JP2023516420A - がんタンパク質抗原を発現するように操作された生チフス菌ベクターおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導するための組成物および方法であって、免疫学的有効量の生チフス菌ベクターを対象に投与することを含み、チフス菌ベクターが１つ以上のがん抗原を発現するように操作されている、組成物および方法を提供する。いくつかの態様では、ベクターは、外膜折り畳みタンパク質Ｂａｍ Ａまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作され、チフス菌ベクターは、対象に投与されたときに、抗原を粘膜組織に、または外膜小胞を介して樹状細胞に皮下で送達することができる。【選択図】図１

Description

電子的に提出された材料の参照による組み込み
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、以下の、２０２１年３月１日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の７４，８４２バイトの１つのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルと特定されるコンピュータ可読配列表である。

本発明の分野は、概して、医学、がん、および分子生物学の分野、特にワクチン免疫療法の技術に関する。

がんは米国における主な死因の第２位であり（心疾患に次ぐ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）は米国の男性および女性の両方において２０１９年の罹患率および死亡率の上位３位の発がん性原因である（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０１９；６９（１）：７－３４；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０１９；６９（５）：３６３－８５）。結腸がん、直腸がん、および肛門がんのための従来の治療法は、典型的には、外科的切除、放射線、および／または拡張し続ける範囲の絶えず改良されている一連の化合物を包含する化学療法を含む（Ｌｉｂｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ，２０１６；Ｌｉｂｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ，２０１６；Ｃｚｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ，２０１６）。最近まで、宿主の免疫系を利用して腫瘍組織を除去しようと試みる、あまり侵襲的ではない治療戦略は、手が届かないように見えていた。しかし、腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、それによって腫瘍微小環境の免疫抑制機構を回避して腫瘍の排除を増強する免疫チェックポイント阻害剤が最近成功したことで、がんの治療に対する免疫療法アプローチへの関心は、現在、楽観主義の高まりを生じている（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６；４（１６）：３０５）。免疫チェックポイント阻害剤を使用してＴ細胞の免疫抑制を抑制することに加えて、樹状細胞の活性化を介して自然免疫を増強して、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の細胞傷害性Ｔ細胞への交差提示をもたらし、またＴ細胞の動員が、Ｔ細胞媒介性および抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答の両方を増強するのを補助するようにする努力も進められている（Ｗｃｕｌｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９）。

サルモネラは、免疫系に外来抗原を送達する粘膜生キャリアワクチンとして使用するために最も研究されている生物の１つである。何年にもわたり、血清型チフス菌由来のサルモネラのいくつかの弱毒化ワクチン株が開発されてきた（Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９７；６５（２）：４５２－６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００；６８（８）：４６４７－５２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ２００ｌ ６９（８）：４７３４－４１；Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００；６８：１１９６－２０１）。一部の弱毒化ワクチン株は、腸管分泌型ＩｇＡ抗体、血清ＩｇＧ抗体およびＴ細胞媒介性免疫を含む広範囲の免疫応答を臨床試験で誘発している（Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９７；６５（２）：４５２－６．；Ｔａｃｋｅｔ ｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００；６８：１１９６－２０１）。経口投与された生きているチフス菌が、循環しているヒト単球および樹状細胞を活性化し、ヒトにおいて樹状細胞の交差提示をすることを通してＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングできることが最近確認された（Ｔｏａｐａｎｔａ ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＮｅｇｌ ＴｒｏｐＤｉｓ ２０１５；９（６）：ｅ０００３８３７；Ｓａｌｅｍｏ－Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２００９；４（６）：ｅ５８７９）。

ヒトにおいてがんの治療的介入をするためサルモネラ菌を使用することは、ネズミチフス菌およびチフス菌血清型の両方を使用した臨床試験で試験されており、期待外れの結果であった。しかし、サルモネラ株を使用するヒトにおける有効性は、使用されている血清型に依存する。ネズミチフス菌はヒトである宿主に適応し、経口投与後にヒトの組織に深く浸透することができるが、ネズミチフス菌は血流に入った後に急速に除去される１（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ，ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ ２０１６；７（１））。弱毒化ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９による治療的処置は、マウスのモデルにおいて大いに有望であるが、生物を数時間血流に直接投与したにもかかわらず不成功であった（Ｔｏｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０（１）：１４２－５２；Ｈｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００３；２６（２）：１７９－８０）。得られたキャリアワクチンＶＸＭ０１において血管新生ＴＡＡ ＶＥＧＦＲ２を発現する認可されたチフス菌ワクチン株Ｔｙ２１ａを用いた臨床試験も、おそらく既に大きく弱化した親Ｔｙ２１ａワクチン株の過剰減衰のために、限られた治療上の利益しかもたらさなかった（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２；１２：３６１；Ｓｃｈｍｉｔｚ－Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５；４（４）：ｅｌ００１２１７；Ｓｃｈｍｉｔｚ－Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８；７（４）：ｅｌ３０３５８４）。

がん胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸直腸がんを含む様々な腫瘍組織において発現される約１８０ｋＤａの表面の糖タンパク質であり、細胞接着および血管新生促進の特性の両方を有するという仮説が立てられる（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ ｅｌ ａｌ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １９９９；９（２）：６７－８１；Ｂｒａｍｓｗｉｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１３；７３（２２）：６５８４－９６）。これは、可変Ｎ末端ドメインとそれに続く３組の定常Ｉｇ様ドメインから構成される免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり、それぞれ「Ａ」および「Ｂ」サブドメインから構成され（Ａ１Ｂ１、Ａ２Ｂ２、およびＡ３Ｂ３と命名）、９０％を超えるアミノ酸配列同一性を示す（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １９９９；９（２）：６７－８１；Ｏｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９８７；１４２（２）：５１１－８）。複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、ＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインにマッピングされている（Ｈｅｆｔａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２；５２（２０）：５６４７－５５；Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７（２０）：４５７０－７；Ｎｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９；８０（１）：９２－７）。臨床試験は、自己免疫を引き起こすことなくＣＥＡを首尾よく標的化する安全性を明確に確立している。２つの最近の研究は、寛容および免疫抑制回避の両方を回避することによって腫瘍特異的適応免疫応答を拡大するために組換えＣＥＡを有する樹状細胞を標的とした。両試験は、臨床的に適切なＣＥＡ特異的Ｔ細胞および抗体応答の誘導の成功を報告した（Ｕｌｌｅｎｈａｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０（１０）：３２７３－８ Ｅ；Ｍｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１０；１２０（９）：３２３４－４１）。

ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ－１は、他の固形腫瘍にも関連する別の表面発現およびグリコシル化結腸直腸がん関連抗原である。このヘテロ二量体糖タンパク質の細胞外タンパク質コアは、最大１２０コピーを含む可変の数のタンデム２０残基プロリンおよびトレオニンリッチリピート（ＶＮＴＲ）配列からなる。細胞外コアは約２０ｋＤａの膜貫通領域と非共有結合している（Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；８２：２４９－９３）。ＭＵＣ－１は、通常、高度にグリコシル化された形態でほとんどの極性化粘膜上皮組織に存在する。しかし、固形腫瘍組織で過剰発現すると、顕著にグリコシル化不足になる可能性があり、これにより、正常にマスクされたエピトープが免疫監視に対して無防備にされる（Ｃａｓｃｉｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１６；６（４）；ｖｏｎ Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ－Ｐｏｕｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５；１５（８）：７３５－４６；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６（３０）：２７７６４－９）。

臨床試験では、ＭＵＣ－１に応答する患者は軽微な副作用を経たが、非応答者は、体液性および細胞性腫瘍特異的免疫の両方を潜在的に妨害する循環骨髄由来サプレッサー細胞のレベルが増加していることが判明した（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）２０１３；６（１）：１８－２６．；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９；１０：１４０１）。ポックスウイルスベースのワクチンでＣＥＡおよびＭＵＣ－１を標的とする二価アプローチは、最近、安全かつ免疫原性であることが第１相の用量漸増臨床試験で確認された（Ｇａｔｔｉ－Ｍａｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１９；２５（１６）：４９３３－４４）。

がんを処置するための新規な組成物および方法を開発する緊急の必要性がある。本発明は、この必要性を満たし、追加の利点も提供する。

この背景情報は、情報提供のみを目的として提供される。前述の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを必ずしも認めることを意図しているのではなく、またそのように解釈されるべきでもない。

実施形態の前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示であり、したがって実施形態の範囲を限定しないことを理解されたい。一態様では、本発明は、１つ以上のがん抗原、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、チフス菌ベクターが、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に抗原を送達することができる、生チフス菌ベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、ＢａｍＡ、ＰａｇＬおよび抗原の１つまたは複数の発現は誘導性であり、誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはオスモル濃度に対して感受性である。いくつかの実施形態では、浸透圧で制御された誘導性プロモーターは、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである。いくつかの実施形態では、抗原は、外膜タンパク質、その抗原断片またはその変異体を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は結腸がん由来である。いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質ＣＥＡおよびＭＵＣ１由来の抗原配列を含む融合タンパク質を発現する弱毒化チフス菌細菌生ベクターワクチン株を提供し、チフス菌細菌生ベクターは、組換え外膜小胞（ｒＯＭＶ）の形成の増加を介した免疫系への融合タンパク質の送達の増強を示す。いくつかの実施形態では、チフス菌細菌の生ベクターは、ｒＯＭＶを介して生ワクチンから輸送されるＣｌｙＡタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、ｒＯＭＶを介した生ワクチンからの融合タンパク質およびＣｌｙＡの細胞外輸送が増加する。

別の態様では、本発明は、１つ以上のがん抗原を含むチフス菌からの単離された組換え外膜小胞を含む組成物を提供し、チフス菌は抗原を発現するように操作されている。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上のがん抗原、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された免疫学的有効量の生チフス菌ベクターを対象に投与することを含み、チフス菌ベクターは、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に抗原を送達することができる方法を提供する。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上のがん抗原を含む生チフス菌ベクターからの免疫学的有効量の単離された組換え外膜小胞を対象に投与することを含む方法を提供する。チフス菌ベクターが、１つ以上のがん抗原、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作されている。

別の態様では、本発明は、
ａ．１つ以上のがん抗原、および
ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、
チフス菌ベクターは、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に抗原を送達することができる生チフス菌ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、チフス菌ベクターからの１つ以上のがん抗原を含む単離された組換え外膜小胞を含む組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．１つ以上のがん抗原、および
ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、
抗原が、チフス菌ベクターによって産生される外膜小胞によって対象の粘膜組織に送達される、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ｉ．免疫学的有効量の生チフス菌ベクターであって、
ａ．１つ以上のがん抗原、および
ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクター、および
ｉｉｉ．生チフス菌ベクターからの免疫学的有効量の単離された組換え外膜小胞であって、チフス菌ベクターが、１つ以上のがん抗原、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作されている組換え外膜小胞を対象に投与することを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、
ａ．１つ以上のがん抗原、および
ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、
抗原が、無関係な診断方法論による標的腫瘍の早期検出後に対象の粘膜組織に送達される方法が提供される。例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｌ ａｌ．２０１８．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９：９２６－９３０を参照されたい。

別の態様では、本発明は、対象に有効量の本明細書に記載の生チフス菌ベクターおよび／または有効量の本明細書に記載の単離された組換え外膜小胞を投与することを含む、対象のがんを治療または予防する方法を提供する。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられることを理解されたい。

当業者は、下段で記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を決して限定することを意図するものではない。

ＰａｇＬの過剰発現によって輸送された染色体コード化ＣｌｙＡを発現する同質遺伝子型弱毒化チフス菌ＣＶＤ ９１０生ベクター株の溶血活性。約２×１０^７ＣＦＵの同期細菌培養物からのサンプルを、１群あたり５回の測定を行って、ヒツジ赤血球を使用して、溶血活性について分析した。レーン１：ＰＢＳ；レーン２：９１０；レーン３：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡレーン４：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬ）。 ＣＶＤ９１０生ワクチン株からのＯＭＶにおける抗原ＯｍｐＡ^Ａｂの輸送。 ＰａｇＬの過剰発現によって輸送された染色体コード化ＣｌｙＡを発現する同質遺伝子型の弱毒化チフス菌ＣＶＤ ９１０生ベクター株の溶血活性。約２×１０^７ＣＦＵの同期細菌培養物からのサンプルを、１群あたり５回の測定を行って、ヒツジ赤血球を使用して、溶血活性について分析した。レーン１：ＰＢＳ；レーン２：９１０；レーン３：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ；レーン４：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬｖｌ）；レーン５：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬｖ２）；レーン６：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬｖ３）。 ＢａｍＡの過剰発現によって輸送された染色体コード化ＣｌｙＡを発現する同質遺伝子型の弱毒化チフス菌ＣＶＤ ９１０生ベクター株の溶血活性。約２×１０^７ＣＦＵの同期細菌培養物からのサンプルを、１群あたり５回の測定を行って、ヒツジ赤血球を使用して、溶血活性について分析した。レーン１：ＰＢＳ；レーン２：９１０；レーン３：９１０（ｐＳＥＣ１０）；レーン４：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ；レーン５：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＡｂＢａｍＡｖｌ）；レーン６：９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＡｂＢａｍＡｖ２）。 候補の二価チフス菌ベースの結腸直腸免疫療法ワクチン。がん胎児性抗原（ＣＥＡ）およびヒトムチンＭＵＣ－１由来の標的化された結腸直腸抗原ドメインは、表面発現融合タンパク質として発現され、その後、新規の誘導性ＰａｇＬ媒介性外膜小胞（ＯＭＶ）送達系を介して、免疫誘導部位に提示される。プラスミドは、新規な一本鎖結合タンパク質ベースの戦略を使用して、遺伝子について安定化される。 弱毒化チフス菌ベースの二価キャリアワクチンで発現される、標的化された結腸直腸がん関連抗原。Ａ．がん胎児性抗原（ＣＥＡ）。Ｂ．ＭＵＣ－１。 ＣＲＣがん抗原カセット ＴＬＲ４の活性化を低下させる脂質Ａ構造に対する操作での改変。ＰａｇＬおよびＬｐｘＥについて示される切断部位を有するサルモネラ菌脂質Ａ構造の概略的な表現。 ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：Ｐ_ｏｍｐＣ－ｂａｍＡ^ＡｂΔｆｌｉＣ：：Ｐ_ｏｍｐＣ－ｌｐｘＥ^Ｆｎ（ｐＰａｇＬ－ＬＯＡＭ）の遺伝子構造。元の上流のＰ_ｆｌｉＣプロモーターを保存しながら、ｆｌｉＣ遺伝子を置換するためのＰ_ｏｍｐＣ－ｌｐｘＥ^Ｆｎの染色体挿入を図表が示し、それによってＰ_ｆｌｉＣ－Ｐ^ｏｍｐＣプロモーターの入れ子のセットを作製する。この同じ戦略をまた、Ｐ_ｏｍｐＣ－ｂａｍＡ^ａｂの染色体挿入と共に使用して、元の上流Ｐ_{ｇｕａＢＡ}プロモーターを保存しながらｇｕａＢＡ遺伝子を置換し、それによってＰ_{ｇｕａＢＡ}－Ｐ_ｏｍｐＣプロモーターの入れ子状のセットを作成した。 精製されたｒＯＭＶにおけるＣＲＣ融合タンパク質発現のインビトロでの特徴づけ。０．５μｇの精製されたｒＯＭＶを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（パネルＡ）で染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにレーンごとに負荷し、精製されたウサギＡ３Ｂ３特異的一次抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用するウエスタン免疫ブロット分析によってさらに特徴付けた。

ここで、図面および以下の実施例と共に本発明の原理を説明するのに役立つ本発明の本好ましい実施形態を詳細に参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分に詳細に記載されており、他の実施形態が利用されてもよく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく構造的、生物学的、および化学的変更が行われてもよいことが理解される。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学的な用語は、当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。

本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技能の範囲にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｌ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９８７））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））、ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９８８））、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９））、およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。

分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版、２０００（ＩＳＢＮ ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）；Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓｓにより出版、１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．により出版、１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）に見出すことができる。

本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書を含む任意の他の文書におけるその単語の使用と矛盾する場合、以下に記載される定義が、反対の意味が明確に意図されない限り（例えば、用語が元来使用されている文書において）、本明細書およびその関連する特許請求の範囲を解釈する目的で、常に統制するものとする。「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数形の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は交換可能であり、限定することを意図するものではない。さらに、１つまたは複数の実施形態の説明が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、いくつかの特定の事例では、１つまたは複数の実施形態は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という文言を使用して代替的に説明され得ることを、当業者は理解するであろう。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、使用されている数の数値の±１０％を意味する。

生ベクターおよび組換え外膜小胞
いくつかの実施形態では、本発明は、チフス菌などの生サルモネラ菌ベクターを提供し、それにおいて、サルモネラ菌ベクターは、１つ以上のがん抗原、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作され、サルモネラ菌ベクターは、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に抗原を送達することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のがん抗原および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体を発現するように操作された生チフス菌ベクターを提供し、それにおいてそのチフス菌ベクターは、対象に投与したときに、外膜小胞を介して粘膜組織に抗原を送達することができる。

ＢａｍＡは、グラム陰性菌の外膜へβバレルタンパク質を挿入するのを触媒する５種のタンパク質の外膜のβバレル集合機構（ＢＡＭ）複合体の必須成分を構成する約９０ｋＤａのタンパク質である。本発明において使用され得るＢａｍＡは、特に限定されない。ＢａｍＡは、ＢａｍＡ全長、ならびに生物学的に活性な断片およびＢａｍＡの変異体を包含する。いくつかの実施形態では、ＢａｍＡはアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＢａｍＡを含むヌクレオチド配列が最適化されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のコドン（例えば、稀なコドン）は、発現を増強するために最適化されている。いくつかの実施形態では、推定リボソーム結合部位は、発現を増強するために最適化されている。いくつかの実施形態では、ＢａｍＡのアミノ酸配列は配列番号８である。いくつかの実施形態では、ＢａｍＡの核酸配列は、配列番号１０である。

本発明において使用され得る脂質Ａ脱アシラーゼＰａｇＬは、特に限定されない。ＰａｇＬは、ＰａｇＬ全長、ならびに生物学的に活性な断片およびＰａｇＬの変異体を包含する。いくつかの実施形態では、ＰａｇＬは、サルモネラ菌由来である。いくつかの実施形態では、ＰａｇＬは、ネズミチフス菌に由来する。いくつかの実施形態では、ＰａｇＬを含むヌクレオチド配列が最適化されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のコドン（例えば、稀なコドン）は、発現を増強するために最適化されている。いくつかの実施形態では、推定リボソーム結合部位は、発現を増強するために最適化されている。いくつかの実施形態では、ＰａｇＬのヌクレオチド配列は、配列番号１、３、または５を含む。いくつかの実施形態では、ＰａｇＬのアミノ酸配列は、配列番号２または４を含む。

いくつかの実施形態では、チフス菌細菌の生ベクターは、チフス菌におけるＯＭＶ形成の自然な誘導に関与するＣｌｙＡなどの１つまたは複数のさらなる小胞触媒タンパク質を過剰発現する。ＣｌｙＡは、ＣｌｙＡ全長、ならびに生物学的に活性な断片およびＣｌｙＡの変異体を包含する。

ＣｌｙＡは、過剰発現されたときに大きな外膜小胞の形成を触媒することができる、チフス菌の内因性タンパク質である。小胞形成のためのこのような機構は、小胞を介して、異種外来抗原を生ベクターから輸送するようにＣｌｙＡを操作する興味深い可能性を高めた。これらの小胞はまた、おそらく他の点では免疫原性が低い抗原の免疫原性を改善するために免疫調節性リポ多糖（ＬＰＳ）を担持することもできる。炭疽毒素からの外来保護抗原（ＰＡ８３）の免疫原性を増強するためのＣｌｙＡの有用性、マウスおよび非ヒト霊長類動物モデルの両方で免疫原性であることが証明された生ベクターの炭疽ワクチンを産生する戦略（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７８（１）：３３７－４７；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９（３）：３２６－３５）が確認されてきた。ＣｌｙＡと同様に、ＰａｇＬの過剰発現もまた、興味深いことに、外膜小胞（Ｅｌｈｅｎａｗｙ ｅｔ ａｌ．２０１６．ｍＢｉｏ．７（４）：ｅ００９４０－１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００９４０－１６）の増殖性の形成を誘導することが最近報告されているが、ｐａｇＬ遺伝子はマウス病原体ネズミチフス菌に存在し、チフス菌には存在しない。

チフス菌から得たＣｌｙＡは、Ｗａｌｌａｃｅらによって最初に記載され、大腸菌から得た相同ＨｌｙＥ溶血素の結晶構造も報告した。（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｃｅｌｌ １００：２６５－２７６）。ＣｌｙＡタンパク質は、標的細胞において溶血を引き起こし得る。本発明は、ＣｌｙＡの溶血活性型および溶血不活性型の両方の使用を包含し、得られたタンパク質の抗原輸送および免疫原性の保存が維持され得る場合、溶血不活性変異型がより好ましい。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５および１６に対応する。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡは、ＣｌｙＡの輸送機能を依然として保持しながら、ＣｌｙＡの溶血活性を低下させるように変異させられる。一実施形態では、ＣｌｙＡ変異体はＣｌｙＡ Ｉ１９８Ｎである。別の実施形態では、ＣｌｙＡ変異体は、ＣｌｙＡ Ｃ２８５Ｗである。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡが、ＣｌｙＡの溶血活性を低下させるように変異させられている。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡ変異体は、ＣｌｙＡ Ｉ１９８Ｎ、ＣｌｙＡ Ｃ２８５Ｗ、ＣｌｙＡ Ａ１９９Ｄ、ＣｌｙＡ Ｅ２０４Ｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡは融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡが、Ｉ１９８Ｎ、Ａ１９９Ｄ、およびＥ２０４Ｋの置換の変異を含む。変異体の配列は、配列番号１６を参照する。

いくつかの実施形態では、チフス菌ベクターは、ＴＬＲ４とＴＬＲ５の両方に媒介される反応原性を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、チフス菌ベクターは、ＴＬＲ５アゴニストであるｆｌｉＣ遺伝子に欠失を有する。いくつかの実施形態では、ＣＶＤ９１０などの候補の弱毒化チフス菌ワクチン株またはその誘導体の染色体から欠失されるｆｌｉＣ遺伝子の配列は、配列番号２９である。

いくつかの実施形態では、チフス菌ベクターは、フランシセラ・ノビシダ菌由来のＩｐｘＥ（ｌｐｘＥ^Ｆｎ）を発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、ＩｐｘＥのヌクレオチド配列は配列番号２６であり、アミノ酸配列は配列番号２７である。ＬｐｘＥは、脂質Ａを脱リン酸化して反応誘発性の低いモノホスホリル種を生成する脂質Ａ１－ホスファターゼである（図８）。ＰａｇＬ（脂質Ａを脱アシル化するが、過剰小胞形成を促進する）の共発現によって、顕著に低下したＴＬＲ４およびＴＬＲ５活性を有するペンタアシル－モノリン酸－脂質Ａを含有するｒＯＭＶを産生することができる。いくつかの実施形態では、チフス菌ベクターは、ＬｐｘＥをコードする核酸配列をチフス菌のｆｌｉＣ遺伝子座に挿入するように操作される。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のがん抗原を含む本発明のチフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、抗原は、外膜タンパク質、その抗原断片またはその変異体を含み、チフス菌は抗原を発現するように操作されている。

いくつかの実施形態では、がんは、結腸がん、結腸直腸がん、白血病（例えば、慢性リンパ球性白血病または急性骨髄性白血病）リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、脳がん、肺がん（例えば、小細胞または非小細胞肺がん）、および皮膚がん（例えば、黒色腫）、子宮がん、胆嚢がん、腺がん、胆管がん、食道がん、胃がん、神経膠芽腫、卵巣がん、膀胱がん、ならびに頭頸部がんから選択される。いくつかの実施形態では、がんは結腸がんである。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、以下の、ネオ抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト上皮ムチンＭＵＣ－１、がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－２、ＫＩＡＡ０１５６、ＡＲＴ－１、ＡＲＴ－４、シクロフィリンＢ、変異伸長因子２、リンゴ酸酵素、およびα－アクチニン－４、ｅＩＦ４Ｇ、アルドラーゼ、アネキシンＸＩ、Ｒｉｐ－１およびＮＹ－ＬＵ－１２、フィブロモジュリン、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＭＤＭ２、ｈＴＥＲＴ、がん胎児抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡｉＬＲＰ）、アディポフィリン、サバイビン、ＫＷ１～ＫＷ１４および腫瘍由来ＩｇＶＨＣＤＲ３領域、ＲＨＡＭＭ由来Ｒ３ペプチド、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－３、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、熱ショックタンパク質、ＩＬ－１３受容体アルファ２、アルファフェトプロテイン、ＭＡＲＴＩ、ｇｐ１００、がん精巣抗原ＭＡＧＥＡ３、Ｌ－ＢＬＰ２５、ｐ５３、Ｗｉｌｍｓ腫瘍－１、ＫＲＡＳ、反応性テロメラーゼ、ガストリン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、腫瘍関連抗原５Ｔ４、がん精巣抗原ＭＡＧＥ、ＰＡＳＤ１、Ｂ細胞抗原ＣＤ２０およびウイルス性がんタンパク質Ｅ６またはＥ７から選択される抗原（または抗原断片または誘導体）の１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、ＣＥＡおよび／またはＭＵＣ１の１つまたは複数の抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＡ抗原およびＭＵＣ１抗原は融合タンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＥＡ抗原およびＭＵＣ１抗原は、同じ融合タンパク質の一部である。

いくつかの実施形態では、ＣＥＡ抗原はドメインＡ３Ｂ３を含む。いくつかの実施形態では、ドメインＡ３Ｂ３のアミノ酸配列は、配列番号２３を含む。いくつかの実施形態では、ドメインＡ３Ｂ３のヌクレオチド配列は、配列番号３０を含む。

いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１抗原は、複数の反復ドメインを含む断片である。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１断片のアミノ酸配列は配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、ＭＵＣ１断片のヌクレオチド配列は配列番号３１を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、融合タンパク質としてチフス菌で発現される。いくつかの実施形態では、がん抗原は、表面提示タンパク質を含むポリペプチド配列に融合される。いくつかの実施形態では、表面提示タンパク質を含むポリペプチド配列は、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡ、Ｌｐｐ－ＯｍｐＴおよびＣｌｙＡから選択される。いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡのアミノ酸配列は、配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｐｐ－ｏｍｐＡのヌクレオチド配列は、配列番号２８を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のチフス菌ベクターにおける発現のための発現カセットをコードする単離された核酸を提供し、発現カセットは、表面提示タンパク質および１つまたは複数の抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、表面発現タンパク質が、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡ、Ｌｐｐ－ＯｍｐＴ、およびＣｌｙＡから選択される。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、ＣＥＡドメインＡ３Ｂ３と、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡなどの表面提示タンパク質に融合したＭＵＣ１断片とを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬｐｐ－ＯｍｐＡ：Ａ３Ｂ３：ＭＵＣｌ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１１によってコードされるｌｐｐ－ｏｍｐＡ：ａ３ｂ３：ｍｕｃｌ遺伝子融合を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡなどの表面提示タンパク質に融合したＣＥＡドメインＡ３Ｂ３を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬｐｐ－ＯｍｐＡ：Ａ３Ｂ３融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１３によってコードされるＬｐｐ－ＯｍｐＡ：Ａ３Ｂ３遺伝子融合を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、Ｌｐｐ－ＯｍｐＡなどの表面提示タンパク質に融合したＭＵＣ１断片を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬｐｐ－ＯｍｐＡ：ＭＵＣｌ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１７によってコードされるｌｐｐ－ｏｍｐＡ：ｍｕｃｌ遺伝子融合タンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣｌｙＡ^{Ｉ１９８Ｎ}：Ａ３Ｂ３：ＭＵＣｌ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原は、配列番号１９によってコードされるｃｌｙＡ^{Ｉ１９８Ｎ}：ａ３ｂ３：ｍｕｃｌ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣｌｙＡ^{Ｉ１９８Ｎ}アミノ酸配列は、配列番号２５を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のポリペプチド成分は、１つ以上のリンカーアミノ酸配列によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーアミノ酸配列は配列番号２２である。好ましい実施形態では、がん抗原はグリコシル化を示さない。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明に記載の操作されたチフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞の組み合わせを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、結腸がんなどのがんの発症および／または進行から保護するための１つまたは複数のがん抗原を送達するための生ワクチンプラットフォームとして、チフス菌の遺伝子操作された弱毒化株を提供する。１つまたは複数の抗原は、インビボでの合成の誘導後に生ワクチンの表面に発現させることができ、以下により詳細に記載されるように、独自の誘導性ＯＭＶ媒介性輸送システムを介して、表面から免疫誘導部位に輸送される。

いくつかの実施形態では、生ワクチンは、がん抗原のがん胎児性抗原（ＣＥＡ）およびヒト上皮ムチンＭＵＣ－１を発現し、結腸がんのワクチンとして有用である。

本発明においてワクチンとして使用することができるチフス菌株は限定的ではない。例えば、それは、元の臨床分離株Ｔｙ２から遺伝的に弱毒化された任意の特定の株を含み得る。Ｔｙ２に由来する任意の弱毒化チフス菌株を、本発明による生ベクターとして使用することができる。非限定的で例示的な弱毒化チフス菌株としては、チフス菌Ｔｙ２１ａ、ＣＶＤ９０８、チフス菌ＣＶＤ９０９、ＣＶＤ９０８－ｈｔｒＡ、ＣＶＤ９１５、およびＣＶＤ９１０が挙げられる。いくつかの実施形態では、チフス菌株は、プラスミドで発現される必須遺伝子に１つまたは複数の追加の染色体の変異を保有し得る。いくつかの実施形態では、プラスミドはまた、本発明による異種タンパク質をコードし、プラスミドの選択および遺伝子安定化を可能にし、チフス菌の喪失を防止する。いくつかの実施形態では、チフス菌株は、選択発現プラスミド上にコードされるｓｓｂ遺伝子に突然変異を保有する。

異種抗原または他のタンパク質がプラスミドを使用して過剰発現される場合、プラスミド安定性は、良質の弱毒化チフス菌ワクチンの開発における重要な因子であり得る。プラスミドを持たない細菌細胞は、プラスミドを有する細胞よりも速く蓄積する傾向がある。この蓄積速度が増加する１つの理由は、プラスミド遺伝子の転写および翻訳が、細胞の増殖を遅らせ、プラスミドをもたない細胞に競争上の利点を与える代謝の負荷を課すことである。さらに、外来プラスミド遺伝子産物は、宿主細胞に対して毒性であるときがある。したがって、コードされた抗原が適切かつ効率的に発現され、その結果、堅牢で効果的な免疫応答が達成され得ることを確実にするために、プラスミドが何らかの形態の選択圧下にあることが有利である。

いくつかの実施形態では、プラスミドは、非抗生物質選択系を使用してチフス菌内で選択される。例えば、プラスミドは、生ベクター染色体からのこの遺伝子座の他の致死的な欠失／突然変異を補完する必須遺伝子をコードすることができる。本発明で使用することができる例示的な非抗生物質発現プラスミドは、本明細書に記載されており、本発明で使用することができるさらなるプラスミド系は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８１３４８号明細書、米国特許第７，１４１，４０８号、同第７，１３８，１１２号明細書、同第７，１２５，７２０号明細書、同第６，９７７，１７６号明細書、同第６，９６９，５１３号明細書、同第６，７０３，２３３号明細書、および同第６，４１３，７６８号明細書に記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、発現プラスミド用の非抗生物質の遺伝学的な安定化および選択系が、チフス菌生ベクター染色体から欠失させることができるＤＮＡの複製、組換え、および修復に関与する必須タンパク質である一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードするように、操作される（Ｌｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４；６３：５２７－５７０；Ｃｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８６；５５：１０３－１３６；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２０１０ Ｊａｎｕａｒｙ；７８（１）：３３７－４７）。いくつかの実施形態では、チフス菌用のプラスミド発現ベクターは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターはｐＳＥＣ１０Ｓである。

本発明のいくつかの実施形態では、非抗生物質のプラスミド選択系に固有のランダムな分離と、触媒の限界との両方が除去された発現プラスミドが使用される。チフス菌生ベクター内のこれらのプラスミドの分離は、チフス菌ＣＶＤ９０８－ｈｔｒＡのための活性分配系（ｐａｒＡ）を使用して改善される（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６４２４－６４３３）。いくつかの実施形態では、触媒酵素への依存は、ｓｓｂ遺伝子に基づくプラスミド選択／分離後死滅システムを使用することによって回避される。

マルチコピープラスミドおよびそれらがコードする外来抗原の不安定性に対する解決策は、外来遺伝子カセットを生ベクターの染色体に組み込むことである。しかし、コピー数の低下は利点と欠点の両方になる。コピー数の減少は確かにマルチコピープラスミド自体とコードされた外来タンパク質の両方に関連する代謝の負荷を減少させるが、外来抗原合成のこの減少は最終的にこれらの抗原の宿主免疫系への送達の減少およびおそらく免疫原性の低下をもたらす。この説明は、臨床試験において、染色体にコードされた抗原に対する血清免疫応答が、今日まで控えめなものであった理由を説明し得た（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１９９４；１６９：９２７－９３１；Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００７；２５：４１７５－４１８２）。

抗原性または生物学的に活性な断片は、ポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列の全部ではなく一部と完全に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。抗原断片は、より大きなポリペプチドの中で「自立している」のでも、または含まれていてもよく、その部分または領域を、最も好ましくは単一の連続領域として形成する。

いくつかの実施形態では、抗原性または生物学的に活性な断片は、例えば、アミノ末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキシル末端を含むものとの２つの連続した一連の残基の欠失を除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケーションポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、断片は、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高抗原性インデックス領域を含む断片などの構造的または機能的属性を特徴とする。

断片は、任意のサイズであり得る。抗原断片は、対象において免疫応答を誘導することができるか、または特異的抗体によって認識され得る。いくつかの実施形態では、断片は、アミノ末端トランケーション変異体に対応する。いくつかの実施形態では、断片から欠落しているアミノ末端アミノ酸の数は、１～１００アミノ酸の範囲である。いくつかの実施形態では、それは、１～７５アミノ酸、１～５０アミノ酸、１～４０アミノ酸、１～３０アミノ酸、１～２５アミノ酸、１～２０アミノ酸、１～１５アミノ酸、１～１０アミノ酸、および１～５アミノ酸の範囲である。

いくつかの実施形態では、断片はカルボキシル末端トランケーション変異体に対応する。いくつかの実施形態では、断片から欠失しているカルボキシル末端アミノ酸の数は、１～１００アミノ酸の範囲である。いくつかの実施形態では、それは１～７５アミノ酸、１～５０アミノ酸、１～４０アミノ酸、１～３０アミノ酸、１～２５アミノ酸、１～２０アミノ酸、１～１５アミノ酸、１～１０アミノ酸、および１～５アミノ酸の範囲である。

いくつかの実施形態では、断片は、アミノ末端アミノ酸およびカルボキシル末端アミノ酸の両方を欠く内部断片に対応する。いくつかの実施形態では、断片は７～２００アミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態では、断片は、１０～１００アミノ酸残基、１５～８５アミノ酸残基、２５～６５アミノ酸残基または３０～５０アミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態では、断片は、７アミノ酸、１０アミノ酸、１２アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸、８０アミノ酸または１００アミノ酸の長さである。

いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、２００アミノ酸または少なくとも２５０アミノ酸の長さである。もちろん、より大きな抗原断片もまた、本発明に従って有用であり、本明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではないにしても大部分に対応する断片も、有用である。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドまたはその抗原性もしくは生物学的に活性な断片と、少なくとも８０、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、保存的アミノ酸置換によって参照から変化するもの、すなわち残基を別の同様の特徴で置換するものである。典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、ＳｅｒとＴｈｒ、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ、ＡｓｎとＧｌｎ、および塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの中のものである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、いくつか、５～１０個、１～５個または１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失または付加された変異体である。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、サルモネラにおいて好ましいコドンを使用して、サルモネラにおける高レベル発現のために最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。本明細書で使用されるとき、「サルモネラ菌における高レベルの発現のために最適化される」コドンは、同じアミノ酸に対応する他のすべてのコドンと比較して、サルモネラ菌において比較的豊富であるコドンを指す。いくつかの実施形態では、コドンの少なくとも１０％がサルモネラにおける高レベル発現のために最適化される。いくつかの実施形態では、コドンの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、サルモネラにおける高レベル発現のために最適化される。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、チフス菌のプラスミドにおいて発現される。いくつかの実施形態では、プラスミドは、非抗生物質ベースのプラスミド選択および遺伝子安定化のシステムを有する。いくつかの実施形態では、プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、チフス菌に染色体で組み込まれる。遺伝子カセットを、例えばチフス菌のｇｕａＢＡ、ｈｔｒＡ、ｓｓｂ、および／またはｒｐｏＳ遺伝子座に挿入することは、例えばラムダレッド組換え系を使用して達成することができることが理解されよう（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．２０００．９７（１２）：６６４０－５）。いくつかの実施形態では、がん抗原は、チフス菌のｇｕａＢＡ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、がん抗原は、チフス菌のｒｐｏＳ遺伝子座に挿入される。

いくつかの実施形態では、例えば、染色体組込みの免疫原性と、プラスミドがベースの発現によって誘発される抗原特異的免疫原性とを比較するために、免疫原性カセットを、ＣＶＤ９１０ｓｓｂのΔｇｕａＢＡ遺伝子座またはΔｒｐｏＳ遺伝子座のいずれかに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ΔｇｕａＢＡおよびΔｒｐｏＳのオープンリーディングフレームのみが欠失され、これらの部位に対する元のプロモーターはそのまま残される。いくつかの実施形態では、挿入カセットは、ΔｇｕａＢＡまたはΔｒｐｏＳへの組み込みが、所与のカセットの誘導性発現を２つのレベルで制御するネステッドプロモーターをもたらすように、低コピー発現プラスミド由来のＰ_ｏｍｐＣプロモーターを含む。

医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のチフス菌生ベクターワクチンを含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、ヒトなどの個体のワクチン接種に使用するためのものであり得る。そのような医薬組成物は、薬学的に有効な担体を含んでいてもよく、任意選択で、当技術分野で公知の様々なアジュバントなどの他の治療成分を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤の非限定的な例には、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、マイクロエマルジョンなどの標準的な薬学的担体または賦形剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、組成物は、本発明の１つ以上の生きている生菌のチフス菌生ベクターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、生チフス菌ベクターの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の生チフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞を含む組成物であって、チフス菌ベクターから発現される１つ以上のがん抗原を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本開示の生チフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、がん抗原は、ＣＥＡ、ＭＵＣ１またはその両方の抗原断片である。いくつかの実施形態では、がん抗原は、Ｉｐｐ－ｏｍｐＡまたはＩｐｐ－ｏｍｐＴと、ＣＥＡおよびＭＵＣ１の抗原断片とを含む融合タンパク質を含む。

１つまたは複数の担体は、治療成分と適合性であり、その受容者に過度に有害ではないという意味で、薬学的に許容されなければならない。１つまたは複数の治療成分は、所望の免疫学的効果を達成するのに必要な量および頻度で提供される。

投与様式および剤形は、ワクチン接種の用途に望ましく、有効なチフス菌生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞の治療量に影響を及ぼす。本願は、ワクチンの経口投与に特に限定されず、所望される場合、舌下の投与を含む非経口または他の粘膜経路も含むことができる。細菌生ベクター材料または組換え外膜小胞は、発現された抗原に対する患者の免疫応答を増加させるのに有効な免疫反応を誘発することができる量で、送達される。

本発明の細菌の生ベクターワクチンまたは単離された組換え外膜小胞は、任意の他の適切な薬理学的または生理学的に活性な薬剤、例えば抗原性および／または他の生物学的に活性な物質と共に、宿主動物に有用に投与され得る。

本明細書に記載の１つ以上の抗原を発現する弱毒化チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞は、特定の用途に対して適切であるように、ヒトを含む哺乳動物への投与のための過度の実験なしに、調製および／または製剤化することができる。医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、糖衣錠製造、浮揚、乳化、カプセル化、封入、噴霧乾燥、もしくは凍結乾燥プロセス、またはそれらの任意の組み合わせによって、過度の実験なしに製造することができる。

一実施形態では、１つ以上の抗原を発現する弱毒化チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、粘膜投与する。適切な投与経路としては、例えば、経口、舌、舌下、直腸、経粘膜、経鼻、頬側、頬内、膣内、または腸内投与、小胞内、尿道内、吸入による投与、鼻腔内注射または眼内注射、および任意選択でデポー製剤または持続放出製剤が挙げられ得る。さらに、標的化された薬物送達系で、組成物を投与することができる。投与経路を組み合わせることが可能である。

本発明の細菌の生ベクターワクチン組成物または組換え単離外膜小胞の用量比率および適切な剤形は、従来の抗体価決定技術および従来の生物学的有効性／生体適合性プロトコルの使用によって、過度の実験なしに当業者によって容易に決定され得る。とりわけ、用量比率および適切な剤形は、使用される特定の抗原、所望の治療効果、および生物活性の所望の期間に依存する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原を発現する弱毒化チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞はまた、経鼻投与のために調製することができる。本明細書で使用される場合、経鼻投与は、化合物を対象の鼻孔の経路または鼻腔の粘膜に投与することを含む。チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞の経鼻投与用の医薬組成物は、治療有効量の、例えば、鼻腔スプレー、点鼻薬、懸濁液、ゲル、軟膏、クリームまたは粉末として投与される周知の方法によって調製されたチフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を含む。チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞の投与は、鼻タンポンまたは鼻スポンジを使用して行うこともできる。

組成物はまた、１つ以上の防腐剤、酸化防止剤などを適切に含み得る。チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞の製剤化および投与のための技術のいくつかの例は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２１ｓｔ ａｄｄｉｔｉｏｎに見出すことができる。

一実施形態では、医薬組成物は、チフス菌細菌の生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、それらの意図された目的を達成するのに有効な量で含有する。一実施形態では、有効量は、がんを予防または治療するのに十分な量を意味する。一実施形態では、治療することは、治療されている対象におけるがんなどの疾患の発症を減少させる、その進行を阻害する、またはその症状を改善することを意味する。一実施形態では、例えば、主治医の意見において、対象の背景、遺伝、環境、職業歴などが、診断時または投与時に、対象がまだ疾患を有していないかまたは疾患を無症候性である場合であっても、その対象が疾患を有するリスクがあるという予想または可能性の増加を生じさせる場合、予防することは、予防的に投与することを意味する。

治療方法
本発明はまた、対象に有効量の本明細書に記載の生チフス菌ベクターおよび／または有効量の本明細書に記載の単離された組換え外膜小胞を投与することを含む、対象のがんを治療または予防する方法を含む。本発明はまた、対象において免疫応答を誘導する方法を含む。免疫応答は、生チフス菌ベクターによって発現される１つ以上の１つ以上のがん抗原に対するものであり得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上のがん抗原を発現するように操作された免疫学的有効量の生チフス菌ベクターを対象に投与することを含み、抗原が、チフス菌ベクターによって産生される外膜小胞によって、対象の粘膜組織に送達される方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上のがん抗原を含む、免疫学的有効量のチフス菌からの単離された組換え外膜小胞を対象に投与することを含み、チフス菌が抗原を発現するように操作されており、外膜小胞が対象の粘膜組織に送達される方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、本発明の生チフス菌ベクターの組み合わせを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターの組み合わせは同じ組成物の中に存在する。いくつかの実施形態では、ベクターは別々の組成物の中に存在する。

一実施形態では、本方法は、単離された組換え外膜小胞の組み合わせを対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、がんの対象に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、がんを発症するリスクがある対象に投与する。いくつかの実施形態では、生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、がんを治療するための１つまたは複数の追加の療法に関して、対象に投与する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる療法は、化学療法、放射線、手術および免疫療法から選択される。好ましい実施形態では、１つまたは複数の追加の治療に関して、生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、標的のがんの早期検出後できるだけ速やかに対象に同時投与する。早期検出は、任意の種類の治療的処置への標的のがん抗原の利用可能性を劇的に減少させ得る大きな固形腫瘤へ進行する前に固形腫瘍の治療の成功可能性を高めることが、現在十分に理解されている。

いくつかの実施形態では、サルモネラ菌ベクターおよび／または組換え外膜小胞は、がんの早期検出後に対象に投与される。これは、早期の検出および介入が、対象のがんを治癒する確率を改善することができるので有利である。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に存在するがんを検出するための診断的なスクリーニングの方法を含む。そのような診断的なスクリーニングの方法は、がん細胞またはがんのマーカーの存在について、対象から得た組織または血液試料を画像化および／またはスクリーニングすることを含み得る。適切な早期診断方法論は、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９：９２６－９３０（２０１８）、およびＬｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ９６０１（２０２０）に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、がんは、液体生検を行うことによって、例えば、血液試料を採取し、試料のがん細胞またはマーカーを検出することによって、検出することができる。いくつかの実施形態では、がんを検出する陽性血液検査は、腫瘤を特定するためのスキャン、例えばＰＥＴ－ＣＴスキャンによって確認することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質または核酸マーカーを液体試料において検出して、対象に存在するがんを特定する。血液において特定され得るがんの種類は、必ずしも限定的ではない。そのようながんには、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、乳がん、リンパ腫、腎臓がん、甲状腺がん、子宮がん、および虫垂のがんが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、卵巣のがんは、マーカーＴＰ５３、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、またはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、肺のがんは、マーカーＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＡ１５－３、ＨＧＦ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、またはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、子宮のがんは、マーカーＴＰ５３、ＣＡ１９－９またはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、甲状腺のがんは、マーカーＣＥＡの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、結腸直腸がんは、マーカーＢＲＡＦ、ＴＰ５３またはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、乳がんは、マーカーＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３またはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、リンパ腫は、マーカーＨＧＦ、ＮＲＡＳまたはそれらの組み合わせの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、腎臓は、マーカーＫＲＡＳの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

いくつかの実施形態では、虫垂のがんは、マーカーＣＥＡの存在を検出することによって、血液において検出することができる。

ワクチン戦略は当技術分野で周知であり、したがって、本発明に包含されるワクチン接種戦略は、いかなる様式でも本発明を限定しない。本発明の特定の態様では、１つ以上のがん抗原または単離された組換え外膜小胞を発現するチフス菌生ベクターワクチンは、単回適用で単独で投与されるか、または経時的に間隔を空けて連続適用で投与される。

本発明の他の態様では、チフス菌生ベクターワクチンは、異種プライム／ブーストレジメンの成分として投与される。「異種プライム／ブースト」の戦略は、同じまたは異なる経路による２つの異なるワクチン製剤の同じ抗原の連続投与（プライミング段階およびブースティング段階）を含む二相免疫化レジームである。異種プライム／ブーストのレジメンに引き込まれる本発明の特定の態様では、粘膜プライム／非経口ブースト免疫化戦略が使用される。例えば、本明細書で教示されるような１つまたは複数のチフス菌生ベクターワクチンは、経口で、または別の粘膜経路を介して投与され得、その後、がん抗原の１つまたは複数を含むチフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞を含むワクチン組成物で、非経口にブーストされ得る。

別の態様では、本発明は、必要とする対象において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、プライムとして免疫学的有効量の本発明の生チフス菌ベクターを対象に投与すること、およびがん抗原の１つまたは複数を含むチフス菌ベクターからの単離された組換え外膜小胞を含む組成物を含むブーストさせた組成物を、続いて投与することを含む方法を対象とする。

いくつかの実施形態では、本発明の単離された組換え外膜小胞はプライムとして投与され、本発明のチフス菌生ベクターワクチンでブーストされる。いくつかの実施形態では、ブーストは、粘膜的に、例えば経口的に、または非経口的に投与される。

いくつかの実施形態では、異種プライム／ブーストという状況で、対象が以下を投与される。
ｉ．１つ以上のがん抗原を発現するように操作された生チフス菌ベクター、および脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体、および
ｉｉ．１つまたは複数のがん抗原を発現するように操作された生チフス菌ベクターから単離された、単離された組換え外膜小胞、脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体、および外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体。いくつかの実施形態では、パートｉの生チフス菌ベクターはプライムとして投与され、パートｉｉの単離された組換え外膜小胞はブーストとして投与される。いくつかの実施形態では、パートｉｉの単離された組換え外膜小胞はプライムとして投与され、パートｉｉの生チフス菌ベクターはブーストとして投与される。

本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、免疫組成物に対する対象の免疫系の生理学的応答である。免疫応答は、自然免疫応答、適応免疫応答、またはその両方を含み得る。本発明の一実施形態では、免疫応答は防御的免疫応答である。防御的免疫応答は、同じまたは類似の抗原への二次曝露が、以下の特徴、すなわち免疫化組成物への事前曝露の非存在下での選択された抗原への曝露から生じる遅滞期よりも短い遅滞期；免疫化組成物への事前曝露の非存在下での選択された抗原への曝露から生じる抗体の産生よりも長期間続く抗体の産生；免疫化組成物への事前曝露の非存在下での選択された抗原への曝露時に産生される抗体のタイプおよび質と比較した、産生される抗体のタイプおよび質の変化；免疫化組成物への事前曝露の非存在下での選択された抗原への曝露に応答して起こるよりも高い濃度およびＩｇＭよりも高い持続性で現れるＩｇＧ抗体によるクラス応答のシフト；免疫化組成物への事前曝露の非存在下での選択された抗原への曝露から生じる抗原に対する抗体の平均親和性と比較した、抗原に対する抗体の平均親和性（結合定数）の増加；および／または二次免疫応答を特徴付けるための当技術分野で公知の他の特徴の１つまたは複数を特徴とする効果と共に、対象に免疫学的細胞記憶を付与する。

さらなる実施形態では、免疫応答を誘導する方法は、１つまたは複数の本発明のサルモネラ菌生ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を含む、本明細書で提供される医薬製剤を、対象において免疫応答を誘導するのに十分な量（免疫学的有効量）で対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は鼻腔内投与される。

いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数のチフス菌生ベクターワクチンまたは単離された組換え外膜小胞は、約２～約１０週間後に、初回プライミング投与で粘膜投与され、その後、任意選択で、生ベクターワクチンまたは単離された組換え外膜小胞の２回目の（または３回目、４回目、５回目などの）プライミング投与が続く。いくつかの実施形態では、ブースティング組成物は、プライミング投与の約３～約１２週間後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースティング組成物は、プライミング投与の約３～約６週間後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースティング組成物は、プライミング組成物（例えば、相同プライム／ブーストレジメン）として投与されるのと実質的に同じタイプの組成物である。

治療および／または予防のための免疫プロトコルを実施する際に、免疫学的有効量の生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を対象に投与する。本明細書で使用される場合、「免疫学的有効量」という用語は、対象において増強された免疫応答を示すのに十分な、生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞の総量を意味する。「免疫学的有効量」が単独で投与される個々の治療薬に適用される場合、この用語はその治療薬単独を指す。併用に適用される場合、この用語は、組み合わせて投与されるか、連続的に投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす成分の組み合わされた量を指す。

特定の投与量は、治療される対象の年齢、体重、性別および医学的状態、ならびに投与方法に依存する。適切な用量は、当業者によって容易に決定することができる。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物などの動物を指す。例えば、企図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどが挙げられる。「対象」、「患者」および「宿主」という用語は互換的に使用される。

本発明の生チフス菌ベクターまたは単離された組換え外膜小胞を、任意の年齢の温血動物に投与することができる。生チフス菌ベクターは、単回用量または複数回プライミング用量、続いて１つ以上のブースターとして投与することができる。例えば、対象は、単回用量を投与され、次いで、最大１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または１０年、またはそれ以上後に、ブーストする用量を投与され得る。

特定の問題へ本発明の教示を適用することは、本明細書に含まれる教示を考慮した当業者の特質の範囲である。本発明の組成物および方法の例は、以下の非限定的な例に示される。

実施例１．ＰａｇＬ媒介抗原送達プラットフォームの開発
ＣｌｙＡは、ＣｌｙＡが過剰発現される候補ワクチン株の臨床的許容性を低下させ得る細胞変性特性を有する溶血素であるので、本発明者らは、ＰａｇＬに基づいてＯＭＶの形成および輸送を誘導するための非病原性の代替物を開発しようと努めた（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９；３１（２）：５５７－６７．；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０００；６８（７）：４３６３－７）。したがって、本発明者らは合成ｐａｇＬ遺伝子を構築し、それを本発明者らの非抗生物質の低コピー数発現プラスミドｐＳＥＣ１０に挿入し、ｃｌｙＡ遺伝子を置換してｐＰａｇＬを作製した。誘導性外膜小胞を用いた本発明者らの以前の実験と同様に、本発明者らは、ＣｌｙＡ媒介性小胞形成に関連する溶血活性を測定することによってＯＭＶの輸送を監視したいと考えた。したがって、ＣＶＤ ９１０のｇｕａＢＡ遺伝子座にＣｌｙＡをコードするカセットを組み込んだ後、得られた株にｐＰａｇＬを導入してＣＶＤ ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬ）を作成した。この特定の株では、ＣｌｙＡは染色体でコードされた抗原の代理の溶血性レポーターとして作用しており、プラスミドコード化ＰａｇＬの過剰発現は、ｒＯＭＶ輸送を大幅に改善すると予想される点に留意されたい。すべての株を３７℃で初期対数期増殖まで増殖させ、ヒツジの赤血球に対する約２×１０^７ＣＦＵの細菌について、ＯＤ_５４０で溶血活性を測定した。図１に示すように、予想通りワクチン株ＣＶＤ９１０に溶血活性は存在しなかった（レーン２）。驚くべきことに、ＣＶＤ９１０（ｐＳＥＣ１０）で観察されたプラスミドコード化溶血活性に対するコピー数の低下のために、染色体でコードされたＣｌｙＡの溶血活性は、ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（レーン３）では検出されなかった［図３、レーン３を参照されたい］。しかし、ｐＰａｇＬを９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（レーン４）に導入した場合に顕著な溶血活性が観察され、ＰａｇＬの過剰発現が外膜小胞を介した外膜タンパク質（すなわち、この場合、ＣｌｙＡ）の優れた輸送を誘導することを明確に実証した。

研究の概要まとめると、本発明者らの結果は、適切に折り畳まれた外来タンパク質を効率的に発現し、本発明者らの生ベクターワクチンの表面に送達することができる弱毒化チフス菌ベースの粘膜生ベクターワクチンの開発の実現可能性を堅固に確立する。これらの外来抗原は、抗原の送達のために大型で潜在的に不安定なマルチコピー発現プラスミドを必要としない生ベクターワクチンの構築を可能にする、染色体に組み込まれた遺伝子カセットから、発現させることができる。本発明者らはまた、独自の外膜小胞抗原送達プラットフォームを操作し、組換えｒＯＭＶを介した輸送のためのモデル外膜タンパク質としてＣｌｙＡを使用するＰａｇＬ媒介抗原送達システムの効率を実証する原理証明研究を、成功裏に完了した。

実施例２．ＰａｇＬ媒介抗原送達プラットフォームの開発
本発明者らは、ｐａｇＬ ｖｌ（配列番号１および２）、ｐａｇＬ ｖ２（配列番号３および４）、およびｐａｇＬ ｖ３（配列番号５）と命名された３つの合成ｐａｇＬ遺伝子の対立遺伝子を構築した。これら３つのバージョンは、各対立遺伝子の翻訳効率を制御する５’末端ＤＮＡ配列が異なる。生物学的に活性なＰａｇＬの十分な合成を保証するｐａｇＬの最適な翻訳効率が、このタンパク質の潜在的に致死的な過剰発現を回避しながら、これらの実験の時点では未知であったので、この慎重な操作アプローチが採用された。ｐａｇＬ ｖ２およびｖ３のアミノ酸配列は同一である。この目的のために、ｐａｇＬ ｖｌは、最適化されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ＡＴＧ開始コドン、および遺伝子が翻訳効率を高め始めるときのいくつかの最適化されたコドンであるコドンを担持する。ｐａｇＬ ｖ２はｖｌに類似しているが、翻訳効率をわずかに低下させるＧＴＧ開始コドンを含む。ｐａｇＬ ｖ３は、ネズミチフス菌の中で天然に存在するｐａｇＬ遺伝子の野生型染色体配列と本質的に同一である。したがって、本発明者らは、ｖ２からの合成レベルの低下およびｖ３からの合成レベルの低下とともに、ｖ１からのＰａｇＬ合成の最高レベルを予想した。

各カセットをＢａｍＨＩ－Ｎｈｅｌ断片として、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅｌで消化した本発明者らの非抗生物質低コピー数発現プラスミドｐＳＥＣ１０に挿入し、ｃｌｙＡ遺伝子を置換してｐＰａｇＬを作製した。ｐＰａｇＬ ｖ１の予想される配列は配列番号６に列挙されている。誘導性組換え外膜小胞（ｒＯＭＶ）を用いた本発明者らの以前の実験と同様に、本発明者らは、ＣｌｙＡ含有小胞に関連する溶血活性を測定することによってＯＭＶ輸送を監視したいと考えた。したがって、ＣＶＤ ９１０のｇｕａＢＡ遺伝子座にＣｌｙＡをコードするカセットを組み込んだ後、得られた株にｐＰａｇＬを導入してＣＶＤ ９１０ＤｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬ）を作成した。この特定の株では、ＣｌｙＡは染色体でコードされた抗原タンパク質の代理の溶血性レポーターとして作用しており、プラスミドコード化ＰａｇＬの過剰発現は、ｒＯＭＶ輸送を大幅に改善すると予想される点に留意されたい。すべての株を３７℃で初期対数期増殖まで増殖させ、ヒツジの赤血球に対する約２×１０^７ＣＦＵの細菌について、ＯＤ_５４０で溶血活性を測定した。図２に示すように、予想通りワクチン株ＣＶＤ９１０に溶血活性は存在しなかった（レーン２）。驚くべきことに、ＣＶＤ９１０（ｐＳＥＣ１０）で観察されたプラスミドコード化溶血活性に対するコピー数の低下のために、染色体でコードされたＣｌｙＡの溶血活性は、ＣＶＤ９１０ＤｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（レーン３）では検出されなかった。しかし、ｐＰａｇＬを９１０ＤｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（レーン４）に導入した場合に顕著な溶血活性が観察され、ＰａｇＬの過剰発現がｒＯＭＶの優れた輸送を誘導することが、明らかに実証された（この場合、代用外膜タンパク質としてＣｌｙＡを含む）。

実施例３．誘導性小胞送達系の開発
本発明者らは、本発明者らの弱毒化チフス菌候補ワクチン株ＣＶＤ ９１０の外膜表面に発現される外来抗原が、これらの外来表面発現タンパク質抗原を保有する組換え外膜小胞を介してワクチン株の表面から効率的に輸送され得る新規の浸透圧的誘導性ワクチン抗原送達システムを遺伝子操作した。ワクチン開発という状況でこの概念を検証するために、本発明者らは、外膜タンパク質が生きた菌株の表面に効率的に発現される、本発明者らの最初のプロトタイプの弱毒化ＣＶＤ９１０候補ワクチンを、さらに操作した。本発明者らは、ＰａｇＬの誘導可能な過剰発現をコードする低コピー発現プラスミドを導入した。ＰａｇＬは、サルモネラ菌において過剰発現されたときに過剰小胞形成を触媒することが最近報告された新規な外膜脂質Ａデアシラーゼである。本発明者らは、ＰａｇＬの過剰発現が、疾患に対する防御を誘発するため免疫誘導部位へ効率的に送達するために、抗原を担持するｒＯＭＶの形成を触媒し得るという仮説を立てた（Ｅｌｈｅｎａｗｙ ｅｔ ａｌ，ｍＢｉｏ ２０１６；７（４）：ｐｉｉ：ｅ００９４０－１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．－１６）。抗原およびＰａｇＬの両方の外膜への輸送効率を改善するために（ｒＯＭＶ媒介性抗原輸送を増強し、ワクチン有効性を改善する意図で）、本発明者らはまた、このプロトタイプワクチンの染色体に、外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡをコードする誘導性遺伝子カセットを組み込んだ。

ＢａｍＡは、グラム陰性菌の外膜へのβバレルタンパク質の挿入を触媒する５種のタンパク質の外膜のβバレル集合機構（ＢＡＭ）複合体の必須成分を構成する約９０ｋＤａのタンパク質である（Ｎｏｉｎａｊ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７；１５（４）：１９７－２０４）。しかし、完全なＢａｍＡＢＣＤＥ複合体は、選択された外膜タンパク質の効率的な挿入に必要とされていない。実際、ＯｍｐＡは、ＢａｍＡのみが存在する脂質二重層に効率的に組み込むことができることが、いくつかのグループによって報告されている（Ｇｅｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ ＳＡ ２０１４；１１１（１６）：５８７８－８３．；Ｐｌｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５，５４（３９）：６００９－１１）。したがって、本発明者らは、ＰａｇＬを共発現するワクチン株におけるＢａｍＡの過剰発現がまた、表面発現外来抗原を担持する外膜小胞のより効率的な輸送をもたらすという仮説を立てた。Ａ．バウマンニから精製したＡｂＢａｍＡが、ＭＤＲ Ａ．バウマンニで負荷したマウスにおいて保護を付与したという最近の報告を考慮して、本発明者らは、Ａ．バウマンニからのｂａｍＡＡｂ対立遺伝子を使用することを選択した（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７（１）：１２４１１）。

ＰａｇＬ媒介抗原送達プラットフォームの開発本発明者らの候補ワクチン株ＣＶＤ９１０の表面の抗原の発現を実証した後、本発明者らは、免疫後に表面発現抗原を免疫誘導部位に送達するための誘導性外膜小胞抗原輸送系の開発を開始した。これを達成するために、本発明者らは、ＰａｇＬ、すなわちサルモネラ菌で過剰発現させたときに過剰小胞形成を触媒することが最近報告された脂質Ａ脱アシル化酵素の使用に集中した（Ｅｌｈｅｎａｗｙ ｅｔ ａｌ，ｍＢｉｏ ２０１６；７（４）：ｐｉｉ：ｅ００９４０－１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．－１６）。ＰａｇＬの過剰発現が理論的に抗原含有ｒＯＭＶの過剰小胞形成を誘導することができるものとして、この戦略はまた、精製された多価ｒＯＭＶを、それ自体粘膜ワクチンとして、またはそれらが精製される生キャリアワクチンと組み合わせて使用する独自の機会を提示した。

この興味深い可能性を調査するために、本発明者らは、最初に、過剰発現したときに大きな外膜小胞の形成を触媒することをＷａｉらによって最初に報告された、細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）と呼ばれる新規の内因性サルモネラ溶血素により、表現型でタグ化する小胞によって、ＯＭＶ輸送を監視することを試みた（Ｗａｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２００３；１１５（１）：２５－３５）。この単純な溶血性レポーター表現型を使用することにより、ＯＭＶ輸送の迅速な定量的評価が可能になり、発現カセットの最適化を効率的に誘導し、潜在的に致死的な小胞形成タンパク質の過剰発現を回避した。本発明者らは、低コピー発現プラスミドによってコードされる融合タンパク質として操作されたキャリア株から外来抗原を輸送するためＣｌｙＡの発現を首尾よく利用した（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００４；７２（１２）：７０９６－１０６）。しかし、ＰａｇＬ媒介小胞形成を試験するために、溶血活性（すなわち、膜表面を表現型で「タグ付け」する）を検出するのに十分なレベルでＣｌｙＡが表面に放出されるが、実際にＣｌｙＡ媒介小胞形成を触媒するのに十分な高さではないように、ＣｌｙＡ溶血素の発現を低下させる必要があった。したがって、本発明者らは、ＣｌｙＡをコードするカセットをＣＶＤ ９１０のｇｕａＢＡ遺伝子座に組み込み、レポーター株ＣＶＤ ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡを作製した。次に、翻訳効率が、最適なＡＴＧ開始コドンの５塩基上流（ｐａｇＬｖ１）、効率の低いＧＴＧ開始コドンの６塩基上流（ｐａｇＬｖ２）、またはこのＧＴＧ開始コドンの５塩基上流ｐａｇＬｖ３）の一致しているリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧＧ）の距離により異なる３バージョンの合成ｐａｇＬ遺伝子を構築した。ＲＢＳの理想的な位置がＡＴＧ開始コドンから７～９塩基離れたものであるとして、本発明者らは、ｐａｇＬｖｌ＞ｐａｇＬｖ２＞ｐａｇＬｖ３の順序でこれら３つの同質遺伝子の対立遺伝子の発現レベルが低下すると予想した（Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９２；６（９）：１２１９－２９）。各対立遺伝子を、浸透圧制御ＰｏｍｐＣプロモーターの下流の低コピー数発現プラスミドｐＳＥＣ１０に挿入して、それぞれｐＰａｇＬｖ１、ｐＰａｇＬｖ２およびｐＰａｇＬｖ３を作製した。得られた発現プラスミドにおけるＰａｇＬの誘導性発現は、ｏｍｐＣプロモーターの浸透圧誘導によって転写的に制御される（Ｓｔｏｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００７；７５（４）：１８２７－３４．；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１０；７８（１）：３３７－４７．；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９９；６７（１２）：６４２４－３３）本発明者らは、プラスミドにコードされたＰａｇＬの発現がＲＢＳの効率と共に増加するにつれて、ＣｌｙＡタグ付きｒＯＭＶの輸送も増加し、溶血活性の増加を伴うという仮説をたてた。

この仮説を検証するために、各プラスミドをレポーター株ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡに導入した。次いで、株を３７℃の誘導条件下で、初期対数期増殖まで増殖させ、ヒツジの赤血球に対する約２×１０^７ＣＦＵの細菌についてＯＤ_５４０で溶血活性を測定した。図３に示すように、ワクチン株ＣＶＤ９１０（レーン２）には溶血活性は存在しなかった。予想通り、染色体でコードされたＣｌｙＡの溶血活性は、染色体からの発現レベルが低下したため、ＣＶＤ ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（レーン３）では検出されなかった。しかし、９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡ（ｐＰａｇＬｖ１）について顕著な溶血活性が観察され、これはＲＢＳの効率が操作されると（レーン４対レーン５および６）減少し、ＰａｇＬの過剰発現が外膜小胞を介して外膜タンパク質（すなわち、この場合、ＣｌｙＡ）の優れた輸送を誘導するという仮説を支持する。

ＡｂＢａｍＡの過剰発現によるＯＭＰの表面発現の増強。予備的結果は、抗原がＣＶＤ９１０の表面に首尾よく発現されたが、透過処理されていない細胞からの発現は、透過処理された細胞で検出されたレベルに対して減少したことを示唆していた。本発明者らは、この差異が輸送速度および／または外膜へのタンパク質の適切な挿入に起因する可能性があり、転座速度に影響する輸送タンパク質の過剰発現が表面発現を増強する可能性があるという仮説をたてた。本発明者らは、抗原およびＰａｇＬが両方ともβバレル膜貫通タンパク質であることに注目した（Ｒｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６；１０３（１８）：７０７１－６）。グラム陰性細菌の外膜へｂバレルタンパク質を挿入することは、ｂバレル集合（ＢＡＭ）複合体によって媒介され、そのタンパク質ＢａｍＡ（それ自体がβバレルタンパク質）は必須コア成分を含む（Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２０１４；７０（Ｐｔ ６）：１７７９－８９．；Ｎｏｉｎａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１７；１５（４）：１９７－２０４．）。ＢａｍＡ単独でβバレルタンパク質の外膜折り畳みおよび膜挿入をインビトロで促進できることも報告されている。したがって、本発明者らは、ＢａｍＡの過剰発現が、例示的なワクチン抗原を含む外膜タンパク質の表面の発現を改善し得ると仮定した。考えられるところでは、外膜へのＰａｇＬの輸送の増強はまた、ｒＯＭＶの形成、したがって免疫誘導部位への外来抗原の送達を増強し得る。

この仮説を検証するために、本発明者らは、ＡｂＢａｍＡをコードする合成遺伝子カセットを操作した。興味深いことに、翻訳がＡＴＧ開始コドンで開始された本発明者らの元のカセットは、低コピー発現プラスミドにうまく挿入されなかった。したがって、ＡｂＢａｍＡの潜在的に致死的な過剰発現を回避するために、本発明者らは、ＧＴＧ開始コドンの５塩基（ｂａｍＡ^Ａｂｖ１）または４塩基（ｂａｍＡ^Ａｂｖ２）上流に位置するリボソーム結合部位を操作し、翻訳のレベルをより厳密に制御させた。ＲＢＳの理想的な位置が開始コドンから７～９塩基離れているとして、本発明者らは、ｂａｍＡＡｂｖ１がｂａｍＡＡｂｖ２よりもわずかに高い発現レベルを有すると予想した（Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔ ｅｌ ａｌ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９２；６（９）：１２１９－２９）。ｐａｇＬ対立遺伝子と同様に、本発明者らは、Ｐ_ｏｍｐＣプロモーターの転写制御下でｂａｍＡ対立遺伝子を操作し、得られたカセットを本発明者らの低コピー発現プラスミドに挿入して、ｐＡｂＢａｍＡｖｌおよびｐＡｂＢａｍＡｖ２を作製した。次いで、これらのプラスミドをＣＶＤ ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡに導入した。ＣｌｙＡはβバレル構造を持たないが、本発明者らは、ＯＭＶの形成に対するＡｂＢａｍＡ過剰発現のいずれの潜在的効果も調査したいと考えた（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２０００；１００：２６５－７６）。図４にまとめられているように、ＣＶＤ９１０（ｐＳＥＣ１０）におけるＣｌｙＡのプラスミドベースの発現に対する溶血活性は、ＣＶＤ９１０（ｐＳＥＣ１０）でｃｌｙＡのコピー数が増加したため、ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡにおける染色体でコードされたＣｌｙＡについて観察されたものよりも著しく高かった（レーン３対レーン４）。驚くべきことに、ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｃｌｙＡへのｐＡｂＢａｍＡｖｌの導入は、ＣＶＤ９１０におけるプラスミドに基づく発現に匹敵するレベルまで溶血活性を増強することができ（ｐＳＥＣ１０）、この効果は、ｂａｍＡ^Ａｂｖ２対立遺伝子をあまり効率的に発現していない株では低下した（レーン５対レーン６）。本発明者らは、これらの実験から、ＡｂＢａｍＡが、ＣｌｙＡで表現型的にタグ化され、ＣＶＤ９１０から輸送される外膜小胞の形成を増強することができ、抗原、またはワクチン開発に関連する他の外来抗原を保有する小胞の輸送も増強することができると結論する。

本発明者らの候補ワクチン株ＣＶＤ９１０における抗原の表面発現を首尾よく実証すること、ならびにｒＯＭＶの輸送を増強するＰａｇＬおよびＡｂＢａｍＡの両方の能力も実証することによって鼓舞され、次いで、本発明者らは、抗原の表面発現が単一ワクチン株におけるＰａｇＬおよびＡｂＢａｍＡの両方の共発現によって最適化され得るという仮説を検証した。表面発現外膜タンパク質が小胞を介して即座に輸送されないとして、本発明者らは、これらの予備実験では明確に判断されていなくとも、表面発現が増加すると外膜小胞形成も最終的に増加すると推論した。これを達成するために、本発明者らは、９３．２ｋＤａのＡｂＢａｍＡタンパク質（配列番号８）をコードする、浸透圧で制御されたＰ_ｏｍｐＣ－ｂａｍＡ^Ａｂｖ１（配列番号７）をＣＶＤ９１０のｇｕａＢＡ遺伝子座に組み込んだ。次いで、得られた株にｐＡｎｔｉｇｅｎ発現プラスミドを導入し、ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：ｂａｍＡ^Ａｂｖ１（Ａｎｔｉｇｅｎ）を作製した。

これらの結果は、適切に折り畳まれた外来外膜タンパク質を効率的に発現し、本発明者らのキャリアワクチンの表面に送達することができる弱毒化チフス菌ベースの粘膜生キャリアワクチンの開発の実現可能性を堅固に確立する。本発明者らの候補の生キャリアワクチンの臨床的許容性を改善するために、本発明者らは、本発明者らの生きたキャリアの病原性に対する抗原発現のいずれの影響をも正式に排除した。本発明者らはまた、抗原表面発現の効率が外膜折り畳みタンパク質ＡｂＢａｍＡの過剰発現によって増強される独自のＰａｇＬ媒介外膜小胞抗原送達プラットフォームを操作した。この革新的な修正は、外膜タンパク質の表面発現を改善する。本発明者らは、ＡｂＢａｍＡによって触媒される表面発現の増強は、他の表面標的外来タンパク質の表面発現も増強し、次いで、ＰａｇＬの誘導は、原核生物または真核生物のいずれかからの多種多様な外来タンパク質を潜在的に有する組換えＯＭＶの効率的な輸送を触媒すると結論付ける。この技術は、ヒトの病原体に対するワクチンの開発に限定されず、獣医学および他の用途、例えば固形腫瘍に対する免疫療法ワクチンの開発にも使用することができる（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２；１２：３６１；Ｓｃｈｍｉｔｚ－Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５；４（４）：ｅ１００１２１７．；Ｓｃｈｍｉｔｚ－Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８；７（４）：ｅ１３０３５８４）。

実施例４．候補の二価チフス菌ベースの結腸直腸がんワクチンの開発
以前に弱毒化され、高度に免疫原性のチフス菌ベースのキャリアワクチン株を使用して、本発明者らは最近、脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬの過剰発現によって駆動される浸透圧誘導性で非常に効率的な組換え外膜小胞（ｒＯＭＶ）抗原送達系を操作し、機能的に試験した（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００９；１９９（３）：３２６－３５；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１４；３２（３５）：４３７６－８５；Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１５；８３（１）：１６１－７２；Ｅｌｈｅｎａｗｙ ｅｔ ａｌ．，ｍＢｉｏ ２０１６；７（４）：ｐｉｉ：ｅ００９４０－１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．－１６）。ＰａｇＬは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の別様には致死的な染色体欠失のトランス型相補によって安定化された、遺伝的に安定化された低コピー数発現プラスミドによってコードされる（図５）（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１０；７８（１）：３３７－４７）。本発明者らは、キメラＬｐｐ－ＯｍｐＡ表面ディスプレイペプチドを使用して、ＣＥＡおよびＭＵＣ－１由来のドメインをコードする二価融合タンパク質を、本発明者らのキャリアワクチンの表面に輸送（図１０参照）した（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９２；８９（７）：２７１３－７．；Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０１９；４１（６－７）：７６３－７７）。本発明者らの経口投与された組換えキャリアワクチンのインビボでのその後の浸透圧誘導は、表面発現ＣＥＡ－ＭＵＣ－１融合タンパク質を有する高度に免疫原性で効率的に発現されたｒＯＭＶを介して、本発明者らの標的化された結腸直腸関連の抗原の提示をもたらす。

実施例５．がんワクチンカセット
ここで、本発明者らは、結腸直腸がん（図６）に対するワクチン接種のための抗原として機能することを意図した融合タンパク質をコードする２つのマスター合成遺伝子カセットの設計を記載する。これらの合成カセットは、カセットの５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩが隣接し、カセットの３’末端にＳｐｅｌが隣接するように合成されることが意図されている。したがって、このカセットは、好ましい実施形態では、得られたプラスミドが、浸透圧調節されたＰ_ｏｍｐＣプロモーターによって転写制御されるｐａｇＬおよびこの融合遺伝子から構成されるオペロンをコードするように、特許取得の発現プラスミドｐＰａｇＬのＰａｇＬオープンリーディングフレームの下流に挿入されることを意図している。このワクチンプラスミドの浸透圧誘導時に、標的化されたがん抗原がチフス菌ベースのキャリアワクチンの表面に発現され、続いて、ＰａｇＬの共発現によって誘導された外膜小胞を介してこれらの抗原が輸送される。

ＰａｇＬと共発現されることが意図される２つの融合タンパク質はそれぞれ、操作されたリンカー領域［Ａ（ＥＡＡＡＫ）４Ａと呼ばれる］によってそれぞれ分離された２つのさらなるがん抗原カセットに作動可能に連結された表面発現カセットから構成される（図７）。リンカー領域は、各がんドメインを分離して翻訳後に適切な折り畳みを可能にする剛性アルファヘリックスに折り畳まれるように設計されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１３；６５（１０）：１３５７－６９）。表面発現カセットは、ＣｌｙＡタンパク質の改変および特許取得の非溶血バージョン（本明細書ではｃｌｙＡ^{Ｉ１９８Ｎ}と呼ばれる）またはＩｐｐ－ｏｍｐＡと呼ばれる以前に公開された表面発現カセット（本明細書ではＬＯＡと呼ばれる）のいずれかで構成される（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｌ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ １９９２；８９（７）：２７１３－７）。これらの表面発現カセットは、順次、一方ががん抗原がん胎児性抗原（ＣＥＡ）由来であり、他方がＭＵＣ１由来である２つのドメインから構成されるがん融合タンパク質をコードするカセットに、作動可能に連結される（図７）。ＣＥＡ由来のドメインはＡ３Ｂ３（ａ３ｂ３によってコードされる）と命名され、ＣＥＡの６番目および７番目のＩｇドメイン由来の１７９アミノ酸領域をコードする（Ｏｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９８７；１４２（２）：５１１－８；Ｈｅｆｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９２；５２（２０）：５６４７－５５．；Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７（２０）：４５７０－７；Ｎｕｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９；８０（１）：９２－７；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０２０；１５８（１）：２３８－５２）。ＭＵＣ１ドメインは、ヒトＭＵＣ１タンパク質由来の７つの反復領域を表す１４０アミノ酸から構成される（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６（３０）：２７７６４－９；Ｓｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；１６６（１１）：６５５５－６３；Ｓｃｈｅｉｋｌ－Ｇａｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１７；１５（１）：１５４；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９９８；９（４）：４５１－８）。ＬＯＡマスター遺伝子カセットのＤＮＡ配列は配列番号１１に記載されており、コードされた融合タンパク質は配列番号１２に記載されている。ＣｌｙＡ^{Ｉ１９８Ｎ}マスター遺伝子カセットは配列番号１９に記載されており、コードされた融合タンパク質は配列番号２０に記載されている。

これらのマスター遺伝子カセットは両方とも、いずれかのカセットを制限酵素ＸｂａｌおよびＡｖｒＩＩで切断し、その後にレリゲーションすると、表面発現ドメイン、リンカー、Ａ３Ｂ３ドメイン、および最終リンカー（例としてＬＯＡについて配列番号１３および１４）のみを含む融合タンパク質をコードする切断型遺伝子が得られるように設計されている。同様に、いずれかのカセットをＮｈｅｌおよびＸｂａｌで切断した後、レリゲーションさせると、単一のリンカー配列によって分離された表面発現ドメインおよびＭＵＣ１ドメインのみを含む融合タンパク質をコードする切断型遺伝子が得られる（例としてＬＯＡについて配列番号１７および１８）。これらのマスター遺伝子カセットは、マウスを免疫化し、がん特異的免疫応答の誘発に対するＡ３Ｂ３かＭＵＣ１、またはその両方の寄与を決定する同質遺伝子キャリアワクチンに使用することができる同質遺伝子構築物を迅速に生成するために、この様式で設計された。

実施例６．ΔｆｌｉＣ：：ｌｐｘＥ株の構築
本発明者らのデータに実証されているように、本発明者らは、今や弱毒化チフス菌株ＣＶＤ９１０に由来する過剰小胞形成試薬株を構築することに成功しており、Ａ．バウマンニ由来の外来外膜タンパク質標的ワクチン抗原ＡｂＯｍｐＡおよびＡｂＢａｍＡが表面で共発現されており、今や非経口ワクチンとして使用するためにｒＯＭＶを介して（ＰａｇＬの作用によって）試薬株から輸送することができる。本発明者らは、脂質Ａを脱アシル化し、インビトロでの反応原性を約１０倍低下させるＰａｇＬの酵素活性のために、これらの小胞の反応原性が低下することを実証した。しかし、精製されたｒＯＭＶは、ＴＬＲ５のアゴニストである表面に吸着され、様々であるが相当な量のフラジェリンを有し得ることが、以前に報告されている。本発明者らは、ヒトへ筋肉内注射によって投与されるワクチンとして精製ｒＯＭＶを使用することを企図しているので、最適な免疫原性および保護の効力を依然として維持しながら、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５アゴニストの両方によって誘発される許容できない反応原性を最小限に抑える必要がある（Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３４７７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３４７７６（２０１６））。したがって、本発明者らのｒＯＭＶベースのワクチンの臨床的許容性および純度をさらに改善するために、本発明者らは、染色体にコードされたＦｌｉＣ（ＴＬＲ５アゴニスト；ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座＃ＡＥ０１４６１３）をフランシセラ－ノビシダ菌由来のＩｐｘＥ（ｌｐｘＥ^Ｆｎ）（配列番号２６）で置き換えることによって、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５媒介反応原性の両方を減少させた（Ｚｈａｏ，Ｊ．＆Ｒａｅｔｚ，Ｃ．Ｒ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，８２０－８３６，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２９５８．２０１０．０７３０５．ｘ（２０１０）；Ｚｈａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ｍＢｉｏ １０，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００８８６－１９（２０１９））。ＬｐｘＥ（配列番号２７）は、脂質Ａを脱リン酸化して反応誘発性の低いモノホスホリル種を生成する脂質Ａ１－ホスファターゼである（図８）。ＰａｇＬ（脂質Ａを脱アシル化するが、過剰小胞形成を促進する）の共発現によって、顕著に低下したＴＬＲ４およびＴＬＲ５活性を有するペンタアシル－モノリン酸１－脂質Ａを含有するｒＯＭＶが産生される。菌株の操作のために、本発明者らは、本明細書に報告された株構築のすべてにこれまで使用されてきた十分に確立されたラムダレッド部位特異的染色体組換え系を使用した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，６６４０－６６４５（２０００））。表１に列挙したように、同質遺伝子の株のセットを構築した。次いで、ＰａｇＬおよびＬｐｐ－ＯｍｐＡ－Ａ３Ｂ３－ＭＵＣ１標的ＣＲＣ融合タンパク質の両方を発現する、命名されたｐＰａｇＬ－ＬＯＡＭを発現する低コピープラスミドをこれらの株に導入した。最終的な株ＣＶＤ９１０ΔｇｕａＢＡ：：Ｐ_ｏｍｐＣ－ｂａｍＡ^ＡｂΔｆｌｉＣ：：Ｐ_ｏｍｐＣ－ｌｐｘＥ^Ｆｎ（ｐＰａｇＬ－ＬＯＡＭ）を、図９にグラフで示す。

実施例７．６つの新規の株におけるＣＲＣ融合タンパク質の発現
５個の小胞を、細菌細胞および残屑を除去するための低速遠心分離および０．２μｍフィルターによる上清の濾過、続いてｒＯＭＶをペレット化するための高速超遠心分離によって、表１に列挙した同質遺伝子型株の液体培養物から精製した。ペレットを、ＰＢＳに再懸濁した。ｒＯＭＶの濃度は、Ｒ．Ｅ．Ｗ．Ｈａｎｏｃｋによって規定された３－Ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－Ｏｃｔｕｌｏｓｏｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＫＤＯ）アッセイを使用して厳密に判定した（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｄｒ．ｕｂｃ．ｃａ／ｂｏｂｈ／ｍｅｔｈｏｄ／ｋｄｏ－ａｓｓａｙ／）。次いで、０．５ｍｇの精製された各ｒＯＭＷを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色およびウエスタン免疫ブロット分析によって分析した。図１０Ａに示すように、チフス菌の外膜に見られる様々なタンパク質およびリポタンパク質を含有する外膜小胞で予想されるように、クーマシー染色試料では複数のバンドが検出される。注目すべきことに、パネルＡのレーン２および３においておよそ５０ｋＤａで移動する強いバンドは、フォームレーン４～７を消失する。パネルＡのレーン２および３においておよそ５０ｋＤａで移動する強いバンドは、フォームレーン４～７を消失する。これは、レーン４～７の株から欠失されたフラジェリンＦｌｉＣの約５０ｋＤａの既知の分子量と一致する。図１０Ｂに示されるように、ＣＲＣ融合タンパク質は、予想通りレーン３、５および７において明確に検出されるが、単一バンドとしては検出されない。ＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインが融合タンパク質（図１０Ｃ）の発現ドメインに２つのジスルフィド架橋を含むとして、本発明者らは、強いトップバンドの下方を進む、より速く進む種が、予想されるジスルフィド架橋の１つまたは複数を含む追加の種であると仮定した。ゲルを２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の還元条件下で進ませたという事実にもかかわらず、ジスルフィド架橋が依然として明らかに形成された。

本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書は、特定の引用によって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が関係する最新技術をより完全近く説明するために、参照により本開示に組み込まれる。

本教示は様々な実施形態に関連して説明されているが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、および均等物を包含する。

Claims (152)

1. ａ．１つ以上のがん抗原、
   ｂ．外膜折り畳みタンパク質ＢａｍＡまたはその断片もしくは変異体、および
   ｃ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体
   を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、
   前記チフス菌ベクターが、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に前記抗原を送達することができる、生チフス菌ベクター。
2. 前記抗原が外膜タンパク質である、請求項１に記載のチフス菌ベクター。
3. 前記抗原が、チフス菌に染色体で組み込まれた核酸によってコードされる、請求項１～２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
4. 前記抗原がプラスミドから発現される、請求項１～３のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
5. 前記チフス菌ベクターが、ｇｕａＢＡおよびｈｔｒＡに欠失を含む、請求項１～４のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
6. 前記抗原が、ｇｕａＢＡ、ｒｐｏＳ、ｈｔｒＡ、ｓｓｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるチフス菌遺伝子座に挿入される、請求項１～５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
7. 前記抗原が、チフス菌の前記ｒｐｏＳ遺伝子座に挿入されている、請求項１～６のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
8. 前記チフス菌が細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）タンパク質を過剰発現して外膜小胞形成を促進する、請求項１～７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
9. 前記ＣｌｙＡが、ＣｌｙＡの溶血活性を低下させるように変異している、請求項８に記載のチフス菌ベクター。
10. 前記ＣｌｙＡ変異体が、ＣｌｙＡ Ｉ１９８Ｎ、ＣｌｙＡ Ａ１９９Ｄ、ＣｌｙＡ Ｅ２０４Ｋ、ＣｌｙＡ Ｃ２８５Ｗおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載のチフス菌ベクター。
11. 前記ＣｌｙＡが融合タンパク質である、請求項８～１０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
12. 前記ＣｌｙＡが、Ｉ１９８Ｎ、Ａ１９９Ｄ、およびＥ２０４Ｋの置換の変異を含む、請求項１１に記載のチフス菌ベクター。
13. 前記ＢａｍＡがアシネトバクター・バウマンニ由来である、請求項１～１２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
14. 前記ＢａｍＡアミノ酸配列が配列番号８を含む、請求項１～１３のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
15. ＢａｍＡタンパク質をコードする前記ｂａｍＡ遺伝子が、チフス菌のゲノムに組み込まれている、請求項１４に記載のチフス菌ベクター。
16. ｂａｍＡが、チフス菌の前記ｇｕａＢＡ遺伝子座に組み込まれている、請求項１５に記載のチフス菌ベクター。
17. ｂａｍＡが誘導性プロモーターによって発現される、請求項１３～１６のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
18. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項１７に記載のチフス菌ベクター。
19. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項１８に記載のチフス菌ベクター。
20. 外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子の前記プロモーターが配列番号９を含む、請求項１９に記載のチフス菌ベクター。
21. ＰａｇＬをコードする前記ｐａｇＬ遺伝子が、チフス菌の前記ゲノムに組み込まれている、請求項１～２０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
22. ｐａｇＬがプラスミドから発現される、請求項１～２０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
23. ＰａｇＬを発現する前記プラスミドが低コピー数発現プラスミドである、請求項２２に記載のチフス菌ベクター。
24. ｐａｇＬの発現が誘導性プロモーターによって制御される、請求項１～２３のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
25. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項２２～２４に記載のチフス菌ベクター。
26. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項２５に記載のチフス菌ベクター。
27. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項２６に記載のチフス菌ベクター。
28. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項２４に記載のチフス菌ベクター。
29. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項２８に記載のチフス菌ベクター。
30. 前記プラスミドが前記抗原をさらにコードし発現する、請求項２２～２９のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
31. 前記ＰａｇＬアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４から選択される、請求項１～３０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
32. ＣｌｙＡがチフス菌のプラスミドで発現される、請求項８～３１のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
33. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項３２に記載のチフス菌ベクター。
34. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項３３に記載のチフス菌ベクター。
35. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項３４に記載のチフス菌ベクター。
36. 前記がんが結腸がん抗原である、請求項１～３５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
37. 前記チフス菌ベクターが２つのがん抗原を含む、請求項１～３６のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
38. 前記がん抗原が、前記抗原の表面提示を促進するためにポリペプチドに融合されている、請求項１～３７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
39. 前記がん抗原が、キメラＬｐｐ－ＯｍｐＡ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項１～３８のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
40. 前記がん抗原が、キメラＬｐｐ－ＯｍｐＡ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項１～３８のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
41. 前記がん抗原が、ＣｌｙＡ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項１～３８のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
42. 前記結腸がん抗原が、ＣＥＡまたはその抗原断片、ＭＵＣ１またはその抗原断片、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項３６～４１に記載のチフス菌ベクター。
43. 前記ＣＥＡ抗原およびＭＵＣ１が同じ融合タンパク質の一部である、請求項４２に記載のチフス菌ベクター。
44. ＭＵＣ１抗原が、複数の反復ドメインを含む断片である、請求項４３に記載のチフス菌ベクター。
45. ＭＵＣ１抗原の前記アミノ酸配列が配列番号２４を含む、請求項４４に記載のチフス菌ベクター。
46. 前記ＣＥＡ抗原がドメインＡ３Ｂ３を含む、請求項４２～４５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
47. Ｌｐｐ－ＯｍｐＡの前記アミノ酸配列が配列番号２１を含む、請求項３９に記載のチフス菌ベクター。
48. ドメインＡ３Ｂ３の前記アミノ酸配列が配列番号２３を含む、請求項４２～４７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
49. 前記Ｌｐｐ－ＯｍｐＡ：ＣＥＡ：ＭＵＣｌ融合タンパク質が、配列番号１２の前記アミノ酸配列を含む、請求項３９または４２～４８のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
50. 前記がん抗原がタンパク質プラスミドで発現され、前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項３６～４９のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
51. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項５０に記載のチフス菌ベクター。
52. 前記プラスミドがＰａｇＬをさらに発現する、請求項５０～５１のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
53. 前記がん抗原および／またはＰａｇＬが誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項３６～５２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
54. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項５３に記載のチフス菌ベクター。
55. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項５４に記載のチフス菌ベクター。
56. 外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子の前記プロモーターが配列番号９を含む、請求項５５に記載のチフス菌ベクター。
57. 前記チフス菌ベクターが、前記ｆｌｉＣ遺伝子に欠失を有する、請求項１～５５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
58. 請求項１～５７のいずれかに記載の前記チフス菌由来の前記抗原を含む単離された組換え外膜小胞を含む組成物。
59. 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の請求項１～５７のいずれかに記載の生チフス菌ベクターを前記対象に投与することを含み、前記抗原が、前記チフス菌ベクターによって産生される外膜小胞によって前記対象の粘膜組織に送達される、方法。
60. 前記対象に、最初にプライムとして請求項１～６７のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項１～６７のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与する、請求項５９に記載の方法。
61. 前記対象に、最初にプライムとして請求項１～５７のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項６８に記載の単離された組換え外膜小胞を投与する、請求項５９に記載の方法。
62. 前記チフス菌ベクターおよび／または単離された組換え外膜小胞を鼻腔内投与する、請求項５９～６１のいずれかに記載の方法。
63. 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の請求項５８に記載の単離された組換え外膜小胞を前記対象に投与することを含み、前記組換え外膜小胞が前記対象の粘膜組織に送達される、方法。
64. 前記対象に、最初にプライムとして前記単離された組換え外膜小胞を投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の前記外膜小胞を投与する、請求項６３に記載の方法。
65. 前記対象に、最初にプライムとして前記単離された組換え外膜小胞を投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項１～６７のいずれかに記載の前記チフス菌ベクターを投与する、請求項６３または６４のいずれかに記載の方法。
66. 前記チフス菌ベクターおよび／または単離された組換え外膜小胞を鼻腔内投与する、請求項６３～６５のいずれかに記載の方法。
67. ａ．１つ以上のがん抗原、および
    ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体
    を発現するように操作された生チフス菌ベクターであって、
    前記チフス菌ベクターが、対象に投与されたときに、外膜小胞を介して粘膜組織に前記抗原を送達することができる、生チフス菌ベクター。
68. 前記抗原が、チフス菌に染色体で組み込まれている核酸によってコードされる、請求項６７に記載のチフス菌ベクター。
69. 前記抗原がプラスミドから発現される、請求項６７に記載のチフス菌ベクター。
70. ｇｕａＢＡおよびｈｔｒＡに欠失を含む、請求項６７～６９のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
71. 前記抗原が、ｇｕａＢＡ、ｒｐｏＳ、ｈｔｒＡ、ｓｓｂ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるチフス菌遺伝子座に挿入される、請求項６７、６８、または７０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
72. 前記抗原が、チフス菌の前記ｒｐｏＳ遺伝子座に挿入されている、請求項６７、６８、または７０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
73. 前記チフス菌が細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）タンパク質を過剰発現して外膜小胞形成を促進する、請求項６７～７２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
74. 前記ＣｌｙＡが、ＣｌｙＡの溶血活性を低下させるように変異されている、請求項７３に記載のチフス菌ベクター。
75. 前記ＣｌｙＡ変異体が、ＣｌｙＡＩ１９８Ｎ、ＣｌｙＡＡ１９９Ｄ、ＣｌｙＡＥ２０４Ｋ、ＣｌｙＡＣ２８５ｗおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７４に記載のチフス菌ベクター。
76. 前記ＣｌｙＡが融合タンパク質である、請求項７３～７５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
77. 前記ＣｌｙＡが、Ｉ１９８Ｎ、Ａ１９９Ｄ、およびＥ２０４Ｋの置換の変異を含む、請求項７３～７６に記載のチフス菌ベクター。
78. 前記ＰａｇＬが、チフス菌のゲノムに組み込まれている、請求項６７～７７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
79. 前記ＰａｇＬがプラスミドから発現される、請求項６７～７７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
80. ＰａｇＬを発現する前記プラスミドが低コピー数発現プラスミドである、請求項７９に記載のチフス菌ベクター。
81. 前記ＰａｇＬが誘導性プロモーターによって発現される、請求項６７～８０のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
82. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項７９～８１に記載のチフス菌ベクター。
83. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項８２に記載のチフス菌ベクター。
84. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項８３に記載のチフス菌ベクター。
85. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項８１に記載のチフス菌ベクター。
86. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項８５に記載のチフス菌ベクター。
87. 前記プラスミドが前記抗原をさらにコードし発現する、請求項７９～８６のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
88. 前記ＰａｇＬアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４から選択される、請求項６７～８７のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
89. ＣｌｙＡがチフス菌のプラスミドで発現される、請求項７３～８９のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
90. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項８９に記載のチフス菌ベクター。
91. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項９０に記載のチフス菌ベクター。
92. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項９１に記載のチフス菌ベクター。
93. 前記がんが結腸がん抗原である、請求項６７～９２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
94. 前記チフス菌ベクターが２つのがん抗原を含む、請求項６７～９３のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
95. 前記がん抗原が、前記抗原の表面提示を促進するためにポリペプチドに融合されている、請求項６７～９４のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
96. 前記がん抗原が、キメラＬｐｐ－ＯｍｐＡ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項６７～９５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
97. 前記がん抗原が、キメラＬｐｐ－ＯｍｐＴ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項６７～９５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
98. 前記がん抗原が、ＣｌｙＡ表面ディスプレイポリペプチドに融合されている、請求項６７～９５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
99. 前記結腸がん抗原が、ＣＥＡまたはその抗原断片、ＭＵＣ１またはその抗原断片、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項９３～９８に記載のチフス菌ベクター。
100. 前記ＣＥＡ抗原およびＭＵＣ１が同じ融合タンパク質の一部である、請求項９９に記載のチフス菌ベクター。
101. ＭＵＣ１抗原が、複数の反復ドメインを含む断片である、請求項９９に記載のチフス菌ベクター。
102. ＭＵＣ１抗原の前記アミノ酸配列が配列番号２４を含む、請求項１０１に記載のチフス菌ベクター。
103. 前記ＣＥＡ抗原がドメインＡ３Ｂ３を含む、請求項９９～１０２のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
104. Ｉｐｐ－ｏｍｐＡの前記アミノ酸配列が配列番号２１を含む、請求項９６に記載のチフス菌ベクター。
105. ドメインＡ３Ｂ３の前記アミノ酸配列が配列番号２３を含む、請求項９９～１０４のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
106. 前記Ｌｐｐ－ＯｍｐＡ：ＣＥＡ：ＭＵＣｌ融合タンパク質が、配列番号１２の前記アミノ酸配列を含む、請求項９６または９８～１０５のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
107. 前記がん抗原がタンパク質プラスミドで発現され、前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項６７～１０６のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
108. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項１０７に記載のチフス菌ベクター。
109. 前記プラスミドがＰａｇＬをさらに発現する、請求項１０７～１０８のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
110. 前記がん抗原および／またはＰａｇＬが誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項６７～１０９のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
111. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項１１０に記載のチフス菌ベクター。
112. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項１１１に記載のチフス菌ベクター。
113. 外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子の前記プロモーターが配列番号９を含む、請求項１１２に記載のチフス菌ベクター。
114. 前記チフス菌ベクターが、ｆｌｉＣ遺伝子に欠失を有する、請求項６７～１１３のいずれかに記載のチフス菌ベクター。
115. 請求項６７～１１４のいずれかに記載の前記チフス菌ベクターからの前記抗原を含む単離された組換え外膜小胞を含む組成物。
116. 請求項３６～５７のいずれかに記載の前記チフス菌ベクターからの前記抗原を含む単離された組換え外膜小胞を含む組成物。
117. 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の請求項６７～１１４のいずれかに記載の生チフス菌ベクターを前記対象に投与することを含み、前記抗原が、前記チフス菌ベクターによって産生される外膜小胞によって前記対象の粘膜組織に送達される、方法。
118. 前記対象に、最初にプライムとして請求項６７～１１４のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項６７～１１４のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与する、請求項１１７に記載の方法。
119. 前記対象に、最初にプライムとして請求項６７～１１４のいずれかに記載の前記生チフス菌ベクターを投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項１１５または１１６のいずれかに記載の単離された組換え外膜小胞を投与する、請求項１１７に記載の方法。
120. 前記チフス菌ベクターおよび／または単離された組換え外膜小胞を鼻腔内投与する、請求項１１７～１１９のいずれかに記載の方法。
121. 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の請求項１１５または１１６のいずれかに記載の単離された組換え外膜小胞を前記対象に投与することを含み、前記組換え外膜小胞が前記対象の粘膜組織に送達される、方法。
122. 前記対象に、最初に請求項１１５または１２６のいずれかに記載の前記単離された組換え外膜小胞をプライムとして投与し、続いて免疫学的有効量の請求項１１５または１１６のいずれかに記載の前記外膜小胞をブーストとして投与する、請求項１２１に記載の方法。
123. 前記対象に、最初にプライムとして請求項１１５または１１６のいずれかに記載の前記外膜小胞を投与し、続いてブーストとして免疫学的有効量の請求項６７～１１４のいずれかに記載の前記チフス菌ベクターを投与する、請求項１２１または１２２のいずれかに記載の方法。
124. 前記チフス菌ベクターを経口投与し、前記単離された組換え外膜小胞を経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、またはこれらの経路の組み合わせによって投与する、請求項１１７～１２３のいずれかに記載の方法。
125. 必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、
     ｉ．免疫学的有効量の生チフス菌ベクターであって、
     ａ．１つ以上のがん抗原、および
     ｂ．脂質ＡデアシラーゼＰａｇＬまたはその断片もしくは変異体、
     を発現するように操作された生チフス菌ベクター、および
     ｉｉ．請求項５８に記載の免疫学的有効量の単離された組換え外膜小胞
     を前記対象に投与することを含む、方法。
126. 前記抗原が外膜タンパク質である、請求項１２５に記載の方法。
127. 前記抗原が、チフス菌に染色体で組み込まれた核酸によってコードされる、請求項１２５～１２６のいずれかに記載の方法。
128. 前記チフス菌が、前記抗原に相同であり、欠失または不活性化されている遺伝子を含む、請求項１２５～１２７のいずれかに記載の方法。
129. 前記抗原がプラスミドから発現される、請求項１２５～１２８のいずれかに記載の方法。
130. 前記チフス菌ベクターが、ｇｕａＢＡおよびｈｔｒＡにおける欠失を含む、請求項１２５～１２９のいずれかに記載の方法。
131. 前記抗原が、ｇｕａＢＡ、ｒｐｏＳ、ｈｔｒＡ、ｓｓｂ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるチフス菌遺伝子座に挿入される、請求項１２５～１２８または１３０のいずれかに記載の方法。
132. 前記抗原が、チフス菌の前記ｒｐｏＳ遺伝子座に挿入されている、請求項１２５～１２８または１３０のいずれかに記載の方法。
133. 前記チフス菌が細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）タンパク質を過剰発現させて外膜小胞形成を促進する、請求項１２５～１３２のいずれかに記載の方法。
134. 前記ＣｌｙＡが、ＣｌｙＡの溶血活性を低下させるように変異されている、請求項１３３に記載の方法。
135. 前記ＣｌｙＡ変異体が、ＣｌｙＡＩ１９８Ｎ、ＣｌｙＡＡ１９９Ｄ、ＣｌｙＡＥ２０４Ｋ、ＣｌｙＡＣ２８５Ｗおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
136. 前記ＣｌｙＡが融合タンパク質である、請求項１３３～１３５のいずれかに記載の方法。
137. 前記ＣｌｙＡが、Ｉ１９８Ｎ、Ａ１９９Ｄ、およびＥ２０４Ｋの置換の変異を含む、請求項１３３～１３６のいずれかに記載の方法。
138. 前記ＰａｇＬが、チフス菌のゲノムに組み込まれている、請求項１２５～１３７のいずれかに記載の方法。
139. 前記ＰａｇＬがプラスミドから発現される、請求項１２５～１３７のいずれかに記載の方法。
140. ＰａｇＬを発現する前記プラスミドが、低コピー数発現プラスミドである、請求項１３９に記載の方法。
141. 前記ＰａｇＬが誘導性プロモーターによって発現される、請求項１２５～１４０のいずれかに記載の方法。
142. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項１３９～１４１のいずれかに記載の方法。
143. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項１４２に記載の方法。
144. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項１４３に記載の方法。
145. 前記誘導性プロモーターが浸透圧で制御されている、請求項１４１に記載の方法。
146. 前記浸透圧で制御された誘導性プロモーターが、外膜タンパク質Ｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子のプロモーターである、請求項１４５に記載の方法。
147. 前記プラスミドが前記抗原をさらにコードし発現する、請求項１３９～１４６のいずれかに記載の方法。
148. 前記ＰａｇＬアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４から選択される、請求項１２５～１４７のいずれかに記載の方法。
149. ＣｌｙＡがチフス菌のプラスミドで発現される、請求項１３３～１４８のいずれかに記載の方法。
150. 前記プラスミドが非抗生物質ベースのプラスミド選択系を有する、請求項１４９に記載の方法。
151. 前記プラスミドが、チフス菌の増殖に必須であり、チフス菌において染色体変異している遺伝子を発現する、請求項１５０に記載の方法。
152. 前記遺伝子が一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする、請求項１５１に記載の方法。

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