MXPA99005529A - Fosfodiesterasa 8a - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos de PDE8 humanos, polinucleótidos que codifican los polipéptidos, constructos de expresión que comprenden los polinucleótidos, células huéspedes transformadas con los constructos de expresión;métodos para la producción de polipéptidos de PDE8;polinucleótidos de antisentido;y anticuerpos específicamente inmunoreactivos con los polipéptidos de PDE8.

Description

FOSFODIESTERASA 8A Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente norteamericana número de serie 08/951,646, presentada el día 16 de octubre de 1997, pendiente. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, generalmente, a una familia de fosfodiesterasas designadas PDE8A y a sus usos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las fosfodiesterasas (PDEs) hidrolizan nucleótidos cíclicos 3', 5' en sus monofosfatos de nucleósidos 5' respectivos . Los nucleótidos cíclicos cAMP y xGMP son sintetizados por adenililciclasa y guanililciclasa, respectivamente, y sirven como segundos mensajeros en varias vías de señalización celular. La duración y fuerza de la señal de segundo mensajero depende de la velocidad de síntesis y de la velocidad de hidrólisis del nucleótido cíclico. Se identificaron varias familias de PDEs. El sistema de nomenclatura incluye primero un número que indica la familia de PDE. A la fecha se conocen 7 familias (PDE1-7) que se clasifican en base a: (i) su estructura primaria; (ii) su preferencia de substrato; (iii) su respuesta a diferentes moduladores; (iv) su sensibilidad a inhibidores específicos y (v) sus modos de regulación (Loughney and Ferguson, en Phosphodiesterase Inhibítors (inhibidores de fosfodiesterasas), Schudt, et al. (Eds), Academic Press: New York, New York (1996), páginas 1-19). El número que indica la familia se encuentra seguido por una letra mayúscula que indica un gen distinto y una letra mayúscula seguida por un segundo número que indica una variante de empalme específica o bien un transcripto específico que emplea un sitio de iniciación de transcripción único. Las secuencias de aminoácidos de todas las PDEs de mamíferos identificadas a la fecha incluyen una región altamente conservada de aproximadamente 270 aminoácidos ubicadas en la mitad de extremo carboxi de la proteína (Charbonneau, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 83:9308 9312(1986)). El dominio conservado incluye el sitio catalítico para hidrólisis de cAMP y/o cGMP y dos sitios de enlace putativos de zinc así como determinantes específicos para familia (Beavo, Physiol, Rev. 75:725-748 (1995): Francis, et al., J. Biol. Chem. 269:22477-22480 (1994)). Las regiones de terminal amino de las varias PDEs son altamente variables e incluyen otros determinantes específicos para familia como por ejemplo : (i) sitios de enlace de calmodulina (PDE1) ; (ii) sitios de enlace de GMP cíclica no catalíticos (PDE2, PDE 5, PDE6) ; (iii) sitios de enfoque hacia membranas (PDE4) ; (iv) sitios de asociación con membrana hidrofóbica (PDE3) ; y (v) sitios de fosforilación para la quinasa II dependiente (PDE1) , la quinasa dependiente de cAMP (PDE1, PDE3, PDE4) , o bien la quinasa dependiente de cGMP (PDE5) (Beavo, Physiol, Rev. 75:725-748 (1995) :Manganiello, et al., Arch. Biochem. Acta 322:1-13 (1995): Conti, et al., Physiol. Rev. 75:723-748 (1995) ) Miembros de la familia PDE1 son activados por calcio-calmodulina. Se identificaron 3 genes: PDE1A y PDE1B hidrolizan de preferencia cGMP mientras que PDE1C presenta una alta afinidad tanto para cAMP como para cGMP. La familia PDE2 se caracteriza por estar estimulada específicamente por cGMP (Loughney y Ferguson, supra) . Solamente un gen ha sido identificado, PDE2A, cuya enzima producto es inhibida específicamente por eritro-9- (2-hidroxi-3-nonil) adenina (EHNA) . Las enzimas en la familia PDE3 son inhibidas específicamente por cGMP. Se conocen dos genes PDE3A y PDE3B, ambos tienen una alta afinidad tanto para cAMP como para cGMP, aún cuando el Vmax para hidrólisis de cGMP es suficientemente bajo para que cGMP funcione como inhibidor competitivo para hidrólisis de cAMP. Las enzimas PDE3 son inhibidas específicamente por milrinona y enoximona (Loughney y Ferguson, supra) . La familia de PDE4 efectúa la hidrólisis de cAMP e incluye cuatro genes como PDE4A, PDE4B, PDE4C, y PDE4D, cada uno teniendo múltiples variantes de empalme. Miembros de esta familia son inhibidos específicamente por el fármaco antidepresivo rolipram. Miembros de la familia PDE5 se unen con cGMP en sitios no catalíticos e hidrolizan de manera preferencial cGMP. Solamente un gen, PDE5A, a sido identificado. Las enzimas PDE6 de fotoreceptor hidrolizan específicamente cGNP (Loughney y Ferguson, supra) . Genes incluyen PDE6A y PDE6B (cuyas proteínas productos dimerizan y enlazan dos copias de una subunidad inhibitoria gamma más pequeña para formar la varilla PDE), además de PDE6C que se asocia con tres proteínas más pequeñas para formar el cono PDE. La familia de PDE7 efectúa una hidrólisis de cAMP pero, • en contraste con la familia PDE'4, no es inhibida por rolipram (Loughney y Ferguson, supra) . Se ha identificado solamente un gen, PDE7A. Dada la importancia de cAMP y cGMP en señalización de segundos mensajeros intracelular, existe por consiguiente una necesidad constante en la técnica de identificar especies adicionales de PDE. La identificación de familias hasta la fecha desconocidas de PDEs, y genes y variantes de empalme dé las mismas proporcionaran enfoques farmacológicos adicionales para tratar condiciones en las cuales vías de nucleótidos cíclicos son aberrantes así como condiciones en las cuales es deseable una modulación de los niveles intracelulares de cAMP y/o cGMP en ciertos tipos de células. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En resumen, la presente invención ofrece polipéptidos y polinucleóticos subyacentes para una familia de PDE novedosa llamada PDE8. La invención incluye tanto polinucleótidos PDE8 que ocurren naturalmente y no naturalmente así como productos de polipéptidos de los mismos. Los productos de PDE8 que ocurren naturalmente incluyen especies distintas de genes y polipéptidos dentro de la familia PDE8 (es decir, PDE8A) ; estas especies incluyen las que se expresan dentro de las células del mismo animal así como homólogos de especies correspondientes que se expresan en células de otros animales. Dentro de cada especie de PDE8, la invención ofrece además variantes de empalme codificadas por el mismo polinucleótido pero que surgen de transcritos de mARN distintos (es decir, PDE8A1 y PDE8A2) . Productos de PDE8 que ocurren de manera no natural incluyen variantes de los productos que ocurren naturalmente, como por ejemplo análogos (es decir, donde uno o varios aminoácidos se agregan, substituyen o bien remueven) y los productos de PDE8 que incluyen modificaciones covalentes (es decir, proteínas de fusión, variantes de glicosilación, Met", """PDEds, Met"3- Lys-1-PDE8s, Gly"1 PDEds y similares) . La familia de PDE8 se distingue de familia de PDE previamente conocidas porque muestra una alta habilidad para la hidrólisis de cAMP y cGMP pero una sensibilidad relativamente baja para inhibidores de enzima específicos para otras familias de PDE. En una modalidad preferida, la invención ofrece un polinucleótido que comprende la secuencia presentada en SEQ ID: 1. La invención abarca polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID número:2. Un polipéptido actualmente preferido de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID número: 2. La invención ofrece dos cADNs de variantes de empalme que proporcionan dos polipéptidos designados PDE8A1 y PDE8A2. Los polipéptidos PDE8A1 y PDE8A2, y los polinucleótidos que codifican los polipéptidos, se comentan aquí como representativos de la familia de enzimas PDE8 abarcada por la invención. La presente invención ofrece polinucleótidos purificados y aislados novedosos (por ejemplo, secuencias de ADN y transcritos de ARN, tanto de hebra de sentido como de hebra de antisentido complementaria, incluyendo variantes de empalme de los mismos) que codifican PDE8s humanas. Secuencias de ADN de la presente invención incluyen secuencias de cADN y genómicas así como secuencias de ADN total o parcialmente sintetizadas químicamente. «Sintetizadas» como se emplea aquí y como se entiende en la técnica, se refiere a métodos puramente químicos y no a métodos enzimáticos para la producción de polinucleótidos. Por consiguiente secuencias de ADN «totalmente» sintetizadas son producidas por consiguiente totalmente por medios químicos y ADNs «parcialmente» sintetizados abarcan los en los cuales solamente porciones del ADN resultante fueron producidas por medios químicos . Una secuencia de ADN preferida que codifica un polipéptido PDE8 humano se presenta en SEQ ID número: 1. También se prefieren los polinucleótidos que codifican el polipéptido PDE8 de SEQ ID número: 2 y los polipéptidos de variante de empalme PDE8A1 y PDE8A2 presentados en SEQ ID número: 6 y 4, respectivamente. Los polinucleótidos preferidos que codifican PDE8A1 y PDE8A2 se presentan en SEQ ID número: 5 y 3, respectivamente. La invención abarca además especies de preferencia mamíferos, homólogos del ADN de PDE8 humano. La invención abarca también secuencias de ADN que codifican especies de PDE8 que se hibridan bajo condiciones moderadamente estrictas con las hebras de no-codificación, o bien complementos, de los polinucleótidos en SEQ ID número 1,3 y 5. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de PDE8A que se hibridarían ahí sino fuera por la redundancia del código genético son contempladas por la invención. Condiciones de hibridación moderadas ejemplares son las siguientes: hibridación a 65°C en 3X SSC, sarcosil al 0.1%, y fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8, y lavado a 65°C en 2X SSC con SDS al 0.1%, Se entiende en la técnica que se- pueden alcanzar condiciones de estrictez equivalente mediante la variación de la temperatura y el amortiguador, o bien concentración de sal según lo descrito. Ausebel, et al, (Eds), Protocols in Molecular Biology, (protocolos en biología molecular) John Wiley & Sons (1994), páginas 6.0-3 y 6.4.10. Modificaciones en cuanto a las condiciones de hibridación pueden ser determinadas empíricamente o bien pueden ser calculadas con g precisión en base a la longitud y el porcentaje de formación de pares de guanosina/citosina (GC) de la sonda. Las condiciones de hibridación pueden ser calculadas de conformidad con lo descrito en Sambrook, et al., (Eds) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Clonación Molecular : un Manual de Laboratorio) , Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), páginas 9.47 a 9.51. Construcciones de expresión recombinante que se replican de manera autónoma como por ejemplo plásmidos y vectores de ADN viral que incorporan secuencias de PDE8 se proporcionan también. Constructos de expresión donde polinucleótidos que codifican PDE8 están unidos operativamente a una secuencia de ADN de control de expresión endógena o bien exógena y un terminador de transcripción se proporcionan también. Según otro aspecto de la invención, se proporcionan células huéspedes, incluyendo células procarióticas y eucarióticas, transformadas ya sea de manera estable o bien de manera pasajera con secuencias de ADN de la invención de tal manera que se permita la expresión de polipéptidos de PDE8 de la presente invención. Células huéspedes de la presente invención son una fuente valiosa de inmunógeno para el desarrollo de anticuerpos específicamente inmunoreactivos con PDE8. Células huéspedes de la presente invención son también útiles en métodos para la producción a gran escala de polipéptidos de PDE8 donde las células se cultivan en un medio de cultivo adecuado y se aislan los productos deseados de polipéptidos a partir de las células o bien a partir del medio en donde se cultivan las células, por ej employ mediante purificación por inmunoafinidad. El conocimiento de secuencias de ADN PDE8 permite la modificación de células con el objeto de permitir o bien incrementar la expresión de PDE8 endógena. Se pueden modificar células (por ejemplo mediante recombinación homologa con el objeto de proporcionar una expresión incrementada de PDE8 reemplazando, totalmente o bien parcialmente, el promotor de PDE8 que ocurre naturalmente con todo o parte de un promotor heterólogo de tal manera que las células expresen PDE8 en niveles más altos. El promotor heterólogo es insertado de tal manera que este unido operativamente a secuencias de codificación de PDE8. Véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT número WO 94/12650, la publicación internacional PCT número WO 92/20808, y la publicación internacional PCT número 91/09955. La invención contempla también que, además, de ADN promotor heterólogo, se pueda insertar ADN marcador amplificable (por ejemplo ada, dhrf, y el gel CAD multifuncional que codifica la carbamilfosfatsintasa, aspartat-transcarbamilasa, y dihidroorotasa) y/o ADN de intron junto con el ADN promotor heterólogo. Si se enlaza con la secuencia de codificación de PDE8, la amplificación del ADN marcador por métodos estándares de selección resulta en la co-amplificación de las secuencias de codificación de PDE8 en las células. La información de secuencia de ADN proporcionada por la presente invención hace también posible el desarrollo, a través de estrategias de recombinanción homologa o bien «KO» (Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)), de animales que no expresan PDE8 funcional o bien que expresan una variante de PDE8. Tales animales son útiles como modelos para estudiar la actividad in vivo de PDE8 y moduladores de PDE8. La invención ofrece también polipéptidos de PDE8 de mamíferos purificados y aislados. Los polipéptidos de PDE8A preferidos actualmente se presentan en SEQ ID números: 4 y 6. Se prefiere especialmente un polipéptido PDE8 que comprende" la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID número 2. Se pueden aislar los polipéptidos de PDE8 de la presente invención a partir de fuentes naturales de células que involucran células huéspedes de la invención. Se espera que el uso de células huéspedes de mamífero proporcione las modificaciones post-translacional (por ejemplo, glicosilación, truncación, lipidación, y fosforilación) que puedan ser requeridas para conferir una actividad biológica óptima a productos de expresión recombinante de la invención. Los productos PDE8 de la presente invención pueden ser polipéptidos de longitud completa, fragmentos biológicamente activos o variantes de los mismos que conservan una actividad biológica de PDE8 específica. Variantes pueden comprender análogos de polipéptidos de PDE8 donde uno o varios de los aminoácidos especificados ~ (es decir, codificados naturalmente) es removido o reemplazado o bien donde se agregan uno o varios aminoácidos no específicos: (1) sin pérdida de una o varias de las actividades biológicas o bien características inmunológicas específicas para PDE8; o bien (2) con una desactivación específica de una actividad biológica particular de PDE8. Productos variantes de la presente invención incluyen productos de PDE8A maduros es decir, productos de PDE8, donde se remueven secuencias líder o señal, que tienen residuos terminales de amino adicionales. Productos (PDE8 que tienen un residuo adicional de metionina en la posición -1 (Met-1-PDE8) se contemplan, como son productos de PDE8 que tienen residuos adicionales de 'metionina y lisina en las posiciones -2 y -1 (Met-2- Lys"1- PDE8) . Variantes de estos tipos son especialmente útiles para la producción recombinante de proteínas en tipos de células bacterianas. La invención abarca también variantes de PDE8 que tienen residuos de aminoácidos adicionales que resultan del uso de sistemas específicos de expresión. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como por ejemplo un producto de fusión de glutation-S-transferasa proporcionan un polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina adicional en la posición -1 como resultado de la disociación del componente de GST a partir del polipéptido deseado. Variantes que resultan de expresión en otros sistemas de vectores se contemplan también. La invención abarca además productos de PDE8 modificados para incluir una o varias fijaciones de polímeros solubles en agua. Particularmente preferidos son los productos de PDE8 covalentemente modificados con subunidades de polietilenglicol (PEG) . Polímeros solubles en agua pueden estar unidos en posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino de los productos de PDE8 o bien pueden estar unidos aleatoriamente a una o varias cadenas laterales del polipéptido. La presente invención abarca también anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena única, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR y similares, y otras proteínas de enlace específicas para productos de PDE8 o bien fragmentos de los mismos. Proteínas de enlace específicas pueden desarrollarse empleando productos de PDE8 aislados o recombinantes, variantes de PDE8, o bien células que expresan tales productos. Las proteínas de enlace son útiles para purificar productos de PDE8 y la detección y cuantificación de productos de PDE8 en muestras de tejidos y fluidos empleando procedimientos inmunológicos conocidos. Proteínas de enlace son también evidentemente útiles para modular (es decir, bloquear, inhibir o estimular) actividades biológicas de PDE8, especialmente las actividades involucradas en transducción de señales. Se contemplan también anticuerpos anti-idiotípicos para anticuerpos anti-PDE8. El valor científico de la información proporcionada a través de las presentaciones de secuencias de aminoácidos y ADN de la presente invención es evidente. Como serie de ejemplos, el conocimiento de la secuencia de cADN para PDE8A hace posible mediante el uso de hibridación Southern o bien reacción en cadena de polimerasa (PCR) , la identificación de secuencias de ADN genómico que codifican PDE8 y secuencias regulatorias de control de expresión de PDE8 como por ejemplo promotores, operadores, realzadores, represores, y similares. Procedimiento de hibridación ADN/ADN llevados a cabo a través de secuencias de ADN de la invención bajo condiciones moderadamente estrictas a altamente estrictas pueden permitir de la misma manera el aislamiento de ADNs que codifican variantes alélicas de PDE8A; variantes alélicas se conocen en la técnica por incluir proteínas estructuralmente relacionadas que comparte una o varias de las propiedades bioquímicas y/o inmunológicas específicas para PDE8A. Similarmente, genes de especies no humanas que codifican proteínas homologas con PDE8A pueden también ser identificados por análisis Southern y/o reacción en cadena de polimerasa. Como alternativa, estudios de complementación pueden ser útiles para identificar otros productos de PDE8 humanos así como proteínas no humanas, y ADNs que codifican las proteínas, que comparten una o varias propiedades biológicas de PDE8A. Los polinucleótidos de la presente invención son también útiles en ensayos de hibridación para detectar la capacidad de células para expresar PDE8. Los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser la base de métodos de diagnóstico útiles para identificar una alteración genética o varias alteraciones genéticas en un locus de PDE8 subyacente a un estado enfermizo o a estados enfermizos. También la invención presenta polinucleótidos de anti-sentido que reconocen y se hibridan con polinucleótidos que codifican PDE8. Se proporcionan polinucleótidos de anti-sentido de longitud completa y fragmentos. Los polinucleótidos de antisentido son especialmente relevantes para regular la expresión de PDE8 por estas células que expresan mARN de PDE8. La información de secuencias de aminoácidos y ADN proporcionada por la presente invención hace también posible el análisis sistemático de la estructura y función de PDE8S. La información de secuencias de aminoácidos y ADN para PDE8 permite también la identificación de moléculas con las cuales interactúa PDE8A. Agentes que modulan (es decir, incrementan, disminuyen o bien bloquean) la actividad de PDE8 pueden ser identificados mediante la incubación de un modulador putativo con PDE8 y mediante la determinación del efecto del modulador putativo sobre la actividad fosfodiesterasa de PDE8. La selectividad de un compuesto que modula la actividad de PDE8 puede evaluarse comparando su actividad en PDE8 con su actividad en otras enzimas PDE. Métodos basados en células como por ejemplo en fallos di-híbridos y ensayos híbridos divididos, así como métodos in vitro, incluyendo ensayos donde un polipéptido o bien su socio de enlace están inmovilizados, y ensayos de solución se contemplan en la invención. Moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos, y otras proteínas o péptidos que se enlazan específicamente a PDE8 o bien al ácido nucleico de PDE8, oligonucleótidos que se unen específicamente con PDE8 o bien el ácido nucleico de PDE8, y otros compuestos que no son péptidos (por ejemplo, moléculas orgánicas aisladas o sintéticas) , que reaccionan específicamente con PDE8 o bien ácido nucleico que codifica PDE8. Formas mutantes de PDE8 que afectan la actividad enzimática o bien localización celular del PDE8 de tipo salvaje están también contempladas por la invención. Los blancos actualmente preferidos para el desarrollo de moduladores selectivos incluyen, como por ejemplo : (1) regiones del PDE8 que están en contacto con otras proteínas y/o localizan PDE8 dentro de una célula (2) regiones de PDE8 que se unen con el sustrato, (3) sitio (s) de enlace con nucleótidos cíclicos alostéricos de PDE8, (4) sitio (s) de fosforilación de PDE8 y (5) regiones de PDE8 involucradas en la multimerización de subunidades de PDE8. Moduladores de la actividad de PDE8 pueden ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades y condiciones fisiológicas en donde se sabe que la actividad de PDE está involucrada. La invención contempla además pequeños moduladores moleculares de la actividad de enzima PDE8A existen al menos tres tipos diferentes de bibliotecas empleadas para la identificación de pequeños moduladores moleculares. Estas incluyen: (1) bibliotecas químigas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas de combinación que contienen péptidos aleatorios, oligonucleótidos o bien moléculas orgánicas. Las bibliotecas químicas consisten de análogos estructurales de compuestos conocidos o bien compuestos identificados como «éxitos» o bien «guías» a través de tamizado de productos naturales. Bibliotecas de productos naturales son colecciones de micro organismos, animales, plantas, o bien organismos marinos empleados para crear mezclas para tamizado mediante : (1) la fermentación y extracción de caldos del suelo, micro organismos vegetales o marinos o bien (2 ) la extracción de plantas o bien organismos marinos. Las bibliotecas de combinación están compuestas de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o bien compuestos orgánicos como mezcla. Son relativamente fáciles de preparar mediante métodos de síntesis automatizada tradicional, reacción encadena de polimerása, clonación o bien métodos sintéticos propietarios. De interés particular son bibliotecas de combinación de péptidos y oligonucleótidos. Todavía otras bibliotecas de interés incluyen colección de péptidos, proteínas, colección sintética multiparalela, colección- peptidomi ética, bibliotecas de recombinación, y bibliotecas de polipéptidos. Para una reseña de la química de combinación y bibliotecas creadas a partir de ella, véase Myers, Curr, Opion Biotechnol 8:701-707 (1997) . La identificación de moduladores a través del uso .de las varias bibliotecas descritas aquí permite la modificación del «éxito» o «guía» candidatos con el objeto de optimizar la capacidad del «éxito» para modular actividad. La invención ofrece además métodos para identificar compuestos de socio de enlace específico de un polipéptido de PDE8A de la invención, que comprende los' pasos de: a) poner en contacto el polipéptido de PDE8A con un compuesto bajo condiciones qµe permiten el enlace entre el compuesto y el polipéptido de PDE8A; b) la detección del enlace del compuesto con el polipéptido de PDE8A; y c) la identificación del compuesto como socio de enlace específico del polipéptido de PDE8A. Un socio de enlace identificado en los métodos de la presente invención modula de preferencia la actividad de enzima de PDE8A, ya sea a través de la inhibición o bien activación o bien realce de la enzima. La invención ofrece también métodos para identificar un compuesto socio de enlace específico de un polinucleótido de PDE8A de la invención, que comprende los pasos de : a) la puesta de contacto del polinucleótido de PDE8A con un compuesto bajo condiciones que permiten el enlace entre el compuesto y el polinucleótido de PDE8A; b) la detección de enlace del compuesto con el polinucleótido de PDE8A; y c) la identificación del compuesto como socio de enlace específico del polinucleótido de PDE8A. El socio de enlace del polinucleótido de PDE8A modula de preferencia la expresión del polipéptido de PDE8A codificado por el polinucleótido de PDE8A, ya sea a través de inhibición de expresión o bien a través de realce de expresión. La invención ofrece también compuestos identificados por un método de la presente invención, así como composiciones que comprenden un compuesto identificado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención es ilustrada a través de los siguientes ejemplos que se relacionan al aislamiento de polinucleótidos que codifican polipéptidos de PDE8 así como la expresión y caracterización de los polipéptidos codificados. El ejemplo 1 describe métodos para buscar base de datos de marcadores de secuencia expresados (EST) con el objeto de identificar sondas potencialmente útiles para aislar ADNs de la invención. El ejemplo 2 se refiere a la identificación de polinucleótidos que codifican PDE8A. El ejemplo 3 se enfoca hacia el análisis de secuencia de los polinucleótidos aislados. El ejemplo 4 describe el análisis de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de PDE8A. El ejemplo 5 se enfoca a la expresión de polipéptidos de PDE8A recombinantes. El ejemplo 6 se refiere al análisis Northern de la expresión de PDE8A. El ejemplo 7 describe el cartografiado de cromosomas del gen que codifica PDE8A. El ejemplo 8 describe la confirmación que PDE8A1 y PDE8A2 son variantes de empalme. El ejemplo 9 se enfoca hacia la expresión y caracterización de PDE8A recombinante. El ejemplo 10 presenta detalles de la producción de anticuerpos monoclonales anti-PDE8A. El ejemplo 11 describe un análisis de la expresión de PDE8 mediante hibridación in situ. Ej emplo 1 Identificación de EST relacionado con una PDE humana Usando las secuencias de fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos 3', 5 'humanas conocidas, se emprendió una búsqueda de la base de datos de Marcadores de Secuencias Expresadas (EST) del centro nacional para información biotecnológica (NCBI) con el objeto de identificar fragmentos de cADN que pudieran ser potencialmente útiles para la identificación de genes novedosos de fosfodiesteras (PDE) . Esta base de datos contiene secuencias de ADN que representan un extremo o ambos extremos de cADNs recogidos de varias fuentes tisulares. Una operación de secuenciamiento única se lleva a cabo en un extremo o en ambos extremos del cADN y la calidad de la secuencia de ADN varia de manera extrema. Al momento de la realización de las búsquedas de PDE, la base de datos de secuencias de ST contenía más que 600,000 secuencias de cADN de varios organismos. La búsqueda de secuencias novedosas de PDE incluyó 3 pasos. Primero se empleo el programa BLASTN disponible a través de NCBI con el objeto de identificar secuencias de ADN en la base de datos de secuencias de ST con homología con secuencias de cADN que codifican PDEs humanas conocidas. El programa compara una secuencia de investigación de nucleótidos contra una base de datos de secuencias de nucleótidos. Las secuencias de cADN de las 50 PDEs humanas conocidas fueron presentadas y se llevaron a cabo 15 búsquedas BLASTN las secuencias PDE investigadas incluyeron PDE1A3 (Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271:796-806 (1996)). PDE1B1 (Yu, et al., Cell Signaling, (señalización celular), en proceso de impresión (1997)), PDE1C2 (Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271-796-806 (1996)), PDE2A3 (Rosman, et al., Gene 191:89-95 (1997)), PDE3A (Meacci, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 89:3721-3725 (1992)), PDE3B (Miki et al., Genomics 36:476-485 (1996)), PDE4A5 (Bolger, et al., Mol. Cell. Biol.' 13:6558-6571 (1993)), PDE4B2 (Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)), PDE4C (Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)), PDE4SD1 y PDE4D3 (Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13:6558-6571 (1993)), PDE5A, PDE6A (Plitter, et al., Genomics 6:272-283 (1990), PDE6B (Collins, et al., Genomics 13:698-704 (1992)), PDE6C (Piriev, et al., Genomics 28:429-435 (1995). Y PDE7A1 (Michaeli, et al., J. Biol. Chem. 17:12925-12932 (1993)). Los resultados de BLASTN fueron examinados y se identificaron y recogieron en una tabla las secuencias de EST que fueron consideradas como correspondiendo a cada uno de los 15 cADNs de PDE conocidos. Las secuencias de PDE6A y PDE6B empleadas como investigación fueron truncadas en el extremo 3' (remoción de una parte de la región no trasladada 3'), debido a la presencia de elementos repetitivos en la región no trasladada 3 'de los cADNs. Segundo, el programa TBLASTN de NCBI se empleo para examinar la homología entre la secuencias de proteínas de las PDEs humanas conocidas (según lo arriba indicado) y las 6 proteínas diferentes posibles codificadas por cada una de la secuencias de ADN de EST. En esta búsqueda, las secuencias de EST se transladan en 6 cuadros y las secuencias de aminoácidos generadas se comparan con las secuencias de aminoácidos de PDE de búsqueda. Las secuencias identificadas como homologas a nivel de los aminoácidos fueron examinadas y todas las secuencias de EST identificadas positivamente como correspondiendo a una PDE conocida durante la búsqueda de BLASTN descrita arriba fueron desechadas . El tercer paso de la investigación involucró el análisis de secuencias que no eran PDEs conocidos. Estas secuencias de aminoácidos fueron homologas a una PDE conocida pero no fueron identificadas como uno de los 15 genes conocidos de PDE durante las búsquedas BLASTN. Las búsquedas BLAST identificaron una secuencia EST (designado W04835) a partir de una biblioteca de cADN de pulmón fetal humano codificando una secuencia de aminoácidos que tiene una homología con la región catalítica de PDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C,PDE5A, alfa PDE6A de varilla, beta PDE6B de varilla, alfa PDE6C de cono, y PDE7A. La secuencia" de base de datos a partir de W04835 se establece en SEQ ID número : 7. Los resultados del análisis de la base de datos se comentan a continuación y se ejemplifican empleando la secuencia PDE4D. Se obtuvo cADN de W04835 a partir de American Type Collection (Rockville,MD) .que conserva y hace público los depósitos disponibles de ESTs identificados y secuenciados por I.M.A.G.E., Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA) . El ADN de W04835 fue secuenciado al recibirlo para confirmar su identidad y determinar que era consiste con SEQ ID número : 7. La secuencia de aminoácidos codificada por el cuadro de lectura -1 de la secuencia W04835 de EST fue reconocido por todas las secuencias de cADN de búsqueda de PDE excepto PDE1A y IB ylC. Usando los resultados de TBLASTN con PDE4D- como • ejemplo, se detectaron dos regiones de similaridad. La primera región mostró 15/37 correspondencias exactas o sea una identidad del 40% (19/37 aminoácidos similares) e incluyó el motivo HD(X) 2HXG(X) 13 A (SEQ ID número: 8) encontrado en todas las secuencias de búsqueda (Charboneau, Mol. Pharmacol. Cell Regul. 2:267-298 (1990)). La segunda región mostró 9/20 correspondencias exactas o sea una identidad del 45% e incluyo el motivo YHNxxHA encontrado en la mayoría de las secuencias de investigación. El análisis BLASTN de las secuencias W04835 reveló que era única en la medida en que no era idéntica a ninguna de las demás secuencias de ADN humanas en la base de datos Genbank. La entrada en la base de datos de EST para Wo4835 identificó la secuencia como similar a PIR;A48719, la secuencia PDE5A1 que hidroliza cGMP, enlaza cGMP bobina. En comparación con la secuencia de proteína del cuadro -1 de W04835 con la secuencia PDE5A1 bobina mostró 58"/153 correspondencias lo que proporcionó una identidad global del 38%. Dentro de esta región se observaron regiones pequeñas de mayor homología; una región mostró 12/14 aminoácidos idénticos. Dada la naturaleza única de la secuencia W04835, su homología relativamente baja con PDE5A1 de bovino, y la presencia de los motivos de aminoácidos encontrados en la mayoría de las demás secuencias conocidas de aminoácidos de PDE humanas, W04835 representa un cADN de PDE humano novedoso. Ej emplo 2 Aislamiento de cADN de PDE putativa Se digirió un inserto de cADN de W04835 a partir del vector pT7T3D en dos fragmentos con enzimas de restricción EcoRI y HindIII y los dos fragmentos fueron purificados empleando dos geles de agarosa de bajo punto de fusión secuenciales. Ambos fragmentos fueron empleados como sondas para tamizar bibliotecas de cADN derivadas de corazón humano (Stratagene, La Jolla, CA) , y cerebro fetal humano (Stratagene) empleando procedimientos practicados de manera rutinaria en la técnica. Se tamizaron aproximadamente 5 x 105 pagos de cada biblioteca. La hibridación se llevó a cabo durante la noche en regulador que contenía 3 x SSC, Sarkosyl al 0.1%, fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8, 10X solución de Denhard, y 50µg/ml de ADN de esperma de salmón a una temperatura de 65°C. Los filtros fueron lavados a una temperatura de 65°C en regulador que contenía 2X SSC y SDC al 0.1% antes de la auto radiografía. Nueve clones provenientes de la biblioteca de cADN de cerebro fetal y 2 provenientes de cADN de corazón se hibridaron con la sonda W04835. Un secuenciamiento y cartografiado parciales llevaron a la selección de un clon proveniente de la biblioteca de cerebro fetal designado FB66a para caracterización adicional. Un segundo tamizado de aproximadamente 7.5 x 10£ fagos provenientes de la biblioteca de cADN de cerebro fetal bajo condiciones empleadas en el primer tamizado empleando el fragmento EcoRI/HindIII de 1.3 Kb a partir de la porción 5 'de W04835 proporcionó 19 clones adicionales de cADN. Seis de estos cADNs se hibridaron también con un fragmento HindIII/Kpnl de W04835 que incluye una región de 256 nucleótidos en el extremo 5 'de W04835. El secuenciamiento y cartografiado parcial de 5 de los clones llego a la selección de un segundo clon designado FB85c-2 para análisis adicional. Ejemplo 3 Análisis de secuencias de ADN de FB66a y FB85c-2 Se determinó la secuencia de ADN de FB66a para ambas hebras usando iniciadores de oligonucleótidos de ADN presentados a continuación en SEQ ID números: 9 a 31 y un secuenciador de ADN 373 A Perkin El er Applied Biosystems División de conformidad con el protocolo sugerido por los fabricantes. La cantidad de productos de Reacción en Cadena de Polimerasa que se empleo como templado se calculo en base al tamaño del producto de la reacción en cadena de polimerasa y se secuenció empleando ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kit (Kit de reacción listo para secuenciamiento) con AplioTaq DNA Polymerase, FS (Perkin Elmer, Foster City, CA) y reacción en cadena de polimerasa asimétrica. El producto de la reacción fue purificado en una columna de vórtice AGCT (Advanced Genetic Technologies Corp., Gaithersburg, MD) y se secó. Se agregó regulador a cada una de las muestras purificadas y la mezcla se calentó a una temperatura de 90°C durante 2 minutos. La solución fue transferida a hielo hasta su carga en un gel de poliacrilamida al 4%. Se recogieron automáticamente datos una vez iniciado el programa de recolección de datos y se analizo automáticamente y se leyó mediante el programa de análisis de secuencia. Se realizaron las ediciones manualmente y la secuencias resultantes fueron alineadas donde se determino la secuencia de consenso. Ml3Rev.l GGAAACAGCTATGACCATG SEQ ID NO: 9 W48A2 ACTCTCCAAGGAAATACAG SEQ ID NO: 10 W48A9 CTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO: 11 W48A4 TTGGCAAGGCCTCTGCAT SEQ ID NO: 12 W48S1 CCTCTATGACTQAGCAG SEQ ID NO: 13 W48A1 GAAGGCACTGCCACTGAT SEQ ID NO: 14 W48S6 TCGAGCTGTATCGGCACT SEQ ID NO: 15 W48A5 AGCGTGTGATTGTTCTGAA SEQ ID NO: 16 W48S7 TGCTGGCCAAGTAGCAAG SEQ ID NO: 17 W48A6 AAGGTCACAGGCAGTCAT SEQ ID NO: 18 W48S2 GAAGAGTGGCAAGGTCTC SEQ ID NO: 19 W48S3 TCATGACCTGGACCACCAG SEQ ID NO: 20 W48A8 CCTTCTTGAAGAGGTTTGC SEQ ID NO: 21 W48S4 ATGACTGCCTGTGACCTT SEQ ID NO: 22 W48S5 CTGCTATACAACCCTTACC SEQ ID NO: 23 W4SSS UCTAATATTGCTGAGGCC SEQ ID NO: 24 W48A7 TAAGTG AGAGGTGACTGC SEQ ID NO: 25 W48S9 CCTAAAGGGCTGAGATCA SEQ ID NO: 26 W48S10 CGCAGTCACCTCTCACTT SEQ ID NO: 27 M13 TG ¡ -AAACGACGGCCAGT SEQ ID NO: 28 W48A1 1 ACAAAACGCCTATGGTGG SEQ ID NO: 29 W48A10 TTGATCTCAGCCCTTTAGC SEQ ID NO: 30 W48S1 1 TCATGTQGCAGGAAACTG SEQ ID NO: 31 El cADN de FB66a, establecido en SEQ ID número: 3, tiene 4389 nucleótidos de longitud y, desde el nucleótido 3 hasta el nucleótido 2411, codifica una proteína de 803 aminoácidos con un peso molecular predicho de aproximadamente 90,775 Da. La secuencia de aminoácidos deducida para FB66a se establece en SEQ ID número: 4. La primera metionina se encuentra codificada en el nucleótido 45; la ausencia del codón de detención en cuadro corriente arriba no permite determinar si este residuo es una metionina interna o bien el principio del cuadro de lectura abierto.

La secuencia de ADN de FB85c-2 (SEQ ID número 5) se determinó de manera similar empleando los iniciadores M13Rev.l, W48A2, W48A9, W48A4, W48S1, W48A1, W48S6, W48A5,W48A6, W48S2, W48S3, W48S4m S48S5, S48S7, S48A8, y M13. FB85c-2 parece incluir dos insertos de ADN distintos, solamente uno de los cuales fue homólogos con W04835. La región homologa con W04835 presentó una longitud de aproximadamente 2.8 Kb. La secuencia precisa en el extremo 5 'del inserto no pudo ser determinada y por consiguiente algunos cientos de base de secuencia en lo que puede ser una región 5 'no trasladada no están incluidas en la secuencia de 2573 nucleótidos presentada en SEQ ID número: 5. El nucleótido 67 al nucleótido 2406 se codifica una proteína que tiene 779 aminoácidos (SEQ ID número 6)~ que tiene un peso molecular predicho de 88353 Da. Un codón de detención en cuadro corriente arriba hace probable que la metionina codificada en la posición de nucleótido 67 sea la metionina de iniciación. Las proteínas codificadas por FB66a y FB85c-2 tienen secuencias terminales amino diferentes lo que pude deberse a empalme alternativo. Las secuencias de ADN divergen entre ellas 5'de nucleótidos 112 en FB66a y nucleótido 104 en FB85c-2. Así, FB85c-2 tiene 13 aminoácidos en el extremo amino que no se encuentran en la proteína FB66a. La proteína FB66a incluye 23 residuos de terminal amino únicos si la metionina de iniciación se encuentra codificada en el nucleótido 35; la proteína incluye más que 37 residuos de terminal amino únicos si el cuadro de lectura abierta en el clon FB66a es incompleto. El análisis BLASTN, donde una secuencia de nucleótidos de investigación se compara con una base de datos de secuencia de nucleótidos, de la secuencia FB66a no revelo ninguna identidad con las secuencias en las bases de datos Genbank, NCCBI STS, NCBI HTGS, o bien NCBI GSS. Sin embargo, se identificaron dos secuencias idénticas en la base de datos NCBI EST. Una secuencia fue W04835 EST que se empleo para identificar el clon de cADN . La segunda, AA307865 (SEQ ID número 32), derivada de una línea de células de cáncer de colon KM12C (HCC) mostró identidad de secuencia con la región no trasladada 3 'de los clones FB66a y FB85c-2. Durante la búsqueda en la cual se identifico AA307865, se identificaron ADNs de EST adicionales que codifican probablemente homólogos putativos de ratón (EST AAA386789, SEQ ID número 38) y de rata (EST H32734, SEQ ID número 33) de las proteínas humanas codificadas FB66a y FB85c-2. La secuencia de ratón presentó un nivel de identidad del 86% con las secuencias humanas y la secuencia de rata presentó un nivel de identidad del 81% con las secuencias humanas . Ejemplo 4 Análisis de proteína de FB85c-2 y FB66a Las PDEs codificadas por los clones FB85c-2 y FB66a fueron designadas PDE'dAl y PDE8A2 respectivamente. Ambas proteínas de PDE8A, que tienen una identidad completa de secuencias de aminoácidos después del punto de divergencia antes comentado, son más similares a PDE2A, PDE5A, PDE5A, PDE6A, PDE6B, y PDE6C humanas. Las tablas 1 y 2 muestran la identidad porcentual de aminoácidos entre PDE8A y PDE2A, PDE5A y PDE6A. PDE8A1 y PDE8A2 comparten homología con otros PDEs en la región catalítica (aminoácidos 492 a 748 en PDE8A1) y con el dominio de enlace de cGMP putativo conservado en la región de terminal amino de PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B, y_PDE6C. El dominio de enlace potencial con cGMP de PDE8A se extiende del aminoácido 75 hasta el aminoácido 445 en el polipéptido PDE8A1. Dentro de los dominios de enlace cGMP de PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B, y PDE6C, existen dos repeticiones internas designadas «a» y «b» y cada repetición contiene una serie de aminoácidos conservados (McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem. 268:22863-22873 (1993)). En la región de repetición «b» correspondiente de PDE8A, todos los aminoácidos conservados se encuentran: en la región de repetición «a» correspondientes, solamente se detectaron algunos de los residuos conservados. Un residuo de aspartato, del cual se mostró que era esencial para el enlace con cGMP por PDE5A de bovino (McAllister-Lucas, et al., J. biol. Chem. 270 1-9 (1995) ) no se encuentra presente en la región de repetición «a» de PDE8A. Por consiguiente es incierto si esta región en PDE8A funciona para unión con cGMP. Tabla 1 Identidad de PDE8A en una proteína entera PDE 2A 5A 6A 8A 2A 100 19 16 28 5A 100 23 28 6A 100 21 8A 100 Tabla 2 Identidad de PDE8 en el dominio catalítico PDE 2A 5A 6A 8A 2A 100 38 33 41 5A 100 42 46 - 6A 100 37 8A 100 Ej emplo 5 Expresión de PDE8A recombinante Un constructo de expresión para PDE8A fue generado el cual incluyó secuencias de ADN 3 'desde el punto de divergencia de PDE8A1 y PDE8A2 a través del codón de retención. La construcción de expresión incluyó ADN que codifica un marcador de epítopo de 8 aminoácidos. Los que se conoce 'co o «marcador FLAG», que comprende la secuencia de péptidos presentada en SEQ ID número: 34, se agrego al extremo amino con el objeto que la proteína pudiera ser identificada por técnicas de tinción Western, empleando un anticuerpo anti- FLAG M2 (Eastman Kodak, Rochester, NY) que reconoció específicamente el péptido de SEQ ID número: 34. SEQ ID número 34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys Secuencias que codifican una metionina inicial en el extremo amino de proteínas se agrego también. Como primer paso para construir el plásmido de expresión, se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa empleando ADN de FB66a como templado usando los iniciadores presentados en (EQ ID número 35 a continuación y W048A2 (SEQ ID número 10, página 14) en una mezcla de reacción que contenía 2µl de cada iniciador (solución madre lOOµg/ml) , 2µg/ml) , 2µl de 10 X regulador II de reacción en cadena de polimerasa (Perkin Elmer) , 2µl 10 X solución madre de cada nucleótido (solución madre 2 mM) , 1.2µl de MgCl2 (solución madre 25 mM) , 0.09µl de 5 unidades/µl de polimerasa taq (Perkin Elmer) , ADN de FB66a y agua para llevar la mezcla de la reacción a 20µl. En el iniciador 5' (SEQ ID número 35), un sitio Ncol y el marcador FLAG de región de codificación se subraya. SEQ ID número : 35 CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGAC- GACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa en un dispositivo para llevar a cabo sitios térmicos de ADN de Perkin El'mer bajo las siguientes condiciones: 94°C durante 4 minutos seguidos por 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 50°C durante un minuto, y 72°C durante 2 minutos. El producto de reacción en cadena de polimerasa resultante fue digerido con Ncol y Kpnl, purificado en gel, y se subclonó en un vector Bluescript SKII previamente digerido con las mismas encimas. El vector Bluescript había sido previamente modificado para incluir un fragmento promotor de alcohol deshidrogenasa 2 (ADH2) Sacl/Ncol removido de un vector YepC-PADH2d (Price, et al., Meth. Enzymol. 185:308-315 (1990)). El plásmido resultante fue designado W48pcrl. Un fragmento Kpnl/Sstl que contiene la porción 3 'del cuadro de lectura abierta fue aislado a partir de un cADN de FB66a e insertado en W48pcrl -previamente digerido con Kpnl „.y EcoRV. El plásmido resultante fue designado W485.1. Un fragmente Sacl/Kpnl que contiene el promotor ADH2 y la porción 5'del gen de PDE8A'fue aislado a partir de W49pcrl. Un fragmento Kpnl/Sall que contiene la región 3 'de PDE8A fue aislado a partir de W485.1. Los dos fragmentos fueron ligados en el vector de expresión de levadura YepC-PADH2d que había sido previamente digerido con Sacl y Salí. El plásmido resultante fue designado W48-2ADH2 y fue depositado el día 2 de octubre de 1997 bajo los términos del Tratado de Budapest ante la America Type Culture Collection (A.T.C.C), 12301 Parklawn Derive,. Rockville, MD 20852. La cepa bacteriana que lleva el plásmido W48-2ADH2 recibió el número de acceso ATCC 98552. Las secuencias de ADN generadas por reacción en cadena de polimerasa y las secuencias de ADN en las uniones PDE8/vector fueron determinadas para "asegurar una construcción de plásmido apropiada. Al confirmar la secuencia, el plásmido fue transformado en una cepa de levadura BJ2-54 que no tenía la actividad DPE endógena (ura3-52;trpl; leu2; cir°; gal2;pep4-3;prbl-1122;prcl-402;?PDE1: :TJRA3;HIS3; ?PDE2 : :TRP1) . Las células huéspedes fueron cultivadas durante la noche en medios selectivos SC-leu que incluye glucosa al 2%, diluido a 1-2 x 105 células/ml y subsecuentemente cultivadas a una densidad de 107 células/ml en el mismo medio. La presencia del plásmido^de expresión pareció incrementar el tiempo de duplicación para el crecimiento celular de 2 a 3 veces aún bajo condiciones no inductivas. Las células fueron recogidas por centrifugación lavadas con medios YEP que incluía glicerol al 3% suspendida de nuevo en YEP/glicerol al 3% a una densidad de 107 células/ml, cultivadas durante 24 horas antes de la cosecha. Las células fueron congeladas hasta su uso. Pellas de células congeladas (0.06 mi) fueron descongeladas y suspendidas en 0.2 mi de regulador de lisis que contenía MOPS 100 mM, pH 8.0, NaCl 200 mM, 2uM de ZNS02 ditiotreitol 2 mM y 10µg/ml cada uno de inhibidores de proteasa pepstatina, leupeptina, y aprotinina. Se agregaron aproximadamente 0.2 mi de perlas de vidrio de 0.5 mm a las células que fueron después lisadas con 4 ciclos de vórtices de 30 segundos. El lisado fue aspirado y las perlas fueron lavadas dos veces con 0.3 mi de regulador de lisis. El lisado fue combinado con los lavados para generar el extracto de levadura. En algunos experimentos, el lisado fue fraccionado mediante centrifugación a 105,000 x g durante 30 minutos. Se llevó a cabo un análisis Western en extracto de levadura que contenía la proteína recombinante de la siguiente manera. Las proteínas fueron primero separadas en SDS-PAGE y transferidas a Immobilon-P (Milipore) empleando métodos estándares . Las tinciones de proteína fueron bloqueadas usando leche deshidratada sin' "grasa al 5% en Tris-HCl 20 M, ' pH 7.4, NaCl 150 iriM, Tween-20 al 0.05% (Regulador de TBST más leche) durante una hora a temperatura ambiente. Las tinciones fueron incubadas con anticuerpo anti-FLAG M2 (antes comentado) en una concentración de lµg/ l en regulador de TBST más leche durante una hora, después de lo cual las tinciones fueron lavadas 4 veces con regulador de TBST. Las tinciones fueron después incubadas durante una hora con anticuerpo de IgG de antiratón de cabra purificado por afinidad de grado de tinción conjugado con peroxidasa de rábano agrio (HRP) (BioRad) . El IgG de cabra fue previamente diluido 1/10000 en regulador de TBST más leche. Las tinciones fueron lavadas 4 veces con TBST y tratadas, de conformidad con el protocolo sugerido por el fabricantes, con el sistema Renaissance® (New England Nuclear Life Sciences Products) para quimicoluminiscencia "realzada antes de autoradiografía. La mayoría de la proteína detectada por el anticuerpo tenía el tamaño esperado para la proteína recombinante. Se ensayo la actividad PDE mediante la detección de 32 P-fosfato liberado de 32 P-cAMP o bien 32 P-cGMP de conformidad con lo descrito previamente (Loughney et al., J. Biol. Chem. 271:796-806(1996)). El extracto de levadura fue diluido en 0.5 X regulador de lisis que contenía también 0.5 mg/ml de albúmina sérica bovina. Veinte µl del extracto de levadura o bien extracto de levadura diluida se ensayaron en un volumen de reacción de lOOµl que incluyó Tris-HCl 50 mM adicional (pH 8.0), MgC12 5 mM, lµM de Zn S04 y 0.1 mg/ml de albúmina sérica bovina. Se ensayo la concentración de proteína mediante el método de Bradford. Se observó que PDE8A hidrolizaba tanto cAMP como cGMP. En los usados no fraccionados, la actividad específica para cAMP fue de 3.9 nmol/min/mg y para cGMP fue de 7.6 nmol/min/mg. El fraccionamiento reveló que 20-40% de la actividad total estaba asociada con la fracción de sobrenadante de alta velocidad. El análisis cinético de la actividad con cAMP como substrato sugirió la presencia de formas altas y bajas de Km de la enzima en una relación de actividad 1:1. Los valores Km estimados fueron 0.2µM y 350µM.

El análisis de la pella de alta velocidad sugirió que las mismas especies estaban presentes pero en una relación entre actividad Km alta: actividad Km baja de 1:4. El análisis cinético con cGMP como substrato sugirió la presencia de formas bajas y altas de la enzima en estos análisis, los valores Km fueron estimados en 3uM y 300µM Los valores IC50 para la inhibición de * a actividad PDE8A fueron determinados empleados un conjunto de inhibidores de PDE selectivos para isozima y el inhibidor no selectivo isometilbutilxantina (IBMX) . Puesto que estos ensayos se llevaron a cabo a una concentración de cAMP de 60 nM, los valores IC50 reflejan inhibición de la forma Km solamente.

Los resultados ""aparecen en la tabla 3 con valores ilustrados en unidades micromolares . Tabla 3 Inhibición de PDE8 con inhibidores de PDE específicos para isozima Compuesto Familia de PDE blanco IC50 para familia blanco IC50 para PDE8 Diferencias en veces IC224 PDE1 0.08-0.008 2.7 38-338 EHNA " PDE2 2 65 31 Cilostamida PDE3 0.02 12 750 IC197 PDE4 0.02 14 714 DMPPO PDE5 0.016 1.1 66 IBMX No selectivo 1-40 4.6 0.12-4.6 Los valores de IC50 para cada uno de los inhibidores selectivos fueron al menos 30 veces más altos contra PDE8 que contra ~ sus isozimas blanco lo que sugiere que el perfil inhibitorio de PDE8 es distinto del perfil inhibitorio de PDEs 1-5. La hidrólisis de cAMP y cGMP distingue claramente la actividad enzimática de PDE8A de la actividad enzimática de PDE6 y PDE7A. La IC50 del inhibidor no selectivo IBMX para PDE8 se controla dentro de un rango observado para las PDEs humanas conocidas lo que sugiere que el sitio catalítico de PDE8 se parece a los sitios catalíticos de otras PDEs humanas y de mamífero y es distinto de formas eucarióticas inferiores que son insensibles a IBMX. Ejemplo^ 6—- " -Análisis Northern de expresión de PDE8A Se llevó a cabo un análisis Northern de la expresión de PDE8A usando tinción tisular múltiples humana (Clontech, Palo Alto, CA) . La sonda de 327 bases fue extendida del nucleótido de 167 al nucleótido 2293 en SEQ ID número 3. Las condiciones de preparación e hibridación de la ribosonda fueron las previamente descritas (Loughney, et al. Supra). Los resultados mostraron un mARN de 9.5 kb en todos los tejidos examinados pero la intensidad de la banda vario. La señal fue más fuerte en el corazón, cerebro y riñon; la señal fue más débil en el hígado, placenta páncreas y músculo esqueletal. La señal fue la más débil en los pulmones. Ejemplo 7 Cartografiado de cromosoma de PDE8A humana Se aislaron cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían el gen de PDE8A humana a partir de un panel de YACs humanos adquiridos en Research Genetics y tamizados por reacción en cadena de polimerasa de la siguiente manera. Los superconjuntos de YAC fueron tamizados con dos pares anidados de iniciadores. En la primera reacción de tamizado, se acopló el iniciador de sentido W48S8 (SEQ ID número 36) con el iniciador de anti-sentido W48A10 (SEQ ID número 37) . Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con Tris HCl lOmM, pH 8.3, KCl 50 mM, MgS04 2 mM, 0.2 mM cada uno de dNTP, lOµg/ml de cada iniciador, 0.5 unidades de polimerasa taq (Perkin Elmer) y 1.5 µl de ADN YAC como templado. Las reacciones fueron realizadas durante 30 ciclos , cada ciclo consistiendo de 1 minuto a una temperatura de 94°C, 2 minutos a 60°C y 4 minutos a 72°C. Después de la primera ronda de amplificación, los productos de la reacción fueron reamplificados con el par interno de iniciadores W48S2 (SEQ ID número 36) y W48A12 (SEQ ID número 37) . W48S12 CCAGAAGGGGTACITITCC SEQ ID NO: 36 W48A12 CATrGTCCTGAGGCTGTGG SEQ ID NO: 37 Las reacciones fueron realizadas de conformidad con lo descrito arriba excepto que el templado fue lµl de una dilución 1:10 (en agua) de la primera ronda de reacción. Los superconjuntos que proporcionan el producto de reacción en cadena de polimerasa de tamaño correcto fueron identificado y los subconjuntos correspondientes fueron tamizados con los mismos pares anidados de iniciadores bajo las mismas condiciones con el objeto de identificar direcciones únicas para YACs que contienen PDE8A. Cepas de levadura que contienen los. YACs relevantes fueron adquiridas en Research Genetics. Con el objeto de verificar la presencia del gen PDEda en los varios YACs, se preparó ADN a partir de cada cepa y se analizo mediante reacción en cadena de polimerasa con iniciadores W48S8 y W48A10. Se preparó el ADN de cada cepa de conformidad con un método previamente, descrito (Hoffman y Winston, Gene 57:26 #2 2 (1987)) pero modificado de la siguientes manera. Las cepas fueron cultivadas durante la noche a .30°C en medio YEP que contenía glucosa. Se formaron pellas con 10 mi de cultivo mediante centrifugación y se resuspendió en 200µl de regulador acuoso que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, Na2 EDTA 1 mM, SDS al 1%, y Triton-XlOO al 2%, . Las células fueron lisadas mediante vórtice en presencia de 200µl de fenol/cloroformo (mezcla 1:1), y lOOµl de perlas de vidrio (425-600µm) . Después de la lisis, se agregaron 200µl de regulador de TE (Tris 10 mM, pH 8.0, Na2 EDTA 1 mM) y la muestra fue centrifugada para separar las fases. La fase orgánica fue extraída otra vez con 200µl de regulador acuoso. La fase acuosa combinada fue tratada con 100 unidades de Rnasa pancreática bobina (Boehringer Mannheim) durante 1 hora a una temperatura de 37°C y la muestra fue extraída con fenol/cloroformo, extraída de nuevo con cloroformo, y precipitado con etanol de conformidad con métodos establecidos. La pella resultante fue resuspendida en 50µl de regulador TE. Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa de conformidad con lo descrito arriba excepto que el volumen de la reacción fue de 25µl y el templado consistía de Iµl de la preparación de ADN de levadura relevante. Tres YACs humanos que contenían el gen de PDE8 fueron identificados con las direcciones 805B6, 919H10 y 920A3 (según la designación CEPH) . De conformidad con . la información que se encuentra en la base de datos en el centro para la investigación Genoma (Whitehead) , los tres YACs se empalman entre ellos y son parte de un contig unido de manera unitaria (WC6.16) en el cromosoma 6 humano. Dos sitios marcados con secuencias dentro de este contig (D6S305 y D6S411) Se colocaron en el mapa genético de los cromosomas 6 en una posición 167 cM a partir del final de 6p en el trabajo en el Centro para Investigación de Genoma; de 6S305 ha sido cartografiado en una posición 173cM a partir del final de 6p en trabajo en CEPH-Genethon. 3 otros YACs dentro del contig WC6.16 (932F1, 956B1 y 947D5) han sido cartografiados por hibridación in situ de florescencia en CEPH-Genethon. Las señales de hibridación caen entre las unidades longitudinales fracciónales 0.94- y 0.99 a partir del final de 6p. De conformidad con el mapa de resumen integrado de -CEPH (Chumakov et al., Nature 377 (Supp) : 175-297 (1995)). Esta región corresponde a la región citogénica 6q26-27. Defectos que pueden heredarse han sido asociados con esta región del genoma humano los cuales incluyen degeneración de cono retinal (base de datos OMIM) diabetes mellitus insulino-dependiente (Davies et al. Nature 371:130-136 (1994; Luo et al. Am. J. Hum. Genet. 57:911-919 81995)) así como enfermedad de parkinson de inicio juvenil (Matsumine et al. Am. J. Hum. Genet. 60;588-596 (1997)). Además, se observa frecuentemente la pérdida de heterozigosidad (LOH) en _esta región en varias células de cánceres diferentes, incluyendo linfoma de Burkitt (Parsa et al. Genes, Chromosomes & Cáncer 9:13-18 (1994)), astrocitoma (Linar et al. Neurology 44:533-536 (1994)), carcinoma gástrico (Queimado et al. Genes' , Chromosomes &Cancer 14:28-34 (1995)), adenoma paratiroideo (Tahara et al. Cáncer Res. 56:599-605 (1996)), y carcinoma de ovarios (Cooke et al. Genes, Chromosomes & Cáncer 15:223-233 (1996); Saito et al. Cáncer Res. 56:5586-5589 (1996)). Se ha sugerido que LOH indica la presencia 'de un gen supresor de tumor en la región afectada (Weinberg, Science 254:1138-1146 (1991) ) . Debido a su expresión generalizada, es posible que la mutación del gen de PDEd pudiera estar involucrada en todas o algunas de estas anormalidades genéticas. Ejemplo 8 Verificación que PDE8A1 y PDE8A2 Representan variantes de empalme y Esfuerzos para extender las secuencias 5 'de PDE8A2 Para verificar que PDE8A1 y PDE8A2 representan variantes de empalme 5', se manejaron dos enfoques. Primero, análisis de reacción en cadena de polimerasa revelo que el ADN genómico, ni las secuencias de PDEdAl ni las secuencias de PDE6A2 estaban adyacentes a la secuencia de ADN de la región común. Las secuencias genómicas corriente arriba de la región común estuvieron presentes en un tercio de cADN de PDE8A, FB74b, que se identifico en el grupo de 6 clones -originales que se hibridaron sobre el extremo 5' de la sonda W04835 descrita en el ejemplo 2. La secuencia parcial (755 nucleótidos en el extremo 3') del clon FB74b se presenta en SEQ ID número 39. El cADN de FB74b fue diferente de FB85c-2 y FB66á en la misma posición que FB85c-2 y FB76a difirieron entre ellos, pero el clon de FB74b no mantuvo el cuadró de lectura abierta. En la secuencia de FB74b 5 'hasta el punto de divergencia de secuencia a partir de los clones FB66a y FB85c-2, un codón de detención en cuadro estuvo más cerca del punto de divergencia que un codón de metionina de iniciación, lo que indica, que si FB74b representó un cADN en vez de un precursor no empalmado, la metionina de iniciación se ubicaría necesariamente en la secuencia común tanto a FB66a como a FB85c-2. Se llevó a cabo un análisis en reacción en cadena de polimerasa empleando un iniciador designado FB74bSl (SEQ ID número 40) dentro de las secuencias corriente arriba de FB74b y un segundo iniciador designado W48A9 (SEQ ID número 11) dentro de las secuencias comunes a FB74b, FB66A y FB85c-2.

FB74bS 1 GTTAGATGAGAGGTTGCTGG - SEQ ID NO: 40 Usando lµg de ADN genómico humano como templado, se amplifico una banda que tiene el mismo tamaño que la banda amplificada empleando FB74b como templado, lo que indica que las secuencias únicas a FB74b y la región común estuvieron adyacentes en el ADN genómico. Así, la secuencia de FB74b puede representar un intron no ^empalmado o bien puede representar una tercera variante empalmada que codificaría una proteína con una metionina inicial dentro de la región común. En cualesquiera de los casos, las secuencias de FB85c-2 y FB66a son probablemente generadas por empalme. Segundo, se llevó a cabo un análisis RACE de 5 'empleando un RNA aislado de la corteza humana, cerebelo, corazón, hígado y tejidos pulmonares. Se aisló ARN a partir de fragmentos de tejido congelados de conformidad con lo descrito (Loughney et al. J. Biol. Chem: 271:796-806 (1996)) y se selecciono un mARN poli A+ empleando un sistema de aislamiento de mARN Fast Track ® (invitrogen) . Se preparó un cADN de doble hebra empleando 5µg de mARN poli A+ y un kit de síntesis de cADN (Boehringer Mannheim) . El cADN fue ligado sobre un enlazador formado mediante el templado de oligonucleótidos L 15 (SEQ ID número 41) y L30 (SEQ ID número 42) . L15 GTATGCTAATCTCAG SEQ ID NO: 41 L30 CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATAC SEQ ID NO: 42 Para el análisis RACE de 5 'el cADN ligado a enlazador fue amplificado por reacción en cadena de polimerasa empleando los oligonucleótidos L 18 (SEQ ID número 43) y W48A13 (SEQ ID número 44) . L18 CAACTCGAATTCCTTGAC SEQ NO: 43 W48A13 GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC SEQ ID NO: 44 La reacción contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, 50 KCl mM, MgCl2 -1.5 mM, 0.2 mM de cada dNTP^ 10 µg/ml de cada iniciador y lµl de cADN ligado a enlazador en un volumen de reacción de 25µl. Después del paso de calentamiento a 94°C, se inicio una reacción en cadena de polimerasa mediante la adición de 0.1 unidad de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim) y se prosiguió con 30 ciclos de un minuto a una temperatura de 94°C, 2 minutos a 60°C, y 4 minutos a 72°C. Los productos de la reacción en cadena de polimerasa fueron diluidos 10 veces con agua y empleados como templado en una segunda reacción en cadena de polimerasa con los oligonucleótidos L21 (SEQ ID número 45) y W48A9S (SEQ ID número 46) bajo las mismas condiciones que las descritas arriba. L21 CAACTCGAATTCCTTGACAGA SEQ ID NO: 45 W48A9S GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO: 46 El ADN amplificado en la segunda reacción en cadena de polimerasa fue disociado con EcoRI y Salí y ligado en el vector Bluescript (Stratagene) previamente digerido con las mismas enzimas. Inicialmente, las secuencias de ADN en 5 plásmidos de cada fuente de tejido se examinaron y tanto las secuencias de PDE8A1 y PDE8A2 5 'se encontraron entre los cADNs aislados. Se obtuvieron también secuencias de FB74b 5, así como varias secuencias, cada una aisladas una vez, lo que podría representar variantes de empalme adicionales o bien secuencias de ADN no relacionadas. Puesto que ninguno de los cADNs de tipo PDE8A2 se extendió 5 'más allá que el cADN de FB66a original, se analizaron clones RACE de PDE8A2 adicionales en un intento de extender la secuencia de extremo 5'. Se identificaron y secuenciaron 5 cADNs de PDE8A2 de pulmón adicionales, pero ninguno extendió la secuencia de PDE8A2. Una segunda ronda de reacción en cadena de polimerasa RACE se repitió usando el iniciador L21 (SEQ ID número 45) con el 'iniciador W48A14S (SEQ ID número 47) . W48A14S SEQ ID NO: 47 GATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG Los clones resultantes fueron tamizados por reacción en cadena de polimerasa y los más largos fueron escogidos para secuenciamiento. Solamente dos clones fueron más largos que el cADN ~~de FB66a original y extendieron la secuencia 5 ' 8 y 12 pares de bases, respectivamente, en la región no trasladada. Las secuencias de FB66a fueron extendidas con 5'-CCCAGGGCGCCA. El final de del extremo de 5 'de FB66a es muy rico en GC lo que puede contribuir a la dificultad de aislamiento de cADNs de longitud total. Ejemplo 9 Expresión y caracterización de PDE8A La PDE8A recombinante descrita en el ejemplo 5 existía tanto en forma de afinidad baja como en forma de afinidad alta en extraetb^de levadura. Debido_a la posibilidad que la forma de afinidad baja represente una enzima parcialmente inactiva, se llevó a cabo una expresión de PDE8A en sf9 y células COS en un intento de obtener ya sea una enzima homogénea o bien determinar si las dos formas cinéticas se expresan siempre a partir del cADN. El constructo de expresión sf9 de PDE8 fue generado con un fragmente Kpnl-Sall de 3 'a partir del plásmido W 85.1 (descrito en el ejemplo 5), y un fragmento 5'generado por reacción en cadena de polimerasa de la siguiente manera. Los. iniciadores FLAG-1 (SEQ ID número 48) y W48A4 (SEQ ID número 12) fueron empleados en reacción en cadena de polimerasa con ADN de COS-l de PDE8 (descrito a continuación) como templado. FLAG-1 GATCGGATCCACCATGGACTACAAGG SEQ ID NO: 48 Se llevó a cabo una reacción en cadena de .polimerasa de _ conformidad con lo descrito en el ejemplo 8 excepto que se empleo MgS04 2 mM en lugar de MgCl2 y se empleo 0.02 U de polimerasa Taq. Después de una incubación inicial de 4 minutos a una temperatura de 94°C se llevaron a cabo 30 ciclos con un minuto a 94 °C, 1 minuto a 50°C y 2 minutos a 72°C. El producto de amplificación de 5 'fue disociado con BamHI y kpnl, purificado en gel, y ligado con el fragmente 3' en el vector Pfastbac (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) previamente digerido con BamHIy Salí. El plásmido resultante fue designado Pfbrpde8. Todos los productos de amplificación ¿por reacción en cadena de polimerasa -y todas las nuevas uniones fueron verificadas mediante secuenciamiento. Se produjeron concentraciones madres virales recombinantes empleando el sistema FastBac (Gibco BRL) de conformidad con "el protocolo sugerido por el fabricante y se llevó a cabo expresión de proteína de la siguiente manera. Células Sf9 . fueron cultivadas a una temperatura de 27°C en medio CCM3 (Hyclone, Logan, UT) que contenía 50 U/ml de penicilina y 50µg/ml de sulfato de estreptomicina (Gibco) . Células de crecimiento exponencial fueron infectadas en una multiplicidad de aproximadamente 2 virus por célula y dichas células fueron incubadas durante 48 horas. Las células fueron recogidas por centrifugación, lavadas, con CMF-PBS (KCl 2.7 mM, KH2PO4 1.5 mM, NaCl 137 mM, Na2P04 8.1 mM) , y las pellas fueron congeladas y almacenadas a una temperatura de -80°C hasta su uso. Las células fueron lisadas en regulador (MOPS 50 mM, pH 7.2, sulfato de zinc lOµM, DTT 1 mM, benzamidina 2 mM, lOµg/ml cada uno de pepstatina, leupeptina, y aprotinina, y 20 µg/ml cada uno de inhibidores de calpain I y calpaina II) mediante sometimiento vórtice en presencia de un volumen igual de perlas de vidrio (lavado con ácido, 0.5 mm sigma) y se determinó la actividad PDE de conformidad con lo descrito en el ejemplo 5. En el extracto de sf9, se detectó una actividad PDE 45.4 nmol/min/mg para hidrólisis de cAMP (lOOµM de Substrato) y 69.4 nmol/min/mg para hidrólisis de _ cGMP (lOOµM de_ Substrato) . La actividad de PDE de fondo fue insignificante. La actividad de PDE8A pareció ser una mezcla de formas de alta afinidad y baja afinidad según lo detectado en extracto de levadura de conformidad con el ejemplo 5. Para la expresión en células COS se generó PDE8 COS-1 mediante la combinación de un fragmento Kpnl/Sall de 3 'a partir del plásmido W485.1 (ejemplo 5) y un fragmento Nhel/Kpnl obtenido mediante disociación de un producto de amplificación por reacción en cadena de polimerasa a partir de una reacción que incluía cADN de FB66a como templado con los iniciadores W48A2 (SEQ ID número 10) y ATG (SEQ ID número 35) . Las condiciones para reacción la reacción en cadena de polimerasa incluyeron una incubación inicial durante 4 minutos a una temperatura de 94 °C seguido por 30 ciclos de un minuto a una temperatura de 94°C, 1 minuto a 50°C y 2 minutos a 72° C en un ciclador térmico de ADN Cetus de Perkin Elmer. El fragmento de 5 'resultante y el fragmento de 3 'arriba descritos fueron unidos en el vector pClneo (Promega, Madison Wl) previamente digerido con Nhel y Salí. Células COS se i-confluentes que crecen en platos de 15 c fueron lavadas una vez con 25 mi de DMEM (Media Eagle Modificado de Dulbecco, 100 U/ml de penicilina y lOOµg/ml de sulfato de estraptomiciana, GIBCO) después de lo cual se agregaron 14 mi de DMEM/DEAE-dextran/cloroquina por plato. DMEM/DEAE dextrano/cloroquina consiste de 75 mi de DMEM -y;. 30µl de cloroquina 0.25 M en PBS (KCl 2.7 mM, KH2P02 1.5 mM, NaCl 137 mM, Na2P04 8.1 mM, CaCl2 0.9 mM, MgCl20.5 mM) , junto con 0.50 mi de 50µg/ml de DEAE-dextrano (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Se agregaron 20µg de ADN de plásmido en 135µl de regulador Tris/EDTA (TE) por plato y los platos fueron incubados durante 2 horas a una temperatura de 37°C en C02 al 5% . El medio fue removido y se agregaron 12 mi de DMSO/PBS al 10% durante un minuto y se removió. Las células fueron lavadas una vez con 25 mi de DMEM después de lo cual se agregaron 25 mi de DMEM que contenía 10% de suero de becerro fetal (Hyclone, Logan, UT) y las células fueron incubadas durante la noche a una temperatura de 37°C en C02 al 5%. El medio fue removido y la monocapa fue lavada con 25 mi de CMF-PBS. Se agregaron seis mi de una solución que contenía 0.05% de tipsina/0.5mM de EDTA (GIBCO) y las células fueron incubadas durante 5 minutos a una temperatura de 37°C. Las células fueron removidas de los platos mediante trituración y transferidas a tubos de centrifugación cónicos. Los platos fueron lavados con 6 mi de DMEM completo para cosechar las células restantes y la solución, de lavado fue agregada a los tubos de centrifugación. Las células fueron formados en pellas mediante centrifugación durante 5 minutos a aproximadamente 340 xg, resuspendidas en 5 mi de DMEM, completo, removidas a un plato de cultivo tisular de 15 cm que contenía 20 mi de DMEM completo e - incubadas durante la noche en C02. La monocapa fue lavada dos veces con CMF-PBS, incubada 5 minutos a 37°C en benceno (0.5 mM Na2EDTA 2H20, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 81 mM Na2HP04, 1.1 Mm glucosa, pH 7.4), y se cosecho de conformidad con lo arriba descrito. Las células en pellas fueron lavadas con CMF-PBS, congeladas en hielo seco, y almacenadas" a -80°C hasta su uso. Las células fueron lisadas en regulador (MOPS mM, pH 7.2, lOµM de sulfato de zinc, DTT lmM, benzamidina 2mM, lOµg/ml cada 'uno de pepstatina, leupeptina, y aprotinina, y 20µg/ml cada uno de inhibidores de calpaina I y calpaina II) mediante pasaje a través de una célula de presión French (SLM Instruments) a 20,000 psi y se determinó la activada de PDE de conformidad con el ejemplo 5. La expresión de PDE8A fue baja en el extracto de células COS y no pudo caracterizarse con presión debido al alto nivel de actividad de fondo proveniente de PDEs endógenas. Para caracterizar con mayor precisión el producto de extracción de células COS, la enzima que incluye un marcador FLAG en el extremo amino (ejemplo 5) es purificada a partir de 100,000 xg de sobrenadante de extracto celular empleando una columna de afinidad M2 anti-FLAG (sigma) de conformidad con el protocolo sugerido por el fabricante. Con el objeto de caracterizar con mayor precisión la actividad de PDE8A de levadura, la expresión de una proteína recombinante truncada en el extremo amino pero que conserva la región catalítica se lleva a cabo de conformidad con lo descrito en el ejemplo 5 en un intento de obtener una proteína homogénea. Ejemplo 10 Producción de anticuerpos Anti-PDE8A Se produjo una proteína de fusión GST en E. coli para proporcionar un antígeno para la generación de anticuerpos monoclonales para PDE8A. Un fragmento E. coli de FB70a (un cADN de PDE8A que incluye los nucleótidos 182-1330 de FB85c-2 y que fue uno de los 9 clones originalmente identificados que se hibridan con la sonda de W04835 de longitud completa descrita en el ejemplo 2) se inserto en el sitio EcoRI de pGEX5Xl (Pharmacia) y el consulto resultante fue transformado en el cepa de E. coli XL1 Blue. Se produjo una proteína de fusión GST-PDE8A que incluye 382 aminoácidos de -PDE8A a partir de este constructo después de inducción IPTG.. La proteína de fusión fue mezclada empleando SDS-PAGE, la banda de tamaño apropiado fue removida del gel después de tinción con KCl 0.4 M frío, y la proteína se obtuvo a partir de la acrilamida mediante electro elusión. El producto de elusión fue dializado. contra PBS y concentrado empleando columnas Centriprep 10 y Centricon (Amicon, Beverly MA) antes de su inyección en ratón. El día 0, 4 ratones Balb/c fueron presangrados y recibieron una inyección subcutánea de un panel de antígenos que incluían 30µg de ratón de proteína de fusión GAT-PDE8 en • adyuvante de Freud completo con 200µl de volumen total. Se repitieron las mismas inyección en las semanas 3 y 9 en adyuvante de Freud incompleto. Diez días después de la última inmunización, se obtuvieron sangrados de prueba y se tamizaron mediante ELISA de captura de antígeno y análisis Western. En el análisis ELISA, datos Immulon 4 (Dynex Cambridge, Massachusetts) fueron revestidos a una temperatura de 4°C con 50µ/pozo de una solución que contenía 2µg/ml de GST-PDE8 en 50mM de regulador de carbonato, pH 9.6. Los platos fueron bloqueados con gelatina de piel de pesado al 0.5% (Sigma) durante 30 minutos y se agrego 50µl de suero diluido en PBS con Tween 20 al 0.5% (PBST) . Las dilusiones séricas estaban dentro de un rango de 1:100 a 1:102,400 y fueron obtenidas mediante una serie de dilusiones dobles. Después de incubación a 37°C durante 30 minutos y después de lavado 3 veces con DBST, se agregó 50µl de anticuerpo de IgG (fe) de antiratón de carga conjugado con peroxidasa de rábano agrio (Jackson) (dilusión 1:10000 en PBST). Los platos fueron incubados como antes mencionado y lavados 4 veces con PBST. Se selecciono el anticuerpo con adición de tetrametilbencidina (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) y se suspendió la reacción de color después de 5 minutos con la adición de 50µl de H2S04 al 15%; . Se midió JLa absorbencia a 450 nM en un lector de platos. Para el análisis Western se emplearon geles SDS-PAGE con aproximadamente lOµg de extracto de PDE8 de levadura y aproximadamente 200 mg de GST-PDE8 purificada en gel y las proteínas fueron transferidas a Immobilon-PVDF. Se llevó a cabo un protocolo de tinción Western de quimioluminiscencia realzada estándar (ECL) empleando peroxidasa de rábano agrio de IgG de antiratón de cabra BioRad como cuerpo secundario. En preparación de hibridomas, esplenocitos de ratones que dieron positivo en protocolos de ELISA y/o tinción Western arriba fueron fusionados con células de NS-1 en una relación de 5:1 por métodos estándares empleando polietilenglicol 1500 (Boehringer Mannheim) (Harlow and Lañe, Antibodies (anticuerpos) , un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) . Las células fusionadas fueron resuspendidas en 200 mi de RPMI que contenía 15% de FBS, hipoxantina sódica 100 mM, aminopterina 0.4 mM, timidina 16 mM (HAT) (Gibco) 25 unidades/ml de IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1.5 x 106 Timocitos de murina/ml y suministrada en 10 platos de cultivo de tejido de 96% de fondo plano (Corning, Reino Unido) a razón de 200µl/pozo. Las células fueron alimentadas los días 2, 4 y 6 después de la fusión mediante la aspiración de aproximadamente lOOµl de cada pozo con una aguja 18 G (Becton Dickinson) y agregándose' lOOµl/pozo del medio de cultivo descrito arriba excepto que contenía 10 unidades/ml de IL-6 y que no tenía timocitos. Los días 9 a 12, se tamizaron lo sobrenadantes de los pozos de fusión mediante ELISA de captura de antígeno usando GST y GST-PDE8 y mediante análisis Western de ECL de conformidad con lo arriba descrito. Una señal positiva del tamaño esperada se obtuvo en ambos segmentos de la tinción Western empleando sangre de ratón y un anticuerpo monoclonal con reactividad muy débil con la proteína recombinantes de levadura se obtuvo en la fusión subsecuente. Todo el procedimiento se repite empleando 50µg de antígeno/ratón hasta obtener anticuerpos monoclonales más fuertemente inmunoreactivos . Ejemplo 11 Análisis de expresión de PDE8A mediante hibridación in situ La expresión de PDE8A" se examino en secciones tisulares mediante hibridación de in situ de conformidad con lo descrito a continuación. Preparación de la sonda Se subclonó un fragmento de enzima de restricción Xhol/EcoRI del FB70a de cADN (que corresponde a los nucleótidos 571 a 1226 de SEQ ID número 1) en un vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) con el objeto de generar un plásmido de expresión designado PDE8XR2A. El plásmido fue disociado con Xhol y transcrito (véase a continuación) con polimerasa T3 con el objeto de generar una sonda de antisentido. Se generó una sonda de sentido mediante la disociación de PDE8XR2A con EcoRI y se transcribió con polimerasa T7. Los templados de. PDE8A fueron transcritos empleando un Kit de transcripción de ARN (Stratagene, La Jolla, CA) en una reacción que contenía 5µg del regulador de transcripción 5X (Stratagene) , DTT 30 mM (Stratagene), 0.8 mM cada uno de ATP, CTP, GTP (10 mM (Stratagene), 40 U RnasaBlock II (Stratagene), 12.5 U T3 o bien T7 polimerasa (Stratagene) y 300 mg de templado de plásmldo linearizado, 50 Ci35 S-UTP (mayor que 1000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) . La mezcla fue incubada a una temperatura de 37°C durante una hora después de lo cual el ADN de templado fue removido por adición de lµl de DNasa y exenta de Rnasa (Stratagene) e incubación durante 15 minutos a una temperatura de 37°C. La sonda fue hidrolizada mediante la adición de 4µl de NaHC03 1 M, y 6µl de Na2C03 un durante 22 minutos de 60°C y la mezcla de la reacción fue neutralizada mediante la adición de 25µl de una solución que contenía lOOµl de acetato de sodio 3 M, 5µl de ácido acético (VWR, So. Plainfield, NJ) , y 395µl de dH20 una columna Quick Spin G50 RNA (5'->3'Inc, Boulder (CO) se preparo de conformidad con el protocolo sugerido por el fabricante. La sonda fue colocada en el centro de la columna y la columna fue sometida a centrifugación durante 4 minutos a 1000 rpm en una centrifugadora de escritorio. El producto de la columna fue mezclado con 50µl de H20, 2µm de 10 mg/ml de una solución de tARN, ÍOµl de acetato de sodio 3 M y 200µl de etanol al 100% (VWR) , y la mezcla resultante fue incubada a una temperatura de -20°C durante la noche. La solución de sonda fue sometida a microcentrifugación durante 15 minutos a 4°C, el sobrenadante fue removido y la pella fue resuspendida en 0µl de 1Z TBE que contenía lµl de DTT 0.1 M. La sonda fue almacenada a -70°C hasta la realización de un ensayo de hibridación in situ. Preparación de las muestras tisulares en hibridación in situ Se inspeccionaron tejidos (National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA y Cooperative Human Tissue Network, Philadelphia, PA) a 6µm y dichos tejidos fueron - colocados en platinas Superfrost Plus (VWR) . Las secciones fueron fijadas durante 20 minutos a una temperatura de 4°C en paraformaldehído al 4% (Sigma, St. Louis, MO) . Las platinas fueron enjuagadas en 3 cambios de IX CMF-PBS, deshidratadas con 3 lavados sucesivos con etanol al 70%, etanol a 95% y etanol al 100% y secadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las platinas fueron colocada en formamida al 70% (J. T. Baker) en 2X SSC durante 2 minutos a una temperatura de 70°C, se enjuagaron en 2XSCC a 4°C, se deshidrataron a través de lavados con etanol al 70%, 95% y 100%, y se secaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se llevó a cabo un paso de pre-hibridación mediante la colocación de las platinas en una caja hermética que contenía un pedazo de papel filtro saturado con regulador de caja que contenía formamida al 50% (J.T. Baker) en 4X SSC. Cada sección fue cubierta con lOOµl de regulador de rHB2 que consistía de sulfato de dextrano al 10% (Sigma) , formamida al 50% (J.T. Baker, Phillpsburg, NJ) , DTT 100 mM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) , NaCl 0.3 M (Sigma), Tris 20 mM, pH 7.5, EDTA 5 mM (Sigma) y una solución de Denhard IX (Sigma) y las platinas fueron incubadas a una temperatura de 42 C durante una hora. La sonda de conformidad con lo descrito arriba, se preparó mediante la mezcla de 4X105 cpm/sección de tejido con 5µl de una solución de 10 mg/ml de tARN por sección y se calentó la mezcla a una temperatura de 95°C durante 3 minutos. Se agrego regulador rH20 a temperatura de hielo para llevar el volumen final a 20µl/sección. La solución que contenía la sonda (20µl/sección) se agregó a lOOµl de regulador rHB2 previamente aplicado. Las platinas fueron incubadas a 55°C durante 12 a 16 horas. Después de hibridación, las platinas fueron lavadas una vez en 4X SSC que contenía DTT 10 mM durante una hora a temperatura ambiente, una vez en formamida desionizada al 50% (J. T. Baker) , IX SSC, y DTT 1 mM durante 40 minutos a una temperatura de 60°C, una vez en 2X SSC durante 30 minutos, a temperatura ambiente; y una vez en 0.1 IX SCC durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron deshidratadas a través de lavados" con etanol al 70%, 95% y 100% y secadas en aire durante 30 minutos. Las platinas fueron sumergidas en una emulsión nuclear Kodak NTB2, secada durante 1 a 3 horas a temperatura ambiente en la obscuridad y almacenadas en la obscuridad a una temperatura de 4°C con secador hasta el tiempo del revelado. Las platinas fueron reveladas en revelador Kodak Dektol a 4°C durante 4 minutos, sumergidas 4 veces en dH20 a 4°C y colocadas en fijador Kodak a 4°C durante 4 minutos. Las platinas fueron enjuagadas en dH20 y se llevó a cabo una tinción H&E estándar de conformidad con lo siguiente. Las platinas fueron enjuagadas en dH20 y teñidas con hematoxilina y eosina mediante transferencia de las platinas a través de una serie de los siguientes pasos : 5 minutos en formaldehído/alcohol (100 mi de formaldehído, 900 mi de etanol al 80%) ; 3 enjuagues en agua durante un total de 2 minutos; 5 minutos en hematoxilina de Harris al 0.75% (Sigma); 3 enjuagues en agua durante un total de 2 minutos; una inversión en HCl al 1%/etanol al 50%; un enjuague en agua; cuatro inversiones en carbonato de litio al 1%, 10 minutos en agua del grifo; 2 minutos en eosina al 0.5% (Sigma) ; 3 enjuagues en agua durante un total de 2 minutos; dos minutos en etanol al 70%; 3 enjuagues de un minuto en etanol al 95%; 2 enjuagues de un minuto en etanol al 100%; y 2 enjuagues de 2 minutos en xileno. Las platinas fueron montadas con Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) . Las señales obtenidas con la sonda PDE8A de antisentido fueron comparadas con las señales de control generadas por la sonda PDE8A de sentido y cualquier señal específica para la sonda de antisentido se considero como representación de la expresión de PDE8A. La señal de PDE8A fue detectada en la mayor parte del cerebelo, en un subconjunto de células en los túbulos de seminíferos de los testículos, en células esparcidas de origen todavía indeterminado en músculos esqueletales en células granulosas en estromas ovarianos en el ovario en células epiteliales en el bucle de Henle en el riñon y en el músculo liso de algunas arteriolas en el corazón. Estos resultados difieren de los resultados obtenidos por la tinción Northern y descritas en el ejemplo 6 en la medida en que se detectó una señal moderada en el corazón mediante tinción Northern mientras que los datos in situ que emplean esta muestra de corazón proporcionaron una señal débil. La inconsistencia podría reflejar diferencias en los tejidos de individuos diferentes o bien diferencias en cuanto al nivel de detección inherentes en los dos métodos. La señal en el ovario y la señal en el riñon pueden indicar que PDE8A está involucrada en la ovulación o bien en homeostasis de sal y/o agua, respectivamente. Los expertos en la materia realizaran probablemente numerosas modificaciones y variaciones a la invención presentada en los ejemplos ilustrativos anteriores. Por consiguiente, la invención está limitada solamente por las limitaciones expuestas en las reivindicaciones anexas .

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido de PDE8 purificado y aislado. 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID número :
2. 2.
3. 3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos en SEQ ID número: 4.
4. 4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, que comprende las secuencias de aminoácidos presentadas en SEQ ID número 6.
5. 5. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3 o bien 4.
6. 6. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, que comprende la secuencia presentada en SEQ ID número: 1.
7. 7. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, que comprende la secuencia presentada en SEQ ID número 3.
8. 8. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, que comprende la secuencia presentada en SEQ ID número: 5.
9. 9. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de PDE8 humana seleccionado dentro del grupo que consiste de: a) el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5; y b) un ADN que se hibrida bajo condiciones moderadamente estrictas con el polinucleótido de (a) .
10. 10. Un polinucleótido de conformidad con un polipéptido de PDE8 humano seleccionado dentro del grupo que consiste de: a) el polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 6, 7 y 8; y b) un ADN que se hibrida bajo condiciones ~ moderadamente estrictas con el polinucleótido de (a) .
11. 11. El polinucleótido de la reivindicación 5, que es una molécula de ADN.
12. 12. El ADN de la reivindicación 11 que es una molécula de cADN.
13. 13. El ADN de la reivindicación 11 que es una molécula de ADN genómico.
14. 14. El ADN de la reivindicación 11 que es una molécula de ADN parcial o totalmente sintetizada de manera química.
15. 15. Un polinucleótido de antisentido que se hibrida específicamente con el complemento del polinucleótido de la reivindicación 5.
16. 16. Un constructo de expresión que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5.
17. 17. Una células huésped transformada o bien transfectada con el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16.
18. 18. Un método para producir un polipéptido de PDE8 que comprende los pasos de: a) cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 17 bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido de PDE8 y b) aislar el polipéptido de PDEd a partir de la célula huésped de medio de cultivo.
19. 19. Un anticuerpo específicamente inmunoreactivo- con el polipéptido de conformidad con la" reivindicación 1, 3, o bien 4.
20. 20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19 que es un anticuerpo monoclonal.
21. 21. Un hibridoma que secreta el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20.
22. 22. Un anticuerpo anti-idiotípico específicamente inmunoreactivo con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19.
23. 23. Un método para identificar un compuesto socio de enlace específico de un polipéptido de PDE8A que comprende los pasos de: a) poner en contacto el polipéptido de PDE8A con un compuesto bajo condiciones que permiten el enlace entre el compuesto y el polipéptido de PDE8A; b) detectar el enlace del compuesto sobre el polipéptido de PDE8A; y c) identificar el compuesto como socio de enlace específico del polipéptido de PDE8A.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, donde el socio de enlace específico modula la actividad del polipéptido de PDE8A.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, donde el compuesto inhibe la actividad del polipéptido de PDE8A.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24, donde el compuesto realza la actividad del polipéptido de PDE10.
27. 27. Un método para identificar un compuesto socio de enlace específico de un polinucleótido de PDE8A que comprende los pasos de: a) poner en contacto el polinucleótido de PDE8A con un compuesto bajo condiciones que permiten el enlace entre el compuesto y el polinucleótido de PDE8A; b) la detección de enlace del compuesto con el polinucleótido de PDE8A; y c) la identificación del compuesto como socio de enlace específico del polinucleótido de PDE8A.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, donde el socio de enlace específico modula la expresión de un polipéptido de PDE8A codificado por el polinucleótido de PDE8A.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el compuesto inhibe la expresión del polipéptido de PDE8A.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, donde el compuesto realza la expresión del polipéptido de PDE10.
31. 31. Un compuesto identificado por el método de conformidad con la reivindicación 23 o bien 27.
32. 32. Una composición que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 31 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.