JP2001526036A - サイクリックｇｍｐホスホジエステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトサイクリックＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ９Ａ）及びＰＤＥ９Ａを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストを提供する。さらに本発明は、ＨＵＣＥ−１の発現に関連した疾患の予防方法及び治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、サイクリックＧＭＰホスホジエステラーゼの核酸配列及びアミノ酸
配列、並びにこれらの配列を癌及び免疫疾患の診断及び予防、治療に関連する。

【０００２】 発明の背景 サイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）は、細胞内セカンドメッ
センジャーとして、ホルモン及び光、神経刺激伝達物質をはじめとする種々の細
胞外信号を伝達する。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ
）がサイクリックヌクレオチドを対応する一リン酸に分解して、サイクリックヌ
クレオチドの細胞内濃度及び信号伝達の効果を調節する。少なくとも哺乳動物Ｐ
ＤＥの７つのファミリーが、基質特異性及び親和性、補助因子に対する感度、抑
制薬剤に対する感度に基づいて同定された（Beavo, J.A.(1995) Physiological
Reviews 75: 725-48）。これらのファミリーの内の幾つかには、多くがスプライ
シング変異配列として様々な組織に発現する性質の異なる遺伝子が含まれる。こ
れらのファミリーには、多数のアイソザイム及びこれらのアイソザイムの多数の
スプライシング変異配列が含まれる。多数のＰＤＥファミリー、アイソザイム、
スプライシング変異配列の存在は、サイクリックヌクレオチドのレベル及びその
機能の調節の可能性を示している。

【０００３】 １型のＰＤＥ（ＰＤＥ１）はカルシウム／カルモジュリン依存性であり３つの
異なる遺伝子が含まれ、それぞれが少なくとも２つの異なるスプライシング変異
配列をもつ。ＰＤＥ１は、肺及び心臓、脳で発見されている。幾つかのカルモジ
ュリン依存性ＰＤＥ１は、リン酸エステル化／脱リン酸化によってin vitroで調
整される。ＰＤＥ１のリン酸エステル化により、ＰＤＥ活性をはじめカルモジュ
リンに対する酵素の親和性が低下する一方、ｃＡＭＰの安定状態が高まる。ＰＤ
Ｅ２は脳に局在するｃＧＭＰ刺激ＰＤＥｓであり、カテコールアミン分泌物のｃ
ＡＭＰの効果を仲介すると考えられている。ＰＥＤ３は、ＰＤＥの主用ファミリ
ーの１つであって血管平滑筋に存在する。ＰＤＥ３はｃＧＭＰによって抑制され
、基質としてのｃＡＭＰに対して高い特異性を有し、心機能において役割を果た
す。ＰＤＥ３のアイソザイムの１つは、１つ或いはそれ以上のインスリン依存性
キナーゼによって調節される。ＰＤＥ４は殆どの炎症細胞における主なアイソザ
イムであり、ｃＡＭＰ依存性リン酸エステル化によって活性化されるものもある
。ＰＤＥ５ｓはｃＧＭＰ特異であると考えられているが、ｃＡＭＰ機能にも影響
を及ぼすとも考えられ得る。高レベルのＰＤＥ５が血小板及び腎臓の平滑筋製剤
の殆どに含まれている。ＰＤＥ６は視覚において役割を果たし、光及びｃＧＭＰ
によって調節される。たった１つの知られているメンバーからなるＰＤＥ７クラ
スはｃＡＭＰ特異であり、ＰＤＥ４に最も深く関係している。ＰＤＥ７はＰＤＥ
４特異インヒビターであるロリプラムに抑制されない（上記Beavo参照）。ＰＤ Ｅ８はｃＡＭＰ特異であるＰＤＥの新しいファミリーを表し、ＰＤＥ４に最も深
く関与し、ロリプラムに反応せず、ジピリダモールに反応する。

【０００４】 ＰＤＥには、２７０個までのアミノ酸からなる触媒領域、及び補助因子結合を
行うＮ末端調節領域が含まれ、場合よっては機能が不明のＣ末端領域も含まれる
。保存型、ＨＤＸＸＨＸＧＸＸＮは、全てのＰＤＥの触媒領域で確認されている
。ＰＤＥファミリーは触媒領域内において概ね３０％のアミノ酸配列同一性を有
するが、同じファミリー内のアイソザイム(例えば、ＰＤＥ４ＡとＰＤＥ４Ｂ)は
この領域において通常約８５〜９５％の配列同一性を有する。さらに、ファミリ
ー内の触媒領域の外側では相当の類似性（６０％を越える）をもつが、各ファミ
リー間では殆ど配列同一性が存在しない。

【０００５】 免疫反応及び炎症反応の機能の多くは、細胞内のｃＡＭＰレベルを低下させる
薬剤によって抑制される（Verghese, M. W.他による(1995) Mol. Pharmacol）。
様々な疾患はＰＤＥ活性の増大によって起こり、サイクリックヌクレオチドのレ
ベルの低下に関連する。マウスにおけるある種の尿崩症はＰＤＥ活性の増加に関
連し、アトピー患者の白血球には低Ｋｍ値ｃＡＭＰ ＰＤＥ活性の増加が見られ
る。また、ＰＤＥの欠陥は網膜疾患と関連する。ｒｄマウス（rd mouse）におけ
る網膜変性、及びヒトにおける常染色体劣勢色素性網膜炎、アイリッシュセッタ
ー犬における棒状／錐体状異形成症１は、ＰＤＥ６Ｂ遺伝子の突然変異による。
ＰＤＥ３は心臓病に関与する。

【０００６】 ＰＤＥのインヒビターが多数同定され臨床評価中である。ＰＤＥ３インヒビタ
ーは、血小板凝集阻止薬及び抗高血圧薬、うっ血性心不全の治療に有用な強心薬
として開発された。ロリプラムであるＰＤＥ４インヒビターは鬱病の治療に使用
されてきた。また、別のＰＤＥ４インヒビターは抗炎症薬として評価中である。
ロリプラムは、in vitroでのＨＩＶ−１の複製を促進するリポ多糖体誘発腫瘍壊
死因子−α（lipopolysaccharide(LPS) induced TNF-alpha）を抑制する。従っ て、ロリプラムがＨＩＶ−１の複製を抑制する可能性がある（Angel, J. B.他(1
995) AIDS 9:1137-44）。更に、腫瘍壊死因子−α及び腫瘍壊死因子−β、γイ ンターフェロンなどのサイトカインの生成を抑制する能力から、ロリプラムが脳
脊髄炎の治療に効果的であることが判明している。また、ロリプラムは晩期の運
動障害の治療及び動物実験モデルの多発性硬化症の治療にも硬化があるであろう
（Sommer,N.他(1995) Nat. Med. 1:244-248; Sasaki, H.他(1995) Eur. J. Phar
mol 282:71-76）。

【０００７】 テオフィリンは、気管支喘息及び呼吸器疾患の治療に用いられる非特異性ＰＤ
Ｅインヒビターである。またテオフィリンは、呼吸器疾患の治療において気道平
滑筋機能及び抗炎症または免疫調節能力にも作用すると考えられている（Banner
, K. H. 及びPage. C. P. (1995) Eur. Respir. J. 8:996-1000）。ペントキシ リフィンは、間欠跛行及び糖尿病性末梢血管疾患の治療に用いられる別の非特異
性ＰＤＥインヒビターである。ペントキシリフィンはまた、腫瘍壊死因子−αの
生成を阻止することが知られ、ＨＩＶ−１の複製を阻止する可能性もある（上記
したAngel他）。

【０００８】 ＰＤＥはまた、様々なタイプの細胞の細胞増殖に影響を及ぼすことが報告され
、様々な癌にも関係している。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰの成長
は、ｃＡＭＰ誘導体及びホスホジエステラーゼインヒビターの送達によって抑制
されるとBang氏他によって報告されている（1994; Proc Natl Acad Sci USA 91:
5330-5334）。これらの細胞はまた、上皮性からニューロン形態に表現型が永久 転換したことを示した。ＰＤＥインヒビターがメサンギウムの細胞増殖及びリン
パ球増殖を調節する可能性があると主張する者もいる（Matousovic, K.他 (1195
)J. Clin. Invest. 96:401-410; Joulain, C.他(1995)J. Lipid Mediat. Cell S
ignal. 11:63-79）。最後に、Deonarain氏他は、細胞の死につながる腫瘍の特定
の細胞区画へのホスホジエステラーゼの細胞内送達を含む癌治療を記載している
（1994; Br. J. Cancer 70:786-94）。

【０００９】 新規のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ及びそれをコードする
ポリヌクレオチドの発見により、癌及び免疫疾患の診断及び予防、治療に役立つ
新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。

【００１０】 発明の要約 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
の断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド、サイクリックＧ
ＭＰホスホジエステラーゼ（PDE9A）を提供する。

【００１１】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製されたＰＤＥ９Ａの変異体を提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。
また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
と少なくとも９０％のポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリ
ヌクレオチド変異配列を提供する。

【００１２】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列を含む組成物を提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配
列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズする単離され精
製されたポリヌクレオチド配列を提供する。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミ
ノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列と相補的な単離され精製されたポリヌクレオ
チド配列も提供する。

【００１３】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片を含
む単離され精製されたポリヌクレオチド配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片を含むポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同
一性を有するポリヌクレオチドを有する単離され精製されたポリヌクレオチド変
異配列とを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２の断片を含むポリヌクレオチド配列と相補的な単離され精製されたポリ
ヌクレオチド配列を提供する。

【００１４】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の断片を少なくとも１つ含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発
現ベクターが宿主細胞の中に含まれる。

【００１５】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）
ポリペプチドの発現に好適な条件の下、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチ
ド配列の少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過
程と、（ｂ）宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法
を提供する。

【００１６】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＰＤＥ９Ａを含む医薬組
成物を好適な医薬用担体と共に提供する。

【００１７】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する精製された抗体と、そ
のポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストとを含む。

【００１８】 本発明はまた、癌の治療が必要な患者にＰＤＥ９Ａのアンタゴニストを効果的
な量投与することを含む、癌の治療または予防方法を提供する。

【００１９】 本発明はまた、免疫不全の治療が必要な患者にＰＤＥ９Ａのアンタゴニストを
効果的な量投与することを含む、免疫不全の治療または予防方法を提供する。

【００２０】 本発明はまた、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＰＤＥ９Ａをコードする
ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または
その断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列と少なく
とも１つの生物学的サンプルの核酸とをハイブリダイズして、ハイブリダイゼイ
ション複合体を形成する過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在と
生物学的サンプルにおけるＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドの存在とが
相関性を有するハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含む方法を提
供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼイションの前に生物学的サン
プルの核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。

【００２１】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の方法論及びプロトコル、細胞系、ベクター、試薬に限定され
ず、その実施形態を変更できることに理解されたい。また、ここで用いられる用
語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求
の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ないということも理解されたい。

【００２２】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００２３】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての方法及び材料は、本発明の
実施及びテストに使用できるが、好適な方法、装置、及び材料をここに記す。本
明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記
載された細胞系、ベクター、及び方法論を記述し開示するため、参照することに
よって本明細書の一部とする。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新
規性が損なわれると解釈されるものではない。

【００２４】 定義 本明細書においてのＰＤＥ９Ａとは、天然、合成、半合成或いは組換え体など
全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくはヒトを含む哺
乳動物）から得られる実質的に精製されたＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列のことであ
る。

【００２５】 本明細書において、用語「アゴニスト」とは、ＰＤＥ９Ａと結合したとき、Ｐ
ＤＥ９Ａの効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。
このアゴニストには、ＰＤＥ９Ａに結合してその効果を変調するタンパク質、核
酸、糖質、任意の他の分子を含み得る。

【００２６】 本明細書において、「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＰＤＥ９Ａをコー
ドする遺伝子の別の形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの変
異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造
や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべ
ての遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがあ
る。一般にアレルを生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置
換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列
内で一回或いはそれ以上生じる。

【００２７】 本明細書において、ＰＤＥ９Ａをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ
クレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、同じ或いは同等の機能を有
するＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドとなるものを指す。この定義には
、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座では
ない位置でアレルと不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及びＰＤＥ
９Ａをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質
も変異され得り、サイレント変化を生じＰＤＥ９Ａと機能的に等価となるアミノ
酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学
的或いは免疫学的にＰＤＥ９Ａの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、
溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成
され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミ
ン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り
、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン
、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００２８】 本明細書において、「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分子または合成の分
子である。ＰＤＥ９Ａの断片は、好ましくは約５〜約１５個の長さのアミノ酸で
あり、ＰＤＥ９Ａの生物学的活性または免疫学的活性を保持する。ここでは、「
アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸配列
及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ
酸配列に限定されるわけではない。

【００２９】 本明細書において、「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成することで
あり、一般にはこの技術分野では公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を
用いて行われる（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

【００３０】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、ＰＤＥ９Ａと結合したとき、Ｐ
ＤＥ９Ａの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続
時間を短縮する分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体
またはＰＤＥ９Ａの効果を減少させるの他の分子である。

【００３１】 本明細書において、「抗体」とは、Ｆａ，Ｆ(ab')₂、及びＦｖなどの抗原決定
基と結合可能な損なわれていない分子及びその断片のことである。ＰＤＥ９Ａポ
リペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷
の分子またはその断片を用いて調整可能である。動物を免疫化するのに使用され
るポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり化学
的に合成され得り、必要に応じて担体プロテインと結合することも可能である。
ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チ
ログロビン、及びキーホールリンペットヘモニアンを含む。次ぎに、この結合し
たペプチドを用いて動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化
する。

【００３２】 本明細書において、「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグ
メント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主
動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、タンパ
ク質上の所定の領域或いは三次元構造体に特異的に結合する抗体の産出が誘発さ
れ得る。このような領域または構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、
抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる
免疫原）と競合し得る。

【００３３】 本明細書において、「アンチセンス」とは、特定のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列と
相補的なヌクレオチド配列を含む全ての組成物である。用語「アンチセンス鎖」
は、「センス」鎖と相補的な核酸鎖のことであるアンチセンス分子は、ペプチド
核酸を含み、合成や転写を含む任意の方法で作ることができる。相補的ヌクレオ
チドは、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して
二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現は、時
としてアンチセンス鎖として使われ、「プラス（＋）」という表現は、センス鎖
として時々使われる。

【００３４】 本明細書において、用語「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節
的、或いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的
に活性」とは、天然の、組換え体の、合成のＰＤＥ９Ａまたはその任意のオリゴ
ペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結
合する能力のことである。

【００３５】 本明細書において、用語「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許
容の温度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合する
ことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合
する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみで部分的相
補性、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となり得る。核酸
鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大
きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並びに
ＰＮＡ分子の設計若しくは使用において特に重要である。

【００３６】 本明細書において、「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、概ね
所定のヌクレオチド配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥
した製剤或いは水溶液を含み得る。ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配
列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。この
プローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合可能で
ある。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは塩（例えば、ＮａＣｌ）、
界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、及びその他の物質（例えば、デンハート液、乾
燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され得る。

【００３７】 本明細書において、「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために
再配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^TM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT
）を用いて５'及び／または３'の方向に延長された核酸配列、或いはGELVIEW^TM
Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のた
めのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン社の重複配
列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によってコンセン
サス配列に構築されるものもある。

【００３８】 本明細書において、用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、
ノーザン分析によるＰＤＥ９Ａをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸
の存在の検出が、サンプル内のＰＤＥ９Ａをコードする核酸の存在を示すことか
ら、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有
することを意味する。

【００３９】 本明細書において、「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基
が欠如する、アミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００４０】 本明細書において、「誘導体」とは、ＰＤＥ９Ａをコードする、或いはそれと
相補的な核酸またはコードされたＰＤＥ９Ａの化学修飾のことである。このよう
な修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換
がある。核酸誘導体は、未修飾の分子の生物学的或いは免疫学的機能を保持する
ポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、もとのポリペプチドの生物
学的機能、或いは免疫学的機能を保持する、グリコシル化、ポリエチレングリコ
ール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたものである。

【００４１】 本明細書において、用語「相同性」とは、相補性の程度を表すものである。こ
れには、部分的相同性と完全な相同性とがあり得る。この「相同性」は用語「配
列同一性」と置き換え可能である。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズす
るのを少なくとも部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に相補的
な」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーション
の抑制は、厳密性を低下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザ
ンブロッティング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーショ
ン等）を用いて検査される。実質的に相同な配列或いはハイブリダイゼーション
プローブは、厳密性を低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列と
の結合のため競合して抑制する。これは、厳密性を低下させた条件の下では非特
異的な結合が許容されるということではなく、厳密性を低下させた条件には、２
つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、選択的）相互作用である必要がある。
部分的な相補性にもならない（例えば、３０％未満の相同性即ち同一性）第２の
標的配列を用いて、非特異的結合の不在の検査が可能である。非特異的結合が存
在しないということは、実質的に相補的な配列或いはプローブが第２の非相補的
標的配列とハイブリダイズしない。

【００４２】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、１０Ｋ〜１０ＭのサイズのＤＮＡ配列を含み得
り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小
染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355）。

【００４３】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよ
りヒトの抗体に似せるために、アミノ酸が非抗原結合領域に置換された抗体分子
である。

【００４４】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相
補的な一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００４５】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的なＧ
塩基とＣ塩基間、及びＡ塩基とＴ塩基間に水素結合が形成されることにより、２
つの核酸配列間に形成された複合体のことである。これらの水素結合は、スタッ
キング相互作用（stacking interaction）によってさらに安定し得る。この２つ
の相補的核酸配列の水素結合は、逆平行構造である。ハイブリダイゼーション複
合体は、溶液中（例えば、Ｃ₀ｔまたはＲ₀ｔ分析）、または溶液中の１つの核酸
配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスラ
イドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定され
たもう一方の核酸配列との間で形成され得る。

【００４６】 本明細書において、用語「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列
に対して、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるア
ミノ酸配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００４７】 本明細書において、「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロンまたは別のタイプ
の膜、フィルター、チップ、スライドガラス、或いはその他の好適な固体の支持
物など基板上に配列されたポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドのそれぞ
れのアレイのことである。

【００４８】 本明細書において、用語「変調」とは、ＰＤＥ９Ａの活性の変化のことである
。変調の例として、ＰＤＥ９Ａタンパク質における活性特性、若しくは結合特性
、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００４９】 本明細書において、「核酸」或いは「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片と、また一本鎖若しくは
二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ
或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ様物 質とを指す。「断片（またはフラグメント）」とは６０ヌクレオチドより長い核
酸配列であり、最も好ましい断片の長さは、少なくとも約１００ヌクレオチド以
上或いは約１０００ヌクレオチド以上、または約１００００ヌクレオチド以上で
ある。

【００５０】 用語「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーション、或
いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さは少なくとも
６ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５から３０ヌク
レオチド、最も好ましいのは約２０から２５のヌクレオチドである。本明細書に
おいて、オリゴヌクレオチドは、当技術分野で一般的な用語「アンプリマー」、
「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と実質的に同じである。

【００５１】 本明細書において、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンであるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、５ヌクレオチド以上の長さのオ
リゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、ポリエチレング
リコール化して、細胞におけるＰＮＡの寿命を延ばすことができる。このような
細胞では、ＰＮＡが相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して、転写物
の伸長を止める。（Nielsen, P.E.等(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。

【００５２】 本明細書において、用語「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられてい
る。生物学的サンプルは、ＰＤＥ９Ａ若しくはその断片を含むと推測される。ま
た生物学的サンプルには、体液、細胞からの抽出物、又は細胞から単離された染
色体、細胞小器官、膜、又は（溶液中の、又は固体の支持物に固定された）細胞
、ゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡ、又は組織、組織プリント等も含まれると推
測される。

【００５３】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タ
ンパク質或いはペプチドとアゴニスト間、または抗体とアンタゴニストとの間の
相互作用のことである。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタン
パク質の特定の構造（即ち、抗原決定基つまりエピトープ）の存在によって左右
される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した
「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（即ち結合していない、
無標識のＡ）を含むタンパク質の存在により、抗体と結合する標識Ａの量が減少
する。

【００５４】 本明細書において、用語「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチド配列と請求項
に記載されたポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件で
ある。好適である厳密な条件は、例えばプレハイブリダイゼーション溶液及びハ
イブリダイゼーション溶液における塩及び／またはホルムアミドの濃度、或いは
ハイブリダイゼーション温度によって定義され、当分野で公知である。詳細には
、塩の濃度を下げたり、ホルムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼー
ションの温度を上げることで厳密性を高めることができる。

【００５５】 例えば、高度な厳密性条件の下でのハイブリダイゼーションは、ホルムアミド
の濃度が約５０％、温度が約３７℃〜４２℃で起こり得る。厳密性条件を下げて
のハイブリダイゼーションは、ホルムアミドの濃度が約３５％〜２５％、温度が
約３０℃〜２５℃で起こり得る。詳細には、温度が４５℃、濃度が５０％のホル
ムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、０，３％のドデシル硫酸ナトリウム、２００μｇ／ ｍｌのせん断されて変性されたサケ精子ＤＮＡの高い厳密性条件の下でハイブリ
ダイゼーションが起こり得る。上述したように、３５％のホルムアミドまたは／
及び温度を３５℃に下げて厳密性条件を下げてもハイブリダイゼーションは起こ
り得る。目的の核酸のプリンとピリミジンとの比率及び温度をしかるべく調節す
ることによって、特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲をさらに狭めること
が可能である。上記の範囲及び条件の変更は当分野ではよく知られている。

【００５６】 本明細書において、用語「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除
かれ、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも６０％以上除去されたものであり、好ましくは７
５％以上の除去、最も好ましいのは９０％以上除去されたものである。

【００５７】 本明細書において、「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを
それぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００５８】 本明細書において、「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変
化させるプロセスのことである。このプロセスは、当分野で公知の種々の方法を
用いた自然或いは人工の条件の下で起こり得る。この形質転換は、原核宿主細胞
若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の公知の方法によって
行うことができる。この方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択
される。この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）
、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。
このように「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製する
プラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質
転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しく
は導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。

【００５９】 本命鎖書において、「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、
置換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異
が含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する
「非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、
挿入、或いはその両方が含まれる。当分野で公知の例えばＤＮＡＳＴＡＲソフト
ウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸
残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００６０】 発明 本発明は、新規のヒトサイクリックＧＭＰ特異ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ
９Ａ）、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドの発見、並びに癌及び免疫不
全の診断、予防、または治療におけるこれらの組成物の使用法に基づく。

【００６１】 本発明のＰＤＥ９Ａをコードする核酸が、前立腺組織ｃＤＮＡライブラリ（PR
OSNOT06）を起源とするインサイト社クローン番号828228において、アミノ酸配 列アライメントのコンピュータ検索を用いて初めて同定された。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２のコンセンサス配列は、このクローンの核酸配列が伸長されたものに由来
する。

【００６２】 或る実施例において、本発明は、図１Ａ及び図１Ｂ，図１Ｃ，図１Ｄ、図１Ｅ
、図１Ｆに示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを含む。ＰＤＥ９Ａはアミノ酸５９３個の長さを有し、Ｈ₃₅₂ＤＬＤＨＰＧＹ ＮＮにおいてサイクリックヌクレオチドＰＤＥに対するコンセンサスサイン配列
（consensus signature sequence）を有する。この配列は、ＰＤＥに保存された
２つの潜在二価の陽イオン部位の内の１つの一部であり、ＨＸＸＸＨ（Ｘ_6-24）
Eの一般構造を有する。これらの部位の１番目は配列Ｈ₃₁₂−Ｈ₃₁₆−Ｄ₃₄₁に見ら
れ、Ｅへの保存的アミノ酸置換としてＤ₃₄₁を有する。この置換は、少なくとも 別のＰＤＥであるＰＤＥ７に見られる。図２Ａ及び図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄに示
されているように、ＰＤＥ９Ａは、ＰＤＥ８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びキ
イロショウジョウバエ（GI 829179; ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）由来のｃＡＭＰ特 異ＰＤＥと化学的相補性及び構造的相補性を有する。詳細には、ＰＤＥ９ＡはＰ
ＤＥ８Ａと２４％の同一性を有し、キイロショウジョウバエｃＡＭＰ ＰＤＥと
は２０％の同一性を有する。全てのＰＤＥに見られる２７０までのアミノ酸触媒
領域が、ＰＤＥ９Ａの残基Ｆ２８８と残基Ｗ５４４との間に概ね伸びていて、こ
の領域においてＰＤＥ８Ａとは３４％の同一性を有し、キイロショウジョウバエ
ＰＤＥとは３０％の同一性を有する。この３つのタンパク質はそれぞれ、２つの
二価の陽イオン結合部位とコンセンサスサイン配列、ＨＤＸＸＨＸＧＸＸＮとを
有する。データは示していないが、ＰＤＥ９Ａは触媒領域において、ＰＤＥの他
のファミリー１及び２，３，４，５，６，７とそれぞれ同程度の相補性（２８％
〜３２％）を有する。

【００６３】 タンパク質の完全長をコードするＰＤＥ９Ａの１．８ｋｂの領域は、ｓｆ９細
胞及び酵素アッセイ用のこれらの細胞から準備された細胞可溶化物に発現したバ
キュロウイルス転移ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣにクローン化される。図３は、ｃ
ＧＭＰを基質とする組換え型の精製されたＰＤＥ９Ａの酵素活性の反応特性を示
す。ＰＤＥ９Ａは、ｃＧＭＰに対して強い親和性を有しそのＫｍ値は１７０ｎＭ
（ナノモル）であり、データは示さないがｃＡＭＰに対しては非常に弱い親和性
（Km=230μM）をもつ。図４はＰＤＥ９Ａの二価陽イオンへの依存性を示し、最 大活性のためにはＭｇ⁺⁺やＣａ⁺⁺よりもＭｎ⁺⁺が好ましい。ＰＤＥ９Ａは、１０
０μＭまでのロリプラム（ＰＤＥ４のインヒビター）またはジピリダモール（Ｐ
ＤＥ２及び４，５，６のインヒビター）、ＳＫＦ９４１２０（ＰＤＥ３のインヒ
ビター）、ビンポセチン（ＰＤＥ１のインヒビター）、ＩＢＭＸ（非特異性ＰＤ
Ｅインヒビター）には阻害されない。ＰＤＥ９Ａは、３５μＭのＩＣ₅₀をもつザ
プリナスト（ＰＤＥ５及び６のインヒビター）によって阻害される。膜系のノー
ザン分析によって様々な組織にこの配列が発現するのが示され、特に精巣及び卵
巣、小腸、結腸で著しい。ＬＩＦＥＳＥＱ^TMを用いたノーザン分析法により、様
々な組織にこの配列が発現し、その内の５０％以上が癌性であり、２５％以上が
炎症及び免疫反応に関係する。特に注目すべきは、クローン病にＰＤＥ９Ａが発
現することである。

【００６４】 ＰＤＥ９ＡとＰＤＥの他の８つのファミリーとの類似性の程度（２８％〜３０
％）は、他のＰＤＥファミリー間の類似性（〜３０％）と一致する。更にＰＤＥ
９Ａは、ｃＧＭＰに対する特異性及び既知のＰＤＥインヒビターによる阻害パタ
ーンによって他のファミリーとは区別できる。したがって、ＰＤＥ９Ａは、ＰＤ
Ｅ９と名付けられたサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの新規のフ
ァミリーメンバーであることが明らかである。

【００６５】 本発明はまた、ＰＤＥ９Ａの変異体を含む。ＰＤＥ９Ａの変異体は、好ましく
はＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列と８０％以上の配列の同一性、更に好ましくは９０
％以上の配列の同一性、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有し、ＰＤ
Ｅ９Ａの機能的特性或いは化学的活性のうちの少なくとも１つを保持している。

【００６６】 本発明はまた、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施
例において本発明は、ＰＤＥ９ＡをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を含
むポリヌクレオチド配列を含む。

【００６７】 本発明はまた、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列の変異体を含む
。詳細には、このポリヌクレオチド配列の変異体は、ＰＤＥ９Ａをコードするポ
リヌクレオチド配列と８０％以上の配列の同一性を有し、更に好ましくは９０％
以上の配列の同一性を有し、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する
。また本発明の特定の形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも８０％の配列
同一性、好ましくは９０％以上の配列同一性、最も好ましくは９５％以上の配列
同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変異体を含む。

【００６８】 遺伝暗号の縮重の結果、作り出され得るＰＤＥ９Ａをコードする種々のヌクレ
オチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のヌクレオチド配列と最小の
相同性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わ
せは、自然発生のＰＤＥ９Ａのヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレ
ット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。

【００６９】 ＰＤＥ９Ａをコードするヌクレオチド配列及びその変異は、好適に選択された
厳密性の条件の下で、自然発生のＰＤＥ９Ａのヌクレオチドとハイブリダイズ可
能なことが望ましいが、実質的に異なったコドンの使用法を備えるＰＤＥ９Ａ又
はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。
特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプ
チドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可能で
ある。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＰＤＥ９Ａ及びその誘導体をコ
ードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から
作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を
作ることにある。

【００７０】 本発明はまた、ＰＤＥ９Ａ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はその断
片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当
分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の
何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＰＤＥ９Ａまたはその
任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００７１】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたヌクレオチド
配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳細には、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２またはその断片に示されているヌクレオチド配列である。厳密
性条件については、Wahl, G.M. 及びS.L.Berger（1987; Methods Enzymol. 152:
399-407）及びKimmel, A.R.（1987; Methods in Enzymol. 152:507-511）に記載
されている。

【００７２】 当分野で良く知られ一般的に入手可能なＤＮＡのシークエンシング方法を用い
て、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には酵素が用いられる、
例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片であるSequenase（US Biochemical社
, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラー ゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）Methods社 が販売するELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼとポリメラー
ゼとの組み合わせである。このプロセスは、以下の装置を用いて自動化するのが
好ましい。Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal
Cycler（PTC200；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Catalyst及び373及び3
77 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）等。

【００７３】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で既知の種々の方法を用いてＰＤ
Ｅ９Ａをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上
流にある配列を検出する。例えば「制限部位」ＰＣＲ法を利用する１つの方法で
は、一般的なプライマーを用いて既知の遺伝子座近傍の未知の配列を検索する（
Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322）。詳しくは、リンカー配列
に対するプライマー及び既知の領域に対して特異的なプライマーの存在の下、ゲ
ノムＤＮＡを初めに増幅する。次ぎに、増幅された配列は、同じリンカープライ
マーと初めのプライマーの中に含まれる別の特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ
の２回目を行う。ＰＣＲによる各回の作製物を、好適なＲＮＡを用いて転写し、
逆転写酵素を用いて配列決定する。

【００７４】 既知の領域に基づく多岐にわたるプライマーを用いた配列の増幅或いは伸長は
、逆ＰＣＲ法を用いて行うことが可能である（Triglia, T.等（1988）Nucleic A
cids Res 16:8186）。プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis softw
are（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなど
を用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃
〜７２℃の温度で標的配列に対してアニールするよう設計される。この方法は幾
つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域の好適な断片を作製する。次ぎに
この断片を分子内のライゲーションにより環状にし、ＰＣＲの鋳型として利用す
る。

【００７５】 使用され得る別の方法にキャプチャＰＣＲ法がある。この方法には、ヒト及び
酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が含ま
れる（Lagerstrom, M.等（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。またこの方
法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う
前にそのＤＮＡ分子の未知の断片の中に組換え二本鎖配列を配置することが可能
である。

【００７６】 Parker, J.D.等の方法（1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060）は、未知の
配列を得るために用い得る別の方法である。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー
、PromoterFinder^TMライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である
（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスはライブラリをスクリーニングする
必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探すのに都合が良い。

【００７７】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、サイズが選択された大きなｃ
ＤＮＡを含むライブラリを用いるのが好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受け
たライブラリは、遺伝子の５'領域を含む配列をより多く含むという点で好適で ある。特にオリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場
合、ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリの使用が有用であろう。ゲノム
ライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【００７８】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及びレーザーで活性化される４つの異なった蛍光色素（各ヌクレオチドに１
つ）、ＣＣＤカメラによる放出された波長の検出に利用する。出力／光強度は、
適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyper^TM及びSequence Naviga
tor^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュー タ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャ
ピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないＤＮＡの小片のシ
ークエンシングに特に適している。

【００７９】 本発明の別の実施例では、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列また
はその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＰＤＥ９Ａ、その
断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重に
より、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ
配列が作られ得り、これらの配列をＰＤＥ９Ａのクローン化及び発現に利用可能
である。

【００８０】 当業者が理解するように、非自然発生のコドンを有するＰＤＥ９Ａをコードす
るヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。例えば、原核細胞または
真核細胞の宿主に好ましいコドンが選択されて、タンパク質の発現の比率を高め
たり、好ましい特性例えば自然発生の配列から生成される転写物より半減期の長
いＲＮＡ転写物を作り出すことが可能である。

【００８１】 種々の目的でＰＤＥ９Ａをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に
知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換え可能である。こ
の目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現を変え
る変更が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片による
ＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用い
て、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、部位特異的変異誘発によ
って、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更
、スプライスバリアントの生成、突然変異の誘発等が可能である。

【００８２】 本発明の別の実施例によれば、自然発生のＰＤＥ９Ａをコードするの核酸配列
、変更されたＰＤＥ９Ａをコードするの核酸配列、または組換えＰＤＥ９Ａをコ
ードする核酸配列を異種の配列に結合して、融合タンパク質をコードする配列に
することが可能である。例えば、ＰＤＥ９Ａの活性のインヒビターをペプチドラ
イブラリからスクリーニングするとき、市販の抗体によって認識され得るキメラ
ＰＤＥ９Ａタンパク質をコードすることが役に立ち得る。融合タンパク質は、Ｐ
ＤＥ９Ａをコードする配列と異種のタンパク質配列との間の位置する切断部位を
含むように設計可能であり、これによってＰＤＥ９Ａを切断し、異種部分から離
れて精製される。

【００８３】 別の実施例によれば、ＰＤＥ９Ａをコードする配列は、当分野で周知の化学的
方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（Caruthers. M.H.等（1980）N
uc Acids Res Symp Ser 7:215-223; Horn, T.等（1980）Nucl. Acids Res Symp.
Ser.225-232参照）。別法として、化学的方法を用いてタンパク質自体を作り出
して、ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列またはその一部を合成することが可能である。
例えば、ペプチド合成は種々の固相技術（Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204）を用いて実行可能であり、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシ ンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。

【００８４】 この新しく合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例え
ばCreighton T.（1983）Proteins Structure And Molecular Principles, WH Fr
eeman and Co., NY参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチ ドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる
（例えばエドマン分解法；Creighton, 前出）。更にＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列 または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を
用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、
変異体ポリペプチドを作ることが可能である。

【００８５】 生物学的に活性のＰＤＥ９Ａを発現するために、ＰＤＥ９Ａをコードするヌク
レオチド配列または機能的に等価なものが、好適な発現ベクター即ち挿入された
コーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する
。

【００８６】 当業者に周知の方法を用いて、ＰＤＥ９Ａをコードする配列、好適な転写及び
翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの
方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技 術が含まれる。このような技術は、Sambrook, J.等（1989）Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY及びAusubel,
F.M.等Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York
, NYに記載されている。

【００８７】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＰＤＥ９Ａをコードする配列の保持
及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリ
オファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された
細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス
発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス
発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザ
イクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３
２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。

【００８８】 「調節エレメント」或いは「調節配列」は、転写及び翻訳を実行するために宿
主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハンサー、プ
ロモーター、５'及び３'非翻訳領域である。このようなエレメントのその強さ及
び特異性は、様々である。使用するベクター系及び宿主によって、構成プロモー
ター及び誘導生プロモーターを含む好適な転写及び翻訳エレメントが任意の数利
用される。例えば、細菌系にクローニングする場合は、Bluescript ファージミ ド（Stratagene, LaJolla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco BRL）等のハ
イブリッドlacZプロモーターなどの誘導的プロモーターを用いることができる。
バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞に使用され得る。植物
細胞由来のプロモーター又はエンハンサー（例えば、熱ショック RUBISCO及び貯
蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウイルス由来のプロモーター又はエンハンサー（
例えば、ウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）は、ベクターの中にクロー
ニング可能である。哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物
ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＰＤＥ９Ａをコードする配列の多数の
複製を含む細胞系を作り出す必要がある場合は、SV40またはEBVベースのベクタ ーを好適な選択可能なマーカーと共に用いる。

【００８９】 細菌系では、多数の発現ベクターがＰＤＥ９Ａの使用目的に応じて選択可能で
ある。例えば、抗体の誘発に多量のＰＤＥ９Ａが必要な場合には、精製が容易な
融合タンパク質のハイレベルな発現を誘導するベクターが使用される。このよう
なベクターには、Bluescript（Stratagene）（ＰＤＥ９Ａをコードする配列が、
アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備えた
フレーム内のベクターに結合可能であり、ハイブリッドタンパク質が生成される
）などの多機能の大腸菌クローニング及び発現ベクターや、pINベクター（Van H
eeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等が含ま れるが、これらに限定されるものではない。またpGEXベクター（Promage、Madis
on WI）も、グルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質と して外来ポリペプチドを発現するために用いることができる。一般に、このよう
な融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた
後にフリーのグルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解した細胞から
容易に精製できる。そのような系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、
トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、目的の
クローン化ポリペプチドがGST部分から自由に放出され得る。

【００９０】 酵母菌サッカロミセス−セレビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼや
ＰＧＨなどの構成的或いは誘導的プロモーターを含む多種のベクターが使用可能
である。これについては、Ausubel等（前出）及びGrant等（1987）Methods Enzy
mol. 153:516-544を参照。

【００９１】 植物発現ベクターが用いられる場合、ＰＤＥ９Ａをコードする配列の発現は、
多種のプロモーターの内の任意のプロモーターによって促進される得る。例えば
、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが
単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオ メガリーダー配列との組み合わせで用いられ得る。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの
小さなサブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターが用
いられる（Coruzzi, G.等（1984）EMBO J 3:1671-1680）; Broglie, R.等（1984
）Science 224:838-843; 及びWinter, J.等（1991）Results Probl. Cell Diffe
r. 17:85-105）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介し
たトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。このような
技術は、多数の一般に入手可能な文献に記載されている（例えば、Hobbs, S.又 はMurry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）M
cGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。

【００９２】 昆虫系もＰＤＥ９Ａの発現に用いられ得る。例えば、タンパク質の完全長をコ
ードするＰＤＥ９Ａの１．８ｋｂの領域がＰＣＲ増幅され、５‘ＦＬＡＧタグを
含むように変更されたバキュロウイルス転移ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ（Life T
echnologiesm Inc., Gaithersburg, MD）にクローン化される。組換えウイルス の材料は、製造者の使用説明書に従って準備される。Ｓｆ９細胞は、２７℃でＳ
ｆ９００II Ｓｆｍ無血清培地（Life technology社）で培養される。発現のため
に、１×１０⁸のＳｆ９細胞が、最終容量が５０ｍｌにおける多数の５'の感染で
感染される。感染の３日後に細胞を収集して酵素を含む可溶物を準備する。発現
を監視するために、模擬感染した細胞可溶物及びＰＤＥ９Ａ感染した細胞可溶物
の１μｌをそれぞれポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、標準的な方法で銀染
色するかニトロセルロースに移して２ｍｇ／ｍｌの濃度でアンチＦＬＡＧ抗体（
M2, Scientific System, Eastman Kodak, New Haven, CT）でウエスタンブロッ トする。

【００９３】 哺乳動物宿主細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデ
ノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リ
ーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＰＤＥ９Ａをコードす
る配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入
により、感染した宿主細胞にＰＤＥ９Ａを発現できる生ウイルスを得ることが可
能である（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3
659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサ
ーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。

【００９４】 ヒト人工染色体（HACs）を用いて、プラスミドで発現し含まれているものより
大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために６〜１０ＭのＨＡＣｓを作
製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル
）で供給する。

【００９５】 ＰＤＥ９Ａをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開
始シグナルが利用可能である。このようなシグナルには、開始コドン及び隣接す
る配列も含まれる。ＰＤＥ９Ａをコードする配列、その開始コドン、及び上流の
配列が好適な発現ベクターの中に挿入される場合、追加の転写または翻訳制御シ
グナルを必要としない。しかしながら、コーディング配列、またはその断片のみ
が挿入される場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを供給し
なければならない。さらに、全ての挿入の翻訳を確実にするために、開始コドン
が正しい読取り枠になければならない。外来の翻訳エレメント及び開始コドンに
は、天然及び合成の両方の起源をもつ様々なものが可能である。発現の効率は、
エンハンサーが含まれることによって高められる。このようなエンハンサーは、
文献（Scharf,D.等（1994）Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載 されているように、用いられる特定の細胞系に好適なものである。

【００９６】 さらに、挿入した配列の調節能力または所望の形のタンパク質の発現をプロセ
シングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修
飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipi
dation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タン
パク質の「prepo」形を切断する翻訳後のプロセシングを、正しい挿入、折りた たみ及び／または機能を高めるために用いることが可能である。修飾語の活性の
ための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば、CH
O、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATCC; B
ethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセ シングを確実にするために選択される。

【００９７】 組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定した発現が望
ましい。例えば、安定してＰＤＥ９Ａを発現する細胞系が、発現ベクターを用い
て形質転換が可能である。この発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／また
は内在性の発現エレメントや、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝
子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で１〜２
日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を与えるとともに
、その存在により導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能と
なる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織
培養技術を用いて増殖可能である。

【００９８】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ（tk）（Wigler, M.等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（aprt）（Lowy, I.等（1980）Cell 22:817-23）遺伝
子が含まれ、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において用いることが可能である。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler, M.等(1
980)Natl Acad Sci 77:3567-70）、nptはアミノグリコシッドネオマイシン及びG
-418に対する耐性を与え（Colbere-Garapin, F.等（1981）J Mol Biol 150:1-14
）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する 耐性を与える（Murry, 前出）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、細胞 がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるtrpB、または細胞がヒスチ
ジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるhisDが文献に記載されて
いる（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:80
47-51）。 アニトシアニン、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及び
その基質ルシフェリンなどのマーカーは、トランスフォーマントを特定するだけ
でなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の定
量に用いることができるため、最近、可視マーカーの使用が一般的になってきた
（Rhodes, C.A.等（1995）Methods Mol. Biol. 55:121-131）。

【００９９】 マーカーの遺伝子出現の存在／不在が目的の遺伝子が存在すると示していても
、その存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＰＤＥ９Ａをコードす
る配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＰＤＥ９Ａをコードする配
列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能であ
る。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＰＤＥ９Ａをコー
ドする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマー
カー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【０１００】 または、ＰＤＥ９Ａをコードする核酸配列を含むと共に、ＰＤＥ９Ａを発現す
る宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。
これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡや、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。

【０１０１】 ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＰＤＥ９Ａをコード
するポリヌクレオチドのプローブや断片或いは一部を用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡま
たはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや増幅によって検出可能である。核
酸増幅に基づいたアッセイでは、ＰＤＥ９ＡをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを
含む形質転換体を検出するために、ＰＤＥ９Ａをコードする配列に基づいたオリ
ゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用する。

【０１０２】 ＰＤＥ９Ａの発現の検出及び計測のための種々のプロトコルには、当分野で周
知のこのタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の
どちらかを用いる。例えば、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある 。ＰＤＥ９Ａ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用い
た、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-bas
ed immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。こ
れらのアッセイ及びその他のアッセイは、Hampton, R.等（1990; Serological M ethods, a Laboratory Manual , APS Press, St. Paul MN）及びMaddox, D.E.等 （1983, J. Exp. Med. 158:1211-1216）及び他の文献に記載されている。

【０１０３】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチ
ドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロー
ブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレ
ーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含
まれる。別法として、ＰＤＥ９Ａをコードする配列、またはその任意の断片をｍ
ＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である
。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，ま
たはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加
によって、in vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの
方法は、種々の市販のキット（Pharmacia Upjohn（Kalamazoo, MI）；Promega（
Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland OH）を用いて行うこと
ができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、
基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤
、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。

【０１０４】 ＰＤＥ９Ａをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞
培地でのこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転
換された細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用
されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＰＤＥ９Ａをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってＰＤＥ
９Ａの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には
理解されよう。別の作製物を用いて、ＰＤＥ９Ａをコードする配列を、可溶性タ
ンパク質の精製を促すポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と結
合させることも可能である。このような精製を促すドメインには、固定された金
属上での精製を可能とするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレ
ートペプチド、固定された免疫グロブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａド
メイン、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seatt
le WA）に用いられるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない 。精製ドメインとＰＤＥ９Ａとの間のXA因子或いはエンテロキナーゼに特異的な
ものなどの切断可能なリンカー配列を含むものを用いて、精製が促進され得る。
このような発現ベクターの１つは、ＰＤＥ９Ａと、チオレドキシン或いはエンテ
ロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合
タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基は、IMAC（Porath, J等（1992; Prote
in Exp. Purif. 3:263-281）に記載されているような固定された金属イオンアフ
ィニティクロマトグラフィー）での精製を促進し、一方エンテロキナーゼ切断部
位が融合タンパク質からＰＤＥ９Ａを精製する手段を提供する。融合タンパク質
を含むベクターの議論は、Kroll, D.J.等（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）
に記載されている。

【０１０５】 組換え生成物に加えて、ＰＤＥ９Ａの断片が、固相技術（Merrifield J. (196
3) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154参照）を用いて直接的なペプチド合成によ って作製され得る。タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合
成は、例えばApplied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を
用いて行うことが可能である。ＰＤＥ９Ａの種々の断片は別々に化学的に合成さ
れ、化学的方法を用いて結合し完全長分子を生成する。

【０１０６】 治療 ＰＤＥ９ＡとＰＤＥ８ＡとキイロショウジョウバエｃＡＭＰ ＰＤＥとの間に
、化学的相同性及び構造的相同性が存在する。更に、ＰＤＥ９Ａは、炎症及び免
疫応答と関連する組織、癌において発現する。従って、ＰＤＥ９Ａは、癌及び免
疫疾患において一定の役割を果たしているものと考えられる。特に、ＰＤＥのイ
ンヒビターがこの種の疾患の治療に効果があることが示されている。

【０１０７】 従って、或る実施例によれば、癌の予防及び治療のため患者にＰＤＥ９Ａのア
ンタゴニストを投与可能である。上記の癌には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色
腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房
、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副
甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌が含まれ得
るが、これらに限定されるものではない。或る実施態様では、特異的にＰＤＥ９
Ａと結合する抗体が、直接的にアンタゴニストとして、或いはＰＤＥ９Ａを発現
する細胞または組織に薬物を運ぶための標的或いは運搬機構として間接的に使用
され得る。

【０１０８】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した種類の癌の治療または
予防のために、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現する
ベクターを患者に投与することもできる。

【０１０９】 別の実施例では、ＰＤＥ９Ａのアンタゴニストを、免疫異常症の予防及び治療
のために患者に投与し得る。このような疾患には、ＡＩＤＳ，副腎機能不全、成
人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテローム硬化症、気管支炎、
胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、（
肺）気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎、通風、グレーブス病、過好酸球増加
症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心
膜の炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎
、強皮症、シェ−グレン症候群、及び自己免疫性甲状腺炎；血液透析、体外循環
、癌の合併症；ウィルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、蠕虫感染症及び外傷が含
まれ得るが、これらに限定されるものではない。

【０１１０】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した種類の免疫不全の治療
または予防のために、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクターを患者に投与することもできる。

【０１１１】 別の実施例では、本発明の治療用タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターの何れかを別の好適な治療薬と組み合わせて投与
することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好
適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々
の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量
の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減
し得る。

【０１１２】 ＰＤＥ９Ａのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造すること
が可能である。詳しくは、精製されたＰＤＥ９Ａを用いて抗体を作ったり、治療
薬のライブラリをスクリーニングしてＰＤＥ９Ａと特異的に結合するものを同定
が可能である。

【０１１３】 ＰＤＥ９Ａの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能であ
る。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗
体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られた
フラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には
、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１１４】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、ＰＤＥ９Ａまたは任意の断片、または免疫原性の特性を
備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、
種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュ
バントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルア
ジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、
油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの
界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられる
アジュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacteri um parvum が特に好ましい。

【０１１５】 ＰＤＥ９Ａに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、または断片は、５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望
ましいのは１０以上のアミノ酸からなるものである。それらは天然のタンパク質
のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のア
ミノ酸配列全体を含むこともある。ＰＤＥ９Ａアミノ酸の短い伸展部は、キーホ
ールリンペットヘモシニアンなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子
に対する抗体が産生され得る。

【０１１６】 ＰＤＥ９Ａに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって
、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの
技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−
ハイブリドーマ技術（Kohler, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.
等. (1985) .J. Immunol. Methods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:
109-120）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【０１１７】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達した技術、即ち好適な抗原特異性及
び生物学的活性を備える分子を得るためにヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子を
スプライシングする技術が用いられる（Morrison, S.L. 等. (1984) Proc. Natl
. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S. 等. (1984) Nature 312:604-608
; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454）。別法では、当分野で周知の方 法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＰＤＥ９Ａ
特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの
組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合に
よって生成することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88
:11120-3）。

【０１１８】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献（Orlandi, R. 等. (198
9) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. 等. (1991) Nature 34
9:293-299）に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリ ーニングすることによって、作製することもできる。

【０１１９】 ＰＤＥ９Ａに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例
えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成可能なＦ（ａ
ｂ’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって
、生成可能なＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法
では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性（Huse, W.
D. 等. (1989) Science 254:1275-1281）とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且 つ容易な同定が可能となる。

【０１２０】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＰＤ
Ｅ９Ａとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性
ＰＤＥ９Ａエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モ
ノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用
することができる（Maddox, 前出）。

【０１２１】 本発明の別の実施例では、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド、または
任意の断片またはその相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施
形態では、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転
写を阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、
ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することも
できる。したがって、相補的分子または断片は、ＰＤＥ９Ａの活性の調節、また
は遺伝子機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野で
は周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片
が、ＰＤＥ９Ａをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさ
まざまな位置から設計可能である。

【０１２２】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＰＤＥ９Ａを
コードする遺伝子のポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを
作製することができる。これらの技術は、Sambrook 等. (supra)及びAusubel 等
. (前出)の両方に記載されている。

【０１２３】 ＰＤＥ９Ａをコードする遺伝子は、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド
又はその断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換
することによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できない
センス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に
組み入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによっ
て機能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過
性の発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製エレメントがベクター系の一部
である場合はさらに長く持続する。

【０１２４】 上記した通り、遺伝子発現の調節は、ＰＤＥ９Ａをコードする遺伝子の制御５
’または調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサー、及びイントロン
）に対する相補的な配列またはアンチセンス分子を設計することによって得るこ
とができる。転写開始部位、即ち開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由
来するオリゴヌクレオチドが好適である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対
合法を用いて阻止することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラ
ーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため
有益である。三重式ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献（Gee, J.E. 等. (1
994) In: Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approache s , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）に記載されている。相補的な配列 またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止するこ
とによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。

【０１２５】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異性切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には相補的な標的ＲＮＡへのリボザ
イム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が
続く。用いられる例には、ＰＤＥ９Ａをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を
、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含
まれる。

【０１２６】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列が、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価する。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護活性を用いて、相補的な
オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによ
って評価することができる。

【０１２７】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでＰＤＥ９Ａをコードする ＤＮＡ配列の転写によって生成する、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６
等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み
入れることができる。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成す
るこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することが
できる。

【０１２８】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態はもち
ろん、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１２９】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる送達（Goldman, C.K. 等. (1997) Nature Biotec
hnology 15:462-66:引用によって本明細書の一部とする）は、当分野で周知の方
法を用いて実行することができる。

【０１３０】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１３１】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物は、ＰＤＥ
９Ａ、ＰＤＥ９Ａに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はＰＤ
Ｅ９Ａのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤など
の１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することが
できる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び
水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或い
は薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１３２】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１３３】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれる。製剤及び投与についての詳しい技術については
、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Eas
ton, PA)に記載されている。

【０１３４】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与量に好適な投与量における当分野で周
知の薬学的に利用される担体を用いて、製剤することができる。このような担体
により、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル
、液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１３５】 経口用に用いられる医薬品製剤は、活性化合物と固体の薬品添加物との混合に
よって得られ、所望に応じて得られた混合物をすりつぶし、顆粒の混合物を処理
して、好適な賦形剤を添加した後、必要に応じてタブレット或いは糖衣錠コア（
dragee cores）が得られる。好適な医薬品添加物とは、ラクトース、スクロース
、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャ
ガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセル
ロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン及びコラーゲ
ンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。必要に応じて
、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギン酸、または
その塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が加えられる。

【０１３６】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量を示すため、即ち薬用量を示すた
め、錠剤または糖衣錠に加えられる。

【０１３７】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１３８】 非経口投与用に好適な医薬品製剤が、水溶液で製剤されるが、好ましくはハン
クス液、リンガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に結合性のある緩衝剤であ
る。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化
合物の懸濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液
または媒体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又は
リボソームなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが
、送達目的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となる
よう化合物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１３９】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１４０】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１４１】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成することができる。塩
分は対応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。
別の場合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２
％スクロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範
囲が４．５〜５．５であり、使用の前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いる
ことができる。

【０１４２】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。ＰＤＥ９Ａの投与のため、このようなラベルには、
量、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１４３】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分が含まれる組成物が含まれる。当業者は、効果的な服用量を自分の
能力の範囲で十分に決めることができる。

【０１４４】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１４５】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＰＤＥ９Ａ又
はその断片、ＰＤＥ９Ａの抗体、アゴニスト、ＰＤＥ９Ａのアンタゴニストまた
はインヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細
胞培養または動物実験における標準的な薬剤実験によって決定することができる
。たとえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％が医薬的効果がある。）及び
ＬＤ５０（服用に対して集団の５０％が致命的である）。治療効果と毒性効果と
の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で示すことができる。高
い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から
得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いら
れる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、Ｅ
Ｄ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量はこの範囲内で幅広
く、用いられる投与形態、患者の感受性、及び投与の経路に左右される。

【０１４６】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関連する要素を考慮して、実務者によっ
て決められるであろう。薬用量及び投与は効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の状態の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び
患者の性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療
に対する許容度／応答が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日
に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率
によって左右され、投与され得る。

【０１４７】 通常の薬用量は０．１〜１００，０００μｇであり、最大約１グラムまでであ
り、投与の経路による。特定の薬用量及び送達の方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、一般に当分野の実務者は利用できる。当業者は、タンパク質
またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様
に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置など
に対して特異的であろう。

【０１４８】 診断 別の実施例では、特異的にＰＤＥ９Ａと結合する抗体が、病状或いはＰＤＥ９
Ａの発現による特徴をもつ病気の診断、或いはＰＤＥ９Ａ、アゴニスト、インヒ
ビターで治療を受ける患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断に有益
な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＰＤＥ９Ａの
診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取
されたものにおけるＰＤＥ９Ａを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾を
して或いはしないで使用され、共有結合か非共有結合でレポーター分子と抗体を
結合することによって標識化される。当分野で周知の幅広いレポーター分子が用
いられ、その内の幾つかは上記した。

【０１４９】 ＰＤＥ９Ａを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々の
プロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＰＤＥ９
Ａの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＰＤＥ９Ａの
発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒト
である被験者から採取した体液または細胞とＰＤＥ９Ａに対する抗と結合させる
ことによって確定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが
、測光法（photometric）が好ましい。被験者のＰＤＥ９Ａの発現の量、制御及 び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間
の偏差により疾患の診断のためのパラメーターが確率される。

【０１５０】 別の実施例によれば、ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチドを診断のため
に用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド
配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチ
ドを用いて、疾患と相関し得るＰＤＥ９Ａを発現する生検組織における遺伝子の
発現を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＰＤＥ９Ａの不在、存在
、及び過度の発現を区別し、治療中のＰＤＥ９Ａレベルの制御を監視する。

【０１５１】 ある実施形態では、ＰＤＥ９Ａまたは近く関連する分子をコードする遺伝子配
列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブとハイブリダイゼー
ションを用いて、ＰＤＥ９Ａをコードする核酸配列を同定することが可能である
。例えば５'調節領域の１０個の特有のヌクレオチドである高度に特異的な領域 か、例えば特に３'コーディング領域のやや特異性の低い領域から作られている かのプローブの特異性、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大
、高い、中間、または低い）は、ＰＤＥ９Ａ、アレルをコードする自然界の配列
のみをプローブが同定するかどうか或いは関連配列を同定するかによって決まる
であろう。

【０１５２】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＰＤＥ９Ａをコードする任
意の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡであり得り、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列、或いはプロモーター、エンハンサーエレメ ント、自然発生のＰＤＥ９Ａのイントロンを含むゲノム配列に由来する。

【０１５３】 ＰＤＥ９ＡをコードするＤＮＡのための特異的なハイブリダイゼーションプロ
ーブの作製には、ＰＤＥ９Ａ及びＰＤＥ９Ａ誘導体をコードする核酸配列をｍＲ
ＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする手段がある。このよう
なベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラー
ゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加える方法により、ＲＮＡプローブを合
成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或
いは３５Ｓなどの放射性核種、アビジン／ビオチン（biotin）結合系によってプ
ローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポータ
ーの集団によって標識され得る。

【０１５４】 ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＰＤＥ９Ａの発現と
関連のある症状または疾患の診断が可能である。このような症状または疾患の例
には、癌としては腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌
、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管
、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺
、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌が含まれ、免疫疾患には、ＡＩＤＳ，副腎
機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテローム硬化症
、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎
、糖尿病、（肺）気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎、通風、グレーブス病、
過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、
心筋または心膜の炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウ
マチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、及び自己免疫性甲状腺炎；血液透
析、体外循環、癌の合併症；ウィルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、蠕虫感染症
及び外傷が含まれる。ＰＤＥ９Ａをコードするポリヌクレオチド配列は、サザー
ンブロット法やノーザンブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、デ
ィップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはマ イクロアレイにおいて患者の生体から採取した体液或いは組織を利用して変異Ｐ
ＤＥ９Ａの発現を検出するに利用される。このような質的或いは量的方法は、当
分野では周知である。

【０１５５】 特定の形態において、ＰＤＥ９Ａをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌
、特に上記したものの活性或いは誘発を検出するアッセイにおいて有益であろう
。ＰＤＥ９Ａをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハ
イブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或
いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サン
プルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生体或いは採取されたサ
ンプルのシグナルの量が、適合性のある制御サンプルのそれと著しく変わってい
る場合は、ヌクレオチド配列がサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイゼー
ションし、サンプル内のＰＤＥ９Ａをコードするヌクレオチド配列の変異レベル
により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動
物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を
推定することが可能である。

【０１５６】 ＰＤＥ９Ａの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正
常あるいは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験体から
採取された体液或いは細胞と、ＰＤＥ９Ａをコードする配列或いはその断片とを
結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常
な被験体から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いら
れる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルか
ら得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験体から得た値と比較可能である。標
準値と被験体の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１５７】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験体における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。癌におい
て、個体からの生体組織における比較的多量の転写物は、疾患の発生の素因を示
し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能
である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的
な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。

【０１５８】 ＰＤＥ９Ａをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診
断への利用は、ＰＣＲの利用を含む。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、特定の遺伝
子を識別するための最良の条件の下で利用される、一方がセンス方向（５'−＞ ３'）他方がアンチセンス方向（３'＜−５'）である２つのヌクレオチド配列か らなるのが望ましい。ネスト化されたオリゴマーのセット、或いは変性したオリ
ゴマーのプールでさえある２つの同じオリゴマーが、やや緩い厳密性条件の下、
近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能
である。

【０１５９】 ＰＤＥ９Ａの発現を定量するために用いられ得る方法には、放射標識或いはビ
オチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び実験結果が加えら れた標準的な曲線が含まれる（Melby, P.C.等(1993) J. Immunol. Methods, 159
:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236）。多数のサンプルの定
量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色
応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを用いることによって加速さ
れた。

【０１６０】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、（転写のイメージを作成するため）同時に極
めて多くの遺伝子の発現レベルを監視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を
識別する。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診
断、及び治療薬剤の開発及び監視に有用である。

【０１６１】 ある実施例では、マイクロアレイを用意して以下に記載の当業者にはよく知ら
れた方法に基づいて行う。PCT出願WO95/11995（Chee 等.）、Lockhart, D. J. 等. （1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M. 等. （1996; Proc
. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619）。

【０１６２】 このマイクロアレイは、固体支持物に固定された通常は合成アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド或いはｃＤＮＡの断片のどちらかである、極めて多数の独特の一
本鎖核酸配列からなるのが好ましい。オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは
６〜６０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドであり
、最も好ましいのは約２０〜２５ヌクレオチドである。ある種のマイクロアレイ
では、オリゴヌクレオチドの長さが僅か７〜１０ヌクレオチドが好ましい。マイ
クロアレイには、５'（または３'）として知られる配列を含むオリゴヌクレオチ
ド、完全長の配列を含む連続したオリゴヌクレオチド、或いは配列の長さに沿っ
た特定の領域から選択された独特のオリゴヌクレオチドを含み得る。マイクロア
レイに用いられるポリヌクレオチドは、少なくとも配列の一断片が既知である目
的の遺伝子或いは遺伝子に特異的であるか、或いは特定の細胞型や組織型または
通常状態や発生状態や疾患状態に一般的である１つ以上の同定されていないｃＤ
ＮＡに特異的である。或る場合は、マイクロアッセイ上のオリゴヌクレオチドの
対を用いることが好適である。これらのペアは、好ましくは配列の中心にあるヌ
クレオチド１つを除いて同一配列である。ペアの２番目のオリゴヌクレオチド（
１つが不一致）は調節として機能する。オリゴヌクレオチドのペアの数は２個か
ら１００万個の範囲である。

【０１６３】 マイクロアレイの既知の配列にオリゴヌクレオチドを生成するために、目的の
遺伝子が、ヌクレオチド配列の５'またはより好ましい末端３'から開始するコン
ピュータアルゴリズムを用いて検査される。このアルゴリズムは遺伝子に特有の
決まった長さのオリゴマーを同定し、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧ
Ｃを含み、ハイブリダイゼーションを阻害すると予想される二次構造を含まない
。或る実施態様によれば、オリゴマーは、光誘導化学処理（light-directed che
mical process）を用いて、基板上の指定した領域で合成される。基板は、紙、 ナイロン或いは他の種類の膜、フィルター、チップ、スライドガラス或いは他の
好適な固体支持物である。

【０１６４】 或る実施態様では、PCT出願WO95/251116（Baldeschweiler 他）で開示された ような化学的結合法及びインクジェット応用装置を用いて、オリゴヌクレオチド
を基板の表面で合成し得る。また、別の実施態様では、ドット或いはスロットブ
ロット（HYBRIDOTョ装置、GIBCO/BRL）と類似の「格子状の」アレイを用いて、真
空システム、熱及びＵＶ機械式または化学結合方法を使用し、基板の表面にｃＤ
ＮＡ断片或いはオリゴヌクレオチドを整列して結合させる。別の実施態様によれ
ば、アレイは手動で生産するか、利用可能な装置、材料、及び機械（Birnkmannョ
マルチチャンネルピペッター、またはロボット式の装置を含む）を用いて生産可
能であり、市販の器具を効果的に使用できるオリゴヌクレオチドの個数８，２４
，９６，３８４，１５３６，または６１４４か、或いは２〜１００万の間の任意
の数を含む。

【０１６５】 マイクロアレイを用いてサンプル分析を行うため、生物学的サンプルからポリ
ヌクレオチドを得る。生物学的サンプルは、体液（血液、尿、唾液、粘液、胃液
など）、培養された細胞、生検材料、または他の組織標本の内の任意のものから
得ることが可能である。プローブを生成するためにサンプルから得たポリヌクレ
オチドを用いて、マイクロアレイ上の核酸と相補的な核酸配列を生成する。マイ
クロアレイがｃＤＮＡからなる場合は、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）がプロ
ーブに好適である。従って或る実施態様によれば、ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを
生成し、この生成されたｃＤＮＡを蛍光性ヌクレオチドの存在の下、断片ａＲＮ
ＡプローブまたはオリゴヌクレオチドａＲＮＡプローブの生成に用いる。これら
の蛍光標識したプローブをマイクロアレイで培養して、これらのプローブ配列を
マイクロアレイのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする。
別の実施態様によれば、プローブとして用いられる核酸配列には、ハイブリダイ
ゼーション技術の分野ではよく知られている制限酵素やＰＣＲ法、オリゴラベリ
ング（Oligolabeling）、トランスプローブキット（TransProbe kits(Pharmacia
)）を用いて生成したポリヌクレオチドや断片、及び相補配列やアンチセンス配 列が含まれ得る。

【０１６６】 培養条件を調節して、完全に相補的なハイブリダイゼーションまたはやや不完
全に相補的な種々のハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションし
なかったプローブを除去した後、スキャナーを用いて蛍光パターン及びそのレベ
ルを決定する。スキャンした画像を検査して、相補性の程度及びマイクロアレイ
上の各オリゴヌクレオチド配列の相対量を決定する。検出装置を用いて、種々の
配列の全てのハイブリダイゼーションの有無、及びその量を同時に測定すること
ができる。このデータを用いて、サンプル内の配列及び突然変異、変異体、多形
性の幅広い相関分析及び機能解析が可能である（Heller, R. A.他(1997) Pros.
Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。

【０１６７】 本発明の別の実施例ではまた、ＰＤＥ９Ａをコードする核酸配列を用いて、自
然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプロー
ブが生成される。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。特定の染
色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、
酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１生成物或いは
単一染色体ｃＤＮＡライブラリであり、詳しくはPrice, C.M. (1993) Blood Rev
. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154に記載されて いる。

【０１６８】 In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH、Verma等（1988）Human Chromosom es: A Manual of Basic Technique , Pergamon Press, New York, NY”に記載） は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関するであろう
。遺伝子マップデータの例は、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inherit
ance in Man（OMIM）で見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＰＤ Ｅ９Ａをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に
対する素因が、このような遺伝的疾患と関係するＤＮＡの領域の限界を決定する
のに役立つ。目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、即
ち感染した者との遺伝子配列における違いを検出することもある。

【０１６９】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳類の染色体上での遺伝子の配置により、た
とえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマーカ
ーが明らかになることが多い。新規の配列が、物理的なマッピングによって、染
色体アーム、或いはその一部に割り付けることもできる。このことは、位置クロ
ーニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者
にとって、価値ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えばATは11q22-
23（Gatti, R.A.等（1988）Nature 336:577-580）という、特定の遺伝子領域に 遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピン
グも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す。また、目
的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、
転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。

【０１７０】 本発明の別の実施例では、ＰＤＥ９Ａ、その触媒作用断片或いは免疫原断片ま
たはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニ
ングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或
いは細胞内に存在する。ＰＤＥ９Ａとテストされる薬剤との複合体を結合するこ
とによる形成は計測されることもある。

【０１７１】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、公開されたＰＴＣ出願WO84/03564に
記載のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング
処理能力が高い。この方法では、ＰＤＥ９Ａに適用したように相当な数の異なる
小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試
験用化合物は、ＰＤＥ９Ａ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに
、結合されたＰＤＥ９Ａが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＰＤ
Ｅ９Ａはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上
で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕ら
え、固体支持物に固定することもできる。

【０１７２】 別の実施例では、ＰＤＥ９Ａと結合可能な中和抗体がＰＤＥ９Ａと結合するた
め試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いるこ
とができる。この方法では、抗体が、ＰＤＥ９Ａと１つ以上の抗原決定因子を共
有するどのペプチドの存在も検出する。

【０１７３】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＰＤＥ９Ａをコードするヌクレ
オチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及
び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術
を提供することができる。以下の実施例は、目的の発明を例示し、発明を限定す
る目的のものではない。

【０１７４】

【実施例】 ＰＲＯＳＮＯＴ０６ｃＤＮＡライブラリ作製 ＰＲＯＳＮＯＴ０６ｃＤＮＡライブラリは、５７歳の白人男性から得た顕微鏡
的に正常な前立腺組織によって作製された。この組織は、同じ患者から採取した
前立腺腫瘍、ｃＤＮＡライブラリＰＲＯＳＴＵＴ０４に関連する。この両方の組
織は、両方の精巣の除去及び局所リンパ節の摘出を含む根治的前立腺切除時に切
除された。病理学的には、前立腺周辺の左右両方における腺線錘筋腫性過形成及
び腺癌（Gleason grade 3+3）である。神経周囲への侵入及び莢膜を穿孔した腫 瘍もあった。また、患者の病歴には大腸に良性新生物もあった。患者は、１型糖
尿病用のインシュリンを服用していた。患者の家族の病歴は、父親に前立腺の悪
性新生物、母親には合併症を伴わない１型糖尿病があった。

【０１７５】 Brinkman Homogenizer Polytron-PT 3000 (Brinkman Instruments社, Westbur
y, NY)を用いて、グアニジニウムイソチオシアネート溶液にこの凍結組織をホモ
ジナイズし、溶解した。この溶解物に２Ｍの酢酸ナトリウム０．１ｍｌを加え、
ストラジーン社のＲＮＡ分離プロトコルによって、ｐＨ５，５のフェノールクロ
ロホルムでこの溶解物を抽出し、さらにｐＨ４．７の酸性フェノールでも抽出し
た。ストラジーン社のプロトコルに従って、このＲＮＡを等量のイソプロパノー
ルで沈殿させた。ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ処理水で再懸濁し、３５℃で５０分
間デオキシリボヌクレアーゼで処理した。等量の酸性フェノールで反応を止め、
０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールでＲＮＡを沈殿させ、Ｄ
ＥＰＣ処理水に再懸濁した。Qiagen Oligotex キット（QIAGEN社, Chatsworth,
CA）でＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。

【０１７６】 このｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用のSuperScript
Plasmid System(Cat.#18248-013: Gibco/BRL)の推奨プロトコルに従って処理さ れた。ｃＤＮＡはSepharose CL4B colmn(Cat. #275105-01, Pharmacia)に分画さ
れ、４００ｂｐを超えるそのｃＤＮＡはpSportIに結合された。その後、プラス ミドpSportIがDH5a^TMコンピテント細胞(Cat. #18258-012 Gibco/ BRL)に転換さ れた。

【０１７７】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは、REAL Prep 96 Plasmidキットを用いて細胞から遊離され
、精製された。このキットによって、マルチチャンネル試薬ディスペンサーを用
いた９６−ウエルブロックにおける９６サンプルの同時精製が可能になった。以
下の点を変更して推奨プロトコルを用いた。１）細菌は２５ｍｇ／Ｌのカルベニ
シリン及び０．４％のグリセロールを有する１ｍｌの滅菌のTerrific Broth（Ca
talog #22711, Gibco/BRL）内で培養された。２）接種後、その培養株を１９時 間インキュベートし、インキュベーション終了時にその細胞を０．３ｍｌの溶解
緩衝液で溶解した。３）イソプロパノール沈殿後、プラスミドＤＮＡペレットを
０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップを終了した後、サ
ンプルを４℃で保管するために９６−ウエルブロックに移した。

【０１７８】 ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertow
n MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと共にHamilton Mic
ro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV)を用いて、Sanger他(1975; J Mol Biol 94:44
1f)の方法により配列決定し、読み枠も決定した。

【０１７９】 ３ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び／またはアミノ酸配列を、GenBank、SwissProt
, BLOCKS及びPima IIのデータベースにある配列と照合するために用いた。以前 に同定されて注釈が付けられた配列を含むそのデータベースを用いて、ＢＬＡＳ
Ｔで相同性（類似性）の領域の検索が行われた。このＢＬＡＳＴとは、Basic Lo
cal Alignment Search Tool（Altschul. S. F.(1993)J. Mol. Evol.36:290-300,
Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）の頭字語である。

【０１８０】 ＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するためにヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列の両方のアライメントを生成する。このアライメントが局部的な性質を有する
ため、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を判定する際、或いは原核（細菌）又は真核（動
物、真菌或いは植物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。参照
して本明細書の一部としているSmith T.他(1992, Protein Engineering 5:35-51
)に記載されるアルゴリズムなどの他のアルゴリズムを、主要配列パターン及び 副次的な構造の間隙の問題を取り扱う際に用いることが可能である。本明細書に
開示しているように、配列の長さは少なくとも４９ヌクレオチドであり、Ａまた
はＣ、Ｇ、ＴではなくＮが記録される不要な塩基の上限は１２％である。

【０１８１】 このＢＬＡＳＴ法は、問合せ配列とデータベース配列との間の一致を検索し、
すべての見つかった一致配列の統計的有意性を評価し、ユーザが選択した有意性
の閾値を満足する一致のみを報告する。本明細書では、ヌクレオチドの閾値を１
０^-25、ペプチドの閾値を１０^-10に設定した。

【０１８２】 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び他
の哺乳動物（ｍａｍ）配列の場合には、GenBankデータベースに対して検索され た。次ぎに、同じクローンに由来する推定されたアミノ酸配列の相同性が、GenB
ank機能タンパク質データベース及び哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔ ｐ）、真核生物（ｅｕｋｐ）に対して検索された。

【０１８３】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、膜に固定された特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡと標識されたヌ
クレオチド配列とのハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook他、上記）。

【０１８４】 ヒト複数組織ノーザンブロット（Clontech, Palo Alto, CA）をクローン番号 ８２８２２８の１０９０個からなるヌクレオチドの５'末端領域をプローブとし てハイブリダイゼーションした。プローブＤＮＡは、「Ready-To-Go」ランダム プライム標識キット（Pharmacia Biotech社、Piscataway, NJ）を用いて³²Ｐで 標識し、６５℃、０．５×ＳＳＣの厳密性で洗浄した。最も高いレベルのＰＤＥ
９Ａは脾臓及び小腸、脳に見られ、検出できるレベルのＰＤＥ９Ａは検査した全
ての組織で確認された。

【０１８５】 ＢＬＡＳＴ（Altschul SF (1993)上記; Altschul, S.F (1990)上記）を用いて
、膜系ノーザン分析に類似のコンピュータ技術を実行した。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％の誤差範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は
通常、１５〜４０の間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定され得る。

【０１８６】 ノーザン分析の結果は、ＰＤＥ９Ａをコードする転写物が発生するライブラリ
のリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特
定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に含まれる回数を直接表し、存在率は、存在
量をｃＤＮＡライブラリ内の検査した配列の全数で割った値である。

【０１８７】 ５ ＰＤＥ９Ａをコードする配列の延長 ｃＤＮＡ配列を、ヒトλｇｔ１０精巣または胃ｃＤＮＡライブラリ（Clontech Laboratories社、Palo Alto, CA）と、ネスト化プライマーを用いてＰＣＲ法に
よって延長した。各反応において、ＤＮＡを変性するために２．５×１０⁷ｐｆ ｕ（プラーク形成単位）を５分間沸騰させた。１回目のＰＣＲ法（１５サイクル
）は、ＰＤＥ９Ａ特異プライマー(9A specific-outer: 5'-GGGTGACAGGGTTGATGCT
-3'; SEQ ID NO: 5)と、λｇｔ１０順方向(forward)プライマー(5'-TCGCTTAGTTT
TACCGTTTTC-3'; SEQ ID NO: 6)或いはλｇｔ１０逆方向(reverse)プライマー(5'
-TATCGCCTCCATCAACAAACTT-3'; SEQ ID NO: 7)のどちらかを用いて行った。２回 目のＰＣＲ法（３０サイクル）は、１／５０の反応混合液のアリコットを鋳型と
して、ＰＤＥ９Ａ特異プライマー(9A specific-inner: 5'-GACACAGAACAGCCACCTC
-3'; SEQ ID NO: 8)と、ネスト化λｇｔ１０順方向(5'-AGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-
3'; SEQ ID NO: 9)或いはλｇｔ１０逆方向(5'-CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA-3';
SEQ ID NO: 10)のどちらかを用いて行った。５'ＲＡＣＥ増幅をヒト脳ｍＲＮＡ （Clontec）について実施して、配列を延長した。５'ＲＡＣＥは、製造者の使用
説明書に従って「５' Race System for Rapid Amplification of cDNA Ends」キ
ット(Life Technology社, Grand Island, NY)を用いて実施した。５'ＲＡＣＥに
用いたＰＤＥ９Ａ特異プライマーには、逆転写酵素プライマー(5'-GCTCCTCCCTCA
TCTTCTTA-3'; SEQ ID NO:12)、アウタープライマー(5'-AGGACAGCCAAGTGATTT-3';
SEQ ID NO:13)、インナープライマー(5'-TGCGCTGGCCTTCCTGGTAG-3'; SEQ ID NO
:14)がある。明確なバンドはサブクローニングされ、配列決定された。結果とし
て延長されたＰＤＥ９Ａ配列に組み入れられた全ての配列は、特定のプライマー
を用いたｃＤＮＡライブラリＤＮＡからの配列決定複数独立(sequencing multip
le independent)ＰＣＲ増幅、或いはｍＲＮＡからの独立増幅によって検証され た。

【０１８８】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 本発明のポリヌクレオチド配列から導き出されたハイブリダイゼーションプロ
ーブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする
。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大
きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレ
オチドを、OLIGO4.06（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを
用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]
アデノシン三リン酸（Amersham）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont N
EN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリ ゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を
用いて実質的に精製する。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリ コットを、次のエンドヌクレアーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いは
PvuII（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベ ースのハイブリダイゼーション解析において用いる。

【０１８９】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager cassette（Mo
lecular Dynamics, Sunnyvale, CA）内のブロットに数時間露光した後、ハイブ リダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１９０】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作製するために、本発明のヌクレオ
チド配列の１つを、このヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリ
ズムを用いて調べる。このアルゴリズムによって、その遺伝子に独特で、ＧＣ含
量がハイブリダイゼーションに適した範囲内にあり、且つハイブリダイゼーショ
ンを妨げるような推定上の２次構造が存在しない、決まった長さのオリゴマー群
を同定する。このアルゴリズムは、それぞれ２０ヌクレオチドからなる長さ（２
０量体）の約２０種の配列特異的オリゴヌクレオチドを同定する。各配列の中央
の１個のヌクレオチドだけが変化している点を除いて一致しているオリゴヌクレ
オチドの組が作られる。このプロセスはマイクロアレイにおける各遺伝子につい
て反復され、上記したＣｈｅｅ氏によるように光照射化学プロセスを用いて、２
０種の２０量体の組が二組、シリコンチップの表面上で合成され並べられる。

【０１９１】 或いは、化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でオリ
ゴマーを合成する（上記したBaldeschweilerを参照）。更に別の形態では、ドッ
トブロット法（またはスロットブロット法）に類似した「格子型」アレイを利用
し、ｃＤＮＡ断片即ちオリゴヌクレオチドを、真空システム、熱、ＵＶ、機械的
または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的なアレイ
は、手作業で、または市販の材料及び機械を用いることによって作製することが
でき、８ドット、２４ドット、９４ドット、３８４ドット、１５３６ドット、又
は６１４４ドットの格子を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、マイクロア
レイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキャナーを用
いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンした画像を調べて、マイク
ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量／発現レ
ベルを決定する。

【０１９２】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＰＤＥ９Ａをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、
自然発生のＰＤＥ９Ａの発現の低下即ち阻害するために用られる。約１５〜約３
０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或い
はより大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法を用いることができ
る。Oligo4.06ソフトウェア及びＰＤＥ９Ａのコーディング配列を用いて、適切 なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配
列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコー
ディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリ
ゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＰＤＥ９Ａをコードする転写物に結合
するのを阻害する。

【０１９３】 ９ ＰＤＥ９Ａの発現 タンパク質の完全長をコードするＰＤＥ９Ａの１．８ｋｂ領域（ヌクレオチド
61-1842）を増幅し、５'ＦＬＡＧタグを含むように変更したバキュロウイルス転
移ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）に
クローン化する。組換えウイルスの材料は、製造者の使用説明書に従って準備す
る。Ｓｆ９細胞を、２７℃でＳｆ９００II Ｓｆｍ無血清培地（Life technology
社）で培養する。発現のために、１×１０⁸のＳｆ９細胞が、最終容量が５０ｍ ｌにおける多数の５'の感染で感染させる。以下に記載するように、感染の３日 後に細胞を収集して酵素を含む可溶物を準備する。発現を監視するために模擬感
染した細胞可溶物及びＰＤＥ９Ａ感染した細胞可溶物の１ｍｌをそれぞれポリア
クリルアミドゲルで電気泳動し、標準的な方法で銀染色するか或いはニトロセル
ロースに移して、２ｍｇ／ｍｌの濃度でアンチＦＬＡＧ抗体（M2, Scientific S
ystem, Eastman Kodak, New Haven, CT）及びウエスタンブロットでアッセイす る。２次抗体は、アルカリホスファターゼ複合抗マウスＩｇＧ(Boehringer Mann
heim, Indianapolis, IN)であり、ブロットは、製造者の使用説明書に従って「 ＢＣＩＰ／ＮＢＴホスファターゼ基質システム」(Kirkegaard&Pery Laboratorie
s, Gaithersburg, MD)で映像化する。

【０１９４】 アッセイに用いるＰＤＥ９Ａは、形質移入されたＳｆ９細胞から準備する。細
胞は遠心分離によって採取し、１×１０⁷細胞／ｍｌの均質化緩衝液(20 mM Tris
-HC2,2mMbenzamindine, 1mM EDTA, 0.25 M source, 100 uM PMSF, ph7.5)に再懸
濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波処理プローブ(3×10秒パルス)を用いて分離する。 壊死組織片は、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離して除去する。この上澄み
を−７０℃で保存する。

【０１９５】 １０ ＰＤＥ９Ａ活性の実証 ＰＤＥ活性は、ＰＤＥ９Ａ及び５'ヌクレオチダーゼの存在の下、³Ｈ−ｃＧＭ
Ｐの³Ｈ−グアノシンへの転換を計測することによって測定できる。１ステップ のアッセイは、ｐｈ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬと、１０ｍＭのＭｇＣ
Ｌ²と、(Crotlus atrox毒からの)０．１ユニットの５'ヌクレオチダーゼと、０ ．００６４−２．０ｕＭの³Ｈ−ｃＧＭＰを含む１００ｕＬのアッセイを用いて 行う。反応は、希釈された酵素上澄みを２５μｌ加えると始まる。この反応は、
ミニＰｏｌｙ−Ｑシンチレーションバイアル(Beckman Instruments社, Fullerto
n CA)で直接行われる。生産阻害に関係する非直線性を避けるために、ｃＧＭＰ 加水分解が１５％に至らないまでの期間アッセイを３７℃でインキュベートする
。この反応は、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ１×８(Cl form)レジン(1:3 slurry)を１ｍｌ 加えると止まる。３ｍｌのシンチレーション溶液を加え、バイアルを混ぜる。バ
イアル内のレジンを計数前に１時間沈静する。Ｂｅｔａシンチレーションカウン
ターを用いて、³Ｈグアノシンに関係する可溶性放射能を定量する。この回収し た放射能の量が反応におけるＰＤＥ９Ａの活性に比例する。

【０１９６】 １１ ＰＤＥ９Ａに特異的な抗体の産生 ＰＡＧＥ電気泳動法（Sambrook前出）または他の精製技術を用いて実質的に精
製されたＰＤＥ９Ａを用いて、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗
体を作り出す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から類推されるアミノ酸配列をDNASTARソ フトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定して対応 するオリゴペプチドを合成し、これを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生さ
せる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような適切な
エピトープの選択については、Ausubel等（前出）及び他の文献に記載されてい る。

【０１９７】 通常、このオリゴペプチドは約１５残基の長さを有するもので、Applied Bios
ystemsのペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリによ
り合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ＭＢＳ：Ausubel等、前出）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシ ニアン（ＫＬＨ、Sigma, St. Louis, MO）に結合する。フロイントの完全アジュ
バントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得
られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチック
に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、
さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０１９８】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＰＤＥ９Ａの精製 自然発生ＰＤＥ９Ａ或いは組換えＰＤＥ９Ａを、ＰＤＥ９Ａに特異的な抗体を
用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノ
アフィニティーカラムは、CnBr-活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）のよ うな活性化クロマトグラフィー用レジンとＰＤＥ９Ａ抗体とを共有結合させるこ
とにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロ
ックし洗浄する。

【０１９９】 ＰＤＥ９Ａを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを
ＰＤＥ９Ａを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において
高イオン強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＰＤＥ９Ａとの
結合を切るような条件下で（例えばｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿
素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、Ｐ
ＤＥ９Ａを回収する。

【０２００】 １３ ＰＤＥ９Ａと相互作用する分子の同定 ＰＤＥ９Ａ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（B
olton他 (1973) Biochem. J. 133:529）で標識する。マルチウェルプレートに予
め配列しておいた候補の分子を、標識したＰＤＥ９Ａとともにインキュベートし
、洗浄して、標識したＰＤＥ９Ａ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。
様々なＰＤＥ９Ａ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＰＤＥ９Ａの関
係、親和性、数について数値を計算する。

【０２０１】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に関
して本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制
限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する
分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々な
改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳＰ ＲＯ^TM（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフト ウエアを用いて作成された。

【図１Ｂ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TMソフ
トウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用い て作成された。

【図１Ｃ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TMソフ
トウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用い て作成された。

【図１Ｄ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TMソフ
トウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用い て作成した。

【図１Ｅ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TMソフ
トウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用い て作成した。

【図１Ｆ】 ＰＤＥ９Ａのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TMソフ
トウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用い て作成した。

【図２Ａ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した ＰＤＥ９Ａ（８２８２２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ＰＤＥ８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と、キイロショウジョウバエ（ＧＩ８２９１７９；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）由来のｃＡＭＰ特異ＰＤＥとの間のアミノ酸配列アライメントの一 部を示す。

【図２Ｂ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した ＰＤＥ９Ａ（８２８２２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ＰＤＥ８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と、キイロショウジョウバエ（ＧＩ８２９１７９；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）由来のｃＡＭＰ特異ＰＤＥとの間のアミノ酸配列アライメントの一 部を示す。

【図２Ｃ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した ＰＤＥ９Ａ（８２８２２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ＰＤＥ８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と、キイロショウジョウバエ（ＧＩ８２９１７９；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）由来のｃＡＭＰ特異ＰＤＥとの間のアミノ酸配列アライメントの一 部を示す。

【図２Ｄ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した ＰＤＥ９Ａ（８２８２２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ＰＤＥ８Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と、キイロショウジョウバエ（ＧＩ８２９１７９；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）由来のｃＡＭＰ特異ＰＤＥとの間のアミノ酸配列アライメントの一 部を示す。

【図３】 基質としてｃＧＭＰを用いたＰＤＥ９Ａの活性の二重逆数プロット、即ちライン
ウイーバー−バークプロットを示す。正方向のＸ軸は基質（ｃＧＭＰ）濃度の逆
数（１／Ｓ）を表し、正方向のＹ軸は反応速度の逆数（１／Ｖ）を表す。インウ
イーバー−バーク解析は、Segal, I. H.（Enzyme Kinetics(1995)pp. 214-245,
John Wiley and Sons, New York, N. Y.）に基づいて実施された。

【図４】 ＰＤＥ９Ａ活性の２価の陽イオン濃度に対する依存性を示し、正方向のＸ軸は陽
イオン濃度（ｍＭ）を表し、正方向のＹ軸はｃＡＭＰの加水分解率を表す。実験
に用いた２価の陽イオンは、塩化カルシウム（CaCl₂; squares）及び塩化マグネ
シウム（Mgcl2; open circles）、塩化マンガン（Mncl₂; closed circles）であ
る。

【図５】 様々なＰＤＥインヒビターのＰＤＥ９Ａの活性への効果を示し、正方向のＸ軸は
インヒビターの濃度（Ｍ）を表し、正方向のＹ軸は無抑制調節インキュベーショ
ン（１００％）に対するｃＧＭＰの加水分解率を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 9/16 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 グッディング、ダグラス・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州94061・ レッドウッドシティー・ジュニペロアベニ ュー 937 (72)発明者 ストリーター、デイビッド・グレイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1211 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA11 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 HA12 HA15 4B050 CC03 DD07 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ44 QR08 QR32 QR36 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG26 AG27 CA10 CC24 DA05 DA14 4B065 AA90X AA93Y AB01 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 DC22 MA01 NA14 ZB072 ZB262 ZC192 ZC202 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA75 DA89 EA22 EA28 EA51 FA72 FA74 GA26

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたサイクリックＧＭＰホ
   スホジエステラーゼ（ＰＤＥ９Ａ）。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一
   性を有する実質的に精製されたＰＤＥ９Ａの変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のＰＤＥ９Ａをコードする単離され精製されたポ
   リヌクレオチド配列。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列と９０％以上のポリヌク
   レオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
6. 【請求項６】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチド配列とハイ
   ブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド配列。
7. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチド配列と相補的な単離され精製
   されたポリヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはその断片を含む単離され精製
   されたポリヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】 請求項８のポリヌクレオチド配列と９０％以上相補的な単
   離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
10. 【請求項１０】 請求項８のポリヌクレオチド配列と相補的な単離され精
    製されたポリヌクレオチド配列。
11. 【請求項１１】 請求項３のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの断
    片を含む発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
13. 【請求項１３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１２の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
14. 【請求項１４】 好適な医薬用担体と共に請求項１のＰＤＥ９Ａを含む医
    薬品組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１のＰＤＥ９Ａと特異的に結合する精製された抗
    体。
16. 【請求項１６】 請求項１のＰＤＥ９Ａの精製されたアゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１のＰＤＥ９Ａの精製されたアンタゴニスト。
18. 【請求項１８】 癌の治療が必要な患者に、請求項１７のアンタゴニスト
    を効果的な量投与する過程を含む、癌を予防及び治療する方法。
19. 【請求項１９】 免疫不全の治療が必要な患者に、請求項１７のアンタゴ
    ニストを効果的な量投与する過程を含む、免疫不全を予防及び治療する方法。
20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてＰＤＥ９Ａをコー
    ドするポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドを少なくとも生物学的サンプルの核酸の１
    つとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおけるＰＤＥ９Ａを
    コードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特
    徴とする検出方法。
21. 【請求項２１】 前記生物学的サンプルの核酸が、ハイブリダイゼーショ
    ンの前にＰＣＲ法により増幅されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。