DE69830143T2

DE69830143T2 - Phosphodiesterase 8

Info

Publication number: DE69830143T2
Application number: DE69830143T
Authority: DE
Inventors: Kate Loughney
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2018-10-17
Also published as: AU1097499A; NO992916L; IL130287A; ATE295423T1; US6566087B1; US20030215919A1; NO992916D0; IL130287A0; IL175698A0; US5932465A; CN1800399A; ES2245485T3; US6133007A; RU2005136013A; RU2272841C2; EP0944725A1; CN1248291A; EP0944725B1; WO1999019495A1; BR9806318A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Familie von Phosphodiesterasen, die als PDE8 bezeichnet werden und deren Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Phosphodiesterasen (PDE) hydrolysieren 3',5'-cyclische Nucleotide zu deren entsprechenden Nucleotid-5'-monophosphaten. Die cyclischen Nucleotide cAMP und cGMP werden durch Adenylyl- bzw. Guanylylcyclasen synthetisiert und dienen als zweite Boten in einer Vielzahl von Zell-signalgebenden Pathways. Die Dauer und Stärke des zweiten Botensignals ist eine Funktion der Synthesegeschwindigkeit und der Hydrolysegeschwindigkeit des cyclischen Nucleotids.
Mehrfachfamilien von PDE wurden identifiziert. Das Nomenklatursystem schließt zuerst eine Zahl ein, die die PDE-Familie ausweist. Bis jetzt sind sieben Familien (PDE1-7) bekannt, die eingeteilt werden durch: (i) Primärstruktur; (ii) Substratbevorzugung; (iii) Reaktion auf verschiedene Modulatoren; (iv) Empfindlichkeit auf spezifische Inhibitoren; und (v) Arten der Regulierung [Loughney und Ferguson, in Phosphodiesterase Inhibitors, Schudt, et al. (Hrsg.), Academic Press: New York, N.Y. (1996) Seiten 1–19]. Die Zahl, die die Familie anzeigt, wird von einem großen Buchstaben gefolgt, der ein bestimmtes Gen anzeigt, und dem großen Buchstaben folgt eine zweite Zahl, die die spezifische Spleißvariante oder ein spezifisches Transkript anzeigt, welches eine einzigartige Transkriptionsstartstelle nutzt.
Die Aminosäuresequenzen von allen Säuger-PDE, die bis jetzt identifiziert sind, schließen einen stark konservierten Bereich von ungefähr 270 Aminosäuren ein, die in der Carboxyterminalen Hälfte des Proteins angeordnet sind [Charbonneau, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 9308–9312 (1986)]. Die konservierte Domäne schließt die katalytische Stelle für cAMP und/oder cGMP Hydrolyse und zwei putative Zinkbindungsstellen sowie die familienspezifischen Determinanten ein [Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–748 (1995); Francis, et al., J. Biol. Chem. 269: 22477–22480 (1994)]. Die Amino-terminalen Regionen der verschiedenen PDE sind sehr variabel und schließen eine weitere Familie von spezifischen Determinanten ein, wie: (i) Calmodulinbindungsstellen (PDE1); (ii) nicht-katalytische cyclische GMP-Bindungsstellen (PDE2, PDE5, PDE6); (iii) Membran-Target-Stellen (PDE4); (iv) hydrophobe Membranbindungsstellen (PDE3); und (v) Phosphorylierungsstellen für entweder die Calmodulin-abhängige Kinase II (PDE1), die cAMP-abhängige Kinase (PDE1, PDE3, PDE4) oder die cGMP-abhängige Kinase (PDE5) [Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–748 (1995); Manganiello, et al., Arch. Biochem. Acta 322: 1–13 (1995); Conti, et al., Physiol. Rev. 75: 723–748 (1995)].
Mitglieder der PDE1-Familie werden durch Calcium-Calmodulin aktiviert. Drei Gene wurden identifiziert; PDE1A und PDE1B hydrolysieren bevorzugt cGMP, während von PDE1C gezeigt wurde, dass es eine hohe Affinität für sowohl cAMP als auch cGMP zeigt. Die PDE2-Familie wird als spezifisch durch cGMP [Loughney and Ferguson, vorstehend] stimuliert charakterisiert. Nur ein Gen wurde identifiziert, PDE2A, dessen Enzymprodukt speziell durch Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenin (EHNA) inhibiert wurde. Enzyme in der PDE3-Familie werden speziell durch cGMP inhibiert. Zwei Gene sind bekannt, PDE3A und PDE3B, beide haben hohe Affinität für sowohl cAMP als auch cGMP, obwohl das V_max für die cGMP-Hydrolyse niedrig genug ist, dass cGMP als ein Konkurrenzfaktor für cAMP-Hydrolyse wirkt. PDE3-Enzyme werden spezifisch durch Milrinone und Enoximone [Loughney und Ferguson, vorstehend] inhibiert. Die PDE4-Familie bewirkt cAMP-Hydrolyse und schließt vier Gene ein, PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D, wobei jede mehrfache Spleißvariante aufweist. Die Mitglieder dieser Familie werden spezifisch durch den Antidepressivumarzneistoff Rolipram inhibiert. Mitglieder der PDE5-Familie binden cGMP an nichtkatalytische Stellen und hydrolysieren bevorzugt cGMP. Nur ein Gen, PDE5A, wurde identifiziert. Die Photorezeptor-PDE6-Enzyme hydrolysieren spezifisch cGMP [Loughney und Ferguson, vorstehend]. Gene schließen PDE6A und PDE6B ein (die Proteinprodukte davon dimerisieren und binden zwei Kopien einer kleineren γ-Inhibitoruntereinheit, unter Bildung von Stab-PDE), zusätzlich zu PDE6C, das mit den drei kleineren Proteinen, unter Bildung von Kegel-PDE assoziiert. Die PDE7-Familie bewirkt cAMP-Hydrolyse, jedoch im Gegensatz zu der PDE4-Familie, wird sie nicht durch Rolipram inhibiert [Loughney und Ferguson, vorstehend]. Nur ein Gen, PDE7A, wurde identifiziert.
Angesichts der Wichtigkeit von cAMP und cGMP beim interzellulären zweiten Botensignalgeben, gibt es einen zwingenden Bedarf auf dem Fachgebiet zum Identifizieren von Additions-PDE-Spezies. Die Identifizierung von bislang unbekannten Familien von PDE und Genen und Spleißvarianten davon liefert zusätzliche pharmakologische Ansätze zum Behandeln von Zuständen, worin cyclische Nucleotidpathways abweichen, sowie Bedingungen, worin die Modulierung von intrazellulären cAMP- und/oder cGMP-Spiegeln in bestimmten Zelltypen erwünscht ist.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide und darunter liegende Polynucleotide für eine neue PDE-Familie, die PDE8 bezeichnet wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein PDE8-Polypeptid bereitgestellt, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 ausgewiesen ist, umfasst, ein PDE8-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 4 ausgewiesen ist, umfasst, ein PDE8-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 ausgewiesen ist, umfasst, und Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren. Die Erfindung schließt sowohl natürlich vorkommende als auch nicht natürlich vorkommende PDE8-Polynucleotide und Polypeptidprodukte davon ein. Die natürlich vorkommenden PDE8-Produkte schließen verschiedene Gen- und Polypeptidspezies innerhalb der PDE8-Familie ein (d.h., PDE8A); diese Arten schließen jene ein, die innerhalb von Zellen des gleichen Tiers und sowie entsprechende Spezies exprimiert werden, wobei Homologe in Zellen von anderen Tieren exprimiert werden. Innerhalb jeder PDE8-Spezies offenbart die Erfindung weiterhin Spleißvarianten, die durch das gleiche Polynucleotid codiert werden, die jedoch aus verschiedenen mRNA-Transkripten entstehen (d.h., PDE8A1 und PDE8A2). Nicht natürlich vorkommende PDE8-Produkte schließen Varianten von natürlich vorkommenden Produkten, wie Analogen (d.h., worin eine oder mehrere Aminosäuren addiert, substituiert oder entfernt werden), ein, und jene PDE8-Produkte, die kovalente Modifizierungen einschließen (d.h., Fusionsproteine, Glycolsylierungsvarianten, Met^–1PDE8s, Met^–2-Lys^–1-PDE8s, Gly^–1PDE8s und dergleichen). Die PDE8-Familie wird von den vorher bekannten PDE-Familien beim Aufzeigen von hoher Affinität für die Hydrolyse von sowohl cAMP als auch cGMP, jedoch durch relativ niedrige Empfindlichkeit auf Enzyminhibitoren, die für andere PDE-Familien spezifisch sind, unterschieden. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polynucleotid bereit, das die in SEQ ID NO: 1 ausgewiesene Sequenz umfasst. Die Erfindung umfasst auch Polynucleotide, die die in SEQ ID NO: 2 ausgewiesene Aminosäuresequenz codiert. Ein gegenwärtig bevorzugtes Polypeptid der Erfindung umfasst die in SEQ ID NO: 2 ausgewiesene Aminosäuresequenz. Die Erfindung offenbart zwei Spleißvarianten, cDNA, die zwei Polypeptide ergeben, die als PDE8A1 und PDE8A2 bezeichnet werden. PDE8A1- und PDE8A2-Polypeptide und die Polynucleotide, die die Polypeptide codieren, werden hierin als Vertreter der PDE8-Enzymfamilie offenbart, die durch die Erfindung umfasst werden.
Die vorliegenden Erfindung offenbart neue gereinigte und isolierte Polynucleotide (beispielsweise DNA-Sequenzen und RNA-Transkripts, sowohl Sense- als auch komplementäre Antisensestränge, einschließlich Spleißvarianten davon), die die Human-PDE8 codieren. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen schließen genome und cDNA-Sequenzen sowie vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ein. "Synthetisiert", wie hierin verwendet und auf dem Fachgebiet verstanden, bezieht sich auf rein chemische, gegenüber enzymatischen, Verfahren zum Herstellen von Polynucleotiden. "Vollständig" synthetisierte DNA-Sequenzen werden deshalb ganz mit chemischen Mitteln hergestellt, und "teilweise" synthetisierte DNA umfassen jene, die nur durch Anteile der sich ergebenden DNA mit chemischen Mitteln hergestellt wurden. Eine bevorzugte DNA-Sequenz, die ein humanes PDE8-Polypeptid codiert, wird in SEQ ID NO: 1 ausgewiesen. Bereitgestellt durch die Erfindung werden Polynucleotide, die das PDE8-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und die PDE8A1- und PDE8A2-Spleißvarianten-Polypeptide, ausgewiesen in SEQ ID NUMMERN: 6 bzw. 4, codieren. Bevorzugte Polynucleotide, die PDE8A1 und PDE8A2 codieren, werden in SEQ ID NUMMERN: 5 bzw. 3 ausgewiesen. Die Erfindung umfasst weiterhin Arten, vorzugsweise Säuger, Homologe von der humanen PDE8-DNA.
Die Erfindung umfasst auch DNA-Sequenzen, die PDE8-Spezies codieren, welche unter moderat stringenten Bedingungen an die nicht codierenden Stränge hybridisieren, oder Komplementäre der Polynucleotide in SEQ ID NUMMERN: 1, 3 und 5. DNA-Sequenzen codieren PDE8A-Polypeptide, die daran hybridisieren würden, jedoch für die Redundanz des genetischen Code auch betrachtet werden. Beispielhafte moderate Hybridisierungsbedingungen sind wie nachstehend: Hybridisierung bei 65°C in 3 × SSC, 0,1% Sarkosyl, und 20 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und Waschen bei 65°C in 2 × SSC mit 0,1 × SDS. Es wird auf dem Fachgebiet verständlich, dass Bedingungen von äquivalenter Stärke auch durch Variation von Temperatur und Puffer, oder Salzkonzentration, wie von Ausebel, et al. (Hrsg.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), Seiten 6.0.3 bis 6.4.10, beschrieben, erreicht werden können. Modifizierungen bei den Hybridisierungsbedingungen können empirisch bestimmt oder genau berechnet werden, bezogen auf die Länge und den Prozentsatz von Guanosin/Cytosin-(GC)-Basenpaarung der Sonde. Die Hybridisierungsbedingungen können, wie in Sambrook, et al., (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Seiten 9.47 bis 9.51, beschrieben, berechnet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionskonstrukt bereitgestellt, das ein Polynucleotid der Erfindung umfasst, insbesondere werden autonom replizierte rekombinante Expressionskonstrukte, wie Plasmid und virale DNA-Vektoren, einarbeitende PDE8-Sequenzen, offenbart. Expressionskonstrukts, worin PDE8-codierende Polynucleotide operativ an eine endogene oder exogene Expressionskontroll-DNA-Sequenz und einen Transkriptionsterminator gebunden sind, werden auch offenbart.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Wirtszellen bereitgestellt, die mit einem Polynucleotid oder Expressionskonstrukt der Erfindung transformiert oder transfiziert sind. Insbesondere sind Wirtszellen, die prokaryotische und eukaryotische Zellen einschließen, entweder stabil oder transient transformiert mit DNA-Sequenzen der Erfindung, in einer Weise, die Expression von PDE8-Polypeptiden der Erfindung erlaubt. Die Wirtszellen der Erfindung sind eine wertvolle Quelle für Immunogen zur Entwicklung von Antikörpern, die besonders immunoreaktiv mit PDE8 sind. Die Wirtszellen der Erfindung sind auch in Verfahren mit industriellem Maßstab von PDE8-Polypeptiden, wo die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium angezogen werden, und die gewünschten Polypeptidprodukte aus den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen angezo gen wurden, beispielsweise durch Immunoaffinitätsreinigung, isoliert werden, hervorragend verwendbar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines PDE8-Polypeptids bereitgestellt, umfassend die Schritte von: a) Anziehen der Wirtszelle der Erfindung unter für die Expression des PDE8-Polypeptids geeigneten Bedingungen und Isolieren des PDE8-Polypeptids aus der Wirtszelle aus dem Medium seines Wachstums.
Das Wissen von PDE8-DNA-Sequenzen erlaubt die Modifizierung von Zellen und erhöht Expression von endogenem PDE8. Zellen können modifiziert werden (beispielsweise durch homologe Rekombination), unter Bereitstellung von erhöhter PDE8-Expression durch Ersetzen, insgesamt oder zum Teil, des natürlich vorkommenden PDE8-Promotors, mit allem oder einem Teil eines heterologen Promotors, sodass die Zellen PDE8 bei höheren Anteilen exprimieren. Der heterologe Promotor wird in einer solchen Weise inseriert, dass er operativ an PDE8-codierende Sequenzen gebunden ist. Siehe beispielsweise PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/12650, PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/20808 und PCT Internationale Veröffentlichung Nr. 91/09955. Die Erfindung erwägt auch, dass, zusätzlich zu der heterologen Promotor-DNA, vergrößerbare Marker-DNA (beispielsweise ada, dhfr, und das multifunktionelle CAD-Gen, die Carbamylphosphatsynthase, Aspartattranscarbamylase und Dihydroorotase codieren) und/oder Intron-DNA, zusammen mit der heterologen Promotor-DNA, inseriert werden können. Wenn an die PDE8-codierende Sequenz gebunden, ergibt Vergrößerung der Marker-DNA durch Standardauswahlverfahren eine gemeinsame Vergrößerung der PDE8-codierenden Sequenzen in den Zellen.
Die DNA-Sequenzinformation, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, ermöglicht es auch, durch beispielsweise homologe Rekombination oder "knock-out"-Strategien [Capecchi, Science 244: 1288–1292 (1989)], von Tieren, die keine funktionelle PDE8 exprimieren oder die eine Variante von PDE8 exprimieren. Solche Tiere sind als Modelle zum Untersuchen der In-vivo-Aktivitäten von PDE8 und Modulatoren von PDE8 verwendbar.
Die Erfindung betrifft auch gereinigte und isolierte Säuger-PDE8-Polypeptide. Gegenwärtig bevorzugte PDE8A-Polypeptide werden in SEQ ID NUMMERN: 4 und 6 ausgewiesen. Besonders bevorzugt ist ein PDE8-Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 2 ausgewiesene Aminosäuresequenz umfasst. PDE8-Polypeptide der Erfindung können aus natürlichen Zellquellen isoliert werden oder können chemisch synthetisiert werden, werden jedoch vorzugsweise durch rekombinante Verfahren, die die erfindungsgemäßen Wirtszellen beinhalten, hergestellt. Es wird erwartet, dass die Anwendung von Säugerwirtszellen solche Post-translational-Modifizierungen (beispielsweise Glycosylierung, Trunkierung, Lipidierung und Phosphorylierung) bereitstellt, wie sie benötigt werden können, um optimale biologische Aktivität auf die rekombinanten Expressionsprodukte der Erfindung zu übertragen. PDE8-Produkte der Erfindung können Volllängenpolypeptide, biologisch aktive Fragmente oder Varianten davon sein, die spezifische PDE8-biologische Aktivität beibehalten. Varianten können PDE8-Polypeptidanaloge umfassen, worin eine oder mehrere der ausgewiesenen (d.h., natürlich codierten) Aminosäuren deletiert oder ersetzt wird/werden oder worin eine oder mehrere nicht-spezifizierte Aminosäuren hinzugefügt werden: (1) ohne Verlust von einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten oder immunologischen Eigenschaften, die für PDE8 spezifisch sind; oder (2) mit spezifischer Unfähigkeit von einer besonderen biologischen Aktivität von PDE8.
Variantenprodukte schließen reife PDE8A-Produkte ein; d.h., PDE8-Produkte, worin Führungs- oder Signalsequenzen entfernt werden, mit zusätzlichen Amino-terminalen Resten. PDE8-Produkte mit einem weiteren Methioninrest in Position -1 (Met^-1-PDE8) sind denkbar als PDE8-Produkte mit zusätzlichen Methionin- und Lysinresten in Positionen -2 und -1 (Met^-2-Lys^-1-PDE8).
Varianten dieser Arten sind besonders verwendbar für die rekombinante Proteinproduktion in bakteriellen Zelltypen.
Die Erfindung umfasst auch PDE8-Varianten mit zusätzlichen Aminosäureresten, die sich aus der Verwendung von spezifischen Expressionssystemen ergeben. Beispielsweise stellt die Verwendung von kommerziell erhältlichen Vektoren, die ein gewünschtes Polypeptid, wie Glutathion-S-Transferase-(GST)-Fusionsprodukt, exprimieren, das gewünschte Polypeptid mit einem zusätzlichen Glycinrest in Position -1 im Ergebnis der Spleißung der GST-Komponente von dem gewünschten Polypeptid bereit. Varianten, die sich aus der Expression in andere Vektorsysteme ergeben, sind auch denkbar.
Die Erfindung umfasst weiterhin PDE8-Produkte, die modifiziert sind, um eine oder mehrere in Wasser lösliche Polymerbindungen einzuschließen. Besonders bevorzugt sind PDE8-Produkte, die kovalent mit Polyethylenglycol-(PEG)-Untereinheiten modifiziert sind. In Wasser lösliche Polymere können an speziellen Positionen gebunden sein, beispielsweise an dem Aminoterminus von den PDE8-Produkten, oder an eine oder mehrere Seitenketten des Polypeptids statistisch gebunden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper (beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, Einketten-Antikörper, Chimäre Antikörper, CDR-gepfropfte Antikörper und dergleichen) und andere Bindungsproteine, die für PDE8-Produkte oder Fragmente davon spezifisch sind. Spezifische Bindungsproteine können unter Anwendung von isolierten oder rekombinanten PDE8-Produkten, PDE8-Varianten, oder solche Produkte exprimierende Zellen, entwickelt werden. Bindungsproteine sind zum Reinigen von PDE8-Produkten und Nachweis oder Quantifizierung von PDE8-Produkten in Fluid- und Gewebsproben, unter Anwendung von bekannten immunologischen Verfahren, verwendbar. Bindungsproteine sind auch beim Modulieren (d.h., Blockieren, Inhibieren oder Stimulieren) biologischer Aktivitäten von PDE8, insbesondere jener Aktivitäten, die in Signalweiterleitung einbezogen sind, besonders verwendbar. Anti idiotypische Antikörper, die für Anti-PDE8-Antikörper spezifisch sind, sind auch denkbar, sowie Hybridoma, die Anti-PDE8-Antikörper der Erfindung sekretieren.
Der wissenschaftliche Wert der Information, die durch die Offenbarungen von DNA- und Aminosäuresequenzen der Erfindung beigetragen wird, ist wesentlich. Als eine Reihe von Beispielen macht das Wissen der Sequenz von cDNA für PDE8A die Anwendung von Southern-Hybridisierung oder Polymerasekettenreaktion (PCR) die Identifizierung von genomen DNA-Sequenzen, die PDE8- und PDE8-Expressionskontroll-regulatorische Sequenzen, wie Promotoren, Operatoren, Verstärker, Repressoren und dergleichen, codieren, möglich. DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter moderat bis sehr stringenten Bedingungen ausgeführt werden, werden gleichfalls erwartet, die Isolierung von DNA, die allelische Varianten von PDE8A codieren, zu erlauben; wobei allelische Varianten auf dem Fachgebiet bekannt sind, dass sie strukturell verwandte Proteine einschließen, die eine oder mehrere der biochemischen und/oder immunologischen Eigenschaften, die für PDE8A spezifisch sind, teilen. In ähnlicher Weise können nicht-humane Spezies Gene, die Proteine, homolog zu PDE8A, codieren, auch durch Southern- und/oder PCR-Analyse identifiziert werden. Als eine Alternative können Komplementärstudien zum Identifizieren von anderen humanen PDE8-Produkten sowie nicht-humanen Proteinen, und DNA, die die Proteine codieren, eine oder mehrere biologische Eigenschaften von PDE8A teilen, nützlich sein.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide sind bei Hybridisierungsassays zum Nachweisen der Kapazität von Zellen zum Exprimieren von PDE8 verwendbar. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können auch auf der Grundlage von Diagnoseverfahren, die zum Identifizieren von einer genetischen Veränderungen) in einem PDE8-Ort, der einem Erkrankungszustand oder -zuständen unterliegt, verwendbar sein.
Auch durch die Erfindung zugänglich gemacht, werden Anti-Sense-Polynucleotide, die Polynucleotide, die PDE8 codieren, erkennen und hybridisieren. Volllängen- und Fragment-Anti-Sense-Polynucleotide werden bereitgestellt. Anti-Sense-Polynucleotide sind zum Regulieren der Expression von PDE8 durch jene Zellen, die PDE8 mRNA exprimieren, besonders relevant.
Die DNA- und Aminosäuresequenzinformation, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, machen auch die systematische Analyse der Struktur und Funktion von PDE8 möglich. DNA- und Aminosäuresequenzinformation für PDE8 erlauben auch Identifizierung von Molekülen, mit denen PDE8A in Wechselwirkung treten wird. Mittel, die die PDE8-Aktivität modulieren (d.h., erhöhen, senken oder blockieren), können durch Inkubieren eines putativen Modulators mit PDE8 und Bestimmen der Wirkung des putativen Modulators auf die PDE8-Phosphodiesteraseaktivität identifiziert werden. Die Selektivität einer Verbindung, die die Aktivität des PDE8 moduliert, kann durch Vergleich seiner Aktivität an dem PDE8 zu seiner Aktivität an anderen PDE-Enzymen bewertet werden. Zell-basierende Verfahren, wie Dihybridassays und Spleißhybridassays, sowie Invitro-Verfahren, einschließlich Assays, worin ein Polypeptid oder sein Bindepartner immobilisiert werden, und Lösungsassays sind denkbar.
Selektive Modulatoren können beispielsweise Antikörper und andere Proteine oder Peptide einschließen, die spezifisch an die PDE8 oder PDE8-Nucleinsäure binden, Oligonucleotide, die spezifisch an die PDE8 oder PDE8-Nucleinsäure binden, und andere Nicht-Peptidverbindungen (beispielsweise isolierte oder synthetische organische Moleküle), die spezifisch mit PDE8 oder PDE8-codierender Nucleinsäure reagieren. Mutantenformen von PDE8, die die enzymatische Aktivität oder Zelllokalisierung des Wildtyp-PDE8 beeinflussen, sind auch denkbar. Gegenwärtig bevorzugte Ziele für die Entwicklung von selektiven Modulatoren schließen beispielsweise ein: (1) Regionen der PDE8, die mit anderen Proteinen in Kontakt treten und/oder die PDE8 innerhalb einer Zelle lokalisieren, (2) Regionen der PDE8, die Substrat binden, (3) allosterische cyclische Nucleotid-Bindungsstelle(n) von PDE8, (4) Phosphorylierungsstelle(n) von PDE8, und (5) Regionen der PDE8, die in die Vervielfachung von PDE8-Untereinheiten einbezogen sind. Modulatoren von PDE8-Aktivität können bei der Behandlung eines breiten Bereichs von Erkrankungen und physiologischen Zuständen, worin PDE-Aktivität bekanntlich einbezogen ist, therapeutisch nützlich sein.
Die Erfindung sieht weiterhin kleine Molekülmodulatoren von PDE8A-Enzymaktivität vor. Es gibt mindestens drei verschiedene Arten von für die Identifizierung von kleinen Molekülmodulatoren verwendeten Libraries. Diese schließen ein: (1) chemische Libraries; (2) natürliche Produktlibraries und (3) kombinatorische Libraries, die statistische Peptide, Oligonucleotide oder organische Moleküle umfassen.
Chemische Libraries bestehen aus Strukturanalogen von bekannten Verbindungen oder Verbindungen, die als „hits" oder „leads" über natürliches Produktscreening identifiziert sind. Natürliche Produktlibraries sind Sammlungen von Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen oder Meeresorganismen, die verwendet werden, um Gemische zum Screening zu erzeugen durch: (1) Fermentierung und Extraktion von Brühen aus Boden-, Pflanzen- oder Meeresorganismen, oder (2) Extraktion von Pflanzen oder Meeresorganismen. Kombinatorische Libraries sind aus großer Anzahl von Peptiden, Oligonucleotiden oder organischen Verbindungen als ein Gemisch zusammengesetzt. Sie sind relativ leicht durch herkömmliche automatisierte Syntheseverfahren, PCR-, Klonierungs- oder proprietäre Syntheseverfahren herzustellen. Von besonderem Interesse sind Peptid- und Oligonucleotid-kombinatorische Libraries. Weitere andere Libraries von Interesse schließen Peptid-, Protein-, Peptid-nachahmende, multiparallele synthetische Sammlung-, rekombinatorische und Polypeptidlibraries ein. Für eine Übersicht von kombinatori scher Chemie und Libraries, die daraus erzeugt wurden, siehe Myers, Curr. Opion. Biotechnol. 8: 701–707 (1997).
Die Identifizierung von Modulatoren durch die Verwendung von verschiedenen, hierin beschriebenen Libraries erlaubt die Modifizierung des Kandidaten „hit" (oder „lead"), um die Kapazität des „hit" zur Modulierung der Aktivität zu optimieren.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Bindepartnerverbindung eines erfindungsgemäßen PDE8-Polypeptids bereit, umfassend die Schritte von: a) in Kontakt bringen eines PDE8-Polypeptids der Erfindung mit einer Verbindung unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE8-Polypeptid ermöglichen; b) Nachweisen einer Bindung der Verbindung an das PDE8-Polypeptid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindepartner des PDE8-Polypeptids. Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren ausgewiesenen Bindepartner modulieren vorzugsweise PDE8-Enzymaktivität, entweder durch Inhibierung oder Aktivierung, oder Verstärkung des Enzyms.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen Bindepartnerverbindung eines PDE8-Polynucleotids der Erfindung bereit, umfassend die Schritte von: a) in Kontakt bringen eines PDE8-Polynucleotids der Erfindung mit einer Verbindung unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE8-Polynucleotid ermöglichen; b) Nachweisen der Bindung der Verbindung an das PDE8-Polynucleotid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindepartner des PDE8-Polynucleotids. Der Bindepartner des PDE8-Polynucleotids moduliert vorzugsweise die Expression des PDE8-Polypeptids, das durch das PDE8-Polynucleotid codiert; entweder durch Inhibieren der Expression oder Verstärken der Expression.
Die Erfindung offenbart auch Verbindungen, die durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert werden, sowie Zusam mensetzungen, die eine identifizierte Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert, die die Isolierung von Polynucleotiden, die PDE8-Polypeptide codieren, sowie Expression und Charakterisierung der codierten Polypeptide betreffen. Beispiel 1 beschreibt Verfahren zum Suchen von exprimierten Sequenz-Tag-(EST)-Datenbanken, um Sonden, die zum Isolieren von DNA der Erfindung potenziell verwendbar sind, zu identifizieren. Beispiel 2 betrifft die Identifizierung von PDE8A-codierenden Polynucleotiden. Beispiel 3 richtet sich an die Sequenzanalyse von den isolierten Polynucleotiden. Beispiel 4 beschreibt die Analyse von Polypeptiden, die durch PDE8A-Polynucleotide codiert wurden. Beispiel 5 richtet sich an die Expression von rekombinanten PDE8A-Polypeptiden. Beispiel 6 betrifft die Northern-Analyse von PDE8A-Expression. Beispiel 7 beschreibt Chromosomenkartierung des Gens, das PDE8A codiert. Beispiel 8 beschreibt die Konformation von dem PDE8A1 und PDE8A2, die Spleißvarianten darstellen. Beispiel 9 richtet sich an die Expression und Charakterisierung von rekombinanter PDE8A. Beispiel 10 gibt Einzelheiten zur Herstellung von Anti-PDE8A-monoklonalen Antikörpern an. Beispiel 11 beschreibt eine Analyse von PDE8A-Expression durch In-situ-Hybridisierung.
Beispiel 1
Identifizierung von einem EST bezüglich einer Human-PDE
Unter Anwendung der Sequenzen von bekannten humanen 3',5'-cyclischen Nucleotidphosphodiesterasen wurde eine Suche in Exprimierten Sequenz Tags (EST)-Datenbanken am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unternommen, um die cDNA-Fragmente zu identifizieren, die potenziell zur Identifizierung von neuen Phosphodiesterase-(PDE)-Genen verwendbar sein könnten. Diese Datenbank enthält DNA-Sequenzen, die ein oder beide Enden von cDNA, die aus einer Vielzahl von Gewebsquellen gesammelt wurden, wiedergeben. Ein einzelner Sequenzierungsversuch wird an einem oder beiden Enden der cDNA durchgeführt und die Qualität der DNA-Sequenz variiert enorm. Zu dieser Zeit wurden PDE-Suchen ausgeführt, wobei die EST-Sequenzdatenbank mehr als 600 000 cDNA-Sequenzen aus einer Vielzahl von Organismen enthielt.
Die Suche für neue PDE-Sequenzen schloss drei Schritte ein. Zuerst wurde das BLASTIN-Programm, das durch die NCBI erhältlich ist, verwendet, um DNA-Sequenzen in der EST-Sequenzdatenbank zu identifizieren, mit Homologie für cDNA-Sequenzen, die bekannte Human-PDE codieren. Das Programm vergleicht eine Nucleotid-Sequenz-Abfrage gegen eine Nucleotid-Sequenzdatenbank. Die cDNA-Sequenzen der fünfzehn bekannten humanen PDE wurden vorgelegt und fünfzehn BLASTIN-Suchen wurden ausgeführt; die PDE-Sequenzen der Abfrage schlossen PDE1A3 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], PDE1B1 [Yu, et al., Cell Signaling, im Druck (1997)], PDE1C2 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], PDE2A3 [Rosman, et al., Gene 191: 89–95 (1997)], PDE3A [Meacci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 3721–3725 (1992)], PDE3B [Miki et al., Genomics 36: 476–485 (1996)], PDE4A5 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4B2 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4C [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4D1 und PDE4D3 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE5A, PDE6A [Pittler, et al., Genomics 6: 272–283 (1990)], PDE6B [Collins, et al., Genomics 13: 698–704 (1992)], PDE6C [Piriev, et al., Genomics 28: 429–435 (1995) und PDE7A1 [Michaeli, et al., J. Biol. Chem. 17: 12925–12932 (1993)] ein. Die BLASTIN-Ergebnisse wurden geprüft und EST-Sequenzen, die als entsprechend von jeder der fünfzehn bekannten PDE cDNA eingeschätzt wurden, wurden identifiziert und in einer Tabelle gesammelt. Die als Abfragen verwendeten PDE6A- und PDE6B-Sequenzen wurden an dem 3'-Terminus (Entfernen eines Teils der 3'-nichttranslatierten Region), auf Grund des Vorliegens von wiederkehrenden Elementen in der 3'-nichttranslatierten Region der cDNA trunkiert.
Zweitens wurde das NCBI-TBLASTN-Programm verwendet, um die Homologie zwischen der Proteinsequenz der fünfzehn bekannten humanen PDE (wie vorstehend) und der sechs verschiedenen möglichen Proteine, die durch jede der EST-DNA-Sequenzen codierten, zu prüfen. Bei dieser Suche werden die EST-Sequenzen in sechs Raster translatiert und die erzeugten Aminosäuresequenzen werden mit den Abfragen zu PDE-Aminosäuresequenzen verglichen. Die als homolog zu dem Aminosäureanteil identifizierten Sequenzen werden geprüft und beliebige EST-Sequenzen, die entsprechend einer bekannten PDE, während der vorstehend beschriebenen BLASTN-Suche, als positiv identifiziert werden, wurden verworfen.
Der dritte Schritt der Suche beinhaltete das Analysieren der Sequenzen, die nicht bekannte PDE waren. Diese Aminosäuresequenzen sind homolog zu einer bekannten PDE, werden jedoch nicht als eines der 15 bekannten PDE-Gene während der BLASTN-Suchen identifiziert.
Die BLASTN-Suchen identifizierten eine EST-Sequenz (bezeichnet WO4835) von einer humanen fötalen Lungen-cDNA-Library als codierend für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie zu der katalytischen Region von PDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE5A, Stab alpha PDE6A, Stab Beta PDE6B, Kegel alpha PDE6C, und PDE7A. Die Datenbanksequenz für WO4835 wird in SEQ ID NO: 7 ausgewiesen. Die Ergebnisse von der Datenbankanalyse, wie nachstehend erörtert, werden unter Verwendung der PDE4D-Sequenz beispielhaft angeführt.
WO4835 cDNA wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten, die zur Veröffentlichung verfügbare Hinterlegung von identifizierten und durch I.M.A.G.E., Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA) sequenzierte EST hält. Die WO4835 DNA wurde nach Empfang sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und als konsistent mit SEQ ID NO: 7 bestimmt.
Die durch das -1 Leseraster der EST-Sequenz WO4835 codierte Aminosäuresequenz wurde durch alle von den PDE-cDNA-Sequenzen-Abfrage, ausgenommen PDE1A, -1B und -1C, erkannt. Unter Anwendung der TBLASTN-Ergebnisse mit PDE4D3, als ein Beispiel, wurden zwei Regionen der Ähnlichkeit nachgewiesen. Die erste Region zeigte 15/37 exakte Treffer oder 40% Identität (19/37 ähnliche Aminosäuren) und schloss HD(X)₂HXG(X)₁₃A (SEQ ID NO: 8), das Motiv wird in allen Sequenzen der Abfrage gefunden, ein. [Charboneau, Mol. Pharmacol. Cell Regul. 2: 267–298 (1990)]. Die zweite Region zeigte 9/20 exakte Treffer oder 45% Identität und schloss das YHNxxHA-Motiv, das in fast allen Sequenzen der Abfrage gefunden wurde, ein. BLASTN-Analyse der WO4835-Sequenz ergab, dass sie dahingehend einzigartig war, dass sie nicht identisch mit beliebigen anderen Human-DNA-Sequenzen in der Genbank-Datenbank war. Der EST-Datenbankeintrag für WO4835 identifizierte die Sequenz als ähnlich zu PIR:A48719, dem Rinder-cGMP-Binden, cGMP-Hydrolyse der PDE5A1-Sequenz. Vergleich der Proteinsequenz von WO4835-Raster -1 zu der Rinder-PDE5A1-Sequenz ergab 58/153 Treffer für eine Gesamtidentifizierung von 38%. In diesem Bereich waren kleine Bereiche von größerer Homologie; ein Bereich zeigte 12/14 identische Aminosäuren. Bei gegebener einzigartiger Beschaffenheit der WO4835-Sequenz, ihrer relativ niedrigen Homologie zu Rinder-PDE5A1, und dem Vorliegen des Aminosäuremotivs, das in den meisten anderen bekannten humanen PDE-Aminosäuresequenzen gefunden wird, gibt WO4835 eine neue Human-PDE-cDNA wieder.
Beispiel 2
Isolierung von putativer PDE cDNA
WO4835 cDNA-Insert wurde von dem pT7T3D-Vektor in zwei Fragmente mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, und die zwei Fragmente wurden unter Anwendung von zwei sequenziellen, nieder schmelzenden Agarosegelen gereinigt. Beide Fragmente wurden als Sonden zum Untersuchen von cDNA- Libraries, die von Humanherz (Stratagene, La Jolla, CA) und humanem fötalem Hirn (Stratagene) abgeleitet sind, unter Anwendung von auf dem Fachgebiet routinemäßig ausgeführten Verfahren, verwendet. Ungefähr 5 × 10⁵ Phagen von jeder Library wurden abgesucht. Die Hybridisierung wurde über Nacht in Puffer, enthaltend 3 × SSC, 0,1% Sarkosyl, 20 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 10 × Denhardt's-Lösung und 50 μg/ml Lachsspermien-DNA, bei 65°C ausgeführt. Die Filter wurden bei 65°C in Puffer, enthaltend 2 × SSC und 0,1% SDS, vor Autoradiographie gewaschen.
Neun Klone aus der fötalen Hirn-cDNA-Library und zwei von der Herz-cDNA-Library hybridisierten an die WO4835-Sonde. Partielles Sequenzieren und Kartierung führte zu der Auswahl von einem Klon von der fötalen Hirnlibrary, bezeichnet FB66a, zur weiteren Charakterisierung.
Ein zweites Screening von ungefähr 7,5 × 10⁵ Phagen von der fötalen Hirn-cDNA-Library, unter Bedingungen, die zum ersten Screening verwendet werden, unter Anwendung des 1,3 kB EcoRI/HindIII-Fragments von der 5'-Portion von WO4835, ergab neunzehn zusätzliche cDNA-Klone. Sechs von diesen cDNA wurden auch an ein HindIII/KpnI-Fragment von WO4835 hybridisiert, das eine 256-Nucleotidregion an dem 5'-Terminus von WO4835 einschließt. Teilweises Sequenzieren und Kartierung von fünf der Klone führte zu der Auswahl eines zweiten Klons, der mit FB85c-2 bezeichnet wurde, zur weiteren Analyse.
Beispiel 3
DNA Sequenz Analyse für FB66a und FB85c-2
Die DNA-Sequenz von FB66a wurde für beide Stränge, unter Anwendung von DNA-Oligonucleotidprimern, ausgewiesen nachstehend in SEQ ID NUMMERN: 9 bis 31, und einem Perkin Elmer Applied Biosystems Division 373A DNA-Sequenzer, gemäß der Anweisungen des vom Hersteller vorgeschlagenen Protokolls, bestimmt. Die Menge an dem als Templat verwendeten PCR-Produkt wurde, bezogen auf die Größe des PCR-Produkts, berechnet und wurde unter Anwendung von ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mit ApliTaq DNA Polymerase, FS (Perkin Elmer, Foster City, CA) und asymmetrischem PCR sequenziert. Das Reaktionsprodukt wurde an einer AGCT Spinsäule (Advanced Genetic Technologies Corp., Gaithersburg, MD) gereinigt und getrocknet. Beladungspuffer wurde zu jeder gereinigten Probe gegeben und das Gemisch für zwei Minuten auf 90°C erhitzt. Die Lösung wurde zu Eis überführt, was auf ein 4%iges Polyacrylamidgel geladen wurde. Die Daten wurden automatisch gesammelt, wenn das Daten-Sammlungs-Programm gestartet war und automatisch analysiert und durch das Sequenz-Analysenprogramm ausgelesen. Alle Eingaben wurden manuell ausgeführt und die erhaltenen Sequenzen wurden ausgerichtet, wobei die übereinstimmende Sequenz bestimmt wurde.
Die FB66a cDNA, ausgewiesen in SEQ ID NO: 3, ist 4389 Nucleotide in der Länge, und, von Nucleotid 3 bis Nucleotid 2411, codiert ein Protein von 803 Aminosäuren mit einem vor hergesagten Molekulargewicht von ungefähr 90 775 Da. Die deduzierte Aminosäuresequenz für FB66a wird in SEQ ID NO: 4 ausgewiesen. Das erste Methionin wird bei Nucleotid 45 codiert; die Abwesenheit eines Raster-Stopp-Codons stromaufwärts macht unklar, ob dieser Rest ein internes Methionin oder der Beginn des offenen Leserasters ist.
Die DNA-Sequenz von FB85c-2 (SEQ ID NO: 5) wurde ähnlich bestimmt, unter Anwendung der Primer M13Rev.1, W48A2, W48A9, W48A4, W48S1, W48A1, W48S6, W48A5, W48A6, W48S2, W48S3, W48S4, W48S5, W48S7, W48A8 und M13. FB85c-2 scheint, zwei verschiedene DNA-Inserts einzuschließen, wobei nur einer davon homolog zu WO4835 ist. Die Region, homolog zu WO4835, war ungefähr 2,8 kB in der Länge. Die genaue Sequenz an dem 5'-Terminus des Inserts konnte nicht bestimmt werden, und somit sind einige hundert Basen der Sequenz, worin eine 5'-nicht translatierte Region sein kann, nicht in die 2573 Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 5 ausgewiesen ist, eingeschlossen. Nucleotid 67 bis Nucleotid 2406 codieren ein Protein mit einem 779 Aminosäureprotein (SEQ ID NO: 6) mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 88 353 Da. Ein Stopp-Codon im Raster stromaufwärts macht es wahrscheinlich, dass das Methionin, das bei Nucleotidposition 67 codiert wird, das Startmethionin ist.
Die Proteine, die durch FB66a und FB85c-2 codiert sind, haben verschiedene Amino-terminale Sequenzen, die auf Grund von alternativem Spleißen vorliegen. Die DNA-Sequenzen unterscheiden sich voneinander 5' von Nucleotid 112 in FB66a und Nucleotid 104 in FB85c-2. Somit hat FB85c-2 13 Aminosäuren an dem Aminoende, die in dem FB66a-Protein nicht gefunden werden. Das FB66a-Protein schließt 23 einzigartige Amino-terminale Reste ein, wenn angenommen wird, dass das Startmethionin bei Nucleotid 35 codiert wird; das Protein schließt mehr als 37 einzigartige Amino-terminale Reste ein, wenn das offene Leseraster in dem FB66a-Klon unvollständig ist.
BLASTN-Analyse, worin eine Abfrage zur Nucleotidsequenz gegen eine Nucleotidsequenzdatenbank verglichen wird, ergab für die FB66a-Sequenz keine Identität mit Sequenzen in der Genbank, NCBI STS, NCBI HTGS oder NCBI GSS-Datenbanken. Jedoch zwei gleiche Sequenzen wurden in der NCBI EST-Datenbank identifiziert.
Eine Sequenz war die WO4835 EST, die verwendet wurde, um den cDNA-Klon zu identifizieren. Die zweite, AA307865 (SEQ ID NO: 32), abgeleitet von einer Darmkrebszelllinie KM12C (HCC), zeigte Sequenzidentität mit der 3'-nichttranslatierten Region von den FB66a- und FB85c-2-Klonen. Während der Suche, worin AA307865 identifiziert wurde, wurden zusätzliche EST DNA, die vorwiegend putative Maus- (EST AA386789, SEQ ID NO: 38) und Ratten- (EST H32734, SEQ ID NO: 33) -Homologe codieren, zu den Humanproteinen, die durch FB66a und FB85c-2 codieren, identifiziert. Die Maussequenz war 86% zu den Humansequenzen und die Rattensequenz war 81% identisch.
Beispiel 4
Analyse von FB85c-2- und FB66a-Protein
Die PDE, die durch Klone FB85c-2 und FB66a codiert werden, wurden PDE8A1 bzw. PDE8A2 bezeichnet. Beide PDE8A-Proteine mit vollständiger Aminosäuresequenzidentität oberhalb des Punktes der vorstehend erörterten Divergenz sind ähnlicher zu Human-PDE2A, -PDE5A, -PDE6A, -PDE6B und -PDE6C. Tabellen 1 und 2 zeigen die Prozent Aminosäureidentität zwischen PDE8A und PDE2A, PDE5A und PDE6A.
PDE8A1 und PDE8A2 teilen die Homologie mit anderen PDE über die katalytische Region (Aminosäuren 492 bis 748 in PDE8A1) und mit der putativen cGMP-Bindungsdomaine, die in der Amino-terminalen Region von PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B und PDE6C konserviert wurde. Die potenzielle cGMP-Bindungsdomaine von PDE8A erstreckt sich von Aminosäure 75 bis Aminosäure 445 in dem PDE8A1-Polypeptid. Innerhalb der cGMP-Bindungsdomaine von PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B und PDE6C gibt es zwei innere Wiederholungen, die mit "a" und "b" bezeichnet werden, und jede Wiederholung enthält eine Reihe von konservierten Aminosäuren [McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem. 268: 22863–22873 (1993)]. In der entsprechenden "b"-Wiederholungsregion von PDE8A werden alle konservierten Aminosäuren gefunden; in der entsprechenden "a"-Wiederholungsregion wurden nur einige der konservierten Reste nachgewiesen. Ein Aspartatrest, der als essentiell für das cGMP-Binden durch Rinder-PDE5A gezeigt wird [McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem. 270: 1–9 (1995)], liegt in der "a"-Wiederholungsregion von PDE8A nicht vor. Es ist deshalb unbestimmt, ob diese Region in PDE8A wirkt, um cGMP zu binden.
Tabelle 1 PDE8A Identität in dem gesamten Protein
Tabelle 2 PDE8A Identität in der katalytischen Domaine
Beispiel 5
Expression von rekombinanter PDE8A
Ein Expressionskonstrukt für PDE8A wurde erzeugt, das DNA-Sequenzen 3' von dem Punkt der Divergenz von PDE8A1 und PDE8A2 durch das Stoppcodon einschloss. Die Expressionskonstruktion schloss DNA, die ein acht Aminosäureepitop-tag codiert, ein. Das so genannte "FLAG tag", umfassend die in SEQ ID NO: 34 ausgewiesene Peptidsequenz, wurde zu dem Aminotermi nus gegeben, sodass das Protein durch Western-blott-Techniken, unter Anwendung eines Anti-FLAG-M2-Antikörpers (Eastman Kodak, Rochester, NY), welcher spezifisch das Peptid von SEQ ID NO: 34 erkennt, identifiziert werden konnte.
Sequenzen, die ein Startmethionin an den Proteinen codieren, wurde der Aminoterminus auch hinzugefügt.
Als ein erster Schritt beim Aufbauen des Expressionsplasmids wurde PCR, unter Verwendung von FB66a DNA als ein Templat, unter Anwendung von Primern, ausgewiesen in SEQ ID Nummern: 35 (nachstehend) und W48A2 (SEQ ID NO: 10, Seite 14), in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 2 μl jedes Primers (Stamm 100 μg/ml), 2 μl 10 × PCR Puffer II (Perkin Elmer), 2 μl 10 × Stamm von jedem Nucleotid (Stamm 2 mM), 1,2 μl MgCl₂ (Stamm 25 mM), 0,09 μl 5 Einheiten/μl Tag Polymerase (Perkin Elmer), FB66a DNA und Wasser, zum Bringen des Reaktionsgemisches auf 20 μl, ausgeführt. In dem 5'-Primer (SEQ ID NO: 35) ist eine NcoI-Stelle in fetten Buchstaben und die FLAG tag codierende Region ist unterstrichen.
PCR wurde in einem Perkin Elmer DNA Thermal Cycler unter den nachstehenden Bedingungen ausgeführt: 94°C für 4 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für eine Minute, 50°C für eine Minute und 72°C für zwei Minuten.
Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit NcoI und KpnI verdaut, Gel-gereinigt und in Bluescript SKII⁺ Vektor, vorher mit den gleichen Enzymen verdaut, subgeklont. Der Bluescript-Vektor wurde vorher modifiziert, um ein SacI/NcoI-Alkoholdehydrogenase-2-(ADH2)-Promotorfragment, entfernt von einem YEpC-PADH2d-Vektor [Price, et al., Meth. Enzymol. 185: 308–315 (1990)] einzuschließen. Das erhaltene Plasmid wurde W48pcr1 bezeichnet.
Ein KpnI/SstI-Fragment, enthaltend den 3'-Anteil des offenen Leserasters, wurde aus einer FB66a cDNA isoliert und in W48pcr1, vorher verdaut mit KpnI und EcoRV, inseriert. Das erhaltene Plasmid wurde W485.1 bezeichnet.
Ein SacI/KpnI-Fragment, enthaltend den ADH2-Promotor und den 5'-Anteil von dem PDE8A-Gen, wurde aus W49pcr1 isoliert. Ein KpnI/SalI-Fragment, das die 3'-Region von PDE8A enthält, wurde aus W485.1 isoliert. Die zwei Fragmente wurden in den Hefeexpressionsvektor YEpC-PADH2d ligiert, der vorher mit SacI und SalI verdaut wurde. Das erhaltene Plasmid wurde W48-2ADH2 bezeichnet und wurde am 2. Oktober 1997 unter den Maßgaben des Budapester Vertrags mit der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt. Dem Plasmid W48-2ADH2 tragenden bakteriellen Stamm wurde die Zugangsnummer ATCC 98552 zugeordnet. Die durch PCR und die DNA-Sequenzen an den PDE8/Vektorverbindungen erzeugten DNA-Sequenzen wurden bestimmt, um geeignete Plasmidkonstruktion zu sichern. Nach Bestätigung der Sequenz wurde das Plasmid in einen Hefestamm BJ2-54, dem endogene PDE-Aktivität fehlt, transformiert (Ura3-52; Trp1; Leu2; Cir°; Gal2; Pep4-3, Prbi-1122, Prc1-402; ΔPDE1::URA3; HIS3; ΔPDE2::TRP1).
Die Wirtszellen wurden über Nacht in SC-Leu-selektiven Medien, einschließlich 2% Glucose, verdünnt auf 1–2 × 10⁵ Zellen/ml, angezogen und anschließend zu einer Dichte von 10⁷ Zellen/ml in den gleichen Medien angezogen. Das Vorliegen des Expressionsplasmids schien das Verdoppeln der Zeit für das Zellwachstum zwei- bis dreifach, auch unter nicht-einschließenden Bedingungen, zu erhöhen. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung gesammelt, mit YEP-Medien, einschließlich 3% Glycerin, gewaschen, in YEP/3% Glycerin, bei einer Dichte von 10⁷ Zellen/ml, resuspendiert und für 24 Stunden vor der Ernte angezogen. Die Zellen wurden bis zur Verwendung gefroren.
Gefrorene Zellpellets (0,06 ml) wurden aufgetaut und in 0,2 ml Lysepuffer, enthaltend 100 mM MOPS, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2 μM ZnSO₂, 2 mM Dithiothreitol und 10 μg/ml von jedem Protease-Inhibitor Pepstatin, Leupeptin und Aprotinin suspendiert. Ungefähr 0,2 ml von 0,5 mm Glaskugeln wurden zu den Zellen gegeben, die dann mit vier 30-Sekunden-Zyklen einer Vortex-Behandlung lysiert wurden. Das Lysat wurde abgezogen und die Kugeln wurden zweimal mit 0,3 ml Lysepuffer gewaschen. Das Lysat wurde mit den Waschungen zur Erzeugung des Hefeextrakts vereinigt. In einigen Versuchen wurde das Lysat durch Zentrifugierung bei 105 000 × G für dreißig Minuten fraktioniert.
Western-Analyse wurde an Hefeextrakt, enthaltend das rekombinante Protein, wie nachstehend ausgeführt. Proteine wurden zuerst an SDS-PAGE getrennt und zu Immobilon-P (Millipore), unter Anwendung von Standardverfahren, überführt. Die Proteinblots wurden, unter Verwendung von 5% Nicht-Fett-Trockenmilch, in 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05 Tween-20 (TBST Puffer plus Milch) für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Blots wurden mit Anti-FLAG M2-Antikörper (vorstehend erörtert) bei einer Konzentration von 1 μg/ml in TBST-Puffer plus Milch für eine Stunde inkubiert, wonach die Blots viermal mit TBST-Puffer gewaschen wurden. Die Blots wurden dann für eine Stunde mit Blottingqualitätaffinität-gereinigtem Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP) (BioRad), inkubiert. Das Ziege-IgG wurde vorher 1:10000 in TBST-Puffer plus Milch verdünnt. Die Blots wurden viermal mit TBST gewaschen und gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll, mit dem Renaissance^®-System (New England Nuclear Life Sciences Products) für verstärkte Chemilumineszenz vor der Autoradiographie behandelt. Die Mehrheit des durch den Antikörper nachgewiesenen Proteins hatte die für das rekombinante Protein erwartete Größe.
Die PDE-Aktivität wurde durch den Nachweis von ³²P-Phosphat, freigesetzt aus ³²P-cAMP oder ³²P-cGMP, wie vorstehend beschrieben [Loughney et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], bestimmt. Der Hefeextrakt wurde in 0,5 × Lysepuffer, auch enthaltend 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin, verdünnt. Zwanzig μl Hefeextrakt, oder verdünnter Hefeextrakt, wurden in einem 100 μl-Reaktionsvolumen bestimmt, das weitere 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂, 1 μM ZnSO₂ und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin einschloss. Die Proteinkonzentration wurde durch das Verfahren von Bradford bestimmt.
Es wurde beobachtet, dass PDE8A sowohl cAMP als auch cGMP hydrolysiert. In nichtfraktionierten Lysaten war die spezifische Aktivität für cAMP 3,9 nMol/min/mg und für cGMP war sie 7,6 nMol/min/mg. Fraktionierung bestätigte, dass 20–40% der Gesamtaktivität mit der Hochgeschwindigkeitsüberstandsfraktion verbunden waren. Kinetische Analyse der Aktivität mit cAMP als Substrat lässt das Vorliegen von sowohl niedrigen als auch hohen Km-Formen des Enzyms in einem 1:1 Aktivitätsverhältnis vermuten. Die geschätzten K_m-Werte waren 0,2 μM und 350 μM. Analyse der Hochgeschwindigkeitspellets lässt vermuten, dass die gleichen Spezies vorlagen, jedoch in einem Verhältnis von hoher K_m-:niederer K_m-Aktivität von 1:4. Kinetische Analyse mit cGMP als Substrat lässt auch das Vorliegen von niedrigen und hohen Formen des Enzyms vermuten. In diesen Analysen wurden K_m-Werte auf 3 μM und 300 μM geschätzt.
Die IC₅₀-Werte zur Inhibierung von PDE8A-Aktivität wurden unter Anwendung einer Reihe von Isozym-selektiven PDE-Inhibitoren und dem nicht-selektiven Inhibitor Isomethylbutylxanthin (IBMX) bestimmt. Da diese Assays bei einer cAMP-Konzentration von 60 nM ausgeführt wurden, reflektieren die IC₅₀-Werte nur die niedrige Km-Form. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 ausgewiesen, mit Werten, die in mikromolaren Einheiten gezeigt werden.
Tabelle 3 PDE8 Inhibierung mit Isozym-spezifischen PDE-Inhibitoren
Die IC₅₀-Werte für jeden von den selektiven Inhibitoren waren mindestens 30-fach höher gegen PDE8, als gegen ihre Ziel-Isozyme, was vermuten lässt, dass das Inhibitorprofil von PDE8 von jenen von PDE 1–5 verschieden ist. Die Hydrolyse von cAMP und cGMP unterscheidet deutlich die Enzymaktivität von PDE8A von jener von PDE6 und PDE7A. Der IC₅₀-Wert für den nicht-selektiven Inhibitor IBMX für PDE8 lag im Bereich, der für bekannte PDE beobachtet wurde, was vermuten lässt, dass die katalytische Stelle von PDE8 jene von anderem humanen und Säuger-PDE nachahmt und sich von niederen eukaryotischen Formen unterscheidet, die auf IBMX unempfindlich sind.
Beispiel 6
Northern-Analyse von PDE8A-Expression
Northern-Analyse von PDE8A-Expression wurde unter Verwendung eines Human-Mehrfach-Gewebsblot (Clontech, Palo Alto, CA) ausgeführt. Die 327-Grundsonde erstreckte sich von Nucleotid 1767 bis Nucleotid 2293 in SEQ ID NO: 3. Ribosondenherstellungs- und Hybridisierungsbedingungen waren wie vorstehend beschrieben [Loughney, et al. vorstehend].
Die Ergebnisse zeigten ein 9,5 kB mRNA in allen Geweben geprüft, jedoch variierte die Bandenintensität. Das Signal war am stärksten in Herz, Hirn und Niere; das Signal war schwächer in der Leber, Placenta, Pankreas und Skelettmuskel. Das Signal war am schwächsten in der Lunge.
Beispiel 7
Chromosomen-Kartierung von humanem PDE8A
Künstliche Hefe-Chromosomen (YAC), die das Human-PDE8A-Gen enthalten, wurden aus einer Gruppe von Human-YAC, bezogen von Research Genetics, isoliert und durch PCR wie nachstehend abgesucht.
Die YAC-Superpools wurden mit zwei Gruppenpaaren von Primern abgesucht. In der ersten Screeningreaktion wurde Senseprimer W48S8 (SEQ ID NO: 36) mit dem Anti-Senseprimer W48A10 (SEQ ID NO: 37) gepaart. PCR wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 2 mM MgSO₄, 0,2 mM von jedem dNTP, 10 μg/ml von jedem Primer, 0,5 Einheiten Tag-Polymerase (Perkin-Elmer) und 1,5 μl YAC-Pool-DNA als Templat, ausgeführt. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen ausgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 60°C, und vier Minuten bei 72°C, bestand. Nach der ersten Runde der Vergrößerung wurden die Reaktionsprodukte mit dem inneren Paar von Primern W48S12 (SEQ ID NO: 36) und W48A12 (SEQ ID NO: 37) wiederverstärkt.
Die Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das Templat 1 μl einer 1:10-Verdünnung (in Wasser) der ersten Kundenreaktion war. Superpools, die die korrekte Größe des PCR-Produkts ergeben, wurden identifiziert und die entsprechenden Subpools wurden mit den gleichen Gruppenpaaren von Primern, unter den gleichen Bedingungen zum Identifizieren von einzigartigen Adressen für YAC, die PDE8A enthalten, abgesucht.
Hefestämme, die relevante YAC beherbergen, wurden von Research Genetics bezogen. Um das Vorliegen von dem PDE8A-Gen in verschiedenen YAC zu verifizieren, wurde DNA aus jedem Stamm hergestellt und durch PCR mit Primern W48S8 und W48A10 analysiert. DNA wurde aus jedem Stamm, gemäß dem vorher beschriebenen Verfahren [Hoffman und Winston, Gene 57: 267–272 (1987)], jedoch wie nachstehend modifiziert, hergestellt. Die Stämme wurden über Nacht bei 30°C in YEP-Medien, die Glucose enthalten, angezogen. Zehn ml Kultur wurden durch Zentrifugierung pelletisiert bzw. sedimentiert und in 200 μl wässrigem Puffer, enthaltend 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1% SDS und 2% Triton-X100, resuspendiert. Die Zellen wurden durch Vortex-Behandeln, in Gegenwart von 200 μl Phenol/Chloroform (1:1 Gemisch), und 100 μl Glaskugeln (425–600 μm) lysiert. Nach Lyse wurden 200 μl TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM Na₂EDTA) zugegeben und die Probe wurde zum Trennen der Phasen zentrifugiert. Die organische Phase wurde erneut mit 200 μl wässrigem Puffer extrahiert. Die vereinigte wässrige Phase wurde mit 100 Einheiten Rinderpankreas RNase (Boehringer Mannheim) für 1 Stunde bei 37°C behandelt, und die Probe wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform erneut extrahiert, und Ethanol gemäß den bekannten Verfahren ausgefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 50 μl TE-Puffer resuspendiert. PCR wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das Reaktionsvolumen 25 μl war und das Templat aus 1 μl relevanter Hefe-DNA-Zubereitung bestand.
Drei Human-YAC, die das PDE8-Gen enthielten, wurden mit Adressen 805B6, 919H10 und 920A3 (wie für die CEPH-Bezeichnung) identifiziert. Gemäß der Information in dem Center for Genome Research database (Whitehead) überlappen die drei YAC einander und sind Teil einer einzeln gebundenen, zusammenhängenden Reihe (WC6.16) am Humanchromosom 6. Zwei Sequenzen von Tag-gebundenen Stellen innerhalb dieser zusammenhängenden Reihe (D6S305 und D6S411) wurden in der Chromosomen-6-genetischen Karte an einer Position 167 cM von dem Terminus von 6p in der Arbeit an dem Center for Genome Research angeordnet; D6S305 wurde zu einer Position 173 cM von dem Terminus von 6p in der Arbeit des CEPH-Genethon kartiert. Drei andere YAC innerhalb der WC6.16-zusammenhängenden Reihe (932F1, 956B1 und 947D5) wurden durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung am CEPH-Genethon kartiert. Die Hybridisierungssignale fallen zwischen 0,94- und 0,99-Fraktionslängeneinheiten von dem Terminus von 6p. Gemäß der CEPH-integrierten Summenkarte [Chumakov et al., Nature 377 (Supp): 175–297 (1995)] entspricht diese Region der zytogenetischen Region 6q26–27.
Vererbungsdefekte, die mit dieser Region des menschlichen Genoms verbunden sind, schließen retinale Kegeldegeneration (OMIM-Datenbank), Insulin-abhängigen Diabetes mellitus [Davies et al. Nature 371: 130–136 (1994); Luo et al. Am. J. Hum. Genet. 57: 911–919 (1995)] und juveniler Beginn von Parkinsonismus [Matsumine et al. Am. J. Hum. Genet. 60: 588–596 (1997)] ein. Zusätzlich wird häufig Verlust an Heterozygosität (LOH) in dieser Region in einer Vielzahl von verschiedenen Krebszellen, einschließlich Burkitt's-Lymphom [Parsa et al. Genes, Chromosomes & Cancer 9: 13–18 (1994)], Astrozytoma [Liang et al. Neurology 44: 533–536 (1994)], Magenkarzinom [Queimado et al. Genes, Chromosomes & Cancer 14: 28–34 (1995)], Parathyroidadenom [Tahara et al. Cancer Res. 56: 599–605 (1996)] und Ovarienkarzinom [Cooke et al. Genes, Chromosomes & Cancer 15: 223–233 (1996); Saito et al. Cancer Res. 56: 5586–5589 (1996)] beobachtet. LOH lässt das Vorliegen von Tumorsuppressorgen in der befallenen Region vermuten [Weinberg, Science 254: 1138–1146 (1991)]. Auf Grund seiner weit verbreiteten Expression ist es möglich, dass Mutation des PDE8-Gens in alle oder einige von diesen genetischen Anormalitäten einbezogen sein kann.
Beispiel 8
Verifizierung, dass PDE8A1 und PDE8A2 Spleißvarianten wiedergeben, und Bemühungen, die 5'-Sequenz von PDE8A2 auszudehnen
Um zu verifizieren, dass PDE8A1 und PDE8A2 5'-Spleißvarianten wiedergeben, wurden zwei Versuche unternommen. Zu erst bestätigte PCR-Analyse, dass in genomer DNA weder PDE8A1- noch PDE8A2-Sequenzen, benachbart zu der DNA-Sequenz der üblichen Region, waren. Die genomen Sequenzen, stromaufwärts der üblichen Region, lagen in einer dritten PDE8A cDNA, FB74b, vor, welche in der Gruppe von sechs ursprünglichen Klonen identifiziert wurde, die den 5'-Terminus der Sonde WO4835, beschrieben in Beispiel 2, hybridisierten. Die Teilsequenz (755 Nucleotide an dem 3'-Terminus) von Klon FB74b wird in SEQ ID NO: 39 ausgewiesen. Die FB74b cDNA divergierte von FB85c-2 und FB66a in der gleichen Position, wie FB85c-2 und FB66a voneinander divergierten, jedoch hielt der FB74b-Klon nicht das offene Leseraster. In der FB74b-Sequenz war 5' zu dem Punkt der Sequenzdivergenz von den FB66a- und FB85c-2-Klonen, wobei ein Im-Raster-Stoppcodon näher zu dem Divergenzpunkt war als ein startender Methionincodon, was ausweist, wenn FB74b eine cDNA, eher als eine ungespleißte Vorstufe, wiedergibt, das Startmethionin notwendigerweise in der Sequenz, üblicherweise sowohl FB66a als auch FB85c-2, lokalisiert sein würde.
PCR-Analyse wurde unter Verwendung eines Primers, bezeichnet FB74bS1 (SEQ ID NO: 40) mit den FB74b-stromaufwärts Sequenzen, und einem zweiten Primer, bezeichnet W48A9 (SEQ ID NO: 11) mit den Sequenzen, üblich für FB74b, FB66a und FB85c-2, ausgeführt.
Unter Verwendung von 1 μg humaner genomer DNA als Templat, wurde eine Bande mit der gleichen Größe wie jene, verstärkt unter Verwendung von FB74b als Templat, vergrößert, was anzeigt, dass die Sequenz gleich FB74b war und der übliche Bereich benachbart in der genomen DNA war. Somit kann die FB74b-Sequenz ein ungespleißtes Intron wiedergeben, oder kann eine dritte Spleißvariante wiedergeben, die ein Protein mit einem Startmethionin innerhalb der üblichen Region codieren würde. In jedem Fall werden die FB85c-2- und FB66a-Sequenzen vorwiegend durch Spleißen erzeugt.
Zweitens wurde 5'-RACE-Analyse, unter Verwendung von RNA, isoliert aus Humancortex-, Cerebellum-, Herz-, Leber- und Lungengewebe, ausgeführt. RNA wurde aus gefrorenen Gewebsfragmenten, wie beschrieben [Loughney et al, J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], isoliert und Poly-A⁺ mRNA wurde, unter Verwendung des Fast Track^TM mRNA-Isolierungssystem (Invitrogen), ausgewählt. Doppelsträngige cDNA wurde, unter Verwendung von 5 μg Poly-A⁺ mRNA- und einem cDNA-Synthesekit (Boehringer Mannheim), hergestellt. Die cDNA wurde an einen Linker, gebildet durch Annealieren von Oligonucleotiden L15 (SEQ ID NO: 41) und L30 (SEQ ID NO: 42), ligiert.
Für den 5'-RACE wurde die Linker-ligierte cDNA durch PCR, unter Anwendung von Oligonucleotiden L18 (SEQ ID NO: 43) und W48A13 (SEQ ID NO: 44), vergrößert.
Die Reaktion enthielt 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 10 μg/ml von jedem Primer und 1 μl Linker-ligierte cDNA in einem Reaktionsvolumen von 25 μl. Nach dem Erwärmungsschritt auf 94°C wurde PCR durch die Zugabe von 0,1 Einheit Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim) gestartet und mit 30 Zyklen von einer Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 60°C und vier Minuten bei 72°C, fortgesetzt.
Die Produkte der PCR-Reaktion wurden zehnfach mit Wasser verdünnt und als Templat in einer zweiten PCR-Reaktion mit Oligonucleotiden L21 (SEQ ID NO: 45) und W48A9S (SEQ ID NO: 46) unter den gleichen, wie vorstehend beschriebenen Bedingungen, verwendet.
DNA, vergrößert in der zweiten PCR-Reaktion, wurde mit EcoRI und SalI gespleißt und in den Vektor Bluescript (Stratagene), vorher mit den gleichen Enzymen verdaut, ligiert.
Anfänglich wurden DNA-Sequenzen in fünf Plasmiden für jede Gewebsquelle geprüft und sowohl PDE8A1 als auch PDE8A2 5'-Sequenzen wurden zusammen mit den isolierten cDNA gefunden. FB74b 5'-Sequenzen wurden auch erhalten, wie verschiedene Sequenzen, jeweils nur einmal isoliert, die zusätzliche Spleißvarianten oder nichtverwandte DNA-Sequenzen wiedergeben könnten.
Weil keine von den PDE8A2-artigen cDNA sich weiter als 5' erstreckte, als die ursprüngliche FB66a cDNA, wurden weitere PDE8A2 RACE-Klone in einem Versuch, die 5'-Endensequenz auszudehnen, analysiert. Weitere fünf Lungen-PDE8A2 cDNA wurden identifiziert und sequenziert, erstreckten sich jedoch nicht auf die PDE8A2-Sequenz.
Eine zweite Runde von RACE PCR wurde, unter Verwendung des L21 Primers (SEQ ID NO: 45) mit Primer W48A14S (SEQ ID NO: 47), wiederholt.
Die erhaltenen Klone wurden durch PCR abgesucht und die längsten wurden zum Sequenzieren ausgewählt. Nur zwei Klone waren länger als die ursprüngliche FB66a cDNA und sie erstreckten die 5'-Sequenz 8 bzw. 12 Bp in der nichttranslatierten Region. Die FB66a-Sequenzen erstreckten sich mit 5'-CCCAGGGCGCCA. Der extreme 5'-Terminus von FB66a ist sehr GC-reich, was zu der Schwierigkeit beim Isolieren von VolllängencDNA beitragen kann.
Beispiel 9
Expression und Charakterisierung von PDE8A
Die in Beispiel 5 beschriebene, rekombinante PDE8A existierte in sowohl niedrigen Affinitäts- als auch hohen Affinitätsformen in Hefeextrakt. Auf Grund der Möglichkeit, dass die Niedrig-Affinitäts-Form teilweise inaktives Enzym wiedergibt, wurde PDE8A-Expression in sf9- und COS-Zellen in einem Versuch ausgeführt, um entweder ein homogenes Enzym zu erhalten oder zu bestimmen, ob zwei kinetische Formen immer aus der cDNA exprimiert werden.
Das PDE8-sf9-Expressionskonstrukt wurde mit einem 3' KpnI-SalI-Fragment von Plasmid W485.1 (beschrieben in Beispiel 5) und einem 5'-Fragment, erzeugt durch PCR, wie nachstehend erzeugt. Die Primer, FLAG-1 (SEQ ID NO: 48) und W48A4 (SEQ ID NO: 12), wurden in PCR mit PDE8 COS-1 DNA (nachstehend beschrieben) als Templat verwendet.
PCR wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, gebildet, mit der Ausnahme, dass 2 mM MgSO₄ anstelle von MgCl₂ verwendet wurden, und 0,02 U Taq-Polymerase angewendet wurde. Nach einer Anfangsinkubation bei 94°C für vier Minuten wurden 30 Zyklen mit einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 50°C und zwei Minuten bei 72°C ausgeführt. Das 5'-Vergrößerungsprodukt wurde mit BamHI und KpnI gespleißt, Gel-gereinigt und mit dem 3'-Fragment in Vektor pFASTBAC (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), vorher verdaut mit BamHI und SalI, ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde pFBRPDE8 bezeichnet. Alle PCR-Vergrößerungsprodukte und alle neuen Junktionen wurden durch Sequenzieren verifiziert.
Rekombinante virale Stämme wurden unter Anwendung des FastBac-Systems (Gibco BRL) gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll ausgeführt und Proteinexpression wurde wie nachstehend ausgeführt. Sf9-Zellen wurden bei 27°C in CCM3-Medien (Hyclone, Logan, UT), enthaltend 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycinsulfat (Gibco), angezogen. Exponentiell wachsende Zellen wurden bei einer Mehrheit von ungefähr zwei Viren pro Zelle infiziert und 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung gesammelt, mit CMF-PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂PO₄) gewaschen, und die Pellets wurden gefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Die Zellen wurden in Puffer (50 mM MOPS, pH 7,2, 10 μM Zinksulfat, 1 mM DTT, 2 mM Benzamidin, 10 μg/ml jeweils Pepstatin, Leupeptin und Aprotinin, und 20 μg/ml je weils Calpain I- und Calpain II-Inhibitoren) durch Vortex-Behandeln, in Gegenwart eines gleichen Volumens von Glaskugeln (Säure-gewaschen, 0,5 mm, Sigma), lysiert, und die PDE-Aktivität wurde wie in Beispiel 5 beschrieben bestimmt.
In dem Sf9-Extrakt wurden 45,4 nMol/min/mg PDE-Aktivität für die cAMP-Hydrolyse (100 μM Substrat) und 69,4 nMol/min/mg für die cGMP-Hydrolyse (100 μM Substrat) nachgewiesen. Die Hintergrund-PDE-Aktivität war vernachlässigbar. Die PDE8A-Aktivität schien, ein Gemisch von Hoch- und Nieder-Affinitätsformen zu sein, wie in Hefeextrakten, wie in Beispiel 5 beschrieben, nachgewiesen.
Zur Expression in COS-Zellen wurde PDE8 COS-1 durch Kombinieren eines 3' KpnI/SalI-Fragments von Plasmid W485.1 (Beispiel 5) und einem NheI/KpnI-Fragment, erhalten durch Spleißung eines PCR-Vergrößerungsprodukts, von einer Reaktion, einschließlich FB66a cDNA als ein Templat, mit Primern W48A2 (SEQ ID NO: 10) und ATG (SEQ ID NO: 35), erzeugt. Bedingungen für das PCR schlossen eine Anfangsinkubation für vier Minuten bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen für eine Minute bei 94°C, eine Minute bei 50°C und zwei Minuten bei 72°C, in einem Perkin Elmer Cetus DNA-Thermalcycler ein. Das erhaltene 5'-Fragment und das 3'-Fragment, vorstehend beschrieben, wurden in Vektor pC1neo (Promega, Madison, WI) ligiert, der vorher mit NheI/SalI verdaut wurde.
Halb zusammengeflossene COS-Zellen, die in 15 cm-Schalen wuchsen, wurden einmal mit 25 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycinsulfat, GIBCO) gewaschen, wonach 14 ml DMEM/DEAE-Dextran/Chloroquin pro Platte zugegeben wurden. DMEM/DEAE Dextran/Chloroquin umfasst 75 ml DMEM und 30 μl 0,25 M Chloroquin in PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂PO₄) zusammen mit 0,75 ml 50 μg/ml DEAE-Dextran (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Zwanzig μg Plasmid DNA in 135 μl Tris/EDTA-Puffer (TE) wurden pro Platte zugegeben und die Platten wurden zwei Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Medien wurden entfernt und 12 ml von 10% DMSO/PBS wurden für eine Minute zugegeben und entfernt. Die Zellen wurden einmal mit 25 ml DMEM gewaschen, wonach weitere 25 ml DMEM, enthaltend 10% fötales Kalbsserum (Hyclone, Logan, UT), zugegeben wurden und die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Medien wurden entfernt und die Monoschicht wurde mit 25 ml CMF-PBS gewaschen. Sechs ml einer Lösung, die 0,05% Trypsin/0,5 mM EDTA (Gibco) enthielt, wurde zugegeben und die Zellen wurden fünf Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden von den Platten durch Verreibung entfernt und zu den kegelförmigen Zentrifugenröhrchen überführt. Die Platten wurden mit sechs ml vollständigem DMEM gewaschen, um jegliche zurückbleibende Zellen zu ernten, und die Waschlösung wurde zu den Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung für fünf Minuten bei ungefähr 340 × G pelletiert, in fünf ml komplettem DMEM resuspendiert, zu einer 15 cm Gewebskulturschale, enthaltend 20 ml komplettes DMEM, entfernt und über Nacht in 5% CO₂ inkubiert.
Die Monoschicht wurde zweimal mit CMF-PBS gewaschen, fünf Minuten bei 37°C in Versene (0,5 mM Na₂EDTA·2H₂O, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,1 mM Glucose, pH 7,4) inkubiert und wie vorstehend beschrieben geerntet. Die pelletisierten Zellen wurden mit CMF-PBS gewaschen, in Trockeneis gefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Die Zellen wurden in Puffer (50 mM MOPS, pH 7,2, 10 μM Zinksulfat, 1 mM DTT, 2 mM Benzamidin, 10 μg/ml jeweils Pepstatin, Leupeptin und Aprotinin, und 20 μg/ml jeweils Calpain I- und Calpain II-Inhibitoren) durch Durchgang durch eine French-Druckzelle (SLM Instruments) bei 20 000 psi lysiert und die PDE-Aktivität wurde wie in Beispiel 5 beschrieben bestimmt.
PDE8A-Expression war in dem COS-Zellextrakt niedrig und konnte auf Grund des hohen Anteils von Hintergrundaktivität von endogenen PDE nicht genau charakterisiert werden. Um vollständiger das COS-Zellexpressionsprodukt zu charakterisieren, wird das Enzym, einschließlich FLAG Tag an dem Aminoterminus (Beispiel 5), von einem 100 000 × G Überstand Zellextrakt, unter Verwendung einer Anti-FLAG-M2-Affinitätssäule (Sigma), gemäß dem von den Herstellern vorgeschlagenen Protokoll gereinigt. Um genauer die Hefe-PDE8A-Aktivität zu charakterisieren, wird Expression von rekombinantem Protein, das an dem Aminoterminus trunkiert ist, jedoch die katalytische Region beibehält, wie in Beispiel 5 in einem Versuch zur Gewinnung von homogenem Protein beschrieben, ausgeführt.
Beispiel 10
Herstellung von Anti-PDE8A-Antikörpern
Ein GST-Fusionsprotein wurde in E. coli hergestellt, um ein Antigen zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern an PDE8A bereitzustellen. Ein EcoRI-Fragment von FB70a (eine PDE8A cDNA, die Nucleotide 182-1330 von FB85c-2 einschließt und die jenes von neun Klonen, die ursprünglich identifiziert wurden, war, welche durch die volle Länge von WO4835-Sonde, beschrieben in Beispiel 2, hybridisierte) wurde in die EcoRI-Stelle von pGEX5X1 (Pharmacia) inseriert und der erhaltene Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm XL1 Blue transformiert. Ein GST-PDE8A-Fusionsprotein, einschließlich 382 Aminosäuren von PDE8A, wurde nach Einführung mit IPTG aus diesem Konstrukt hergestellt. Das Fusionsprotein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE isoliert, wobei die Bande von geeigneter Größe aus dem Gel, nach Anfärben mit kalter 0,4 M KCl, herausgeschnitten wurde, und das Protein aus dem Acrylamid durch Elektroelution erhalten wurde. Das Elutionsprodukt wurde gegen PBS dialysiert und, unter Verwendung von Centriprep 10 und Centricon-Säulen (Amicon, Beverly MA), vor dem Einspritzen in die Maus aufkonzentriert.
Am Tag 0 wurden vier Balb/c-Mäuse vorbluten lassen und subkutan mit einer Gruppe von Antigenen, einschließlich 30 μg/Maus GST-PDE8-Fusionsprotein in vollständigem Freund'schem Adjuvant in 200 μl Gesamtvolumen, injiziert. Die gleichen Injektionen wurden bei Wochen drei und neun in unvollständigem Freund'schem Adjuvant wiederholt. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden Testblutungen erhalten und durch Antigen-Einfang-ELISA- und Western-Analyse abgesucht.
In dem ELISA wurden Immunolon-4-Platten (Dynex, Cambridge, Massachusetts) bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung einer Lösung, enthaltend 2 μg/ml GST-PDE8 in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, beschichtet. Die Platten wurden mit 0,5% Fischhautgelatine (Sigma) für 30 Minuten blockiert und 50 μl Serum, verdünnt in PBS mit 0,5% Tween 20 (PBST), wurden zugegeben. Serumverdünnungen lagen im Bereich von 1:100 bis 1:102400 und wurden durch eine Reihe von Doppelverdünnungen erhalten. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und dreimaligem Waschen mit PBST, wurden 50 μl Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziege-Anti-Maus-IgG(fc)-Antikörper (Jackson) (verdünnt 1:10000 in PBST) zugegeben. Die Platten wurden wie vorstehend inkubiert und viermal mit PBST gewaschen. Antikörper wurde mit Zusatz von Tetramethylbenzidin (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) nachgewiesen und die Farbreaktion wurde nach fünf Minuten mit der Zugabe von 50 μl 15%iger H₂SO₄ gestoppt. Absorption bei 450 nM wurde auf einem Plattenleser gemessen.
Zur Western-Analyse wurden SDS-PAGE-Gele mit ungefähr 10 μg Hefe-PDE8-Extrakt und ungefähr 200 ng Gel-gereinigtem GST-PDE8 laufen lassen und die Proteine wurden zu Immobilon-PVDF überführt. Ein Standard-verstärktes Chemilumineszenz(ECL)-Westernblot-Protokoll wurde unter Verwendung von BioRad Ziege-Anti-Maus-IgG-Meerrettich-Peroxidase als dem zweiten Antikörper ausgeführt.
Beim Präparieren von Hybridoma wurden Splenozyten von Mäusen, die ein positives Ergebnis bei den vorstehenden ELISA- und/oder Western-Blotting-Protokollen ergeben, an NS-1-Zellen in einem Verhältnis von 5:1 durch Standardverfahren, unter Verwendung von Polyethylenglycol 1500 (Boehringer Mannheim) (Harlow und Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), kondensiert. Die kondensierten Zellen wurden in 200 ml RPMI, enthaltend 15% FBS, 100 mM Natrium hypoxanthin, 0,4 mM Aminopterin, 16 mM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Einheiten/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ murine Thymozyten/ml und in zehn 96-Vertiefungs-Flachboden-Gewebskulturplatten dosiert (Corning, United Kingdom), bei 200 μl/Vertiefung resuspendiert. Die Zellen wurden an Tagen 2, 4 und 6, Tagen nach Fusion durch Absaugen mit ungefähr 100 μl für jede Vertiefung mit einer 18G-Nadel (Becton Dickinson) und Zusetzen von 100 μl/Vertiefung Plattierungsmedium, vorstehend beschrieben, ausgenommen enthaltend 10 Einheiten/ml IL-6 und dem Fehlen von Thymozyten, zugeführt. An Tagen 9 bis 12 wurden die Überstände von den Fusionsvertiefungen durch Antigen-Einfang-ELISA, unter Verwendung von GST und GST-PDE8, und durch ECL-Western-Analyse, wie vorstehend beschrieben, abgesucht.
Ein positives Signal der erwarteten Größe wurde auf beiden Wegen des Western-Blots, unter Verwendung von Mausblut und einem monoklonalen Antikörper mit sehr schwacher Reaktivität, auf das Hefe-rekombinante Protein in der anschließenden Fusion erhalten. Das gesamte Verfahren wurde, unter Anwendung von 50 μg Antigen/Maus, wiederholt, um stärkere immunoreaktive monoklonale Antikörper zu erhalten.
Beispiel 11
Analyse von PDE8A-Expression durch In-situ-Hybridisierung
Expression von PDE8A wurde in Gewebsabschnitten durch In-situ-Hybridisierung, wie nachstehend beschrieben, geprüft.
Herstellung einer Sonde
Ein XhoI/EcoRI-Restriktionsenzymfragment von der cDNA FB70a (entsprechend Nucleotiden 571 bis 1226 von SEQ ID NO: 1) wurde in einen Bluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) zur Erzeugung eines Expressionsplasmids, bezeichnet PDE8XR2A, subgeklont. Das Plasmid wurde mit XhoI gespleißt und mit T3-Polymerase, zur Erzeugung einer Antisensesonde (siehe nachstehend), transkribiert. Eine Sensesonde wurde durch Spleißen von PDE8XR2A mit EcoRI und Transkribieren mit T7-Polymerase erzeugt. Die PDE8A-Template wurden, unter Verwendung eines RNA-Transkriptionskits (Stratagene, La Jolla, CA) in einer Reaktion, enthaltend 5 μl 5x-Transkriptionspuffer (Stratagene), 30 mM DTT (Stratagene), 0,8 mM jeweils ATP, CTP, GTP (10 mM (Stratagene)), 40 U RNase Block II (Stratagene), 12,5 U T3- oder T7-Polymerase (Stratagene) und 300 ng linearisiertes Plasmidtemplat, 50 μCi ³⁵S-UTP (größer als 1000 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heights, IL), transkribiert. Das Gemisch wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert, wonach Templat-DNA durch Zusatz von 1 μl RNase-freier DNase I (Stratagene) und Inkubation für 15 Minuten bei 37°C entfernt wurde. Die Sonde wurde durch Zusetzen von 4 μl 1 M NaHCO₃ und 6 μl 1 M Na₂CO₃ für 22 Minuten bei 60°C hydrolysiert, und das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von 25 μl einer Lösung, enthaltend 100 μl 3 M Natriumacetat, 5 μl Essigsäure (VWR, So. Plainfield, NJ) und 395 μl dH₂O, neutralisiert. Eine Quick Spin G50 RNA-Säule (5' –3' Inc., Boulder, CO) wurde gemäß dem von den Herstellern vorgeschlagenen Protokoll hergestellt. Die Sonde wurde in der Mitte der Säule angeordnet und die Säule wurde vier Minuten bei 1000 U/min auf einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Säulendurchfluss wurde mit 50 μl dH₂O, 2 μl einer 10 mg/ml tRNA-Lösung, 10 μl 3 M Natriumacetat und 200 μl 100 Ethanol (VWR) vermischt, und das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei –20°C inkubiert. Die Sondenlösung wurde für 15 Minuten bei 4°C mikrofugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 40 μl 1 × TBE, enthaltend 1 μl 0,1 M DTT, resuspendiert. Die Sonde wurde bei –70°C, bis das In-situ-Hybridisierungsassay ausgeführt wurde, gelagert.
Herstellung von Gewebssonden und In-situ-Hybridisierung
Gewebe (National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA und Cooperative Human Tissue Network, Philadelphia, PA) wurden bei 6 μm geschnitten und in Superfrost Plus Scheiben (VWR) angeordnet. Die Abschnitte wurden für 20 Minu ten bei 4°C in 4%igem Paraformaldehyd (Sigma, St. Louis, MO) fixiert. Die Scheiben wurden in drei Chargen von 1 × CMF-PBS gespült, mit drei aufeinander folgenden Waschungen mit 70%igem Ethanol, 95%igem Ethanol und 100%igem Ethanol entwässert und 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Die Scheiben wurden in 70%igem Formamid (J. T. Baker) in 2 × SSC für zwei Minuten bei 70°C angeordnet, in 2 × SSC bei 4°C gespült, durch 70%ige, 95%ige und 100%ige Ethanolwaschungen entwässert und 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet.
Ein Vorhybridisierungsschritt wurde durch Anordnen der Scheiben in einer luftdichten Box, enthaltend ein Stück Filterpapier, gesättigt mit Boxpufferlösung, enthaltend 50%iges Formamid (J. T. Baker) in 4 × SSC, ausgeführt. Jeder Abschnitt wurde mit 100 μl rHB2-Puffer, bestehend aus 10%igem Dextransulfat (Sigma), 50%igem Formamid (J. T. Baker, Philipsburg, NJ), 100 mM DTT (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,3 M NaCl (Sigma), 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA (Sigma) und 1 × Denhardt's-Lösung (Sigma), bedeckt und die Scheiben wurden für 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Die Sonde, wie vorstehend beschrieben, wurde durch Vermischen von 4 × 10⁵ cPm/Gewebsabschnitt mit 5 μl einer 10 mg/ml tRNA-Lösung pro Abschnitt und Erhitzen des Gemisches auf 95°C für drei Minuten hergestellt. Eiskalter rHB2-Puffer wurde zugegeben, um ein Endvolumen auf 20 μl/Abschnitt zu bringen. Die Sonde enthaltende Lösung (20 μl/Abschnitt) wurde zu 100 μl rHB2-Puffer, vorher aufgetragen, gegeben. Die Scheiben wurden bei 55°C für 12 bis 16 Stunden inkubiert. Nach Hybridisierung wurden die Scheiben einmal in 4 × SSC, enthaltend 10 mM DTT, für eine Stunde bei Raumtemperatur, einmal in 50%igem desionisiertem Formamid (J. T. Baker), 1 × SSC, und 1 mM DTT für 40 Minuten bei 60°C, einmal in 2 × SSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur, und einmal in 0,1 × SSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gewaschen. Die Abschnitte wurden durch 70%ige, 95%ige und 100%ige Ethanolwaschungen entwässert und für 30 Minuten luftgetrocknet. Die Scheiben wurden in Kodak NTB2-Kernemulsion getaucht, für eine bis drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln getrocknet und im Dunkeln bei 4°C in einem Exsikkator bis zur Entwicklung gelagert. Die Scheiben wurden in 4°C Kodak Dektol-Entwickler für vier Minuten entwickelt, viermal in 4°C dH₂O getaucht und in 4°C Kodak-Fixierungsmittel für vier Minuten angeordnet. Die Scheiben wurden in dH₂O gespült und eine Standard-H&E-Anfärbung wurde wie nachstehend ausgeführt.
Die Scheiben wurden in dH₂O gespült und mit Hematoxylin und Eosin durch Überführung der Scheiben durch eine Reihe des nachstehenden Schritts angefärbt: fünf Minuten in Formaldehyd/Alkohol (100 ml Formaldehyd, 900 ml 80%iges Ethanol); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; fünf Minuten in 0,75 Harris-Hematoxylin (Sigma); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; eine Eintauchung in 1% HCl/50% Ethanol; eine Spülung in Wasser; vier Eintauchungen in 1%igem Lithiumcarbonat; zehn Minuten in Leitungswasser; zwei Minuten in 0,5% Eosin (Sigma); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; zwei Minuten in 70%igem Ethanol; drei Eine-Minute-Spülungen in 95%igem Ethanol; zwei Eine-Minute-Spülungen in 100%igem Ethanol; und zwei Zwei-Minuten-Spülungen in Xylol. Die Scheiben wurden mit Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) befestigt.
Die mit einer Antisense-PDE8A-Sonde erhaltenen Signale wurden mit den Kontrollsignalen, erzeugt durch eine Sense-PDE8A-Sonde, verglichen, und jedes Signal, das mit der Antisensesonde spezifisch war, wurde als PDE8A-Expression wiederzugeben angenommen. Das PDE8A-Signal wurde durchgängig durch das Cerebellum, in einer Unterreihe von Zellen in den Seminiferousröhrchen der Tests, auf verstreuten Zellen von noch unbestimmten Ursprungs, in dem Skelettmuskel, in Granulosazellen und Ovarienstroma in dem Ovarium, in Epithelialzellen in der Schleife von Henle in der Niere, und in dem Glattmuskel von einigen Arteriolen im Herzen, nachgewiesen.
Diese Ergebnisse unterscheiden sich von jenen, die durch Northern-Blotting und beschrieben in Beispiel 6 erhalten wurden, dahingehend, dass ein moderates Signal im Herzen durch Northern-Blot nachgewiesen wurde, während die In-situ-Daten, unter Anwendung dieser Herzsonde, ein schwaches Signal ergab. Die Inkonsistenz könnte Unterschiede in den Geweben von verschiedenen Individuen reflektieren, oder den Anteil des Nachweises von Unterschieden, die in den zwei Verfahren inhärent sind. Das Signal in dem Ovarium und das Signal in der Niere können anzeigen, dass PDE8A in die Ovulation bzw. in Salz- und/oder Wasserhämostase einbezogen sind.
Zahlreiche Modifizierungen und Änderungen in der Erfindung, wie in den vorstehend erläuterten Beispielen angeführt, können gemäß dem Fachgebiet erfolgen. Folglich sollten nur solche Begrenzungen, wie in den beigefügten Ansprüchen aufscheinen, der Erfindung auferlegt werden.
SEQUENZ LISTING

Claims

PDE8 Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 2.
PDE8 Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 4.
PDE8 Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 6.
Polynukleotid, das für das Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 4, umfassend die Sequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 1.
Polynukleotid nach Anspruch 4, umfassend die Sequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 3.
Polynukleotid nach Anspruch 4, umfassend die Sequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 5.
Polynukleotid, das für ein menschliches PDE8 Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 7; und b) einer DNA, die unter moderat stringenten Bedingungen an das Komplement des Polynukleotids nach a) hybridisiert, wobei diese moderat stringenten Bedingungen ein finales Waschen bei 65°C in 2 × SSC und 0,1% SDS umfassen.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 8, das ein DNA Molekül ist.
Polynukleotid nach Anspruch 9, wobei die DNA ein cDNA Molekül ist.
Polynukleotid nach Anspruch 9, wobei die DNA ein genomisches DNA Molekül ist.
Polynukleotid nach Anspruch 9, wobei die DNA ein ganz oder teilweise chemisch synthetisiertes DNA Molekül ist.
Anti-sense Polynukleotid, das spezifisch mit einem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 8 hybridisiert.
Expressionskonstrukt, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis B.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 8 oder dem Expressionskonstrukt nach Anspruch 14.
Verfahren zur Herstellung eines PDE8 Polypeptids, umfassend die Schritte von: a) Anziehen der Wirtszelle nach Anspruch 15 unter für die Expression des PDE8 Polypeptids geeigneten Bedingungen, und b) Isolieren des PDE8 Polypeptids aus der Wirtszelle aus dem Mediums seines Wachstums.
Antikörper, spezifisch immunreaktiv mit dem Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3.
Antikörper nach Anspruch 17, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 18 sekretiert.
Anti-Idiotyp Antikörper, der spezifisch immunreaktiv mit dem Antikörper nach Anspruch 18 ist.
Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Bindepartnerverbindung eines PDE8 Polypeptids, umfassend die Schritte von: a) in Kontakt bringen des PDE8 Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Verbindung unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE8 Polypeptid ermöglichen, b) Nachweisen der Bindung der Verbindung an das PDE8 Polypeptid, und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindepartner des PDE8 Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei in Schritt b) eine Modulation der Aktivität des PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei in Schritt b) eine Inhibierung der Aktivität des PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei in Schritt b) eine Verstärkung der Aktivität des PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.
Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Bindepartnerverbindung eines PDE8 Polynukleotids, umfassend die Schritte von: a) in Kontakt bringen des PDE8 Polynukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 8 mit einer Verbindung unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE8 Polynukleotid ermöglichen, b) Nachweisen der Bindung der Verbindung an das PDE8 Polynukleotid, und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindepartner des PDE8 Polynukleotids.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei in Schritt b) eine Modulation der Expression des durch das PDE8 Polynukleotid kodierten PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei in Schritt b) eine Inhibierung der Expression des PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei in Schritt b) eine Verstärkung der Expression des PDE8 Polypeptids nachgewiesen wird.