ES2274543T3 - Lipido cinasa. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA CINASA LIPIDICA QUE FORMA PARTE DE LA FAMILIA DE CINASAS PI3. LAS CINASAS PI3 CATALIZAN LA ADICION DE FOSFATO A INOSITOL, GENERANDO MONO - , DI Y TRIFOSFATO DE INOSITOL. LOS FOSFATOS DE INOSITOL HAN SIDO IMPLICADOS EN LA REGULACION DE CASCADAS DE SEÑALIZACION INTRACELULAR, DANDO COMO RESULTADO LA ALTERNACION EN LA EXPRESION DE GENES QUE, ENTRE OTROS EFECTOS, PUEDEN DAR LUGAR A REMODELACION CITOESQUELETICA Y MODULACION DE LA MOVILIDAD CELULAR. MAS CONCRETAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA CINASA PI3 HUMANA, LA P110 DE QUE INTERACCIONA CON P85, TIENE UNA AMPLIA ESPECIFICIDAD PARA LA FOSFOINOSITIDA Y ES SENSIBLE A LOS MISMOS INHIBIDORES DE LA CINASA QUE LA CINASA PI3 P110 AL . NO OBSTANTE, EN CONTRASTE CON LAS CINASAS PI3 ANTERIORMENTE IDENTIFICADAS, QUE MUESTRAN UN MODELO MUY GENERICO DE EXPRESION, LA P110 DE SE EXPRESA SELECTIVAMENTE EN LOS LEUCOCITOS. LO IMPORTANTE ES QUE LA P110 DE MUESTRA UNA EXPRESION REFORZADA EN LA MAYORIA DE MELANOMAS PROBADOS, POR LO QUE PUEDE DESEMPEÑAR UN PAPEL CRUCIAL EN LA REGULACION DE LA PROPIEDAD METASTASICA QUE PRESENTAN LOS MELANOMAS. LA IDENTIFICACION DE AGENTES QUE PROMUEVEN O REDUCEN LA ACTIVIDAD DE LA P110 DE PUEDEN, PUES, PREVENIR LA METASTASIS DEL CANCER.

Description

Lípido cinasa.

La invención se refiere a una nueva lípido cinasa que es parte de la familia de la PI3 cinasa (P13K) y, más específicamente, la invención se refiere a diversos aspectos de la nueva lípido cinasa especialmente, pero no de forma exclusiva, a la identificación de la expresión de dicha cinasa con vistas a diagnosticar o predecir la movilidad o capacidad de invasión de células, tales como metástasis de células cancerígenas; y también a agentes para interferir con dicha expresión o inhibir dicha cinasa con vistas a potenciar, reducir o prevenir dicha movilidad o capacidad de invasión reduciendo o restringiendo, respectivamente, de este modo el movimiento de las células seleccionadas.

En nuestra solicitud pendiente de tramitación W093/21328 se proporciona una visión general de las enzimas de la familia de la PI3 cinasa. Brevemente, esta clase de enzimas muestra actividad fosfoinosítido (denominado a partir de ahora en este documento PI) 3-cinasa. Tras los avances principales en nuestro conocimiento sobre la transducción de la señal celular y los sistemas de segundos mensajes, se sabe que las PI3K tienen un papel principal en la regulación de la función celular. De hecho, se sabe que las PI3K son miembros de un número creciente de posibles proteínas de señalización que se asocian con proteína tirosina cinasas activadas mediante estimulación por ligando o como consecuencia de la transformación celular. Una vez asociadas de este modo, proporcionan un complejo importante en la ruta de señalización celular y, de este modo, dirigen los sucesos hacia una conclusión determinada.

Las PI3 cinasas catalizan la adición de fosfato a la posición 3'-OH del anillo de inositol de los lípidos de inositol, generando fosfatidil inositol monofosfato, fosfatidil inositol difosfato y fosfatidil inositol trifosfato (Whitman y col., 1988, Stephens y col., 1989 y 1991). Ahora se ha identificado una familia de enzimas PI3 cinasas en organismos tan diversos como plantas, moho del cieno, levaduras, moscas de la fruta y mamíferos (Zvelebil y col., 1996).

Es concebible que las diferentes PI3 cinasas sean responsables de la generación in vivo de los diferentes lípidos de inositol 3'-fosforilados. Basándose en sus sustratos lipídicos específicos in vitro, pueden diferenciarse tres clases de PI3 cinasas. Las enzimas de una primera clase tienen una amplia especificidad de sustrato y fosforilan PtdIns, Ptdlns(4)P y PtdIns(4,5)P_{2}. La clase I de PI3 cinasas incluyen la p110\alpha, p110\beta y p110\gamma de mamíferos (Hiles y col, 1192; Hu y col, 1993; Stephens y col, 1994; Stoyanov y col, 1995).

Las p110\alpha y p110\beta son PI3 cinasas muy relacionadas que interaccionan con proteínas adaptadoras p85 y con Ras unido a GTP.

Se han clonados dos subunidades 85 kDa, la p85\alpha y la p85\beta (Otsu y col., 1992). Estas moléculas contienen un dominio de homología con src 3 (SH3) en N-terminal, una región de homología con el agrupamiento del punto de rotura (bcr) flanqueada por dos regiones ricas en prolina y dos dominios de homología con src 2 (SH2). Proteínas p85 más cortas, generadas mediante empalme alternativo de gen p85\alpha o codificadas por genes distintos de los de p85\alpha/\beta, carecen todas del dominios SH3 y de la región bcr, que parecen estar sustituidas por una única región corta N-terminal (Pons y col., 1995, Inukai y col., 1996; Antonetti y col., 1996). Los dominios SH2, presentes en todas las moléculas p85, proporcionan las PI3K heterodiméricas p85/p110 con la capacidad para interaccionar con restos de tirosina fosforilada en diversos receptores y en otras proteínas celulares. A diferencia de p110\alpha y \beta, p110\gamma no interacciona con p85, pero en su lugar se asocia con una proteína adaptadora p101 (Stephens y col., 1996). La actividad de p110\gamma es estimulada por las subunidades de la proteína G.

Una segunda clase de PI3K contiene enzimas que, al menos in vitro, fosforilan a PtdIns y PtdIns(4)P pero no a PtdIns(4,S)P2 (MacDougall y col, 1995; Virbasius y col, 1996, Molz y col, 1996). Todas estas PI3K contienen un dominio C2 en sus extremos C-terminales. Se desconocen el papel in vivo de estas PI3K de clase II.

Una tercera clase de PI3K tiene una especificidad de sustrato restringida a PtdIns. Estas PI3K son homólogas a la Vps34p de levaduras, implicada en el tráfico de proteínas sintetizadas de novo desde el aparato de Golgi a la vacuola en levaduras, el equivalente al lisosoma de mamíferos (Stack y col., 1995). Ambas Vps34p de levaduras y mamíferos aparecen formando un complejo con Vps15p, una proteína serina/treonina cinasa de 150 kDa (Stack y col., 1995; Volinia y col., 1995; Panaretou y col., enviado para su publicación).

Ptdlns(3)P se presenta de forma constitutiva en las células y sus niveles permanecen en gran parte inalterados tras la estimulación extracelular. Por el contrario, PtdIns(3, 4)P_{2} y PtdIns(3, 4, 5)P_{3} están prácticamente ausentes en células inactivas pero se producen rápidamente tras la estimulación con diversos factores de crecimiento, lo que sugiere que probablemente funcionan como segundos mensajeros (Stephens y col., 1993). Se acaba de empezar a entender la función de las PI3K y de sus lípidos fosforilados en la fisiología celular. Estos lípidos pueden cumplir un doble papel: además de ejercer efectos físicos mediados por la carga en la curvatura de la bicapa lipídica, también tienen la capacidad de interaccionar con proteínas de unión específicas y de modular su localización y/o actividad. Entre las posibles dianas de estos lípidos están las proteínas cinasas, tales como las isoformas de la proteína cinasa C, las cinasas activadas por la proteína cinasa N/Rho y la Akt/RAC/proteína cinasa B (Toker y col, 1994; Palmer y col, 1995; Burgering y Coffer, 1995; Franke y col, 1995; James y col, 1996; Klippel y col, 1996). La Akt/RAC/proteína cinasa B probablemente está corriente arriba de dianas tales como la p70 S6 cinasa y la glucógeno sintasa cinasa 3 (Chung y col., 1994; Cross y col., 1995). Las PI3K también afectan a la actividad de las proteínas pequeñas que se unen a GTP, tales como Rac y Rab5, posiblemente regulando el intercambio de nucleótidos (Hawkins y col, 1995; Li y col, 1996). Finalmente, la combinación de estas acciones puede dar lugar a reordenamientos del citoesqueleto, a síntesis/mitogénesis de ADN, supervivencia celular y diferenciación (Vanhaesebroeck y col., 1996).

En este documento se describe una nueva PI3 cinasa de clase I de mamíferos que se han denominado p110\delta. Esta nueva PI3 cinasa tipifica a la familia de PI3 cinasas de clase I por que se une a p85\alpha, p85\beta y p85\gamma. Además, también se une a GTP-ras pero, al igual que p110\alpha, no se une a rho ni a rac. También comparte la misma especificidad de ámplio sustrato de lípidos de fosfoinosítido con GTP de p110\alpha y p110\beta, y también muestra actividad proteína cinasa y tiene una sensibilidad a fármacos similar a p110\alpha.

Sin embargo, se caracteriza por su distribución tisular selectiva. A diferencia de p110\alpha y p110\beta que parecen expresarse de forma ubicua, la expresión de p110\delta es especialmente elevada en poblaciones de glóbulos blancos, es decir, bazo, timo y, especialmente, en leucocitos de sangre periférica. Además de esta observación, también se ha descubierto que p110\delta se expresa en la mayoría de los melanomas, pero en ningún melanocito, la célula normal equivalente de los melanomas. Debido a la distribución natural de p110\delta en tejidos que se sabe muestran movilidad o capacidad de invasión y también la expresión de p110\delta en células cancerígenas, se considera que p110\delta desempeña un papel en la movilidad o capacidad de invasión celular y, por tanto, la expresión de esta lípido cinasa en células cancerígenas puede explicar el comportamiento metastático de las células cancerígenas.

Una nueva característica adicional de p110\delta es su capacidad para autofosforilarse de forma dependiente de Mn^{2+}. De hecho, se ha mostrado que la autofosforilación tiende a impedir la actividad lípido cinasa de la proteína. Además, p110\delta contiene módulos de potencial interacción proteína:proteína diferenciados que incluyen una región rica en prolina (véase la Figura 1, posiciones 292-311, en la que 8 de los 20 aminoácidos son prolina) y un dominio básico similar a la región en cremallera de leucina (bZIP) (Ing y col., 1994 y Hirai y col., 1996). Estas diferencias bioquímicas y estructurales entre PI3 cinasas que unen p85 indica que pueden cumplir funciones funcionales diferenciadas y/o estar reguladas diferencialmente in vivo.

En este documento se describe una molécula de ácido nucleico de origen humano y los datos correspondientes a la secuencia de aminoácidos relativa a p110\delta. Usando esta información es posible determinar la expresión de p110\delta en diversos tipos de tejido y, en particular, determinar la expresión de la misma en el tejido cancerígeno con vistas a diagnosticar la movilidad o invasividad de este tejido y predecir, de este modo, el potencial de aparición de tumores secundarios. Además, también será posible proporcionar agentes que alteren la expresión de p110\delta o alternativamente, interfieran con el funcionamiento de la misma. Por ejemplo, teniendo en cuenta los datos de secuencia proporcionados en este documento es posible proporcionar material complementario que previene la expresión de p110\delta.

Como se mencionó anteriormente, la invención abarca a oligonucleótidos no codificantes que se une selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PI3K\delta, para disminuir la transcripción y/o traducción de los genes PI3K\delta. Esto es deseable en prácticamente cualquier enfermedad en la que es deseable una reducción de la expresión del producto del gen PI3K\delta, incluyendo la reducción de cualquier aspecto del fenotipo de célula tumoral atribuible a la expresión del gen PI3K\delta. Las moléculas complementarias, de esta forma, pueden usarse para ralentizar o parar estos aspectos del fenotipo de una célula tumoral.

Según se usa en este documento, la expresión "oligonucleótido no codificante" o "no codificante" describe un oligonucleótido que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado u oligodesoxirribonucleótido modificado que hibrida en condiciones fisiológicas con el ADN que comprende un gen en particular o con una transcripción de ARNm y, por tanto, inhibe la transcripción de este gen y/o la traducción de este ARNm. Las moléculas no codificantes se diseñan de modo que interfieran con la transcripción o la traducción de un gen diana tras la hibridación con el gen diana. Los expertos en la materia reconocerán que la longitud exacta de los oligonucleótidos no codificantes y su grado de complementariedad con esta diana dependerán de la diana específica seleccionada, incluyendo la secuencia de la diana y las bases particulares que comprende esta secuencia. Se prefiere que el oligonucleótido no codificante se construya y ordene de modo que se una selectivamente con la diana en condiciones fisiológicas, es decir, hibride sustancialmente más con la secuencia diana que con cualquier otra secuencia de la célula diana en condiciones fisiológicas. Basándose en la secuencia de ADN presentada en la Figura 9 o a las secuencias genómicas y/o de ADN alélicas u homólogas, un experto en la materia puede elegir y sintetizar fácilmente cualquiera de las diversas moléculas no codificantes apropiadas para su uso según la presente invención. Para que sean suficientemente selectivos y potentes para la inhibición, estos oligonucleótidos no codificantes comprenderán al menos 7 (Wagner y col., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996) y, más preferiblemente, al menos 15 bases consecutivas que son complementarias con la diana. Más preferiblemente, los oligonucleótidos no codificantes comprenden una secuencia complementaria de 20-30 bases. Aunque pueden elegirse oligonucleótidos que sean no codificantes con cualquier otra región del gen o de los ARNm transcritos, en realizaciones preferidas los oligonucleótidos complementarios se corresponden con los sitios N-terminal o antes del extremo 5', tales como los sitios de iniciación de la traducción, iniciación de la transcripción o promotores. Además, puede dirigirse hacia regiones 3' no traducidas. También se ha usado en la técnica la dirección hacia sitios de empalme del ARN pero puede ser menos preferido si tiene lugar un empalme alternativo del ARNm. Además, el no codificante se dirige, preferiblemente, a sitios en los que se espera que el ARNm no tenga estructura secundaria (véase, por ejemplo Sainio y col., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457. 1994) y en el que se espera que no se unan proteínas. Finalmente, aunque la secuencia del ADNc se describe en la Figura 9, un experto en la materia puede derivar fácilmente el ADN genómico correspondiente con el ADNc de la Figura 9. De este modo, la presente invención también proporciona oligonucleótidos no codificantes que lo son con el ADN genómico que se corresponde con la Figura 9. De forma similar, pueden facilitarse no codificantes de ADN alélicos u homólogos y de ADN genómicos sin necesidad de demasiada experimentación.

En un grupo de realizaciones, los oligonucleótidos no codificantes de la invención pueden estar compuestos de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos "naturales" o cualquier combinación de los mismos. Es decir, el extremo 5' de un nucleótido nativo y el extremo 3' de otro nucleótido nativo puede estar unidas covalentemente, como en los sistemas naturales, mediante enlaces fosfodiester internucleósido. Estos oligonucleótidos pueden prepararse mediante procedimientos reconocidos en la técnica que puede realizarse de forma manual y mediante un sintetizador automático. También puede producirse de forma recombinantes mediante vectores.

En realizaciones preferidas, sin embargo, los oligonucleótidos no codificantes de la invención también pueden incluir oligonucleótidos "modificados". Es decir, los oligonucleótidos pueden modificarse de varias formas que no impidan que hibriden con su diana pero que potencien su estabilidad o selección de diana que, por otro lado, potencien su eficacia terapéutica.

El término "oligonucleótido modificado" según se usa en este documento describe un oligonucleótido en el que (1) al menos dos de sus nucleótidos están unidas covalentemente mediante un enlace sintético internucleosídico (es decir, un enlace distinto al enlace fosfodiester entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido) y/o (2) se ha unido covalentemente al oligonucleótido un grupo químico normalmente no asociado con ácidos nucleicos. Los enlaces sintéticos internucleosídicos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, péptidos y ésteres de carboximetilo.

El término "oligonucleótido modificado" también abarca oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificado covalentemente. Por ejemplo, los oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que tiene esqueletos de azúcares que se unen covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos del grupo hidroxilo en la posición 3' y un grupo distinto al grupo fosfato en la posición 5'. Los oligonucleótidos modificados de este modo pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares, tales como arabinosa, en lugar de ribosa. Los oligonucleótidos modificados también pueden incluir análogos de base, tales como bases modificadas con propina en C-5 (Wagner y col., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). La presente invención, de este modo, contempla preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas complementarias modificadas que son complementarias y capaces de hibridar con, en condiciones fisiológicas, con ácidos nucleicos que codifican las proteínas PI3K\delta, junto con vehículos farmacéuticamente aceptables.

Pueden administrarse oligonucleótidos no codificantes como parte de una composición farmacéutica. Esta composición farmacéutica puede incluir los oligonucleótidos no codificantes en combinación con cualquier vehículo convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica. Las composiciones serán estériles y contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de los oligonucleótidos no codificantes en una unidad de peso o volumen adecuada para su administración a un paciente. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. La expresión "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico, tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales que son bien conocidos en la técnica.

Por tanto, es un objetivo de la invención identificar una nueva PI3 cinasa y proporcionar así medios para predecir la posible movilidad o invasividad de las células.

Es aún otro objetivo de la invención proporcionar agentes que potencien o reduzcan o prevengan la expresión de p110\delta y/o agentes que interfieren con el funcionamiento de p110\delta, con vistas a potenciar o detener o prevenir, respectivamente, la movilidad o invasividad de las células.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona por tanto un polipéptido aislado que se autofosforila que posee actividad PI3 cinasa, representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1.

Idealmente, dicho polipéptido deriva de glóbulos blancos y se expresa típicamente en melanomas, aún más idealmente dicho polipéptido es de origen humano.

Además, el polipéptido es capaz de asociarse idealmente con las subunidades p85 de las PI3 cinasa de mamíferos para producir complejos activos.

Aún más preferiblemente, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A que especialmente se caracteriza por un dominio rico en prolina.

Se pretende que la referencia en este documento al término homólogo cubra al material de naturaleza similar o de procedencia común, o tratar las características, según se describe en este documento, que caracterizan a la proteína, o material, cuya molécula de ácido nucleico correspondiente hibrida, por ejemplo en condiciones rigurosas, con la molécula de ácido nucleico mostrada en la Figura 9. Las condiciones típicas de hibridación podrán incluir formamida al 50%, SSPE x 5, solución de Denhardt x 5, SDS al 0,2%, 200 \mug de ADN de esperma de arenque sonicado y desnaturalizado, 200 \mug/ml de ARN de levadura a una temperatura de 60ºC (condiciones descritas en la descripción de patente publicada Nº WO 93/21328).

Idealmente, el polipéptido se produce usando tecnología recombinante y típicamente es de origen humano.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo frente a al menos una parte del polipéptido de la invención, este anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona la molécula de ácido nucleico completa o en parte mostrada en la Figura 9, codificando dicha molécula un polipéptido que se autofosforila que tiene actividad PI3 cinasa.

En el caso en que se proporcione dicha parte de dicha molécula, la parte se seleccionará teniendo en cuenta su finalidad, por ejemplo, puede ser deseable seleccionar la parte que tiene la actividad cinasa para su uso posterior u otra parte que es más adecuada para la producción de anticuerpos.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una construcción de una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico completa o en parte, de la invención en la que la molécula de ácido nucleico anterior está bajo en control de una secuencia control y en una fase de lectura apropiada de modo que se asegure la expresión de la proteína correspondiente.

Según aún otro aspecto adicional de la invención, se proporcionan células hospedadoras que se han transformado, idealmente usando la construcción de la invención, de modo que incluye la molécula de ácido nucleico mostrada en la Figura 9 completa o parte de modo que se permita la expresión del correspondiente polipéptido o de una parte significativa.

Idealmente, estas células hospedadores son células eucarióticas, por ejemplo, células de insectos de la especie Spodoptera frugiperda que usan el sistema de expresión de baculovirus. Este sistema de expresión se ve favorecido en caso de que se requiera la modificación postraduccional. Si no se requiere esta modificación puede usarse un sistema procariótico.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para diagnosticar la movilidad de células que comprende examinar la expresión del polipéptido de la invención en una muestra de dichas células.

Idealmente, se realizan investigaciones para establecer si el ARNm que se corresponde con el polipéptido de la invención se expresa en dichas células usando, por ejemplo, técnicas de PCR o análisis por inmunotransferencia del ARN total. Alternativamente, puede realizarse cualquier otra técnica convencional para identificar dicha expresión.

Según aún otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para identificar antagonistas eficaces para bloquear la actividad del polipéptido de la invención que comprende analizar la actividad de estas moléculas candidatas usando el polipéptido de la invención o fragmentos del mismo.

Idealmente, el análisis puede implicar técnicas artificiales, tales como técnicas asistidas por ordenador o técnicas convencionales de laboratorio.

Idealmente, el procedimiento anterior se realizar exponiendo las células que se sabe que expresan el polipéptido de la invención, de forma natural o en virtud de una transfección, al antagonista apropiado y controlar, a continuación la movilidad de las mismas.

Alternativamente, el procedimiento de la invención puede suponer un ensayo de unión competitiva para identificar agentes que se unen de forma selectiva e idealmente de forma reversible al polipéptido de la invención.

Según aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica o veterinaria que comprende un agente eficaz para potenciar o bloquear la actividad o expresión del polipéptido de la invención que se ha formulado para su uso farmacéutico o veterinario y que también incluye opcionalmente un diluyente, vehículo o excipiente y/o está en forma de unidad de dosificación.

Según aún un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para controlar la movilidad de las células que comprende exponer a una población de dichas células a un anticuerpo o al polipéptido de la invención y a material complementario como se describe en este documento.

Alternativamente, en el procedimiento mencionado anteriormente, dichas células pueden exponerse alternativa o adicionalmente, al polipéptido de la invención con vistas a aumentar los niveles de eficacia de dicho polipéptido y potenciar de este modo la movilidad celular.

El procedimiento mencionado anteriormente puede realizarse in vivo o in vitro.

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Según aún otro aspecto adicional de la invención se proporciona el uso de un agente eficaz que bloquee la actividad del polipéptido de la invención para controlar la movilidad celular.

Según aún otro aspecto adicional de la invención se proporciona el uso del polipéptido de la invención para potenciar la movilidad celular.

Según aún otro aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica de oligonucleótidos no codificantes idealmente modificados como se describe en este documento, para que hibriden con el ácido nucleico de la invención.

Ahora se describirá una realización de la invención a modo de ejemplo sólo en referencia a las figuras, materiales y procedimientos siguientes en las que:

La Figura 1 (A) muestra la secuencia de aminoácidos traducida del ADNc de p110\delta humano. La región rica en prolina y el dominio similar a bZIP se indican mediante recuadros vacíos o sombreados, respectivamente. (B) comparación de la gráfica de puntos de la secuencia de aminoácidos completa de p110\delta con las de p110\alpha y p110\beta. Se subrayan los motivos de la secuencia no conservados. Las comparaciones de las gráficas de puntos se realizaron usando el programa COMPARE (conjunto de programas UWGCG: Devereux y col., 1984). (C) Comparación de la secuencia de aminoácidos de p110\delta que flanquean a HR3 con las respectivas regiones homólogas de p110\alpha y p110\beta. La numeración de los aminoácidos es la de p110\delta. Región rica en prolina: las prolinas críticas que permiten la formación de una hélice levógira de tipo II de poliprolinas en p110\delta se indican con un asterisco. Región bZIP: Los restos L/V/I conservados de la región en cremallera de leucina se indican con cabezas de flechas.

Figura 2. Interacción de p110\delta con p85 y Ras (A) las células de insectos se infectaron con baculovirus recombinantes que codifican GST-p110\delta, sola o en combinación con virus que codifican p85\alpha, \beta o \gamma. Después de 2 días, la GST-p110\delta se purificó por afinidad a partir de los lisados celulares usando glutatión-sepharosa, se lavó y analizó mediante SDS-PAGE y se tiñó con Coomassie. (B) p110\delta se inmunoprecipitó a partir de 500 \mug del citosol de neutrófilos humanos y se incubó con una sonda para detectar la presencia de diferentes isoformas de p85 mediante inmunotransferencia. rec = p85 recombinante purificada a partir de células Sf9. (C) GST-p110\alpha/85\alpha y GST-p110\delta/85\alpha (0.25 \mug) se incubaron con la cantidad indicada (en \mug) de V12-Ras cargado con GTP o GDP, se lavó e incubó con una sonda para detectar la presencia de Ras mediante inmunotransferencia (Rodríguez-Viciana y col., 1994, 1996).

Figura 3. (A) especificidad de sustrato lipídico in vitro de p110\delta. Se usó GST-p110\delta/p85\alpha en un ensayo de lípido cinasa usando los sustratos indicados en presencia de Mg^{2+}. Se aplicaron en el origen cantidades iguales de cpm. (B) análisis por HPLC del producto de fosforilación PtdIns generado por GST-p110\delta/p85\alpha. Se muestran los tiempos de elución del producto desacilado de p110\delta (línea continua) y de los patrones de glicerofosfoinositol-3P y glicerofosfoinositol-4P (líneas punteadas). Las posiciones de los controles de AMP y ADP se indican mediante flechas.

Figura 4. Actividad proteína cinasa de p110\delta. (A) GST-p110\alpha o GST-p110\delta, formando complejo con las subunidades de p85 indicadas, se sometieron a una reacción de proteína cinasa in vitro en presencia de Mn^{2+} y adicionalmente se analizaron mediante SDS-PAGE, se tiñeron con Coomassie y autorradiografía, (B,C) p110\alpha y p110\delta no marcados [naturales (S) o mutantes defectuosos para la cinasa (p110\alpha-R916P y p110\delta-R894P)], formando complejo con p85\alpha o \beta en perlas de PDGF-receptor de fosfopéptido, se sometieron a una reacción cinasa in vitro y posteriormente se analizaron como se describe en (A). Las cabezas de flecha vacías y rellenas señalan a las proteínas p110 y p85, respectivamente. Panel derecho de (B): Análisis del ácido fosfoamino de p85\alpha y p110\delta.

Figura 5. Sensibilidad de la actividad lípido cinasa de p110\delta a fármacos. La inhibición de p110\delta/p85\alpha (círculos rellenos) y p110\alpha/p85\alpha (círculos vacíos) se normaliza con respecto a la actividad en ausencia del fármaco wortmanina. Estos valores son la media (+DT) de 3 experimentos.

Figura 6. Análisis de inmunotransferencia del ARN total de la expresión de p110\alpha, p110\beta y p110\delta.

Figura 7. Análisis de la expresión de las proteínas p110\alpha y p110\delta. Se cargaron 100 \mug de lisado completo de células por carril. Las plaquetas se lisaron en tampón de lisis como se describe en Materiales y procedimientos o en tampón de carga en gel de Laemmli que contenía 2-mercaptoetanol. PMBC; células mononucleares de sangre periférica; PBL, linfocitos de sangre periférica.

Figura 8. Implicación de p110\alpha y p110\delta en la señalización de citocinas. Las líneas celulares Ba/F3 (A) y MC/9 (B) se estimularon con las citocinas indicadas. Las muestras de las células control no tratadas se marcan como Con. Los lisados completos de células y las IP p110\alpha y p110\delta se separaron mediante SDS-PAGE para preparar transferencias por duplicado, cuyas referencias fueron p110\delta/85\alpha (paneles a, b y d) o p110\alpha/85\alpha (paneles c y e). Las inmunotransferencias de las transferencias nativas se realizaron con 4G10 (anti-PTyr, paneles a) y anti-p110\alpha (paneles c). Las transferencias se dividieron posteriormente en tiras y se incubaron de nuevo con anticuerpos anti-SHP2. (A, panel b), anti-kit (B, panel b), anti-p110\delta (paneles d) y anti-p85 (paneles e). Las cabezas de flecha indican las posiciones de p170 (IRS-2), p100 y p70 (SHP2) (A, panel a) y de p150 (c-kit) y p100 (B, panel b).

Figura 9. La secuencia completa del ADNc humano de p110\delta.

Figura 10. Representa las imágenes de inmunofluorescencia de macrófagos murinos microinyectados con anticuerpos purificados por afinidad frente a p110\delta. Los citoesqueletos de los macrófagos se marcaron con rodamina conjugada con faloidina.

Materiales y procedimientos Clonación de p110\delta

Se han descrito los detalles del aislamiento de clones del ADNc parcial de la PI3 cinasa mediante RT-PCR basada en las regiones homólogas entre p110\alpha bovina y Vps34p de S. cerevisiae (Volinia y col., 1995; MacDougall y col., 1996). Esta aproximación produjo un fragmento parcial del ADNc de p110\delta a partir de la línea de células T, MOLT4, que se usó a continuación para analizar una biblioteca de ADNc de U937 incubada con oligo(dT). El ADN complementario se clonó mediante EcoRI-XhoI en un vector Lambda ZAPII digerido con EcoRI-XhoI (Stratagene). De los 4 millones de clones analizados, se encontraron 6 placas primarias positivas, 3 de las cuales siguieron siendo positivas durante dos rondas adicionales de selección. Las inserciones de ADNc en pBluescript se prepararon mediante escisión in vivo según las instrucciones del fabricante (Stratagene). Mediante mapeo de restricción y PCR se caracterizaron tres clones pBluescript representativos (0_{5 . 1}, 0_{9 . 1} y 0_{11 . 1}) y se encontró que contenían inserciones de tamaños que oscilaban de 4,4, kb (0_{11 . 1}) a 5,0 kb (0_{5 . 1}. 0_{9 . 1}). El clon 0_{9 . 1} se usó para una caracterización detallada. El mapeo de restricción de esta inserción mostró la ausencia de un sitio XhoI interno y la presencia de 2 sitios EcoRI internos en los nucleótidos 223 y 3.862, respectivamente, en dirección 3' desde el sitio de inserción de EcoRI en el ADNc (nucleótido 1 = nucleótido subrayado de la Figura 9). Por tanto, la digestión combinada con EcoRI y XhoI divide la inserción 0_{9 . 1} en 3 fragmentos, denominados adicionalmente fragmento I de EcoRI (nucleótidos 1-222), fragmento II de EcoRI (nucleótidos 223-3.861) y fragmento III de EcoRI-XhoI (nucleótidos 3.862-5.000, aproximadamente). Se secuenciaron ambas cadenas de los fragmentos I y II usando el sistema de secuenciación de terminación de ciclo Taq-Dye-Deoxy (ABI) y la secuencia de ADNc completo se muestra en la Figura 9. Se encontró una fase de lectura abierta que se extiende del nucleótido195 al 3.330 de la inserción 0_{9 . 1}. Un codón de parada en fase precede al posible codón de inicio, que está en un contexto favorable para el inicio de la traducción (Kozak, 1991). Esto da lugar a 196 nucleótidos de una región 5' no traducida (NT) y a una 3' NT de aproximadamente 2,2, kb. En el extremo 5' secuenciado de los clones 0_{5 . 1}, 0_{9 . 1} y 0_{11 . 1}, se encontraron 2 regiones 5' no traducidas diferentes pero relacionadas que indicaban la existencia de al menos 2 ARN mensajeros ligeramente diferentes.

Construcción de vectores de expresión para p110\delta

Los vectores de transferencia para células de insecto usados fueron pVL1393 (para p110\delta sin marcar; InVitrogen) y pAcG3X (para GST-p110\delta; Davies y col., 1993). La región codificadora para p110\delta se subclonó en estos vectores en dos etapas. En primer lugar, los vectores de expresión se manipularon genéticamente, mediante la inserción de un enlazador en el sitio de clonación múltiple, para que contuvieran parte de la secuencia del fragmento I de EcoRI de p110\delta, que se extiende del codón de inicio (en el nucleótido 197; véase antes) al segundo sitio EcoRI (nucleótido 223; véase antes). En este ultimo sitio EcoRI, se subclonó el fragmento II de EcoRI de p110\delta, seguido de la selección de clones con inserciones correctamente orientadas. La primera etapa para los vectores de células de insecto fue la escisión con BamHI-EcoRI seguida de la inserción del enlazador siguiente (enlazador I):

GATCCCCACCATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCATGG \hskip0,3cm (sentido: 5'-3')(complementario:5'-3')

AATTCCATGGGGCAGTCCACCCCAGGGGGCATGGTGGG.

Este enlazador contiene el ATG con una secuencia consenso de Kozak óptima (Kozak, 1991). Se hicieron derivados adicionales de p110\delta mediante PCR usando la ADN polimerasa Vent (New England Biolabs). El fragmento II de EcoRI de p110\delta, subclonado en pBluescript-SK (indicado adicionalmente como pBluescript-p110\delta-EcoII) se usó aquí como molde. En estas reacciones de PCR, se eliminó la región 3' no traducida de la inserción del fragmento II de EcoRI. Los oligonucleótidos usados para crear la mutación R894P fueron los siguientes: oligonucleótido mutagénico sentido = CEBADOR 1 (resto mutagénico subrayado) = 5'-GTGTGGCCACATATGTGCTGGGCATTGGCGATCCGCA
CAGCGACAACATCATGATCCG, complementario = CEBADOR 2 = 5'-GGCCCGGTGCTCGAGAATTCTACTG
CCTGTTGTCTTTGGACACGT TGTGGGCC.

Se realizó una PCR paralela usando el cebador 2 y un cebador sentido (CEBADOR 3 = 5'-GTGTGGCCACA
TATGTGCTGGGCATTGGCG) que dejaba intacta la secuencia p110\delta de tipo natural. Todos los productos de PCR se escindieron con NdeI y XhoI, se subclonaron en pBluescript-p110\delta-EcoII abierto con NdeI-XhoI y se secuenciaron. A continuación, los clones correctos se transfirieron como un casete EcoRI a pVL1393 abierto con EcoRI que contenía el enlazador I, seguido de la selección de los clones con inserciones correctamente orientadas.

Expresión de p110\delta en células de insecto

El ADN plasmídico se transfectó conjuntamente con ADN BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA) usando el reactivo Lipofectina (Gibco). Las placas recombinantes se aislaron y caracterizaron mediante procedimientos establecidos (Summers y Smith, 1987).

Cultivo celular

Las células se cultivaron en un incubador de CO_{2} al 5% humidificado en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2-mercaptoetanol 20 \muM, penicilina/estreptomicina a 100 unidades/ml y glutamina 2 mM. Ba/F3 es una línea celular pre-B murina dependiente de IL3 (Palacios y Steinmetz, 1985) y MC/9 es una línea de mastocitos murinos dependiente de IL3 (Nabel y col., 1981). Ba/F3 y MC/9 se mantuvieron ambas en medio condicionado al 10% (v/v) derivado de WEHI3B, como fuente de IL3 murina. Las células progenitoras mielóides FDMAC11/4.6 (FD-6) son una variante autóctona de FDMAC 11 que crecerán en respuesta a IL4, así como a IL3, GM-CSF y CSF-1 (Welham y col., 1994a).

Estas células se mantuvieron en medio condicionado con IL-4 al 3% (v/v) derivado de las células AgX63/OMIL4 (Karasuyama y Melchers, 1988).

Ensayo de lípido cinasa

La actividad lípido cinasa se realizó esencialmente como describen Whitman y col. (1985). El tampón del ensayo de lípido cinasa fue Tris HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM y EGTA 0,5 mM. Los lípidos se obtuvieron de Sigma. La concentración final de ATP y Mg2+ en el ensayo fue rutinariamente de 0,5 y 3,5 mM, respectivamente, mientras que los lípidos se usaron a una concentración de 0,2-0,4 mM. A no se que se indique otra cosa, la reacción cinasa se realizó durante 10 min a 37ºC. El disolvente para la separación por TLC de los productos de reacción fue propan-1-ol/ácido acético 2 M/H_{3}PO_{4} 5 M (65:35:1). Los ensayos de los efectos de fármacos sobre la cinasa se realizaron usando PtdIns como sustrato en presencia de ATP 40 \muM (final) durante 10 min a 25ºC, todos los tubos contenían DMSO al 1%. La actividad se cuantificó mediante análisis por láser de barrido (Molecular Dynamics) de los productos lipídicos separados en TLC.

Análisis HPLC

Se usaron como patrones [^{32}P]-PtdIns3P, preparados mediante fosforilación de PtdIns con p110\alpha recombinante y [^{32}P]-PtdIns4P, generado mediante la conversión de PtdIns con membranas de A431 en presencia de NP-40 al 0,5%. Los glicerofosfoinositoles, generados mediante desacilación de lípidos con metilamina (Clarke y Dawson, 1981), se separaron mediante HPLC de intercambio aniónico en una columna PartisphereSAX (Whatman Internacional) usando un gradiente lineal de (NH_{4})_{2}HPO_{4} 1M frente a agua (0-25% B; 60 min) a 1 ml/min. Los picos de radiactividad se detectaron en un detector en línea (Reeve Analytical, Glasgow). Los patrones de nucleótidos ADP y ATP, añadidos como controles internos para asegurar la uniformidad entre los desarrollos, se detectaron mediante absorbancia a 254 nm.

Ensayo de fosforilación de proteínas in vitro y efecto sobre la actividad lípido cinasa

Las proteínas precipitadas se incubaron durante 30 min a 37ºC en tampón del ensayo de proteína cinasa (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, EGTA 0,5 mM, ATP 50 \muM y MnCl_{2}.4H_{2}O 1 mM, 5-10 \muCi de [\gamma-^{32}P]ATP/ml). La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de la muestra de SDS-PAGE y los productos de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía. El análisis de fosfoaminoácidos se realizó en un sistema de electroforesis en capa fina (CBS Scientific Co, Del Mar, CA) como se ha descrito (Jelinek y Weber, 1993).

Interacción de proteínas pequeñas que se unen a GTP con PI-3K in vitro

La unión de ras, rac y rho a GST-PI3K se realizó como se ha descrito (Rodriguez-Viciana y col., 1995, 1996).

Anticuerpos, inmunoprecipitaciones e inmunotransferencia

Se han descrito anticuerpos monoclonales frente a p85\alpha (U1, U13) y p85\beta (T15) (End y col., Reif y col., 1993). En nuestro laboratorio se desarrolló un anticuerpo monoclonal (I2) frente a p85\gamma bovina. Los anticuerpos policlonales de ratón frente a GST-p85\alpha humana (AA 5-321) fueron amablemente proporcionados por el Dr. P. Shepherd, del University College de Londres. Se obtuvieron antisueros policlonales de conejo frente a un péptido C-terminal de p110\delta (C)KVNWLAHNVSKDNRQ_{1044} y frente al péptido N-terminal de p110\alpha humana (CGG)SVTQEAEEREEFFDETRR_{88}. Para obtener anticuerpos dirigidos frente a la forma fosforilados de p110\delta, se fosforiló la secuencia peptídica 1044 en el resto de serina durante la síntesis del péptido. El Dr. Roya Hoshmand-Rad (Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Suecia) nos proporcionó amablemente un antisuero frente al C-terminal de la p110\alpha humana. Los anticuerpos se purificaron por afinidad a péptidos unidos a Actigel (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) o a gel AF-Amino ToyoPearl TSK (Tosho Co., Japón). Se encontró que los anticuerpos eran específicos de la PI3K a la que se dirigían (ensayado frente al siguiente panel de PI-3K, expresadas en células Sf9: p110\alpha bovina, p110\beta humana (C. Panaretou y R.S.; resultados sin publicar), p110\gamma humano (Stoyanov y col., 1995), p110\delta, PI3 cinasa específica (Volinia y col., 1995). Se purificaron células de sangre periférica en un gradiente de ficoll (Lymphoprep; Nycomed, Oslo, Noruega). El citosol de los neutrófilos se preparó mediante sonicación como se ha descrito (Wientjes y col., 1993). El tampón de lisis fue Tritón-X100 al 1%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, NaVO_{3} 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinina a 0,27 UIT/ml y leupeptina 10 \muM. En algunos experimentos, se añadieron disopropilfluorofosfato 1mM y clorhidrato de Na-p-tosil-L-lisina clorometilcetona 27 mM. El tampón de lisis usado para los experimentos de citocinas fue Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol al 10% (v/v), NP-40 al 1% (v/v), NaCl 150 mM, molibdato sódico 100 \muM, fluoruro sódico 500 \muM, ortovanadato sódico 100 \muM, EDTA 1 mM, PMSF 40 \mug/ml, aprotinina 10 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml, pepstatina 0,7 \mug/ml, DIFP 1 mM, TLCK 1 mM). Las células estimuladas con citocinas se sedimentaron y lisaron a 2 x 10^{7} células/ml como se ha descrito (Welham y Schrader, 1992) con la excepción de que los lisados se aclararon durante 5 min en una microfuga a 4ºC para análisis adicional. Las inmunoprecipitaciones se realizaron como se ha descrito (Welham y col., 1994a). El péptido receptor de PDGF (YpVPMLG) se conjugó con Actigel según las instrucciones del fabricante. El antisuero frente al C-terminal de p110\delta se usó tanto para las inmunoprecipitaciones como para inmunotransferencia. Para p110\alpha, se usaron antisueros frente a los extremos C y N-terminal para inmunoprecipitaciones y los análisis de inmunoelectroforesis, respectivamente.

El SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizaron como se ha descrito (Laemmli, 1970; Welham y Schrader, 1992; Welham y col., 1994a). Los anticuerpos se usaron para inmunotransferencia a las siguientes concentraciones: 4G10, anticuerpo monoclonal antifosfotirosina a 0,1 \mug/ml; anti-p110\alpha y p110\delta a 0,25 \mug/ml; anti-p85 a 1:4.000; anti-C-kit (Santa Cruz Biotechnology, sc-168) a 0,4 \mug/ml, anti-SHP (Santa Cruz Biotechnology, sc-280) a 0,1 \mug/ml y anti-IRS-2 (regalo del Dr. M. White, Joslin Diabetes Center, Boston, MA) a 1:1.000.

Tanto los anticuerpos de cabra anti-ratón como los anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako, Dinamarca) se usaron a una concentración de 0,05 \mug/ml. Las inmunotransferencias se desarrollaron usando el sistema ECL (Amersham). Las transferencias se cortaron en tiras y se incubaron de nuevos con una sonda como se ha descrito previamente (Welham y col., 1994a).

Inyección de macrófagos de ratón estimulados con CFS-1 con anticuerpos frente a p110\delta y p110\alpha

La línea celular de macrófagos murinos, BAC 1, se usó en los experimentos de microinyección de anticuerpos. Los anticuerpos policlonales frente a péptidos de p110\delta se dirigieron frente al péptido 1044 del extremo C-terminal (describo en p17 Materiales y procedimientos) o frente a la secuencia peptídica (C)R222KKATVFRQPLVEQPED_{238}. Los sueros policlonales se purificaron por afinidad antes de la microinyección y se usaron a una concentración de 0,5-5 mg/ml. El control de antisuero policlonal frente al péptido de la p110\alpha humana es como se describe en p17 de Materiales y procedimientos. Tras la microinyección, las células Bac1 se privaron del Factor estimulante de colonias 1 (CSF1) durante 24 horas. A continuación, los anticuerpos se inyectaron en células privadas de CSF1 y expuestos a CSF1 durante 10-15 minutos antes de la visualización del citoesqueleto de las células Bac1 microinyectadas con rodamina conjugada con faloidina (la preparación y visualización de las células es como se describió en Allen y col., 1997).

Estimulaciones de las células

La estimulación de las células con factores de crecimiento diferentes se realizó como se ha descrito (Welham y Schrader, 1992) con la excepción de que las células se resuspendieron a 2x10^{7}/ml en RPMI sin suero antes de las estimulaciones. Las IL3 e IL4 murinas sintetizadas químicamente fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Ian Clark-Lewis (University of British Columbia, Vancouver). El SCF murino recombinante se obtuvo de R & D Systems Europe (Abingdon, Oxon). La concentración de factores de crecimiento y la duración de la estimulación (2 minutos para SCF; 10 minutos para IL3 e IL4) se optimizaron previamente para obtener niveles máximos de fosforilación de tirosina de receptores y sustratos celulares. Estos fueron como sigue, IL3 a 10 \mug/ml (Welham y Schrader, 1992), IL4 a 10 \mug/ml (Welham y col., 1994a) y SCF a 50 ng/ml (M.J.W., observaciones sin publicar).

Análisis por inmunotransferencia del ARN total

Las inmunotransferencias del ARN poliA+ humano (Clontech) se hibridó con fragmento II de EcoRI marcado aleatoriamente del clon_{09.1} de pBluescript. A continuación, se realizaron la división en tiras y la incubación de nuevo usando las siguientes sondas: fragmento EcoRI-XhoI interno de 2,1 kb de la p110\alpha humana (Volinia y col., 1994) y el ADNc EcoRI-XhoI de 5 kb de la p110\beta humana (C. Panaretou; resultados sin publicar).

Usando los materiales y procedimientos descritos anteriormente, se pudieron obtener datos que describen la nueva lípido cinasa y, en particular, una PI3 cinasa que se ha denominado p110\delta. Ahora los datos en relación con esta cinasa se describirán con vistas a comparar p110\delta con otros miembros del grupo PI3 cinasa, comparando y contrastando de este modo sus características respectivas.

Resultados Clonación de p110\delta

Los cebadores degenerados basados en secuencias de aminoácidos conservados (GDDLRQD y FHI/ADFG) en el dominio cinasa de p110\alpha bovina y de la Vps34p de S. cerevisiae se usaron en las reacciones de RT-PCR con el ARNm de la leucemia humana de células T, MOLT4. Se obtuvo un ADNc parcial, homólogo pero diferente a otras PI3K humanas conocidas. Este fragmento de PCR se usó como sonda para analizar una biblioteca de monocitos U937 y para aislar el correspondiente clon de longitud completa (para detalles, véase Materiales y Procedimientos y la Figura 9). El análisis de secuencia reveló una potencial fase de lectura abierta, precedida de un codón de parada en fase. También se encontró que el potencial codón de inicio está en un contexto favorable para iniciar la traducción (Kozak, 1991). Esta fase de lectura abierta de 3.135 nucleótidos permite predecir una proteína de 1.044 aminoácidos con una masa molecular calculada de 119.417 daltons (Figura 1A). La comparación de la secuencia de aminoácidos con otras PI3K mostraba que esta proteína está más relacionada con la p110\beta humana (identidad total del 58%; Hu y col., 1993) y más lejanamente con la p110\alpha humana (identidad del 41%; Volinia y col., 1994), la p110\gamma humana regulada por la proteína G (identidad del 35%; Stoyanov y col., 1995) y el análogo humano de la Vps34p (identidad del 28%; Volinia y col., 1995). La nueva PI3K descrita aquí se indicará a continuación como p110\delta.

La comparación de la gráfica de puntos a alta rigurosidad (Figura 1B) muestra que p110\alpha, \beta y \delta son muy homólogas en la región de unión a p85 (AA 20-140 de p110\alpha; Dhand y col., 1994) así como en el dominio C-terminal (HR2) de la PI-cinasa (PIK) y en el centro catalítico (AA 519-final de p110\alpha, Zvelebil y col., 1996). Se encontró una región adicional de elevada homología de secuencia, que ocupa los AA 370-470 de p110\delta, entre el sitio de unión a p85 y HR2. Esta región contenía el denominado motivo distintivo HR3 (WxxxLxxxIxIxDLPR/KxAxL) que está conservada en todas las PI3K que unen p85 y en p110\gamma. El área más en el extremo N-terminal de diferencia de secuencia entre p110\alpha y p110\beta/\delta se superpone con la región definida en p110\alpha como suficiente para la unión a Ras (AA 133-314 en p110\alpha; Rodríguez-Viciana y col., 1996). En p110\delta se identificaron dos motivos estructurales adicionales. La primera es una región rica en prolina (Figura 1 B,C) para la que el modelado molecular indica que puede formar una hélice levógira de poliprolina de tipo II con el potencial para interaccionar con dominios SH3 (datos no mostrados). En la región correspondiente, p110\alpha y p110\beta carecen de prolinas cruciales que permiten un plegamiento similar. El segundo motivo es una región básica, dominio similar a la cremallera de leucina (bZIP), inmediatamente en el extremo C-terminal de HR3 (Figura 1B, C).Tanto p110\delta como en p110\beta presentan una región bZIP (y también la p110 de Drosophila (Leevers y col., 1997)), mientras que el componente básico de este dominio es menos prominente en p110\alpha (Figura 1C). El modelado de la región ZIP de p110\delta muestra que su ordenamiento de restos L/V/I se acomodan fácilmente a la formación de una estructura helicoidal que puede forman un complejo proteico dimérico en cremallera superhelicoidal (datos no mostrados).

P110\delta se une al adaptador p85 y a proteínas Ras

Para verificar la predicción hecha a partir de la comparación de la secuencia de aminoácidos de que p110\delta podría unirse a subunidades p85, p110\delta se expresó en células de insecto como una proteína de fusión con la glutatión-S-transferasa (GST), junto con baculovirus recombinantes que codifican p85\alpha, p85\beta o p85\gamma (esta última es una isoforma de la p85 bovina de 55 kDa homóloga a p55^{PIK}, p55\alpha y p58/AS53 (Pons y col., 1995; Inukai y col., 1996; Antonetti y col., 1996)). Como queda claro en la Figura 2A, todos los subtipos del adaptador p85 se purifican conjuntamente de forma eficaz con GST-p110\delta a partir de células coinfectadas.

Previamente, no se ha abordado la cuestión de si diferentes subunidades catalíticas de p110 de la clase I muestran in vivo unión preferente con diferentes proteínas adaptadoras p85. Usando un antisuero específico para p110\delta, se descubrió que tanto p85\alpha como p85\beta estaban presentes en los inmunoprecipitados de p110\delta a partir de diferentes glóbulos blancos (La Figura 2B muestra los datos de neutrófilos humanos; puede apreciarse que p85\gamma no se expresa en leucocitos). Se obtuvieron resultados similares para p110\alpha (datos no mostrados). En estos complejos inmunes, también se observó una proteína de 45 kDa reactiva con anticuerpos frente a p85\alpha (Figura 2B). Actualmente, no está clara la naturaleza de esta proteína, pero podría ser similar a una proteína de 45 kDa que se ha descrito previamente está presente en IP p85 y p110 de diversos tejidos (Pons y col., 1995).

Se ha demostrado que p110\alpha y p110\beta interaccionan con Ras-GTP (Kodaki y col., 1995; Rodríguez-Viciana y col., 1994 y 1996). La región requerida para esta interacción está entre los AA 133 y 314 de estas PI3K (Rodriguez-Viciana y col., 1996). A pesar de la relativamente baja conservación de secuencia con p110\alpha y p110\beta en esta región (Figura 1C); ciertos aminoácidos aparentemente críticos que están conservados en p110\delta interaccionan con Ras in vitro, de manera dependiente de GTP (Figura 2C).

p110\delta se une a ras, pero no a rac o rho

Se descubrió que la incubación de GST-p110\delta/p85\alpha retiene el ras de tipo natural unido a GTP o el ras V12 oncogénico (Figura 2C). Este no era el caso del ras unido con GDP, o con A38-ras, un mutante ras funcionalmente muerto. De forma similar que para p110\alpha, no pudo demostrarse la unión de rho y rac (datos no mostrados).

Actividad lípido cinasa de p110\delta

Cuando se ensayó en presencia de Mg2+, se encontró que p110\delta fosforilaba PtdIns, PtdIns4P y PtdIns(4,5)P_{2} (Figura 3A). El análisis por HPLC confirmó que estos lípidos estaban fosforilados en la posición D3 (Figura 3B). La preferencia de sustrato in vitro era PtdIns > PtdIns4P > PtdIns(4,5)P_{2} (datos no mostrados). La actividad lípido cinasa era menor en presencia de Mn^{2+} que en presencia de Mg^{2+} (ensayado para el intervalo de concentración de 0,25 a 16 mM, datos no mostrados). La actividad específica de p110\delta, aislada de células Sf9, era menor en un factor de 2-5 que la de p110\alpha (datos no mostrados). Estos datos en conjunto establecen que p110\delta es una PI3K de clase I genuina.

p110\delta no fosforila a p85 sino que se autofosforila

Se ha demostrado que la subunidad p85 es un sustrato de la subunidad catalítica de p110\alpha para una fosforilación dependiente de Mn^{2+} (Carpenter y col., 1993; Dhand y col., 1994). Por el contrario, GST-p110\delta no puede fosforilar a p85\alpha, p85\beta y p85\gamma expresadas conjuntamente en diversas condiciones in vitro (datos parciales mostrados en la Figura 4A; no se observaba actividad en presencia de Mg^{2+} o Mn^{2+}). p85\gamma carece de dominio SH3, y la ausencia de fosforilación en esta molécula por p110\delta va en contra de la posibilidad de que una interacción intermolecular del dominio SH3 de p85\alpha/\beta con la región rica en prolina de p110\delta bloquee la fosforilación eficaz de las moléculas de p85 por parte de p110\delta. Para excluir que p110\delta haya fosforilado ya por completo a p85 durante la expresión conjunta in vitro en células de insecto, se añadió p85\alpha exógena purificada a GST-p110\delta inmovilizada. Tras lavar el exceso de p85, se encontró que la p85 unida era fosforilada de forma eficaz por 110\alpha, pero una vez más no por p110\delta (datos no mostrados). Cuando la p110\delta sin marcar, formando complejo con 85\alpha o con p85\beta, se sometió a un ensayo cinasa in vitro en presencia de Mn2+, p110\delta se autofosforilaba (observe en la Figura 4B, que está actividad está en gran parte ausente en GST-p110\delta inmovilizada (Figura 4B). Esta fosforilación no se ha visto en complejos p110\alpha/p85, en los que una vez más se encontró que la p85 estaba fosforilada (Figura 4B). El análisis del ácido fosfoamino demostró que la fosforilación en p110\delta tenía lugar en la serina (Figura 4B). Se observó que tanto la fosforilación de p85 por p110\alpha como la autofosforilación de p110\delta dependían en gran parte de Mn^{2+}, con sólo una fosforilación muy débil en presencia de Mg^{2+} (datos no mostrados). La autofosforilación de p110\delta daba lugar a la reducción de la actividad lípido cinasa.

Para excluir la posibilidad de que la fosforilación observada de p110\delta fuera debida a una proteína cinasa precipitada conjuntamente, se generó un mutante de p110\delta defectuoso para la cinasa. Esto se hizo convirtiendo la arginina 894 en prolina en p110\delta, generando p110\delta-R894P. El resto de arginina mutado se localiza en el motivo conservado DRX_{3}NX_{12-13}DFG del dominio cinasa, que probablemente es parte del lazo catalítico como en las proteína cinasas (Taylor y col., 1992, Zvelebil y col., 1996). Se encontró que una mutación similar en la p110\alpha de bovino (R916P) anulaba completamente la actividad catalítica (Dhand y col., 1994). Como queda claro a partir de la Figura 4C, la p110\delta-R894P, expresada en células de insecto, no seguía estando fosforilada en los precipitados de p110\delta, lo que indicaba que esta última tenía de hecho capacidad de autofosforilación. De este modo, se encontró que la actividad lípido cinasa se perdida en p110\delta-R894P (datos no mostrados).

Se han producido antisueros policlonales frente a la forma fosforilada de p110\delta. La secuencia peptídica C-terminal 1.044 estaba fosforilada en el resto de serina 1.033 y se usó para inmunizar conejos. Los antisueros dirigidos frente al péptido fosforilado nos han permitido establecer que p110\delta está fosforilada in vivo y esta fosforilación se potencia tras la estimulación con citocina (resultados no mostrados).

Sensibilidad a fármacos de la actividad catalítica de p110\delta

Se encontró que las actividades lípido cinasa de p110\alpha y \delta mostraban una sensibilidad similar a la inhibición por wortmanina y LY294002 (Figura 5), con una CI_{50} de 5 nM (para wortmanina) o 0,5 \muM (para LY294002). Asimismo, la actividad de autofosforilación de p110\delta también se inhibía con la wortmanina en el intervalo de concentración nanomolar (datos no mostrados).

Distribución tisular de p110\delta

El patrón de expresión de p110\delta se investigó mediante análisis de inmunotransferencia del ARN poliA^{+} de tejidos humanos y se comparó con los de p110\alpha y p110\beta. Se encontró que una especie de ARNm único de aproximadamente 6 kb especialmente se expresaba mucho en poblaciones de glóbulos blancos, es decir, bazo, timo, y especialmente, en leucocitos de sangre periférica (esta última contiene todos los glóbulos blancos habiéndose retirado sólo la mayoría de los eritrocitos) (Figura 6). En algunos experimentos de inmunotransferencia de ARN total, también se observó un mensajero adicional para p110\delta de \sim5 kb (datos no mostrados). Se encontraron bajos niveles de expresión del ARN mensajero de p110\delta en la mayoría de los demás tejidos examinados, aunque es difícil excluir la posibilidad de que la contaminación de células sanguíneas sea la responsable de esta señal del ARNm de p110\delta. También se encontró que p110\alpha y p110\beta se expresaban en la mayoría de los tejidos examinados (Figura 6).

A continuación, se usaron anticuerpos específicos de p110\alpha y \delta para ensayar la expresión de estas PI3K a nivel proteico. Tras ensayar diferentes tejidos de rata, se encontró en el bazo y en el timo una proteína de 110 kDa reactiva con los anticuerpos frente a p110\delta , pero no en ninguno de los demás tejidos ensayados (Figura 7). Este patrón confirma en gran parte los datos del análisis de inmunotransferencia de ARN completo descrito anteriormente. También se encontró que p110\delta estaba presente tanto en glóbulos blancos primarios como en transformados, independientemente de su etapa de diferenciación (Figura 7). En los glóbulos blancos primarios, tanto las poblaciones de células linfoides como las mielóides eran positivas para p110\delta, mientras que las plaquetas no lo eran (Figura 7). Tanto las líneas celulares T (por ejemplo, Jurkat, HPB All) como B (por ejemplo, Raji, HFB1) expresaban p110\delta (Figura 7). La p110\delta de 110 kDa no se encontró en los fibroblastos Rat-1, NIH 3T3 y Swiss 3T3, en adenocarcinomas de colon LS174T y COLO 320HSR, carcinoma epidermóide A431, carcinoma endometrial ECC-1 y carcinoma de laringe HEp-2 (Figura 7) ni en células de ovario chino CHO, en la línea celular de cáncer de pulmón de células pequeñas POC, en células endoteliales de aorta porcina y bovina, en adenocarcinoma de mama MDA-MB-468 y músculo y en fibroblastos primarios humanos (datos no mostrados). En conclusión, parece que p110\delta se expresa selectivamente en leucocitos.

A diferencia de p110\delta, p110\alpha se encontró en la mayoría de los tejidos y células investigados, incluyendo a los glóbulos blancos (Figura 7).

Microinyección de anticuerpos policlonales anti-p110\delta en macrófagos murinos estimulados con CSF-1

La posible función de p110\delta se investigó adicionalmente mediante una serie de experimentos de microinyección de la línea celular de macrófago murina, BAc 1 con antisueros frente a p110\delta y p110\alpha. Antes de la microinyección, las células Bac1 estuvieron privadas de CSF1 durante 24 horas. La falta de CSF1 induce a las células a dividirse y a volverse móviles cuando posteriormente se exponen a CSF1. Los anticuerpos policlonales anti-p110\delta purificados mediante afinidad, se microinyectaron en células Bac1 privadas de CSF1 seguido de la exposición a CSF1 durante 10-15 minutos.

Las células Bac1 microinyectadas muestran alteraciones destacables en la morfología celular. Las ondulaciones normales de la membrana celular desaparecen y tiene lugar una retracción del citoplasma. El citoesqueleto de las células Bac 1 microinyectadas se visualizó usando un conjugado faloidina-rodamina y la figura 10 muestra un ejemplo representativo de estas células que muestran un ordenamiento del citoesqueleto desorganizado. La inyección de anti-p110\alpha no produce un efecto equivalente.

De manera interesante, se muestra un fenotipo similar mediante la expresión de la proteína pequeña rac de unión a GTP dominante negativa, N17RAC. Esto sugiere que p110\delta puede ser parte de la misma cascada de señalización que puede estar implicada en la organización del citoesqueleto y en la movilidad celular.

p110\delta está implicado en la señalización de citocinas

En leucocitos, se ha implicado a las PI3K que se unen a p85 en una amplia variedad de sucesos de señalización, incluyendo la señalización a través de citocinas y de receptores del complemento, intregrinas, receptores para Fc, receptores para el antígeno de las células B y T y sus moléculas accesorias, tales como CD28 (revisado por Stephens y col., 1993; Fry, 1994). Por tanto, está claro que una multitud de procesos de señalización podrían estar potencialmente ligados a p110\delta. Una cuestión crucial es si en las células tiene lugar la unión selectiva de p110\delta con los complejos de señalización/receptor mencionados anteriormente que también contienen otra PI3K de clase I, dado la observación de que diferentes p110 parecen estar formando complejos con las mismas isoformas de p85 (Figura 2B). Se abordó esta importante cuestión en el contexto de la transducción de señales de citocinas que funcionan en diversos tipos de leucocitos.

Diferentes familias de citocinas transducen señales a través de distintas clases de receptores que comparten gp130 o cadenas \beta o \gamma comunes, o a través de receptores con actividad tirosina cinasa intrínseca (revisado en Taga y Kishimoto, 1995). Mientras que no se ha recogido la activación de PI3K por la señalización de citocinas a través de gp130, se ha demostrado la activación de PI3K que se unen a p85 en respuesta a la señalización de citocinas a través de la cadena \beta común (por ejemplo, IL3), cadena \gamma común (por ejemplo, IL4) o a través de receptores tirosina cinasa (tales como C-kit, que se une al factor de células troncales (SCF)) (Wang y col., 1992; Gold y col., 1994). Se examinó la capacidad de IL3, IL4 y SCF para unirse a p110\delta y a p110\alpha en líneas celulares de leucocitos dependientes de citocinas. Se encontró que con los anticuerpos frente a p110\alpha y p110\delta precipitaba conjuntamente un patrón idéntico de proteínas que contenían fosfotirosina, específico de la citocina usada para la estimulación, (Figura 8, panel a). En las líneas celulares pre-B Ba/F3 y progenitor mielóide FD-6 que respondían a IL3 e IL4 (Figura 8A; no se muestran los datos de FD6), el tratamiento con IL3 inducía la aparición de IP p110\alpha/\delta de una proteína desconocida de 100 kDa y de la proteína tirosina fosfatasa de 70 kDa, SHP2 (Figura 8A, panel b). Mediante inmunotransferencia se demostró que la proteína de 170 kDa coprecipitada tras la estimulación con IL4 (Figura 8A, panel a) era IRS-2, el sustrato principal de fosforilación inducida por IL4 en estas células (dato no mostrado). La Figura 8B muestra los resultados de análisis similares en mastocitos MC/9. Tras la estimulación con SCF, los IP p110\alpha y p110\delta contenían una proteína fosforilada en tirosina de 100 kDa no identificada así como una proteína de 150 kDa identificada como c-kit, el receptor de SCF (Figura 8B, paneles a y b). Todos estos datos en conjunto indican que p110\alpha y p110\delta no muestran diferencias aparentes en su reclutamiento hacia diversos complejos receptores de citocinas activados. Además, la implicación en la señalización de citocinas de al menos dos miembros de la clase PI3K que se unen a p85 mostró una complicación no reconocida previamente de las rutas de traducción de señales en cascada de estos receptores de
citocinas.

Expresión de subunidades de la PI3·cinasa p110 en líneas celulares de melanoma murino y humano

La expresión de p110\delta se investigó adicionalmente en diversas línea celulares de melanoma humano y murino Una característica del melanoma es la naturaleza agresiva de la metástasis asociada con este cáncer. La posible implicación de p110\delta en la metástasis se investigó analizando la relativa abundancia de la proteína p110\delta en una gama de líneas celulares murinas y humanas. Se usaron inmunotransferencias para valorar los niveles de p110\alpha y \beta así como de p110\delta. Como control positivo de las inmunotransferencias murinas se uso una línea celular murina, J774. Se usaron melanocitos neonatales como control de la inmunotransferencia humana. La Tabla 1 indica que p110\alpha y \beta se expresan constitutivamente en ambas líneas celulares control y melanoma tanto de origen murino como humano. De manera interesante, la línea celular murina control J744 muestra niveles considerablemente reducidos de p110\delta cuando se comparan con las líneas celulares de melanoma murino.

Sin embargo, se encuentran niveles detectables de p110\delta en melanocitos neonatales humanos. Esto puede explicarse por la naturaleza de estas células humanas control. La expresión de p110\delta en estas células control puede explicarse por la relativamente reciente migración de estas células a la piel humana y, por tanto, estas células pueden presentar niveles residuales de p110\delta. Los melanocitos adultos residen prolongadamente en la piel y el nivel de p110\delta puede reducirse a niveles indetectables proporcional a su diferenciación final

Se ha descrito una nueva subunidad de la p110 humana, la p110\delta, que es parte de la familia de PI3 cinasa. p110\delta muestra un patrón de expresión restringido, acumulándose sólo a niveles significativos en poblaciones de glóbulos blancos y especialmente en leucocitos de sangre periférico. La naturaleza móvil de estas células nos ha llevado a proponer que este miembro de la familia de PI3 cinasas puede estar implicado en la regulación de la movilidad de las células a través de la reorganización del citoesqueleto. Los datos relativos a las líneas celulares de melanoma murino y humano son interesante pero no concluyentes en los que respecta a los melanomas humanos. El uso de biopsias de tejido de melanocitos humanos normales y de melanomas humanos nos permitirá determinar esto.

TABLA 1

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Referencias

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Claims (26)

1. Un polipéptido aislado que se autofosforila caracterizado porque dicho polipéptido está representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 en el que dicho polipéptido es capaz de asociación con al menos un polipéptido adaptador p85 de mamífero.

3. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 ó 2 en el que dicho polipéptido se caracteriza por un dominio rico en prolina.

4. Un polipéptido aislado según la reivindicación 3 en el que dicho dominio rico en prolina idealmente está en la posición 292-311 de los datos de secuencia proteica mostrados en la Figura 1A pero que puede estar en un sitio homólogo en una PI3 cinasa equivalente.

5. Un polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el que dicho polipéptido es de origen mamífero.

6. Un polipéptido aislado según la reivindicación 5 en el que dicho polipéptido es de origen humano.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido representado por la secuencia de aminoácidos de la Figura 1A, o una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con la molécula de ácido nucleico mostrada en la Figura 9 y que codifica un polipéptido que se autofosforila que tiene actividad PI3 cinasa.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7 en la que la secuencia de ácido nucleico es ADNc o ADN genómico.

9. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7 u 8 en la que dicha molécula es un vector recombinante clonado.

10. Una molécula de ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en la que dicha molécula, o parte de la misma, se adapta para la expresión recombinante del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

11. Una célula hospedadora, transfectada o transformada usando el ácido nucleico según la reivindicación 9 ó 10 en la que dicha molécula de ácido nucleico dirige la síntesis recombinante de un polipéptido completo o de una parte según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Una línea celular hospedadora según la reivindicación 11 en la que dicha línea celular es una línea celular de insecto.

13. El uso del polipéptido expresado de forma recombinante según la reivindicación 10 o del polipéptido aislado según cualquiera de las Reivindicaciones 1-6 para la producción de anticuerpos frente a un polipéptido representado por la secuencia de aminoácidos de la Figura 1A.

14. Un anticuerpo, o parte del mismo, en el que dicho anticuerpo se une al menos a parte del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

15. Un procedimiento diagnóstico para la identificación de la expresión específica de tejido del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende determinar la presencia del polipéptido relevante y/o del ARNm y/o del ADNc, o de ambos, que codifican el mismo, en una muestras de células.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15 en el que dicho procedimiento comprende la unión de al menos dos moléculas de ácido nucleico cebadoras adaptadas para hibridar con al menos una parte seleccionada de la molécula de ácido nucleico de la invención al dicho ADNc.

17. Un procedimiento según la reivindicación 15 ó 16 en el que dicho procedimiento comprende proporcionar las condiciones para amplificar y purificar al menos una parte de dicha molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7-10 usando dichos cebadores.

18. Un procedimiento según la reivindicación 15 en el que dicho procedimiento comprende usar un anticuerpo según la Reivindicación 14 para la detección de dicho polipéptido en el que dicho uso implica ELISA, inmunotransferencia, inmunoprecipitación o inmunofluorescencia.

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19. Un procedimiento para identificar agentes eficaces para modular la actividad cinasa del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende exponer el polipéptido, in vitro, a agentes que puedan tener efectos moduladores y, a continuación, observar la actividad cinasa de dicho polipéptido.

20. Un procedimiento según la reivindicación 19 en el que se analizan agentes potencialmente antagonistas usando modelización asistida por ordenador o técnicas convencionales de laboratorio.

21. Un procedimiento según las reivindicaciones 19 ó 20 en el que las células que expresan el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 se exponen a antagonistas potenciales y se monitoriza la movilidad de dichas células.

22. Una composición farmacéutica/veterinaria que comprende un anticuerpo eficaz para modular la actividad del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

23. Una composición farmacéutica/veterinaria según la reivindicación 22 que opcionalmente también incluye un diluyente, vehículo o excipiente y/o está en forma de dosificación monodosis.

24. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o del anticuerpo según la reivindicación 14, para la fabricación de una composición para su uso en el control de la movilidad de las células.

25. Una composición farmacéutica/veterinaria que comprende un oligonucleótido no codificante adaptado para hibridar con una molécula de ácido nucleico como la representada por la secuencia de ácido nucleico de la Figura 9.

26. Una composición según la reivindicación 25 en la que dicho oligonucleótido no codificante comprende nucleótidos modificados.