過しているべきである。

本発明の方法はさらに、ｐＨが約４．５から約８であることを含む溶液中で、修飾された細胞結合剤と薬物を反応させることによって、修飾された細胞結合剤を薬物と複合体化させることを含み、そこにおいて（ｉ）薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、並びに（ｉｉｉ）溶媒及び反応副産物、を含む第二の混合物が生産される。複合体化反応は、ｐＨ約４．５とｐＨ約８．０との間のｐＨにて行われるものの、反応は好ましくは、６未満又は７より大きいｐＨにて行われる。

本発明の工程は任意で、細胞結合剤−薬物複合体の溶解度及び回収率を増加させるため、本発明の方法において用いられる複合体化工程へのショ糖の添加を含んでいてもよい。望ましくは、ショ糖は、約０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）（例、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、又は２０％（ｗ／ｖ））の濃度にて添加される。好ましくは、ショ糖は、約１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）（例、約２％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、又は約８％（ｗ／ｖ））の濃度にて添加される。さらに、複合体化反応はまた、緩衝剤の添加を含み得る。当分野で公知の任意の適切な緩衝剤が用いられ得る。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液が挙げられる。

複合体化工程に続いて、複合体は好ましくは、最終精製工程に供される。この点で、複合体混合物は、膜ベースの接線流ろ過工程（ＴＦＦ）を用いて精製され得る。当業者は、最終精製工程が、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む安定な複合体の単離を可能とすることを理解するであろう。

あるいは、米国特許第６，４４１，１６３ Ｂ１において開示されているように、薬物は第一に、細胞結合剤と反応するのに適切な反応性エステルを導入するために修飾され得る。活性化リンカー部分を含むこれらのメイタンシノイドと、細胞結合剤との反応は、切断可能又は切断不可能な細胞結合剤メイタンシノイド複合体を生産する別の方法を提供する

したがって、本発明はまた、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を調製する方法であって、（ａ）細胞結合剤を、活性エステルを持つ薬物と接触させ、それによって、薬物が安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤を含む混合物を調製し、（ｂ）混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、薬物が結合した細胞結合剤を混合物の他の成分から精製し、それによって精製された混合物を調製し、（ｃ）精製された混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）に任意で供し、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を単離し、かつ（ｄ）混合物を、工程ａ−ｂ及びｂ−ｃの少なくとも１つの間で保持し、不安定に結合した薬物を細胞結合剤から放出させることを含む方法を提供する。

複合体は、米国特許第６，４４１，１６３ Ｂ１号中に説明されているように精製され得る。薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む安定な複合体の単離を可能とするために、複合体が形成された後で、かつ最終精製工程の前に、保持工程が含まれてもよい。保持工程は、上記のように、上昇させた温度にて、上昇させたｐＨにて、及び／又は求核試薬の存在下において行われることによって、減少され得る。さらに、反応性エステルを持つ薬物と細胞結合剤の反応はまた、上記のように約４．５から約８．０のｐＨにて、任意でショ糖の存在下（０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ））で行われてもよい。

以下の実施例は本発明をさらに説明するが、もちろん、その範囲を如何なる様式にも制限するものとして解釈されるべきではない。

実施例１Ａ
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、二官能性架橋試薬での抗体の修飾後で、かつ薬物への抗体の複合体化前に行われる、保持工程を含む方法を実証する。

ｈｕＮ９０１モノクローナル抗体（最終濃度８ｍｇ／ｍＬ）を、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（７倍モル濃度過剰のＳＰＰ）と、およそ１００分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中でインキュベートした。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆのカラムを用い、エタノールを欠く前述のリン酸カリウム緩衝液中で平衡化して溶出し、反応混合物を精製した。

修飾した抗体のサンプルを最大２週間まで４℃で保持し、次いでジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度は３％）中に溶解したメイタンシノイドＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、複合体化した抗体サンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．５中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。サンプルは、一週間、４℃にて保存した。抗体１分子あたりの連結したＤＭ１分子の数を、以前に報告された抗体及び薬物用の吸光係数（Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９３，８６１８−８６２３（１９９６））を用いて決定した。複合体化反応後に存在する遊離薬物の量を、複合体２０〜５０μｇを、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２５％のアセトニトリル中で平衡化したＨｉＳｅｐカラム上へと注入し、アセトニトリル中で溶出することによって決定した。２５２ｎｍの波長に設定された吸光度検出器を用いて測定された全遊離薬物種（グラジエントで溶出し、既知標準物質との溶出時間の比較によって同定した）のピーク面積を、結合した薬物（カラムフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分中の複合体ピーク中に溶出した）に関連したピーク面積と比較し、遊離している全薬物種の割合を算出した。この解析の結果を表１に示す。

表１に示されたデータによって明らかであるように、修飾後であるが複合体化前に修飾抗体を４℃にて保持することは、（薬物／抗体比に反映されるような）結合していた薬物の量に有意に影響することなく、１週間貯蔵した後の複合体サンプル中の遊離薬物の量を有意に減少させた。

実施例１Ｂ
本実施例は、二官能性架橋試薬での抗体の修飾後であって、修飾抗体の薬物への複合体化前の、ｐＨ６．５及び７．５と比較して、ｐＨ５．０での保持工程の有益な影響を実証する。

ｈｕＮ９０１モノクローナル抗体（最終濃度８ｍｇ／ｍＬ）を、およそ１８０分間、２０℃にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で、ｐＨ７．５にて、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（５．６倍モル濃度過剰のＳＰＰ）とインキュベートした。反応混合物を三分割し、各部分をＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５（アマシャムバイオサイエンスから取得したＮＡＰ１０カラム）で充填され、３つの異なる緩衝液で平衡化して溶出するゲルろ過カラムを用いて精製した。第一のカラムは、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化し、溶出した。第二のカラムは、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化し、溶出した。第三のカラムは、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化し、溶出した。

抗体に連結しているピリジルジチオ基（−ＳＳＰｙ）の数を、３４３ｎＭにて８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を有するピリジン−２−チオンを放出させるためのジチオスレイトールでの処理によって検定した。３つのサンプル全ては、抗体１分子あたり４．７個の−ＳＳＰｙが連結していた。

修飾抗体のサンプルを、最長１２１時間まで室温にて保持した。この時間の経過中に放出された４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＰＰＡ）の量は、弱く結合したリンカーの放出の指標である。１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２５％のアセトニトリル中で平衡化したＨｉＳｅｐカラム上へ４５〜５５μｇの修飾抗体を１．５時間ごとに注入し、アセトニトリル中で溶出することによって、ＰＰＡ放出を決定した。２５２ｎｍの波長に設定された吸光度検出器を用いて測定したＰＰＡ種（グラジエント中で溶出し、既知の標準物質との溶出時間の比較によって同定された）のピーク面積を用いて、各サンプルにおける放出されたリンカーの割合を算出した。この解析の結果を図に示す。

図に示されるように、弱く結合したリンカーを表すＰＰＡの放出は、ｐＨ６．５及び７．５と比較して、ｐＨ５．０において有意により急速である。さらに、ＰＰＡの放出は、製造に適当である期間（例、約５から２４時間の間）にわたって、ｐＨ５．０にて実質的により完了している。

実施例２
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、二官能性架橋試薬での抗体の修飾後で、かつ抗体の薬物との複合体化前に行われる保持工程を含む方法を実証する。

ｐＨ６．５にて、５０ｍＭ リン酸カリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、及び２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム塩からなる緩衝液中のｈｕＣ２４２抗体の溶液（８ｍｇ／ｍＬにて１６ｍｇ）を、ＳＰＰの溶液（エタノール中１０ｍＭのストック、６．５モル濃度過剰、最終エタノール濃度は５％ ｖ／ｖであった）で、外界温度にて処理した。反応混合物を、９０分間、外界温度にてインキュベートした。混合物の一部（０．４ｍＬ）を次いで、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５で充填されたゲルろ過カラム（アマシャムバイオサイエンスから取得したＮＡＰ１０カラム）を通過させ、未反応のＳＰＰ及び他の低分子量物質を取り除いた。上記緩衝液での溶出で、修飾抗体（「サンプルＡ」）を得た。反応混合物の第二の部分（０．２ｍＬ）をリジンの溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中、２５０ｍＭ リジンのストック溶液を０．０５ｍＬ）で処理し、５０ｍＭの最終リジン濃度を得た。反応混合物を、外界温度にて２時間インキュベートし、次いで上記のようにゲルろ過カラムを通過させることによって精製し、「サンプルＢ」を得た。

抗体に連結したピリジルジチオ基（−ＳＳＰｙ）の数を、３４３ｎＭにて８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を有するピリジン−２−チオンを放出させるためのジチオスレイトールでの処理によって検定した。リジンで処理されていなかった親サンプルＡは、抗体１分子あたり４．９個の−ＳＳＰｙが連結していた。サンプルＢは、抗体１分子あたり３．５個の−ＳＳＰｙが連結しており、リジン処理が、不安定に結合したリンカー（それは、このサンプルでは最初に結合していたリンカーの合計の４０％もの量であった）を取り除くことを示した。

修飾抗体サンプルＡ及びＢ（２．３ｍｇの抗体）を、５０ｍＭ リン酸カリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、及び２ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中、ｐＨ６．５にて、各々２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。両サンプルを、連結した−ＳＳＰｙに対して１．７倍モル濃度過剰のＤＭ１を用いて、ジメチルアセトアミド中のＤＭ１（ジメチルアセトアミドの最終濃度３％ ｖ／ｖ）で処理した。したがって、サンプルＡを、０．１３マイクロモルのＤＭ１で処理したものの、リジン処理サンプルＢは０．０８６マイクロモルのＤＭ１しか必要としなかった。反応混合物を、外界温度にて、２４ｈインキュベートした。

単量体抗体−ＤＭ１複合体を、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）Ｓ３００で充填したゲルろ過カラム（２０ｍＬ）を通過させ、ｐＨ６．５にてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で溶出することによって分離した。抗体１分子あたりに連結したＤＭ１分子の数を、実施例１で説明されているように決定した。最初に４．９個の−ＳＳＰｙ基を含んでいたサンプルＡは、１抗体あたり３．５個のＤＭ１を与え、３．５個の−ＳＳＰｙを有していたサンプルＢは、１抗体あたり３．２個のＤＭ１という結果となった。両方の抗体−ＤＭ１複合体を、ＰＢＳ中へと４８時間透析し、ＤＭ１含有量を再検定した。サンプルＡにおいては、連結したＤＭ１分子の数は３．５から３．４へと減少したものの、サンプルＢにおける連結したＤＭ１分子の数は３．２で変化がなかった。これは、リジンでの処理が、不安定に結合したリンカーを取り除くものの、達成され得る安定に結合したＤＭ１薬物のレベルに影響しないという結論を裏付ける。

実施例３
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、複合体反応混合物の精製後に保持工程を含み、かつ保持工程後に複合体の透析（膜ベースのＴＦＦを用いる）を含む方法を実証する。

ＢＩＷＡ ４抗体を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で、１０５分間、室温にて、ＳＰＰ（抗体に対して６．６倍モル濃度過剰のＳＰＰ）で修飾した。修飾抗体を次いで、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化されたＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。精製された修飾抗体を次いで、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（最終濃度３％）中のＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、複合体を、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。

複合体の一部（サンプルＡ）を、さらなる処理なしで４℃に置いた。第二の部分（サンプルＢ）は、４℃にて４日間保持し、次いでＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して透析し、また４℃に置いた。遊離薬物を、実施例１において説明したように、周期的に測定した。結果を表２に示す。

表２中に示されるデータによって明らかであるように、透析されたサンプルからの遊離薬物の放出は、未処理のサンプルからの放出と比べて、有意に減少した。

実施例４Ａ
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、膜ベースのＴＦＦによる透析に先立ち、延長された保持工程を含む方法を実証する。

ＢＩＷＡ ４モノクローナル抗体（２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、ＳＰＰ（ＳＰＰが６．６倍モル濃度過剰）と、およそ１３０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で反応させた。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆのカラムを用いて、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化及び溶出し、修飾抗体を精製した。修飾抗体を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中に溶解したＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、複合体化した抗体サンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。

複合体の一部を、一日間４℃にて保持し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して膜ベースのＴＦＦによって透析し、４℃に置いた。複合体の第二の部分を、３０日間保持し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して膜ベースのＴＦＦによって透析し、４℃に置いた。遊離薬物を、実施例１において説明したように測定した。４℃にて８週間保存した後、１日間の保持後に透析したサンプルは、１．７％の遊離薬物を有した一方で、３０日間の保持後に透析したサンプルは、０．８％の遊離薬物を有した。この結果は、延長された保持工程が、複合体中の遊離薬物のレベルを下げることを実証する。

実施例４Ｂ
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、膜ベースのＴＦＦによる透析に先立って延長された保持工程を含む方法を実証し、より高いｐＨ（６．５）にて保持することが、より有益であることを明らかにする。

ＢＩＷＡ ４モノクローナル抗体（２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、ＳＰＰ（ＳＰＰが４．４〜４．６倍モル濃度過剰）と、およそ１２０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で反応させた。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆのカラムを用いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む３５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で平衡化及び溶出し、修飾抗体を精製した。修飾抗体を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中に溶解したＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、複合体化した抗体サンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．５（サンプルＡ）か、あるいは１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５（サンプルＢ）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。両サンプルを、２ｍｇ／ｍＬの複合体濃度にて、２〜８℃にて、２９日間保持した。次いで、サンプルＡをＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して透析した。サンプルＢは、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して透析した。両サンプルを、２〜８℃にて保存し、実施例１Ａ中に説明されているように、周期的に遊離薬物を解析した。この解析の結果を表３に示す。

表３に示されたデータによって明らかであるように、ｐＨ６．５にて保持されていた複合体（サンプルＡ）の安定性（遊離薬物の放出に関して）は、ｐＨ５．５にて保持されていた複合体サンプル（サンプルＢ）の安定性よりも有意に大きかった。注目すべきは、サンプルＢの最終製剤はｐＨ５．５であったのに対し、サンプルＡではｐＨ６．５であったことである。しかし、米国特許出願公開２００４／０２４１１７４ Ａ１中に開示されているように、ｐＨ５．５にて複合体を製剤化することは、ｐＨ６．５にて製剤化することと比較して、著しい安定性（遊離薬物の放出に関して）を付与する。これらの結果は、ｐＨ５．５と比較して、ｐＨ６．５にて複合体を保持することの安定化効果を裏付ける。

実施例５
本実施例は、ｐＨ６未満にて、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法を実証する。

ｈｕＮ９０１抗体を、ＳＰＰ（表３に示されるように、ＳＰＰがモル濃度過剰である）と、９０〜１２０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で修飾した。修飾抗体の一定分量を次いで、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む３５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）か、あるいは５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化した別々のＧ２５Ｆのカラム上で精製した。各溶液からの修飾抗体を、実施例１においてに説明されているように、ＤＭ１と複合体化させ、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５上で精製した。薬物／抗体比もまた、実施例１において説明されているように決定した。リンカー／抗体比を、実施例２中に説明されているように、放出可能なピリジルジチオ基を測定することによって決定した。異なるｐＨをもつ溶液中で複合体化したサンプルの解析の結果を、表４に示す。

表４に示されるデータによって明らかであるように、複合体化がより低いｐＨにて行われる場合、より高いｐＨにて観察されるのと同一の最終薬物／抗体レベルを達成するのに、より小さな過剰量のＳＰＰが必要である。その結果、添加される薬物の量は測定されたリンカー／抗体比に基づくため、同一の最終薬物／抗体レベルを達成するのに、より少ないＤＭ１が必要である。より低いｐＨでのリンカー及び薬物のより効率的な利用は、材料費を減少させるだけではなく、また複合体化反応の間の減少された副反応を指し示している。

実施例６
本実施例は、ｐＨ６未満にて修飾抗体を薬物と複合体化させることの有益な効果をさらに実証する。

ｈｕＮ９０１モノクローナル抗体（８ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ、５．６倍モル濃度過剰）と、およそ１８０分間、２０℃にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。第一グループにおいては、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で平衡化及び溶出して、反応混合物を精製した。第二グループにおいては、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化及び溶出して、反応混合物を精製した。両サンプルを、３％の最終濃度のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中で、３、１９、２５、４８、及び１２０時間、室温にて、ＤＭ１（結合したリンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。

したがって、第一グループのサンプルは、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で複合体化させ、第二グループのサンプルは、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で複合体化させた。次いで、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化及び溶出して、サンプルを精製した。

両グループにおいて、リンカー／抗体比を、３４３ｎＭにて８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を有するピリジン−２−チオンを放出させるためのジチオスレイトールでの処理によって決定した。複合体化工程の薬物／抗体比を、分光光度法（２８０ｎｍ及び２５２ｎｍの波長）で決定した。

第一グループは、４．３のリンカー／抗体比を有した。第二グループは、４．２のリンカー／抗体比を有した。

２つのグループの経時的な薬物／抗体比を、表５に示す。

表５中に示されるデータセットから明白であるように、ｐＨ５．０にて修飾抗体を薬物と複合体化させることによって作られる複合体は、６．５の複合体化ｐＨにて作られる複合体よりも、複合体化反応の過程において、結合した薬物が、より高く、かつより安定なレベルに達する。増加した安定性に加え、この結果は、６．５の複合体化ｐＨにて同一量の薬物を用いた場合よりも、ｐＨ５．０での複合体化によって、より高い薬物／抗体レベルが達成されることを示し、それによってｐＨ５．０での薬物のより効率的な利用を示す。

両グループにおいて、経時的な複合体単量体量を決定した。得られたデータを、表６に示す。

表６に示されたデータから明白であるように、５．０のｐＨにて修飾抗体を薬物と複合体化させることによって作られた複合体は、６．５の複合体化ｐＨにて作られた複合体よりも、より高いレベルの複合体単量体を有する。

実施例７
本実施例は、ｐＨ６未満にて、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法をさらに実証する。

ＢＩＷＡ ４抗体を、ＳＰＰ（表６に示されるように、ＳＰＰがモル濃度過剰である）で、１２０〜１４０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で修飾した。修飾抗体の一定分量を、様々なｐＨ値（ｐＨ４．６〜６．５）を有する緩衝液中で平衡化した別々のＮＡＰ ２５カラム上で精製した。ｐＨ４．６〜５．９の緩衝液は、３５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、及び２ｍＭ ＥＤＴＡから構成された。ｐＨ６．５の緩衝液は、２ｍＭ ＥＤＴＡを有するＰＢＳであった。

各ｐＨにて、修飾抗体をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中のＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。１７〜１８時間、室温にてインキュベートした後、複合体化された抗体サンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＮＡＰ ２５カラム上のクロマトグラフィによって精製した。この解析結果を、表７に示す。リンカー／抗体比（表７におけるＬ／Ａ）を、実施例２中に説明されているように、放出可能なピリジルジチオ基の測定によって決定した。薬物／抗体比（表７におけるＤ／Ａ）を、実施例１Ａ中に説明されているように決定した。ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラムを用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、０．２Ｍ 塩化カリウム、及び２０％ イソプロパノールを含む０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化して展開し、複合体単量体、高分子量種、及び低分子量種を決定した。複合体化工程収率を、複合体化された抗体の収率（実施例１Ａ中に説明されているように算出した）を、複合体化工程において用いられた修飾抗体の量（２８０ｎｍの波長にて、分光光度法によって決定した）で割り算することによって、決定した。

表７中に示されるデータは、ＳＰＰ修飾ＢＩＷＡ ４のＤＭ１での複合体化が、ｐＨ６．５での複合体化と比較して、６．０未満のｐＨにてより効率的であったことを実証する。特定の最終薬物／抗体比に達するために必要なＳＰＰリンカー及びＤＭ１の量は、より低いｐＨにて減少した。さらに、複合体単量体、高分子量種、及び低分子量種のレベルは、より低いｐＨにてより至適であり、収率が改善される。

実施例８
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、複合体化反応のｐＨが７より大きい方法を実証する。

ｈｕＢ４抗体を、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（６．０倍モル濃度過剰）と１２０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５中で反応させた。修飾抗体の様々な一定分量を次いで、様々なｐＨ値（６．１〜８．０）をもつ緩衝液中で平衡化した別々のＮＡＰ ２５カラム上で精製した。これらの異なるｐＨ値をもつ溶液からの修飾抗体を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中のＤＭ４（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて１６〜１８時間インキュベートした後、複合体化された抗体サンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。この解析の結果を、表８に示す。リンカー／抗体比（表８におけるＬ／Ａ）を、実施例２中に説明されているように、放出可能なピリジルジチオ基を測定することによって決定した。薬物／抗体比（表８におけるＤ／Ａ）を、実施例１Ａ中に説明されているように決定した。複合体単量体及び複合体化工程収率を、実施例８中に説明されているように決定した。

表８に示されるデータは、複合体収率及び複合体単量体レベルが、ｐＨ６．１〜６．５よりも７．０以上のｐＨにて、より至適であったことを実証する。さらに、同一量のＤＭ４の利用でより高い薬物／抗体比が達成され、それはより高いｐＨにてＤＭ４のより効率的な取込みを指し示す。

実施例９
本実施例は、６．５より大きいｐＨにて修飾抗体を薬物と複合体化させることの有益な効果を実証する。

第一の実験において、ＣＮＴＯ９５抗体（１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ、４．５倍モル濃度過剰）で１２０分間、２０℃にて、２．７％ショ糖及び５％エタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で修飾した。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて、１２．５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５、１２．５ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中で平衡化し溶出し、反応混合物を精製した。精製された修飾抗体を次いで二つのグループに分割した。第一グループにおいて、１２．５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＤＭＡ、及びリンカーあたり１．７倍モル濃度過剰の薬物を含む１２．５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５）中で、２０℃にて、複合体化を行った。第二グループにおいては、複合体化を、７．５のｐＨに調整した緩衝液中で行った。複合体化された抗体を、１３５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で平衡化したＮＡＰ−１０カラム上で、精製した。

薬物／抗体比を両グループについて測定した。その結果のデータを表９に示す。

表９に示されるデータによって明らかであるように、複合体化は、ｐＨ６．５よりもｐＨ７．５でより迅速に進む。

第二の実験において、ｈｕＢ４ヒト化モノクローナル抗体を、（ａ）抗体に対して４．９倍モル濃度過剰のＳＰＤＢか、又は（ｂ）抗体に対して４．８倍モル濃度過剰のＳＰＤＢ、のいずれかで修飾した。両方の状況において、反応は合計１２０分間、室温で、５％エタノール中、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で行った。サンプル（ａ）を、５０ｍＭ リン酸カリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ中、ｐＨ６．５にて平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラム上で精製した。サンプル（ｂ）を、クロマトグラフィ緩衝液をｐＨ７．５に調整したこと以外は同等に精製した。両サンプルを、ＤＭ４（結合したリンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と、１８時間、室温にて、３％の最終濃度のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中で複合体化させた。

したがって、サンプル（ａ）はｐＨ６．５にて複合体化し、サンプル（ｂ）はｐＨ７．５にて複合体化した。サンプルを次いで、ｐＨ６．５にて９．６ｍＭ リン酸カリウム及び４．２ｍＭ 塩化ナトリウム中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ樹脂のカラム上で精製した。両サンプルを、４℃にて、最大７ヶ月間までインキュベートし、一定間隔で放出された遊離薬物の解析に供した。その結果のデータを表１０に示す。

表１０に示されたデータによって明らかであるように、遊離薬物の放出は、ｐＨ６．５にて複合体化されたサンプル（ａ）に対して、ｐＨ７．５にて複合体化されたサンプル（ｂ）からの方が、実質的により遅い。したがって、ｐＨ６．５にて調製された薬物複合体産物と比較して、ｐＨ７．５にて調製された薬物複合体産物のほうが、経時的な遊離薬物の放出に関して、より安定であることが明らかである。ｐＨ７．５における複合体化はまた、ｐＨ６．５においてよりもよい薬物の取り込みを示し、それによってより少ない薬物を用いることが必要となる。

実施例１０
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、複合体化反応混合物がショ糖を含む方法を実証する。

Ｊ５９１抗体を、ＳＰＰ（抗体に対して７．０倍モル濃度過剰のＳＰＰ）で、１３０分間、室温にて、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び５％エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で修飾した。修飾抗体を次いで、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。修飾抗体を、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖の存在下又は非存在下のいずれかにおいて、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中のＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、ショ糖なしで複合体化したサンプルを、２０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。ショ糖の存在下で複合体化したサンプルを、５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む２０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。添加ショ糖とともに行われた方法の複合体化工程収率（実施例７において説明したように決定した）は６２％であった（２回の操作の平均）一方で、ショ糖なしの方法の収率は４９％であった（２回の操作の平均）。したがって、本実施例の結果は、ショ糖が複合体化反応の収率を改善することを実証している。

実施例１１
本実施例は、薬物と化学的に共役した抗体を含む複合体を調製する方法であって、複合体化反応混合物がショ糖を含む方法を実証する。

ＢＩＷＡ ４抗体を、ＳＰＰ（抗体に対して６．６倍モル濃度過剰のＳＰＰ）で、１２０分間、室温にて、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５％エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で修飾した。修飾抗体を、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。精製した修飾抗体を次いで、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖の存在下又は非存在下のいずれかにおいて、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終濃度３％）中のＤＭ１（リンカーに対して１．７倍モル濃度過剰）と複合体化させた。室温にて一晩インキュベートした後、ショ糖なしで複合体化したサンプルをＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。ショ糖の存在下で複合体化したサンプルを、２つの部分に分割した。１つの部分は、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。２つめの部分は、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィによって精製した。複合体化反応及び引き続いてのＧ２５カラム両方においてショ糖とともに行われた方法の複合体化工程収率（実施例７において説明したように決定した）は８０％であった一方で、複合体化反応のみにおいてショ糖とともに行われた方法の収率は６８％であり、ショ糖なしで行われた方法の収率は６２％であった。したがって、本実施例の結果は、ショ糖が複合体化反応及び引き続いての精製工程の収率を改善することを実証している。

本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が本明細書中に示されるのと同じ程度に、本明細書により参考として援用される。

本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示語の使用は、本明細書中で他に示されない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に注記されない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の列記は、本明細書中で他に示されない限り、単にその範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載されている全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は他に文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言語（例、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く明瞭にすることが意図され、そして他に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の如何なる言葉も、主張されていない任意の要素を本発明の実施に必須なものとして示すと解釈されるべきではない。

本発明を実施するために本発明者らが把握する最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、先の記載を読むことで、当業者に明白となり得る。本発明者らは、当業者が適宜このような変形形態を用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組合せが、本明細書中で他に示されない限り、又は他の文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。

この図は、種々のｐＨレベルにて保持した後の、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）で修飾したｈｕＮ９０１からの４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＰＰＡ）リンカーの放出（最初に結合していた全リンカーの％）のグラフである。

Claims (44)

1. 薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を調製する方法であって、以下を含む方法：
   （ａ）細胞結合剤を二官能性架橋試薬と接触させて、細胞結合剤にリンカーを共有結合させ、それによって、リンカーが安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤を含む第一混合物を調製すること、
   （ｂ）第一混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーが結合した細胞結合剤を第一混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第一混合物を調製すること、（ｃ）ｐＨが４．５から８の溶液中で、リンカーが結合した細胞結合剤を薬物と反応させることによって、薬物をリンカーが結合した細胞結合剤と複合体化させ、（ｉ）リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤、（ｉｉ）遊離薬物、並びに（ｉｉｉ）溶媒及び反応副産物、を含む第二混合物を調製すること、
   （ｄ）第二混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、リンカーを通じて薬物と化学的に共役した細胞結合剤を第二混合物の他の成分から精製し、それによって精製された第二混合物を調製すること、
   （ｅ）精製された第二混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）に任意で供し、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を単離すること、並びに
   （ｆ）混合物を、工程ａ−ｂ、工程ｂ−ｃ、及び工程ｄ−ｅの少なくとも１つの間で少なくとも５時間保持し、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から放出させること。
2. 細胞結合剤が、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トランスフェリン、及び抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 細胞結合剤が抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
5. 抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５及びｈｕＤＳ６及びリツキシマブからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
7. 薬物が細胞毒性剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 細胞毒性剤が、メイタンシノイド、タキサン、ＣＣ１０６５、及び前述のアナログからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 薬物がメイタンシノイドである、請求項８に記載の方法。
10. メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項９に記載の方法。
11. メイタンシノイドがＤＭ１又はＤＭ４である、請求項１０に記載の方法。
12. 細胞結合剤が、ジスルフィド結合、酸解離性結合、光解離性結合、ペプチダーゼ解離性結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼ解離性結合からなる群より選択される化学結合を介して薬物と化学的に共役している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 工程（ｃ）及び／又は（ｄ）における溶液がさらにショ糖を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 工程（ｃ）及び／又は（ｄ）における溶液がさらに、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液からなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 不安定に結合したリンカーが、工程（ｆ）の混合物のｐＨを調整することによって細胞結合剤から放出される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 保持工程が、混合物を２℃〜８℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から４週間までの間インキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 保持工程が、混合物を２０℃〜３０℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から１週間までの間インキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 保持工程が、混合物を２℃〜８℃で、４．５〜５．９のｐＨにて、５時間から５日までの間インキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
19. 保持工程が、混合物を２０℃〜３０℃で、４．５〜５．９のｐＨにて、５時間から１日までの間インキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
20. 保持工程がさらに、混合物へ求核試薬を添加することを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 求核試薬が、一級求核アミン、二級求核アミン、又はそれらの組合せである、請求項２０に記載の方法。
22. 求核試薬が、グリシルグリシン、タウリン、ジエタノールアミン、リジン、ヒドロキシルアミン、イミダゾール、エチルアミン、４−アミノ−１−ブタノール、ポリリジン、リジン含有ペプチド、ポリ（エチレンイミン）、ヒドラジン、グリシン、エタノールアミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパン−ジオール及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 非吸着性クロマトグラフィが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂、及びＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂からなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を調製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）細胞結合剤を、活性エステルを持つ薬物と接触させ、それによって、薬物が安定に結合した細胞結合剤及び不安定に結合した細胞結合剤を含む混合物を調製すること、
    （ｂ）混合物を非吸着性クロマトグラフィに供し、薬物が結合した細胞結合剤を混合物の他の成分から精製し、それによって精製された混合物を調製すること、
    （ｃ）精製された混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）に任意で供し、薬物と化学的に共役した細胞結合剤を含む複合体を単離すること、並びに
    （ｄ）混合物を、工程ａ−ｂ及びｂ−ｃの少なくとも１つの間で保持し、不安定に結合した薬物を細胞結合剤から放出させること；
    ここで、保持工程は、（ｉ）混合物を２℃〜８℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から４週間までインキュベートすること、又は（ｉｉ）混合物を２０℃〜３０℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から１週間までインキュベートすることを含む。
25. 細胞結合剤が、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トランスフェリン、及び抗体からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 細胞結合剤が抗体である、請求項２５に記載の方法。
27. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の方法。
28. 抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
29. 抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、及びリツキシマブからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
30. 薬物が細胞毒性剤である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 細胞毒性剤が、メイタンシノイド、タキサン、ＣＣ１０６５、及び前記のアナログからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 薬物がメイタンシノイドである、請求項３１に記載の方法。
33. メイタンシノイドがチオール基を含む、請求項３２に記載の方法。
34. メイタンシノイドがＤＭ１又はＤＭ４である、請求項３３に記載の方法。
35. 細胞結合剤が、ジスルフィド結合、酸解離性結合、光解離性結合、ペプチダーゼ解離性結合、チオエーテル結合、及びエステラーゼ解離性結合からなる群より選択される化学結合を介して薬物と化学的に共役している、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 工程（ａ）及び／又は（ｂ）における溶液がさらにショ糖を含む、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 工程（ａ）及び／又は（ｂ）における溶液がさらに、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、及びリン酸塩緩衝液からなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
38. 不安定に結合したリンカーが、工程（ｄ）の混合物のｐＨを調整することによって細胞結合剤から放出される、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 保持工程が、混合物を２℃〜８℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から４週間までインキュベートすることを含む、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 保持工程が、混合物を２０℃〜３０℃で、６〜７．５のｐＨにて、１２時間から１週間までインキュベートすることを含む、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
41. 保持工程がさらに、混合物への求核試薬の添加を含む、請求項２４〜４０のいずれかに記載の方法。
42. 求核試薬が、一級求核アミン、二級求核アミン、又はそれらの組合せである、請求項４１に記載の方法。
43. 求核試薬が、グリシルグリシン、タウリン、ジエタノールアミン、リジン、ヒドロキシルアミン、イミダゾール、エチルアミン、４−アミノ−１−ブタノール、ポリリジン、リジン含有ペプチド、ポリ（エチレンイミン）、ヒドラジン、グリシン、エタノールアミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパン−ジオール及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
44. 非吸着性クロマトグラフィが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂、及びＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂からなる群より選択される、請求項２４〜４３のいずれか１項に記載の方法。

Images