JPH022352A - 抗ｈｉｖ抗体可変領域をコードする遺伝子断片およびこれらを用いて発現された抗ｈｉｖキメラ抗体ならびにその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に起因するエ
イズ（ＡＩＤＳ＞の治療および予防に期待できる新規な
抗ＨＩＶキメラ抗体に関する。さらに詳細には、旧Ｖに
対し中和抗体を有する抗ＨＩＶキメラ抗体の発現に有効
な１１鎖及びＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子断片、
これを組み込んだ形質転換体、これらを用いて発現され
た坑口■キメラ抗体並びにその製法に関する。

ｉ胛ム１ｊ 今凹紀最大の奇病と形容され、注目を浴びている後天性
免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄ
ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　５ｙｎｄｒｏＨｅ：　　ＡＩＤＳ
）は、レトロウィルスに属するヒト免疫不全ウィルス（
ＨＩＶ）に起因するウィルス・訃疾患である。この疾患
は、１９８１年アメリカＣＤＣの３ＪＡｆｆｌにロスア
ンゼルスの男性同性者５人にカリニ肺炎が発症したこと
に端を発する［　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒＤｉｓｅａｓ
ｅ　Ｃｏ＋＋ｔｒｏｌ：　ＭＭＷＲ，３０，ｐ２５０．
　（１９８１）］、その後、この病気はまたたく間に世
界中に広がり、世界保健ｖ１横（ＷＨＯ）ノ集計ニＪ：
　レバ、１９８７年８月１２日時点においてずでに１２
２ケ国に発生が認められ、患者総数は６万人を越してい
る。わが国においても１９８７年９月　４日時点で５０
人の患者が確認され、そのうち２８人はすでに死亡して
いる。　　ＡＩＤＳがこのように急速に世界［１１に広
がりをみせているにもかかわらず本店の予防法及び治療
法はほとんど確立されていない。

抗ＨＩＶ剤として、唯一実用化されているものとしてア
ジドチミジン（＾ＺＴ）がある［　Ｎａｔｕｒｅ：　３
２６゜ｐ４３０．　　（１９８７）］、　　これは、制
ガン剤として合成されたものであり、旧Ｖの逆転写酵素
阻害作用に基づく抗ＨＩＶ剤であるが、生体の造血組織
に対する強い毒性を有するため、多くの例で貧血をもた
らすことがわかっている。その他、多くの物質が、坑口
■剤の候補として研究が行われているが、有効であり且
つ安全な抗ＨＩＶ剤はまだ開発されているとは言えない
。一方、重病予防のためのワクチン開発に関しても盛ん
に研究が行われているが、これまでに実用可能なワクチ
ン開発に成功したというような報告もない。

このような状況の中で、輸血によって旧Ｖ陽性となった
サラセミアの患者グループと小児のＡＩＤＳ及びＡＲＣ
（ＡＩＤＳ関連症候群）のグループについてその臨床と
中和抗体の関連について報告されている［Ｒ。

Ｇｕｒｏｆｆら、　　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　　
１３８．　　ｐ３７３１．　（１９８７）　；　　Ｒ。

Ｇｕｒｏｆｆら、　　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、　　１ｎｐｒｅｓｓ］、　　いずれの場合でも
中和抗体の検出できる症例においては臨床症状も軽く良
好であるが、中和抗体が検出できない症例においては臨
床症状が悪化していることが報告されており、ｉｎ　ｖ
ｉｖｏにおいても中和ｖＬ体が有効である可能性を示し
ている。また、すでに感染しているヒトにも能動免疫を
すべきだと主張している報告もある［　５ａｌｋ、　Ｊ
、　、　Ｎａｔｕｒｅ３２７、　ｐ４７３．　　（１９
８７）　］　。

以上のように、中和活性を有する抗ＨＩＶ抗体は、１ｎ
ｖｉｖｏにおける感染の拡大防止や感染細胞の排除に役
立つ可能性があり、現在、臨床で用いられている抗ウィ
ルス剤等との併用により更に高い効果が得られることが
期待される。

【釆韮ｌ 上記のような抗１１１Ｖ抗体として、中和活性を有する
モノクローナル抗体の使用が考えられる。モノクローナ
ル抗体作製に関する基本的な技術は、これまでにすでに
確立されているが、これらは主としてマウス型モノクロ
ーナル抗体である。

このようなマウス型モノクローナル抗体の医学分野にお
ける免疫学的診断、治療、予防への利用法においては生
理活性（補体活性化能や抗体依存性の細胞傷害活性等〉
や抗原性（マウスモノクローナル抗体をヒトに使用した
場合、異種タンパクとしてアナフィラキシ−ショックや
血清病などの副作用をおこすことが考えられる）等の制
約から、これらの実用に際して才だ問題が残されており
、このような問題のないヒト型モノクローナル抗体への
期待がよせられている。しかし、ヒト型モノクローナル
抗体作製技術はマウス型モノクローナル抗体作製技術は
ど進歩しておらず、現状では、特異性においてマウス型
モノクローナル抗体よりも優れたし１〜型モノクロ一ナ
ル抗体を得ることが困難な場合が多い、さらに、ＨＩＶ
のような危険度の高い抗原に対する抗体は、バイオハザ
ードの面からも、モノクローナル抗体作製のためのリン
パ球の原資をヒトに求めることは望ましくない。

一方、免疫グロブリン遺伝子についての解析は、最近の
遺伝子操作技術の急速な発展に伴って８速に進みつつあ
る。免疫グロブリン遺伝子は抗原との結合部位である可
変領域（Ｖ領域）遺伝子と補体や特定の細胞と相互作用
等に関与した生理活性を持つ定常領域（Ｃ領域）３ｆｉ
伝子により形成されていることがよく知られている。さ
らに、■領域遺伝子は、数ある■遺伝子断片群、Ｄ遺伝
子断片群（Ｌ鎖ではまだ見つかっていない）及びＪ遺伝
子断片群の中からそれぞれ１個が選ばれこの順序で並ん
で結合することによって形成される。各遺伝子断片群の
中でどの遺伝子断片が選ばれるかが抗体の特異性を大き
く左右する。即ち、抗体の特異性は］（鎖とＬ鎖のＶ領
域遺伝子の中の各遺伝子断片の組合せによって決定され
る［利根用進、　Ｎａｔ、ｕｒｅ、　３０７．　ｐ５７
５　（１９８３）；本庶佑、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、
　　Ｉ■ｕｎｏ１．　　ｌ、　ｐ４９９　（１９８３）
参照］、従って、ある特定の抗原に対しては、特定の！
■鎖ＬＨのＶ（Ｄ）Ｊ３１！を転子断片の組合せがある
と考えられる。

また、このＶ領域遺伝子の５゛上流域及び３′下流域に
は免疫グロブリン遺伝子の発現に重要な役割をしている
と思われるＤＮＡ配列が存在する。即ち、■領域遺伝子
の５°上流域にはプロモーター機能を有するＤＮＡ配列
が存在し、３°下流域（Ｊ遺伝子断片とＣ領域遺伝子の
間）には免疫グロブリン遺伝子の転写効率を著しく増大
させる機能を有するエンハンサ−と呼ばれるＤＮＡ配列
が存在する。これらの領域はマウス及びヒトの免疫グロ
ブリン遺伝子で同定されており、そのＤＮＡ配列も明ら
かにされている［　Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、　　Ｃｅ１ｌ、
　　３３．　　ｐ７４１　　（１９８３）：　　Ｊ。

Ｂａｎｅｒｊｉら、　　Ｃｅ１ｌ、　　３３．　　ｐ７
２９．　　（１９８３）；　　Ｓ、　　Ｄ。

Ｇ１１ｌｉｅｓら、　　Ｃｅ１ｌ、　　３３．　　ｐ７
１７　　（１９８３）：　　Ａ、　　Ｃ。

Ｉｆ　ａ　ｙ　ｄ　ａ　ｙら、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　
３０７．　　ｐ３３４（１９８４）；Ｉ５．　　Ｅｍｏ
ｒｉｎｃら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０４．　　ｐ４４７
　（１９８３）参照］。

最近、先に記したようなマウス型モノクローナル抗体と
ヒト型モノクロナール抗体のいずれの問題をも解決する
方法として、抗原と結合する可変（■）領域はマウスモ
ノクローナル抗体から、抗原性或は免疫原性及び生理活
性に関与する定常（Ｃ）領域はヒトの抗体からなるマウ
ス−ヒトキメラ抗体の作製が注目されており、すでにい
くつかの報告が見受けられる（特開昭６０−１５５１３
２号、特開昭６１−４７５００号）、シかしながら、こ
のようなキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結合能を
持つ抗体分子の可変領域のアミノ酸配列をコードする遺
伝子を見いだすことが非常に重要な要素となっており、
本発明の対象となる旧■に関しては、そのような可変領
域のアミノ酸配列、ひいては旧Ｖに対して中和活性を有
する抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子
を見いだずことが困難であったため、これまでに旧■に
対して有効なキメラ抗体が得られたというような報告は
見あたらず、ましてや］目Ｖに対して中和活性を有する
抗＋＋１Ｖキメラ抗体の作製に成功した例はない。

１哩ユ■血 このような状況において、本発明者らはＨＩＶに対して
中和活性を有するモノクローナル抗体を産生する細胞（
ハイブリドーマ）から、該抗体の可変領域をコードする
遺伝子を分離することに成功し、さらにこれを用いてマ
ウス−ヒトキメラ抗体の発現を試みた結果、ＨＩＶに対
して中和活性を有する抗＋＋１Ｖキメラ抗体の作製に成
功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
これまでに−切報告されていない、抗ＨＩＶ中和抗体の
可変領域をコードする遺伝子を提供するものであり、こ
れを用いて形質転換細胞内で発現される抗ＨＩＶキメラ
抗体を提供するものである。さらに詳細には、本発明は
、抗ＨＩＶ中和活性を持つマウスモノクローナル抗体の
抗原結合部位（■領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領域
）からなる抗ＨＩＶキメラ抗体を提供するものであり、
このようにして得られる本発明の抗［１！ｖキメラ抗体
は、抗ＨＩＶ中和活性を有し、かつ副作用のないＡＩＤ
Ｓ診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能にするもので
ある。

０　　１　゛　　　− 本発明に用いる抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体屋生
細胞は、これまでに確立されているマウスモノクローナ
ル抗体の作製技術を用いて作製される。

例えば、Ｈ　９　／　ｌ（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ｍ　Ｂで示さ
れるウィルス感染細胞株（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ８５４
３）や、　Ｍｏ１ｔ３／ＨＴＬＶ−ｍ　Ｂ　　（ＡＴＣ
ＣＮｏ、　ＣＲＬ８６０２）等の入手可能なウィルス感
染細胞より、ウィルス或はウィルス糖蛋白分画（ｅｎｖ
；　ｇｐ４１．　ｇｐ１２０）を精製し、これを免疫原
として用い通常のハイブリドーマを作製する方法でハイ
ブリドーマをイヤ製すれば、抗ＨＩＶマウスモノクロー
ナル抗体産生細胞を得ることが可能である。更に、この
ようにして得られた抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体
産生細胞の中から、ＨＩ　Ｖに対して中和活性を有する
モノクローナル抗体を産生している細胞を選択する。

ＨＩＶの場合、該ウィルス特有の性質から、このような
中和活性を有するモノクローナル抗体を得ることは容易
なことではないが、そのような細胞株として本発明者ら
は、旧Ｖに対して中和活性を有する抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ５４°ＣＢＩ細胞の確立に成功しており［松
下修三ら、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

３、　ｐ１４．　（１９８７）　］、これらが本発明の
以下の遺伝子調製に用いる最も好ましい細胞株として挙
げられる。

本発明の可変領域をコードする遺１云子断片は、このよ
うな抗１１１Ｖ中和モノクローナル抗体産生細胞より、
分離され、解析された遺伝子配列である。

しかしながら、前にも述べたように、このような細胞は
、目的の抗１１１Ｖ抗体に特異的なＶ領域をコードする
遺伝子の他に、数多いＶ領域構成遺伝子群を有している
（例えば、マウス抗体の特異性を決定するＶＨ鎖のＶ遺
伝子群だけでも少なくとも１００種以上異なる遺伝子を
持ち、Ｄ遺伝子群として１１種以上、Ｊ遺伝子群として
４種の遺伝子を持っている。同様にＶに鎖のＶ遺伝子群
としては約３００種以上の遺伝子、Ｊ遺伝子群としては
４種の遺伝子を保有している）ため、細胞の持つ染色体
遺伝子の中から、目的の抗１目Ｖ抗体に特異的なＶ領域
をコードしている遺伝子を分離することが必要である。

このような特異性を担っているマウス免疫グロブリン１
１鎖遺伝子と■、鎖遺伝子の可変領域（Ｖ）遺伝子を単
離する方法としては、主として２つの方法が可能である
。１つは、その細胞の染色体ＤＮＡから常法［例えば、
Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ”　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂ、　（１９８２＞’を照］に従ってＶ領域遺伝子をク
ローニングする方法であり、もう一方は、その細胞のメ
ツセンジャーＲＮＡを材料として常法［例えば、　Ｄ、
Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ編４Ｊ　　”　ＤＮＡ　　ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　　Ｖｏｌ、Ｉ”　　Ｉ］？Ｌｐｒｅ！ｌｌｓ　（
１９８５）］によりｃＤＮＡを合成しＶ領域）ｎ転子を
クローニングする方法である。いずれの方法も、■領域
遺伝子クローニングの為の１０−ブとして、すでに報告
されているマウス免疫グロブリン遺伝子の核酸塩基配列
［例えば、坂野ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８６ｐ６７６、
（１９８０）；　　Ｅ、Ｈ，Ｍａｘら、　Ｊ、　　Ｂｉ
ｏｌ、　　ＣＩｕｅｓ、、　　２５６゜ｐ５１１６．　
（１９８１）　］を参照して合成したＤＮＡプローブ等
を利用することが出来る。また、前者の方法においては
、活性型の発現可能な、即ちＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子の再配列
を終え、メツセンジャーＲＮＡに転写され、さらに蛋白
質に翻訳されているＶ領域遺伝子を同定するためのサザ
ンハイプリダイゼーションを、抗体産生細胞とその親株
の染色体１１ＮＡを用いて、常法［例えば、Ｔ、　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　（
１９８２）参照］に従って行い抗体産生細胞に特異的な
遺伝子を決定すれば、よ−り速く目的のＶ領域遺伝子を
クローニングすることが出来る。目的の３１！伝子を、
前者の染色体ＤＮＡから調製した場合には、遺伝子の中
にイントロンと呼ばれる介在配列を含んでいる。

このようにしてクローニングされた抗ＨＩＶ中和抗体を
有する抗体の■領域をコードする遺伝子断片の配列と、
他の抗ＨＩＶ結合能を有さない抗体遺伝子とを比較し遺
伝子解析を行なった結果、抗ＨＩＶ抗体Ｖ領域をコード
する本発明の遺伝子断片は、その特異的な遺伝子配列と
して、！■鎖をコードする遺伝子に、 （ａ）Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　Ｇｌ
ｕ（ｂ）Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　１ｌｉｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｔｌ＋ｒ　
　ＡｓｎＴｙｒ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｔ
’ｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ（Ｃ）　　Ｔｙｒ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　Ｔｙｒ　　Ａｌａ（ｄ）　　
Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｔｌ”ｈｒ　　Ｖａｌ　　
Ｓｅｒ　　Ｓｅｒのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
その一部に含み、またμ鎖をコードする遺伝子に、（ａ
）　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＧｌｙＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ（ｂ）　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒ（ｃ）　Ｇ
ｉｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ
。

（ｄ）　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕｌｌｅ　　Ｌｙ
ｓ のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列をその一部に有
することが見い出された。このような上記の］［鎖、μ
鎖に含まれるそれぞれ４種のアミノ酸配列は、抗体分子
の結合能を決定する重要なアミノ酸配列と考えられ、こ
のようなアミノ酸配列が、旧■に対する中和活性を有す
る抗体分子の機能と密接に関連しているものと考えられ
た。すなわち、本発明の抗１１１Ｖキメラ抗木は、１１
鎖およびμ鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列として
それぞれ上記のアミノ酸配列をその一部に有することを
特徴とする。このような抗１１１Ｖ中和活性を有する抗
体分子の可変領域をコードする遺伝子として、μ鎖、μ
鎖それぞれ第６図、第８［Ｆのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子断片がその好ましい一例として挙げられる９　
また、そのような遺伝子の具体的塩基配列の一例として
は、１１鎖、μ鎖それぞれ第５図、第７図に示された塩
基配列が挙げられる。

一方、抗ＨＩＶキメラ抗体作製に用いられるヒト免疫グ
ロブリン１ｌＶ４遺伝子並びにμ鎖遺伝子の定常領域（
Ｃ）遺伝子は、例えばＡ　ＲＨ−７７細胞株（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６２１）の様なヒト抗体産生細胞から同様の方
法により単離することが出来る。また、Ｃ領域遺伝子は
その遺伝子内で再配列を行わないので特にヒトＣ領域遺
伝子を単離するためにヒト抗体産生細胞を使う必要はな
い。単離する方法としては、前述のマウスＶ領域遺伝子
の単離の場合と同じように主として２つの方法があり、
いずれの場合も、Ｃ領域遺伝子クローニングの為のプロ
ーブとして、すでに報告されているヒト免疫グロブリン
遺伝子の核酸塩基配列［例えば、　Ｊ、　　Ｗ、　　Ｅ
ｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃ、　　Ａｃ１ｄｓ、　　１ｉｅ
ｓ、。

ｔｏ、　　ｐ４０７１．　　（１９８２）：　　Ｐ、　
　Ａ、　　ｌ１ｅｉｔｅｒら、　Ｃｅ１ｌ、　　２２゜
ｐ１９７　（１９８０）］を参照して合成したＤＮＡプ
ローブ等を利用することが可能である。また、Ｃ領域遺
伝子の種類としては、特にγ１鎖、に鎖に限ったもので
はなく、μ鎖、α鎖、γ２〜４鎖、λ鎖の各鎖の遺伝子
でも可能である。しかし、補体活性化能、抗体依存性細
胞傷害活性を期待するならば、γ１鎖が望ましい。

抗ＨＩＶキメラ抗体遺伝子は、１１鎖遺伝子もＬ鎖遺伝
子も、基本的に上記２種のｉｆＬ伝子導子（Ｖ領域遺伝
子とＣ領域遺伝子）を結合させることにより構築される
。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主として２つ結合
の組合せがある。即ち、染色体ＤＮＡから単離したＶと
Ｃ領域遺伝子、ｃＤＮＡから単離したＶとＣ領域遺伝子
の組合せである。

例えば、マウス染色体ＤＮＡからｊｉｉ離したＶ領域逍
１云子を、ヒト染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子
と結合さぜた場ｈ、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要
なプロモーターやエンハンサ−等の発現調節領域をよん
でいることが好ましい、ただし、プロモーターやエンハ
ンサ−等はマウス由来である必要はなく、ヒト由来でも
ウィルス由来でも差しつかえない。また、プロモーター
はＶ領域の５°上流域に位置し、エンハンサ−は■領域
遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好ましいが、
エンハンサ−については必ずしもこの位置に限定される
ものではない。

一方、マウスｃＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子を、ヒ
トｃＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合させる場合
、その結合部分は適当な制限酵素サイトや、必要であれ
ば適当な合成リンカ−を用いて、Ｖ領域遺伝子のコード
しているアミノ酸配列とＣ領域遺伝子のコードしている
アミノ酸配列がずれないよう、またＶ領域アミノ酸配列
とＣ領域アミノ酸配列が変化しないよう結合しなければ
ならない、さらに、動物細胞中で発現を可能にするため
の適当なプロモーターやエンハンサ−等の発現調節領域
を遺伝子の５゛上流域に付加してやる必要がある。

このようにして作製したキメラ抗体遺伝子を、例えばｐ
ｓＶ２−ｇｐｔ　［Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｐｒ
ｏ、　ＮＡＳ。

ＵＳ　Ａ、　　　７８．　　　ｐ２０２７　　　　（１
９８１）　コ　、　　　ｐｓＶ２−ｎｅｏ　　［Ｐ、　
　　Ｊ。

５ｏｕｔｈｅｒｎら、　　Ｊ、　間ｏ１．　　Ａｐｐｌ
、　　Ｇｅｎｅｔ、、　　１．　　ｐ３２７（１９８２
）　］等の選択マーカーの付いた適当なベクタープラス
ミドに、或は、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖でき
るウィルス遺伝子の一部（パピローマウィルスなど）を
持ったベクタープラスミドに、１１Ｍ３Ｉｉ伝子とＬ鎖
遺導子を別々に、あるいは同時に組み込み、キメラ抗体
遺伝子プラスミドを構築することが望ましい。

抗１（ＩＶキメラ抗体を得るためには、このようにして
ｉＡ製されたキメラ抗体遺伝子を含むプラスミドを用い
て宿主動物細胞を形質転換することが必要である。宿主
動物細胞としては、不死化されたマウスおよび池の動物
細胞、好ましくはＢリンパ系細胞株［例えばＰ３Ｘ６３
Ａｇ８・６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、Ｐ３
Ｘ６３＾ｇ８Ｕ・Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＴ、Ｉ　５９７＞、
Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴ（：ＣＣＲＬ１８
）、Ｓｐ２１０−Ａｇ１２（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１
）等の形質細胞腫、ハイブリドーマコである。　　ＤＮ
Ａによる細胞の形質転換方法としては、ＤＥＡＲ−デキ
ストラン法、燐酸カルシウム共沈降法、プロトプラスト
融合法、エレクトロポレーション法等の方法［例えばＢ
、　Ｄ。

１１ａｍｅｓら４９％　　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｒ＋５ｌａｔｉｏｎＩＲＬ　Ｐｒｅ
ｓｓ　（１９８４）を照］があり、いずれの方法でもよ
い。１１鎖とＬ鎖のキメラ抗体遺伝子を同時に持つプラ
スミドで形質転換を行う場合には選択マーカーは１種類
でよいが、ｌ［ｇＬｊｉ別々の場合には２種類のマーカ
ーが必要である。この場合には１つのプラスミドで形質
転換を行った後に、さらにもう−方のプラスミドで形質
転ｔｉを行う二重形質転換法を用いるのが好ましい。

このようにして形質転換された細胞を通常のハイブリド
ーマと同じ適当な条件下（例えば、１０％牛脂児血清を
含むＲＰ旧−１６４０培地中）で培養すれば、この細胞
から通常のハイブリドーマの産生する抗体と同様に抗Ｈ
ＩＶキメラ抗体が分泌産生される。

このキメラ抗体は通常の抗体と同様な方法により精製す
ることが出来る。

このようにして得られる本発明のキメラ抗体は、旧Ｖに
対して中和活性を有していることが確認され、本発明に
より、これまでになかった抗ＨＩＶキメラ抗体を調製す
ることが可能となる。このような抗１目Ｖキメラ抗体は
、ＡＩＤＳの臨床において、これまでになっかた実質的
に有効なＡＩＤＳ治療剤となりうるちのである。さらに
、本発明により提供される抗ＨＩＶ抗体可変領域をコー
ドする遺伝子断片は、Ｈ　Ｉ　Ｖに対して中和活性を有
する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは
ＤＮＡ配列を開示するものであり、今後、さらに進んだ
遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分子を修飾、ま
たは一部置換等することにより、より優れた抗日Ｖ中和
抗体を有する組換え抗体分子の発現を可能にするもので
ある。

次に、その実施例を示すが、本発明はこれに限定される
ものではない。

抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマの作製方法は以下に示す通りである。

即ち、加熱不活化した７１′を製ウィルス（ｌ（ＴＬＶ
−ｍ　Ｂ）及びＣｏ　ｎ　Ａ−セファローズ（ファルマ
シア社）とイムノアフイニテイセファローズを組み合わ
せて精製したウィルス糖蛋白分画を免疫原として用いて
、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを４回免疫後、Ｈ２！細胞を採取
し、Ｘ６３マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコ
ール（シグマ社）を用いて細胞融合を行いクローニング
した。

得られたクローンの培養土清中の抗体のＨＴＬＶ−ｍＢ
蛋白への結合活性を酵素抗体法にて測定し、反応が陽性
と思われるクローンについて、さらに、ウェスタンプロ
ット法及び間接蛍光法を用いて確認し、抗ＨＩＶモノク
ローナル抗体（０，５β抗体）を産生するハイブリドー
マ、５４’Ｃ１１１！胞を確立した［松下修三ら、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　３．　ｐ１４．
（１９８７）コ。

該モノクローナル抗体（０，５β抗体）の認識する分子
は、交差免疫沈降法にて旧■に感染したヒトの血清中に
ある抗ｇｐ１２０抗体が認識する分子と同一のものであ
ることが確認され、０．５β抗体は旧Ｖの外被蛋白ａｐ
１２０に対するモノクローナル抗体であることが証明さ
れている。又、０．５β抗体は旧Ｖ感染細胞と非感染Ｃ
Ｄ４陽性細胞間の合胞体形成（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ）を抑制する。さらに、０．５β抗体と
旧■ウィルスを混和し細胞（［１９＞へ感染させるウィ
ルス中和試験において、０．５β抗体は１１００ｎ／−
という低１度で感染を阻止することがわかっている。

以下に述べる本発明の抗開■キメラ抗体の■領域遺伝子
の調製には、該中和活性を有する抗１１１Ｖマウスモノ
クローナル抗体（０，５β抗体）を産生する５４゜ＣＢ
Ｉ細胞を使用した。

マウス免疫グロブリンｌ］鎖可変（Ｖｌｌ）領域遺伝子
の単離については、以下のように行った。５４′ＣＤＩ
細胞、Ｘ　６３　Ｋｍ胞及びＢＡＬＨ／ｃマウス肝臓細
胞からＮ。

［１１ｉｎと　Ｄ、　Ｗ、５ｔａｒ　ｆｏｒｄの方法［
Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　ＲｅＳ、　。

３、　ｐ２３０３　（１９７６）］に従って染色体ＤＮ
Ａを単離し、各染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造製；　以下本実施例で使用した試薬は、特
に断わりのない限り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用し
た）で切断する。制限酵素切断ＤＮＡを電気泳動で０．
７％アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィ
ルター（シーンスクリーンプラス、ＮＵＮ・リサーチ・
プロダクト）に転写後、マウスＪ１１領域を含んだ［３
２ｐｌ標識合成りＮＡプローブ［坂野ら、Ｎａｔｕｒｅ
、　２８６．　ｐ６７６（１９８０）　］とサザンハイ
プリダイゼーションを行った。サザンハイプリダイゼー
ションの方法はシーンスクリーンプラスに付属していた
マニュアルのプロトコールに従った。各細胞のＤＮＡに
検出されたバンドを比較した結果、マウスＪｌｆプロー
ブを用いた場合、３．３ｋｂのバンドが、５４’Ｃｌ３
１ａ胞に特異的なバンドとして同定された。このバンド
は機能的なＶｌ＋領域を含む活性な遺伝子であり、５４
　’ＣＢＩ細胞の産生ずる抗ＨＩＶ抗体の特異性の発現
に関与する遺伝子である０分子サイズはλフアージＤＮ
Ａを旧ｎｄｍで切断したマーカーＤＮＡによって算出し
た。

このサイズに相当するＤＮＡ断片をしよ稠密度勾配遠心
［ショ糖１０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、２６００　Ｏ
ｒ　ｐｍ、１８時間、１５℃］により調製した６次にこ
のＤＮＡ断片とλｇｔｌｌベクターＤＮＡ　（ストラタ
ジーン社）のＥｃｏＲＩアームとをＴ４ＤＮＡリガーゼ
により連結させ、ス１−ラタジーン社のキットを用いて
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、５４′ＣＤ
Ｉ細胞のＶＩ１３ｆｔ伝子ライブラリィを得た。このラ
イブラリィから、ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓのプラーク
ハイブリダイゼーション法［Ｗ、　Ｄ、　Ｂｅｎｔｏｎ
、Ｒ，Ｗ、　　Ｄａｖｉｓ、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　
１９６．　　ｐ１８０　　（１９７７）ｅ照］により、
マウスＪ１１プローブにより坑口■抗体のＶｌ＋領域遺
伝子を含むクローンｇｌｌｌｌを選択した。このクロー
ンの制限酵素切断点地図を第１図に示す。このクローン
のＥｃｏＲＩ挿入断片をＴｈｏｍａｓとＤａｖｉｓの方
法［Ｍ、　Ｔｈｏｍａｓ、Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

９１、　ｐ３１５　（１９７４）参照］によりファージ
ＤＮＡより単離し、以下のノーザンハイブリダイゼーシ
ョンに使用した。

５４°Ｃ旧細胞、ｘ６３細胞から全ＲＮＡをグアニジウ
ムチオシアネート法［Ｊ、　Ｍ、　Ｇｈｉｎｇｖｉｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８、　ｐ５２９４　（１
９７９）］により分離し、このＲＮＡ、１０μ９を電気
泳動により３％ホルムアルデヒドを含む０．７５％アガ
ロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルター（
シーンスクリーンプラス）に転写ｆＬ　　マウスＣγ１
領域を含んだ［３２Ｐ］ｆｉ識合成りＮＡプローブ［重
度ら、Ｃｅ１ｌ、　１８、ｐ５５９　（１９７９）］あ
るいはｇｌｌｌｌの［３２ｐ］標ＪＥｃｏＲＩ挿入断片
とノーザンハイブリダイゼーションを行った。ノーザン
ハイブリダイゼーションの方法はシーンスクリーンプラ
スに付属のマニュアルのプロトコールに従った。この両
プローブにより１．８ｋｂの位置にバンドが検出された
（第２図）、従って、クローンｇＨ１１は機能的なＶｌ
ｌ遺伝子構造を含んでいる。

一方、マウス免疫グロブリンに鎖可変（Ｖに）領域遺伝
子の単離については、以下のように行った。

５４°ＣＢＬｔａ胞、Ｘ　６３４ｆｆｌ胞及びＢＡｌ、
Ｉｌ／ｃ？　＋７　ス肝臓細胞から染色体ＤＮＡをＮ、
　ｌ１ｌｉｎと　Ｄ、Ｗ、　５ｔａｆｆｏｒｄの方法に
従って単離し、各染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素旧ｎ
ｄｌ［Ｉで切断する。この制限酵素切断ＤＮＡを電気泳
動で０．７％アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブ
レンフィルター（シーンスクリーンプラス）に転写後、
制限酵素旧ｎｄｍ切断ＤＮＡはマウスＪに領域を倉む［
３２Ｐ］ｌ！Ａ識合成りＩ４＾プローブ［ｌｉ、　Ｅ、
　Ｍａｘら、Ｊ。

１１ｉｏ＋、　Ｃｂｅｍ、　、　２５Ｇ、　ｐ５１１６
　（１９８１）　］とサザンハイプリダイゼーションを
行った。各細胞のＤＮＡＧこ検出されたバンドを比較し
た結果、マウスＪにプローブを用いた場合、５４°ＣＢ
Ｉ細胞のＨ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌ切断１１ＮＡに３，６
ｋｂのバンドが、５４　’ＣＢＩ細胞に特異的なバンド
として同定された。このバンドは機能的なＶｉｃＫＪ域
を含む活性な遺伝子であり、５４°ＣＤＩ細胞の産生ず
る抗＋！ＩＶ抗体の特異性の発現に関与する遺伝子であ
る。

分子サイズはλフアージＤＮＡをＨ　ｉ　ｒ＋　ｄ　ｍ
で切断したマーカーＤＮＡによって算出した。

このサイズに相当するＤＮＡ断片をしよ糖密度勾配遠心
［しよ糖１０〜４０％（ｙｔ／ｖｏｌ）、２６０００　
ｒ　ｐｍ、１８時間、１５℃］により調製した６次にこ
のＤ　Ｎ　Ａ　１ｔＩｉ片とＣｈａｒｏｎ２８ベクター
ＤＮＡ　（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）のｔ
ｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ＨＩアームとをＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結させ、ストラタジーン社のキットを用いて、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、５４′Ｃ旧細胞
■に遺伝子ライブラリィを得た。このライブラリィから
、Ｂｅｎｔｏｎと　Ｄａｖｉｓの１ラークハイプリダイ
ゼーシコン法を使用して、マウスＪにプローブにより抗
ＨＩＶ抗体のＶに領域遺伝子を含むクローンｇＬ４１を
選択した。このクローンの制限酵素切断点地図を第３図
に示す。このクローンの旧ｎｄｍ挿入断片をＴｈｏｎａ
ｓとＤａｖｉｓの方法によりファージＤＮＡより単離し
、ノーザンハイブリダイゼーシヲンに使用した。

５４’ＣＢｌ＋ｔ（Ｂ胞、Ｘ６３細胞カラ全ＲＮＡ　ラ
グ７　ニジ’）　ｈチオシアネート法により分離し、こ
のＲＮＡｌ０μ９を電気泳動により３％ホルムアルデヒ
ドを含む０．７５％アガロースゲルに展開し、ナイロン
メンブレンフィルター（シーンスクリーンプラス）に転
写後、マウスＣに領域を含んだ［３２Ｐ］（Ｆ！識合成
りＮＡプローブ［Ｅ、Ｅ、、Ｍａｘら、　Ｊ、　　Ｂｉ
ｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　　２５６．　　ｐ５１１６　
　（１９８１）コあるいは　ｇＬ４１の［３２ｐｌ標Ｊ
ｌｌｉｎｄｌｌｌ挿入断片とノーザンハイブリダイゼー
ションを行った。この両プローブにより１．２ｋｂの位
置にバンドが検出された（第４図）、従って、クローン
ｇＬ４１は機能的なＶに遺伝子構造を含んでいる。

（３）ヒ　Ｃ，−−ｌｉｅ 抗ＨＩＶキメラ抗体に使用したヒトＣγｌ領域を含んだ
遺伝子、及びヒトＣに領域を含んだ遺伝子は、ヒト培養
細胞ＡＲ１１７７株［ＡＴＣＣＣＲＬ　１６２１コより
クローニングされたものであり、凡用大学・生体防御医
学研究所・渡邊武教授より分与された［工藤ら、Ｇｅｎ
ｅ、　３３．　ｐ１８１　（１９８５）　：　　画材ら
、Ｃａ＋＋ｃｅｒ　Ｒｅｓ、　。

４７、　ｐ９９９　（１９８７）参照］。

（４）旧Ｖ　　マ　ス■　　　　　の 抗ＨＩＶ抗体のＶｌｌ領域の核酸塩基配列を調べるため
に、クローンｇ旧１よりＶ１１領域を含む１．４ｋｂ（
７）　ＤＮＡ断片（旧ｎｃ　ｎ　−Ｘｂａ　Ｉ　）を単
離し、ＤＮＡポリメレース・ラージフラグメント（宝酒
造）を用いて両端を平滑末端に変えた後、ｐＵｃ１８ベ
クターの旧ｎｃｌｌサイトに再クローニングし、挿入方
向の異なる２つのクローンを得た。これらのクローンを
それぞれ制限酵素Ｋｐｎ　ＩとＢａｍ［Ｈで切断し、宝
酒造キロシークエンス用プリージョンキットを用いてＢ
ａｍｔｌｌサイトからのプリージョンの程度が異なるデ
リーションミュータントクローンを選択し、それぞれの
クローンを制限酵ｉＦ、ｃｏＲＩとＩｆ　ｉ　ｎ　ｄ　
ｍで切断することにより長さの異なるＶｌｌｆｉ伝子断
片導子得た。これらのＶｌｌ遺伝子断片群を旧３＋ｌ１
ｐ１９ベクターのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｍサイトに宝ライ
ゲーションキットを用いて挿入した。

東洋紡インストラクトマニュアルの方法に従い、ＪＭＩ
ＯＩのコンビテンｌ−細胞を調装し、Ｖｌ＋遺伝遺伝子
種入した旧３＋ａｒ＋１９ＤＮＡで形質転換させ、−重
鎖ＤＮＡを抽出精製した。さらにこの−重鎖ＤＮＡの核
酸塩基配列決定は、タカラ旧３シークエンシングキット
と富士・ジェンサー・ゲル・システムを用いて行った。

その結果、２つのエクソンからなるＶ１１遺伝子が確認
された。第５図にその結果を示す。

塩基配列の結果から、免疫グロブリン遺伝子のプロモー
ターに必須であると言われているＡＴＧＣＡＡＡＴのオ
クタマー配列が存在し、Ｖ３ｉ伝子導子、Ｄ遺伝子断片
とＪ　Ｈ　４３ｆｉ伝子導子が集合してＶ１１遺伝子が
形成されていることが確認された（第５図）。

さらに、この核酸塩基配列を基にエクソン部分をアミノ
酸に変換したところ、このエクソンがオーブンリーディ
ングフレームをとることが示されたく第６図）、また、
この０，５β抗体のＨ鎖のＮ末端アミノ酸配列を「続生
化学実験講座２、タンパク質の化学（上）」日本生化学
会編ｐ３１３　（１９８７）に記載のエドマン分解法に
従って解析したところ、Ｎ末端アミノ酸が何等かの形で
修飾されており、解析てきなかった。核酸塩基配列から
推定されるＮ末端アミノ酸はグルタミンであり、これが
ピログルタミル化を受けやすいためにエドマン分解がで
きなかったものと思われた。

一方、抗Ｈ　Ｉ　Ｖ抗体のＶに領域の核酸塩基配列を調
べるために、クローンｇＬ４１よりＶに領域を〜む２．
１ｌｋｂのＤＮＡ断片（ＢｓｔＥＨ＝旧ｎｃｌｌ）を単
離し、ＤＮＡポリメレース・ラージフラグメント（宝酒
造）を用いて両端を平滑末端に変えた後、ｐＵｃ１８ベ
クターの１ｌｉｎｅ１１サイトに再クローニングし、挿
入方向の異なる２つのクローンを得た。これらのクロー
ンを一方（正方向）は制限酵素Ｓａｃ　Ｉと５ｏｄａ　
Ｉで切断し、もう一方（逆方向）は制限酵素Ｓａｃ　Ｉ
とＡｃｃ　Ｉで切断し、宝酒造キロシークエンス用プリ
ージョンキットを用いてＳｍａ　ＩあるいはＡｃｃ　Ｉ
サイトからのプリージョンの程度が異なるデリーション
ミュータントクローンを選択し、それぞれのクローンを
制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ　ｉ　ｎ　ｄ■で切断すること
により長さの異なるＶに道導子断片群を得た。これらの
Ｖｃ遺伝導子片群を１３ｍｐ１９ベクターのＥｃｏ１日
−旧＋１ＬＨＨサイトに宝ライゲーションキットを用い
て挿入した。

東洋紡インストラクトマニュアルの方法に従い、Ｊ　Ｍ
　１０１のコンピテント細胞を調製し、Ｖｐｃ３ｆｉ伝
千群を挿入した旧３ａｐ１９ＤＮＡで形質転換させ、−
本Ｍ　ＤＮＡを抽出精製した。さらにこの−重鎖ＤＮＡ
の核酸塩基配列決定は、タカラ旧３シークエンシングキ
ットと富士・ジェンサー・ゲル・システムを用いて行っ
た。その結果、２つのエクソンからなるＶに遺伝子が確
認された。その結果を第７Ｃ！Ｉに示す。

塩基配列の結果から、免疫グロブリン遺伝子のプロモー
ターに必須であると言われているＡＴＴＴＧＣＡＴのオ
クタマー配列が存在し、Ｖ３’ｆｉ伝子断片導子に３遺
伝予断片が集合してＶに遺伝子が形成されていることが
確認された（第７図）。さらに、この核酸塩基配列を基
にエクソン部分をアミノ酸に変換したところ、このエク
ソンがオーブンリーディングフレームをとることが示さ
れた（第８図）、また、この０．５β抗体の■鎖のＮ末
端アミノ酸配列を前述のエドマン分解法に従って解析し
たところ、Ｎ末端アミノ酸から５つのアミノ酸配列（ア
スパラギン−イソロイシン−バリン−ロイシン−スレオ
ニン）が決定され、核酸塩基配列から推定される５個の
Ｎ末端アミノ酸配列と一致した（第８図参照）、このこ
とからもこのＶに遺伝子が発現可能な遺伝子であること
を確認した。

ヒトＣ７１遺伝子を含む１４ｋｂのＤ　Ｎ　Ａ　ｌｌＪ
ｉ片（Ｘｂａｌ−１１ｐａｌ＞をｐｕｃ１８ベクターの
Ｘｂａｌ−１１ｉｎｃ■サイトに挿入し、制限酵素Ｘｂ
ａ　Ｉで切断した後、Ｔ４−ＤＮＡポリメレースを用い
て切断面を平滑末端に変える。一方、マウス１（鎖プロ
モーター領域、マウスＶｌ＋遺伝子及びマウスＩｆ鎖エ
ンハンサー領域を含む３．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅｃｏ
ＲＴ　−ＥｃｏＲＩ　）の両端をＴ４−ＤＮＡポリメレ
ースを用いて平滑末端に変え、これら２つのＤＮＡ断片
同士を宝ライゲーションキットを用いて連結し、キメラ
抗体］ｌ鎖遺伝子βγ１を含むプラスミドを作製した。

ついで、このプラスミドを制限酵素Ｂａｍ１ｌ　Ｉで切
断し、アガロースゲル電気泳動によりβγ１３ｆｉ伝子
断片を草子断片、コノ断片をｐｓＶｌ−ｇＰｊベクター
［Ｒ，Ｃ。

Ｍｕｌｌｉｇａ＋＋ら、　　　Ｐｒｏ、　　ＮＡＳ、　
　ＵＳＡ、　　７８．　　　ｐ２０７２（１９８１）参
！ｑコのＤａｍｌｌｌサイトに挿入し、ｐＳＶ２−βγ
ｌを作製した（第９図）。

ｐｓＶｌ−ｎｅｏベクター［Ｐ、　　Ｊ、　　５ｏｕｔ
ｈｅｒｎらＪ、　　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１．　　ｐ３２７　（１
９８２）参照］は、そのクローニングサイトとしてＥｃ
ｏＲｌ及びＢａｍｔｌｌサイトを持っているが、さらに
Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍサイトもクローニングサイトとして
使用できるように改造した。はじめに、ｐｓＶｌ−ｎｅ
ｏベクターを制限酵素器ｎｄｌｌＩで切断し、その切断
面をＴ４−ＤＮＡポリメレースを用いて平滑末端に変え
、再びＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、本来ベク
ターの保持しているＩｆ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍサイトを消失
させた０次に、このベクターを制限酵素ＨｃｏＲＩとＢ
ａｍ１ｌｌで切断してアガロースゲル電気泳動により約
５．０ｋｂのＤＮＡ断片を単離した後、ｐＢＲ３２２ベ
クターのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩの３７５ｂｐＤＮＡ
断片とタカラライゲーションキットを用いて連結して、
ｐｓＶｌ。

ｎｅｏベクターを構築した。

ｐｓＶ２°−ｎｅｏベクターを制限酵素ＨｃｏＲＩと旧
ｎｄｍで切断したｆ＆、　　マウスに鎖のエンハンサ−
領域を含む１．１ｋｂのｌ１ｉｎｄｎｌ　−ＥｃｏＲＩ
　　ＤＮＡ［ｔＪｉ片［ＨｃｏＲＩサイトは本来Ｘｍｎ
　１サイトであるが、ＥｃｏＲＩリンカ−を用いて変化
させである。この遺伝子は、凡用大学・生体防御医学研
究所渡邊武教授より分与された。］と宝ラうゲーション
キットを用いて連結した０次に、制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断し、ヒトＣに遺伝子を含む２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ
　−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡ断片とタカラライゲーション
キットを用いて連結した。さらに、制限酵素器ｎｄｍで
切断し、マウスに鎖プロモーター領域及びマウスＶＫｆ
ｉ伝子を含む３．６ｋｂの旧ｎｄｍ　−１１ｉｎｄｍＤ
ＮＡ断片と宝ライゲーションキットを用いて連結し、ｐ
ＳＶ２　’−βにを構築した（第１０図）。

また、ヒト免疫グロブリンｌ（Ｍｆｆｉ伝子のエンハン
サ−を利用したｐＳＶ２−βに２も同時に構築した。マ
ウスに鎖プロモーター領域及びマウスＶＫ遺伝子を含む
３．６ｋｂの１ｌｉｎｄｌｌｌ　−ｌｌｉｎｄｍ　ＤＮ
Ａ断片の両端を７４−ＤＮＡポリメレースを用いて平滑
末端に変え、ｐａｃｔｓベクターの［１ｉｎｃＨサイト
に挿入し、マウスＶに遺伝子断片の５゛端の旧ｎｄｍサ
イトをＥｃｏＲＩサイトに変更した。同様にして、ヒト
Ｃに遺伝子を含む２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲ
Ｉ　ＤＮＡ断片の３′端のＥｃｏＲＩサイトを旧ｎｄ［
［Ｉサイトに変更した。次に、この両ＤＮＡ断片をＴ４
リガーゼを用いて旧ｎｄｍサイトで連結し、さらに両端
のＥｃｏＲＩサイトを用いて、ｐｓＶｌ−ｎｅｏベクタ
ーのＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ、このプラスミドを
制限酵素ＥｃｏＲｒで部分切断し、アガロースゲル電気
泳動を行って２ケ所あるＥｃｏＲＴサイトの内どちらか
一方が切断されたＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断
片にヒト免疫グロブリン１１鎖遺伝子のエンハンサ−を
含む１．０ｋｂのＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片
（旧ｕ１−１ｌｐａ　Ｉ　ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩリン
カ−を用いてＥｃｏＲＩＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片に変化
させている。）を宝ライゲーションキットを用いて組み
込み、マウス■に遺伝子の５°側のＥｃｏＲＩサイトに
エンハンサ−ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを選別
し、ｐｓＶｌ−βに２を構築した（第１１図）。

ｐｓＶｌ　’−βにＤＮＡを制限酵素１１ａｎ＋Ｈ　Ｉ
で部分切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、２カ
所あるＢａｍＨＩサイトのうちどちらか一方が切断され
たＤＮＡ断片を単離した。一方、ｐｓＶｌ−βγｌＤＮ
Ａを制限酵素１１ａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動を行って、マウス−ヒトキメラＨ鎖遺伝子を含む
ＤＮＡ［！Ｉ７片を単離した。このようにして得た２つ
のＤＮＡ＠片を宝ライゲーションキットを用いて連結さ
ぜ、マウスＶに領域内のＢａｍ１日サイトではな（ｐｓ
Ｖ２’−ｎｅｏべフター内のＢａｗ＋ＨＩサイトにマウ
ス−ヒトキメラｌ１ｆｆｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドを、制限酵素切断点地図の違いによ
り選別した。こうして、１（鎖り鎖２つのキメラ抗体遺
伝子を含むプラスミドｐｓＶ２°−βγｌにを作製した
く第１２図）。

ｐｓＶ２−β７１．　　ｐｓＶ２’−７９にあるいはｐ
ＳＶ２−／３　ｐｃ　２（１７）ＤＮＡをＤＥＡＥ−デ
キストラン法［Ｍ、　Ｓ、　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ。

ＥＨＯＪ、、　２．ｐ１３１７　（１９８３）参照］に
より種々の形質細胞腫である　Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・
１（ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５９７）、　Ｐ３／ＮＳＩ／
１−＾ｇ４−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１８）、Ｓｐ２１０−
Ａｇ１２（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）細胞株［ＫｏｈＩ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６．　　ｐ４９５　　
（１９７５）；　　Ｋｏｈｌｅｒら　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６．　ｐ２９２　（１９７
６）］等に導入し形質転換を行った。即ち、形質細胞腫
を牛胎児血清（Ｆｅ２）を含まないＤＭ１ｉＭ培地で数
回洗浄した後、その１ｘ１０’個の細胞を９０μ９（７
）　ｐｓＶ２−βγ１、ｐｓＶ２°−βにあるいは、ｐ
ＳＶ２−７９　ｐｃ　２７ラスミドＤＮＡと２００ａｑ
　／ｌｄ　ＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア）を含
むＤＭＥＭ２．５−に３０分間浮遊させる０次に、この
細胞をＦｅ２を含まないＤＭＩ’：Ｍで数回洗浄した後
、１０％のＦｅ２を含むＲＰＭ１１６４０培地に浮遊さ
せて、２４ウエルプレートにそれぞれ１−ずつ５ｘｌＯ
５個の細胞が入るように分注し、４８時間培養する。そ
の後、ｐｓＶ２−βγｌＤＮＡを導入した場合には、６
．５μ９／−のミコフェノールｉ！１２（シグマ社）と
２５０７１ｇ／ｄのキサンチン（シグマ比）と１０％Ｆ
Ｃ３を含むＲＰ旧−１６４０培地に、ｐｓＶ２’−Ｂ　
にまたはｐ　Ｓ　Ｖ　’ｉ！βに２　　ＤＮＡを導入し
た場合には、１．５ｍｇ／−のジェネチシン（シグマ社
）と１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に取り
替え、形質転換細胞をそれぞれ選択する。

次に、形質転換細胞をスライドグラス上に固定し、アセ
トン−エタノール（１：１）処理した後、蛍光標識抗体
［ＦＩＴＣ標識ヤ標識ヤギ抗ヒト１アＧ特異性、或はに
鎖特異性）：Ｃａｐｐｌ　ｌａｂ、Ｉｎｃ、］で染色し
て形質転換細胞の細胞質に強く特異的な蛍光染色が認め
られる細胞を選択し、導入したＴＩＮＡがヒトγｌ頷あ
るいはに鎖として強く発現している細胞を確立した。

次に、ｐｓＶ２−βγｌＤＮＡで形質転換された細胞に
はｐｓＶ２°−βにまたはｐｓＶ２−βｔｃ　２ＤＮＡ
を、ｐｓＶ２°−βにＤＮＡまたはｐｓＶ２−βに２で
形質転換された細胞にはｐｓＶ２−βγｌＤＮＡを、前
述した方法に従ってさらに導入し、二重形質転換細胞を
得た。

この中からキメラ抗体を産生じている細胞を選択するた
めに、抗ヒｌ−１ｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｉａｂ、ｉ
ｎｃ、）を用いた酵素免疫測定法（ＥＴＡ）を行った。

即ち、抗ヒｌ−１ｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、ｉ
ｎｃ、）をコーティングしたｐｖｃ製プラスッチクプレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ３９１２＞に二重形質転換細胞の培
養上清を加え、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｃａｐｐｅｌ　Ｉａｈ、Ｉｎｃ、）を反応させ、ＴＭ
ＢＺ（３，３’、　５．５°テトラメチルベンジジン：
同仁化字）で発色させて、キメラ抗体産生細胞を選択、
確立した。

ｐｓＶ２’−βｒ　１にＤＮＡヲＤＥＡＥ−テキスト−
ｙ　：ｙ法［Ｍ。

Ｓ、　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　ＥＭＢＯＪ、、　２．　
ｐ１３１７　（１９８３）参照］により種々の形質細胞
腫であるＰ３Ｘ６３Ａｇ８・６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ　
１５８０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・０１（ＡＴＣＣＣＲＬ
　１５９７）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−＾ｇ４−１（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ１８）、　Ｓｐ２１０−Ａｇ１２（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ１５８１）細胞株［Ｋｏｈｌｅｒら、−Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２５６．　ｐ４９５（１９７５）；　　Ｋｏｂｌ
ｅｒら　Ｆｕｒ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　
　６．　　ｐ２９２（１９７６）　］等に導入し形質転
換を行った。即ち、形質細胞腫を牛胎児血清（Ｆｅ２）
を含まないＤＭＥ１４培地で数回洗浄した後、その１ｘ
ｌＯ”個の細胞を９０μ９のＤＮＡと２００μｇ　／ａ
Ｑ　ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア）を含むＤ
ＭＥＭ２．５ｍｌに３０分間浮遊させる０次に、この細
胞をＦｅ２を含まないＤＭＥＭで数回洗浄した後、１０
％のＦｅ２を含むＲＰＭ［−１６４０培地に浮遊させて
、２４ウエルプレートにそれぞれＨｎｌｌずつ５ｘｌＯ
’個の細胞が入るように分注し、４８時間培養する。そ
の後、１５■／−のジェネチシン（シグマ社）と！０％
ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に取り替え、形質
転換細胞を選択した。

この中からキメラ抗体を産生じている細胞を選択するた
めに、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、Ｉｎ
ｃ、）を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を行った。即
ち、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、Ｉｎｃ
、）をコーティングしたｐｖｃｔ！Ｊプラスッチクプレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ３９１２＞に形質転換細胞の培養上
清を加え、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｃ
ａｐｐｅｌ　ｌａｂ、Ｉｎｃ、）を反応させ、ＴＭＨＺ
（３，３°、５．５’テトラメチルベンジジン：同口化
学）で発色させて、キメラ抗体産生細胞を選択、確立し
た。

（ｔｏ）　　ｌ＋ＩＶ　　メー　　　　　のこのように
して確立したキメラ抗体産生細胞の産生するキメラ抗体
の発現状態を調べるため、酵素免疫測定法（ＥＩＡ＞、
ウェスタンプロット分析、ノーザンプロット分析を行っ
た。

１１１Ｖの外皮膜蛋白ｇ　Ｈ　１２０、抗ヒトγ１鎖抗
体（Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、Ｉｎｅ、）、あるいは抗ヒ
トに鎖抗体（Ｃａｐｐｅｌｌｌｂ、　Ｉｎｃ、　）をＰ
ＶＣ製プラスッチクプレート（ｐａｌｃｏ＋＋３９１２
）にコーディングした後、上述のＤＮＡで形質転換され
た形質細胞腫の培養上清を加え、ペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ　ｌａｂ、ｉｎｃ、）
で反応させたｆＬ　　ＴＭＢＺ（３，３’、　５．５″
テトラメチルベンジジン：同口化学）で発色させた結果
、キメラ抗体を産生じている全ての形質転換細胞の培養
上清は、］１１ｖ外皮膜蛋白ｇｐ１２０と強く反応し、
なおかつ抗ヒＩ・γｌ鎖抗体及び抗ヒトに鎖抗体とも強
く反応した。

従って、これらキメラ抗体産生細胞の産生ずるキメラ抗
体は、ｇｐ１２０に対する特異性を持ち、なおかつＨ鎖
もＬ鎖もヒト型化していることが示唆された。

また、ヒトポリクローナルＩｇＧを用いた検量線から、
その発現量を推定すると、１ｘｌＯ”個のＰａｐＩｉが
１０ｍ１ｌの培養上清中に約０．５〜５μ９／−の範囲
で抗ＨＩＶキメラ抗体を産生していることが認められた
。実施例〈８）で確立した抗ＨＩＶキメラ杭木産生細胞
の中から、再クローニングにより５〜８μｑ／ａｌｌの
キメラ抗体を産生じている細胞（Ｃβ１細胞）を選び、
以下に述べる実験に使用した。なお、この細胞は、４２
のスピナーフラスコで１ケ月間培養しても、その産生量
を低下させることはなく、キメラ抗体を安定して産生し
ていた。このような抗日Ｖ中和キメラ抗体を産生ずる形
質転換体Ｃβｌは、微工研菌寄第１０１００号として本
出願人により寄託されている。

次に、キメラ（Ｃβ１）抗体の＋ｍＲＮＡが正常に作ら
れているか否かを調べた。Ｃβｌ抗体産生細胞及びその
親株であるＰ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３　（β３・６５３
）カラｅ＋ＲＮＡヲ抽出し、０．５βＶ１１遺伝子（ｇ
Ｈｌｌ）、０．５（ｊＶに遺伝子（ｇＬ４１）、ヒト０
１１Ｍ遺伝子、及びヒトＣに！Ｓ遺伝子をプローブに、
ノーザンプロット分析を行った。その結果、第１３図に
示すようにＣβ１４ａ胞において、１１鎖では０．５β
ＶＩ＋とヒ１−Ｃｙ１７ｏ−ブでそれぞれ約１．８ｋｂ
ノ一致したバンドが検出され、＝方、Ｌ鎖では０．５β
■にとヒトＣにプローブでそれぞれ約１．３ｋｂの一致
したバンドが検出された。このことより、キメラ抗体は
ｍ　Ｈ　Ｎ　Ａの段附でキメラ化していることが示唆さ
れた。

次に、発現されたＣβ■抗体の蛋白サイズをウェスタン
プロット分析により検討した。Ｃβ１抗体あるいは正常
ヒトＩｇＧ抗体を、２ＭＥ存在下あるいは非存在下で５
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロースフィルター（
バイオ・ラット）へトランスファーした。

その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ　Ｉａｂ、１ｎｃ）を反応させ、次いで、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　ｔａｂ、
　ｉｎｃ、　）を作用させ、バイオラッド社のＨＲＰ　
Ｃｏ１ｏｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ
を用いて、発色させた。その結果、第１４図に示すとう
り、Ｃβ１らヒトＩｇＧもほぼ同じ位置にバンドが検出
された。そのサイズは、１１２Ｌ２で約１６０ｋ、Ｈで
約５０ｋ、■、で約２８にであった。このことより、こ
のＣβ１キメラ抗体は、抗体分子として正常な形をとっ
ているものと思われる。

（１１）　　旧Ｖ　　−パ 今回キメラ化に使用したマウス０．５β抗体は、ＨＩＶ
のｇｐ１２０に対して特異性のある抗体であるが、この
キメラ化したＣβ１抗体が同様にｇｐ１２０に対して特
異性を示すか否かを、旧Ｖ粒子を用いたウェスタンプロ
ット分析で検討した。　　ＩＨＶ粒子を可溶化して５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥを行い、先述のように、ニトロセルロース
フィルターへトランスファーした。このフィルターにマ
ウス０．５β抗木、Ｃβ１抗体、ヒト正常血清、及びヒ
ト旧Ｖ陽性血清をそれぞれ反応させ、マウス０．５β抗
体の場合はペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（
Ｃａｐｐｅｌ　Ｉａｂ、　ｉｎｃ、　）で、それ以外は
ペルオキシダーゼ標諏ヒトｒｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　
Ｉａｂ、ｉｎｃ、）で、１１ＲＰ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｒｅａｇｅｎｔ（バイオ・ラット）
を用いて染色した。その結果、第１５図に示すように、
マウス０．５β抗体と同様、Ｃβ１抗体ははりきりとｇ
Ｐ１２Ｑと反応していることが示された。

次に、このＣβｌ抗体が旧Ｖ感染細胞と反応するが否か
を調べた。方法は、］目Ｖ感染ｔ＋９細胞にｃ／３１抗
体を作用させ、ファクスター（ベクトン・デッキンノン
）を用いて分析した。第１６図に示すように、Ｃβｌ抗
体は、正常ヒトｒｇＧに比べて蛍光強度がシフトシてお
り、このことより、ＨＩＶ感染細胞上のｇＰ１２０抗原
をＣβ１は認識しているものと思われる。

次に、Ｃｌ１１抗体の旧Ｖ中和活性を検討した。初めに
、ＨＶ感染細胞の合胞体形成システムを用い、Ｃβ１抗
体の合法体形成阻止能を検討した。即ち、ＨＩＶを産生
じているＬＡＶ感染ＣＥＭ細胞と未感染のＣＥＭ細胞を
混合培養すると、２４時間後には合法体形成が認められ
るが、ＬＡＶ感染細胞をＣβ１抗体であらかじめ処理し
て未感染ＣＥＭ細胞と混合培養すると、合法体形成が１
００％抑制されたく第１７図）、従って、Ｃｌ３１抗体
にはｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅｌｌ感染防御箭が期待できる
。

次に、Ｃβｌ抗体のＩ［Ｉ　Ｖ粒子感染阻止能を検討し
た。

即ち、ＨＴＶ（ＬＡＶ）粒子をＭＴ４細胞に感染させ、
３日間培養すると、ＬＡＹ感染の結果生じる巨細泡形成
が認められるが、ＬＡＶをＣβ１抗体であらがしめ処理
しておくと、巨細泡形成は認められず、感染が成立しな
い（第１８図）、さらに、このような細胞の中がら怒染
細胞を抗Ｐ２４モノクローナル抗体（セルラ−１０ダク
ツ社）を用い間接蛍光抗体法にて測定しても、Ｐ２４抗
原の発現は認められない。従って、Ｃβｌ抗体には、旧
■粒子怒染阻止能があると思われる。

前述の２つの結果から、Ｃβ１抗体は、旧Ｖ中和活性を
有していると思われる。

このように上記（１０）、　（１１）の結果より、］Ｈ
ν外皮膜蛋白ｇｐ１２０と特異的に結合するマウス０，
５β抗体の可変領域　（Ｖｌｌ、Ｖに）を有し、定常領
域がヒトＩｇＧ抗体（Ｃｌ１．Ｃに）であるマウスヒト
キメラ抗体が、完全な免疫グロブリン（Ｈ２Ｌ２）の形
で本形質転換細胞（Ｃβｌ細胞）から発現産生されてい
ることか証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図および第３１Ｚは、それぞれ実施例で調製したＶ
Ｈ領域遺伝子およびＶに領域遺伝子の制限酵素切断点地
図である。 第２図は、実施例（２）で調製したＶｌｌ領域遺伝子と
５４’ＣＢＩＲｉＡ胞のｍＲＮＡとのノーザンハイブリ
ダイゼーションの解析結果を示すＸ線写真の模式図であ
る。 第４図は、実施例（２）で調製しなＶに領域遺伝子と５
４°ＣＨＩ細胞のｍＲＮＡとのノーザンハイプリダイゼ
ーションの解析結果を示すＸ線写真の模式図である。 第５図および第７図は、それぞれ本発明のＶｌｌ領域遺
伝子およびＶに領域遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一例を示
したちのである。 第６図および第８図は、それぞれ本発明のＶｌｌ領域遺
伝子およびＶに領域遺伝子のアミノ酸配列の一例を示し
たものである。 第９図は、抗ＨＩＶキメラ抗体１］鎖遺伝子を含む発現
型プラスミドを得る系統図を示したものの一例である。 第１０図は、抗＋＋１Ｖキメラ抗体り鎖遺伝子を含む発
現型１ラスミドを得る系統図を示したものの一例である
。 第１１図は、抗ＨＩＶキメラ抗体ＬＭ遺伝子を含む発現
型プラスミドを得る系統図を示したものの一例である。 第１２図は、抗ＨＩ　Ｖキメラ抗体１１鎖遺伝子および
Ｌ鎖遺伝子を含む発現型プラスミドを得る系統図を示し
たものの一例である。 第１３図は、抗１１１■キメラ抗体を産生している細胞
のｎＲＮＡと実施例（２）で調製したＶＴｌ、ＶＡ−領
域遺伝子、及び実施例（３）で調製したヒトＣγ１、Ｃ
Ｋ頭域遺伝子とのノーザンハイブリダイゼーションの解
析結果を示すＸ線写真の模式図である。 第１４図は、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた抗１１１Ｖキメ
ラ抗木蛋白のウェスタンプロット分析の解析結果を示し
た模式図である。 第１５図は、抗１１１Ｖキメラ抗体を用いた可溶化Ｈ１
ｖ粒子のウェスタンプロット分析の解析結果を示した模
式図である。 第１６図は、抗ＨＩＶキメラ抗体を用いたＨＩＶ感染細
胞のファクスター分析の解析結果を示している。 第１７図は、抗ＨＩＶキメラ抗体の合胞体形成阻止活性
を示した細胞写真である。 第１８図は、抗ＨＩＶキメラ抗体の旧Ｖ感染阻止活性を
示した細胞写真である。 プローブ Ｃ１０ Ｈ１１ 第２図 第 図 第３図 ７０−ブ Ｃに Ｌ４１ Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＶｈＩ　Ａｌａ　Ｔｈ
ｒ　Ａｌａ　ｌ１ｅＧｌｙ　Ｖａｔ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　
ＧＪＩ　’／ｉｆ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ
　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　
ＧｌｙＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔ　
ｒ　Ｐｒｏ　Ｔｌｅ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ
　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ＨｉｓＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｈ
ｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｔ　　Ｓｅｒ＾５ＡｓｎＴ　　Ａ
ｓｎＧＩｕＬ　　　　Ｌ　　ＧＩ　　ＬｙｓＡｌａＬｙ
ｓＬｅｕＴｈｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅ’ｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＬｅｕＴｈｒ　Ｓｅｒ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔ
ｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　加」瀉Ｓｅｒ
　Ａｌ−≧−Ｑ　Ｍｅｔ　　　Ｔ　　Ｔ　　ＧＩ　　Ｇ
ＩｎＧＩ　　ＴｈｒＳｅｒＶａｌＴｈｒＶａｌ　Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ □はＮ末アミノ酸；□　は本発明の特異配列第６図 オクタマー オクタマー ＧＴＡＡＧＴＡＧ　ＡＣＴｒＴＴＧＣＴＣＡｍＡＣＴＴ
ＡＴ　ＧＡＣＧ’ｍＴＧＧ□　はエクソン部分を示す 第７図 Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｉｃｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ｌ／ａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｒｐ　ＶａｌＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
　Ｇａｙ　Ａｓ　　Ｔｉｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　５ｅｒＬｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｖ＆ｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ
　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ｌｅｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　−ロム５
ｅｒＧ］ｎ５ｅｒＶａｌ　　　　Ｔ　　ＡｓＧＩ　　　
　５ｅｒＴ　　ＭｅｔＡｓｎＴｒｐＴｙｒＧｌｎ　Ｇｉ
ｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｉｅ　ＪＳｅｒ　Ａｓｎ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ
ａｙＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ
　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｈ４ｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＡｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ
　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓ　　Ｐｒｏ　ＰｈｅＴｈｒ　Ｐ
ｈｅ　ＧＩ　　Ｓｅｒ　ＧＩ　　Ｔｈｒ　Ｌ　　Ｌｅｕ
　Ｇｌｕ　Ｉｃｅ　ＬｐｓＶ２−ｎｅｏ（ΔＨ＋ｎｄｌ
ｌ１１第１０図 ヒトＨ鎖定常領域遺伝子 第１１図 １）ＳＶ２′−βに Ｂａｍ１（Ｉ 第１２図 ２ＭＥ＋＞ 第１４図 ２ＭＥ　（＋） 第１５図 第１６図 Ｃ／ｌ／１　ｇｆ＃ｔＲ’下（箸定刈１１Ｍ１）第１７
図 事件の表示 昭和６３年 特許願第 １７１３８５号 発明の名称 補正をする者 事件との関係

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ＨＩＶ中和活性を持つ免疫グロブリンのＨ鎖可
   変領域をコードする遺伝子断片であって、少なくとも下
   記の（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   配列をその一部に持つ遺伝子断片。 （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】
2. （２）該遺伝子断片が、下記のアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子を含むものである前記第（１）項記載の遺伝子
   断片。 【遺伝子配列があります】
3. （３）該遺伝子断片が、下記の遺伝子を含む配列である
   前記第（２）項記載の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
4. （４）抗ＨＩＶ中和活性を持つ免疫グロブリンのＬ鎖可
   変領域をコードする遺伝子断片であって、少なくとも下
   記の（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   をその一部に持つ遺伝子断片。 （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】
5. （５）該遺伝子断片が、下記のアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子を含むものである前記第（４）項記載の遺伝子
   断片。 【遺伝子配列があります】
6. （６）該遺伝子断片が、下記の遺伝子を含む配列である
   前記第（５）項記載の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
7. （７）Ｈ鎖並びにＬ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリン
   由来のアミノ酸配列であり、さらにＨ鎖並びにＬ鎖の可
   変領域がそれぞれ下記に示された（ａ）〜（ｄ）のアミ
   ノ酸配列をその一部に有するアミノ酸配列からなること
   を特徴とする抗ＨＩＶキメラ抗体。 ［Ｈ鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列］；（ａ）【遺
   伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】 ［Ｌ鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列］；（ａ）【遺
   伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】
8. （８）Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列が、それ
   ぞれ下記のアミノ酸配列である前記第（７）項記載の抗
   ＨＩＶキメラ抗体。 ［Ｈ鎖可変領域］； 【遺伝子配列があります】 ［Ｌ鎖可変領域］； 【遺伝子配列があります】
9. （９）前記第（１）項記載の遺伝子断片の下流（３′側
   ）にヒト免疫グロブリンのＨ鎖定常領域をコードする遺
   伝子断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｈ鎖をコード
   する遺伝子と、その上流にプロモーターを有する発現ベ
   クター、及び前記第（４）項記載の遺伝子断片の下流に
   ヒト免疫グロブリンのＬ鎖定常領域をコードする遺伝子
   断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｌ鎖をコードする
   遺伝子と、その上流にプロモーターを有する発現ベクタ
   ーとにより共形質転換されたミエローマ細胞からなる形
   質転換体。
10. （１０）前記第（１）項記載の遺伝子断片の下流（３′
    側）にヒト免疫グロブリンのＨ鎖定常領域をコードする
    遺伝子断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｈ鎖をコー
    ドする遺伝子、及び前記第（４）項記載の遺伝子断片の
    下流にヒト免疫グロブリンのＬ鎖定常領域をコードする
    遺伝子断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｌ鎖をコー
    ドする遺伝子の上流にそれぞれプロモーターを有する発
    現ベクターにより形質転換されたミエローマ細胞からな
    る形質転換体。
11. （１１）前記第（１）項記載の遺伝予断片の下流（３′
    側）にヒト免疫グロブリンのＨ鎖定常領域をコードする
    遺伝子断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｈ鎖をコー
    ドする遺伝子と、前記第（４）項記載の遺伝子断片の下
    流にヒト免疫グロブリンのＬ鎖定常領域をコードする遺
    伝子断片を連結させた抗ＨＩＶキメラ抗体Ｌ鎖をコード
    する遺伝子とを同時にマウスミエローマ細胞で発現・分
    泌させ、これを回収することを特徴とする抗ＨＩＶキメ
    ラ抗体の製法。