JP2001512327A

JP2001512327A - ホスホジェステラーゼ８ａ

Info

Publication number: JP2001512327A
Application number: JP52275099A
Authority: JP
Inventors: ローニー，ケイト
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2001-08-21
Also published as: EP1571216A2; EP0944725B1; NO992916L; AU1097499A; EP1571216A3; IL175698A0; DE69830143D1; ES2245485T3; US6133007A; US20030215919A1; CN1229499C; NO992916D0; ATE295423T1; EP0944725A1; CA2275135A1; WO1999019495A1; RU2005136013A; CN1248291A; RU2272841C2; DE69830143T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトPDE8ポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現構築体、当該発現構築体で形質転換された宿主細胞、PDE8ポリペプチドを製造するための方法、アンチセンスポリヌクレオチド、PDE8ポリペプチドと特異的な免疫反応性を有する抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ホスホジエステラーゼ８Ａ本願出願は、1997年10月16日に出願され現在係属中の米国特許出願第08/951,6 46号の一部継続出願である。発明の技術分野本発明は、一般にPDE8Aと命名されたホスホジエステラーゼのファミリー及びその使用に関する。発明の背景ホスホジエステラーゼ（PDE）は、3',5'環状ヌクレオチドをそれに対応する5' モノホスフェートに加水分解する。環状ヌクレオチドのcAMP及びcGMPはそれぞれ、アデニリル及びグアニリルシクラーゼによって合成され、そして数多くの細胞シグナル伝達経路における第２メッセンジャーとして働く。第２メッセンジャーの持続時間及び強度は環状ヌクレオチドの合成速度及び加水分解速度の関数である。 PDEのファミリーが複数同定されている。命名のシステムには先ず、PDEファミリーを示す数が含まれる。今日までに、７つのファミリー（PDE1〜7）が知られており、これらは(i)一次構造；(ii)基質選択性；(iii)異なるモジュレーターに対する応答；(iv)特異的インヒビターに対する感受性；及び(v)調節の態様によって分類される［Loughney及びFerguson、Phosphodiesterase Inhibitors、Schu dtら（編集）Academic Press、ニューヨーク、ニューヨーク(1996)、1〜99頁］。ファミリーを示す数の後ろには、大文字が続き、これは異なる遺伝子を示しており、その大文字の後ろに第２の数字が続き、これは特異的なスプライス変異体または独特の転写開始部位を利用する特異的な転写物を示している。今日までに同定された哺乳動物のすべてのPDEのアミノ酸配列には、タンパク質のカルボキシ末端半分に位置するおよそ270アミノ酸の高度に保存された領域が含まれている［Charbonneauら、Proc.Natl.Acad.Sci．(USA)83巻、9308〜9312 頁(1986)］。保存されたドメインには、cAMP及び／またはcGMP加水分解に対する触媒活性部位と、２つの亜鉛結合部位と推定される部位と、さらにファミリーに特異的な決定子が含まれる［Beavo、Physiol．Rev．75巻、725〜748頁(1995)；F rancisら、J.Biol.Chem．269巻、22477〜22480頁(1994)］。様々なPDEのアミノ末端領域は、非常に多様であり、(i)カルモジュリン結合部位（PDE1）：(ii)非触媒性環状GMP結合部位（PDE2、PDE5、PDE6）；(iii)膜標的部位（PDE4）；(iv) 疎水性膜会合部位（PDE3）；及び(v)カルモジュリン依存性キナーゼII（PDE1）、cAMP依存性キナーゼ（PDE1、PDE3、PDE4）またはcGMP依存性キナーゼ（PDE5）のいずれかに対するリン酸化部位などといった他のファミリーに特異的な決定子を含んでいる［Beavo、Physiol．Rev．75巻、725〜748頁(1995)；Manganiello、 Arch.Biochem.Acta 322巻、1〜13頁(1995)；Contiら、Physiol．Rev．75巻、723 〜748頁(1995)］。 PDE1ファミリーのメンバーは、カルシウム−カルモジュリンによって活性化される。３つの遺伝子が同定されており、PDE1A及びPDE1Bは主としてcGMPを加水分解し、そしてPDE1CはcAMP及びcGMPの双方に対して高い親和性を呈することが示されている。PDE2ファミリーは、cGMPによって特異的に刺激されるものとして特徴付けられる［Loughney及びFerguson、前出］。PDE2Aという遺伝子が１つだけ同定されており、その酵素産物はエリスロ-9-(2-ヒドロキシ-3-ノニル)アデニン（EHNA）により特異的に阻害される。PDE3ファミリーに属する酵素はcGMPによって特異的に阻害される。PDE3A及びPDE3Bの２つの遺伝子が知られており、双方ともcAMP及びcGMPに対して高い親和性を有しているが、cGMP 加水分解に対するV_maxは十分に低いのでcGMPはcAMPに対する競合的インヒビターとして機能する。PDE3酵素は、ミルリノンによって特異的に阻害される［Loughn ey及びFerguson、前出］。PDE4ファミリーはcAMP加水分解の働きをし、これには PDE4A、PDE4B、PDE4C及びPDE4Dの４つの遺伝子が含まれ、各々が複数のスプライス変異体を有している。このファミリーのメンバーは、抗うつ剤のロリプラムによって特異的に阻害される。PDE5ファミリーのメンバーは非触媒性部位にてcGMP に結合し、そしてcGMPを優先的に加水分解する。PDE5Aという遺伝子１つだけが同定されている。光受容体PDE6酵素はcGMPを特異的に加水分解する［Loughney及びFerguson、前出］。遺伝子には、PDE6A及びPDE6B（そのタンパク質産物は二量体化して、もっと小さなγ阻害性サブユニットの２つのコピーと結合し、rod PD Eを形成する）、加えてPDE6C（２つの小タンパク質と会合してcone PDEを形成する）が包含される。PDE7ファミリーはcAMP加水分解の働きをするが、PDE4ファミリーとは違ってロリプラムによって阻害されない［Loughney及びFerguson、前出］。PDE7Aという１つの遺伝子のみが同定されている。かくして、細胞内第２メッセンジャーシグナル伝達におけるcAMP及びcGMPの重要性に鑑み、さらなるPDE種を同定することが当該技術分野において希求され続けている。これまでに知られていなかったPDEのファミリー、その遺伝子及びスプライス変異体の同定によって、環状ヌクレオチド経路が異常になっている状態や、さらに特定の細胞型におけるcAMP及び／またはcGMPの細胞内レベルのモジュレーションが望まれる状態を処置するためのさらなる薬理学的アプローチが提供されることとなるはずである。発明の要旨要約すると、本発明はPDE8と命名された新規PDEファミリーに対するポリペプチド及びその基礎をなすポリヌクレオチドを提供する。本発明には、天然に生じているものと天然に生じていないもの双方の、PDE8ポリヌクレオチド及びそのポリペプチド産物が包含される。天然に生じているPDE8産物には、PDE8ファミリーの中の別異の遺伝子及びポリペプチド種（すなわち、PDE8A）が包含され、これらの種には、同じ動物の細胞内に発現されている種や、さらには他の動物の細胞内に発現されている対応種相同体が包含されている。各PDE8種の中で、本発明はさらに、同じポリヌクレオチドによってコードされているが異なるmRNA転写物より生じるスプライス変異体（すなわち、PDE8A1及びPDE8A2）を提供する。天然に生じていないPDE8産物には、類似体（すなわち、１以上のアミノ酸が付加、置換、または欠失したもの）などの、天然に生じている産物の変異体や、共有結合修飾体（すなわち、融合タンパク質、グリコシル化変異体、Met^-1PDE8、Met^-2-Lys^-1 PDE8、Gly^-1PDE8等）を包含するPDE8産物が含まれる。PDE8ファミリーはcAMP 及びcGMPの双方の加水分解に対して高い親和性を呈するが他のPDEファミリーに対して特異的な酵素インヒビターに比較的低い感受性を呈するという点においてこれまでに知られているPDEファミリーから識別される。好ましい実施態様において、本発明は配列番号：１に示す配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらにまた配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。現在のところ好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む。本発明はPDE8A1及びPDE8A2と命名された２つのポリペプチドを生じさせる２つのスプライス変異体cDNAを提供する。PDE8A1及びPDE8A2ポリペプチド、ならびにそれらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明に包含されるPDE8 酵素ファミリーを代表するものとして本明細書に開示する。本発明は、ヒトPDE8をコードする新規の精製及び単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA配列及びmRNA転写物、双方ともセンス及び相補的アンチセンス鎖、さらにそれらのスプライス変異体を含む）を提供する。本発明のDNA配列には、ゲノミック及びcDNA配列のみならず、全体的または部分的に化学合成されたDN A配列が含まれる。本明細書で用いられ当該技術分野において理解される「合成された」の語は、ポリヌクレオチドを製造するための、酵素的方法に対して純粋に化学的な方法を称するものである。「全体的に」合成されたDNA配列は従って、全体に及んで化学的手段により製造されたものであって、そして「部分的に」合成されたDNAは、得られるDNAの一部分だけが化学的手段によって製造されたものである。ヒトPDE8ポリペプチドをコードする好ましいDNA配列は、配列番号：１に示される。さらに好ましいのは、配列番号：２のPDE8ポリペプチドと、配列番号：６及び４にそれぞれ示されるPDE8A1及びPDE8A2スプライス変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。PDE8A1及びPDE8A2をコードする好ましいポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号：５及び３に示されている。本発明はさらに、ヒトPDE8 DNAの種、好ましくは哺乳動物相同体を包含する。本発明はまた、配列番号：１、３及び５のポリヌクレオチドの非コード鎖、または相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするPDE8種をコードするDNA配列も含むものである。遺伝コードの縮重がなければそれとハイブリダイズするはずであるPDE8AポリペプチドをコードするDNA配列が、本発明によって企図される。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである：3X SSC、0.1％サルコシル、及び20mMリン酸ナトリウム、pH6.8で65℃にてハイブリダイゼーションを行い、１％SDSを含む2X SSCで65℃にて洗浄する。当該技術分野にあっては、Ausebelら、（編）Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1994)6.0.3〜6.4. 10頁に記載されるように、温度及び緩衝液、または塩濃度を変更することによって同等のストリンジェンシーの条件にできることは理解されるはずである。ハイブリダイゼーション条件の改変は、経験的に決定するか、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さ及び含有率に基づき正確に算定することが可能である。Sambrookら（編）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、C old Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（19 89）9.47〜9.51頁に記載される通りに、ハイブリダイゼーション条件を算定できる。 PDE8配列を組み込んだプラスミド及びウイルスDNAベクターなどの、自己複製する組換え発現構築体も提供される。PDE8をコードするポリヌクレオチドが、内在性または外来性発現制御DNA配列及び転写ターミネーターに作動可能に連結された発現構築体も提供される。本発明のさらなる特徴によれば、本発明のPDE8ポリペプチドの発現を許容するように、本発明のDNA配列で安定にまたは一過性に形質転換された、原核細胞及び真核細胞を含む宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、PDE8と特異的な免疫反応性を有する抗体の開発のための免疫原の貴重な供給元である、本発明の宿主細胞は、PDE8ポリペプチドの大量生産のための方法においてきわめて有用なものでもあり、かかる方法では、細胞が好適な培地中で生育され、そして目的のポリペプチド産物が、細胞からまたは細胞が生育される培地から、例えばイムノアフィニティー精製によって単離される。 PDE8 DNA配列の知見により、内在性PDE8の発現を許容または増加させるような細胞の修飾が可能となる。細胞がより高いレベルでPDE8を発現するよう、異種性のプロモーターのすべてまたは一部を用いて、天然に生じているPDE8プロモーターの全体または一部を置換することによって、PDE8の発現増大をもたらすように細胞を修飾することができる（例えば、相同組換えによる修飾）。異種性プロモーターは、PDE8をコードする配列に作動可能に連結するように挿入される。例えば、PCT国際公開第WO 94/12650号、PCT国際公開第WO 92/20808号、及びPCT国際公開第WO 91/09955号パンフレットを参照されたい。本発明はまた、異種性プロモーターDNAに加えて、増幅可能なマーカーDNA（例えば、ada、dhfr、ならびに及びカルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼをコードする多機能CAD遺伝子など）及び／またはイントロンDNAを、異種性プロモーターDNAと共に挿入してもよい。PDE8コーディング配列に連結される場合、標準的な選択方法によるマーカーDNAの増幅の結果、細胞でのPDE8コーディング配列の共増幅が導かれる。本発明によって提供されるDNA配列情報はさらに、例えば相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Capecchi、Science、244巻、1288〜1292頁(1989)］による、機能を有するPDE8を発現しない、またはPDE8の変異体を発現する動物の開発も可能になる。かかる動物は、 in vivoでのPDE8及びPDE8のモジュレーターの活性を調べるためのモデルとして有用である。本発明はまた、精製及び単離された哺乳動物PDE8ポリペプチドを提供する。現在のところ好ましいPDE8Aポリペプチドは、配列番号：４及び６に示される。最も好ましいのは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むPDE8ポリペプチドである。本発明のPDE8ポリペプチドは、天然の細胞供給源から単離されても、あるいは化学合成されてもよいが、好ましくは本発明の宿主細胞を用いた組換え法によって製造される。哺乳動物宿主細胞の使用によって、本発明の組換え発現産物に対する至適な生物学的活性を付与するのに必要がもしれない転写後修飾（例えば、リコシレーション、トランケーション、リピデーション及びリン酸化など）が提供されることが予測される。本発明のPDE8産物は、全長のポリペプチド、生物学的に活性を有するその断片、またはPDE8特異的な生物学的活性を保持している変異体であってもよい。変異体には、（１）PDE8に特異的な生物学的活性もしくは免疫学的特性を損失することなく、または（２）PDE8の特定の生物学的活性の無力化を伴って、１以上の特定の（すなわち、天然にコードされている）アミノ酸が欠失もしくは置換されているか、または１以上の不特定のアミノ酸が付加されているPDE8ポリペプチド類似体が含まれうる。本発明の変異体産物には、成熟PDE8A産物、すなわちリーダーまたはシグナル配列が除去され、さらなるアミノ末端残基を有するPDE8産物が含まれる。−１位にさらなるメチオニン残基を有するPDE8産物（Met^-1-PDE8）が企図され、同様に −２及び−１位にさらなるメチオニン及びリジン残基を有するPDE8産物（Met^-2- Lys^-1-PDE8）も同様に企図される。これらのタイプの変異体は、細菌細胞型での組換えタンパク質の生産に対して特に有用である。本発明はまた、特異な発現系の使用に起因したさらなるアミノ酸残基を有する PDE8変異体をも含むものである。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質などの所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用によって、その所望のポリペプチド由来のGST成分の切断の結果、−１位にさらなるグリシン残基を有する目的のポリペプチドが提供される。他のベクター系での発現から得られる変異体もさらに、本発明で企図される。本発明はさらに、１以上の水溶性ポリマー接着物を含むように修飾されたPDE8 産物が包含される。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（PEG）サブユニットで共有結合修飾されたPDE8産物である。水溶性ポリマーは、例えばPDE8産物のアミノ末端などの特定の位置に結合させても、あるいはポリペプチドの１以上の側鎖に無作為に接着させてもよい。さらに本発明によって企図されるのは、PDE8産物またはその断片に対して特異的な抗体（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体等）ならびに他の結合タンパク質である。特異的な結合タンパク質は、単離されたPDE8産物もしくは組換えPDE8産物、PDE8変異体、またはこのような産物を発現している細胞を使用して開発することができる。結合タンパク質は、PDE8産物を精製するため、そして既知の免疫学的方法を使用して体液及び組織試料中のPDE8産物を検出または定量するために有用である。結合タンパク質はまた、PDE8の生物学的活性、特にシグナル伝達経路に関与する活性をモジュレートする（すなわち、ブロッキング、阻害する、または抑制する）上で極めて有用である。抗PDE8抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、さらに企図される。本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示を通じて寄与される情報の価値は、明白である。一連の実験にて、PDE8Aに対するcDNAの配列の知見から、PDE8や、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のPDE8発現制御配列をコードするゲノミックDNA配列の同定が、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用によって可能となる。中程度から高度のストリンジェント条件下に本発明のDNA配列を用いて行ったDNA/DNAハイブリダイゼーション法で同様に、PDE8Aの対立変異体をコードするDNAの単離が可能となることが予測され：対立変異体は当該技術分野においてPDE8Aに特異的な生化学的及び／または免疫学的特性の１以上持つ構造的に関連するタンパク質を含むことが知られるものである。同様に、PDE8Aと相同なタンパク質をコードする非ヒト種の遺伝子も、サザン分析及び／またはPCR分析によって同定することができる。選択手段として、PDE8Aの１以上の生物学的特性を持つ、非ヒトタンパク質、さらには他のヒトPDE8産物、そのタンパク質をコードするDNAを同定するために相補性試験が有用でありうる。本発明のポリヌクレオチドは、細胞がPDE8を発現する能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドは、１以上の疾患の原因となっているPDE8遺伝子座における遺伝的変化を同定するための診断方法に対する基礎をなすものとなりうる。さらに本発明によって実現されるのは、PDE8をコードするポリヌクレオチドを認識する、またはハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。全長及び断片のアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。アンチセンスポリヌクレオチドは、PDE8 mRNAを発現している細胞によるPDE8の発現調節に特に関連するものである。本発明によって提供されるDNA及びアミノ酸配列情報によりさらに、PDE8の構造及び機能の系統的な分折が可能になる。PDE8に対するDNA及びアミノ酸情報によってさらに、PDE8Aと相互作用すると考えられる分子の同定が可能となる。PDE 8ホスホジエステラーゼ活性に対するモジュレーターと推定される物質をPDE8とインキュベートし、そしてそのモジュレーター推定物質のPDE8ホスホジエステラーゼ活性に対する効果を判定することによって、PDE8活性をモジュレートする（すなわち、増加、減少または阻止する）物質を同定することができる。PDE8の活性をモジュレートする化合物の選択性は、その化合物の他のPDE酵素に対する活性と、PDE8に対する活性とを比較することによって評価することができる。ジ− ハイブリッドアッセイ及びスプリットハイブリッドアッセイなどの、細胞を用いた方法、さらにポリペプチドまたはその結合パートナーが固定化されるアッセイを含めたインビトロのアッセイ、及び溶液アッセイが、本発明によって企図される。選択的モジュレーターには、例えば、抗体及びPDE8またはPDE8核酸に特異的に結合する他のタンパク質またはペプチド、PDE8またはPDE8核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、ならびにPDE8またはPDE8をコードする核酸と特異的に結合する他の非ペプチド化合物（例えば、単離されたもの、または合成有機分子）などが包含されうる。野生型PDE8の酵素活性または細胞局在性に影響を及ぼすPD E8の変異体型もまた、本発明によって企図される。選択的モジュレーターを開発するための現在のところ好ましい標的には、例えば（１）他のタンパク質と接触する及び／または細胞内でのPDE8局在下に与るPDE8の領域、（２）基質と結合するPDE8の領域、（３）PDE8のアロステリック環状ヌクレオチド結合部位、（４）PDE8のリン酸化部位ならびに（５）PDE8サブユニットの多量体化に関わるPDE8の領域が包含される。PDE8活性のモジュレーターは、PDE活性が関わることが知られている広範囲にわたる疾患及び病理状態の処置において治療的に有用であるかもしれない。本発明はさらに、PDE8A酵素活性の小分子モジュレーターを企図する。小分子モジュレーターの同定のために使用されるには、少なくとも３つの異なるタイプのモジュレーターがある。これらに含まれるのは、（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、及び（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子を含んでなる組合わせライブラリーである。化学ライブラリーは、既知化合物、または天然産物のスクリーニングによって「ヒット」もしくは「リード（手がかり）」であると同定される化合物の構造類似体からなるものである。天然産物ライブラリーは、（１）土壌、植物もしくは海洋微生物由来の培養液の発酵及び抽出または（２）植物もしくは海洋生物の抽出によるスクリーニング用の混合物を創出すべく使用される、微生物、動物、植物、または海洋生物を集めたものである。組合せライブラリーは、混合物として、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から構成される。これらは、旧来の自動化合成方法、PCR、クローニング、または独自の（所有権のある）合成方法によって、比較的容易に調製される。特に重要なのは、ペプチド及びオリゴヌクレオチド組合せライブラリーである。さらに別の重要なライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド擬似物、多数平行合成収集品（mult iparallel synthetic collection）、再組合せのポリペプチドライブラリーが包含される。組合せ化学品及びそれから作出されたライブラリーの検討については、Myers、Curr．Opion．Biotechnol．8巻、701〜707頁( 1997)を参照されたい。本明細書中に記載された、様々なライブラリーを使用することによるモジュレーターの同定は、「ヒット」（あるいは「リード」）の候補物を、活性をモジュレートする能力を至適化するように修飾することを可能ならしめる。本発明はさらに、以下の工程すなわち、ａ）化合物とPDE8Aポリペプチドとの間の結合を許容する条件下にPDE8Aポリペプチドと化合物とを接触させ；ｂ）その化合物のPDE8Aポリペプチドとの結合を検出し；そしてｃ）PDE8Aポリペプチドの特異的結合パートナーとして化合物を同定する工程を含む、本発明のPDE8Aポリペプチドの特異的結合パートナー化合物を同定する方法を提供する。本発明の方法にて同定された結合パートナーは、好ましくは、酵素の阻害、活性化、または増強のいずれがによってPDE8A酵素活性をモジュレートする。本発明はさらに、以下の工程すなわち、ａ）化合物とPDE8Aポリヌクレオチドの間の結合を許容する条件下にPDE8Aポリヌクレオチドと化合物とを接触させ；ｂ）その化合物のPDE8Aポリヌクレオチドとの結合を検出し；そしてｃ）PDE8Aポリヌクレオチドの特異的結合パートナーとして化合物を同定する工程を含む、本発明のPDE8Aポリヌクレオチドの特異的結合パートナー化合物を同定する方法を提供する。PDE8Aポリヌクレオチドの結合パートナーは、好ましくは、発現を阻害するかまたは発現を増強することのいずれかによってPDE8AポリヌクレオチドによってコードされるPDE8Aポリペプチドの発現をモジュレートする。本発明はまた、本発明の方法によって同定された化合物や、さらに同定された化合物及び医薬上容認しうる担体を含む組成物も提供する。発明の詳細な説明本発明は、PDE8Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離、さらには、そのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現及び特徴付けに関する以下の実施例によって例証される。実施例１には、本発明のDNAを単離するために潜在的に有用なプローブを同定するための、発現配列タグ（EST）データベースを検索するための方法を記載する。実施例２は、PDE8Aをコードするポリヌクレオチドの同定に関する。実施例３には、単離されたポリヌクレオチドの配列分析を述べる。実施例４には、PDE8Aポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分析を記載する。実施例５には、組換えPDE8Aポリペプチドの発現を述べる。実施例５は、PDE8A発現のノザン分析に関する。実施例７には、PDE8Aをコードする遺伝子のクロモソームマッピングを記載する。実施例８には、PDE8A1及びPDE8A2がスプライス変異体であることの確証を記載する。実施例９には、組換えPDE8Aの発現及び特徴付けを述べる。実施例１０には、抗PDE8Aモノクローナル抗体の製造を詳説する。実施例１１には、in situハイブリダイゼーションによるPDE8A発現の分析を記載する。実施例１ヒトPDEに関連するESTの同定既知のヒト3',5'環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの配列を使用して、新規ホスホジエステラーゼ（PDE）遺伝子の同定のために潜在的に有用でありうるcDNA断片を同定することを目的としてNational Center for Biotechnology In formation（N CBI）発現配列タグ（EST）データベースの検索を実行した。このデータベースは、様々な組織供給源から集められたcDNAの一端または両端を示すDNA配列を含んでいる。そのcDNAの一端または両端についての、単回の配列決定操作が実施されており、DNA配列の質は非常に多様である。PDE検索が実施された時点では、EST 配列データベースは、様々な器官に由来する600,000を越えるcDNA配列を含んでいた。新規PDE配列の検索には、３つの上程が含まれていた。第１は、NCBIより入手可能なBLASTNプログラムを用いて、既知のヒトPDEをコードするcDNA配列と相同性を有するEST配列データベース内のDNA配列を同定した。このプログラムでは、ヌクレオチド配列データベースに対して照会ヌクレオチド配列が比較される。１５の既知ヒトPDEのcDNA配列が検索に付され、そして１５件のBLASTN検索が実施された。照会PDE配列には、PDE1A3[Loughneyら、J.Biol.Chem.271巻、796〜806 頁(1996)]、PDEIBI［Yuら、Cell Signaling、印刷中］、PDE1C2［Loughneyら、J .Biol.Chem.271巻、796〜806頁(1996)］、PDE2A3［Rosmanら、Gene 191巻、89〜 95頁(1997)］、PDE3A［Meacciら、Proc.Natl.Acad,Sci.（USA）89巻、3721〜372 5頁(1992)］、PDE3B［Mikiら、Genomics 36巻、476〜485頁(1996)］、PDE4A5［B olgerら、Moll.Cell.Biol．13巻、6558〜6571頁(1993)］、PDE4B2［Bolgerら、M oll.Cell.Biol．13巻、6558〜6571頁(1993)］、PDE4C［Bolgerら、Moll.Cell.Bi ol．13巻、6558〜6571頁(1993)］、PDE4D1及びPDE4D3［Bolgerら、Moll.Cell.Bi ol．13巻、6558〜6571頁(1993)］、PDE5A、PDE6A［Pittlerら、Genomics 6巻、2 72〜283頁(1990)］、PDE6B［Collinsら、Genomics 13巻、698〜704頁(1992)］、 PDE6C［Pirievら、Genomics 28巻、429〜435頁(1995)、］ならびにPDE7A1［Mich aeliら、J.Biol.Chem．17巻、12925〜 12932頁(1993)］が含まれていた。BLASTNの結果を検証し、そして１５の既知PDE cDNAの各々に対応すると判断されたEST配列を同定して表にまとめた。照会配列として用いられたPDE6A及びPDE6B配列は、cDNAの3'非翻訳領域に反復エレメントが存在するため、3'端で切断（3'非翻訳領域の一部を除去）したものであった。第２に、NCBI TBLASTNプログラムを用いて、１５の既知ヒトPDE（前記のとおり）のタンパク質配列と、EST DNA配列の各々によってコードされた６つの可能な異なるタンパク質との間の相同性を検証した．この検索で、EST配列は６つのフレームで翻訳されており、そこで、作製されるアミノ酸配列を照会PDEのアミノ酸配列と比較する。アミノ酸レベルで相同であるとして同定された配列を検証し、そして前記のBLASTN検索において既知PDEに対応するものとして陽性に同定されたEST配列はすべて破棄した。検索の第３工程には、既知のPDEではない配列を分析することが包含される。これらのアミノ酸配列は、既知PDEと相同であったが、BLASTN検索の際に１５の既知遺伝子の１つとして同定されることはなかった。 BLAST検索で、PDE2A、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE5A、rod alph a PDE6A、rod beta PDE6B、cone alpha PDE6C、及びPDE7Aの触媒領域と相同性を有するアミノ酸配列をコードするものとして、ヒト胎児肺cDNAライブラリーから EST配列（WO4835と命名）を同定した。WO4835に対するデータベース配列は、配列番号：７に示す。以下に述べるデータベース分析からの結果は、PDE4D配列データベースを用いて例証されたものである。 WO4835 cDNAは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）より得たものであり、これはI.M.A.G.E.、ローレンス・リバーモア・ナショナル・ラボラトリー（リバーモア、カリホルニア州）によって同定及び配列決定されたESTの寄託物を維持し、公に入手可能な状態にしているところである。WO4835 DNAは、受領次第配列決定し、その一致度を確認して配列番号：７に一致すると判定した。 EST配列WO4835の−１読み取り枠によってコードされるアミノ酸配列は、PDE1A 、1B及び1Cを除く照会cDNA配列のすべてにより認識された。例としてPDE4D3での TBLASTN検索を使用して、類似性のある２つの領域が検出された。第１の領域は、15／37の正確な整合、あるいは40％の一致度（19／37の類似アミノ酸）を示し、そして照会配列すべてに認められるHD(X)₂HXG(X)₁₃A（配列番号：８）モチーフを含んでいた。［Charboneau、Mol.Pharmacol.Cell Regul．2巻、267〜298頁( 1990)］。第２の領域は、9／20の正確な整合、あるいは45％の一致度を示し、そしてほとんどの照会配列に認められるYHNxxHAモチーフを含んでいた。WO4835配列のBLASTN分析によって、Genbankデータベースの他のヒトDNA配列のいずれとも一致していないということで、それが独自のものであることが明らかとなった。 WO4835についてのESTデータベースエントリーによって、PIR:A48719（ウシcGMP 結合性の、cGMPを加水分解するPDE5A1配列に類似のものとして、かかる配列が同定された。WO4835フレーム−１のタンパク質配列とウシPDE5A1配列との比較によって、全体として38％の一致度の、58／153の整合性が明らかになった。この領域内にあるのは、相同性がより高い小さな領域であり、１つの領域は12／14の一致したアミノ酸を示していた。WO4835配列の独特の性質、すなわちそのウシPDE5 A1との比較的低い相同性、及び他の既知ヒトPDEアミノ酸配列のほとんどに認められるアミノ酸モチーフの存在をもって、WO4835は新規のヒトPDE cDNAを表している。実施例２ PDE cDNA推定物の単離 WO4835 cDNAインサートを、pT7T3Dベクターから制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて２つの断片に消化し、そしてその２つの断片を２枚の連続低融点アガロースゲルを用いて精製した。両断片をプローブとして用いて、ヒト心臓（Stratage ne、La Jolla、カリホルニア州）及びヒト胎児脳（Stratagene）由来のcDNAライブラリーを当該技術分野で通常実施されている方法にてスクリーニングした。各ライブラリーからおよそ5x10⁵のファージをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、3X SSC、0.1％サルコシル、20mMリン酸ナトリウム、pH6.8、10X デンハーツ溶液、及び50μg/mlサケ精子DNAを含有する緩衝液中で65℃にて終夜行った。フィルターをオートラジオグラフィーにかける前に、2X SSC及び1％SDS を含有する緩衝液で65℃にて洗浄した。胎児脳cDNAライブラリーからの９つのクローンと心臓のcDNAライブラリーからの２つのクローンを、WO4835ブローブにハイブリダイズさせた。部分配列決定及びマッピングによって、さらに特徴づけを行うため、FB66aと命名した１つのクローンを胎児脳ライブラリーから選択した。胎児脳cDNAライブラリーから、およそ7.5x10⁵ファージの第２スクリーニングを、WO4835の5'部分に由来する1.3kbのEcoRI／HindIII断片を用いる第１スクリーニングで使用した条件のもとで行い、さらに１９のcDNAクローンを得た。これらのcDNAのうち６つも、WO4835の5'端にて256ヌクレオチドの領域を含むWO4835 のHindIII／KpnI断片にハイブリダイズした。そのクローンのうち５つの部分的な配列決定とマッピングから、さらなる分析対象としての FB85c-2と命名された第２のクローンを選択することとなった。実施例３ FB66a及びFB85c-2のDNA配列分析 FB66aのDNA配列を、下記配列番号：９から３１ＭＰDNAオリゴヌクレオチドプライマーとPerkin Elmer Applied Biosystems Division 373A DNAシーケンサーを用い、製造業者の示したプロトコルに従って双方の鎖について決定した。鋳型として用いたPCR産物の量は、PCR産物のサイズに基づいて算出し、そしてApliTa q DNAポリメラーゼFSを含むABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ Perkin Elmer、Foster City、カリホルニア州）と非対称PCRを用いて配列決定した。反応産物はAGCTスピンカラム（Advanced Genetic Technologies Corp、Gait herburg、メリーランド州）にて精製して乾燥させた。各精製試料に負荷用緩衝液を添加し、その混液を90℃にて２分間加熱した。溶液は、4％ポリアクリルアミドゲルに付されるまで氷に移しておいた。一端データ集積プログラムが開始されれば、データは自動的に集積され、そして配列分析プログラムによって自動的に分析及び読み取りがなされた。編集はすべて手動式で行われ、得られた配列の、コンセンサス配列が判定される場所におけるアラインメント（並列）が実施された。配列番号：３に示されるFB66a cDNAは、長さが4389ヌクレオチドであり、ヌクレオチド３位からヌクレオチド2411位が、803アミノ酸のタンパク質をコードしており、予測される分子量はおよそ90,775Daであった。FB66aに対する推定アミノ酸配列は、配列番号：４に示す。第１位のメチオニンはヌクレオチド45位でコードされているが、上流の読み取り枠内終始コドンがないことから、この残基が内部メチオニンかまたは読み取り枠開始部位に該当するのかは不明である。 FB85c-2のDNA配列（配列番号：５）は、プライマーM13Rev.1、W48A2、W48A9、 W48A4、W48S1、W48A1、W48S6、W48A5、W48A6、W48S2、W48S3、W48S4、W48S5、W4 8S7、W48A8、及びM13を用いて同様に決定した。FB85c-2は、２つの別のインサートを含んでいるらしく、そのうち１つだけがWO4835と相同であった。WO4835と相同な領域は、およそ2.8kbの長さであった。インサートの5'端の正確な配列は決定することができず、かくして配列番号：５に示す2573ヌクレオチドの配列には、5'-非翻訳領域かもしれない数百の配列が含まれていない。ヌクレオチド67位からヌクレオチド2406位は、779アミノ酸を有するタンパク質（配列番号：６）をコードし、これは見積もり88,353Daの分子量を有する。読み取り枠内上流終始コドンから、ヌクレオチド第67位でコードされるメチオニンが開始のメチオニンであると考えられる。 FB66a及びFB85c-2によってコードされるタンパク質は、オーターナティブスプライシングに起因するのかもしれないが、異なるアミノ末端配列を有している。 DNA配列は、FB66aのヌクレオチド112位とFB85c-2のヌクレオチド104位の5'から互いに分かれている。しかしてFB85c-2は、FB66aタンパク質には認められない13 アミノ酸をアミノ末端に有している。FB66aタンパク質は、ヌクレオチド第35位で開始メチオニンがコードされていると推定すれば23の独自のアミノ末端残基を含んでおり、FB66aクローンの読み取り枠が不完全なのであれば37以上の独自のアミノ酸残基を含んでいる。照会ヌクレオチド配列をFB66a配列のヌクレオチド配列データベースと比較することによるBLASTN分析で、かかる配列はGenBank、NCBI STS、NCBI HTGS、またはNCBI GSSデータベースに含まれる配列と一致度がないことが明らかになった。しかしながら、NCBI ESTデータベースでは、２つの一致配列が同定された。１つの配列は、このcDNAクローンを同定するために用いられたWO4835 ESTであった。結腸ガン細胞系KM12C（HCC）由来の第2の配列、AA307865（配列番号：32 ）は、FB66a及びFB85c-2クローンの3'非翻訳領域と一致度を示すものであった。 AA307865が同定された検索の際にさらなるEST DNAが同定され、これらはおそらく、FB66a及びFB85c-2によってコードされるヒトタンパク質との、マウス（EST AA386789、配列番号：38）及びラット（EST H32734、配列番号：33）相同体をコードしていると推定される。マウス配列はヒト配列と86％一致しており、ラット配列は81％一致していた。実施例４ FB85c-2及びFB66aタンパク質の分析クローンFB85c-2及びPB66aによってコードされるPDEは、それぞれPDE8A1及びP DE8A2と命名された。双方のPDE8Aタンパク質は、前記した分岐点を越えて完全なアミノ酸一致度を有しており、ヒトPDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B、及びPDE6Cに最も類似している。表１及び２に、PDE8AとPDE2A、PDE5A及びPDE6Aとの間のアミノ酸一致度の百分率を示す。 PDE8A1及びPDE8A2は、触媒領域（PDE8A1でアミノ酸第492位から748位まで）で他のPDEと、そしてPDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B、及びPDE6Cのアミノ末端領域で保存されているcGMP結合ドメイン（推定）と相同性を有している。PDE8AのcGMP 結合ドメイン（可能性のある部位）は、PDE8A1ポリペプチドのアミノ酸第75位から445位までに及んでいる。PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B、及びPDE6CのcGMP結合ドメイン内には、「a」及び「b」と命名された２つの内部反復配列があり、各反復配列は保存された一連のアミノ酸を含んでいる［McAllister-Lucasら、J.Biol.Chem.268巻、22863〜22873頁(1993)］。P DE8Aの対応する「b」反復領域では、保存されているアミノ酸のすべてが見いだされ、対応する「a」反復領域では、保存された残基のいくつかのみが検出された。ウシPDE5AによるcGMP結合に対して必須であることが示されているアスパラギン酸残基［McAllister-Lucasら、J.Biol.Chem．270巻、1〜9頁(1995)］は、PD E8Aの「a」反復領域には存在していない。従って、PDE8Aのこの領域がcGMPに結合するのか否かは不明である。表１表２実施例５組換えPDE8Aの発現 PDE8A1とPDE8A2の分岐点より3'の終始コドンに至るDNA配列を含む、PDE8Aに対する発現構築体を作製した。発現構築体には、８アミノ酸エピトープタグをコードするDNAが含まれていた。配列番号：34に示されるペプチド配列を含むいわゆる「FLAG tagを、配列番号：34のペプチドによって特異的に認識される抗FLAG M 2抗体（Eastman Kodak、Rochester、ニューヨーク）を用いたウェスタンブロッディング技術によってタンパク質を同定することができるようにするためにアミノ末端に付加した。配列番号：34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys タンパク質アミノ末端で開始のメチオニンをコードする配列も付加した。発現プラスミドを構築するうえでの第１工程として、２μl各プライマー（保存液100μg/ml）、2μl 10X PCR緩衝液II（Perkin Elmer）、2μl 10X各ヌクレオチド保存液（保存液２mM）、1.2μｌ MgCl₂（保存液25mM）、0.09μｌ５単位/μl taqポリメラーゼ（Perki n Elmer）、FB66a DNA及び水（反応混液を20μlとする）を含有する反応混合液中で、配列番号：35（下記）に示すプライマー及びW48A2（配列番号：10、14頁）を用い、鋳型としてFB66a DNAＷＰ使用してPCRを実施した。5'プライマー（配列番号：35）で、NcoI部位を強調文字で示し、そしてFLAG tagをコードする領域に下線を付した。 PCRは、以下の条件下にPerkin Elmer DNA Thermal Cyclerにて行った：94℃で４分間の後、94℃で１分間、50℃で１分間、及び72℃で２分間を３０サイクル実施。得られたPCR産物はNcoI及びKpnIで消化し、ゲルで精製して、同じ酵素で予め消化しておいたBluescript SKIIベクターへサブクローニングした。Bluescript ベクターは前もって、YepC-PADH2dベクターから取り出しておいたSacI／NcoIアルコールデヒドロゲナーゼ2（ADH2）プロモーター断片［Priceら、Meth.Enzymol .185巻、308〜315頁(1990)］を含むように修飾しておいたものであった。こうして得られたプラスミドは、W48pcrlと命名した。読み取り枠の3'部分を含むKpnI／SstI断片をFB66a DNAから単離して、予めKpn I及びEcoRVで消化したW48pcr1に挿入した。この結果得られたプラスミドをW485. 1と命名した。 ADH2プロモーター及びPDE8A遺伝子の5'部分を含むSacI／KpnI断片を、W49pcrl から単離した。PDE8Aの3'領域を含むKpnI／SalI断片を、W485.1から単離した。この２つの断片を、予めSac I及びSdlIで消化しておいた酵母発現ベクターYEpC-PADH2dに連結した。こうして得られたフラスミドをW48-2ADH2と命名し、ブダペスト条約のもと、郵便番号208 52、メリーランド州、パークロウン、ロックビル12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（A.T.C.C.）に、1997年10月２日に寄託した。プラスミドW48-2ADH2を保有する細菌株は受託番号ATCC 98552を受けた。正しいプラスミド構築を保証すべく、PCRによって作製されたDNA配列及びPDE8／ベクター接合部でのDNA配列を決定した。配列を確認したうえで、プラスミドを内在性P DE活性を欠損している酵母株BJ2-54（ura3-52;trpl;leu2;cir；gal2;pep4-3;prb -1122;prcl-402;ΔPDE1::URA3;HIS3;ΔPDE2::TRP1）へプラスミドを形質転換した。宿主細胞は2％グルコースを含むSC-leu選択培地にて終夜生育し、1〜2ｘ10⁵細胞数/mlに希釈して、引き続き同じ培地で10⁷細胞数/mlの密度にまで生育した。発現プラスミドの存在によって、非誘導条件下にあっても細胞生育の倍加時間が２倍から３倍増大するようであった。細胞を遠心分離によって集めて、３％グリセロールを含むYEP培地で洗浄し、YEP／3％グリセロールで10⁷細胞数/mlの密度に再懸濁して、回収するまでに２４時間生育させた。細胞は使用するまで凍結しておいた。凍結した細胞ペレット（0.06ml）を解凍し、100mM MOPS、pH8.0、200mM NaCl 、2μM ZnSO₂、２mMジチオスレトール、及び10μg/mlのペプスタチン、ロイペプチン、及びアプロチニンの各プロテアーゼを含む0.2mlの溶解緩衝液にて懸濁した。0.5mmのガラスビーズおよそ0.2mlを細胞に添加し、次いでこれを３０秒間、４サイクルのボルテックスによって溶解した。溶解液を吸引し、ビーズを0.3ml の溶解緩衝液で２回洗浄した。溶解液を洗浄液と合わせて酵母抽出液を作製した。実験によっては、溶解液を105,000xgにて３０分間遠心分離することによって分画した。以下のとおりに、組換えタンパク質を含有する酵母抽出液についてウェスタン分折を行った。最初にタンパク質をSOS−PAGEで分離し、標準法を用いてイモビロン-P（ミリポア）に転写した。タンパク質のブロットは、室温にて１時間、5 ％脱脂粉乳を含む20mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05％Tween-20（TBST緩衝液プラスミルク）用いてブロッキングした。ブロットは、１μg/mlの濃度で抗 FLAG M2抗体（前記）を含むTBST緩衝液プラスミルクと１時間インキュベートし、その後TBST緩衝液で４回洗浄した。次にブロットを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）に接合させた、ブロッティンググレードのアフィニティー精製済みヤギ抗マウスIgG抗体（BioRad）と共に１時間インキュベーートした。ヤギI gGは予め、TBST緩衝液プラスミルクにて1：10,000に希釈したものであった。ブロットをTBSTで４回洗浄し、オートラジオグラフィーを行う前に強化化学発光用のRenaissance（商品名）システム（New England Nuclear Life Sciences Produ cts）で、製造業者の示すプロトコルに従って処理した。抗体によって検出されたタンパク質のほとんどは、組換えタンパク質に対して推定されたサイズのものであった。 PDE活性は、以前報告されたとおり、³²P-cAMPまたは³²P-cGMPから遊離した³²P -ホスフェートの検出によってアッセイした［Loughneyら、J.Biol.Chem.271巻、 796〜806頁(1996)］。酵母抽出液は、0.5mg/mlのウシ血清アルブミンも含有する 0.5X溶解緩衝液で希釈した。酵母抽出液、または希釈した酵母抽出液の20μlを、さらに50mM Tris-HCl（pH8.0）、5mM MgCl₂、1μMZnSO₂、及び0.1mg/mlウシ血清アルブミンを含んだ100μl容量の反応液中でアッセイした。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法によってアッセイした。 PDE8AはcAMP及びcGMPの双方を加水分解することが観察された。分画されなかった溶解液では、cAMPに対する比活性は3.9nmol/分/mgで、cGMPに対しては7.6nm ol/分/mgであった。分画によって、総活性の20〜40％が高速上清画分に会合していることが明らかになった。基質としてcAMPを用いた場合の活性の反応速度解析により、１：１の活性比で、酵素の低及び高Km型の双方が存在することが示唆された。Km値の概算値は、0.2μM及び350μMであった。高速ペレットの分析によって、同じ種が存在しているものの、高Km：低Km活性の割合は１：４であることが示唆された。基質としてcGMPを用いた場合の反応速度解析によっても、酵素に低速度型及び高速度型が存在することが示唆された。これらの分析において、Km値は3μM及び300μMであると見積もられた。 PDE8A活性の阻害に対するIC₅₀値を、イソ酵素選択的PDEインヒビターと、非選択的インヒビターのイソメチルブチルキサンチン（IBMX）との組合せを用いて定量した。これらのアッセイは60nMのcAMP濃度で実施されたので、IC₅₀値は低Km型のみの阻害を反映している。結果を表３に示すが、この表で各数値はミクロモル単位を示している。表３イソ酵素特異的PDEインヒビターによるPDE8阻害選択的インヒビターの各々に対するIC₅₀値は、それらの標的イソ酵素に対するよりもPDE8に対する方が少なくとも３０倍の高さであり、このことによって、PDE8 の阻害アロファイルはPDE1〜5のものと異なっていることが示唆される。cAMP及びcGMPの加水分解は、PDE6及びPDE7Aの酵素活性とPDE8Aの酵素活性とを明瞭に識別する。非選択的インヒビターIBMXののPDE8に対するIC₅₀は、既知のヒトPDEについて観察された範囲内にあり、PDE8の触媒部位が哺乳動物PDEのものと類似しておりIBMXに非感受性の低等真核生物型と異なっていることを示唆していた。実施例６ PDE8A発現のノザン分析 PDE8A発現のノザン分析を、ヒト複数組織ブロット（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）を用いて行った。327塩基のプローブを、配列番号：３のヌクレオチド第1767位からヌクレオチド第2293位まで延ばした。リボプローブの調製及びハイブリダイゼーション条件は、以前に報告したことおりである［Loughneyら、前出］。その結果、すべての組織に9.5kbのmRNAが示されたがバンドの強度は相違していた。シグナルは、心臓、脳、及び腎臓で最も強く、また肝臓、胎盤、膵臓、及び骨格筋では弱かった。シグナルは肺で最も弱かった。実施例７ヒトPDE8AのクロモソームマッピングヒトPDE8A遺伝子を含む酵母の人工的なクロモソーム（YAC）を、Reseach Gene ticsより購入したヒトYACのパネルから単離して、以下のとおりにPCRによってスクリーニングした。 YACスーパープールを２つのネスト化された対でスクリーニングした。第１のスクリーニング反応では、センスプライマーW48S8（配列番号：36）を、アンチセンスプライマーW48A10（配列番号：37）と対合した。10mM Tris-HCl、pH8.3、 50mM KCL、2mM MgSO₄、0.2mMの各dNTP、10μg/mlの各プライマー、0.5単位のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）及び鋳型としての1.5μlのYACプールDNAを用いて PCRを行った。反応は30サイクル実施し、各サイクルは、94℃で１分間、60℃で２分間、及び72℃で４分間からなるものであった。増幅の第１回が終了した後、反応産物を内部プライマーの対であるW48S12（配列番号：36）及びW48A12（配列番号：37）を用いて再度増幅した。反応は、鋳型が第１回の反応液の１：10希釈液（水で希釈）の1μlであったことを除いて前記と同様とした。正しいサイズのPCR産物をもたらすスーパープールを同定し、対応するサブプールを、同じ条件下に同じネスト化したプライマー対を用いてスクリーニングし、PDE8Aを含ムYACについての独自のアドレスを同定した。関連するYACを保有している酵母株は、Research Geneticsより購入した。様々なYACにおけるPDE8A遺伝子の存在を立証するために、各株からDNAを調製し、W48 S8及びW48A10の対を用いたPCRによって分析した。各株からのDNAの調製は下記の修飾を施した前記方法［Hoffman及びWinston、Gene、57巻、267〜272頁(1987)］に従って行った。グルコースを含有するYEP培地で、30℃にて終夜、菌株を生育した。10mlの培養液を遠心分離によってペレット化し、10mM Tris-HCl、pH8.0、 100mM NaCl、１mM Na₂EDTA、1％SDS、及び2％Triton-X100を含有する水性緩衝液 200μｌに再懸濁した。200μlのフェノール／クロロホルム（１：１混合液）及び100μlのガラスビーズ（425〜600μm）の存在下にボルテックスを行うことによって細胞を溶解した。溶解の後、200μlのTE緩衝液（10mM Tris、pH8.0、１mM Na₂EDTA）を添加し、そして試料を遠心して相を分離させた。有機相を、再度20 0μlの水性緩衝液で抽出した。集めた水性緩衝液を37℃にて１時間、100単位のウシ膵臓RNase（Boehringer Mannheim）で処理し、その試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、再びクロロホルムで抽出して、確立されている方法に従って、エタノール沈殿した。得られたペレットは、50μlのTE緩衝液に再懸濁した。P CRは、反応液の容量が25μlであったことと、鋳型が1μlの関連酵母DNA調製物からなるものであったことを除き前記と同様に実施した。 PDE8遺伝子を含む３種のヒトYACを同定し、それらのアドレスは805B6、919H10 及び920A3（CEPH命名による）であった。ゲノムリサーチデータベースのセンター（Whitehead）情報によれば、この３種のYACは互いに重複しており、ヒトクロモソーム６上の一本に連結したコンティグ（WC6.16）の一部である。このコンティグ内の２つのタグ付けされた部位（D6S305及びD6S411）は、ゲノムリサーチセンターにおける作業で6pの端から167cMの位置でクロモソーム６遺伝マップ上に位置付けされ、D6S305はCEPH-Genethonでの作業で6pの端から173cMの位置にマッピングされている。WC6.16コンティグ内の他の３つのYAC（932F1、956B1及び947 D5）は、CEPH-Genethonにて、蛍光in situハイブリダイゼーションによってマッピングされている。ハイブリダイゼーションシグナルは6pの端から0.94と0.99画分長（fractional length）単位の間にあたる。CEPHで統括された概略マップ［C humakovら、Nature 377巻（追補）、175〜297頁(1995)］によれば、この領域は細胞遺伝学的領域6q26-27に対応する。ヒトゲノムのこの順域に関わる遺伝的欠損には、錐体変性（OMIMデータベース）、インスリン依存性糖尿病［Davlesら、Nature 371巻、130〜136頁(1994)；Lu oら、Am.J.Hum.Genet.57巻、911〜919頁(1995)］及び若年性パーキンソン病［Ma tsumineら、Am.J.Hum.Genet.60巻、588〜596頁(1997)］が包含される。加えて、ヘテロ接合性の喪失（LOH）が、バーキットリンパ腫［Parsaら、Genes,Chromoso mes & Cancer 9巻、13〜18頁(1994)］、星状細胞腫［Liangら、Neurology 44巻、533〜536頁(1994)］、胃ガン［Queimadoら、Genes,Chromosomes & Cancer 14 巻、28〜34頁(1995)］、副甲状腺腺腫［Taharaら、Cancer Res．56巻、599〜605 頁(1996)］及び卵巣ガン［Cookeら、Genes,Chromos omes & Cancer 15巻、223〜233頁(1996)；Saitoら、Cancer Res．56巻、5586〜5 589頁(1996)］を含めた様々な異なるガン細胞の、本領域に観察されることが多い。LOHは、患部での腫瘍抑制遺伝子の存在を示唆することが示されている［Wei nherg、Science 254巻、1138〜1146頁(1991)］。その発現が広範囲にわたるので、PDE8遺伝子の変異はこれら遺伝子異常のすべてかまたはあるものに関与している可能性がある。実施例８ PDE8A1及びPDE8A2がスプライス変異体であることの立証及びPDE8A2の5'配列を伸長する試み PDE8A1及びPDE8A2が5'スプライス変異体であることを立証するために、２つのアプローチを実行した。第１に、PCR分析により、ゲノミックDNAではPDE8A1とPD E8A2のいずれもが共通領域のDNA配列に隣接していないことが明らかになった。共通領域の上流のゲノミック配列は、第３のPDE8A cDNAであるFB74bに存在し、これは実施例２に記載のプローブWO4835の5'端にハイブリダイズした６つの元のクローンの群にて同定されたものである。クローンFB74bの部分配列（3'端の755 ヌクレオチド）は、配列番号：39に示す。FB85c-2とFB66aとが互いに分岐したと同じ部位で、FB74b cDNAはFB85c-2及びFB66aと分岐しているが、FB74bクローンは読みとり枠を維持していなかった。FB66a及びFB85c-2からの配列分岐点の5'側のFB74b配列では、読みとり枠内終止コドンが開始のメチオニンコドンよりも分岐点に近く、もしFB74bがスプライシングされていない前駆体でなくcDNAであるのならば開始のメチオニンは必然的に、FB66a及びFB85c-2の双方に共通の配列に位置しているはずであることを示唆していた。 FB74b上流配列内のFB74bS1（配列番号：40）と命名された１つのプライマーと、FB74b、FB66a、及びFB85c-2に共通の配列内にあるW18A9（配列番号：11）と命名された第２のプライマーとを用いて、PCR分析を実施した。 1μgのヒトゲノミックDNAを鋳型として用いて、FB74bを鋳型として用いて増幅したものと同じサイズを有するバンドを増幅し、FB74hに独特なその配列と共通領域とがゲノミックDNAにおいて隣接していることが示唆された。かように、FB74b 配列はスプライスされていないイントロンを表すか、または共通領域内に開始のメチオニンを有するタンパク質をコードしているらしい第３のスプライス変異体を表すのかもしれない。いずれにせよ、FB85c-2及びFB66a配列はおそらくスプライシングによって作られたものである。第２に、ヒト皮質、小脳、心臓、肝臓及び肺組織から単離したRNAを用いて、5 'RACE分析を実施した。RNAは、報告にあるように［Loughneyら、J.Biol.Chem.27 1巻、796〜806頁(1996)］凍結組織断片から単離し、そしてFast Track（商品名）mRNA単離システム（Invitrogen）を用いてポリA⁺mRNAを選択した。5μgのポリ A⁺mRNA及びcDNA合成キット（Boehringer Mannheim）を使用して二本鎖cDNAを調製した。オリゴヌクレオチドL15（配列番号：41）及びL30（配列番号：42）をアニーリングすることによって形成したリンカーに前記cDNAを連結した。 5'RACEのため、リンカーに連結したcDNAを、オリゴヌクレオチドL18（配列番号：43）及びW48A43（配列番号：44）を用いたPCRによって増幅した。反応液には、10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.2mMの各dNTP、 10μg/mlの各プライマー及び1μlのリンカーに連結したcDNAを25μlの反応液容量中に含有していた。94℃における加熱工程に続き、0.1単位のTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を添加することによってPCRを開始し、そして94℃にて１分間、60℃にて２分間、及び72℃にて４分間の３０サイクルを継続した。 PCR反応の産物は、水で１０倍に希釈し、前記と同じ条件下にオリゴヌクレオチドL21（配列番号：45）及びW48A9S（配列番号：46）を用いた第２PCR反応での鋳型として使用した。第２のPCR反応によって増幅されたDNAは、EcoRI及びSalIで切断し、同じ酵素で予め消化しておいたベクターBluescript（Stratagene）に連結した。初めに、各組織源由来の５種のプラスミド内のDNA配列を調べ、PDE8A1及びPDE 8A2の5'配列が、単離されたcDNAのうちに見出された。FB74bの5'配列もいくつかの配列として得られ、各配列を１度だけ単離したが、それらはさらなるスプライス変異体または関連のないDNA配列である可能性があった。元のFB66a cDNAよりもさらに5'に伸長したPDE8A2様のcDNAはなかったので、5' 端配列を伸長させる試みとしてさらなるPDE8A2 RACEクローンを分析した。さらに５種の肺PDE8A2 cDNAを同定して配列決定したが、PDE8A2配列を伸長したものはなかった。 L21プライマー（配列番号：45）を、プライマーW48A14S（配列番号：47）と共に用いて第２回目のRACE PCRを繰り返した。得られたクローンをPCRによってスクリーニングし、最長のものを配列決定用に選択した。２つのクローンだけが元のFB66a cDNAよりも長く、それらはそれぞれ、非翻訳領域で８及び12bpだけ5'配列を伸長したものであった。FB66a配列は、5 '-CCCAGGGCGCCAが伸長された。FB66aの5'最先端は極めてGCに富んでおり、これが全長のcDNAを単離するうえでの困難性に寄与しているのかもしれない。実施例９ PDE8Aの発現及び特徴付け実施例５に記載の組換えPDE8Aは、酵母抽出液中で、低アフィニティー及び高アフィニティー型にて存在していた。低アフィニティー型が部分的に不活性な酵素となっている可能性があるので、均質な酵素を得るか、またはこの２種の動力学的型が常にcDNAより発現されているのかを調べるか、いずれかの試みとして、 sf9及びCOS細胞でPDE8A発現を行った。 PDE8 sf9発現構築体は、プラスミドW485.1（実施例５に記載）からの3’KpnI- SalI断片及び以下のごとくにPCRにより作製された5'断片を用いて製造した。プライマーFLAG-1（配列番号：48）及びW48A4（配列番号：12）を、鋳型としてPDE 8 COS-1 DNA（下記）を使ったPCRに使用した。 PCRは、２mM MgSO₄をMgCl₂の代わりに使用し、そして0.02単位のTaqポリメラーゼを用いたことを除いては実施例８に記載したとおりに実施した。最初に94℃にて４分間インキュベートした後、94℃にて１分間、50℃にて１分間、及び72℃にて２分間の３０サイクルを行った。5'増幅産物は、BamHI及びKpnIで切断し、ゲルで精製して、予めBamHI及びSalIで消化しておいたベクターpFASTBAC（Gibco B RL、Gaitherhurg、メリーランド州）へと3'断片と共に連結した。この結果得られたプラスミドは、pFBRPDE8と命名した。すべてのPCR産物及びすべての新しい接合部は、配列決定によって確認した。組換えウイルス保存液は、FastBacシステム（Gibco BRL）を用いて製造業者が示すプルトコルに従って製造し、そしてタンパク質発現は以下のとおりに行った。Sf9細胞は、50U/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシン硫酸塩（Gibco ）を含有するCCM3培地（Hyclone、Logan、ユタ州）中で27℃にて生育した。対数増殖期の細胞を、細胞あたりおよそ２ウイルスの感染効率にて感染させ、４８時間インキュベートした。遠心分離することによって細胞を集め、CMF-PBS（2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、137mM NaCl、8.1mM Na₂PO₄）で洗浄して、ペレットを凍結し使用するまで−80℃に保存した。細胞は、緩衝液（50mM MO PS、pH7.2、10μM硫酸亜鉛、１mM DTT、２mMベンズアミジン、各々10μg/mlのペプスタチン、ロイペプチン、及びアプロチニン、ならびに各々20μg/mlのカルパインＩ及びカルパインIIインヒビター）中で、等容量のガラスビーズ（酸洗浄済、0.5mm、Sigma）の存在下にボルテックスすることによって溶解し、そして実施例５に記載のとおりにPDE活性を定量した。 sf9抽出物に、cAMP加水分解（100μM基質）について45.4nmol/分/mgのPDE活性が、そしてcGMP加水分解（100μM基質）に対して69.4nmol/分/mgの活性が検出された。バックグラウンドのPDE活性は無視できる程度であった。PDE8A活性は、実施例５に記載の酵母抽出物にて検出されたと同様、高アフィニティー及び低アフィニティーが混合したものであるらしかった。 COS細胞での発現には、プラスミドW485.1（実施例５）からの3'KpnI／SalI断片と、プライマーW48A2（配列番号：10）及びATG（配列番号：35）と共に鋳型としてFB66a cDNAを含む反応混液からのPCR増幅産物を切断することによって得られたNheI／KpnI断片とを組み合わせることによってPDE8COS-1を作製した。PCRのための条件は、Perkin Elmer Cetus DNAサーマルサイクラーで、最初に94℃で４分間の後、94℃で１分間、50℃で１分間、及び72℃で２分間を３０サイクル行うことを含んでいた。この結果得られた5'断片及び前記3'断片を、予めNheI及びSa lIで消化しておいたpClneo（Promega、Madison、ウィスコンシン州）へ連結した。 15cmのディッシュにて生育している亜集密のCOS細胞を25ml DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩、GIBCO）で１回洗浄し、その後プレート１枚あたり14mlのDMEM／DEAE-デキストラン／クロロキンを添加した。DMEM／DEAE-デキストラン／クロロキンは、75mlのDMEM及び30μlの0.25Mクロロキンを、0.75mlの50μg/ml DEAE-デキストラン（Pharmacia、Uppsala、スウェーデン）と共にPBS（2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、137mM NaCl、8.1mM Na₂PO₄、0.9mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂中に含んでなるものである。プレート１枚に対し20μgのプラスミドDNAを含む135μlのTris／ED TA緩衝液（TE）を添加し、そしてプレートは5％CO₂中で37℃にて２時間インキュベートした。培地を除去し、12mlの10％DMSO／PBSを１分間加えて除いた。25ml のDMEMで細胞を１回洗浄し、その後10％胎児ウシ血清（Hyclone、Logan、ユタ州）を含有するDMEMをさらに25ml添加して、5％CO₂中で37℃にて終夜、細胞をインキュベートした。培地を除去し、単層を25mlのCMF-PBSで洗浄した。0.05％トリプシン／0.5mM（Gibco）を含有する溶液6mlを添加して、細胞を37℃にて５分間インキュベートした。摩砕することにより細胞を取り出して円錐状遠心チューブに移した。6mlの完全DMEMでプレートを洗浄して残存細胞すべてを回収し、洗液を遠心チューブに加えた。およそ340xgで５分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、5mlの完全DMEMに再懸濁して、20mlの完全DMEMを含む15cm組織培養ディッシュに取り出して、5％CO₂中で終夜インキュベートした。単層をCMF-PBSで２回洗浄し、バーセン（0.5mM Na₂EDTA・2H₂O、137mM NaCl、2 .68mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄、1.1mMグルコース、pH7.4）中で37℃にて５分間インキュベートし、そして前記と同様に回収した。ペレット化した細胞をCMF-PBSで洗浄し、ドライアイス中で凍結し、そして使用するまで−80℃に保存した。細胞を緩衝液（50mM MOPS、pH7.2、10μM硫酸亜鉛、1mM DTT、2mMベンズアミジン、各々10μg/mlのペプスタチン、ロイペプチン、及びアプロチニン、ならびに各々 20μg/mlのカルパインI及びカルパインIIインヒビター）中で、フレンチプレッシャーセル（加圧型細胞粉砕装置）に20,000psiで通過させることによって溶解し、実施例５に記載のとおりにPDE活性を定量した。 PDE8A発現はCOS細胞抽出物中では低く、内在性PDE由来のバックグラウンド活性のレベルが高いことに起因して正確に特徴付けすることができなかった。COS 細胞発現産物をさらに十分に特徴付けするために、アミノ末端にFLAG tagを含む酵素（実施例５）を、抗FLAG M2アフィニティーカラム（Sigma）を用い製造業者の示すプロトコルに従って細胞抽出物の100,000xg上清から精製する。酵母PDE8A 活性をさらに正確に特徴付けるために、アミノ末端にて欠失しているが触媒領域は保持している組換えタンパク質の発現を、均質なタンパク質を取得するための試みにおいて、実施例５に記載のとおりに実施する。実施例１０抗PDE8A抗体の製造 PDE8Aに対するモノクローナル抗体の製造のための抗原を提供すべく、大腸菌でGST融合タンパク質を製造した。FB70a由来のEcoRI断片（FB85c-2のヌクレオチド182〜1330を含み、実施例２に記載の全長のWO41835とハイブリダイズした、始めに同定された９つのクローンのうちの１つであるPDE8A cDNA）をpGEX5X1（Pha rmacia）のEcoRI部位へ挿入し、得られた構築体を大腸菌株XL1 Blueに形質転換した。この構築体からIPTGで誘導した後に、PDE8A由来の382アミノ酸を含むGST −PDE8A融合タンパク質を製造した。SDS-PAGEを用いて融合タンパク質を分離し、冷0.4M KClで染色した後ゲルから適切なサイズのバンドを切り取って、電気的溶出によってアクリルアミドからタンパク質を得た。溶出産物はPBSに対して透析し、そしてマウスに注射する前に、Centriprep 10及びCentriconカラム（Amicon、Bevcrly、マサチューセッツ州）を用いて濃縮した。第０日に、４匹のBalb/cマウスを予備採血し、200μlの総容量にて完全フロインドアジュバントに30μg／マウスのGST-PDE8融合タンパク質を含む抗原を皮下注射した。３週及び９週に、不完全フロインドアジュバントにて同様の注射を繰り返した。最後の免疫付与後１０日目に、被験血液を採取して、抗原捕捉ELISA 及びウェスタン分析によってスクリーニングした。 ELISAでは、Immulon 4プレート（Dynex、Cambridge、マサチューセッツ州）を、2μgGST-PDE8を含有する50mMカーボネート緩衝液、pH9.6で、4℃にて被覆した。プレートを30分間、0.5％フィッシュスキンゼラチン（Sigma）でブロッキングし、そして0.5％Tween 20を含むPBS(PBST)で希釈した50μlの血清加えた。血清の希釈は、1：100から1：102,400の範囲であり、これは一連の倍希釈によって得たものである。37℃にて３０分間インキュベートし、PBSTで３回洗浄した後、50 μlのセイヨウワサビへルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG（fc）抗体（Jackso n）（PBSTで１：10000に希釈）を添加した。プレートを前記と同様にインキュベートし、PBSTで４回洗浄した。テトラメチルベンチジン（Sigma Chemical、St． Louis、ミズーリ州）の添加によって抗体を検出し、そして呈色反応は15％のH₂S O₄を50μl添加することにより５分後に停止させた。450nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。ウェスタン分析には、SDS-PAGEゲルにおよそ10μgの酵母PDE8抽出物をかけ、そしておよそ200ngのゲル精製されたGST-PDE8及びそのタンパク質をイモビロン- PVDFへ転写した。標準的な、強化化学発光（ECL）ウェスタンブロットプロトコルを、二次抗体としてBioRadヤギ抗マウスIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて実施した。ハイブリドーマの調製において、前記のELISA及び／またはウェスタンブロッティングプロトコルにより陽性の結果を与えたマウス由来の脾臓細胞を、ポリエチレングリコール1500（Boehringer Mannheim）（Harlow及びLane、Antibodies 、a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988）を用いた標準法によって５：１の割合でNS-1細胞と融合した。融合細胞は15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、0.4mMアミノプテリン、16mMチミジン(HAT)(Gibco)、25 単位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)及び1.5×10⁶個のネズミ胸腺細胞/mlを含む、200mlのRPMI中に再懸濁して、96穴平底組織培養プレート（Corning、英国）に、ウェル当たり200μlで分配した。細胞には融合後２、４、及び６日目に、18Ｇの針（Becton Dickinson）を用いて各々のウェルからおよそ100μlを吸引し、そしてウェル当たり100μlの培養用（plating）培地（10単位/mlのIL-6を含み胸腺細胞を欠いている以外は、前記に同じ）を加えることによって、栄養を供給した。９日目から１２日目に、融合物のウェルからの上清を、GST及びGST-PDE8を用いた抗原捕捉ELISAならびに前記のごときECLウェスタン分析によってスクリーニングした。マウス血液を用いたウェスタンブロットの双方のレーンで期待されるサイズの陽性シグナルが得られ、さらなる融合において酵母組換えタンパク質と非常に弱い反応性を有するモノクローナル抗体が得られた。手順全体を、50μg抗原／マウスを用いて繰り返し、免疫性がさらに強いモノクローナル抗体を取得する。実施例１１ in situハイブリダイゼーションによるPDE8A発現の分析下記のとおりのin situハイブリダイゼーションによって、組織切片でのPDE8A の発現を調べた。プローブの調製 cDNA FB70a由来のXhoI／EcoRI制限酵素断片（配列番号：１のヌクレオチド第5 71から1226位に対応している）を、Bluescriptベクター（Stratagene、La Jolla 、カリホルニア州）へとサブクローニングし、PDE8XR2Aと命名された発現プラスミドを作製した。プラスミドはXhoIで切断し、T3ポリメラーゼを用いて転写して（下記参照のこと）、アンチセンスプローブを作製した。センスプローブは、PD E8XR2AをEcoRIで切断しT7ポリメラーゼを用いて転写することにより作製した。P DE8A鋳型は、RNA転写キット（Stratagene、La Jolla、カリホルニア州）を用い、5μlの5X転写緩衝液（Stratagene）、30mM DTT（Stratagene）、各々0.8mMのA TP、CTP、GTP（10mM（Stratagene））、40単位RNase Block II(Stratagene)、12 .5単位T3またはT7ポリメラーゼ（Stratagene）、及び300ngの線状化プラスミド鋳型、50μCi ³⁵S-UTP（1000Ci/mmolを越える、Amersham、Arlington Heights、イリノイ州）を含有する反応液にて転写した。混合液を37℃にて１時間インキュベートし、その後、1μlのRNase不含のDNase I（Stratagene）を添加して37℃にて１５分間インキュベートすることにより鋳型DNAを除去した。60℃にて4μlのN aHCO₃及び6μlのNa₂CO₃を２２分間添加することによりプローブを加水分解し、そして100μlの3M酢酸ナトリウム、5μlの酢酸（VWR、So.Plainfield、ニュージャージー州）、及び395μlの蒸留水を添加することによって反応混液を中和した。クイックスピン G50 RNAカラム（5'→3'Inc.、Boulder、コロラド州）を製造業者の示すプロトコルに従って調製した。プローブをカラムの中心に置き、卓上遠心分離器にてカラムを1,000rpmで４分間遠心した。カラムからのフロースルーは、50μlの蒸留水、2μlの10mg/ml tRNA溶液、10μlの3M酢酸ナトリウム、及び200μlの100％エタノール（VWR）と混合し、得られた混合液は−20℃にて終夜インキュベートした。プローブ溶液を４℃にて１５分間ミクロ遠心し、上清を除いてそのペレットを 1μlの0.1M DTTを含有する40μlの1X TBEに再懸濁した。プローブは、in situハイブリダイゼーションを実施するまで−70℃にて保存した。組織試料の調製及びin situハイブリダイゼーション組織（National Disease Research Intercharge、Philadelphia、ペンシルバニア州及びCooperative Human Tissue Network、Philadelphia、ペンシルバニア州）を6μmに切片化し、そしてSuperfrost Plusスライド（VWR）に載置した。切片を4％パラホルムアルデヒド（SigmaSt．Louis、ミズーリ州）にて4℃で２０分間固定した。このスライドを1X CMF-PBSを３回交換して濯ぎ、70％エタノール、 95％エタノール及び100％エタノールで連続的に洗浄して脱水し、次いで室温にて３０分間乾燥した。スライドは70％ホルムアミド（J.T.Baker）を含む2X SSC 中に70℃にて２分間載置し、4℃にて2X SSCで濯ぎ、70％、95％及び100％エタノールで洗浄して脱水し、そして室温にて３０分間乾燥した。プレハイブリダイゼーション工程は、50％ホルムアミド（J.T.Baker）を4X SS C中に含むボックス緩衝液で飽和させた１枚のフィルターペーパーを入れた密封箱にスライドを載置することによって実施した。各切片を、10％デキストラン硫酸塩（Sigm a）、50％ホルムアミド（J.T.Baker、Phillipsburg、ニュージャージー州）、10 0mM DTT（Boehringer Mannheim、Indianapolis、インディアナ州）、0.3M NaCl （Sigma）、20mM Tris、pH7.5、5mM EDTA（Sigma）、及び1Xデンハーツ溶液（Si gma）からなる100μlのrHB2緩衝液で被覆し、そのスライドを42℃にて１時間インキュベートした。前記のとおりのプローブは、4x10⁵cpm／組織切片を、切片１枚あたり5μlの10mg/ml tRNA溶液と混合し、そして当該混合液を95℃にて３分間加熱することによって調製した。氷冷rHB2緩衝液を加え、最終容量を切片あたり 20μlとした。プローブを含有する溶液（20μl／切片）を、予め適用していたrH B2緩衝液100μlに添加した。スライドを55℃にて１２から１６時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションに続き、スライドは、10mM DTTを含有する4X S SCで室温にて１時間１回、50％脱イオン化ホルムアミド（J.T.Baker）、1X SSC 及び1mM DTTで60℃にて４０分間１回、2X SSCで室温にて３０分間１回、そして0 .1X SSCで室温にて３０分間１回洗浄した。切片を、70％、95％及び100％エタノールで洗浄して脱水し、そして３０分間風乾した。スライドをコダックNTB2核感光乳剤に浸し、暗所で室温にて１から３時間乾燥させ、そして現像するときまで乾燥剤と共に4℃にて暗所に保存した。次いでスライドは4℃のコダックDektol現像液にて４分間現像し、4℃の蒸留水に４分間浸し、そして4℃のコダック固定液に４分間入れた。スライドを蒸留水で濯ぎ、標準H & E（ヘマトキシリンエオシン）染色を以下のごとくに実施した。スライドを蒸留水で濯ぎ、そしてこのスライドを以下の一連の工程に付すことによってヘマトキシリン及びエオシンで染色した。すなわち、ホルムアルデヒド／アルコール（100mlホルムアルデヒド、900ml 80％エタノール）中で５分；合計２分間、水で３回濯ぎ；0.75％Harrisヘマトキシリン（Sigma）中で５分間；合計２分間、水で３回濯ぎ；1％HCl／50％エタノールに１回浸漬；水で１回濯ぎ；1％リチウムカーボネートに４回浸漬；流水中に１０分間；0.5％エオシン（Sigma）中に２分間；合計２分間、水で３回濯ぎ；70％エタノール中に２分間；95％エタノールで１分間濯ぎを３回；100％エタノールで１分間濯ぎを２回；及びキシレンで２分間濯ぎを２回の工程を経るものであった。スライドをサイトシール60（St ephens Scientific、Roverdale、ニュージャージー州）とマウントした。アンチセンスPDE8Aプローブで得られたシグナルを、センスPDE8Aプローブによって産生された対照シグナルと比較し、そしてアンチセンスプローブに特異的なシグナルのすべてが、PDE8A発現に相当していると考えられた。PDE8Aシグナルは、小脳の多くの箇所にわたり、また精巣の精細管における細胞の下位集合に、骨格筋の起源未同定の分散細胞上に、顆粒膜細胞に、そして卵巣の卵巣支質に、さらには腎臓のヘンレの係蹄内の上皮細胞、及び心臓の動脈のいずれかの平滑筋上に検出された。これらの結果は、ノザンブロットによれば中程度のシグナルが心臓に検出されたのであるが当該心臓組織を用いたin situデータでは弱いシグナルしか得られなかったという点で、ノザンブロッティングによって得られ実施例６に述べた結果とは相違している。この矛盾は、異なる個体由来の組織の差異、または２つの方法に固有な検出レベルの差を反映している可能性がある。卵巣でのシグナル及び腎臓でのシグナルはそれぞれ、排卵に関わる、あるいは塩及び／または水のホメオスタシスにPDE8Aが関わっていることを示唆するのかもしれない。前記の例証的な実施例に示す本発明に対する多くの修正や変更が、当業者に想起されようことが予期される。しかして、添付の特許請求の範囲に示される限定によってしか、本発明の範囲は限定されるべきでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 9/16 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/16 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/54

Claims

【特許請求の範囲】１．精製及び単離されたPDE8ポリペプチド。２．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド。３．配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む請求の範囲第２項記載のポリペプチド。４．配列番号：６に示すアミノ酸配列を含む請求の範囲第２項記載のポリペプチド。５．請求の範囲第１、２、３または４項記載のポリペプチドでコードされるポリヌクレオチド。６．配列番号：１に示す配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。７．配列番号：３に示す配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。８．配列番号：５に示す配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。９．以下の群すなわち、ａ）請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド；及びｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNA よりなる群から選択される、ヒトPDE8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。１０．以下の群すなわち、ａ）請求の範囲第６、７及び８項のいずれかに記載のポリヌクレオチド；ならびにｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNA よりなる群から選択される、ヒトPDE8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。１１．DNA分子である請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。１２．cDNA分子である請求の範囲第１１項記載のDNA。１３．ゲノミックDNA分子である請求の範囲第１１項記載のDNA。１４．全体的または部分的に化学合成されたDNA分子である請求の範囲第１１項記載のDNA。１５．請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチドの相補体と特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド。１６．請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチドを含む発現構築体。１７．請求の範囲第１６項記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１８．以下の工程すなわち、ａ）PDL8ポリペプチドの発現のために適切な条件下で請求の範囲第１７項記載の宿主細胞を生育し、及びｂ）宿主細胞またはその生育培地からPDE8ポリペプチドを単離する工程を含むPDE8ポリペプチドの製造方法。１９．請求の範囲第１、２、３または４項のいずれかに記載のポリペプチドと特異的な免疫反応性を有する抗体。２０．モノクローナル抗体である請求の範囲第１９項記載の抗体。２１．請求の範囲第２０項記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。２２．請求の範囲第１９項記載の抗体と特異的な免疫反応性を有する抗イディオタイプ抗体。２３．PDE8Aポリペプチドの特異的結合パートナー化合物を同定する方法で、ａ）ある化合物とPDE8Aポリペプチドとの間の結合を許容する条件下にPDE 8Aポリペプチドと化合物とを接触させ、ｂ）PDE8Aポリペプチドへの化合物の結合を検出し、及びｃ）PDE8Aポリペプチドの特異的結合パートナーとして化合物を同定する工程を含む方法。２４．前記特異的結合パートナーが、PDE8Aポリペプチドの活性をモジュレートする請求の範囲第２３項記載の方法。２５．前記化合物がPDE8Aポリペプチドの活性を阻害する請求の範囲第２４項記載の方法。２６．前記化合物がPDE8Aポリペプチドの活性を増強する請求の範囲第２４項記載の方法。２７．PDE8Aポリヌクレオチドの特異的結合パートナー化合物を同定する方法で、ａ）ある化合物とPDE8Aポリヌクレオチドとの間の結合を許容する条件下にPDE8Aポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、ｂ）PDE8Aポリヌクレオチドへの化合物の結合を検出し、及びｃ）PDE8Aポリヌクレオチドの特異的結合パートナーとして化合物を同定する工程を含む方法。２８．前記特異的結合パートナーが、PDE8AポリヌクレオチドによりコードされるPDE8Aポリペプチドの発現をモジュレートする請求の範囲第２７項記載の方法。２９．前記化合物がPDE8Aポリペプチドの発現を阻害する請求の範囲第２８項記載の方法。３０．前記化合物がPDEIOポリペプチドの発現を増強する請求の範囲第２８項記載の方法。３１．請求の範囲第２３または２７項記載の方法によって同定された化合物。３２．請求の範囲第３１項記載の化合物と、医薬的に容認しうる担体とを含む組成物。