KR20020038589A - 유전자 조절 뉴클레오티드 서열 및 그의 이용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 연령 조절 방식 및(또는) 간 특이적인 방식으로 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 연령 관련 및(또는) 간 특이적 발현에 본원에서 제공하는 조절 핵산 서열을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 조절 핵산 서열을 갖는 숙주 세포 및 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 연령 관련 및(또는) 간 특이적인 방식으로 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는데 유용하다.
Description
본 발명은 부분적으로 미정부의 지원과 함께 국립 보건 연구소(National Institutes of Health) 승인번호 HL38644 및 HL53713으로 수행되었다. 미정부는 본 발명에 있어서 특정 권한을 갖는다.
수많은 인간 질병 (예를 들어, 혈전증, 심혈관 질병, 당뇨병, 알츠하이머병,암종, 골다공증, 골관절염, 파킨슨씨병, 치매)은 연령 증가와 관련있으며, 이러한 질병을 갖는 환자의 평균 수명 및 삶의 질에 중대한 영향을 미친다. 간에 유해한 다른 질병들 (예를 들어, 경화증, 원발성 종양 및 전이성 종양, 윌슨병, 간무색소증, 전염성 간염, 간괴사, 길버트병, 크리글러-나자르병(Criggler-Najar disease))은 또한 심각한 임상적 징후를 나타내며, 높은 이병률 및 사망률의 원인이 된다.
연령 관련 질병들 (즉, 임상적 징후의 이환율 및(또는) 중증도가 환자의 연령에 따라 증가하는 질병) 및 간에 유해한 질병의 치료는 두가지 양식, 즉 비약리학적 치료 및 약리학적 치료 중 하나를 사용하거나 또는 이들을 병용하여 상기 질병들의 일반적인 증상을 경감시키는 데 주안점을 둔다. 비약리학적 치료의 예로는 안정 주기법 및 규정식 변화법을 들 수 있다. 비약리학적 치료는 종종 약물 사용을 포함하는 약리학적 치료를 보조하는 데 사용한다. 불행하게도, 통상 사용되는 약제 중 다수에는 여러가지 부작용이 있으며, 이러한 약제를 사용하면 질병이 중한, 역설적으로 치료를 가장 필요로 하는 환자들의 불응성으로 인해 질병이 악화된다. 비약리학적 치료 및 약리학적 치료 모두는 연령 관련 및 간 관련 질병에 만족스런 해법을 제공하지 못하는데, 이는 종종 이들 해법이 효능없고, 효능이 일관되지 않으며, 질병의 일반적인 증상을 완화하기보다는 이병률 및 사망률의 원인을 제기하는 것과 관련있기 때문이다. 더욱이, 연령 관련 및 간 관련 질병과 연관된 특정 생화학적 및 생리학적 경로를 표적으로 하는 합리적으로 고안된 약물에 대한 적합한 동물 모델도 일반적으로 이용가능하지 않는다.
필요로 하는 방법은 연령 관련 및 간 특이적 게놈의 발현 방법 및 연령 관련및 간 특이적 질병을 위한 모델이다.
본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 연령 관련 방식 및(또는) 간 특이적 방식으로 조절하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 목적하는 뉴클레오티드 서열의 연령 관련 및(또는) 간 특이적 발현을 위해 본 명세서에서 제공되는 유전자 조절 핵산 서열을 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 유전자 조절 핵산 서열을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 동물 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 연령 관련 및(또는) 간 특이적 방식으로 조절하는 데 유용하다.
도 1은 11 개의 예시적 인간 FIX 미니유전자 발현 구조물의 구조 및 상대적 시험관내 일시 발현 활성을 나타낸다 (ng hFIX/106세포/48 시간).
도2는 -416FIXml (A), -416FIXml/1.4 (B), -590FIXml (C), -679FIXml (D) 및 -770FIXml (E) 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 장기적 분석 그래프를 나타내며, 상기 마우스는 초기 발정기 이전에 hFIX 고발현도를 나타내지만 노화하면서 급속감소되는 발현도를 나타낸다.
도 3은 인간 FIX mRNA 수준의 노던 블롯 (A) 및 -416FIXml을 보유하는 동물의 간 및 꼬리에서 다중 PCR 분석에 의해 측정된 hFIX 트랜스진 DNA 수준을 나타내는 겔 (B)을 나타낸다.
도 4는 -802FIXml (A), -802FIXml/1.4 (B), -2231FIXml (C), -2231FIXml/1.4 (D) 및 -416FIXml/AE5' (E) 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 장기적 분석 그래프를 나타내며, 상기 마우스는 노화하면서 hFIX를 안정하고 증가하는 수준으로 생성한다.
도 5 -802FIXml 및 -802FIXml/1.4 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 노던 블롯을 나타낸다.
도 6은 상이한 연령 집단으로부터의 마우스 간의 핵 추출물 (NEs), 및 hFIX 유전자 (A)의 nt -797 내지 -776에 걸쳐있는 PEA-3 요소 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 및 PEA-3 뉴클레오티드 서열 (B)을 함유하는32P 표시된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 대한 경쟁 분석을 사용한 겔 전기영동 이동 시프트의 겔이다.
도 7은 -416FIXm1 (A) 및 -802 FIXml (B) 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스에서의 hFIX 발현의 조직 특이성을 나타내는 노던 블롯이다.
도 8a-e는 뉴클레오티드 서열 (서열 4), 및 인간 인자 IX (젠뱅크 기탁 번호 K02402)를 함께 형성하는 8 개의 아미노산 서열 (서열 5 내지 12)을 나타낸다. ●는 개시 전사 부위 (뉴클레오티드 1) 및 폴리-A-첨가 부위 (뉴클레오티드 32, 757)는로 나타낸다. 검은 수직 화살표는 인트론-엑손 스플라이스 접합을 나타낸다. Alu가 5 번 반복된 서열은 밑줄로 그어졌으며, 반면에 인트론 A내 5-염기 삽입 및 엑손 VIII내 AATAAA 서열은 박스 표시하였다. 유전자 (CATTG)의 3' 말단의 절단 또는 종료 부위는 점괘선으로 밑줄그어져 있다.
도 9는 마우스 PEA-3 (젠뱅크 기탁 번호 X63190)의 cDNA 서열 (서열 13) (A) 및 코딩된 폴리펩티드 서열 (서열 47) (B)을 나타낸다.
도 10 a-d는 인간 α1-항트립신 유전자 (젠뱅크 기탁 번호 K02212)의 cDNA 서열 (서열 42)을 나타낸다.
도 11은 인간 항트롬빈 III(젠뱅크 기탁 번호 A06100)의 DNA 서열 (서열 43)을 나타낸다.
도 12는 인간 단백질 C의 cDNA 서열 (a) (서열 49) (젠뱅크 기탁 번호 X02750) 및 게놈 DNA 서열 (b) (서열 50) (젠뱅크 기탁 번호 M11228)을 나타낸다.
도 13 (a-e)는 AE3' (서열 3)의 예시적 상동체의 핵산 서열 (서열 76 내지 83)을 나타낸다.
도 14는 인간 단백질 C 유전자의 5'-말단에 위치한 뉴클레오티드 서열 (nt -1462 내지 nt +1, 서열 85)을 나타낸다.
도 15는 8 개의 예시적 인간 단백질 C 미니유전자 발현 구조물의 구조를 나타낸다.
도 16은 5 개의 예시적 인간 단백질 C 미니유전자 발현 구조물의 상대적 시험관내 일시적 발현 활성을 나타낸다.
도 17은 -1462hPCml (A), -82hPCml (B) 및 AE5'/-1462hPCml/AE3' (C) 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 장기적 분석 그래프를 나타낸다.
<정의>
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기의 용어들을 정의하였다.
용어 "단리된"은, "단리된 핵산 서열"에서와 같이 핵산과 관련하여 사용되는 경우, 핵산 서열이 통상적으로 그의 천연 상태 또는 그의 실질적인 공급원으로부터 수득된 경우 결합되어 있는 1 종 이상의 오염 핵산으로부터 확인 및 분리된 핵산 서열을 의미한다. 단리된 핵산은 천연에서 발견되는 것과는 다른 형태 또는 세팅으로 존재하는 핵산이다. 대조적으로, 단리되지 않은 핵산은 천연에서 존재하는 상태로 발견되는 DNA 및 RNA와 같은 핵산이다. 예를 들어, 소정의 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 인접 유전자 근처의 숙주 세포 염색체상에서 발견되며, 특정 단백질을 코딩하는 특정 mRNA 서열과 같은 RNA 서열은 세포내에서 다수의 단백질을 코딩하는 많은 다른 mRNA와의 혼합물로 발견된다. 그러나, 예컨대 서열 1을 포함하는 단리된 핵산 서열은 통상적으로 서열 1을 함유하는 세포내에 상기 핵산 서열을 포함하며, 이 때 핵산 서열은 천연상태의 세포와는 다른 염색체 또는 염색체외 위치에 존재하거나, 천연상태의 것과 상이한 핵산 서열의 측면에 위치한다. 단리된 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 서열이 단백질 발현에 이용되는 경우, 핵산 서열은 (최소한) 적어도 센스 또는 코딩 가닥의 일부분을 포함할 것이다 (즉, 핵산 서열은 단일 가닥일 수 있음). 별법으로, 핵산 서열은 센스 및 안티-센스 가닥을 모두 포함할 수도 있다 (즉, 핵산 서열은 이중 가닥일 수 있음).
본 명세서에서 사용된 "정제된"이란 용어는, 천연 환경으로부터 단리 또는 분리되어 제거된 핵산 또는 아미노산 서열 분자를 나타낸다. 따라서, "단리된 핵산 서열"이란 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된" 분자는 천연적으로 결합된 다른 성분들이 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 없다.
"재조합체"란 용어는 분자 생물학 기술을 이용하여 함께 조립된 DNA 단편들로 이루어진 DNA 서열을 나타낸다. "재조합체"란 용어는 폴리펩티드 서열의 경우에재조합 DNA 서열을 사용하여 발현되는 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, "벡터" 및 "비히클"은 모두 DNA 단편(들)을 세포로부터 한 다른 세포로 운반하는 핵산 분자를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 "발현 벡터"란 용어는 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 기관내에서 작동가능하게 결합된 코딩 서열을 발현시키는 데 필요한 적절한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 나타낸다. 원핵생물내 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 임의로 작동 서열, 리보솜 결합 부위 및 임의로 다른 서열을 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인헨서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
"트랜스제닉"이란 용어는 세포와 관련되는 경우에, 트랜스진을 함유하거나, 또는 트랜스진의 도입에 의해 게놈이 변형된 세포를 나타낸다. "트랜스제닉"이란 용어는 조직 또는 동물과 관련된 경우에, 각각 트랜스진을 함유하거나, 트랜스진의 도입에 의해 게놈이 변경된 1 개 이상의 세포를 포함하는 조직 또는 동물을 나타낸다. 트랜스제닉 세포, 조직 및 동물은 핵산 (일반적으로 DNA)을 포함하는 인간 중재에 의해 "트랜스진"을 표적 세포내로 도입하거나 표적 세포의 염색체로 트랜스진을 삽입하는 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
"비인간 동물"이란 인간이 아닌 설치류, 비인간 영장류, 양, 소, 반추 동물, 토끼, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 조류 등과 같은 척추 동물을 포함하는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직한 비인간 동물은 로덴티아(Rodentia)목중에서 선택된다."로덴티아목"이란 용어는 설치류, 즉 뮤리대(Muridae)족 (예컨대, 래트 및 마우스), 가장 바람직하게는 마우스를 포함하는 태반 포유류(유쓰리아(Euthria) 클래스)를 나타낸다.
"목적하는 뉴클레오티드 서열"이란 용어는 당업계의 일반적인 숙련자에 의해 임의의 동기(예컨대, 질병 치료, 품질 개선 등)를 위해 조작이 바람직한 것으로 여겨지는 임의의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이러한 뉴클레오티드 서열은, 구조 유전자의 코딩 서열(예컨대, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 종양발생유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등), 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 코딩하지 않는 비코딩 조절 서열 (예컨대, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 인헨서 서열 등)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상보성" 또는 "상보적"이란 용어는 염기 짝짓기 규칙과 관련된 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용된다. 예컨대, 서열 5'-AGT-3'은 서열 5'-ACT-3'에 상보적이다. 상보성은 "부분적" 또는 "완전한"일 수 있다. "부분적" 상보성의 경우에는 1 개 이상의 핵산 염기가 염기 짝짓기 규칙에 따라 매칭되지 않는다. 핵산간의 "완전한" 또는 "부분적" 상보성의 경우에, 각각 및 모든 핵산 염기가 다른 염기와 염기 짝짓기 규칙에 따라 매칭된다. 핵산 가닥간의 상보도는 핵산 가닥간의 혼성화 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 명세서에 사용된, 핵산 서열의 "상보체"란 그의 핵산이 핵산 서열의 핵산에 대해 완전한 상보성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
"상동성"이란 용어는 핵산과 관련하여 사용되는 경우에, 상보도를 나타낸다.부분적 상동성(즉, 부분적 동일) 또는 완전한 상동성(즉, 완전한 동일)일 수 있다. 부분적 상보성인 서열이란, 완전 상보 서열이 표적 핵산 서열과 완전히 혼성화되는 것을 적어도 부분적으로 저해하는 것을 나타내며, "실질적으로 상동성"이란 기능적 용어를 사용하여 나타낸다. 완전 상보 서열의 표적 서열과의 혼성화 억제는 혼성화 분석법(서던 또는 노던 블롯, 용액 혼성화 등)을 사용하여 저엄격도의 조건하에 측정할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브(즉, 다른 목적하는 올리고뉴클리오티드와 혼성화될 수 있는 올리고뉴클리오타이드)는 결합(즉, 혼성화)에 대해 경쟁하거나 이를 저해한다. 이는 저엄격도의 조건이 비특정 결합을 허용한다는 것을 말하고자 함이 아니며, 저엄격도의 조건은 두 서열이 서로 결합하는 경우에 특정한(즉, 선택적) 상호 작용일 것을 요구한다는 것이다. 비특정 결합의 부재는, 부분적 상보성조차도 없는(즉, 약 30% 미만의 동일성) 제2의 표적 세포를 사용함으로써 시험할 수 있으며, 비특정 결합이 존재하지 않으면 프로브는 제2의 비상보적 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
"실질적으로 상동성"이란 용어는, cDNA 또는 게놈 클론과 같은 이중 가닥 핵산 서열과 관련되어 사용되는 경우, 하기에 기재된 저엄격도의 조건하에 이중 가닥 핵산 서열의 어느 한 쪽 또는 양 쪽 모두의 가닥과 혼성화될 수 있는 임의의 프로브를 나타낸다.
"실질적으로 상동성"이란 용어는, 단일 가닥 핵산 서열과 관련되어 사용되는 경우, 하기에 기재된 저엄격도의 조건하에 단일 가닥 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 임의의 프로브를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "혼성화"란 용어는 "핵산의 가닥이 염기 짝짓기를 통해 상보적 가닥과 결합하는 임의의 방법"을 포함한다 [Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY]. 혼성화 및 혼성화의 강도 (즉, 핵산간의 결합 강도)는 핵산간의 상보도, 관련된 조건의 엄격도, 형성된 하이브리드의 Tm, 및 핵산내 G:C 비율과 같은 인자에 의해 영향을 받는다.
본 명세서에 사용된 "Tm"이란 용어는 "융점"과 관련하여 사용된다. 이 융점이란 이중 가닥 핵산 분자의 군집의 절반이 단일 가닥으로 해리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 수학식은 당업계에 잘 알려져 있다. 표준 참고 문헌에 기재된 바와 같이, Tm값의 간단한 계산은 하기의 수학식 1에 의해 계산될 수 있으며, 이 때 핵산은 1 M NaCl의 수용액중에 존재한다 (앤더슨(Anderson) 및 영(Young)의 문헌[Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 다른 참고 문헌은 Tm계산에 있어서 서열 특성 뿐만 아니라 구조적 특성을 고려하는 더욱 정교한 계산을 포함한다.
핵산 혼성화와 관련하여 사용되는 저엄격도 조건은 약 100 내지 약 1000개의 뉴클레오티드 길이의 DNA 프로브를 사용하는 경우, 5 ×SSPE (43.8 g/ℓNaCl, 6.9 g/ℓNaH2PO4H2O 및 1.85 g/ℓEDTA, NaOH를 이용하여 pH 7.4로 조정), 1% SDS, 5 ×덴하트 (Denhardt) 시약 [50 ×덴하트 시약은 500 ㎖ 당 Ficoll (Type 400, 파마시아 (Pharmacia)), BSA (Fraction V, 시그마(Sigma))] 및 100 μg/㎖ 변성된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 68℃에서 결합 또는 혼성화한 후 실온에서 0.2 ×SSPE 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 세척하는 조건과 동등한 조건을 포함한다.
핵산 혼성화와 관련하여 사용되는 고엄격도 조건은 약 100 내지 약 1000개의 뉴클레오티드 길이의 DNA 프로브를 사용하는 경우, 5 ×SSPE, 1% SDS, 5 ×덴하트 시약 및 100 μg/㎖ 변성된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에 68℃에서 결합 또는 혼성화한 후 68℃에서 0.1 ×SSPE 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 세척하는 조건과 동등한 조건을 포함한다.
혼성화 조건과 관련한 용어 "동등한"은 목적하는 혼성화 조건에 관한 것일 때 혼성화 조건 및 목적하는 혼성화 조건은 동일한 상동성 (%) 범위를 갖는 핵산 서열을 혼성화시킨다는 것을 의미한다. 예를 들면, 목적하는 혼성화 조건에서 제1 핵산 서열이 제1 핵산 서열과 50% 내지 70%의 상동성을 갖는 다른 핵산 서열과 혼성화하고, 또다른 조건에서도 제1 핵산 서열이 제1 핵산 서열과 50% 내지 70%의 상동성을 갖는 다른 핵산 서열과 혼성화하는 경우, 또다른 혼성화 조건이 목적하는 혼성화 조건과 동등하다고 말한다.
핵산 혼성화와 관련하여 사용하는 경우, 저엄격도 또는 고엄격도 조건을 포함하는 수많은 동등한 조건이 사용될 수 있으며, 인자, 예를 들어 프로브의 길이 및 특성 (DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 특성 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액중의 존재 또는 고정화 여부 등) 및 염 및 다른 성분 (예, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 여부)의 농도를 고려하고, 혼성화 용액을 상기한 조건과는 상이하지만 동등한 저엄격도 또는 고엄격도 혼성화 조건을 갖도록 변화시킬 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
당업자는 고엄격도일수록 서열 1 또는 서열 3의 뉴클레오티드 서열과 다른 핵산 서열의 비특이적 결합을 감소시키거나 제거하는데 바람직할 수 있는 반면, 저엄격도일수록 서열 1 및 서열 3의 뉴클레오티드 서열과 상이한 상동성을 갖는 더 많은 핵산 서열을 검출하는데 바람직할 수 있다는 것을 안다.
본원의 용어 "조절 요소" 및 "조절 서열"은 상호 교환적으로 RNA 또는 단백질을 코딩하지 않으면서 핵산 서열의 발현 수준을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소에는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종료 신호 등이 있다. 반면, 용어 "조절 유전자"는 다른 유전자 발현을 조절하는 RNA 또는 단백질 (e. g., 전사 인자)을 코딩하는 DNA 서열을 의미한다.
조절 요소는 조직 특이적이거나 세포 특이적이다. 용어 "조직 특이적"은 조절 요소에 사용될 때, 특정 조직형 (예, 간)에서 목적하는 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 발현시킬 수 있지만, 상이한 조직형 (예, 폐)에서는 목적하는 동일한 뉴클레오티드 서열을 상대적으로 발현시키지 않는 조절 요소를 의미한다.
조절 요소의 조직 특이성은 예를 들어 프로모터 서열 (비-조직 특이적) 및 조절 요소에 리포터 유전자를 연결하여 리포터 구조물을 제조하는 단계, 리포터 구조물을 동물 게놈에 도입하여 리포터 구조물을 생성된 트랜스제닉 동물의 모든 조직에 혼입시키는 단계, 및 트랜스제닉 동물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출 (예, mRNA, 단백질, 또는 리포터 유전자가 코딩하는 단백질 활성을 검출)하는 단계에 의해 평가할 수 있다. 다른 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준에 비해 1 종류 이상의 조직에서 리포터 유전자가 더 높은 수준으로 검출되었다는 것은 조절 서열이 더 높은 발현 수준이 검출된 조직에서 "특이적"이라는 것을 나타낸다. 따라서, 본원의 "조직 특이적" (예, 간 특이적)은 발현의 절대적인 특이성을 요구하지 않는 상대적인 용어이다. 즉, "조직 특이적"은 조직에서 매우 높은 수준으로 발현되는 것과 전혀 발현되지 않는 것을 요구하지 않는다. 한 조직에서 다른 조직에서보다 더 많이 발현되는 것으로 충분하다. 대조적으로, "엄격" 또는 "절대적인" 조직 특이적 발현은 다른 조직에서 전혀 발현되지 않고 단일 조직형 (예, 간)에서만 발현되는 것을 의미한다.
조절 요소에 사용되는 용어 "세포형 특이적"은 동일한 조직 내의 상이한 세포형에서 목적하는 뉴클레오티드 서열을 상대적으로 발현하지 않는 특정 세포형에서 목적하는 동일한 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 발현시킬 수 있는 조절 요소를 의미한다. 또한, 조절 요소에 사용되는 용어 "세포형 특이적"은 단일 조직 내 부위에서 목적하는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진할 수 있는 조절 요소를 의미한다.
조절 요소의 세포형 특이성은 공지된 기술 예를 들어 면역조직화학적 염색법 및(또는) 노던 블롯 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 간략하게, 면역조직화학적 염색의 경우, 조직 절편을 파라핀에 함몰시키고, 파라핀 절편을 조절 요소에 의해발현이 조절되는 목적하는 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 폴리펩티드 산물에 특이적인 1차 항체와 반응시킨다. 1차 항체에 특이적인 표지된 (예, 퍼옥시다제 접합된) 2차 항체를 절편 조직과 결합시키고, 특정 결합 (예, 아빈딘/비오틴과의 결합)을 현미경으로 검출한다. 간략하게, 노던 블롯 분석의 경우, RNA를 세포중에서 단리하여 아가로스 겔에서 전기영동하여 크기에 따라 RNA를 분리시킨 후 RNA를 겔에서 고상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나이론 막으로 이동시킨다. 이어서, 고정시킨 RNA를 표지된 올리고-데옥시리보뉴클레오티드 프로브 또는 DNA 프로브로 프로빙하여 사용한 프로브와 상보성인 RNA 종류를 검출한다. 노던 블롯은 분자 생물학의 표준 기술이다.
본원의 용어 "프로모터," "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"은 목적하는 뉴클레오티드 서열과 라이게이션된 경우 목적하는 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 nRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.
프로모터는 구성적이거나 조절가능하다. 프로모터와 관려하여 사용되는 용어 "구성적"은 프로모터가 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 반면, "조절가능한" 프로모터는 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등)이 존재하는 경우 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극없는 경우와는 구별되게 지시할 수 있는 프로모터이다.
용어 "..로 필수적으로 이루어진" 및 "필수적으로 ..로 이루어진"은 동일한 용어이며, 핵산 서열과 관련하여 핵산 서열 내에 존재하는 핵산 염기의 50% 내지 100%를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 내의 상기 핵산 염기 사이의 배열은 핵산 서열과 동일하고, 핵산 서열의 생물학적 활성은 핵산 서열의 생물학적 활성의 50% 내지 100, 보다 바람직하게는 75% 내지 100%, 가장 바람직하게는 90% 내지 100%를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예시적으로, 용어 "필수적으로 서열 1로 이루어진 핵산 서열은 서열 1에 존재하는 핵산 염기의 50% 내지 100%를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 내의 상기 핵산 염기 사이의 배열은 서열 1과 동일하고, 뉴클레오티드 서열이 서열 1의 연령 관련 조절 활성 및 (또는) 간 특이적 활성의 50% 내지 100%, 보다 바람직하게는 75% 내지 100%, 가장 바람직하게는 90% 내지 100%를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
도 8의 hFIX 유전자에서 유래된 뉴클레오티드 서열의 "기능적 상동체"는 hFIX 유래 뉴클레오티드 서열 (도 8의 hFIX 서열의 전체 또는 일부분)과 50% 초과 100% 미만의 동일성을 가지며, 연령 관련 조절 활성 및(또는) 간 특이적 활성을 갖는 갖는 핵산 서열로 정의된다. 예를 들면, 서열 33의 기능적 상동체는 서열 33과 과 50% 초과 100% 미만의 동일성을 가지며, 연령 관련 조절 활성 및(또는) 간 특이적 활성을 갖는 핵산 서열로 정의된다.
도 14의 hPC 서열에서 유래된 뉴클레오티드 서열의 "기능적 상동체"는 hPC 유래 뉴클레오티드 서열 (도 14의 hPC 서열의 전체 또는 일부분)과 50% 초과 100%미만의 동일성을 가지며, 연령 관련 조절 활성 및(또는) 조절 활성을 갖는 핵산 서열로 정의된다. 예를 들면, 서열 93의 기능적 상동체는 서열 93과 50%이상 100% 미만의 동일성을 가지며, 연령 관련 조절 활성 및(또는) 조절 활성을 갖는 핵산 서열로 정의된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 연령 관련 방식으로 조절하는 핵산 서열을 제공한다. 더욱 구체적으로, 예시적인 연령-조절 요소 5' (age-regulatory element 5', AE5')는 생체내에서 시간에 따른 유전자 발현이 안정하도록 조절하는 것으로 밝혀진 반면, 예시적인 연령-조절 요소 3' (AE3')는 생체내에서 시간에 따라 유전자 발현이 증가하도록 조절하는 것으로 밝혀졌다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 유전자의 간 특이적 발현을 지시하는 핵산 서열 (예를 들면, AE5')을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연령 관련 방식 및(또는) 간 특이적 방식으로 발현하는, 본원에서 제공되는 핵산 서열을 함유하는 트랜스제닉 동물을 제공한다. 본원에서 제공되는 핵산 서열은 예를 들어, AE5' 및 AE3'의 기능적 상동체를 확인 및 단리하고, AE5' 및 AE3'의 적어도 일부분을 증폭시키는데 유용하다. 중요한 것은, 본 발명의 핵산 서열이 동물의 목적하는 뉴클레오티드 서열의 연령 관련 발현 및(또는) 간 특이적 발현에도 유용하여 유전자 요법 및 동물에서의 인자 IX의 발현 감소에 유용하다는 점이다.
인간의 인자 IX 유전자로부터 유래된 조절 서열 (예를 들면, AE5', AE3', 및 AE3") 뿐 아니라, 본 발명은 인간 단백질 C (hPC) 유전자로부터 유래되고, 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성에 의해 특징지어지는 서열을 추가로 제공한다.
본 발명은 다음의 항목에서 추가로 논의된다.
(A) 조절 핵산 서열,
(B) 프로브를 이용한, AE5' 상동체, AE3' 상동체 및 hPC로부터 유래된 조절 서열 상동체의 확인 및 단리,
(C) 프라이머를 이용한, AE5' 및 AE3'의 적어도 일부분의 증폭, 및 hPC로부터 유래된 조절 서열의 적어도 일부분의 증폭,
(D) 유전자 발현의 조절 방법,
(E) 유전자 요법, 및
(F) 동물에서의 인자 IX의 발현 감소
A. 조절 핵산 서열
본 발명은 hFIX 및 hPC 유전자로부터 유래된 조절 서열을 제공한다.
i. hFIX 유전자로부터의 조절 핵산 서열
본 발명의 조절 핵산 서열 및 유전자 발현 조절에 관한 이들의 놀라운 특성은 본 발명자들이 혈액 응고에 관여하는 인간 인자 IX에 의한 연령 관련 조절에 대한 기본적인 메카니즘을 조사하는 동안 발견되었다. 혈액 응고는 항상성에서 뿐 아니라, 많은 생리적 및 병리적 상태에서도 중대한 역할을 한다 [Saito in Disorders of Hemostasis, O.D.Ratnoff and C.D.Forbes, Eds., Sauders,Philadelphia, ed. 2 (1991), pp.18-47; Kurachi et al. (1993) Blood Coagul. Fibrinol. 4:953-974]. 인간 및 다른 포유동물에서의 혈액 응고 잠재성은 젖을 뗄 무렵 즈음에는 청소년 수준에 다다르게 된다 [Yao et al. (1991) Thromb. Haemost. 65:52-58; Andrew et al. (1992) Blood 80:1998-2005; Andrew et al. Blood (1987) 70:165-172; Andrew et al. (1988) Blood 72:1651-1657]. 이후, 상기 응고 잠재성은 청소년기 동안 점차 증가하여 노년에 이르면 거의 2 배로 증가한다 [Sweeney and Hoernig (1993) Am. J. Clin. Pathol. 99:687-688; Kurachi et al. (1996) Thromb. Haemost. 76:965-969]. 응고 잠재성의 이러한 연령 관련 증가는 건강한 개인들에서 일어나며 [Marie et al. (1995) Blood 85:3144-3149], 이는 이러한 증가가 연령과 관련된 정상적인 현상임을 나타낸다.
본 발명자들은 응고 잠재성의 이러한 증가가 심혈관 장애 및 혈전성 장애 등과 같은 연령 관련 질환의 발병 및 진행에 지대한 기여를 할 수 있다고 생각한다 [Conlan et al. (1993) The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study 70:380-385; Balleisen et al. (1985) Thromb. Haemost. 54:475-479; Rode et al. (1996) Nat. Med. 2:293-298; Woodward et al. (1997) Brit. J. Haemat. 97:785-797]. 본 발명자들의 이러한 생각은 혈액 응고 잠재성에서의 이러한 증가가 인자 IX 등과 같은 응혈촉진성 인자의 혈장 수준 증가와는 부합되지만, 항-응고 인자 (예를 들면, 항트롬빈 III 및 단백질 C) 또는 섬유소용해에 관여하는 인자들의 혈장 수준에는 단지 미약한 영향만을 미친다는 관찰 결과 [Conlan et al. (1994) The Atherosclerosis Risk in Committees (ARIC) Study 72:551-556; Lowe et al.(1997) Brit. J. Haemat. 97:775-784]에 근거한다. 이러한 사실은 본 발명자들에게 연령이 증가함에 따라 혈액 응고 활성이 증가한다는 관찰 결과가, 조절되는 사건에 기인한다는 것을 강하게 암시했다. 혈액 응고, 섬유소용해 및 이의 조절 시스템에 관여하는 단백질 인자 각각의 혈장 수준은 많은 관여 과정들의 균형에 의해 결정된다고 추정할 수 있다. 현재, 연령이 증가함에 따라 혈액 응고 활성이 증가하는 이유, 또는 혈액 응고의 연령-의존성 조절 (항상성)에 관여하는 분자 메카니즘이 무엇인지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다 [Finch in Longevity, Senescence, and the Genome, The University of Chicago Press, Chicago, 1990].
혈액 응고 인자 IX (FIX)는 혈액 응고 캐스캐이드 중 내인성 경로와 외인성 경로가 합쳐지는 위치에서 핵심적인 입지를 차지한다 [Saito in Disorders of Hemostasis, O.D.Ratnoff and C.D.Forbes, Eds., Sauders, Philadelphia, ed. 2 (1991), pp.18-47; Kurachi et al. (1993) Blood Coagul. Fibrinol. 4:953-974]. FIX는 간에서 합성되고 엄격한 조직-특이성이 있으며, FIX의 결핍은 출혈 장애 혈우병 B를 초래한다. 정상적인 인간에서, 인간 FIX (hFIX)의 혈장 활성 및 단백질 농도는 연령이 증가함에 따라 증가한다 [Sweeney and Hoernig (1993) Am. J. Clin. Pathol. 99:687-688; Kurachi et al. (1996) Thromb. Haemost. 76:965-969]. 또한, 마우스 FIX (mFIX)의 혈장 활성도 hFIX와 유사한 방식으로 연령에 따라 증가하고, 간에서의 mFIX 메신저 RNA (mRNA) 농도 증가와 직접적인 상관관계가 있다 [Sweeney and Hoernig (1993) Am. J. Clin. Pathol. 99:687-688; Kurachi et al. (1996) Thromb. Haemost. 76:965-969]. 그러나 이 외에는, 상기 증가에 관한 기본적인 분자 메카니즘에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다. hFIX의 연령 관련 조절을 담당하는 기본적인 분자 메카니즘을 조사하여, 본 발명자들은 hFIX 유전자의 연령 관련 발현을 조절하고, 이의 간 특이적 발현을 지시하는 뉴클레오티드 서열을 밝혀냈다.
본 발명의 서열은 부분적으로는, 본 발명자들이 hFIX 프로모터를 통상적으로 사용되는 리포터 단백질에 대한 코딩 서열이 아니라 hFIX 코딩 서열과 조합하여 사용했기 때문에 발견될 수 있었다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열의 놀라운 기능 역시, 본 발명자들이 시험관내 분석이 아니라 장기적인 생체내 분석을 했기 때문에 가능한 것이었다. 구체적으로, 본 발명자들의 초기 연구에서는 인자 IX 프로모터에 이종인 리포터 유전자 (예를 들면, 세균성 β-갈락토시다제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 [CAT])가 사용되었다. 이러한 초기 연구에서, 인자 IX 프로모터는 아주 약한 시험관내 발현 활성만을 나타냈다 [Kurachi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:5276-5281]. 이러한 이종 리포터 유전자의 사용으로는 동물에서의 트랜스진 발현에 관한 장기적인 분석을 신뢰성있고 정량적으로 수행하기가 불가능했다. 우연히도, 본 발명자들은 hFIX 프로모터를 함유하는 hFIX 미니유전자 (minigene) 발현 벡터 및 이의 상동성 hFIX 유전자를 사용하면, 생체내 혈장 hFIX를 고농도로 생성할 수 있다는 것을 알아냈다. 이러한 예기치못한 관찰은 신뢰할 수 있는 동물 분석 시스템을 제공함으로써 hFIX 프로모터에 이종인 유전자의 사용과 관련된 의문점들을 해결했을 뿐 아니라, 예시적인 hFIX 유전자의 안정성 및 연령 관련 발현 증가를 조절하는 뉴클레오티드 서열의 결정 등을 포함하는, hFIX 유전자의 조절 메카니즘에 대해 예기치못한 중대한 사실들에 대한 통찰력을 제공했다.
본 발명은 AE5'의 32 개 뉴클레오티드 핵산 서열 5'-agccatt cagtcgagga aggatagggt ggtat-3' (서열 1)을 제공하며, 이는 젠뱅크 (GenBank)에 기탁번호 K02402로 기탁된 hFIX 유전자의 서열 2164 내지 2195에 상응하고, 아데닌을 위치 +30으로 표시한 hFIX 개시 코돈 (ATG)에 관한 경우에는 도 8의 서열 -802 내지 -771에 상응한다.
또한, 본 발명은 AE3'의 1273 개 뉴클레오티드 핵산 서열 (서열 3) (도 13)을 제공하며, 이는 젠뱅크 기탁번호 K02402의 서열 34,383 내지 35,655에 상응하고, 아데닌을 위치 +30으로 표시한 hFIX 개시 코돈 (ATG)에 관한 경우에는 도 8의 서열 31,418 내지 32,690에 상응한다.
핵산 서열과 관련한 용어 "연령 관련 조절 활성" 및 "연령 관련 활성"이란, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 목적하는 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사 수준 및(또는) 이것이 코딩하는 폴리펩티드의 합성 수준을 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열이 없는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 경우의 mRNA로의 전사 수준과 비교될 만큼 연령 관련 방식 (예를 들면, 어느 정도 기간의 시간에 걸쳐 증가함)으로 변경하는 핵산 서열의 능력을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "연령 조절 서열"은 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열을 지칭한다.
목적하는 유전자의 발현 수준이 어느 정도 기간의 시간에 걸쳐 감소하는 경우의 예를 들었지만, 어떤 서열이 목적하는 유전자에 작동가능하게 연결된 경우의발현 수준을 상기 핵산 서열이 없는 경우에서와 비교할 때, (a) 동일한 기간의 시간에 걸친 발현 수준 감소 비율이 더 적거나, (b) 동일한 기간의 시간에 걸친 발현 수준이 비교적 일정했거나 (즉, 발현 수준이 변하지 않았거나), 또는 (c) 동일한 기간의 시간에 걸친 발현 수준이 증가한 경우, 이 핵산 서열은 연령 관련 조절 활성이 있다고 일컬어진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된", "작동가능한 조합으로", 및 "작동가능한 순서로"란, 핵산 서열들이 이들의 의도된 기능을 수행하도록 연결된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 서열을 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 프로모터 서열이 목적하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성을 지시할 수 있게 하는 방식으로 프로모터 서열과 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 의미한다. 유사하게, 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열을 프로모터 서열 및 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열이 어느 정도 기간의 시간에 걸쳐 목적하는 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사 수준 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성 수준을 변경시킬 수 있게 하는 방식으로 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열, 프로모터 서열 및 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 교시되는 후보 핵산 서열의 연령 관련 조절 활성 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 본원에서 개시한 방법들로 예를 들었다. 예를 들어,후보 핵산 서열이 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열의 상류 또는 하류에 연결되도록 시험 벡터를 제작했다 (예를 들면, 실시예 1). 또한, 시험 벡터와 유사하지만 후보 핵산 서열이 없는 대조구 벡터도 제작했다. 시험 벡터 및 대조구 벡터를 별개의 숙주 세포에 도입시켰다. 숙주 세포 (예를 들면, 수정란)는 트랜스제닉 다세포 생물, 예를 들면 트랜스제닉 마우스를 생성할 수 있는 것이어서 (예를 들면, 실시예 3), 트랜스제닉 다세포 생물이 생성되는 것이 바람직하다. 어느 정도 기간의 시간에 걸쳐 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 발현에 관한 장기적인 분석 (예를 들면, 노던 블롯팅 혼성화에 의한 분석)을 트랜스제닉 다세포 생물의 파운더 (founder) 및 다음 세대들의 일생에 걸쳐 수행 (예를 들면, 실시예 3)하는 것이 바람직하다. 시험 벡터를 함유하는 트랜스제닉 동물의 임의의 조직에서, 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 및(또는) 단백질 수준의 검출값이 대조구 벡터를 함유하는 트랜스제닉 동물에서의 경우에 비해 1 회 이상의 시점에서 더 높다면, 이는 상기 후보 핵산 서열에 연령 관련 조절 활성이 있음을 나타낸다.
예를 들어, 본원에서는 트랜스제닉 동물이 AE5' (서열 1)가 없는 벡터를 함유하는 경우에는 그 트랜스제닉 동물의 일생에 걸친 상이한 시점에서 hFIX mRNA 수준이 감소 (도 2A 및 2E)되지만, AE5'가 있는 벡터를 함유하는 경우에는 AE5'가 hFIX mRNA를 안정화시켜 hFIX mRNA 수준이 일생동안 본질적으로 변화하지 않는다 (도 4, A, C 및 E)는 점에서 AE5' 단독이 연령 관련 조절 활성을 갖는다는 놀라운 결과를 증명했다. AE5'가 발현 구조물의 프로모터 서열의 상류에 존재하는지 (도4A) 또는 하류에 존재하는지 (도 4E) 여부와는 상관없이, AE5'는 연령 관련 조절 활성을 가짐이 관찰되었다.
또한, 본원에서 제공되는 데이타는 트랜스제닉 동물이 AE3' (서열 3)가 있는 벡터를 함유하는 경우 (도 2A)에는 그 트랜스제닉 동물의 일생에 걸친 여러 시점에서의 hFIX mRNA 수준이 AE3'가 없는 벡터를 함유하는 경우에 비해 증가된다 (도 2B)는 점에서, AE3' 단독이 연령 관련 조절 활성을 갖는다는 예기치못한 결과를 증명했다. AE3'는 정상 상태의 hFIX mRNA 수준을 실질적으로 증가시켰다 (도 5). AE3'가 시험관내 hFIX 생성에 관해서는 약한 하향 조절 효과를 보였기 때문에 생체내에서 관찰된 이러한 결과는 조금 놀라운 것이었다. 이러한 결과는 AE3'가 순환계내 hFIX 단백질 수준 증가와 직접적인 상관관계가 있는 hFIX mRNA 안정성을 증가시키는 기능을 한다는 것을 암시하는데, 이는 본 발명을 어느 특정 메카니즘에 한정시키려는 것은 아니다. 본 발명자들은 AE3'의 연령 관련 조절 활성이 3' UTR 내에 존재하는, sl 구조 형성 디뉴클레오티드 반복부의 존재에 기인한다고 생각하지만, 이 또한 본 발명을 어느 특정 이론에 한정시키려는 의도는 아니다; sl 영역은 도 8의 뉴클레오티드 32,141 내지 32,243의 103 bp 서열 (서열 61)이다. 이러한 생각은 각종 유전자의 3' UTR의 (AT)n등과 같은 디뉴클레오티드 반복부가 특이적 단백질에 결합한 직후에는 mRNA 안정성을 대개는 덜 안정한 상태로 조정하는 것으로 알려진 sl 구조 [Ross (1995) Microbiol. Rev. 59:423-450]를 mRNA 중에서 형성할 수 있다는 본 발명자들의 관찰 결과에 근거한다.
중요한 것은, AE5' 및 AE3'가 함께 있는 벡터를 함유하는 트랜스제닉 동물에서의 hFIX mRNA 수준을 AE5' 및 AE3'가 모두 없는 벡터를 함유하는 트랜스제닉 동물에서와 비교할 때, AE5' 및 AE3'가 함께 있는 경우가 트랜스제닉 동물의 일생에 걸쳐 시험한 각 시점에서 더욱 높게 나타났을 뿐 아니라 (도 4B 및 D), 트랜스제닉 마우스에서 인간 FIX mRNA의 증가 수준 프로파일이 야생형 마우스의 연령 증가에 따른 마우스 FIX mRNA의 증가 수준 프로파일을 반복하는 것으로 나타나 AE5'와 AE3'의 놀라운 상승 작용을 본 발명이 증명했다는 점이다.
또한, 본원에 제시한 데이타는 AE5' 단독, AE3' 단독, 및 AE5'와 AE3' 조합체의 연령 관련 조절 활성이 이들을 함유하는 트랜스진의 발현 수준, 트랜스제닉 동물의 성(性), 세대 또는 접합 상태와는 무관함을 증명했다.
본 발명은 서열 1 및 3에 제한되는 것이 아니라, 본질적으로 이들의 일부분들까지 고려하고 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열과 관련한 용어 "일부분"이란, 그 서열의 단편을 지칭한다. 상기 단편은 5 개의 접촉 뉴클레오티드 잔기 내지 전체 핵산 서열에서 핵산 잔기 1 개를 뺀 크기일 수 있다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열의 "적어도 일부분"을 포함하는 핵산 서열에는 5 개의 접촉 뉴클레오티드 잔기 내지 전체 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 범위에 속하는 것으로 고려되는 서열 1의 일부분에는 젠뱅크 기탁 번호 K02402의 서열 2176 내지 2182에 상응하고, 아데닌을 위치 +30으로 표시한 hFIX 개시 코돈 (ATG)에 관한 경우에는 젠뱅크 기탁 번호 K02402의 서열 -790 내지 -784에 상응하는 폴리오마바이러스 인핸스 활성자 3(polyomavirusenhanceractivator 3) (PEA-3) (5'-GAGGAAG-3') (서열 2)의 7 개 뉴클레오티드 핵산 서열 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 처음에는, 본 발명의 PEA-3 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열 [5'-CAGGAAG-3' (서열 40)]이 폴리오마 바이러스 인핸서로서 당업계에 보고되었고, 여러 조직에 있는 각종 유전자 (예를 들면, 콜라겐 유전자 및c-fos)의 발현 조절에 관여하는 것으로 보고되었다 [Martin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5839-5843; Xin et al. (1992) Genes ＆ Develop. 6:481-496; Chotteau-Lelievre et al. (1997) Oncogene 15:937-952; Gutman and Wasylyk (1990) EMBO J. 9:2241-2246]. 그러나, 본 발명의 PEA-3 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열에 결합하는 PEA-3 단백질 (또는 PEA-3 관련 단백질(들)) 서열이 간 특이적이거나 간에 풍부한 것으로 보고된 적은 없었다.
본 발명의 범위에 속하는 서열 1의 다른 일부분들에는 서열 33 [5'-tcgaggaagga-3'], 서열 34 [5'-agtcgaggaaggata-3'], 서열 35 [5'-tcagtcgaggaaggatagg-3'], 서열 36 [5'-attcagtcgaggaaggatagggt-3'], 서열 37 [5'-ccattcagtcgaggaaggatagggtgg-3'], 및 서열 38 [5'-gccattcagtcgaggaaggatagggtggta-3'] 등이 있으며, 이들 모두가 PEA-3 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 범위에 속하는 것으로 고려되는 서열 3의 일부분들에는 서열 51 [5'-TTATTTTATATATATAATATATATATAAAATA-3'], 서열 52 [5'-TATAATATA-3'], 서열 53 [5'-CAATATAAATATATAG-3'], 서열 54 [5'-TGTGTGTGTATGCGTGTGTGTAGACACACACGCATACACACATA-3'], 서열 51과 52의 조합체, 즉 서열 55 [5'-TTATTTTATATATATAATATATATATAAAATATATAATATA-3'], 서열 52과 53의 조합체, 즉, 서열 56 [5'-TATAATATACAATATAAATATATAG-3'], 서열 53과 54의 조합체, 즉, 서열 57 [5'-CAATATAAAT ATATAGTGTGTGTGTATGCGTGTGTGTAGACACACACGCATACACACATA-3'], 서열 51, 52, 53, 및 54의 조합체, 즉, 서열 58 [5'-TTATTTTATATATATAATATATATATAAAATATATAATATACAATATAAATATATAGTGTGTGTGTATGCGTGTGTGTAGACACACACGCATACACACATA-3'], 도 8의 뉴클레오티드 31,418 내지 32,140의 723 bp 서열 (서열 59), 도 8의 뉴클레오티드 32,244 내지 32,690의 447 bp 서열 (서열 60), 및 도 8의 뉴클레오티드 32,141 내지 32,243의 103 bp 서열 (서열 61) (즉 3' UTR의 sl 영역) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
연령 관련 조절 활성을 보이는 서열 1 및 3의 일부분들의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 결실 구조물 (예를 들면, 문헌 [Yang et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:891-897] 참조)을 사용하는 방법으로 결정할 수 있다. 간략하게, 서열 1 및 3의 내부 서열을 제한 효소로 결실시키거나, 서열 1 및 3의 5' 및(또는) 3' 말단을 제한 효소로 결실시키거나, PCR을 통해 서열 1 및 3에 1 개 핵산 염기 변화를 도입하거나, 또는 화학적 합성법으로 얻은 상이한 후보 뉴클레오티드 서열 및 프로모터의 조절을 받는 리포터 유전자를 함유하는 여러 발현 플라스미드들을 제작한다. 상이한 구조물들의 유전자 관련 조절 활성을 상기 기재한 바에 따라 측정하여 후보 뉴클레오티드 서열이 연령 관련 조절 활성을 보이는지 여부를 결정한다.
본 발명의 서열은 서열 1 및 3, 및 이들의 일부분들에 제한되는 것이 아니라 서열 1 및 3, 및 이들의 일부분들의 상동체도 포함한다. 서열 1 및 3, 및 이들의 일부분들의 상동체를 서열 1 및 3, 및 이들의 일부분들 각각과 비교할 때, 이들 상동체는 상이한 뉴클레오티드들 또는 뉴클레오티드 유사체가 결실, 삽입 또는 치환된 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 상동체들은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성할 수 있다.
서열 1의 "상동체"란, 서열 1과의 서열 동일성이 63％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다. 서열 1의 상동체의 예로는 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 66 (5'-acccatt cagtcgagga aggatagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,165의 G가 C로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 67 (5'-agccatt gagtcgagga aggatagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,171의 C가 G로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 68 (5'-agccatt cagacgagga aggatagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,171의 T가 A로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 69 (5'-agccatt cagtcgagga aggatagggt ggttt-3') 중 뉴클레오티드 2,194의 A가 T로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 70 (5'-agccatt cagtcgagga tcccaagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,186에서 시작하는 AGGGT가 TCCCA로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 71 (5'-agccatt cagtcgagga aggatagggcctaat-3') 중 뉴클레오티드 2,190에서 시작하는 TGGT가 CCTA로 대체된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 72 (5'-agaccatt cagtcgagga aggatagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,165 뒤에 A가 삽입된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 73 (5'-agccatt cagtcgagga aggatagcggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,187 뒤에 C가 삽입된 서열; 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 74 (5'-agccatt cagtcgagga aggataat-3') 중 뉴클레오티드 12,187에서 시작하는 GGGTGGT가 결실된 서열; 및 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 2,164 내지 2,195로부터의 서열 75 (5'-agccatt cgagga aggatagggt ggtat-3') 중 뉴클레오티드 2,171에서 시작하는 CAGT가 결실된 서열 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
서열 2의 "상동체"란, 서열 2와의 서열 동일성이 75％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다. 서열 2의 상동체의 예로는 GAGGATG (서열 39), CAGGAAG (서열 40), CAGGATG (서열 41), GTGGAAG (서열 62), GTGGATG (서열 63), CTGGAAG (서열 64), CTGGATG (서열 65), 및 CAGGAAG (서열 84) 등이 있다.
서열 3의 "상동체"란, 서열 3과의 서열 동일성이 60％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다. 서열 3의 상동체의 예로는 도 13에 나타낸 서열 76-83 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 서열 76은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 34,390의 C가 G로 대체된 서열이다. 서열 77은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 34,649의 T가 A로 대체된 서열이다. 서열 78은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 34,959에서 시작하는 GC가 CG 로 대체된 서열이다. 서열 79는 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 35,501에서 시작하는 CATG가 GTAC로 대체된 서열이다. 서열 80은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 34,681의 A뒤에 TT가 삽입된 서열이다. 서열 81은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 35,581의 C 뒤에 TGC가 삽입된 서열이다. 서열 82는 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 35,636의 A가 결실된 서열이다. 서열 83은 젠뱅크 기탁번호 k02402의 뉴클레오티드 서열 34,383 내지 35,655로부터의 서열 중 뉴클레오티드 34,383의 G가 결실된 서열이다.
서열 59의 "상동체"란, 서열 59와의 서열 동일성이 62％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다.
서열 60의 "상동체"란, 서열 60과의 서열 동일성이 60％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다.
서열 61의 "상동체"란, 서열 61과의 서열 동일성이 60％를 넘고 100％에는 못 미치는 뉴클레오티드 서열로 정의된다.
서열 1의 일부분의 상동체의 예로는 PEA-3 뉴클레오티드 서열 (서열 2)의 상동체가 있고, 이것의 예로는 GAGGATG (서열 39), CAGGAAG (서열 40), CAGGATG (서열 41), GTGGAAG (서열 62), GTGGATG (서열 63), CTGGAAG (서열 64), CTGGATG (서열 65), 및 CAGGAAG (서열 84) 등이 있다.
본 발명은 또한 서열 1, 서열 1의 일부분 (예, 서열 2 및 33 내지 38의 기능적 일부분), 및 서열 3의 일부분 (예, 서열 51 내지 61의 기능적 일부분)의 기능성 또는 기능적 상동체를 고려한다.
서열 1의 "기능적 상동체"는 서열 1과 63％ 초과 100％ 미만의 동일성을 가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다. 대안적으로, 서열 1의 기능적 상동체는 서열 1과 63％ 초과 100％ 미만의 동일성을 가지며 간 특이적 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2의 "기능적 상동체"는 서열 2와 75％ 초과 100％ 미만의 동일성을 가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다. 대안적으로, 서열 2의 기능적 상동체는 서열 2와 75％ 초과 100％ 미만의 동일성을 가지며 간 특이적 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 3의 "기능적 상동체"는 서열 3과 100％ 미만 60％ 초과의 동일성을 가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.
서열 59의 "기능적 상동체"는 서열 59와 100％ 미만 62％ 초과의 동일성을 가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.
서열 60의 "기능적 상동체"는 서열 60과 100％ 미만 60％ 초과의 동일성을가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.
서열 61의 "기능적 상동체"는 서열 61과 100％ 미만 60％ 초과의 동일성을 가지며 연령 관련 조절 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.
본 발명은 서열 1 및 3의 센스 분자로 한정되는 것이 아니며, 서열 1 및 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분 (예, 길이가 10 뉴클레오티드 염기 초과, 보다 바람직하게는 100 뉴클레오티드 염기 초과인 일부분)에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 분자도 본 발명의 범위 내로 고려된다. 이들 안티센스 분자는 예를 들어 서열 1 및 3에 의해 발현이 조절되는 유전자 (예, hFIX)의 발현을 감소 또는 억제시키는 데 용도가 있음이 발견되었다.
본 발명은 또한 AE3'의 바람직한 일부분인 뉴클레오티드 서열 AE3"를 제공한다. AE3" [5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'; (서열 93)]은 젠뱅크 기탁 번호 K02402의 35,075 내지 35,228의 154 뉴클레오티드 핵산 서열이며, 이는 아데닌이 위치 +30으로서 지정된 hFIX 시작 코돈 (ATG)과 관련이 있는 도 8의 32,110 내지 32,263의 서열에 상응한다. AE3"는 102-bp의 스템 루프 형성 서열 (서열 91)을 함유한다.
본원에 제시된 데이타는 AE3"가 연령 관련 방식으로 이종 hPC 유전자의 발현을 조절하는데 성공적으로 이용된다는 점에서 AE3'의 일부분의 조절 기능의 일반성을 입증한다. 특히, -1462hPCm1 구조물을 함유하는 트랜스제닉 동물은 인간 단백질 C를 연령 안정적 수준으로 발현시키고, 즉 트랜스제닉 동물의 수명 동안 상이한시점에서 인간 단백질 C를 비교적 일정한 수준으로 발현시킨다 (실시예 12, 도 17a). 완전 대조적으로, AE5' 및 AE3" 서열이 존재하면 시간에 따라 인간 단백질 C의 발현 수치가 증가된다 (도 17c). 이러한 결과는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 연령 관련 방식으로 조절하는데 있어서 AE3'의 AE3" 부분의 기능의 일반성을 확증시킨다.
본 발명은 또한 AE3"의 일부분들을 고려한다. 이들 일부분에는 서열 94 내지 144가 포함되나 이로 한정되는 것은 아니며, 여기서 서열 94는 5'-tgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 95는 5'-gggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 96은 5'-ggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 97은 5'-gg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 98은 5'-g gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 99는 5'-gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatatataaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 100은 5'-aaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 101은 5'-aaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 102는 5'-aagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 103은 5'-agtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 104는 5'-gtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 105는 5'-tttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 106은 5'-ttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 107은 5'-tc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtgtgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 108은 5'-c tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 109는 5'-tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 110은 5'-ttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 111은 5'-tcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 112는 5'-cagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 113은 5'-agagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 114는 5'-gagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 115는 5'-agag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 116은 5'-gag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatataatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 117은 5'-ag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 118은 5'-g ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 119는 5'-ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 120은 5'-taagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 121은 5'-aagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 122는 5'-agttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 123은 5'-gttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 124는 5'-ttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagccat-3'이고; 서열 125는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatataatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagcca-3'이고; 서열 126은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagcc-3'이고; 서열 127은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taagc-3'이고; 서열 128은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taag-3'이고; 서열 129는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa taa-3'이고; 서열 130은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa ta-3'이고; 서열 131은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa t-3'이고; 서열 132는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagcaa-3'이고; 서열 133은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatatataaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagca-3'이고; 서열 134는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaagc-3'이고; 서열 135는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaag-3'이고; 서열 136은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atggaa-3'이고; 서열 137은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atgga-3'이고; 서열 138은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atgg-3'이고; 서열 139는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata atg-3'이고; 서열 140은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata at-3'이고; 서열 141은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcatacacacatata a-3'이고; 서열 142는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatata-3'이고; 서열 143은 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacatat-3'이고; 서열 144는 5'-ttgggg gaaaagtttc tttcagagag ttaagttatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacata-3'이다.
특히 바람직한 실시양태에서, AE3' 및 AE3"의 일부분은 102 뉴클레오티드의 스템 루프 형성 서열인 5'-tatt ttatatatat aatatatata taaaatatat aatatacaat ataaatatat agtgtgtgtg tgtatgcgtg tgtgtagaca cacacgcata cacacata-3' (서열 91)이다. 스템 루프 서열은 도 8의 뉴클레오티드 32,142 내지 32,243에 위치하며, 이는 젠뱅크 기탁 번호 K02402의 뉴클레오티드 35,107 내지 35,208의 서열에 상응한다. 본 발명자들은 AE3' 및 AE3" 서열 중 본원에 기재된 102 뉴클레오티드의 스템 루프 형성 서열이 연령 조절 기능을 나타낸다고 믿는다.
서열 1 및 3의 뉴클레오티드 서열, 그들의 일부분, 상동체 및 안티센스 서열은 상업적으로 이용가능하고 당업계에 널리 공지된 합성 화학 기술에 의해 합성될 수 있다 [참조: Caruthers MH et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn T. et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232]. 또한, 서열 1 및 3의 단편은, 제한 효소를 서열 1 및 3에 처리한 다음 겔 전기영동에 의해 단편을 정제함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 서열은 또한 모두 본원의 참고문헌으로 포함되는 물리스 (Mullis)의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호에 기재된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 제조될 수 있다. 서열 1 및 3, 그들의 일부분, 상동체 및 안티센스 서열은 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 서로서로에 또는 이종 핵산 서열에 라이게이션시킬 수 있다.
합성된 서열의 뉴클레오티드 서열은, 시판되는 키트뿐 아니라, DNA 중합효소 I의 클레노우 (Klenow) 단편, 시쿼나제 (Sequenase, 등록상표),TaqDNA 중합효소, 또는 열안정성 T7 중합효소와 같은 효소를 이용하는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 모세관 전기영동 또한 핵산 합성, 제한 효소 절단 또는 PCR 증폭에 따른 산물의 크기를 분석하고 그 뉴클레오티드 서열을 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 서열이 다양한 방법으로 이용될 수 있음은 당업자들에게 자명할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열 및 그의 일부분을 AE5' 및 AE3'의 기능적 상동체의 검출 및 단리를 위한 프로브로서 이용하고, 상동 뉴클레오티드 서열의 증폭에 이용하고, 동물에서 목적하는 뉴클레오티드 서열의 연령 관련 및(또는) 간 특이적 발현에 이용하고, 유전자 치료법에 이용하고, 동물에서 인자 IX 수준의 감소에 이용할 수 있다.
ii. hPC 유전자로부터의 조절 핵산 서열
본 발명은 hPC 유전자로부터 유래된 조절 핵산 서열을 제공한다. 이들 서열의 존재 및 그들의 놀라운 특성은 hFIX 유전자로부터 조절 서열의 기능의 일반성을 조사하는 과정에서 본 발명자들에 의해 우연히 발견되었다. 특히, hPC 유전자에서 +1의 뉴클레오티드 서열 상류의 다른 일부분을 함유한 "제어" 구조물일 것으로 믿어지는 것을 이용할 때, -1462hPCm1 구조물을 함유하는 트랜스제닉 동물은 시간에 따라 비교적 일정하고 비교적 높은 수치 (약 100 내지 약 3000 ng/ml)의 인간 단백질 C를 나타내고 (도 17a), 이와는 완전 대조적으로, -82hPCm1 구조물을 함유하는 트랜스제닉 동물은 시간에 따라 급격한 속도로 감소하는 비교적 낮은 수치 (1달 되었을 때 약 5 내지 약 40 ng/ml)의 인간 단백질 C를 나타낸다 (도 17b)는 것을 본 발명자들은 발견하였다 (실시예 12). 실제로, 5달 되었을 때에는 -82hPCm1 구조물을 갖는 모든 트랜스제닉 동물에서 인간 단백질 C의 수치가 검출불가능하였다. 본 발명자들에게서 이러한 결과는 인간 단백질 C 유전자의 -1462 내지 -83 뉴클레오티드 서열이 연령 관련 조절 활성 (시간에 따른 연령 안정적 발현에 의해 입증됨) 및 작동가능하게 연결된 목적하는 서열의 조절 활성 (-1462 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 부재시의 수치보다 비교적 높은 발현 수치에 의해 입증됨)을 나타낸다는 것을 입증하였다.
본원에서 핵산 서열과 관련하여 사용된 용어 "조절 활성"이란, 조절 활성을 갖는 핵산 서열의 부재시에 mRNA로의 전사 수준 및(또는) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성 수준과 비교하였을 때, 상기 핵산 서열이 mRNA로의 전사 수준 및(또는) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성 수준을 변경시키는 능력을 말한다. "연령 관련 조절 활성"과는 대조적으로, 용어 "조절 활성"이란 세포, 조직 또는 유기체의 수명중 (소정의 기간에 걸쳐서가 아니라) 한 시점에서 전사 수준 또는 단백질 합성 수준을 변경시키는 것과 관련있다. 바람직한 실시양태에서, mRNA로의 전사 수준 및(또는) 폴리펩티드의 합성 수준은, 조절 활성을 갖는 핵산 서열의 부재시에 mRNA로의 전사 수준 및(또는) 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성 수준과 비교하였을 때, 2배 내지 적어도 10,000배, 바람직하게는 2배 내지 10,000배, 보다 바람직하게는 2배 내지 1,000배, 가장 바람직하게는 2배 내지 500배 증가된다. 본원에 제시된 데이타는, 인간 단백질 C (hPC) 뉴클레오티드 서열 -1462 내지 -83을 포함하면 1달된 트랜스제닉 마우스에서는 인간 단백질 C가 약 5 내지 약 40 ng/ml 발현되는 (도 17b) 것에 비해 인간 단백질 C가 약 100 내지 약 3000 ng/ml 발현되었다 (도 17a)는 것을 나타낸다. 발현 수치는 트랜스제닉 동물이 5달 되었을 때 심지어 보다 급격히 증가되었으며, -1462 내지 -83 뉴클레오티드 서열의 부재시에는 hPC 수치가 검출되지 않은 반면, 이 서열이 존재할 때는 약 100 내지 약 3000 ng/㎖이었다.
한 실시양태에서, 본 발명은 hPC 유전자의 -1462 내지 +1 핵산 서열 (서열 85)를 제공한다 (도 14; 5'-GAATTCTGTA AGCATTTCCT ATGTGTACCT GCCCCTGGGC AAGGTGGGCC TGACTTGTTA GAGTGTTAGA GTTTTACCCT GTTCCTCTAG GAGGGCCTGG TACCACCACA GCCCAGCATG GTGTGGTGCC TCAGCAGGAG GCATCTGGTT ACAATCAACA CAAGCTGTTC CAGCCAATTT AAAGAAACTT CAGGAGGAAT AGGGTTTTAG GAGGGCATGG GGACCCTCCT GCACCCGAAG CCAGGATGTGCCACCAATCA TAAGGAGGCA GGGGCCTCCT TCCGCTGCTC CCTGGGACTC TCTAGGTGTC CGTGGCCTCA GCCCCCCTCT GCACACCTGC ATCTTCCTTC TCATCAGCTT CCTCTGCTTT AAGCGTAAAC ATGGATGCCC AGGACCTGGC CTCAATCTTC CGAGTCTGGT ACTTATGGTG TACTGACAGT GTGAGACCCT ACTCCTCTGA TCAATCCCCT GGGTTGGTGA CTTCCCTGTG CAATCAATGG AAGCCAGCGA GGCAGGGTCA CATGCCCCGT TTAGAGGTGC AGACTTGGAG AAGGAACGTG GGCAAGTCTT CCCAGGAACA GGTAGGGCAG GGAGGAAAGG GGGGCATCTC TGGTGCAGCC CGGTTCGGAG CAGGAAGACG CTTAATAAAT GCTGATAGAC TGCAGGACAC AGGCAAAGGT GCTGAGCTGG ACCCTTTATT TCTGCCCTTC TCCCTTCTGG CACCCCGGCC AGGAAATTGC TGCAGCCTTT CTGGAATCCC GTTCATTTTT CTTACTGGTC CACAAAAGGG GCCAAATGGA AGCAGCAAGA CCTGAGTTCA AATTAAATCT GCCAACTACC AGCTCAGTGA ATCTGGGCGA GTAACACAAA ACTTGAGTGT CCTTACCTGA AAAATAGAGG TTAGAGGGAT GCTATGTGCC ATTGTGTGTG TGTGTTGGGG GTGGGGATTG GGGGTGATTT GTGAGCAATT GGAGGTGAGG GTGGAGCCCA GTGCCCAGCA CCTATGCACT GGGGACCCAA AAAGGAGCAT CTTCTCATGA TTTTATGTAT CAGAAATTGG GATGGCATGT CATTGGGACA GCGTCTTTTT TCTTGTATGG TGGCACATAA ATACATGTGT CTTATAATTA ATGGTATTTT AGATTTGACG AAATATGGAA TATTACCTGT TGTGCTGATC TTGGGCAAAC TATAATATCT CTGGGCAAAA ATGTCCCCAT CTGAAAAACA GGGACAACGT TCCTCCCTCA GCCAGCCACT ATGGGGCTAA AATGAGACCA CATCTGTCAA GGGTTTTGCC CTCACCTCCC TCCCTGCTGG ATGGCATCCT TGGTAGGCAG AGGTGGGCTT CGGGCAGAAC AAGCCGTGCT GAGCTAGGAC CAGGAGTGCT AGTGCCACTG TTTGTCTATG GAGAGGGAGG CCTCAGTGCT GAGGGCCAAG CAAATATTTG TGGTTATGGA TTA-3'). 이 서열은 연령 관련 방식 (즉, 시간에 따라 비교적 일정한 수준; 도 17a) 및 비교적 높은 수준 (-1462 내지 -82 뉴클레오티드 서열 존재시의 발현 수준과 비교하였을 때; 도 17a)으로 트랜스제닉 마우스에서 hPC를 발현시키는데 성공적으로 이용되었다.
본 발명은 또한 hPC 유전자의 -1462 내지 -83 뉴클레오티드 서열 (서열 92)을 제공한다 (도 14). 서열 92가 연령 관련 조절 활성 및 이후 실시예 11에서 논의되는 바와 같은 조절 활성을 나타낸다는 발견은, 단백질 C 5'-말단 서열을 변화시키는 전사적 조절하에 이종 리포터 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)를 이용하였을 때 미아오 (Miao) 등의 문헌 [Miao et al. (1996) J. Biol. Chem. 16:9587-9594]에서 이전에 보고된 결과와는 반대이기 때문에 놀라운 것이다. 특히, 미아오 등은 뉴클레오티드 -1462 내지 +1를 함유한 구조물 pPC-1528이 뉴클레오티드 -82 내지 +1을 함유한 구조물 pPC-82-66과 비교하였을 때 상당히 감소된 CAT 시험관내 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 결과로부터, 미아오 등은 -1462 내지 -82 사이의 영역에 사일런서 (silencer) 활성을 갖는 요소가 있다고 결론지었었다. 대조적으로, 본원에 제시된 데이타는, 뉴클레오티드 -1462 내지 +1 및 뉴클레오티드 -82 내지 +1이 유사한 hPC의 시험관내 활성을 나타냄을 입증한다 (실시예 11, 도 16). 실제로, hPC 코딩 서열의 상류에 있는 hPC의 연령 관련 조절 서열을 hPC의 발현을 조절하는데 이용하는 것에 대한 본 발명자들의 데이타는, hFIX의 연령 관련 조절 AE5' 서열을 hFIX의 발현을 조절하는데 이용하는 것에 대한 본 발명자들의 관찰 결과 (도 1)와 일치한다. 특히, 본 발명자들은 hFIX 및 hPC를 이용할 때 각각 hFIX의 AE3' 및 AE3" 서열이 시험관내 일시적 발현 분석에서 적당한 억제성을 나타낸다는 것을 알아냈다 (도 1 및 16).
또한, 본 발명의 범위에는 서열 85 및 92의 일부분이 포함된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이들 일부분은 제1 PEA-3 요소 (서열 89) [길이 7-bp; 5'-GAGGAAA-3', 도 14의 hPC 유전자에서 -871 내지 -865] 및 제2 PEA-3 요소 (서열 90) [길이 7-bp; 5'-CAGGAAG-3', 도 14의 hPC 유전자에서 -832 내지 -826] 중 하나 또는 둘다를 함유한다.
제1 및 제2 PEA-3 요소 둘다를 함유하는 서열 85 및 92의 일부분의 예로는 hPC 유전자에서 -1462 내지 -802의 뉴클레오티드 서열 (서열 88)이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니며, 이 서열은 플라스미드 -849hPCm1 (도 15, 실시예 10)에서 구축된다. 추가의 예로는 -1462 내지 -804의 뉴클레오티드 서열 (서열 145), -1462 내지 -805의 뉴클레오티드 서열 (서열 146), -1462 내지 -806의 뉴클레오티드 서열(서열 147), -1462 내지 -807의 뉴클레오티드 서열 (서열 148), -1462 내지 -808의 뉴클레오티드 서열 (서열 149), -1462 내지 -809의 뉴클레오티드 서열 (서열 150), -1462 내지 -810의 뉴클레오티드 서열 (서열 151), -1462 내지 -811의 뉴클레오티드 서열 (서열 152), -1462 내지 -812의 뉴클레오티드 서열 (서열 153), -1462 내지 -813의 뉴클레오티드 서열 (서열 154), -1462 내지 -814의 뉴클레오티드 서열 (서열 155), -1462 내지 -815의 뉴클레오티드 서열 (서열 156), -1462 내지 -816의 뉴클레오티드 서열 (서열 157), -1462 내지 -817의 뉴클레오티드 서열 (서열 158), -1462 내지 -818의 뉴클레오티드 서열 (서열 159), -1462 내지 -819의 뉴클레오티드 서열 (서열 160), -1462 내지 -820의 뉴클레오티드 서열 (서열 161), -1462 내지 -821의 뉴클레오티드 서열 (서열 162), -1462 내지 -822의 뉴클레오티드 서열 (서열 163), -1462 내지 -823의 뉴클레오티드 서열 (서열 164), -1462 내지 -824의 뉴클레오티드 서열 (서열 165), -1462 내지 -825의 뉴클레오티드 서열 (서열 166), -1462 내지 -826의 뉴클레오티드 서열 (서열 167), -1452 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 168), -1442 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 169), -1412 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 170), -1102 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 171), -902 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 172) 및 -873 내지 -803의 뉴클레오티드 서열 (서열 173)이 포함된다.
제1 PEA-3 요소만을 함유하는 서열 85 및 92의 일부분에는 hPC 유전자의 -1462 내지 -849 뉴클레오티드 서열 (서열 87)이 포함되며, 이 서열은 플라스미드 -802hPCm1 (도 15, 실시예 10)에서 구축된다. 이러한 일부분의 추가의 예로는 -1462 내지 -850의 뉴클레오티드 서열 (서열 174), -1462 내지 -851의 뉴클레오티드 서열 (서열 175), -1462 내지 -852의 뉴클레오티드 서열 (서열 176), -1462 내지 -853의 뉴클레오티드 서열 (서열 177), -1462 내지 -854의 뉴클레오티드 서열 (서열 178), -1462 내지 -855의 뉴클레오티드 서열 (서열 179), -1462 내지 -856의 뉴클레오티드 서열 (서열 180), -1462 내지 -857의 뉴클레오티드 서열 (서열 181), -1462 내지 -858의 뉴클레오티드 서열 (서열 182), -1462 내지 -859의 뉴클레오티드 서열 (서열 183), -1462 내지 -860의 뉴클레오티드 서열 (서열 184), -1462 내지 -861의 뉴클레오티드 서열 (서열 185), -1462 내지 -862의 뉴클레오티드 서열 (서열 186), -1462 내지 -863의 뉴클레오티드 서열 (서열 187), -1462 내지 -864의 뉴클레오티드 서열 (서열 188), -1462 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 189), -1362 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 190), -1262 내지 -865의 뉴클레오티드서열 (서열 191), -1162 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 192), -1062 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 193), -962 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 194) 및 -872 내지 -865의 뉴클레오티드 서열 (서열 195)이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
제2 PEA-3 요소만을 함유하는 서열 85 및 92의 일부분의 예로는 -863 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 (서열 196), -853 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 (서열 197), -843 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 (서열 198), -833 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 (서열 199), -832 내지 -83의 뉴클레오티드 서열 (서열 200), -863 내지 -183의 뉴클레오티드 서열 (서열 201), -863 내지 -283의 뉴클레오티드 서열 (서열 202), -863 내지 -383의 뉴클레오티드 서열 (서열 203), -863 내지 -483의 뉴클레오티드 서열 (서열 204), -863 내지 -583의 뉴클레오티드 서열 (서열 205), -863 내지 -683의 뉴클레오티드 서열 (서열 206), -863 내지 -783의 뉴클레오티드 서열 (서열 207) 및 -863 내지 -826의 뉴클레오티드 서열 (서열 208)이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
특히 바람직한 실시양태에서, 서열 85 및 92의 일부분은 제1 PEA-3 요소 (서열 89) 및 제2 PEA-3 요소 (서열 90)로부터 선택된다. 본 발명자들의 견해는, 서열 85 및 92 내의 제1 및(또는) 제2 PEA-3 요소가 상기 관찰된 연령 관련 조절 활성 및 서열 85 및 92 조절 활성을 책임진다는 것이다.
B. AE5'의, AE3'의, 및 hPC-유래 조절 서열의 상동체를 확인 및 단리하는데 프로브를 이용
본원에 제공된 본 발명은 연령 관련 조절 활성을 갖는 서열 1, 3, 85 및 92, 그들의 상동체 및 일부분에 한정되지 않으며, 연령 관련 조절 활성을 갖지 않는 서열 (즉, 비기능적 상동체 및 상동체의 비기능적 일부분)도 포함한다. 이러한 서열의 용도로는, 예를 들어 샘플에서 서열 1, 3, 85 및 92 또는 그들의 일부분의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 각각 서열 1, 3, 85 및 92의 일부분을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "프로브"는 정제된 제한 절단에서와 같이 천연 발생한 올리고뉴클레오티드이거나, 또는 합성, 재조합 또는 PCR 증폭에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드이며, 프로브는 목적하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 임의의 검출 시스템에서 검출가능하게끔 "리포터 분자"로 표지될 것이며, 이러한 시스템에는 효소 시스템 (예, ELISA뿐 아니라, 효소 기재 조직화학적 분석 시스템), 형광 시스템, 방사성 시스템, 열량 시스템, 중력 시스템, 자성 시스템 및 발광 시스템이 포함되나, 이로 한정되지 않는다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지로 한정되지 않는다.
본원에 제공된 프로브는 예를 들어 서열 1, 3, 85 및 92뿐 아니라 그의 상동체로서 열거된 것과 같은 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 바람직한 프로브는 고엄격 혼성화에 이용될 수 있도록 충분한 길이 (예, 길이가 약 9 뉴클레오티드 내지 약 20 뉴클레오티드 또는 그 이상)를 갖는다. 한 실시양태에서는, 길이가 20 내지 50 뉴클레오티드 염기인 프로브가 이용된다.
C. AE5'의, AE3'의, 및 hPC-유래 조절 서열의 적어도 일부분을 증폭시키는데 프로브를 이용
본원에 제공된 본 발명은 연령 관련 조절 활성을 갖는 서열 1 및 3, 그들의 상동체 및 일부분으로 한정되지 않으며, 연령 관련 조절 활성을 갖지 않는 서열도 포함한다. 예를 들어, 서열 1 및 3으로서 제시된 핵산 서열의 일부분을 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의한 핵산 서열 증폭을 위한 프라이머로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "증폭"이란, 핵산 서열의 추가의 카피를 제작하는 것으로 정의되며, 일반적으로 당업계에 널리 공지된 중합효소 연쇄 반응 기술 [참조; Dieffenbach CW and GS Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY]을 이용하여 수행한다. 본원에 사용된 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR")이란, 모두 본원의 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호에 개시된 물리스 (K. B. Mullis)의 방법을 말하며, 이 특허 문헌에는 클로닝과 정제를 하지 않고 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열 세그먼트의 농도를 증가시키는 방법이 기재되어 있다. 표적 서열을 증폭시키는 방법은, 다량의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를 목적하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입시킨 후, DNA 중합효소의 존재하에 정확한 순서로 열 사이클링하는 것으로 구성된다. 두 프라이머는 표적 서열의 각 이중 가닥에 상보적이다. 증폭시키기 위해서는, 혼합물을 변성시킨 다음, 프라이머를 표적 분자내부의 그들의 상보 서열에 어닐링시킨다. 어닐링시킨 후, 프라이머를 중합효소를 이용하여 연장시켜서 새로운쌍의 상보 가닥을 형성한다. 변성, 프라이머 어닐링 및 중합효소 연장 단계는 여러 횟수로 반복하여 (즉, 변성, 어닐링 및 연장이 한 "사이클"을 구성하며, "사이클"을 여러번 수행할 수 있음), 목적하는 표적 서열의 증폭된 세그먼트를 고농도로 수득할 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 세그먼트의 길이는 각각 서로에 대한 프라이머의 상대적인 위치에 의해 측정되고, 따라서 그 길이는 제어가능한 변수이다. 상기 방법을 반복한다는 점에서, 이 방법은 "중합효소 연쇄 반응" (이후, "PCR")이라 지칭된다. 표적 서열의 목적하는 증폭된 세그먼트가 혼합물 중 주된 서열 (농도의 면에서)이 되기 때문에, 그들은 "PCR 증폭된" 것이다.
PCR을 이용하여, 게놈 DNA 중 단일 카피의 특정 표적 서열을 여러가지 다른 방법 (예, 표지된 프로브를 사용한 혼성화; 바이오티닐화된 프라이머의 혼입후 아비딘 효소 접합체 검출; 및(또는) dCTP 또는 dATP와 같은32P-표지된 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 증폭된 세그먼트로의 혼입)에 의해 검출할 수 있는 수준으로 증폭시킬 수 있다. 게놈 DNA 이외에, 임의의 뉴클레오티드 서열도 적합한 프라이머 분자쌍으로 증폭시킬 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 생성된 증폭된 세그먼트는 그 자체로 후속 PCR 증폭에 유효한 주형이다. 증폭된 표적 서열은 표적 벡터, 트랜스진 등의 제작을 위한 DNA 세그먼트 (예, 유전자)를 얻는 데 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 천연의 정제된 제한 절단체이거나 합성 제조되며, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성을 유도하는 조건하(즉, 적절한 온도 및 pH에 뉴클레오티드, 및 DNA 폴리머라제와 같은 유도제의 존재하) 두었을 때 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위해서는 단일 가닥이 바람직하지만, 별법으로 이중 가닥일 수도 있다. 이중 가닥일 경우, 프라이머를 사용하기 전에 먼저 두가닥으로 분리 처리하여 연장 생성물을 제조한다. 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 프라이머는 유도제의 존재하에 연장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 (예를 들어, 약 9개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 길이) 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 실험적으로 결정할 수 있으며, 온도, 프라이머원 및 사용 방법 등의 인자에 따라 달라진다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 길이가 20 내지 50개의 뉴클레오티드 염기인 프라이머를 사용한다.
본 발명에서 의도되는 프라이머는 예를 들어 AE5', AE3'에 상동성인 서열, 및 포유 동물, 효모, 세균 및 기타 유기체에서 hPC에서 유래된 조절 서열을 확인하는 데 유용하다.
D. 유전자 발현의 조절 방법
본 발명은 단세포 또는 다세포 유기체에서 오랜 기간 동안 관심이 되어온 뉴클레오티드의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 유전자 발현은 다세포 유기체에서 바람직하게 조절된다. 하나의 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 서열을 안정화시켜 유기체 생존시 다른 시기에 mRNA 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 수준을 비교적 일정하게 유지시킨다. 다른 실시양태에서는, 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 증가시킨다. 발현의 증가는 유기체 생존시 특정 시점에서 mRNA 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 수준이 이전의 mRNA 및(또는) 단백질 수준보다 각각 높다는 것을 의미한다. 별법으로, 발현의 증가는 유기체 생존시 동일 시점에서 mRNA 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 수준이 본 발명의 서열없이 발현되었을 때의 mRNA 및(또는) 단백질 수준보다와 비교했을 때보다 크다는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 시간에 따른 목적하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 및 연령 관련 조절 활성을 갖는 본원에서 제공되는 서열에 작동가능하게 연결된 목적하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 발현을 조절한다. 트랜스펙션된 숙주 세포는 목적하는 뉴클레오티드 서열이 1종 이상의 조직에서 발현되는 트랜스제닉 동물로 발생되도록 한다. 이러한 단계는 구체적인 실시양태으로 하기에 추가로 기재한다.
1. 발현 구조물
연령 관련 방식으로, 및(또는) 간 조직에서 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위한 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열 (예, AE5' 단독, AE3' 단독, 또는 AE5'과 AE3'의 조합)을 프로모터 서열 및 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시켜 제작한다. 하나의 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 서열은 hFIX 유전자의 코딩 영역이다 (실시예 1). 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 서열은 단백질 C 유전자의 코딩 영역이다 (실시예 7).
본 발명은 hFIX 유전자 또는 단백질 C 유전자의 코딩 서열에 제한되는 것은 아니다. 그보다는, 본원에서 제공되는 서열에 의해 조절하고자 하는 모든 핵산 서열이 본 발명의 범주에 속하는 것으로 의도된다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 단백질을 코딩하는 구조 유전자 (예, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 유전자, 활성화 단백질 1 유전자, 활성화 단백질 2 유전자, Sp1 유전자 등)의 코딩 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시양태에서, 구조 유전자는 기종 치료에 사용되는 혈장 프로테이나제 억제제를 코딩하는 인간 α1-항트립신 유전자 (도 10) (서열 42)이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 구조 유전자는 헤파린에 의해 활성이 증가되고, 활성화된 혈액 응고 인자의 혈장 프로테이나제 억제제인 인간 항트롬빈 III (도 11) (서열 43)을 코딩하는 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 구조 유전자는 본원에 기재한 PEA-3 뉴클레오티드 서열 (서열 2)의 상동체에 특이적으로 결합하는 것으로 나타난, PEA-3 단백질 (도 9) (서열 47) 및(또는) 그의 관련 단백질을 코딩하는 유전자이다.
본 발명은 본 발명의 서열과의 작동가능한 조합으로 단일의 목적하는 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것으로 제한되지 않는다. 그보다는, 다수 (즉, 하나 이상)의 목적하는 뉴클레오티드 서열을 일렬로 라이게이션 시켜 본 발명의 조절 서열에 의해 발현을 조절할 수 있다. 다수의 코딩 서열이 바람직할 수 있는데, 예를 들면 하나 이상의 유전자의 전사 산물을 발현시켜 이들 전사 생성물들을 상호작용하도록 하는 데 유용하다. 별법으로, 다수의 코딩 서열중 한 유전자 서열은 리포터 유전자 서열인 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 유전자의 코딩 서열과 일렬로 리포터 유전자의 코딩 서열을 위치시켜, 리포터 유전자 및 목적하는 유전자 모두의 코딩 영역의 발현이 본 발명의 서열에 의해 조절하는 것이 유리할 수 있다. 리포터 유전자의 발현은 일반적으로 목적하는 유전자의 발현과 관련이 있다. 리포터 유전자 서열의 예로는 β-갈락토시다제 및 루시퍼라제 효소를 코딩하는 서열을 들 수 있다. 또한, 융합 유전자가 발현된 단백질을 용이하게 정제하는데 바람직할 수도 있다. 예를 들면, 단백질 A를 코딩하는 이종 서열은 고정된 면역글로불린 상에서 융합 단백질의 정제를 가능하게 한다. 다른 친화 트랩도 당업계에 공지되어 있으며, 발현된 융합 단백질의 정제에 유익하게 사용할 수 있다. 예를 들면, pGEX 벡터 (미국 위스콘신주 마디슨 소재, 프로메가(Promega))를 사용하여 목적하는 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재하에 용출시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. 목적하는 단백질의 정제에 유용한 다른 융합 폴리펩티드는 상업적으로 구입가능하며, 히스티딘 꼬리 (Ni2+에 결합함), 비오틴 (스트렙타비딘에 결합함), 및 말토스-결합 단백질 (MBP)(아밀로스에 결합함)을 포함한다. 이러한 계에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 설계되어 클로닝된 목적하는 폴리펩티드가 융합된 이종 폴리펩티드 잔기로부터 의도에 따라 방출시킬 수 있다.
당업자는 다수의 목적하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 서열에 작동가능하게 연결되었을 때, 목적하는 핵산 서열이 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고, 본 발명의 서열이 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는 한, 목적하는 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 개입에 의해 인접하거나 분리될 수 있다.
본원에 이용되는 구체적인 바람직한 실시양태은 hFIX 프로모터 및 CMV 프로모터의 사용을 기재하고 있으나, 본 발명의 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터 서열 유형 및 공급원에 본 발명을 제한시키고자 하는 것은 아니다. 본원에서 제공되는 서열에 의해 조절되도록 의도된 활성을 갖는 모든 프로모터는 본 발명의 범주에 속하는 것으로 의도된다. 예시적인 프로모터로는 tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터 (인비트로겐(Invetrogen)사의 벡터 플라스미드 pRc/RSV로부터 단리될 수 있음), 레트로바이러스 LTR 프로모터 (클론테크(Clontech)사의 벡터 플라스미드 pLXSN으로부터 단리될 수 있음), SV40 프로모터 (인비트로겐사의 벡터 플라스미드 pCR3 중의 +3530 내지 +3192 위치 사이에 위치함), PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, 23-bp 서열 (서열 44) 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3'를 갖는 T7프로모터, 24-bp 서열 (서열 45) 5'-TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3'를 갖는 T3프로모터, 23-bp 서열 (서열 46) 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3'를 갖는 SP6 프로모터 및 K11프로모터를 들 수 있다. T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터 및 K11 프로모터는 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,591,601호에 개시되어 있다.
본 발명은 단일 프로모터를 사용하는 것에 제한하려는 의도는 아니다. 예를 들면, 키메라 프로모터 (즉, 하나 이상의 유전자로부터 유래된 2개 이상의 프로모터)는 본 발명의 범주에 속하는 것으로 의도된다. 이러한 키메라 프로모터는, 예를 들어 키메라 프로모터가 작동가능하게 연결된 하류 코딩 서열의 발현의 수준을 증가시키는데 바람직할 수 있다. 키메라 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 이중Tet프로모터 [Kistner et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10933-10938], 및 U1 snRNA 프로모터-CMV 프로모터/인핸서 [Bartlett et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8852-8857]가 포함된다.
목적하는 핵산 서열의 발현이 본 발명의 서열에 의해 조절되는 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY; Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY]과 함께 본 발명의 교시를 이용하여 제작할 수 있다. 간략하게, 목적하는 핵산 서열을 개시 코돈 (즉, ATG)과 같은 개시 신호, 인핸서, 및 전사 종결 신호를 비롯한, 전사 및 번역 조절 서열의 존재하에 프로모터 서열 및 본 발명의 서열과 작동가능한 조합으로 위치시킨다. ATG 개시 코돈은 전체 이종 뉴클레오티드 서열의 번역을 보장하기 위해서 정확한 리딩 프레임 내에 있어야 한다. 전사 종결 신호는 이종 핵산 서열의 하류에 위치하며, 비제한적으로 SV40 폴리-A 서열, hINV 폴리-A 서열 또는 소 성장 호르몬 폴리-A 서열 등으로 예시되는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
RNA 안정성 및 인핸서 (즉, 활성화되는 경우 유전자 전사의 기본 속도를 증가시키는 서열) 및 사일렌서 (즉, 유전자의 발현 감소에 관여하는 서열)에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 서열도 포함될 수 있다. 이러한 조절 서열은 비교적 위치에 민감하지 않을 수 있는데, 즉 조절 요소는 이종 뉴클레오티드 서열의 게놈중에 상응하는 위치와 구조물 내의 이종 뉴클레오티드 서열 위치가 다른 경우에도 정확하게 기능한다. 예를 들면, 인핸서는 프로모터 서열과 다른 거리, 다른 방향 및(또는) 다른 순서로 선상에 위치할 수 있다. 따라서, 생식세포 배열에서 프로모터 서열의 3'에 위치하는 인핸서는 구조물 중의 프로모터 서열에 대해 5'에 위치할 수 있다.
2. 숙주 세포
목적하는 핵산 서열과 작동 가능하게 조합된 본 발명의 서열을 포함하는 발현 벡터로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 본원에서 사용하는 용어 "형질전환"이란 트랜스진을 세포 내에 도입하는 것을 의미한다. 본원에서 사용하는 용어 "트랜스진"이란 실험적 조작에 의해 세포의 게놈 내로 도입되는 임의의 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 사용하는 용어 "트랜스진"이란 실험 조작에 의해 세포의 게놈 내로 도입되는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 트랜스진은 "내생 DNA 서열" 또는 "이종DNA 서열"일 수 있다. 용어 "내생 DNA 서열"이란 천연 서열에 대해 임의의 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선별 마커 유전자의 존재 등)을 포함하기 이전에는 도입 목적이 되는 세포 내에서 천연적으로 발견되는 것인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "이종 DNA 서열" 및 "외래 DNA 서열"이란 원래는 라이게이션되지 않거나 원래는 다른 위치에서 라이게이션되는 핵산 서열에 라이게이션된 또는 라이게이션되도록 조작된 핵산 서열을 의미한다. 이종 DNA는 도입 목적이 되는 세포로부터 유래되지 않고, 다른 세포로부터 얻어진 것이다. 또한 이종 DNA에는 천연 유전자에 대해 임의의 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선별 가능한 표지 유전자의 존재 등)을 포함하는 내생 DNA 서열도 포함된다. 반드시 요구되는 것은 아니지만, 일반적으로 이종 DNA는 발현 목적이 되는 세포에 의해 정상적으로는 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 코딩한다. 이종 DNA의 예로는 리포터 유전자, 전사 및 번역 조절 서열, 선별 가능한 표지 단백질 (예를 들어, 약물 내성 부여 단백질) 등이 포함된다.
형질전환은 인산 칼슘-DNA 동시침전 (co-precipitation)법, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션 (transfection)법, 폴리브렌 매개 트랜스펙션법, 전기천공법, 마이크로인젝션 (microinjection)법, 리포좀 융합법, 리포펙션 (lipofection)법, 원형질체 융합법, 레트로바이러스 감염법, 바이오리스틱 (biolistic) (예를 들어 파티클 봄바드먼트 (particle bombardment)) 등을 비롯하여 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
세포의 형질전환은 안정적 또는 일시적일 수 있다. 용어 "일시적 형질전환" 또는 "일시적으로 형질전환"이란 하나 이상의 트랜스진이 숙주 세포의 게놈 내로삽입되지 않고 세포 내로 도입되는 것을 의미한다. 예를 들어, 일시적 형질전환은 하나 이상의 트랜스진에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 효소 면역 측정법 (ELISA)에 의해 확인할 수 있다. 별법으로, 일시적 형질전환은 트랜스진에 의해 코딩된 단백질의 활성을 검출함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, GUS 효소 존재시 청색 침전을 일으키는 X-gluc로의 염색에 의한 GUS 효소 활성의 조직화학 분석 시험 또는 GUS-Light 키트 (트로픽스 (Tropix))를 사용한 화학발광 분석 시험 중 어느 하나를 이용하여uid A유전자에 의해 코딩되는 β-글루쿠로니다제 (GUS)의 활성을 검출할 수 있다. 용어 "일시적 형질전환체"란 하나 이상의 이식 유전자가 일시적으로 혼입된 세포를 의미한다. 대조적으로, 용어 "안정적 형질 전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"이란 하나 이상의 트랜스진이 세포의 게놈 내로 도입 및 삽입된 것을 의미한다. 세포의 안정적 형질전환은 하나 이상의 트랜스진에 결합할 수 있는 핵산 서열과 세포의 게놈 DNA와의 서던 블럿 (Southern blot) 혼성화에 의해 검출할 수 있다. 별법으로, 세포의 게놈 DNA에 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 트랜스진 서열을 증폭시킴으로써 세포의 안정적 형질 전환을 검출할 수도 있다. 용어 "안정적 형질전환체"란 하나 이상의 트랜스진이 게놈 DNA 내로 안정적으로 삽입된 세포를 의미한다. 따라서, 안정적 형질전환체로부터의 게놈 DNA가 하나 이상의 이식 유전자를 함유하는데 반해서 일시적 형질전환체로부터의 게놈 DNA는 트랜스진을 함유하지 않는다는 점에서, 안정적 형질전환체는 일시적 형질전환체와 구별된다.
적합한 숙주 세포에는 세균, 효모, 식물, 곤충 및 포유류 세포가 포함된다.한 실시양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 바람직한 실시양태에서 상기 포유류 숙주 세포는 마우스의 수정란 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 포유류 숙주 세포는 HepG2 세포 (ATCC 기탁번호 HB8065), 섬유아세포 (예를 들어, ATCC 기탁번호 CCL 110), 근아세포 (예를 들어, 클로네틱스 (Clonetics), 카탈로그 번호 SkMC) 및 표피세포 (예를 들어, 인간의 탯줄 표피세포; ATCC 기탁번호 CRL 1730)이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 목적하는 핵산 서열과 작동 가능하게 조합된 본 발명의 서열을 함유하는 발현 벡터뿐만 아니라 PEA-3 단백질을 발현하는 발현 벡터 둘 다에 의해 형질전환된다 (실시예 6). 그러한 동시 형질전환은 예를 들어, AE5', 그의 일부분 또는 PEA-3 단백질이 결합하는 PEA-3 뉴클레오티드 서열의 상동체를 포함하는 AE5'의 상동체에 의해 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현이 조절되는 경우에 바람직할 수 있다. 한 실시양태에서, PEA-3 단백질의 발현은 일부 세포 유형에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 몰로니 (Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 (MoLV)의 LTR 프로모터의 조절 하에 있다. 목적하는 PEA-3 단백질 수준으로 발현시키는데 대한 상대적인 프로모터 활성을 결정하기 위해서는 일시적 발현 분석 시험이 적합하다.
몇몇 선별 시스템을 사용하여 트랜스펙션된 세포를 수획할 수 있다. 여기에는 tk-또는 aprt-세포에 대해 각각 사용할 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wingler Met al. (1977) Cell 11;223-32] 참조) 및 아데닌포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Lowy Iet al. (1980) Cell 22:817-23] 참조)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 대사길항물질, 항생제 또는 제초제 내성이 선별을 위한 근거로 사용될 수 있는데, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는dhfr(문헌 [Wigler M et al. (1980) Proc Natl Acad Sci 77:3567-70] 참조), 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는npt(문헌 [Colbere-Garapin F et al., (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14] 참조) 및 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는als또는pat(상기 문헌 [Murry] 참조)를 사용할 수 있다. 추가적인 선별 가능한 유전자로는, 예를 들어 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는trpB또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용할 수 있도록 하는hisD가기술되어 있다 (문헌 [Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci 85:8047-51] 참조). 최근, 가시적인 표지를 발현하는 리포터 유전자 시스템이 널리 사용되며, 예를 들어 β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 (GUS), 루시퍼라제 및 그의 기질 (루시페린)과 β-갈락토시다제 및 그의 기질 (X-GAL)이 형질전환체를 확인하는 데뿐만 아니라 특정 벡터 시스템에 기인한 일시적 또는 안정적 단백질 발현의 양을 정량하는 데에도 널리 사용되고 있다 (문헌 [Rhodes CAet al. (1995) Methods Mol Biol 55:121-131] 참조).
일반적으로 리포터 유전자의 존재 또는 발현은 각각 일렬의 이종 핵산 서열의 존재 또는 발현을 또한 나타내는 것이다. 그러나, 목적하는 이종 핵산 서열의 존재 및 발현을 확증하는 것이 바람직하다. 이는 이종 핵산 서열의 프로브 또는단편을 사용하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화나 증폭을 포함하는, 당업계에 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 형광 계내 혼성화 (FISH)를 사용하여 세포 내의 이종 핵산 서열을 검출할 수 있다. FISH법에 대한 몇몇 안내서가 입수 가능한데, 예를 들어 문헌 [Gallet al. Meth. Enzymol. 21:470-480 (1981)], 문헌 [Angereret al., in "Genetic Engineering: Principles and Methods," Setlow ＆ Hollaender, Eds. Vol. 7pp. 43-65, Plenum Press, New York (1985)]가 있다. 별법으로, 서던 또는 노던 혼성화에 의해 또는 증폭식 분석법에 의해 트랜스진을 검출하기 위해서 세포로부터 DNA 또는 RNA를 단리할 수 있다. 핵산 증폭식 분석법에는 목적하는 뉴클레오티드 서열에 기반한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머를 사용하여 목적하는 트랜스진을 코딩하는 DNA 또는 RNA가 함유된 세포 및 조직을 검출하는 것이 포함된다. 본원에서 사용하는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "올리고머"는 약 5개 이상, 많게는 약 60개, 바람직하게는 약 15 내지 30개, 보다 바람직하게는 약 20 내지 25개의 연속된 뉴클레오티드 잔기의 핵산 서열을 의미하며, 이들은 프로브 또는 앰플리머 (amplimer)로서 사용 가능하다. 본 발명에 유용한 표준 PCR 방법은 문헌 [Innis et al. (Eds.), "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications," Academic Press, San Diego (1990)]에 기술되어 있다.
이종 핵산 서열 검출을 위한 또다른 별법으로는 이종 뉴클레오티드 서열의 전사체의 폴리펩티드 산물을 검출하는 것이 포함된다. 단백질 산물에 대해 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는 다양한 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 효소 면역 측정법 (ELISA), 방사 면역 측정법 (RIA) 및 형광 활성화 세포분류법 (FACS)이 포함된다. 또한 경쟁적 결합 분석법도 포함된다. 별법으로, 목적하는 단백질 상에서 2개의 비간섭성 에피토프에 대해 반응성이 있는 모노클로날 항체를 사용하는 2-부위 (2-site) 모노클로날 면역분석법을 사용할 수 있다. 이들 및 다른 분석법은 다른 곳들로부터 문헌 [Hampton Ret al. (1990),Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) 및 문헌 [Maddox DEet al. (1983), J.Exp.Med. 158:1211]에 기술되어 있다.
다양한 종류의 표지 및 접합 방법이 당업자에게 공지되어 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석시험에서 사용 가능하다. 관련 서열의 검출용으로서 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브를 제작하는 방법으로는 표지된 뉴클레오티드를 사용한 올리고라벨링 (oligolabeling), 새김눈 번역 (nick translation), 말단 표지 또는 PCR 증폭이 포함된다. 별법으로, 목적하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부분을 mRNA 프로브 생산용으로 벡터 내에 클로닝할 수 있다. 그러한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있고, T7, T3 또는 SP6과 같은 적절한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오티드를 첨가함으로써 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용할 수 있다. 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech) (뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가 (Promega) (위스콘신주 매디슨 소재) 및 US 바이오케미칼 코프 (US Biochemical Corp) (오하이오주 클리브랜드 소재)와 같은 다수의 기업들이 이들 방법을 위한 시판 키트와 프로토콜을 제공하고 있다. 적합한 리포터 분자 또는 표지는 방사성 핵종, 효소, 형광, 화학발광 또는 발색 시약뿐만 아니라 기질, 보조인자, 저해제, 자성 입자 등을 포함한다.
본원에서 제공하는 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 목적하는 재조합 단백질의 연령 관련 발현에 유용하다. 본 발명의 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관의 일부일 수 있다. 본원에서 사용하는 "살아있는 동물"란 본원에서 제공하는 서열을 도입할 세포를 가진 임의의 다세포 동물 (예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 양, 소, 반추동물, 토끼, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 조류 등)을 지칭한다. 숙주 세포 (예를 들어 수정란 세포)가 다세포 생명체를 생성할 수 있는 경우, 본 발명의 서열을 함유하는 발현 벡터로 이들 세포를 형질전환시키면 목적하는 뉴클레오티드 서열의 연령 관련 발현 및(또는) 간 특이적 발현을 나타내는 트랜스제닉 동물을 생성하는데 유용하다.
3.트랜스제닉 동물
본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연령 관련 방식으로 발현하는 비인간 트랜스제닉 동물을 제공한다. 이들 동물은 노화와 관련된 질병 (예를 들어, 혈전증, 심혈관계 질환, 비만, 알츠하이머병, 암, 골다공증, 골관절염, 파킨슨씨병, 치매)에 유용한 모델뿐만 아니라 그러한 질병에 대한 치료제 후부물질의 스크리닝에 유용한 모델을 제공한다. 또한 이들 트랜스제닉 동물은 노화, 유전자 조절 등과 같은 정상적인 현상의 연구에서도 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명은 AE5' 및(또는) AE3'의 조절 하에서 예시적으로 hFIX 코딩 서열을 연령 관련 방식으로 발현하는 트랜스제닉 마우스를 개재하였다 (실시예 3).
목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 관해서 사용된 용어 "연령 관련 방식"이란 목적하는 뉴클레오티드 서열이 연령 관련 조절 활성이 있는 핵산 서열 부재 하의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경우 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 및(또는) 단백질의 양에 비해서, 목적하는 뉴클레오티드 서열이 연령 관련 조절 활성을 가진 프로모터 및 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 경우의 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 및(또는) 단백질 각각의 양이 일정 기간에 걸쳐 증가함을 의미하는 상대적 용어이다. 따라서, 트랜스제닉 동물에 의한 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 대해서 사용한 "연령 관련"이란 용어는 트랜스제닉 동물이 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연령 관련 방식으로 발현하는 것을 의미한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 hFIX가 AE3'의 부재 하의 hFIX 프로모터의 조절 하에 있는 이식 유전자 (-416FIXml) (도 2A)를 함유하는 트랜스제닉 마우스 내의 hFIX의 발현과 비교해서, hFIX 프로모터의 조절 및 AE3'의 조절 하에 hFIX를 포함하는 트랜스진 (-416FIXml/1.4)를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 hFIX가 연령 관련 방식으로 발현되었음을 증명하였다. -416FIXml/1.4 구조물을 함유하는 트랜스제닉 마우스에서는 일정 기간 (예를 들어, 1 내지 9개월의 연령)에 걸쳐 hFIX 활성 수준이 감소하는 것으로 나타나기는 하였지만, 이러한 감소는 같은 기간동안 -416FIXml 구조물을 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 관찰된 hFIX 활성 수준의 감소 정도보다 낮은 것이었다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 hFIX가 AE5' 부재 하의 hFIX 프로모터의 조절 하에 있는 트랜스진 (-416FIXml 및 -770FIXml) (도 2A 및 E)를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서의 hFIX의 발현과 비교해서, hFIX 프로모터 및 AE5' 조절 하의 hFIX를 함유하는 트랜스진 (-802FIXml, -2231FIXml 및 -416FIXml/AE5') 각각을 함유하는 트랜스제닉 마우스 내에서 hFIX가 연령 관련 방식으로 발현됨을 보였다. -802FIXml, -2231FIXml 및 -416FIXml/AE5' 구조물 각각을 함유하는 트랜스제닉 마우스는 일정 기간동안 (예를 들어 1 내지 7개월 연령) hFIX 활성 수준이 상대적으로 일정한 것으로 나타난 것에 반해서 -416FIXml이나 -770FIXml 구조물을 함유하는 트랜스제닉 마우스는 같은 기간동안 hFIX 활성 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 hFIX가 AE3' 및 AE5' 둘 모두의 부재 하의 hFIX 프로모터의 조절 하에 있는 트랜스진 (-770FIXml) (도 2E)를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서의 hFIX의 발현과 비교해서, hFIX 프로모터와 AE5' 및 AE3' 둘 모두의 조절 하의 hFIX를 함유하는 트랜스진 (-802FIXml/1.4 및 -2231FIXml/1.4) (도 4B 및 D) 각각을 함유하는 트랜스제닉 마우스 내에서 hFIX가 연령 관련 방식으로 발현됨을 증명하였다. -802FIXml/1.4 또는 -2231FIXml/1.4 구조물 중 어느 하나를 함유하는 트랜스제닉 마우스는 일정 기간동안 (예를 들어 1 내지 3개월 연령) hFIX 활성 수준이 증가하는 것으로 나타난 데에 반해서 -770FIXml 구조물을 함유하는 트랜스제닉 마우스는 같은 기간동안 hFIX 활성 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
또한 본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열을 간 특이적인 방식으로 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물을 제공한다. 이들 동물은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 간으로 표적화하는데 유용하다. 목적하는 뉴클레오티드 서열의 예로는 그 결함이 비정상적인 출혈성 질병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는혈액 응고 인자 (예를 들어, 제VIII인자, 제VII인자, 제X인자 및 프로트롬빈)을 코딩하는 것들이다. 목적하는 뉴클레오티드 서열의 다른 예로는 그 결함이 혈전증을 야기하는 혈액 응고 조절제 및(또는) 저해제 (예를 들어, 프로틴 (protein) C, 안티트롬빈 III 및 조직인자 경로 저해제 (TFPI)), 그 결함이 폐기종을 야기하는 α1-안티트립신 및 그 결함이 고콜레스테롤증을 야기하는 LDL-수용체를 코딩하는 것들을 포함한다.
목적하는 뉴클레오티드 서열의 또 다른 예로는 특정 대사 결손에 관련된 효소 (예를 들어, 요소 회로 효소, 특히 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르기니노석시네이트 신타아제 및 카바밀 포스페이트 신타아제), 독소, 특정 세포 또는 조직을 박리하는 티미딘 키나제, 이온 채널 (예를 들어, 낭성섬유증의 염화이온 채널), 막 트랜스포터 (예를 들어, 글루코스 트랜스포터) 및 세포골격 단백질 (예를 들어, 디스트로핀 (dystrophin))을 코딩하는 것들이 포함된다. 목적하는 뉴클레오티드 서열은 합성되거나, cDNA 또는 게놈에 기원하거나, 그의 조합에 의한 것일 수 있다. 목적하는 뉴클레오티드 서열은 천연적이거나, 천연 폴리펩티드를 코딩함에도 불구하고 비천연적이거나, 그 폴리펩티드의 인식 가능한 돌연변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 또한 숙주 세포 내에서 발견되는 DNA나 정상적으로 전사되는 mRNA에 대해 "안티센스"일 수 있는, 그러나 안티센스 RNA 자체로는 단백질로 번역되지 못하는 mRNA를 코딩할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 AE5'의 조절 하의 예시적인 hFIX 코딩 서열을 간 특이적인 방식으로 발현하는 트랜스제닉 마우스를 개재하였다 (실시예 3).
트랜스제닉 동물 내에서의 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 관해서, 본원에서 사용하는 용어 "간 특이적인 방식"이란 본원에서 기술한 것처럼 노던 블럿 혼성화 및(또는) 코딩된 단백질의 활성에 의해 검출해서, 간 조직 내에서 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 및(또는) 단백질의 양이 동일한 트랜스제닉 동물의 간 이외의 조직 내에서 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 mRNA 및(또는) 단백질의 양보다 많은, 바람직하게는 두배 많은, 보다 바람직하게는 5배 많은, 그리고 가장 바람직하게는 10배 많은 것을 의미하는 상대적인 용어이다. 따라서, 트랜스제닉 동물 내에서의 목적하는 뉴클레오티드 발현에 관해서, 본원에서 사용하는 "간 특이적인"이란 용어는 트랜스제닉 동물이 목적하는 뉴클레오티드 서열을 간 특이적인 방식으로 발현한다는 것을 의미한다.
본 발명의 트랜스제닉 동물을 생성하기 위한 첫 단계는 본 발명의 서열의 발현 조절 하의 목적하는 핵산 서열을 함유하는 구조물을 숙주 세포 내로 도입하는 것이다. 이를 이루기 위해 마이크로인젝션법, 레트로바이러스 감염 및 배아 간세포의 이식을 포함하는 수종의 방법이 이용 가능하다. 이들 방법은 하기에 상술된다.
i. 마이크로인젝션법
발현 벡터를 수정란의 전핵 내로 직접 마이크로인젝션하는 것은 이종 핵산 서열을 생식 세포계 내로 도입하는데 있어서 바람직하고 가장 많이 이용되는 방법이다. 마이크로인젝션법의 기술적 측면과 핵산 서열의 삽입을 최적화하는 주요 매개변수는 기존의 문헌 [Hogan et al., (1986) Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Lab.]에 기술되어 있다.
일단 발현 벡터가 수정란 세포로 주입되면, 그 세포를 가임된 암컷의 자궁 내로 이식하고 동물 성체로 발생하도록 한다. 탄생한 파운더 (founder) 트랜스제닉 동물 중에서, 70％가 생식 세포를 비롯하여 그들 세포 전체 내에서 발현 벡터 서열을 보유한다. 트랜스제닉 동물의 나머지 30％는 체세포 및 생식세포 내에서 키메라인데, 이는 발현 벡터 서열의 삽입이 1회 이상의 복제 후에 일어나기 때문이다. 그후 파운더 트랜스제닉 동물들을 이종교배시켜 이형접합 및 동형접합 동물을 생성할 수 있다. 이 방법은 트랜스제닉 마우스, 양, 돼지, 토끼 및 소를 생성하는데 성공적이었다 (문헌 [Hammeret al., (1986) J.Animal Sci.:63:269; Hammeret al., (1985) Nature 315;680-683] 참조).
ii. 레트로바이러스법
레트로바이러스 감염을 사용하여, 유전 공학으로 조작된 레트로바이러스로 미리 이식된 배아를 감염시켜 동물 세포 내로 트랜스진을 도입할 수 있다 (문헌 [Jaenisch, (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931], 문헌 [Van der Puttenet al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152] 참조).
예를 들어 바이러스를 생산하는 섬유아세포와 함께 투명대가 제거된 8세포기 배아를 배양함으로써 트랜스펙션체를 얻을 수 있다 ( 상기 문헌 [Van der Putten (1985)], 문헌 [Stewartet al., (1987) EMBO J. 6:383-388] 참조). 그후 트랜스펙션된 배아를 양모 (foster mother)에 이식하여 발생을 계속시켰다. 별법으로,후기 단계에서 감염을 수행할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생산 세포를 포배강 내로 주입할 수 있다 (문헌 [Jahneret al., (1982) Nature 293:623-628] 참조). 또 다른 별법으로 회태기간중의 배아에 대해 자궁 내에서 레트로바이러스를 감염시키는 것도 포함된다 (상기 문헌 [Jahneret al. (1982)] 참조).
레트로바이러스 감염법의 이점으로는 트랜스펙션이 용이하다는 점과 말단 반복 배열 (LTR)의 측면에 위치한 단일 카피의 트랜스진이 염색체 내로 삽입된다는 점이 포함된다. 그러나, 이 방법은 바람직한 방법이 아닌데, 이는 세포 분열이 시작된 이후에 감염을 일으키기 때문에 파운더의 대부분이 모자이크형을 보일 것이기 때문이다. 이로 인해 유전자 발현의 분석에 적합한 동형접합 및 이형접합 선을 만들기 위해 이계교배를 필요로 한다. 보다 중요한 것은 레트로바이러스의 LTR 서열이 이형 핵산 서열의 발현을 지시하는 hINV 상류 서열의 활성을 방해할 수 있다는 것이다.
iii. 배아 간세포 (embryonic stem cell) 이식
트랜스진을 생식 세포계 (germ line)에 도입하는 또다른 방법은 배아간 (ES) 세포를 발현 벡터의 수용체로 사용하는 것을 포함한다. ES 세포는 배반포의 내세포 매쓰 (문헌 [Doetchman et al., (1988) Dev. Biol. 127:224-227]), 내세포 매쓰 (문헌 [Tokunaga et al., (1989) Jpn. J. Anim. Reprod. 35:173-178]), 분해된 상실배 (문헌 [Eistetter, (1989) Dev. Gro. Differ. 31:275-282]) 또는 원시 생식세포 (문헌 [Matsui et al., (1992) Cell 70:841-847])로부터 직접 유래된 다능 세포이다. 발현 벡터는 세포내로의 유전자 전달에 적합한 임의의 방법, 예를 들어 트랜스펙션, 세포 융합, 전기천공법, 마이크로인젝션 (microinjection), DNA 바이러스 및 RNA 바이러스을 이용하여 ES 세포로 도입될 수 있다 (문헌 [Johnson et al., (1989) Fetal Ther. 4 (Suppl. 1): 28-39]).
ES 세포를 사용하는 것의 장점은 이들이 시험관내 영구 세포주를 형성하여 무한한 유전 물질원을 제공할 수 있는 능력이 포함된다. 또한, ES 세포는 알려진 배양된 동물 세포 중 가장 다능성이다. 예를 들어, ES 세포를 상실기 배아에서 무손상 배반포 공간 또는 투명대에 주입할 경우, 얻어진 키메라에서 ES 세포는 생식 세포계를 포함하는 모든 체세포 조직에 기여할 수 있다.
일단 발현 벡터를 ES 세포로 도입하면, 변형된 ES 세포는 배아 환경으로 다시 도입되어 발현된 후 자손 동물로 전달된다. 가장 통상적으로 사용되는 방법은 몇몇 ES 세포를 무손상 배반포의 포배강 공간에 주입하는 것이다 (문헌 [Bradley et al., (1984) Nature 309:225-256]). 다르게는, ES 세포의 응괴를 두개의 8세포기 배아 사이에 샌드위치시킬 수 있다 (문헌 [Bradley et al., (1987), "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach," Ed. Robertson E. J. (IRL, Oxford, U. K.), pp. 113-151; Nagy et al., (1990) Development 110:815-821]). 이러한 방법 모두는 높은 빈도의 생식 세포계 전달을 야기한다.
이종 핵산 서열을 함유하는 표적 세포가 회수되고, 상기에서 기재된 바와 같이 이종 핵산 서열은 표적 세포에서 뿐만 아니라 동물에서도 존재하게 된다.
E. 유전자 치료법
본원에 제공된 조절 핵산 서열은 사람을 제외한 동물 뿐만 아니라 사람에서도 유전자 치료법 적용에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조절 핵산 서열을 생체내 및 생체외 전달 모두에 유용한 당업계에 공지된 다양한 수단 (하기 단락에 기재된 바와 같은 (1) 재조합 레트로바이러스 형질 도입, (2) 재조합 아데노바이러스 벡터, (3) 표적 양이온성 리포좀 및 (4) 바이오리스틱스 (biolistics)를 사용한 유전자 전달을 포함)을 사용하여 목적하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 발현 벡터를 사용하여 세포로 도입할 수 있다.
1. 재조합 레트로바이러스 형질 도입
목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 임의의 목적 세포 (예, 일차 종양 세포)에서 폴리펩티트의 발현을 위해 사용할 수 있다. 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 역가를 증가시키고 형질도입 효율을 증가시킴으로써 레트로바이러스를 사용한 목적하는 폴리펩티드의 전달을 더욱 효율적으로 만들 수 있다. 바이러스 역가를 증가시키기 위해, 레트로바이러스 구조물은 선택 표지 (예, neo 유전자)를 포함하도록 디자인할 수 있고, 적합한 선택제의 존재하에서 레트로바이러스 구조물을 포함하는 세포를 배양하고 선별하고 가장 높은 바이러스 역가를 제공하는 클론을 증식시킨다. 형질도입 효율을 개선하기 위해, 레트로바이러스를 리포좀 또는 폴리-L-오르니틴 또는 폴리리신과 함께 사용하여 바이러스 업테이크를 강화시킨다.
레트로바이러스를 이용하여 유전자 전달 효율을 개선하는 또다른 방법은 표적 효율을 증가시키는 것이다. 교모세포종 및 흑색종을 함유하는 많은 종양 세포는 과도한 수준의 트랜스페린 수용체를 발현한다. 트랜스페린은 폴리리신과 함께 아데노바이러스의 형질도입 효율을 증가시키는데 사용되어 왔다. 최근의 몇몇 문헌에는 레트로바이러스에서env유전자의 SU (표면) 도메인을 대체하여 수용체-매개 형질도입 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 증명되어 있다. 인간 트랜스페린 유전자의 길이는 2097 bp이고, 이를 MLV 벡터에서env유전자의 SU 도메인으로 삽입하여서는 안정한 Env 생성물을 생성할 수 없다. 그러나, 초기의 연구들은 변형된 Env 융합 단백질은 안정한 어셈블리 (assembly) 및 효율적인 침입 (entry)을 위해 선천적env유전자를 필요로 하며, 선천적env유전자가 있는 트랜스페린-env융합 유전자의 동시형질도입을 사용하여 야생형 및 재조합 Env의 혼합물을 함유하는 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있다고 제안해 왔다. 신규한 벡터의 유전자 전달 효율은 높은 수준의 트랜스페린 수용체를 발현시키는 종양 세포를 형질도입함으로써 조사할 수 있다.
2. 재조합 아데노바이러스 벡터
재조합 아데노바이러스는 외래 DNA (~ 7 kb)의 비교적 대형 단편에 수용할 수 있고, 숙주 세포 범위가 넓고 바이러스 생성 역가가 높다는 장점을 갖는다. 아데노바이러스는 쥐의 생체내에서 유전자를 간 및 이자 내분비부분에 (문헌 [Becker et al. (1994) In protein Expression in Animal Cells, Roth et al. eds.]) 및 중추신경계에 (문헌 [Davidson et al. (1993) Nature Genet. 3:219]) 효율적으로 전달하는데 사용되어 왔다. 또한 쥐의 간을 효율적으로 생체외 형질도입한 후 재이식하였다 (문헌 [Shaked et al. (1994) Transplantation 57:1508]). 따라서, 본발명은 생체외 형질도입 후 트랜스펙션된 세포 또는 장기의 이식에 관한 것이다.
바람직하게, 복제 결함의 조합 아데노바이러스를 사용하고, 이들 바이러스는 중요한 조기 발현 유전자 E1a 및 E1b의 결실을 함유한다. 재조합 바이러스를 제조, 증식시키기 위해, E1a 및 E2a 단백질을 트랜스 방식으로 공급하는 293 세포와 같은 패키징 (packaging) 세포주를 사용한다. 재조합 아데노바이러스는 대부분의 바이러스 게놈을 코딩하는 대형 플라스미드와, 바이러스 통합 부위 (viral integration site)와 상동성이 있는 지역이 양측에 놓이게 목적하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 소형 플라스미드간의 세포내 재조합을 사용하여 생성된다. 표준 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스를 구성할 수 있다 (문헌 [Graham and Prevec (1991) Meth. Mol. Biol. 7:109-128; Becker et al. (1994) In Protein Expression in Animcal Cells, Roth et al. eds.]). 즉, 각 플라스미드는 pJM17 (토론토 소재의 마이크로빅스 시스템즈 (Microbix Systems))와 함께 칼슘 포스페이트 침전물 및 글리세롤 스톡 (stock)을 사용하여 293 세포 (ATCC CRL 1573)의 반융합성 단층으로 동시에 트랜스펙션된다. 초기 재조합 바이러스 스톡은 293 세포의 단층에 적정되고, 분리된 단일 플라그를 얻고 ELISA를 사용하여 목적하는 폴리펩티드의 발현에 대해 실험한다. 바이러스 스톡은 293 세포에서 증폭되고 적정되며 - 70 ℃에서 부분표본으로 저장되며, 필요할 경우 스톡을 밀도 구배 원심 분리에 의해 농축한다. 재조합 아데노바이러스로 종양 세포를 감염시키기 위해, 새롭게 분리한 종양 세포를 최소 부피의 아데노바이러스 스톡과 혼합한다. 스톡의 역가는전형적으로 105내지 108/㎖이다. 몇 시간 후 배지를 교체하고 세포에서 재조합 아데노바이러스-코딩된 목적하는 폴리펩티드 (예, 리포터 유전자)를 발현시킨다.
아데노바이러스 전달 시스템을 사용하는 것의 잠재적인 단점은 형질도입된 세포가 그의 표면에 소량의 아데노바이러스 항원을 보유하거나 발현한다는 점이다. E2a 유전자내 결실을 함유하는 "제2 발생" 아데노바이러스 벡터를 사용할 수 있으며 수용자의 염증의 감소 및 장기간의 목적하는 유전자 발현과 관계된다 (문헌 [Engelhardt et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6196]). 필요한 경우, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제2 발생 아데노바이러스 벡터에 삽입한다.
최근, 아데노관련된 바이러스 (AAV) 벡터 및 키메라성 렌티바이러스 벡터도 또한 목적하는 폴리펩티드 서열 발현의 가망성을 보여주었다.
3. 표적화된 양이온성 리포좀
양이온성 리포좀은 표적 세포에서 DNA의 일시적 발현을 유도하는데 안정하고 효율적인 수단인 것으로 입증되어 왔다 (문헌 [Ledley (1995) Human Gene Ther. 6:1129]). 양이온성 리포좀을 사용하여 CFTR 유전자를 낭성섬유증 환자의 폐에 도입하거나 (문헌 [Caplen et al. (1994) Gene Ther. 1:139] 및 [Alton et al. (1993) Nature Genet. 5:135]), 또는 직접 종양내 주입에 의해 T 세포 공동자극제 B7-1를 악성흑색종 병변에 도입하여 세포-매개된 면역 반응을 유발하는 (문헌 [Nabel et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307]) 임상적 실험이 진행중이다.
양이온성 리포좀 (예, DOTAP/DOPE) 및 리간드-표적화된 양이온성 리포좀을 목적하는 폴리펩티드의 종양 세포로의 전달에 사용할 수 있다. 최근, 양이온성 리포좀 이외에 중성 리포좀도 또한 리간드를 세포에 표적화하는데 유용하다고 보고되었다. 리간드-표적화된 리포좀은 리간드 또는 항체를 양이온성 리포좀의 표면에 공유적으로 부착함으로써 제조된다. 예를 들어, 교모세포종 세포를 표적화할 경우, 교모세포종 세포의 표면에서 높은 수준의 트랜스페린 수용체가 발현되므로 트랜스페린을 리간드로서 사용한다. 흑색종 세포를 표적화할 경우, 수용체를 내재화시키는 흑색종-특이성 표면 항원에 대한 모노클로날 항체 (예, mAb HMSA5)를 리간드로서 사용할 수 있다.
목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 DNA는 표준 방법을 이용하여 미리형성된 양이온성 리포좀과의 복합체로 형성되거나, 다르게는 DNA는 리포좀내로 캡슐화된다. 이어서, DNA-함유 리포좀을 사용하여 종양내 직접 주입에 의해 생체내 종양 세포 또는 시험관내 (새롭게 이식된 종양 세포를 사용) 종양 세포로 DNA를 전달시킨 후 형질도입된 세포를 수용자 (예, 인간 환자 또는 사람을 제외한 동물)로 다시 돌려보낸다.
4. 바이오리스틱을 이용한 유전자 전달
바이오리스틱 (마이크로바이오리스틱)은 DNA-코팅된 입자를 세포 또는 조직으로 투입하여 DNA를 세포로 전달하는 방법이다. DNA는 금 또는 텅스텐 미립자 (~ 1 내지 3 ㎛ 직경)의 표면에 코팅되고, 이들 입자를 높은 속도로 가속시켜 표적 세포에 충돌시킨다. 입자는 세포 막을 통해 파열하고 표적 세포내로 들어가게 된다. 세포막은 재빨리 재봉합되고 입자의 패신저 DNA는 분리되고 발현된다. 바이오리스틱 방법은 포유동물 세포를 트랜스펙션하는데 사용되어 왔다 (문헌 [Sanford et al. (1993) Methods Enzymol. 217:483]).
핸드-헬드 (hand-held) 바이오리스틱 장치 (BioRad)를 사용하여 DNA를 종양 세포 또는 분리된 종양 조각으로 전달한다. 이러한 장치는 압축된 헬륨을 사용하여 정제된 플라스미드 DNA (스페르민과 함께 함침됨)로 코팅된 금의 미립자 (1 내지 5 ㎛)를 그의 표면에 운반하는 디스크형의 매크로투사물 (macroprojectile)을 구동시킨다 (상기 윌리엄즈 (Williams) 등의 문헌). 이러한 장치는 일차 조직을 성공적으로 트랜스펙션시키는데 사용되었다.
제조자 (BioRad)의 지시에 따라 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 DNA를 금 미립자의 표면에 코팅할 수 있고, 바이오리스틱 장치는 새롭게 이식된 (explanted) 종양 세포 또는 직접 노출된 종양 (예, 간 표면의 전이성 결절, 피부의 흑색종 병변)에 DNA를 전달하는데 사용된다.
발현 벡터의 세포로의 전달 방법에도 불구하고, 발현 벡터가 트랜스펙션된 세포의 선별을 촉진시키기 위한 선택 표지 (예, neo 유전자)를 함유하는 것은 바람직한 것이지 필수적인 것은 아니다. 트랜스펙션된 세포를 G418의 존재하에서 (예, 200 ㎍/㎖) 배양하고 감소된 농도의 G418 (예, 100 ㎍/㎖)을 함유하는 성장 배지중 배양하여 전면성장시킴으로써 선별한다. 목적하는 폴리펩티드의 발현은 예를 들어 면역블로트 분석 또는 목적하는 폴리펩티드에 대해 특이성인 모노클로날 항체를 사용한 유세포분석을 사용하여 평가한다. 필수적이지는 않지만, 트랜스펙션된 종양 세포에서 목적하는 폴리펩티드의 발현이 구성적이고 안정한 것은 바람직하다. 구성적 발현은 유발 사건 또는 조건이 없는 발현을 의미하며, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 조정하는 프로모터를 선택함으로써 달성될 수 있다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 구조적 핵산 서열의 구성적 발현을 조정하는 프로모터의 예로는 SRα 프로모터, CMV 프로모터 및 HIV 프로모터가 있다.
목적하는 핵산 서열을 세포로 전달하는데 사용된 발현 벡터의 유형과 관계없이, 발현 벡터는 종양 및(또는) 발암전 조직으로의 직접 주입, 전신 (예, 정맥내) 투여, 에어로졸 투여 (예, 기관지 나무 및 다른 폐 조직으로의 전달을 위함), 흉부관으로의 주입 (예, 흉부 조직으로의 전달을 위함) 및 국소 투여 (예, 경부 조직으로의 전달을 위함)에 의해 세포로 도입될 수 있다.
F. 동물에서 인자 IX의 발현 감소
또한, 본원에 제공된 조절 서열에 의해 전사가 조절 제어되는 핵산 서열로 코딩된 목적하는 폴리펩티드 서열의 발현을 감소시키는데 본 발명의 조절 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조절 서열을 FIX 활성의 연령 관련 증가률과 관련된 질병 (예, 혈전증, 심혈관질환 등)을 치료하는 수단으로서 동물에서 FIX 활성의 연령 관련 증가률을 감소시키는데 사용할 수 있다. 본 발명자들은 대표적인 핵산 서열인 AE5' 및 AE3'가 각각 hFIX의 안정하고 증가된 발현 수준을 조절한다는 것을 알게 되었기 때문에, hFIX의 발현 증가를 조절하는 AE3'의 작용을 억제함으로써 시간에 따른 hFIX 활성 수준의 증가를 감소시킬 수 있다. 이러한 방법은hFIX의 발현이 AE5'의 통제하에 있으므로 시간에 따른 안정한 hFIX 활성을 제공하고 정상 혈액 응고 공정에서 중요한 역할을 계속한다는 장점을 갖는다.
FIX의 연령 관련 발현에서 AE3'의 작용은 예를 들어 AE3'에 특이적으로 결합하는 단백질의 활성을 억제함으로써 억제될 수 있다. AE3' (또는 연령 관련 조절 활성을 갖는 최소량의 AE3')를 사용하여 AE3' 또는 그의 일부분에 특이적으로 결합하는 단백질 라이브러리를 스크리닝함으로써 AE3'에 결합하는 단백질(들)을 확인할 수 있다. 일단 AE3'에 결합하는 단백질을 확인하면, 이러한 단백직에 특이성인 항체를 사용하여 이들 단백질의 작용을 확인할 수 있다. AE3'에 결합하는 단백질에 특이성인 항체는 AE3'와 단백질간의 상호작용을 분열시킬 것으로 예상된다.
AE3' 또는 그의 일부분에 결합하는 단백질에 특이성인 항체 (다클론성 또는 모노클로날)는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 용어 "항체"는 동물에서 면역원 (항원)에 의해 유발된 면역글로불린을 의미한다. 항체가 항원에 함유된 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 것이 바람직하다. 용어 "다클론성 항체"는 형질 세포의 클론 하나 이상으로부터 생성된 면역글로불린을 의미하는 반면, "모노클로날 항체"는 형질 세포의 클론 하나로부터 생성된 면역글로불린을 의미한다. 용어 "특이 결합", "특이적으로 결합하는" 및 이들과 문법적으로 유사한 용어들은 항체 및 면역원의 상호작용에 관하여 사용될 때 특정 구조 (즉, 항원성 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존하는 상호작용을 의미하며, 다시 말해서 일반적으로 항체는 면역원이 아닌 특정 면역원의 구조를 인식하고 결합한다. 예를 들어, 항체가 에피토프 "A"에 특이성이라면, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응 중에피토프 A (또는 유리된 비표지 A)를 함유하는 항원의 존재는 표지된 A가 항체에 결합하는 양을 감소시킬 것이다.
본원에 제공된 목적하는 폴리펩티드에 특이성인 다클론성 및 모노클로날 항체는 당업자가 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 목적 항원을 갖는 동물 (예, 마우스, 토끼 등)을 면역시킴으로써 발생될 수 있고, 면역화된 동물로부터의 비장 세포는 통상적으로 골수종 세포의 융합에 의해 무한증식된다. 항원을 사용한 면역화는 프로인트 보강제 (Freund's adjuvant)와 같은 보강제의 존재하 또는 부재하에서 달성될 수 있다. 통상적으로, 마우스에서 50 내지 200 ㎕ 보강제 또는 수용액 중 10 ㎍의 항원을 피하적, 복강내 또는 근육내 경로로 투여한다. 추가 면역은 예를 들어 2 내지 8 주의 간격을 두고 실행할 수 있다. 최종 추가 면역은 융합 약 2 내지 3일 전에 행해지고 일반적으로 보강제 보다는 수성형태로 제공된다.
비장을 실온에서 멸균된 체를 통해 배양 배지로 꺼내거나, 또는 두개의 멸균된 유리 현미경 슬라이드의 급냉된 말단 사이의 압력에 의해 비장 세포를 배지로 조심스럽게 꺼내어 면역된 동물로부터의 비장 세포를 제조할 수 있다. 세포를 원심분리에 의해 (5 분간 400 x g) 수집하고 세척하고 수를 센다. 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포주를 발생시킨다. 히포산티네아미노프네린-티미딘 (HAT)에 대한 선택성에 대해 선택된 몇몇 마우스 골수종 세포주는 시판되며, 예를 들어 10 내지 15 % 소태아 혈청을 함유하는 둘베코 (Dulbecco)의 변형된 이글 (Eagle) 배지 (DMEM) (Gibco BRL)에서 성장시킨다. 골수종 세포와 비장 세포의 융합은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하거나 또는 당업계에 통상적인 프로토콜을 사용한 전기 융합에 의해 달성될 수 있다. 융합된 세포들을 96-웰 플레이트에 분배한 후 10 내지 15 %의 소태아혈청 및 HAT를 함유하는 0.1 ㎖의 DMEM중 1 내지 2주간 배양하여 융합된 세포를 선별한다. 상청액을 스크리닝하고 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 항체를 제조한다. 항체를 생성하는 세포를 함유하는 웰로부터의 하이브리도마 클론을, 예를 들어 제한적으로 희석하여 얻는다. 클로닝된 하이브리도마 세포 (4 - 5 x 106)를 마우스 (바람직하게 BALB/c 유전자 배경)에게 복강내 이식한다. 10 내지 14 일 후 마우스로부터 혈청 및 복수액을 수거하였다.
본 발명은 또한 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 본원에 그의 전문이 참고로 인용된 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호 및 제5,625,126호를 사용하여 발생될 수 있는 인체에 적응된 항체에 관한 것이다. 이러한 방법들은 예를 들어 인간 면역그로블린 사슬 유전자를 함유하고 이들 유전자를 발현시켜 인간 면역 글로불린 유전자에 의해 코딩된 다양한 동종형 항체의 레파토리를 생성하는 사람을 제외한 트랜스제닉 동물의 발생을 포함한다.
별법으로, FIX의 연령 관련 발현에 있어서의 AE3'의 기능은 예를 들어, AE3'에 대한 안티센스 서열을 사용하여 AE3'의 활성을 억제함으로써 억제할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "안티센스"란 디옥시리보뉴클레오티드 잔기의 서열이 DNA 이중나선 가닥의 디옥시리보뉴클레오티드 잔기의 서열에 대해 5'에서 3' 방향으로 역으로 있는 디옥시리보뉴클레오티드 서열을 말한다. AE3' 안티센스 서열은 원하는AE3' 안티센스 올리고머 (예컨대, 15-20 뉴클레오티드) 또는 보다 큰 단편을 높은 수준으로 발현하는 발현 벡터로 세포 또는 조직을 트랜스펙션시킴으로써 AE3'의 발현 조절 하에 유전자의 발현을 막는 데 사용할 수 있다. 이러한 구조물은 FIX의 발현을 억제하는 안티센스 서열로 세포를 채울 수 있다. 안티센스 서열은 AE3' 서열을 따라 다양한 위치로부터 디자인할 수 있다. AE3' 안티센스 서열을 발현하는 벡터로 처리된 동물 (예컨대, 마우스)을 FIX 발현과 관련된 연령 관련 증상에 있어서의 변화에 대해 관찰하였다. 동물에서 안티센스 서열로 이들 증상 중 하나 이상을 완화시키거나 치료하는 것은 안티센스 서열이 인간의 연령 관련 FIX 발현의 치료 및(또는) 예방에 유용할 수 있음을 의미한다.
<실험>
하기 실시예는 본 발명의 일부 바람직한 실시양태 및 측면을 기술하고자 하는 것이지 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 명시하지 않는 한, 인자 IX 뉴클레오티드 서열에 대한 뉴클레오티드 수는 모두 도 8에 나타낸 hFIX 유전자 서열의 뉴클레오티드 수를 말한다.
<발명의 개요>
본 발명은 목적하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 연령 관련 방식으로 조절하는 핵산 서열, 및 목적하는 유전자의 간 특이적 발현을 유도하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 연령 관련 및(또는) 간 특이 질병을 위한 모델로 사용될 수 있는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명이 목적하는 핵산 서열의 특정 유형 또는 공급원으로 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 바람직한 실시양태에서 목적하는 핵산 서열이 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-안티트립신, 항트롬빈 III, 섬유소용해 경로 인자 및 억제제, PEA-3 단백질, PEA-3 관련 단백질 (Ets족 전사 인자, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제 포함)중에서 선택된 당백질을 코딩한다. 본 발명이 프로모터 서열의 특정 유형 또는 공급원에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 또다른 바람직한 실시양태에서 프로모터 서열이 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 본 발명이 서열 1의 일부분인 특정한 연령 조절 서열에 국한되는 것은 고려하지 않는다. 그러나, 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 1의 일부분인 연령 조절 서열은 서열 2, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 및 서열 38중에서 선택된다. 본 발명이 서열 3의 일부분인 특정한 연령 조절 서열에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서 서열 3의 일부분인 연령 조절 서열은 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60 및 서열 61중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열 및 iii) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분 중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명이 숙주 세포가 포함된 환경에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 바람직한 일 실시양태에서 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 포함되어 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 배우체이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포중에서 선택된다.
본 발명은 또한 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열 및 iii) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절서열의 기능적 상동체를 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명이 목적하는 핵산 서열의 특정 유형 또는 공급원에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 바람직한 일 실시양태에서 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 섬유소용해 경로 인자 및 억제제, PEA-3 단백질, PEA-3 관련 단백질 (Ets 계열 전사 인자, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제 포함)중에서 선택된 당백질을 코딩한다. 본 발명이 프로모터 서열의 특정 유형 또는 공급원에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 또다른 바람직한 실시양태에서 프로모터 서열은 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 본 발명이 연령 관련 조절 활성을 갖는 서열 1의 일부분에 국한되는 것은 고려하지 않지만, 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 1의 일부분인 연령 조절 서열은 서열 2, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 및 서열 38중에서 선택된다. 본 발명이 연령 관련 조절 활성을 갖는 서열 3의 일부분에 국한되는 것은 고려하지 않지만, 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서 서열 3의 일부분인 연령 조절 서열은 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60 및 서열 61중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열 및 iii) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명이 숙주 세포가 포함된 환경에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 바람직한 일 실시양태에서 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 포함되어 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 배우체이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포중에서 선택된다.
본 발명은 또한 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 제공하는 단계, b) 상기 목적하는 핵산 서열, 상기 프로모터 서열, 및 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계; 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 상기 목적하는 핵산 서열이 상기의 처리된 세포에서 발현되도록 하는 조건 하에서 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 처리된 세포가 특정 환경에 국한되도록 의도하는 것은 아니지만, 처리된 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 포함되어 있다.
본 발명은 또한 서열 1의 기능적 상동체 및 그의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 3의 기능적 상동체 및 그의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 1의 기능적 상동체 및 그의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 일부분를 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 일부분은 서열 2이다. 또다른 실시양태에서, 상기 일부분은 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 및 서열 38중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 서열 3의 기능적 상동체 및 그의 보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 일부분을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 일부분은 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60 및 서열 61중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1 또는 그의 보체를 사용하여 하이브리드를 형성하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공하며, 이 때 상기 핵산 서열은 연령 관련 조절 활성을 갖는 것과, 서열 1에 대해 63% 초과 내지 100% 미만의 상동체를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 3 또는 그의 보체를 사용하여 하이브리드를 형성하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공하며, 이 때 상기 핵산 서열은 연령 관련 조절 활성을 갖는 것과, 서열 3에 대해 60% 초과 내지 100% 미만의 상동체를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로, 서열 1의 기능적 상동체 및 그의 보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 3의 기능적 상동체 및 그의 보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 1의 기능적 상동체 및 그의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 포함하는 트랜스제닉 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 목적하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 동물에 포함되어 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 트랜스제닉 세포에서 연령 관련 방식으로 발현된다.
본 발명은 추가로, 서열 3의 기능적 상동체 및 그의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 포함하는 트랜스제닉 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 목적하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 동물에 포함되어 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 트랜스제닉 세포에서 연령 관련 방식으로 발현된다.
본 발명은 또한 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열 및 iv) 서열 1, 및 v) 서열 3을 제공하는 단계, b) 상기 목적하는 핵산 서열, 상기 프로모터 서열, 및 서열 1 및 서열 3을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계; 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 상기 목적하는 핵산 서열이 상기의 처리된 세포에서 발현되도록 하는 조건 하에서 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 세포는 서열 47로서 동정된 재조합 단백질을 발현한다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포는 HepG2 세포, 섬유모세포, 근모세포 및 내피세포중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포는 수정란 세포이고, 상기 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 수정란 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추가로, d) 트랜스제닉 수정란 세포를 인간을 제외한 동물에 도입하여, 동물이 상기 트랜스진을 함유하는 운반 프로제니를 허용하도록 하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 프로제니는 목적하는 핵산 서열의 연령 관련 발현을 특징으로 한다. 또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 프로제니는 목적하는 핵산 서열의 간 특이적 발현을 특징으로 한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 수정란 세포는 로덴티아 목 (the order Rodentia)의 포유류중에서 유도된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 수정란 세포는 마우스 수정란 세포이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 섬유소용해 경로 인자 및 억제제, PEA-3 단백질, PEA-3 관련 단백질 (Ets 계열 전사 인자, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제 포함)중에서 선택된 당백질을 코딩한다
본 발명은 또한 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열 및 iv) 서열 1의 일부분, 및 v) 서열 3의 일부분을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 목적하는 핵산 서열이 트랜스제닉 세포에서 발현되도록 하는 조건하에서 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열 및 iv) 서열 1을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열 및 서열 1을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 목적하는 핵산 서열이 트랜스제닉 세포에서 발현되도록 하는 조건하에서 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열 및 iv) 서열 1의 일부분을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열 및 서열 1의 일부분을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 목적하는 핵산 서열이 트랜스제닉 세포에서 발현되도록 조건하에 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열및 iv) 서열 3을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열 및 서열 3을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 목적하는 핵산 서열이 트랜스제닉 세포에서 발현되도록 하는 조건하에 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포에서 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 3의 일부분을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 및 서열 3의 일부분을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 세포내로 도입하여 목적하는 핵산 서열이 트랜스제닉 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에서 트랜스제닉 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 세포내에서 발현시키는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 hFIX 유전자에서 유래된 추가의 서열을 또한 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 93의 적어도 일부분을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 일부분은 연령 관련 조절 활성을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 상기 일부분은 서열 91, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120, 서열 121, 서열 122, 서열 123, 서열 124, 서열 125, 서열 126, 서열 127, 서열 128, 서열 129, 서열 130, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 134, 서열 135, 서열 136, 서열 137, 서열 138, 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144중에서 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 일부분은 서열 91이다.
본 발명은 또한 고엄격도 혼성화 조건하에 서열 91, 서열 91의 상보체, 서열 93 및 서열 93의 상보체중에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 연령 관련 조절 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열의 기능적 상동체를 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 hFIX 서열을 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-항트립신, 항트롬빈 III, PEA-3 단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제중에서 선택된 단백질을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 서열 93의 일부분은 서열 91, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120, 서열 121, 서열 122, 서열 123, 서열 124, 서열 125, 서열 126, 서열 127, 서열 128, 서열 129, 서열. 130, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 134, 서열 135, 서열 136, 서열 137, 서열 138, 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143 및 서열 144중에서 선택된다. 더욱 바람직한 한 실시양태에서, 일부분은 서열 91이다. 또다른 실시양태에서, 발현 벡터는 또한 서열 1 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함한다.
본 발명은 hFIX 유래 서열을 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 속한다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 생식세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포중에서 선택된다.
본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열의 기능적 상동체를 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-항트립신, 항트롬빈 III, PEA-3 단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제중에서 선택된 단백질을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 서열 93의 일부분은 서열 91, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120, 서열 121, 서열 122, 서열 123, 서열 124, 서열 125, 서열 126, 서열 127, 서열 128, 서열 129, 서열 130, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 134, 서열 135, 서열 136, 서열 137, 서열 138, 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142 및 서열 143중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 1 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열의 기능적 상동체를 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 속한다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 생식세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포중에서 선택된다.
본 발명은 hFIX 유래 서열을 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 예컨대, 본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 및 연령 관련 조절 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 세포내로 도입하여 목적하는 핵산 서열이 처리된 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열의 기능적 상동체를 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 및 기능적 상동체를 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 세포내로 도입하여 목적하는 핵산 서열이 처리된 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다.
hFIX 유전자로부터의 서열 이외에, 본 발명은 hPC 유전자로부터 유래된 서열을 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 85의 적어도 일부분 및 서열 92의 적어도 일부분중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 일부분은 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 상기 일부분은 서열 88, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149, 서열 150, 서열 151, 서열 152, 서열 153, 서열 154, 서열 155, 서열 156, 서열 157, 서열 158, 서열 159, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 서열 166, 서열 167, 서열 168, 서열 169, 서열 170, 서열 171, 서열 172, 서열 173, 서열 87, 서열 174, 서열 175, 서열 176, 서열 177, 서열 178, 서열 179, 서열 180, 서열 181, 서열 182, 서열 183, 서열 184, 서열 185, 서열 186, 서열 187, 서열 188, 서열 189, 서열 190, 서열 191, 서열 192, 서열 193, 서열 194, 서열 195, 서열 196, 서열 197, 서열 198, 서열 199, 서열 200, 서열 201, 서열 202, 서열 203, 서열 204, 서열 205, 서열 206, 서열 207, 서열 208, 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 일부분은 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다.
본 발명은 또한 엄격한 혼성화 조건하에 서열 92, 서열 92의 상보체, 서열 85, 서열 85의 상보체, 서열 89, 서열 89의 상보체, 서열 90 및 서열 90의 상보체중에서 선택된 핵산 서열과 혼성화하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는다.
본 발명은 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 서열의 기능적 상동체를 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 제38항에 기재된 발현 벡터의 경우에, 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-항트립신, 항트롬빈 III, PEA-3 단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제중에서 선택된 단백질을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 일부분은 서열 88, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149, 서열 150, 서열 151, 서열 152, 서열 153, 서열 154, 서열 155, 서열 156, 서열 157, 서열 158, 서열 159, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 서열 166,서열 167, 서열 168, 서열 169, 서열 170, 서열 171, 서열 172, 서열 173, 서열 87, 서열 174, 서열 175, 서열 176, 서열 177, 서열 178, 서열 179, 서열 180, 서열 181, 서열 182, 서열 183, 서열 184, 서열 185, 서열 186, 서열 187, 서열 188, 서열 189, 서열 190, 서열 191, 서열 192, 서열 193, 서열 194, 서열 195, 서열 196, 서열 197, 서열 198, 서열 199, 서열 200, 서열 201, 서열 202, 서열 203, 서열 204, 서열 205, 서열 206, 서열 207, 서열 208, 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 일부분은 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 속한다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 생식세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열의 기능적 상동체를 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 목적하는 핵산 서열은 인자 VIII, 인자 VII, 인자IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-항트립신, 항트롬빈 III, PEA-3 단백질, β-갈락토시다제 및 루시퍼라제중에서 선택된 단백질을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 일부분은 서열 88, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149, 서열 150, 서열 151, 서열 152, 서열 153, 서열 154, 서열 155, 서열 156, 서열 157, 서열 158, 서열 159, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 서열 166, 서열 167, 서열 168, 서열 169, 서열 170, 서열 171, 서열 172, 서열 173, 서열 87, 서열 174, 서열 175, 서열 176, 서열 177, 서열 178, 서열 179, 서열 180, 서열 181, 서열 182, 서열 183, 서열 184, 서열 185, 서열 186, 서열 187, 서열 188, 서열 189, 서열 190, 서열 191, 서열 192, 서열 193, 서열 194, 서열 195, 서열 196, 서열 197, 서열 198, 서열 199, 서열 200, 서열 201, 서열 202, 서열 203, 서열 204, 서열 205, 서열 206, 서열 207, 서열 208, 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 일부분은 서열 89 및 서열 90중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열의 기능적 상동체를 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 속한다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 생식세포이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 hPC 서열을 사용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 및 뉴클레오티드 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 세포내로 도입하여 목적하는 핵산 서열이 처리된 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법을 개시한다.
또한, 본 발명은 a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택되며 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열의 기능적 상동체를 제공하는 단계, b) 목적하는 핵산 서열, 프로모터 서열, 및 기능적 상동체를 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계, 및 c) 상기 트랜스진을 세포내로 도입하여 목적하는 핵산 서열이 처리된 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다.
<실시예 1>
일련의 예시적 인간 인자 IX (hFIX) 미니유전자 발현 벡터 12개의 제작
인자 IX의 연령 관련 조절의 분자 기작을 밝히기 위해, 일련의 hFIX 미니유전자 발현 벡터 12개를 제작하였다. 이들 벡터를 먼저 HepG2 세포 (인간 간세포암 세포주; 실시예 2 참조)에서 시험관내 분석하였다. hFIX 미니유전자 벡터를 수반하는 트랜스제닉 마우스를 만들고, 트랜스제닉 마우스의 파운더 (founder) 및 후세대의 전체 수명에 대한 hFIX 발현의 장기적인 분석을 수행하였다 (실시예 3 참조).
12개의 예시적 미니유전자은 (a) 5' 플랭킹 영역에서 뉴클레오티드 (nt) - 2231까지 걸쳐 있는 다양한 길이의 프로모터 서열, (b) 제1 인트론의 중간 부분이 절단된 제1 인트론을 함유하는 코딩 영역, 즉 도 8의 nt +1098 내지 nt +5882, 및 (c) 완전한 3'UTR 서열 또는 중간 부분이 결실된 3'UTR 서열을 포함하는, hFIX 유전자 서열로부터 전체적으로 유래된 서열을 함유한다. 도 1은 12개의 인간 FIX 미니유전자 발현 구조물 중 11개의 구조를 나타낸다. 각 구조물의 명칭은 좌측에 나타나 있다. 상기 구조는 5' 말단 뉴클레오티드 수와 함께 프로모터 함유 영역 (좌측상의 굵은 직선)으로 표시된다. 전사된 hFIX 영역 (단축된 제1 인트론을 나타내는 가는 선으로 연결된 개방된 직사각형) 다음에 3' 플랭킹 서열 영역 (우측에 굵은 직선)이 있다. 화살표: 전사 개시 부위; 애스터리스크: 번역 종료 코돈; pA: 폴리아데닐화; sl: 잠재적 스템-루프 형성 디뉴클레오티드 반복부.
hFIX 미니유전자 발현 벡터의 제작은 -416FIXm1을 개시 구조물로 사용하여 수행할 수 있었다 (Kurachi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 5276-5281). 본 연구에 사용된 뉴클레오티드 (nt) 번호 부여 시스템은 이미 보고된 완전 hFIX 유전자 서열을 기초로 하였다 (Yoshitake et al. (1985) Biochem. 24: 3736-3750). 미니유전자 -416FIXml/1.4는 BamHI 링커가 있는 하기 프라이머 세트 및 증폭 주형인 인간 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 생성된 3'UTR (크기: 1.2 kb)의 중간 부위를 삽입함으로써 -416FIXml로부터 제작하였다.
5' 프라이머: TAACAGGATCCGGCCTCTCACTAACTAATCAC (nt +31418 내지 +31438) (서열: 14)
3' 프라이머: CAACTGGATCCAAGATTCAAGATAGAAGGAT (nt +32690 내지 +32671) (서열: 15)
PCR 산물을 BamHI으로 절단하고, 생성된 단편을 -416FIXml의 3'UTR 부위에 삽입하여 전체 3'UTR을 함유하는 -416FIXml/1.4를 제작하였다. -416FIXml/0.7은 nt +32117에 인접한 3' 서열을 함유하는, BamHI 링커가 있는 PCR-증폭 700 bp 단편을 삽입함으로써 제작하였다. 사용된 프라이머 중 5' 프라이머는 -416FIXml/1.4의 경우에 사용한 것과 동일하며, 3' 프라이머는 GGACAGGATCCCCCAAACTTTTCAGGCAC (nt +32117 내지 +32097) (서열 16)이었다. 미니유전자 -590FIXml, -679FIXml, -770FIXml, -802FIXml 및 -2231FIXml은 SphI/NheI 절단에 의해 생성된 -416FIXml의 5' 말단 433 bp 서열을 각각 nt -590, -679, -770, -802 및 -2231까지 걸쳐 있는 5' 말단 hFIX 영역을 함유하는 607, 696, 787, 819 및 2248 bp 단편으로 바꿈으로써 제조하였다. 이들 607, 696, 787, 819 및 2248 bp 단편은 SphI 링커가 있는 하기 5' 프라이머와 하기 공통 3' 프라이머 및 증폭 주형인 인간 게놈 DNA로 수득된 PCR 산물을 SphI/NheI으로 절단하여 얻었다.
5' 프라이머:
CAAGCATGCATCTAGTGTTAGTGGAAGAG (nt -590 내지 -571) (서열: 17),
CAAGCATGCAAATATTAACTCAAAATGGA (nt -679 내지 -660) (서열: 18),
CAAGCATGCTGTTGTTTTTTGTTTTAAC (nt -770 내지 -752) (서열: 19),
CAAGCATGCAGCCATTCAGTCGAGGAAGG (nt -802 내지 -783) (서열: 20),
CAAGCATGCGATCCCTTCCTTATACCT (nt -2231 내지 -2214) (서열: 21)
3' 프라이머: TAAGCTTAACCTTTGCTAGCAGATTGT (nt +30 내지 +10) (서열: 22).
미니유전자-802FIXml/0.7 (그의 구조는 도 2에 나타내지 않음)은 nt 32,140까지 걸쳐 있는 3'UTR 영역을 포함하고, 이어서 이 영역은 다른 11개의 구조물 각각에 공통인 그의 하류 폴리(A) 신호 서열을 통해 nt 32,690에 연결된다.
-416FIXml/AE5'은 3'-말단 위치로 옮겨진 AE5' 영역을 갖는 구조물을 나타내고 우측에 개방된 상자로서 나타나 있다. -416FIXml/AE5'은 PCR ((nt -802 내지 nt -417)에 의해 생성된 KpnI 단편을 -416FIXml 벡터 (KpnI 부위는 FIX 유전자의 외부있음, 도 1)에 삽입함으로써 제작하였다. PCR에 사용된 5' 및 3' 프라이머는 각각 CTTGGTACCAGCCATTCAGTCGAGGAAGG (nt -802 내지 -783) (서열: 23) 및 CTTGGTACCATATGAATCCTTTCATAGAT, (nt -417 내지 -436) (서열: 24)이었다. 모든 구조물의 PCR 증폭 영역 뿐만 아니라 단편 결합 부위를 서열분석하여 정확한 서열 및 방향을 확인하였다.
<실시예 2>
인간 간세포암 HepG2 세포주에서의 hFIX 미니유전자 발현 벡터 11개의 일시적 시험관내 발현
hFIX 미니유전자 구조물의 일시적 시험관내 발현 활성은 HepG2 세포 및 이미 기재된 hFIX 특이적 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)을 일부 변형하여 사용함으로써 분석하였다 (Kurachi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 5276-5281). 세포 트랜스펙션은 인산칼슘-DNA 컨쥬게이트 방법 또는 퓨진 6 (FuGene 6; Boehringer Manheim)을 사용하여 수행하였다. 개선된 트랜스펙션 방법인 퓨진 6은 일관되게 트랜스펙션 효율을 증가시켜 상기 효율이 20%를 초과하였고 (Kurachi et al. (1998) Biochemica 3: 43-44), 퓨진 6을 사용하여 모든 초기 분석을 다시 조사하였다. 인자 IX 활성의 독립적인 분석을 4 또는 5회 수행하였고 그 평균을 표준 오차와 함께 나타내었다. 퓨진 6 트랜스펙션시, 조절 미니유전자-416FIXml은 전형적으로 ~50 ng/106세포/48시간의 수준으로 hFIX를 생성하였다.
도 1은 인간 FIX 미니유전자 발현 구조물의 상대적 시험관내 일시 발현 활성을 나타낸다 (도 1에 나타내지 않은 미니유전자 -802FIXml/0.7의 일시 발현 활성은 미니유전자 -416FIXml의 활성의 81.5%이었음). -416FIXml의 활성에 대한 일시 발현 활성 (∼50 ng/106세포/48시간, 100% 활성으로 정의됨)은 표준 편자와 함께 우측에 나타나 있다 (4-5회의 독립적인 분석으로부터 얻음). 활성은 사용된 미니유전자의 크기에 맞게 표준화하였다. 도 1에 나타낸 상대적인 일시적 발현 활성은 모든 구조물이 HepG2 세포 (∼50 ng/106세포/48 시간)에 있어서 비교적 높은 일시 hFIX 발현을 나타냄을 보인다. 그러나, 인버티드 (inverted) AT, GT 및 GC 디뉴클레오티드 반복부 [Yoshitake et al. (1985) Biochem. 24: 3736-3750]의 102 bp 스트레치를 포함하는, 완전 3'UTR을 함유하는 모든 구조물은 반복 서열이 없는 상응하는 미니유전자보다 25-30% 더 낮은 발현 활성도를 재현가능하게 나타내었다. hFIX 3'UTR에 나타나 있는 디뉴클레오티드 반복부와 유사하며 mRNA에서 안정한 스템-루프 (s1) 구조를 형성할 수 있는 디뉴클레오티드 반복부는 포유동물 뿐만 아니라 효모 및 식물에서 mRNA 안정성을 조절하는 데 관여함으로써 단백질 생합성 조절의 중요한 층을 제공한다 [Ross (1995) Microbiol. Rev. 59: 423-450]. 또한, 이들 결과는 HepG2 분석 시스템에서 hFIX 유전자의 구조가 hFIX 유전자의 발현에 대한 유사한 음성 조절 활성을 갖고 있음을 의미한다. 그러나, 아래에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 실시예 3), 디뉴클레오티드 반복 영역을 함유하는 hFIX 유전자의 3'UTR 구조는 hFIX 유전자의 진행성 연령 관련 조절에 결정적인 생체내 기능 (기대되지 않은 것)을 나타내었다.
HepG2 세포 분석 시스템에서 밝혀진 중요하고 놀라운 다른 발견은 이들 hFIX 미니유전자 (이 미니유전자은 hFIX 유전자의 상류 및 하류에 위치된 서열을 포함하며, 이종 리포터 유전자 대신에 동종 hFIX 유전자로부터 유래됨)에 의한 발현이 5' 상류 영역 (nt -802 up 내지 nt -1900)의 존재 하에 어떠한 억제-조절도 나타내지 않는다는 것이다 [Salier et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 7062-7068] (도 1). 반대로, CAT 리포터 유전자를 사용한 경우, 음성 조절 요소를 이 영역에서 확인하였다 [Salier et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 7062-7068].
<실시예 3>
hFIX 미니유전자 발현 벡터를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 발생 및 분석
형질전환 동물은 표준 방법에 따라 실시예 2에 기재된 발현 플라스미드를 사용하여 제작하였다 [Hogan et al. (1994) in "Manipulating the Mouse Embryo, a Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press, New York, 2nd Edition)]. 모든동물 실험은 미시건 대학의 기관 지침에 따라 수행하였다 (OPRR No. A3114-01).
간단히 말해, 인자 IX 미니유전자 발현 플라스미드를 SphI/KpnI으로 이중 절단하고 생성된 인자 IX 미니유전자-함유 단편을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 단리한 후, 스핀바인드 (SpinBind) DNA 추출 유닛 (FMC)으로 정제하였다. C57B/6 X SJL 마우스의 수정난을 DNA (1-2 ng/난(egge))로 미세주입하고 대리모 동물에 이식하였다 (CD-1).
A. 다중 PCR 분석
트랜스진 카피 수가 많은 파운더 동물을 찾기 위해, 꼬리 조직 DNA 샘플의 정량적인 다중 PCR 분석을 이용하여 태어난 자손을 스크리닝하였다. 2쌍의 하기 프라이머를 사용하였는데, 하나는 hFIX 트랜스진에 특이적이고 나머지 하나는 마우스 β-글로빈 유전자 (내인성 조절)에 특이적이다.
5' 프라이머: CTGTGGGAACACACAGATTTTGG (nt +6172 내지 +6195) (서열: 25)와 3' 프라이머: GGAATAATTCGAATCACAT (nt +30885 내지 +30867) (서열: 26); 및
5' 프라이머: CCAATCTGCTCACACAGGAT (nt +2590 내지 +2609) (서열: 27)와 3' 프라이머: CCTTGAGGCTGTCCAAGTGA (nt +3083 내지 +3064) (서열: 28).
이들 프라이머는 각각 hFIX 트랜스진으로부터의 단일 966 bp 단편 및 마우스 β-글로빈 유전자로부터의 494 bp 단편을 증폭하도록 디자인하였다. PCR은 94℃에서 3분 인큐베이션하여 개시한 후, 94℃/30초, 65℃/1분 어닐링 및 72℃/2분 신장으로 구성된 25 주기를 수행하였다.
파운더를 형질전환되지 않은 마우스 (C57B/6 X SJL)와 역교배하여 F1 자손동물을 발생시켰다. 동종접합 F2 동물은 이종접합 F1 한배 새끼를 서로 교배시켜 발생시키고 후세대를 유사하게 발생시켰다. 동물의 접합 상태는 상기 정량적인 다중 PCR 분석에 의해 결정하였다.
최소한, 각 미니유전자 구조물에 대해 3종의 파운더 라인을 2년 이하의 전체 수명동안 장기적으로 분석하였다.
도 3B는 꼬리 및 간 조직에서의 상대적인 트랜스진 수준을 측정하기 위한 정량적인 다중 PCR 분석의 결과를 보여준다. 게놈 DNA는 생후 3주 및 19개월에 형질전환 416FIXml 동물 (PA112)의 절단된 꼬리 조직으로부터 추출하였다. 간 DNA는 생후 19개월에 희생된 상기 동물 (PA112) 및 생후 1개월에 희생된 -416FIXml 동물 (PA412)로부터 추출하였다. hFIX 특이적 단편 (966 bp) 및 마우스 β-글로빈 특이적 단편 (494 bp, 내부 카피 수 조절)의 위치는 우측에 나타나 있다. 레인 1: kb 크기의 레더; 레인 2: 416FIXml 플라스미드로부터 증폭된 단편 크기 대조구; 레인 3: 주형인 비트랜스제닉 마우스 꼬리 DNA; 레인 4: 생후 3주된 PA112의 꼬리 DNA; 레인 5: 생후 19개월 된 PA112의 꼬리 DNA; 레인 6: 생후 1개월 된 PA412의 간 DNA;레인 7: 생후 19개월 된 PA112의 간 DNA. 내인성 마우스 β-글로빈 유전자에 맞게 표준화된, 1개월 된 동물 대 19개월 된 동물에 대한 상대적인 트랜스진 카피 수는 꼬리 게놈 DNA 표본 뿐만 아니라 간 게놈 DNA 표본 둘다의 경우 1.0-1.1이었고, 이는 연령에 따라 게놈의 hFIX 트랜스진이 손실되지 않음을 나타낸다 (비율의 정량 및 계산에 사용된 것은 바이오라드(BioRad)로부터의 멀티 분석 프로그램).
B. 트랜스제닉 마우스에서의 hFIX 수준의 면역분석
다양한 hFIX 미니유전자 트랜스진을 수반하는 대표적인 파운더 라인으로부터의 트랜스제닉 마우스를 장기적으로 분석하는 동안 순환하는 hFIX 수준을 관찰하였다. 생후 1개월부터 시작하여 다양한 연령에서, 꼬리-팁 스닙핑 (snipping)을 통해 트랜스제닉 마우스의 혈액 샘플을 개별적으로 채취하고 (∼100㎕의 분취액), 얻은 혈청을 통상적으로 사용함으로써 각 연령에서 2회의 hFIX-특이적 ELISA를 이용하여 순환중인 hFIX 수준을 정량하였다. 모은 인간 혈장 (George King Bio-Medical)을 사용하여 각 분석에 대한 hFIX 표준 곡선을 얻었다. 장기적인 분석에 있어서 분석 사이의 실험적인 변동을 최소화하기 위해, 이전 분석 군으로부터의 중복 혈청 샘플을 각 분석에 포함시켰다. 재현성을 보장하기 위해, 3 내지 6종의 독립적인 파운더 라인을 각 미니유전자 구조물에 대해 발생시키고, 적어도 3종의 대표적인 라인으로부터 발생된 동물의 전체 수명에 대해 장기적으로 분석하였다. 2회의 ELISA 값과 평균의 차이는 11% 이하 이었다. 결과는 도 2 및 4에 나타나 있다.
도 2 및 4에 있는 모든 패널에서, 동물의 표지는 태그 수 + 추가 정보를 기초로 한다. 표지 F 또는 P의 제1 문자는 각각 파운더 및 자손을 나타낸다. 자손 세대 (F1 또는 F2) 및 성별에 대한 정보는 괄호안에 있고 (m: 수컷, f: 암컷), 그 뒤에 상태 (+: 건강이 양호한 상태로 살아 있음; d: 죽음; s: 다양한 조사를 위해 희생됨; mo: 죽거나 희생된 연령)가 있다. 패널의 혼잡을 피하기 위해, 대표적인 동물로부터 얻은 결과를 각 미니유전자 구조물에 대해 나타내었다. 중요한 것은, 연령 조절 패턴이 각 특이적 구조물 및 다양한 파운더 라인에 대해 모든 동물 사이에 매우 유사하다는 것이었다. 도 2의 패널 A-E는 -416FIXm1 (A); -416FIXm1/1.4 (B), -590 FIXml (C), -679FIXml (D) 및 -770FIXml (E)를 갖는 대표적인 파운더 라인 동물을 나타낸다. 도 4의 패널 A-D는 -802FIXml, -802FIXml/1.4, -2231 FIXml 및 -2231FIXml/1.4 각각을 갖는 대표적인 파운더 라인을 나타낸다. 패널 E는 -416FIXml/AE5'를 갖는 대표적인 파운더 라인 동물을 나타낸다.
도 2는 -416FIXml 미니유전자을 수반하는 마우스가 생후 1개월에 천연 hFIX 유전자 발현도 (∼4 ㎍/ml)만큼 높은 수준부터 훨씬 더욱 낮은 수준 (∼50 ng/ml)까지 다양한 수준으로 hFIX를 생성한다는 것을 보인다 (도 2A). 이러한 다양성은 게놈내의 트랜스진 위치 효과에 주로 기인한다. 그러나, 미니유전자을 수반하는 대표적인 파운더 라인으로부터 얻은 동물의 순환 hFIX 수준은 발정기를 지나면서 급격히 감소하고 다음 2 내지 3개월 동안 훨씬 더욱 낮은 수준까지 감소한 후, 남은 수명동안 안정한 상태로 유지된다. 파운더 라인, 트랜스진 위치 효과로 인한, 발정기전 (생후 1개월) 초기 hFIX 수준의 차이, 세대 (파운더 및 F1 또는 F2 자손), 성별 또는 트랜스진의 접합 상태 (동종접합/이종접합)와 관계없이, 순환 hFIX 수준에서 이러한 특징적인 급속 연령 의존성 감소는 분석된 모든 동물 (n=69)에서 관찰되었다.
C. 트랜스제닉 마우스에서의 hFIX mRNA의 노던 블롯 분석
동물로부터 얻은 간 RNA 샘플 (레인 당 15 ㎍)의 노던 블롯 분석은32P-표지된 SspI/BamHI 단편 (cDNA의 hFIX 코딩 영역의 3' 절반)을 프로브로 사용하고 엄격한 세척 조건을 이용하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [상기 문헌 (Kurachi et al. (1995)]. 이들 조건 하에, 상기 프로브는 마우스 FIX mRNA 밴드 (3.2 kb 및 2.2 kb)와 약간 교차 혼성화하면서 hFIX 미니유전자 mRNA 밴드 (∼1.7 kb)와 매우 강하게 혼성하였다 [Yao et al. (1994) Gene Therapy 1: 99-107].
각 레인에 등량의 RNA가 존재함을 확인하기 위해, hFIX 프로브로 미리 혼성화된 필터의 프로브를 제거하고 RNA18 cDNA (라이보좀 RNA 18S)를 프로브와 혼성화시켰다. 핵심 파운더 라인의 동물의 전체 수명에 대해 장기적인 분석을 완료한 후, 대표적인 라인을 배아-동결시켜 보존하였다.
-416FIXml을 수반하는 동물의 간에서의 트랜스진 DNA 및 인간 FIX mRNA의 수준을 노던 분석한 결과는 도 3A에 나타나 있다. 어린 형질전환 동물 (PA412: F1/f, 1개월 된 동물) 및 성숙 형질전환 동물 (PA112; Fl/f, 19개월 된 동물)의 간에서의 hFIX mRNA 수준을 간의 총 RNA의 노던 블롯 분석으로 분석하였다. PA412 및 PA112 동물은 파운더 FA661이 낳은 동일한 한배 새끼이고, 생후 1개월에 각각 1252 및 1675 ng/ml 순환 hFIX를 발현하였다. PA112는 희생시에 63.8 ng/ml의 혈청 hFIX를 발현하고 있었다. 레인 1: 비트랜스제닉 마우스 간 RNA; 레인 2: 형질전환 PA412 간 RNA; 레인 3: 형질전환 PA112 간 RNA. 좌측 또는 우측에 있는 FIX 및 18S는 각각 hFIXml mRNA (∼1.7 kb) 및 RNR18 (1.9 kb, 리보좀 RNA)의 밴드 위치를 나타낸다.
도 3A는 도 2에 관찰된 혈액 hFIX 수준의 감소와 정상 상태의 간 hFIX mRNA의 유사한 감소의 관련성을 보여주는데, 이러한 감소는 노화하면서 hFIX 트랜스진의 손실이 있기 때문이다 (도 3B). 이것은 hFIX 수준이 매우 감소된 4-5개월 된 마우스가 자손을 낳았을 경우, 그들의 새끼가 동일한 시점 (생후 1개월)에서 그들의 부모와 동일한 발정전 hFIX 고발현도를 나타낸다는 사실에 의해 더욱 지지되었다.
미니유전자 벡터 -416FIXml/1.4는 3'UTR의 중간 영역에 있는 디뉴클레오티드 반복 구조 (길이: 102 bp)를 포함하는 완전한 3'UTR을 함유한다는 것을 제외하고 -416FIXml와 동일하다 [Yoshitake et al. (1985) Biochem. 24: 3736-3750] (도 1). -416FIXml/1.4를 갖는 트랜스제닉 마우스 (n=48) (도 2B)는 높은 발정전 hFIX 수준을 보였고, 그 뒤에 노화하면서 -416FIXml과 유사한 hFIX 수준의 연령-의존성 감소를 보였지만 (도 2A), 이 감소는 -416FIXml의 경우에 관찰된 것보다 덜 급격하고 발현 수준은 -416FIXml의 경우에 관찰된 것보다 훨씬 더 높은 수준에서 안정화되었다 (도 2B).
이들 결과는, hFIX 3'UTR의 디뉴클레오티드 반복 구조를 포함하는 102 bp 서열이 hFIX의 발현의 연령 관련 감소를 완화시킬지라도, 보다 긴 디뉴클레오티드 반복 구조를 포함하는 완전한 3'UTR의 존재가 파운더 라인, 초기 발정전 hFIX 수준, 세대, 성별 또는 트랜스진의 접상 상태와 관계없이 이들 모든 동물에서 관찰된 연령 관련 감소로부터 hFIX 발현을 완전히 구제하지 못함을 의미한다.
미니유전자 -590FIXml 및 미니유전자 -679FIXml을 수반하는 모든 동물 (장기적인 분석에 각각 총 25마리 및 26마리의 동물을 사용함)도 -416FIXml를 수반하는 동물에서 보여진 것과 유사한 hFIX 발현의 연령 관련 급강을 보였다 (도 2, C 및D). 더욱이, -770FIXml을 수반하며 최근에 발생된 3종의 독립적인 파운더 동물에서의 hFIX 발현도도 상기 미니유전자과 유사한 패턴으로 발정기에 걸쳐 급속히 감소하였다 (도 2E). 이들 관찰은 nt -771까지 걸쳐 있는 프로모터 영역을 갖는 미니유전자이 hFIX 발현에 필수적인 기본 구조 요소를 포함하지만, hFIX 유전자 발현의 연령 관련 안정성에 작용하는 구조 요소(들)를 갖고 있지 않다는 것을 의미한다.
반대로, 미니유전자 -416FIXml을 수반하는 동물(도 2A)과 비교할 때 미니유전자-802FIXml를 수반하는 동물(도 4A)에서는 hFIX 발현 패턴에서의 예기치 않은 놀라운 차이가 관찰되었다. -802FIXml은 포함된 5' 말단 플랭킹 서열이 nt -802까지 걸쳐 있다는 점을 제외하고는 -416FIXml과 동일한 벡터 프레임으로 구성된다 (도 1).
-802FIXml, -2231FIXml 및 -416FIXml/AE5'를 갖는 모든 동물 (패널 A, C, E)은 이들의 전체 수명에 걸쳐 안정한 발현을 보였다. 802FIXml/1.4 및 -2231FIXml/1.4 (도 4 B, D)를 갖는 동물은 hFIX 발현도에 있어서 연령 관련 증가를 보였다. 모든 동물은 파운더 라인, 생후 1개월에서의 초기 발현 수준, 성별, 세대 또는 접합 상태와 관계없이 안정한 순환 hFIX 수준을 유지하거나 증가시켰다. 예측된 정상 수명보다 훨씬 더 어린 나이에 죽은 마우스는 d로 표시한다. 상기 결과는 -802FIXml(도 4A)를 갖는 3종의 독립적인 파운더 라인으로부터 얻은 모든 동물이 -416FIXml(도 2A) 및 -416FIXml/1.4(도 2B)를 갖는 동물의 hFIX 발현 패턴에서 특징적인 차이를 보였음을 나타낸다.
장기적으로 분석한 -802FIXml 형질전환 동물 (n = 62)은 변함없이 그들의 전체 수명동안, 통상적으로 2024개월 이하동안 연령-안정 혈장 hFIX 수준을 보였다. 연령-안정 순환 hFIX 수준은 연령-안정 mRNA 수준과 연관성이 있다 (도 5). -802FIXml의 경우 이러한 관찰은 -2231FIXml를 수반하는 마우스에 의한 연령-안정 hFIX 발현에 의해 더 지지되었다 (도 4C). 또한, 이러한 결과는 hFIX 유전자의 연련-안정 발현에 책임있는 구조 요소가 nt -770 내지 -802에 걸쳐 있는 소영역에 존재함을 암시한다. 본 발명자들은 이 소영역을 "5' 말단에 있는 연령-조절 요소" (AE5')로 지칭하였다. 이 영역은 컨센서스 모티프 (C/G)AGGA(A/T)G와 완전히 일치하는 전사 인자 PEA-3 뉴클레오티드 서열(GAGGAAG: nt -784 내지 -790)을 포함한다 [Martin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5839-5843; Xin et al. (1992) Genes & Develop. 6: 481-496; Chotteau Lelievre et al. (1997) Oncogene 15: 937-952; Gutman and Wasylyk (1990) EMBO J. 9: 22412246]. AE5' 뉴클레오티드 서열의 기능은 -416FIXml/AE5' (여기서, AE5'은 hFIX 미니유전자의 3' 말단 외부로 옮겨져 있음)를 함유하는 동물에 의한 연령-안정 hFIX 발현에 의해 나타낸 바와 같이 위치와 관련없다 (도 4E).
-416FIXml, -590FIXml, -679FIXml 및 -770FIXml의 트랜스진과 미니유전자-802FIXml 및 미니유전자 -2231FIXml은 그들의 프로모터만 다르기 때문에, 이들 미니유전자 모두로부터 생성된 hFIX mRNA (인트론은 FIXml RNA의 형태로 스플라이싱됨)는 동일한 hFIX 단백질을 생성할 것으로 기대되었다. 따라서, -416FIXml, -590FIXml, -679FIXml 및 -770FIXml를 갖는 동물에서는 관찰되지만 -802FIXml 및 -2231FIXml를 갖는 동물에서는 관찰되지 않는, 순환 hFIX 수준에서의 연령-의존성 감소는 트랜스진의 전사 활성에서의 연령-의존성 감소에 기인해야 한다고 가정하였다. 이것은 -802FIXml을 수반하는 동물(도 5, 레인 2 및 3)에서는 간의 hFIX mRNA 수준이 연령에 따라 별로 변화되지 않은 것을 관찰하였지만 -416FIXml을 갖는 동물(도 3A, 레인 2 및 3)에서는 정상 상태 mRNA 수준에서의 진행성 연령-의존성 감소를 관찰하였다는 사실과 일치한다.
순환 hFIX 수준의 연령-의존성 감소가 트랜스진의 전사 활성의 연령-의존성 감소로 인한 것인지를 추가로 결정하기 위해, 순환류로부터 hFIX 제거에 대한 연령의 효과를 다음과 같이 시험하였다. 혈장으로부터 유도된 hFIX 제제(PBS 0.1 ml 당 5 ㎍) 분획을 트랜스제닉 마우스(C57B/6X SJL)와 동일한 유전적 배경을 갖는 2, 9-10 및 19-23 개월 령의 정상 동물(연령 군 당 n=3)의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 단백질 주입 후 10분, 2, 6, 12, 18, 24, 30, 36 및 48 시간 후에 채혈한 혈액 시료(약 50 ㎕ 분획)를 ELISA법에 의해 분석하여 순환류 중 hFIX 수준을 모니터링하였다. 예상한 바와 같이, 여러 연령 군의 모든 동물들은 초기 급속한 제거 단계(α-단계) 이후에 이보다 느린 제거 단계(β-단계)를 갖는 전형적인 2-단계 제거 반응속도론(2 부분 분포 및 제거)을 나타내었다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
| 마우스에서 인간 인자 IX의 제거 시간 | |
| 연령(개월) | 제거 시간(인간 인자 IX의 T1/2) |
| 2 | 16.8 ±0.21 |
| 9-10 | 17.4 ±0.55 |
| 19-23 | 16.9 ±0.35 |
표 1에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 연령의 군에 대해 매우 유사한 절반 제거 시간이 관찰되었다. 이는 다른 종인 BALB/c 마우스(2 개월 령)에서 hFIX 제거에 대한 우리의 선행 결과(17.8 시간)와도 일치한다(Yao et al. (1994) supra).
또한, 표 1의 결과는 순환류로부터 hFIX의 턴오버 시간이 초령(2 개월)에서 중간 연령(9-10 개월) 내지 노령(19-23 개월)에 이르기까지 연령 증가에 따라 생체내에서 크게 변화하지 않음을 증명한다. 이러한 결과에 의해 순환 hFIX 수준에서 연령-의존성 감소가 트랜스진 전사 활성의 연령-의존성 감소로 인한 것임을 추가로 확인하였다.
시험관내 HepG2 세포 분석 시스템에서는 미니유전자내 AE5'의 존재 또는 부재로 인해 hFIX 미니유전자로부터의 hFIX 발현에 있어서 어떤 큰 차이가 없음을 유의해야 한다(도 1, 및 실시예 2, supra). 대조적으로, 상기 실시예에서 언급한 바와 같이, 생체내 AE5'의 존재 또는 부재로 인해 hFIX 유전자 발현에 있어서 큰 연령-의존성 차이가 나타난다. 이는 생체내 장기적인 분석이 유전자의 연령에 따른 조절을 연구하는데 있어 중요하다는 사실을 추가로 입증한다.
-802FIXm1을 갖는 동물과는 달리, -802FIXm1/1.4를 갖는 마우스(완전한 3'UTR을 포함)는 순환류 중 hFIX 수준의 연령 증가와 관련된 증가를 나타내었다(n=48)(도 4A 및 B). 따라서, 순환하는 hFIX 수준에서 이러한 예상치 못한 연령-의존성 증가가 간 hFIX mRNA의 수준 증가와 직접적인 상관관계가 있는지를 결정하기 위해, -802FIXm1 및 -802FIXm1/1.4를 보유하는 트랜스진의 노던 블롯분석을 수행하였다. -802FIXm1를 보유하는 1-개월(초령) 또는 15-개월(령) 마우스(각각, 마우스 P327 또는 P552) 및 -802FIXm1/1.4를 보유하는 1-개월(초령) 또는 15-개월(령) 마우스(각각, 마우스 P32 및 P697)의 간의 hFIX mRNA 수준은 도 5에 나타나 있다. 이러한 동물은 -802FIXm1에 대한 파운더 F17549 및 -802FIXm1/1.4에 대한 파운더 F229에 의해 생산된 동일한 리터 유래의 것이었다(도 4A 및 B). 희생 시에, P552 및 P697은 hFIX를 각각 2200 및 1658 ng/ml을 발현시켰다. 각 동물로부터 간의 RNA 총 15 ㎍을 도 3A에 기재된 바와 같이 수행된 노던 블롯 분석에 사용하였다. 상부 패널: hFIX cDNA의 SspI/BamHI 단편으로 프로빙; 하부 패널: RNR18(리보좀 RNA) 프로브로 재혼성화. 레인 1: 비-트랜스제닉 마우스 간; 레인 2: 트랜스제닉 P327 간 RNA; 레인 3: 트랜스제닉 P552 간 RNA, 레인 4: 트랜스제닉 P32 간 RNA; 레인 5: 트랜스제닉 P697 간 RNA. 포스포이메이져(PhosphorImager)(Molecular Dynamics)를 사용하여 mRNA 수준(계수)을 정량하고 초령 대 노령 마우스의 비율을 계산하였다. -802FIXm1을 보유하는 초령 및 노령 동물은 mRNA 수준(노령 대 초령 비율: 0.92)에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았다. 대조적으로, -802FIXm1/1.4 동물은 더 노령의 동물에 비해 mRNA 수준에 있어서 실제적인 증가를 나타내었다(노령 대 초령의 비율: 1.54).
이 결과(도 5, 레인 4 및 5)는 디뉴클레오티드 반복 구조의 넓은 스트레치가 포함된 3'UTR의 중간 근처에 위치하는 AE3'로 명명되는 다른 중요한 연령-조절성 뉴클레오티드 서열의 존재를 나타내었다. AE5'의 존재시에, AE3'은 hFIX 발현에 있어서 결정적인 연령 관련 증가를 분명히 제공한다. 이러한 결론은 -2231FIXm1/1.4(n=42)로 얻어진 결과에 의해 추가로 뒷받침된다(도 4D). AE5'과 AE3'의 조합에 의해 제공되는 독특한 조화된 기능은 또한 파운더 라인, 1 개월 령의 초기 발현 수준, 성별, 세대, 또는 동물의 접합자 구조의 상태와는 독립적이었다.
흥미롭게도, 순환류 중 지속된 높은 hFIX 수준을 나타내는 동물은 예상된 수명 기간(약 2년) 보다 훨씬 더 이른 연령에서 죽는 경향이 있었다 (도 4A, B, D). 이러한 결과는 수컷 및 암컷 모두에게서 나타났으나, 수컷에서 보다 빈번한 것으로 보인다. 어떤 특정의 메카니즘으로 본 발명을 한정하지 않는다면, 이러한 트랜스제닉 마우스가 그들 자신의 mFIX 이외에도 hFIX를 갖기 때문에, 이 마우스는 트랜스진을 발현시키지 않는 야생형 마우스에 비해 치명적인 혈전증을 일으킬 위험이 증가될 수 있는 것으로 생각된다.
hFIX 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스의 상기 기재된 특징은, (a) 시험관내 HepG2 세포에서 AE5'의 존재가 hFIX 유전자 발현에는 영향을 주지 않지만, 생체내 AE5'의 존재는 hFIX 유전자 발현에서 연령-의존성 안정성을 크게 증가시키고, (b) -416FIXm1, -590FIXm1, -679FIXm1 및 -770FIXm1을 갖는 동물에서 관찰된 순환성 hFIX 수준에서 연령-의존성 감소는 안정한 상태의 mRNA 수준의 감소와 직접적인 상관관계가 있으며, 발명자들은 이것이 트랜스진 전사 활성의 연령-의존성 감소로 인한 것이라고 믿고 있으며, (c) -802FIXm1/1.4를 운반하는 동물은 더 노령의 마우스의 hFIX의 간 mRNA 수준의 실제적인 증가를 나타내었음을 입증한다.
<실시예 4>
인간 인자 IX의 뉴클레오티드 -665 내지 -805 영역의 풋프린트 및 겔 전기영동 이동성 변화 분석.
AE5'의 기능에 관여하는 AE5' 내 영역을 미리 결정하기 위해, 풋프린트 분석 및 겔 전기영동 이동성 변화 분석을 다음과 같이 수행하였다.
A. 풋프린트 분석
뉴클레오티드 -665 내지 -805에 걸친 영역의 풋프린트 분석을 위해,32P-표지된 5' 프라이머 ATGGTTAACTGACTTACGAA(뉴클레오티드 -833 내지 -814)(서열 29) 및 3' 비표지된 프라이머 GCTCCATTTTGAGTTAATATTTGTGT(뉴클레오티드 -657 내지 -682)(서열 30)를 사용하여 PCR에 의해 사용되는 단편을 증폭하였다. HepG2 인간 간세포 및 초령(1 개월 령) 및 노령(19 개월 령) 마우스의 간으로부터의 핵 추출물(NE)을 선행 문헌[Kurachi et al. (1986) Biochemistry 33:1580-1591]에 보고된 바와 같이 제조하였다. 여러가지 양의 NE(0, 100 및 150 ㎍)를 얼음상에서 1시간 동안 표지된 단편(30,000 CPM)과 함께 인큐베이션하고, 실온에서 2분 동안 DNase 1 절단(0.5 유닛)처리하였다. 시험된 시료는 NE를 포함하지 않는 것, HepG2 세포 NE를 100 ㎍ 및 150 ㎍ 포함하는 것, 노령 마우스로부터의 NE를 100 ㎍ 및 150 ㎍ 포함하는 것, 초령 마우스로부터의 NE를 100 ㎍ 및 150 ㎍ 포함하는 것이었다. 주요 및 소수 풋프린트 및 분명한 DNase 과민성을 관찰하였다.
노령 마우스 간의 핵 추출물을 사용한 뉴클레오티드 -665 내지 -805 영역의 풋프린트 분석은 메이저 풋프린트(뉴클레오티드 -784 내지 -802), 마이너풋프린트(뉴클레오티드 -721 내지 -728) 및 흥미로운 DNase 과민성 영역(뉴클레오티드 -670 내지 -714)을 보여주었다. 1개월 령 내지 노령 동물 또는 HepG2 세포로부터의 핵 추출물을 사용하면, 이러한 분명한 풋프린트는 관찰되지 않았다.
B. 겔 전기영동 이동성 변화 분석
3가지 다른 연령 군으로부터의 마우스 간 핵 추출물을 사용하는 겔 전기영동 이동성 변화 분석을 이용하였다. 1, 5 또는 19 개월 령의 마우스 간으로부터 핵 추출물을 제조하였다(상기 문헌에 기재된 바와 같음). hFIX 유전자의 뉴클레오티드 -797에서 -776에 걸쳐 있는 PEA-3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중쇄 올리고뉴클레오티드(TTCAGTCGAGGAAGGATAGGGT)(서열 31)를 1.9 ×109cpm의 특이적 활성으로 5' 말단에서32P-표지하였다. 방사성-표지된 올리고뉴클레오티드(20,000 cpm) 분획을 실온에서 20분 동안 DNA 결합 완충액 중에서 폴리 dI-dC 1 ㎍의 존재하에 NE 10 ㎍과 함께 인큐베이션하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동처리하였다(Kurachi et al. (1986) supra). 도 6A에서, 레인 1: NE 무함유; 레인 2: 1 개월 령 마우스의 NE 함유; 레인 3: 5 개월 령 마우스의 NE 함유; 레인 4: 19 개월 령 마우스의 NE 함유; 레인 5: 마우스 뇌의 NE 함유(PEA-3에 대한 양성 대조군, 약간 더 큰 크기의 이동된 밴드를 보여줌).
도 6B는 PEA-3 뉴클레오티드 서열을 포함하는32P-표지된 이중쇄 올리고뉴클레오티드에 대한 경쟁적 분석의 결과를 나타낸다. 이전 단락에 기재된 100-배 과량의 비표지된 올리고뉴클레오티드 또는 변이체올리고뉴클레오티드[TTCAGTCGGTTGGTGATAGGGT(서열 32), 변이된 서열에는 밑줄이 그어져 있음]를 19 개월 령 마우스 간의 NE 10 ㎍과 함께 5분 동안 인큐베이션한 다음, 상기 문헌에 기재된 바와 같이32P-표지된 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다. 레인 1: NE 무함유; 레인 2: NE 함유; 레인 3: NE 및 야생형 경쟁자 함유; 레인 4: NE 및 변이체 경쟁자 함유.
상기 풋프린팅 결과와 일치하는 것으로, 겔 전기영동 이동성 변화(밴드 변화) 분석은 노령 마우스(19 개월 령)의 핵 추출물을 사용한 단백질 결합에서의 증가를 보여주었다(도 6A). PEA-3 모티프를 보유하는 과량의 올리고뉴클레오티드의 사용으로 밴드 변화는 경쟁적으로 감소하였지만, 변이체 PEA-3 모티프 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하자 그렇지 않았으며, 따라서 AE5'에서 PEA-3 모티프의 존재를 확인하였다. Ets 전사 인자 군의 한 구성원이며, AE5' 영역내에서 PEA-3 뉴클레오티드 서열과 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열[서열 40, 서열 48 및 서열 84]과 결합하는 것으로 알려져 있는 PEA-3 단백질[Karim et al. (1990) Genes & Develop. 4:1451-1453; Nelsen et al. (1993) Science 261:82-86; Fisher et al. (1991) Oncogene 6:2249-2254]은 유전자의 연령 안정성 조절에 있어서 이와 같은 독특한 역할과 관련이 있음이 최초로 밝혀졌다.
본 발명을 어떤 특정의 메카니즘으로 한정하지 않는다면, hFIX 유전자내 PEA-3 뉴클레오티드 서열은 본래 부가된 L1 서열의 아마도 5'의 특정 위치로의 재전위에 의한 진화적 이동을 통해 생성된 것으로 보인다. 근래의 재전위가능한L1[Kazazian et al. (1988) Nature 332:164-166; Dombroski et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6513-6517; Minakami et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:3139-3145; Dombroski et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:4485-4492]은 상응하는 PEA-3 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는다. AE5' 뉴클레오티드 서열의 PEA-3 뉴클레오티드 서열은 근래의 재전위가능한 L1의 ORF2 대응 영역과 63 내지 70 %의 유사성을 보유하는 L1 유래의 서열내에 5'에서 3' 방향으로 존재한다. 흥미롭게도, 쥐 FIX 유전자는 또한 그의 5' 말단 영역내에 hFIX 유전자에서와 거의 동일한 위치에 L1 유래의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여러 PEA-3 컨센서스 뉴클레오티드 요소를 갖는다[Kawarura et al. in Organization of L1 Sequence in the 5' Flanking Region of Factor IX Gene[in preparation]]. 쥐 FIX 유전자의 연령-조절은 hFIX 유전자의 것과 매우 유사하며[Sweeney and Hoering (1993) Am. J. Clin. Pathol. 99:687-688; Kurachi et al. (1996) Thromb. Haemost 76:965-969], 따라서 FIX 유전자의 연령 관련 조절의 기초가 되는 분자 메카니즘의 진화적인 기원에 대한 통찰력을 추가로 제공한다.
<실시예 5>
hFIX 프로모터 조절하의 전형적인 hFIX 유전자의 간 특이적 발현
천연 FIX 유전자의 발현은 실제로는 간으로 한정된다[Salier et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:7062-7068]. hFIX 미니유전자에서 상류 및(또는) 하류 서열 중 어떤 것이 hFIX 트랜스진의 간 특이적 발현을 지시하는 지를 결정하기 위해, -416FIXm1 및 -802FIXm1 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스에서 상기(실시예3)에 기재된 바와 같이 노던 블롯 분석을 수행하였다. hFIX를 높은 수준으로 발현하는 동물(각각 -416FIXm1 및 -802FIXm1을 보유하는 PA412 및 P580) 중 1 개월 령의 것을 희생시켜 전체 RNA를 간, 폐, 소장, 근육, 신장, 뇌 및 심장, 및 트랜스펙션되지 않은 HepG2 세포(음성 대조군)로부터 추출하였다. -416FIXm1 및 -802FIXm1을 보유하는 트랜스제닉 마우스에서의 결과는 도 7A 및 7B에 각각 나타나 있다.
도 7에서, hFIX mRNA, RNR18 (웰에서 RNA 로딩에 대한 대조군) 및 리보좀 28S 및 18S RNA 밴드의 위치는 좌측 및 우측에 각각 나타나 있다. -416FIXm1/1.4 및 -679FIXm1를 갖는 동물은 -416FIXm1의 패턴(A)과 유사한 조직 특이적 발현 패턴을 나타내었다 (데이타 미제시). 흥미롭게도, AE5'을 포함하는 영역이 결여되어 있는 미니유전자에 대해 관찰된 hFIX (충분한 자손 동물을 이용할 수 있게 될 때 시험된 -770FIXm1은 제외함)의 간 발현 수준은 높지만, 천연 유전자를 갖는 동물에서 관찰되는 바와 같이 건강한 경우는 그렇지 않았다. 또한, 이러한 미니유전자는 간뿐만 아니라 다른 조직, 예를 들어, 신장, 폐 및 근육에서도 간 발현 수준의 약 20 %와 같은 높은 다양한 수준으로 발현되었다 (도 7A). 대조적으로, -802FIXm1을 갖는 동물은 천연 FIX 유전자에 대한 것과 유사한 간 특이적 hFIX 발현을 실제적으로 나타내었다 (도 7B). 이러한 결과는 AE5' 영역이 hFIX의 간 특이적 발현을 조절한다는 사실을 시사한다.
ETS 족 표적 서열 5'-CCCGGAAG-3'(서열 48)을 포함하는 아포리포단백질 전사 조절 영역(ACR)은 시험관내 간 유래의 HepG2 세포에서 인핸서 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, ACR은 간 특이적인 것으로 보이지 않는다[Yang et al.(1998), supra].
<실시예 6>
HepG2 간 세포에서 PEA-3 단백질의 발현
트랜스진 FIX의 발현은, AE5'를 포함하는 발현 벡터를 사용한 경우, 생체내에서는 관찰되었지만, 시험관내 HepG2 세포에서는 관찰되지 않았다(실시예 2 및 3, supra를 참조). 이러한 관찰 결과는 HepG2 세포 NE에서 풋프린트의 부재와 함께 (실시예 4, supra를 참조) 발명자들에게 HepG2 세포의 FIX 트랜스진의 발현 결여가 본 발명의 PEA-3 뉴클레오티드 서열의 상동체와 결합하는 세포의 PEA-3 단백질(및(또는) PEA-3 관련 단백질)이 낮은 수준으로 발현된 결과일 수 있음을 시사하였다. 완전한 인간 PEA-3 cDNA는 아직 클로닝되지 않았다 (젠뱅크 기탁 번호 U18018의 인간 PEA-3 cDNA 서열은 마우스 PEA-3 cDNA 서열과 비교했을 때 N-말단 영역의 아미노산 8개가 결여되어 있다). 시험관내 유전자 발현에서 PEA-3 뉴클레오티드 서열의 역할을 결정하기 위해, 마우스 PEA-3 단백질을 과다발현하는 HepG2 세포를 하기와 같이 제작하였다.
<실시예 7>
AE5' 및 AE3'을 포함하는 전형적인 인간 단백질 C 미니유전자 발현 벡터의 시험관내 및 생체내 발현
단백질 C는 항-혈액 응고 메카니즘에서 중요한 역할을 하는 인자이다. 순환류 중 수준이 연령 증가에 따라 실제적으로 증가하는 인자 IX와는 달리, 순환류 중 단백질 C 수준은 연령 증가에 따라 증가하지 않으며, 오히려 시간에 따라 약간 감소하는 것으로 나타난다. 본 발명자들은 순환하는 단백질 C 수준에서의 이러한 감소가 유전자 발현 수준에서의 조절의 결과라고 생각하였다. 이러한 이유로 인해, 단백질 C 유전자는 다음과 같이 시험관내 및 생체내 둘 다에서 유전자 발현에 있어서 AE5' 및 AE3' 기능의 다양성을 입증하는 흥미로운 전형적인 유전자를 제공한다. 이 실시예에서는, 선행 문헌[Miao et al. (1996) J. Biol. Chem. 16:9587-9594]에 기재된 바와 같이, 주요 전사 개시 부위(+1)에 대해 상대적으로 염기에 숫자를 부여하였다.
A. 인간 단백질 C 미니유전자 발현 벡터의 작제
인간 단백질 C 게놈 서열은 이미 보고되었다[젠뱅크 기탁 번호 M11228, 도 12b]. 이 서열을 사용하여, 세가지 단백질 C 미니유전자 발현 벡터를 제조하였다. 첫번째 인간 단백질 C 미니유전자 벡터 (-1426PCm1)는 첫번째 전체 인트론 및 폴리-A 서열을 포함하는 인간 단백질 C cDNA (젠뱅크 기탁 번호 X02750; 도 12a)에 라이게이션된 단백질 C 유전자 (젠뱅크 기탁 번호 M11228; 도 12b)의 인간 단백질 C 프로모터 영역을 포함하였다. 두번째 인간 단백질 C 미니유전자 (AE5'/-1426PCm1)는 인간 단백질 C cDNA의 5' 말단에서 뉴클레오티드 서열 AE5'을 추가로 포함하고 있다는 점을 제외하면 첫번째 벡터와 동일하였다. 세번째 인간 단백질 C 미니유전자 (AE5'/-1426PCm1/AE3')는 각각 인간 단백질 C cDNA의 5' 및 3' 말단에서 뉴클레오티드 서열 AE5' 및 AE3'을 추가로 포함한다는 점을 제외하면 첫번째 벡터와 동일하였다.
B. 시험관내 HepG2 세포에서 인간 단백질 C의 일시적인 발현
FuGene 6 (Boehringer Mannheim)를 사용하여 단백질 C 미니유전자 발현 벡터 각각을 HepG2 세포내에 트랜스펙션시켰다. 인간 단백질 C 활성에 대한 4가지 또는 5가지 독립적인 분석을 선행 문헌[Turkey et al (1999) Throm. Haemost. 81:727-732]에 기재된 바와 같이 수행하였다. -1426PCm1 벡터로 트랜스펙션된 HepG2 세포는 AE5'/-1426PCm1 벡터로 트랜스펙션된 HepG2 세포에 의해 나타난 활성에 비할만한 시험관내의 일시적인 단백질 C 활성(즉, 60-70 ng/10E6 세포/24 시간)을 나타내었다.
C. 단백질 C 미니유전자 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스의 발생
AE3'과 함께 AE5'가 인자 IX 발현에 대해 관찰된 바와 같이 연령 증가에 따라 인간 단백질 C의 발현을 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위해(실시예 3, supra), 단백질 C 미니유전자 발현 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 표준 방법에 따라 발생시켰다[Hogan et al. (1994), supra]. 요컨대, 단백질 C 미니유전자 벡터 플라스미드를 C57B/6X SJL 마우스의 수정란에 주입하고, 대리모 동물(CD-1)에 이식하였다. 단백질 C 트랜스진으로부터의 독특한 단편 및 마우스 β-글로빈 유전자로부터의 494 bp 단편을 각각 증폭시키기 위해 디자인된 두쌍의 프라이머를 사용하는 꼬리 조직 DNA 시료의 정량적 복합 PCR 분석을 이용하여, 출생한 자손을 높은 트랜스진 카피수(게놈 당 5 내지 10 카피)를 갖는 파운더 동물에 대하여 스크리닝하였다.
파운더를 비-트랜스제닉 마우스(C57B/6X SJL)와 역교배하여 F1 자손 동물을 발생시켰다. 이종접합 F1 한배 자손들끼리 교배하여 동종접합 F2 동물을 발생시키고, 다음 세대도 이와 유사하게 발생시켰다. 동물의 접합자 구조의 상태를 상기 기술한 바와 같은 정량적 복합 PCR 분석에 의해 결정하였다. 각 미니유전자 구조물에 대해 파운더 라인을 2년 이하의 이들의 전체 수명 범위에 대한 장기적인 분석을 하였다.
단백질 C 미니유전자 트랜스진을 보유하는 대표적인 파운더 라인 유래의 트랜스제닉 마우스의 장기적인 분석 동안에 순환성 인간 단백질 C 수준을 모니터링하였다. 트랜스진의 위치상 효과, 세대(파운더 및 F1 또는 F2 자손), 성별, 및 트랜스진의 접합자 구조(동형접합체/이형접합체) 상태에 기인한 각각의 특이적 구조물, 여러 파운더 라인, 발정기전 연령(1개월)에서 다른 초기 인간 단백질 C 수준에 대해 모든 동물들끼리 순환성 인간 단백질 C 수준의 연령-조절 패턴을 비교하였다.
순환성 인간 단백질 C 수준에서의 어떤 변화가 연령 또는 인간 단백질 C의 턴오버 시간의 변화로 인한 인간 단백질 C 트랜스진의 감소보다는 안정한 상태의 간 인간 단백질 C의 mRNA 수준의 유사한 변화와 상관관계가 있는지를 결정하기 위해, 엄격 세척 조건을 사용하여 동물로부터의 간 RNA 시료에 대한 노던 블롯 분석을 수행하였다. 인간 단백질 C 서열뿐 아니라 AE5' 및 AE3'를 포함하며, AE5' 및 AE3' 부재하에 인간 단백질 C 서열을 발현시키는 트랜스제닉 동물에서의 수준과 비교했을 때, 동물 연령 증가에 따라 안정한 순환성 인간 단백질 C의 수준을 증가시키는 트랜스제닉 동물에 대한 관찰 결과는, AE5' 및 AE3'의 조합이 전형적인 인간 단백질 C 유전자의 연령 안정성 발현에서 작용함을 입증한다. 이러한 관찰에 의해 상기 결과가 전형적인 hFIX 및 단백질 C 유전자 이외의 유전자에 대해 달성될 수있음을 확인하였다.
<실시예 8>
사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 AE5'와 AE3'을 포함하는 발현 벡터 예의 생체외 발현
바이러스 프로모터를 사용하여 AE5'와 AE3'의 연령 관련 유전자 발현 조절 기능의 보편성을 증명하기 위해 본 실시예를 수행하였다. CMV 프로모터는 몇 가지 유전자 치료 구조물에 일반적으로 사용되지만, 간에서 시간이 지남에 따라 그 활성이 감소된다. 또한 트랜스제닉 마우스의 간에서 CMV 프로모터의 활성은 근육과 같은 다른 조직에서보다 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 실시예는 AE5'와 AE3'의 조합이 간에서 CMV 프로모터의 활성 감소를 정지시키거나 역행시키는지를 조사하였다.
상기 기재된 -416FIXml 발현 벡터 (실시예 1 및 도 1)를 사용하여 대조 벡터를 제조하여 간에서 AE5'와 AE3'의 효과와 트랜스제닉 동물에서 발현된 인간 인자 IX의 순환량을 측정하였다. AE5'와 AE3' 모두가 존재하지 않는 CMV 프로모터에 의해 hFIX 유전자의 발현을 조절하는 대조군 벡터는 인간 인자 IX 프로모터 서열을 CMV 프로모터 서열 (National Vector Core for Non-Viral Vectors at the University of Michigan)(CMV 프로모터는 또한 인비트로젠 (invitrogen)의 벡터 플라스미드 pCR3내의 +1 내지 +596사이에 위치함)로 대체하여 제조하였다. 인간 인자 IX 유전자를 CMV 프로모터에 의해 조절하는 생성된 발현 벡터를 HepG2 세포에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포는 인간 인자 IX 활성을 보일 것으로 기대되었다.
도 1의 -802FIXml/1.4 벡터를 사용하여 -802FIXml/1.4 벡터 (AE5'와 AE3' 모두를 함유함)의 인간 인자 IX 프로모터 서열이 CMV 프로모터 서열로 대체된 시험 벡터를 제조하였다.
대조군 벡터 또는 시험 벡터를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 상기 (실시예 3 및 7)에 기재된 표준 방법에 따라 생산하여, 인자 IX 프로모터의 조절하의 인자 IX 발현을 관찰한 바와 같이 (상기 실시예 3), AE5'와 AE3'의 조합이 시간 경과에 따라 CMV 프로모터의 조절하의 인간 인자 IX 발현을 증가시킬 수 있는지를 측정하였다. 트랜스제닉 마우스를 장기적으로 분석하면서, 혈액, 간 및 다른 조직에서 인간 인자 IX의 mRNA 수준을 모니터링하였다. 다른 조직에서 인간 인자 IX mRNA 수준의 연령 조절 패턴을 각각의 특정 구조물, 상이한 파운더 라인, 발정기 이전 시기에 트랜스진의 위치 효과에 의한 상이한 초기 인간 인자 IX 수준, 세대, 성 및 트랜스진의 접합자 구조에 대해 상기 기재된 모든 동물에서 비교하였다.
시험 벡터를 함유하고 안정한 순환 인간 인자 IX mRNA 수준을 증가시키는 트랜스제닉 동물의 관찰은, 대조군 벡터를 함유한 트랜스제닉 동물에서의 순환 mRNA 수준과 비교하여, AE5'와 AE3' 기능의 조합이 CMV 프로모터 실례의 활성을 증가시킴을 증명하였다.
<실시예 9>
CMV 프로모터 조절하에 있는 인간 인자 IX 유전자 실례의 간 특이적 발현
본 실시예에서는 간이외에 몇 가지 조직에서 유전자 발현을 유도하지 않는경우, AE5'의 존재가 CMV 프로모터의 간 특이적 활성을 가져다 주는지를 조사하였다. AE5'를 함유하고 AE3'가 결실된 -803FIXml 벡터 (도 1)를 사용하여 -802FIXml 벡터의 인간 인자 IX 프로모터 서열을 CMV 프로모터 서열로 대체시킨 시험 벡터를 제작하였다. 이 시험 벡터를 hFIX 유전자의 발현이 AE5'와 AE3' 모두의 부재하에 CMV 프로모터의 조절을 받는 실시예 8의 대조군 벡터와 함께 대조 실험에 사용하였다. 트랜스제닉 마우스에서 대조군 벡터 또는 시험 벡터를 이용하여 상기 실시예 3에 기재한 바와 같이 노턴 블롯 분석을 수행하였다. hFIX를 높은 수준으로 발현하는 동물을 생후 1 개월에 희생시켜, 전체 RNA를 간, 폐, 창자, 근육, 신장, 뇌 및 심장, 및 트랜스펙션되지 않은 HepG2 세포(음성 대조군)으로부터 추출하였다. 다른 조직의 hFIX mRNA 수준과 비교하였다. 대조군 벡터를 갖는 트랜스제닉 동물은 간과 하나 이상의 다른 조직에서 hFIX mRNA를 발현할 것으로 기대되었다. 대조적으로, 시험 벡터를 갖는 트랜스제닉 동물은 hFIX mRNA를 간에서 발현하고 다른 조직에서는 발현하지 않았다는 결과는 AE5'가 CMV 프로모터 실례에 간 특이적 활성을 제공한다는 것을 나타내었다.
상기로부터, 본 발명은 연령 관련 및 간 특이적 유전자 발현 방법과 연령 관련 및 간 특이적 질환 모델을 제공함이 분명하다.
<실시예 10>
인간 단백질 C 미니유전자 발현 벡터 실례의 일련의 구조물
본 실시예 및 하기 실시예 11 내지 12에서는 예시적으로 인간 단백질 C의 발현의 조절과 관련된 AE5'와 AE3" 서열 기능의 보편성을 증명하기 위해 상기 실시예7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 인간 단백질 C 게놈 서열은 이미 보고되고 있다 (젠뱅크 기탁 번호 M11228, 도 12b). 특히, 도 14는 인간 단백질 C 유전자 (Miao et al., 1996, J, Biol. Chem. 16: 9587-9594)의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 85)을 나타낸다. 도 14에서, 염기는 상기 기재된 마이오 등의 문헌 (Miao et al., 1996, J, Biol. Chem. 16: 9587-9594)과 같이 주요 전사 개시 부위 (+1)에 상대적으로 번호를 붙였다. 2개의 마이너 시작 위치는 이중 별표로 표시하였다. 엑손에는 밑줄을 그었다. 번역 시작 코돈 (ATG)는 굵은 글씨체로 나타내었다.
이 서열을 사용하며, 도 15에 나타낸 8개의 단백질 미니유전자 발현 벡터를 제조하였다. 5'와 3' 말단의 굵은 줄은 측면 서열을 나타낸다. 인트론은 빈 직사각형으로 나타낸다. 엑손은 어두운 직사각형으로 나타낸다 (마지막 엑손의 3' UTP 부위에 상응함). 화살표는 전사 개시 부위를 나타낸다. 벡터는 Sph I 링커 서열에 연결된 인간 FIX AE5' 서열 (서열 번호 1, 도 8의 nt -802 내지 -771, 크기 32bp) 및(또는) Sse8387 I 링커 서열에 연결된 인간 FIX AE3"을 함유하였다. 모든 인간 단백질 C 미니유전자 벡터의 증폭된 서열을 디데옥시 서열분석으로 확인하였다.
제 1 인간 단백질 C(hPC) 미니유전자 벡터 (-1462hPCml)는 nt -1462 이하까지의 인간 단백질 C의 5' 측면 서열, 엑손 I 서열, 천연 부위에서의 완전한 첫 번째 인트론 (길이 1431 bp), 및 엑손 2 내지 9(hPC cDNA로부터 유래됨) 및 nt 11,108에서 3' 직접적인 인접한 게놈 서열 (길이 325bp)을 함유한 인접하는 상기서열로 구성되었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 뉴클레오티드 67은 인트론 I의 첫 번째 염기, 뉴클레이티드 1,497은 엑손 2 (Met 코돈의 첫 번째 염기는 뉴클레오티드 1,514임)의 첫 번째 염기, 및 뉴클레오티드 10,488은 종료 코돈의 마지막 염기이었다.
-1462hPCml을 제조하기 위해, hPC 유전자의 nt -1462 내지 1,560 (길이 3,022bp)의 영역을 Sph I 링커와 엑손 2 내의 특이적인 내부 Msc I 위치를 각각 함유한 5'와 3' 프라이머, 및 주형으로서 인간 게놈 DNA를 사용하는 PCR (Expand High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim)로 증폭하였다. 5' 인접 서열, 엑손 I, 인트론 I 및 내부 Msc I 위치가 있는 엑손 2의 짧은 5'말단 부위를 함유한, 생산된 단편을 이어서 hPC cDNA 서열의 Sph I와 Msc I위치 사이의 5' 부위와 교체하여 PUC119-hPC인 hPC cDNA 플라스미드에 삽입하였다. 생성된 미니유전자의 3' 말단인 -1462hPCm'은 전체 3' UTR을 함유하지만, 단지 폴리 (A) 부착 부위 (nt 10,783)이하 까지 함유한다. 그의 3' 말단 영역 (3' UTR에서 내부 Sse8387 I 위치 상단의 3' 서열)을 Sse8387 I/EcoR I 이중 절단에 의해 유리시키고, PCR로 생성한 Sse8387 I/ EcoR I 단편 (길이 612bp, hPC 유전자 nt 10,497 내지 11,108에 걸쳐 있음)으로 교체하였다. 따라서, 제조된 hPC 미니유전자를 -1462hPCml(길이 약 4981bp)로 명칭하고, 하기와 같이 다른 hPC 미니유전자 구조물을 생산하기 위해 모-구조물로 제공하였다. 이 hPC 미니유전자 벡터를 사용하여 hPC발현을 위한 양성 대조군으로서 사용하는 제 1 트랜스제닉 마우스 콜로니를 제조하였다.
제 2 인간 단백질 C 미니유전자 벡터 (-82hPCml)는 또 다른 대조군 인간 hPC미니유전자이었다. 이 벡터는 -1462hPCml과 그의 프로모터 영역이 nt -1462 대신에 단지 nt -82이하에 걸쳐있는 것을 제외하고는 동일하고, 따라서, nt -82 내지 nt +1의 hPC 상류 서열 (서열 번호 86)을 함유하였다. 미니유전자 -1462hPCml은 Sph I 절단을 한 후 부분 Msc I 절단을 한 후, 5' 상류 내의 nt -1462에서 엑손 2내의 내부 Msc I 위치까지 걸쳐있는 5' 말단 절반 영역을 유리시켰다. 첫 번째 인트론 내의 또 다른 Msc I 위치때문에, 부분 절단이 필요한 5' 말단 절반 단편을 가지기 위해 필요하였다. 이 영역을 이어서 PCR로 생산하고 5' 상류 내의 nt -82에서 내부 Msc I 위치까지에 걸쳐 있는 작은 Sph I/Msc I 단편으로 교체하여 -82hPCml을 생산하였다.
제 3 인간 단백질 C 미니유전자 벡터 (AE5'/-1462hPCml)는 5' 말단의 Sph I 위치에 삽입된 AE5' 서열(길이 32bp)을 갖는 것을 제외하고는 -1462hPCml과 동일하였다.
제 4 인간 단백질 C 미니유전자 벡터(-1462hPCml/AE3')는 hPC 미니유전자의 3' 비-번역 영역(UTR) 내의 Sse8387 I에 삽입된 AE3" 서열을 가지는 것을 제외하고는 -1462hPCml과 동일하였다.
제 5 인간 단백질 C 미니유전자 벡터(AE5'/-1462hPCml/AE3")는 AE5'와 AE3"를 가지는 것을 제외하고는 -1462hPCml과 동일하였다. AE5' 단편(길이 32bp, hFIX 유전자의 nt -802 내지 -771에 걸쳐 있음)을 주형으로서 인간 게놈 DNA와 Sph I 링커 서열을 함유한 PCR 프라이머와 함께 PCR(Expand High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim)로 증폭하였다. nt 32,110 내지 32,263에 걸쳐있고, 잠재적줄기-고리 (stem-loop) 구조 형성 영역(nt 32,142 내지 32,243)을 함유한 AE3" 단편을 내부 Sse8387 I 위치 서열을 함유한 프라이머를 사용하는 PCR로 생산하였다. Sph I 또는 Sse8387 I 스틱키(sticky) 말단을 각각 갖는 AE5' 및 AE3" 단편을 이어서 5' 말단의 Sph I 위치와 3' UTR의 Sse8387 I 위치의 -1462hPCml 내로 삽입하여, 미니유전자 AE5/-1462hPCml/AE3"을 제조하였다. 따라서, AE5'/-1462hPCml/AE3"는 5' 말단 Sph I 위치와 3' UTR 내의 Sse8387 I 위치의 hFIX 유전자의 AE5'와 AE3' 서열 모두를 각각 갖는 것을 제외하고는 -1462hPCml과 동일하다.
제 6 와 제 7 인간 단백질 C 미니유전자 벡터 (-849hPCml 및 -802hPCml)는 nt -1462 대신 각각 nt -849와 -802까지 걸쳐있는 그의 5' 말단 서열을 제외하고는 -1462hPCml과 동일하였다. 이들 미니유전자의 제조는 제 2 인간 단백질 C 미니유전자 (-82hPCml)의 제조와 필수적으로 동일하였다. 미니유전자 -1462hPCml을 Sph I 절단을 하고, 이어서 부분 Msc I 절단하여 5' 상류 영역 내의 nt -1462에서 엑손 2 내의 내부 Msc I 위치의 nt 1,547에 걸쳐있는 5' 절반 영역을 유리하였다. 첫 번째 인트론 내의 또 다른 Msc I 위치 때문에, 부분 절단이 필요한 5' 말단 절반 단편을 가지기 위해 필요하였다. 이 영역을 이어서 PCR로 생산하고 5' 상류 내의 nt -849 또는 -802에서 내부 Msc I 위치 까지 걸쳐 있는 작은 Sph I/Msc I 단편으로 교체하여, 각각 -849hPCml과 -802hPCml을 생산하였다.
제 8 인간 단백질 C 미니유전자 벡터 (AE5'/-82PCml)를 Sph I 스틱키 말단을 갖는 AE5' 서열을 제 2 벡터인 -82hPCml의 5' 말단 Sph I 위치에 삽입하여 생산하였다.
<실시예 11>
인간 간종양 HepG2 세포주 내의 인간 단백질 C 미니유전자 발현 벡터 실례의 생체외 일시적 발현
실시예 10의 hPC 미니유전자의 일시적 발현 활성을 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 HepG2 세포주로 시험하였다. 도 16은 상대적인 생체외 일시적 발현 활성과 대조군 -1462hPCml 구조물의 활성(약 70ng/106세포/48시간, 100% 활성으로 정의됨)에 상대적인 인간 단백질 C 미니유전자 발현 구조물의 표준 편차를 나타낸다.
도 16의 상대적인 일시적 발현 활성은 hPC 유전자와 제휴된 AE3"의 결과는 본 발명자가 hFIX 유전자(도 1)와 제휴된 AE3"를 관찰한 것과 완전히 일치한다. AE3"의 존재는 AE3"가 결실된 미니유전자와 비교하여 일시적 발현에서 약 30% 억제를 보였다(즉, -1462hPCml과 -1462hPCml/AE3"의 비교 및 AE5'/-1462hPCml과 AE5'/-1462hPCml/AE3"의 비교). 대조군 구조물 -1462hPCml과 -82hPcml은 각각 서로 유사한 일시적 발현 활성을 보였다.
상기에서 검토한 바와 같이, 이들 결과는 이종 리포터 유전자인 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT)가 단백질 5' 말단 서열의 다양한 길이의 전사 조절하에 있는 경우, 이들 결과가 이전에 보고된, 미아오 등의 상기 문헌의 것과 상이하기 때문에 놀라웠다.
<실시예 12>
인간 단백질 C 미니유전자 발현 벡터를 가진 트랜스제닉 마우스의 생산과 분석
트랜스제닉 동물을 실시예 10에서 상기 기재한 각각 8개의 발현 플라스미드를 상기 실시예 3에 기재한 바와 같이 표준 방법 [Hogan et al., 1994, "Manipulating the Mouse Embryo, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York, 2nd Edition]에 따라 제조하였다. 마우스의 수정된 난자에 미니유전자 트랜스제닉 DNA를 마이크로인젝션(microinjection)하고 대리모 동물에게 주입하였다.
-1462hPCml, -82hPCml 및 AE5'/-1462hPCml/AE3" 미니유전자 트랜스제닉 유전자를 보유한 트랜스제닉 마우스를 장기적으로 분석하면서 순환 hPC 수준을 모니터하였다. 생후 1개월에서 시작하여, 여러 시기에 트랜스제닉 마우스를 꼬리끝을 절단하여 혈액 시료를 각각 수득하고, 수득한 혈청을 통상적으로 사용하여, 각 시점에서 순환하는 hPC 수준을 ELISA를 이용하여 정량하였다. ELISA 분석은 제 1 항체로서 마우스 모노클로날 항-hPC 항체 (Celsus Laboratories)와 제 2 항체로서 토끼 폴리클로날 항-hPC 항체 (Celsus Laboratories)를 사용하였다. 수집한 인간 플라스미드 (George King Bio-Medical)를 사용하여 각 분석에 대한 hPC 표준 곡선을 작성하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17의 표지는 각 미니유전자 구조물을 함유한 동물의 태그(tag) 번호를 나타낸다. 도 17은 -1462hPCml(A), -82hPCml(B) 및 AE5'/-1462hPCml/AE3"(C) 발현 벡터를 갖는 대표적 동물을 나타낸다.
중요하게는, 도 17은 연령-조절 패턴은 각각의 특정 구조물에 대해 모든 동물간에 두드러지게 유사하였다. 부분적으로, 이 결과는 -1462hPCml 구조물을 함유한 트랜스제닉 동물 즉, 트랜스제닉 동물의 생존 기간 동안 상이한 시기에 인간 단백질 C을 상대적으로 일정한 수준으로 발현하는 동물은 인간 단백질 C를 연령 안정한 수준으로 함유함을 보인다 (도 17a). 완전히 대조적으로, AE5'와 AE3' 서열의 존재는 시간이 경과하면서 인간 단백질 C의 발현 수준을 증가시키는 결과를 보였다 (도 17c). 이들 결과는 연령 관련 방법에서 유전자에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 AE5'와 AE3" 기능의 보편성을 입증하였다.
이 데이타는 -1462hPCml 구조물을 보유하는 트랜스제닉 동물이 시간 경과에 따라 인간 단백질 C가 상대적으로 일정하고 높은 수준 (약 100 내지 약 300ng/ml)을 보인 반면, 매우 대조적으로, -82hPCml 구조물을 함유한 트랜스제닉 동물은 시간 경과에 따라 급격히 감소하는 상대적으로 낮은 수준의 인간 단백질 C를 나타내었다. 또한, 생후 5개월 이후, 인간 단백질 C 수준을 -82hPCml 구조물을 보유한 모든 트랜스제닉 동물에서 검출되지 않았다. 이러한 결과는 인간 단백질 C 유전자의 nt -1462 내지 nt -83의 뉴클레오티드 서열이 연령 안정한 발현과 작동가능하게 연결된 목적하는 서열을 상대적으로 더 높은 수준 (nt -1462 내지 nt -83의 뉴클레오티드가 결실된 상태의 수준과 비교하여)으로 발현시킨다는 것을 증명한다.
Claims (20)
- i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터.
- a) i) 세포, ii) 목적하는 핵산 서열, iii) 프로모터 서열, 및 iv) 서열 1, 서열 3, 서열 1의 일부분 및 서열 3의 일부분중에서 선택된 하나 이상의 연령 조절 서열을 제공하는 단계,b) 상기 목적하는 핵산 서열, 상기 프로모터 서열, 및 하나 이상의 연령 조절 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계; 및c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 상기 목적하는 핵산 서열이 상기의 처리된 세포에서 발현되도록 하는 조건 하에서 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
- 서열 93의 적어도 일부분을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 일부분이 연령 관련 조절 활성을 갖는 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 일부분이 서열 91, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120, 서열 121, 서열 122, 서열 123, 서열 124, 서열 125, 서열 126, 서열 127, 서열 128, 서열 129, 서열 130, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 134, 서열 135, 서열 136, 서열 137, 서열 138, 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143, 및 서열 144중에서 선택된 핵산 서열.
- 제3항에 있어서, 상기 일부분이 서열 91인 핵산 서열.
- i) 목적하는 핵산 서열, ii) 프로모터 서열, 및 iii) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 목적하는 핵산 서열이 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 항트롬빈 III, 조직 인자 경로 억제제, LDL-수용체, 인간 α1-항트립신, 항트롬빈 III, PEA-3 단백질, β-갈락토시다제, 및 루시퍼라제중에서 선택된 단백질을 코딩하는 발현 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 인간의 인자 IX 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, tRNA 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, PEPCK 프로모터, MT 프로모터, SRα프로모터, P450 계열 프로모터, GAL7 프로모터, T7프로모터, T3프로모터, SP6 프로모터, K11 프로모터 및 HIV 프로모터중에서 선택되는 발현 벡터.
- 제7항에 있어서, 상기 서열 93의 일부분이 서열 91, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120, 서열 121, 서열 122, 서열 123, 서열 124, 서열 125, 서열 126, 서열 127, 서열 128, 서열 129, 서열 130, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 134, 서열 135, 서열 136, 서열 137, 서열 138, 서열 139, 서열 140, 서열 141, 서열 142, 서열 143 및 서열 144중에서 선택되는 발현 벡터.
- 제10항에 있어서, 상기 일부분이 서열 91인 발현 벡터.
- 제7항에 있어서, 서열 1 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 작동가능한 조합으로 더 포함하는 발현 벡터
- 제7항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제13항에 있어서, 살아 있는 동물의 조직 또는 기관에 포함되는 숙주 세포.
- 제13항에 있어서, 배우체인 숙주 세포.
- 제13항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포중에서 선택되는 숙주 세포.
- a) i) 세포; ii) 목적하는 핵산 서열; iii) 프로모터 서열; 및 iv) 서열 93 및 그의 일부분중에서 선택된 연령 관련 조절 서열을 제공하는 단계;b) 상기 목적하는 핵산 서열, 상기 프로모터 서열, 및 상기 연령 관련 조절 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계; 및c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 상기 목적하는 핵산 서열이 상기의 처리된 세포에서 발현되도록 하는 조건 하에서 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 처리된 세포가 살아있는 동물의 조직 또는 기관에 포함되는 방법.
- 서열 85의 적어도 일부분 및 서열 92의 적어도 일부분중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 핵산 서열.
- a) i) 세포; ii) 목적하는 핵산 서열; iii) 프로모터 서열; 및 iv) 서열 92, 서열 92의 일부분, 서열 85, 서열 85의 일부분, 서열 89 및 서열 90중에서 선택된, 연령 관련 조절 활성 및 조절 활성중에서 선택된 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 을 제공하는 단계;b) 상기 목적하는 핵산 서열, 상기 프로모터 서열, 및 상기 뉴클레오티드 서열을 작동가능하게 연결시켜 트랜스진을 제조하는 단계; 및c) 상기 트랜스진을 상기 세포에 도입하여 목적하는 핵산 서열이 상기 처리된 세포에서 발현되도록 하는 조건 하에서 처리된 세포를 제조하는 단계를 포함하는 목적하는 핵산 서열을 발현시키는 방법.
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