ES2245485T3 - Fosfodiesterasa 8. - Google Patents
Fosfodiesterasa 8.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONAL POLIPEPTIDOS PDE8, POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS, CONSTRUCCIONES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN LOS POLINUCLEOTIDOS, CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS CON LAS CONSTRUCCIONES DE EXPRESION; PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR POLIPEPTIDOS PDE8, POLINUCLEOTIDOS ANTISENTIDO, Y ANTICUERPOS ESPECIFICAMENTE INMUNORREACTIVOS CON LOS POLIPEPTIDOS PDE8.
Description
Fosfodiesterasa 8.
La presente invención se refiere en general a una
familia de fosfodiesterasas designadas PDE8 y a las utilizaciones
de la misma.
Las fosfodiesterasas (PDEs) hidrolizan
nucleótidos cíclicos 3', 5', para obtener sus monofosfatos
nucleósido 5 respectivos. Los nucleótidos cíclicos cAMP y cGMP son
sintetizados por adenilil y guanilil ciclasas, respectivamente, y
sirven de segundos mensajeros en cierto número de rutas de
señalización celular. La duración y fuerza de la señal del segundo
mensajero es función de la velocidad de la síntesis y de la
hidrólisis del nucleótido cíclico.
Se han identificado varias familias de PDEs. El
sistema de nomenclatura incluye primero un número que indica la
familia PDE. Hasta la fecha se conocen siete familias
(PDE1-7), que se clasifican según: (i) estructura
primaria; (ii) preferencia de substrato; (iii) respuesta a
moduladores diferentes; (iv) sensibilidad a inhibidores
específicos; y (v) modos de regulación [Loughney and Ferguson, en
Phosphodiesterase Inhibitors, (Inhibidores de la
fosfodiesterasa), Schudt, et al. (Eds.) Academic Press:
Nueva York, Nueva York (1996) páginas 1-19]. El
número que indica la familia va seguido de una letra mayúscula que
indica un gen diferente, y la letra mayúscula seguida de un segundo
número que indica un empalme específico o una transcripción
específica que utiliza un sitio de iniciación de
transcripción
único.
único.
Las secuencias de aminoácido de todos los PDEs de
mamífero identificados hasta la fecha incluyen una región altamente
conservada de aproximadamente 270 aminoácidos, situados en la
mitad terminal carboxi de la proteína [Charbonneau, et al.
Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 83:9308-9312 (1986)].
El dominio conservado incluye el sitio catalítico para hidrólisis
de cAMP y/o cGMP y dos sitios de fijación de zinc putativos así como
determinantes específicos de la familia [Beavo, Physiol. Rev.
75:725-748 (1995); Francis et al. J. Biol.
Chem. 269:22477-22480 (1994)]. Las regiones
terminales amino de los diversos PDEs son altamente variables y
comprenden otros determinantes específicos de familia como: (i)
sitios de fijación de calmodulina (PDE1); (ii) sitios de fijación
de GMP cíclico no catalítico (PDE2, PDE5, PDE6); (iii) sitios de
referencia (targeting) de membrana (PDE4); (iv) sitios de
asociación de membrana hidrófoba (PDE3); y (v) sitios de
fosforilación para la quinasa II
calmodulin-dependiente (PDE1), la quinasa
cAMP-dependiente (PDE1, PDE3, PDE4), o la quinasa
cGMP dependiente (PDE5) [Beavo, Physiol. Rev.
75:725-748 (1995); Manganiello, et al.,
Arch. Biochem. Acta 322:1-13 (1995); Conti, et
al., Physiol. Rev. 75:725-748
(1995).
(1995).
Los miembros de la familia PDE1 son activados por
calcio-calmodulina. Se han identificado tres genes:
PDE1A y PDE1B hidrolizan de preferencia cGMP mientras que PDE1C
presenta, según se ha visto, una alta afinidad tanto por cAMP como
por cGMP. La familia de PDE2 se caracteriza porque es estimulada
específicamente por cGMP [Loughney and Ferguson, supra]. Se
ha identificado únicamente un gen PDE2A, cuyo producto enzimático
es inhibido específicamente por
eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)
adenina (EHNA). Las enzimas en la familia PDE3 son inhibidas
específicamente por cGMP. Se conocen dos genes PDE3A y PDE3B que
tienen ambos una afinidad elevada por cAMP y cGMP, aunque el
V_{max} para la hidrólisis de cGMP es suficientemente reducido
para que cGMP funcione como un inhibidor competitivo para la
hidrólisis de cAMP. Las enzimas de PDE3 son inhibidas
específicamente por milrinona y enoximona [Loughney and Ferguson,
supra]. La familia PDE4 realiza la hidrólisis de cAMP e
incluye 4 genes, PDE4A, PDE4B, PDE4C y PDE4D, cada uno de los cuales
tienen múltiples empalmes. Los miembros de esta familia son
inhibidos específicamente por el fármaco antidepresor rolipram. Los
miembros de la familia de PDE5 fijan cGMP en sitios no catalíticos
e hidrolizan de preferencia cGMP. Únicamente se ha identificado un
gen, PDE5A. Las enzimas PDE6 foto-receptoras
hidrolizan específicamente cGMP [Loughney and Ferguson,
supra]. Como genes se pueden citar PDE6A y PDE6B (cuyos
productos proteínicos dimerizan y fijan dos copias de una subunidad
inhibitoria \gamma más pequeña para formar PDE bastón (varilla)
además de PDE6 que se asocia con tres proteínas más pequeñas para
formar PDE cono. La familia PDE7 realiza la hidrólisis de cAMP
pero, en contraste con la familia de PDE4, no es inhibida por
rolipram [Loughney and Ferguson, supra]. Únicamente se ha
identificado un gen
PDE7A.
PDE7A.
Dada la importancia de cAMP y cGMP en la
señalización intracelular del segundo mensajero, existe por lo
tanto la necesidad permanente, en el estado de la técnica, de
identificar especies PDE de adición. La identificación de familias
de PDEs desconocidas hasta la fecha y de genes y empalmes de los
mismos ofrecerá enfoques farmacológicos adicionales para el
tratamiento de estados en los cuales las rutas de nucleótido
cíclico son aberrantes así como estados en los cuales es deseable
la modulación de niveles de cAMP intracelulares y/o cGMP en ciertos
tipos de
células.
células.
En suma, la presente invención se refiere a
polipéptidos y polinucleótidos subyacentes para una nueva familia
de PDE designada PDE8. Según la presente invención, se presenta un
polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácido indicada
en SEQ ID NO: 2; un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de
aminoácido indicada en SEQ ID NO: 4; un polipéptido PDE8 que
comprende la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 6 y
polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. La invención
comprende tanto los polinucleótidos PDE8 como los productos
polipeptídicos de los mismos que se producen de forma natural y no
natural. Los productos PDE8 que se producen de forma natural
comprenden especies de polipéptido y gen diferentes dentro de la
familia PDE8 (es decir PDE8A); estas especies comprenden aquellos
expresados dentro de células del mismo animal así como homólogos de
especies correspondientes expresados en células de otros animales.
Dentro de cada especie de PDE8, la invención describe además
empalmes codificados por el mismo polinucleótido pero que proceden
de transcripciones diferentes de mRNA (es decir, PDE8A1 y PDE8A2).
Los productos PDE8 que se producen de forma no natural comprenden
variantes de los productos que se producen de forma natural, como
análogos (es decir donde se añaden, se sustituyen o se eliminan uno
o más aminoácidos) y aquellos productos PDE8 que comprenden
modificaciones covalentes (es decir proteínas de fusión, variantes
de glicosilación, Met^{-1}PDE8s,
Met^{-2}-Lys^{-1}- PDE8s, Gly^{1}- PDE8s y
similares). La familia PDE8 se distingue de las familias PDE
conocidas con anterioridad por el hecho de que presentan una
elevada afinidad por la hidrólisis de cAMP y cGMP aunque una
sensibilidad relativamente baja a inhibidores enzimáticos
específicos de otras familias PDE. En una realización preferida, la
invención presenta un polinucleótido que comprende la secuencia
indicada en SEQ ID NO: 1. La invención también comprende
polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada
en SEQ ID NO: 2. Un polipéptido actualmente preferido de la
invención comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID
NO: 2. La invención describe dos empalmes cADNs que dan origen a
dos polipéptidos designados PDE8A1 y PDE8A2. Los polipéptidos
PDE8A1 y PDE8A2 y los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos se tratan aquí como representativos de la familia
enzimática PDE8 contemplada por la invención.
La presente invención describe polinucleótidos
aislados y purificados nuevos (por ejemplo secuencias ADN y
transcripciones ARN, ambos sentidos y cadenas antisentido
complementarias, inclusive empalmes de los mismos) que codifican
los PDE8s humanos. Las secuencias de ADN de la invención incluyen
secuencias genómicas y de cADN así como secuencias ADN total o
parcialmente sintetizadas químicamente. El término
"sintetizado" tal como se utiliza aquí y se entiende en el
estado de la técnica, se refiere a métodos puramente químicos, en
oposición a metidos enzimáticos para la producción de
polinucleótidos. Por consiguiente, las secuencias ADN
"enteramente" sintetizadas son producidas por lo tanto
enteramente por medios químicos, y los ADNs parcialmente
"sintetizados" abarcan aquellos en los que únicamente se
producen por medios químicos partes del ADN resultante. En la SEQ
ID NO: 1 se indica una secuencia ADN preferida que codifica un
polipéptido PDE8 humano. La invención ofrece polinucleótidos que
codifican el polipéptido PDE8 de la SEQ ID NO: 2 y los polipéptidos
de empalme PDE8A1 y PDE8A2 indicados en la SEQ ID NO: 6 y 4,
respectivamente. Los polinucleótidos preferidos que codifican
PDE8A1 y PDE8A2 se indican en la SEQ ID NO: 5 y 3 respectivamente.
La invención contempla además especies, de preferencia mamíferos,
homólogos del ADN PDE8 humano.
La invención también contempla secuencias de ADN
que codifican especies de PDE8 que hibridan en condiciones
moderadamente rigurosas para las cadenas no codificadoras, o
complementos de los polinucleótidos en la SEQ ID NO: 1, 3 y 5.
También se contemplan secuencias de ADN que codifican polipéptidos
PDE8A que podrían hibridar aunque para redundancia del código
genético. Como ejemplos de condición de hibridación moderada se
pueden citar las siguientes: hibridación a 65°C en 3X SSC, 0,1%
sarcosil y 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8 y lavado a 65°C en 2X
SSC con 0,1% SDS. Se entiende en el estado de la técnica que se
pueden conseguir condiciones de rigurosidad equivalente haciendo
variar la temperatura y el tampón o la concentración salina tal
como describe Ausebel, et al. (Eds). Protocols in
Molecular Biology (Protocolos de biología Molecular) John Wiley
& Sons (1994), páginas 6.0.3 a 6.4.10. Las modificaciones en
las condiciones de hibridación se pueden determinar empíricamente
o calcularse de forma precisa tomando como base la longitud y el
porcentaje de emparejamiento de base guanosina/citosina (GC) de la
sonda. Las condiciones de hibridación se pueden calcular según lo
descrito en Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (Clonación Molecular. Manual de
Laboratorios), Cold Spring Harbor Laboratory Press: cold Spring
Harbor, Nueva York (1989), páginas 9.47 a 9.51.
Según la presente invención, se presenta un
constructo de expresión que comprende un polinucleótido de la
invención. En particular, se describen construcciones de expresión
recombinante de replicación autónoma como vectores ADN plásmido y
viral que incorporan secuencias PDE8. Se describen también
constructos de expresión en los cuales unos polinucleótidos de
codificación de PDE8 están operativamente ligados con una secuencia
ADN de control de expresión endógena o exógena y un terminador de
transcripción.
Según otro aspecto de la invención, se presentan
células anfitrionas transformadas o transfectadas con un
polinucleótido o constructo de expresión de la invención. En
particular se transforman de forma estable o transitoria células
anfitrionas que incluyen células procarióticas y eucarióticas, con
secuencias ADN de la invención de una forma que permite la expresión
de polipéptidos PDE8 de la invención. Las células anfitrionas de la
invención son fuentes valiosas de inmunógeno para el desarrollo de
anticuerpos específicamente inmunoreactivos con PDE8. Las células
anfitrionas de la invención también resultan notablemente útiles en
métodos para la producción a gran escala de polipéptidos PDE8 donde
las células son cultivadas en un medio de cultivo adecuado y los
productos polipéptidos deseados se aíslan de las células o del
medio en el que se cultivan las células, por ejemplo, por
purificación por
inmunoafinidad.
inmunoafinidad.
Según otro aspecto de la invención, se presenta
un método para la producción de un polipéptido PDE8 que comprende
las siguientes etapas: a) cultivo de una célula anfitriona de la
invención en condiciones adecuadas para la expresión del
polipéptido PDE8 y aislamiento del polipéptido PDE8 de la célula
anfitriona o del medio en el que se cultiva.
El conocimiento de la secuencias ADN PDE8 permite
modificar células para conseguir o incrementar la expresión de
PDE8 endógeno. Se pueden modificar células (por ejemplo por
recombinación homóloga) para obtener una mayor expresión de PDE8
sustituyendo, total o parcialmente, el promotor PDE8 que se produce
de forma natural por la totalidad o parte de un promotor heterólogo
de forma que las células expresen PDE8 a niveles más elevados. El
promotor heterólogo se inserta de modo que está ligado
operativamente con secuencias de codificación de PDE8. Véase por
ejemplo, Publicación Internacional PCT WO 94/12650, Publicación
Internacional PCT WO 92/20808 y Publicación Internacional WO
91/09955. La invención también contempla que, además del ADN
promotor heterólogo, se pueda insertar junto con el ADN promotor
heterólogo ADN marcador amplificable (por ejemplo ada, dhfr, y el
gen multifuncional CAD que codifica la carbamil fosfato sintasa,
asparto transcarbamilasa y dihidroorotasa) y/o ADN intron. Si se
liga a la secuencia de codificación de PDE8, la amplificación del
ADN marcador por métodos de selección standard da como resultado
una co-amplificación de las secuencias de
codificación de PDE8 en las
células.
células.
La información de la secuencia ADN ofrecida por
la presente invención también permite el desarrollo, por ejemplo
por estrategias de recombinación homóloga o
"knock-out" [Capecchi, Science
244:1288-1292 (1989)], de animales que no expresan
PDE8 funcional o que expresan una variante de PDE8. Estos animales
resultan útiles como modelos para estudiar las actividades in
vivo de PDE8 y moduladores de PDE8.
La invención también se refiere a polipéptidos de
PDE8 de mamífero, purificados y aislados. Los polipéptidos PDE8A
actualmente preferidos se indican en la SEQ ID NO: 4 y 6. Todavía
se prefiere más un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:2. Los polipéptidos PDE8 de la
invención se pueden aislar de fuentes celulares naturales o pueden
sintetizarse químicamente, pero se producen de preferencia por
procedimientos recombinantes que involucran células anfitrionas de
la invención. Se espera que la utilización de células anfitrionas
de mamífero proporcione modificaciones
post-translacionales (por ejemplo glicosilación,
truncación, lipidación y fosforilación) que se pueden necesitar
para conferir actividad biológica óptima a productos de expresión
recombínate de la invención. Los productos PDE8 de la invención
pueden ser polipéptidos de longitud normal, fragmentos
biológicamente activos o variantes de los mismos que mantienen
actividad biológica específica PDE8. Las variantes pueden
comprender análogos de polipéptido PDE8, donde uno o más de los
aminoácidos especificados (es decir codificados naturalmente) es
borrado o sustituido o donde se añade uno o más aminoácidos no
especificados: (1) sin pérdida de una o más de las actividades
biológicas o características inmunológicas específicas de PDE8; o
(2) con incapacidad específica de una actividad biológica
particular de PDE8.
Como productos variantes se pueden citar
productos PDE8A maduros, es decir productos PDE8 en los que se
quitan las secuencias líder o de señal, que tienen residuos amino
terminales adicionales. Se contemplan productos PDE8 que tienen un
residuo de metionina adicional en posición -1
(Met^{-1}-PDE8), como por ejemplos productos PDE8
que tienen residuos de lisina y de metionina adicional en las
posiciones -2 y -1 (Met^{-1} - Lys^{-1} - PDE8). Las variantes
de estos tipos resultan particularmente útiles para la producción
de proteínas recombinantes en tipos de células
bacterianas.
bacterianas.
La invención también contempla variantes de PDE8
que tienen residuos aminoácidos adicionales derivados del uso de
sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, la utilización de
vectores disponibles en el comercio que expresan un polipéptido
deseado como un producto de fusión de
glutationa-S-transferasa (GST)
ofrecen el polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina
adicional en la posición -1 como resultado de segmentación del
componente GST del polipéptido deseado. También se contemplan
variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de
vectores.
vectores.
La invención contempla productos PDE8 modificados
que incluyen uno o más anclajes polímeros solubles en agua.
Particularmente preferidos son los productos PDE8 modificados
covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG). Los
polímeros solubles en agua se pueden unir en posiciones
específicas, por ejemplo en el término amino de los productos PDE8,
o anclarse aleatoriamente a una o más cadenas laterales del
polipéptido.
La presente invención contempla también los
anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y policlonales,
anticuerpos de cadena simple, anticuerpos híbridos, anticuerpos con
injerto CDR y similares) y otras proteínas de enlace específicas de
productos PDE8 o de fragmentos de los mismos. Se pueden desarrollar
proteínas de enlace específico utilizando productos PDE8 aislados o
recombinantes, variantes de PDE8 o células que expresan dichos
productos. Las proteínas de enlace resultan útiles para purificar
productos PDE8 y detectar o cuantificar productos PDE8 en muestras
de fluido y de tejido que utilizan procedimientos inmunológicos
conocidos. Las proteínas de enlace resultan también manifiestamente
útiles en la modulación (es decir, bloqueo, inhibición o
estimulación) de actividades biológicas de PDE8, especialmente
aquellas actividades que intervienen en la transducción de señales.
También se contemplan anticuerpos anti-idiotípicos
específicos de anticuerpos anti-PDE8 como por
ejemplo hibridomas que se secretan anticuerpos
anti-PDE8 de la invención.
El valor científico de la información aportada
por las descripciones de secuencias de ADN y aminoácidos de la
presente invención resulta evidente. En una serie de ejemplos, el
conocimiento de la secuencia de un cADN para PDE8A permite,
mediante la utilización de hibridación Southern o reacción de
cadena polimerasa (PCR) la identificación de secuencias de ADN
genómico que codifican PDE8 y secuencias reguladoras de control de
expresión de PDE8 tales como promotores, operadores, potenciadores,
represores y similares. Los procedimientos de hibridación de
ADN/ADN realizados con secuencias ADN de la invención en
condiciones moderadamente a altamente rigurosas permitirán, según se
espera, con toda probabilidad, el aislamiento de variantes alélicos
de PDE8A que codifican ADNs; en el estado de la técnica se conocen
variantes alélicos que incluyen proteínas estructuralmente
relacionadas que comparten una o más de las propiedades bioquímicas
y/o inmunológicas específicas de PDE8A. De forma similar, también
se pueden identificar proteínas de codificación de genes de
especies no humanas, homólogas a PDE8A mediante análisis Southern
y/o PCR. Como alternativa, los estudios de complementación pueden
resultar útiles para identificar otros productos PDE8 humanos así
como proteínas no humanas y ADNs que codifican las proteínas, y
comparten una o más propiedades biológicas de PDE8A.
Los polinucleótidos de la invención resultan
también útiles en los ensayos de hibridación para detectar la
capacidad de las células para expresar PDE8. Los polinucleótidos
de la invención también pueden constituir la base para métodos
diagnósticos útiles para la identificación de una o varias
alteraciones genéticas en un locus PDE8 sujeto a estado o estados
patológicos.
La invención también presenta polinucleótidos
antisentido que reconocen e hibridan polinucleótidos de
codificación de PDE8. Se presentan polinucleótidos anti sentido en
fragmento y longitud normal. Los polinucleótidos
anti-sentido resultan particularmente relevantes
para regular la expresión de PDE8 por medio de las células que
expresan PDE8 mARN.
La información sobre secuencia de aminoácidos y
ADN facilitados por la presente invención permite también el
análisis sistemático de la estructura de PDE8s. La información de
la secuencia de aminoácidos y ADN para PDE8 permite también la
identificación de moléculas con las que interactúa PDE8A. Los
agentes que modulan (es decir, aumentan, reducen o bloquean) la
actividad de PDE8 se pueden identificar incubando un modulador
putativo con PDE8 y determinando el efecto del modulador putativo
en la actividad de fosfodiesterasa de PDE8. La selectividad de un
compuesto que modula actividad del PDE8 se puede evaluar comparando
su actividad en el PDE8 con su actividad en otras enzimas PDE. Se
contemplan análisis de soluciones y métodos de base celular como
análisis di-híbridos y análisis híbridos divididos,
así como métodos in vitro, inclusive análisis en los cuales
se inmoviliza un polipéptido o su elemento de enlace.
Los modulares selectivos pueden incluir por
ejemplo anticuerpos y otras proteínas o péptidas que interaccionan
específicamente con el PDE8 o el ácido nucléico del PDE8,
oligonucleótidos que interactúan específicamente con PDE8 o ácido
nucléico de PDE8 y otros compuestos no peptídicos (por ejemplo
moléculas orgánicas aisladas o sintéticas) que reaccionan
específicamente con PDE8 o ácido nucléico de codificación de PDE8.
También se contemplan formas mutantes de PDE8 que afectan la
actividad enzimática o la localización celular del PDE8 natural.
Los blancos actualmente preferidos para el desarrollo de
moduladores selectivos incluyen por ejemplo (1) regiones del PDE8
que están en contacto con otras proteínas y/o localizan el PDE8
dentro de una célula, (2) regiones del PDE8 que fijan substrato (3)
sitio(s) de fijación de nucleótido cíclicos alostéricos de
PDE8 (4) sitio(s) de fosforilación de PDE8 y (5) regiones
del PDE8 involucradas en la multimerización de subunidades de PDE8.
Los moduladores de la actividad de PDE8 pueden ser terapéuticamente
útiles en el tratamiento de una amplia gama de patologías y estados
fisiológicos en los cuales se sabe que actúa PDE.
La invención contempla además moduladores de
molécula pequeña de la actividad enzimática de PDE8A. Existen por lo
menos tres tipos diferentes de bibliotecas utilizados para la
identificación de moduladores de molécula pequeña. Estos incluyen:
(1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y
(3) bibliotecas combinatorias que comprenden péptidos aleatorios,
oligonucleótidos o moléculas orgánicas.
Las bibliotecas químicas están constituidas por
análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos
identificados como "hits" o "leads" por medio de examen
del producto natural (screening). Las bibliotecas de productos
naturales son colecciones de microorganismos, animales, plantas u
organismos marinos que se utilizan para crear mezclas para
selección (screening) por: (1) fermentación y extracción de caldos
de microorganismos del suelo, vegetales o marinos o (2) extracción
de plantas u organismos marinos. Las bibliotecas combinatorias
constan de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o
compuestos organismos en forma de mezcla. Resultan relativamente
fáciles de preparar con métodos de síntesis automática tradicional,
PCR, clonación o métodos sintéticos protegidos por patentes.
Presentan un interés particular las bibliotecas combinatorias de
péptidos y oligonucleótidos. Otras bibliotecas de interés incluyen
péptidos, proteínas, colecciones peptido miméticas, multiparalelas
sinteticas, bibliotecas recombinatorias y polipéptidas. Para ver
una panorámica de la química combinatoria y las bibliotecas creadas
a partir de la misma, véase Myers, Curr. Opion. Biotechnol.
8:701-707 (1997).
La identificación de moduladores utilizando las
diversas bibliotecas descritas aquí permite modificar el "hit"
(o "lead") para optimizar la cantidad del "hit" para
modular la actividad.
La invención ofrece además métodos para
identificar un compuesto, elemento de fijación específico de un
polipéptido de PDE8 de la invención que comprende las siguientes
etapas: a) poner en contacto un polipéptido de PDE8 de la invención
con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el
compuesto y el polipéptido de PDE8; b) detectar la fijación del
compuesto al polipéptido de PDE8, y c) identificar el compuesto
como elemento de fijación específica del polipéptido de PDE8. Los
elementos de fijación identificados en los métodos de la invención
modulan de preferencia la actividad enzimática de PDE8 ya sea por
medio de inhibición o activación, o potenciación de la enzima.
La invención también presenta métodos para
identificar un compuesto elemento de fijación específico de un
polinucleótido de PDE8 de la invención que constan de las
siguientes etapas: a) poner en contacto un polinucleótido de PDE8
de la invención con un compuesto en condiciones que permitan la
fijación entre el compuesto y el polinucleótido de PDE8; b)
detectar la fijación del compuesto en el polinucleótido de PDE8; y
c) identificar el compuesto como elemento de fijación específico
del polinucleótido de PDE8. El elemento de fijación del
polinucleótido de PDE8 modula de preferencia la expresión de
polipéptido de PDE8 codificado por el polinucleótido de PDE8, ya
sea inhibiendo la expresión o potenciando la misma.
La invención también describe compuestos
identificados por un método de la invención así como composiciones
que comprenden un compuesto identificado y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se ilustra con los
siguientes ejemplos que se refieren al aislamiento de
polinucleótidos que codifican polipéptidos de PDE8 así como a la
expresión y la caracterización de los polipéptidos codificados. El
ejemplo 1 describe métodos para buscar bases de datos de rótulo de
secuencia expresada (EST) con el objeto de identificar sondas
potencialmente útiles para aislar ADNs de la invención. El ejemplo
2 se refiere a la identificación de polinucleótidos que codifican
PDE8A. El ejemplo 3 contempla el análisis de secuencia de los
polinucleótidos aislados. El ejemplo 4 describe el análisis de
polipéptidos codificados por los polinucleótidos de PDE8A. El
ejemplo 5 contempla la expresión de polipéptidos de PDE8A
recombinante. El ejemplo 6 se refiere al análisis Northern de
expresión de PDE8A. El ejemplo 7 describe la cartografía
cromosómica del gen de codificación de PDE8A. El ejemplo 8 describe
la confirmación de que PDE8A1 y PDE8A2 son enlaces. El ejemplo 9
contempla la expresión y la caracterización de PDE8A recombinante.
El ejemplo 10 detalla la producción de anticuerpos monoclonales
anti-PDE8A. El ejemplo 11 describe un análisis de
expresión de PDE8A por hibridación in situ.
Utilizando las secuencias de fosfodiesterasas
núcleotido cíclico 3', 5' humanas se realizó un estudio de la base
de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Expressed Sequence Tags (EST) con el objeto de identificar
fragmentos de cADN que pudieran ser potencialmente útiles para la
identificación de genes de fosfodiesterasa (PDE) nuevos. Esta base
de datos contiene secuencias de ADN que representan uno o ambos
extremos de cADNs recogidos entre una variedad de fuentes de
tejidos. Se realizó una serie (run) de secuencia única en uno o
ambos extremos del cADN y la calidad de la secuencia ADN varia
enormemente. En el momento en que los estudios de PDE fueron
realizados, la base de datos de secuencia EST contenía más de
600.000 secuencias de cADN de toda una serie de organismos.
La búsqueda de nuevas secuencias PDE comprendía
tres etapas. En primer lugar se utilizó el programa BLASTN puesto
a disposición por NCBI para identificar secuencias ADN en la base
de datos de secuencias EST que presentaran homologías con las
secuencias cADN codificadoras de PDEs humanas conocidas. El
programa compara una secuencia de consulta de nucleótido (query)
con una base de datos de secuencia de nucleótido. Se obtuvieron las
secuencias cADN de quince PDEs humanas conocidas y se realizaron
quince búsquedas BLASTN; las secuencias PDE de consulta incluían
PDE1A3 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271:
796-806(1996)], PDE1B1 [Yu, et al.,
Cell Signaling, in press (1997)], PDE1C2 [Loughney, et al.,
J. Biol. Chem. 271: 796-806-(1996)], PDE2A3
[Rosman, et al., Gene 191:85-95 (1997)]
PDE3A [Meacci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA)
89:3721-3725 (1992)], PDE3AB [Miki et al.,
Genomics 36: 476-485 (1996)], PDE4A5 [Bolger et
al., Mol. Cell Biol. 13:6558-6571 (1993)],
PDE4D1 y PDE4D3 [Bolger et al., Mol. Cell Biol.
13:6558-6571 (1993)], PDE5A, PDE6A [Pittler, et
al., Genomic 6: 272-283 (1990)], PDE6B
[Collins, et al., Genomics 13:698-704
(1992)], PDE6C [Piriev, et al., Genomics 28:
429-435 81995)], y PDE7A1 [Michaeli, et al.,
J. Biol. Chem. 17:12925-12932 (1993)]. Se
examinaron los resultados de BLASTN y las secuencias EST
consideradas correspondientes a cada uno de los quince cADNs PDE
conocidos se identificaron y recogieron en una tabla. Las
secuencias de PDE6A y PDE6B utilizadas como consultas se truncaron
en el extremo 3' (quitando una parte de la región no traducida 3')
debido a la presencia de elementos repetitivos en la región no
traducida 3' de los cADNs.
En segundo lugar, se utilizó el programa NCBI
TBLASTN para examinar la homología entre la secuencia proteínica de
los quince PDE humanos conocidos (como arriba) y las seis posibles
proteínas diferentes codificadas por cada una de las secuencias EST
ADN. En esta búsqueda, las secuencias EST se traducen en seis
marcos de lectura y las secuencias de aminoácidos generadas se
comparan con las secuencias de aminoácido PDE de consulta. Las
secuencias identificadas como homólogas a nivel del aminoácido se
examinaron y se descartó toda secuencia EST positivamente
identificada como correspondiente a un PDE conocido durante la
búsqueda BLASTN descrita
anteriormente.
anteriormente.
La tercera etapa de la búsqueda comprendía el
análisis de las secuencias que no eran PDEs conocidas. Estas
secuencias de aminoácidos eran homólogas a una PDE conocida pero
no se identificaron como uno de los quince genes PDE conocidos
durante las búsquedas BLASTN.
Las búsquedas BLASTN identificaron una secuencia
EST (designada WO4835) de una biblioteca cADN de pulmón fetal
humano que codificaba una secuencia de aminoácidos que tenía
homología con la región catalítica de PDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4A,
PDE4B, PDE4C, PDE5A PDE6A barra alfa, PDE6B barra beta, PDE6C cono
alfa y PDE7A. La secuencia de la base de datos de WO4835 se indica
en LA SEQ ID NO: 7. Los resultados del análisis de la base de datos
tratados a continuación se ejemplifican utilizan la secuencia
PDE4D.
Se obtuvo WO4835 cADN de la American Type Culture
Collection (Rockville, MD) que mantiene y pone a disposición del
público depósitos de ESTs identificados y secuenciados por
I.M.A.G.E., Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA).
Se secuenció el ADN WO4835 a su recepción para confirmar su
identidad y se determinó si se correspondía con SEQ ID NO: 7.
La secuencia de aminoácidos codificada por el
marco de lectura -1 de la secuencia EST WO4835 fue reconocida por
todas las secuencias cADN de consulta PDE con excepción de PDE1A,
1B y 1C. Utilizando los resultados TBLASTN con PDE4D3 como ejemplo,
se detectaron dos regiones de similaridad. La primera región
mostraba 15/37 coincidencias exactas ó 40% de identidad (19/37
aminoácidos similares) e incluía el motivo HD (X) _{2}HXG (X)
_{13}A (SEQ ID NO: 8) encontrado en todas las secuencias de
consulta. [Charboneau, Mol. Pharmacol. Cell Regul.
2:267-298 (1990)]. La región mostraba 9/20
coincidencias exactas o 45% de identidad e incluía el motivo
YHNxxHA encontrado en la mayoría de las secuencias de consulta. El
análisis BLASTN de la secuencia WO4835 reveló ser único ya que no
era idéntico a ninguna otra secuencia ADN humano en la base de
datos Genbank. La entrada de la base de datos EST para WO4835
identificaba la secuencia como similar a PIR:A47819, la secuencia
de fijación cGMP bovina, de PDE5A1 de hidrolización de cGMP. La
comparación de la secuencia proteinica del marco de lectura -1
WO4835 con la secuencia PDE5A1 bovino reveló 58/153 coincidencias
para una identidad global de 38%. Dentro de esta región se
encontraban pequeñas regiones de mayor homología. Una región mostró
12/14 aminoácidos idénticos. Dada la naturaleza única de la
secuencia WO4835, su homología relativamente baja con PDE5A1 bovino
y la presencia de motivos de aminoácido encontrados en la mayoría
de otras secuencias de aminoácidos PDE humano, WO4835 representa un
cADN de PDE humano nuevo.
Se procedió a la digestión de una inserción cADN
WO4835 del vector pT7T3D en dos fragmentos con las enzimas de
restricción EcoRI y HindIII y los dos fragmentos se purificaron
utilizando dos geles agarosa secuenciales de fusión baja. Ambos
fragmentos se utilizaron como sondas para examinar bibliotecas cADN
derivadas de corazón humano (Stratagene, La Jolla, CA), y cerebro
fetal humano (Stratagene) utilizando procedimientos rutinarios en
el estado de la técnica. Se reconocieron aproximadamente 5 x
10^{5} fagos de cada biblioteca. La hibridación se realizó
durante la noche en tampón que contenía 3X SSC, 0,1% sarcosil, 20
mM fosfato sódico, pH 6,8, 10X de solución Denhardt y 50 \mug/ml
de ADN de esperma de salmón a 65°C. Los filtros se lavaron a 65°C
en tampón que contenía 2X SSC y 0,1% SDS antes de la
autoradiografia.
Se hibridaron nueve clones de la biblioteca de
cADN de cerebro fetal y dos de la biblioteca de cADN de corazón
para obtener la sonda WO4835. La secuenciación y cartografía
parcial condujo a la selección de un clon de la biblioteca de
cerebro fetal designados FB66a para su ulterior caracterización.
Un segundo cribaje de aproximadamente 7,5 x
10^{5} fagos de la biblioteca cADN de cerebro fetal en
condiciones utilizadas en el primer reconocimiento utilizando el
fragmento 1,3 kb EcoRI/HindIII de la parte 5' de WO4835 dio como
resultado 19 clones de cADN adicionales. Seis de estos cADNs
también hibridaron obteniéndose un fragmento HindIII/Kpnl de WO4835
que incluye una región nucleótida 256 en el extremo 5' de WO4835.
La secuenciación y cartografía parcial de cinco de los clones
condujo a la selección de un segundo clon designado
FB85c-2 para su ulterior análisis.
La secuencia ADN de FB66a se determinó para ambas
cadenas utilizando iniciadores oligonucleótidos de ADN indicados
más abajo en SEQ ID NO: 9 a 31 y un secuenciador Perkin Elmer
Applied Biosystems División 373A ADN según el protocolo sugerido
por el fabricante. La cantidad de producto PCR utilizada como
plantilla se utilizó sobre la base del tamaño del producto PCR y se
secuenció utilizando un ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit con ApliTaq ADN polimerasa, FS (Perkin Elmer
Foster City, CA) y PCR asimétrico. El producto de reacción se
purificó sobre una columna giratoria (Advanced Genetic Technologies
Corp. Gaithersburg, MD) y se secó. Se añadió tampón de carga a cada
muestra purificada y la mezcla se calentó a 90°C durante dos
minutos. La solución se puso en hielo hasta cargar en un gel 4%
poliacrilamida. Se recogieron automáticamente los datos una vez que
se inició el programa Data Collection y se analizaron
automáticamente y fueron leídos por el Programa de Análisis de
Secuencia. Toda la operación de edición se realizó manualmente y
las secuencias resultantes se analizaron cuando se determinó la
secuencia de consenso.
El cADN FB66a indicado en la SEQ ID NO: 3 tiene
4389 nucleótidos de longitud y del nucleótido 3 al nucleótido 2411
codifica una proteína de 803 aminoácidos con un peso molecular
previsto de aproximadamente 90.775 Da. La secuencia de aminoácidos
deducida para FB66a se indica en SEQ ID NO: 4. La primera metionina
está codificada en nucleótido 45; la ausencia de un codón de
terminación corriente arriba en el marco de lectura hace que
existan dudas acerca de si este residuo es una metionina interna o
el comienzo del marco de lectura abierto.
La secuencia de FB85c-2 (SEQ ID
NO: 5) se determinó de forma similar utilizando iniciadores
M13Rev.1, W48A2, W48A9, W48A4, W48SI, W48A1, W48S6, W48A5, W48A6,
W48S2, W48S3, W48S5, W48S5, W48S7, W48A8, y M13. Se observó que
FB85c-2 incluida dos inserciones ADN distintas;
únicamente una de ellas era homóloga a WO4835. La región homóloga a
WO4835 tenía una longitud de aproximadamente 2,8 kb. La secuencia
precisa en el extremo 5' de la inserción no se pudo determinar y
por lo tanto no se incluye en la secuencia nucleótido 2573 indicada
en SEQ ID NO: 5 unos cuantos centenares de bases de secuencia en lo
que puede ser una región no traducida 5'. El nucleótido 67 al
nucleótido 2406 codifica una proteína que tiene 779 aminoácidos,
proteína (SEQ ID NO: 6) que tiene un peso molecular previsto de
88353 Da. Un codón de terminación corriente arriba del marco de
lectura hace que se considere probable que la metionina codificada
en la posición nucleótido 67 sea la metionina de iniciación.
Las proteínas codificadas por FB66a y
FB85c-2 tienen diferentes secuencias amino
terminales que pueden ser debidas a cortado y empalmado
alternativo. Las secuencias de ADN divergen entre sí, 5' del
nucleótido 112 en el FB66a y nucleótido 104 en
FB85c-2. Por consiguiente, FB85c-2
tiene 13 aminoácidos en el término amino que no se encuentran en
la proteína FB66a. La proteína FB66a incluye 23 residuos terminales
amino únicos si la metionina de iniciación se codifica según lo
supuesto en el nucleótido 35; la proteína incluye más de 37
residuos terminales amino únicos si el marco de lectura abierta en
el clon FB66a es incompleto.
El análisis BLASTN en el que se compara una
secuencia de nucleótido de consulta con una base de secuencia de
datos de nucleótidos de la secuencia FB66a no reveló ninguna
identidad con secuencias en Genbank, base de datos NCBI STS, NCBI
GTSS o NCBI GSS. No obstante se identificaron dos secuencias
idénticas en la base de datos NCBI EST.
Una secuencia fue la WO4835 EST que se utilizó
para identificar el clon cADN. La segunda AA307865 (SEQ ID NO: 32)
derivada de una línea celular de cáncer de colon KM12C (HCC) mostró
identidad de secuencia con la región no traducida 3' de los clones
FB66a y FB85c-2. Durante la búsqueda en la que se
identificó AA307865, se identificaron ADNs EST adicionales
supuestamente codificadores de ratón putativo (EST AA386789, SEQ ID
NO: 38) y rata (EST H32734, SEQ ID NO: 33) homólogos a la proteínas
humanas codificadas por FB66a y FB85c-2. La
secuencia de ratón fue un 86% idéntica a las secuencias humana y la
secuencia de la rata lo fue en un 81%.
Las PDEs codificadas por clones
FB85c-2 y FB66a se designaron PDE8A1 y PDE8A2,
respectivamente. Ambas proteínas PDE8A que tienen identidad de
secuencia de aminoácido completa más allá del punto de divergencia
tratada anteriormente, son muy similares a PDE2A, PDE5A, PDE6A,
PDE6B y PDE6C humanos. Los cuadros 1 y 2 muestran el porcentaje de
identidad de aminoácido entre PDE8A y PDE2A, PDE5A y PDE6A. PDE8A1
y PDE8A2 comparten homología con otros PDEs sobre la región
catalítica (aminoácidos 492 a 748 en PDE8A1) y con el dominio de
fijación de cGMP putativo conservado en la región amino terminal del
PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B y PDE6C. El dominio potencial de
fijación de cGMP de PDE8A se extiende desde los aminoácidos 75 al
aminoácido 445 en el polipéptido PDE8A1. Dentro de los dominios de
fijación de cGMP de PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B y PDE6C hay dos
repeticiones internas designadas "a" y "b" y cada
repetición contiene una serie de aminoácidos conservados
[McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem.
268:22863-22873 (1993)]. En la región de repetición
correspondiente "b" de PDE8A todos los aminoácidos conservados
se encuentran en la región de repetición correspondiente "a";
únicamente algunos de los residuos conservados se detectaron. Un
residuo de aspartato, considerado esencial para la fijación de cGMP
por PDE5A bovino [McAllister-Lucas, et al.,
J. Biol. Chem. 270: 1-9 (1995)] no está presente en
la región de repetición "a" de PDE8A. Por consiguiente no
existe incertidumbre acerca de si esta región en PDE8A funciona par
fijar cGMP.
CUADRO
1
Identidad de PDE8A en toda la
proteína
| PDE | 2A | 5A | 6A | 8A | |
| 2A | 100 | 19 | 16 | 28 | |
| 5A | 100 | 23 | 28 | ||
| 6A | 100 | 21 | |||
| 8A | 100 |
\vskip1.000000\baselineskip
CUADRO
2
Identidad de PDE8A en el dominio
catalítico
| PDE | 2A | 5A | 6A | 8A | |
| 2A | 100 | 38 | 33 | 41 | |
| 5A | 100 | 42 | 46 | ||
| 6A | 100 | 37 | |||
| 8A | 100 |
Se generó un constructo de expresión para PDE8A
que incluía secuencias de ADN 3' desde el punto de divergencia de
PDE8A1 y PDE8A2 por el codón de terminación. La construcción de
expresión incluía ADN codificando un rótulo de epítopo de 8
aminoácidos. Se añadió el denominado "FLAG tag" que comprende
la secuencia de péptido indicada en SEQ ID NO: 34 al término amino
con el fin de poder identificar la proteína mediante técnicas de
transferencia Western utilizando un anticuerpo
anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, Rochester, NY) que
reconocía específicamente el péptido de SEQ ID NO: 34.
SEQ IN NO: 34
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys
Se añadieron también secuencias que codifican una
metionina de iniciación en el término amino de las proteínas.
Como primera etapa en la construcción se realizó
el plásmido de expresión, PCR utilizando ADN FB66a como plantilla
utilizando iniciadores indicados en SEQ ID NOs: 35 (más abajo) y
W48A2 (SEQ ID NO: 10, página 14) en una mezcla de reacción que
contenía 2 \mul de cada iniciador (cepa 100 \mug/ml), 2 \mul
10X PCR tampón II (Perkin Elmer), 2 \mul l0X cepa de cada
nucleótido (cepa 2 mM), 1,2 \mul MgCl_{2} (cepa 25 mM), 0,09
\mul 5 unidades/\mul taq polimerasa (Perkin Elmer), ADN FB66a y
agua para llevar la mezcla de reacción a 20 \mul. En el iniciador
5' (SEQ ID NO: 35) hay un sitio NcoI en negrita y en la región que
codifica el rótulo FLAG está subrayada.
| SEQ ID NO: 35 |
| CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG |
Se realizó PCR en un Perkin Elmer DNA Thermal
Cycler en las siguientes condiciones: 94°C durante 4 minutos
seguido de 30 ciclos de 94°C durante un minuto, 50°C durante un
minuto y 72°C durante dos minutos.
Se realizó la digestión del producto PCR
resultante con Ncol y Kpnl, gel purificado y subclonado en vector
Bluescript SKII previamente digerido con las mismas enzimas. El
vector Bluescript había sido modificado previamente para incluir un
fragmento promotor de alcohol de hidrogenasa 2 Sacl/Ncol (ADH2) que
se había quitado de un vector YepC-PADH2d [Price,
et al., Meth. Enzymol. 183:308-315 (1990)].
El plásmido resultante se designó W48pcr1.
Se aisló de cADN FB66a un fragmento de Kpnl y
SstI que contenía la parte 3' del marco de lectura abierto y se
insertó en W48perl previamente diferido con Kpnl y EcoRV. El
plásmido resultante se designó W485.1.
Se aisló de W49pcrl un fragmento de SacI/KpnI que
contenía el promotor ADH2 y la parte 5' del gen PDE8A. Se aisló de
W485.1 un fragmento de Kpnl/Sa/l que contenía la región 3' de
PDE8A. Los dos fragmentos se ligaron en el vector de expresión de
levadura YepC-PADH2d que había sido previamente
digerido con SacI y Sa/l. El plásmido resultante se designó
W48-2ADH2 y se depositó el 2 de octubre de 1997
según los términos del Tratado de Budapest en la American Type
Culture Collection (A.T.C.C.) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD
20852. Se dio a la cepa bacteriana que llevaba el plásmido
W48-ADH2 el número de acceso ATCC 98552. Las
secuencias de ADN generadas por PCR y las secuencias de ADN en los
enlaces PDE8/vector fueron determinadas para garantizar una
construcción adecuada de plásmido. Tras la confirmación de la
secuencia, el plásmido se transformó en una cepa de levadura
BJ2-54 que carecía de actividad endógena PDE
(ura3-52;trpl;leu2;cirº;gal2;pep4-3;
prbl-1122;prcl-402;\DeltaPDE1::URA3;HIS3;\DeltaPDE2::TRP1).
Las células anfitrionas se cultivaron durante la
noche en un medio SC-leu selectivo, que contenía 2%
de glucosa, diluido a 1-2 x 10^{5} células/ml y
seguidamente se cultivó hasta una densidad de 10^{7} células/ml en
el mismo medio. La presencia del plásmido de expresión pareció
aumentar el tiempo de duplicación del crecimiento celular dos a
tres veces incluso en condiciones no inductoras. Las células se
recogieron por centrifugación, se lavaron con un medio YEP que
contenía 3% de glicerol, se volvieron a suspender en YEP/3%
glicerol a una densidad de 10^{7} células/ml y se cultivaron
durante 24 horas antes de la colecta. Se congelaron las células
hasta su utilización.
Los nódulos celulares congelados (0,06 ml) se
descongelaron y volvieron a suspender en 0,2 ml de tampón de lisis
que contenía 100 mM MOPS, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2 \muM ZnSO_{2},
2 mM ditiotreitol y 10 \mug/ml de cada inhibidor de proteasa
pepstatina, leupeptina y aprotinina. Se añadieron aproximadamente
0,2 ml de perlas de cristal de 0,5 mm a las células que se
sometieron a lisis con 4 ciclos de 30 segundos de vórtice. El
lisato se aspiró y las perlas se lavaron dos veces con 0,3 ml de
tampón de lisis. El lisato se combinó con los lavados para generar
el extracto de levadura. En algunos experimentos, el lisato se
fraccionó por centrifugación a 105.000 x g durante 30 minutos.
Se realizó el análisis Western en el extracto de
levadura que contenía la proteína recombinante, en la forma
indicada a continuación: las proteínas se separaron primero en
SDS-PAGE y se transfirieron a
Immobilon-P (Millipore) utilizando métodos
standard. Las transferencias proteinicas se bloquearon utilizando
5% de leche seca no grasa en 20 mM Tris-HCl, pH
7,4, 150 mM, NaCl, 0,05% Tween-20 (tampón TBST más
leche) durante una hora a temperatura ambiente. Las transferencias
(blots) se incubaron con anticuerpo anti-FLAG M2
(tratado anteriormente) a una concentración de 1 \mug/ml en
tampón TBST más leche durante una hora, durante lo cual las
transferencias se lavaron cuatro veces con tampón TBST. Se incubaron
entonces las transferencias durante una hora con anticuerpo IgG
anti-ratón, cabra purificado de afinidad de calidad
de transferencia conjugado con preoxidasa de rábano picante (HRP)
(BioRad). El IgG de cabra se diluyó previamente a 1:10.000 en
tampón TBST más leche. Los blots se lavaron cuatro veces con TBST y
se trataron siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, con
el Renaissance® system (New England Nuclear Life Science Products)
para quimioluminiscencia potenciada antes de autoradiografía. La
mayoría de la proteína detectada por el anticuerpo tenía el tamaño
esperado para proteína
recombinante.
recombinante.
Se analizó la actividad de PDE por detección de
fosfato ^{32}P liberado de ^{32}P-cAMP o
^{32}P-cGMP tal como se describió anteriormente
[Loughney et al., J. Biol. Chem. 271:796-806
(1996)]. El extracto de levadura se diluyó en 0,5X de tampón de
lisis que contenía también 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se
analizaron 20 \mul del extracto de levadura, o extracto de
levadura diluido en un volumen de reacción de 100 \mul que
comprendía además 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM,
MgCl_{2} 1 \muM Zn SO_{2}, y 0,1 mg/ml de albúmina de suero
bovino. Se analizó la concentración de proteína utilizando el
método de Bradford.
Se observó que la PDE8A hidrolizaba tanto cAMP
como cGMP. En lisatos no fraccionados, la actividad específica de
cAMP era de 3,9 nmol/min/mg y para cGMP era de 7,6 nmol/min/mg. El
fraccionamiento reveló que el 20-40% de la actividad
total estaba asociada con la fracción sobrenadante de alta
velocidad. El análisis cinético de la actividad con cAMP como
substrato sugirió la presencia de formas altas y bajas de K_{m}
de la enzima en una proporción de actividad 1:1. Los valores
K_{m} estimados fueron 0,2 \muM y 350 \muM. El análisis del
gránulo de alta velocidad sugirió que las mismas especies estaban
presentes aunque en una proporción de actividad K_{m} alto:
K_{m} bajo de 1:4. El análisis cinético con cGMP como sustrato
sugirió también la presencia de formas altas y bajas de la enzima.
En estos análisis, se estimó que los valores de K_{m} eran 3
\muM y 300 \muM.
Los valores IC_{50} para la inhibición de la
actividad de PDE8A se determinaron utilizando un conjunto de
inhibidores PDE isozima-selectivos y el inhibidor
no selectivo isometil butil xantina (IBMX). Como estos ensayos se
realizaron a una concentración de cAMP de 60 nM, los valores de
IC_{50} reflejan la inhibición de la forma de K_{m} baja
solamente. Los resultados se indican en el cuadro 3, donde los
valores se dan en unidades micromolares.
CUADRO
3
Inhibición de PDE8 con
inhibidores de PDE
isozima-específicos
| Compuesto | Familia PDE | IC_{50} para familia | IC_{50} para | Diferencia pliegue |
| Blanco | blanco | PDE8 | (Fold) | |
| IC224 | PDE1 | 0,08-0,008 | 2,7 | 38-338 |
| EHNA | PDE2 | 2 | 65 | 31 |
| Cilostamida | PDE3 | 0,02 | 12 | 750 |
| IC197 | PDE4 | 0,02 | 14 | 714 |
| DMPPO | PDE5 | 0,016 | 1,1 | 66 |
| IBMX | No select. | 1-40 | 4,6 | 0,12-4,6 |
Los valores de IC_{50} para cada uno de los
inhibidores selectivos fueron por lo menos 30 veces superiores
frente a PDE8 que frente a sus isozimas blancos lo cual sugiere que
el perfil inhibitorio de PDE8 es distinto del perfil de PDEs
1-5. La hidrólisis de cAMP y cGMP distingue
claramente la actividad enzimática de PDE8A de la de PDE6 y PDE7A.
El IC_{50} del inhibidor no selectivo IBMX para PDE8 se
encontraba dentro de los márgenes observados para PDEs humano
conocido, lo cual sugería que el sitio catalítico de PDE8 se parece
a los de otros PDEs humanos y mamíferos y difiere de formas
eucarióticas inferiores insensibles a IBMX.
El análisis Northern de la expresión de PDE8A se
realizó utilizando un blot de tejido múltiple humano (Clontech,
Palo Alto, CA). La sonda de base 327 se extendía del nucleótido
1767 al nucleótido 2293 en SEQ ID NO: 3. Las condiciones de
preparación e hibridación de ribosonda fueron como las descritas
anteriormente [Loughney, et al., supra].
Los resultados mostraron un mARN 9,5 kb en todos
lo tejidos examinados pero la intensidad de banda variaba. La
señal era más fuerte en el corazón, el cerebro y el riñón. La señal
era más débil en el hígado, la placenta, el páncreas y los músculos
del esqueleto. La señal era muy débil en el pulmón.
Se aislaron cromosomas artificiales de levadura
(YACs) que contenían el gen PDE8A humano de un grupo de YACs
humanos comprados en Research Genetics y se cribaron por PCR de la
siguiente forma.
Los super-grupos YAC se cribaron
con dos pares encajados de iniciadores. En la primera reacción de
cribaje, el iniciador de sentido W48S8 (SEQ ID NO: 36) se emparejó
con el iniciador antisentido W48A10 (SEQ ID NO: 37). Se realizó el
PCR con 10 mM Tris-HCl, pH 8, 3, 50 mM KCl, 2 mM
MgSO_{4}, 0,2 mM de cada dNTP, 10 \mug/ml de cada iniciador,
0,5 unidades de polimerasa taq (Perkin Elmer) y 1,5 \mul de ADN
del grupo YAC como plantilla. Se realizaron reacciones durante 30
ciclos; cada ciclo era de un minuto a 94°C, dos minutos a 60°C, y
cuatro minutos a 72°C. Después de la primera tanda de
amplificación, los productos de reacción se volvieron a amplificar
con el par interno de iniciadores W48S12 (SEQ ID NO: 36) y W48S12
(SEQ ID NO: 37).
W48S12
\hskip0.5cmCCAGAAGGGGTACTTTTCC
\hskip0.5cmSEQ ID NO: 36
W48Al2
\hskip0.5cmCATTGTCCTGAGGCTGTGG
\hskip0.5cmSEQ ID NO: 37
Las reacciones se realizaron en la forma descrita
anteriormente con la diferencia de que la plantilla era 1 \mul de
una dilución 1:10 (en agua) de la reacción de la primera tanda. Se
identificaron super-grupos que daban el producto PCR
de tamaño correcto y se cribaron los sub-grupos
correspondientes con los mismos pares encajados de iniciadores en
las mismas condiciones para identificar direcciones únicas para
YACS que contuvieran PDE8A.
Se compraron en Research Genetics cepas de
levadura que albergaban los YACs relevantes. Con el objeto de
verificar la presencia del gen PDE8A en los diversos YACs, se
preparó ADN de cada cepa y se analizó por PCR con iniciadores W48S8
y W48A10. Se preparó ADN de cada cepa según un método descrito
anteriormente [Hoffman and Winston, Gene 57:267-272
(1987)] que se modificó del siguiente modo. Se cultivaron cepas
durante la noche a 30°C en medio YEP que contenía glucosa. Se
granularon por centrifugación 10 ml de cultivo y se volvieron a
suspender en 200 \mul de tampón acuoso que contenía 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM Na_{2}EDTA,
1% SDS y 2% Triton-X100. Las células se lisaron
sometiéndolas a vórtice en presencia de 200 \mul de
fenol/-cloroformo (mezcla 1:1) y 100 \mul de perlas de cristal
(425-600 \mum). Tras la lisis, se añadieron 200
\mul del tampón TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM Na_{2}EDTA) y la
muestra se centrifugó para separar las fases. La fase orgánica se
extrajo nuevamente con 200 \mul de tampón acuoso. La fase acuosa
agrupada se trató con 100 unidades de RNase pancreático bovino
(Boehringer Mannheim) durante una hora a 37°C y se extrajo la
muestra con fenol/cloroformo, se volvió a extraer con cloroformo y
se precipitó en etanol según los métodos establecidos. El nódulo
resultante se volvió a suspender en 50 \mul de tampón TE. Se
realizó el PCR en la forma descrita anteriormente con la diferencia
que el volumen de reacción era de 25 \mul y la plantilla consistía
en 1 \mul del preparado de ADN de levadura relevante.
Se identificaron tres YACs humanos que contenían
el gen PDE8 con direcciones 805B6, 919H10 y 920A3 (según la
designación CEPH). Según la información en la base de datos de
Center for Genome Research (Whitehead), los tres YACs se solapan
entre si y forman parte de un contig de ligado único (WC6.16) en
cromosoma humano 6. Se colocaron sitios rotulados de dos secuencias
dentro de este contig (D6S305 y D6S411) en el mapa genético de
cromosomas 6 en una posición 167 cM del extremo de 6p en el Center
for Genome Research; se cartografió D6S305 en una posición 173 cM
del extremo de 6p en funcionamiento en
CEPH-Genethon. Se cartografiaron otros tres YACs
dentro del contig WC6.16 (932F1, 956B1 y 947D5) por fluorescencia
hibridación in situ en CEPH-Genethon. Las
señales de hibridación caen entre 0,94 y 0,99 unidades de longitud
fraccional del extremo de 6p. Según el mapa resumen integrado CEPH
[Chumakov et al., Nature 377 (Supp): 175-297
(1995)], esta región corresponde a la región citogenética
6q26-27.
Como defectos heredables que se han asociado con
esta región de genoma humano se pueden citar la degeneración del
cono retiniano (base de datos OMIM), diabetes mellitus dependiente
de insulina [Davies et al., Nature
371:130-136 (1994); Luo et al., Am. J. Hum.
Genet. 57:911-919 (1995)] y aparición juvenil de la
enfermedad de Parkinson [Matsumine et al., Am. J. Hum.
Genet. 60:588-596 (1997)]. Además se observa
frecuentemente pérdida de heterocigosidad (LOH) en esta región en
toda una serie de células cancerosas diferentes, inclusive el
linfoma de Burkitt [Parsa et al., Genes Chromosomes &
Cancer 9: 13-18 (1994)], astrocitoma [Liang et
al. Neurology 44:533-536 (1994)], carcinoma
gástrico [Queimado et al. Genes Chromosomes & Cancer
14:28-34 (1995)] adenoma paratiroide [Tahara et
al. Cancer Res, 56: 599-605 (1996)] y carcinoma
de ovario [Cooke et al. Genes Chromosomes & Cancer 15:
223-233 (1996)]; Saito et al. Cancer Res.
56:5586-5589 (1996)]. Se ha sugerido que LOH indica
la presencia de un gen supresor de tumor en la región afectada
[Weinberg, Science 254:1138-1146 (1996)]. Debido a
su expresión muy extendida es posible que la mutación del gen PDE8
esté involucrada en todas o el algunas de estas anomalías
genéticas.
genéticas.
Se adoptaron dos métodos para verificar si PDE8A1
y PDE8A2 representan empalmes 5'. En primer lugar el análisis PCR
reveló que en el ADN genómico no había secuencias PDE8A1 ni PDE8A2
adyacentes a la secuencia ADN de la región común. Las secuencias
genómicas corriente arriba de la región común estaban presentes en
un tercer cADN PDE8A, FB74b, que se identificó en el grupo de 6
clones originales que hibridaron para formar el extremo 5' de la
sonda WO4835 descrita en el ejemplo 2. La secuencia parcial (755
nucleótidos en el extremo 3') del clon FB74b se indica en SEQ ID
NO: 39. El cADN de FB74b divergía de FB85c-2 y FB66a
en la misma posición que FB85c-2 y FB66a divergían
entre si, pero el clon FB74b no mantenía el marco de lectura
abierto. En la secuencia FB74b 5' hasta el punto de divergencia de
secuencia respecto de los clones FB66a y FB85c-2, un
codón de terminación dentro del marco de lectura estaba más cerca
del punto de divergencia que un codón de metionina iniciador lo
cual indicaba que si FB74b representaba un cADN y no un precursor
cortado y empalmado la metionina de iniciación estaría situada
necesariamente en la secuencia común tanto a FB66a como a
FB85c-2.
El análisis PCR se realizó utilizando un
iniciador designado FB74bS1 (SEQ ID NO: 40) dentro de las
secuencias corriente arriba FB74b y un segundo iniciador designado
W48A9 (SEQ ID NO: 11 dentro de las secuencias común a FB74b, FB66a
y FB85c-2.
FB74bS1
\hskip0.5cmGTTAGATGAGAGGTTGCTGG
\hskip0.5cmSEQ ID NO: 40
Utilizando 1 \mug de ADN genómico humano como
plantilla, se amplificó una banda que tenía el mismo tamaño que la
amplificada utilizando FB74b como plantilla, lo cual indicaba que
las secuencias únicas de FB74b y la región común eran adyacentes en
el ADN genómico. Por consiguiente, la secuencia FB74b puede
representar un intron no cortado ni empalmado o puede representar
un tercer empalme que codificaría una proteína con una metionina de
iniciación dentro de la región común. En cualquier caso, las
secuencias de FB85c-2 y FB66a se generan
supuestamente por cortado y empalme.
En segundo lugar, se realizó análisis 5' RACE
utilizando ARN aislado de cortex humano, cerebellum,
corazón, hígado y tejidos del pulmón. Se aisló ARN de tejidos de
fragmento congelados según lo descrito [Loughney et al, J.
Biol. Chem. 271:796-806 (1996)] y seleccionó poli A'
mARN utilizando el sistema de aislamiento Fast Track^{TM} mARN
(In-vitrogen). Se preparó cADN de doble
cadena utilizando 5 \mug de mARN poli A^{+} y un kit de
síntesis de cADN (Boehringer Mannheim). El cADN se ligó a un
ligante formado hibridando oligonucleótidos L15 (SEQ ID NO: 41) y
L30 (SEQ ID NO: 42).
| L15 | GTATGCTAATCTCAG | SEQ ID NO: 41 |
| L30 | CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATAC | SEQ ID NO: 42 |
Para el 5' RACE, se amplificó por PCR el cADN
ligado al ligante utilizando oligonucleótidos L18 (SEQ ID NO: 43)
y W48A13 (SEQ ID NO: 44).
| L18 | CAACTCGAATTCCTTGAC | SEQ ID NO: 43 |
| W48A13 | GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC | SEQ ID NO: 44 |
La reacción contenía 10 mM
Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2} 0,2
mM de cada dNTP, 10 \mug/ml de cada iniciador y 1 \mul de cADN
ligado al ligante en un volumen de reacción de 25 \mul. Tras la
etapa de calefacción a 94°C, se inició el PCR por medio de adición
de 0,1 unidad de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim) y se continuó
con 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 60°C y 4 minutos a
72°C.
Los productos de la reacción PCR se diluyeron
diez veces con agua y se utilizaron como plantilla en una segunda
reacción PCR con oligonucleótidos L21 (SEQ ID NO: 45) y W48A9S (SEQ
ID NO: 46) en las mismas condiciones descritas anteriormente.
| L21 | CAACTCGAATTCCTTGACAGA | SEQ ID NO: 45 |
| W48A9S | GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACAC | SEQ ID NO: 46 |
Se separó con EcoRI y Sa/l ADN amplificado en la
segunda reacción PCR y se ligó en el vector Bluescript (Stratagene)
previamente digerido con las mismas enzimas.
Inicialmente, se examinaron secuencias ADN en 5
plásmidos de cada fuente de tejido y ambas secuencias PDE8A1 y
PDE8A2 5' se encontraron entre los cADNs aislados. Se obtuvieron
también secuencias FB74b 5' como si fueran varias secuencias, cada
una aislada solo una vez, lo cual podría representar sin embargo
empalmes adicionales o secuencias ADN no relacionadas.
Debido a que ninguno de los cADNs similares a
PDE8A2 se extendieron más allá de 5' de lo que había hecho el cADN
original FB66a, se analizaron clones adicionales PDE8A2 RACE en un
intento de extender la secuencia final 5'. Se identificaron y
secuenciaron 5 cADNs PDE8A2 de pulmón pero ninguno extendió la
secuencia PDE8A2.
Se repitió una segunda tanda de RACE PCR
utilizando el iniciador L21 (SEQ ID NO: 45) con el iniciador
W48A14S (SEQ ID NO: 47).
W48A14S
\hskip0.5cmGATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG
\hskip0.5cmSEQ ID NO:47
Los clones resultantes se cribaron por PCR y se
eligieron los más largos para a secuenciación. Únicamente dos
clones eran más largos que el cADN original de FB66a y extendieron
la secuencia 5' 8 y 12 bp, respectivamente, en la región no
traducida. Las secuencias FB66a se extendieron con
5'-CCCAGGGCGCCA. El extremo 5' de FB66a es muy rico
en GC lo cual puede contribuir a la dificultad de aislar cADNs de
longitud normal.
El PDE8A recombinante descrito en el ejemplo 5
existía, tanto en formas de afinidad bajas como alta en el extracto
de levadura. Debido a la posibilidad de que la forma de afinidad
baja representada parcialmente enzima inactiva, se realizó la
expresión de PDE8A en células sf9 y COS en un intento de obtener
una enzima homogénea o determinar si las dos formas cinéticas se
expresan siempre partir del cADN.
El constructo de expresión PDE8 sf9 se generó con
un fragmento 3' KpnI-SalI a partir del plásmido
W485.1 (descrito en el ejemplo 5) y un fragmento 5' generado por
PCR en la forma indicada a continuación. Los iniciadores
FLAG-1 (SEQ ID NO: 48) y W48A4 (SEQ ID NO: 12) se
utilizaron en PCR con PDE8 COS-1 ADN (descrito más
abajo) como plantilla.
FLAG-1
\hskip0.5cmGATCGGATCCACCATGGACTACAAGG
\hskip0.5cmSEQ ID NO: 48
Se realizó el PCR en la forma descrita en el
ejemplo 8 con la diferencia de que se utilizó 2 mM MgSO_{4} n
lugar de MgCl_{2} y también se utilizó 0,02 U Taq polimerasa.
Tras un período inicial de cuatro minutos de incubación a 94°C, se
realizaron 30 ciclos con un minuto a 94°C, un minuto a 50°C y dos
minutos a 72°C. El producto de amplificación 5' se segmentó con
BamHI y Knpl, se purificó en gel y se ligó con el fragmento 3' en
el vector pFASTBAC (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) previamente
digerido con BamHI y SalI. El plásmido resultante se designó
pFBRPDE8. Se verificaron por secuenciación todos los productos de
amplificación PCR y todas las nuevas uniones.
Se produjeron estirpes virales recombinantes
utilizando el sistema FastBac (Gibco BRL) siguiendo el protocolo
sugerido por el fabricante se realizó en la forma indicada a
continuación la expresión proteinica. Se cultivaron células Sf9 a
27°C en medio CCM3 (Hyclone, Logan, UT) que contenía 50 \mug/ml
penicilina y 50 \mug/ml de sulfato de estreptomicina (Gibco). Las
células de crecimiento exponencial se infectaron con una
multiplicidad de aproximadamente 2 virus por célula y se incubaron
durante 48 horas. Las células se recogieron por centrifugación, se
lavaron con CMF-PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM
KH_{2}PO_{4}, 137 mM NaCl, 8,1 mM, Na_{2}PO_{4}), y los
nódulos se congelaron y almacenaron a -80°C hasta su utilización.
Se lisaron células en tampón (50 mM MOPS pH 7,2, 10 \muM sulfato
de zinc, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina, 10 \mug/ml de pepstatina,
leupeptina y aprotinina y 20 \mug/ml de inhibidores de calpain I
y calpain II) sometiendo a vórtice en presencia de un volumen igual
de perlas de cristal, (lavado en ácido, 0,5 mm, Sigma) y la
actividad PDE se determinó en la forma descrita en el ejemplo
5.
En el extracto sf9, se detectó actividad de PDE
45,4 nmol/min/mg para hidrólisis cAMP (100 \muM sustrato) y 69,4
nmol/min/mg para hidrólisis cGMP (100 \muM sustrato). La
actividad de fondo de PDE era despreciable. La actividad de PDE8A
resultó ser una mezcla de formas de afinidad alta baja según se
detectó en extractos de levadura, tal como se describe en el
ejemplo 5.
Para la expresión en células COS, se generó PDE8
COS-1 combinando un fragmento 3' KpnI/SalI de
plásmido W845.1 (ejemplo 5) y un fragmento de Nhel/kpnI obtenido
por fragmentación de un producto de amplificación PCR de una
reacción que comprendía cADN FB66a como plantilla con iniciadores
W48A2 (SEQ ID NO: 10) Y ATG (SEQ ID NO:35). Las condiciones para el
PCR incluían una incubación inicial durante 4 minutos a 94°C,
seguido de 30 ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 50°C y dos
minutos a 72°C en un ciclador termal ADN Perkin Elmer Cetus. El
fragmento 5' resultante y el fragmento 3' descritos anteriormente
se ligaron en el vector pClneo (Promega, Madison, WI) que había
sido previamente digerido con NheI y SalI.
Se lavaron células COS semiconfluentes cultivadas
en recipientes de 15 cm una vez con 25 ml DMEM (Medio Eagle
Modificado de Dulbecco, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml sulfato
de estreptomicina, Gibco), después de lo cual se añadieron 14 ml de
dextrano/cloroquina DMEM/DEAE por placa. El dextrano/cloroquina
DMEM/DEAE comprende 75 ml DMEM y 30 \mul de 0,25 M cloroquina en
PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH_{2}PO_{4}, 137 mM NaCl, 8,1 mM,
Na_{2}PO_{4}, 0,9 mM CaCl_{2} 0,5 Mm MgCl_{2}) junto con
0,75 ml 50 \mug/ml DEAE dextrano (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se
añadieron 20 \mug de plásmido ADN en 135 \mul de tampón
Tris/EDTA (TE) por placa y las placas se incubaron durante dos
horas a 37°C en 5% CO_{2}. Se quitó el medio y se añadieron 12 ml
de 10% de DMSO/PBS durante un minuto y se quitaron. Las células se
lavaron una vez con 25 ml DMEM, después de lo cual se añadieron
otros 25 ml de DMEM que contenían 10% de suero de ternera fetal
(Hyclone, Logan, UT) y las células se incubaron durante la noche a
37°C en 5% CO_{2}. Se quitó el medio y se lavó el monocapa con 25
ml de CMF-PBS. Se añadieron seis ml de una solución
que contenía 0,05% tripsina/0,5 mM EDTA (Gibco) y las células se
incubaron 5 minutos a 37°C. Se quitaron las células de las placas
por trituración y se transfirieron a tubos centrífugos cónicos. Se
lavaron las placas con 6 ml de DMEM completo para recoger las
posibles células restantes y se añadió solución de lavado a los
tubos centrífugos. Las células se nodularon por centrifugación
durante cinco minutos a aproximadamente 340 x g, se volvieron a
suspender en 5 ml de DMEM completo se llevaron a un recipiente de
cultivo de tejido de 15 cm que contenía 20 ml de DMEM completo y se
incubaron durante la noche en 50% CO_{2}.
El monocapa se lavó dos veces con
CMF-PBS, se incubó durante 5 minutos a 37°C en
verseno (0,5 mM Na_{2}EDTA 2H_{2}O, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl
8,1 mM Na_{2}HPO_{4}, 1,1, mM glucosa, pH 7,4), y se recolectó
en la forma descrita anteriormente. Las células noduladas se
lavaron con CMF-PBS, se congelaron en hielo seco y
se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Las células se lisaron
en tampón (50 mM MOPS, pH 7,2, 10 \muM sulfato de zinc, 1 mM DTT,
2 mM benzamidina, 10 \mug/ml de pepstatina, leupeptina y
aprotinina y 20 \mug/ml de inhibidores de calpain I y calpain II)
haciéndolas pasar por una célula de presión francesa (SLM
Instruments) a 20.000 psi y de determinó la actividad PDE en la
forma descrita en el ejemplo 5.
La expresión de PDE8A era baja en el extracto
celular COS y no se pudo caracterizar con precisión debido al
elevado nivel de la actividad de fondo de PDEs endógenas. Con el
fin de caracterizar más completamente el producto de expresión
celular, se purificó la enzima que comprendía un rótulo FLAG en el
término amino (ejemplo 5) a partir de 100.000 x g de sobrenadante
de extracto celular utilizando una columna de afinidad
anti-FLAG M2 (Sigma) siguiendo el protocolo
sugerido por el fabricante. Con el objeto de caracterizar con más
precisión la actividad PDE8A de levadura se realiza la expresión de
una proteína recombinante truncada en el término amino pero que
mantiene la región catalítica, en la forma descrita en el ejemplo 5
en un intento de obtener una proteína homogénea.
Se produjo una proteína de fusión GST en E.
coli para obtener un antígeno para la generación de anticuerpos
monoclonales en PDE8A. Se inserto un fragmento de EcoRl de FB70a
(un cADN de PDE8A que comprende nucleótidos 182-1330
de FB85c-2 y que era uno de los nuevo clonos
identificados originalmente que se hibridaron para obtener la sonda
W4835 de longitud normal descrita en el ejemplo 2), en el sitio
EcoRl de pGEX5X1 (Pharmacia) y el constructor resultante se
transformó en la cepa E. coli XL1 Blue. A partir de este
constructo y trans inducción con IPTG se produjo una proteína de
fusión GST-PDE8A que comprendía 382 aminoácidos de
PDE8A. La proteína de fusión se aisló utilizando
SDS-PAGE se extrajo del gel la banda de tamaño
adecuada tras teñir con 0,4 M KCl frío y la proteína se obtuvo a
partir de la acrilamida por electroelución. El producto de elusión
se dializó frente a PBS y se concentró utilizando columnas
Centriprep 10 y Centricon (Amicon, Beverly MA) antes de inyectarlo
en ratones.
El día 0, se pre-sangraron cuatro
ratones Balb/c y se inyectaron subcutáneamente con un conjunto de
antígenos que incluía 30 \mug/ratón de proteína de fusión
GST-PDE8 en adyuvante de Freund completo en 200
\mul de volumen total. Las mismas inyecciones se repitieron las
semanas 3 y 9 en adyuvante de Freund incompleto. Diez días después
de la última inmunización, se obtuvieron y cribaron sangrías de
prueba por captura antígeno ELISA y análisis Western.
En el ELISA, se recubrieron cuatro placas Immulon
(Dynex, Cambridge, Massachusetts) a 4°C con 50 \mul/pocillo de
una solución que contenía 2 \mug/ml GST-PDE8 en 50
mM de tampón de carbonato pH 9,6). Las placas se bloquearon con
gelatina de piel de pescado 0,5% (Sigma) durante 30 minutos y se
añadieron 50 \mul de suero diluido en PBS con 0,5% Tween 20
(PBST). Las diluciones de suero oscilaban entre 1:100 y 1:102.400 y
se obtuvieron con una serie de diluciones de duplicación. Tras la
incubación a 37°C durante 30 minutos y el lavado tres veces con PBST
se añadieron 50 \mul de anticuerpo IgG(fc) anti ratón
cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson) (diluido
1:10.000 en PBST). Las placas se incubaron en la forma indicada
anteriormente y se lavaron cuatro veces con PBST. Se detecto el
anticuerpo con adición de tetrametil bencidina (Sigma Chemical, St.
Louis, Missouri) y la reacción de color se detuvo a los cinco
minutos con la adición de 50 \mul de 15 H_{2}SO_{4}. Se medió
la absorbancia a 450 nM en un lector de placa.
Para el análisis Western, se vertieron geles
SDS-PAGE con aproximadamente 10 \mug de extracto
PDE8 de levadura y aproximadamente 200 ng de
GST-PDE8 purificado con gel y las proteínas se
transfirieron a Immobilon-PVDF. Se realizó un
protocolo de transferencia Western de quimioluminiscencia
potenciada standard (ECL) usando como anticuerpo secundario
peroxidasa de rábano picante IgG anti ratón cabra BioRad.
En la preparación de hibridomas se fundieron
esplenocitos de ratón que dieron un resultado positivo en los
protocolos de transferencia Western y/o ELISA, en células
NS-1 en una proporción de 5:1 utilizando métodos
standard y polietilen glicol 1500 (Boehringer Mannheim) (Harlow and
Lane, Anticuerpos Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988). Las células fundidas se volvieron a suspender en
200 ml RPMI que contenía 15% FBS 100 nM hipoxantina sódica, 0,4 mM
aminopterina, 16 mM timidina (HAT) (Gibco) 25 unidades/ml
IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 106 timocitos
murino/ml y se prepararon en 10 placas de cultivo de tejido de
fondo plano de 96 pocillos (Corning, Reino Unido) a 200
\mul/pocillo. Las células fueron alimentadas los días 2, 4 y 6
tras la fusión aspirando aproximadamente 100 \mul de cada pocillo
con una aguja 18 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul/pocillo
de medio de chapado descrito anteriormente con la diferencia de que
contenía 10 unidades/ml IL-6 y que carecía de
timocitos. Los días 9 a 12, se cribaron los sobrenadantes de los
pocillos de fusión por captura antígena ELISA utilizando GST y
GST-PDE8 y por análisis Western ECL en la forma
descrita anteriormente.
Se obtuvo una señal positiva del tamaño esperado
en las dos bandas de la transferencia Western utilizando sangre de
ratón y se obtuvo en la fusión ulterior un anticuerpo monoclonal
con reactividad muy débil a la proteína recombinante de levadura.
Se repitió todo el procedimiento utilizando 50 \mug antígeno/ratón
para obtener anticuerpos monoclonales más fuertemente
inmunoreactivos.
Se examinó la expresión de PDE8A en secciones de
tejido por hibridación in situ en forma descrita
seguidamente.
Se clonó en un vector Bluescript (Stratagene, La
Jolla, CA) un fragmento de enzima de restricción Xhol/EcoRI del
cADN FB70a (correspondiente a nucleótidos 571 a 1226 de SEQ ID NO:
1) para generar un plásmido de expresión designado PDE8XR2A. El
plásmido se fragmentó con Xhol y se transcribió (véase más abajo)
con T3 polimerasa para generar una sonda antisentido. Se generó una
sonda antisentido fragmentando PDE8XR2A con EcoRI y transcribiendo
con T7 polimerasa. Las plantillas PDE8A se transcribieron
utilizando un kit de transcripción de ARN (Stratagene, La Jolla,
CA) en una reacción que contenía 5 \mul de %X de tampón de
transcripción (Stratagene) 30 mM DTT (Stratagene), 0,8 mM de ATP,
CTP, GTP (10 mM (Stratagene) 40 U RNase Bloque II (Stratagene),
12,5 U T3 o T7 polimerasa (Stratagene) y 300 ng de plantilla de
plásmido linealizado, 50 \muCi ^{35}S-UTP
(superior a 1000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). La
mezcla se incubó a 37°C durante una hora tras lo cual se eliminó el
ADN de plantilla añadiendo 1 \mul de DNase I libre de RNase
(Stratagene) e incubando durante 15 min. a 37°C. La sonda se
hidrolizó añadiendo 4 \mul 1M NaHCO_{3} y 6 \mul 1 M
Na_{2}CO_{3} durante 22 minutos a 60°C y la mezcla de reacción
se neutralizó añadiendo 25 \mul de una solución que contenía 100
\mul 3 M acetato sódico, 5 \mul ácido acético (VWR, So.
Plainfield, NJ) y 395 \mul dH_{2}O. Se preparó una columna
quick Spin G50 ARN (5'-3' Inc., Boulder, CO)
siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. La sonda se
colocó en el centro de la columna y la columna se centrífugo
durante 4 minutos a 1.000 rpm en una centrifugadora de mesa. Se
mezcló lo que circulaba por la columna con 50 \mul dH_{2}O, 2
\mul de una solución 10 mg/ml tARN, 10 \mul acetato sódico 3 M
y 200 \mul 100% etanol VWR) y la mezcla resultante se incubó
durante la noche a -20°C. La solución de la sonda se microfugó
durante 15 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y el nódulo se
volvió a suspender en 40 \mul 1X TBE que contenía 1 \mul de 0,1
M DTT. Se almacenó la sonda a -70°C hasta realizar el ensayo de
hibridación in situ.
Se cortaron a 6 \mum unos tejidos (National
Disease Research Interchange, Philadelphia, PA y Cooperative Human
Tissue Network, Philadelphia, PA) y se colocaron sobre portaobjetos
Superfrots Plus (VWR). Las secciones se fijaron durante 20 minutos
a 4°C en 4% para formaldehído (Sigma, St. Louis, MO). Los
portaobjetos de enjuagaron en 3 cambios de 1X
CMF-PBS, se deshidrataron con tres lavados sucesivos
con 70% etanol, 95% etanol y 100% etanol y se secaron durante 30
minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se colocaron en
70% formamida (J.T. Baker) en 2X SSC durante dos minutos a 70°C, se
enjuagaron en 2X SSC a 4°C, se hidrataron con lavados de etanol al
70%, 95% y 100% y se secaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
Se realizó una etapa de prehibridación colocando
los portaobjetos en una caja hermética al aire que contenía un
papel de filtro saturado con tampón box que contenía 50% de
formamida (J.T.Baker) en 4X SSC. Cada sección se cubrió con 100
\mul de tampón rHB2 que consistía en 10% sulfato de dextrano
(Sigma), 50% formamida (J.T.Baker, Phillpsburg, NJ), 100 mM DTT
(Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), 0,3 M NaCl (Sigma), 20 mM
Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA Sigma) y 1X solución de Denhardt (Sigma) y
los portaobjetos se incubaron a 42°C durante 1 hora. La sonda
descrita anteriormente se preparó mezclando 4 x 10^{5}
cpm/sección de tejido con 5 \mul de una solución de 10 mg/ml tARN
por sección y se calentó la mezcla a 95°C durante 3 minutos. Se
añadió tampón helado rHB2 para llevar el volumen final a 20
\mul/sección. La solución que contenía la sonda (20
\mul/sección) se añadió a 100 \mul de tampón rHB2 previamente
aplicado. Los portaobjetos se incubaron a 55°C durante 12 a 16
horas. Tras la hibridación, los portaobjetos se lavaron una vez en
4X SSC que contenía 10 mM DTT durante una hora a temperatura
ambiente, una vez en formamida desionizada al 50% (J. T. Baker), un
1X SSC, y 1 mM DTT durante 40 minutos a 60°C, una vez en 2X SSC
durante 30 minutos a temperatura ambiente; y una vez en 0,1X SSC
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se
deshidrataron mediante lavados de etanol al 70%, 95% y 100% y se
secaron al aire durante 30 minutos. Los portaobjetos se sumergieron
en emulsión unclear Kodak NTB2, se secaron durante una a tres horas
en temperatura ambiente en la oscuridad y se almacenaron en un
sitio oscuro a 40% con desecante hasta el momento del revelado. Los
portaobjetos se revelaron en revelador Kodak Dektol 4°C durante 4
minutos, se sumergieron 4 veces en dH_{2}O 4°C y se colocaron en
fijador 4°C Kodak durante minutos. Los portaobjetos se enjuagaron
en dH_{2}O y se realizó una tinción standard H&E en la forma
indicada a continuación.
Los portaobjetos se enjuagaron en dH_{2}O y se
tiñeron con hematoxilina y eosina haciendo pasar los portaobjetos
por una serie de etapas siguientes: 5 minutos en
formadlehído/alcohol (100 ml formaldehído, 900 ml 80% etanol); tres
enjuagues en agua por un total de 2 minutos; 5 minutos en 75%
Harris hematoxilina (Sigma); tres enjuagues en agua con un total de
dos minutos; una inmersión en 1% HCl/50% etanol; un enjuague en
agua; cuatro inmersiones en carbonato de litio 1%; 10 minutos en
agua de grifo; dos minutos en 0,5% en eosina (Sigma); tres
enjuagues en agua durante un total de dos minutos; dos minutos en
70% etanol; tres enjuagues de un minuto en 95% etanol; dos
enjuagues de un minuto en 100% etanol y dos enjuagues de dos
minutos en xileno. Los portaobjetos se montaron con citoseal 60
(Stephens Scientific, Riverdale, NJ).
Las señales obtenidas con una sonda antisentido
PDE8A se compararon con las señales de control generadas por una
sonda de sentido PDE8A y se consideró que toda señal específica de
la sonda antisentido representaba una expresión de PDE8A. La señal
PDE8A se detectó en gran parte del cerebelo, en un subconjunto de
células en los túbulos seminíferos del testes en células
diseminadas de origen todavía indeterminado en el músculo del
esqueleto, en células granulosas y a estromas del ovario, en
células epiteliales en el bucle de Henle en el riñón y el músculo
liso de algunas arteriolas en el corazón.
Estos resultados difieren de los obtenidos por
transferencia Northern y descritos en el ejemplo 6 en el sentido
de que se detectó una señal moderada en el corazón por
transferencia Northern mientras que los datos in situ,
utilizando esta muestra de corazón, dieron una señal débil. La
inconsistencia puede reflejar diferencias en los tejidos de
individuos diferentes o diferencias en el nivel de detección
inherentes a los dos métodos. La señal en el ovario y la señal en
el riñón puede indicar que PDE8A interviene en la ovulación o en la
homeostasis de la sal y/o del agua, respectivamente.
Los expertos en la materia podrán imaginar
numerosas modificaciones y variaciones en la invención expuesta en
los ejemplos anteriores a modo de ilustración. Por consiguiente, la
invención sólo tiene en cuenta las limitaciones reflejadas en las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Loughney, Kate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fosfodiestersa 8A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 27866/35047
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 08/951,648
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-10-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2298)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (868)..(870)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El aminoácido codificado por
nucleótidos 868—870 es Pro o LEU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(2411)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(2403)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 779
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp Xaa Xaa His Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaacagct atgaccatg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactctccaag gaatacag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtctctgc actaacac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggcaaggc ctctgcat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctatgaa ctgagcag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211>18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggcactg ccactgat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgagctgta tcggcact
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtgtgat tgttctgaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctggccaa gtagcaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtcacag gcagtcat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagagtggc aaggtctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatgacctg gaccaccag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcttgaa gaggtttgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgactgcct gtgacctt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctataca acccttacc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211>18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaatattg ctgaggcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaagtgagag gtgactgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctaaagggc tgagatca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcagtcacc tctcactt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211>18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaaaacgcc tatggtgg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgatctcag ccctttagc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatgtggca ggaaactg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcagcta gccgccatgg actacaagga cgacgatgac caagttgact gatgaaaagg
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptg
\hfill62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211>19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaagggg tacttttcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgtcctg aggctgtgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 755
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttagatgag aggttgctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgctaat cccag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactcgaat tccttgacag attagcatac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactcgaat tccttgac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgttcttc ctcttcagcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactcgaat tccttgacag a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripci6n de secuencia
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgtcgac ctgtetctgc actaacac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgtcgac aagcactcgg tcagccttcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcggatcc accatggact acaagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2.
2. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4.
3. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.
4. Polinucleótido que codifica el polipéptido
según las reivindicaciones 1, 2 o 3.
5. El polinucleótido según la reivindicación 4
que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 1.
6. El polinucleótido según la reivindicación 4
que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 3.
7. El polinucleótido según la reivindicación 4
que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5.
8. Polinucleótido que codifica un polipéptido
PDE8 humano elegido dentro del grupo formado por:
- a)
- el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7; y
- b)
- un ADN que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas para formar el complemento del núcleotido de (a), comprendiendo dichas condiciones moderadamente rigorosas un lavado final a 65°C en 2 x SSC y 0,1% SDS.
9. El polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8, que es una molécula de ADN.
10. El polinucleótido de la reivindicación 9, en
el que el ADN es una molécula de cADN.
11. El polinucleótido de la reivindicación 9, en
el que el ADN es una molécula de ADN genómico.
12. El polinucleótido de la reivindicación 9, en
el que el ADN es una molécula de ADN total o parcialmente
sintetizada químicamente.
13. Un polinucleótido antisentido que hibrida
específicamente con el polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8.
14. Un constructo de expresión que comprende el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.
15. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8 o el constructo de expresión de la
reivindicación 14.
16. Método para producir un polipéptido PDE8 que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- cultivar la célula anfitriona según la reivindicación 15 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PDE8 y
- b)
- aislar e polipéptido PDE8 de la célula anfitriona de su medio de cultivo.
17. Anticuerpo específicamente inmunoreactivo con
el polipéptido según la reivindicación 1, 2 o 3.
18. El anticuerpo según la reivindicación 17, que
es un anticuerpo monoclonal.
19. Un hibridoma que segrega el anticuerpo según
la reivindicación 18.
20. Un anticuerpo anti-idiotipo
específicamente inmunoreactivo con el anticuerpo según la
reivindicación 17.
21. Método para identificar un compuesto elemento
de fijación específico de un polipéptido PDE8 que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto el polipéptido PDE8 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polipéptido PDE8;
- b)
- detectar la fijación del compuesto en el polipéptido PDE8; e
- c)
- identificar el compuesto como un elemento de fijación específico del polipéptido PDE8.
\newpage
22. El método según la reivindicación 21, en el
que, en la etapa b), se detecta la modulación de la actividad del
polipéptido PDE8.
23. El método según la reivindicación 22, en el
que, en la etapa b), se detecta la inhibición de la actividad del
polipéptido PDE8.
24. El método según la reivindicación 22, en el
que, en la etapa b), se detecta la potenciación de la actividad del
polipéptido PDE8.
25. Método para identificar un
compuesto-elemento de fijación específico de un
polinucleótido PDE8, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto el polinucleótido PDE8 de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polinucleótido PDE8;
- b)
- detectar la fijación del compuesto en el polinucleótido PDE8; e
- c)
- identificar el compuesto como un elemento de fijación específico del polinucleótido PDE8.
26. El método según la reivindicación 25 en el
que, en la etapa b), se detecta la modulación de expresión de un
polipéptido PDE8 codificado por el polinucleótido PDE8.
27. El método según la reivindicación 26, en el
que, en la etapa b), se detecta la inhibición de la expresión del
polipéptido PDE8.
28. El método según la reivindicación 26, en el
que, en la etapa b), se detecta la potenciación de la expresión del
polipéptido PDE8.
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