JP2007534954A - 標的が携わる機能的カスケードを選択的に修飾できるリガンドを同定する方法、及び興味対象分子のハイスループットスクリーニングのためのその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
しかし、新規薬剤の発見は、効果的な分子のライブラリのハイスループットスクリーニング方法、すなわち、制限された数の選択された分子(ヒット)から、治療されることを意図する病理に対してインビボで活性な分子(リード)を単離することを可能にする方法の開発を伴う。
実際に、スクリーニングの間に選択されたヒットの活性を確かめることを可能にする機能性試験(細胞培養におけるインビトロで又は適切な動物モデルにおけるインビボで)は、通常、ハイスループットに適用可能ではない。
アプタマ及び/又はペプチドを用いるスクリーニング方法は、Lapanら, Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 507〜516; Greenら, BioTechniques, 2001, 30, 1094〜1110; Burgstallerら, Drug Discovery Today, 2002, 7, 1221〜1228; PCT国際出願WO 98/19162及びWO 03/059943並びに米国特許第6329145号に説明されている。
第二工程において、標的に対して修飾活性を有するアプタマ/ペプチドを、アプタマ/ペプチドと標的との間に存在する結合を置き換えることができるヒットを同定するための競合的結合アッセイにおいて用いる。標的についてのヒットの修飾活性は、その後、「リード」分子を単離するために、細胞培養におけるインビトロで又は適切な動物モデルにおけるインビボでの機能性試験により確かめられる。
a) 標的に結合できかつ該標的が携わる機能的カスケードを修飾できる、抗体又は免疫グロブリン鎖の可変ドメインの少なくとも1つを含む抗体フラグメントを同定し、
b) 上記の標的とa)で同定された抗体又は抗体フラグメントとの結合を修飾するリガンドを、分子のライブラリを用いてスクリーニングし、そして
c) b)で得られた修飾性リガンドから、上記の機能的カスケードを修飾できるものを同定する
を含むことを特徴とする、標的が携わる機能的カスケードを選択的に修飾できるリガンドを同定する方法である。
上記で規定される本発明の方法の工程は、図1に模式的に示す。
以下の用語:
「機能的カスケード」は、各反応が前の反応に依存しかつ細胞内での測定可能な生物活性をもたらす細胞内の反応(酵素反応、分子相互作用、立体配置変換、化学修飾)の連続を伴う代謝経路、シグナリング経路又は活性化カスケードを意味することを意図する。
「修飾」は、正又は負の修飾:全体的又は部分的な活性化若しくは阻害を意味することを意図する。
適切な細胞系及び生物のうち、特に、上記の機能的カスケードを伴う生理的又は病理学的プロセスのモデル、限定しないが例えば糖尿病、アレルギー、関節炎又は喘息のモデルであるものを挙げることができる。
細胞系でのインビトロでの、又は適切な生物におけるインビボでのこの確認において用いられる機能性試験は、治療的又は治療的でない目的のために修飾されようとする生物活性に依存する。細胞における測定できる生物活性の限定しない例としては、特に、分裂、移動(migration)、脱顆粒、膜を介する輸送、分化、アポトーシス、複製、転写、及びサイトカインのような因子の産生が挙げられる。インビトロ又はインビボで上記の生物活性を測定するための機能性試験は、当業者に知られている。
- 上記の標的に結合できる抗体又は抗体フラグメントを、特にファージ-ELISAによりスクリーニングすることからなる第一工程と
- 特に、上記の抗体又は抗体フラグメント(細胞内である抗体又は抗体フラグメント)を発現するためのベクターで改変された細胞において、上記の機能的カスケードを修飾できる抗体又は抗体フラグメントを同定することからなる第二工程と
を含み得る。
- 試験されるべき分子のライブラリを標的又は上記で規定されるその誘導体の1つと接触させ、
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを加え、そして
- 上記の分子ライブラリの存在下又は非存在下で、いずれの適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含む。
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを、標的又は上記で規定されるその誘導体の1つと接触させ、
- 試験されるべき分子のライブラリを加えて、抗体又は抗体フラグメントを標的のフラグメントとのその複合体から置き換えることができる分子を検出し、そして
- 上記の分子のライブラリの存在下又は非存在下で、いずれの適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含む。
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを、試験されるべき分子のライブラリと混合し、
- 上記の混合物を、上記で規定される標的又はその誘導体の1つと接触させ、そして
- 上記の分子のライブラリの存在下又は非存在下で、適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含む。
これらのタンパク質の限定しない例としては、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばSykタンパク質のような酵素;IL-13受容体、EGF受容体又はTNF受容体のようなサイトカイン受容体;SLP-76及びE6-APのようなアダプタタンパク質;HSP70及びHSP60のようなシャペロンタンパク質;及びNF-κB、I-κB、Akt、PSAT-1、p53、p73及びBcl2ファミリーのような調節タンパク質が挙げられる。
- 機能的カスケードに携わる標的、上記で規定される興味対象部位を少なくとも含む上記標的のフラグメント、上記の標的のミモトープ、又は標的の上記の興味対象部位の内部イメージを表現する抗イディオタイプ抗体、
- 上記の標的に結合できかつ上記の標的が携わる上記の機能的カスケードを修飾できる、抗体又は免疫グロブリン鎖の可変ドメインの少なくとも1つを含む抗体フラグメント、あるいは上記で規定される抗体又は抗体フラグメントのライブラリ、並びに
- 上記で規定される、試験されるべき分子のライブラリ
を含むことを特徴とする、上記で規定される方法を行うためのキットでもある。
これは、治療上又は治療上でない興味の新規な特性を示す分子、又は比活性及び/又は治療係数が改善されたこれらの分子の誘導体をスクリーニングするのに用いることができる。
分子ライブラリは、当業者に知られる、コンビナトリアル化学合成の通常の方法に従って調製される。
- モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein (Nature, 1975, 256, 495〜497)の方法に従って、免疫された動物からのBリンパ球とミエローマとの融合により得られるハイブリドーマから産生される。ハイブリドーマは、インビトロで、特に醗酵槽で培養されるか、又はインビボで、腹水の形で産生される。あるいは、上記のモノクローナル抗体は、Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display Methods and Protocols, P.M. O'Brien及びR. Aitken. Humana Press, 第178巻, 2002に記載されるようにして、遺伝子工学により産生される。例えば、等容量の完全フロイントアジュバント中の抗原の腹腔内注射による最初の免疫化、及び同じ条件ではあるがこの場合は不完全フロイントアジュバントを用いる、15日後の2回目の免疫化(ブースター)を含む標準的なプロトコルに従って、適切な動物を、標的又はそのフラグメントの1つで反復免疫する。モノクローナル抗体は、最後のブースターの2週間後に動物を犠牲にし、脾臓を回収し、脾臓リンパ球を懸濁し、これらのリンパ球を、いずれのマウス抗体を産生せず、不死化されかつ免疫グロブリンの分泌に要求される全ての機構を有するSP2/0マウス細胞系統と融合させることを含む標準的なプロトコルに従って産生される。
本発明の方法は、生理病理学的プロセスに選択的及び特異的に作用しかつ薬剤として用いることができる可能性がある新規な分子を、2つのスクリーニング工程:
- 容易に自動化でき、ハイスループットに適する結合アッセイによる、標的と抗体又は抗体フラグメントとの相互作用を模倣し(イディオタイプ的アプローチ)、よって上記の標的が携わる機能的カスケードを修飾できる分子のスクリーニングの工程、及び
- 上記の標的が携わる機能的カスケードを修飾できる分子の、細胞培養又は適切な動物モデルでの機能性試験による、特に該カスケードに起因する生物活性を測定することによるロースループットスクリーニングの工程
の組み合わせを介して同定することを可能にする。
- 本発明の方法は、全ての細胞標的に適切であり、
- 本発明の方法は、タンパク質−タンパク質の種類の相互作用によりパートナーに結合できる興味対象の標的のいずれの部位、特に該標的の表面での部位の特異的及び高親和性(1 nM程度)の認識に適し、したがって、このスクリーニング方法により単離されるリガンドは、特に標的についての親和性/特異性の点で同じ特性を有するはずであり、
- 本発明の方法は、標的との相互作用が抗体と分子ライブラリから選択されるリガンドとにより模倣される天然のパートナーの知見を必要としない。
- 図1は、本発明による方法の概略図である。
- 図2は、標的及びそれが携わる機能的カスケードの概略図である。
- 図4は、標的としてSykタンパク質を、及びコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための抗体としてG4G11 scFvフラグメントを用いる本発明による方法の確認を示す。ELISAによるスクリーニングに由来する10の分子のうち、少なくとも1つは、β−ヘキソサミニダーゼ放出試験において炎症メディエイタの放出を強く阻害する。3μMの濃度において、薬剤は、IgEによる誘導される脱顆粒の93%を阻害するが、イオノマイシンにより誘導される脱顆粒は阻害しない。
Sykタンパク質は、Bリンパ球、肥満細胞及び好塩基球並びにTリンパ球の副次集団を含むリンパ球系統のある細胞の活性化において重要な役割を演じる多機能性タンパク質チロシンキナーゼである。アレルゲンに関連するIgEのIgE受容体(FcεRI)による認識の後の肥満細胞系統の活性化は、ヒスタミン及びセロトニンのようなアレルギー性メディエイタの放出をもたらす。
Sykタンパク質は第二の経路に携わり(図3)、これがRasタンパク質、次いでMAPキナーゼ(MAPK)の活性化の原因となる。この経路は細胞増殖及び分化に携わり、この第二の経路の修飾は悪性の現象に導き得ることが示されているので、この経路を妨害しないことが重要である。
a) 材料
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のC-末端と融合した2つのSH2ドメインを含む組換えSykタンパク質を、大腸菌(E. coli)で産生させ、上記のPeneffらに記載されるようにして精製する。
抗体を用いる検出のためのc-mycタグ、及びアフィニティクロマトグラフィーによる精製のためのポリヒスチジンタグをC-末端に含む、G4G11とよばれる抗SykヒトscFv抗体フラグメントを大腸菌で産生させ、上記のPeneffらに記載されるようにして精製する。
試験される分子のライブラリは、3000の有機小分子のライブラリである(ChemBridge Corporation; http://chembridge.com)。
洗浄は、PBS/0.1% Tween 20緩衝液で行った。
組換えSykタンパク質(PBS中に10μg/ml)を、96ウェルプレート(Maxisorp(登録商標)、NUNC; 100μl、すなわちウェル当たり1μg)に、4℃で一晩吸着させた。最初の洗浄後、プレートの非特異的部位を、ウェル当たり250μlのPBS/1% BSAの溶液で、周囲温度にて一晩飽和させた。過剰の飽和溶液の洗浄後、ライブラリの分子(3000分子)を、50μlの容積中に20μMの濃度で加え、プレートを周囲温度にて1時間インキュベートした。次いで、scFvフラグメントを、50μlの容積中に150 nMの濃度で加え、プレートを周囲温度にて1時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体50μlを加え、ウェルを周囲温度にて30分間インキュベートした。最後の洗浄の後、ペルオキシダーゼ反応基質を100μlの容積で加え、プレートを5分間インキュベートし、50μlの2N H2SO4を加えることにより反応を停止した。450 nmでの吸光度を、自動ELISAプレートリーダーを用いて測定した。
ライブラリは、独立した実験において2回スクリーニングした。
試験されるべき分子による、Sykタンパク質のフラグメントとG4G11 scFvとの間の結合の阻害は:
((薬剤の非存在下でのシグナル)−(薬剤の存在下でのシグナル))/(薬剤の非存在下でのシグナル)
に等しい比Iにより測定される。
- 2990の分子は、いずれの阻害も発生しない (I = 1±0.2)
- 8の分子は、弱い阻害を生じる(0.4<I<0.8)
- 2の分子は、強い阻害を生じる(I≦0.3)。
ELISAにより選択された分子の修飾能力のインビボでの確認を、上記のDauvillierらにより記載されるβ−ヘキソサミニダーゼの放出の測定による肥満細胞脱顆粒試験により行った。
さらに、全でのタンパク質チロシンリン酸化並びにSyk、PLCγ-2及びMAPKタンパク質のチロシンリン酸化に対する、ELISAにより選択された分子の影響を、上記のDauvillierらに記載されるようにして分析した。
Hex S1/(Hex S1 + Hex S2)×100
に相当する。
I≦0.8の比を有するELISAスクリーニング由来の10の分子のうち、1つが、図4に示すようにβ−ヘキソサミニダーゼを強く阻害する。具体的には、この分子は、3μMの濃度でIgE誘導脱顆粒を93%阻害するが、イオノマイシン誘導脱顆粒には影響しない。
- これは、全体のタンパク質のリン酸化に影響せず(図5a)、
- これは、Sykのリン酸化に影響せず(図5c)、
- これは、MAPKのリン酸化に影響せず(図5b)、
- これは、PLC-γのリン酸化を減少させる(図5d)。
図4の最も活性な分子の、全身性アナフィラキシーショックを阻害する能力を、BALB/cマウスにおいて試験した。
より具体的には、マウスの群(群1)に、BALB/cマウス当たり100μgの割合で、抗DNPモノクローナルIgEを静脈内注射した。47時間後、及びDNP抗原の注射の1時間前に、分子を、100 mg/kgの割合で単回用量で投与した。分子の投与の1時間後に、2% Evansブルー含有DNP抗原を、マウス当たり1 mgの割合で静脈内注射した。コントロールマウスの3つの群を、群1と並行して試験した。すなわち:
- 群2:最大アナフィラキシーショックを測定するために、薬剤を投与していないBALB/cマウス(ポジティブコントロール)。
- 群3:不活性な分子を与えられたBALB/cマウス。
- 群4:IgEを投与されたがDNP抗原を与えられていないマウス(ネガティブコントロール)。
Claims (13)
- 少なくとも以下の工程:
a) 標的に結合できかつ該標的が携わる機能的カスケードを修飾できる、抗体又は免疫グロブリン鎖の可変ドメインの少なくとも1つを含む抗体フラグメントを同定し、
b) 分子のライブラリを用いて、前記標的とa)で同定された抗体又は抗体フラグメントとの結合を修飾するリガンドをスクリーニングし、そして
c) b)で得られた修飾性リガンドから、前記機能的カスケードを修飾できるものを同定する
を含むことを特徴とする、標的が携わる機能的カスケードを選択的に修飾できるリガンドを同定する方法。 - 前記工程a)及びb)が、標的又は標的の誘導体、例えば興味対象部位を少なくとも含むフラグメント、ミモトープ又は標的の前記興味対象部位の内部イメージを表現する抗イディオタイプ抗体を用いて行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記標的及びその誘導体又は前記抗体及び該抗体フラグメントが、適切な支持体上に固定化されているか及び/又は測定可能なシグナルを得るためのいずれの手段により標識されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- a)における前記抗体又は抗体フラグメントの同定が、抗体又は抗体フラグメントのライブラリ、好ましくはscFvフラグメントのライブラリ、好ましくはその表面でscFvフラグメントを発現するファージのライブラリをスクリーニングすることにより行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記スクリーニングが、前記ライブラリ又は該ライブラリから単離された前記抗体若しくは抗体フラグメントを発現するためのベクターを用いて改変された細胞を用いて行われる請求項4に記載の方法。
- 前記スクリーニング工程b)が:
- 試験されるべき分子のライブラリを、請求項2で規定される標的又はその誘導体の1つと接触させ、
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを加え、そして
- 前記分子のライブラリの存在下又は非存在下に、適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 前記スクリーニング工程b)が:
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを、請求項2で規定される標的又はその誘導体の1つと接触させ、
- 試験されるべき分子のライブラリを加えて、抗体又は抗体フラグメントを標的のフラグメントとのその複合体から置き換えることができる分子を検出し、そして
- 前記分子ライブラリの存在下又は非存在下に、適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 前記スクリーニング工程b)が:
- 任意に標識された抗体又は抗体フラグメントを試験されるべき分子のライブラリと混合し、
- 前記混合物を、請求項2で規定される標的又はその誘導体と接触させ、そして
- 前記分子ライブラリの存在下又は非存在下に、適切な手段により、標的に結合した抗体の相対量を測定する
ことを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 工程a)及びc)が、前記機能的カスケードに起因する生物活性を測定するための機能性試験により、特に適切な細胞系におけるインビトロ試験又は適切な生物におけるインビボ試験により行われることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的が、酵素、受容体、アダプタタンパク質、輸送体、シャペロンタンパク質及び調節タンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
- a)で同定された前記抗体又は抗体フラグメントが、Sykタンパク質のSH2ドメインに指向されかつPLCγ-2経路を特異的に阻害できることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)の前記ライブラリが、有機小分子のライブラリであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも:
- 機能的カスケードに携わる標的、興味対象部位を少なくとも含む該標的のフラグメント、該標的のミモトープ又は該標的の前記興味対象部位の内部イメージを表現する抗イディオタイプ抗体、
- 前記標的に結合できかつ前記標的が携わる前記機能的カスケードを修飾できる、抗体又は免疫グロブリン鎖の可変ドメインの少なくとも1つを含む抗体フラグメント、あるいは抗体又は抗体フラグメントのライブラリ、及び
- 試験されるべき分子のライブラリ
を含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法を行うためのキット。
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