FI97303B - Kimeeristen vasta-aineiden tuottaminen homologisella rekombinaatiolla - Google Patents

Description

97303

Kimeeristen vasta-aineiden tuottaminen homologisella rekombinaatiolla Tämä keksintö koskee menetelmää kimeeristen vasta-5 aineiden tuottamiseksi käyttäen uusia rekombinantteja DNA-vektoreita ja homologista rekombinaatiota in situ. Keksinnön rekombinantti DNA-konstrukteja voidaan käyttää transfektoimaan vasta-aineita tuottavat solut niin, että kohdistettu homologinen rekombinaatio tapahtuu transfek-10 toiduissa soluissa, mikä johtaa kimeeristen vasta-aineiden tuotantoon transfektoiduissa soluissa.

Keksintöä kuvataan esimerkein, joissa jyrsijän immunoglobuliinin raskaan ketjun vakioalueet korvattiin ihmisen IgGl vakioalueilla ja jyrsijäsolulinja tuotti 15 kimeerisiä raskaita ketjuja.

Aina lähtien solufuusiotekniikan kehittämisestä monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi (Kohler ja Milstein, 1975, Nature (London) 256:495) lukuisat tutkijat ovat tuottaneet suuren määrän monoklonaalisia vas-20 ta-aineita, joista monet määrittävät tähän saakka tuntemattomia antigeenejä. Pahaksi onneksi useimmat tähän asti tehdyt vasta-aineet tuotetaan jyrsijöissä ja niiden käyttökelpoisuus on siksi rajallinen ihmisten terapeuttisina aineina, jollei niitä muunneta siten, että jyrsi-25 jän monoklonaalisia vasta-aineita ei "tunnisteta" vieraiksi epitoopeiksi ja "neutraloida" ihmisen immuunijärjestelmässä. Useat tutkijat yrittävät siksi kehittää ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joita ei "tunnisteta" yhtä helposti vieraiksi epitoopeiksi ja jotka voi-30 vat poistaa ongelmat, jotka liittyvät monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöön ihmisissä. On selvää, että Kohlerin ja Milsteinin (supra) kehittämää hybridooma-menetelmää, johon kuuluu immunisoitujen hiirien tappaminen ja niiden pernan käyttäminen lymfosyyttilähteenä 35 seuraavalle fuusiolle vasta-aineita tuottavien solulin-jojen säilyttämiseksi, ei voida käyttää ihmiselle. Siksi 2 97303 monet tutkijat ovat suunnanneet huomionsa viime aikojen edistysaskeliin molekyylibiologian alalla, jotka sallivat DNA:n lisäämisen nisäkkäiden soluihin immuno-globuliinigeenien ekspressoimiseksi (Oi et ai., 1983 5 Proc. NatL Acad. Sei. USA 80:825; Potter et ai., 1984 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7161), ja he ovat käyttäneet näitä menetelmiä kimeeristen vasta-aineiden tuottamiseksi (Morrison et ai-, 1984 Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 81:6581; Sahagan et ai., 1986, J. Immunol.

10 137:1066; Sun et ai., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei.

84:214).

Kimeeriset vasta-aineet ovat immunoglobuliinimole-kyylejä, jotka sisältävät ihmis- ja ei-ihmisosan. Tarkemmin, kimeerisen vasta-aineen antigeeniin yhdistyvä alue 15 (eli muuttuva alue) otetaan ei-ihmislähteestä (esim.

jyrsijästä) ja kimeerisen vasta-aineen vakioalue (joka tuottaa immunoglobuliinille biologisen vaikuttajafunktion) otetaan ihmislähteestä. Kimeerisellä vasta-aineella tulisi olla ei-ihmisvasta-ainemolekyylin antigeeninsidonta-20 spesifisyys ja ihmisvasta-ainemolekyylin vaikuttajafunktio.

Yleensä näiden kimeerisen vasta-aineiden tuottamiseen käytetyt menetelmät koostuvat seuraavista vaiheista (joidenkin vaiheiden järjestys voi muuttua): a) tunnistetaan ja kloonataan oikea geenisegment-25 ti, joka koodaa vasta-ainemolekyylin antigeeniä sitovan osan; tämä geenisegmentti (joka tunnetaan VDJ:nä, raskaiden ketjujen muuttuva, eroavuus- ja yhdistävä osa, tai VJ:nä, kevyiden ketjujen muuttuva, yhdistävä alue (tai yksinkertaisesti V:nä tai muuttuvana alueena) voi olla 30 joko cDNA- tai genomisessa muodossa.

b) kloonataan geenisegmentit, jotka koodaavat vakio-osan tai sen halutut osat; c) ligatoidaan muuttuva alue vakioalueen kanssa niin, että täydellinen kimeerinen vasta-aine on koodattu 35 transkriboituvaan ja translatoituvaan muotoon; 3 97303 d) ligatoidaan tämä rakenne vektoriin, joka sisältää valikoitavat merkki- ja geenikontrollialueet, kuten promotoottorit, tehostajat ja poly(A)-lisäyssignaalit; e) vahvistetaan tämä rakenne bakteereissa; 5 f) lisätään DNA:ta eukaryoottiisin soluihin (transfektio) useimmiten nisäkkään lymfosyytteihin; g) valikoidaan soluja, jotka ekspressoivat valikoitavaa merkkiä; h) seulotaan solut, jotka ekspressoivat haluttua 10 kimeeristä vasta-ainetta; ja i) testataan vasta-aine sopivan sitoutumisspesi-fisyyden ja efektorifunktioiden suhteen.

Useiden eri antigeenisidontaspesifiyksien vasta-aineita on käsitelty näillä menetelmillä kimeeristen 15 proteiinien valmistamiseksi (esim. anti-TNP: Boulianne et ai., 1984, Nature Voi. 312 s. 643; ja antituumoriantigee-nit: Sahagan et ai., 1986, J. Immunol. Voi. 137:1066). Samoin on saavutettu useita eri efektorifunktioita kytkemällä uusia sekvenssejä niihin, jotka koodaavat antigeenin 20 sitoutumisalueen. Jotkut näistä ovat entsyymejä (Neuberger et ai., 1984, Nature 312:604), immunoglobuliinivakio-alueita toisesta lajista ja vakioalueita toisesta immuno-globuliiniketjusta (Sharon et. ai., 1984, Nature 309:364;

Tan et ai., 1985, J. Immunol. Voi. 135:3565-3567).

25 Eräs molekyylibiologinen viime aikainen edistys askel on havainto, että viljellyt nisäkkään solut integroivat eksogeenisen plasmidi-DNA:n kromosomi-DNA:hän kromosomipaikassa, joka sisältää sekvenssejä, jotka ovat homologisia plasmidisekvenssien kanssa. Tätä tapahtumaa 30 kutsutaan homologiseksi rekombinaatioksi (Folger, et ai., 1982, Mol. Cell. Biol. 2, 1372-1387; Folger, et. ai., 1984, Symp. Quant. Biol. 49, 123-138; Kucherlapati, et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 3153-3157; Lin, et ai., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 1391-1395; 35 Robert de Saint Vincent, et ai., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 2002-2006; Shaul, et ai., 1985, Proc. Natl.

4 97303

Acad. Sei. USA 82, 3781-3784). Nisäkässolut sisältävät myös entsyymilaitteiston plasmidi-DNA:n integroimiseksi satunnaisiin kromosomipaikkoihin, mitä kutsutaan ei-homo-logisiksi rekombinaatioiksi. Homologisen rekombinaation 5 frekvenssin on raportoitu olevan jopa 1/100 - 1/1000 rekombinaatiotapauksista, suurimman osan rekombinaatiois-ta johtuessa ei-homologisista vuorovaikutuksista (Thomas et ai., 1986, Cell 44:419-428; Smithies et. ai., 1985, Nature 317:230-234; Shaul, et. ai., 1985, Proc. Natl.

10 Acad. Sei. USA 82, 3781-3784; Smith, et ai., 1984, Symp. Quant. Biol. 49', 171-181; Subramani, et ai., 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1040-1052). Homologisen rekombinaation mahdollistavan solulaitteiston läsnäolo mahdollistaa geenien modifioinnin in situ. Joissakin tapauksissa on löy-15 detty olosuhteet, joissa kromosomisekvenssiä voidaan muunnella lisäämällä soluun plasmidi-DNA, joka sisältää DNA-segmentin, joka on homologinen kohdelokuksen kanssa ja segmentin uusia sekvenssejä, joissa on haluttu modifikaatio (Thomas et ai., 1986, Cell 44:419-428; Smithies et 20 ai., 1985, Nature 317:230-234; Smith, et ai., 1984,

Symp. Quant. Biol. 49, 171-181). Homologinen rekombinaatio nisäkässolun kromosomi-DNA:n ja eksogeenisen plasmidi-DNA: n välillä voi johtaa plasmidin integraatioon tai joidenkin kromosomisekvenssien korvautumiseen homologi-25 silla plasmidisekvensseillä. Prosessia, jossa homologisia DNA-sekvenssejä korvataan, kutsutaan geenikonversiok-si. Sekä integraatio- että konversiotapahtumat voivat johtaa halutun uuden sekvenssin asettumiseen endogeeni-seen kohdelokukseen.

30 Homologista rekombinaatiota on kuitenkin tutkittu pääasiassa käyttäen geenejä, jotka tarjoavat dominantti-valinnan kuten NEO ja HPRT ja vain harvoilla solutyypeillä (Song et ai., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6820-6824; Rubinitz ja Subramani, 1986, Mol. Cell. Biol.

35 6:1608-1614; ja Liskay, 1983, Cell 35:157-164). Ei ole selvitetty, voivatko lymfosyytit tai myeloomasolut 5 97303 välittää sellaisia tapahtumia tai voidaanko immuno-globuliinigeenejä kohdistaa tai rekonstruoida sellaisella menetelmällä.

Keksintö koskee menetelmää vasta-ainemolekyylien 5 modifioimiseksi ja sellaisten kimeeristen vasta-ainemolekyylien luomiseksi ja tuottamiseksi, joissa antigeeniin liittyvä alue on kytketty (a) immunoglobuliinin vakio-alueeseen tai sen johonkin osaan, joka tuottaa halutun ominaisuuden kuten efektorifunktion, luokan (esim. IgG, 10 IgA, IgM, IgD tai IgE) alkuperän (esim. ihmisen tai muiden lajien); tai (b) toisentyyppiseen molekyyliin, joka tuottaa jonkin muun ominaisuuden kimeeriselle vas-ta-ainemolekyylille (esim. entsyymi, toksiini, biologisesti aktiivinen peptidi, kasvutekijän inhibiittori tai kyt-15 kentäpeptidi mahdollistamaan konjugaation lääkkeeseen, toksiiniin tai muuhun molekyyliin, jne.).

Keksinnössä käytetään uusia rekombinantteja DNA-vektoreita tuottamaan kohdistetun geenimodifikaation, joka saadaan aikaan homologisella rekombinaatiolla joko 20 (a) solulinjoissa, jotka tuottavat vasta-aineita, joilla on halutut antigeenispesifisyydet siten, että vasta-aine-molekyylin antigeeniin yhdistyvä kohta pysyy muuttumattomana, mutta vasta-ainemolekyylin vakio-osa tai sen osa korvataan tai sitä muutetaan; tai (b) solulinjoissa, 25 jotka tuottavat haluttujen luokkien vasta-aineita, joissa voi olla haluttuja efektorifunktioita, siten että vasta-ainemolekyylin vakio-osa pysyy muuttumattomana, mutta vasta-ainemolekyylin muuttuva osa tai sen osa korvataan tai sitä muutetaan.

30 Keksinnön erään toteutustavan mukaisesti käytetään uutta rekombinanttia DNA-vektoria transfektoimaan solu-linja, joka tuottaa vasta-ainetta, jolla on haluttu antigeenispesif isyys . Uusi rekombinantti DNA-vektori sisältää "korvausgeenin", joka korvaa kokonaan tai osittain 35 geenin, johon on koodattu solulinjan immunoglobuliini-vakio-osa (korvausgeeni voi esim. koodata kokonaan tai 6 97303 osittain ihmisen immunoglobuliinin vakio-osan, spesifin immunoglobuliiniluokan tai entsyymin, toksiinin, biologisesti aktiivisen peptidin, kasvutekijän, inhibiittorin tai kytkentäpeptidin, joka mahdollistaa konjugaation 5 lääkkeeseen, toksiiniin tai muuhun molekyyliin, jne.) ja "kohdesekvenssin", joka mahdollistaa homologisen rekombi-naation ja kohdegeenin muunnoksen vasta-ainetta tuottavassa solussa. Keksinnön vaihtoehtoisessa toteutustavassa käytetään uutta DNA-vektoria transfektoimaan solulinja, 10 joka tuottaa vasta-ainetta, jolla on haluttu efektori- funktio, jossa tapauksessa uudessa rekombinanttivektorissa oleva korvausgeeni voi koodata kokonaan tai osittain vas-ta-ainemolekyylin, joll aon haluttu antigeenispesifisyys, ja rekombinanttivektorissa oleva kohdesekvenssi mahdollis-15 taa homologisen rekombinaation ja kohdegeenin modifikaation vasta-ainetta tuottavassa solussa. Kummassakin toteutustavassa, kun vain osa muuttuvasta tai vakio-osasta korvataan, syntyvä kimeerinen vasta-aine voi määritellä saman antigeenin ja/tai sillä voi olla sama efektori-20 funktio ja kuitenkin sitä voidaan muuntaa tai parantaa siten, että kimeerisellä vasta-aineella voi olla suurempi antigeenispesifisyys, suurempi affiniteettisitoutumisva-kio, voimakkaampi efektorifunktio tai lisääntynyt eritys ja tuotanto transfektoidussa vasta-ainetta tuottavassa 25 solulinjassa, jne. Riippumatta käytetystä toteutustavasta, valintamenetelmiä integroitua DNA:ta varten (valikoitavalla leimalla), seulontaa kimeerisen vasta-aineen-tuotannon suhteen ja solukloonausta voidaan käyttää tuotettaessa soluklooni, joka tuottaa kimeeristä vasta-30 ainetta.

Niinpä DNA-pala, joka koodaa muunnoksen mono-klonaaliseen vasta-aineeseen voidaan kohdistaa suoraan expressoidun immunoglobuliinigeenin kohdalla B-solussa tai hybridoomasolulinjassa. DNA-rakenteita mille tahansa 35 modifikaatiolle voidaan käyttää muuntamaan minkä tahansa monoklonaalisen solulinjan tai hybridooman proteiinituotetta. Sellainen menetelmä kiertää kalliin ja aikaa- 7 97303 vievän sekä raskas- että kevytketjuissa muuttuvan alueen geenien kloonaamisen kustakin B-solukloonista, jossa on käyttökelpoista antigeenispesifisyyttä. Sen lisäksi, että kierretään muuttuvan alueen geenien kloonaamisprosessi, 5 kimeerisen vasta-aineen ekspression pitäisi olla suurempaa, kun geeni on luonnollisessa kromosomipaikassaan eikä sattumanvaraisessa paikassa.

Seuraavilla termeillä, olivatpa ne yksikössä tai monikossa, on tässä käytettynä nämä merkitykset: 10 Kimeerinen vasta-aine: vasta-ainemolekyyli, jossa (a) vakioaluetta tai sen osaa on muutettu, korvattu tai vaihdettu siten, että antigeeniin sitoutuva osa (muuttuva alue) on kytkeytynyt toisen tai muutetun luokan, efek-torifunktion ja/tai lajin vakio-osaan tai kokonaan toi-15 senlaiseen molekyyliin, joka tuottaa uusia ominaisuuksia kimeeriselle vasta-aineelle, esim. entsyymiin, toksiiniin, hormoniin, kasvutekijään, lääkkeeseen, jne; tai (b) muuttuva alue tai sen osa on muutettu, korvattu tai vaihdettu muuttuvaan osaan, jolla on erilainen tai muunnettu anti-20 geenispesifisyys.

Korvausgeeni: geeni, johon on koodattu tuote, joka korvaa kokonaan tai osittain vasta-ainemolekyylin vakio-osan tai muuttuvan osan kimeerisen vasta-ainemolekyylin muodostamiseksi. Korvausgeenit muodostetaan keksinnön 25 uusiin rekombinantti DNA-kohdevektoreihin, joita käytetään transfektoimaan vasta-ainetta tuottavat solulinjat.

Koko vakioalueen tai sen osan muuttamiseksi keksinnön korvausgeenit voivat olla muun muassa immunoglobuliini-vakio-osa, jossa on tietty efektorifunktio, luokka ja/tai 30 alkuperä (esim. ihmisen tai minkä tahansa muun lajin immunoglobuliinien IgG, IgA, IgM, IgD tai IgE vakio-osat) tai vakio-osasta, joka muuttaa immunoglobuliinin vakio-osan toimintaa tai ominaisuuksia; samoin kuin geenejä, jotka koodaavat muita molekyylejä, jotka aiheuttavat jon-35 kin uuden funktion kimeeriselle vasta-ainemolekyylille, esim. entsyymi, toksiini, hormooni, kasvutekijä, konju-goituva kytkijä, jne. Koko muuttuvan osan tai sen osan 8 97303 muuntamiseksi keksinnön korvausgeenit voivat olla muun muassa immunoglobuliinin muuttuvia osia, joihin on koodattu eri muuttuva osa, jolla on erilainen antigeeni-affiniteetti tai -spesifisyys tai osa muuttuvasta aluees-5 ta, joka muuttaa immunoglobuliinin muuttuvan alueen toimintaa tai ominaisuuksia siten, että syntyvällä kimeeri-sellä vasta-aineella on suurempi affiniteetti tai spesifisyys antigeenille.

Kohdesekvenssi: sekvenssi, joka on homologinen 10 DNA-sekvenssille, joka rajoittaa vasta-ainemolekyylin muutettavaa aluetta tai on sen vieressä vasta-ainemole-kyyliä tuottavan solun kromosomissa. Kohdesekvenssejä rakennetaan keksinnön uusiin rekombinantteihin DNA-vekto-reihin, joita käytetään transfektoimaan vasta-ainetta tuot-15 tavia solulinjoja.

Kohdesekvenssejä raskasketjuisille rekombinaatioil-le, jotka ohjaavat korvausta tai lisäystä koko vakio-alueessa tai sen osassa ovat muun muassa koko V, D, J ja vaihtoalue (mukaanlukien väkisekvenssit, joita kutsutaan 20 introneiksi) ja reunasekvenssit, jotka liittyvät tiettyyn raskasketjuiseen vakioalueen geeniin, jota ekspressoi transfektoitava vasta-ainetta tuottava solulinja ja niitä voivat olla myös alueet, jotka ovat alavirtaan vakioalu-eesta (mukaanlukien intronit). Kohdealueita kevytketjui-25 sille rekombinaatioille, jotka ohjaavat korvausta tai lisäystä koko vakioalueessa tai sen osassa voivat olla muun muassa V- ja J-alueet, niiden ylävirran rajasek-venssit ja välisekvenssit (intronit), jotka liittyvät kevytkejuiseen vakioaluegeeniin, jota ekspressoi trans-30 fektoitava vasta-ainetta tuottava solulinja ja niitä voivat olla alueet, jotka sijaitsevat vakioalueella tai siitä alavirtaan (mukaanlukien intronit).

Kohdealueita raskasketjuisille rekombinaatioille, jotka ohjaavat korvausta tai lisäystä koko muuttuvassa 35 alueessa tai sen osassa voivat olla muun muassa V-, D- ja J-alueet, (mukaanlukien intronit) ja reunasekvenssit, 9 97303 jotka liittyvät siihen muuttuvan alueen geeniin, jota ekspressoi transfektoitava vasta-ainetta tuottava solu-linja. Kohdealueita kevytketjuisille rekombinaatioille, jotka ohjaavat korvausta tai lisäystä koko muuttuvassa 5 alueessa tai sen osassa voivat olla muun muassa V- ja J-alueet, (mukaanlukien intronit) ja reunasekvenssit, jotka liittyvät kevytketjuiseen muuttuvan alueen geeniin, jota ekspressoi transfektoitava vasta-ainetta tuottava solulinja.

10 Kohdevektori: rekombinantti nukleotidivektori, jos sa on kohdesekvenssi ja korvausgeeni, jota voidaan käyttää muodostettaessa kimeeristen vasta-aineiden tuotantoa koh-devektorilla transfektoiduilla vasta-ainetta tuottavilla soluilla. Kohdevektoreita käytetään transfektoimaan solu-15 linjoja, jotka sisältävät sekvenssejä, jotka ovat homologisia vektorin kohdesekvenssille ja tuottavat vasta-ainetta, jolla on (a) haluttu antigeenispesifisyys; (b) haluttu vakioalue; tai (c) muu haluttu ominaisuus kuten korkea eritys, sopivuus suurimittakaavaiseen viljelyyn, 20 jne.

Seuraavilla lyhenteillä on alla annetut merkitykset : FITC: fluoreskeiini-isotiosyanaatti HRP: piparjuuriperoksidaasi 25 hu: ihminen huCyl: ihmisen gammaimmunoglobuliini l:n vakio- alue-eksonit huIgG: ihmisen gammaimmunoglobuliini m: hiiri 30 mAB: monoklonaalinen vasta-aine mlgG: hiiren gammaimmunoglobuliini

Kuvio 1 kuvaa kaavamaisesti yleistä kaavaa geenien korvaamiseksi homologisella rekombinaatiolla käyttäen keksinnön kohdevektoreita. Muuttuva (V), vaihtelu (D), 35 yhdistävä (J), vaihto- (S) ja vakio- (C) alueet on osoitettu. Osa A kuvaa kaavamaisesti raskasketjuisten geenien 10 97303 vakio- tai muuttuvan alueen korvaamista kokonaan tai osittain käyttäen kohdesekvenssiä, joka on homologinen minkä tahansa osan kanssa, joka on V-, D-, J-, S- tai C-alueella. Osa B esittää kaavamaisesti kevytketjuisten 5 geenien vakio- tai muuttuvan alueen korvaamista kokonaan tai osittain käyttäen kohdesekvenssiä, joka on homologinen minkä tahansa osan kanssa, joka on V-, J- tai C-alueella. Osa C esittää kaavamaisesti kevyt- tai raskas-ketjuisten geenien vakio- tai muuttuvan alueen korvaamis-10 ta kokonaan tai osittain käyttäen sekvenssejä, jotka rajoittuvat korvattavaan geeniin.

Kuvio 2 kuvaa kaavamaisesti kohdeplasmidin pRSV-140-neo/HuC-gamma l/MuJ4/e:n rakentamista. Kohdesekvenssi sisältää 2,2 kb Hind-III fragmentin, joka on saatu hiiren 15 immunoglobuliinin raskasketjuisesta (IgH) lokuksesta, joka sisältää neljännen liitosalueen (J4), IgH voimistimen (e) ja intronisekvenssit 5 vaihtoalueelle. Kohdesekvenssi sijaitsee 5' korvausgeeniin, joka sisältää 7,0 kb Hind III-Bam HI -fragmentin ihmisen IgGl raskasketjuisesta 20 lokuksesta, joka sisältää ihmisen gamma 1 vakioalueen.

Kuvio 3 on kartta ihmisen IgGl rekombinaatiovek-torista. Vektori sisältää 2,2 kb Hind III -fragmentin, joka sisältää hiiren raskasketjuisen voimistimen, jota on muunnettu Xba I -kohdan poistamiseksi, joka on 3,0 kb 25 Hind III/Pvu II -fragmentti, joka sisältää ihmisen gamma 1 vakioalue-eksonit (huCfl), 2,0 kg Bgl II/Bam HI -fragmentin, joka on saatu pSV2/neo:sta, joka koodaa neo:n, 667 bp Bal I/Sst I -fragmentin, jossa on ihmisen CMV -vahvistin ja edistin ja 2,3 kb Pvu II/Hind III -frag-30 mentti pBR322:sta, joka sisältää replikaation alkuperän ja ampisilliiniresistanssigeenin. Bal I/Sst I -fragmentti, joka sisältää CMV siirrettiin pEMBL 18:n Sst I/Hinc III -kohtiin, poistettiin Hind ΙΙΙ/Sst I -fragmenttina ja kloonattiin samojen kohtien välillä Picl9R:ssä ja 35 eristettiin Sma Ι/Bgl II -fragmenttina pantavaksi Pvu II- ja Bgl II -kohtien väliin rakenteessa. Samoin Hind » 11 97303 III/Pvu II -fragmentti, joka sisältää ihmisen c gamma 1 vakioalue-eksonit kloonattiin Puc 9:n Hind III- ja Hinc II -kohtiin ja siirrettiin Hind III/Bam HI -fragmenttina.

Kuvio 4 esittää lisäplasmideja, joita käytetään 5 kohdistamaan ihmisen c gamma 1 -sekvenssejä. Kuviossa 4A ja 4B olevat plasmidit ovat samat kuin kuvataan kuvion 3 plasmidin yhteydessä, paitsi: molemmissa kuvion 4A ja 4B esittämissä plasmideissa on 500 bp Bgl II/Pvu II, joka sisältää SV40 voimistimen ja edistimen pSV2neo:sta (J.

10 Molec. Appi. Genet. 1-327-341, 1982) CMV voimistimen ja edistimen sijalla, ja plasmidissa 4B on 7 kb Hind III/

Bara HI -fragmenttia, joka koodaa ihmisen c gamma l:n enemmän alavirtaan vakioalue-eksoneista.

Keksintö koskee menetelmää kimeeristen vasta-ainei-15 den tuottamiseksi käyttäen uusia rekombinantteja DNA- vektoreita kohdistamaan haluttu sekvenssimuutos tiettyyn paikkaan genomissa homologisella rekombinaatiolla in vivo. Käyttäen keksinnön menetelmää vasta-ainemolekyylin proteiinisekvenssiä voidaan muuttaa transfektoimalla vas-20 ta-ainetta tuottava solulinja sopivalla "kohdevektorilla". Yhdessä keksinnön toteutustavassa solulinja, joka tuottaa vasta-ainemolekyyliä, jolla on haluttu antigeenispesi-fisyys transfektoidaan keksinnön kohdevektorilla, joka sisältää rekombinantin DNA-molekyylin, johon on koodattu 25 "korvausgeeni" ja "kohdesekvenssi". Korvausgeeniin on koodattu haluttu molekyyli, jonka on tarkoitus korvata kokonaan tai osittain solulinja ekspressoiman vasta-ainemolekyylin vakioalue. Korvausgeeni voi esimerkiksi koodata kokonaan tai osittain immunoglobuliinin vakioalue, jol-30 la on tietty efektorifunktio, luokka ja/tai alkuperä, mukaanlukien muun muassa ihmisen tai muun halutun lajin IgG, IgA, IgM, IgD tai IgE vakioalueet; vaihtoehtoisesti korvausgeeniin voi olla koodattuna toisenlainen molekyyli, joka voi tuottaa jonkin muun funktion syntyvään ki-35 meeriseen vasta-aineeseen; esim. entsyymi, toksiini, biologisesti aktiivinen peptidi, kasvutekijä, inhibiittori, konjugoituva peptidikytkin, jne. Kohdevektorin 12 97303 kohdesekvenssi on homologinen DNA-sekvensseille, jotka ovat kromosomissa transfektoitavan solulinjan tuottaman immunoglobuliinin vakioalueen koodaavassa geenissä tai sen vieressä tai sopivalle osalle vakioalueen koodisek-5 venssiä. Transfektion jälkeen tapahtuu homologista re-kombinaatiota vasta-ainetta tuottavassa solulinjassa; jotkin näistä rekombinaatiotapahtumista johtavat koko immunoglobuliinigeenin vakioalueen tai sen osan korvautumiseen korvausgeenillä ja siksi kimeeristen vasta-ainemo-10 lekyylien ekspressoitumiseen transfektoitujen solujen toimesta.

Keksinnön vaihtoehtoisessa toteutustavassa solu-linja, joka tuottaa vasta-ainemolekyyliä, jolla on haluttu vakioalue, transfektoidaan kohdevektori11a, joka 15 sisältää korvausgeenin, johon on koodattu kokonaan tai osittain muuttuva alue, jolla on haluttu antigeenispesi-fisyys ja kohdealueen, joka ohjaa geenimodifikaatiota osassa tai koko muuttuvassa koodialueessa isäntäsolun kromosomissa. Transfektion jälkeen tapahtuu homologista 20 rekombinaatiota vasta-ainetta tuottavassa solulinjassa; osa näistä rekombinaatiotapahtumista johtavat immunoglo-buliinigeenin muuttuvan alueen korvautumiseen kokonaan tai osittain korvausgeenillä ja siksi kimeeristen vas-ta-ainemolekyylien ekspressoitumiseen transfektoitujen 25 solujen toimesta.

Kun transfektantti, joka ekspressoi kimeeristä vasta-ainetta on tunnistettu, keksinnön käyttöön kuuluu transfektantin viljely ja kimeeristen vasta-ainemolekyy-lien eristys soluviljelmäsupernatantista käyttäen sinän-30 sä tunnettuja menetelmiä monoklonaaisten vasta-aineiden eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti transfektoituja soluja voidaan viljellä askiittinesteessä eläimissä ja kerätä sinänsä tunnetuilla menetelmillä monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi.

35 Keksinnön eri puolia kuvataan tarkemmin seuraavis- sa osissa ja demonstroidaan esimerkein, joissa tuotetaan · «Hi »Iti I M Iti 13 97303 hiiren/ihmisen immunoglobuliiniraskasketjuja. Kuvauksen selvyyden vuoksi keksintöä kuvataan seuraavasti: (a) kohdevektorit; (b) transfektio; ja (c) kimeerisiä vasta-ainemolekyylejä tuottavien transfektanttien seu-5 lonta ja valinta.

Kuten aiemmin on selitetty, keksinnön kohdevektorit koostuvat rekombinantti DNA-vektoreista, mukaanlukien muun muassa plasmidit, fagit, fagemidit, kosmidit, virukset ja vastaavat, jotka sisältävät korvausgeenin ja 10 kohdesekvenssin. Kuten alla kuvataan yksityiskohtaisemmin, korvausgeeni voi sisältää minkä tahansa lukumäärän geenejä, joihin on koodattu haluttu rakennetuote, kun taas kohdesekvenssi voi vaihdella riippuen muunnettavan vas-ta-ainemolekyylin tyypistä ja transfektoitavan eläinso-15 lun tyypistä. Kohdesekvenssi ja korvausgeeni sijaitsevat kohdevektorissa siten, että sopivan vasta-ainetta tuottavan solulinjan transfektio kohdevektorilla saa aikaan kohdistetun homologisen rekombinaation siten, että gee-nimuunnos saadaan aikaan korvausgeenin kohdespesifillä 20 lisäyksellä vasta-ainegeeniin.

Keksinnön kohdevektorit voivat sisältää lisägee-nejä, jotka koodaavat valikoitavia merkkejä, esim. lääkeresistenssiä, entsyymiä, transfektanttien valinnan helpottamiseksi, tai ne voidaan ko-transfektoida sellai-25 silla merkeillä. Myös muita sekvenssejä, jotka paranta-: vat rekombinaatiotapahtumia voidaan käyttää. Sellaisia geenejä ovat muun muassa joko eukaryoottiset tai pro-karyoottiset rekombinaatioentsyymit kuten REC A, topo-isomeraasi, REC 1 tai muut DNA-sekvenssit, jotka lisää-30 vät rekombinaatiota kuten CHI. Eri proteiineja kuten niitä, jotka on koodattu edellä mainittuihin geeneihin voidaan myös transfektoida rekombinaatiofrekvenssien lisäämiseksi. Eri kohdesekvenssejä, korvausgeenejä ja valittavia merkkejä, joita voidaan käyttää keksinnön 35 menetelmän mukaisesti kuvataan alla.

14 97303

Kohdesekvenssin koostumus voi vaihdella riippuen siitä käytetäänkö kohdeplasmidia korvaamaan kokonaan tai osittain joko muuttuva tai vakioalue kevyissä ketjuissa tai raskaissa ketjuissa, ja lisäksi vasta-ainettat tuot-5 tavan isäntäsolun eläinlajista. Tarkemmin sanoen kohde-sekvenssien tulisi olla homologisia sekvenssien kanssa, jotka ovat korvattavan tai muunnettavan vakio- tai muunnettavan alueen tai sen osan vieressä.

Esimerkiksi kromosomissa kypsät raskasketjuiset 10 geenit koostuvat 5'-terminuksissaan VDJ-alueista; toisin sanoen muuttuvasta alueesta (V), vaihtelualueesta (D) ja liitosalueesta (J), mitä seuraavat jäljellä olevat J-alueet, jotka eivät ekspressoidu (J-alueiden määrä vaihtelee lajin mukaan), sekä intronsekvensseistä. Geenin 15 keskimmäinen ja 3'-alue koostuu vakioalue-eksoneista (joiden ympärillä ja seassa on introni- ja translatoitu-mattomia sekvenssejä), jotka voivat olla yhtä erilaisista luokista (esim. mu, delta, gamma, epsilon, alfa), joista kukin liittyy omaan viereiseen vaihtoalueeseensa. Niin-20 pä kohdesekvenssi, jota käytetään kohdistamaan homologista rekombinaatiota vasta-ainetta tuottavan isäntäsolun raskasketjuisessa geenissä voi koostua alueesta, joka on homologinen minkä tahansa vasta-ainegeenin osan kanssa, riippuen halutusta muutoksesta. Esimerkiksi kohde-25 sekvenssi raskaan ketjun vakioalueiden korvauksen oh-• jäämiseksi voi sisältää sekvenssejä, jotka ovat homo logisia millä tahansa alueella olevien sekvenssien kanssa aina vaihtoalueeseen asti, joka päättyy V:hen, D:hen tai J:hin ja sijoittuisi sen mukaisesti kohdevektoria 30 rakennettaessa; esim. paikkaan 5' korvausgeenin koodi- alueelle. Todellinen käytettävä kohdesekvenssi voi vaihdella kohdeisäntäsolun eläinlajin ja kohdeisäntäsolun ekspressoiman vasta-aineluokan mukaan.

Poiketen raskasketjuisten geenien rakenteesta 35 kromosomissa kypsät kevytketjuiset geenit koostuvat VJ-alueesta 5'-terminuksissaan, intronisekvensseistä ja 15 97303 yhdestä vakioalue-eksonista. Niinpä kohdesekvenssi homologisen rekombinaation kohdistamiseksi vasta-ainetta tuottavan isäntäsolun kevytketjuisessa geenissä voi sisältää alueen, joka on homologinen minkä tahansa geenin 5 osan kanssa, riippuen halutusta muutoksesta. Esimerkiksi kohdesekvenssi kevytketjuisten vakioalueiden korvauksen ohjaamiseksi voi olla homologinen sekvenssien kanssa, jotka kuuluvat kyseisiin V- ja J-alueisiin tai niiden osiin intronisekvenssien ollessa ennen koodialuetta kevyen 10 ketjun vakioalueella. Sellaiset kohdesekvenssit asettuisivat sopivasti kohdeplasmidissa; esim. paikkaan 5' kor-vausgeenin koodisekvenssiin. Todellinen käytettävä kohdesekvenssi voi jälleen vaihdella kohdeisäntäsolun eläinlajin ja kohdeisäntäsolun ekspressoiman vasta-aineluokan 15 mukaan.

Yllä kuvattujen sekvenssien lisäksi kohdesekvenssi voi sisältää sekvenssejä, jotka ovat homologisia alueiden kanssa, jotka ovat vakion raskaan tai kevyen ketjun koo-dialueen 5'- tai 3'-terminusten vieressä, ja siksi ase-20 tettaisiin sen mukaisesti rakennettaessa kohdevektoria? toisin sanoen korvausgeenin koodialueen kohtaan 5' tai 3'. Samaan tapaan kohdesekvenssit raskas- tai kevytketjuisten muuttuvien alueiden korvaamiseksi voivat sisältää sekvenssejä, jotka ovat homologisia sopiville alueille tai 25 niiden osille, jotka ympäröivät muuttuvaa aluetta. Joka ·” tapauksessa kohdesekvenssit voivat myöskin sisältää koo- dialuesekvenssejä, jotka ympäröivät sellaista aluetta eksonissa, jossa vain osa muuttuvasta tai vakioalueesta on korvattava niin, että ekspressoituva proteiini muun-30 tuu halutulla tavalla.

Kuten aiemmin kuvattiin, vasta-aineen vakioalueiden muuttamiseksi käytetyt korvausgeenit voivat sisältää koodisekvenssin eri luokan ja/tai eläin- tai ihmislajin immunoglobuliinin vakio osalle tai sen osalle. Niinpä 35 raskaiden ketjujen tapauksessa korvausgeeni voi sisältää kokonaan tai osittain geenin, johon on koodattu ihmisen 16 97303

IgM, IgD, IgG, IgE tai IgA tai niiden minkä tahansa alaluokan vakio-osa. Vaihtoehtoisesti korvausgeeniin voi olla koodattuna tuote, joka voi tuottaa jonkin erilaisen efektorifunktion ekspressoituvalle kimeeriselle molekyy-5 lille. Esimerkiksi entsyymi, toksiini, kasvutekijä, biologisesti aktiivinen peptidi, kytkijä, jne. Korvausgeeni voi sisältää myös minkä tahansa yhdistelmän edellä mainittuja sekvenssejä, esimerkiksi kokonaan tai osittain vasta-aineen vakioalueen kytkettynä uuteen proteiini-10 sekvenssiin.

Korvausgeenin valinta riippuu osittain ekspressoi-dun kimeerisen vasta-ainemolekyylin aiotusta käyttötarkoituksesta. Esimerkiksi, jos tarkoituksena on terapeuttinen käyttö ihmisiin, korvausgeeni voisi koodata ihmisen 15 vakioalueen, edullisesti luokasta, jolla on haluttu efektorifunktio aiotulle terapeuttiselle käytölle. Jos halutaan saada aikaan parannus tai muutos vasta-aineen olemassaolevaan efektorifunktioon, osa vakioalueesta voidaan korvata sekvenssillä, joka aiheuttaa sellaisen pa-20 rannetun tai muunnetun efektorifunktion syntyvälle kimeeriselle vasta-ainemolekyylille. Jos halutaan entsyymin, toksiinin, lääkkeen, hormonin tai kasvutekijän kohdistettu toimitus in vivo, tulisi käyttää korvausgeeniä, joka koodaa tuon entsyymin, toksiinin, lääkkeen, hormonin 25 tai kasvutekijän tai sopivan kytkimen sellaiseen konju-• goimista varten. Jos kimeerisiä vasta-aineita aiotaan käyttää diagnostisissa määrityksissä, esimerkiksi silloin, kun käytetään leimattuja vasta-aineita, tulisi käyttää korvausgeeniä joka koodaa entsyymin tai sen 30 substraatin. Sellaisia entsyymi/substraattisysteemejä ovat muun muassa ne, jotka tuottavat reaktioistaan värillisen tuotteen; esimerkiksi betagalaktosidaasi, alkali-fosfataasi, piparjuuriperoksidaasi ja vastaavat. Syntyviä kimeerisiä vasta-aineita voidaan käyttää leimattui-35 na vasta-aineina aiotuissa menetelmissä lisämuutoksin, esim. lisäämällä kemiallisesti entsyymejä, lääkkeitä, toksiineja, hormoneja, kasvutekijöitä jne. tai ilman niitä.

17 97303

Korvausgeeni, jota käytetään muunnettaessa vasta-aineen muuttuvia alueita voi sisältää kokonaan tai osittain koodisekvenssin sellaisen vasta-ainemolekyylin muuttuvalle osalle, joka määrittää halutun antigeenin. Nämä 5 voivat koodata antigeenin sitoutumisalueita, jotka määrittävät läheisiä tai täysin eri antigeenejä. Jos halutaan parannusta tai muutosta vasta-aineen sitoutumiseen tai spesifisyyteen, osa muuttuvasta alueesta voidaan korvata sekvenssillä, joka tuottaa sellaisen parantuneen tai 10 muuttuneen sitoutumisen tai spesifisyyden syntyvälle ki-meeriselle vasta-ainemolekyylille.

Kohdesekvenssin ja korvausgeenin lisäksi keksinnön kohdevektori voi koodata valittavan merkin, joka auttaa menestyksellisesti transformoitujen vasta-ainetta tuot-15 tavien solujen seulonnassa ja valinnassa. Sellaisia merkkejä ovat muun muassa lääkeresistenssigeenit, kuten gpt, neo, his, jne. ja vastaavat.

Muita osia, jotka voivat lisätä rekombinaatio-tapahtumien määrää voidaan myös sisällyttää kohdevekto-20 riin. Esimerkiksi replikaation alku (ori), joka on lämpö-herkkä (esimerkiksi polyooma tsA ori -systeemi) voidaan sisällyttää rakenteeseen niin, että transfektanttien kasvu sallivassa lämpötilassa johtaa vektorin replikoitu-miseen siten, että kohdesekvenssien ja korvausgeenien 25 kopiomäärä lisääntyy ja seurauksena oleva rekombinaatioi-den määrä voi kasvaa. Myös muita ori -systeemejä voitaisiin käyttää lisäämään kopiomäärää (esim. EBV ori plus-tekijöitä, BPV ori plus -tekijöitä tai SV40 ori ja T-antigeenia).

30 Keksinnön menetelmän mukaisesti solulinja, joka tuottaa haluttua vasta-ainetta (eli sellaista, jolla on haluttu antigeenispesifisyvs tai haluttu vakioalue) trans-fektoidaan sopivalla kohdevektorilla sellaisten transfektanttien tuottamiseksi, joille tapahtuu kohdeohjattu 35 homologinen rekombinaatio. Sekä kevytketjuisia että ras-kasketjuisia kohdevektoreita voidaan käyttää transfektoi-maan sopiva vasta-ainetta tuottava solulinja; monissa 18 97303 tapauksissa kuitenkin transfektio raskasketjuisella kohde-vektorilla voi riittää aikaansaamaan kimeerisen vasta-ainemolekyylin ekspressio.

Transfektio voidaan saada aikaan millä tahansa 5 useista alaa taitavien tuntemista menetelmistä, mukaanlukien muun muassa kalsiumfosfaattisaostus, elektroporaa-tio, mikroinjektio, liposomifuusio, RBC-ghost -fuusio, protoplastifuusio, jne. Kohdevektori voidaan linearisoida leikkaamalla restriktioentsyymillä kohdesekvenssin sisäl-10 lä ennen transfektiota homologisen rekombinaation todennäköisyyden kasvattamiseksi transfektoidussa solussa.

Lopullinen testi menestyksekkäälle transformaatiolle, homologiselle rekombinaatiolle ja kohdistetulle geenimuutokselle on kimeeristen vasta-aineiden tuotanto vas-15 ta-ainetta tuottavan solulinjan toimesta. Kimeerisiä vasta-aineita tuottavien transfektanttien havaitseminen voidaan suorittaa monin tavoin riippuen korvausgeenituotteen luonteesta.

Jos kohdevektori sisältää havaittavan merkin, 20 transfektoidut solut tulisi ensin seuloa merkkiä sisältävien valikoimiseksi. Esimerkiksi käytettäessä lääkeresis-tenssigeeniä voidaan ne transfektantit, jotka kasvavat valinta-alustassa, joka sisältää muuten kuolettavaa myrkkyä, havaita ensimmäisessä seulonnassa. Sitten tarvittai-25 siin toinen seulonta niiden transfektanttien tunnistami-: seksi, jotka ekspressoivat kimeeristä vasta-ainetta.

Toisen seulonnan protokolla riippuu korvausgeenin luonteesta. Esimerkiksi sellaisen korvausgeenin ekspressio, joka koodaa eri vasta-aineluokan tai lajin vakio-30 alueen voidaan havaita immuunimäärityksellä käyttäen vasta-aineita, jotka ovat spesifejä sille immunoglobuliini-luokalle ja/tai lajille; vaihtoehtoisesti voitaisiin suorittaa biomääritys ja testata tiettyä korvausgeenin aiheuttamaa efektorifunktiota. Sellaisen korvausgeenin 35 ekspressio, joka koodaa biologisesti aktiivisen molekyylin kuten entsyymin, toksiinin, kasvutekijän tai muun 19 97303 peptidin voitaisiin määrittää kyseisestä biologisesta aktiviteetista; transfektoitavat solutuotteet voidaan testata esimerkiksi käyttäen sopivaa enstyymisubstraat-tia tai toksiinin, kasvutekijän, hormonin jne. kohdetta; 5 vaihtoehtoisesti nämä korvausgeenituotteet voitaisiin myös määrittää immunologisesti käyttäen vasta-aineita, jotka ovat spesifejä korvausgeenituotteelle.

Transfektantit, jotka ekspressoivat korvausgeeniä tulisi myös testata sopivan antigeenitunnistuksen suh-10 teen. Tämä voidaan saada aikaan sopivalla immuunimääri-tyksellä, mukaanlukien kilpailuimmuunimääritys käyttäen alkuperäisiä ja kimeerisiä vasta-aineita. Näiden seulonta testien ei tarvitse olla peräkkäisiä ja ne voitaisiin itse asiassa suorittaa yhtä aikaa käyttäen "kerrosimmuu-15 nimääritystä”, jossa käytetään vangitsijavasta-ainetta, joka määrittelee korvausgeenituotteen (eli joko vakio-tai muuttuvan alueen) immobilisoimaan kimeerisen vasta-aineen ja muuttumattoman osan (eli joko muuttumattoman muuttuvan alueen tai muuttumattoman vakioalueen) läsnäolo 20 tai puute havaitaan (eli käyttäen leimattua antigeeniä lai leimattua vasta-ainetta). Esimerkiksi voitaisiin käyttää antigeeniä vangitsemaan kimeeriset vasta-aineet ja vakioalueen korvausgeenituotteet voitaisiin havaita käyttäen leimattuja vasta-aineita, jotka määrittävät 25 korvausgeenituotteet, tai määrittämällä vangitut kimee- « riset vasta-aineet korvausgeenituotteen (esim. entsy-maattisen, toksisen, hormoni-, kasvutekijä-, jne.) biologisen aktiviteetin suhteen. Vaihtoehtoisesti kimeerinen vasta-aine voidaan immobilisoida vakioalueelle (esim.

30 käyttäen sille alueelle spesifiä vasta-ainetta tai stafylokokki A proteiinia jne.) ja muuttuvan alueen geenin tuote voitaisiin havaita käyttäen leimattua antigeeniä tai anti-idiotyyppivasta-ainetta.

20 97303

Esimerkki

Hiiren inununoqlobuliinin raskaan ketjun vakioalueen korvaaminen ihmisen gamma 1 immunoqlobuliinilla

Seuraavat esimerkit kuvaavat sellaisen kohdeplas-5 midin valmistusta, joka sisältää hiiren kohdesekvenssin (joka koodaa raskasketjuisen geenin neljännen liitos-alueen ja vahvistajan) ligatoituna korvausgeeniin, joka joodaa ihmisen gamma 1 -immunoglobuliinin (huIgGl) vakio-alueen. Tätä kohdeplasmidia käytettiin yhdessä fagin 10 kanssa, joka sisälsi koko kypsän geenin, joka koodaa hiiren raskaan ketjun (koko muuttuva ja vakioalue) ko-transfektoimaan hiiren myeloomasoluja, jotka ovat ras-kasketjuisia mutantteja, jotka alun perin ekspressoivat vain kevyitä ketjuja. Transfektoidut solut seulottiin 15 ja ne kloonit, jotka ekspressoivat ihmisen IgGl raskaita ketjuja identifioitiin. Nämä kokeet osoittavat menestyksekkään homologisen rekombinaatiotapahtuman, integroitumisen isäntäsolun kromosomeihin ja ihmisne gamma 1 -geenin ekspression hiiren solujärjestelmässä.

20 Jollei toisin mainita, alla kuvattua aineistoa ja menetelmiä käytettiin seuraavissa esimerkeissä.

Transfektio

Transfektiot suoritettiin pesemällä ja suspensoi- 7

maila uudelleen noin 10 solua PBS:ssä (fosfaattipusku-25 roitu suolaliuos) 4°C:ssa lisäten 2 mM MgCl2 ja 2 mM

CaCl2 ja siirtäen solut steriiliin muovikyvettiin, joka oli vuorattu alumiinipaperilla (BioRad, CA). Linearisoi-tu DNA lisättiin ja sekoitettiin lopullisessa konsentraa-tiossa 10-100 pg/ml, sitten siihen johdettiin sähköä 30 sopivasta virtalähteestä (esim. Gene Pulsar, BioRad, CA). Kyvettejä "näpäytettiin" kevyesti hyvän sekoittumisen : varmistamiseksi. Kahden minuutin jälkeen huoneenlämmössä solut siirrettiin sitten 9 mlsaan RPMI-alustaa (GIBCO), jossa oli 10 % PBS 37°C:ssa. 48 tunnin inkubaation jäl-35 keen elävät solut kerättiin sentrifugoimalla, laskettiin 3 ja pantiin maljoille tiheydelle 10 solua/kalvo 96- 4 21 97303 kalvoisilla maljoilla tai 10 solua/kalvo 24-kalvoisilla maljoilla RPMI-alustassa, jossa oli 10 % FBS, penisilliiniä (60 mg/ml)/streptomysiiniä (100 mg/1), natrium-pyruvaattia (1 mM), L-glutamiinia (292 mg/1) ja 5 0,1-2 pg/ml mykofenolihappoa tai 1-2 mg/ml G418. Sama alusta joko täydennettiin tai vaihdettiin joka toinen tai kolmas päivä. 2-3 viikon päästä kaivot arvosteltiin kasvun suhteen. Viljelmäsupernatantit analysoitiin sitten ELISAtlla ihmisen gamma l:n läsnäolon suhteen ja 10 positiiviset kaivot kloonattiin ja seulottiin uudelleen.

Transfektanttien seulonta onnistuneiden rekombi-nanttien suhteen ELISA-määritykset suoritettiin päällystämällä immulon 2 levyjä (Dynatec Labs, Chantilly, VA) 100 pl:lla 15 joko vuohen anti-ihmis IgG (Antibodies Inc., Davis, CA) 1:1000 laimennoksena tai vuohen anti-hiiri IgA (Cappel) 1:5000 laimennoksena päällystyspuskurissa (0,1 M NaHCO^ pH 9,6) 4°C:ssa yön yli. Levyt täytettiin näytelaimennok-sella (Genetic System) blokkaamiseksi yhden tunnin ajan 20 huoneenlämmössä, minkä jälkeen ne ravistettiin pois, suljettiin ja varastoitiin 4°C:ssa ei yli 3 viikoksi. Levyt valmistettiin määritystä varten pesemällä 3 kertaa pesu-puskurilla (0,15 M NaCl, 0,05 % v/v Tween 20) ja sitten lisättiin 100 μΐ standardeja (laimennettuina sopivaan 25 alustaan) tai viljelmäsupernatantteja ja inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti. Levyt pestiin 3 kertaa pesupuskurilla ja sitoutunut vasta-aine havaittiin 100 pl:lla joko pi-parjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugoitua vuohen anti-ihmis IgG (American Qualex) laimennoksena 1:6000, HRP 30 vuohen anti-hiiri IgA (Cappel) laimennoksena 1:5000, tai HRP vuohen anti-hiiri Lambda (Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL) laimennoksena 1:3000, 1 tunti 37°C:ssa. Sitten levyt pestiin 3 kertaa pesupuskurilla ja inkuboitiin huoneenlämmössä 15 minuuttia TMB 35 Chromogenin 1:1000 laimennoksessa puskuroidussa substraatissa (Genetic Systems), pysäytettiin 100 |ul:lla/kaivo 22 97303 3M ja luettiin heti 450/630 nm:ssä mikrolevyluki jalla (Genetic Systems). Samoin Kappaa tuottavat solu-linjat voidaan seuloa käyttäen HRP vuohen anti-hiiri Kappa reagenssia (Southern Biotech. Ass. Inc.). Ihmisen 5 IgGille ja/tai hiiren IgA:lle positiiviset solulinjat subkloonattiin rajoittamalla laimennusta tai pehmeässä agaroosissa ekspressoivien kloonien eristämiseksi. Kloonattavaksi pehmeässä agaroosissa suunnilleen 1000 solua positiivisesta kaivosta suspensoitiin uudelleen 0,4 % 10 agaroosiin ja pantiin kerroksena agarkerroksen päälle, jossa oli hiiren peritonaalieksudaattisyöttösoluja. Kolmas kerros, joka sisälsi ihmisen IgGl:lle spesifiä anti-seerumia lisättiin näiden päälle 1-2 vuorokautta myöhemmin. Positiiviset kloonit tunnistettiin immuunisaostuman 15 läsnäolosta.

Southern ja Western hiotit

Korkeamolekyylipainoista DNA:ta eristettiin soluista pääosin siten kuin on kuvannut Blin ja Stafford (Blin. N. ja Stafford, D.W., 1976, Nucleic Acid Res.

20 3:2303) ja myöhemmin Maniatis, Fritsch ja Sambrook (Maniatis et. ai., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY s. 280) sillä erotuksella, että solut pestiin ensin standardifosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa (eikä Tris:issä) ja RNaasikäsit-25 tely suoritettiin samanaikaisesti proteinaasi K -käsittelyn kanssa 55°C:ssa.

Southern blotit ja hybridisaatio suoritettiin kuten on ensin kuvannut Southern (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503) ja myöhemmin yksityiskohtaisemmin Maniatis, 30 Fritsch ja Sambrook (Maniatis et. ai., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY ss. 383-389). Hybridisaatiossa käytetyt koettimet olivat 1,0 kb Hind III-PstI -fragmentti, joka sisältää ihmisen IgGl -geenin ensimmäisen vakioaluekohdan, tai 0,7 kb 35 Hind Ill-Hind III -fragmentti, joka koodaa hiiren ja JH3 9een;‘-se9men't;*-'t· Koettimien leimaus suoritettiin 23 97303 valmistajan protokollan mukaisesti käyttäen Nick trans-laatiosarjaa (Bethesda Research Laboratories). Restrik-tioentsyymit hankittiin Boehringer Mannheim Biochemicals: ilta.

5 Western blot -analyysit suoritettiin kuten on ku vannut (Towbin et. ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei.

(USA) 76:4350) ja kehitysreagenssit ovat samat kuin ne, joita käytettiin havaitsemiseen ELISA-määrityksessä.

Ihmisen immunoqlobuliinin vakioalueen koodaavien 10 kohdeplasmidien konstruktio

Rakennettiin kohdeplasmidi, joka koostuu bakteeri-plasmidivektorista pRSV-140-neo, johon kloonattiin kor-vausgeeninä 8,0 kb Hind III-Bam HI -fragmentti, joka sisältää ihmisen gamma 1 vakioaluegeenin (kuvio 2). Kohde-15 geeni, 2,2 kb Hind III -fragmentti, joka on johdettu hiiren immunoglobuliinin raskasketjuisesta (IgH) kohdasta ja joka sisältää neljännen liitosalueen (J4), IgH vahvistimen (e) ja intronisekvenssit 5' vaihtoalueelle, lisättiin Hind III -kohtaan, joka sijaitsee 5' ihmisen 20 gammageeniin (kuvio 2). Tämä rakenne linearisoitiin uniikissa Xba I kohdassa hiiren kohdesekvenssissä ja transfektoitiin alla kuvattuun hiiren myeloomasolulinjaan edellä kuvatulla elektroporaatiolla.

Transfektio ja homologinen rekombinaatio 25 Alla kuvatut kokeet ja tulokset osoittavat menes tyksellistä homologista rekombinaatiota kohdeplasmidin ja hiiren myeloomaisäntäsolun kotransfektointiin käytettyyn fagiin sisältyvän hiiren raskasketjuisen geenin välillä. Homologinen rekombinaatio ja integroituminen hiiren 30 myeloomaisäntäsolukromosomiin aiheutti ihmisen immunoglobuliinin raskaan ketjun (IgGl) ekspressoitumiseen.

: Hiiren myeloomasolujen kotransfektointi

Kohdaplasmidi, joka sisälsi (a) hiiren kohdesek-venssin, joka koodaa neljännen liitosalueen (J4), IgH 35 vahvistimen ja intronisekvenssit 5' vaihtoalueelle, ja (b) korvausgeenin, joka koodaa ihmisen IgGl vakioalueen 24 97303 linearisoitiin kohdesekvenssin alueella ja kotransfek-toitiin samassa moolisuhteessa fagi-DNA-kloonin kanssa, joka sisälsi funktionaalisen J558 hiiren raskasketjuisen geenin, raskasketjuiseen hiiren mutanttimyeloomasolulin-5 jaan, joka ekspressoi vain kevyitä ketjuja. G418:lle (valittavalle merkille, jonka koodasi kohdeplasmidi-konstruktio) resistentit solulinjat seulottiin ihmisen IgGl-proteiinin suhteen. Koska ihmisen gamma 1 vakio-alueesta, joka sisältyi yllä konstruoituihin kohdeplas-10 mideihin puuttuu immunoglobuliinin edistäjäsekvenssi, ihmisen IgG proteiinin ekspression transfektoidun hiiren solulinjan toimesta pitäisi olla tulos homologisesta re-kombinaatiotapauksesta transfektoitujen DNA-molekyylien välillä ja integraatiosta isäntäsolun kromosomissa.

15 Kimeerisiä immunoglobuliineja erittävien solujen tunnistus

Transfektantit, jotka erittivät ihmisen IgG ja/tai hiiren IgA proteiinia subkloonattiin. Homologisten rekom-binaatiotapausten varmistuksen tarjosi DNA-blot-siirto-20 analyysi, jossa tunnistettiin juuri uudelleen järjestynyt restriktiofragmentti; tämä fragmentti oli odotetun kokoinen (10,5 Kb Bam HI -fragmentti) ja sisälsi sekä ihmisen gamma 1, että hiiren jjj2-JH3 ”se^vensse3^· Lisävarmistus saatiin supernatanttiproteiinien Western blot -analyysil-25 lä, joka näytti 50 kilodaltonin (50 kd) proteiiniketjun, jossa oli ihmisen IgG serologisia determinantteja trans-fektoomaviljelysupernatanteissa. Anti-ihmis IgG -reagens-si ei reagoinut hiiren IgA:n kanssa, joka erottui myöskin perustuen hitaampaan elektroforeettiseen liikkuvuu-30 teen.

Myös ELISA-tulokset paljastivat hiiren IgA:n läsnäolon monissa transfektoomasupernatanteissa. Tämä on tulosta siitä, että funktionaalinen J558 raskas ketjui-nen geeni integroituu häiriintymättä (eli ilman homolo-35 gista rekombinaatiotapahtumaa). Vertaamalla ihmisen IgG:n ja IgA:n ekspression ja tuotannon määrää on homologisten 25 97303 rekombinaatiotapahtumien frekvenssin verrattuna ei-homo-logisiin reaktiotapahtumiin arvioitu olevan 30-80 % kokeesta riippuen.

Yllä esitetyt tulokset ovat todistaneet: (a) että 5 kohdeplasmidi toimii kuten on suunniteltu; ja (b) että myeloomasolut ovat hyvin tehokkaita kyvyssään välittää homologista rekombinaatiota.

Sekvenssejä, jotka ovat homologisia alueille ylävirtaan ja/tai alavirtaan muuttuvista geenisegmenteistä 10 voitaisiin käyttää yhdessä muuttuvan alueen geenisegment-tien tai niiden osien kanssa muuttamaan antigeenin affiniteettia ja/tai spesifisyyttä. Lisäksi tässä kuvattua J558-systeemiä voidaan käyttää seulontamenetelmänä rekombinaatiota lisäävien proteiinien tunnistuksessa.

15 Esimerkki: L20 ihmisen tuumoriin assosioituneelle antigeenille spesifisen kimeerisen immunoglobuliinin raskaan ketjun tuotanto

Alla kuvatut esimerkit osoittavat, että hiiren 20 hybridoomasolut voivat tehokkaasti välittää homologista rekombinaatiota ja että tätä kykyä voidaan käyttää endo-geenisen immunoglobuliinin raskasketjuisen kohdan suurien rekonstruktioiden ohjaamiseen. Konstruoitiin plasmidi, joka sisälsi ihmisen IgGl vakioalueen eksonit rajoittu-25 neina hiiren raskaan ketjun vahvistimeen ja neomysiini-geeniin. Tätä konstruktiota käytettiin ohjaamaan anti-geenispesifisen kimeerisen raskasketjuisen Ig:n tuotantoa kohdistamalla paikkaspesifisesti endogeeniseen ras-kasketjuiseen kohtaan hybridoomasolulinja L20, joka tuot-30 taa monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen ihraisen tuumoriin liittyvälle antigeenille (patenttihake-: mus nro 834 172, jätetty 26.2.1986 ja siihen sisältyvät viitteet). Kohdistustapahtuman frekvenssin on havaittu olevan 1 200:sta tai 0,5 % hybridoomasoluista, jotka 35 integroivat plasmidin.

26 97303

Kohdevektorin konstruoiminen ja hybridooma L20:n transfektio

Konstruoitiin plasmidivektori, joka sisältää ihmisen IgGl (Cgl) vakioalueet rajoittuneina hiiren raskas-5 ketjuvahvistimeen (MHE) ja neomysiiniresistenssigeeniin (NEO) (kuvio 3). Plasmidi linearisoitiin uniikissa Xba I kohdassa sekvenssi-identiteetin 2,2 kb alueella, joka on yhteinen hiiren IgH-lokuksne kanssa ja transfektoi-tiin hybridoomasolulinjaan L20, joka tuottaa hiiren IgGl-10 vasta-ainetta, joka on spesifinen antigeenille, jota ekspressoituu pääasiassa ihmisen karsinoomasoluissa seuraavasti: Kuviossa 3 kuvattu vektori linearisoitiin uniikissa Xba I kohdassa ja 50 pg käytettiin transfektoimaan 8 x 106 L20 hybridoomasolua elektroporaatiolla (kuten 15 aiemmin kuvattiin aineistossa ja menetelmissä). Elävät 4 3 solut pantiin levyille tiheytenä 1 x 10 (tai 1 x 10 frekvenssilaskuja varten) solua/kaivo 96-kaivoisilla levyillä IMDM 10 % FBS-alustalle, joka sisälsi 2,5 mg/ml G418. Levyjä ruokittiin 2-3 päivän välein ja 2 viikon 20 päästä kaikki kaivot seulottiin ihmisen IgGl tuotannon suhteen käyttäen standardi ELISA-menetelmiä. Vuohen anti-ihmis IgG (Cat. nro 4132 Antibodies Inc., Davis CA) laimennoksena 1:10 000 käytettiin vangitsijareagenssina ja vuohen anti-ihmis IgH/HRP (Cat. nro HAP009 American 25 Qualex, La Miranda CA) laimennoksena 1:6000 käytettiin havaitsemiseen. Kaikki positiiviset supernatantit verifioitiin myös seuraavilla ELISA-testeillä.

Koska ihmisen IgGl eksonit eivät ole assosioituneet muuttuvan alueen geenisegmenttiin, ihmisen IgGl ras-30 kaiden ketjujen tuotanto voi tapahtua vain plasmidin rekombinaatiolla funktionaalisen edistimen, initiaatio-. kodonin ja splicing-sekvenssien kanssa. Niinpä solut, jotka selviytyivät valinnasta G418 sisältävässä alustassa (eli kaikki ne, jotka tyydyttävästi integroivat 35 plasmidin) analysoitiin ihmisen IgGl tuotannon suhteen ELISA:lla (taulukko I).

5

Taulukko I

27 97303

Ihmisen IgGl tuotantoon johtavien integraatiotapahtumien frekvenssi

Int. Seulottu- Tapahtu- Kaivoja tapahtu- ja kaivo- mia yh- HU Frekv.

mi a_ja_teensä_IqGlrllä per kaivo 2,2 480 1056 8 0,75 % 10

Transfektiosekvenssi määritettiin maljoittamalla pienempänä tiheytenä ja ihmisen IgGl tuotantoon johtavien integraatiotapahtumien frekvenssin todettiin siksi olevan luokkaa 1 132:sta tai 0,75 %. Myöhemmät kokeet samoilla 15 soluilla ja plasmideilla johtivat ihmisen IgG:n tuotantoon 2:ssa 512:sta integraatiosta tai 0,39 % - nämä viittaavat siihen, että keskimääräinen frekvenssi olisi lähempänä 0,5 % kiintoisasti, jopa kloonauksen jälkeen useimpien solulinjojen havaittiin tuottavan sekä hiiren 20 että ihmisen IgGl, vaikka satunnaisesti klooneja eristettiin, jotka tuottivat yhtä tai toista näistä (taulukko II). Soluja emokaivoista, jotka tuottivat ihmisen IgGl pantiin rajoittavaan laimennokseen ja 12 kloonia kustakin vanhemmasta määritettiin ihmisen IgGl (huIgGl) (ku-25 ten kuvattiin taulukolle I) ja hiiren IgG tuotannon suhteen. Hiiren IgG (mlgG) -määritykset suoritettiin käyttäen vuohen anti-hiiri IgG (Cat nrol070 Southern Bio-gech, Birmingham AL) ja vuohen anti-hiiri Kappa/HRP (Cat nroOBH41-85 Fisher Biotech, Orangeburg NY) van-30 gitsija- ja havaintoreagensseinä. Tulokset esitetään taulukossa II. Annetut numerot ovat klooneista, jotka tuottavat ihmisen, hiiren tai molempien vasta-ainetta.

Taulukko II

28 97303

Ihmisen ja hiiren IgGl tuotanto klooneissa ihmisen IgGl tuottavista L20 transfektanteista

5 Vanhempi huIgGl mlqG huIgGl/mlgG

7C5 0 0 12 7E6 1 0 11 8D6 O 0 12 8F8 2 28 10 8H12 1 0 11 10G3 0 2 10 9F11 0 1 11 9F12 1 0 11 15

Ekspressoidun kimeerisen L20 raskaan ketjun karakterisointi

Western Blot -analyysi

Ihnisen raskaan ketjun osoitettiin olevan serolo-20 gisesti erotettavissa ja odotetulla kokoalueella valikoitujen kloonien supernatanttien Western blot -analyysillä seuraavasti: kasvun tasaista vaihetta lähenevät viljelmät pestiin ja suspensoitiin uudelleen seerumittomaan alustaan. 24 tunnin kuluttua supernatantit kerättiin, 25 dialysoitiin 0,1 M NH^OAc vasten, lyofilisoitiin ja suspensoitiin uudelleen 5 mM Trisiin, pH 6,8. Annoksia näistä näytteistä ja vanhemmaissolulinjasta L20 sekä puhdistetusta vasta-aineesta 2H9 (ihmisen IgGl proteiini) ja puhdistetusta L20 IgGl denaturoitiin keittämällä 30 beta-merkaptoetanolin läsnä ollessa ja elektroforoitiin gradienttiakryyliamidigeelin läpi, joka vaihtui 10:stä 20 %:iin. Geeli siirrettiin nitroselluloosapaperille elektroforeettisesti. Syntyvä suodatin blokattiin 2 % rasvattomalla kuivamaidolla PBS:ssä, värjättiin vuohen 35 anti-ihmis IgG/HRP:llä (nro 10501 CALTAG, San Francisco CA) ja kehitettiin 30 mg:11a 4-kloori-l-naftolilla (Sigma, St. Louis MO) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa.

29 97303

Virtaussytometrinen analyysi

Sekä ihmisen että hiiren IgGl:n osoitettiin myös olevan antigeenispesifisiä virtaussytometrialla (taulukko III) seuraavasti: Western bloteihin käytetyt näytteet 5 analysoitiin ELISA:11a ihmisen ja hiiren IgGl-konsentraa-tion määrittämiseksi. Tehtiin laimennoksia konsentraatioi-den säätämiseksi (|ug/ml) virtaussytometriseen analyysiin 5 sopiviksi. Viisi x 10 solua ihmisen tuumorilinjoista 2981 tai 3347 (Hellström et. ai., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei.

10 USA 83:7059-7063) inkuboitiin mainittujen L20-vasta-ai-neiden läsnä ollessa (tai alustan) 30 minuuttia 4°C:ssa, pestiin 2 x ja värjättiin 1:50 laimennoksella (alustassa), joko vuohen anti-ihmis IgG/FITC (fluoreskeiini-isotiosya-naatti) (CALTAG, San Francisco CA) tai vuohen anti-hiiri 15 IgG/FITC (TAGO, Burlingame CA - raskas- ja kevytketju- spesifillä) 30 minuuttia 4°C:ssa. Nämä valmisteet pestiin sitten kahdesti, suspensoitiin uudelleen ja analysoitiin virtaussytometrisesti suhteellisen fluoresenssin suhteen. Tulokset esitetään taulukossa III. Annetut arvot ovat kun-20 kin preparaatin lineaarifluoresenssiekvivalenssi (LFE).

Taulukko ill 30 97303

Hiiren ja raskasketjuisten kimeeristen L20 vasta-aineiden antigeenispesifisyys 5 _LFE_ _Ab conc_ 2981 Kohde

Klooni huIqG ml qG a-hu a-m 7E6-10 1T0 0 35 6 8H12-8 1,0 0 38 7 10 8F8-8 1,0 0,5 39 11 9H12-1 1,0 0,1 42 7 8F8-10 0 0,4 2 10 10G3-5 0 1,0 2 31 mL20 0 1,0 2 18 15 alusta 0 0 22 3347 Kohde a—hli a—ro 7E6-10 0,4 0 73 20 mL2° 0 0,4 2 3 alusta 0 0 22

Niinpä vanhemmais L20 solulinja raita luultavimmin 25 säilyttää kaksi kopiota produktiivisesta raskasketjuises-ta alleelista, joista vain yhdelle tapahtuu spesifinen rekombinaatio tietyssä solussa. Tuotantomäärien vain kimeeristä vasta-ainetta ekspressoivilla soluilla havaittiin olevan luokkaa 5-10 pg/ml 10 ml viljelmäsuperna-30 tanteissa kasvun tasaisessa vaiheessa.

Southern blot -analyysi

Southern blot -analyysi käyttäen koetinta, joka on spesifinen ihraisen Cylslle osoitti yhteisiä integraa-tiospesifejä fragmentteja kaikkien ihmisen IgGl tuotta-35 vien solulinjojen välillä kolmella eri entsyymillä. Bam HI kohta kartoitettiin 1,4 kb ylävirtaan kohdesekvenssistä 31 97303 L20 vanhemmaislinjassa, siksi rekombinaatiovektorin lisäämisen kohdepaikkaan odotetaan tuottavan 5,5 kb Bam HI -fragmentti, joka hybridisoituu huC^l koettimeen. Sellainen fragmentti havaittiin kaikissa kolonneissa, 5 jotka tuottavat ihmisen IgGl.

ADCC -analyysi

Hiiren L20 IgGl vasta-ainetta verrattiin proteiiniin, jossa on kimeerinen raskas ketju aktiivisuuden suhteen ADCC-määrityksessä (Hellström et. ai., 1985, 10 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1499-1502). Kuten voidaan nähdä tuloksista taulukossa IV, raskasketjuisten vakio-alueiden vaihtaminen ihmisen IgGl:n vastaaviin tuottaa uuden efektorifunktion tähän spesifiteettiin.

Taulukko IV 15 2981 kohdesolun ADCC välitettynä hiiren MAb L20:llä ja kimeerisellä raskasketjuisella L20

Konsentraatio 2981 kohde-

Immunoqlobuliini_(yq/ml)_solun ADCC

20 L20 8F8-8 4 58 % L20 7E6-10 8 53 % MAb L20 10 31 %

Ei mitään* 0 31 % 25 * Vain efektorisoluja (lymfosyyttejä) «

Kimeerinen L20 raskas ketju tuotettuna eri kohde-vektoria käyttäen

Lisäesimerkeissä olemme käyttäneet toista plasmi-30 dia, joka on kuvattu kuviossa 4A viemään ihmisen Cfl eksonit hiiren hybridoomasoluihin L20, mistä seuraa ihmisen IgGl kimeeristen raskasketjuisten proteiinien tuotantoon. Plasmidi 4A transfektoitiin hybridoomasolulin-jaan L20 saaden 4 kalvoa tuottamaan huIgG noin 700 35 integraatiotapauksen ELISA-määrityksessä.

32 97303

Kimeeristen G28.1 raskaiden ketjujen konstruktio Tässä esimerkissä olemme käyttäneet kuvion 3 esittämää plasmidia muuntamaan hiiren hybridoomasolulinja G28.1 (Ledbetter et. ai., Leukocyte typing III, A. J.

5 McMichael, toim., Oxford Univ. Press ss. 339-340 (1987)) antigeenispesifisen ihmisen IgGl raskaan ketjun tuotantoon samalla menetelmällä. Tehty yksi koe tuotti 4 huIgGl tuottajaa 864 integraatiotapauksesta. Nämä solu-linjat identifioitiin ELISA:11a, verifioitiin ja testat-10 tiin sitten kyvyn suhteen sitoa tonsili B soluja seuraavasti: Ihmisen tonsili B soluja inkuboitiin supernatan-tilla esitetyistä solulinjoista (tai alustalla), pestiin ja vastavärjättiin joko vuohen anti-ihmis IgG:llä (orhu) tai vuohen anti-hiiri IgG:llä (oCm) kuten aiemmin on ku-15 vattu ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset esitetään taulukossa V. Supernatantit mitattiin ELISA:11a hiiren ja ihmisen IgG:n suhteen ja arvot annettiin ng/ml. Fluoresenssitiedot annetaan lineaarisina fluore-senssiekvivalentteina.

20

Taulukko V

Raskasketjuisten kimeeristen G28.1 supernatanttien antigeenispesifisyys 25

LFE

Solulinja huIqG mlqG

11F10 0 87 9 iFll 97 89 93 4F5 86 91 38 30 3D2 90 86 77 3011 56 85 16

Alusta 0 o 9 g—a 35 G28.1 0 83 53

Alusta 0 0 3 ‘i · mt anu m tm I i 33 97303

Tulokset osoittavat jälleen antigeenispesifisyy-den säilymisen vasta-ainemolekyylissä, joka sisältää ihmisen IgGl kimeerisen raskaan ketjun.

Kimeeristen L6 raskaiden ketjujen konstruktio 5 Kuviossa 4B kuvattu rekombinanttikohdeplasmidi transfektoitiin hiiren hybridoomasolulinjaan L6, mistä seurasi yksi solulinja, joka tuotti klooneja, jotka sta-biilisti tuottivat kimeeristä raskasta ketjua (hiiren raskaan ketjun puuttuessa). Vasta-aineen osoitettiin si-10 toutuvan ihmisen tuumorisoluihin ja välittää tuhoutumista ADCC:n välitykslelä ihmisen efektorisoluilla tehokkaammin kuin hiiren L6 (taulukko VI), mikä on verrattavissa raskas- ja kevytketjuiseen kimeeriseen L6:teen tuotettuna tavanomaisilla rekombinanttitekniikoilla (patentti-15 hakemus nro 684 759, jätetty 21.12.1984 ja patenttihakemus nro 776 321, jätetty 18.10.1985 ja niihin sisältyvät viitteet).

Taulukko VI

20

Konsentraatio 3347 kohde-

Immunoglobuliini_(pq/ml)_solun ADCC

L6 7B7.16 0,01 83 % L6 7B7.7 0,01 82,5 % 25 MAb L6 0,01 58 %

Ei mitään* 0,01 53 % * Vain efektorisoluja (lymfosyyttejä) 30 Southern blotit varmistivat 10 kb Ava I -fragmen tin ja 8 kb Bgl II -fragmentin läsnäolon, jotka molemmat hybridoituvat huCgl koettimeen. Nämä fragmentit ovat konsistentteja vektoriplasmidin lisäämisessä kohdepaik-kaan perustuen aiempaan kloonatun genomisen L6 raskas-35 ketjuisen muuttuvan alueen geenisegmentin kartoitukseen.

34 97303 Tätä keksintöä ei ole tarkoitus rajata esimerkkien kuvaamiin toteutustapoihin, jotka on tarkoitettu ainoastaan kuvauksiksi keksinnön eri puolista ja mitkä tahansa menetelmät, jotka ovat funktionaalisesti vastaa-5 via kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Todellakin, erilaiset keksinnön muunnelmat tässä kuvattujen lisäksi ovat selviä alaa taitaville edellisestä kuvauksesta. Sellaisten muunnosten tarkoitetaan kuuluvan liitteenä olevien patenttivaatimusten puitteisiin.

Claims (11)

97303

1. Menetelmä muunnettua vasta-ainemolekyyliä eks-pressoivan solulinjan tuottamiseksi, tunnettu 5 siitä, että a) transfektoidaan vasta-ainetta tuottava imusolu-linja kohdevektorilla, joka sisältää (i) korvausgeenin imusolulinjan immunoglobuliini-geenien genomisekvenssin osan muuntamiseksi ja 10 (ii) kohdesekvenssin, joka on homologinen toisel le, muunnettavan immunoglobuliinisekvenssin vieressä olevalle DNA-sekvenssille, siten, että korvausgeeni muuntaa immunoglobuliinisekvenssin kohdespesifisellä, homologisella rekombinaatiolla ge- 15 nomin kromosomaalisen DNA:n kanssa in vivo; ja b) valitaan transfektantti, joka tuottaa muunnettua vasta-ainemolekyyliä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muunnettava immunoglobulii- 20 nisekvenssi sisältää vakioaluegeenin tai sen osan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että korvausgeeni koodaa toisen immunoglobuliinin vakioaluetta tai sen osaa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, . 25 tunnettu siitä, että muunnettava immunoglobulii- nisekvenssi sisältää muuttuvan alueen geenin tai sen osan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muunnettava immunoglobulii- 30 nisekvenssi sisältää raskaan ketjun geenin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesekvenssi on homologinen muunnettavan raskaan ketjun geenin viereisille J-alueelle tai introneille.

7. Menetelmä muunnetun vasta-ainemolekyylln val mistamiseksi, tunnettu siitä, että 97303 a) viljellään muunnettua vasta-ainetta tuottavaa solulinjaa, joka valmistettiin transfektoimalla vasta-ainetta tuottava imusolulinja kohdevektorilla, joka sisältää: 5 (i) korvausgeenin imusolulinjan immuno-globuliini- geenien genomisekvenssin osan muuntamiseksi, ja (ii) kohdesekvenssin, joka on homologinen toiselle, muunnettavan immunoglobuliinisekvenssin vieressä olevalle DNA-sekvenssille, 10 siten, että korvausgeeni muuntaa immunoglobuliinisekvens-siä kohdespesifisellä, homologisella rekombinaatiolla ge-nomin kromosomaalisen DNA:n kanssa in vivo; ja transfek-toitu solulinja ekspressoi muunnettua vasta-ainetta; ja b) eristetään muunnettu vasta-ainemolekyyli vil- 15 jelmästä.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muunnettava vasta-ainemolekyyli sisältää muuttuvan alueen hiirestä ja vakio-alueen ihmisestä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transfektoitava imusolulinja on imusolulinja ATCC HB8677, joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta L6.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että transfektoitava imusolulinja on imusolulinja ATCC HB8913, joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta L20.

11. Kohdevektori, tunnettu siitä, että se sisältää 30 (i) korvausgeenin imusolulinjan immunoglobuliin- igeenien genomisekvenssin osan muuntamiseksi, ja (ii) kohdesekvenssin, joka on homologinen toiselle, muunnettavan immunoglobuliinisekvenssin vieressä olevalle DNA-sekvenssille. 97303