DE69924877T2

DE69924877T2 - Humanes akt-3 protein

Info

Publication number: DE69924877T2
Application number: DE69924877T
Authority: DE
Inventors: Stefan Leo Jozef Masure; Alan Richardson
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: IL143862A0; JP4721205B2; JP2002535964A; IL143862A; CA2355834A1; WO2000037613A2; NZ512933A; CA2355834C; DK1141326T3; EP1141326A2; AU1873200A; WO2000037613A3; AU774718B2; US7071316B1; DE69924877D1; EP1141326B1; ATE293695T1; ES2242441T3; GB9828375D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Klonen und Exprimieren einer neuen humanen Serin/Threoninkinase mit der Bezeichnung "Akt-3" und insbesondere die Nukleinsäuremoleküle, die für das Akt-3-Protein kodieren, das Protein selbst und Verbindungen, die zum Hemmen des Überlebens von Zellen verwendbar sind.
Ein charakteristisches Merkmal zahlreicher Krebszellen ist deren Fähigkeit, sich adhäsionsunabhängig zu vermehren. Im Gegensatz dazu erfahren nicht transformierte Endothelzellen, deren Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (ECM) verhindert wird, eine Apoptose (Frisch & Francis, 1994; Meredith et al., 1993). Der Prozess, der die Apoptose von normalerweise adhärenten Zellen auslöst, wenn diese außer Stande sind, an der ECM zu haften, wurde als "Anoikis" bezeichnet (Frisch & Ruoslahti, 1997) und ist ein Beispiel für die Auswirkung auf eine Zelle nach Entfernen eines Überlebensfaktors. Signalveränderungen durch Adhäsionsmoleküle können zur Beständigkeit gegenüber Anoikis (Frisch & Ruoslahti, 1997) führen und dies unterstützt möglicherweise den Mechanismus, mit dem Krebszellen, die sich adhäsionsunabhängig vermehren, Anoikis vermeiden können.
Akt (auch als Proteinkinase B (PKB) oder "mit der A- und C-Proteinkinase verwandt" (RAC-PK) bekannt) ist eine Serin/Threoninkinase, die mit der Regulierung des Überlebens von Zellen in Verbindung gebracht wurde (Khwaja et al., 1997; Dudek et al., 1997; Kauffmann-Zeh et al., 1997; Kennedy et al., 1997; Datta et al., 1997; Marte & Downward, 1997). Akt kann die Apoptose hemmen, die durch das Ablösen von ECM (Anoikis; Khwaja et al., 1997), durch den Entzug von Überlebensfaktor (Kennedy et al., 1997; Ahmed et al., 1997; Dudek et al., 1997; Kauffmann-Zeh et al., 1997; Philpott et al., 1997; Crowder & Freeman, 1998; Eves et al., 1998) oder Bestrahlung (Kulik et al., 1997) induziert wird.
Akt umfasst eine NH₂-terminale Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH), die an der Lipidbindung beteiligt ist, eine Kinasedomäne und einen COOH-terminalen "Schweif". Es wird angenommen, dass Akt durch Rekrutierung zur Plasmamembran und anschließende Phosphorylierung durch zwei stromaufwärts befindliche Kinasen, PDK-1 und PDK-2, aktiviert wird (besprochen in Coffer et al., 1998; Alessi & Cohen, 1998). Es wird angenommen, dass die durch Phosphatidylinositol-3-kinase (PI 3-Kinase) erzeugte Bindung von 3-Phosphoinositiden an die PH-Domäne von Akt eine Verlagerung zur Plasmamembran unterstützt und die Phosphorylierung von Akt-1 durch PDK-1 bei Thr³⁰⁸ (Alessi et al., 1996; Alessi et al., 1997; Stephens et al., 1998) oder von Akt-2 bei Thr³⁰⁹ (Meier et al., 1997) vereinfacht. Neben der Phosphorylierung von Thr³⁰⁸ verlangt eine vollständige Aktivierung die Phosphorylierung des COOH-Schweifs bei Ser⁴⁷³ in Akt-1 (Alessi et al., 1996) oder bei Ser⁴⁷⁴ in Akt-2 (Meier et al., 1997). Als das Enzym, das für die Phosphorylierung von Ser⁴⁷³/Ser⁴⁷⁴ verantwortlich ist, wurde ursprünglich PDK-2 genannt, kürzlich hat sich jedoch die Integrin Linked Kinase ILK (Delcommenne et al., 1998) als Kandidat für diese Funktion herausgeschält.
Bisher sind zwei humane Isoforme von Akt beschrieben, Akt-1 und Akt-2 (Coffer & Woodgett, 1991; Jones et al., 1991; Cheng et al., 1992). Eine dritte Isoform, hier als Akt-3 bezeichnet, wurde bei Ratten beschrieben (Konishi et al., 1995). Da dieses Ratten-Akt-3 einen offenbar verkürzten Schweif aufweist und somit Ser⁴⁷³ mangelt, kann sich dessen Regulierung von der von Akt-1 und Akt-2 unterscheiden. Sowohl Akt-1 als auch Akt-2 werden in großem Umfang exprimiert, die Expression von Akt-2 ist jedoch in Geweben, die auf Insulin reagieren, wie Leber und Skelettmuskeln, am ausgeprägtesten (Konishi et al., 1994; Altomare et al., 1995). Akt-1 und Akt-2 werden durch Insulin in Adipozyten, Hepatozyten und Skelettmuskeln von Ratten aktiviert. Im Gegensatz dazu wird Akt-3 in diesen Geweben offenbar nicht kräftig durch Insulin aktiviert (Walker et al., 1998). Die Rolle der verschiedenen Akt-Isoforme auf dem Insulin-Signalweg kann die Nützlichkeit von Verbindungen begrenzen, die die Aktivierung von Akt-1 oder Akt-2 hemmen, da derartige Mittel Symptome hervorrufen können, die bei Diabetes-Patienten beobachtet werden. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass dieses Problem durch die Verwendung selektiver Inhibitoren für Akt-3 vermieden werden kann und dies brachte uns dazu, das humane Analogon des Ratten-Akt-3 zu finden.
Die Erfinder haben nun ein Nukleinsäuremolekül identifiziert und charakterisiert, das für die humane Isoform von Akt-3 kodiert. Wesentlich ist hierbei, dass humanes Akt-3 einen COOH-terminalen Schweif besitzt, der einen Aminosäurerest aufweist, der analog zu Ser⁴⁷³/Ser⁴⁷⁴ ist, die bereits mit der Aktivierung von Akt-1/Akt-2 in Verbindung gebracht wurden, jedoch nicht im Akt-3-Protein von Ratten vorhanden sind.
Somit wird in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das für humanes Akt-3 oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder Bio-Vorläufer davon kodiert, umfassend die in 2 dargestellte Aminosäuresequenz. Das Molekül ist vorzugsweise ein DNS-Molekül und noch mehr bevorzugt ein cDNS-Molekül und umfasst noch mehr bevorzugt die in 1 dargestellte Nukleotidsequenz. Durch diesen Aspekt der Erfindung wird auch ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das unter hoch stringenten Bedingungen zu einem erfindungsgemäßen Molekül hybridisieren kann.
Die Stringenz der Hybridisierung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität der Hybride lässt sich anhand der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride ausdrücken. Tm lässt sich näherungsweise durch folgende Formel wiedergeben: 81,5°C – 16,6 (log10[Na+] + 0,41 (%G&C) – 600/lworin 1 die Länge der Hybride in Nukleotiden ist. Tm nimmt mit jedem 1%igen Rückgang der Sequenzhomologie um 1–1,5°C ab.
Der Begriff "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen, unter denen sich eine einsträngige Nukleinsäure mit einem komplementären Strang verbindet, wenn sich die Purin- oder Pyrimidinbasen darin über Wasserstoffbindungen mit ihren komplementären Basen paaren. Hoch stringente Bedingungen favorisieren homologe Basenpaare, wohingegen niedrig stringente Bedingungen nicht homologe Basenpaare favorisieren.
"Niedrig stringente" Bedingungen umfassen beispielsweise eine Temperatur von ungefähr 37°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als ungefähr 50% und eine mäßige bis niedrige Salzkonzentration (SSC) oder, als Alternative, eine Temperatur von ungefähr 50°C oder weniger und eine mäßige bis hohe Salzkonzentration (SSPE), beispielsweise 1 M NaCl.
"Hoch stringente" Bedingungen umfassen beispielsweise eine Temperatur von ungefähr 42°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als ungefähr 20% und eine niedrige Salzkonzentration (SSC) oder, als Alternative, eine Temperatur von ungefähr 65°C oder weniger und eine niedrige Salzkonzentration (SSPE). Hoch stringente Bedingungen umfassen beispielsweise eine Hybridisierung in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band I, 1989; Green Inc. New York, unter 2.10.3).
"SSC" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 20 × SSC-Stammlösung enthält 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0.
"SSPE" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 1 × SSPE-Lösung enthält 180 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1 mM EDTA, pH 7,4.
Die Nukleinsäuren, die zu erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren können, sind im Allgemeinen wenigstens zu 85%, vorzugsweise wenigstens 90% und noch mehr bevorzugt wenigstens 95% mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen homolog.
Die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle können vorteilhaft in einem geeigneten Expressionsvektor zum Exprimieren von Polypeptiden, die daraus in einem geeigneten Wirt kodiert werden, enthalten sein.
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfasst ebenfalls Proteine oder Polypeptide, die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder Bio-Vorläufer davon kodiert werden.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor umfasst einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die wirksam an Regulierungssequenzen, wie Promoterregionen, gebunden ist, welche im Stande sind, die Expression der DNS-Fragmente zu bewirken. Der Begriff "wirksam gebunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die deren Wirkungsweise auf geplante Weise ermöglicht. Derartige Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, um die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu ermöglichen. Somit stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden bereit, das das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor wie vorstehend beschrieben transformiert oder transfektiert wurde, unter Bedingungen, die die Expression einer kodierenden Sequenz, welche für die Polypeptide kodiert, durch den Vektor ermöglichen, sowie die Gewinnung der exprimierten Polypeptide umfasst.
Die Vektoren können beispielsweise Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsstartpunkt, wahlweise einem Promotor zur Expression des Nukleotids und wahlweise einem Regulator des Promotors versehen sind. Die Vektoren können einen oder mehrere selektierbare Marker, wie beispielsweise Ampicillinresistenz, enthalten.
Zu Regulatorelementen, die für die Expression erforderlich sind, gehören Promotorsequenzen zum Binden von RNS-Polymerase und Sequenzen zur Transkriptionsinitiierung zum Binden von Ribosomen. Ein bakterieller Expressionsvektor kann beispielsweise einen Promotor, wie den lac-Promotor, und zur Transkriptionsinitiierung die Shine-Dalgarno-Sequenz und das Startcodon AUG umfassen. Entsprechend kann ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNS-Polymerase II, ein Polyadenylationssignal stromabwärts, das Startcodon AUG und ein Stoppcodon zum Ablösen des Ribosoms umfassen. Derartige Vektoren sind im Handel erhältlich oder können mithilfe von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren aus den beschriebenen Sequenzen hergestellt werden.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann in die beschriebenen Vektoren in Antisense-Orientierung eingesetzt werden, um die Erzeugung von Antisense-RNS zu ermöglichen. Antisense-RNS oder andere Antisense-Nukleinsäuren können auf synthetische Weise erzeugt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine definierte Nukleinsäure nicht nur die identische Nukleinsäure, sondern auch jede geringe Basenabweichung, einschließlich insbesondere des Austausches von Basen auf grund einer Kodedegeneration bei konservativen Aminosäuresubstitutionen, was zu einem synonymen Codon (einem unterschiedlichen Codon das denselben Aminosäurerest angibt) führt. Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" umfasst auch die komplementäre Sequenz jeder einsträngigen Sequenz hinsichtlich der Basenabweichungen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch vorteilhaft Nukleinsäuresequenzen mit wenigstens ungefähr 10 zusammenhängenden Nukleotiden einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und vorzugsweise 10 bis 120, und noch mehr bevorzugt 10 bis ungefähr 50 Nukleotiden bereit. Diese Sequenzen können vorteilhaft als Sonden oder Primer zur Initiierung der Replikation oder dergleichen verwendet werden. Derartige Nukleinsäuresequenzen können gemäß im Fachgebiet gut bekannten Techniken, wie auf rekombinante oder synthetische Weise, hergestellt werden. Sie können auch in Diagnose-Kits oder dergleichen zum Nachweis der Gegenwart einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet werden. Diese Tests umfassen im Allgemeinen ein Kontaktieren der Sonde mit der Probe unter Hybridisierungsbedingungen und Nachweis der Gegenwart einer Doppelstrang- oder Dreifachstrangbildung zwischen der Sonde und einer Nukleinsäure der Probe.
Erfindungsgemäß können diese Sonden auf einem festen Träger verankert sein. Vorzugsweise sind sie auf einer Anordnung vorhanden, sodass mehrere Sonden gleichzeitig mit einer einzigen biologischen Probe hybridisieren können. Die Sonden können auf die Anordnung getüpfelt oder in situ auf der Anordnung synthetisiert werden. (Siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, Band 14, Dezember 1996 "Expression monitoring by hybridisation to high density oligonucleotide arrays". Eine einzige Anordnung kann mehr als 100, 500 oder sogar 1.000 verschiedene Sonden an getrennten Orten enthalten.
Vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung rekombinanter oder synthetischer Mittel, wie beispielsweise unter Verwendung von PCR-Klonmechanismen, erzeugt werden, was im Allgemeinen die Herstellung eines Primerpaars mit ungefähr 10 bis 50 Nukleotiden an einer Region des zu klonenden Gens, Kontaktieren der Primer mit mRNS, cDNS oder genomer DNS einer humanen Zelle, Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region verursachen, Isolieren der vervielfältigten Region oder des vervielfältigten Fragments und Gewinnung der vervielfältigten DNS beinhaltet. Im Allgemeinen sind die hierin definierten Techniken im Fachgebiet gut bekannt und beispielsweise von Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Oligonukleotide können eine Erkennungsmarkierung tragen. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie Biotin oder fluoreszierende Marker. Derartige Markierungen können den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden zugegeben und unter Verwendung von per se bekannten Techniken nachgewiesen werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst humanes Akt-3 oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder Biovorläufer davon, umfassend eine Aminosäuresequenz wie in 2 dargestellt.
Das erfindungsgemäße Polypeptid mit der Bezeichnung humanes Akt-3 umfasst alle möglichen Aminosäurevariationen, die durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert werden, einschließlich eines Polypeptids, das durch das Molekül kodiert wird und konservative Aminosäureänderungen aufweist. Zu erfindungsgemäßen Polypeptiden gehören weiterhin Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender alleler Varianten, die im Wesentlichen homolog zu den Polypeptiden sind. In diesem Zusammenhang gilt eine wesentliche Homologie als eine Sequenz, die eine wenigstens 90%ige Aminosäurehomologie mit den Polypeptiden, die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, und noch mehr bevorzugt eine 95%ige Aminosäurehomologie aufweist.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder humane Akt-3 kann vorteilhaft als ein Arzneimittel oder zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die mit Akt-3-Aktivität verbunden sind, wie Krebs oder dergleichen, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid kann vorteilhaft in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Hemmung von Akt-3 in vivo durch die Verwendung von Antisense-Technik. Antisense-Technik kann zur Steuerung der Genexpression über die Bildung einer Dreifachhelix oder Antisense-DNS oder -RNS verwendet werden, wobei beide dieser Verfahren auf der Bindung eines Polynukleotids an DNS oder RNS basieren. Beispielsweise wird der kodierende 5'-Teil der reifen Proteinsequenz, die für das erfindungsgemäße Protein kodiert, zur Konstruktion eines Antisense-RNS-Oligonukleotids mit einer Länge von 10 bis 40 Basenpaaren verwendet. Ein DNS-Oligonukleotid wird als Komplement zu einer Region des Gens, die an der Transkription beteiligt ist, konstruiert (Dreifachhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988) und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991), wodurch die Transkription und die Erzeugung von Akt-3 verhindert werden. Das Antisense-RNS-Oligonukleotid hybridisiert in vivo zu mRNS und blockiert die Translation eines mRNS-Moleküls zu Akt-3 (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1998)).
Als Alternative lässt sich das vorstehend beschriebene Oligonukleotid durch im Fachgebiet bekannte Verfahren derart in die Zelle einführen, dass die Antisense-RNS oder -DNS in vivo exprimiert werden kann, um die Erzeugung von Akt-3 auf die vorstehend beschriebene Weise zu hemmen.
Antisense-Konstrukte für Akt-3 können somit das Überleben von Zellen hemmen und weiteres Krebs- oder Tumorwachstum verhindern.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird auch eine transgene Zelle, ein transgenes Gewebe oder ein transgener Organismus umfassend ein Transgen, das ein erfindungsgemäßes humanes Akt-3-Protein exprimieren kann, bereitgestellt. Der Begriff "Transgen, das exprimieren kann", wie hierin verwendet, bedeutet eine geeignete Nukleinsäuresequenz, die zur Expression von humanem Akt-3 oder humanen Proteinen mit derselben Funktion und/oder Aktivität führt. Das Transgen kann beispielsweise aus humanen Zellen isolierte genome Nukleinsäure oder synthetische Nukleinsäure umfassen, einschließlich DNS, die in das Genom integriert wurde oder in extrachromosomalem Zustand vorliegt. Das Transgen umfasst vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz, die wie hierin beschrieben für die erfindungsgemäßen Proteine kodiert, oder ein funktionelles Fragment der Nukleinsäure. Ein funktionelles Fragment der Nukleinsäure ist so zu verstehen, dass es ein Fragment des Gens umfassend die Nukleinsäure ist, die für die erfindungsgemäßen Proteine oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat, oder ein nicht funktionelles Derivat, wie einen dominanten negativen Mutanten, oder einen Biovorläufer der Proteine kodiert. Beispielsweise ist es für Fachleute offensichtlich, dass Substitutionen oder Deletionen von Nukleotiden unter Verwendung von üblichen Techniken vorgenommen werden können, die keinen Einfluss auf die Proteinsequenz haben, die durch die Nukleinsäure kodiert wird, oder die für ein erfindungsgemäßes funktionelles Protein kodieren.
Humanes Akt-3-Protein, das durch die transgene Zelle, das transgene Gewebe oder den transgenen Organismus oder ein funktionelles Äquivalent oder eine Bio-Vorstufe des Proteins exprimiert wird, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Mithilfe von im Fachgebiet bekannten Techniken können vorteilhaft Antikörper für humanes Akt-3 hergestellt werden. Polyklonale Antikörper können beispielsweise durch Impfen eines Wirtstieres, wie einer Maus, mit erfindungsgemäßem humanem Akt-3 oder einem Epitop davon und Gewinnung des Immunserums hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können anhand bekannter Techniken, wie von Kohler R. und Milstein C., Nature (1975), 256, 495–497, beschrieben, hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Antikörper können auch bei einem Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von erfindungsgemäßem humanem Akt-3 verwendet werden, wobei das Verfahren die Reaktion des Antikörpers mit einer Probe und die Identifizierung jedes an den Antikörper gebundenen Proteins umfasst. Es kann auch ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens bereitgestellt werden, der einen erfindungsgemäßen Antikörper sowie Mittel für die Reaktion des Antikörpers mit der Probe umfasst.
Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid in Wechselwirkung treten, können beispielsweise durch Untersuchung der Protein-Protein-Wechselwirkung unter Verwendung des Zwei-Hybridvektor-Systems, das zuerst von Chien et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578–9582, vorgeschlagen wurde, identifiziert werden.
Diese Technik basiert auf einer funktionellen Wiederherstellung in vivo eines Transkriptionsfaktors, der ein Reporter-Gen aktiviert. Genauer gesagt umfasst die Technik das Bereitstellen einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNS-Konstrukt umfassend ein Reporter-Gen, das von einem Promotor gesteuert wird, welcher durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNS-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne reguliert wird, Exprimieren einer ersten Hybrid-DNS-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Fragments oder für die gesamte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz und entweder für die DNS-Bindungsdomäne oder die Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors kodiert, in der Wirtszelle, Exprimieren wenigstens einer zweiten Hybrid-DNS-Sequenz, wie einer Bibliothek oder dergleichen, die für mutmaßliche Bindungsproteine kodiert, die zusammen mit der DNS-Bindungsdomäne und der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors untersucht werden, welche nicht in der ersten Fusion enthalten sind, in der Wirtszelle, Nachweisen einer zu untersuchenden Bindung der Proteine mit einem erfindungsgemäßen Protein durch Nachweis der Gegenwart eines Reporter-Genprodukts in der Wirtszelle, wahlweise Isolieren zweiter Hybrid-DNS-Sequenzen, die für das Bindungsprotein kodieren.
Ein Beispiel für eine derartige Technik bedient sich des GAL4-Proteins von Hefe. GAL4 ist ein Transkriptionsaktivator des Galactose-Stoffwechsels in Hefe und weist eine separate Domäne zum Binden an Aktivatoren stromaufwärts der Gene für die Galactose-Verstoffwechselung sowie eine Proteinbindungsdomäne auf. Es können Nukleotidvektoren konstruiert werden, von denen einer die Nukleotidreste umfasst, die für die DNS-Bindungsdomäne von GAL4 kodieren. Diese Bindungsdomänenreste können zu einer bekannten für Proteine kodierenden Sequenz, wie beispielsweise die erfindungsgemäßen Nuk leinsäuren, fusioniert werden. Der andere Vektor umfasst die Reste, die für die Proteinbindungsdomäne von GAL4 kodieren. Diese Reste werden mit Resten fusioniert, die für ein Testprotein kodieren. Jegliche Wechselwirkung zwischen Polypeptiden, die für die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodieren und dem zu prüfenden Protein führt zur Transkriptionsaktivierung eines Reporter-Moleküls in einer Hefezelle ohne GAL-4-Transkription, in die die Vektoren transformiert wurden. Ein Reporter-Molekül, wie β-Galactosidase, wird vorzugsweise nach Wiederherstellung der Transkription der Hefegene für den Galactose-Stoffwechsel aktiviert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die eine durch humanes Akt-3 vermittelte Promotion des Überlebens von Zellen selektiv hemmen, wobei das Verfahren i) das Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der den Akt-3-Weg aktiviert, und die verglichen mit einer Kontrollzelle, die nicht mit dem Vektor transformiert wurde und in Abwesenheit des Überlebensfaktors stirbt, in Gegenwart oder Abwesenheit des Überlebensfaktors überlebt ii) Kontaktieren dieser Zellen nach dem Trennen der Zellen von den Überlebensfaktoren mit einer zu prüfenden Verbindung, wobei der Tod der transformierten Zelle ein Anzeichen für die selektive Hemmung der Verbindung im Rahmen des das Überleben fördernden humanen Akt-3-Wegs ist, umfasst.
Als Alternative kann die das Überleben fördernde Aktivität von Akt-3 durch i) Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der den Akt-3-Weg aktiviert, zusätzlich zu einer Kontrollzelle, die nicht mit dem Vektor transformiert wurde, ii) Kontaktieren jeder dieser Zellen mit einem den Tod verursachenden Mittel, wobei der Tod der Kontrollzelle und das Überleben der transformierten Zelle ein Anzeichen für die das Überleben fördernde Aktivität des aktivierten Akt-3-Wegs ist, iii) anschließendes Kontaktieren der transformierten Zelle ohne Entfernen des den Tod verursachenden Mittels mit einer zu prüfenden Verbindung, wobei der Tod der Zelle ein Anzeichen für die selektive Hemmung der Verbindung im Rahmen des das Überleben fördernden humanen Akt-3-Wegs ist, beurteilt werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Identifizierung von Mitteln bereitgestellt, die die Aktivität des humanen Akt-3-Proteins beeinflussen, umfassend das Kontaktieren des Proteins mit einem Substrat, Regulierungsmolekül oder Surrogat davon und Kontrolle der Wechselwirkung mit der Prüfsubstanz unter Verwendung von üblichen im Fachgebiet gut bekannten Phosphorylierungs- oder Bindungsversuchen.
Verbindungen, die zusätzlich zu den Antikörpern für humanes Akt-3 gemäß diesem Aspekt der Erfindung identifiziert wurden, können vorteilhaft als ein Arzneimittel oder alternativ bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die mit der Expression von erfindungsgemäßem humanem Akt-3-Protein verbunden sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, ein erfindungsgemäßes Antisense-Molekül oder einen erfindungsgemäßen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür.
Die Antisense-Moleküle oder tatsächlich die Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Polypeptide identifiziert sind, können in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die gemäß Verfahren hergestellt werden kann, die im Fachgebiet gut bekannt sind. Bevorzugte Zusammensetzung umfassen pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel, wie beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung. Es können auch weitere pharmazeutisch unbedenkliche Träger, einschließlich anderer nicht toxischer Salze, sterilen Wassers oder dergleichen, verwendet werden. Es kann ein geeigneter Puffer vorhanden sein, der ein Gefriertrocknen der Zusammensetzungen und deren Aufbewahrung unter sterilen Bedingungen vor der Wiederherstellung durch Zugabe von sterilem Wasser für die anschließende Verabreichung ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in eine feste oder halbfeste biologisch kompatible Matrix, die in behandlungsbedürftige Gewebe implantiert werden kann, eingearbeitet werden.
Der Träger kann auch weitere pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsmittel zur Modifizierung weiterer Bedingungen, wie pH-Wert, Osmolarität, Viskosität, Sterilität, Lipophilität, Löslichkeit oder dergleichen, enthalten.
Es können pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsmittel eingeschlossen werden, die eine langsame oder verzögerte Freisetzung nach der Verabreichung ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle oder Verbindungen können oral verabreicht werden. In dieser Ausführungsform können sie gekapselt und mit geeigneten Trägern in festen Dosierungsformen kombiniert werden, die Fachleuten gut bekannt sind.
Wie Fachleuten gut bekannt, kann die spezifische Dosis abhängig von dem jeweils verwendeten spezifischen Verabreichungsweg entsprechend der Körperoberfläche des Patienten oder des Volumens des einzunehmenden Körperraums ermittelt werden. Die tatsächlich verabreichte Menge der Zusammensetzung wird jedoch von einem Arzt auf der Grundlage der Umstände festgelegt, die mit der zu behandelnden Störung verbunden sind, wie der Schwere der Symptome, der zu verabreichenden Zusammensetzung, Alter, Gewicht und Reaktion des jeweiligen Patienten und des gewählten Verabreichungswegs.
Die vorliegende Erfindung ist unter Bezugnahme auf das nachfolgende Beispiel, das ausschließlich der Veranschaulichung dient, und den beiliegenden Zeichnungen besser verständlich, wobei:
1 eine Darstellung der cDNS-Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von humanem Akt-3 ist. Die für Akt-3 kodierende Sequenz und Teile der nicht translatierten 5'- und 3'-Region sind in der linken Spalte dargestellt und nummeriert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Akt-3-Proteins ist oberhalb der entsprechenden DNS-Sequenz dargestellt und in der rechten Spalte nummeriert. Die beiden Aminosäurereste, die vermutlich nach Aktivierung von Akt-3 (Thr³⁰⁵ und Ser⁴⁷²) phosphoryliert sind, sind fett gedruckt und mit einem Stern gekennzeichnet. Der COOH-terminale Schweif des humanen Akt-3-Proteins, der sich von dem Ratten-Homologen unterscheidet, ist unterstrichen.
2 ein Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für humanes Akt-1, Akt-2 und Akt-3 ist. Die Sequenzen wurden mithilfe des Alignment-Programms ClustalW (EMBL, Heidelberg, Deutschland) angeglichen. Die bei allen drei Proteinen konservierten Aminosäurenreste befinden sich in den schwarzen Bereichen. Reste, die nur in zwei der Sequenzen konserviert sind, sind grau unterlegt. Aminosäurereste sind in der rechten Spalte nummeriert. Der konservierte Thr- und Ser-Rest, die beide vermutlich nach der Aktivierung phosphoryliert sind, sind mit einem Stern oberhalb der Sequenz gekennzeichnet.
3 eine Veranschaulichung der Phosphorylierung von Histon-H2B durch Akt-3-Varianten ist. (A) Akt-3 wurde als ein GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Zur Beurteilung der hAkt-3-Aktivität wurde Histon-H2B für die angegebene Dauer mit GST-Akt-3 und GST-Akt-3-Varianten inkubiert und das Ausmaß der Phosphorylierung nach SDS-PAGE beurteilt. Die Varianten von Akt-3 waren: W. T., Wildtyp; T305D, Thr³⁰⁵ mutiert zu Asp; S472D, Ser⁴⁷² mutiert zu Asp; T305D, S472D, sowohl Thr³⁰⁵ als auch Ser⁴⁷² mutiert zu Asp. Bei der Verwendung von GST anstatt GST-Akt wurde keine signifikante Phosphorylierung beobachtet. Die Ergebnisse sind Bemittelt (± Standardfehler des Mittelwerts; n = 3 bis 6) und im Verhältnis zum Ausmaß der Phosphorylierung von H2B, die durch T305D, S472D hAkt-3 katalysiert wurde, nach 45 Minuten ausgedrückt. Insert. Die Reinheit von gereinigtem GST (Spur 1), Wildtyp Akt-3 (Spur 2), T305D Akt-3 (Spur 3), S472D Akt-3 (Spur 4) oder T305D/S472D Akt-3 (Spur 5) wurde mittels SDS-PAGE und mittels Coomassie-Blau-Färbung beurteilt. (B) HEK-293-Zellen wurden mit entweder dem Vektor (Spur 1 & 2) oder Akt-3 (Spur 3 und 4), Akt-3 T305A (Spur 5 & 6) oder Akt-3 S472A (Spur 7 und 8) transfektiert und entweder mit Puffer (Spur 1, 3, 5 und 7) oder IGF-1 (50 ng/ml; Spur 2, 4, 6 und 8) behandelt. Akt-3 wurde mit dem Antikörper 3F10 (Anti-HA-Tag) einer Immunpräzipitation unterworfen. Die Proben wurden durch Blotten auf das HA-Tag (oberer Bereich) oder mit einem phosphospezifischen Antikörper, der phosphoryliertes Ser⁴⁷² erkennt, (unterer Bereich) analysiert. (C) Akt-Aktivität in HA-Immunpräzipitaten von Proben, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, wurden durch Bestimmung der Phosphorylierung eines Peptidsubstrats beurteilt (Crosstide). Die Ergebnisse sind als Anstieg der Aktivität im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen, die mit einem leeren Vektor transfektiert wurden, (Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 7) ausgedrückt.
4 eine Veranschaulichung der Hemmung von Akt-3 durch Staurosporin und RO 31-8220 ist. Histon-H2B wurde mit Akt-3 (T305D, S472D-Variante) in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von entweder Staurosporin oder RO 31-8220 behandelt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion beendet und das Ausmaß der H2B-Phosphorylierung nach SDS-PAGE mit einem Phosphorimager quantifiziert. Die Ergebnisse (Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts, n = 3) sind im Verhältnis (%) zur Phosphorylierung, die in Gegenwart des Lösungsmittels (Kontrolle, "C") stattfand, ausgedrückt.
5 eine Veranschaulichung der Chromosomenlokalisation von humanem Akt-3 ist. (A) Diagramm der Ergebnisse einer FISH-Kartierung von Akt-3. Jeder Punkt stellt die FISH-Doppelsignale dar, die auf einem Humanchromosom 1, Region q43–q44 nachgewiesen wurden. (B) Beispiel einer FISH-Kartierung von Akt-3. Der linke Bereich zeigt die FISH-Signale für Chromosom 1. Der rechte Bereich zeigt dieselbe Mitose, die zur Identifizierung von Chromosom 1 mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol gefärbt wurde.
6 eine Veranschaulichung der Expression von Akt-3 in verschiedenen menschlichen Geweben ist. (A) Northern-Blot-Analyse der Gewebeexpression von Akt-3. Die Expression von hAkt-3-mRNS in verschiedenen menschlichen Geweben wurde mit einer Sonde beurteilt, die der nicht translatierten 3'-Region von hAkt-3 entsprach, um einen Blot von humaner polyA⁺ RNS ("Mehrfach-Gewebe-Northern") zu analysieren. Zur Bestätigung gleicher Belegung der Spuren wurde humanes β-Actin als Kontrolle verwendet (Daten nicht vorgelegt). (B) und (C) RT-PCR-Analyse der Gewebeexpression von Akt-3. RT-PCR-Analysen wurden mit cDNS aus verschiedenen menschlichen Geweben (B) und verschiedenen Tumorzelllinien (C) unter Verwendung von Primern, die für humanes Akt-3 oder G3PDH (Kontrolle) spezifisch sind, über die angegebene Anzahl an PCR-Zyklen durchgeführt. Auf den Gelen sind Bänder mit der erwarteten Größe (425 bp bei Akt-3 und 1 kb bei G3PDH) sichtbar. Die Abbildungen der mit Ethidiumbromid gefärbten 1,2% Agarose-Gele wurden zur Verdeutlichung mithilfe der Software EagleSight (Stratagene) invertiert. Die Ergebnisse ähnlicher PCR-Reaktionen, die über 25, 30 oder 35 Zyklen durchgeführt wurden, sind nicht dargestellt, zeigen aber, dass die Ergebnisse dieser Figur im linearen Verstärkungsbereich liegen. Caco-2 = kolorektales Adenokarzinom; T84 = kolorektales Karzinom; MCF-7 = Mammaadenokarzinom; T-47D = duktales Mammakarzinom; HT1080 = Knochenfibrosarkom; SaOS-2 = Osteosarkom; SK-N-MC = Neuroblastom; HepG2 = Hepatoblastom; JURKAT = T-Zellen-Leukämie.
7 eine Darstellung der Ergebnisse ist, die mittels Szintillationszählung in einem Scintillation Proximity Assay zur Identifizierung von Mitteln, die die Aktivität der Akt-3-Aktivität modulieren, erhalten wurden.
8 eine Darstellung der Ergebnisse ist, die in einem Akt-3-Filter-Assay zur Identifizierung von Mitteln, die die Aktivität der Akt-3 modulieren, erhalten wurden.
MATERIALIEN UND METHODEN
Oligonukleotidsynthese und DNS-Sequenzbestimmung
Alle Primer wurden von Eurogentec, Seraing, Belgien, erworben. Insertspezifische Sequenz-Primer (15- und 16-mere) wurden durch visuelle Inspektion der DNS-Sequenzen konstruiert. DNS wurden auf Qiagen-tip-20-Säulen oder auf Qiaquick-Spin-Säulen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) hergestellt und aus den Spin-Säulen in 30 μl Tris/EDTA-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA (Natriumsalz)) gewonnen. Sequenzreaktionen wurden unter Verwendung des Kits BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA) durchgeführt und auf einem DNS-Sequenzer Applied Biosystems 377 (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA) untersucht.
Molekulares Klonen von humanem Akt-3.
Unter Verwendung der RAC-PKγ-Rattensequenz (Konishi et al., 1995; GenBank Kontonr. D49836) als Abfragesequenz wurde eine BLAST-Suche (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990) in der WashU Merck Expressed Sequence Tag (EST) (Lennon et al., 1996) und in der geschützten Datenbank LifeSeq^TM Human EST (Incyte Pharmaceuticals Inc, Palo Alto, CA, USA) durchgeführt. Es wurden mehrere humane EST-Klone mit hoher Ähnlichkeit zu Ratten-RAC-PKγ identifiziert. Eine EST-Sequenz (Incyte Zugriffsnummer 2573448), die von einer Hippocampus-cDNS-Bibliothek abgeleitet war, enthielt einen Teil der kodierenden Sequenz, einschließlich des mutmaßlichen Methionin-Startcodons (ATG) und einen Teil der nicht translatierten 5'-Region. Das Startcodon war von einer Kozak-Konsensus-Sequenz für den Startpunkt der Translation umgeben und an den Positionen -6 bis -3 war ein in-frame-Stoppcodon vorhanden: Auf der Grundlage dieser Sequenz mit 239 bp wurden Oligonukleotid-Sense-Primers für Versuche zur schnellen 3'-Amplifikation von cDNS-Enden (3' RACE) synthetisiert: Akt-3sp1 = 5'-ACC ATT TCT CCA AGT TGG GGG CTC AG-3' und Akt-3sp2 = 5'GGG AGT CAT CAT GAG CGA TGT TAC C-3'. 3'-RACE-Versuche wurden mit humaner cDNS Marathon-Ready^TM aus Gehirnen von Föten oder Kleinhirnen (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Akt-3sp1/race-ap1 als Primer der primären PCR und Akt-3sp2/race-ap2 in der ineinandergeschachtelten PCR durchgeführt. Die gebildeten PCR-Fragmente wurden geklont und sequenziert. Dabei wurde die für Akt-3 kodierende Sequenz um 916 bp verlängert, die neue Sequenz umfasste jedoch kein in-frame-Stoppcodon. Ein zweiter Durchgang einer 3'-RACE-Amplifikation wurde mit humaner cDNS Marathon Ready^TM aus Gehirnen unter Verwendung von Sense-Primern auf der Grundlage der im ersten Durchgang erhaltenen Sequenz (Akt-3sp3 = 5'CAC TCC AGA ATA TCT GGC ACC AGA GG-3' und Akt-3sp4 = 5'CTA TGG CCG AGC AGT AGA CTG GTG G-3') in Kombination mit race-ap1 bzw. race-ap2 durchgeführt. Die erhaltene Sequenz umfasste ein in-frame-Stoppcodon und die nicht translatierte 3'-Sequenz bis zum Poly(A)-Schweif. Auf der Grundlage der nicht translatierten 3'-Region (Akt-3ap4 = 5'-TGC CCC TGC TAT GTG TAA GAG CTA GG-3' und Akt-3ap5 = 5'AAG AGC TAG GAC TGG TGA TGT CCA GG-3') wurden Antisense-Primer konstruiert und die gesamte für Akt-3 kodierende Sequenz wurde unter Verwendung von Akt-3sp1/Akt-3ap4 (primäre PCR) und Akt-3sp2/Akt-3ap5 (ineinandergeschachtelte PCR) als Primer mit humaner Hippocampus-cDNS vervielfältigt. Das gebildete PCR-Fragment mit 1200 bp wurde anschließend im TA-Klonvektor pCR2.1 (Original-TA-Klonkit, Invitrogen BV, Leek, Niederlande) geklont und die Inserts verschiedener Klone wurden vollständig sequenziert. Ein Klon, der ein Insert mit der bestätigten Sequenz (hAkt-3/pCR2.1) enthielt, wurde für das anschließende Subklonen im Säugetier-Expressionsvektor pcDNS-3 (Invitrogen) verwendet, was das Konstrukt hAkt-3/pcDNS-3 ergab. Zur Herstellung eines Konstrukts, das für ein COOH-terminales markiertes Akt-3-Protein kodiert, wurde ein Fragment mit 553 bp mit dem Plasmid Akt-3/pcDNS-3 unter Verwendung eines Antisense-Primers vervielfältigt, der eine XhoI-Restriktionsstelle und die Sequenz enthält, die nach Aminosäure 479 der Akt-3-Sequenz für einen Hämagglutinin-Marker (HA) (YPYDVPDYA) kodiert. Dieses Fragment wurde unter Verwendung der BstEII- und der XhoI-Restriktionsstelle erneut in das Plasmid hAkt-3/pcDNS-3 geklont, was das Konstrukt HA-hAkt-3/pcDNS-3 ergab.
Konstrukte und Mutanten für die E.-coli-Expression von Akt-3.
Zur Expression von humanem Akt-3-Protein in E. coli wurde die gesamte für Akt-3 kodierende Sequenz unter Verwendung von Primern, die eine EcoRI-Restriktionsstelle und eine XhoI-Restriktionsstelle am 5'- bzw. 3'-Ende einführen, mit dem Plasmid hAkt-3/pCR2.1 verviel fältigt. Dieses PCR-Fragment wurde als EcoRI/XhoI-Fragment im Vektor pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) geklont, was das Konstrukt hAKT-3 (WT)/pGEX-4T-3 ergab, und die Sequenz des Inserts wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
Mutanten dieses Konstrukts wurden unter Verwendung des Kits für ortsgerichtete Mutagenese Quickchange (Stratagene, La Jolla, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Der T305D-Mutant (Konstrukt hAKT-3(T305D)/pGEX-4T-3) wurde durch Mutieren von ACA in Position 923–925 zu GAC geschaffen, was zu einer Mutation von Thr³⁰⁵ zu Asp in dem gebildeten Protein führte. Der S472D-Mutant (Konstrukt hAKT-3(S472D)/pGEX-4T-3) wurde durch Verändern von TC in Position 1404–1405 zu GA unter Verwendung von PCR mit einem langen Antisense-Primer, der die Veränderung enthielt, geschaffen, was zu einer Mutation von Ser⁴⁷² zu Asp in dem gebildeten Protein führte. Außerdem wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese an hAKT-3(S472D)/pGEX-4T-3 ein Doppelmutant konstruiert, der beide Mutationen (Konstrukt hAKT-3(T305D/S472D)/pGEX-4T-3) enthielt. Die Inserts aller gebildeten Konstrukte wurden durch vollständige Sequenzanalyse bestätigt. Die Fusionsproteine, die durch die Expression dieser Konstrukte in E. coli gebildet wurden, enthielten eine GST-Einheit, die mit dem NH₂-Ende der humanen Akt-3-Sequenz gekoppelt war.
Expression in Cos-7-Zellen und HEK-293-Zellen
Akt-3 wurde durch Calciumphosphat-Transfektion der Zellen mit dem Konstrukt HA-hAkt-3/pcDNS-3 transient in Cos-7 exprimiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit 10 ng/ml IGF-1 stimuliert, lysiert und Akt-3 mit mAb 12CA5 einer Immunpräzipitation unterworfen. Die Akt-3-Aktivität wurde wie nachstehend beschrieben beurteilt.
Zur Expression in HEK-293-Zellen wurden Zellen mit pcDNS-3-Akt-3-Konstrukten wie vorstehend beschrieben transfektiert (Alessi et al., 1996). Nach Stimulieren mit IGF wurden die Zellen lysiert (Alessi et al., 1996) und mit Antikörper 3F10 (Roche Molecular Biochemicals) HA-Akt-immunpräzipitiert. Akt-Aktivität wurde durch Bestimmung der Phosphorylierung eines Peptidsubstrats (Crosstide) in Gegenwart von 1 μM PKI (PKA-Hemmer) und 1 μM GF 109302X (PKC-Hemmer) wie beschrieben in Immunkomplexen beurteilt.
Expression und Assay von Wildtyp- und mutantem Akt-3 in E. coli.
Die pGEX-Expressionskonstrukte wurden in den E. coli-Stamm BL21 DE3 transformiert und GST-Fusionsproteine von Wildtyp- und mutiertem Akt-3 wurden auf Glutathion-Sepharose gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gereinigt. Das aus den Kügelchen eluierte Protein wurde in 50%igem Glycerol bei –20°C aufbewahrt. Akt-Aktivität wurde durch 30 Minuten langes Inkubieren von 0,8 μg des gereinigten Enzyms bei Raumtemperatur (soweit nicht anders angegeben) in einem Puffer, der 10 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml Histon-H2B mit einem pH-Wert von 7,0 enthielt, mit einem Gesamtvolumen von 25 μl und enthaltend 10 μCi [γ-³²P]-ATP (6000 Ci/mmol) beurteilt. Die ersten Versuche zeigten an, dass die Reaktion wenigstens 45 Minuten lang zeitlich linear verlief. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl Probenpuffer für SDS-PAGE beendet. Die Ergebnisse wurden nach SDS-PAGE auf 15 Gew./Vol.-% Acrylamidgel in einem Phosphorimager quantifiziert.
Untersuchungen zur Chromosomenkartierung
Untersuchungen zur Chromosomenkartierung wurden von SeeDNA Biotech Inc, Toronto, Kanada, unter Verwendung einer fluoreszierenden In-situ-Hybridisierungsanalyse (FISH) im Wesentlichen wie beschrieben (Heng et al., 1992; Heng & Tsui, 1993) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden humane Lymphozyten 68–72 h lang bei 37°C gezüchtet, ehe sie mit 0,18 mg/ml 5-Brom-2'-deoxyuridin (BrdU) zur Synchronisierung der Zellzyklen der Zellpopulation behandelt wurden. Die synchronisierten Zellen wurden gewaschen und 6 h lang bei 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und es wurden unter Verwendung von üblichen Verfahren, wie hypotoner Behandlung, Fixieren und Lufttrocknen, Träger hergestellt. Eine cDNS-Sonde für Akt-3 (1,44 kb EcoRI-Fragment des Klons hAkt-3/pcDNS-3) wurde biotiniliert und zum FISH-Nachweis verwendet. Die Träger wurden 1 h lang bei 55 PC gebacken, mit Arase behandelt und 2 min lang bei 70°C in 70 Vol.-% Formamid in 2 × NaCl/Cit (0,3 M NaCl, 0,03 M Dinatriumcitrat, pH 7,0) mit anschließender Entwässerung in Ethanol denaturiert. Die Sonden wurden vor dem Aufbringen auf die Träger mit denaturiertem Chromosom denaturiert. Nach Hybridisierung über Nacht wurden die Träger gewaschen und die FISH-Signale und die 4,6-Diamidion-2-phenylindol-Bandmuster getrennt auf fotografischen Filmen aufgezeichnet und die Zuweisung der FISH-Kartierungsdaten und Chromosomenbänder wurde durch Überlagern von FISH-Signalen und Chromosomen-Bänderung mit 4,6-Diamidin-2-phenylindol erreicht (Heng & Tsui, 1993).
Northern-Blot-Analyse.
Northern Blots mit 2 μg Poly(A)-reicher RNS, die von verschiedenen menschlichen Geweben stammte (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA), wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem NotI-XbaI-Akt-3-Fragment mit 454 bp (Nukleotide 1404 bis 1857), das mittels "Random Priming" (HighPrime-Kit, Boehringer Mannheim) mit ³²P-dCTP markiert war und einem Teil der nicht translatierten 3'-Sequenz entsprach, hybridisiert.
Analyse mittels reverser Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Für die spezifische PCR-Amplifikation eines Fragments von Akt-3 wurden Oligonukleotidprimer konstruiert. Bei diesen Primern handelte es sich um Akt-3sp2 = 5'-GGG AGT CAT CAT GAG CGA TGT TAC C-3' (Sense-Primer) und Akt-3ap1 = 5'-GGG TTG TAG AGG CAT CCA TCT CTT CC-3' (Antisense-Primer), was ein Produkt mit 425 bp ergab. Unter Verwendung der G3PDH-Primer 5'-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3' (Sense-Primer) und 5'-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-3' (Antisense-Primer) wurden PCR-Amplifikationen für humane Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) mit denselben cDNS-Proben als positive Kontrollen durchgeführt, was ein Fragment mit 1000 bp ergab. Diese Primer wurden für PCR-Amplifikationen mit Multiple Tissue cDNS Panels (Clontech Laboratories) und mit cDNS, die aus Tumorzelllinien hergestellt worden war, verwendet. Zur Herstellung der Tumorzellen-cDNS wurden Zellen homogenisiert und unter Verwendung des Kits RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers total RNS hergestellt. 1 μg total RNS wurde unter Verwendung von Oligo(dT)₁₅ als ein Primer und 50 U Expand^TM Reverse Transcriptase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland ) gemäß den Anweisungen des Herstellers reverse transkribiert. Anschließend wurden mit 1 μl cDNS PCR-Reaktionen mit Akt-3-spezifischen oder G3PDH-spezifischen Primern durchgeführt. Abbildungen der mit Ethidiumbromid gefärbten Gele wurden mithilfe des Videosystems Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, USA) erhalten und die PCR-Bänder mit der Software EagleSight analysiert.
Assays zur Identifizierung von Mitteln zur Modulation der Akt-3-Aktivität
Zur Identifizierung von Mitteln zur Modulation der Akt-3-Aktivität wurden SPA (Scintillation Proximity Assay) und Filter-Assays für Akt-3-Aktivität entwickelt.
SPA wurden 3 h lang bei 25 SC in Gegenwart von 25 mM Hepes, pH 7,0, mit 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT durchgeführt. Jedes Assay wurde in einem Reaktionsvolumen von 100 μl mit 111 nM GST-AKT-3 (verdünnt in 25 mM Hepes, pH 7,0, mit 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT), 0,75 μM biotiniliertem Histon-H2B, 2 nM [γ-³³P]-ATP und jedem zu prüfenden Mittel durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl Stop-Mix (50 μM ATP, 5 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 und 7,5 mg/ml mit Streptavidin beschichtete PVT-SPA-Kügelchen) beendet. Nach 30 Minuten langem Stehenlassen zum Absetzen der Kügelchen wurde die Assay-Mischung in einem Szintillationszähler für Mikrotiterplatten ausgezählt. Die Ergebnisse gehen aus 7 hervor.
AKT3-Filterassays wurden 3 h lang bei 25°C in Gegenwart von 25 mM Hepes, pH 7,0, mit 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT durchgeführt. Jedes Assay wurde in einem Reaktionsvolumen von 100 μl mit 111 nM GST-AKT-3 (verdünnt in 25 mM Hepes, pH 7,0, mit 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT), 2,5 μM Histon-H2B, 2 nM [γ-³³P]-ATP und jedem zu prüfenden Mittel durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl 75 mM H₃PO₄ beendet. 90 μl der Assay-Mischung wurden durch Phosphocellulose-Kationenaustauscherpapier filtriert. Nach fünfmaligem Waschen mit 75 μM H₃PO₄ wurde das Filterpapier in einem Szintillationszähler für Mikrotiterplatten ausgezählt. Die Ergebnisse gehen aus 8 hervor.
ERGEBNISSE
Molekulares Klonen von humanem Akt-3.
Mit der Ähnlichkeitssuche in den Datenbanken LifeSeq^TM und EMBL in Form einer Abfragesuche unter Verwendung der Akt-3-Rattensequenz wurden mehrere humane EST-Sequenzen gefunden, die für einen Teil des humanen Homologen des Ratten-Akt-3 kodieren. Mithilfe der DNS-Sequenzinformationen in den Datenbanken konnten wir in anschließenden 3'-RACE-Versuchen die vollständige cDNS-Sequenz von humanem Akt-3 ableiten (1). Die erhaltene cDNS-Sequenz kodierte für ein Protein mit 479 Aminosäureresten und einer rechnerischen Molekülmasse von 55770 Da. Die ersten 451 Aminosäuren des humanen Akt-3-Proteins enthalten nur zwei Unterschiede im Vergleich zur entsprechenden Rattensequenz (Konishi et al., 1995) – Asp (Ratte) anstatt Gly (human) in Position 10 und Pro (Ratte) anstatt Ala (human) in Position 396 und kodieren für eine Pleckstrin-Homologie-Domäne, eine Kinasedomäne und einen COOH-terminalen "Schweif". Das vorhergesagte Akt-3-Protein (2) zeigt wesentliche Ähnlichkeit mit Akt-1 (Jones et al., 1991; 83,6% Identität; 87,8% Ähnlichkeit) und mit Akt-2 (Cheng et al., 1992; 78% Identität; 84,3% Ähnlichkeit). Der COOH-terminale "Schweif" wurde in Akt-1- und Akt-2-Proteinen von sowohl Mensch als auch Ratte beobachtet, ist aber offenbar in der einzigen anderen veröffentlichten Akt-3-Sequenz (Ratten-Akt-3, Konishi et al., 1995; Zugriffsnummer D49836) verkürzt. 3'-RACE-Versuche mit humanen cDNS, die von verschiedenen Geweben stammten, ergaben keinen Nachweis für das Vorhandensein einer kürzeren Form von Akt-3, die mit Ratten-Akt-3 analog wäre (Daten nicht vorgelegt). Der Schweif von humanem Akt-3 umfasst 28 Aminosäurereste (YDEDGMDCMDNERRPHFPQFSYSASGRE), die 3 Aminosäurereste der Rattensequenz ersetzen (CPL). Der Schweif in humanem Akt-3 enthält einen Serinrest in Position 472 (fett gedruckt), der Ser⁴⁷³ in Akt-1 oder Ser⁴⁷⁴ in Akt-2 ent spricht. Eine Phosphorylierung von Ser⁴⁷³ und Ser⁴⁷⁴ wurde bereits mit der Aktivierung von Akt-1 bzw. Akt-2 in Verbindung gebracht (Alessi et al., 1996; Meier et al., 1997). Thr³⁰⁸ (in der Kinasedomäne) wurde ebenfalls mit der Aktivierung von Akt-1 in Verbindung gebracht und dieser Rest ist ebenfalls in humanem Akt-3 konserviert (Thr³⁰⁵).
Charakterisierung der Akt-3-Aktivität.
Zur Charakterisierung der Enzymaktivität von Akt-3 exprimierten und reinigten wir das rekombinante Enzym als ein GST-Fusionsprotein. Die Analyse des gereinigten Produkts mittels SDS-PAGE zeigte eine Reinheit des Proteins von > 90%. Das gereinigte Enzym konnte Histon-H2B (3) phosphorylieren und unter Verwendung von rekombinantem GST alleine konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. Zuvor wurde gezeigt, dass die Enzymaktivität von Akt-1 durch Phosphorylierung von Thr³⁰⁸ und Ser⁴⁷³ erhöht werden konnte und die Mutation beider Reste zu Asp (zur Nachahmung der Phosphorylierung) aktiviert Akt-1 synergistisch (Alessi et al., 1996). Zur Untersuchung, ob Akt-3 ähnlich reguliert ist, wurden GST-Fusionsproteine, in denen entweder Thr³⁰⁵ oder Ser⁴⁷² (entsprechend Thr³⁰⁸ und Ser⁴⁷³ in Akt-1) oder sowohl Thr³⁰⁵ als auch Ser⁴⁷² zu Asp mutiert worden waren, exprimiert und mit dem Wildtyp-Enzym in Versuchen verglichen. Die Mutation von Thr³⁰⁵ zu Asp ("T305D") führte zu einem 2,0fachen Anstieg der anfänglichen Phosphorylierungsrate von Histon-H2B, wohingegen die Mutation von Ser⁴⁷² zu Asp ("S472D") die anfängliche Rate nur um das 1,4fache erhöhte (3A). Wenn sowohl Thr³⁰⁵ als auch Ser⁴⁷² ("T305D, S472D") zu Asp mutiert wurden, wurde ein 3,2facher Anstieg der anfänglichen Phosphorylierungsrate beobachtet.
Zur Bestätigung, dass extrazelluläre Stimulanzien Akt-3 in Säugetierzellen aktivieren können, wurden Cos-7-Zellen mit einer cDNS transfektiert, die für mit einem HA- Marker verschmolzenes Akt-3 kodiert. Akt-3-Aktivität in HA-Immunpräzipitaten war nach der Stimulierung mit IGF-1 (10 ng/ml) um das 1,5- und 1,9fache (n = 2) höher.
Zur weiteren Bestätigung, dass extrazelluläre Stimulanzien Akt-3 in Säugetierzellen aktivieren können, wurden HEK-293-Zellen mit einer cDNS transfektiert, die für mit einem HA-Epitop-Marker verschmolzenes Akt-3 kodiert. Nach der Behandlung mit IGF war die Akt-3-Aktivität in Anti-HA-Immunpräzipitaten (3B) um beinahe das 60fache höher als in den nicht transfektierten Zellen (3C). Akt-Varianten, in denen Thr³⁰⁵ und Ser⁴⁷² zu Alanin mutiert waren, zeigten sich der Aktivierung durch IGF gegenüber beständig. Dem entspricht auch, dass Western Blotting mit einem Ser⁴⁷² phosphospezifischen Antikörper für HA-Immunopräzipitate aus mit IGF stimulierten Zellen zeigt, dass Ser⁴⁷² nach Stimulierung mit IGF phosphoryliert wurde (3B). Weiterhin war die Aktivierung von Akt-3 durch zuvorige Behandlung mit CY29 4002 (100 μM, 94% Hemmung) gehemmt (Daten nicht vorgelegt).
Zur weiteren Charakterisierung von humanem Akt-3 haben wir die Fähigkeit einer Reihe von Ser/Thr-Kinasehemmern zur Hemmung von Akt-3 untersucht. Dazu gehörten Go 6976, GF-109203X (beides Proteinkinase-C-Hemmer (PKC) ); H-85, H-88, H-89 und KT5720 (Proteinkinase-A-Hemmer (PKA)), KN-62 (Ca⁺²/Calmodulin-abhängiger Kinasehemmer) und PD 98059 (MEK-Hemmer). Bei der Prüfung mit einer Konzentration von 10 μM hatten diese Verbindungen keinen wesentlichen Einfluss auf die Aktivität der T305D, S472D-Variante von Akt-3. Der Breitspektrum-Kinasehemmer Staurosporin (IC₅₀ = 2,0 ± 0,3 μM) und der PKC-Hemmer Ro 31-8220 (IC₅₀ = 3,2 ± 1,0 μM) hemmen jedoch die T305D, S472D-Variante von Akt-3 (4).
Chromosomenlokalisation von Akt-3.
Die vollständige kodierende Sequenz für Akt-3 wurde als Sonde für die FISH-Analyse verwendet. Unter den verwendeten Bedingungen betrug die Hybridisierungswirksamkeit für diese Sonde (bei 100 geprüften Mitosen, von denen 75 Signale an einem Paar der Chromosomen zeigten) ungefähr 75%. Da zur Identifizierung des spezifischen Chromosoms die DAPI-Bänderung verwendet wurde, wurde die Zuweisung des Signals der Sonde zum langen Arm von Chromosom 1 erreicht. Die genaue Position wurde in dem Diagramm auf der Grundlage der Zusammenfassung von 10 Fotografien weiter bestimmt (5A). Durch den FISH-Nachweis wurde unter den verwendeten Bedingungen kein weiterer Locus gefunden, woraus geschlossen wurde, dass sich Akt-3 auf dem humanen Chromosom 1, Region q43–q44 befindet. Ein Beispiel der Kartierungsergebnisse geht aus 5B hervor.
Gewebeverteilung für Akt-3 mRNS.
Mit mRNS, die von verschiedenen humanen Geweben stammte, wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt. Akt-3 mRNS wurde in Form von zwei Transkripten mit ungefähr 4,5 kb und 7,5 kb gefunden, was ein ähnliches Expressionsmuster zeigt (6A). Akt-3 mRN5 wurde in einer Reihe von Geweben, insbesondere Gehirn, exprimiert. Ähnlich wurde Ratten-Akt-3 in Form von multiplen Transkripten nachgewiesen, die am meisten im Gehirn exprimiert waren (Konishi et al., 1995). Die geringste Expression von Akt-3 wurde in zwei auf Insulin reagierenden Geweben, Skelettmuskeln und Leber, beobachtet. Akt-3 wurde auch in einer Anzahl von Krebszelllinien, einschließlich SW480 kolorektalen Adenokarzinoms, A549 Lungenkarzinoms und G361 Melanoms, exprimiert (Daten nicht vorgelegt).
Zur Bestätigung der Northern-Blot-Analyse wurden PCR-Reaktionen mit Akt-3-spezifischen und G3PDH-spezifi schen (interne Kontrolle) Primern mit cDNS, die von verschiedenen humanen Geweben stammten, durchgeführt (6B). Die Akt-3-Nachricht war in jedem geprüften Gewebe vorhanden, da in jeder cDNS ein spezifisches Fragment mit 425 bp nach 30 Zyklen PCR vervielfältigt wurde. In der Plazenta, den Eierstöcken und der Milz war die Expression von Akt-3 mRNS hoch. Im Gehirn, dem Herzen, den Nieren, dem Kolon, der Prostata, dem Dünndarm und den Hoden wurde eine moderate Expression beobachtet. In der Leber, der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, den Skelettmuskeln, den peripheren Blutleukozyten und der Thymusdrüse war die Expression am geringsten. In den Tumorzelllinien (6C) war die Expression von Akt-3 mRNS in HT1080 Knochenfibrosarkomzellen, in SaOS-2-Osteosarkom- und in JURKAT T-Zellen-Leukämiezellen relativ hoch (das Akt-3-Band konnte nach 30 Zyklen PCR nachgewiesen werden). Zellen des Caco-2 kolorektalen Adenokarzinoms, T84 des kolorektalen Karzinoms, des MCF-7 Mammaadenokarzinoms und des SK-N-MC Neuroblastoms zeigten eine Expression von Akt-3 mRNS nach 35 Zyklen PCR. Bei T-47D duktalem Mammakarzinom und HepG2 Hepatoblastom war die Expression von Akt-3 mRNS sehr gering oder nicht vorhanden (kein nachweisbares Signal nach 35 Zyklen PCR).
Akt-1 und Akt-2 wurden in mehreren Spezies identifiziert. Humane (Jones et al., 1991; Coffer et al., 1991), murine (Bellacosa et al., 1993) und bovine (Coffer & Woodgett, 1991) Akt-1-Klone sind veröffentlicht, wohingegen humane (Cheng et al., 1992), murine (Altomare et al., 1995) und Ratten-Klone (Konishi et al., 1994) von Akt-2 identifiziert wurden. Akt-3 wurde bisher jedoch nur in der Ratte identifiziert (Konishi et al., 1995). Die Erfinder haben eine humane Isoform von Akt-3 identifiziert. Humanes Akt-3 zeigt zwar erhebliche Ähnlichkeit mit humanem Akt-1 und Akt-2, die Entdeckung von humanem Akt-3 ist jedoch besonders wichtig, da die cDNS-Sequenz für einen COOH-terminalen "Schweif" kodiert, der eine Phosphorylierungsstelle enthält, welche an der Aktivierung von Akt-1 und Akt-2 beteiligt ist (Alessi et al., 1996; Meier et al., 1997). Dieser Schweif fehlt in der vorhergesagten Aminosäuresequenz der Ratte. Humanes Akt-3 wird offenbar auf ähnliche Weise wie Akt-1 und Akt-2 durch Phosphorylierung aktiviert. Sein Expressionsprofil lässt jedoch darauf schließen, dass die Hauptfunktion dieses Enzyms nicht die Regulierung von Reaktionen auf Insulin ist.
Die identifizierte Sequenz stellt das humane Homolog von Akt-3 dar. Diese Zuweisung basiert auf der Identität von > 99% zwischen den Akt-3-Proteinsequenzen von Ratte und Mensch. Mit Ausnahme des COOH-terminalen Schweifs, der in humanem Akt-3 beobachtet wird, beträgt der Unterschied zwischen Akt-3-Protein von Ratte und Mensch nur 2 Aminosäuren (Gly¹⁰ und Ala³⁹⁶ in humanem Akt-3). Ein Alignment aller bereits beschriebenen Akt-Sequenzen zeigt, dass Gly¹⁰ und Ala³⁹⁶ in humanem Proteins dem Gly- bzw. Ala-Rest der Akt-1- und Akt-Sequenzen entsprechen, die bei anderen Spezies identifiziert wurden. Ein weiterer Beweis dafür, dass wir die Akt-3-Isoform identifiziert haben, ist die Gegenwart von isotypspezifischen Sequenzen, die durch die humanen Akt-3-Reste 47–49 (LPY), 118–122 (NCSPT) und 139–141 (HHK) dargestellt sind. Diese Sequenzen werden bei jedem Isotyp speziesübergreifend konserviert, unterscheiden sich aber von Isotyp zu Isotyp.
Es wurde vorhergesagt, dass die humane Akt-3-cDNS-Sequenz für eine NH₂-terminale Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH) (Musacchio et al., 1993) und eine COOH-terminale Kinasedomäne kodiert. Ein bemerkenswerter Unterschied zwischen der humanen und der Ratten-Akt-3-Proteinsequenz (Konishi et al., 1995) ist die Gegenwart eines COOH-terminalen "Schweifs", der nach der Kinasedomäne 74 Reste umfasst. Die letzten 28 Aminosäurereste in humanem Akt-3 fehlen in der Ratten-Akt-3-Sequenz. Es gelang uns nicht, trotz RACE-Versuchen unter Verwendung von cDNS aus mehreren unterschiedlichen humanen Geweben humane cDNS-Sequenzen zu identifizieren, die für eine ähnliche Verkürzung kodieren. Die Region in humanem Akt-3, die im Ratten-Akt-3 nicht vorhanden ist, umfasst einen Bereich von 10 Resten (Reste 467–476 in humanem Akt-3), die mit der entsprechenden Region von humanem Akt-1 und Akt-2 identisch sind. Dies lässt vermuten, dass der in humanem Akt-3 beobachtete Schweif authentisch ist. Die Bedeutung dieses Unterschieds, der in der Schweifregion von Ratten-Akt-3 beobachtet wurde, muss noch untersucht werden. Die COOH-terminale Sequenz von humanem Akt-3 umfasst jedoch Ser⁴⁷², was Ser⁴⁷³ in Akt-1 entspricht. Es hat sich herausgestellt, dass eine Phosphorylierung von Ser⁴⁷³ zu einer 5fachen Erhöhung der Aktivität von Akt-1 führt, während eine 20-25fache Erhöhung der Akt-1-Aktivität beobachtet wurde, wenn sowohl Ser⁴⁷³ als auch Thr³⁰⁸ phosphoryliert sind (Alessi et al., 1996). Somit ist unsere Beobachtung, dass Ser⁴⁷² in humanem Akt-3 vorhanden ist, signifikant, da sie vermuten lässt, dass humanes Akt-3 möglicherweise auf ähnliche Weise wie Akt-1 und Akt-2 reguliert wird. Ob Ratten-Akt-3 auf andere Weise reguliert wird, muss noch festgestellt werden.
Die Kinase- und die PH-Domäne von Akt-3 zeigen Homologie zu der Sequenz der Konsensus-PH- und -Kinasedomäne (Musacchio et al., 1993; Hanks & Hunter 1995). Die PH-Domäne von humanem Akt-3 ist zu 77% und zu 86% identisch mit der PH-Domäne von Akt-1 bzw. Akt-2, während die Kinasedomäne von Akt-3 zu 88% und 87% identisch mit der Kinasedomäne von Akt-1 bzw. Akt-2 ist. Die hohe Konservierung der PH-Domäne kann ein Anzeichen für eine Akt-spezifische Funktion sein, da PH-Domänen in der Regel hoch divergent sind (Musacchio et al., 1993). Es hat sich gezeigt, dass die pH-Domäne von Akt nicht nur Phosphoinositide bindet, sondern auch Wechselwirkungen zwischen Akt und PKC vermittelt (Konishi et al., 1995) sowie die Bildung von multimeren Akt-Komplexen steuert (Datta et al., 1995). Im Gegensatz dazu ist die Region zwischen der PH-Domäne und der Kinasedomäne beim Vergleich der humanen Akt-1-, Akt-2- und Akt-3-Sequenz schlecht konserviert und diese Region ist ebenfalls für die Vermittlung der Bildung multimerer Akt-Komplexe wichtig (Datta et al., 1995). Dies führt zu einer interessanten Frage – vermittelt die zur Kinasedomäne NH₂-terminale Sequenz von Akt-3 die Wechselwirkung zwischen Bindungspartnern, die nur bei Akt-3 auftreten oder die nur an multiple Akt-Isoforme binden.
Um zu überprüfen, ob die vorhergesagte Kinasedomäne katalytisch aktiv ist, exprimierten wir Akt-3 als ein GST-Fusionsprotein in E. coli. Das gereinigte Protein war im Stande, ein exogenes Substrat zu phosphorylieren, wohingegen bei der Verwendung von GST anstatt GST-Akt-3 keine katalytische Aktivität beobachtet wurde. Zur Bestätigung, dass Akt-3 tatsächlich auf ähnliche Weise wie Akt-1 und Akt-2 reguliert wird, mutierten wir Thr³⁰⁵ und Ser⁴⁷³, entweder getrennt oder gemeinsam zu Asp. Es ist bekannt, dass diese Strategie die Wirkung der Phosphorylierung dieser beiden Reste in Akt-1 genau nachahmt (Alessi et al., 1996). Eine Mutation jedes einzelnen dieser Reste führt zu einer erhöhten Aktivität, die Steigerung war jedoch geringer als bei Akt-1 beobachtet (Alessi et al., 1996). Darüber hinaus beobachteten wir keine synergistische Aktivierung von Akt-3 durch Mutation von sowohl Thr³⁰⁵ als auch Ser⁴⁷³. Im Gegensatz dazu wurde eine synergistische Aktivierung beobachtet, wenn die beiden entsprechenden Reste bei Akt-1 gleichzeitig zu Asp mutiert wurden (Alessi et al., 1996). Die offensichtlichen quantitativen Unterschiede zwischen Akt-1 und Akt-3 reflektieren möglicherweise die wahren Unterschiede bei der Regulierung der beiden Isoforme, sie können aber auch auf andere Faktoren, wie die verwendeten unterschiedlichen Expressionssysteme, zurückzuführen sein. In der vorliegenden Studie wurde Akt-3 als ein GST-Fusionsprotein in E. coli. exprimiert, währen die Akt-1-Aktivität unter Verwendung eines HA-markierten Proteins, das in COS- Zellen exprimiert wurde, untersucht wurde. Trotzdem zeigen unsere Ergebnisse, dass Akt-3 qualitativ auf ähnliche Weise wie Akt-1 reguliert wird. Bekannte Arbeiten haben gezeigt, dass die Aktivierung von Akt davon abhängt, dass die PI-3-Kinase 3-Phosphoinositide erzeugt, die die PH-Domäne von Akt binden, die Translokation von Akt zur Plasmamembran fördert und die Phosphorylierung von Akt durch stromaufwärts befindliche Kinasen erleichtern (besprochen in Alessi & Cohen, 1998; Coffer et al., 1998). Unsere Beobachtung, dass der T305D/S472D-Mutant von Akt-3 bei der Bestimmung in Abwesenheit von 3-Phosphoinositiden aktiver ist als das Wildtyp-Enzym (3), lässt vermuten, dass Akt-3 nach der Phosphorylierung (wenigstens teilweise) unabhängig von der Phosphoinositid-Bindung wird.
Die Struktur der katalytischen Domäne von Akt ist eng mit der Proteinkinase A und der Proteinkinase C verwandt. Tatsächlich ergab eine BLAST-Suche in der Datenbank SwissProt, dass mehrere Isoenzyme von Proteinkinase C zu den am engsten verwandten Kinasen (abgesehen von den verschiedenen Akt-Isoformen) gehören. Dies veranlasste uns zur Untersuchung, ob sich vorhandene Hemmer von PKA oder PKC sowie andere Serin/Threonin-Hemmer als Hemmer von Akt-3 verwenden lassen. Unter den geprüften Verbindungen waren nur Staurosporin und die strukturell verwandte Verbindung Ro 31-8220 kräftige Hemmer von Akt-3. Staurosporin ist ein nicht selektiver Kinasehemmer, Ro 31-8220 hingegen ein selektiverer PKC-Hemmer (Davis et al., 1992). Obowhl Ro 31-8220 PKC ungefähr 100 Mal kräftiger (IC₅₀ 10 nM; Davis et al., 1992) hemmt als Akt-3, lässt diese Beobachtung vermuten, dass Versuche, bei denen hohe Konzentrationen von Ro 31-8820 verwendet werden, eine Wirkung auf Akt-3 haben können. Im Gegensatz zu als Staurosporin und Ro 31-8220 hemmten zwei weitere PKC-Hemmer und drei weitere PKA-Hemmer Akt-3 nicht. Dies lässt vermuten, dass es trotz der engen Verwandschaft der Akt-3-Sequenz zu PKC möglich ist, selektive Akt-Hemmer zu finden.
Die Beobachtung, dass Akt-3 durch IGF-1 aktiviert wird, legt den Schluss nahe, dass Akt-3 möglicherweise eine Rolle bei der Regulierung des Überlebens von Zellen spielt. Akt-3 kann möglicherweise die Apoptose in Tumorzellen unterdrücken. Ein Problem bei der Verwendung von Akt als Ziel für die Entwicklung eines Wirkstoffs gegen Krebs ist die Tatsache, dass Akt auf dem Insulin-Signalweg eine Rolle spielt (besprochen in Sheperd et al., 1998). Somit können Akt-Hemmer Symptome induzieren, die bei Diabetes-Patienten beobachtet werden. Eine vorgeschlagene Lösung besteht in der Entwicklung von selektiven Akt-2-Hemmern (Walker et al., 1998). Dies basiert zum Teil auf der Beobachtung, dass Insulin in Ratten-Hepatozyten und Skelettmuskeln eine kräftige Aktivierung von Akt-1 verursacht, wohingegen die Aktivierung von Akt-2 durch Insulin in diesen Geweben nur schwach ausgeprägt ist. Offenbar ist die Aktivierung von Ratten-Akt-3 durch Insulin in diesen Geweben jedoch noch schwächer (Walker et al., 1998) und in dieser Untersuchung haben wir nachgewiesen, dass Akt-3 mRNS in der Leber und den Skelettmuskeln des Menschen, die auf Insulin reagieren, nur in geringen Anteilen exprimiert wird. Dies lässt vermuten, dass das Potenzial selektiver Akt-3-Hemmer beim Hervorrufen von Symptomen ähnlich der, die bei Diabetes-Patienten beobachtet werden, noch geringer ist als das von Akt-2-Hemmern. Die Lokalisierung von humanem Akt-3 auf dem humanen Chromosom 1q43-44 ist ebenfalls interessant, da Patienten mit hämatologischen Krebserkrankungen bekannte Chromosomenabnormalitäten in dieser Region zeigen (Mitelman et al., 1997). Die Bedeutung der letzteren Beobachtung ist zwar umstritten, da bei Patienten mit hämatologischen Krebserkrankungen Chromosomenabnormalitäten an zahlreichen Loci beobachtet wurden, die hier vorgelegten zeigen jedoch, dass sich Akt-3 als wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer Arzneimittel zur Behandlung von Krebs erweisen kann.
SEQUENZPROTOKOLL

1. Sequenz ID Nr. 1 entspricht der Nukleotidsequenz des in 1 dargestellten Akt-3.
2. Sequenz ID Nr. 2 entspricht Nukleotidposition 11 bis 1447 der in 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz von Akt-3.
3. Sequenz ID Nr. 3 entspricht der Aminosäuresequenz des in 1 und 2 dargestellten Akt-3.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuremolekül, das humanes Akt-3-Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert, umfassend die in SEQ ID Nr. 3 angeführte Aminosäuresequenz, wobei ein funktionelles Äquivalent ein Akt-3-Protein ist, das bei der Expression und Reinigung als ein rekombinantes GST-Fusionsprotein Histon-H2B phosphorylieren kann.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNS-Molekül, und vorzugsweise cDNS, ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 2.
Antisense-Molekül mit einer Länge von 10 bis 40 Basenpaaren, das unter hoch stringenten Bedingungen zu dem Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisieren kann.
Humanes Akt-3-Protein oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder Bio-Vorläufer davon, umfassend eine in SEQ ID Nr. 3 angeführte Aminosäuresequenz, wobei ein funktionelles Äquivalent ein Akt-3-Protein ist, das bei der Expression und Reinigung als ein rekombinantes GST-Fusionsprotein Histon-H2B phosphorylieren kann.
Humanes Akt-3-Protein, das durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert wird.
Humanes Akt-3-Protein nach Anspruch 7, umfassend die in SEQ ID Nr. 3 angeführte Aminosäuresequenz.
Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 3.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, umfassend einen induzierbaren Promotor.
Expressionsvektor nach Anspruch 9 oder 10, umfassend eine für ein Reporter-Molekül kodierende Sequenz.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Krebsbehandlung.
Humanes Akt-3-Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines humanen Akt-3-Proteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Krebsbehandlung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein humanes Akt-3-Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 8 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerverdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür.
Wirtszelle oder nicht humaner Organismus, der mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11 transformiert oder transfektiert ist.
Transgene Zelle, transgenes Gewebe oder transgener nicht humaner Organismus, umfassend ein Transgen, das ein humanes Akt-3-Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 8 exprimieren kann.
Humanes Akt-3-Protein, das aus der Zelle oder dem nicht humanen Organismus nach Anspruch 17 oder 18 exprimiert ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die selektiv die durch humanes Akt-3-Protein vermittelte Förderung des Überlebens einer Zelle hemmen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: i) Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der den Akt-3-Weg aktiviert, und die, verglichen mit einer Kontrollzelle, die nicht mit dem Vektor transformiert wurde und in Abwesenheit eines Überlebensfaktors stirbt, in Gegenwart oder Abwesenheit des Überlebensfaktors überlebt, ii) Kontaktieren jeder dieser Zellen nach dem Trennen der Zellen vom Überlebensfaktor mit einer Prüfverbindung, wobei der Tod der transformierten Zelle ein Anzeichen für die selektive Hemmung der Verbindung im Rahmen des das Überleben fördernden humanen Akt-3-Wegs ist.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die selektiv die durch humanes Akt-3-Protein vermittelte Förderung des Überlebens einer Zelle hemmen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: i) Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der den Akt-3-Weg aktiviert, zusätzlich zu einer Kontrollzelle, die nicht mit dem Vektor transformiert wurde, ii) Kontaktieren jeder dieser Zellen mit einem den Tod verursachenden Mittel, wobei der Tod der Kontrollzelle und das Überleben der transformierten Zelle ein Anzeichen für die das Überleben fördernde Aktivität des aktivierten Akt-3-Wegs ist, iii) Kontaktieren der transformierten Zelle mit einer Prüfverbindung, wobei der Tod der Zelle ein Anzeichen für die selektive Hemmung der Verbindung im Rahmen des das Überleben fördernden humanen Akt-3-Wegs ist.
Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, die die Aktivität eines humanen Akt-3-Proteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8 beeinflussen, wobei das Verfahren das Kontaktieren des humanen Akt-3-Proteins mit einem Substrat dafür in Gegenwart einer Prüfverbindung und einer Phosphatquelle und die Kontrolle auf Phosphorylierung des Substrats umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Akt-3-Protein als ein Fusionsprotein oder ein epitopmarkiertes Protein mit einer Domäne vorliegt, die ein bekanntes Substrat phosphorylieren kann.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Akt-3-Protein als ein Fusionsmolekül von GST und humanem Akt-3 vorliegt.
Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, die die Aktivität eines humanen Akt-3-Proteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8 beeinflussen, wobei das Verfahren das Kontaktieren eines Phospholipids oder eines Surrogats oder funktionellen Äquivalents davon mit einer PH-Domäne eines humanen Akt-3-Proteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in Gegenwart eines zu prüfenden Mittels und Kontrolle auf eine Bindung des Phospholipids, Surrogats oder funktionellen Äquivalents davon mit der PH-Domäne des Akt-3-Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Phospholipid Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat umfasst.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Akt-3-Kinaseaktivität moduliert, umfassend: a) Kontaktieren des Akt-3 mit einem Substrat davon in Gegenwart einer radioaktiv markierten Phosphatquelle und der zu prüfenden Verbindung, b) Unterbrechen der Reaktion durch die Zugabe eines Kinasehemmers in Gegenwart von SPA-Kügelchen, c) Überwachen des Signals von den Kügelchen verglichen mit einer Kontrolle, die nicht mit der Verbindung kontaktiert wurde.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Akt-3-Aktivität moduliert, umfassend: a) Kontaktieren des Akt-3 mit einem Substrat davon in Gegenwart einer radioaktiv markierten Phosphatquelle und der zu prüfenden Verbindung, b) Unterbrechen der Reaktion, c) Filtrieren der Reaktionsmischung durch Phosphocellulose-Kationenaustauscherpapier und d) Überwachen des Signals vom Filterpapier verglichen mit einer Kontrolle, die nicht mit der Verbindung kontaktiert wurde.