WO2000066727A9 - Tumorassoziiertes antigen - Google Patents

Tumorassoziiertes antigen

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Guenther Adolf
Karl-Heinz Heider
Wolfgang Sommergruber
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Boehringer Ingelheim Int
Guenther Adolf
Karl-Heinz Heider
Wolfgang Sommergruber
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the invention relates to the immunotherapy of tumor diseases.
  • the immune system's task is to protect the organism from a variety of different microorganisms or to actively combat them.
  • the importance of an intact immune system is particularly evident in inherited or acquired immunodeficiencies.
  • the use of prophylactic vaccine programs has proven to be an extremely effective and successful immunological intervention in the fight against viral or bacterial infectious diseases.
  • the immune system is also significantly involved in the elimination of tumor cells.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • Stimulation of an immunological response leads to act as a tumor antigen in the unogenous.
  • those tumor antigens that not only cause an immunological reaction, but also cause rejection of the tumor.
  • the identification of defined antigens that can cause such an immunological reaction is an important step in the development of a molecularly defined tumor vaccine.
  • T-lymphocytes (CTLs) play a major role (Coulie,
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • PBMC peripheral mononuclear blood cells
  • TAA tumor associated antigens
  • CD8-positive CTLs are recognized, a stated main goal on the way to the development of a tumor vaccine (Pardoll, 1998; Robbins and Kawakami, 1996). It is still unclear whether other cell types of the immune system such as CD4 + T helper cells also play an important role; some studies with MAGE-3 / HLA-A1 peptides in melano patients suggest this (Marchand et al., 1995; Boon et al., 1998). A number of TAAs recognized by CTLs have been identified in recent years (Boon et al., 1994; van den Eynde and van der Bruggen, 1997).
  • MHC-I molecules MHC-I molecules occur on most cells with a nucleus and present peptides (usually 8-10 mers) , which result from proteolytic degradation of endogenous proteins (so-called antigen processing, "antigen processing").
  • Peptide MHC-I complexes are recognized by CD8-positive CTLs. MHC-II molecules only come on so-called
  • MHC-II complexes are recognized by CD4 helper T cells
  • MHC complex can trigger various effector mechanisms that lead to apoptosis of the target cell in the case of CTLs, either when the MHC (eg in the case of transplant rejection) or the peptide (eg in the case of intracellular) Pathogens) is recognized as foreign, however, not all of the peptides presented meet the structural and functional requirements for effective interaction with T cells (as described by Rammenee et al., 1995 and below).
  • the antigen can either be used as a recombinant protein with suitable adjuvants or carrier systems, or as a cDNA coding for the antigen in plasmid (DNA vaccine; Tighe et al., 1998) , or viral vectors (Restifo, 1997) are applied.
  • DNA vaccine Tighe et al., 1998)
  • viral vectors Restifo, 1997) are applied.
  • Another possibility is the use of recombinant bacteria (eg Listeria, Salmonella), which recombinantly express the human antigen and which have an adjuvative effect due to their additional components (Paterson, 1996; Pardoll, 1998). In all of these cases, processing and presentation of the antigen by so-called "professional antigen-presenting cells" (APC) is necessary.
  • APC professional antigen-presenting cells
  • Antigens or their epitopes include molecules that can originate from all protein classes (eg transcription factors, receptors, enzymes; for an overview see Rammenee et al., 1995; Robbins and Kawakami, 1996). These proteins do not necessarily have to be located on the cell surface, as is the case with detection by antibodies is required. In order to function as a tumor-specific antigen for recognition by CTLs or to be used for therapy, the proteins must meet certain conditions: firstly, the antigen should be expressed mainly by tumor cells and not or only to a lesser extent in so-called "critical" normal tissues Concentration than in tumors. Critical normal tissues are essential tissues; an immune reaction directed against them could have serious, sometimes lethal consequences.
  • the antigen is said to be present not only in the primary tumor, but also in the metastases. Furthermore, in view of a wide clinical use of the antigen, it is desirable if it is present in high concentration in several types of tumor.
  • Another prerequisite for the suitability of a TAA as an effective component of a vaccine is the presence of T cell epitopes in the amino acid sequence of the antigen; Peptides derived from TAA are said to lead to an in vitro / in vivo T cell response ("immunogenic" peptide).
  • Another selection criterion for a clinically widely applicable immunogenic peptide is the frequency with which the antigen is found in a given patient population.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • viral proteins viral proteins
  • mutated proteins overexpressed proteins
  • fusion proteins formed by chromosomal translocation fusion proteins formed by chromosomal translocation
  • differentiation antigens oncofetal antigens (Van den Eynde and Brichard, 1995; van den Eynde and van der Bruggen, 1997).
  • TAAs which represent the starting point for the development of a tumor vaccine
  • CTLs cellular immune response
  • antibodies humor immune response
  • differential transcription profiles between tumors and normal tissues are based on the one hand on the use of CTLs (cellular immune response) or antibodies (humoral immune response) that have already been induced in patients, or are based on the creation of differential transcription profiles between tumors and normal tissues.
  • patient CTLs are used for screening eukaryotic tumor cDNA expression libraries which present the CTL epitopes via MHC-I molecules (Boon et al., 1994), while using high-affinity patient antisera prokaryotic cDNA expression libraries can be examined directly for the presence of TAAs via an immunoblot analysis of the individual plaques (Sahin et al., 1995).
  • a combination of CTL reactivity and protein chemical methods represents the isolation of peptides isolated from MHC-I from tumor cells which have been preselected for reactivity with patient CTLs.
  • the peptides are washed out of the MHC-I complex and identified using mass spectrometry (Falk et al., 1991; Woelfel et al., 1994; Cox et al., 1994).
  • the approaches that use CTLs to characterize antigens are associated with considerable effort or not always successful due to the required cultivation and activation of CTLs.
  • TAAs which are based on the comparison of the transcription profile of normal with tumor tissue
  • these include differential hybridization, the creation of subtraction cDNA banks ("representational difference analysis”; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) and the use of DNA chip technology or the SAGE method (Velculescu et al., 1995).
  • the use of molecular biological methods must show that the potential antigen candidates found with them are tumor-specific (tumor-associated) and actually have T-cell epitopes that can trigger a cytotoxic T-cell response , In at least one case
  • the object of the present invention was to provide a new tumor-associated antigen (TAA).
  • RDA representational difference analysis
  • the human B99 CDNA was cloned, the sequence obtained is shown in SEQ ID NO: 1. Sequence analysis of the cloned human B99 cDNA showed that from position 427 to position 1743 there is a continuous open reading frame which, at the nucleotide and protein level, has a high identity with the open reading frame of beta-1,3-galactosyl-o-glycosyl -Glycoprotein beta-1, 6-n-
  • Acetyglucosaminyltransferase possesses. It can be concluded from the data obtained from Northern blot experiments that the B99 transcript is approx.
  • the cloned region of the B99 cDNA is 2216 bp, with the presence of a polyA tail at the 3 'end of the sequence speaks for the completeness of the cDNA in this area.
  • the difference in the size of the cloned B99 cDNA compared to the size derived from the Northern blot analysis can be explained by the presence of a polyA tail of unknown length and an additional sequence in the 5 'untranslated region of B99. Due to the fact that there is no continuous reading frame in the 5 'region of the cloned cDNA from position 0 to 427, it can be concluded that the ATG at position 427 is the start codon of B99.
  • RNA preferably mRNA
  • RNA is reverse transcribed from cells or tissues in which B99 is transcribed (eg colon carcinoma tissue or cell lines derived from lung adenocarcinoma such as A549) and then ligated with an adapter of known sequence, PCR with an adapter primer (binds specifically to the adapter at the 5 'end of the cDNA) and a B99-specific primer (eg SEQ ID NO: 8, 10, 11) allows the corresponding amplification B99 fragments: As described in Example 1, these PCR products can be cloned by standard methods and characterized, in particular by DNA sequencing.
  • 5 ' end is the screening of cDNA libraries Hybridization with DNA probes or antisera specific for B99.
  • RNA can be examined in genomic libraries by, for example, as in the screening of cDNA libraries, by cloning by cloning with DNA probes specific for B99 to isolate the clones upstream from the obtained 5 'end of the cDNA lying sequence information eg contain the promoter region of B99.
  • the isolated cDNA codes for the tumor-associated antigen (TAA) of the designation B99 with the amino acid sequence given in SEQ ID N0: 2 (B99-1).
  • TAA tumor-associated antigen
  • the sequence of B99-1 is defined by the start codon at position 427 of the isolated B99 CDNA.
  • the cDNA isolated from A549 cells a nucleotide exchange at position 622 compared to sequence SEQ ID N0: 1.
  • This nucleotide exchange requires replacement of arginine (SEQ ID NO: 2, B99-1) by tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2) at position No. 66.
  • the amino acid sequence from B99-2 up to and including position 166 is identical to B99-1.
  • a protein expressed by a cDNA with this reading frame has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (B99-3).
  • the sequence of B99-3 differs from items 1 to 27 to B99-1 and from item 28 is identical to B99-1.
  • the invention thus relates in a first aspect to a tumor-associated antigen of the designation B99, selected from the group of polypeptides with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 (B99-1), SEQ ID NO: 4 (B99-2) and SEQ ID NO: 6 (B99-3) can have deviations, for example those which are caused by the exchange of amino acids if the B99 derivative has the immunogenic properties desired for use in a tumor vaccine.
  • SEQ ID NO: 2 B99-1
  • SEQ ID NO: 4 B99-2
  • SEQ ID NO: 6 B99-3
  • the natural amino acid sequence of B99 (or correspondingly the sequences of the B99 cDNA) can optionally be modified by exchanging individual amino acids in a B99 CTL epitope in order to increase the affinity of B99 compared to the natural B99 CTL epitope -Peptides to MHC-I molecules and thus an increased immunogenicity and ultimately an increased reactivity to tumors.
  • Modifications in the area of the B99 epitopes can be carried out on the total B99 protein (this is processed by the APCs into the corresponding peptides) or on larger B99 protein fragments or on B99 peptides (see below).
  • the present invention relates to immunogenic fragments and peptides derived from B99.
  • B99 peptides The latter are referred to below as "B99 peptides”.
  • a first group are
  • B99 peptides that trigger a humoral immune response are selected sections of B99 (at least 12 to 15 amino acids), which by means of so-called prediction algorithms ("prediction algorithms") such as the surface probability blot “(Emini et al., 1985), the” hydrophobicity blot “(Kyte and Doolittle, 1982) and the "antigenic index” (Jameson and Wolf, 1988).
  • prediction algorithms such as the surface probability blot "(Emini et al., 1985), the” hydrophobicity blot “(Kyte and Doolittle, 1982) and the "antigenic index” (Jameson and Wolf, 1988).
  • prediction algorithms such as the surface probability blot "(Emini et al., 1985), the” hydrophobicity blot “(Kyte and Doolittle, 1982) and the "antigenic index” (Jameson and Wolf, 1988).
  • tumor-associated antigens can have tumor-specific mutations that contribute to an immunological differentiation between tumor and normal
  • the B99 cDNA is expediently cloned from one or more different tumors with the aid of probes from the isolated cDNA according to the invention and the sequences obtained are compared with normal tissue B99 cDNA. It is to be expected that tumor B99 peptides from a sequence section mutated compared to normal tissue B99 have an increased immunogenicity compared to normal tissue B99 peptides from the corresponding section.
  • Invention thus relates in a further aspect B99- peptides derived from regions of a tumor discourse appearing in a further aspect.
  • the regions of B99-2 and B99-3 that differ from B99-1 deserve special interest. Provided that the insertion of the B99 DNA, which leads to these differences in the amino acid sequence, is a tumor-specific one
  • peptides from this area have an increased immunogenicity compared to peptides from B99-1.
  • antibodies against this area can be generated and tumor cells can be examined for expression of B99-2 and B99-3.
  • B99- ⁇ Peptides are those that are presented by MHC molecules and cause a cellular immune response.
  • MHC molecules There are two classes of MHC molecules, namely MHC-I molecules that are recognized by CD8-positive CTLs and MHC-II molecules that are recognized by CD4-positive T helper cells.
  • a peptide In order for a peptide to trigger a cellular immune response, it must bind to an MHC molecule, and the patient to be treated must have the MHC molecule in its repertoire.
  • the determination of the patient's MHC subtype thus represents one of the essential prerequisites for the effective application of a peptide to this patient with regard to triggering a cellular immune response.
  • the sequence of a B99 peptide to be used therapeutically is predetermined by the respective MHC molecule with regard to anchor amino acids and length. Defined anchor positions and lengths ensure that a peptide fits into the peptide binding groove of the patient's respective MHC molecule. As a result, the immune system is stimulated and a cellular immune response is generated which, in the case of using a peptide derived from a tumor antigen, is directed against the patient's tumor cells.
  • Immunogenic B99 peptides can be identified by known methods, one of the bases for this is the relationship between MHC binding and CTL induction.
  • B99 peptides that represent CTL epitopes are identified and synthesized based on the B99 protein sequence.
  • Various methods are suitable for this, which have been used to identify CTL epitopes of known protein antigens; e.g. the method described by Stauss et al., 1992, for the identification of T cell epitopes in human papillomavirus.
  • the peptide candidates can also be examined for non-anchor residues which have a negative or positive effect on the binding or which make this possible (Ruppert et al., 1993). With this approach, however, it should be considered that the peptide binding motif is not the only decisive factor in the search for natural ligands; other aspects, e.g. the enzyme specificity during antigen processing, in addition to the specificity of the MHC binding, contribute to the identity of the ligand.
  • the peptides can also be selected for their ability to bind to MHC-II molecules.
  • Amino acids has a higher degree of degeneration in the anchor positions than the MHC-I Binding motif.
  • Methods have recently been developed, based on the X-ray structure analysis of MHC-II molecules, which allow the precise analysis of the MHC-II binding motifs, and on the basis thereof, variations of the peptide sequence (Rammenee et al., 1995, and the original literature cited therein ).
  • Peptides that bind to MHC-II molecules are typically presented to CD4-T cells by dendritic cells, macrophages or B cells. The CD4-T cells in turn then directly activate CTLs by, for example
  • APC dendritic cells, macrophages and B cells
  • Binding properties determined (stability of the peptide-MHC interaction correlates in most cases with immunogenicity; van der Burg et al., 1996). To determine the immunogenicity of the selected peptide or peptide
  • Heteroclitic peptides They can be obtained by the following methods:
  • the length of the peptide in the case of its adaptation to MHC-I molecules preferably corresponds to a minimum sequence of 8 to 10 amino acids with the required anchor amino acids.
  • the peptide can also be extended at the C- and / or at the N-terminus, provided that this extension does not impair the ability to bind to the MHC molecule or the extended peptide can be processed cellularly for the minimal sequence.
  • TILs tumor-infiltrating lymphocytes
  • CTL induction for CTL induction
  • MHC binding and immunogenicity as described by Parkhurst et al., 1996, and Becker et al., 1997, described.
  • Another method suitable for the purposes of the present invention for finding peptides with greater immunogenicity than that of the natural B99 peptides is to screen peptide libraries with CTLs which recognize the naturally occurring B99 peptides on tumors, as described by Blake et al. , 1996, described; in this context, the use of combinatorial peptide libraries is proposed to design molecules that mimic tumor epitopes recognized by MHC-I restricted CTLs.
  • the B99 polypeptides of the present invention or immunogenic fragments or peptides derived therefrom can be produced recombinantly or by means of peptide synthesis, as described in WO 96/10413, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the corresponding DNA molecule is inserted into an expression vector according to standard methods, transfected into a suitable host cell, the host is cultivated under suitable expression conditions and the protein is purified.
  • Conventional methods can be used for the chemical synthesis of B99 peptides, e.g. commercially available automatic peptide synthesizers.
  • B99 peptides or heteroclitic peptides substances which simulate such peptides, for example "peptido imetica” or “retro-inverse peptides", can be used. The same methods are used to test these molecules with regard to their therapeutic utility in a tumor vaccine as for the natural B99 peptides or B99 peptide equivalents.
  • the TAA of the designation B99 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, for example to induce an immune response against tumor cells which express the corresponding antigen determinants. They are preferably used for the therapy of B99-positive tumors, in particular in renal cell, lung, colon, pancreas, breast and stomach carcinoma.
  • the immune response in the form of induction of CTLs can be brought about in vivo or ex vivo.
  • a pharmaceutical composition containing the active component TAA B99 or fragments or peptide (s) derived therefrom is administered to a patient suffering from a tumor disease associated with the TAA, the amount of TAA ( Peptide) must be sufficient to achieve an effective CTL response to the antigen-bearing tumor.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical composition for parenteral, topical, oral or local administration.
  • the composition is preferably used for parenteral administration, for example for subcutaneous, intradermal or intramuscular use.
  • the B99 TAAs / peptides are dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable, preferably aqueous, vehicle.
  • the composition can also contain customary auxiliaries, such as buffers, etc.
  • the TAAs / peptides can be used alone or in combination with adjuvants, for example incomplete Freund's adjuvant, saponins, aluminum salts or, in a preferred embodiment, polycations such as polyarginine or polylysine.
  • the peptides can also attach to components that make up the
  • Support CTL induction or activation be bound, e.g. on T helper peptides, lipids or liposomes, or they are used together with these substances and / or together with immunostimulating substances, e.g. Cytokines (IL-2, IFN- ⁇ ) administered.
  • immunostimulating substances e.g. Cytokines (IL-2, IFN- ⁇ ) administered.
  • B99 (fragments) or B99 peptides can also be used to trigger a CTL response ex vivo.
  • An ex vivo CTL response to a tumor expressing B99 is induced by incubating the CTL progenitor cells together with APCs and B99 peptides or B99 protein.
  • the activated CTLs are then allowed to expand, after which they are re-administered to the patient.
  • APCs can be loaded with B99 peptides, which can lead to an efficient activation of cellular immune responses against B99 positive tumors (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996).
  • a suitable method for peptides on cells e.g. Loading dendritic cells is disclosed in WO 97/19169.
  • B99 peptides are combined with peptides derived from other TAAs.
  • the selection of peptides for such combinations is made with a view to the detection of different MHC types in order to cover the widest possible patient population and / or it is based on the widest possible range of indications by combining peptides from several different tumor antigens.
  • Composition can vary over a wide range, typically a clinically applicable vaccine contains 1 to 15, preferably 3 to 10 different peptides.
  • the peptides according to the invention can also be used as diagnostic reagents.
  • the peptides can be used to test a patient's response to the humoral or cellular immune response elicited by the immunogenic peptide. This makes it possible to improve a treatment protocol.
  • the dosage form (peptide, total protein or DNA vaccine) of the TAA for example, the increase in precursor T cells in the PBLs that are reactive to the defined peptide epitope can be investigated (Robbins and Kawakami, 1996 and references cited therein) .
  • the peptides or the total protein or antibodies directed against the TAA can be used to characterize the course of the disease of a B99-positive tumor (for example by immunohistochemical analyzes of the primary tumor and metastases).
  • the present invention relates to isolated DNA molecules coding for a protein with the immunogenic properties of B9-9 or for fragments thereof.
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule which contains a polynucleotide with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or which contains a polynucleotide which hybridizes with a polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions ,
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule which comprises a
  • the DNA molecules or fragments thereof according to the invention code for (poly) peptides of the designation B99 (B99-1, B99-2 or B99-3) with that in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 amino acid sequence shown or for protein fragments or peptides derived therefrom; this also includes DNA molecules which, due to the degeneration of the genetic code, deviate from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • the invention also relates to DNA molecules which, due to the conservative exchange of amino acids, have deviations from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (or SEQ ID NO: 5), provided they are for a B99 derivative or encode fragments or peptides with the immunogenic properties desired for use as tumor vaccines.
  • the B99 DNA molecules of the present invention or the corresponding RNAs, which are also the subject of the present invention, are used, like the (poly) peptides encoded therein, for the immunotherapy of cancerous diseases.
  • DNA molecules coding for natural B99 polypeptides are used.
  • B99-CDNA DNA molecules coding for natural B99 polypeptides
  • Fragments thereof can be used in modified derivatives. These include sequences with modifications that code for a protein (fragment) or peptides with greater immunogenicity, the same considerations for the modifications at the DNA level as for the peptides described above. Another type of modification is the purification of numerous sequences, coding for immunologically relevant peptides, in the manner of a string of pearls ("string-of-beads"; Toes et al., 1997). The sequences can also be modified by adding auxiliary elements, for example functions which ensure more efficient delivery and processing of the immunogen (Wu et al., 1995).
  • the present invention relates to a recombinant DNA molecule which contains B99 DNA.
  • the B99 DNA molecules of the present invention can be administered, preferably in recombinant form as plasmids, directly or as part of a recombinant virus or bacterium.
  • any gene therapy method for the immunotherapy of cancer based on DNA (“DNA vaccine”) on B99-DNA can be used, both in vivo and ex vivo.
  • Examples of in vivo administration are the direct injection of "naked" DNA, either intramuscularly or by means of a gene gun, which has been shown to lead to the formation of CTLs against tumor antigens.
  • Examples of recombinant organisms are vaccinia virus, adenovirus or Listeria monocytogenes (an overview was given by Coulie, 1997).
  • synthetic carriers for nucleic acids such as cationic lipids,
  • Microspheres, microspheres or liposomes for the in vivo administration of nucleic acid molecules coding for B99 peptide can be used. Similar to peptides, various adjuvants that enhance the immune response can be co-administered, for example cytokines, either in the form of proteins or plasmids encoding them.
  • the application can optionally be combined with physical methods, eg electroporation.
  • An example of ex vivo administration is the transfection of dendritic cells, as described by Tuting, 1997, or other APCs that are used as cellular cancer vaccines.
  • the present invention thus relates to the use of cells which express B99, either on their own or, in optionally modified form, after transfection with the corresponding coding sequence, for the production of a cancer vaccine.
  • the invention relates to antibodies against B99 or fragments thereof.
  • Polyclonal antibodies can be obtained in a conventional manner by immunizing animals, in particular rabbits, by injecting the antigen or fragments thereof, and then purifying the immunoglobulin.
  • Monoclonal anti-B99 antibodies can be obtained according to standard protocols according to the principle described by Köhler and Milstein, 1975, by
  • these animal antibodies can optionally be chimerized in a conventional manner (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) or humanized (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995).
  • Human monoclonal anti-B99 antibodies fragments can also be obtained from so-called “phage display libraries” (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) and by means of transgenic animals (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995).
  • the anti-B99 antibodies according to the invention can be used in immunohistochemical analyzes for diagnostic purposes.
  • the invention relates to the use of B99-specific antibodies in order to selectively bring any substances into or into a tumor which expresses B99. Examples of such
  • Substances are cytotoxic agents or radioactive nuclides, the effect of which is to damage the tumor on site. Due to the tumor-specific expression of B99, no or only minor side effects are expected.
  • substances can be used to visualize tumors that express B99 using B99 antibodies. This is useful for the diagnosis and evaluation of the course of therapy. Therapeutic and diagnostic applications of antibodies which are suitable for anti-B99 antibodies are described in WO 95/33771 for.
  • the TAA of the designation B99 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. B. to induce an immune response against tumor cells that express the corresponding antigen detectors inanten. They are preferably used for the therapy of B99-positive tumors, especially in the
  • B99 DNA
  • B99 (DNA) can therefore be used in screening assays to identify substances that modulate, in particular inhibit, the activity of this protein.
  • such an assay can consist of introducing the B99 protein, or an active fragment thereof, into cells which react to the activity of B99 with proliferation or to bring the corresponding B99 DNA into expression in the cell, and the Determine cell proliferation in the presence and absence of a test substance.
  • Substances with an anti-proliferative effect can be used for the treatment of tumors with strong B99 expression, especially in the kidney
  • Fig. 1 RT-PCR analysis of cDNA pools of various human tumor and normal tissues using B99-specific primers
  • Fig. 4 Immunohistochemical analysis of four different cases of adenocarcinoma with B99 serum
  • Fig. 5 MHC stabilization on T2 cells using different concentrations of B9-9 peptides
  • RDA Representative Difference Analysis
  • the human lung adenocarcinoma cell line A549 (CCL 185) obtained from ATCC was in T150
  • the 4 ml were transferred to a 15 ml falcon tube, mixed with 8 ml PBS, centrifuged at 1200 rpm in a Haereus table centrifuge (Megafuge 2.0R) for 5 min at 4 ° C, the cell pellet with 1 ml lysis buffer (10 mm TrisHCl pH8, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40) were added, shaken vigorously and centrifuged in a 2 ml Eppendorf tube at 12,000 rpm and 4 ° C. for 5 min in a Sigma table centrifuge (Sigma 202 MK).
  • 1 ml lysis buffer (10 mm TrisHCl pH8, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40
  • the supernatant was transferred to a new Eppendorf tube and, after addition of 55 ⁇ l 20% SDS solution, extracted twice with twice the volume of a CHCl 3 / phenol (1: 1 v / v) mixture and once with the single volume of CHC1 3 .
  • the aqueous RNA-containing phase was mixed with 1/10 volume of 3M NaAc (pH5) and twice the volume of 96% EtOH and the RNA was precipitated overnight at -20 ° C.
  • the isolation of poly-A (+) RNA using the PolyATtract Kit (Promega) was carried out in accordance with the manufacturer's protocol.
  • the A549 poly-A (+) RNA with a concentration of 1 mg / ml in DEPC-treated H 2 0 was stored in aliquots at -80 ° C.
  • Restriction enzyme interfaces were necessary because point mutations were often observed, particularly in the primer sequences due to the PCR amplification steps.
  • the cDNA obtained was digested by "fixed” and “driver” with Rsal (Rsal is a 4-base-recognizing restriction enzyme and provides a statistical average of 256 bp long cDNA fragments).
  • tester cDNA Identical parts of "tester cDNA” were ligated either with adapters 1 or 2 and then hybridized separately with an excess of "driver cDNA” at 65 ° C. The two approaches were then combined and subjected to a second hybridization with freshly denatured "driver cDNA”. The enriched "solid" -specific cDNAs were then amplified exponentially by PCR with primers specific for adapters 1 or 2. For further enrichment, an aliquot of this reaction was subjected to a second PCR with specific nested primers.
  • the exponentially amplified cDNA fragments resulting from this reaction were directly inserted into the pCRII vector (Invitrogen; carefulTA cloning vector ”) and then a third of the ligation mixture was transfected into competent E. coli (OneShot TM, Invitrogen).
  • Obtained subtraction library which was available both in the form of E. coli glycerol stock cultures and in the form of purified plasmids.
  • the isolated plasmid DNA of all 712 clones was sequenced according to the Sanger method on an ABI-Prism device. The sequences obtained were annotated using the BioScout software (LION, Heidelberg) and subjected to database comparisons (Genbank). From 712 clones, 678 could be sequenced and annotated. The rest (34) had either only poly (A) sequences as an insert or corresponded to a religious vector or could not be sequenced. Of the 678 annotable sequences, 357 proved to be genes with a known function. The remaining 321 represented clones encoding genes with unknown function; 59 of them did not even have entries in the human EST database. Known genes were not further treated. The expression profile was estimated for those unknown genes for which an EST entry was available: all those ESTs were> 95%
  • BLAST Altschul et al. (1994), which belonged to the experimentally determined sequence of the subtraction libraries, was checked. The annotation was divided into i) critical normal tissues, ii) fetal, "dispensable” and immune-privileged tissues and iii) tumors and tumor cell lines. On the basis of this "virtual mRNA profile", 200 clones for which no ESTs were used in group i) were selected for further experimental analyzes (including the 59 clones for which there was no EST entry). To further narrow the candidate clones, oligonucleotide primer pairs were designed and synthesized from the sequences determined from the 200 selected clones.
  • cDNA libraries 8 different human tissue-derived cDNA libraries (GibcoBRL “SUPERSCRIPT TM”), which are directionally cloned into pCMV-SPORT, were initially analyzed by means of qualitative PCR tested for the presence of each candidate.
  • the cDNA libraries used came from tissue from the heart (# 10419-018), liver (# 10422-012), leukocytes (# 10421-022), kidney (# 10420-016), lung (# 10424-018), Testis (# 10426-013), brain (# 10418-010) and fetal brain (# 10662-013).
  • the PCR conditions were as follows: 20 ⁇ l i total volume per PCR mixture contained 1 ⁇ TaqPol
  • Buffer 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 9, 0.1% Triton X-100), 1.5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs (Promega), 0.025 U / ul Taq DNA polymerase (Promega), respectively 5 pM of specific oligonucleotide primers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and 100 ng of the plasmid DNA to be examined in each case.
  • specific primers for GAPDH SEQ ID NO: 14 and 15
  • the primer pairs were also tested in parallel for the isolated plasmid.
  • cDNA pools were used which were produced from 3 ⁇ g total RNA from 3 different tissues of the same type.
  • the 9 ⁇ g total RNA per tissue pool from tumor or normal tissues was reverse transcribed using AMV-RT (Promega) according to the manufacturer's recommendation.
  • AMV-RT Promega
  • the RNA was previously incubated with DNAse I (Boehringer Manheim).
  • the quality and amount of the cDNAs were checked by PCR with GAPDH-specific primers (SEQ ID NO: 14 and 15) after 20 cycles (30 "95 ° C, 90" 60 ° C).
  • B99 cDNA was plicated by 25, 30 and 35 cycles of the program 1 '95 ° C, 1' 55 ° C, 1 '72 ° C with the B99-specific primers according to SEQ ID NO: 7 and 8 a.
  • the other 55 candidate clones, each with specific primers, were examined analogously.
  • the PCR products were by means of agarose gel electrophoresis and
  • FIG. 1 An example for candidate B99 is shown in FIG. 1: The RT-PCR analysis of cDNA pools of various human tumor and normal tissues using B99-specific primers gave a strong signal in colon carcinoma and in lung adenoma carcinoma line A549 as well as a weak signal in Breast carcinoma and renal cell carcinoma. A weak signal was only of all examined normal tissues noticeable in colon tissue. In the further course, the candidate B99 was evaluated in more detail.
  • Colon tissue Using RT-PCR analysis of individual cDNAs from various human tumor and normal tissues using B99-specific primers, B99-CDNA was detected in 6 of 7 tumor samples, whereas only one of the examined normal tissues (1/6) showed a weak expression of B99 , Table 1
  • Example 4 shows that B99 is clearly transcribed in a high percentage of tumors of various indications, whereas no or only isolated transcription was found in all examined normal tissues.
  • B99-specific antibodies were generated in rabbits.
  • the bacterial fusion protein pGEX-ORF2-1 / 1 (position 1278 to 1740 SEQ ID No: 1) was used for the immunization, and the serum obtained was affinity-purified using peptide B99-KML (SEQ ID NO: 61).
  • SEQ ID NO: 61 peptide B99-KML
  • Clone B99 has a 271 bp insert of an unknown human gene between the adapters introduced by the RDA.
  • the complete cloning of the human sequence was carried out as follows: a UniGene analysis (National Center for Biotechnology Information) revealed the following ESTs homologous to B99: AA315469, AA345780, AA295520. With the help of these ESTs, the B99 sequence could be extended to 439 nucleotides. New primers within this sequence were synthesized (SEQ ID NO: 9 to 12). The respective theoretical fragment lengths from A549 cDNA could be amplified by PCR with various combinations of these primers.
  • one of the clones isolated from A549 cells showed a nucleotide exchange at position 622 in comparison to sequence SEQ ID NO: 1.
  • This nucleotide exchange requires a replacement of arginine (SEQ ID NO: 2, B99-1) with tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2) at position No. 66 of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence from B99-2 to position 166 is identical to B99-1.
  • the aforementioned insertion requires a second potential reading frame from items 845 to 1744 the sequence shown in SEQ ID NO: 3 (or SEQ ID NO: 5).
  • a protein expressed by a cDNA with this reading frame has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (B99-3).
  • the sequence of B99-3 differs from items 1 to 27 to B99-1 and from item 28 is identical to B99-1.
  • B99-MHC binding peptides were tested in a T2 peptide loading test for their ability to stabilize HLA-A2 molecules on the surface of T2 cells, which is an indication of their MHC binding ability.
  • the experiment was carried out as described by Böhm et al. , 1998. Stabilization was measured by FACS analysis with an HLA-A2 specific antibody (BB7.2). Five peptides showed a stabilizing effect when used in a concentration of 100 ⁇ g / ml, represented by an increase in the mean fluorescence intensity compared to the control without peptide or to a MAGE-3 Al control peptide which shows no binding. (Table 4):
  • these peptides were examined in a dilution series in the same test system in order to show a possible concentration dependence of the binding.
  • 5 shows the MHC stabilization on T2 cells by means of different concentrations of B99 peptides.
  • the peptides B99-19, B99-187 and B99-209 in particular show a clear one
  • Paterson Y Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 664-9
  • Rapellino M, Pecchio, F, Baldi, S, Scappaticci, E, and
  • van Elsas A., van der Minne, CE, Borghi, M., van der Spek, CW, Braakman, E., Osanto, S., and Schrier, PI (1996), CTL Recognition of an IL-2 Producing Melanoma Vaccine.
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  • van Elsas A., van der Minne, CE, van der Spek, CW, Brouwenstijn, N., Osanto, S., and Schrier, PI (1997), J. Immunother. 2TJ: 343-353.

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Abstract

Tumorassoziiertes Antigen, davon abgeleitete immunogene Peptide und dafür kodierende DNA-Moleküle sowie deren Verwendung in der Immuntherapie von Krebserkrankungen.

Description

Titel: Tumorassoziiertes Antigen
Die Erfindung bezieht sich auf die Immuntherapie von Tumorerkrankungen.
Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor i einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu schützen bzw. diese aktiv zu bekämpfen. Die Bedeutung eines intakten Immunsystems zeigt sich vor allem bei vererbten oder erworbenen I mundefizienzen. Der Einsatz von prophylaktischen Vakzinprogrammen erwies sich in vielen Fällen als äußerst zielführende und erfolgreiche immunologische Intervention im Kampf gegen virale oder bakterielle Infektionserkrankungen. Weiters hat sich gezeigt, daß das Immunsystem auch an der Eliminierung von Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist. Dabei spielt die Erkennung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) durch Komponenten des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Im weitesten Sinn kann jede (peptidische oder nicht peptidische) Komponente einer Tumorzelle, die von einem Element des Immunsystems erkannt und zur
Stimulation einer immunologischen Antwort führt, als im unogenes Tumorantigen fungieren. Besondere Bedeutung kommt dabei jenen Tumorantigenen zu, die nicht nur eine immunologische Reaktion hervorrufen, sondern auch eine Abstoßung des Tumors bewirken. Die Identifizierung definierter Antigene, die solch eine immunologische Reaktion bewirken können, stellt einen wichtigen Schritt für die Entwicklung einer molekular definierten Tumorvakzine dar. Obwohl noch nicht ganz geklärt ist, welche Elemente des Immunsystems für eine Abstoßung des Tumors verantwortlich sind, besteht doch ein Konsens darüber, daß dabei CD8-exprimierende zytotoxische
T-Lymphozyten (CTLs) eine Hauptrolle spielen (Coulie,
1997). Besonders bei jenen Tumorarten (z.B. Melanom und Nierenkarzinom) , die eine relativ hohe
Spontanremissionsrate- aufweisen, konnte eine
Korrelation zwischen klinischem Verlauf und dem i vermehrten Auftreten von CD8+- und CD4+-T-Zellen festgestellt werden (Schendel et al., 1993; Mackensen et al., 1993/ Halliday et al., 1995; Kawakami et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Wang, 1997; Celluzzi und Falo, 1998) . Dabei wurden spezifische CTL-Klone entweder aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nach Kokultivierung mit meist autologen Tumorzellen und Zytokinstimulierung in vitro erhalten. Sowohl in Tiermodellen als auch in in vitro kultivierten humanen Zellkultursystemen konnte die T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen durch Transfektion der Tumorzellen mit Zytokinen verstärkt werden (van Elsas et al . , 1997;
Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).
Aufgrund der Korrelation zwischen Remission und Beteiligung von CD8+-T-Zellen ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA) , die durch
CD8-positive CTLs erkannt werden, ein erklärtes Hauptziel auf dem Weg zur Entwicklung einer Tumorvakzine (Pardoll, 1998; Robbins und Kawakami, 1996) . Ob auch andere Zelltypen des Immunsystems wie z.B. CD4+-T-Helferzellen eine wesentliche Rolle spielen ist noch unklar; einige Studien mit MAGE-3/HLA-A1 Peptiden in Melano patienten deuten darauf hin (Marchand et al., 1995; Boon et al., 1998). In den vergangenen Jahren ist eine Reihe von TAAs, die durch CTLs erkannt werden, identifiziert worden (Boon et al., 1994; van den Eynde und van der Bruggen, 1997) .
T-Zellen erkennen Antigene als Peptidfragmente, die an Zelloberflächen von MHC-Molekülen („major
Figure imgf000005_0001
complex" , im Menschen „HLA" = „human leukocyte antigen") präsentiert werden. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I Moleküle kommen auf den meisten Zellen mit Kern vor und präsentieren Peptide (üblicherweise 8-10-mere) , die durch proteolytischen Abbau endogener Proteine entstehen (sog. Antigen-Verarbeitung, „antigen processing" ) . Peptid: MHC-I Komplexe werden von CD8-positiven CTLs erkannt. MHC-II Moleküle kommen nur auf sog.
„professionellen antigen-präsentierenden Zellen" (APC) vor, und präsentieren Peptide exogener Proteine,„die im Zuge der Endocytose von APC aufgenommen und verarbeitet werden. Peptid:MHC-II Komplexe werden von CD4-Helfer-T- Zellen erkannt. Durch eine Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und Peptid: MHC Komplex können verschiedene Effektormechanismen ausgelöst werden, die im Fall von CTLs zur Apoptose der Zielzelle führen. Das geschieht, wenn entweder der MHC (z.B. im Fall der Transplantatabstoßung), oder das Peptid (z.B. im Fall intrazellulärer Pathogene) als fremd erkannt wird. Allerdings erfüllen nicht alle präsentierten Peptide die strukturellen und funktioneilen Anforderungen für eine effektive Interaktion mit T-Zellen (wie von Rammensee et al., 1995 und weiter unten beschrieben). Für den Einsatz von TAAs in einer Tumorvakzine sind grundsätzlich mehrere Applikationsformen möglich: Das Antigen kann entweder als rekombinantes Protein mit geeigneten Adjuvantien bzw. Trägersystemen, oder als für das Antigen kodierende cDNA in Plasmid- (DNA- Vakzine; Tighe et al., 1998), bzw. viralen Vektoren (Restifo, 1997) appliziert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von rekombinanten Bakterien (z.B. Listeria, Salmonella) , die das humane Antigen rekombinant exprimieren und durch ihre zusätzlichen Komponenten eine adjuvative Wirkung haben (Paterson, 1996; Pardoll, 1998) . In allen diesen Fällen ist eine Verarbeitung und Präsentation des Antigens durch sog. „professionelle antigen-präsentierende Zellen" (APC) notwendig. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz synthetischer Peptide (Melief et al., 1996) , die den korrespondierenden T-Zell-Epitopen des Antigens entsprechen und die entweder von außen "auf die APC geladen (Buschle et al., 1997; Schmidt et al., 1997) oder von den APC aufgenommen und intrazellulär auf die MHC I Moleküle transferiert werden. Die therapeutisch effizienteste Applikationsform für ein definiertes Antigen wird im allgemeinen in klinischen Studien bestimmt.
Zu den von den tumorspezifischen CTLs erkannten
Antigenen bzw. deren Epitopen zählen Moleküle, die aus sämtlichen Proteinklassen stammen können (z.B. Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren, Enzyme; zur Übersicht siehe Rammensee et al., 1995; Robbins und Kawakami, 1996) . Diese Proteine müssen nicht notwendigerweise an der Zelloberfläche lokalisiert sein, wie dies bei der Erkennung durch Antikörper erforderlich ist. Um für die Erkennung durch CTLs als tumorspezifisches Antigen zu fungieren bzw. um für die Therapie eingesetzt zu werden, müssen die Proteine bestimmte Bedingungen erfüllen: erstens soll das Antigen hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert werden und in sog. "kritischen" Normalgeweben nicht oder nur in geringerer Konzentration als in Tumoren vorkommen. Kritische Normalgewebe sind essentielle Gewebe; eine gegen sie gerichtete Immunreaktion könnte unter Umständen schwerwiegende, zum Teil lethale Folgen haben. Zweitens soll das Antigen nicht nur im Primärtumor, sondern auch in den Metastasen vorhanden sein. Des weiteren ist es im Hinblick auf eine breite klinische Anwendung des Antigens erstrebenswert, wenn es in mehreren Tumorarten in hoher Konzentration vorhanden ist. Eine weitere Vorbedingung für die Eignung eines TAA als wirksamer Bestandteil einer Vakzine ist das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens; vom TAA abgeleitete Peptide sollen zu einer in vi tro/in vivo T-Zell Antwort führen ("immunogenes" Peptid) . Ein weiteres Selektionskriterium für ein klinisch breit anwendbares immunogenes Peptid ist die Häufigkeit, mit der das Antigen in einer gegebenen Patientenpopulation anzutreffen ist.
Die immunogenen tumorassoziierten Antigene (TAAs) , von denen größtenteils bereits gezeigt wurde, daß sie T-Zell Epitope besitzen, lassen sich in mehrere Kategorien einteilen, u.a. virale Proteine, mutierte Proteine, überexprimierte Proteine, durch chromosomale Translokation gebildete Fusionsproteine, Differenzierungsantigene, onkofötale Antigene (Van den Eynde und Brichard, 1995; van den Eynde und van der Bruggen, 1997) .
Die Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von TAAs, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Tumorvakzine darstellen, beruhen einerseits auf dem Einsatz von in Patienten bereits induzierten CTLs (zelluläre Immuηantwort) oder Antikörpern (humorale Immunantwort) , oder basieren auf der Erstellung differenzieller Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Im ersten Fall, dem immunologischen Ansatz, werden Patienten-CTLs für ein Screening eukaryotischer Tumor-cDNA-Expressionsbibliotheken, die über MHC-I Moleküle die CTL-Epitope präsentieren, eingesetzt (Boon et al., 1994), während mittels hochaffiner Patienten-Antiseren prokaryotische-cDNA- Expressionsbibliotheken, direkt über eine Immunoblot- Analyse der einzelnen Plaques auf das Vorhandensein von TAAs untersucht werden (Sahin et al., 1995). Eine Kombination von CTL-Reaktivität und proteinchemischen Verfahren stellt die Isolierung von aus MHC-I isolierten Peptiden von Tumorzellen dar, die über Reaktivität mit Patienten-CTLs vorselektioniert wurden. Die Peptide werden aus dem MHC-I Komplex ausgewaschen und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert (Falk et al., 1991; Woelfel et al., 1994; Cox et al., 1994) . Die Ansätze, welche CTLs zum Charakterisieren von Antigenen verwenden, sind aufgrund der erforderlichen Kultivierung und Aktivierung von CTLs mit einem erheblichen Aufwand verbunden bzw. nicht immer erfolgreich. Methoden zur Identifizierung von TAAs, welche auf dem Vergleich des Transkriptionsprofils von Normal- mit Tumorgewebe beruhen, sind vielfältig; dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken ("representational difference analysis" ; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) und der Einsatz der DNA-Chip Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995). Im Gegensatz zur oben erwähnten immunologischen Methode mit Hilfe von Patienten-CTLs muß beim Einsatz von molekularbiologischen Methoden gezeigt werden, daß die damit gefundenen potentiellen Antigenkandidaten tumorspezifisch (tumorassoziiert) sind und tatsächlich T-Zell Epitope besitzen, die eine zytotoxische T-Zell Antwort auslösen können. In zumindest einem Fall
(NY-ESO/LAGE-1) wurde ein Antigen sowohl durch die Verwendung von Patientenseren als auch durch RDA identifiziert (Chen et al., 1997; Lethe et äl . 1998), außerdem wurden CTL-Epitope dieses Antigens und eine gleichzeitige spontane humorale und T-Zell Antwort in einem Patienten beschrieben (Jager et al., 1998).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues tumorassoziiertes Antigen (TAA) bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA („representational difference analysis") zwischen einer Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie (A549) und Normallungengewebe eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden anschließend die erhaltenen cDNA-Klone sequenziert und mit in
Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 321 unbekannte, zu denen größtenteils ESTs („expressed sequence tags" ) - Einträge in der Datenbank existierten. Nach einer weiteren qualitativen PCR-Analyse in cDNA-Bibliotheken von kritischen Normalgeweben und immunprivilegierten Geweben sowie detaillierteren Datenbankrecherchen wurden die Anzahl der Kandidatenklone auf 56 eingeschränkt, deren ESTs nicht aus kritischen Normalgeweben stammen. Mittels RT-PCR wurde festgestellt, daß drei der 56 untersuchten Klone eine Expression hauptsächlich in verschiedenen Tumorgeweben und keine oder geringe Expression in Normalgeweben aufweisen. Der qualitative Vergleich (mittels PCR) der Expression eines der Klone (B99) zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte eine Überexpression der B99-cDNA in verschiedenen Tumoren. Das mittels Northern Blot analysierte Expressionsprofil zeigte ergänzend, daß B99 in den untersuchten Normalgeweben keine oder nur eine schwache Transkription aufwies.
Die humane B99-CDNA wurde kloniert, die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO:l dargestellt. Die Sequenzanalyse der klonierten humanen B99-cDNA ergab, daß von Position 427 bis Position 1743 ein durchgehender offener Leserahmen vorliegt, der, auf Nukleotid- und Proteinebene, eine hohe Identität mit dem offenen Leserahmen von beta-1, 3-Galaktosyl-o- Glykosyl-Glykoprotein beta-1, 6-n-
Azetyglucosaminyltransferase besitzt. Aus den aus Northern Blot Experimenten gewonnenen Daten ist zu schließen, daß das B99-Transkript eine Länge von ca.
3,0 kb hat. Der klonierte Bereich der B99-cDNA beträgt 2216 bp, wobei das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes am 3 '-Ende der Sequenz für die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich spricht. Der Unterschied in der Größe der klonierten B99-cDNA im Vergleich zu der aus der Northern Blot Analyse ableitbaren Größe läßt sich durch das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes unbekannter Länge sowie eine zusätzliche Sequenz im 5 '-nicht translatierten Bereich von B99 erklären. Aufgrund der Tatsache, daß im 5 '-Bereich der klonierten cDNA von Position 0 bis 427 kein durchgehender Leserahmen vorhanden ist, kann gefolgert werden, daß es sich bei dem ATG an Position 427 um das Startkodon von B99 handelt.
Zusätzliche Information über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz von B99 kann durch molekularbiologische Standardmethoden gewonnen werden, z.B. mittels 5'-RACE („rapid amplification of cDNA ends" ) . Bei dieser Methode wird RNA, vorzugsweise- mRNA, aus Zellen oder Geweben, in denen B99 transkribiert wird (z.B. Kolonkarzinom-Gewebe oder von Lungenadenokarzinom abgeleitete Zelllinien wie A549) revers transkribiert und anschließend mit einem Adaptor bekannter Sequenz ligiert. Eine PCR mit einem Adaptorprimer (bindet spezifisch an den Adaptor am 5'- Ende der cDNA) und einem B99-spezifischen Primer (z.B. SEQ ID NO: 8, 10, 11) erlaubt die Amplifikation entsprechender B99-Fragmente. Diese PCR-Produkte können, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach Standardmethoden kloniert und, insbesondere durch DNA Sequenzierung, charakterisiert werden.
Eine alternative Methode zur Charakterisierug des
5 '-Endes ist das Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit für B99 spezifischen DNA-Sonden oder Antiseren.
Führt das Screenen von cDNA-Bibliotheken aufgrund methodisch bedingter Beschränkungen, z.B. ineffiziente reverse Transkription bedingt durch ausgeprägte
Sekundärstrukturen der RNA, nicht zum gewünschten Ziel, können genomische Bibliotheken untersucht werden, indem z.B., wie beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, durch Hybridisierung mit für B99 spezifischen DNA-Sonden Klone isoliert werden können, die die stromaufwärts vom erhaltenen 5 '-Ende der cDNA liegende Sequenzinformation z.B. die Promotorregion von B99 enthalten.
Die isolierte cDNA kodiert für das tumorassoziierte Antigen (TAA) der Bezeichnung B99 mit der in SEQ ID N0:2 angegebenen Aminosäuresequenz (B99-1) . Die Sequenz von B99-1 wird definiert durch das Startcodon an Position 427 der isolierten B99-CDNA.
In einem weiteren Versuch zur Klonierung des kodierenden Bereichs von B99, bei dem cDNA aus der Lungenadenokarzinom-Zellinie A549 verwendet wurde, wurde eine Sequenz ermittelt, die im Vergleich zur in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz eine Insertion eines Nukleotids an Position 923 aufweist (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5). Diese Insertion führt zu einer Veränderung des offenen Leserahmens von B99 mit einer daraus resultierenden veränderten Aminosäuresequenz im C-terminalen-Bereich des B99-Proteins; die von diesem Leserahmen abgeleitete Sequenz dieses B99-Antigens (B99-2) ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt. Außer der Insertion weist die aus A549-Zellen isolierte cDNA einen Nukleotidaustausch an Position 622 im Vergleich zu Sequenz SEQ ID N0:1 auf. Dieser Nukleotidaustausch bedingt an Position Nr. 66 einen Ersatz von Arginin (SEQ ID NO: 2, B99-1) durch Tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2). Abgesehen von diesem Aminosäureaustausch ist die Aminosäuresequenz, von B99-2 bis einschließlich Position 166 identisch mit B99-1.
Die Insertion eines Nukleotids an Position 923 ergibt einen zweiten potentiellen Leserahmen von Pos. 845 bis 1744 der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz. Ein von einer cDNA mit diesem Leserahmen exprimiertes Protein weist die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz auf (B99-3) . Die Sequenz von B99-3 ist von Pos. 1 bis 27 unterschiedlich zu B99-1 und ab Pos 28 identisch mit B99-1.
Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B99, ausgewählt aus der Gruppe von Polypeptiden mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegebenen Aminosäuresequenz .
Die in SEQ ID NO:2 (B99-1) , SEQ ID NO:4 (B99-2) und SEQ ID NO: 6 (B99-3) dargestellten Aminosäuresequenzen können Abweichungen aufweisen, z.B. solche, die durch Austausch von Aminosäuren bedingt sind, sofern das B99- Derivat die für die Anwendung in einer Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften aufweist. (Ein Beispiel für einen B-99-Polymorphismus dieser Art ist der durch die Punktmutation bedingte Unterschied an Position 66 zwischen B99-1 und B99-2) . Im folgenden wird, wenn nicht anders angegeben, die Bezeichnung „B99" stellvertretend für B99-1, B99-2 und B99-3 verwendet.
Die natürliche Aminosäuresequenz von B99 (bzw. entsprechend die Sequenzen der B99-cDNA) kann gegebenenfalls modifiziert sein, indem einzelne Aminosäuren in einem B99 CTL-Epitop ausgetauscht werden, um, im Vergleich zum natürlichen B99 CTL- Epitop, eine Steigerung der Affinität von B99-Peptiden zu MHC-I-Molekülen und damit eine erhöhte Immunogenität und letztlich eine verstärkte Reaktivität gegenüber Tumoren zu bewirken. Modifikationen im Bereich der B99- Epitope können am B99-Gesamtprotein (dieses wird von den APCs zu den entsprechenden Peptiden prozessiert) bzw. an größeren B99-Proteinfragmenten oder an B99- Peptiden (vgl. unten) vorgenommen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung immunogene Fragmente und Peptide, die von B99 abgeleitet sind. Letztere werden im folgenden als "B99-Peptide" bezeichnet. Eine erste Gruppe sind
B99-Peptide, die eine humorale Immunantwort (Induktion von Antikörpern) auslösen. Derartige Peptide sind ausgewählte Abschnitte von B99 (mindestens 12 bis 15 Aminosäuren) , die mittels sogenannter Vorhersage- Algorithmen ("prediction algorithms") wie z.B. dem surface probability blot" (Emini et al., 1985), dem "hydrophobicity blot" (Kyte and Doolittle, 1982) und dem "antigenic index" (Jameson and Wolf, 1988) ermittelt werden können. Es ist bekannt, daß tumorassoziierte Antigene tumorspezifische Mutationen aufweisen können, die zu einer immunologischen Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe beitragen (Mandruzzato et al . , 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al.,1995). Um das Vorhandensein tumorspezifischer B99-Mutationen festzustellen, wird, zweckmäßig mit Hilfe von Sonden aus der erfindungsgemäßen isolierten cDNA, die B99-cDNA aus einem oder mehreren unterschiedlichen Tumoren kloniert und die erhaltenen Sequenzen mit Normalgewebs-B99-cDNA verglichen. Es ist zu erwarten, daß Tumor-B99-Peptide aus einem gegenüber Normalgewebs-B99 mutierten Sequenzabschnitt im Vergleich zu Normalgewebs-B99- Peptiden aus dem entsprechenden Abschnitt eine verstärkte Immunogenität aufweisen. Die vorliegende
Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt B99- Peptide, abgeleitet von Bereichen eines tumorexprimierten B99, die tumorspezifische "Mutationen aufweisen.
Bei der Auswahl von B99-Peptidkandidaten verdienen die Regionen von B99-2 und B99-3, die sich von B99-1 unterscheiden, besonderes Interesse. Unter der Voraussetzung, daß es sich bei der Insertion der B99- DNA, die zu diesen Unterschieden in der Aminosäuresequenz führt, um eine tumorspezifische
Mutation handelt, ist nämlich zu erwarten, daß Peptide aus diesem Bereich eine verstärkte Immunogenität im Vergleich zu Peptiden aus B99-1 aufweisen. Um zu bestätigen, daß die Insertion tumorspezifisch ist, können Antikörper gegen diesen Bereich generiert und Tumorzellen auf Expression von B99-2 und B99-3 untersucht werden. B99-Peptide werden direkt oder in modifizierter Form (z.B. an KLH = "keyhole limpet hemocyanine" gekoppelt) verabreicht und die Bildung von Antikörpern mittels gängiger immunologischer Assays, z.B. mittels ELISA, bestimmt.
Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte, B99-ιPeptide sind diejenigen, die durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort bewirken. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich MHC-I-Moleküle, die von CD8-positiven CTLs und MHC-II-Moleküle, die von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.
Damit ein Peptid eine zelluläre Immunantwort auslöst, muß es an ein MHC-Molekül binden, wobei der zu behandelnde Patient das MHC-Molekül in seinem Repertoir aufweisen muß. Die Bestimmung des MHC-Subtyps des Patienten stellt somit, im Hinblick auf die Auslösung einer zellulären Immunantwort, eine der wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung eines Peptids an diesem Patienten dar.
Die Sequenz eines therapeutisch einzusetzenden B99- Peptids wird durch das jeweilige MHC-Molekül hinsichtlich Ankeraminosäuren und Länge vorgegeben. Definierte Ankerpositionen und Länge gewährleisten, daß ein Peptid in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen MHC-Moleküls des Patienten paßt. Dies hat zur Folge, daß das Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet. Immunogene B99-Peptide können nach bekannten Methoden identifiziert werden, eine der Grundlagen dafür ist die Beziehung zwischen MHC-Bindung und CTL-Induktion.
Da also die Sequenz immunogener Peptide aufgrund ihres Peptidbindungsmotivs vorherbestimmbar ist, können
B99-Peptide, die CTL-Epitope darstellen, aufgrund der B99-Proteinsequenz identifiziert und synthetisiert werden. Dazu sind verschiedene Methoden geeignet, die zur Identifizierung von CTL-Epitopen von bekannten Protein-Antigenen verwendet wurden; z.B. die von Stauss et al., 1992, für die Identifizierung von T-Zell- Epitopen in humanem Papillomavirus beschriebene Methode.
Die allelspezifischen Anforderungen jedes MHC-I Allel- Produkts an ein Peptid, das an das MHC-Molekül bindet und von diesem präsentiert wird, wurden als Motiv zusammengefaßt (z.B. Falk et al., 1991). Bisher ist eine große Anzahl sowohl von MHC-Peptid-Motiven als auch von MHC-Liganden bekannt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Suche nach Epitopen eines bekannten Proteins, das in ein bestimmtes MHC-I-Molekül paßt, wurde in einem Übersichtsartikel von Rammensee et al., 1995, beschrieben. Sie umfaßt die folgenden Schritte: zunächst wird die Protein-Sequenz auf Abschnitte untersucht, die dem Anker-Motiv entsprechen, wobei gewisse Variationen hinsichtlich Peptidlänge und Ankerbesetzung möglich sind. Wenn z.B. ein Motiv ein 9-mer mit Ile oder Leu am Ende vorschreibt, können auch 10-mere mit einem entsprechenden C-Terminus in Betracht gezogen werden, ebenso Peptide mit anderen aliphatischen Resten, wie Val oder Met am C-Terminus. Auf diese Weise wird eine Reihe von Peptid-Kandidaten erhalten. Diese werden auf das Vorhandensein möglichst vieler Ankerreste, die sie gemeinsam mit bereits bekannten Liganden haben, untersucht und/oder daraufhin, ob sie für. verschiedene MHC-Moleküle
"bevorzugte" Reste haben (entsprechend der Tabelle von i Rammensee et al., 1995). Um schwach bindende Peptide auszuschließen, werden zweckmäßig Bindungs-Assays durchgeführt. Wenn die Anforderungen an die Peptid-
Bindung für bestimmte MHC-Molküle bekannt sind, können die Peptid-Kandidaten auch auf Nicht-Ankerreste untersucht werden, die sich negativ oder positiv auf die Bindung auswirken, oder die diese erst ermöglichen (Ruppert et al., 1993). Bei dieser Vorgangsweise ist jedoch in Betracht zu ziehen, daß das Peptid-Bindungs- Motiv für die Suche nach natürlichen Liganden nicht allein ausschlaggebend ist; auch andere Aspekte, z.B. die Enzymspezifität während der Antigenprozessierung, tragen - zusätzlich zur Spezifität der MHC-Bindung - zur Identität des Liganden bei. Eine Methode, die diese Aspekte berücksichtigt, und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von immunogenen B99-Peptiden geeignet ist, wurde u.a. von Kawakami et al., 1995, angewendet, um auf der Grundlage bekannter HLA-A*0201 Motive gplOO Epitope zu identifizieren.
Die Peptide können auch im Hinblick auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-II-Moleküle ausgewählt werden. Das MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neun
Aminosäuren erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in den Ankerpositionen auf als das MHC-I- Bindungsmotiv. Es wurden kürzlich, ausgehend von der Röntgenstrukturanalyse von MHC-II-Molekülen, Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II- Bindungsmotive, und ausgehend davon, Variationen der Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al., 1995, und die dort zitierte Originalliteratur) . Peptide, die an MHC-II-Moleküle binden, werden den CD4-T-Zellen typischerweise von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen präsentiert. Die CD4-T-Zellen wiederum aktivieren dann in der Folge direkt CTLs durch z.B.
Cytokin-Ausschüttung und Verstärken die Effizienz der Antigen-Präsentation durch APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen) .
Seit kurzem sind Datenbanken und Vorhersage-Algorithmen verfügbar, die mit großer Verläßlichkeit die Vorhersage von Peptid-Epitopen erlauben, die an ein bestimmtes MHC-Molekül binden. i1
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden, unter Verwendung des von Parker et al., 1994 und Rammensee et al., 1995 beschriebenen Algorithmus, für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Auf ähnliche Weise können, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Algorithmen, die den unterschiedlichen Charakteristika der Peptide (Hydrophobizität, Ladung, Größe) bzw. Anforderungen an die Peptide, z.B. die 3D-Struktur des HLA-Moleküls, Rechnung tragen, weitere potentielle Peptid-Epitope ermittelt werden; dies gilt auch für Peptid-Epitope anderer HLA-Typen.
Nach Auswahl von B99-Peptid-Kandidaten mit Hilfe der angeführten Methoden wird deren MHC-Bindung mittels Peptidbindungs-Assays getestet. Als nächstes wird die Immunogenität der Peptide mit guten
Bindungseigenschaften bestimmt (Stabilität der Peptid- MHC-Wechselwirkung korreliert in den meisten Fällen mit Immunogenität; van der Burg et al., 1996). Um die Immunogenität des ausgewählten Peptids oder Peptid-
Äquivalents zu bestimmen, können Methoden, wie z.B. von Sette et al., 1994, beschrieben, in Kombination mit quantitativen MHC-Bindungs-Assays verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenität des ausgewählten Peptids über in vi tro CTL-Induktion mittels bekannter Methoden (wie weiter unten für ex vivo CTL-Induktion beschrieben) getestet werden. Das Prinzip der in mehreren Schritten durchgeführten Methode für die Auswahl von Peptiden, die zur Auslösung einer zellulären Immunantwort fähig sind, ist in der
WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. Eine allgemeine Strategie zum Erhalt effizienter immunogener Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde außerdem von Schweighoffer, 1997, beschrieben.
Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die Bindungsfurche von MHC-I -oder MHC-II-Molekülen passen, also Peptide, die unverändert von B99 abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen bezüglich Ankerpositionen und Länge Variationen vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die effektive Immunogenität des Peptids, die sich zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinität an das MHC-Molekül und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also künstliche Peptide oder Peptid-Äquivalente verwendet, die entsprechend den Anforderungen der Bindungsfähigkeit an ein MHC-Molekül entworfen sind.
Solchermaßen veränderte Peptide werden als
„heteroclitische Peptide" bezeichnet. Sie können nach folgenden Methoden erhalten werden:
Zunächst werden die Epitope von MHC-I- bzw. MHC-II- Liganden bzw. deren Variation z.B. nach dem von Rammensee et al., 1995, beschriebenen Prinzip vorgenommen. Die Länge des Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I Moleküle vorzugsweise einer Minimalsequenz von 8 bis 10 Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosäuren.
Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus verlängert sein, sofern diese Verlängerung die Bindungsfähigkeit an das MHC-Molekül nicht beeinträchtigt bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz zellulär prozessiert werden kann.
Die modifizierten Peptide werden daraufhin auf ihre Erkennung durch TILs („tumor-infiltrating lymphocytes" ) , auf CTL-Induktion sowie auf verstärkte MHC-Bindung und Immunogenität geprüft, wie von Parkhurst et al., 1996, und Becker et al., 1997, beschrieben. Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Auffindung von Peptiden mit stärkerer Immunogenität als die der natürlichen B99-Peptide besteht im Screenen von Peptid-Bibliotheken mit CTLs, die die natürlich auf Tumoren vorkommenden B99-Peptide erkennen, wie von Blake et al., 1996, beschrieben; in diesem Zusammenhang wird die Verwendung kombinatorischer Peptid-Bibliotheken vorgeschlagen, um Moleküle zu entwerfen, welche von MHC-I-restringierten CTLs erkannte Tumorepitope nachahmen.
Die B99-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder davon abgeleitete immunogene Fragmente oder Peptide können rekombinant oder mittels Peptid-Synthese hergestellt werden, wie in der WO 96/10413 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Für die rekombinante Herstellung wird das entsprechende DNA-Molekül nach Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, der Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert und das Protein gereinigt. Für die chemische Synthese von B99-Peptiden können herkömmliche Methoden verwendet werden, z.B. im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer .
Alternativ zu natürlichen B99-Peptiden oder heteroclitischen Peptiden können Substanzen, die solche Peptide vortäuschen, z.B. "Peptido imetica" oder "retro- inverse-Peptide" , verwendet werden. Zur Testung dieser Moleküle im Hinblick auf die therapeutische Verwendbarkeit in einer Tumorvakzine werden dieselben Methoden angewendet wie oben für die natürlichen B99-Peptide oder B99-Peptidäquivalente. Das TAA der Bezeichnung B99 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z.B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten expri ieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B99- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Nierenzell-, Lungen-, Kolon-, Pankreas-, Brust- und Magenkarzinom.
Die Immunantwort in Form einer Induktion von CTLs kann in vivo oder ex vivo bewirkt werden.
Für die in vivo Induktion von CTLs wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Komponente das TAA B99 bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid (e), einem Patienten verabreicht, der an einer mit dem TAA assoziierten Tumorerkrankung leidet, wobei die Menge an TAA(Peptid) ausreichen muß, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Antigen-tragenden Tumor zu erzielen.
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung. Vorzugsweise dient die Zusammensetzung der parenteralen Verabreichung, z.B. für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Anwendung. Die B99-TAAs/Peptide sind in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässerigen, Träger gelöst oder suspendiert. Die Zusammensetzung kann außerdem übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, etc. enthalten. Die TAAs/Peptide können allein oder in Kombination mit Adjuvantien, z.B. inkomplettem Freund' s Adjuvans, Saponinen, Aluminiumsalzen oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, Polykationen wie Polyarginin oder Polylysin, verwendet werden. Die Peptide können auch an Komponenten, die die
CTL-Induktion oder CTL-Aktivierung unterstützen, gebunden werden, z.B. an T-Helferpeptide, Lipide oder Liposomen, oder sie werden gemeinsam mit diesen Substanzen und/oder gemeinsam mit immunstimulierenden Substanzen, z.B. Zytokinen (IL-2, IFN-γ) verabreicht. Methoden und Formulierungen, die zur Herstellung und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, sind in der WO 95/04542 und WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.
B99 (Fragmente) bzw. B99-Peptide können auch verwendet werden, um eine CTL-Antwort ex vivo auszulösen. E-ine ex vivo CTL-Antwort auf einen Tumor, der B99 exprimiert, wird induziert, indem man die CTL-Vorläuferzellen zusammen mit APCs und B99-Peptiden bzw B99-Protein inkubiert. Dann läßt man die aktivierten CTLs expandieren, worauf sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Alternativ können APCs mit B99-Peptiden beladen werden, was zu einer effizienten Aktivierung zellulärer Immunreaktionen gegen B99 positive Tumoren führen kann (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996). Eine geeignete Methode um Peptide auf Zellen, z.B. dendritische Zellen, zu laden, wird in der WO 97/19169 geoffenbart.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine
Kombination mehrerer verschiedener B99-Peptide oder B99-Peptidäquivalente angewendet. In einer weiteren Ausführungsform werden B99-Peptide mit von anderen TAAs abgeleiteten Peptiden kombiniert. Die Auswahl von Peptiden für derartige Kombinationen wird im Hinblick auf die Erfassung unterschiedlicher MHC-Typen getroffen, um eine möglichst breite Patientenpopulation abzudecken, und/oder sie wird auf ein möglichst breites Indikationsspektrum abgestellt, indem Peptide mehrerer unterschiedlicher Tumorantigene kombiniert werden. Die Anzahl der Peptide in einer pharmazeutischen
Zusammensetzung kann über einen weiten Bereich schwanken, typischerweise enthält eine klinisch anwendbare Vakzine 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10 verschiedene Peptide.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch als diagnostische Reagentien eingesetzt werden. Beispielsweise können die Peptide dazu benutzt werden, um das Ansprechen eines Patienten auf die durch das immunogene Peptid hervorgerufene humorale oder zelluläre Immunantwort zu testen. Dadurch besteht die Möglichkeit, ein Behandlungsprotokoll zu verbessern. Beispielsweise kann in Abhängigkeit der Darreichungsform (Peptid, Gesamtprotein oder DNA-Vakzine) des TAA die Zunahme von Vorläufer T-Zellen in den PBLs, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptidepitop aufweisen, untersucht werden (Robbins und Kawakami, 1996 sowie darin zitierte Referenzen) . Außerdem können die Peptide oder das Gesamtprotein bzw. gegen das TAA gerichtete Antikörper dazu verwendet werden, um den Krankheitsverlauf eines B99-positiven Tumors zu charakterisieren (z.B. durch immunhistochemische Analysen von Primärtumor und Metastasen) . Eine derartige Strategie hat sich schon mehrfach als erfolgreich erwiesen, z.B. der Nachweis des Östrogenrezeptors als Entscheidungsgrundlage zur Endokrintherapie bei Brustkrebs; c-erbB-2 als relevanter Marker bei Prognostik und Therapieverlauf bei Brustkrebs (Ravaioli et al., 1998; Revillion et al., 1998); PSMA ("prostate specific membrane antigen") als Marker für Epithelialzellen des Prostatakarzinoms im Serum bzw. durch Einsatz eines nιIn-markierten monoklonalen Antikörpers gegen PSMA bei der Immunoscintigraphie auf Prostatakarzinom (Murphy et al., 1998 und inkludierte Referenzen); CEA ("carcinoembryonic antigen") als serologischer Marker für die Prognose und Verlauf bei Patienten des kolorektalen Karzinoms (Jessup und Loda, 1998) .
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt isolierte DNA-Moleküle, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften von B9-9- oder für Fragmente davon.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Unter „stringenten Bedingungen" wird z.B. verstanden: Inkubation über Nacht bei 65 °C - 68 °C mit 6xSSC (Ix SSC = 150 mM NaCl, 15mM Tri-Natriumcitrat) , 5xDenhardt's Lösung, 0.2%SDS, 50 μg/ml Lachsspermien- DNA, daran anschließend Waschen zweimal 30 min mit 2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C, einmal 30 min mit 0.2xSSC, 0.1% SDS bei 65 °C und gegebenenfalls abschließendes Spülen mit O.lxSSC, 0.1%SDS bei 65 °C, oder äquivalente Bedingungen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein
Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle bzw. Fragmente davon kodieren für (Poly) peptide der Bezeichung B99 (B99-1, B99-2 oder B99-3) mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA Moleküle mitumfaßt, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die durch konservativen Austausch von Aminosäuren bedingte Abweichungen von der in SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz aufweisen, sofern sie für ein B99-Derivat bzw. Fragmente oder Peptide mit den für die Anwendung als Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften kodieren.
Im folgenden werden die oben definierten, gegebenenfalls modifizierten, für B99-1, B99-2 bzw. B99-3 bzw. für Fragmente davon kodierenden DNA- Moleküle, wenn nicht anderes angegeben, als „B99-DNA- Moleküle" bezeichnet.
Die B99-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden RNAs, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden, wie die davon kodierten (Poly) Peptide, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden DNA-Moleküle, kodierend für natürliche B99-Polypeptide verwendet. Alternativ zur natürlichen B99-CDNA bzw.
Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein (fragment) bzw. Peptide mit stärkerer Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Äneinanderreinung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads" ; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z.B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targetting sequence" ) die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden. Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das B99-DNA enthält.
Die B99-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf B99-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo.
Beispiele für die in vivo Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, daß sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben) . Desweiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide,
Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für B99-Peptid verwendet werden. Ähnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z.B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z.B. Elektroporation, kombiniert werden. Ein Beispiel für die ex vivo Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die B99 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen B99 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.
Monoklonale anti-B99-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem
Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-B99-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) werden.
Humane monoklonale anti-B99-Antikörper (fragmente) können auch von sog. „Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen anti-B99-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von B99-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der B99 exprimiert. Beispiele für solche
Substanzen sind zytotoxische Agentien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor vorort zu schädigen. Aufgrund der tumorspezifischen Expression von B99 sind dabei keine oder nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von B99-Äntikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die B99 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen. Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-B99-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 für beschrieben.
Das TAA der Bezeichnung B99 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Deter inanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B99- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim
Nierenzell-, Lungen-, Kolon-, Pankreas-, Brust- und
Magenkarzinom.
Auf Grund der bevorzugten Expression von B99 in Tumorzellen kann angenommen werden, daß dieses Protein eine wichtige Funktion für den Tumor hat, z.B. für Entstehung, Infiltration und Wachstum. B99(DNA) kann daher in Screening-Assays verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität dieses Proteins modulieren, insbesondere inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein derartiger Assay darin bestehen, das B99 Protein, oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von B99 mit Proliferation reagieren, einzubringen bzw. die entsprechende B99 DNA in der Zelle zur Expression zu bringen, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testsubstanz zu bestimmen. Substanzen mit proliferationshemmender Wirkung können zur Behandlung von Tumoren mit starker B99-Expression verwendet werden, insbesondere beim Nierenzeil-,
Lungen-, Kolon- und Mammakarzinom sowie beim Hodgkin- Lymphom. Figurenübersicht
Fig. 1: RT-PCR Analyse von cDNA-Pools verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99- spezifischen Primern
Fig. 2: RT-PCR Analyse von individuellen cDNAs verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern
Fig. 3: Transkription von B99 in Normalgeweben: Northern Blot Analyse von mRNA aus 16 Normalgeweben
Fig. 4: Immunhistochemische Analyse von vier verschiedenen Fällen von Adenokarzinomen mit B99-Serum
Fig. 5: MHC Stabilisierung auf T2-Zellen mittels verschiedenen Konzentrationen von B9-9-Peptiden
Beispiel 1
RDA („Representational Difference Analysis") von der humanen Adenokarzinomzelllinie der Lunge (A549) und normalem Lungengewebe
Die von ATCC bezogene humane Lungenadenokarzinom- Zellinie A549 (CCL 185) wurde in T150
Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente MEM mit 10% hitze-inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1:5 bis 1:10 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8g NaCl, 0,2g KC1, 1,13g Na2HP0-wasserfrei, 0,2g KH2P04, 100ml 2,5% Trypsinlösung, lg EDTA-Na-Salz; pH7,2-7,4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Die 4 ml wurden in ein 15 ml Falconröhrchen transferiert, mit 8 ml PBS versetzt, bei 1200 rpm in einer Haereus Tischzentrifuge (Megafuge 2.0R) 5 min bei 4°C zentrifugiert, das Zellpellet mit 1 ml Lysis-Puffer (lOmM TrisHCl pH8, 140mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5% NP40) versetzt, kräftig geschüttelt und in einem 2 ml Eppendorfgefäß bei 12 000 rpm und 4°C 5 min in einer Sigma Tischzentrifuge (Sigma 202 MK) abzentrifugiert . Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und nach Zusatz von 55 μl 20% SDS-Lösung zweimal mit dem doppelten Volumen an einer CHCl3/Phenol (1:1 v/v) Mischung und einmal mit dem einfachen Volumen an CHC13 extrahiert. Die wässrige RNA-enthaltende Phase wurde mit 1/10 Volumen an 3M NaAc (pH5) und dem zweifachen Volumen an 96% EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C die RNA präzipitiert . Ausgehend von 1 mg total-RNA wurde für die Isolierung von poly-A(+)RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller- Protokoll vergegangen. Die Lagerung der A549 poly- A(+)RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml in DEPC- behandeltem H20 erfolgte in Aliquots bei -80°C.
Zur Durchführung der repräsentativen Differenzanalyse (RDA; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) wurde die poly-A(+)RNA der Lungenadenokarzinom-Zellinie A549 als „fester", die von normalem Lungengewebe
(1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; #6524-1) als „driver" eingesetzt. Die RDA wurde unter Verwendung des PCR- select™ kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem
Hersteller-Protokoll durchgeführt mit der Ausnahme, daß ein modifiziertes Primer/Adaptor-2-Oligonukleotidsystem mit folgender Sequenz zum Einsatz kam: 5 ' -TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3 '
(Adaptor-2-alt-l; SEQ ID NO: 19),
5'-AGGGCGTGGTACCGAGCTCGAG-3' (nested-PCR-primer-2-alt; i SEQ ID NO: 20) und 5 ' -GGCTCGAGCTC-3' (Adaptor-2-alt-2;
SEQ ID NO: 21). Die neu generierten Primer/Adaptor- Sequenzen ermöglichen durch die Anwesenheit von drei neuen Restriktionsenzymschnittstellen (Kpn I, Sac I und
Xho I) in der Sequenz des nested-PCR-primer-2-alt nach
Klonierung der subtrahierten cDNA-Fragmente in den pPCRII-Vektor ein nachträgliches Herausschneiden der jeweiligen cDNA-Fragmente. Das Designen einer
Primer/Adaptorsequenz mit mehreren verfügbaren
Restriktionsenzymschnittstellen war deshalb notwendig, weil besonders in den Primersequenzen - bedingt durch die PCR-Amplifikationsschritte- oft Punktmutationen zu beobachten waren.
Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde die erhaltene cDNA von „fester" und „driver" mit Rsal verdaut (Rsal ist ein 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym und liefert im statistischen Mittel 256 bp lange cDNA-Fragmente) .
Gleiche Teile von „tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren 1 oder 2 ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuß an „driver-cDNA" bei 65 °C hybridsiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter „driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten „fester" -spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR mit für die Adaptoren 1 bzw. 2 spezifischen Primern exponentiell amplifiziert. Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten („nested") Primern unterworfen. Die aus dieser Reaktion resultierenden, exponentiell amplifizierten cDNA-Fragmente wurden direkt in den pCRII-Vektor (Invitrogen; „TA-cloning vector" ) ligiert und anschließend ein Drittel des Ligationsansatzes in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transfiziert.
712 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden erhalten und in 96-Napf Blöcken in LB-Amp Medium (1,3 ml pro Napf) für 48 h bei 37°C kultiviert. Pro Napf wurden 750 μl der E. coli Suspensionen für die
Präparation der Plasmid-DNA eingesetzt (96-Napf- Minipräparationsmethode von QIAgen nach Vorschrift des Herstellers) . Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Gycerinstamkulturen bei -80°C gelagert.
Es wurde eine aus 712 Einzelklonen bestehende cDNA-
Subtraktionsbibliothek erhalten, die sowohl in Form von E. coli Glycerin-Stammkulturen als auch in Form gereinigter Plasmide vorlag.
Beispiel 2
DNA-Sequenzierung und Annotation von TAA-Kandidaten
Die isolierte Plasmid-DNA sämtlicher 712 Klone (siehe Beispiel 1) wurde nach der Sanger-Methode auf einem ABI-Prism Gerät sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels der BioScout-Software (LION, Heidelberg) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Von 712 Klonen konnten 678 sequenziert und annotiert werden. Der Rest (34) wies als Insert entweder nur poly(A) Sequenzen auf oder entsprach einem religierten Vektor oder war nicht sequenzierbar. Von den 678 annotierbaren Sequenzen erwiesen sich 357 als Gene mit bekannter Funktion. Die restlichen 321 repräsentierten Klone, kodierend für Gene mit unbekannter Funktion; 59 davon wiesen nicht einmal Einträge in der humanen EST-Datenbank auf. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für jene unbekannten Gene, für die ein EST-Eintrag verfügbar war, wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurden all jene ESTs mit > 95%
Identität (BLAST) , die zur entsprechend experimentell ermittelten Sequenz der Subtraktionsbibliotheken gehörten, überprüft. Bei der Annotation wurde eine Unterteilung in i) kritische Normalgewebe, ii) foetale, „verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und iii) Tumore und Tumor-Zellinien vorgenommen. Auf der Basis dieses „virtuellen mRNA-Profils" wurden 200 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe i) gefunden wurden, für weitere experimentelle Analysen ausgewählt (inklusive der 59 Klone, für die keine EST-Eintragung vorlag) . Zur weiteren Einengung der Kandidatenklone wurden aus den von den 200 ausgewählten Klonen ermittelten Sequenzen Oligonukleotidprimerpaare entworfen und synthetisiert. Es wurden zunächst 8 verschiedene, von humanem Gewebe abgeleitete cDNA- Bibliotheken (GibcoBRL „SUPERSCRIPT™"), welche direktional in pCMV-SPORT kloniert sind, mittels qualitativer PCR auf das Vorhandensein der jeweiligen Kandidaten getestet. Die dabei eingesetzten cDNA- Bibliotheken stammten aus Gewebe von Herz (#10419-018) , Leber (#10422-012), Leukozyten (#10421-022), Niere (#10420-016), Lunge (#10424-018), Testis (#10426-013), Gehirn (#10418-010) und fötalem Gehirn (#10662-013) .
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 20 μl i Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz enthielten lx TaqPol-
Puffer(50mM KC1, 10 mM TrisHCl pH9, 0,1% Triton X-100) , 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Promega), 0,025 U/μl Taq- DNA-Polymerase (Promega), jeweils 5 pM an spezifischen Oligonukleotidprimer SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 und 100 ng der jeweils zu untersuchenden Plasmid-DNA. Zur Kontrolle wurden spezifische Primer für GAPDH (SEQ ID NO: 14 und 15) eingesetzt. Zur Überprüfung des selektiven Nachweises wurden die Primerpaare parallel auch auf das isolierte Plasmid hin ausgetestet. Die Nachweisbarkeit von Fragmenten der zu erwartenden Länge in einem der kritischen Normalgewebe (Herz, Leber, Lunge, Niere und Leukozyten), nicht jedoch in den cDNA- Bibliotheken aus immunprivilegierten Geweben (Gehirn, fötales Gehirn und Testis) unter diesen PCR-Bedingungen (1 Zyklus: 3' 94°C; 35 Zyklen: 1' 94°C - 1' 55°C - 1' 72°C; 1 Zyklus: 7' 72°C) wurde als Ausscheidungskriterium definiert. Mittels dieser qualitativen PCR-Analyse konnte die Zahl der Kandidaten auf 56 eingeengt werden. Beispiel 3
Transkriptionelle Analyse der Kandidaten-Klone in verschiedenen Tumor- und Normalgeweben
Für die RT-PCR Analyse wurden cDNA-Pools verwendet die aus je 3 μg total-RNA von 3 verschiedenen Geweben des gleichen Typs hergestellt wurden. Die 9 μg total-RNA pro Gewebepool aus Tumor- oder Normalgeweben wurden mittels AMV-RT (Promega) entsprechend der Herstellerempfehlung revers transkribiert. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit genomischer DNA wurde die RNA vorher mit DNAse I (Boehringer Manheim) inkubiert. Qualität und Menge der cDNAs wurde durch PCR mit GAPDH spezifischen Primern (SEQ ID NO: 14 und 15) nach 20 Zyklen (30" 95°C, 90" 60°C) überprüft. B99-cDNA wurde durch 25, 30 und 35 Zyklen des Programms 1' 95°C, 1' 55°C, 1' 72°C mit den B99-spezifischen Primern gemäß SEQ ID NO: 7 und 8 a plifiziert . Analog wurden die anderen 55 Kandidaten-Klone mit jeweils spezifischen Primern untersucht. Die PCR Produkte wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und
Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen. Für 3 der 56 untersuchten Klone konnte mittels RT-PCR eine vermehrte Expression in verschiedenen Tumorgeweben im Vergleich zu Normalgeweben gezeigt werden. Ein Beispiel für Kandidat B99 ist in Fig. 1 gezeigt: Die RT-PCR Analyse von cDNA-Pools verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern ergab ein starkes Signal im Kolonkarzinom und in der Lungenadeno- Karzinomlinie A549 sowie ein schwaches Signal im Brustkarzinom und im Nierenzellkarzinom. Von allen untersuchten Normalgeweben war ein schwaches Signal nur in Kolongewebe feststellbar. Im weiteren Verlauf wurde der Kandidat B99 genauer evaluiert.
Beispiel 4
Expressionsprofil von B99 in Tumor- und Normalgeweben
Einer der 56 Kandidaten (Bezeichnung: B99) zeigte mittels RT-PCR Transkription in 3 von 5 getesteten Tumorgewebe-Pools ein Signal. In den meisten getesteten Normalgeweben konnte hingegen keine Transkription festgestellt werden.
Für eine detaillierte Untersuchung der B99-Expression wurden im folgenden cDNAs individueller Tumor- und Normalgewebeproben mittels PCR analysiert. Dabei zeigte sich, daß die Mehrzahl aller untersuchten Kolonkarzinome (17/ 23), alle Pankreaskarziriome (3/ 3) und alle Magenkarzinome (4/4) B99 exprimieren. In entsprechenden Normalgeweben wurde eine Expression in 1/ 4, 0/ 3 bzw. 2/ 4 Fällen nachgewiesen. Alle Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, Fig. 2 zeigt exemplarische Ergebnisse für Pankreas- und
Kolongewebe: Mittels RT-PCR Analyse von individuellen cDNAs verschiedener humaner Tumor- und Normalgewebe mittels B99-spezifischen Primern konnte in 6 von 7 Tumorproben B99-CDNA nachgewiesen werden, während nur eines der untersuchten Normalgewebe (1/ 6) eine schwache Expression von B99 zeigte. Tabelle 1
Figure imgf000041_0001
Für die Northern Blot Analyse wurden Human Multiple Tissue Northern blots (Clontech, Palo Alto) mit dem [α-32P]dCTP (NEN, Boston) markierten 271 bp B99 PCR Produkt bei 65° für 16 h hybridisiert. Die Visualisierung erfolgte durch Standard-Autoradiografie (Xomat AR film, Kodak) und Exposition auf einen Phosphoimager (Molecular Dynamics) . Fig. 3 zeigt das Ergebnis dieser Analyse von 16 Normalgeweben. Dabei zeigte sich lediglich in Kolon und deutlich schwächer in Duodenum ein Transkript von ~3,0 kb Größe. Die geringe Intensität des Signals läßt jedoch eine immunologisch relevante Expression als unwahrscheinlich erscheinen.
Das Ergebnis aller Versuche bezüglich des mRNA-Profils von B99 (kompiliert aus RT-PCR und Northern Blot Analyse) ist in Tab. 1 zusammengefaßt. Beispiel 4 zeigt, daß B99 in einem hohen Prozentsatz von Tumoren verschiedener Indikationen deutlich transkribiert wird, während in allen untersuchten Normalgeweben keiner Oder nur vereinzelte Transkription gefunden wurde.
Beispiel 5: Nachweis der Proteinexpression von B99 im humanen Tumoren
Zum Nachweis der Proteinexpression von B99 wurden B99- spezifische Antikörper in Kaninchen generiert. Zum Immunisieren wurde das bakterielle Fusionsprotein pGEX- ORF2-1/1 verwendet (Position 1278 bis 1740 SEQ ID No:l) verwendet, das erhaltene Serum wurde mittels Peptid B99-KML (SEQ ID NO: 61) affinitätsgereinig . Zur Überprüfung der spezifischen Reaktivität des Serums wurde der gesamte Leserahmen von B99 als GFP- Fusionsprotein transient in COS-Zellen exprimiert und die transfizierten Zellen im Western-Blot mit dem Serum B99-NKF getestet. Dabei zeigte sich, daß das Serum deutlich mit dem exprimierten B99 Fusionsprotein reagiert. In weiterer Folge wurden 56 Proben von verschiedenen Tumortypen immunhistochemisch mit dem Serum B99-NKF auf B99 Expression hin analysiert (Tabelle 2) . Dabei zeigte sich in 53 Fällen eine Expression von B99 in den Tumorzellen. Beispiele sind in Fig. 4 zu sehen, die die immunhistochemische Analyse von vier verschiedenen Fällen von Adenokarzinomen zeigt (a: Kolon, b: Brust; c: Pankreas; d: Magen) . In allen Fällen ist eine deutliche Anfärbung der Tumorzellen zu sehen, während Bindegewebe und Gefäße keine Anfärbung zeigen. In Fig. 4a kann man weiterhin sehen, daß residuale normale Kolonmukosa keine Reaktivität mit dem Antikörper zeigt. Die Gegenfärbung der Schnitte erfolgte mit Hämatoxylin. Die positive Reaktivität in der Immunhistochemie wurde in einer Auswahl"der Fälle mittels RT-PCR auch auf RNA-Ebene bestätigt .Dabei lieferten auch Brusttumoren ein positives PCR-Signal. Dieser gegenüber Beispiel 4 unterschiedliche Befund kann durch die Verwendung anderer PCR-Primer als in Beispiel 4 erklärt werden.
Tabelle 2
Figure imgf000044_0001
Beispiel 6
Klonierung von B99
Klon B99 besitzt zwischen den durch die RDA eingeführten Adaptoren ein 271 bp langes Insert eines unbekannten humanen Gens. Zur vollständigen Klonierung der humanen Sequenz wurde wie folgt vorgegangen: eine UniGene Analyse (National Center for Biotechnology Information) ergab folgende zu B99 homologe ESTs: AA315469, AA345780, AA295520. Mit Hilfe dieser ESTs konnte die B99 Sequenz auf 439 Nukleotide verlängert werden. Neue Primer innerhalb dieser Sequenz wurden synthetisiert (SEQ ID NO: 9 bis 12). Durch PCR mit verschiedenen Kombinationen dieser Primer konnten die jeweiligen theoretischen Fragmentlängen aus A549 cDNA amplifiziert werden. Klonierung des 3 '-Endes; 10 μg total-RNA aus der Nierenzellkarzinom-Zelllinie 786-0 wurden mittels Oligo-dT Primer revers transkribiert, und ein Aliquot dieser cDNA wurde einer PCR unterzogen, deren Programm mit hohen Annealingtemperaturen beginnt, sodaß nur der genspezifische Primer. an die cDNA bindet (Primer SEQ ID NO: 7 bzw. 9), während der zweite Primer (Tm~53°C, SEQ ID NO: 13) erst bei niedrigerer Temperatur an die neu synthetisierte DNA-Vorlage bindet. Diese sog. "touch-down PCR" (Mastercycler Gradient, Eppendorf) wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 20 Zyklen {15" 95°C, 30" 75°C (reduziert um 0,7°C je Zyklus)}, TZyklus7' 72°C, sowie 20 Zyklen (15" 95°C, 30" 50°C), 1 Zyklus7' 72°C}.
Ein Aliquot des obigen Ansatzes wurde mittels einer zweiten Primerkombination (SEQ ID NO: 7 und 13 bzw. SEQ ID NO: 12 und 13) unter den gleichen Bedingungen- wie vorher erneut PCR amplifiziert. Aliquots der PCR- Ansätze wurden direkt in den pGEM-T easy-Vektor (Promega) ligiert und anschließend in kompetente E. coli J109 (Promega) transformiert. Positive Klone wurden nach PCR-Selektion sequenziert. Die Sequenzierung ergab eine Übereinstimmung mit der bisherigen Sequenz ab dem für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer und darüberhinaus 1777 zusätzliche Nukleotide bis zum Beginn einer PolyA-Sequenz im 3 '-Bereich der Sequenz. PCR Amplifikation von cDNA aus Tumorzelllinien (786-0, A549) sowie Gewebeproben von Kolonkarzinomen mit den Primern gemäß SEQ ID NO: 16 bis 18 ergaben mit den ursprünglichen Primern die nach der
Klonierung erwarteten Fragmente. In dem nunmehr aus 2216 bp bestehenden cDNA-Fragment konnte ein durchgehender Leserahmen von Pos. 427 bis 1743 identifiziert werden. Weiter im 5 '-Bereich der Sequenz konnten keine zusätzlichen Leserahmen identifiziert werden, woraus zu schließen ist, daß der Bereich von 0 bis 427 bereits zum 5 '-nicht translatierten Bereich der B99 mRNA gehört.
Mit Hilfe der Printer SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 17 wurde der gesamte kodierende Bereich von B99 aus A549-cDNA amplifiziert, kloniert und sequenziert. Bei der Sequenzierung wurden mehrere Klone mit einer
Insertion von einem Nukleotid an Pos. 923 im Vergleich zu SEQ ID NO:l (kodiert für B99-1) erhalten (SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5).
Diese Insertion führt zu einer Veränderung des offenen Leserahmens von B99 mit einer daraus resultierenden veränderten Aminosäuresequenz im C-terminalen-Bereich des B99-Proteins; die von diesem Leserahmen abgeleitete Sequenz des B99-Antigens (B99-2) ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt.
Einer der aus A549-Zellen isolierten Klone zeigte neben der genannten Insertion einen Nukleotidaustausch an Position 622 im Vergleich zu Sequenz SEQ ID NO:l auf. Dieser Nukleotidaustausch bedingt an Position Nr. 66 der Aminosäuresequenz einen Ersatz von Arginin (SEQ ID NO: 2, B99-1) durch Tryptophan (SEQ ID NO: 4, B99-2) . Abgesehen von diesem Aminosäureaustausch ist die Aminosäuresequenz von B99-2 bis zu Position 166 identisch mit B99-1.
Darüberhinaus bedingt die genannte Insertion einen zweiten potentiellen Leserahmen von Pos. 845 bis 1744 der in SEQ ID NO: 3 (bzw. SEQ ID NO: 5) dargestellten Sequenz. Ein von einer cDNA mit diesem Leserahmen exprimiertes Protein weist die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz auf (B99-3) . Die Sequenz von B99-3 ist von Pos. 1 bis 27 unterschiedlich zu B99-1 und ab Pos. 28 identisch mit B99-1.
Beispiel 7
Potentielle MHC-Bindungspeptide in der kodierenden Region von B99
Potentielle Peptid-Epitope innerhalb der kodierenden Region von B99-1 gemäß SEQ ID NO: 2
(Aminosäureposition: 1-438; Tab. 3A) , von B99-2 gemäß SEQ ID NO: 4 (Aminosäureposition 150-190; Tab. 3B) und von B99-3 gemäß SEQ ID NO: 6 (Aminosäureposition 1-40; Tab. 3C) wurden mittels den von Parker et. al., 1994 beschriebenen Algorithmen unter Zugrundelegung bekannter Motive (Rammensee et al. 1995) durchgeführt. Für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, wurden 9-mer
Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 3 aufgelistet. Durch analoges Vorgehen können weitere potentielle
Peptid-Epitope für andere HLA-Typen bzw. 8- und 10-mer Peptide ermittelt werden. Tabelle 3A
Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-1 )
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Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Tabelle 3B
Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-2 )
Figure imgf000051_0001
Tabelle 3C
Immunogene B99-Peptid-Kandidaten (B99-3 )
Startposition in SEQ ID NO: 6/ SEQ ID NO:
2 Arg Arg Leu Lys Thr Leu AI, B14 Lys Gly Tyr
5 Lys Thr Leu Lys Gly Tyr A*0201 Cys Glu Leu
10 Tyr Cys Glu Leu Cys Met AI Pro Leu Arg
12 Glu Leu Cys Met Pro Leu AI, A3 Arg Thr Tyr
14 Cys Met Pro Leu Arg Thr A*0201 Tyr Thr Val
16 Pro Leu Arg Thr Tyr Thr A*0201 Val Ser Met Beispiel 8
MHC-Stabilisierungsversuch mit potentiellen B99-spezifischen MHC-Bindungspeptiden
Potentielle B99-MHC-Bindungspeptide wurden in einem T2-Peptid-Beladungsversuch auf ihre Fähigkeit hin überprüft, HLA-A2 Moleküle auf der Oberfläche von T2-Zellen zu stabilisieren, was einen Hinweis auf ihre MHC-Bindungsfähigkeit darstellt. Der Versuch wurde durchgeführt, wie von Böhm et al . , 1998, beschrieben. Die Stabilisierung wurde durch eine FACS-Analyse mit einem HLA-A2 spezifischen Antikörper (BB7.2) gemessen. Fünf Peptide zeigten einen Stabilisierungseffekt wenn sie in einer Konzentration von 100 μg/ ml verwendet wurden, dargestellt durch eine Erhöhung der mittleren Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Kontrolle ohne Peptid bzw. zu einem MAGE-3 Al-Kontrollpeptid, welches keine Bindung zeigt. (Tabelle 4) :
Tabelle 4
Figure imgf000054_0001
Zur weiteren Analyse wurden diese Peptide in einer Verdünnungsreihe im selben Testsystem untersucht, um eine eventuelle Konzentrationsabhängigkeit der Bindung zu zeigen. Fig. 5 zeigt die MHC Stabilisierung auf T2-Zellen mittels verschiedener Konzentrationen von B99 Peptiden. Insbesondere die Peptide B99-19, B99-187 und B99-209 zeigen eine deutliche
Konzentrationsabhängigkeit der MHC-Stabilisierung, weshalb diese Peptide bevorzugte Kandidaten für Immunisierungsstrategien sind. Als Positivkontrolle wurde Tyrosinase, als Negativkontrolle das HLA-Al- spezifische Peptid MAGE-3 verwendet. Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B99, ausgewählt aus der Gruppe von Polypeptiden mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegebenen Aminosäuresequenz.
2. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist.
3. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 1 oder 2, das eine humorale Immunantwort auslöst.
4. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 1 oder 2, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.
5. Immunogenes Peptid nach Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 22 bis 55.
6. Immunogenes Peptid nach Anspruch 5, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 31, 57 und 59.
7. Immunogenes (Poly) peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly) peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die B99 exprimieren.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly) peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie verschiedene von B99 abgeleitete immunogene Peptide enthält.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere von B99 abgleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthält.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.
12. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften eines in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigens oder für Fragmente davon.
13. DNA-Molekül nach Anspruch 12, kodierend für ein immunogenes Polypeptid der Bezeichung B99 mit der in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.
14. DNA-Molekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO:l, 3 oder 5 dargestellten Sequenz ist oder mit einem Polynukleotid der in SEQ ID N0:1, 3 oder 5 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
15. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA- Molekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14.
16. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 12 bis 15, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen, wobei das von dem DNA-Molekül exprimierte B99-
(Poly) peptid eine Immunantwort gegen TumorZeilen des Patienten induziert, die B99 exprimieren.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksamen Bestandteil ein oder mehrere der in einem der Ansprüche 12 bis 16 definierten DNA-Moleküle.
18. Verwendung von Zellen, die das in Anspruch 1 definierte tumorassozierte Antigen exprimieren, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
19. Antikörper gegen ein in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiertes (Poly) peptid.
20. Antikörper nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
21. Antikörper nach Anspruch 19 oder 20 für die
Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von B99 assoziiert sind.
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