WO2004009833A2 - Testsysteme zur auffindung von inhibitoren von inositolphosphatkinasen und verwendung dieser inhibitoren für die prophylaxe oder therapie von proliferativen erkrankungen - Google Patents

Testsysteme zur auffindung von inhibitoren von inositolphosphatkinasen und verwendung dieser inhibitoren für die prophylaxe oder therapie von proliferativen erkrankungen Download PDF

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WO2004009833A2 PCT/DE2003/002440 DE0302440W WO2004009833A2 WO 2004009833 A2 WO2004009833 A2 WO 2004009833A2 DE 0302440 W DE0302440 W DE 0302440W WO 2004009833 A2 WO2004009833 A2 WO 2004009833A2
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nucleic acid
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Georg W. Mayr
Marcus M. Nalaskowski
Kirsten Hillemeier
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Medlnnova Gesellschaft Für Medizinische Innovationen Aus Akademischer Forschung Mbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the invention relates to a test system for finding active substances for the prophylaxis and therapy of proliferative diseases.
  • the invention further relates to a new human gene, uses of this gene in screening methods, a test system with this gene, uses of various substances to inhibit this gene or its gene product.
  • the inositol phospholipids are the starting compounds in the formation of the messenger substances inositol 1, 4, 5-trisphosphate ⁇ Ins (1, 4, 5) P 3 ⁇ and diacylglycerol ⁇ DAG ⁇ .
  • the polyphosphoinositide phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate ⁇ Ptdlns (4, 5) P 2 ⁇ is contained in the plasma membrane as well as in the nuclear membrane (especially in the inner membrane). This becomes from phosphatidylinositol ⁇ Ptdlns ⁇ by two specific phosphoinositide kinases of the plasma and the nuclear membrane, PI4K and PI4P5K, which first (through PI4K) the 4-position of the inositol ring of Ptdlns to phosphatidylinositol-4-phosphate ⁇ PtdIns4P ⁇ and in one second phosphorylation reaction (by PI4P5K) phosphorylate the 5-position of PtdIns4P to Ptdlns (4, 5) P 2 .
  • PLC phospholipase C
  • PLC PLC-activated protein-coupled receptors
  • G protein-coupled receptors For example for the agonists acetylcholine, histamine and vasopressin, stimulate the subtypes of the PLC- ⁇ isoform on the plasma membrane.
  • growth factors EGF, PDGF etc.
  • these receptors are dimerized and this in turn leads to the mutual phosphorylation (so-called autophosphorylation) of tyrosine residues.
  • This isoform of the enzyme can bind to the tyrosine phosphate domains of the activated receptor via the SH2 domains which are present in the ⁇ -isoform of the PLC.
  • This membrane translocation and phosphorylation of tyrosine residues of this isoform activate PLC- ⁇ (Berridge, 1993).
  • the activation mechanism for the PLC- ⁇ has not yet been elucidated in detail.
  • the fat-soluble DAG remains in the plasma or nuclear membrane and activates the Ca 2+ and DAG-dependent isoforms of protein kinase C (PKC), which are involved in numerous intracellular regulatory mechanisms through the phosphorylation of cell proteins.
  • PKC protein kinase C
  • DAG is deacylated by lipases with the formation of arachidonic acid, which is the precursor for the synthesis of eicosanoids, which also act as messenger substances.
  • DAG is phosphorylated to phosphatidic acid by a specific DAG kinase and then converted into CDP-diacylglycerol with the participation of cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • CTP cytidine 5 'triphosphate
  • Ptdlns is transported back to the plasma membrane and the core membrane by a Ptdlns carrier and the resynthesis of Ptdlns (4, 5) P 2 via PtdIns4P (Shears, 1991) now takes place in these membranes, whereby the "phosphoinositide cycle" in its lipid portion is closed.
  • the water-soluble Ins (1,4, 5) P 3 diffuses into the cytosol and binds to the Ins (1, 4, 5) P 3 receptor of the endoplasmic reticulum (ER), which is a tetrameric intracellular receptor Ca 2+ channel (Berridge, 1993). This opens this channel so that Ca 2+ stored in the lumen of the ER flows out into the cytosol.
  • the In (1, 4, 5) P 3 signal can be inactivated by two metabolic pathways.
  • Various isoforms I to III of inositol polyphosphate 5-phosphatase dephosphorylate Ins (1,4, 5) P 3 at the 5-position to Ins (1,4) P 2 .
  • Further dephosphorylations follow in the 1- and 4-positions with the formation of myo-inositol, which goes into the resynthesis of phosphoinositides (Mayr, 1988; Shears, 1991). This is the only way to close the "phosphoinositide cycle" in its inositol phosphate content.
  • the other metabolic pathway is the phosphorylation of Ins (1,4, 5 ⁇ P 3 at the 3-position using inositol 1, 4, 5-trisphosphate 3-kinases ⁇ Ins (1,, 5) P 3 -3-kinases or IP3K's ⁇ to inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisphosphate ⁇ Ins (1,3,4, 5) P 4 ⁇ (Irvine et al., 1986).
  • Inositol 1, 4, 5-trisphosphate 3-kinase (IP3K) Inositol 1, 4, 5-trisphosphate 3-kinase (IP3K) activity was found ubiquitously in all animal tissues examined to date (Irvine et al., 1986). This enzyme plays a central role in the anabolic signal metabolism of inositol phosphates in animal cells. It metabolizes the secondary messenger Ins (1,4, 5) P 3 with the help of ATP to Ins (1, 3, 4, 5) P 4 .
  • This enzyme was purified from the smooth muscles of the pig aorta, from rat brain, from rat liver, from bovine brain and from human platelets.
  • the determined molecular weights of the IP3K from these different sources are in a range of 32-93 kDa.
  • This heterogeneity of the polypeptides was due to the existence of isoforms of the kinase (Takazawa et al., 1990) or to proteolysis during protein purification (Lee et al., 1990).
  • the Ins (1,4, 5) P 3 was identified in macrophages, in human lymphocytes, in rat thymus and in the retina.
  • isoforms A and B Two different cDNA clones were isolated from human brain tissue, which were designated as isoforms A and B (Takazawa et al., 1991a, Takazawa et al., 1991b).
  • the clone of isoform A has a 93% homology to the rat brain cDNA (Takazawa et al., 1991b).
  • isoforms A and B These isoforms have the greatest homology in their C-terminally located catalytic domain (Takazawa and Erneux, 1991).
  • the third isoform C isolated from human platelets has since been cloned and encodes a 75 kDa polypeptide with IP3K activity with recombinant expression (Dewaste et al., 2000).
  • IP3K The activity of IP3K is regulated both by Ca 2+ / CaM and by protein phosphorylation (Communi et al., 1995). While the isoform A already without CaM activation is very active and is activated by Ca 2+ -CaM by about a factor of 2, the isoform B, which is only slightly active without CaM activation, is very strongly activated by CaM. Isoform C appears to be activated more weakly than isoform B by Ca 2+ -CaM (Dewaste et al., 2000).
  • IP3K can be phosphorylated by PKC and cAMP-dependent protein kinase (PKA). Phosphorylation by PKA led to an increase in enzyme activity. In contrast, phosphorylation by PKC reduces the activity (Lin et al., 1990; Sim et al., 1990; Woodring and Garrison, 1997). Furthermore, the IP3K-A was phosphorylated by the calcium / cal odulin-dependent protein kinase (CaMK-), whereby the enzyme activity increased strongly and the K ⁇ value for CaM decreased (Communi et al., 1997). According to the investigations of the inventors, a corresponding regulation can also be demonstrated on isoform B.).
  • CaMK- calcium / cal odulin-dependent protein kinase
  • IP3K Key role of IP3K in signal transduction and biosynthesis of highly phosphorylated inositol phosphates.
  • IP3K The central importance of IP3K is also due to the ubiquitous occurrence of at least one isoform in all animal tissues and cell types examined to date. (Irvine et al., 1986) and because of their high specific activity.
  • Ins (1,4, 5) P 3 released in seconds to minutes by PLC activation is almost instantaneous converted to Ins (1, 3, 4, 5) P 4 .
  • This phosphorylation eliminates Ins (1,4, 5) P 3 and forms the only substrate known hitherto in animal cells for the biosynthesis of all higher-phosphorylated inositols (InsP 4 , InsP 5 , InsP 6 ).
  • the Ins (1, 3, 4, 5) P 4 biosynthesis also causes a sensitization for a subsequent Ins (1,4, 5) P 3 signal to come (Irvine and Schell, 2001).
  • Ins (1, 3, 4, 5) P 4 does this by phosphorylating at 6-OH an inositol phosphate multikinase (IPMK), which is also homologous to IP3K, but differs more in terms of sequence and substrate selectivity from the IP3K's - separates (see below).
  • IPMK inositol phosphate multikinase
  • P 3 becomes Ins (1, 3, 4, 6) through an Ins (1, 3, 4) P 3 -5/6 kinase (Wilson and Majerus, 1996) other than IPMK.
  • P 4 phosphorylates, the latter then again becoming Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 by an Ins (1, 3, 4, 6) P 4 -5-kinase (according to our unpublished data this is IPMK) phosphorylated.
  • Ins (1, 3, 4) P 3 -5 / 6-kinase also partially forms Ins (1, 3, 4, 5) P 4 from Ins (1,3, 4) P 3 , so it happens may have ensured that Ins (1, 3, 4, 5) P 4 remains high for as long as possible.
  • IPMK Inositol polyphosphate multikinase
  • IPMK inositol polyphosphate multikinase
  • ArgRIII phosphorylates various inositol phosphates at the 3- and 6-positions.
  • the Ins (1,4, 5) P 3 is converted to yeast
  • a homologous protein was cloned from the rat and
  • the human gene was first identified and cloned, bacterially expressed and characterized by two of the inventors. This cloning and a first characterization as a nuclear enzyme as well as the use of the human gene
  • this enzyme can specifically phosphorylate a relatively large number of other biological inositol phosphate isomers. Some of these additional in vitro detected phosphorylation reactions are also likely to be important for the biosynthesis of certain cellular InsP 5 isomers and of InsP 6 from low phosphorylated inositols. Under certain conditions, the human enzyme can also synthesize diphosphoinositol phosphates from Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 .
  • the IPMK of which up to now only a functional gene has been found in higher vertebrate genomes, in contrast to the IP3K, can via its partly with the IP3K-analogous reaction selectivity with sufficiently strong expression (IP3K has up to 10 times higher specific activity for the phosphorylation of Ins (1,4, 5) P 3 as IPMK) may replace the function of the former enzyme. Pharmacological inhibition of IP3K could therefore be at least partially compensated for by overexpression of IPMK.
  • the IPMK fulfills very specific functions in the biosynthesis of higher inositol phosphates, which are obviously specific for this enzyme and which, based on the results of the mutant yeast, are at least not fully substitutable by other enzymes there.
  • the biosynthesis of highly phosphorylated inositols and especially InsP 6 is essential for normal cell growth
  • the disturbances in the vacuolar sorting processes could be due to the fact that InsP 6 interacts with adapter proteins (AP2, AP3 / AP180, arrestin ß, COPI, Synaptotagmin, see summary: Irvine and Schell, 2001) in a number of special membrane sorting processes in a more eukaryotic way Cells plays an important role.
  • AP2, AP3 / AP180, arrestin ß, COPI, Synaptotagmin see summary: Irvine and Schell, 2001
  • Cells plays an important role.
  • a protein kinase activated by InsP 6 has recently been detected (Hilton et al., 2001), which plays an important role in the regulation of the endocytotic machinery through modulated interaction of the pacsin / syndapine phosphorylated by the kinase with dynamine.
  • InsP 6 plays an extremely important role for normal cell growth in the so-called non-homologous ligation of chromosomal DNA double-strand breaks (non-homologous end-joining, NHEJ). This process is catalyzed by a complex of five different proteins (two complexes of DNA-PK, Ku80 and Ku70, ligase IV and the protein XRCC4 associated with the chromosomal break ends. A cell-free implementation of this ligation reaction with chromatographically purified proteins was only possible if a non-protein factor from another chromatographic fraction was added, which was identified as InsP 6 by precise analysis (Hanakahi et al. 2000).
  • InsP 6 had to interact with the Ku subunit and not with DNA PK (Ma and Lieber, 2002). This essential role of InsP 6 in this mechanism of double-strand break repair, which is very important in higher eukaryotes, can be used for another deduce the causal role of InsP 6 biosynthesis in normal cell growth. Non-repaired double-strand breaks normally prevent cells from entering the S phase or the mitosis phase.
  • the invention now relates to the surprising finding that, in addition to these protein and phosphoinositide kinases previously regarded as essential for tumor cell proliferation, the inositol phosphate kinases IP3K and IPMK are also crucially involved in the proliferation of cells and the inhibition of IP3K and IPMK in everyone up to now A potent inhibitor identified in vitro on the recombinant enzyme inhibits the proliferation of tumor cells and usually also leads to their apoptosis.
  • Objects of the invention are specified in claims 14 to 23.
  • the invention relates to the inhibition of IP3 kinases and of IPMP by means of suitable inhibitors and a test system based on these enzymes for the detection of active substances for the prophylaxis and therapy of proliferative diseases, characterized in that it consists of one (a or b), two (a + c or a + b or b + c) or three (a + b + c) of the following components or contains them: a) An IP3K of any species and in whatever isoform (A, B, or C) , whereby this IP3K is mixed with the substance to be tested, a substrate for the IP3K and a phosphate donor is subsequently added to the mixture and it is checked whether the substance to be tested is able to inhibit the enzymatic activity of the IP3K in such a way that the substrate Ins (1,4, 5) P 3 is not or only slightly phosphorylated, b) An IPMK from whatever species and in whatever isoform, the IPMK being mixed with the substance to be
  • the subject of the invention is the human isoform of the IPMK and the human gene for this enzyme, which was identified according to this invention and cloned in the human form, the use of the DNA sequence of this gene or of parts thereof for the expression of the enzyme or a part of the enzyme in whatever cells, the use of the complete or partial gene product and of gene products which are homologous to the gene product according to the invention or of activating or inactivating mutations of the gene according to the invention.
  • a cell preferably a tumor cell, to which a substance capable of inhibiting IP3K is added and a check is made to determine whether it is
  • Substance inhibits cell growth and / or kills the cell.
  • the invention further relates to substances which are effective in component a) or b) and in component c) of the test system according to the invention and the use of these substances for the prophylaxis or therapy of a proliferative disease.
  • IP Kinasen is a collective term for IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C and IPMK, but also for IP6K1, IP6K2, IP6K3, IP3-5 / 6-K (Majerus) and IP5-2-K.
  • These substances according to the invention include quercetin, myricetin and their derivatives, gossypol, aurintricarboxylic acid (ATA),
  • the substances according to the invention further include ellagic acid, 3 ', 4', 7, 8-tetrahydroxyflavon, fisetin, galangin, robinetin, luteolin, chrysin, amentoflavone, pyrogallol red, bromopyrogallol red, bengal pink B, quinalizarin, chlorogenic acid, bis-tyrphostin, and rottler.
  • the antiproliferative effectiveness of these substances is new.
  • a preferred object of the invention is the administration of a combination of at least two of the substances according to the invention (different, from one or both of the above groups) for the prophylaxis and or therapy of a proliferative disease.
  • the combination can be in the form of a mixture the same or different proportions of the substances according to the invention and the administration of the mixture for the purpose of prophylaxis or therapy of a proliferative disease.
  • the combination can also be carried out by administering the respective individual substances according to the invention separately from one another, either simultaneously or in succession within a period in which the effect of the substance administered first continues. This period usually lasts a maximum of two weeks.
  • the maximally antitumoral, non-toxic doses of the respective substances according to the invention are preferably combined.
  • the substances according to the invention are administered as an aqueous solution, as a suspension, as an ointment, as a powder, as granules, in capsules or as tablets.
  • aqueous solution as a suspension
  • an ointment as a powder
  • granules in capsules or as tablets.
  • the person skilled in the art is familiar with the preparation of the respective active substance preparation.
  • the substances according to the invention are preferably administered orally. Ointments are given locally, solutions and suspensions are preferably administered parenterally. Parenteral administration can take place in the vascular system, in an organ, in a body cavity or in the connective tissue.
  • the human IP3K-A was, for example, according to Takazawa et al. (1991a, 1991b).
  • the m-RNA for the production of recombinant human IP3K-B was isolated from human myeloid TF 1 cells by means of a total RNA preparation.
  • the cDNA for this isoform was obtained from the
  • the recombinant fusion protein with an N-terminal strep tag was overexpressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS [pREP4]. After two hours of induction with 0.5mM IPTG at 37 ° C, the bacterial cells were harvested by centrifugation at 4000g for 10min and resuspended in 1/20 of the culture volume (50mM HEPES pH7.5; ImM EDTA; ImM DTT; 0.5% TritonX-100; 0.5mM benzamidine; ImM PMSF). After sonification for one minute, the lysate was centrifuged at 12000g for 10min (4 ° C).
  • the HEPES concentration in the supernatant was adjusted to 25 mM by 1: 2 dilution, the concentration of the other components being obtained in this way.
  • the supernatant was placed on a DEAE-Sephacel column and the HsIPMK was found predominantly in flow, while the other proteins were predominantly bound.
  • the flow was placed on a phosphocellulose column, washed and eluted with the following buffer (25mM HEPES pH7.5; 750mM NaCl; ImM EDTA; ImM DTT; 0.1% TritonX-100).
  • the purified protein and BSA standard samples were separated on an SDS-PAGE and the products were stained with Coomassie Blue. Digitized images were generated with a Sharp JX-325 (Sharp) transmitted light scanner. The amount of HsIPMK was quantified using the ImageMasterID (Pharmacia) program. After separation by SDS-PAGE and transfer of the proteins to a nitrocellulose membrane, the HsIPMK with the terminal strep tag was treated with an avidin alkaline-phosphatase conjugate (Bio-Rad, California, USA) detected.
  • the enzyme activity determinations were carried out using a coupled optical test in which the formation of ADP from ATP (phosphate donor) by IP3K was coupled with the consumption of NADH by means of the pyruvate kinase and lactate dehydrogenase reactions. This is shown on
  • IP3K Ins (1, 4, 5) P3 + ATP ⁇ > Ins (1, 3, 4, 5) P4 + ADP
  • ADP a product of the IP3K catalytic reaction, reacts with the help of pyruvate kinase (PK) with phosphoenol pyruvate (PEP) to form ATP and pyruvate.
  • Lactate dehydrogenase (LDH) reduces the pyruvate to lactate in the presence of NADH. The decrease in NADH was measured in a thermostated spectrophotometer at a wavelength of 339 nm or 440 nm and a temperature of 30 ° C. Quartz cuvettes or plastic cuvettes with a layer thickness of 10 mm were used for the measurements.
  • the standard reaction mix had the following composition: 0.2 mM NADH, 1 mM PEP, 10 mM triethanolamine-HCl pH 7.5, 30 mM KCl, 1 mM DTT, 500 ⁇ M ATP, 5 U / ml L-LDH, 2.5 U / ml PK.
  • the final volume of the test mix was 800 ⁇ l.
  • Add to this mix at 30 ° C for 10 minutes is pre-incubated, the IP3K prediluted in 10 M triethanolamine-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT with a final concentration of 4.8 nM to 100 nM and the IPMK in a concentration of 140 nM (maximum 10 ⁇ l) was pipetted.
  • the inhibitors were dissolved in DMSO at a concentration of 3 - 20 mM in the absence of light and stored at - 20 ° C. Before use, aliquots of these stock solutions were diluted to a concentration of 0.05-1 mM with DMSO. Enzyme activities were measured using the coupled optical test shown above by starting the reaction with 25 ⁇ M Ins (1,4,5) P 3 . In the absence of an inhibitor and in at an enzyme concentration of 4.8 nM, the enzyme activity remained for 10 to 15 minutes at the maximum turnover rate (V max ) of 1 ⁇ M / min.
  • the inhibitors were pipetted in volumes of 1 - 2 ⁇ l step by step until the maximum inhibitory effect or a concentration of 100 uM was reached.
  • the final concentration of DMSO was a maximum of 3% (v / v) and had no influence on the enzyme activity, as control measurements showed.
  • These measurements were also carried out with the human Ins (1,4, 5) P 3 3-kinase B, which was present in a concentration of 16.88 nM.
  • the cell number was determined with the aid of a cell number determination device (Coulter Counter). The cells were then at a density of 2 ⁇ 10 5 / ml in 25 cm 3 - or 75 cm 3 - or 3 x 10 5 / ml diluted in 175 cm3 culture bottles with growth medium (RPMI 1640 + 10% FBS).
  • NASH 3T3 Cultivation of adherent mouse fibroblasts (NIH 3T3) as well as Chinese ovarian carcino cells Hamsters (CHO cells), human mammary carcinoma cells (MCF7) and human colon carcinoma cells (HT29).
  • the adherently growing cells were detached from the bottom of the cell culture bottle by treatment with trypsin / EDTA solution. A 10-fold volume of serum-containing medium was then added, as a result of which the trypsin is inactivated. The cell number was then determined using the Coulter Counter. The cells were then seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 / ml in 25 cm 3 or in 75 cm 3 culture bottles with growth medium (RPMI 1640 + 10% FBS). The subcultivation was repeated for MCF-7 cells after 3-4 days, for HAT-29 cells after 2-3 days, since the substrates of the growth medium were metabolized by the cells.
  • SEQ ID 3, 4 and 5 respectively show the complete cDNA sequence of the human ArgRIII homologous gene, the gene for the human form of inositol polyphosphate multikinase (GenBank Acc: AF 432853; blocked) and the code encoded thereby amino acid sequence.
  • a homology search was carried out in the HTGS database with the tBLASTn program using the known amino acid sequence of the yeast protein ArgRIII (GenBank Acc: X05328.1; GenBank gi: 3375).
  • This database includes the sequences obtained from the human genome project, which are still are not fully assembled.
  • This search provided, among others, the Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-637J22 (GenBank Acc.: AL358155.10; GenBank gi: 11322007).
  • An open reading frame (ORF) in this clone shows significant similarities to the ArgRIII sequence after translation, in particular to the putative inositol phosphate binding site.
  • a hypothetical cDNA was assembled from this genomic clone by analyzing the putative splice sites and comparing homology.
  • the human EST database was searched with the BLASTn program using the hypothetical cDNA sequence. This search provided, among others, the Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 4510867 (GenBank Acc: BG258567; GenBank gi: 12768383). According to the sequence data of this clone contains the complete coding sequence at the 5 -end ⁇ .
  • the clone was obtained from the UK HGMP, Hinxton, England. The clone was sequenced on both strands.
  • the ORF was complete and corresponded to the hypothetical cDNA sequence. However, there was a one-base insert at nucleotide position 458 of the ORF, which led to the loss of the reading frame and an early stop codon. The insert was removed by QuikChange mutagenesis (9).
  • the cDNA sequence (Fig. 1) of the human ARGRIII homologous gene was stored in the GeneBank database (see above).
  • the chromosomal localization of the human ARGRIII homologous gene is 10q21.
  • the coding sequence is distributed over six exons.
  • the open reading frame codes for a protein with 416 amino acids (calculated molecular weight: 47219.40 daltons).
  • the corresponding gene is assigned as a putative gene in the NCBI database because of the identified exons, but without being assigned to a specific protein function.
  • HsIPMK human inositol polyphosphate multikinase
  • the multifunctional yeast protein ArgRIII is an inositol polyphosphate multikinase, but also a Transcription regulator and an important factor in the RNA export route (El Bakkoury et al., 2000; Saiardi et al., 2000).
  • the human homologue of the yeast ArgRIII protein is an inositol phosphate multikinase.
  • the gene of the human homologue has the chromosomal localization 10q21. Six exons contribute to the coding sequence.
  • the open reading frame codes for a protein of 416 amino acids (calculated molecular weight: 47219.40 daltons).
  • the amino acid sequence shows an 82% similarity to the rat IPMK.
  • Functionally important motifs are conserved between the mammalian IPMKs and ArgRIII.
  • the inositol phosphate binding site shows the greatest similarity.
  • the ATP binding site and the catalytically important SSLL domain are also clearly conserved.
  • FIG. 5 Local sequence alignments of functionally important regions of the yeast ArgRIII protein with the corresponding sequences of the HsIPMK are shown in FIG. 5.
  • the numbers refer to the position of the first amino acid in the primary sequence of the protein shown.
  • the one-letter code for amino acids is used. Preserved residues are highlighted in black, similar residues are highlighted in gray. The invariable residues in these motifs are marked (*).
  • NRK52E cells were transiently transfected with the HsIPMK cDNA fused with a C-terminal or N-terminal fluorescent protein tag. Both orders the protein sequences in the fusion protein were used to exclude the possibility of steric effects of the fused fluorescent protein that could lead to protein misfolding.
  • the linker sequence consists mainly of small amino acids to ensure a high degree of flexibility.
  • Both fusion proteins were predominantly located in the nuclei of the transfected cells.
  • the fluorescent protein alone was evenly distributed between the nucleus and the cytoplasm.
  • the nuclear localization was confirmed by co-staining of the DNA in the nucleus with 4 ', 6-diamidino-2phenylindole dihydrochloride (DAPI). Overlays of the DAPI fluorescence with the fluorescence of the fusion protein confirm the localization in a single organ part, the nucleus. Proteins with a maximum size of approx. 40 kDa can passively translocate through the nuclear pore complex. Larger proteins can only get into the nucleus through active transport (Cole and Hammeil, 1998). Since the HsIPMK with the fluorescent protein tag has a molecular weight of approx. 75 kDa, active NLS-directed transport across the nuclear membrane must occur.
  • the exponentially growing cells in suspension culture (Jurkat, HL60) or to a confluency of 70% grown up by trypsin treatment in suspension accommodated HT29 cells were plated at a density of 1 x 10 4/200 .mu.l of growth medium (RPMI 1640 + 2% FBS ) sown in 96-hole plates. To analyze the inhibitor effect on cell proliferation, the cells were different
  • the inhibitors were first dissolved in DMSO with exclusion of light at a concentration of 3-20 mM and stored at -20 ° C. Before use, aliquots of these stock solutions were diluted with water to a concentration of 2 - 2000 ⁇ M, from which in turn the further dilutions of the respective test substances were made with a mixture of DMSO: water, which corresponds to the mixing ratio present in the aliquot. Since the same volume was pipetted for each reaction batch of an inhibitor, the concentration of DMSO was kept constant. The final concentration of DMSO in the medium was a maximum of 0.5% (v / v) and had no influence on the proliferation of the cells as control measurements showed.
  • the NIH 3T3 cells as well as the CHO cells and the MCF-7 cells were at a density of 1 x 10 4 / 200 ⁇ l
  • DMEM + 2% FBS or RPMI 1640 + 2% FBS Growth medium
  • the PBS / methanol mixture was poured off, the cells resuspended in 500 ⁇ l cold PBS and with 5 ⁇ l of a 5 mg / ml RNAse (final concentration: 50 ⁇ g / ml) and with 25 ⁇ l of a 1 mg / ml propidium iodide solution (final concentration: 50 ⁇ g / ml) was added. This was followed by an incubation for 30 minutes at 37 ° C in the dark. The distribution of the DNA was measured using a flow cytometer (Becton Dickinson), using 20,000 cells per measurement. The DNA distribution was then calculated using the ModFit computer program.
  • a flow cytometer Becton Dickinson
  • the exponentially growing cells were seeded in a density of 2 ⁇ 10Vl00 ⁇ l RPMI 1640 medium, 10% FBS, in a 96-well plate in a volume of 100 ⁇ l / well. After 24 hours, both the inhibitor was added in different concentrations and the corresponding volume of DMSO was added as a control. The cells were incubated at 37 ° C. in a water-saturated, 5% CO 2 -containing atmosphere for 48 hours, with the medium being changed after 24 hours and fresh inhibitor being added. After the incubation period, 10 ⁇ l of a 110 ⁇ M BrdU labeling solution were pipetted onto the cells (final concentration 10 ⁇ M).
  • the cells were incubated for 16 hours at 37 ° C, 5% CO 2. Thereafter, centrifugation was carried out at 1500 rpm for 10 minutes and the medium was carefully suctioned off. The cells were then dried for 2 hours at 60 ° C., fixed with 200 ⁇ l / well of a fixing solution precooled at ⁇ 20 ° C. and then incubated at ⁇ 20 ° C. for 30 minutes. The cells were then washed 3 times with 250 ⁇ l / well RPMI 1640 medium, 10% FBS, mixed with 100 ⁇ l / well nuclease working solution and incubated for 30 minutes at 37 ° C. in a water bath.
  • the cells were then washed again three times with 250 ⁇ l / well RPMI 1640 medium, 10% FBS, 100 ⁇ l / well of an anti-Brod-POD working solution (final concentration: 200 U / ml) and added for a further 30 minutes Incubated 37 ° C in a water bath.
  • the cells were then washed 3 times with 250 ⁇ l / well of PBS, with 100 ⁇ l / well of a peroxidase substrate solution (ABTS (2, 2 '-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)] -diammoniu salt concentration: mg / l) and incubated at room temperature until green (2 to 30 minutes) The subsequent measurement was carried out at 405 nm and 492 nm in a microtiter plate reader.
  • ABTS 2, 2 '-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)] -diammoniu salt concentration: mg / l
  • IP3K vital Jurkat T cells Inhibition of the activity in IP3K vital Jurkat T cells
  • the Jurkat T cells were seeded at a density of 4 x 10 7/200 ml of growth medium in 175 cm 3 -Zellkulturflaschen and incubated at 37 ° C and 5% C02. After 24 hours, a certain concentration of the inhibitor, dissolved in DMSO, was applied to the cells. As a control, the cells were exposed to an appropriate volume of DMSO.
  • the final concentration of DMSO was a maximum of 0.1% and had no influence on both the growth of the cells and the activity of the endogenous IP3K, such as control measurements of the inositol phosphate spectrum in trichloroacetic acid cell extracts, with special attention to the Ins (1,4, 5) P 3 and Ins (1, 3, 4, 5) P 4 .
  • the cells were then incubated for 24 and 48 hours at 37 ° C. and in an atmosphere containing 5% CO 2 in an incubator.
  • the cells were added Counted with the help of a Coulter Counter, the number of living cells determined using trypan blue staining. The cells were then extracted with trichloroacetic acid and subjected to an examination of the inositol phosphate spectrum using the MDD-HPLC technique (Mayr 1990).
  • IP3K-A inhibitors were found to be tested in detail as to whether they acted competitively or non-competitively or mixed competitively with respect to both substrates.
  • IP3K-A Inhibitors of the IP3K isoforms A, B and C To clarify the role of the IP3K-A or its isoforms and the partly. Comprehensive screening of chemical and plant compounds for an inhibitory effect of the corresponding enzymes was carried out by IPMK-formed higher phosphorylated inositols in the intact cell. The inhibition of the IP3K and IPMK activities was based on publications on protein kinase, phospholipase C and phosphatidylinositol 3 kinase inhibitors (Matter et al., 1992; Ruckstuhl et al., 1979; Sanger et al., 1977; Srivastava , 1985) with numerous substances from the group of flavonoids. A particularly extensive screening was carried out with IP3K-A, since this enzyme can be produced in very large quantities with high specific activities.
  • flavonoids flavones and flavonols
  • IC 50 values for IP3K were found -A be identified. These are quercetin, myricetin, myricetin trimethyl ether, amentoflavone and 3 ⁇ 4 ⁇ 7, 8-tetrahydroxyflavon (Fig. 1, Tab. 2).
  • the catechins (flavan-3-ole) catechin and epicatechin inhibited the IP3K-A to a significantly lower degree (IC 50 :> 100 uM).
  • the IC 50 values of the ECG and EGCG are 94 nM and 120 nM.
  • the stereoisomer of the ECG, (-) -catechin-3-gallate showed an IC 50 -value increased by a factor of 500.
  • Flavonoids as inhibitors of IP3K-A activity are shown in Table 2 and Fig. 1.
  • the perylenequinones hypericin and pseudohypericin show inhibitory effects on protein kinases (Takahashi et al., 1989).
  • the hypericin has photodynamic activity. For this reason, the measurements were carried out both in the dark and after previously irradiating the sample with laboratory light.
  • hypericin is a further potent IP3K-A inhibitor ⁇ IC 50 : 200 nM (darkness), 75 nM (radiation) ⁇ .
  • IC 50 200 nM (darkness), 75 nM (radiation) ⁇ .
  • IC 50 value 2.4 ⁇ M could be measured for pseudohypericin.
  • Calp ostin C a perylenequinone analog of hypericin (Kobayashi et al., 1989; Bruns et al., 1991), was also tested and an IC50 value of 1.0 ⁇ M was measured. The measurements with Calphostin C and with pseudohypericin were carried out in the dark.
  • pyrogallol red and bromopyrogallol red were identified as specific inhibitors of IP3K-A with IC 50 values of 0.90 ⁇ M and 1.04 ⁇ M.
  • triphenylmethane inhibitor was aurintricarboxylic acid (ATA) with an IC 50 value of 0.15 ⁇ M.
  • Anthraquinones which have been described as inhibitors of topoisomerase II (Lee et al., 1996), were also analyzed for an inhibitory effect on the enzyme. Of these compounds, quinalizarin was identified as the most potent inhibitor (IC 50 : 2.40 ⁇ M) (see FIG. 2, Table 3).
  • the compounds gossypol polyphenolic binaphthalene
  • ellagic acid phenolic bislactone
  • Inhibitor concentrations A complete inhibition of enzyme activity (97%) was possible for Gossypol, ECG, EGCG, Hypericin; ATA and 3 ', 4', 7, 8-tetrahydroxyflavon can be measured.
  • ellagic acid inhibited IP3K-A by up to 75%, quercetin by 80% and myricetin by 85%. There was no correlation between inhibitory potency and completeness of the inhibition.
  • Ins (1,4, 5) P 3 was not influenced by any of the inhibitors, ie the inhibitors were non-competitive with Ins (1, 4,5) P 3 .
  • HsIP3K-B were done as described above. Both the IC 50 values and the maximum inhibitory effects (% max.) Of the most potent inhibitors were analyzed.
  • Inhibitors of IP3K-C are shown in Table 5 and Fig. 4, respectively. After this search for inhibitors and characterization, there is a different selectivity profile of the potent inhibitors for each IP3K isoform, but this is not so different, at least for IP3K-A and IP3K-B, that it is not detected that both isoforms are inhibited by a potent inhibitor to IP3K-A. Something similar could apply to the inhibition of IPK3K-C.
  • IPMK can also phosphorylate Ins (1,4, 5) P 3 to Ins (1, 3, 4, 5) P 4 and this enzyme also catalyzes several steps that are essential for the biosynthesis of highly phosphorylated inositol phosphates (see introduction) , was the
  • IP3K inhibitors act as cell growth inhibitors (Agullo et al., 1996; Ahmad et al., 1997; Band et al., 1989; Chen et al., 1998; Kang et al., 1997; Okabe et al. , 1997; Rodgers et al. , 1998; Wang et al. , 2000) were known, and in a recent work, quite comparable data were presented (Caltagirone et al., 2000), the hypothesis emerged that IP3K isoforms and IPMK are a causally important, particularly high-affinity intracellular target for these antipro - Liferative agents could be.
  • the Jurkat T cells were incubated with different concentrations of inhibitor over a period of 72 hours. After every 24 hours, the cell number was determined using the Coulter Counter.
  • Gossypol and hypericin turned out to be the inhibitors with the strongest inhibitory effect, although Gossypol (IC 50 : 1.15 ⁇ M) showed a very small "therapeutic range" (dose ratio between antiproliferative and cell-killing effect, see below). With concentration differences of just 0.5 ⁇ M, very different inhibitory effects were observed: Hypericin showed the phenomenon of photosensitization. In addition, reference is made to FIGS. 8, 9 and 10.
  • the ratio of cells in the G 0 /G.,, S and G 2 / M phase was determined with increasing inhibitor concentrations.
  • the distribution of the DNA stained with propidium iodide was measured by means of flow cytometry. 20,000 cells were analyzed in each case. The results were presented as a percentage distribution of the cells in each phase of the cell cycle.
  • the Jurkat T cells were x 10 4 / seeded at a density of 2 100 ul and incubated for 48 hours in the presence of different concentrations of inhibitor at 37 ° C in a 5% C0 2 -containing atmosphere. After the incubation period, the vitality of the Jurkat T cells was examined using the trypan blue staining method and BrdU incorporation. Gossypol, ATA, (-) - EGCG and 3 ',', 7, 8-tetrahydroxyflavon were used as inhibitors.
  • DNA synthesis was also not significantly influenced by 3 ',', 7, 8-tetrahydroxyflavon. In contrast, a slight inhibition of synthesis by Gossypol could be determined. At a concentration of 1 ⁇ M and a percentage In 66% of living cells, DNA synthesis was reduced by 16%. A 21% inhibition of DNA synthesis was analyzed at the maximum concentration of gossypol (3 ⁇ M). If the Jurkat T cells were incubated with different concentrations of ATA for 48 hours, a stimulation of the DNA synthesis by 17% could be observed.
  • IP3K inhibitors in the S phase Since the observed block of cell growth by IP3K inhibitors in the S phase is obviously not correlated with this inhibition of DNA synthesis, the possibility has now been analyzed that the antiproliferative effect as well as the S phase block with an inhibition of inositol phosphate -Metabolism correlate and could be causally related. It was therefore examined whether the IP3IK inhibitors in the intact cells inhibit the biosynthesis of the higher inositol phosphates by inhibiting this enzyme.
  • the cells were first incubated for 48 hours in the presence and absence of 30 ⁇ M quercetin or 3 ⁇ M gossypol. These were then processed for the HPLC analysis of the inositol phosphates and the cellular inositol phosphates were measured.
  • Ins (1,5, 6) P 3 , Ins (1,2,4, 5, 6) P 5 and Ins (1, 2, 3, 4, 6) P 5 can be determined.
  • Transport protein (MDR) expression was eliminated and therefore had no effect on the inositol phosphate metabolism.
  • IP3K inhibitor or an IPMK inhibitor ie a significant reduction in the IC 50 value for the action of this latter inhibitor in comparison to the IC 50 of this substance alone (FIG. 8 or Table 8; the IC50 values were determined by sigmoidal hill fits Functions on the cell count vs. Inhibitor concentration data determined after 48 and 72 hours of cell growth; 100% inhibition means no growth and persistence of the initial cell count; (1) Inhibition> 100% means apoptosis-related decrease in the number of cells below the initial value).
  • the additivity demonstrated here shows a new method for antiproliferative combination pharmacotherapy.
  • ATA inhibited the proliferation of NIH 3T3 cells by a factor of 5 (IC 50 : 6.25 ⁇ M) more than that of Jurkat T cells.
  • IC 50 values of all other inhibitors tested do not differ significantly from the values analyzed for the Jurkat T cells.
  • ATA had the lowest cytotoxicity, which also had the weakest inhibitory effect on proliferation. At a concentration of 24 times the IC 50 value of cell growth, 55% of the cells survived.
  • the MCF7 cells were examined with different concentrations of inhibitor over a period of 72 hours. This analysis was carried out with the most potent inhibitors of IP3K and IPMK.
  • the analysis of the inhibitor effect on the cell proliferation of the HL60 cells was carried out with the most potent inhibitors of the IP3K and the IPMK. For this, the cells were cultivated with different concentrations of inhibitor over a period of 72 hours and counted.
  • the HT29 cells were tested with different concentrations of inhibitor over a period of 72 hours analyzed. This analysis was carried out with the most potent inhibitors of IP3K and IPMK.
  • Shears SB Pharmacol Ther 1991; 49 (1-2): 79-104 Shears SB. Bioessays 2000 Sep; 22 (9): 786-9
  • HsIPMK The sequence of the HsIPMK is also under Accession No. AF432853 (gi: 22532104) deposited

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer IP3K und/oder einer IPMK, bevorzugt des Menschen oder des höheren Vertebraten für ein Testsystem mit einer IP3K und/oder einer IPMK zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie pro­liferativer Erkrankungen. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein neues humanes Gen, Verwendungen dieses Gens in Screening Verfahren, ein Testsystem mit diesem Gen und Verwendungen verschiedener Substanzen zur Hemmung dieses Gens oder seines Genprodukts.

Description

Testsysteme zur Auffindung von Inhibitoren von Inositolphos- phat inasen und Verwendung dieser Inhibitoren für die Prophylaxe oder Therapie von proliferativen Erkrankungen
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein neues humanes Gen, Verwendungen dieses Gens in Screening Verfahren, ein Testsystem mit diesem Gen, Verwendungen verschiedener Substanzen zur Hemmung dieses Gens oder seines Genprodukts.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Die Inositol-Phospholipide (Phosphoinositide) sind die Ausgangsverbindungen bei der Bildung der Botenstoffe Inosi- tol 1, 4, 5-trisphosphat {Ins (1, 4, 5) P3} und Diacylglycerol {DAG} .
In der Plasmamembran wie auch in der nuklearen Membran (v.a. in der inneren Membran) ist das Polyphosphoinositid Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphat {Ptdlns (4, 5) P2} enthalten. Dieses wird aus Phosphatidylinositol {Ptdlns} durch zwei spezifische Phosphoinositid-Kinasen der Plasma- und der Kernmembran, PI4K und PI4P5K, welche zunächst (durch PI4K) die 4-Position des Inositolringes des Ptdlns zum Phosphatidylinositol-4-phosphat {PtdIns4P} und in einer zweiten Phosphorylierungsreaktion (durch PI4P5K) die 5-Position des PtdIns4P zum Ptdlns (4, 5) P2 phosphorylieren. Die hydrolytische Spaltung dieses Phosphoinositides in DAG und Ins (1,4, 5) P3 erfolgt durch Phospholipase C (PLC) (Ber- ridge und Irvine, 1984), welche ebenfalls sowohl an der Plasmamembran als auch an der Kernmembran (Maraldi et al . , 1999) aktivierbar ist.
Es konnten verschiedene Isoformen der PLC in unterschiedlichen Geweben von Säugetieren nachgewiesen werden. Diese Isoformen werden in die drei Gruppen ß,γ und δ eingeteilt (Berridge, 1993) . Die Aktivierung von PLC erfolgt über zwei unterschiedliche Wege. Eine Vielzahl G-Protein- gekoppelter Rezeptoren (Dessauer et al . , 1996), z.B. für die Agonisten Acetylcholin, Histamin und Vasopressin, stimuliert die Subtypen der Isoform PLC-ß an der Plasmamembran. Durch die Bindung von Wachstumsfaktoren (EGF, PDGF etc.) an Rezeptor-Tyrosinkinasen findet eine Dimerisierung dieser Rezeptoren und hierdurch wiederum die gegenseitige Phosphorylierung (sogenannte Autophosphorylierung) von Tyrosinresten statt. Über die SH2 -Domänen, die in der γ-Isoform der PLC vorkommen, kann diese Isoform des Enzyms an die Tyrosinphosphat-Domänen des aktivierten Rezeptors binden. Durch diese Membrantranslokation sowie durch Phosphorylierung von Tyrosinresten dieser Isoform erfolgt eine Aktivierung der PLC-γ (Berridge, 1993) . Der Aktivierungsmechanismus für die PLC-δ konnte bislang noch nicht im Detail aufgeklärt werden.
Das fettlösliche DAG verbleibt in der Plasma- bzw. Kernmembran und aktiviert die Ca2+- und DAG-abhängigen Isoformen der Proteinkinase C (PKC) , die durch Phosphorylierung von Zellproteinen an zahlreichen intrazellulären Regulationsmechanismen beteiligt sind.
DAG wird nun zum einen durch Lipasen unter Entstehung von Arachidonsäure deacyliert, die Vorstufe für die Synthese von ebenfalls als Botenstoffe agierenden Eicosanoiden ist. Zum anderen wird DAG nach Transport zum ER durch eine spezifische DAG-Kinase zur Phosphatidsäure phosphoryliert und anschließend unter Beteiligung von Cytidin-5' -triphosphat (CTP) in CDP-Diacylglycerol umgewandelt. Mit myo-Inositol wird hieraus Ptdlns synthetisiert. Ptdlns wird durch einen Ptdlns Carrier zur Plasmamembran und zur Kernmembran zurücktransportiert und in diesen Membranen erfolgt nun die Resyn- these von Ptdlns (4, 5) P2 über PtdIns4P (Shears, 1991), wodurch der "Phosphoinositidzyklus" in seinem Lipidanteil geschlossen wird. Das wasserlösliche Ins (1,4, 5) P3 diffundiert in das Zy- tosol und bindet an den Ins (1, 4, 5) P3-Rezeptor des endoplasma- tischen Retikulums (ER) , bei dem es sich um einen tetrameren intrazellulären Rezeptor-Ca2+-Kanal handelt (Berridge, 1993) . Hierdurch wird dieser Kanal geöffnet, so dass im Lumen des ER gespeichertes Ca2+ in das Zytosol ausströmt.
Die Inaktivierung des Ins (1, 4, 5) P3-Signals kann durch zwei Metabolisierungswege erfolgen. Durch verschiedene Isoformen I bis III der Inositolpolyphosphat-5-phosphatase wird Ins (1,4, 5) P3 an der 5-Position zum Ins(l,4)P2 dephospho- ryliert. Weitere Dephosphorylierungen folgen in der 1- und 4-Position unter Bildung von myo-Inositol, welches in die Resynthese von Phosphoinositiden eingeht (Mayr, 1988; Shears, 1991). Erst hierdurch wird der "Phosphoinositidzyklus" auch in seinem Inositolphosphatanteil geschlossen.
Der andere Metabolisierungsweg ist die Phosphorylierung von Ins (1,4, 5} P3 an der 3-Position mit Hilfe von Inositol 1, 4, 5-trisphosphat 3-Kinasen {Ins (1, , 5) P3-3-Kinasen oder IP3K's} zum Inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisphosphat {Ins (1,3,4, 5)P4} (Irvine et al . , 1986).
Inositol 1, 4, 5-trisphosphat 3-Kinase (IP3K) Inositol 1, 4, 5-trisphosphat 3-Kinase (IP3K) Aktivität wurde ubiquitär in allen bisher untersuchten tierischen Gewe- ben gefunden (Irvine et al . , 1986) . Dieses Enzym spielt eine zentrale Rolle in dem anabolen Signal-Stoffwechsel von Inosi- tolphosphaten in tierischen Zellen. Es metabolisiert den sekundären Botenstoff Ins (1,4, 5) P3 unter Mitwirkung von ATP zum Ins (1, 3, 4, 5) P4. Hierdurch wird nicht nur der sekundäre Botenstoff Ins (1,4, 5) P3 eliminiert, sondern in Form dieses 3-phosphorylierten Produktes ein Hauptsubstrat für die Biosynthese aller höher phosphorylierten Inositole (Inosi- toltetrakis-, -pentakis- und -hexakisphosphate) gebildet. Die Ins (1,4, 5) P3 3-Kinasen binden Ins (1,4, 5) P3 mit hoher Affinität und hoher Spezifität. Dieses wird anhand der niedrigen K-,- Werte verdeutlicht, die in einem Bereich von 0.4 - 2.1 uM gefunden wurden (Ryu et al . , 1987; Ya aguchi et al., 1988; Shin et al . , 1995; Bertsch et al . , 1999).
Isoformen der IP3K
Dieses Enzym wurde aus der glatten Muskulatur der Schweineaorta, aus Rattenhirn, aus Rattenleber, aus Rinderhirn und aus menschlichen Thrombozyten aufgereinigt . Die ermittelten Molekulargewichte der IP3K aus diesen verschiedenen Quellen liegen in einem Bereich von 32 - 93 kDa . Diese Heterogenität der Polypeptide war auf die Existenz von Isoformen der Kinase (Takazawa et al . , 1990) oder auf eine Proteolyse während der Proteinaufreinigung (Lee et al . , 1990) zurückzuführen. Weiterhin wurde die Ins (1,4, 5) P3 in Makrophagen, in humanen Lymphozyten, im Rattenthymus und in der Retina identifiziert .
Aus etlichen Organen menschlicher sowie tierischer Herkunft ist es gelungen, cDNA' s für verschiedene Isoformen der IP3K zu klonieren. Unter Verwendung von spezifischen An- tikörpern konnte ein cDNA-Klon aus Rattenhirn isoliert werden, der für ein ca. 50 kDa großes Polypeptid mit IP3K Aktivität bei rekombinanter Expression codiert (Choi et al., 1990, Takazawa et al . , 1990b).
1991 konnten zwei unterschiedliche cDNA -Klone aus menschlichem Hirngewebe isoliert werden, die als Isoform A und B bezeichnet wurden (Takazawa et al . , 1991a, Takazawa et al . , 1991b) . Der Klon der Isoform A weist eine 93 %-ige Homologie zur cDNA aus Rattenhirn auf (Takazawa et al., 1991b). Zwischen den Isoformen A und B dagegen liegen größere Unter- schiede in der Sequenz vor. Die größte Homologie besitzen diese Isoformen in ihrer C-terminal gelegenen katalytischen Domäne (Takazawa und Erneux, 1991) . Erst 2001 konnten durch die Arbeitsgruppe von Mayr (siehe Genbank gi : 14329671) sowie durch Dewaste (Dewaste et al., 2002) Volllängenformen der Isoformen B aus Ratte und Mensch kloniert werden. Während die c-DNAs für die Isoformen A von Ratte und Mensch jeweils ein Protein von 51 kDa codieren, codieren die Volllängen cDNAs für die Isoformen B von Ratte und Mensch jeweils für ein Polypeptid von ca. 102 kDa. Die aus humanen Thrombozyten isolierte (Communi et al . , 1994) dritte Isoform C wurde zwischenzeitlich kloniert und kodiert für ein 75 kDa Polypeptid mit IP3K-Aktiviät bei rekombinanter Expression (Dewaste et al . , 2000).
In Vogelerythrozyten konnten zwei Formen der Ins (1,4, 5) P3 3-Kinase nachgewiesen werden. Hierbei handelt es sich um eine lösliche, Ca2+/Calmodulin (Ca2+/CaM) -insensitive und um eine membrangebundene mäßiggradig Ca2+/CaM-sensitive Form der Kinase (Morris et al . , 1987; Bertsch et al . , 1999). Die aus der vollständig klonierten cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz des codierten ca. 51 kDa großen Polypeptides weist vor allem in einer ca. 15 kDa großen Domäne N-terminal von der CaM Bindungsdomäne eine sehr hohe Homologie zu allen zuvor klonierten Isoformen A auf und nahezu keine Sequenzidentitäten zu den Isoformen B und C. Auch in der katalytischen Domäne weist diese Isoform die höchste Übereinstimmung mit der Isoform A auf. Es handelt sich demnach klar um avine IP3K-A.
Anhand von Northernblot-Untersuchungen konnte eine gewebe- und zellspezifische Expression der IP3K Isoformen in Mensch und Ratte nachgewiesen werden (Vanweyenberg et al . , 1995; Dewaste et al . , 2000).
Regulation der IP3K
Neben den verschiedenen Molekulargewichten, den Unterschieden in der Aminosäuresequenz sowie den unterschiedlichen gewebe- und zellspezifischen Expressionsmustern der drei Isoformen der IP3K konnten auch Unterschiede in der Regulation der Kinaseaktivität nachgewiesen werden.
Die Aktivität der IP3K wird sowohl durch Ca2+/CaM als auch durch Proteinphosphorylierung reguliert (Communi et al . , 1995) . Während die Isoform A bereits ohne CaM-Aktivierung sehr aktiv ist und durch Ca2+-CaM etwa um den Faktor 2 aktiviert wird, wird die Isoform B, welche ohne CaM Aktivierung nur gering aktiv ist, durch CaM sehr stark aktiviert. Die Isoform C scheint durch Ca2+-CaM schwächer als die Isoform B aktiviert zu werden (Dewaste et al . , 2000) .
Mehrere Studien ergaben, das IP3K durch PKC und cAMP- abhängige Proteinkinase (PKA) phosphorylierbar sind. Eine Phosphorylierung durch PKA führte zu einer Erhöhung der Enzymaktivität. Eine Phosphorylierung durch PKC reduziert dagegen die Aktivität (Lin et al . , 1990; Sim et al . , 1990; Woodring und Garrison, 1997) . Weiterhin wurde die IP3K-A durch die Calcium/Cal odulin-abhängige Proteinkinase (CaMK-) phospho- ryliert, wodurch die Enzymaktivität stark anstieg und der K^-Wert für CaM sich verringerte (Communi et al . , 1997). Ent- sprechend den Untersuchungen der Erfinder ist eine entsprechende Regulation auch an der Isoform B nachzuweisen.).
In Rattenfibroblasten konnte eine weitere Regulation der IP3K beobachtet werden. Wurden diese Zellen mit dem Onkogen v-src transformiert, erhöhte sich die Aktivität der Kinase im zytosolischen Extrakt (Johnson et al . , 1989; Mattingly et al . , 1991; Woodring & Garrison, 1996). Dieses lässt auf eine Beteiligung von Proteintyrosinkinasen an der Regulation schließen, da durch die Transformation mit v-src das Produkt pp60v-src gebildet wird, welches Tyrosinkinaseaktivität be- sitzt.
Schlüsselrolle der IP3K bei Signaltransduktion und Biosynthese hochphosphorylierter Inositolphosphate .
Die zentrale Bedeutung der IP3K wird auch durch das ubiquitäre Vorkommen zumindest jeweils einer Isoform in allen bisher untersuchten tierischen Geweben und Zelltypen. (Irvine et al., 1986) sowie auf Grund ihrer hohen spezifischen Aktivität deutlich.
In Sekunden- bis Minutenperioden durch PLC Aktivierung freigesetztes Ins (1,4, 5) P3 wird hierdurch nahezu unverzögert in Ins (1, 3, 4, 5) P4 konvertiert. Durch diese Phosphorylierung wird Ins (1,4, 5) P3 eliminiert und das in tierischen Zellen bislang einzig bekannte Substrat für die Biosynthese aller höher phosphorylierten Inositole (InsP4, InsP5, InsP6) gebildet.
Die Ins (1, 3, 4, 5) P4 Biosynthese bewirkt auch eine Sensi- tisierung für ein nachfolgendes Ins (1,4, 5) P3 Signal zu kommen (Irvine und Schell, 2001) .
Die weitere Metabolisierung von Ins (1, 3, 4, 5) P4 erfolgt vor allem durch eine Dephosphorylierung durch die
Ins (1, 3, 4, 5) P4-5-Phosphatase zu Ins (1, 3, 4) P3. (Erneux et al . , 1998). Sowohl ausgehend von Ins (1, 3, ) P3, als auch direkt aus Ins (1, 3, 4, 5) P4 kann das in allen Zellen in der höchsten Konzentration (5-60μM) vorhandene InsP5 Isomer, Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5, synthetisiert werden. Direkt aus
Ins (1, 3, 4, 5) P4 bewerkstelligt dies über eine Phosphorylierung an 6-OH eine Inositolphosphat-Multikinase (IPMK), welche ebenfalls homolog zur IP3K ist, sich jedoch in der Sequenz und in der Substratselektivität stärker von den IP3K's unter- scheidet (s.u.) . Ins (1,3, 4) P3 wird durch eine von IPMK verschiedene Ins (1, 3, 4) P3-5/6-Kinase (Wilson und Majerus, 1996) zu Ins (1, 3, 4, 6) P4 phosphoryliert, letzteres wird dann durch eine Ins (1, 3, 4, 6) P4-5-Kinase (nach unseren unveröffentlichten Daten ist dies IPMK) abermals zu Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 phospho- ryliert. Durch Ins (1, 3, 4) P3-5/6-Kinase wird aus Ins (1,3, 4) P3 auch wieder zum Teil Ins (1, 3, 4, 5) P4 gebildet, es wird so möglicherweise dafür gesorgt, dass Ins (1, 3, 4, 5) P4 möglichst lange hoch bleibt.
Inositolpolyphosphat-Multikinase (IPMK) als IP3K komplementierendes multifunktionales Enzym.
Neben den drei Isoformen der IP3K gibt es in allen Eu- karyonten ein weiteres Enzym, welches Ins (1,4, 5) P3 zu Ins (1, 3, 4, 5) P4 phosphorylieren kann. Dieses Enzym wird als Inositolpolyphosphat Multikinase (IPMK) bezeichnet wird (Shears, 2000) , und stellt die in Hefe schon länger charakterisierte ArgRIII Kinase dar. Das nukleare Hefeprotein ArgRIII hat in der Hefe vielfältige Funktionen. Es ist ein Transkriptions-Regulator im Arginin-Metabolismus (El Bakkoury 5 et al., 2000), eine Inositol Polyphosphat Multikinase
(Saiardi et al . , 1999; Odom et al . , 2000; Zhang et al . , 2001) mit einer wichtigen Rolle im Inositolphosphat-Metabolismus (Saiardi et al . , 2000) und ein wichtiger Faktor beim mRNA- Export aus dem Zellkern (Saiardi et al . 2000; York et al . ,
10 1999) .
Die enzymatischen Eigenschaften von ArgRIII wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen in vitro untersucht. ArgRIII phosphoryliert verschiedene Inositolphosphate an 3- und 6-Position. Das Ins (1,4, 5) P3 wird in Hefe umgesetzt zum
15 Ins (1,3,4, 5) P4 (Saiardi et al . , 1999) und zum Ins (1, 4, 5, 6) P4 (Saiardi et al., 1999; Odom et al . , 2000). Es erfolgt eine weitere Umsetzung des Ins (1, 3, 4, 5) P4 (Saiardi et al., 1999; Zhang et al . , 2001) und des Ins (1, 4, 5, 6) P4 (Saiardi et al . , 1999; Odom et al . , 2000) zum Ins ( 1, 3, 4, 5, 6) P5. Außerdem kann
20 ArgRIII auch eine Pyrophosphatgruppe in das Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 einfügen, was zu einem PP-InsP4 (Zhang et al . , 2001).
Die enzymatischen Eigenschaften von ArgRIII wurden auch in vivo untersucht (Saiardi et al . , 2000). Die Synthese der Inositolphosphate Ins (1, 4, 5, 6) P4 und Ins (1, 2, 4, 5, 6) P5 verläuft
25 in vivo ausschließlich ArgRIII-abhängig.
Ins (1, 3, 4, 5) P4 und ein weiteres InsP4-Isomer, sowie Ins (1, 2, 3, , 5) P5 und Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 können hingegen in Hefe auch ArgRIII-unabhängig gebildet werden.
Ein homologes Protein wurde aus der Ratte kloniert und
30 charakterisiert (Saiardi et al., 2001). Das menschliche Gen wurde erstmals von zweien der Erfinder identifiziert und kloniert, bakteriell exprimiert und charakterisiert. Diese Klo- nierung und eine erste Charakterisierung als ebenfalls nukleares Enzym sowie die Verwendung des menschlichen Gens
35 oder Proteins für das unten erläuterte Screeningverfahren sind zentraler Bestandteil dieser Erfindung. Neben der o.g. Phosphorylierung kann dieses Enzym eine relativ große Zahl weiterer biologischer Inositolphosphat-Isomere spezifisch phosphorylieren. Einige dieser zusätzlichen in vi tro nachge- wiesenen Phosphorylierungsreaktionen sind mit Wahrscheinlichkeit ebenfalls für die Biosynthese bestimmter zellulärer InsP5 Isomere und von InsP6 aus niedrig phosphorylierten Inositolen von Bedeutung. Auch das menschliche Enzym kann unter bestimmten Bedingungen Diphosphoinositolphosphate aus Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 synthetisieren.
Die IPMK, von der bisher in höheren Vertebratengenomen im Gegensatz zur IP3K bisher nur immer ein funktionales Gen gefunden wurde, kann über ihre zum Teil mit der IP3K-analoge Reaktionsselektivität bei genügend starker Expression (IP3K besitzt eine bis zu 10-mal höhere spezifische Aktivität für die Phosphorylierung von Ins (1,4, 5) P3 als IPMK) die Funktion des ersteren Enzyms u.U. substituieren. Eine pharmakologische Hemmung von IP3K könnte also ggf. durch eine Überexpression von IPMK zumindest teilweise kompensierbar sein. Daneben er- füllt die IPMK bei der Biosynthese von höheren Inositolphos- phaten ganz spezifische Funktionen, welche offensichtlich spezifisch für dieses Enzym sind und welche abgeleitet von den Ergebnissen der Hefemutanten, zumindest dort auch nicht durch andere Enzyme voll substituierbar sind. Die Biosynthese hochphosphorylierter Inositole und vor allem von InsP6 ist essentiell für das normale Zellwachstum
Eine Deletion des Gens für das nukleare Protein ArgRIII hemmt auch in Gegenwart von genügend Arginin massiv das Hefewachstum, o fensichtlich über die Hemmung der Biosynthese von lnsP5 Isomeren und vor allem von InsP6, und des Exportes der Polymerase II abhängigen polyadenylierten RNAs (York et al., 1999; Saiardi et al . , 2000). Darüber hinaus zeigt diese Hefemutante eine stark veränderte und gestörte Struktur der intrazellulären Vakuolen. Die Störungen der vakuolären Sortierungsprozesse könnte darauf zurückzuführen sein, dass InsP6 durch seine Wechselwirkung mit Adapterproteinen (AP2, AP3/AP180, Arrestin ß, COPI, Synaptotagmin, siehe Zusammenfassung: Irvine und Schell, 2001) bei einer Reihe von speziellen Membran- Sortierungsprozessen eukaryontischer Zellen eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus konnte kürzlich eine durch InsP6 aktivierte Proteinkinase nachgewiesen werden (Hilton et al . , 2001) , welche bei der Regulation der endozytotischen Maschin- erie durch modulierte Wechselwirkung des durch die Kinase phosphorylierten Pacsin/Syndapin mit Dynamin eine wichtige Rolle spielt.
Untersuchungen der Erfinder an wachsenden Zellen haben gezeigt, dass beim Zellwachstum in etwa parallel zur DNA- Replikation eine Verdoppelung des zellulären InsP6 stattfindet. Diese Beobachtung ist mit der Hypothese kompatibel, dass eine bestimmte Menge an zellulärem InsP6 für die normale Zellteilung essentiell ist.
Eine für das normale Zellwachstum überaus wichtige Rolle spielt InsP6 bei der sog. nicht-homologen Ligation von chro- osomalen DNA-Doppelstrangbrüchen (non-homologous end- joining, NHEJ) . Dieser Prozess wird von einem Komplex aus fünf verschiedenen Proteinen (zwei mit den chromosomalen Bruchenden assoziierten Komplexen aus DNA-PK, Ku80 und Ku70, der Ligase IV und dem Protein XRCC4 katalysiert. Eine zellfreie Durchführung dieser Ligationsreaktion mit chromatographisch gereinigten Proteinen war nur möglich, wenn ein Nicht-Proteinfaktor aus einer anderen chromatographischen Fraktion wieder zugesetzt wurde, welcher durch eine präzise Analyse als InsP6 identifiziert wurde (Hanakahi et al . 2000). Weitere Untersuchungen zeigten, dass InsP6 hierbei mit der Untereinheit Ku interagieren musste und nicht mit DNA-PK (Ma und Lieber, 2002) . Aus dieser essentiellen Rolle von InsP6 bei diesem in höheren Eukaryonten sehr bedeutsamen Mechanis- mus der Doppelstrangbruch-Reparatur lässt sich eine weitere kausale Rolle der InsP6-Biosynthese beim normalen Zellwachstum ableiten. Nicht-reparierte Doppelstrangbrüche verhindern im Normalfall bei Zellen den Eintritt in die S-Phase bzw. in die Mitosephase.
Die Tatsache, dass alle Wachstumshormone und Wachstumsfaktoren zu einer Stimulation der PLC führen und dass in v- src-transformierten Fibroblasten die IP3K Aktivität signifikant ansteigt, untermauert weiter die Bedeutung der Biosynthese von Inositolphosphaten beim Zellwachstum.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen Proliferative Erkrankungen zeichnen sich dadurch aus, dass Zellen eines Gewebes nicht mehr der gewebespezifischen Kontrolle der Zeilproliferation unterliegen. An dieser gewe- bespezifischen Kontrolle sind rezeptorassoziierte Proteink- inasen und einige Phosphoinositidkinasen und Proteinkinasen der zellulären Signalübertragungswege wesentlich beteiligt. Daher stellen besonders diese Kinasen Zielstrukturen für die Suche nach Inhibitoren dar. Die Hoffnung ist, mit Hilfe der- artiger Inhibitoren neue Wirkstoffe für die Therapie von pro- liferativen Erkrankungen, besonders von Tumorerkrankungen zu finden. *
Die bisher für diese Wirkstoffsuche ausgewählten Kinasen sind umfassend von Sedlacek Drugs 59:435-476, 2000 und Sed- lacek Critical Reviews in Oncology/He atology, 38: 139-170, 2001 beschrieben worden.
Gegenstand der Erfindung ist nun der überraschende Befund, dass neben diesen bislang für die Tumorzellprolifera- tion als wesentlich angesehenen Protein- und Phosphoinositidkinasen die Inositolphosphatkinasen IP3K und IPMK auch entscheidend an der Proliferation von Zellen beteiligt ist und die Hemmung von IP3K und IPMK bei jedem bisher in vitro am rekombinanten Enzym identifizierten potenten Hemmstoff die Proliferation von Tumorzellen hemmt und in der Regel auch zu deren Apoptose führt. Gegenstände der Erfindung sind in den Patentansprüchen 14 bis 23 angegeben.
Gegenstand der Erfindung ist die Inhibierung von IP3-Kinasen und von IPMP durch geeignete Hemmstoffe und ein auf diesen Enzymen beruhendes Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen, dadurch charakterisiert, dass es aus einer (a oder b) , zwei (a + c oder a + b oder b + c) oder drei (a + b + c) der folgenden Komponenten besteht bzw. diese enthält: a) Eine IP3K aus welcher Spezies und in welcher Isoform auch immer (A, B, oder C) , wobei diese IP3K mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IP3K und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IP3K derartig zu hemmen in der Lage ist, dass das Substrat Ins (1,4, 5) P3 nicht oder nur gering phosphoryliert wird, b) Eine IPMK aus welcher Spezies auch immer und in welcher Isoform auch immer, wobei die IPMK mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IPMK und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IPMK derartig zu hemmen in der Lage ist, dass eines seiner Substrate nicht oder nur gering phosphoryliert wird. Im besonderen ist Gegenstand der Erfindung die humane Isoform der IPMK und das humane Gen für dieses Enzym, welches gemäß dieser Erfindung identifiziert und in der humanen Form kloniert wurde, die Verwendung der DNA-Sequenz dieses Genes oder von Teilen hieraus für die Expression des Enzyms oder eines Teiles des Enzyms in welchen Zellen auch immer, die Verwendung des vollständigen oder partiellen Genproduktes sowie von Genprodukten, welche homolog sind zu dem erfindungsgemäßen Genprodukt oder von aktivierenden oder inaktivierenden Mutationen des erfindungsgemäßen Genes. c) Eine Zelle, bevorzugt einer Tumorzelle, zu welcher eine Substanz, welche in der Lage ist, eine IP3K zu hemmen, hinzugegeben wird und geprüft wird, ob diese
Substanz das Wachstum der Zelle hemmt und/oder die Zelle tötet.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Substanzen, welche in der Komponente a) bzw. b) und in der Komponente c) des erfindungsgemäßen Testsystems Wirksamkeit zeigen und die Verwendung dieser Substanzen für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung.
Kern der Erfindung ist des weiteren die in vitro oder in vivo Hemmung von IP-Kinasen im Zusammenhang mit den an an- derer Stelle genannten Erkrankungen. IP-Kinasen ist ein Sammelbegriff für IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C und IPMK, aber auch für IP6K1, IP6K2, IP6K3, IP3-5/6-K (Majerus) und IP5-2-K.
Zu diesen erfindungsgemäßen Substanzen gehören Quercetin, Myricetin und deren Derivate, Gossypol, Aurintricarbon- säure (Aurintricarboxylic acid, ATA) ,
Hypericin und die Grüntee-Catechinderivate ECG und EGCG. Für diese Substanzen ist bereits eine antitumorale Wirksamkeit beschrieben worden.
Zu den erfindungsgemäßen Substanzen gehören des weiteren Ellagsäure, 3' , 4' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon, Fisetin, Galangin, Robinetin, Luteolin, Chrysin, Amentoflavon, Pyrogallolrot, Brompyrogallolrot, Bengalrosa B, Chinalizarin, Chlorogen- säure, Bis-Tyrphostin, und Rottlerin. Die antiproliferative Wirksamkeit dieser Substanzen ist neu. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Verabreichung einer Kombination von mindestens zwei der erfindungsgemäßen (verschiedenen, aus einer oder beiden der vorstehenden Gruppen) Substanzen für die Prophylaxe und oder Therapie einer proliferativen Erkrankung. Die Kombination kann erfolgen in Form der Herstellung eines Gemisches aus gleichen oder ungleichen Anteilen der erfindungsgemäßen Substanzen und die Verabreichung des Gemisches zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung. Die Kombination kann jedoch auch erfolgen durch Verabreichung der jeweiligen erfindungsgemäßen Einzelsubstanzen getrennt voneinander entweder gleichzeitig oder nacheinander innerhalb eines Zeitraumes, in welchem die Wirkung der zuerst verabreichten Substanz noch anhält. Dieser Zeitraum umfasst im Regelfall maximal zwei Wochen. Bevorzugt werden die maximal antitumoral wirksamen, nicht toxischen Dosen der jeweiligen erfindungsgemäßen Substanzen miteinander kombiniert.
Die erfindungsgemäßen Substanzen werden als wässrige Lösung, als Suspension, als Salbe, als Pulver, als Granulat, in Kapseln oder als Tabletten verabreicht. Die Herstellung der jeweiligen WirkstoffZubereitung ist dem Fachmann geläufig.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgt vorzugsweise oral. Salben werden lokal, Lösungen und Suspensionen werden bevorzugt parenteral verabreicht. Die parenterale Verabreichung kann in das Gefäßsystem, in ein Organ, in eine Körperhöhle oder in das Bindegewebe erfolgen.
Methoden und Ergebnisse
Die Abkürzungen "M", mM", "uM" und "nM" stehen für die Einheiten mol/1, mmol/1, μmol/1 und nmol/1, respektive.
Expression und Reinigung der rekombinanten IP3K-A, der rekombinanten humanen IP3K-B und ihrer Mutanten und der sowie der rekombinanten IP3K-C aus Ratte Die rekombinante IP3K-A aus Huhn (Gg-IP3K-A) und deren Mutanten, die rekombinante humane IP3K-A (Hs-IP3K-A) , die rekombinante humane IP3K-B (Hs-IP3K-B) sowie die IP3K-C der Ratte (Rn-IP3K-C) wurden wie folgt rekombinant hergestellt: Ein Fragment der Gg-IP3K-A von 306 Aminosäuren, welches die C-terminale katalytische Domäne und eine benachbarte Calmodulin-Bindungsdomäne aufweist, wurde in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert und durch Phosphocellulose- sowie Calmodulin-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt (Bertsch et al . 1999) . 5 In gleicher Weise wurden die durch gezielte Mutagenese hergestellten Mutanten der IP3K-A exprimiert und gereinigt. In diesen Mutanten ist jeweils die Aminosäure Lysin durch eine andere Aminosäure (Arginin, Glutamin, Leucin, Asparagin- säure, Glutaminsäure) ausgetauscht worden (Bertsch et al . ,
10 2000) . Die humane IP3K-A wurde beispielsweise gemäß Takazawa et al. (1991a, 1991b) hergestellt. Die m-RNA für die Herstellung rekombinanter humaner IP3K-B (Hs-IP3K-B) wurde aus humanen myeloischen TF 1-Zellen mittels einer Total-RNA-Prä- paration isoliert. Die cDNA für diese Isoform wurde von der
15 Poly-A+ RNA mittels RT-PCR kloniert. Anschließend wurde ein c-DNA-Fragment von 976 Basenpaaren, welches die Calmodulin- Bindungsdomäne und die katalytische Domäne enthält, in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert. Die Aufreinigung des Enzyms bis zur Homogenität erfolgte mit Hilfe einer Pll-Phosphocellu-
20 lose- und einer Calmodulin-Sepharose-Säule analog der Methode von Bertsch et al. (1999).
Die c-DNA für die Herstellung rekombinanter IP3K-C aus Ratte (Rn-IP3K-C) wurde aus einer Ratten c-DNA Bibliothek in Volllängenform kloniert (Schmale, unveröffentlicht) .
25 Anschließend wurde ein c-DNA Fragment, welche die Calmodulin- Bindungsdomäne und die katalytische Domäne enthält, in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert und analog der Isoform B aufgereinigt .
30 Expression und Reinigung von rekombinanter humaner IPMK Ein Expressionsvektor für die Volllängenform der HsIPMK wurde durch PCR-Techniken erzeugt. Das gemäß dieser Erfindung entdeckte offene Leseraster der HsIPMK (siehe Kapitel "Identifizierung und Klonierung eines ARGRIII-homologen Gens aus
35 Mensch) wurde hierzu mit folgendem Primerpaar amplifiziert : 5 'AGCCATGGCATGGCAACAGAGCCACCATCC3 ' (Seq.-ID 1), 5 'AGCTCGAGTCAATTGTCTAAAATACTTCGAAG3 ' (Seq.-ID 2) . Eine Ncol Restriktionsstelle wurde am 5' -Ende eingefügt, eine Xhol Re- striktionsstelle am 3'-Ende. Das PCR-Produkt wurde zuerst in den pGEM T Easy vector (Promega, Mannheim, Germany) kloniert. Das offene Leseraster wurde vollständig re-sequenziert und dann wurde das erzeugte Fragment über die eingefügten Restriktionsstellen in einen pET17b basierten Expressions- Vektor (Novagen, Madison, USA) subkloniert. Das rekombinante Fusionsprotein mit einem N-terminalen Strep-tag wurde in E. coli BL21 (DE3) pLysS [pREP4] überexprimiert. Nach zwei Stunden Induktion mit 0,5mM IPTG bei 37 °C wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 4000g für 10min geerntet und in 1/20 des Kulturvolumens resuspendiert (50mM HEPES pH7,5; ImM EDTA; ImM DTT; 0.5% TritonX-100; 0.5mM Benzamidin; ImM PMSF) . Nach Sonifikation für eine Minute wurde das Lysat bei 12000g für 10min (4°C) zentrifugiert . Die HEPES Konzentration im Überstand wurde durch 1:2 Verdünnung auf 25mM eingestellt, hierbei wurde die Konzentration der anderen Komponenten erhalten. Der Überstand wurde auf eine DEAE-Sephacel Säule gegeben und die HsIPMK wurde überwiegend im Durchfluss gefunden, während die anderen Proteine zum überwiegenden Teil gebunden wurden. Zur weiteren Anreicherung des Proteins wurde der Durchfluss auf eine Phosphocellulose Säule gegeben, gewaschen und eluiert mit folgendem Puffer (25mM HEPES pH7,5; 750mM NaCl; ImM EDTA; ImM DTT; 0.1% TritonX-100) .
Das gereinigte Protein und BSA Standard Proben wurden auf einer SDS-PAGE getrennt und die Produkte wurden mit Coomassie Blau gefärbt. Digitalisierte Bilder wurden mit einem Durchlicht Scanner Sharp JX-325 (Sharp) erzeugt. Die Menge von HsIPMK wurde mit dem Programm ImageMasterlD (Pharmacia) quantifiziert. Nach Auftrennung durch SDS-PAGE und Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose Membran wurde die HsIPMK mit Nterminalem Strep-tag mit einem Avidin- alkalische-Phosphatase Konjugat (Bio-Rad, California, USA) nachgewiesen .
Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C und IPMK im gekoppelten optischen Test
Die Enzymaktivitätsbestimmungen wurden mit Hilfe eines gekoppelten optischen Tests , in dem die Bildung von ADP aus ATP (Phosphatdonor) durch IP3K mit dem Verbrauch an NADH mittels der Pyruvatkinase- und Lactatdehydrogenase-Reaktionen gekoppelt wurde , durchgeführt . Dargestellt ist dies am
Beispiel der Reaktion von IP3K, welche mit IPMK analog durchgeführt wurde :
IP3K Ins ( 1 , 4 , 5 ) P3 + ATP < > Ins ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P4 + ADP
PK ADP + PEP > ATP + Pyruvat
LDH
Pyruvat + NADH + H+ > L-Laktat + NAD+
ADP, ein Produkt der IP3K-Katalysereaktion, reagiert unter Mitwirkung von Pyruvatkinase (PK) mit Phosphoenolpyru- vat (PEP) zu ATP und Pyruvat. Die Lactatdehydrogenase (LDH) reduziert in Gegenwart von NADH das entstandene Pyruvat zum Laktat. Die Abnahme an NADH wurde in einem thermostatisierten Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 339 nm oder 440 nm und einer Temperatur von 30 °C gemessen. Für die Messungen wurden Quarzküvetten oder Plastikküvetten mit einer Schichtdicke von 10 mm verwendet. Der Standardreaktionsmix hatte die folgende Zusammensetzung: 0.2 mM NADH, 1 mM PEP, 10 mM Triethanolamin-HCl pH 7.5, 30 mM KCl, 1 mM DTT, 500 uM ATP, 5 U/ml L-LDH, 2.5 U/ml PK. Das Endvσlumen des Testmixes betrug 800 μl. Zu diesem Mix, der bei 30 °C für 10 Minuten vorinkubiert wird, wurde die in 10 M Triethanolamin-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT vorverdünnte IP3K mit einer Endkonzentration von 4.8 nM bis 100 nM und die IPMK in einer Konzentration von 140 nM (maximal 10 μl) pipettiert. Nach einer weiteren Inkubation von 10 Minuten bei 30 °C und Messung des basalen Umsatzes von ATP in Abwesenheit des zweiten Substrats (herrührend von der Kontamination der Kopplungsenzympräparation mit ATPasen) wurde die maximale Enzymaktivität durch Zugabe von 25 μM Ins(l,4,5)P3 (8 μl einer 2.5 mM Stocklösung) ge es- sen. Die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten für NADH (ε = 6.3 l*mmol"1*cm"1) aus den Steigungen der Kurven ermittelt.
Zur Bestimmung des apparenten f^-Wertes (Km(app) für Ins (1,4, 5) P3 wurden die jeweiligen Ansätze durch Zugabe un- terschiedlicher Endkonzentrationen von Ins (1,4, 5) P3 (2, 3, und 5 μM, 6.4 - 16 μl aus einer 0.25 mM Stocklösung; 10, 15 und 25 μM, 3.2 - 8 μl aus einer 2.5 mM Stocklösung) gestartet und bis zur kompletten Substratumsetzung verfolgt ("single transient", Gutfreund 1972) . Die ATP-Konzentration wurde in- nerhalb einer Messreihe konstant gehalten, variierte aber von Messreihe zu Messreihe (125 -1000 μM) .
Zur Bestimmung der apparenten K^-Werte für ATP wurde dessen Konzentration zwischen 62.5 und 1000 μM variiert und die Reaktion mit jeweils 25 μM Ins (1,4, 5) P3 gestartet.
Inhibierung der Aktivitäten von IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C sowie IPMK
Zur Herstellung von Stocklösungen wurden die Hemmstoffe unter Lichtausschluss mit einer Konzentration von 3 - 20 mM in DMSO gelöst und bei - 20 °C gelagert. Vor Gebrauch wurden Aliquots dieser Stocklösungen bis zu einer Konzentration von 0.05 - 1 mM mit DMSO verdünnt. Die Enzymaktivitäten wurden unter Anwendung des oben dargestellten gekoppelten optischen Tests gemessen, indem die Reaktion mit 25 μM Ins (1,4, 5) P3 gestartet wurde. In Abwesenheit eines Hemmstoffes und bei einer Enzymkonzentration von 4.8 nM verblieb die Enzymaktivität für 10 bis 15 Minuten bei der maximalen Umsatzgeschwin- digkeit (Vmax) von 1 μM/min. In dieser Periode wurden die Hemmstoffe unter Lichtausschluss in Volumina von 1 - 2 μl stufenweise bis zum Erreichen des maximalen Hemmeffekts oder einer Konzentration von 100 uM dazu pipettiert. Die Endkonzentration von DMSO betrug maximal 3 % (v/v) und hatte keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, wie Kontrollmessungen ergaben. Diese Messungen wurden ebenfalls mit der humanen Ins (1,4, 5) P3 3-Kinase B durchgeführt, die in einer Konzentration von 16.88 nM vorlag.
Untersuchung des Einflusses der Hemmstoffe auf die Kopplungsenzyme des optischen Tests Der Standardreaktionsmix wurde bei 30 °C für 10 Minuten sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Hemmstoff und ohne Zugabe von IP3K oder IPMK inkubiert. Anschließend wurde ADP in einer Endkonzentration von 10 μM zum Reaktionsmix pipettiert und der schnelle Verbrauch an NADH gemessen. Bei keinem der getesteten Hemmstoffe konnte eine Hemmung der Aktivität der Kopplungsenzyme (PK, LDH) beobachtet werden.
Zellkulturen
Kultivierung von in Suspension wachsenden humanen Leukämiezellen (Jurkat T-Zellen, HL60-Zellen) .
Für die Kultivierung von Jurkat T-Zellen wurde die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzahlbestimmungsgerätes (Coulter Counter, bestimmt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 2 x 105/ml in 25 cm3- bzw. 75 cm3- oder 3 x 105/ml in 175 cm3-Kulturflaschen mit Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10% FBS) verdünnt .
Kultivierung von adhärenten Fibroblasten der Maus (NIH 3T3) sowie von Ovarialcarcino -Zellen des chinesischen Hamster (CHO-Zellen) , von humanen Mammacarcinom-Zellen (MCF7) sowie von humanen Coloncarcinoma-Zellen (HT29) .
Die Ablösung der adhärent wachsenden Zellen vom Boden der Zellkulturflasche erfolgte durch Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung. Anschließend wurde ein 10-faches Volumen an serumhaltigen Medium dazugegeben, wodurch das Trypsin inaktiviert wird. Danach wurde die Zellzahl mit Hilfe des Coulter Counters bestimmt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 1 x 105/ml in 25 cm3- oder in 75 cm3-Kulturflaschen mit Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10% FBS) ausgesät. Die Subkultivierung wurde bei MCF-7 Zellen jeweils nach 3 - 4 Tagen, bei HAT-29 Zellen jeweils nach 2-3 Tagen wiederholt, da die Substrate des Wachstumsmediums von den Zellen verstoffwechselt waren.
Bestimmung der Vitalität von Zellen
200 μl der homogenen Zellsuspension wurden in ein Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf) pipettiert und mit 200 μl einer 0.4 %-igen Trypanblau-Lösung (in 0.81 % NaCl, 0.06 % KC1) versetzt. Anschließend wurden die ungefärbten (lebend) und die blau angefärbten (toten) Zellen ausgezählt und in Prozenten angegeben.
Identifizierung und Klonierung eines ARGRIII-homologen Gens aus Mensch
Fig. 11 bzw. Seq.-ID 3, 4 und 5 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz des humanen ArgRIII-homologen Gens, des Gens für die humane Form von Inositolpolyphosphat-Multikinase (GenBank Acc: AF 432853; gesperrt) sowie die hierdurch codierte Aminosäurensequenz.
Zuerst wurde mit der bekannten Aminosäure-Sequenz des Hefeproteins ArgRIII (GenBank Acc: X05328.1; GenBank gi : 3375) eine Homologie-Suche in der HTGS-Datenbank mit dem tBLASTn-Programm durchgeführt. Diese Datenbank umfasst die im Rahmen des Humangenomprojektes gewonnen Sequenzen, die noch nicht vollständig assembliert sind. Diese Suche lieferte u.a. den Homo sapiens Chromosom 10 Klon RP11-637J22 (GenBank Acc. : AL358155.10; GenBank gi : 11322007). Ein Offenes Leseraster (ORF) in diesem Klon weist nach Translation deutliche Ähnlichkeiten zur ArgRIII-Sequenz auf, insbesondere zu der putativen Inositolphosphat-Bindungsstelle. Aus diesem genomischen Klon wurde durch Analyse der putativen Splicestellen und Homologievergleich eine hypothetische cDNA assembliert. Mit der hypothetischen cDNA-Sequenz wurde die humane EST Datenbank mit dem BLASTn Programm durchsucht. Diese Suche lieferte u.a. den Homo sapiens cDNA Klon IMAGE: 4510867 (GenBank Acc: BG258567; GenBank gi : 12768383). Laut Sequenzdaten enthält dieser Klon am 5λ-Ende die vollständige codierende Sequenz. Der Klon wurde vom UK HGMP, Hinxton, England be- zogen. Der Klon wurde beidsträngig sequenziert.
Der ORF war vollständig und entsprach der hypothetischen cDNA-Sequenz . An der Nukleotidposition 458 des ORFs war jedoch ein Ein-Basen-Einschub vorhanden, der zum Verlust des Leserasters und einem frühzeitigem Stop-Codon führte. Der Einschub wurde durch QuikChange-Mutagenese (9) entfernt. Die cDNA-Sequenz (Abb. 1) des humanen ARGRIII-homologen Gens wurde in der GeneBank Datenbank hinterlegt (s.o) .
Die chromosomale Lokalisation des humanen ARGRIII- homologen Gens ist 10q21. Die codierende Sequenz ist auf sechs Exons verteilt. Das offene Leseraster codiert für ein Protein mit 416 Aminosäuren (Berechnetes Molekulargewicht: 47219,40 Dalton) . Das entsprechende Gen ist in der NCBI Datenbank zwar wegen der identifizierten Exons als putatives Gen assigniert, jedoch ohne Zuordnung zu einer bestimmten Proteinfunktion.
Analyse von Genstruktur und Proteinsequenz der humanen Inositolpolyphosphat Multikinase (HsIPMK)
Das multifunktionelle Hefeprotein ArgRIII ist eine Inositolpolyphosphat Multikinase, aber auch ein Transkriptionsregulator und ein wichtiger Faktor des RNA Exportweges (El Bakkoury et al . , 2000; Saiardi et al . , 2000).
Das humane Homolog des Hefe ArgRIII Proteins ist eine Inositolphosphat Multikinase. Das Gen des humanen Homologen hat die chromosomale Lokalisation 10q21. Sechs Exons leisten einen Beitrag zur kodierenden Sequenz. Das offene Leseraster kodiert für ein Protein von 416 Aminosäuren (berechnetes Molekulargewicht: 47219,40 Dalton) . Die Aminosäuresequenz zeigt eine 82% Ähnlichkeit zur Ratten IPMK. Funktional wichtige Motive sind konserviert zwischen den Säugetier IPMKs und ArgRIII. Die höchste Ähnlichkeit zeigt die Inositolphosphat Bindungsstelle. Die ATP Bindungsstelle und die kataly- tisch wichtige SSLL-Domäne sind ebenfalls klar konserviert.
Zusammensetzung von funktional wichtigen Bereichen von HsIPMK und ArgRIII
Lokale Sequenz Alignments von funktional wichtigen Bereichen des Hefe ArgRIII Proteins mit den korrespondierenden Sequenzen der HsIPMK sind in der Figur 5 dargestellt. Die Nummern beziehen sich auf die Position der ersten Aminosäure in der Primärsequenz des dargestellten Proteins. Der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren wird benutzt. Konservierte Reste sind schwarz hinterlegt, ähnliche Reste sind grau hinterlegt. Die invariablen Reste in diesen Motiven sind markiert (*) .
Verifizierung der nuklearen Lokalisation der human IPMK Das Hefeprotein ArgRIII ist im Zellkern lokalisiert (El Bakkoury et al . , 2000). Diese Lokalisation ist angemessen für seine Aufgaben in der Transkriptionsregulation und im RNA- Export. Die Kenntnis über die intrazelluläre Verteilung der HsIPMK bringt Einsichten über ihre möglicherweise ähnlichen Funktionen. NRK52E Zellen wurden transient transfiziert mit der HsIPMK cDNA fusioniert mit einem C-terminalen bzw. N- terminalen fluoreszierenden Protein-Tag. Beide Anordnungen der Proteinsequenzen im Fusionsprotein wurden benutzt, um die Möglichkeit von sterischen Effekten des fusionierten fluoreszierenden Proteins auszuschließen, die zur Proteinmissfaltung führen könnten. Die Linkersequenz besteht hauptsächlich aus kleinen Aminosäuren, um eine hohe Flexibilität sicherzustellen. Beide Fusionsproteine waren vorherrschend in den Kernen der transfizierten Zellen lokalisiert. Das fluoreszierende Protein allein war gleichmäßig zwischen Kern und Zy- toplasma verteilt. Die nukleare Lokalisation wurde bestätigt durch eine Co-Färbung der DNA im Kern mit 4' , 6-Diamidino- 2phenylindole dihydrochloride (DAPI) . Overlays der DAPI- Fluoreszenz mit der Fluoreszenz des Fusionsproteins bestätigen die Lokalisation in einem einzigen Organeil, dem Kern. Proteine mit einer maximalen Größe von ca. 40kDa können pas- siv durch den Kernporenkomplex translozieren. Größere Proteine können nur durch aktiven Transport in den Kern gelangen (Cole und Hammeil, 1998) . Da die HsIPMK mit dem Fluoreszierenden ProteinTag ein Molekulargewicht von ca. 75kDa hat, uss ein aktiver NLS-gerichteter Transport über die Kernmembran auftreten.
Proliferationshemmung von Jurkat T-Zellen, HL60 Zellen und HT29 Zellen
Die exponentiell wachsenden Zellen in Suspensionskultur (Jurkat, HL60) bzw. die bis zu einer Konfluenz von 70% herangewachsenen durch Trypsin-Behandlung in Suspension gebrachten HT29 Zellen wurden in einer Dichte von 1 x 104/200μl Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 2% FBS) in 96-Loch-Platten ausgesät. Zur Analyse des Hemmstoffeffektes auf die Zellprolif- eration wurden die Zellen mit unterschiedlichen
Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz für 72 Stunden sowie mit dem entsprechenden Volumen an DMSO als Kontrolle im Dunkeln inkubiert, wobei nach 24 Stunden ein Mediumwechsel und die Zugabe an frischem Hemmstoff erfolgte. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde die Zellzahl sowie die Überlebensrate der Zellen ermittelt.
Für diese Analyse wurden zunächst die Hemmstoffe unter Lichtausschluss mit einer Konzentration von 3 - 20 mM in DMSO gelöst und bei -20 °C gelagert. Vor Gebrauch wurden Aliquots dieser Stocklösungen mit Wasser bis zu einer Konzentration von 2 - 2000 μM verdünnt, aus denen wiederum die weiteren Verdünnungen der jeweiligen Testsubstanzen mit einer Mischung von DMSO: asser, die dem im Aliquot vorhandenen Mischungsverhältnis entspricht, angefertigt wurden. Da für jeden Reaktionsansatz eines Hemmstoffes immer das gleiche Volumen pipettiert wurde, wurde die Konzentration an DMSO konstant gehalten. Die Endkonzentration von DMSO im Medium betrug maximal 0.5 % (v/v) und hatte keinen Einfluss auf die Proliferation der Zellen wie Kontrollmessungen ergaben.
Proliferationshemmung von NIH 3T3-Zellen, CHO-Zellen und MCF7-Zellen
Die NIH 3T3-Zellen sowie die CHO-Zellen und die MCF-7-Zellen wurden in einer Dichte von 1 x 104/200μl
Wachstumsmedium (DMEM + 2% FBS bzw. RPMI 1640 + 2% FBS) in 96-Loch-Platten ausgesät. Zur Analyse des Hemmstoffeffektes auf die Zellproliferation wurden die Zellen wie oben beschrieben mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz inkubiert, und nachfolgend wurde die Zellzahl sowie die Überlebensrate der Zellen ermittelt.
Einfluss von Hemmstoffen auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 x 106/25 ml
Wachstumsmedium in 75 cm3-Zellkulturflaschen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanz versetzt. Das entsprechende Volumen an DMSO wurde auf die Kontrollzellen pipettiert. Nach weiteren 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel sowie die Zugabe von frischem Hemmstoff. Nach einer insgesamt 48-stündigen Inkubationszeit wurden 1 x 10δ Zellen entnommen, bei 2000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und das alte Medium abgesaugt. Anschließend wurden die Zellen in 200 μl gekühltem PBS resuspendiert, in 1 ml bei -20 °C vorgekühltem Methanol pipettiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Hiernach wurden die Zellen bei 2000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das PBS/Methanol-Gemisch wurde abgegossen, die Zellen in 500 μl kaltem PBS resuspendiert und mit 5 μl einer 5 mg/ml RNAse (Endkonzentration: 50 μg/ml) sowie mit 25 μl einer 1 mg/ml Propidiumiodid-Lösung (Endkonzentration: 50 μg/ml) versetzt. Es folgte eine Inkubation von 30 Minuten bei 37 °C im Dunkeln. Die Verteilung der DNA wurde mittels eines Durchflusszytometers (Fa. Becton Dickinson) gemessen, wobei 20000 Zellen pro Messung verwendet wurden. Die DNA-Verteilung wurde anschließend mit Hilfe des Computerprogramms ModFit kalkuliert.
5-Bromo-2' deoxy-uridin-Einbau in Jurkat T-Zellen
Die exponentiell wachsenden Zellen wurden in einer Dichte von 2 x 10Vl00 μl RPMI 1640 Medium, 10 % FBS, in einer 96-Loch-Platte in einem Volumen von 100 μl/Loch ausgesät. Nach 24 Stunden erfolgte sowohl die Zugabe des Hemmstoffs in unterschiedlichen Konzentrationen als auch die Zugabe an entsprechendem Volumen DMSO als Kontrolle. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer wassergesättigten, 5 % C02-haltigen Atmosphäre für 48 Stunden inkubiert, wobei nach 24 Stunden ein Mediumwechsel und die Zugabe an frischen Hemmstoff erfolgte. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 10 μl einer 110 μM BrdU labeling solution auf die Zellen pipettiert (Endkonzentration 10 μM) .
Die Zellen wurden über 16 Stunden bei 37 °C, 5 % C02 inkubiert. Hiernach wurde 10 Minuten bei 1500 Upm zentrifu- giert und das Medium vorsichtig abgesaugt. Die Zellen wurden dann 2 Stunden bei 60 °C getrocknet, mit 200 μl/Loch einer bei -20 °C vorgekühlten Fixierlösung fixiert und anschließend 30 Minuten bei -20 °C inkubiert. Hiernach wurden die Zellen 3 x mit je 250 μl/Loch RPMI 1640 Medium, 10 % FBS gewaschen, mit 100 μl/Loch Nuclease working solution versetzt und 30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Danach wurden die Zellen wieder 3 x mit je 250 μl/Loch RPMI 1640 Medium, 10 % FBS gewaschen, mit 100 μl/Loch einer Anti-Brdü-POD working solution (Endkonzentration: 200 U/ml) versetzt und für weitere 30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen 3 x mit je 250 μl/Loch PBS gewaschen, mit 100 μl/Loch einer Peroxidase Substrate solution (ABTS (2, 2 ' -Azino-di- [3- ethylbenzthiazolin sulfonat (6) ] -diammoniu salz Konzentration: lmg/ l) versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Grünfärbung (2 - 30 Minuten) inkubiert. Die anschließende Messung erfolgte bei 405 nm und 492 nm im Mikrotiterplatten-Reader .
Hemmung der IP3K Aktivität in vitalen Jurkat T-Zellen Die Jurkat T-Zellen wurden in einer Dichte von jeweils 4 x 107/200 ml Wachstumsmedium in 175 cm3-Zellkulturflaschen ausgesät und bei 37 °C und 5 % C02 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde eine bestimmte Konzentration des Hemmstoffes, gelöst in DMSO, auf die Zellen gegeben. Als Kontrolle wurden die Zellen einem entsprechenden Volumen an DMSO ausgesetzt. Die Endkonzentration an DMSO betrug maximal 0.1 % und hatte keinen Einfluss sowohl auf das Wachstum der Zellen als auch auf die Aktivität der endogenen IP3K wie Kontrollmessungen des Inositolphosphat-Spektrums in trichloressigsauren Zellex- trakten unter besonderer Berücksichtigung des Ins (1,4, 5) P3 und des Ins (1, 3, 4, 5) P4 ergaben. Die Zellen wurden anschließend über 24 bzw. 48 Stunden bei 37 °C und in einer 5 % C02-haltigen Atmosphäre in einem Brutschrank inkubiert.
Vor Zugabe des Hemmstoffes sowie nach 24 und 48 Stunden unter Hemmstoff- bzw. DMSO-Inkubation wurden die Zellen mit Hilfe eines Coulter Counters gezählt, die Anzahl an lebenden Zellen mittels Trypanblau-Färbung ermittelt. Sodann wurden die Zellen mit Trichloressigsäure extrahiert und einer Untersuchung des Inositolphosphat-Spektrums mittels der MDD-HPLC Technik (Mayr 1990) unterzogen.
Bestimmung der Km(app-Werte von IP3K-A, IP3K-B, IP3K-C und IPMK für Ins (1,4, 5) P3 und ATP sowie der maximalen spezifischen Aktivitäten Vmax Zur Bestimmung der apparenten f^-Werte der IP3K Isoformen und der IPMK für ATP wurden die maximalen Umsatzgeschwindigkeiten (Vmaκ) bei variierenden ATP-Konzentrationen (125 - 1000 μM) und einer initialen sättigenden Konzentration an Ins (1,4, 5) P3 von 25 μM gemessen. Die K^-Werte für ATP wurden durch eine hyperbolische Funktion gemäß der Michaelis-Menten- Kinetik bestimmt. Die Km, app Werte für Ins (1,4, 5) P3 wurde aus single-transients (Gutfreund 1972) durch Verfolgung des NADH- Verbrauchs bis zum vollständigen Umsatz kleiner initialer Ins (1,4, 5) P3 Konzentrationen in Gegenwart von 500 uM ATP bes- timmt. Tabelle 1 gibt Aufschluss über die gefundenen enzy- mologischen Parameter für die drei verschiedenen Isoenzmye der IP3K und für HsIPMK. Die Daten der IP3K-A entstammen hierbei der Publikation von Bertsch et al . (1999) und Bertsch et al. (2000) Tabelle 1: t Werte für ATP und Ins (1,4, 5) P3 und Vmax-Werte (+/-Ca2+-CaM) von Gg-IP3K-A, Hs-IP3K-B, Rn-IP3K-C und Hs-IPMK
Figure imgf000028_0001
(a) : In Abwesenheit von Ca und von CaM gemessen (b) : Gemessen in Gegenwart von 20μM freiem Ca2+ Alle Daten sind Mittelwerte +/- SE
Im folgenden wurde bei aufgefundenen Hemmstoffen der IP3K-A jeweils im Detail getestet, ob diese kompetitiv oder nicht-kompetitiv oder gemischt kompetitiv bezüglich beider Substrate wirkten.
Hemmstoffe der IP3K-Isoformen A, B und C Zur Aufklärung der Rolle der IP3K-A bzw. seiner Isofor- men sowie der z.T. durch IPMK gebildeten höher phosphorylier- ten Inositole in der intakten Zelle wurde ein umfangreiches Screening von chemischen und pflanzlichen Verbindungen auf einen Hemmeffekt der entsprechenden Enzyme durchgeführt. Die Inhibierung der IP3K- und IPMK-Aktivitäten wurde aufgrund von Veröffentlichungen über Proteinkinasen-, Phos- pholipase C- sowie Phosphatidylinositol 3-Kinasehemmstoffe (Matter et al . , 1992; Ruckstuhl et al . , 1979; Sanger et al . , 1977; Srivastava, 1985) mit zahlreichen Substanzen aus der Gruppe der Flavonoide durchgeführt. Ein besonders u fan- greiches Screening wurde mit IP3K-A durchgeführt, da dieses Enzym in sehr großen Mengen mit hohen spezifischen Aktivitäten herstellbar ist.
Anhand der unter Substratsättigung durchgeführten Messungen, bei denen der Hemmstoff stufenweise bis zum Erreichen des maximalen Hemmeffekts bzw. einer Konzentration von 100 μM dazu pipettiert wurde, konnten aus der Gruppe der Flavonoide (Flavone und Flavonole) fünf Verbindungen mit submikromolaren IC50-Werten für IP3K-A identifiziert werden. Diese sind Quer- cetin, Myricetin, Myricetintrimethylether, Amentoflavon und 3\4\7, 8-Tetrahydroxyflavon (Fig. 1, Tab. 2).
Im Gegensatz zu den obigen Flavonoiden hemmten die Cate- chine (Flavan-3-ole) Catechin und Epicatechin die IP3K-A in einem deutlich geringeren Maße (IC50: > 100 uM) . Die . Catechin- Derivate, die am C3-Atom des Chromon-Ringsystems einen Gallussäure-Substituenten tragen, Epicatechingallat (ECG) und Epigallocatechingallat (EGCG) , verursachten jedoch wiederum einen starken Hemmeffekt der IP3K-A. Die IC50-Werte des ECG sowie EGCG betragen 94 nM und 120 nM. Das Stereoisomer des ECG, (-) -Catechin-3-gallat, zeigte einen um den Faktor 500 erhöhten IC50-Wert.
Flavonoide als Hemmstoffe IP3K-A Aktivität sind in Tabelle 2 bzw. Fig. 1 dargestellt.
Die Perylenchinone Hypericin und Pseudohypericin zeigen Hemmeffekte an Proteinkinasen (Takahashi et al . , 1989). Das Hypericin besitzt eine photodynamische Aktivität. Deswegen wurden die Messungen sowohl im Dunkeln als auch nach vorheriger Bestrahlung der Probe mit Laborlicht durchgeführt.
Aus diesen Messungen stellt sich Hypericin als weiterer potenter Hemmstoff der IP3K-A dar {IC50: 200 nM (Dunkelheit), 75 nM (Bestrahlung) } . Dagegen konnte für Pseudohypericin nur ein deutlich höherer IC50-Wert von 2.4 μM gemessen werden.
Ebenso wurde Calp ostin C, ein Perylenchinon Analogon des Hypericin (Kobayashi et al., 1989; Bruns et al., 1991), getestet und ein lC50-Wert von 1.0 μM gemessen. Die Messungen mit Calphostin C und mit Pseudohypericin wurden unter Lichtausschluss durchgeführt.
Aus der Gruppe der Triphenylmethane als entfernte Strukturanaloga von ECG konnten Pyrogallolrot sowie Brompyrogal- lolrot als spezifische Inhibitoren der IP3K-A mit IC50-Werten von 0.90 μM bzw. 1.04 μM identifiziert werden.
Der beste Triphenylmethan-Hemmstoff war jedoch Aurintri- carbonsäure (ATA) mit einem IC50-Wert von 0.15 μM. Anthrachinone, die als Hemmstoffe der Topoisomerase II (Lee et al., 1996) beschrieben wurden, wurden ebenfalls auf einen Hemmeffekt am Enzym analysiert. Von diesen Verbindungen wurde Chinalizarin als der potenteste Hemmstoff (IC50: 2.40 μM) identifiziert (siehe Fig. 2, Tab. 3).
Aus der Gruppe der Tyrphostine, die als Proteintyrosinkinase-Inhibitoren bekannt sind (Gazit et al . , 1991) , konnte das Bis-Tyrphostin als ein guter Hemmstoff der IP3K-A identifiziert werden (IC50: 0.7 μM) .
Basierend auf der für Flavonoide ermittelten Struktur- Funktionsbeziehung wurden die Verbindungen Gossypol (polyphe- nolisches Binaphthalin) und Ellagsäure (phenolisches Bislak- ton) auf einen Hemmeffekt untersucht. Die beiden Substanzen erwiesen sich als sehr potente Inhibitoren des Enzyms, wobei Gossypol und Ellagsäure von allen bisher untersuchten Stoffen die höchst potenten Hemmstoffe darstellten (IC50: Gossypol: 58 nM, Ellagsäure: 36 nM) .
Da die meisten der als Hemmstoffe der IP3K-A identifizierten Verbindungen strukturell eine Art von Symmetrie von phenolischen Carbonylgruppen-tragenden Substrukturen ("Zweihändigkeit") aufweisen, wurden weiterhin Biflavonoide auf einen Hemmeffekt an diesem Enzym untersucht. Apigenin, als Monomer ein schwacher Hemmstoff der IP3K-A (IC50: 8.3 μM) , weist als Dimer, wie im daraus resultierenden Amentoflavon (Abb. 3.9.), eine um den Faktor 10 erhöhte Potenz (IC50: 0.50 μM) auf. Ein weiterer Proteinkinasehemmer, das Rottlerin
(Gschwendt et al., 1994), welches ebenfalls eine "Zweihändigkeit" aufweist, konnte ebenso als ein potenter Hemmstoff (IC50: 1.21 μM) identifiziert werden.
Nicht alle der hoch potenten Inhibitoren zeigten eine komplette Inaktivierung der IP3K-A Aktivität unter hohen
Hemmstoff onzentrationen. Eine vollständige Hemmung der Enzymaktivität ( 97 %) konnte für Gossypol, ECG, EGCG, Hypericin; ATA und 3' , 4' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon gemessen werden. Dagegen hemmte Ellagsäure die IP3K-A bis zu 75 %, Quercetin zu 80 % und Myricetin zu 85 %. Es gab hierbei keine Korrelation zwischen Hemmstoffpotenz und Vollständigkeit der Hemmung.
Weitere Stoffklassen als Hemmstoffe der IP3K-A sind in Tabelle 3 bzw. Fig. 2 dargestellt.
Basierend auf diesen umfangreichen Messungen konnten insgesamt neun sehr potente Hemmstoffe (IC50: < 0.6 μM) der IP3K-A gefunden werden und eine ganze Reihe weiterer Hemmstoffe mit IC50 werten unter und um 3 μM.
Alle potenten Hemmstoffe der IP3K-A mit IC50 Werten < luM zeigten einen "mixed type" Hemmtyp des Enzyms in Bezug auf das Substrat ATP, während die Bindung des Substrates
Ins (1,4, 5) P3 von keinem der Hemmer beeinflusst wurde, d.h. die Hemmstoffe wirkten nicht-kompetitiv in Bezug auf Ins(l,4,5)P3.
Die meisten dieser potenten Inhibitoren wurden weiterhin auf ihren Hemmeffekt an der humanen IP3K-B getestet. Diese Isoform ist ubiquitärer als die Isoform A, welche nur in Neuronen und Testes und zumindest bei Vögeln auch in Erythrozyten exprimiert wird. Deshalb sollte die Frage geklärt werden, ob die Inhibitoren der A-Form auch die Aktivität der weiter verbreiteten B-Isoform hemmen können.
Bei diesen Messungen stellte sich heraus, dass Hypericin, ATA und Chinalizarin ähnliche oder niedrigere IC50-Werte bei humaner IP3K-B im Vergleich zu Gg-IP3K-A aufwiesen. Die Messungen der Hemmeffekte an der Gg-IP3K-A der
HsIP3K-B erfolgten wie oben beschrieben. Es wurden sowohl die IC50-Werte als auch die maximalen Hemmeffekte (% max.) der potentesten Inhibitoren analysiert.
Die potentesten Inhibitoren von Gg-IP3K-A und HS-IP3K-B sind in Tabelle 4 bzw. Fig. 3 dargestellt.
Schließlich wurden noch zwei sehr gute Hemmstoffe der IP3K Isoformen A und B (Quercetin und
3' , 4' , 7, 8-Tetrahydroxy- flavon) auf ihre Wirkung an der IP3K-C untersucht. Es zeigte sich hierbei für Quercetin eine etwas bessere Hemmung als bei der B-Isoform, während 3 ' , 4 ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon diese Isoform deutlich schlechter hemmte als EPK3K-B.
Inhibitoren von IP3K-C sind in Tabelle 5 bzw. Fig. 4 dargestellt. Es zeigt sich nach dieser Hemmstoffsuche und Charakterisierung zwar für jede Isoform der IP3K ein unterschiedliches Selektivitätsprofil der potenten Hemmstoffe, jedoch ist dieses zumindest für IP3K-A und IP3K-B nicht so different, dass nicht mit einer Hemmung beider Isoformen durch einen potenten Hemmstoff, aufgespürt an IP3K-A, gerechnet werden kann. Ähnliches könnte für die Hemmung von IPK3K-C zutreffen.
Hemmstoffe der Hs-IPMK
Da IPMK ebenfalls Ins (1,4, 5) P3 zu Ins ( 1, 3, 4, 5) P4 phospho- rylieren kann und dieses Enzym darüberhinaus etliche für die Biosynthese hochphosphorylierter Inositolphosphate wesentli- ehe Schritte katalysiert (s. Einleitung), wurde die
Hemmbarkeit dieses Enzyms ebenfalls im Detail untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen für die Hemmstoffe dieses Enzym abermals eine Präferenz von polyphenolischen Strukturen. Die besten Hemmstoffe für IPMK scheinen jedoch immer saure Funktionen zu tragen. Als Hemmstoffe der Hs-IPMK, welche auch IP3K effektiv im Bereich unter oder um luM IC50 inhibieren, wurden die Triphenylmethane Aurintricarbonsäure (ATA) und Bengalrosa, die Ellagsäure und das Gossypol identifiziert (Tabelle 6 bzw. Fig. 6) . Die IPMK sehr gut hemmende Phenylacrylsäure Chlorogensäure ist hingegen ein sehr schlechter IP3K-Hemmstoff . Andererseits zeigt der potente IP3K-Inhibitor Quercetin bei IPMK nur eine sehr schwache Hemmung, ebenso das Säurefuchsin, und nicht alle sauren Polyphe- nole sind gute Hemmstoffe der IPMK (Tabelle 7 bzw. Fig. 7) .
Wirkung von Inhibitoren der IP3K bzw. der IPMK auf das Wachstum kultivierter Zellen
Da einige der effektivsten Hemmstoffe der IP3K als Inhibitoren des Zellwachstums (Agullo et al . , 1996; Ahmad et al., 1997; Band et al . , 1989; Chen et al . , 1998; Kang et al . , 1997; Okabe et al . , 1997; Rodgers et al . , 1998; Wang et al . , 2000) bekannt waren und gerade in einer jüngsten Arbeit hierzu recht gut vergleichbare Daten vorgelegt wurden (Caltagirone et al., 2000), ergab sich die Hypothese, dass IP3K-Isoformen und IPMK ein gemeinsames kausal bedeutsames da besonders hochaffines intrazelluläres Ziel für diese antipro- liferativen Wirkstoffe sein könnten. Deshalb wurde die Wirkung aller identifizierten potenten IP3K-Hemmstoffe bzw. IPMK-Hemmstoffe alleine und in besonders ausgewählten Zweierkombinationen auf das Zellwachstum unter einheitlichen Bedingungen an verschiedenen humanen und anderen Tumorzelllinien (Jurkat T-Zellen, humane T-Zell-Lymphomzellen; MCF7-Zellen, humane Mammacarcinomzellen; HT29, humane Colonk- arzinomzellen; HL60, undifferenzierte promyeloische Leukämiezellen; CHO-Zellen, eine Hamster-Ovarialkarzinom- Zelllinie) sowie an der Mäuse-Fibroblastenzelllinie NIH 3T3- analysiert .
Wirkungen von IP3K- und IPMK-Hemmstoffen auf Jurkat T-Zellen
Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellprolifera- tion wurden die Jurkat T-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert Nach jeweils 24 Stunden erfolgte die Bestimmung der Zellzahl mittels des Coulter Counters.
Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Prolifera- tionshemmung der Jurkat T-Zellen nachgewiesen werden.
Gossypol und Hypericin stellten sich als Inhibitoren mit dem stärksten Hemmeffekt heraus, wobei Gossypol (IC50: 1.15 μM) allerdings eine sehr geringe "therapeutische Breite" (Dosisverhältnis zwischen antiproliferativen und zelltötenden Effekt, siehe unten) zeigte. Bei Konzentrationsunterschieden von bereits 0.5 μM konnten sehr unterschiedlich ausgeprägte Hemmeffekte beobachtet werden: Hypericin zeigte das Phänomen der Photosensitivierung. Ergänzend wird auf die Figuren 8, 9 und 10 verwiesen.
Effekte von antiproliferativen IP3K und IPMK Hemmstoffen der Jurkat Zellen auf den Zellzyklus
Zur Analyse der antiproliferativen und zeiltötenden Hemmstoffeffekte auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen wurde das Verhältnis von Zellen in G0/G.,-, S und G2/M- Phase bei steigenden Hemmstoffkonzentrationen bestimmt. Hierbei wurde die Verteilung der mit Propidiumjodid gefärbten DNA mittels der Durchflusszytometrie gemessen. Es wurden jeweils 20.000 Zellen analysiert. Die Resultate wurden als prozentuale Verteilung der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus dargestellt. Diese Versuche wurden mit den Inhibitoren (-)-EGCG,
Quercetin, Gossypol und 3' , 4' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon durchgeführt (Fig. 11) .
Effekte von (-)-EGCG Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung der Zellen mit steigenden Konzentrationen an (-)-EGCG (0 - 40 μM) über einen Zeitraum von 48 Stunden eine Anhäufung der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus hervorrief.
Effekte von Gossypol
Unter dem Einfluss von Gossypol (0 - 2 μM) wurde der Zellzyklus der Jurkat T-Zellen ebenfalls bevorzugt in der S-Phase geblockt.
Effekte von 3' , ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon
Dieser Hemmstoff, der in einem Konzentrationsbereich von 0 μM bis 20 μM eingesetzt wurde, bewirkte abermals einen Anstieg des Prozentsatzes der Zellen in der S-Phase (siehe Fig. 11) . Effekte von Quercetin
Deutlich komplexer als bei den obigen Hemmstoffen waren die Effekte verschiedener Konzentrationen von Quercetin auf den Zellzyklus von Jurkat T-Zellen. Unter dem Einfluss von 5 μM Quercetin verminderte sich zunächst der Anteil an Zellen in der S-Phase von 40 % + 1.4 % (0 μM) auf 35 % + 5.3 % (5 μM) .
5-Bromo-2' -deoxy-uridin-Einbau in Jurkat T-Zellen als Maß für die Beeinflussung der DNA-Synthese durch IP3K und IPMK Hemmstoffe
Da die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass alle Hemmstoffe der IP3K-A den Zellzyklus der Jurkat T-Zellen in der S-Phase blockierten, wurde anhand des 5-Bromo-2' -deoxy-uridin-Einbaus (BrdU) die DNA-Synthese der Zellen überprüft. Diese Analyse diente zur Klärung der Frage, ob die Blockade in der S-Phase auf eine Hemmung der DNA- Synthese zurückzuführen ist.
Die Jurkat T-Zellen wurden in einer Dichte von 2 x 104/100 μl ausgesät und für 48 Stunden in Gegenwart unter- schiedlicher Konzentrationen des Hemmstoffes bei 37 °C in einer 5 % C02-haltigen Atmosphäre inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Vitalität der Jurkat T-Zellen mit Hilfe der Trypanblau-Färbemethode und der BrdU-Einbau untersucht. Als Hemmstoffe wurden Gossypol, ATA, (-)-EGCG sowie 3' , ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon eingesetzt.
(-)-EGCG, welches den Zellzyklus in der S-Phase blockiert, beeinflusst die DNA-Synthese bei der maximal eingesetzten Konzentration von 20 μM nicht signifikant. Bei dieser Konzentration konnte eine deutliche Hemmung der Proliferation sowie mittels der Trypanblau-Färbemethode 50 % vitale Zellen ermittelt werden.
Ebenso wurde durch 3' , ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon die DNA- Synthese nicht signifikant beeinflusst. Dagegen konnte eine leichte Hemmung der Synthese durch Gossypol ermittelt werden. Bei einer Konzentration von 1 μM und einem prozentualen Anteil von 66 % lebenden Zellen wurde die DNA-Synthese um 16 % erniedrigt. Bei der maximal eingesetzten Konzentration an Gossypol (3 μM) wurde eine 21 %-ige Inhibition der DNA- Synthese analysiert. Wurden die Jurkat T-Zellen für 48 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen an ATA inkubiert, konnte eine Stimulierung der DNA-Synthese um 17 % beobachtet werden.
Hemmstoffeffekte auf den Inositolpolyphosphat- Metabolismus in Jurkat T-Zellen
Da der beobachtete Block des Zellwachstums durch IP3K-Hemmstoffe in der S-Phase ganz offensichtlich nicht mit dieser Hemmung der DNA-Synthese korreliert ist, wurde nun die Möglichkeit näher analysiert, dass der antiproliferative Effekt wie auch der S-Phasenblock mit einer Hemmung des Inositolphosphat-Metabolismus korrelieren und vielleicht kausal zusammenhängen könnte. Es wurde also untersucht, ob die IP3IK-Hemmstoffe in den intakten Zellen über die Inhibi- tion dieses Enzyms die Biosynthese der höheren Inositolphosphate hemmt.
Die Effekte von Quercetin und Gossypol auf die Konzentrationen der höher phosphorylierten Inositole in humanen Jurkat T-Zellen wurden mittels der MDD-HPLC-Analytik (Mayr, 1990) analysiert.
Zunächst wurden die Zellen in An- und Abwesenheit von 30 μM Quercetin bzw. 3 μM Gossypol über 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden diese für die HPLC-Analyse der Inositolphosphate aufgearbeitet und die zellulären Inositolphosphate gemessen.
Wirkung von Quercetin
Im Vergleich zu den Kontrollen konnte unter Behandlung der Jurkat T-Lymphozyten mit 30 μM Quercetin ein Rückgang der Konzentration an Ins (1, 3, 4) P3, des Dephosphorylierungsproduktes des Produktes der IP3K {Ins (1, 3, 4, 5) P4 } , um 49 % nach 48 Stunden Inkubation analysiert werden.
Parallel hierzu wurde wie erwartet eine Abnahme der Konzentration an Ins (1, 3, 4, 5) P4 um 68 % und an Ins (1, 4, 5, 6) P4 um 77 % gemessen.
Ebenso wurde eine Verringerung in der Konzentration an InsP5-Isomeren beobachtet. Insbesondere bei Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 konnte ein Rückgang um 68 % ermittelt werden. Bei dem Isomer Ins (1, 2, 4, 5, 6) P5 wurde dagegen nur eine nicht signifikante Abnahme analysiert.
Auch die Konzentrationen an noch höher phosphorylierten Inositolen nahmen unter dem Einfluss von Quercetin ab (InsP6: -44 %, InsP7 (5-PPInsP5) : -19 %) . In der Menge an Ins (1,5, 6) P3 konnte kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollen festgestellt werden.
Gleichzeitig konnte eine deutliche Zunahme in der Konzentration an den InsP5-Isomeren Ins (1, 2, 3, 4, 6) P5 und Ins (1, 2, 3, 4, 5) P5 im Vergleich zur Kontrolle unter dem Einfluß von Quercetin festgestellt werden.
Wirkung von Gossypol
Unter der Behandlung von Jurkat T-Zellen mit 3 uM Gossypol konnte eine Abnahme der Konzentration an Ins (1,3, 4) P3 um 35 % nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden detektiert werden.
Ebenso nahmen die Konzentrationen an Ins (1, 3, 4, 5) P4 um 39 %, an Ins (1,3,4, 6) P4 um 33 % und an Ins (1, 4, 5, 6) P4 um 61 % ab.
Parallel hierzu wurde auch eine Verringerung der Konzen- tration der InsP5-Isomeren Ins (1, 2, 3, 4, 5) P5 um 28 % sowie Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 um 24 % analysiert, die sich aber aufgrund einer statistischen Analyse (t-Test) nicht als signifikant herausstellte . Die Konzentrationen der höher phosphorylierten InsPs verringerten sich ebenfalls unter dem Einfluss von Gossypol (InsP6: -25%, InsP7 (5-PPInsP5) : -35%) .
Keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollen konnte in der Konzentration der Isomeren
Ins (1,5, 6)P3, Ins (1,2,4, 5, 6)P5 und Ins (1, 2, 3, 4, 6) P5 ermittelt werden.
Bei allen InsP-Isomeren {Ausnahme Ins (1, 3, 4, 5) P4} konnte nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden kein Rückgang der Konzentrationen der jeweiligen Isomeren im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet werden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass während des Versuchs keine Zugabe an frischem Gossypol erfolgte, so dass nach 24 Stunden der Hemmstoff vollständig von den sehr dicht gewachsenen Zellen abgebaut oder z.B. über eine Multi-Drogen-Resistenz-
Transportprotein (MDR) -Expression eliminiert wurde und somit keinen Effekt mehr auf den Inositolphosphatstoffwechsel hatte.
Antiproliferative Kombinationen an IP3K und IPMK Hemmstoffen getestet an Jurkat T-Zellen
Auf Grund der Beobachtung, dass die meisten der potenten Hemmstoffe sowohl der IP3K als auch der IPMK jeweils der Gruppe der pflanzlichen Polyphenole zugehören ergab sich die interessante Hypothese, dass Pflanzen diese als Insekten- Phytoalexine bekannten Substanzen (Harborne & Grayer 1994) möglicherweise in ihrer Evolution zur Wachstumshemmung dieser Fraßfeinde in der Weise entwickelt haben, dass mehrere anti- proliferativ wirksame Flavonoide bzw. Polyphenole anderer Grundstruktur sich in ihrem antiproliferativen Effekt addieren. Der Grund für die Kombination verschiedener antipro- liferativer Polyphenole in einer Pflanzenspezies könnte darin liegen, dass es für die Pflanzen "pharmakologisch" als vorteilhaft erwiesen hat, mehrere antiproliferative Wirkstoffe additiv zu kombinieren um zwar das Wachstum der Fraßfeinde, v.a. der Insekten zu unterdrücken, sie andererseits aber nicht zu töten bzw. sie nicht in ihrer Fortpflanzungsfähigkeit zu schädigen. Denn die meisten dieser Fraßfeinde sind gleichzeitig Vektoren für die Befruchtung entsprechender Pflanzen. Es könnte sich bei der hier beobachteten Akkumulation von antiproliferativen Polyphenolen um ein seit über 100 Mio Jahren laufendes Evolutionsexperiment handeln, bei welchem Pflanzen im wesentlichen nicht genotox- ische antiproliferative Wirkprinzipien durch Kombination von mehreren Wirkstoffen in genügend niedriger Kombinationsdosis erworben haben. Bei bestimmten Insekten wurde gezeigt, dass selbst extrem hohe Gesamtkonzentrationen bestimmter durch Pflanzenfraß aufgenommener Flavonoide nicht zu toxischen Wirkungen führen, so dass für einige der Mitglieder dieser Verbindungen von völlig fehlender Genotoxizität ausgegangen werden kann.
Entsprechende Kombinationsexperimente durchgeführt in Form von Wachstums-Hemmexperimenten von Jurkat-T-Zellen haben diese Hypothese voll bestätigt. In jedem Falle einer solchen Wirkstoffkombination von zwei potenten Hemmstoffen von IP3K (Gossypol und Myricetin, Gossypol und ATA, Quercetin und ATA) bzw. von IP3K (Quercetin, Gossypol, Myricetin und ATA) und IPMK (ATA und mit Einschränkung Gossypol) wurde ein Effekt der Kombination dieser Substanzen beobachtet, welcher sich wir folgt beschreiben lässt und durch die Daten in den Tabellen 8 und 9 belegt ist:
1. die Zugabe einer Konzentration eines (zweiten) potenten IP3K-Hemmstoffes im Bereich unterhalb seines IC50-Wertes seiner wachstumshemmenden Wirkung bewirkt eine Sensitisierung für die wachstumshemmende Wirkung eines ersten
IP3K-Hemmstoffes oder eines IPMK-Hemmstoffes, d.h. eine signifikante Erniedrigung des IC50 Wertes für die Wirkung dieses letzteren Hemmstoffes im Vergleich zum IC50 dieser Substanz allein (Fig. 8 bzw. Tabelle 8; die IC50-Werte wurden durch Fits von sigmoidalen Hill-Funktionen an die Zellzahl vs . Inhibitorkonzentrationsdaten nach 48 und 72 Stunden Zellwachstum ermittelt; 100% Hemmung bedeutet kein Wachstum und Persistenz der initialen Zellzahl; (1) Inhibition >100% bedeutet Apoptose-bedingte Abnahme der Zellzahl unter den ini- tialen Wert) .
2. Eine präzise quantitative Analyse des Hemmeffektes bei Kombination zweier IP3K-Hemmstoffe bzw. eines IP3K- und eines IPMK-Hemmstoffes in Konzentrationen unterhalb oder im Bereich ihrer IC50-Werte ergibt in jedem Fall eine ausge- prägtere Hemmwirkung des Zellwachstums als wie sie durch lineare Addition der beiden isolierten Hemmeffekte errechenbar ist. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Dosis- Wirkungsfunktionen der einzelnen Hemmstoffe im Bereich ihres ansteigenden Schenkels nicht linear sind und zumeist Hill- Koeffizienten von <-l aufweisen, kann hieraus mit Sicherheit eine additive Wirkung der Kombination zweier submaximal konzentrierter Hemmstoffe abgeleitet werden. In einigen Fällen ist der über die lineare Addition hinausgehende Hemmeffekt so ausgeprägt, dass eine Potenzierung der Wirkung der Kombination dieser Hemmstoffe (z.B. Gossypol bei Konzentrationen <lμM und ATA) vermutet werden kann (Tabelle 9 bzw. Fig. 9: Additivität von IP3K/IPML Inhibitoren bei der Wachstumshemmung von Jurkat Zellen) .
Es zeigt sich in der hier bewiesenen Additivität ein neues Verfahren für eine antiproliferative Kombinations-Pharmakotherapie .
Proliferationshemmung von NIH 3T3-Zellen Zur Bestimmung der Hemmstoffeffekte auf die Zellprolif- eration von NIH 3T3-Zellen wurden diese mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden bei 37 °C und 5 % C02 inkubiert. Diese Versuche wurden mit den an Jurkat T-Zellen getesteten Hemmstoffen der IP3K-A durchgeführt. Für alle getesteten Inhibitoren der IP3K konnte auch bei dieser Zelllinie eine Proliferationshemmung der NIH 3T3-Zellen nachgewiesen werden.
Gossypol zeigte wie bei den Jurkat T-Zellen den stärk- sten Effekt (IC50: 1.37 μM) , wobei diese Verbindung auch bei diesen Zellen eine sehr geringe "therapeutische Breite" (Dosisverhältnis zwischen antiproliferativen und zeiltötenden Effekt) besaß.
Für (-)-ECG konnte ein um Faktor 1.7 niedrigerer IC50-Wert im Vergleich zu den Jurkat T-Zellen bestimmt werden. Dagegen hemmte Quercetin die Proliferation der NIH 3T3-Zellen um Faktor 2 geringer (IC50: 52.5 μM) .
Hypericin zeigte nach 15-minütiger Bestrahlung mit Laborlicht bei einer Konzentration von 200 nM eine deutliche Hemmung der Proliferation, die allerdings nicht so stark ausgeprägt war wie bei den Jurkat T-Zellen. Wurde der Versuch unter Lichtausschluss durchgeführt, konnte ein sehr geringfügiger Hemmeffekt (7% Proliferationshemmung) bei einer Konzentration von 300 nM festgestellt werden. ATA hemmte die Proliferation der NIH 3T3-Zellen um Faktor 5 stärker (IC50: 6.25 μM) als diejenige der Jurkat T-Zellen.
Die IC50-Werte aller anderen getesteten Hemmstoffe unterscheiden sich nicht signifikant von den bei den Jurkat T- Zellen analysierten Werten.
Bei der Ermittlung der Zytotoxizität der Inhibitoren stellte sich heraus, dass bei (-)-ECG, Quercetin und 3' , 4 ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon in einer Konzentration des 2- bis 3-fachen IC50-Wertes des Zellwachstums über eine Inkuba- tionszeit von 72 Stunden bis zu 70 % der Zellen überlebten. Für Hypericin konnte bei einer Konzentration von 200 nM nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden eine Überlebensrate der Zellen von 51 % gemessen werden. Bei (-)-EGCG und Myricetin wurden bei einer Konzentration des 4-fachen IC50-Wertes des Zellwachstums nach 72 Stunden 50 % bzw. 34 % vitale Zellen analysiert.
Die geringste Zytotoxizität besaß ATA, die auch den schwächsten Hemmeffekt auf die Proliferation aufwies. Bei einer Konzentration des 24-fachen IC50-Wertes des Zellwachstums überlebten 55 % der Zellen.
Bei Gossypol dagegen starben alle Zellen bei einer Konzentration des 3.5-fachen IC50-Wertes des Zellwachstums ab,
Proliferationshemmung von MCF7-Zellen
Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellproliferation wurden die MCF7-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden untersucht. Diese Analytik wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.
Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Prolifera- tionshemmung der MCF7-Zellen nachgewiesen werden (Tabelle 10 bzw. Fig. 10) .
Proliferationshemmung von HL60 Zellen
Die Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellprolifera- tion der HL60-Zellen wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden kultiviert und gezählt.
Für alle getesteten Verbindungen konnte eine Proliferationshemmung der HL60-Zellen nachgewiesen werden (Tabelle 10 bzw. Fig. 10) .
Proliferationshemmung von HT29 Zellen
Zur Analyse des Hemmstoffeffekts auf die Zellprolifera- tion wurden die HT29-Zellen mit unterschiedlichen Konzentra- tionen an Inhibitor über einen Zeitraum von 72 Stunden analysiert. Diese Analytik wurde mit den potentesten Hemmstoffen der IP3K und der IPMK durchgeführt.
Gossypol zeigte wie bei den Jurkat T-Zellen, NIH 3T3-Zellen, HL60-Zellen und MCF7-Zellen den stärksten anti- proliferativen Effekt von den getesteten Hemmstoffen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10/Tabelle 10 (Proliferationshemmung verschiedener getesteter Zelllinien nach 72 Stunden; *: Bestrahlung mit Laborlicht; Angegeben sind Mittelwerte + SD für die Proliferationshemmung nach 72 Stunden Zellkul- tivierung) aufgeführt.
LITERATUR
Berridge MJ et al., Nature 1984 22-28; 312 (5992) : 315-21
Berridge MJ, Nature 1993; 361 (6410) : 315-25 Bertsch U et al . , Gene 1999; 228 (1-2) : 61-71
Choi KY, Kim HK, Lee SY, Moon KH, Si SS, Kim JW, Chung HK, Rhee SG. Science 1990 Apr 6; 248 (4951) : 64-6
Communi D et al . , Biochem J 1994;298 Pt 3:669-73 Communi D et al . , Cell Signal 1995; 7 (7) : 643-50 Communi D et al . , C.EMBO J 1997 ; 16 (8) : 1943-52
Dessauer CW et al . , Clin Sei (Lond) 1996; 91 (5) : 527-37 Dewaste V et al . , Biochem J 2000; 352 Pt 2:343-51 Dewaste V et al . , Biochem Biophys Res Commun 2002;291 (2) :400-5 El Bakkoury M et al . , Mol Microbiol 2000; 35 (1) : 15-31 Erneux C et al., Biochim Biophys Acta 1998;1436(l-2) :185-99
Hanakahi LA et al . , Cell 2000; 102 (6) : 721-9
Hilton JM et al . , J Biol Chem 2001; 276 (19) : 16341-7 Irvine RF et al . , Nature 1986; 320 (6063) : 631-4
Irvine RF et al . , Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2 (5) :327-3E Johnson RM et al . , Science 1989; 246 (4926) : 121-4 Lee SY et al . , J Biol Chem 1990;265 (16) : 9434-40 Lin AN et al . , Biochem Biophys Res Commun 1990;170(3) -.1371-6 Ma Y, Lieber MR.J Biol Chem 2002 Mar 29;277(13) : 10756-9 Maraldi NM, Zini N, Santi S, Manzoli FA.J Cell Physiol 1999 Nov;181(2) :203-17
Mattingly RR et al . , J Biol Chem 1991; 266 (23) : 15144-53 Mayr GW. Biochem J 1988 Sep 1; 254 (2 ): 585-91
Morris AJ et al . , Biochem J 1987; 248 (2) : 489-93 Odom AR et al . , Science 2000; 287 (5460) : 2026-2029 Ryu SH et al., FASEB J 1987 Nov; 1 (5) : 388-93 Saiardi A, Erdjument-Bromage H, Snowman AM, Tempst P, Snyder SH.Curr Biol 1999 Nov 18; 9 (22) : 1323-1326
Saiardi A et al . , FEBS Lett 2000; 468 (1) : 28-32 Saiardi A et al., Proc Natl Acad Sei USA 2001 Feb 27;98 (5) .2306-11
Shears SB. Pharmacol Ther 1991; 49 (1-2) : 79-104 Shears SB. Bioessays 2000 Sep; 22 (9) : 786-9
Sim SS et al., J Biol Chem 1990; 265 (18) : 10367-72 Shin et al . , Molecules Cells 1995, 5: 348-353 Takazawa K et al . , C. Biochem J. 1990;268 (1) : 213-7 Takazawa K et al . , Biochem J. 1990; 272 (1) : 107-12 Takazawa K et al . , Nucleic Acids Res. 1990; 18 (23) : 7141 Takazawa K et al . , Biochem Biophys Res Commun. 1991/174 (2) :529-35
Takazawa K et al . , Biochem J. 1991/278 (Pt 3):883-6 Takazawa K, Erneux C. Biochem J. 1991 Nov 15; 280 ( Pt 1) : 125-9
Thomas S et al., Biochim Biophys Acta 1994;1220(2:219-22
Vanweyenberg V et al . , Biochem J 1995;306:429-35 Wilson MP et al . , J Biol Chem 1996; 271 (20) : 11904-10 Woodring PJ et al., Biochem J 1996;319 (Pt l):73-80
Woodring PJ et al., J Biol Chem 1997;272 (48) : 30447-54 Yamaguchi K, Hirata M, Kuriyama H. Biochem J 1988 Apr 1/251 (1) :129-34
York JD et al., Science 1999 Jul 2/ 285 (5424) : 96-100 Zhang T et al., FEBS Lett 2001 Apr 13/ 494 (3) : 208-12 Agostinis P et al . , Biochem Pharmacol 1995 Mai 26,49 (11) -1615-22
Agostinis P et al . , Int J Biochem Cell Biol 2002 Mar, 34 (3) : 221-241 5 Agullo G et al . , Cancer Lett 1996 Jul 19, 105 (1) : 61-70
Ahmad N et al . , J Natl Cancer Inst 1997 Dec 17,89(24) .1881-86
Akiyama T et al . , J Biol Chem 1987 Apr 25,262 (12) :5592-95 10 Band V et al . , Gynecol Oncol 1989 Mar, 32 (3) : 273-77
Bertsch U et al . , Gene 1999 Mar 4/ 228 (1-2) : 61-71
Bertsch U et al . , J Biol Chem 2000 Jan 21,275(3) :15575-64
Bruns RF et al . , Biochem Biophys Res Commun 1991 Apr 15 15,176(1) :288-91
Chen ZP et al . , Cancer Lett 1998 Jul 17, 129 (2) : 173-9
Cole CN et al . , Curr Biol 1998 May 21/ 8 (11) : R368-72
El Bakkoury M et al . , Mol Microbiol 2000 Jan/35 (1) : 15-31 20 Gutfreund H., Enzymes: Physical Principles, Gutfreund H, ed., Wiley & Sons Ltd, London 1972,189-203
Gschwendt M et al . , Biochem Biophys Res Commun 1994 Feb 28,199(1) :93-8
Da Silva CP et al . , J Biol Chem 1994 Apr 25 29,269(17) :12521-26
Gazit A et al . , J Med Chem 1991 Jun, 34 ( 6) : 1896-1907
Harborne JB et al, . The Flavonoids . Advances in Research since 1986. Harborne JB, ed., Chapman & Hall 1994, 589-618.
Kang TB et al . , Biochem Pharmacol 1997 Nov 30 1,54 (9) :1013-18
Kobayashi E et al . , Biochem Biophys Res Commun 1989 Mar 15,159(2) :548-553
Lee HS et al . , Planta Medica 1996,62:293-6
Matter WF et al . , Biochem Biophys Res Commun 1992 Jul 35 31,186 (2) : 624-31 Mayr GW, Methods in Inositide Research. Irvine, RF, ed.,
Raven Press, London 1990, 83-108.
Okabe S et al . , Jpn J Cancer Res 1997 Jul, 88 (7) : 639-43 Rodgers EH et al . , Chem Biol Interact 1998 Nov 27,116(3) :213-28
Ruckstuhl M et al . , Biochem Pharmacol 1979, 28 (4) : 535-38 Sanger F et al . , Proc Natl Acad Sei USA 1977
Dez, 74(12) :5463-67
Sarkaria JN et al., Cancer Res. 1998 Oct 1/58 (19) :4375-82
Spinozzi F et al., Leukemia Res 1994 Jun, 18 ( 6) : 431-39 Saiardi A et al . , FEBS Lett 2000 Feb 18/ 468 (1) : 28-32 Srivastava A., Biochem Biophys Res Commun 1985,131:1-5 Tamaoki T et al., Biotechnology 1990 Aug, 8 (8) : 732-5 Takahashi I et al . , Biochem Biophys Res Commun 1989 Dec
29,165(3) : 1207-12
Bertsch U et al . , Gene 1999 Mar 4/ 228 (1-2) : 61-71 Bertsch U et al . , J Biol Chem 2000 Jan
21,275(3) :15575-64 Gutfreund, H. (ed) ; Enzymes: Physical Principles, Wiley
& Sons Ltd., London 1972,189 - 203
Mayr GW: Methods in Inositide Research (ed. Irvine, RF) .
Raven Press, London 1990, 83-108.
Die Sequenz der HsIPMK ist auch unter der Accession No . AF432853 (gi : 22532104) hinterlegt

Claims

Patentansprüche :
1) Testsystem zur Auffindung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie proliferativer Erkrankungen mit einer oder mehreren, insbesondere a) und b) , oder allen der folgenden Komponenten:
a) eine IP3K aus welcher Spezies auch immer, vorzugsweise eine humane IP3K oder eine IP3K aus einem höheren Verte- braten, und in welcher Isoform auch immer (A, B, oder C) , wobei diese IP3K mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IP3K und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und ge- prüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IP3K derartig zu hemmen in der Lage ist, dass das Substrat Ins (1,4, 5) P3 nicht oder nur vermindert phosphoryliert wird.
b) Eine IPMK aus welcher Spezies auch immer und in welcher Isoform auch immer, wobei die IPMK mit der zu prüfenden Substanz vermischt wird, nachfolgend ein Substrat für die IPMK und ein Phosphatdonor dem Gemisch hinzugegeben wird und geprüft wird, ob die zu prüfende Substanz die enzymatische Aktivität der IPMK derartig zu hemmen in der Lage ist, dass eines seiner Substrate nicht oder nur vermindert phosphoryliert wird.
c) Eine Zelle, bevorzugt einer Tumorzelle, zu welcher eine Substanz, welche in der Lage ist, eine IP3K zu hemmen, hinzugegeben wird und geprüft wird, ob diese Substanz das Wachstum der Zelle hemmt und/oder die Zelle tötet. 2) Humane Isoform der IPMK, oder ein aktives Fragment hiervon, oder ein Protein, welches homolog ist zu dieser Isoform ist, oder ein Protein, welches eine aktivierende oder inaktivierende Mutation dieser Isoform darstellt, insbe- sondere eine isolierte Aminosäuresequenz enthaltend ein Fragment einer Länge von zumindest 4, vorzugsweise von zumindest 6, höchstvorzugsweise zumindest 8, beispielsweise zumindest 30, Aminosäuren aus der Sequenz Seq.-ID 5 oder bestehend hieraus, oder codiert durch eine Nuklein- säure nach Anspruch 3.
3) Ein Gen für ein Protein oder Peptid gemäß Anspruch 2) und/oder hierfür codierende Nukleinsäure (DNA oder RNA) , insbesondere eine isolierte Nukleinsäure (RNA oder DNA) enthaltend ein Fragment einer Länge von zumindest 12, vorzugsweise von zumindest 18, höchstvorzugsweise zumindest 24, beispielsweise zumindest 90, Nukleotiden aus einer der Sequenzen Seq.-ID 3 oder 4, oder bestehend hieraus, eine allelische Variante einer solchen Nukleinsäure, eine zu einer vorstehenden Nukleinsäure zumindest 90%ig, insbesondere zumindest 95%ig, homologe Nukleinsäure, eine zu einer vorstehenden Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, oder eine mit einer vorstehenden Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure.
4) Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 3 für die Expression des Enzyms oder eines Teiles des Enzyms in einer beliebigen Zelle, oder Verwendung des vollständigen oder partiellen Genproduktes, insbesondere nach Anspruch 2, für ein Testsystem nach Anspruch 1. 5) Verwendung des Testsystems nach Anspruch 1 für die Auffindung und Prüfung eines das Zellwachstum hemmenden Wirkstoffes .
6) Wirkstoffe für die Hemmung des Zellwachstums, aufgefunden in einem Testsystem nach Anspruch 1, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend bzw. bestehend aus "Ellagsäure, 3' , 4 ' , 7, 8-Tetrahydroxyflavon, Fisetin, Galangin, Robinetin, Luteolin, Chrysin, Amentoflavon, Pyrogallolrot, Brompyrogallolrot, Bengalrosa B, Chinalizarin, Chlorogensäure, Bis-Tyrphostin, Rottlerin".
7) Kombinationen von mindestens zwei verschiedenen Wirkstoffen gemäß Anspruch 6) zur Hemmung des Zellwachstums.
8) Kombination von mindestens einem Wirkstoff gemäß Anspruch 6) mit mindestens einem Wirkstoff ausgewählt aus der
Gruppe, umfassend bzw. bestehend aus "Quercetin, Myricetin und deren Derivate, Gossypol, Aurintricarbonsäure (Aurin- tricarboxylic acid, ATA) , Hypericin, die Grüntee- Catechinderivate ECG und EGCG" .
9) Zubereitung enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Verwendung als Nahrungsmittelergänzung oder als Arzneimittel.
10) Verwendung einer Zubereitung für die Nahrungsmittelergänzung nach Anspruch 9) für die Prophylaxe einer proliferativen Erkrankung. 11) Verwendung einer Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 9) für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung.
5
12) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 9) und 11) für die Verabreichung auf die Haut, auf die Schleimhaut, in die Unterhaut, in das Blutgefäßsystem, in eine Körperhöhle,
10 in das Bindegewebe, in die Muskulatur, in ein Organ, in ein Gelenk oder für die orale oder rektale Verabreichung oder inhalative Aufnahme.
15 13) Verwendung einer Arzneimittelzubereitung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Prophylaxe oder Therapie einer proliferativen Erkrankung, umfassend eine Krebserkrankung, eine Leukämie, ein Sarkom, einen be- nignen Tumor, eine Entzündung, eine Rheumaerkrankung,
20 eine Autoimmunerkrankung, und/oder eine Organabstoßung.
14) Expressionskassette bzw. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 3.
25
15) Mit einem Vektor bzw. einer Expressionskassette nach Anspruch 17 transformierte prokaryontische oder eukaryon- tische Zelle.
30
16) Antisense oder Ribozym gegen eine Nukleinsäure nach Anspruch 3.
35 17) Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper oder Phage Display Antikörper, gegen ein Peptid nach Anspruch 2.
18) Substanz mit einem Mw von weniger als 10000, weniger als 5000, weniger als 2000, oder weniger als 1000, spezifisch bindend an ein Peptid nach Anspruch 2.
19) Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 3 oder eines Peptids nach Anspruch 2 in einem Screening Verfahren zur Findung daran bindender Substanzen.
20) Verwendung eines Peptids nach Anspruch 2 in einem Verfahren gemäß Merkmal b) des Anspruchs 1, wobei eine hemmende Substanz selektiert wird.
21) Verwendung eines Wirkstoffes oder mehrerer, insbesondere zwei oder drei, der Wirkstoffe nach Anspruch 6, optional kombiniert mit einem Wirkstoff nach Anspruch 8, und/oder eines Stoffes oder mehrerer Stoffe nach einem der An- sprüche 16 - 28, ggf. kombiniert mit einem oder mehreren der Stoffe nach Anspruch 6 und/oder 8, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Nahrungsmittelergänzung zur Hemmung des Zellwachstums, insbesondere zur Prophylaxe oder Behandlung einer Er- krankung nach Anspruch 13, wobei optional der Wirkstoff in einer physiologisch wirksamen Dosis mit Trägerund/oder Hilfsstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird. 22) Verfahren zur Hemmung einer IP-Kinase in einer Zelle, wobei einen (höheren) Vertebraten, insbesondere einem Menschen, eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21 in einer physiologisch wirksamen Dosis dargereicht wird.
23) Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer
Erkrnakung nach Anspruch 13, wobei einen (höheren) Verte- braten, insbesondere einem Menschen, welcher erkrankt ist oder dem Risiko einer Erkrankung ausgesetzt ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21 in einer physiologisch wirksamen Dosis dargereicht wird.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004066926A2 (en) * 2003-01-25 2004-08-12 Irm Llc Methods and compositions for modulating t lymphocytes

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0702087A1 (de) * 1994-09-14 1996-03-20 Landesvereinigung der Bayerischen Milchwirtschaft e.V. Testmedium für einen mikrobiologischen Hemmstofftest und Verfahren zu seiner Durchführung
WO1997046688A1 (en) * 1996-06-01 1997-12-11 Ludwig Institute For Cancer Research Lipid kinase
US6100090A (en) * 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648214A (en) * 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5385936A (en) * 1990-07-12 1995-01-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of The Health And Human Services Gossypol acetic acid for the treatment of cancer
DE69103503T2 (de) * 1990-09-28 1995-01-05 Mercian Corp Adriamycinderivate.
CA2330790A1 (en) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Method and device for isolating nucleic acids
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
DE19837758A1 (de) * 1998-08-20 2000-02-24 Beiersdorf Ag Verwendung von Wirkstoffkombinationen aus Flavonoiden und UV-Filtersubstanzen als antivirales Wirkprinzip
KR20000019718A (ko) * 1998-09-15 2000-04-15 박호군 탄닌 또는 탄닌 유래 페놀성 화합물을 포함하는 동맥경화증, 고지혈증 및 간질환의 예방 및 치료용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0702087A1 (de) * 1994-09-14 1996-03-20 Landesvereinigung der Bayerischen Milchwirtschaft e.V. Testmedium für einen mikrobiologischen Hemmstofftest und Verfahren zu seiner Durchführung
WO1997046688A1 (en) * 1996-06-01 1997-12-11 Ludwig Institute For Cancer Research Lipid kinase
US6100090A (en) * 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBI 14. Januar 2000 (2000-01-14), "Homo sapiens chromosome 19 clone LLNLR-244B2, complete sequence" XP002290628 gefunden im EBI Database accession no. AC020950 *
DATABASE EMBL 13. November 2001 (2001-11-13), STRAUSBERG R. ET AL.: "Homo sapiens, clone IMAGE:4510867, mRNA" XP002290627 gefunden im EBI Database accession no. BC016612 *
DATABASE EMBL 7. September 2001 (2001-09-07), TANG Y.T. ET AL.: "Human polypeptide SEQ ID NO: 20977 of patent WO200164835" XP002290626 gefunden im EBI Database accession no. AAO07085 *
SAIARDI A. ET AL.: "Inositol polyphosphate multikinase (ArgRIII) determines nuclear mRNA export in Saccharomyces cerevisiae" FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, Bd. 468, Nr. 1, 18. Februar 2000 (2000-02-18), Seiten 28-32, XP004260992 ISSN: 0014-5793 *
SAIARDI A. ET AL.: "Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, Bd. 98, Nr. 5, 27. Februar 2001 (2001-02-27), Seiten 2306-2311, XP002290624 ISSN: 0027-8424 *
SAIARDI A. ET AL.: "Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases" CURRENT BIOLOGY, Bd. 9, Nr. 22, 18. November 1999 (1999-11-18), Seiten 1323-1326, XP002290625 ISSN: 0960-9822 *
SEDLACEK H.H.: "Kinase inhibitors in cancer therapy: A look ahead" DRUGS, Bd. 59, Nr. 3, M{rz 2000 (2000-03), Seiten 435-476, XP009034095 ISSN: 0012-6667 in der Anmeldung erw{hnt *
SHEARS S.B.: "The versatility of inositol phosphates as cellular signals" BIOCHIMICA AND BIOPHYSICA ACTA. MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF LIPIDS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, Bd. 1436, Nr. 1-2, 8. Dezember 1998 (1998-12-08), Seiten 49-67, XP004277217 ISSN: 1388-1981 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004066926A2 (en) * 2003-01-25 2004-08-12 Irm Llc Methods and compositions for modulating t lymphocytes
WO2004066926A3 (en) * 2003-01-25 2006-07-06 Irm Llc Methods and compositions for modulating t lymphocytes

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