KR100463476B1 - 쥐과의동물세포들을위한상동성재조합항체발현시스템 - Google Patents

Abstract

쥐과 동물 숙주세포의 게놈내의 특이적 부위를 확인한 다음, 이 특이적 염색체 부위내로 재조합 유전자를 상동성 재조합에 의해 안정적으로 도입하여 고수준의 재조합 유전자 발현을 일으킨다. 재조합 유전자의 삽입과 발현을 위한 적합한 게놈 부위의 선별이 게시되어 있고 DNA 벡터와 숙주세포도 개시되어 있다.

Description

쥐과의 동물 세포들을 위한 상동성 재조합 항체 발현시스템

제 1 도는 플라스미드 P9014의 구성도이고,

제 2 도는 마우스 염색체내로의 P9014의 삽입부위를 나타낸 도면이며,

제 3A 도는 상동성 재조합 항체발현 플라스미드 pIgG2A의 도면이고,

제 3B 도는 염색체내로의 항체발현 플라스미드의 삽입을 위한 상동성 재조합을 나타낸 도면이고,

제 3C 도는 상동적으로 재조합된 항체 발현 플라스미드를 포함하는 염색체의 일부분을 나타낸 도면이다.

본 발명은 포유류 세포내에서 고수준의 재조합 유전자 발현을 달성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서 고수준의 재조합 유전자 발현은 재조합 유전자를 숙주세포 게놈내의 목적된 부위로 도입(intergration) 시킴으로써 이루어진다.

도입부위는 미리 선택되며, 도입은 숙주 게놈내에서의 특이적 부위와 상동성인 것으로 알려진 특이적 DNA 서열을 포함하는 DNA 벡터의 상동성 재조합을 통해 이루어진다. 숙주 게놈내의 특이적 부위는, 이 부위가 유전자 전사에 관하여 고도로 활성적이고, 쉽게 상동성 DNA 단편과 통합된다는 사실에 기초하여 재조합 유전자의 삽입을 위해 선택된다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 포유류 세포들에는, 제한되지는 않지만, NS/O 세포들이 포함되며, 이들이 가장 바람직한 세포들이다.

NS/O 세포들[Galfre, G. and Milstein, C. 효소학의 방법(1981) 73B : 3-46]은 약 37℃에서, 약 10％ 태아 송아지 혈청(HyClone ; 엔도톡신이 없는 혈청)을 갖는 돌베코(Dulbecco's)의 변형된 최소 필수배지(Hazelton Research Products) 또는 약 9％ 말혈청을 갖는 이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코배지(JRH 바이오사이언스)내에서 현탁액 상태로 성장한다. 세포들은 로울러병(roller bottle), 휘톤(wheaton) 터보리프트 461 현탁용 플라스크(Wheaton 제) 또는 75,200 리터나 300리터용 발효조(fermenter)에서 성장되어, 주당 약 1∼2×10⁶ 세포/ml(3∼4 더블링/주)로 얻어진다.

현탁용 플라스크 또는 발효조에 사용하기 위한 배지는 세포에 대한 전단력을 감소시키기 위하여 약 0.1∼0.3％ F68 플루로닉(pluronic)을 포함할 수 있다. 세포들은 통상 최초의 배양 후 3~4개월이내에 성장된다.

질소 캐비테이션(cavitation), 저장성(hypotonic) 세포분해등에 의한 세포의 분열에 의하여 NS/O 세포들로 부터 세포가 없는(cell-free) 추출물을 제조한다. 세포들을 원심분리에 의해 회수하고, 인산염으로 완충처리된 식염수와 같은 pH 약 7.4의 등장성 완충용액내에서 세척한다. 저장성 세포분해는 약 10부피의 저장 완충액(약 10mM KCl, 약 20mM HEPES, 약 pH 7.4, 약 1.5mM MgCl₂ 약 0.1mM EDTA) 또는 (약 25mM HEPES, 약 pH 7.5, 약 5mM MgCl₂와 1mM EGTA)내에서 세포들을 세척하므로써 이루어지며, 그후에 원심분리에 의해 회수된다. 세포분해용 완충액은 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제를 포함할 수도 있다. 저장성 완충액은 대개 PMSF와 로이펩틴 및 펩스태틴과 같은 프로테아제 저해제를 포함할 수 있다. 세포들을 약 3부피의 저장성 완충액으로 재현탁 처리하고, 약 20분동안 얼음위에 놓고, 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)내에서 약 20스트로크(stroke)로 분해했다. 100ml 또는 300ml 밀착충진 다운스 호모게나이저를 사용하여 약 25 스트로크 또는 약 15 스트로크로 각각 분해하면 세포들의 약 90%∼약 95％가 분열된다.

질소압 분열도 저장성 완충액내에서 일어난다. 재현탁 처리된 세포들을 진탕하면서 약 4℃에서 약 30분간, 400psi의 질소압을 가한다. 분열은 압력을 풀고 가압된 세포로 부터 세포들을 소개(evacuate) 시키므로써 이루어진다. 세포 분해물을 연속적인 원심분리 단계 즉, 약 400∼약 1000 × g(상등액 S1), 약 30,000 × g(상등액 S2) 및 약 300,000 × g(상등액 S3)에서의 원심분리에 의해 정제한다. 또한, 세포 분해들은 다음의 방법에 따라서 정제될 수 있다. 미파괴된 세포들과 핵은 약 3000rpm, 약 10분간, 약 5℃의 백크만 GPR 원심 분리기에 의한 원심분리로써 제거된다.

그후에 핵 상등액을 SS34 로터를 지닌 소르발 원심분리기 내에서 약 16,000rpm으로 약 20분동안 원심분리했다. 상등액을 백크만 원심분리기(50.2Ti 로터)에서 약 50,000rpm 또는 45,000rpm(45Ti 로터)으로 약 60분동안 원심분리하여 더 정제한다. 결과적으로 얻은 상등액에 약 2mM DTT와 0.1％ CHAPS를 첨가한 다음에 약 -80℃로 저장한다.

다양한 방법들중의 어느 방법도 cDNA를 분자 클로닝하는데 사용될 수가 있다. 이러한 방법들은, 제한되지는 않지만, 적절한 발현벡터 시스템내에서 cDNA 라이브러리(library)를 구성한 다음에 재조합 유전자를 직접 기능적으로 발현시키는 것을 포함한다. 다른 방법은 원하는 단백질의 아미노산 서열로 부터 디자인된 표지된 올리고 뉴클레오티드 탐침(probe)을 지닌 플라스미드 셔틀 벡터 또는 박테리오 파아지내에 구성된 cDNA 라이브러리를 스크린하는 것이다.

cDNA 라이브러리의 제조는 당분야에 잘 알려진 표준 기술방법들에 따라서 행해질 수 있다. 잘 알려진 cDNA 라이브러리 구성기술은 예를들면, 매니아티스 T., 후리취, E.F., 샘브룩, J. 의, 분자 클로닝 ; 라보러토리 매뉴얼(laboratory manual), (콜드 스프링 하버 실험실, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1982)에 기재되어 있다.

원하는 단백질을 암호하는 DNA도 적당한 게놈 DNA 라이브러리로 부터 분리할 수 있음은 당업자들에게는 자명한 것이다.

게놈 DNA 라이브러리의 구성은 당 기술분야에 공지된 표준기술에 따라서 행해질 수 있다. 잘 알려진 게놈 DNA 라이브러리 구성기술은 맨니아티스 T., 후리취, E.F., 샘프룩, J.,의 분자클로닝 ; 라보러토리 매뉴얼(콜드 스프링 하버 실험실, 콜드스프링 하버 뉴욕 1982)에 설명되어 있다.

바람직한 방법에 의하여 재조합 유전자를 클로닝 하기 위해서, DNA 서열을 이용할 수가 없다면, 암호된 단백질의 아미노산 서열이 필요할 수가 있다. 이를 이루기 위해서, 원하는 단백질을 정제하고 부분적 아미노산 서열을 자동 서열화기(sequenator)로 결정할 수 있다. 완전한 아미노산 서열을 결정할 필요는 없지만, 부분적 DNA 단편의 PCR 증폭을 위해 약 6∼8 아미노산으로 된 하나이상의 영역의 선형 서열을 결정하는 것이 필요하다.

적당한 아미노산 서열이 확인되면, 이들을 암호할 수 있는 DNA 서열이 합성된다. 유전자 암호가 변형되기 때문에, 특정의 아미노산을 암호하기 위해 하나이상의 코돈(codon)이 사용될 수 있으며, 따라서 아미노산 서열은 한 세트의 유사한 DNA 올리고 뉴클레오티드중의 어느 것에 의해서도 암호될 수 있다. 셋트중의 한 멤버만이 DNA 서열과 동일할 수 있지만, 짝을 잘못이룬(mismatched) DNA 올리고 뉴클레오티드의 존재하에서도 DNA에 혼성화(hybridize)될 수 있다. 짝을 잘못이론 DNA 올리고 뉴클레오티드들은 원하는 단백질을 암호하는 DNA의 동정과 분리가 용이할 정도로 충분히 DNA에 혼성화될 수 있다.

여기에서 사용된 바와 모든 아미노산 3자 명칭과 1자 명칭은 당분야에서 표준으로 쓰는 명칭에 따르며, 이들은 다음과 같다 ;

Alanine Ala A Leucine Leu L

Alanine Arg R Lysine Lys K

Aspargine Asn N Methionine Met M

Aspartic acid Asp D Phenylalanine Phe F

Cysteine Cys C Proline Pro P

Glutamic acid Glu E Serine Ser S

Glutamine Gln Q Threonine Thr T

Glycine Gly G Tryptophan Trp W

Histidine His H Tyrosine Try Y

Iso Leucine Ile I Valine Val V

상술한 방법에 따라서 얻은 클로닝된 DNA는 적당한 프로모터와 다른 적절한 전사조절요소를 포함하는 발현벡터내로의 분자클로닝에 의하여 재조합적으로 발현될 수 있으며, 진핵 숙주세포 또는 원핵 숙주세포 내로 도입되어 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 조작을 위한 기술은 매니아티스, T. 등의 앞서 언급된 문헌에 잘 설명되어 있으며, 이는 당 기술분야에 잘 알려진 내용이다.

여기에서 발현벡터는 유전자들의 클로닝된 복사체의 전사와 적절한 숙주내에서의 이들의 mRNA외 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의된다. 이러한 벡터들은 박테리아, 청록조류, 식물세포, 곤충세포와 동물세포 등과 같은 다양한 숙주내에서 진핵성 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다.

특별히 디자인된 벡터들은 박테리아-효모 또는 박테리아-동물세포와 같은 숙주들 사이에서 DNA의 셔틀링(shuttling, 왕복)을 가능케 한다. 적절하게 구성된 발현 벡터는 숙주세포내에서 자율적 복제를 위한 복제 출발물(origin), 선별가능한 마커(marker), 제한된 수의 유용한 제한 효소부위, 높은 복사체 수(copy number)를 위한 가능성, 활성 프로모터를 포함해야 한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 DNA에 결합되도록 유도하여 RNA 합성을 개시시키는 DNA 서열로 정의된다. 강력한 프로모터는 mRNA가 고 빈도(high frequency)로 개시될 수 있도록 하는 것이다. 발현벡터는, 제한되지는 않지만, 클로닝 벡터, 개량된 클로닝 벡터, 특별히 디자인된 플라스미드 또는 비루스를 포함한다.

다양한 포유류의 발현벡터들은 포유류 세포내에서 재조합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 재조합 단백질 발현을 위해서 적당한 상업적으로 구입가능한 포유류 발현 벡터들은, 제한되지는 않지만, pMClneo(Stratagene), pXT1(Stratagene), pSG5(Stratagene), EBO-pSV2-neo(ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt(ATCC 37199), pRSVneo(ATCC 37198), pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC 37460)과 IZD35(ATCC 37565)를 포함한다.

원하는 단백질을 암호하는 DNA는 재조합 숙주 세포내에서 발현을 위해 발현벡터내로 클로닝 될 수 있다. 재조합 숙주세포들은, 제한되지는 않지만, 박테리아, 효모 등의 진핵세포 또는 원핵 세포와 인간, 소, 돼지, 원숭이와 설치류기원의 세포를 포함하는 포유류 세포들 및, 제한되지는 않지만, 드로소필라(drosophila) 유래의 세포주를 포함하는 곤충세포들일 수 있다. 상업적으로 구입가능하고, 적당한 포유류종으로 부터 유래된 세포주들은, 제한되지는 않지만, CV-1(ATCC CCL 70), COS-1(ATCC CRL 1650), COS-7(ATCC CRL 1651), CHO-K1(ATCC CCL 61), 3T3(ATCC CCL 92), NIH/3T3(ATCC CRL 1658), HeLa(ATCC CCL 2), C127I(ATCC CRL 1616), BS-C-1(ATCC CCL 26)과 MRC-5(ATCC CCL 171)를 포함한다.

발현벡터는, 제한되지는 않지만, 형질전환, 형질감염, 구상세포 융합 및 일렉트로포레이션(electroporation) 등을 포함하는 수많은 기술들중의 어느 한가지를 통해서 숙주세포들로 도입될 수 있다. 발현벡터를 포함하는 세포들은 클론적으로(clonally) 증식되고, 이들이 재조합 단백질을 생성하는지의 여부를 결정하기 위해 개별적으로 분석된다. 재조합 단백질을 발현하는 숙주세포 클론들의 동정은, 제한되지는 않지만, 항체에 대한 면역학적 반응성 및 숙주세포와 회합된 재조합 단백질 활성의 존재 등을 포함하는 몇가지 방법에 의해 실행가능하다.

재조합 숙주세포내에서 재조합 단백질을 발현시킨 다음에, 단백질은 정제된 형태의 단백질로 제공되게끔 회수될 수 있다. 몇가지의 정제방법들이 이용가능하며, 이들은 사용하기에도 적당하다. 재조합 단백질은 세포 분해물과 추출물 또는 조정배양배지로 부터 정제될 수 있으며, 이때 정제방법으로는 염분획법, 이온교환크로마토그래피, 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 흡착 크로마토그래피와 소수성 상호작용 크로마토그래피 등의 개별적인 이용 또는 이들의 컴비네이숀등이 이용될 수 있다.

또한, 재조합 단백질들은 재조합 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 만들어진 면역-친화력-컬럼(immuno-affinity column)을 사용하여 다른 세포성 단백질로 부터 분리가능하다. 항체들은 당 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라서 제조된다.

단일 특이적(monospecific) 항체들은 재조합 단백질에 대하여 반응성이 있는 항체들을 포함하는 포유류 항혈청(antisera)으로 부터 정제되거나, 또는 퀼러와 밀스테인, Nature, 256 ; 495-497(1975)에 기재된 기술을 사용하여 재조합 단백질에 대해 반응성이 있는 모노클로날 항체로서 제조된다.

여기에서 사용된 바의 단일 특이적 항체는 재조합 단백질에 대해 상동성의 결합특성을 지닌 단일의 항체 종(species) 또는 다수의 항체종으로서 정의된다. 여기에서 사용된 바의 상동성의 결합은 상술한 바와 같이 재조합 단백질과 회합되는 항체들과 같이 특이적 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 항체의 능력을 뜻한다. 특이적 항체들은 마이스(mice), 래트(rat), 기니아 돼지, 토끼, 염소, 말등과 같은 동물들, 이들중 특히 바람직하게는 토끼를 면역 보조제와 함께 또는 면역보조제 없이 적절한 농도의 재조합 단백질로 면역화시켜서 얻어진다.

다음의 방법들은 인간의 일정 부위에 결합된 인간 B세포주들로 부터 얻은, 항체를 여러부위에 혼입하는 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)의 재조합 DNA 서열을 제조하는데 바람직하다.

이 재조합 DNA들은 인간-B 세포 공급체-유래 항체의 항원특이성을 갖는 재조합 인간항체의 발현을 위하여 포유류 세포들을 형질감염 시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 면역글로불린은 질병치료 목적을 위한 투여시에 자기단백질(self protein)로 인식될 수 있다. 전체 RNA는 예를들면, 구아니디니움 이소티오시아네이트를 이용한 세포 가용화를 포함하는 표준방법들을 사용해 인간의 헤테로하이브리도마로 부터 추출된다(처그윈등의 생화학회지 18 ; 5294-5299(1979)).

항체 생성세포들이 항체분자의 일부 또는 모두를 암호하는 재조합 DNA 분자의 제조를 위하여 적합하다는 것은 당업자들에게는 자명한 것이다. 이러한 항체 생성 세포들은, 제한되지는 않지만, "세포주와 하이브리도마의 ATCC 카타로그", 7판, 1992에 설명된 것들을 포함한다. 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 암호하는 DNA가 개시되고, 인간 항체 가변성 영역을 위하여 이용 가능한 서열 데이타는 카뱃(Kabat)등의 "면역학적으로 의미있는 단백질의 서열", 4판, 베데스다, 메릴랜드 : 국립보건연구소(N.I.M) 1987에 기재되어 있으며, 이 데이타베이스와 다른 미국과 외국의 데이타 베이스에(핵산과 단백질서열 모두에 관한) 최신정보가 제공되어 있다.

발현플라스미드인 p9014[팔라디노 등, 1993. 바이오테크닉스, 14, PP. 754-755]는 인간의 시토메갈로비루스(cytomegalovirus) 초기 프로모터로 부터 유래된 면역 글로불린 중쇄와 경쇄 전사 유니트를 포함하고, 선별가능한 마커(marker)로서 글루타민 신스타제 전사 유니트를 사용하는, 표준 DNA 클로닝방법에 의하여 구성된다(제1도). 세포주는 쥐의 플라스마시토마 세포주 NS/O내로 Sal I 선형화된 p9014를 일렉트로포레이션 시키고, 글루타민이 없는 배지에서 성장시켜, 안정된 통합체(integrants)을 선택하므로써 생성되었다[드마르티노 등, 항체, 면역 결합체와 방사성약제 1991, 4 ; 829-835화 싱거등, 면역학지, 1993, 150 : 2844-2857]. 생성된 클론(clones)으로 부터, D12를 선택하여 더 연구한 결과, 매우 고수준(〉15pg/cell/day)으로 재조합 항체를 발현함을 보여주었다. 이 클론의 높은 특이적 생산성은 p9014 벡터가 마우스게놈내의 발현을 위한 특정된 부위로 삽입되었음을 의미한다. 이 세포들내에서의 p9014의 통합부위를 확인하기 위한 최초단계로서 게놈 DNA를 D12로 부터 분리하였으며, XbaI로 분해하고 인간 면역글로불린 카파 불변영역 단편(kappa constant region fragment)으로 프로우브하였다. 엄격한 조건하에서, 이 단편은 형질감염된 유전자에 혼성화될 뿐이며, 플라스미드를 선형화하는데 사용되는 SaI I 부위근처에 존재하기 때문에 플라스미드/마우스 게놈 DNA 접합부를 포함하는 제한 단편을 동정할 수 있다. 이 탐침(probe)은 하나의 통합된(integrated) p9014 복사체를 나타내주는 D12 게놈 DNA내의 하나의 3.3Kb 밴드를 동정했다. 이 결과들로 부터, D12 클론내에서 나타난 높은 수준의 발현이 3.3Kb X ba I 결합단편을 생성하기 위하여 삽입된 p9014의 단일 복사체로 부터 유래된 것임을 알 수 있다.

이 삽입 부위를 확인하기 위하여, 전체 게놈 D12 DNA 라이브러리를 만들고, 재조합 박테리오파아지 플라그를 인간의 면역글로불린 카파 불변 영역 탐침으로 스크리닝 하였으며, Sal I 부위의 다른쪽으로 부터의 플라스미드 탐침은 형질감염을 하기전에 원래의 플라스미드을 선형화하는데 사용되었다. 삽입부위의 양쪽면으로 부터의 p9014/쥐 게놈 DNA 접합 단편을 포함하는 재조합 박테리오파아지 클론을 분리하여 플라스미드에 서브클로닝 하였다. 통합 위치의 쥐 게놈 DNA의 서열분석은 p9014 벡터가 쥐의 면역글로불린 감마 2A 부위로 삽입되었음을 보여주었다. 삽입에 의해, 멤브레인 엑손(exon) 2의 상류 48염기쌍(b. p.)으로 부터 시작하여 폴리A 첨가 시그널의 하류로 연장되는, 쥐의 면역글로불린 감마 2A 유전자의 1.8킬로베이스(kb) 복제물이 생성되었다. 3' 플라스미드/쥐 게놈 DNA 접합부에, 형질감염된 벡터나 쥐의 면역글로불린 감마 2A 부위로 부터 유래되지 않은 36 염기쌍(b. p.)외 DNA가 존재했다. 이 접합부에서 32 b. p.의 플라스미드 서열이 삭제되었다. 5' 접합부에 대한 실험결과는 791 b.p.의 벡터서열이 삽입공정중에 삭제되었으며, 16b.p.의 동정되지 않은 DNA가 존재함을 보여주었다(제2도).

형질감염을 위하여 사용된 원래의 세포주 NS/O는 Ig 중쇄 부위로 부터 상당히 고수준의 면역글로불린 RNA를 정상적으로 발현하는 세포타입인 B 세포와는 완전히 구별된다. p9014가 이 부위에 삽입되었다는 관찰결과는 CMV-IEp 프로모터가 이 염색체 위치에서 고수준으로 발현될 수 있음을 보여준다. 이 결과들은 이 면역글로불린 부위로 재조합 DNA 발현 벡터를 삽입하기 위해 상동성 재조합법을 사용함으로써 이 세포주에서 다른 재조합 단백질의 발현을 고수준으로 증진시킬 수 있음을 보여준다.

이 접근방법을 평가하기 위하여, 상동성 재조합 표적(targeting) 서열로서 생식계통 쥐의 면역글로불린 감마 2A 유전자를 포함하는 발현 구조물이 제조되었다. NS/O 게놈 DNA 박테리오파아지 라이브러리가 만들어졌으며, 쥐의 IgG2A 유전자의 M2 3' 비번역영역으로 부터의 탐침으로 스크리닝 되었으며, 몇개의 정제된 클론은 생식계통의 쥐의 IgG2A 전체 유전자를 포함했다. 이 박테리오 파아지들중의 하나로 부터, 5.1Kb BamHI 게놈 단편이 서브클론(subcloned)되었고, 이들은 CH1 엑손의 대부분의 5' 부위를 제외한 쥐 Ig 감마 2A의 암호영역 모두를 포함했다. 쥐의 면역 글로불린 감마 2A 서열내에 선형화를 위한 독특한 부위를 제공하기 위해서, Sal I 제한부위를 멤브레인 엑손 2의 39b.p. 상류에 존재하는 천연 Stu I 부위에 삽입했다.

이 클론된 단편은 다음의 1)∼4)를 포함하는 복합 발현벡터를 만드는데 사용되었다 :

1) 인간 CMV 초기프로모터로 부터 전사된 중쇄와 경쇄 면역글로불린 유전자 ;

2) 선별가능한 마커(표식)로서 사용될 글루타민 합성효소 ;

3) 플라스미드 벡터서열 ; 및

4) 쥐의 면역글로불린 감마 2A 부위의 5.1kb BamHI 단편(제3A도)

[야마와키-카타오카, Y. 등, Proc, Natl, Acad. Sci. U.S.A. 1982, 79 : 2623-2627 ; 홀, B. 등, 분자면역학 1989, 26 : 819-826 ; 야마와키-카타오카, Y.등, 헥산연구 1981, 9:1365-1381 ; 베빙톤, C.R.등, 바이오 테크놀로지 1992, 10 : 169-175].

이러한 상동성 재조합 삽입형 벡터는 발현벡터의 직접적이고 명확한 삽입을 야기하도록 벡터내에 포함된 쥐의 면역 글로불린 감마 2A 부위와 내생의 쥐 면역글로불린 감마 2A 부위가 재조합될 수 있는 통합과정을 최대화할 수 있게끔 디자인 되었다(제3B도). 상동성 재조합을 통해 면역글로불린 감마 2A 부위내의 어떤 부위로 이 벡터를 삽입함으로써 재조합 항체-암호 DNA의 발현을 고수준으로 할 수 있다.

NS/O 세포들은 일렉트로포레이션에 의하여 Sal I 선형화된 면역글로불린 벡터 구조물로 형질감염되고, 96웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이트되었다. 147웰은 GS 선택성 배지조건하에서는 세포성장에 대해 양성이다. 상동성 재조합에 의하여 내생의 쥐 면역 글로불린 감마 2A 부위로 면역글로불린 구조물이 통합된 안정된 세포주들은 고수준의 재조합 항체를 발현한다. 상동성 재조합 가능성이 있는 클론을 신속히 검색하기 위해서, 고수준의 재조합 항체를 발현하는 웰에 대한 신속한 제1의 패스 스크린(pass screen)으로서 엘리사(ELISA)법이 사용다. 모든 147웰로 부터외 액에 대해 행해진 엘리사(ELISA)법에 의해, 고수준의 항체를 발현하는 20웰을 동정했다. 이 20웰로 부터의 세포들을 성장시키고, 항체 발현에 대하여 재분석 평가했다. 20웰중의 12웰로 부터 유래된 세포들은 고수준의 항체 발현을 계속했다. 이 12세포주들은 pIgG2A/면역글로불린 플라스미드가 염색체내로 삽입된 클론들의 풀(pool of clones)을 형성했다.

형질감염된 벡터가 쥐의 면역글로불린 감마 2A 부위로 통합된 안정한 클론을 동정하기 위해 게놈 서던 블롯 분석을 행하였다. 상동성 재조합을 감지하기에 적합한 효소를 확인하기 위해 다수의 제한 효소들이 스캐닝되었다. NS/O 게놈 DNA를 분해하고, 블롯(blot)한 다음 상기 부위의 3'측면으로 부터의 쥐의 면역글로불린 감마 2A 탐침으로 검색할 때 Hpa I은 15kb 생식계통 밴드를 제공한다. 이와는 대조적으로, 만일 면역글로불린 벡터가 상동성 재조합에 의하여 IgG2A 부위내로 삽입되면, 10kb HPa I 단편이 블롯(blot)상에 존재할 것이다(제3C도).

12개의 고발현 세포주들의 서던 분석결과는 이들 세포주들중의 9개가 상동성 재조합에 의하여 쥐의 IgG2A 부위내로 구조물이 삽입된 삽입체와 일치하는 10kb 밴드를 갖고 있음을 보여준다(표 1). 이들 9개의 클론들은 면역글로불린 발현벡터에 특이적인 혼성화 탐침을 사용하는 부가적인 서던 블롯분석에 의하여 상동성 재조합체인 것으로 확인되었다. 이 결과는 쥐의 면역글로불린 감마 2A 부위로의 상동성 재조합이 상당히 높은 빈도로 발생됨을 보여준다. 고발현 클론중의 75％와 안정된 세포주들의 전체수중의 6％는 상동성 재조합체들 이었다.

12개의 고발현 클론 모두에 대하여 재조합 단백질의 생산성 수준을 시험했다. 알려진 밀도로 플레이트된 세포들로 부터 24, 48 및 72시간째에 세포 배양배지를 제거하고, 제조합 항체의 생성량(pg/cell/day)을 결정하기 위하여 포러스(Poros) 분석을 실시했다. 이 세포들은 14∼43 pg/cell/day 범위의 상당히 고수준의 재조합 항체들을 생산한다. 이 생산수준은 원래의 D12 세포주에 의하여 생산된 재조합 항체량에 맞먹거나 또는 이보다 더 높은 양이다.

이 세포들내에서의 재조합 항체의 특이적 생산성에 있어서의 3배 변이(three fold variation)가 RNA 수준 또는 클로날 변이의 차이에 기인된 것인가를 결정하기 위해서, 선택된 세포주들을 배양하여 특이적 생성량을 측정하고, 동일한 원래의 세포 풀로 부터 RNA를 분리했다. 혼성화 탐침으로서 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 불변영역 유전자를 사용하여 분리된 RNA에 대하여 노던(northern) 분석을 행했다. 레인(lane)당 RNA의 양은 쥐의 베타 액틴 발현을 기준으로 하였으며, 혼성화 시그널의 강도를 정량하였다. 이 실험결과는 RNA의 양이 세포주에 따라 대체적으로 일정함을 보여준다. 이는 이 세포들의 항체발현에 있어서의 차이는 세포성 요인에 기인되며, 다른 RNA수준에 의하여 야기되는 것이 아님을 뜻한다.

다음의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

실시예 1

라이브러리 구성

Sal I선형화 p9014를 쥐의 플라스마시토마 세포주 NS/O내로 일렉트로포레이션시키고 [팰라디노 등, 1993, 바이오테크닉, 14, pp. 754-755] 글루타민이 없는 배지내에서 성장시킨 후 안정된 통합체(integrants)를 선택함으로써 세포주를 얻었다[드마르티노 등, 항체, 면역접합체와 방사약제들, 1991, 4 : 829-835와 싱거등, 면역학지, 1993, 150 : 2844-1857]. 생성된 클론들중에서, 세포주 D12는 예외적으로 고수준의 (〉15 pg/cell/day) 재조합 항체를 발현함을 보여준다. 이 클론의 특이적인 높은 생산성은 p9014 벡터가 발현을 위한 특정의 부위로 마우스게놈내로 삽입되었음을 암시해준다. 5' 게놈 DNA/플라스미드 접합체를 클로닝하기 위해, 제조사의 설명서를 따라 람다-젬 11 Xho I-하프-사이트 암스 클로닝 시스템(프로메가)을 사용해서 게놈 라이브러리를 구성했다. D12 게놈 DNA는 Mbo I(베링거-맨하임)을 이용해서 부분적으로 분해되었다. 양성 프라그(plaques)는 하기와 같은 두개의 다른 탐침을 사용해 동정했다 ;

1) Xmn I/엠피실린내성 유전자의 Pst I 단편(354b.p.)

2) 햄스터 글루타민 신스타제 유전자의 엑손 7의 300b.p. 단편.

3' 플라스미드/게놈 DNA 접합체를 클로닝하기 위해, 람다/잽Ⅱ/기가팩 Ⅱ 골드 클로닝 킷트(스트라타젠)를 사용하여 게놈 라이브러리를 구성했다. 벡터와 D12 게놈 DNA 양쪽 모두를 Xba I(베링거-맨하임)으로 완전히 분해하고, 생성물을 결합시킨 다음(리게이션 킷트, 스트라타젠), 제조사의 설명서에 따라서 팩킹혔다. 양성 프라그는 탐침으로서 인간 카파 불변 영역 유전자를 사용해 동정했다. 모든 탐침들은 닉 트랜스레이션(nick translation)에 의해 라벨링되었다. 파아지 DNA는 제조사의 설명서에 따라서 람다소르브(프로메가)를 사용해 분리했다.

파아지 인서어트(phage inserts)를 pSP72 벡터(프로메가)내로 서브클론했다. 박테리아로부터의 플라스미드 DNA를 표준 알카리 분해법을 사용해 분리했다. 인서어트는 생거(Sanger) 디데옥시 체인 종단법에 의해 서열화 되었다.

실시예 2

NS/O 세포들로부터 생식계통 쥐의 IgG2A 유전자의 분리

쥐의 플라스마시토마 세포주 NS/O로 부터 분리된 DNA의 Mbo I부분 분해물을 프로메가사제 람다 젬-11 벡터에 삽입하고, 1.8×10⁶의 독립 프라그를 IgG2A M2 3' 비번역영역으로부터 유래된 탐침(Bgl Ⅱ-BstX1)으로 스크린했다. 14개의 양성 박테리오파아지를 프라그 정제하고, 대규모의 분해생성물을 제조했다. 재조합 박테리오파아지는 제한 매핑(restriction mapping)과 서던 혼성화법에 의하여 확인하였고, 쥐의 Ig 감마 2A 유전자의 암호영역 모두를 포함하는 하나의 클론을 동정했다. IgG2A 암호영역(CH1 엑손의 대부분의 5' 부위는 제외)을 모두 포함하는 5.1kb BamH I 단편과, 멤브레인 엑손 및 3' 비번역 영역을 절단하여, 멀티클로닝 부위의 Sal I 부위가 파괴된 블루스크립트(Bluescript)의 변형형(스트라타젠)의 BamH I 부위내로 클로닝하였다.

실시예 3

IgG2A 표적 플라스미드의 구성

쥐의 IgG2A 유전자의 5.1Kb를 포함하는 플라스미드를 Stu I으로 부분적으로 분해하고, 선형화 플라스미드를 겔 정제했다. 독특한 Sal I 부위를 링커 결합에 의하여 IgG2A 단편내로 도입하고, IgG2A M2엑손의 첨가된 Sal I 부위 39b.p. 상류를 포함하는 서브클론을 선택했다. 개량된 5.1Kb IgG2A 인서어트를 BamH I으로 분해하여 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 블런트하고(blunted), Ig 발현 벡터의 유사하게 블런트된 Sal I 부위내로 클로닝 했다. 최종의 pIgG2A 표적 플라스미드를 Sal I으로 분해하여 일렉트로포레이션을 위해 선형화하였다. 최종적 표적 플라스미드의 지도는 제3도에 도시된다.

실시예 4

일렉트로포레이션(electroporation)

NS/O 세포들을 10% 태아 송아지 혈청과 4mM 글루타민으로 보충된 이스코베의 변형된 둘베코배지(시그마회사제품)내에서 성장시켰다. 1000만개의 세포들을 800 μl의 인산염으로 완충처리된 생리 식염용액내에서 선형화된 pIgG2A 25㎍과 함께 혼합하고, 바이오-래드 젠 펄서(Bio-Rad, Gene Pulser, 1.5kV ; 3㎌ ; 전극거리, 0.4㎝)를 사용해 일렉트로포레이션했다. GS 선택 클론을 위하여, 형질감염된 세포들을 10% FCS와 1mM 글루타민과 함께 이스코베 배지내에서 배양했다. 선택배지(GS 선별-글루타민이 없는 이스코베, 10% 투석 FCS, 1 X 뉴클레오시드, 1 X 아스파라긴)를 24시간후에 웰(well)에 첨가했다. 147웰은 세포성장에 대하여 양성이며, 이를 엘리사법으로 분석했다.

실시예 5

엘리사(ELISA)

재조합 항체 생산에 대한 클론의 스크리닝(검색)은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 이루어졌다. 클론들로 부터의 배지 상층액을 PBS중의 1% BSA 내에서 1:10 및 1:100으로 희석했다. 샘플을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고(Immulon 2, 다이나테크, 레보라토리, Inc.), 인간 람다 경쇄(Zymed)에 마우스 모노클로날 항체로 코팅하고, 37℃에서 1시간동안 배양했다. 그후에 홀스래디시 퍼옥시다제(Zymed)에 접합된 마우스 모노클로날 항-인간 IgG1 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양했다. 각각의 배양후에 플레이트를 PBS로 3회 세척했다. 결합된 항체의 검출은 기질 ABTS(2,2-아니조-디(3-에틸벤즈티아졸린)설폰산)(Zymed)을 첨가함으로써 시각적으로 명확해 진다.

색상은 실온에서 20분간 발색되게 했다. 흡수도는 415㎚에서 측정했으며(바이오래드 마이크로플레이트 리더 3550), 항체농도는 마이크로플레이트 매니져(바이오래드) 데이타 분석 소프트 웨어를 사용해서 계산했다. 표준곡선은 재조합 항체의 2배 희석액을 사용해 작성하였다.

실시예 6

서던 블롯팅에 의한 상동성 재조합체의 동정

클론으로 부터의 게놈 DNA는 단백질 분해효소 K/SDS 방법 또는 신속한 구아니딘 하이드로 클로라이드 방법에 의해 분리되었다(매니아티스,T., 후리취, E.F., 샘브룩, J., 분자클로닝 ; 래보라토리 매뉴얼(콜드 스프링 하보 래보라토리, 콜드 스프링 하보, 뉴욕, 1982)).

상동성 재조합체를 동정하기 위하여, 비-생산 대조클론들과 고발현 클론으로 부터의 게놈 DNA 10㎍을 HPa I으로 완전히 분해하고, 0.8% 아가로스 겔상에 적용시키고, 서던 방법(서던, E.J. 분자생물학, 1975, 98:505)에 의하여 니트로셀루로오스로 이전시켰다. 블롯(blots)을 하기와 같은 두가지의 다른 탐침으로 혼성화 했다 :

1) 쥐의 IgG2a 부위의 3.5Kb Xba I 단편하류,

2) pBR322 플라스미드 주쇄의 Sal I/BamH I 단편(276b.p.).

혼성화(잡종형성)를 위한 DNA 탐침들을 닉 트랜스레이션에 의해 라벨링했다(릭비, P.J.J. 분자생물학, 1977, 113:237-251). 고수준의 항체발현을 하는 20개웰을 동정했다. 클로날 확대후에 재스크리닝을 한 결과, 2웰중의 12웰은 고수준의 항체를 계속 생산하였으며, 이들 모두의 경우 발현벡터가 게놈 DNA내로 상동적으로 재조합되었다.

실시예 7

특이적 생성량

클론의 특이적 생성량은 6웰의 조직배양용 플레이트에 삼연식(triplicate)으로 세포를 3×10⁵ 세포/웰의 밀도로 플레이팅시키므로써 결정되었다. 24시간후에 하나의 웰로 부터 배지를 회수하고, 두번째 웰로 부터는 48시간 후에, 세번째 웰로 부터는 72시간후에 배지를 회수하였다. 세포수 카운트는 각 시점에서 행해졌다. POROS 단백질 친화력 컬럼을 사용해 재조합 항체의 농도에 대하여 배지를 분석했다. 생성량 g/세포/일로 표시되는, 특이적 생성량은 칼레이다그래프 프로그램을 사용하여 계산했다. 항체 생성량의 수준은 대개 14∼43pg/cell/day 사이의 범위내였다.

실시예 8

RNA 분석

각각의 세포주에 대하여, 10⁸세포들을 1×PBS로 3회 세척하고, 4M 구아니딘 이소티오시아네이트내에서 분해하고, 조직용 호모게나이저를 사용해 분쇄했다. 분해생성물을 5.7M CsCl쿠숀상에 층이 형성되게 가하고, 20℃에서 20,000rpm으로 SW 28로터로 밤새 회전시겼다. 펠릿(pellet)을 dH₂O에 용해하고, 이어서 에탄올 침전을 시켜서 RNA를 회수하였다. RNA의 농도는 파장 260㎚에서의 흡광도로 결정하였다.

전체 RNA 10㎍을 180V에서 3시간동안 1 × MOPS 완충액내에서 포름알데히드/아가로스겔상의 각각의 세포주에 대하여 적용시킨 후, 상술한 바대로 니트로셀루로오스 종이에 옮겼다(쳐그윈등, 생화학, 18:5294-5299[1979]).

RNA블롯은 다음의 32P- 라벨된 마우스 DNA 탐침들에 혼성화 되었다 ;

a) 인간 IgG1 불변영역을 포함하는 2kb EcoR1-Xho1 단편 ;

b) 인간의 Ig람과 C2 불변영역을 포함하는 600bp EcoR1-Xbal 단편 ;

c) 올리고뉴클레오티드 5'-CUA CUA CUA CUA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC-3'(SEQ. ID. NO:1)과 5'-CAU CAU CAU CAU ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC-3' (SEQ. ID. NO:2)를 사용한 RT-PCR 증폭을 통해 생성된 마우스 베타-액틴 유전자로부터의 1200b.p. EcoR1-BamH I 단편.

하나의 RNA 블롯은 10% 덱스트란 설페이트, 4×SSC, 40% 포름아미드, 0.8% 덴하르트 트리스 완충용액내에서 42℃에서 두개의 면역 글로불린 탐침들 각각과 함께 혼성화되었다. 방사선자동사진법을 행하기 전에 혼성화필터를 실온에서 2×SSC, 0.1% SDS로 3, 50℃에서 20분동안 0.1×SSC, 0.1% SDS로 2회 세척했다. 시그널 강도는 포스포리메이저(phosphorimager)로 결정되었다. 두개의 면역 글로불린 탐침으로 정량한 후에, 필터를 70℃에서 15분동안 dH₂O로 세척하여 시그널을 제거하고, 각각의 레인(lane)내에 가해진 RNA의 양의 규격화를 위해 베타-액틴 탐침으로 재혼성화 했다. 각각의 세포주들은 항체-특이적 RNA에 거의 맞먹는 양을 생산했다.

실시예 9

NS/O 세포들의 형질감염

NS/O 세포들은 다음의 배지중에서 지수기 성장을 유지했다 : 열에 의해 비활성화된 10% 태아 소혈청과 4mM 글루타민으로 영양보충된 이스코베 최소필수 배지 ; 이들은 CO₂를 5%∼6.5% 범위로 고정시킨 가습 인큐베이터내에서 37℃로 유지되었다.

형질감염을 위한 플라스미드를 독특한 부위에서 제한효소로 분해시켜서 선형화 했다 ; 바람직한 독특한 부위는 벡터의 박테리아 서열내에서 외래 유전자 발현서열 밖에 위치한 것이다. 제한후에, DNA는 페놀추출, 페놀/클로로포름(1:1) 추출에 의하여 탈단백질화하고, 클로로포름으로 최종 추출했다 ; 그후에 최종농도 0.2∼0.4M NaCl및 70% 에탄올을 사용하여 생물학적으로 안전한 캐비넷내에서 멸균조건하에서 침전시켰다. DNA를 계산된 농도인 1mg/ml의 농도로 멸균된 증류수에 재현탁시켰다. DNA는 바로 사용되거나 또는 사용될때까지 동결상태(-20℃)로 보존될 수 있다.

형질감염시키는 날에 생균을 스톡(stock) NS/O 배지에 가했다. 형질감염큐벳(cuvette)당 전체 1×10⁷ 생균이 사용되었다. 처음에는 실온에서 5분동안 3,000 x g으로 원심분리하여 세포들을 회수하고 ; 그후에, 펠릿으로 된 세포들을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고 10⁷cells/800ml 농도로 PBS 중에 재현탁했다. 이 시점에서 부터는 세포현탁액은 얼음상에서 보관되었다. 10⁷ 세균을 멸균조건하에서 생물학적으로 안전한 캐비넷내의 0.4㎝(전극 사이의 거리) 바이오래드 큐벳에 얌전히 옮겼다. 용액상태의 선형화 플라스미드 DNA 40mg을 세포들과 함께 혼합하고, 큐벳을 5분간 얼음상에서 보관했다. 일렉트로포레이션을 하기 전에, 큐벳의 의부를 말린 후에, "바이오래드 유전자 전동기"의 큐벳 홀더에 넣었다.

유전자 진동기를 1500볼트/진동에서 3mF를 전달하도록 고정했다. 두개의 연속진동이 사용다.

그후에 큐벳을 2∼5분동안 얼음위에 놓고, 세포들을 50ml용 일회용 멸균튜브내의 1mM 글루타민을 포함하는 개량 성장배지 30ml에 옮겼다. 이 30ml중에서 세포현탁액 10ml를 웰당 약 100ml로 96웰의 마이크로타이터 접시에 가하고, 세포현탁액 10ml (남아 있는 20ml중에서)를 개량 성장배지 10ml로 희석하고, 웰당 약 100ml로 개의 96웰 마이크로타이터 접시에 가하고, 최종의 세포현탁액 10ml를 개량 성장배지 30ml로 희석하고, 웰당 100ml로 4개의 96-웰 마이크로타이터 접시에 가했다. 이 플레이트들을 5%∼6.5% CO₂, 37℃로 고정시킨 가습 인큐베이터 내에서 밤새 항온 배양했다.

선택 배지(Selective Medium) :

GS 선별을 위한 선택 배지는 다음과 같다 ;

이스코베 최소필수 배지(글루타민이 없는 배지 ; 시그마)

10% 투석 처리된 태아 소혈청(하이클론)

1 × 뉴클레오시트*

1 × 아스파라긴**

* 50 × 리보뉴클레오시드 저장액 :

35mg 아데노신

35mg 구아노신

35mg 시티딘

12mg 티미딘

(각각 시그마회사제품, 세포배양용 배지등급) 멸균된 증류수로 100ml로 되게 함.

0.1m 필터 유니트를 사용해 여과하고 10ml 용량으로 나누어 냉동상태(-20℃)로 보관.

** 100×아스파라긴 : 600mg/멸균증류수 100ml, 0.1m 필터 유니트을 사용해 여과하고 4℃에서 보관.

선 별:

24시간 경과된 형질감염된 각각의 96웰 마이크로 타이터 접시에 100μl의 선택배지를 공급하고 가습된 인큐베이터에서 37℃, 5%∼6.5%의 CO₂조건에서 콜로니가 생성될 때까지 배양하였고, 이 기간은 약 3∼3.5주간 이었다. 웰이 건조되기 시작하지 않는 한 어떠한 영양공급도 필요하지 않았다 ; 플레이트들을 3∼4일 간격으로 관찰하였다. 콜로니가 성장하는 웰들은 황색으로 변하기 시작하였고, 그 시점에서 50∼100μl의 배양액을 제거하고, (클론의 생존을 유지하기 위해) 선택 배지를 재공급함으로써 웰들을 분석하였다.

배 경

재조합 발현 구조물은 원하는 재조합 단백질을 발현하는 안정된 포유류 세포주를 생성하는데 통상적으로 사용된다.

이 재조합발현 구조물들은 형질감염됨 숙주세포에서는 염색체의 플라스미드로서 남아 있는 유형일 수 있거나, 또는 숙주의 게놈내로 도입된 유형일 수도 있다. 재조합 유전자들의 통합된 복사체(copy)를 안전하게 수송하는 포유류의 숙주세포들은 재조합 유전자의 유지와 완전함에 대해 전형적으로 더욱 믿을 만하다. 재조합 포유류 숙주세포가 재조합 단백질을 생성하는 것으로 동정되면, 재조합 유전자가 도입된 복사체는 유전자의 염색체외 복사체들에 비하여 더 바람직할 수 있다.

그러나, 원하는 재조합 단백질을 고수준으로 발현하는 재조합 유전자의 통합된 복사체를 안전하게 수송하는 세포주의 빈도(frequency)는 아주 낮다. 전형적으로 안전하게 형질감염된 대부분의 포유류 세포들은 고수준으로 재조합 단백질을 발현하는 클론들(clone)을 동정하기 위해 스크린되어야만 한다. 이는 포유류 게놈내로의 재조합 유전자의 삽입부위(locus)에 따른 효과에 기인되는 것으로 믿어진다. 포유류 게놈의 크기때문에 무작위 도입에 의해서는 고수준의 유전자 발현을 위해 바람직한 부위내로 재조합 유전자가 삽입되기가 쉽지 않다.

세포주를 발현하는 고수준의 재조합 유전자의 빈도증가는 고도의 발현자(expressor)들의 훨씬 더 큰 풀(pool)을 제공하며, 이로부터 다음의 선택을 위하여 재조합 단백질 생산자(producer)를 선택할 수 있다. 더우기, 그러한 빈도증가는 고수준의 재조합 단백질 발현자들을 동정하기 위하여 요구되는 안정된 세포주들의 수를 감소시켜 준다.

발명의 요약

본 발명은 높은 수준의 재조합 유전자 발현을 위하여 포유류게놈 내에서의 바람직한 특이적 위치를 결정하는 방법과 발현구조물을 바람직한 게놈위치로 타겟팅(targeting)함으로써 고도의 발현자들의 빈도수를 증가시키는 효율적인 방법을 개시한다.

또한, 본 발명은 고수준의 재조합 단백질을 발현하는 안정된 세포주를 만들기 위한 본 발명의 방법의 작동에 관해 개시한다. 또한, 본 발명은 본 발명을 사용하여 얻은 세포주가 포유류의 게놈내로 발현구조물의 무작위 도입에 의하여 생성된 가장 우수한 발현 세포주들을 능가하는 상당히 높은 수준으로 제조합 단백질을 발현함을 보여준다.

Claims (16)

1. 재조합 유전자의 발현을 위한 프로모터, 선별성 마커를 암호하는 전사유니트 및 상동성 재조합 타겟팅을 위한 쥐과 동물의 면역글로불린 감마 2A 불변 영역(constant region) 부위-특이적 DNA 서열을 포함하는, 포유동물세포 내에서의 재조합 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현벡터.
2. 제 1 항에 있어서, 쥐과 동물세포 내에서의 재조합 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현벡터.
3. 제 2 항에 있어서, NSO 세포내에서의 재조합 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현벡터.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별성 마커는 gpt, dhfr, 항생물질내성, 또는 글루타민 신스타제 전사유니트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
5. 제 4 항에 있어서. 상기 선별성 마커는 글루타민 신스타제 전사유니트인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV-IE 프로모터인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 면역글로불린 유전자인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
8. 제1 면역글로불린 유전자의 발현을 위한 제1 프로모터, 제2 면역글로불린 유전자의 발현을 위한 제2 프로모터, 선별성 마커를 암호하는 전사 유니트 및 상동성 재조합 타겟팅을 위한 쥐과 동물의 면역글로불린 감마 2A 불변 영역 부위-특이적 DNA 서열을 포함하는, 포유동물세포 내에서의 재조합 면역글로불린 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현 벡터.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 제1 프로모터와 제2 프로모터는 각각 CMV-IE 프로모터인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 선별성 마커는 글루타민 신스타제 전사 유니트인 것을 특징으로 하는 상동성 재조합 발현벡터.
11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 쥐과 동물세포 내에서의 재조합 면역글로불린 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현 벡터.
12. 제 11 항에 있어서, NOS 세포내에서의 재조합 면역글로불린 유전자의 발현을 위한 상동성 재조합 발현 벡터.
13. 하기 단계들을 포함하는, 완전히 분화된 B-세포인 숙주세포내에서의 재조합 유전자의 발현방법.

    (a) 재조합 유전자를 암호하는 DNA를 포함하며, 숙주세포 염색체 감마 2A 불변영역 부위에 상동적으로 재조합되는 면역글로불린 감마 2A 불변 영역 부위-특이적 상동성 재조합 벡터를 상기 숙주세포내로 도입하는 단계; 및

    (b) 상기 숙주세포를 선별과 재조합 유전자 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 숙주세포 선별은 gpt, dhfr, 항생물질 내성 또는 글루타민 결핍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 숙주세포 감마 2A 불변 영역내의 어느 위치에서 숙주세포 염색체 감마 2A 불변영역 부위에 상동적으로 재조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 항체 (antibody) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.