MXPA01008746A - Antigeno asociado al tumor - Google Patents

Abstract

Se describen antígenos asociados al tumor, péptidos inmunogénicos derivados de los mismos y mo1éculas de que los codifican y el uso de los mismos en inmunoterapia de cánceres.

Description

Antigeno Asociado al Tumor Campo de la Invención. La invención se refiere a la inmunoterapia de enfermedades del tumor. Antecedentes de la Invención El sistema inmune tiene la tarea de proteger al cuerpo de una diversidad de microorganismos diferentes y combate activamente a esos microorganismos. La importancia de un sistema inmune intacto es aparente, particularmente en el caso de inmunodeficiencias adquiridas o heredadas. El uso de programas profilácticos de vacunas, en muchos casos probó ser una intervención inmunológica extremadamente efectiva y exitosa en el combate de enfermedades infecciosas, virales o bacterianas. También se ha encontrado que el sistema inmune se involucra también en un amplio grado en la eliminación de células de tumor. El reconocimiento de los antigenos asociados al tumor (TAAs) por los componentes del sistema inmune juega un papel crucial. En el sentido más amplio, cualquier componente (péptido o no péptido) de una célula de tumor que se reconoce por un elemento del sistema inmune, y conduce a la estimulación de una respuesta inmune, puede actuar como un antigeno inmunogénico del tumor. Son de particular importancia aquellos antigenos de tumor que no solamente provocan una Ref: 132492 reacción inmunológica sino también provocan el rechazo del tumor. La identificación de antigenos específicos que sean capaces de provocar una reacción inmunológica de este tipo, constituye un paso importante en el desarrollo de una vacuna para tumor molecularmente definida. Aunque todavía no están claros los elementos del sistema inmune que son responsables del rechazo al tumor, hay sin embargo un consenso de que los linfocitos-T citotóxicos que expresan CD8 (CTLs) juegan un papel importante (Coulie, 1997) . Particularmente en aquellos tipos de tumor (tal como el melanoma y el carcinoma de riñon) que tienen una tasa de remisión espontánea relativamente alta, se ha encontrado una correlación entre el progreso clínico y la aparición creciente de células de CD4+ y CD8+ (Shendel y colaboradores, 1993; Mackensen y colaboradores, 1993; Halliday y colaboradores, 1995; Kawakami y colaboradores, 1996; Wang, 1997; Celluzzi and Falo, 1998) . Se obtuvieron clones específicos de CTL, a partir de linfocitos que infiltran al tumor (TIL) o células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) después de un co-cultivo con células de tumor generalmente autólogas y estimulación de citoquinas in vi tro . En los modelos animales y en sistemas de cultivo de células humanas cultivadas in vi tro, la respuesta de las células-T contra las células de tumor se incrementó por la transfección de células de tumor con citoquinas (van Elsas y colaboradores, 1997; Gansbacher y colaboradores, 1990; Tepper y colaboradores, 1989; Fearon y colaboradores, 1990; Dranoff y colaboradores, 1993) . A la luz de la correlación entre la remisión y el involucramiento de células-T CD8+, la identificación de antigenos asociados al tumor (TAA) que se reconocen por CTLs positivos de CD8, es un objetivo primario especifico hacia el desarrollo de una vacuna para el tumor (Pardoll, 1998; Robbins and Kawakami, 1996) . Todavía no está claro si otros tipos de células del sistema inmune juegan un papel importante, tales como por ejemplo las células de ayuda de CD4+; diversos estudios con péptidos MAGE-3/HLA-Al en pacientes con melanoma, indican esto (Marchand y colaboradores, 1995; Boon y colaboradores, 1998) . En años recientes, han sido identificados una variedad de TAAs que se reconocen por CTLs, (Boon y colaboradores, 1994; van den Eynde and van der Bruggen, 1997) . Las células-T reconocen antigenos como fragmentos de péptidos que se presentan en la superficies de la células de moléculas MHC (complejo principal de histocompatibilidad, en el hombre "HLA" = "Antigeno humano de leucocitos") . Existen dos tipos de moléculas MHC: moléculas MHC-I que se presentan en la mayoría de las células con un núcleo y en péptidos actuales (usualmente 8-10-meros) que se producen por la degradación proteolitica de proteínas endógenas (denominadas procesamiento de antigenos) . Los complejos péptido:MHC-I se reconocen por los CTLs positivos de CD8. Las moléculas de MHC-II se presentan solamente en las denominadas "células profesionales que presentan antigenos" (APC) y los péptidos actuales de las proteínas exógenas que se absorben y procesan en el transcurso de la endocitosis por APC. Los complejos péptido:MHC-II se reconocen por células-T de ayuda a CD4. Por la interacción entre el receptor de células-T y el complejo péptido: HC, se pueden activar mecanismos efectores diversos lo que conduce a la apoptosis de la célula objetivo en el caso de CTLs. Esto sucede si el MHC (por ejemplo en el caso de rechazo en transplantes) o el péptido (por ejemplo en el caso patógenos intracelulares) se reconocen como extraños. En cualquier caso, no todos los péptidos actuales satisfacen los requerimientos estructurales y funcionales para una interacción efectiva con las células-T (como se describe por Rammensee y colaboradores, 1995 de aqui en adelante) . En principio, son posibles diversos métodos de administración para el uso de los TAAs en una vacuna para tumor: el antígeno se puede administrar como una proteína recombinante con los adyuvantes apropiados o sistemas portadores, o se le puede dar una codificación de cADN para el antígeno en el plásmido (vacuna de ADN; Tighe y colaboradores, 1998) o vectores virales (Restifo, 1997) . Otra posibilidad es el uso de bacterias recombinantes (por ejemplo listeria, salmonella) que expresan de forma recombinante el antígeno humano y tienen un efecto adyuvante como resultado de sus componentes adicionales (Paterson, 1996; Pardoll, 1998) . En todos estos casos, el antigeno se tiene que procesar y presentar por las denominadas "células profesionales que presentan antígenos" (APC) . Otra posibilidad es el uso de péptidos sintéticos (Melief y colaboradores, 1996) que corresponde a los epítopes equivalentes de células-T del antígeno y se cargan sobre las APC desde el exterior (Buschle y colaboradores, 1997; Schmidt y colaboradores, 1997) o por las APC y se transfieren intracelularmente a las moléculas MHC-I. El método terapéuticamente más eficiente de administración de un antígeno especificado, se determina generalmente por ensayos clínicos. Los antígenos o epítopes de los mismos reconocidos por los CTLs del tumor, incluyen moléculas que pueden venir de cualquier clase de proteínas (por ejemplo: factores de trascripción, receptores, enzimas; para una investigación ver Rammensee y colaboradores, 1995; Robbins and Kawakami, 1996) . Estas proteínas no han sido localizadas necesariamente en la superficie de la célula, como es necesario para el reconocimiento por los anticuerpos. Con objeto de actuar como un antígeno específico de tumor para reconocimiento por CTLs, o con objeto de utilizarse para terapia, las proteínas deben satisfacer ciertas condiciones: primero que todo, el antígeno debe expresarse exclusivamente por las células de tumor o debe presentarse en los denominados tejidos normales "críticos" en concentraciones más pequeñas que en los tumores. Los tejidos normales críticos son tejidos esenciales; una reacción inmune dirigida contra ellos tendría consecuencias severas, en algunos casos mortales. En segundo lugar, el antígeno debe estar presente no solamente en el tumor primario sino también en la metástasis. Además, con una vista para ampliar el uso clínico del antígeno, se desea que esté presente en concentraciones elevadas en diversos tipos de tumor. Una precondición adicional para la compatibilidad de un TAA, como un ingrediente efectivo de una vacuna, es la presencia de epítopes de células-T en la secuencia de aminoácidos del antígeno; los péptidos derivados del TAA, deben conducir a una respuesta de células in vitro/in vivo (péptido "inmunogénico") . Otro criterio para seleccionar un péptido inmunogénico clínicamente de aplicación amplia, es la frecuencia con la cual se encuentra el antígeno en una población dada de pacientes. Los antígenos inmunogénicos asociados al tumor (TAAs) , que ya se han demostrado fuertemente que tienen epítopes de células-T, se pueden dividir en una diversidad de categorías, incluyendo proteínas virales, proteínas mutadas, proteínas sobreexpresadas, proteínas de fusión formadas por la transubicación cromosomal, antígenos de diferenciación, antígenos oncofetales (Van den Eynde and Brichard, 1995; van den Eynde and van der Bruggen, 1997) . Los métodos de identificación y caracterización de los TAAs que forman el punto de partida para el desarrollo de una vacuna de tumor, se basan por un lado en el uso de los CTLs que ya han sido inducidos en pacientes (respuesta celular inmune) o anticuerpos (respuesta humoral inmune) , o se basan en tomar perfiles de transcripción diferencial entre los tumores y los tejidos normales. En el caso anterior, el enfoque inmunológico, se usan CTLs de paciente para separar por exclusión las colecciones de expresión de cADN de tumor eucariótico, que presentan los epítopes CTL por medio de moléculas MHC-I (Boon y colaboradores, 1994), mientras que con el uso de colecciones de expresión de cADN procarióticas antisuero de pacientes con alta afinidad, se puede buscar directamente la presencia de TAAs por medio de análisis de inmunomanchado de las placas individuales (Sahin y colaboradores, 1995) . Una combinación de la reactividad CTL y los procesos químicos de proteínas, producen el aislamiento de péptidos aislados de MHC-I de células de tumor, que se preseleccionan por reactividad con los CTLs del paciente. Los péptidos se lavan del complejo MHC-I y se identifican por espectrometría de masas (Falk y colaboradores, 1991; oelfel y colaboradores, 1994; Cox y colaboradores, 1994). Los enfoques que usan los CTLs para caracterizar antígenos, involucran costos sustanciales y no siempre son exitosos, debido a la necesidad de cultivar y activar los CTLs. Los métodos de identificación de TAAs que se basan en la comparación del perfil de transcripción de tejido normal y tumor, son muchos y variados; estos incluyen la hibridación diferencial, el establecimiento de bancos de sustracción de cADN ("análisis de diferencia de representación"; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko y colaboradores, 1996) y el uso de tecnología de microplaquetas de ADN o el método SAGE (Velculescu y colaboradores, 1995) . En contraste con el método inmunológico arriba mencionado que usa CTLs del paciente, cuando se usan métodos de biología molecular, es necesario mostrar que los candidatos potenciales de antígenos descubiertos por este método, sean específicos de tumor (asociados al tumor) y tengan de hecho epítopes de células-T capaces de disparar una respuesta citotóxica de las células-T. En al menos un caso (NY-ESO/LAGE-1) , se identifica un antígenb para el uso de sueros del paciente y para RDA (Chen y colaboradores, 1997; Lethe y colaboradores, 1998), y más aun, se describen en un paciente los epítopes CTL de este antígeno y una respuesta espontánea simultánea de células-T y humoral (Jager y colaboradores, 1998). Descripción de la Invención La finalidad de la presente invención es proporcionar un nuevo antígeno asociado al tumor (TAA) . Este objetivo se alcanza al establecer primero una colección de sustracción de cADN por RDA (análisis de diferencia de representación) entre el tejido de carcinoma de célula de riñon y el tejido normal de riñon, e hibridizar esto con una colección de cADN específica de testículos con objeto de seleccionar antigenos del tipo tumor/testículo. Los clones de cADN obtenidos, se forman en secuencias y se comparan con las secuencias disponibles en los bancos de datos. Entre los genes identificados, hay 29 genes desconocidos para los cuales existen entradas EST (etiquetas de secuencia expresada) en el banco de datos. De estos genes, aquellos 16 cuyas ESTs no se derivaron del tejido normal crítico, se investigan adicionalmente. Se establece por RT-PCR que 5 de 16 clones investigados mostraron una clara sobreexpresión en un carcinoma de célula de riñon en comparación con el tejido normal del riñon. La comparación cuantitativa (usando PCR) de la expresión de uno de los clones (9D7) entre el tejido de tumor y el tejido normal, mostró una sobreexpresión clara del cADN 9D7 en el tumor. El perfil de expresión analizado por manchado Northern, también mostró que el 9D7 no tuvo o tuvo una transcripción pobre en los tejidos normales investigados. La hibridación in si tu del carcinoma de célula del riñon y el tejido normal de riñon con una sonda etiquetada de ARN específica 9D7, confirmó los resultados obtenidos por RT-PCR, PCR cuantitativo y manchado Northern. El cADN humano 9D7 se clonó completamente; la secuencia obtenida se muestra en la SEQ ID NO.: 1. La secuencia de 9D7 muestra, al nivel del nucleótido y la proteína una elevada homología al SM20, un gen inmediato temprano inducido por los factores de crecimiento en células del músculo liso de la rata, que se ha descrito como un marcador específico para células del músculo liso de la aorta (Wax y colaboradores, 1994, 1996) . El análisis de secuencias del cADN 9D7 en comparación con SM20, muestra que los primeros 323 bp tuvieron una homología significativamente menor que el cADN restante (40% comparado con 96% al nivel de la secuencia derivada de aminoácidos) . Ya que el cADN humano tiene el primer ATG en la posición 324 en la transición entre la homología superior e inferior con SM20, se puede suponer que este es el codón de partida para el gen humano 9D7. Ya que la secuencia en la dirección 5' de la posición 324, también tiene una estructura de lectura continua que aunque pequeña, muestra sin embargo una homología significativa con SM20 (40% al nivel de la secuencia derivada de aminoácidos), no se puede descartar la posibilidad de que haya un codón de partida además en la dirección 5 ' . La información en cuanto a la secuencia localizada más allá en la dirección 5', se puede obtener por métodos estándar de biología molecular, por ejemplo, por 5 '-RACE (amplificación rápida de terminaciones cADN) en este método, el ARN, preferiblemente mARN, se transcribe de forma inversa a partir de células o tejidos en los cuales se transcribe 9D7 (por ejemplo, el tejido RCC o líneas de célula derivadas de RCC, tal como la 786-0, ver el ejemplo 9) y seguida después con un adaptador de secuencia conocido. Un PCR con un cebador adaptador (que se enlaza específicamente al adaptador en la terminación 5' del cADN) y un cebador específico 9D7 (por ejemplo SEQ ID NO.: 21, 19 17, 16 14, 12, 11, 4) permite la amplificación de los fragmentos correspondientes 9D7. Estos productos PCR, se pueden clonar por métodos estándar como se describe en el ejemplo 1, y se caracterizan particularmente por la formación de secuencias ADN. Un método alternativo de caracterización de la terminación 5', es por la separación por exclusión de colecciones de cADN por hibridación con sondas de ADN o antisueros que son específicos para el 9D7. Si la separación por exclusión de las colecciones de cADN, no alcanza el producto deseado, por cuenta de las limitaciones del procedimiento, por ejemplo, transcripción inversa ineficiente provocada por estructuras secundarias marcadas de ARN, colecciones genómicas se pueden buscar por ejemplo, clones aislantes, como en la separación por exclusión de las colecciones de cADN, al hibridizar con sondas de ADN específicas para el 9D7, los clones contienen la información de la secuencia localizada en la dirección de 5' del cADN obtenido, por ejemplo, la región promotora de 9D7. El cADN aislado, codifica el antígeno asociado al tumor (TAA) designado 9D7 con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO.: 2. Esta secuencia se define por el codón de partida en la posición 324 del CADN-9D7 aislado. De conformidad con un primer aspecto de la presente invención, se relaciona a un antígeno de tumor asociado, designado como 9D7, con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. : 2. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. : 2, puede tener algunas diferencias, como por ejemplo aquellas provocadas por el intercambio conservador de aminoácidos, si el derivado 9D7 tiene las propiedades inmunogénicas deseadas para su uso en una vacuna para tumor. De conformidad con otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido, que contiene la secuencia 9D7 como una secuencia parcial. Comparado con la secuencia 9D7 mostrada en SEQ ID NO. : 2, este polipéptido tiene una extensión en la terminación de terminal-N, su secuencia se define por un codón de partida del CADN-9D7, que se localiza opcionalmente en la dirección 5' hacia arriba de la posición 324. La secuencia de aminoácidos (o correspondientemente la secuencia del CADN-9D7), se puede opcionalmente modificar al reemplazar los aminoácidos individuales en un epítope-CTL 9D7 con objeto de lograr un incremento en la afinidad de los péptidos 9D7 para las moléculas MHC-I, en comparación con el epítope natural CTL 9D7, creando así una inmunogenicidad creciente y finalmente una reactividad a los tumores. Las modificaciones en la región de los epítopes 9D7, se puede llevar a cabo en la proteína completa 9D7 (esto se procesa por las APCs, para formar los péptidos correspondientes) o en los fragmentos de proteína 9D7 mayores o en los péptidos 9D7 (cf. abajo) . De conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a fragmentos inmunogénicos y péptidos derivados del 9D7. El último se refiere de aquí en adelante como péptido 9D7. Un primer grupo son los péptidos 9D7 que disparan una respuesta inmune humoral (inducción de anticuerpos) . Tales péptidos son porciones selectas de 9D7 (al menos 12 a 15 aminoácidos) que se pueden determinar por los denominados algoritmos de predicción tales como por ejemplo el manchado de probabilidad de superficie (Emini y colaboradores, 1985) , el manchado de hidrofobicidad (Kyte and Doolittle, 1982) y el índice antigénico (Jameson and Wold, 1988). Los péptidos 9D7 se administran directamente o en forma modificada (por ejemplo acoplados a la KLH hemocianina de una variedad de lapa) y la formación de anticuerpos se determina por ensayos inmunológicos normales, por ejemplo, por ELISA.

Otros péptidos 9D7 que se prefieren dentro del alcance de la presente invención, son aquellos que se presentan por moléculas MHC y producen una respuesta celular inmune. Existen dos tipos de moléculas MHC, nominalmente moléculas MHC-I que se reconocen por los CTLs positivos CD8 y moléculas MHC-II que se reconocen por las células de ayuda T positivas CD4. Con objeto de que un péptido dispare una respuesta celular inmune, debe enlazarse a una molécula MHC, mientras que la molécula en cuestión debe estar en su repertorio. La determinación del subtipo MHC del paciente, constituye entonces uno de los prerequisitos más importantes para el uso efectivo de un péptido en este paciente, con una vista para disparar una respuesta celular inmune. La secuencia de un péptido para usarse terapéuticamente, se determina por la molécula MHC en cuestión, en términos de los aminoácidos y longitud de anclaje. Las posiciones y longitud de anclaje definidas, garantizan que un péptido se ajuste al canal de enlace de péptidos de la molécula MHC del paciente en cuestión. El resultado de esto, es que el sistema inmune se estimula y se produce una reacción celular inmune que se dirige contra las células de tumor del paciente, si se usa un derivado de péptido de un antígeno de tumor.

Los péptidos inmunogénicos 9D7, se pueden identificar pon métodos conocidos, una de las condiciones básicas es la correlación entre el enlace de MHC y la inducción de CTL. Así, ya que se puede predecir la secuencia de péptidos inmunogénicos con base en su porción de enlace de péptidos, los péptidos 9D7 que constituyen epítopes CTL, se pueden identificar y sintetizar sobre la base de la secuencia de proteínas 9D7. Están disponibles diversos métodos para hacer esto, que se usan para identificar epítopes CTL de antígenos conocidos de proteínas, por ejemplo, el método descrito por Stauss y colaboradores, 1992, para identificar epítopes de células T en el virus de papiloma humano. Se han ensamblado como una porción, los requerimientos específicos de alelos de cada producto de alelo del MHC-I, con respecto a un péptido que se enlaza a la molécula MHC y se presenta con ella (por ejemplo Falk y colaboradores, 1991) . Hasta ahora se han dado a conocer un gran número de porciones de péptidos MHC y ligandos MHC. Un método apropiado dentro del alcance de la presente invención, para la búsqueda de epítopes de una proteína conocida que se ajuste a la molécula específica MHC-I, se describe en una investigación por Rammensee y colaboradores, 1995. Comprende las siguientes etapas: primero, se busca la secuencia de proteínas para fragmentos que corresponden a la porción de anclaje, aunque son posibles ciertas variaciones con respecto a la longitud del péptido y ocupación del anclaje. Si por ejemplo, se indica una porción de un nonámero con lie o Leu en la terminación, los decámeros con una terminación C correspondientes se pueden considerar también, como pueden también los péptidos con otros grupos alifáticos tales como Val o Met en la terminación C. De esta manera, se obtiene una gran diversidad de candidatos a péptidos. Estos se buscan por la presencia de tantos grupos de anclaje como sea posible, que tienen en común con los ligandos conocidos y/o para observar si tienen grupos "preferidos" para diversas moléculas MHC (según la Tabla por Rammensee y colaboradores, 1995) . Con objeto de excluir péptidos que se enlazan débilmente, se llevan a cabo preferiblemente ensayos de enlace. Si se conocen los requerimientos para el enlace de péptidos para las moléculas específicas de MHC, los candidatos a péptidos pueden también buscarse para grupos sin anclaje que tengan un efecto negativo o positivo en el enlace o que de hecho lo hagan posible en absoluto (Ruppert y colaboradores, 1993) . Sin embargo, con este método se debe tener en mente que la porción de enlace de péptidos no es el único factor de decisión cuando se buscan ligandos naturales, otros aspectos, como la especificidad de la enzima durante el procesamiento de antígenos, también contribuye para la identidad del ligando, además de la especificidad del enlace de MHC. Un método que toma en cuenta estos aspectos y que es apropiado para la identificación de péptidos inmunogénicos 9D7 dentro del alcance de la presente invención, se usó inter alia por Kawakami y colaboradores, 1995, para identificar los epítopes gplOO sobre la base de porciones conocidas HLA-A*0201. Los péptidos también se pueden seleccionar por su capacidad para enlazar moléculas MHC-II. La porción de enlace MHC-II que se extiende sobre nueve aminoácidos, tiene un mayor grado de degeneración en las posiciones de anclaje que la porción de MHC-I. Se han desarrollado recientemente métodos basados el análisis estructural de rayos X de las moléculas MHC-II, que permite el análisis preciso de las porciones de enlace MHC-II y, con base en ello, variaciones en la secuencia de péptidos (Rammensse y colaboradores, 1995, y la literatura original allí citada) . Los péptidos que se enlazan a moléculas MHC-II, se presentan típicamente a las células T-CD4 por células dendríticas, macrófagos o células B. Las células T-CD4 a su vez activan entonces los CTLs directamente en secuencia, para la liberación de citoquina por ejemplo, e incrementar la eficiencia de la presentación de antígenos por APC (células dendríticas, macrófagos y células B) . Recientemente, han estado disponibles bancos de datos y algoritmos de predicción, que permiten una predicción más confiable de los epítopes de péptidos que se enlazan a una molécula específica MHC. Dentro del alcance de la presente invención, usando el algoritmo descrito por Parker y colaboradores, 1994, hay péptidos candidatos para los tipos más importantes de HLA, especialmente para HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 Y -B*403, que se puede esperar que se enlacen a las moléculas correspondientes de HLA y constituir así epítopes inmunogénicos CTL; los péptidos descubiertos se enlistan en la Tabla 3. Similarmente, usando posiblemente otros algoritmos que tomen en cuenta las características diferentes de los péptidos (hidrofobicidad, carga, tamaño) o requerimientos hechos de los péptidos, tales como la estructura 3D de la molécula HLA, es posible encontrar epítopes potenciales de péptidos para otros tipos de HLA. Después de seleccionar los candidatos de péptidos 9D7, usando los métodos descritos, se prueba su enlace MHC por ensayos de péptidos. Primero, se determina la inmunogenicidad de los péptidos con buenas propiedades de enlace (estabilidad de la interacción péptido-MHC se correlaciona en la mayoría de los casos con la inmunogenicidad; van der Burg y colaboradores, 1996) . Con objeto de determinar la inmunogenicidad del péptido seleccionado o el equivalente de péptido, se pueden usar métodos como se describen por ejemplo, por Sette y colaboradores, 1994, combinados con ensayos cuantitativos de enlace MHC. Alternativamente, se puede probar la inmunogenicidad del péptido seleccionado por inducción CTL in vi tro, usando métodos conocidos (como se describen de aquí en adelante para la inducción de CTL ex vivo) . El principio de este método, llevado a cabo en diversas etapas, para seleccionar péptidos que son capaces de disparar una respuesta celular inmune, se describe en WO 97/30721, los contenidos de la cual se refieren expresamente aquí, una estrategia general para la obtención de péptidos inmunogénicos eficientes, que sean apropiados dentro del alcance de la presente invención, también ha sido descrita por Schweighoffer, 1997. En lugar de usar los péptidos originales que se ajustan al canal de enlace de las moléculas MHC-I o MHC-II, esto es, péptidos que se derivan sin alterar del 9D7, se pueden llevar a cabo variaciones, adhiriéndose a los requerimientos mínimos en relación con las posiciones de anclaje y longitud especificadas, en la base de la secuencia original de péptidos, con la condición de que estas variaciones no solamente afecten la inmunogenicidad efectiva del péptido que resulta de su afinidad enlace a la molécula MHC y su capacidad para estimular los receptores de células T, sino que la enriquezca preferiblemente. En ' este caso, se usan péptidos artificiales o equivalentes de péptidos que se diseñan para corresponder a los requerimientos en relación con la capacidad de enlace a una molécula MHC. Los péptidos modificados de esta manera, se refieren como "péptidos heterocíclicos". Se pueden obtener por los siguientes métodos. Primero que todo, los epítopes de los ligandos MHC-I o MHC-II o variaciones de los mismos se comprometen, por ejemplo usando el principio descrito por Rammensee y colaboradores, 1995. La longitud del péptido corresponde preferiblemente a una secuencia mínima de 8 a 10 aminoácidos con los aminoácidos necesarios de anclaje, si el péptido se va a acoplar a moléculas de MHC-I. Si se desea, el péptido se puede también extender en la terminación N y/o C, con tal que esta extensión no afecte la capacidad de enlace de la molécula MHC y el péptido extendido se pueda procesar celularmente hasta la frecuencia mínima.

Los péptidos modificados se investigan después para su reconocimiento de TILs (linfocitos que infiltran tumores, para inducción CTL y para enlace creciente MHC e inmunogenicidad, como se describe por Parkhurst y colaboradores, 1996 y Becker y colaboradores, 1997). Otro método para encontrar péptidos con mayor inmunogenicidad que aquella de los péptidos naturales 9D7, que es apropiada para los propósitos de la presente invención, consiste en colecciones de péptidos de separación por exclusión con CTLs que reconocen los péptidos 9D7 que se presentan naturalmente en los tumores, como se describe por Blake y colaboradores, 1996; conectado con esto, se propone el uso de colecciones combinatorias de péptidos con objeto de diseñar moléculas que imiten los epitopes de tumor reconocidos por los CTLs restringidos a MHC-I. Los polipéptidos 9D7 de conformidad con la presente invención o fragmentos inmunogénicos o péptidos derivados de los mismos, se pueden producir de forma recombinante o por síntesis de péptidos, como se describe en WO 96/10413, la descripción de la cual se refiere aquí. Para la producción recombinante, la molécula correspondiente de ADN se inserta por métodos estándar en un vector de expresión, se transfecta dentro de una célula o huésped apropiado, el huésped se cultiva bajo condiciones apropiadas de expresión y se purifica la proteína. Se pueden usar métodos convencionales para la síntesis química de péptidos 9D7, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos que están disponibles comercialmente. Alternativamente a los péptidos naturales 9D7 o péptidos heteróclitos, es también posible usar sustancias que imiten tales péptidos, por ejemplo "péptidos miméticos" o "péptidos retroinversos". Con objeto de probar estas moléculas con respecto a su uso terapéutico en una vacuna para tumor, se usan los mismos métodos que se describieron arriba para los péptidos naturales 9D7 o equivalentes de péptidos 9D7. El 9D7 designado con TAA de conformidad con la presente invención y los fragmentos de proteínas, péptidos o equivalentes de péptidos o péptidos miméticos derivados de los mismos, se pueden usar en terapia de cáncer por ejemplo, con objeto de inducir una respuesta inmune a las células de tumor que expresan los determinantes correspondientes de antígenos. Se usan preferiblemente para tratamiento de tumores con una expresión potente de 9D7, particularmente en carcinoma de células de riñon, pulmón, colón y mama y en el linfoma de Hodgkin.

La respuesta inmune en forma de inducción de CTLs se puede lograr in vivo o ex vivo. Con objeto de inducir los CTLs in vivo, una composición farmacéutica que contiene como compuesto activo 9D7 de TAA o fragmentos, o un péptido o péptidos derivados de los mismos, se administra a un paciente que padece de un trastorno tumoral asociado con el TAA, mientras que la cantidad de TAA (péptido) debe ser suficiente para obtener una respuesta efectiva CTL para el tumor que soporta el antígeno. Así, de conformidad con otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica para administración parenteral, local, tópica u oral. Preferiblemente, la composición se usa parenteralmente, por ejemplo para aplicación subcutánea, mtraderir.al o intramuscular. Los péptidos de lAAs, 9D7 se disuelven o suspenden en un portador farmacéuticamente acepcabJe, preferiole ente acuoso. La composición puede también contener adyuvantes convencionales tales como soluciones amortiguadoras, etc. Les péptidos/TAAs, se pueden usar por sí m_ smos o en conjunto con adyuvantes, por ejemplo, adyuvante incompleto d»= Freuna, saponinas, sales de aluminio, o en una modalidad preferida policationes tales como poliarginina o pcliiisina. Los péptidos se pueden también enJazar a componentes que ayudan a la inducción CTL o a la activación CTL, por ejemplo, péptidos de ayuda T, lípidos o liposomas, o se administran junto con estas sustancias y/o junto con sustancias inmunoestimulantes, por ejemplo, citoquinas (IL-2, IFN-?) . Los métodos y formulaciones que son apropiados para la preparación y administración de la composición farmacéutica de conformidad con la invención se describen en WO 95/04542 y WO 97/30721, la descripción de la cual se refiere aquí. Los péptidos 9D7 o fragmentos 9D7 se pueden también usar para disparar una respuesta CTL ex vivo. Una respuesta ex vivo a un tumor que expresa 9D7, se induce al incubar las células precursoras de CTL junto con APCs y péptidos 9D7 o proteínas 9D7. Los CTLs activados se dejan expandir, con lo cual se readministran al paciente. Alternativamente, se pueden cargar APCs con péptidos 9D7, con lo que puede conducir a una activación eficiente de reacciones celulares inmunes contra tumores positivos 9D7 (Mayordomo y colaboradores, 1995; Zitvogel y colaboradores, 1996) . Un método apropiado para cargar péptidos sobre las células, por ejemplo, células dendríticas, se describe en WO 97/19169. En una modalidad de la invención, se usa una combinación de diversos péptidos 9D7 diferentes o equivalentes de péptidos 9D7. En otra modalidad, los péptidos 9D7 se combinan con péptidos derivados de otros TAAs. La elección de péptidos para tales combinaciones se hace a la luz de detectar diferentes tipos de MHC, con objeto de cubrir la población de pacientes más amplia posible y/o aspirar al espectro más amplio posible de indicaciones, al combinar péptidos de diversos antígenos de tumor diferente. El número de péptidos en una combinación farmacéutica, puede fluctuar en un amplio intervalo, pero típicamente una vacuna clínicamente utilizable contiene de 1 a 15, preferiblemente de 3 a 10 péptidos diferentes. Los péptidos de conformidad con la invención se pueden también usar como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, los péptidos se pueden usar para probar la respuesta de un paciente a la respuesta inmune humoral o celular producida por el péptido inmunogénico. Esto da la posibilidad de mejorar un procedimiento de tratamiento. Por ejemplo, dependiendo de la vía de administración del TAA (péptido, proteína total o vacuna ADN) , se pueden investigar el incremento de las células T del precursor en los PBLs, que muestran reactividad contra el epítope definido del péptido ( Robbins and Kawakami, 1996 y las referencias ahí citadas) . Además, los péptidos o proteína total o anticuerpos dirigidos contra el TAA, se pueden usar para predecir el riesgo de un paciente que cede a un tumor asociado 9D7 o para caracterizar la progresión de un tumor positivo 9D7 (por ejemplo, por análisis inmunohistoquímico de un tumor primario y metástasis) . Ya ha sido probada exitosamente una estrategia de este tipo en muchos casos, por ejemplo, detectando el receptor estrógeno como la base para decidir una terapia endocrina en cáncer de mama; el' c-erbB-2 como el marcador relevante en la prognosis y curso de terapia en el cáncer de mama (Raviaioli y colaboradores, 1998; Revillion y colaboradores, 1998); PSMA (antígeno de membrana especifico de la próstata) como un marcador para células epiteliales del carcinoma de la próstata en el suero, o por el uso de un anticuerpo monoclonal etiquetado con ?nIn, contra el PSMA en la inmunoescintigrafía sobre el carcinoma de próstata (Murphy y colaboradores, 1998 y referencias ahí incluidas) ; CEA (antígeno carcinoembriónico) como un marcador serológico para prognosis y progresión en pacientes que padecen de carcinoma colorectal (Jessup y Loda, 1998). De conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas aisladas de ADN que codifican una proteína, en las propiedades inmunogénicas de 9D7 o fragmentos del mismo. Preferiblemente, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ADN que contiene un polinucleótido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO. : 1 o que contiene un polinucleótido que se hibridiza con un polinucleótido de la secuencia mostrada en SEQ ID NO. : 1, bajo condiciones severas. Por "condiciones severas de hibridación" como se usa aquí, quiere decir la incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende: formamida al 50%, SSC 5x (lx SSC = 150 mM NaCl, citrato de trisodio 15mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano 10%, ADN de esperma de salmón fragmentada, desnaturalizada 20 µg/ml seguida por lavado de los filtros en SSC 0. lx alrededor de 65°C o condiciones equivalentes . La molécula de ADN de conformidad con la invención o fragmentos de la misma, codifica un polipéptido inmunogénico designado 9D7 con la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO. : 2 o los fragmentos de proteínas o péptidos derivados de los mismos; esto incluye moléculas de ADN que muestran desviaciones de la secuencia mostrada en SEQ ID NO. : 1 como resultado de la degeneración del código genético. La invención también se refiere a moléculas de ADN que tienen desviaciones de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO. : 1, provocadas por el intercambio conservador de aminoácidos, si codifican para un derivado o fragmentos o péptidos de 9D7 con las propiedades inmunogénicas que son deseables para su uso como vacunas para tumor. En comparación con las moléculas mostradas en la SEQ ID NO. : 1, las moléculas de ADN de conformidad con la invención se pueden extender en la terminación 5' hasta el codón de partida que se localiza opcionalmente en la dirección 5' de la posición 324. Las moléculas de ADN del 9D7 de la presente invención, o los ARNs correspondientes, que también son objeto de la presente invención se usan, como los péptidos codificados por ellos, para la inmunoterapia de enfermedades de cáncer. En una modalidad de la invención, se usan las moléculas de ADN que codifican el 9D7 natural. Alternativamente al cADN 9D7 natural o fragmentos del mismo, es posible usar derivados modificados. Estos comprenden secuencias con modificaciones que codifican una proteína (fragmento) o péptidos con mayor inmunogenicidad, mientras que las mismas consideraciones aplican para modificaciones al nivel ADN como aplican a los péptidos arriba descritos. Otro tipo de modificación es la alineación de diversas secuencias que codifican los péptidos inmunológicamente relevantes como un collar de perlas (Toes y colaboradores, 1997). Las secuencias se pueden también modificar por la adición de elementos auxiliares, por ejemplo, funciones, que aseguran la liberación más eficiente y el procesamiento del inmunógeno (Wu y colaboradores, 1995) . Por ejemplo, el procesamiento y por lo tanto la presentación y finalmente la inmunogenicidad del antígeno, se pueden incrementar por una secuencia de localización en el retículo endoplásmico ("secuencia objetivo ER") . En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula recombinante de ADN que contiene ADN-9D7. Las moléculas ADN de la presente invención, se pueden administrar, preferiblemente en forma recombinante como plásmidos, directamente o como parte de un virus recombinante o bacteria. En teoría, se puede usar cualquier método de terapia de genes para la inmunoterapia del cáncer con base en ADN ("vacuna ADN") sobre ADN-9D7, tanto in vivo y ex vivo. Ejemplos de la administración in vivo, son la inyección directa de ADN "desnudo", ya sea por vía intramuscular o usando una pistola de genes, que se ha demostrado que conduce a la formación de CTLs contra los antígenos de tumor. Ejemplos de organismos recombinantes son los virus de vacuna, adenovirus o monocitogenes de la listeria (un resumen se suministró por Coulie, 1997). Además, los portadores sintéticos de ácidos nucleicos tales como lípidos catiónicos, microesferas, micropeletizados o liposomas, se pueden usar para la administración in vivo de moléculas de ácido nucleico que codifican al péptido 9D7. Al igual que con los péptidos, se pueden también administrar adyuvantes diferentes que aumenten la respuesta inmune, por ejemplo, citoquinas, ya sea en forma de proteínas o plásmidos que las codifiquen. La aplicación se puede opcionalmente combinar con métodos físicos, por ejemplo electroforación. Un ejemplo de la administración ex vivo es la transfección de células dendríticas como se describe por Tuting, 1997, u otras APCs que se usan como vacunas celulares de cáncer. Así, de conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a uso de células que expresan 9D7, ya sea per se o, en una forma opcionalmente modificada, después de la transfección con la secuencia codificadora correspondiente, con objeto de producir una vacuna de cáncer. En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos contra el 9D7 o fragmentos de los mismos. Se obtienen convencionalmente anticuerpos policlonales al inmunizar animales, particularmente conejos, al inyectar el antígeno o fragmentos de los mismos y purificar posteriormente la inmunoglobulina.

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales anti-9D7, mediante procedimientos estándar siguiendo el procedimiento descrito por Kdhler y Milstein, 1975, al inmunizar animales, particularmente ratones, después inmortalizar las células que producen anticuerpos de los animales inmunizados, por ejemplo, por la fusión con células de mieloma, y separando por exclusión el sobrenadante de los hibridomas obtenidos por los ensayos inmunológicos estándar para los anticuerpos monoclonales anti-9D7. Para el uso terapéutico o diagnóstico en humanos, estos anticuerpos animales se pueden quimerizar opcionalmente en forma convencional (Neuberger y colaboradores, 1984, Boulianne y colaboradores, 1984) o humanizados (Riechmann y colaboradores, 1988, Graziano y colaboradores, 1995) . Los anticuerpos monoclonales humanos anti-9D7 (o fragmentos de los mismos) se pueden también obtener de las colecciones denominadas de despliegue de fagos (Winter y colaboradores, 1994, Griffiths y colaboradores, 1994, Kruif y colaboradores, 1995, Me Guiness y colaboradores, 1996) y por medio de animales transgénicos (Brüggemann y colaboradores, 1996, Jakobovits y colaboradores, 1995) .

Los anticuerpos anti-9D7 de conformidad con la invención, se pueden usar en análisis inmunohistoquímicos para propósitos de diagnóstico. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de anticuerpos específicos 9D7 para traer selectivamente cualquier sustancia ' deseada dentro de un tumor que expresa el 9D7. Ejemplos de tales sustancias, son los agentes citotóxicos o núclidos radioactivos la actividad de los cuales consiste en dañar al tumor in si tu . Debido a la expresión específica del tumor de 9D7, no se pueden esperar efectos laterales o son muy pocos. De conformidad con otro aspecto, se pueden usar sustancias que muestren tumores que expresan el 9D7, con la ayuda de anticuerpos 9D7. Esto es útil para el diagnóstico y evaluación del tratamiento. Los usos terapéuticos y de diagnóstico de los anticuerpos que aplican los anticuerpos anti-9D7, se describen en WO 95/33771. Debido a la expresión preferida del 9D7 en células de tumor, se puede suponer que esta proteína tiene una función importante en el tumor, por ejemplo para la formación del tumor, infiltración y crecimiento. El 9D7 (ADN) se puede por lo tanto emplear en ensayos de separación por exclusión para identificar sustancias, que modulan en particular y miden, la actividad de esta proteína. En una modalidad, un ensayo puede comprender la introducción de la proteína 9D7, o una fragmento activo de la misma dentro de células, que reaccionan a la actividad 9D7 por proliferación, o la expresión del ADN respectivo de 9D7 en la célula, y determinar la proliferación de las células en presencia o ausencia de una sustancia de prueba. Se pueden usar sustancias con un efecto inhibidor de la proliferación para el tratamiento de tumores con una expresión fuerte de 9D7, particularmente carcinoma renal, de células de pulmón, de colon y de mama y en linfoma de Hodgkin. Resumen de los dibujos Figura 1: Trascripción de 9D7 en tejidos normales y RCC: RT-PCR semicuantitativa de ARN para ríñones, corazón, leucocitos, hígado, pulmón, testículos y cuatro carcinomas de células de riñon. Figura 2: Transcripción de 9D7 en tejido normal: Análisis de manchado Northern de mARN a partir de 16 tejidos normales. Figura 3: Hibridación In si tu de ARN-9D7 con carcinoma de células de riñon y secciones normales del tejido de riñon. Figura 4: Detección de la expresión 9D7 en carcinoma de célula renal.

Ejemplo 1: RDA (Análisis de Diferencia de Representación) de un carcinoma de célula de riñon y tejido normal de riñon. Las biopsias de carcinomas humanos de célula de riñon del tipo de célula clara (RCC, carcinoma de célula renal) y tejido normal de riñon, del mismo paciente se congelaron de forma instantánea en N2 líquido inmediatamente después de la separación quirúrgica y se almacenaron a -80 °C. Para el aislamiento del ARN, se prepararon secciones en serie de 20 µm a -20°C en un criomicrotomo (Jung CM1800, Leica) y se disolvieron directamente en tiocianato de guanidino 4 M/ß-mercaptoetanol al 1%. Esta muestra se sometió a ultracentifugación sobre un gradiente de CsCl (Sambrook, 1989) . Partiendo de 60 µg del ARN total del carcinoma de célula de riñon RCC6, y 350 µg del ARN total del riñon autólogo normal N6, y otro tejido de riñon normal (N3), se llevó a cabo el RDA (Diatchenko y colaboradores,; Hubank y Schatz) usando el estuche de PCR-select™ (Clontech, Palo Alto) según las instrucciones del fabricante: el ARN del RCC (probador) y el tejido normal de riñon (conductor) se usó para aislar el poli-A (+) ARN usando el estuche polyATtract (Promega) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de la síntesis del cADN de hebra doble usando el oligo-dT, se digirió con Rsal. Se ligaron partes iguales del cADN probador con los adaptadores A o B y se hibridizaron separadamente con un exceso del cADN conductor a 65°C. Se combinaron después las dos mezclas y se sometieron a una segunda hibridación con el conductor fresco desnaturalizado de cADN. Los cADNs enriquecidos específicos del probador, se amplificaron después exponencialmente por PCR con los cebadores específicos para los adaptadores A o B. Para un enriquecimiento adicional, se sometió una alícuota de esta reacción a un segundo PCR con los cebadores específicos alojados internamente. El producto resultante de esta reacción, se ligó dentro del vector pCRII (Invitrogen) y se transfectó después en la E. coli competente (OneShot™, Invitrogen) . Se cultivaron 1920 transformantes positivos (selección azul-blanco) en bloques de 96 pozos en un medio LB-Amp durante 24-28 horas a 37°C. Se calentaron alícuotas de 200 µl de las suspensiones de E. coli a 100°C durante 10 minutos. Después de una centrifugación breve de los residuos bacterianos, se tomaron 140 µl del sobrenadante claro (alrededor de ~1 µg de ADN del plásmido) en 60 µl de 20xSSC y se inmovilizaron en membranas equilibradas de nylon (Hybond-N, Amersham) que corresponden a los métodos estándar para la producción de manchados de punto ADN (Sambrook, 1989) . Los cultivos bacterianos que permanecían se almacenaron como cultivos de origen de glicerina a -80°C. Una colección de sustracción de cADN se obtuvo de 1920 clones individuales que estaban presente como cultivos de origen de glicerina de E. coli y también como plásmidos inmovilizados sobre manchados de punto de ADN. Ejemplo 2: Selección de antígenos de tumor de testículos por hibridación de la colección de sustracción de cADN con una colección de cADN específica de testículos. Un cADN específico de testículos humanos por PCR-Select™ (Clontech, Palo Alto) se amplificó por 11 ciclos de PCR de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se etiquetaron alícuotas por el método de cebado aleatorio (HiPrime Kit, Boehringer Mannheim) con [a-32P]dCTP (NEN, Boston) y se hibridizaron por métodos estándar (Sambrook, 1989) bajo condiciones severas (65°C) con manchados de punto ADN descritos en el ejemplo 1. Los clones que se hibridizan con cADN específico de testículos humanos por PCR-Select™, se visualizaron por medio de autoradiografía estándar (película Xomat DR, Kodak) . El resultado del ejemplo 2 hizo posible seleccionar 150 clones que son predominantemente transcritos en el carcinoma de célula de riñon RCC6 y en testículos. Estos clones son candidatos para el tipo de antígenos de tumor de testículos. Ejemplo 3: Formación de secuencias de ADN y anotación de los candidatos de antígenos de tumor de testículos. El ADN del plásmido de 62 clones que había sido seleccionado sobre la base de los resultados obtenidos en el ejemplo 2, se aisló de conformidad con las instrucciones del fabricante (QIAgen) y formo secuencias por el método Sanger en un aparato ABI-prisma. Las secuencias así determinadas se anotaron usando un paquete de cómputo BioWorkBench (GeneData, Basle) y se sometieron a comparaciones de banco de datos (Genbank) . Esto hizo posible la identificación de 33 genes conocidos y 29 desconocidos. Para los últimos solamente había entradas EST. Los genes conocidos no se trataron adicionalmente. Para los 29 genes desconocidos, se evalúo el perfil de expresión: para todas las ESTs en bancos de datos con >95% de identidad (BLAST) con la secuencia experimentalmente determinada, el tejido de partida se verificó para la colección correspondiente de cADN. Se llevó a cabo la subdivisión en i) tejido normal crítico, ii) fetal, "desechable" y tejido inmunoprivilegiado y iii) tumores y líneas de célula. Sobre la base de este "perfil virtual de mARN", se seleccionaron para análisis experimental adicional 16 clones para los cuales no se encontraron ESTs en el grupo i) . Ejemplo 4: Análisis transcripcional de los clones candidato en el carcinoma de célula de riñon y riñon normal. Entre 2 y 5 µg del ARN total de tejido de tumor o normal, se trascribieron de forma inversa por medio del SuperscriptII (Gibco) o AMV-RT (Promega) según las recomendaciones del fabricante. Para cada sonda individual de ARN, se corrió un segundo lote sin transcriptasa inversa como control para la contaminación del ADN cromosomal. Alternativamente, se usaron colecciones de cADN de plásmidos del corazón humano, leucocitos, riñon, hígado, pulmón y testículos (Gibco) . La calidad y cantidad de los cADNs se verificó por PCR con cebadores específicos de la ß-actina (SEQ ID NO. : 29 y 30) después de 20, 25 y 30 ciclos (40'' a 94°C, 45'' a 55°C, 1'30" a 72°C, del ciclo 11 con 30" a 55°C y una extensión de 3'' a 55 °C en cada ciclo adicional. El cADN de 9D7 se amplificó por 30 ciclos del mismo programa con los cebadores específicos de 9D7 de conformidad con los SEQ ID NO.: 3 y 4. Los otros 15 clones candidatos, se investigaron de forma análoga con cebadores específicos. Los productos de PCR se detectaron por electroforesis con gel de agarosa y teñido con bromuro de etidio. Para 5 de los 16 clones examinados, se pudo detectar una sobreexpresión clara por RT-PCR en el carcinoma de célula de riñon RCC6 en comparación con el tejido autólogo normal de riñon N6. La presencia de cADN de testículos se examinó como un control positivo adicional para todos los clones . Ejemplo 5: Comparación cuantitativa de la expresión de mARN de 9D7 entre los tejidos de tumores y normales. Se transcribieron de forma inversa acumulados de 9µg de ARN total de tres tejidos normales o de tumor, después de pretratamiento con Dnasa I (Boehringer Mannheim) y una extracción posterior con fenol usando oligo dT y AMV-RT (Promega) . El número de copias de CADN-9D7 o de gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa-cADN (GAPDH) como una referencia para la cantidad y calidad del cADN completo, se cuantificó usando un ensayo PCR con 5'-nucleasa (TaqMan PCR, PE Aplied Biosystems) . Los cebadores o sondas etiquetadas TaqMan para la cuantificación de cADN consistieron de los cebadores de conformidad con la SEQ ID NO. : 3 y 4 y SEQ ID NO. : 31 (etiquetados en la terminación 5' con 6-carboxi-fluorosceína y en la terminación 3' con 6-carboxi-tetrametil-rodamina) o para GAPDH, los cebadores según la SEQ ID NO. : 25 y 26 y las sondas según la SEQ ID NO. : 32 (etiquetada en la terminación 5' con tetracloro-6-carboxi-fluorosceína y en la terminación 3' con 6-carboxi-tetrametil-rodamina) . El PCR (40 ciclos {15'' a 95°C, 1' a 60°C} para el 9D7 o 40 ciclos {15" a 95°C, 1' a 66°C} para GAPDH) en la medición de fluorescencia en línea, se llevó a cabo usando un sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems) . El ejemplo 5 muestra que el 9D7 se transcribe en los acumulados de carcinoma de célula de riñon y carcinomas de pulmón (SCC) alrededor de 1.5 a 6.5 veces más intensamente que con el GAPDH. En otro tipos de tumor, la velocidad de trascripción fluctúa entre 0.25 y 0.6 veces el valor de GAPDH. EL hígado y testículos normales muestran un valor de alrededor 10% de la transcripción de GAPDH, mientras que los otros tejidos normales investigados no mostraron virtualmente transcripción de 9D7 (Tabla 1) . Ejemplo 6: Perfil de expresión de 9D7 en tejido de tumor y normal. Uno de los 15 candidatos (designado 9D7) mostró una transcripción poderosa por RT-PCR, en todos los carcinomas de célula de riñon probados y en diversos otros tipos de tumor. En la mayoría de los tejidos normales sin embargo, no se pudo encontrar transcripción. La figura 1 muestra una comparación entre cuatro ríñones normales (NI, 2, 4, 5) y cuatro carcinomas de célula de riñon (RCC1, 2, 3, 6); también en esta prueba, se probaron cADN de músculo del corazón (he) , leucocitos (leu), riñon (ki), hígado (li), pulmón (lu) y testículos (tes) y se llevó a cabo un control con cebadores de ß-actina. Estos resultados se confirmaron en experimentos independientes con tres diferentes pares de cebadores (SEQ ID NO.: 3 y 4, SEQ ID NO.: 5 y 10 y SEQ ID NO.: 11 y 15) . Para el análisis de manchado Northern, se hibridizaron manchados Northern de tejidos humanos múltiples (Clontech, Palo Alto) con el [a-32P]dCTP (NEN, Boston) etiquetado 170 bp con producto de PCR 9D7 a 65°C durante 16 horas. La visualización se obtuvo por autoradiografías estándar (película Xo at AR, Kodak) . La figura 2 muestra los resultados de este análisis: de 16 tejidos normales (1: leucocitos, 2: colón, 3: intestino delgado, 4: ovarios, 5: testículos, 6: próstata, 7: timo, 8: bazo, 9: páncreas, 10: riñon, 11: músculo esquelético, 12: hígado, 13: pulmón, 14: placenta, 15: cerebro, 16: músculo del corazón) , solamente en el músculo del corazón hubo un transcripto de alrededor de -2.2 kb en tamaño. La baja intensidad de la señal sin embargo, hace que parezca improbable la expresión inmunológicamente relevante.

Los resultados de todos los experimentos con relación al perfil de mARN de 9D7 (compilados a partir de RT-PCR, RT-PCR cuantitativo y análisis de manchado Northern) se muestran en la tabla 2. El ejemplo 6 muestra que el 9D7 se transcribe fuertemente en un alto porcentaje de tumores o indicaciones diversas, mientras que no se encuentra o es muy poca la transcripción en cualquiera de los tejidos normales investigados. Ejemplo 7: Hibridación in si tu de una sonda de ARN específica de 9D7 con carcinomas de células de riñon y tejido normal de riñon. Un fragmento Notl de 280 bp con información de secuencias de 220 bp del 9D7, se subclonó en pBluescript y se usó posteriormente para transformar el DH5-a de E. coli competente. Las sondas de ARN se sintetizaron por transcripción in vi tro con polimerasa de ARN-T3 y T7 (sentido: Sac I, T2; antisentido: BamH I, T7) con la adición de Digoxigenina-UTP según las recomendaciones del fabricante (estuche de etiquetado de ARN DIG, Boehringer Mannheim) . Después de la purificación de los transcriptos (columnas de rotación rápida Sephadex G50, Boehringer Mannheim) se determinó la eficiencia de etiquetado por manchado de puntos. Se llevó a cabo la hibridación in si tu usando procedimientos estándar (Boehringer Mannheim, Manual de Aplicación de Hibridación in si tu No Radiactiva, 1996) : se desnaturalizaron secciones congeladas de 5 µm después de fijarlas con paraformaldehido, acetilación y de- o re- idratación y se hibridizaron durante la noche a 52°C en una cámara húmeda. Después de las etapas usuales de lavado, se saturaron los sitios no específicos de enlace de proteínas durante 15 minutos con FCS al 10% y suero de cabra al 3% (DAKO) . La visualización de la sonda hibridizada con mARN-9D7, se alcanzó a incubar con un conjugado a-DIG-AP junto con NBT/BCIP (Boehringer Mannheim) , desarrollado a 4°C en la obscuridad. La figura 3 muestra los resultados de la hibridación in si tu del carcinoma de célula de riñon o tejido de riñon normal con una sonda de ARN etiquetada con digoxigenina-UTP específica del 9D7 (antisentido) : el tejido de tumor muestra un teñido fuerte homogéneo, mientras que el tejido normal no reacciona; la especificidad del teñido se muestra por el control negativo (sentido) . El ejemplo 7 muestra que el 9D7 se transcribe en células de tumor de los tejidos de carcinoma de célula de riñon, pero no en algún tipo de célula del tejido normal de riñon y se confirman así los resultados descritos en los ejemplos 4 al 6.

Ejemplo 8: Con objeto de detectar la expresión de la proteína 9D7, se generaron anticuerpos específicos 9D7 en el conejo. El péptido designado 9D7-3aa con la secuencia DAEERAEAKKKFRNLTRKTES (SEQ ID NO: 59) se usó para inmunización, el suero obtenido se purificó por afinidad con el péptido 9D7-3aa. Para verificar la reactividad específica del suero 9D7-3aa, la estructura completa de lectura de 9D7 se expresó transitoriamente como una proteína de fusión GFP en células COS, y las células transfectadas se probaron con el suero 9D7-3aa en un manchado Western. El suero reaccionó claramente con la proteína de fusión expresada de forma eucariótica. Posteriormente, 18 diferentes carcinomas de célula renal se analizaron inmunohistoquímicamente para la expresión del 9D7 con el suero 9D7-3aa. La expresión en las células de tumor se pudo detectar en 15 casos, mientras que la expresión de 9D7 no fue detectable en el estroma de tumor. Los ejemplos se muestran en la figura 4. Ejemplo 9: Clonación de 9D7. El clon 9D7, tiene un inserto de 221 pares base de longitud de un gen humano desconocido, entre los adaptadores introducidos por la RDA. Las comparaciones de banco de datos muestran homologías del 9D7 con el SM20 de la rata, con 69 pares base de la región codificadora de la terminal C (correspondiente a 23 aminoácidos) , el codón de detención y 149 pares base de la región no traducida 3' del SM20, que corresponden a 221 bp de 9D7 en la orientación antisentido. Los 23 aminoácidos muestran solamente 2 intercambios entre la secuencia de la rata y el humano. El SM20 ha sido descrito como un gen temprano inmediato inducido por factores de crecimiento y un marcador específico para células del músculo liso de la aorta (Wax et al., 1994; Wax et al., 1996). Con objeto de clonar completamente la secuencia humana, se llevó a cabo el siguiente procedimiento: un análisis UniGene (National Centre for Biotechnology Information) , resultaron las siguientes ESTs que son homologas al 9D7: AA234127, AA233899, AA917421, AA878927. El ARN total de las líneas de célula de tumor 786-0 (ATCC# CRL-1932) o A549 (ATCC# CCL 185) se aislaron usando TRIzol (Gibco) y se transcribieron de forma inversa con Superscript II MMLV-RT (Gibco) y un cebador oligo-dt-adaptador (SEQ ID NO:27) según las instrucciones del fabricante. La amplificación PCR de este cADN con los cebadores según la SEQ ID NOS: 5, 6, 7 y 10, resultó en los fragmentos esperados de conformidad con la secuencias homologas, con los cebadores originales (SEQ ID NOS : 3 y 4) y uno con el otro. El fragmento más largo de 804 bp se obtuvo al combinar los cebadores según la SEQ ID NO: 10 y 5. Los cebadores de la secuencia SEQ ID NO: 8 y 9, se localizan en un intervalo de secuencias de EST-AA234127 que no muestra homología con el SM-20 y no resultó consecuentemente en un producto de amplificación con cualquiera de los otros cebadores. Clonación de la terminación 3' : 10 µg de ARN total de una línea de célula de carcinoma de célula de riñon 786-0, se transcribió de forma inversa y una alícuota de este cADN se sometió a PCR, el programa del cual comienza con temperaturas elevadas de cocimiento de manera que solamente el cebador específico del gen se enlaza al cADN (Tm~93°C, SEQ ID NO:22), mientras que el segundo cebador ( (Tm~53°C, SEQ ID NO:28) solamente se enlaza al ADN recientemente sintetizado a una temperatura más baja. Este PCR denominado de derribamiento (Mastercycler Gradient, Eppendorf) se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 20 ciclos {15'' a 95°C, 30'' a 80°C (reducido por 1°C por cada ciclo), 2' a 72°C} y 20 cilos de {15" a 95°C, 30" a 50°C, 2' a 72°C}. Clonación de la terminación 5' : 1 µg del ARN total de una línea celular de carcinoma de células de riñon 786-0, se transcribió de forma inversa de conformidad con un procedimiento modificado SMART™ (estuche de síntesis cADN PCR SMAR™, Clontech) usando los cebadores SEQ ID N0:4 y SMART-II (SEQ ID NO:23): El cADN se sintetizó con el cebador específico 9D7 según la SEQ ID NO: 4 y con la adición de Rnasin (Promega) . El cebador específico 9D7 según la SEQ ID NO: 11, se usó en una concentración final de 0.4 µM y el cebador SMART-PCR (SEQ ID NO: 24) con 0.1 µM. Se llevó a cabo la amplificación con PCR con 40 ciclos de (15" a 95°C, 30" a 65°C y 2' a 72°C) . Se ligaron las alícuotas de los lotes de PCR directamente dentro del pCR2.1 (Invitrogen) y después se transformaron en la E. coli competente (OneShot™, Invitrogen) . Se formaron en secuencia los clones positivos por selección azul-blanco. La formación de secuencias resultó en 50 nucleótidos adicionales que correspondieron a la EST-AA878927, hasta la terminación 3' confirmada y después 870 nucleótidos adicionales a la terminación 5' confirmada hasta entonces. La amplificación PCR del cADN de líneas de células de tumor (786-0, A549) y las biopsias de tejido de carcinoma de célula de riñon con los cebadores según la SEQ ID NO: 14 a 21, resultaron en los fragmentos esperados después de la clonación, con los cebadores originales y con otro más. La identidad de todos los productos de PCR se verificó por formación de secuencias. Durante la formación de secuencias, se identificaron diversos clones con o sin un exón de 282 bp (Pos. 399-680) . La presencia de dos variantes divididas se muestra por RT-PCR con los cebadores según la SEQ ID NO: 11 y 15 o 13, en diversas sondas de tumor (carcinoma de célula de riñon, carcinoma de pulmón/SCC, carcinoma de colon/AC) . Ejemplo 10 Péptidos potenciales de enlace NHC en la región codificadora de 9D7. Los epítopes de péptidos potenciales dentro de las regiones de codificación de 9D7 de conformidad con SEQ ID NO: 2, se llevaron a cabo usando los algoritmos descritos por Parker et al., 1994, sobre la base de porciones conocidas (Rammensee et al., 1995). Para los tipos más importantes de HLA, particularmente para HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 y -B*4403, se identificaron péptidos candidato que se podía esperar enlazaran a las moléculas correspondientes de HLA y ser por lo tanto epítopes inmunogénicos CTL; los péptidos encontrados se enlistan en la tabla 3. Al usar métodos análogos, se pueden encontrar otros epítopes de páptidos potenciales para otros tipos de HLA. Tabla 1 Transcripción del 9D7 en tejido normal y de tumor en relación con el GAPDH Tabla 2: Perfil de expresión de mARN de 9D7 Tabla 3 Candidatos inmunogénicos del péptido 9D7 Literatura Becker, D., Kuhn, U. 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Claims (20)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un antígeno asociado a un tumor titulado 9D7, caracterizado porque' tiene la secuencia de aminoácido definida en SEQ ID NO: 2.
2. 2. Un polipéptido, caracterizado porque contiene la secuencia definida SEQ ID NO: 2 como una secuencia parcial.
3. 3. Un fragmento o péptido inmunogénico de proteína, caracterizado porque se deriva de un antígeno asociado al tumor definido en la reivindicación 1.
4. 4. Un polipéptido inmunogénico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque dispara una respuesta inmune humoral .
5. 5. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque en él o en sus productos de rompimiento, se presentan moléculas MHC y disparan una respuesta celular inmune.
6. 6. El péptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se selecciona del grupo de péptidos de conformidad con la SEQ ID NOS: 34 a 58.
7. 7. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, para inmunoterapia de enfermedades de cáncer in vivo o ex vivo, caracterizado porque el polipéptido induce una respuesta inmune contra células de tumor en el paciente que expresa el 9D7.
8. 8. Una composición farmacéutica para administración parenteral, tópica, oral o local, caracterizada porque contiene como componente activo uno o mas polipéptidos inmunogénicos de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a la 6.
9. 9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque contiene diversos péptidos inmunogénicos derivados del 9D7.
10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque contiene uno o más péptidos derivados del 9D7 mezclados con péptidos derivados de otros antigenos asociados al tumor.
11. 11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque los péptidos se enlazan a al menos dos tipos diferentes de HLA.
12. 12. Una molécula aislada de ADN caracterizada porque codifica a una proteína con las propiedades inmunogénicas del antígeno asociado al tumor definido en la reivindicación 1 o para fragmentos del mismo.
13. 13. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque codifica un polipéptido inmunogénico designado 9D7, con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o para fragmentos o péptidos de proteínas derivados de los mismos.
14. 14. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque es o contiene un polinucleótido con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:l, o porque contiene un polinucleótido que se hibridiza con un polinucleótido de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:l bajo condiciones severas.
15. 15. Una molécula recombinante de ADN caracterizada porque contiene una molécula de ADN de conformidad con una de las reivindicaciones 12 a 14.
16. 16. Una molécula de ADN de conformidad con una de las reivindicaciones 12 a 15, para inmunoterapia de cánceres, caracterizada porque el polipéptido 9D7 expresado por la molécula de ADN, induce una respuesta inmune contra células de tumor en el paciente que expresa 9D7.
17. 17. El uso de células que expresan el antígeno asociado al tumor definido en la reivindicación 1 o 2, para la preparación de una vacuna para el cáncer.
18. 18. Un anticuerpo contra un polipéptido caracterizado porque se define en una de las reivindicaciones 1 a la 6.
19. 19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es monoclonal.
20. 20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque se usa para el tratamiento y diagnostico de cánceres asociados con la expresión del 9D7.