JP2002504329A - Ｃａｆ１関連タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＣＡＦ１関連タンパク質（ＣＡＦＲＰ）と、そのＣＡＦＲＰを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＣＡＦＲＰの発現に関連する疾患の治療方法または予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ＣＡＦ１関連タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれ
らの配列を細胞増殖及び炎症に関連する疾患の診断及び予防、治療に関連する。

【０００２】 発明の背景 遺伝子発現の差次的制御が、多細胞生物の成長及び発達に不可欠である。遺伝
子発現は、ＤＮＡからタンパク質になる際の多くの段階で制御することが可能で
あるが、殆どの遺伝子の主な制御ポイントは転写開始時である。この重要な段階
が一般的な転写因子及び組織特異的転写因子の組み合わせによって正及び負に調
節される。その転写因子の大部分は１つ以上の標的遺伝子の転写を刺激する。

【０００３】 多くの転写因子は、分離可能なＤＮＡ結合領域及び転写活性（抑制）領域を有
するモジュラータンパク質である。このＤＮＡ結合領域は、遺伝子のプロモータ
ー領域近傍の特定のＤＮＡ配列（調節エレメント）と相互作用し、この相互作用
により活性（抑制）領域が、他のタンパク質と相互作用して転写を刺激（抑制）
できる位置にくる。多くの転写因子は、十分に機能するように二量体化或いは多
量体化する必要がある。例えば、転写因子のへリックスループへリックスファミ
リーのメンバーはホモ二量体或いはヘテロ二量体として機能する。これらの因子
の単量体形は、ＤＮＡ結合活性がない。(Stryer.L. (1995) Biochemistry,第４ 版、998-999ページ) ＣＣＲ４が、マルチサブユニット複合体の成分として現れる酵母の一般的な転
写因子である。ＣＣＲ４は、非発酵性の成長に関与する様々な遺伝子の発現を刺
激する。詳しくは、ＣＣＲ４は、グルコース抑制アルコール脱水素酵素II遺伝子
（ＡＤＨ２）の発現に必要である。ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域に融合された際、
ＣＣＲ４はＤＮＡと直接結合するようには見えないが、ＣＣＲ４はグルコース応
答性転写活性化因子として機能する。ＣＣＲ４は、他の幾つかのタンパク質因子
と物理的に相互作用する。これらのＣＣＲ４関連因子である２つのＣＡＦ１及び
ＣＡＦ２が、ＣＣＲ４タンパク質の中央にあるロイシンの多い反復モチーフと結
合する。(Denis. C. L. 及び Malvar. T.(1990) Genetics 124: 283-291; Malva
r 他. (1992) Genetics 132 (4):951-962; Draper. M.P. 他. (1994) Mol. Cell
. Biol. 14(7): 4522-4531; 及び Draper. M.P. 他. (1995) Mol.Cell. Biol. 1
5(7): 3487-3495.) ＣＡＦ１は進化的に保存されたマウスタンパク質であり、相同体がヒト及びS. cerevisiae、線虫、A. thalianaで同定された。ＣＡＦ１の酵母相同体、ＰＯＰ
２がその効果によってグルコース制御された遺伝子発現において初めて同定され
た。提案された転写因子としての機能と一致し、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域に融 合された際、マウスＣＡＦ１及び酵母ＣＡＦ１の両方がＬｅｘＡ応答性レポータ
ー遺伝子の転写を活性化する。更に、ＣＡＦ１は、例えばプロリンの多い領域及
び幾つかのグルタミンの多い領域、セリン／トレオニンの多い領域などの転写因
子に共通に見られる幾つかの構造的特徴を有する。(Sakai. A. 他. (1992) Nuc.
Acids Res. 20: 6227-6233; Draper. M.P. 他. (1995) 前出.) 第２のＣＣＲ４関連因子であるＣＡＦ２は、ＤＢＦ２として初めに同定され、
細胞周期の進行に必要な酵母プロテインキナーゼである。免疫沈降と酵母との２
つのハイブリッド研究により、ＣＣＲ４及びＣＡＦ１、ＣＡＦ２がin vivoで結 合して安定した複合体を形成することが明らかになった。更に、ＣＣＲ４或いは
ＣＡＦ１、ＣＡＦ２をコードする遺伝子における変異が、特異的転写欠陥及び細
胞周期の進行異常を含む類似した一群の多形質発現性表現型になる。例えば、３
つのどの遺伝子における変異も、ｓｐｔ６及びｓｐｔ１０変異において起こるＡ
ＤＨ２及びＨＩＳ４−９１２遺伝子の上昇した発現を抑制する。従って、ＣＡＦ
１及びＣＡＦ２、ＣＣＲ４は、様々な遺伝子の転写を調節する進化的に保存され
た多タンパク質複合体の成分として共に機能する。(Draper,M.P. 他. (1995) 前
出.; Liu, H.Y., 他. (1997) EMBO J. 16(17):5289-5298.) 転写調節の異常が発癌に関与していることは公知であり、遺伝子の発現におけ
る転写調節の異常が細胞増殖に関与すると推測される。例えば、Fos及びJun、My
c、Rel、Spilなどのプロトオンコジーンによってコードされる転写因子の変異体
は、細胞増殖の刺激が高まると発癌性となり得る。逆に言えば、例えばｐ５３及
びＲＢ１、ＷＴ１などの腫瘍抑制遺伝子によってコードされる転写因子の変異体
が、細胞増殖の抑制が弱まると発癌性となり得る。(Latchman. D. (1995) Gene
Regulation: A Eukaryotic Perspective, 第2版 Chapman and Hall, London. UK
, pp 242-255.) 新規のＣＡＦ１関連タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
により、細胞増殖及び炎症に関連する疾患の予防及び治療に有用である新規の組
成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。

【０００４】 発明の要約 本発明は、新規のＣＡＦ１関連タンパク質（以下、ＣＡＦＲＰと言う）の発見
に基づいている。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを
提供する。

【０００５】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実
質的に精製された変異体を提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配
列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片の配列を含むポリペプチドをコードする単
離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌクレオ
チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供す
る。

【０００６】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む組成物を提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列ま
たはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドと相補的な単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。更に、厳密な条件の下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌク レオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドも提供する
。

【０００７】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片のポ
リヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドと、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片のポリヌクレオチド配列を含む ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する単離され精製されたポリ
ヌクレオチド変異配列とを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２また
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
と相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【０００８】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断
片の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの断片を少なくとも
１つ含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターが宿主細胞
の中に含まれる。

【０００９】 更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチドの１０８３から１１１
３までを含むオリゴヌクレオチドの設計或いはハイブリダイゼーションプローブ
としての使用に有用なポリヌクレオチド断片を提供する。

【００１０】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）
ポリペプチドの発現に好適な条件の下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列ま
たはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞
を培養する過程と、（ｂ）宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とを
含む製造方法を提供する。

【００１１】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断
片の配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬組成物を好適な医
薬用担体と共に提供する。

【００１２】 更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断
片の配列を含むポリペプチドと結合する精製された抗体と、そのポリペプチドの
精製されたアゴニスト及びアンタゴニストとを含む。

【００１３】 本発明はまた、細胞増殖性疾患の予防及び治療が必要な患者にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与することを含む、細胞増殖性
疾患の予防方法または治療方法を提供する。

【００１４】 本発明はまた、炎症性疾患の予防または治療が必要な患者にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与することを含む、炎症性疾患の
予防方法または治療方法を提供する。

【００１５】 本発明はまた、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の
アミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配 列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列と少なくとも
１つの生物学的サンプルの核酸とをハイブリダイズして、ハイブリダイゼイショ
ン複合体を形成する過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在と、生
物学的サンプルにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列またはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク レオチドの存在とが相関性を有するハイブリダイゼーション複合体を検出する過
程とを含む方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼイション
の前に生物学的サンプルの核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。

【００１６】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の方法論及びプロトコル、細胞系、ベクター、試薬に限定され
ず、その実施形態を変更できることに理解されたい。また、ここで用いられる用
語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求
の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものでは
ないということも理解されたい。

【００１７】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００１８】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての方法及び材料は、本発明の
実施及びテストに使用できるが、好適な方法、装置、及び材料をここに記す。本
明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記
載された細胞系、ベクター、及び方法論を記述し開示するために引用した。従来
の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるもの
ではない。

【００１９】 定義 本明細書においてのＣＡＦＲＰとは、天然、合成、半合成或いは組換え体など
全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺
乳動物）から得られる実質的に精製されたＣＡＦＲＰのアミノ酸配列のことであ
る。

【００２０】 本明細書において、「アゴニスト」とは、ＣＡＦＲＰと結合したとき、ＣＡＦ
ＲＰの効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。この
アゴニストには、ＣＡＦＲＰに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、
糖質、任意の他の分子を含み得る。

【００２１】 本明細書において、「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＣＡＦＲＰをコー
ドする遺伝子の別の形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの変
異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造
や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべ
ての遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがあ
る。一般にアレルを生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置
換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列
内で一回或いはそれ以上生じる。

【００２２】 本明細書において、ＣＡＦＲＰをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ
クレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＣＡＦＲＰと同じポリペプ
チド或いはＣＡＦＲＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す
。この定義には、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体
の遺伝子座ではない位置でアレルと不適当或いは予期せずハイブリダイゼーショ
ン、及びＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド
プローブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードさ
れたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＣＡＦＲＰと機能的に等
価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸
置換は、生物学的或いは免疫学的にＣＡＦＲＰの活性が保持される範囲で、残基
の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似
性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン
酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギ
ニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は
、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グル
タミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００２３】 本明細書において、「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチ
ド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の
分子または合成された分子である。ＣＡＦＲＰの断片である「断片」及び「免疫
原性断片」、「抗原性断片」は、好ましくは約５〜約１５個の長さのアミノ酸で
あり、ＣＡＦＲＰのある生物学的活性または免疫学的活性を保持する。ここでは
、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸
配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関連する完全で元のままのア
ミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００２４】 本明細書において、用語「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成するこ
とに関連する。一般にはこの技術分野では公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995)
PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY
, pp. 1-5.を参照)。

【００２５】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、ＣＡＦＲＰと結合したとき、Ｃ
ＡＦＲＰの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続
時間を短縮する分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体
またはＣＡＦＲＰの効果を減少させるの他の分子である。

【００２６】 本明細書において、「抗体」とは、Ｆａ及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆ
ｖ断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。ＣＡＦＲＰポリ
ペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の
分子またはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、
若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチ
ドは、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり化学的に合成され得り、必要に応じて担
体プロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に
用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペ
ットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物
を免疫化する。

【００２７】 本明細書において、「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグ
メント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主
動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決
定基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体
の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、
免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００２８】 本明細書において、「アンチセンス」とは、特定の核酸配列と相補的な核酸配
列を含む全ての組成物である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖と相補的な
核酸鎖のことである。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作り
出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞によ
って作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「
マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラス（＋）」という
表現はセンス鎖と言える。

【００２９】 本明細書において、「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、
或いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活
性」とは、天然或いは組換え体のＣＡＦＲＰ、合成のＣＡＦＲＰまたはそれらの
任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特
定の抗体と結合する能力のことである。

【００３０】 本明細書において、「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の
温度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合すること
である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する
。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合
、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る
。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強
度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、
並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である
。

【００３１】 本明細書において、「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所
定のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或い
はアミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤
或いは水溶液、無菌組成物を含み得る。ＣＡＦＲＰ若しくはＣＡＦＲＰの断片を
コードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖
質などの安定化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プロー
ブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物
質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展
開され得る。

【００３２】 本明細書において、「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために
再配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^TM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT
）を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或い
はGELVIEW^TM Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメン
トの構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクロー
ン社の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によ
ってコンセンサス配列に構築されるものもある。

【００３３】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノー
ザン分析によるＣＡＦＲＰをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検
出が、サンプル内のＣＡＦＲＰをコードする核酸の存在を示すことから、ＣＡＦ
ＲＰをコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを
意味する。

【００３４】 本明細書において、「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基
が欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００３５】 本明細書において、「誘導体」とは、ＣＡＦＲＰ或いはＣＡＦＲＰをコードす
るポリヌクレオチド、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリ
ヌクレオチド配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾に
は、例えば、アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。
誘導体ポリヌクレオチドは、未修飾の分子の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。

【００３６】 本明細書において、「相同性」とは、相補性の程度を表すものである。これに
は、部分的相同性と完全な相同性とがあり得る。この「相同性」は「配列同一性
」とも言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少な
くとも部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に相補的な」と呼ば
れる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、
厳密性を低下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッテ
ィング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用
いて検査される。実質的に相同な配列或いはハイブリダイゼーションプローブは
、厳密性を低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合のた
め競合して抑制する。これは、厳密性を低下させた条件の下では非特異的な結合
が許容されるということではなく、厳密性を低下させた条件には、２つの配列の
互いへの結合が特異的（即ち、選択的）相互作用である必要がある。部分的な相
補性にもならない（例えば、３０％未満の相同性即ち同一性）第２の標的配列を
用いて、非特異的結合の不在の検査が可能である。非特異的結合が存在しないと
いうことは、実質的に相補的な配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列と
ハイブリダイゼーションしない。

【００３７】 本明細書において、「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミ
ノ酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。
この百分率同一性は、例えば、MegAlignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison Wl
)など電子装置を用いて決定可能である。このMegAlignプログラムは、様々な方 法、例えば、クラスター方法 (Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:23
7-244.)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能であ る。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラス
ターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループ
に分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂ
の百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さか
ら配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し
、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い相
同性或いは非相同性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配
列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分野で公
知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(例えば、Hein.
J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性はまた、 例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で公知の別の方法
によって決定することも可能である。

【００３８】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み
得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微
小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照） 。

【００３９】 本明細書において、「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒ
トの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子
である。

【００４０】 本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的
な一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００４１】 本明細書において、「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対
間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことであ
る。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ₀ｔまたはＲ₀ｔ分析）
で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、
膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核
酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成
され得る。

【００４２】 本明細書において、「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対
して、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ
酸配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００４３】 本明細書において、「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染
症、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系
に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因
子の発現によって特徴づけられ得る。

【００４４】 本明細書において、「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロンまたは別のタイプ
の膜、フィルター、チップ、スライドガラス、或いはその他の好適な固体の支持
物などの基板上に配列されたポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドのそれ
ぞれのアレイのことである。

【００４５】 本明細書において、「変調」とは、ＣＡＦＲＰの活性の変化のことである。変
調の例として、ＣＡＦＲＰのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはそ
の他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００４６】 本明細書において、「核酸」或いは「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片と、また一本鎖若しくは
二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ
或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ様物 質とを指す。「断片（またはフラグメント）」とは６０ヌクレオチドより長い核
酸配列である。最も好ましい断片の長さは、少なくとも約１００ヌクレオチド以
上或いは約１０００ヌクレオチド以上、または約１００００ヌクレオチド以上で
ある。

【００４７】 本明細書において、「機能的に関係した」或いは「機能的に結合した」とは、
機能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプ
ロモータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係す
る或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列
は近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺
伝子要素は、コードされたポリペプチドとは近接して結合していないが、ポリペ
プチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００４８】 本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイ
ゼーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長
さは少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５
から３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチ
ドである。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定
義される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じ
である。

【００４９】 本明細書において、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わる
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さ
のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。こ
の末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本
鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコ
ール化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993)
Anticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００５０】 本明細書において、「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。
ＣＡＦＲＰをコードする核酸若しくはその断片、ＣＡＦＲＰ自体を含むと推測さ
れる生物学的サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染
色体や細胞小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノム
ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００５１】 本明細書において、「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパ
ク質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用
のことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗
原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右さ
れる。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合してい
ない標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリ
ペプチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体
と結合する標識Ａの量が減少する。

【００５２】 本明細書において、「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチド配列と請求項に記
載されたポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件である
。好適である厳密な条件は、例えばプレハイブリダイゼーション溶液及びハイブ
リダイゼーション溶液における塩またはホルムアミドの濃度、或いはハイブリダ
イゼーション温度によって定義され、当分野で公知である。詳細には、塩の濃度
を下げたり、ホルムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温
度を上げることで厳密性を高めることができる。

【００５３】 例えば、高度な厳密性条件の下でのハイブリダイゼーションは、ホルムアミド
の濃度が約５０％、温度が約３７℃〜４２℃で起こり得る。厳密性条件を下げて
のハイブリダイゼーションは、ホルムアミドの濃度が約３５％〜２５％、温度が
約３０℃〜２５℃で起こり得る。詳細には、温度が４５℃、濃度が５０％のホル
ムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、０，３％のドデシル硫酸ナトリウム、２００μｇ／ ｍｌのせん断されて変性されたサケ精子ＤＮＡの高い厳密性条件の下でハイブリ
ダイゼーションが起こり得る。上述したように、３５％のホルムアミドで温度を
３５℃に下げて厳密性条件を下げてもハイブリダイゼーションは起こり得る。目
的の核酸のプリンとピリミジンとの比率及び温度をしかるべく調節することによ
って、特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲をさらに狭めることが可能であ
る。上記の範囲及び条件の変更は当分野ではよく知られている。

【００５４】 本明細書において、「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれ
てから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結
合している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましく
は約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００５５】 本明細書において、「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを
それぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００５６】 本明細書において、「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変
化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で公知の種々の方法により
、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞
の中に外来核酸配列を挿入する任意の公知の方法によって行うことができる。こ
の形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。こ
の方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェ
クション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換
された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或い
は宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれ
る。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する
細胞も含まれる。

【００５７】 本命鎖書において、「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、
置換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異
が含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する
「非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、
挿入、或いはその両方が含まれる。当分野で公知の例えばＤＮＡＳＴＡＲソフト
ウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸
残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００５８】 発明 本発明は、新規のヒトＣＡＦ１関連タンパク質（ＣＡＦＲＰ）、ＣＡＦＲＰを
コードするポリヌクレオチドの発見、並びに細胞増殖及び炎症に関連する疾患の
診断、予防、または治療におけるこれらの組成物の使用法に基づく。

【００５９】 本発明のＣＡＦＲＰをコードする核酸が、アミノ酸配列アライメントのコンピ
ュータ検索を用いて、前立腺ｃＤＮＡライブラリPROSNOT16を起源とするインサ イト社クローン番号2229466において初めて同定された。コンセンサス配列、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、インサイト社クローン番号2743652 (BRSTTUT14)及び222
9466 (PROSNOT16)、2748488 (LUNGTUT11)、1443657 (THYRNOT03)、1714768 (UCM
CNOT02)、1605302 (LUNGNOT15)、1697743 (BLADTUT05)、725125 (SYNOOAT01)の 重複及び／又は伸長された核酸配列に由来する。

【００６０】 或る実施例において、本発明は、図１Ａ及び図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ
、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈに示されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のアミ ノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＣＡＦＲＰはアミノ酸２９２個の長さを有
し、残基Ｎ１０２における１個のＮ−グリコシル化可能部位と、残基Ｓ１８及び
Ｓ５６、Ｓ１５８、Ｓ１９１、Ｓ２４９、Ｓ２７６における６個のカゼインキナ
ーゼIIリン酸化可能部位と、残基Ｓ２０１における１個のプロテインキナーゼＣ
（ＰＫＣ）リン酸化可能部位と、残基Ｙ６２における１個のチロシンリン酸化可
能部位とを有する。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、ＣＡＦＲＰは、マ
ウスＣＡＦ１タンパク質（GI 726136：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と化学的及び構 造的相同性を有する。ＣＡＦＲＰとマウスＣＡＦ１タンパク質との相同性は７６
％であり、長さが２８５対２９２、等電点が４．６対４．７、ロイシン残基が１
１．６％対１０．２％と類似性を有する。注目すべきは翻訳後に修飾するための
様々な部位が保存されていることであり、その中には、残基Ｎ１０２におけるＮ
−グリコシル化可能部位と、Ｓ５６及びＳ１５８における２個のカゼインキナー
ゼIIリン酸化可能部位と、Ｓ２０１における１個のＰＫＣリン酸可能部位と、残
基Ｙ６２における１個のチロシンリン酸化可能部位とを有する。ヌクレオチドの
約１０８３から約１１１３までのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片は、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析によれば、種々のライブラ
リにおけるＣＡＦＲＰの発現は、少なくとも４８％が不死化即ち癌化、少なくと
も２７％が免疫応答に関連し、少なくとも１４％が胎児／増殖性細胞に関連する
。また、生殖組織及び造血／免疫組織、胃腸組織、神経組織、心臓血管組織に由
来するライブラリにおいてＣＡＦＲＰが広範囲に発現することに注目されたい。

【００６１】 本発明はまた、ＣＡＦＲＰの変異体を含む。ＣＡＦＲＰの変異体は、好ましく
はＣＡＦＲＰのアミノ酸配列と約８０％以上の配列の同一性、更に好ましくは約
９０％以上の配列の同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列の同一性を有し
、ＣＡＦＲＰの機能的特性或いは構造的特性のうちの少なくとも１つを保持して
いる。

【００６２】 本発明はまた、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施
例において、本発明は、ＣＡＦＲＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を
含むポリヌクレオチド配列を含む。

【００６３】 本発明はまた、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含
む。詳細には、このポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはＣＡＦＲＰ
をコードするポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列の同一性を有し、更に好
ましくは９０％以上の配列の同一性を有し、最も好ましくは９５％以上の配列の
同一性を有する。また本発明の或る実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少な
くとも約８０％の配列同一性、好ましくは約９０％以上の配列同一性、最も好ま
しくは約９５％以上の配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の変異配列を含
む。上記のポリヌクレオチド配列の任意の変異配列は、ＣＡＦＲＰの機能的或い
は構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【００６４】 遺伝暗号の縮重により、作り出され得るＣＡＦＲＰをコードする種々のポリヌ
クレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列
と最小の相同性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう
。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によっ
て作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これ
らの組み合わせは、自然発生のＣＡＦＲＰのポリヌクレオチド配列に適用される
標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されてい
ると考慮する。

【００６５】 ＣＡＦＲＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択さ
れた厳密性の条件の下で、自然発生のＣＡＦＲＰのヌクレオチドとハイブリダイ
ズ可能なことが望ましいが、実質的に異なったコドンの使用法を備えるＣＡＦＲ
Ｐ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得
る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、
ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可
能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＣＡＦＲＰ及びその誘導体
をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列
から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写
物を作ることにある。

【００６６】 本発明はまた、ＣＡＦＲＰ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれら
の断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を
、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞
系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＣＡＦＲＰまたは
その任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００６７】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳細には、
様々な厳密性条件の下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはその断片に示されている
ヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。( 例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407; 及び Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.を参照)。

【００６８】 当分野で良く知られ一般的に入手可能なＤＮＡのシークエンシング方法を用い
て、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には酵素が用いられる、
例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片であるSequenase（US Biochemical社
, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラー ゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはELONGASE増幅システム(GIBCO/BRL,Gaither
sburg, MD)にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合
わせである。このプロセスは、以下の装置を用いて自動化するのが好ましい。Ha
milton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC2
00；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Catalyst及び373及び377 DNAシーケ
ンサ（Perkin Elmer）等。

【００６９】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で既知の種々の方法を用いてＣＡ
ＦＲＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上
流にある配列を検出する。例えば「制限部位」ＰＣＲ法を利用する１つの方法で
は、一般的なプライマーを用いて既知の遺伝子座近傍の未知の配列を検索する（
例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。詳しくは
、ベクター内のリンカー配列と相補的なプライマー及びそのヌクレオチド配列の
領域に特異的なプライマーの存在の下、ゲノムＤＮＡを初めに増幅する。次ぎに
、増幅された配列は、同じリンカープライマーと初めのプライマーの中に含まれ
る別の特異的プライマーを用いて、ＰＣＲの２回目を行う。ＰＣＲによる各回の
作製物を、好適なＲＮＡを用いて転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。

【００７０】 既知の領域に基づく多岐にわたるプライマーを用いた配列の増幅或いは伸長は
、逆ＰＣＲ法を用いて行うことが可能である（Triglia, T.等（1988）Nucleic A
cids Res 16:8186）。プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis softw
are（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなど
を用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃
〜７２℃の温度で標的配列に対してアニールするよう設計される。この方法は幾
つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域の好適な断片を作製する。次ぎに
この断片を分子内のライゲーションにより環状にし、ＰＣＲの鋳型として利用す
る。

【００７１】 使用され得る別の方法にキャプチャＰＣＲ法がある。この方法には、ヒト及び
酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が含ま
れる（Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。また
この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲ
を行う前にそのＤＮＡ分子の未知の断片の中に組換え二本鎖配列を配置すること
が可能である。また、未知の配列を得るために用い得る当分野で公知の別の方法
もある(例えば、 Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を 参照)。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、PromoterFinder^TMライブラリを用 いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である（Clontech, Palo Alto CA）。この
プロセスはライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン
接合部を探すのに都合が良い。

【００７２】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、サイズが選択された大きなｃ
ＤＮＡを含むライブラリを用いるのが好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受け
たライブラリは、遺伝子の５'領域を含む配列をより多く含むという点で好適で ある。特にオリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場
合、ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリの使用が有用であろう。ゲノム
ライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【００７３】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及びレーザーで活性化される４つの異なった蛍光色素（各ヌクレオチドに１
つ）、ＣＣＤカメラによる放出された波長の検出に利用する。出力／光強度は、
適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyper^TM及びSequence Naviga
tor^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュー タ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャ
ピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないＤＮＡの小片のシ
ークエンシングに特に適している。

【００７４】 本発明の別の実施例では、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列また
はその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＣＡＦＲＰ、その
断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重に
より、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ
配列が作られ得り、これらの配列をＣＡＦＲＰのクローン化及び発現に利用可能
である。

【００７５】 当業者が理解するように、非自然発生のコドンを有するＣＡＦＲＰをコードす
るヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。例えば、原核細胞または
真核細胞の宿主に好ましいコドンが選択されて、タンパク質の発現の比率を高め
たり、好ましい特性例えば自然発生の配列から生成される転写物より半減期の長
いＲＮＡ転写物を作り出すことが可能である。

【００７６】 種々の目的でＣＡＦＲＰをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に
知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換え可能である。こ
の目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現を変え
る変更が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片による
ＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用い
て、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、部位特異的変異誘発によ
って、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更
、スプライスバリアントの生成、突然変異の誘発等が可能である。

【００７７】 本発明の別の実施例によれば、自然発生のＣＡＦＲＰをコードするの核酸配列
、変更されたＣＡＦＲＰをコードするの核酸配列、または組換えＣＡＦＲＰをコ
ードする核酸配列を異種の配列に結合して、融合タンパク質をコードする配列に
することが可能である。例えば、ＣＡＦＲＰの活性のインヒビターをペプチドラ
イブラリからスクリーニングするとき、市販の抗体によって認識され得るキメラ
ＣＡＦＲＰタンパク質をコードすることが役に立ち得る。融合タンパク質は、Ｃ
ＡＦＲＰをコードする配列と異種のタンパク質配列との間の位置する切断部位を
含むように設計可能であり、これによってＣＡＦＲＰを切断し、異種部分から離
れて精製される。

【００７８】 別の実施例によれば、ＣＡＦＲＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的
方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等 （1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Ac
ids Res Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてタンパ ク質自体を作り出して、ＣＡＦＲＰのアミノ酸配列またはその一部を合成するこ
とが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能であ
る（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:202-204を参照）。また、合 成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達
成し得る。更にＣＡＦＲＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合
成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のそ
の一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチドを作ることが可能
である。

【００７９】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M. 及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質 的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei n.s, Structures and Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York,
NYを参照)。

【００８０】 生物学的に活性のＣＡＦＲＰを発現するために、ＣＡＦＲＰをコードするヌク
レオチド配列またはその誘導体が、好適な発現ベクター即ち挿入されたコーディ
ング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する。

【００８１】 当業者に周知の方法を用いて、ＣＡＦＲＰをコードする配列、好適な転写及び
翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの
方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技 術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Labor atom Manual , Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, 4章及び8章, 及び１6
-17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995, and periodicsupplements) Current Pr otocols irt Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York,NY. ch. 9章及
び13章、16章を参照)。

【００８２】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＣＡＦＲＰをコードする配列の保持
及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリ
オファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された
細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス
発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス
発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザ
イクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３
２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。

【００８３】 「調節エレメント」或いは「調節配列」は非翻訳領域であり、例えば、転写及
び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用するエンハンサー及びプ
ロモーター、ベクターの５'及び３'非翻訳領域、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌ
クレオチドなどである。このようなエレメントのその強さ及び特異性は、様々で
ある。使用するベクター系及び宿主によって、構成プロモーター及び誘導生プロ
モーターを含む好適な転写及び翻訳エレメントが任意の数利用される。例えば、
細菌系にクローニングする場合は、Bluescript ファージミド（Stratagene, LaJ
olla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco BRL）等のハイブリッドlacZプロ モーターなどの誘導的プロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポ
リヘドリンプロモーターは、昆虫細胞に使用され得る。植物細胞由来のプロモー
ター又はエンハンサー（例えば、熱ショック RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子
）又は植物ウイルス由来のプロモーター又はエンハンサー（例えば、ウイルス性
プロモータ或いはリーダー配列）は、ベクターの中にクローニング可能である。
哺乳動物細胞系においては、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロ
モーターが好ましい。ＣＡＦＲＰをコードする配列の多数の複製を含む細胞系を
作り出す必要がある場合は、SV40またはEBVベースのベクターを好適な選択可能 なマーカーと共に用いる。

【００８４】 細菌系では、多数の発現ベクターがＣＡＦＲＰの使用目的に応じて選択可能で
ある。例えば、抗体の誘発に多量のＣＡＦＲＰが必要な場合には、精製が容易な
融合タンパク質のハイレベルな発現を誘導するベクターが使用される。このよう
なベクターには、Bluescript（Stratagene）（ＣＡＦＲＰをコードする配列が、
アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備えた
フレーム内のベクターに結合可能であり、ハイブリッドタンパク質が生成される
）などの多機能の大腸菌クローニング及び発現ベクターや、pINベクター等が含 まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Van Heeke, G.及びS.M.
Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照）。またpGEXベクター(P
harmacia Biotech, Uppsala, Sweden)も、グルタチオンS−トランスフェラーゼ （GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために用いるこ とができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン
アガロースビーズへ吸着させた後にフリーのグルタチオンの存在下で溶出させる
ことによって溶解した細胞から容易に精製できる。そのような系において生成さ
れるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位
を含むように設計され、目的のクローン化ポリペプチドがGST部分から自由に放 出され得る。

【００８５】 酵母菌サッカロミセス−セレビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼや
ＰＧＨなどの構成的或いは誘導的プロモーターを含む多種のベクターが使用可能
である(例えば、Ausubel, 前出; 及び Grant他 (1987) Methods Enzymol. 153:5
16-544を参照)。

【００８６】 植物発現ベクターが用いられる場合、ＣＡＦＲＰをコードする配列の発現は、
多種のプロモーターの内の任意のプロモーターによって促進される得る。例えば
、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが
単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオ メガリーダー配列との組み合わせで用いられ得る。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの
小さなサブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターが用
いられる（例えば、Coruzzi, G.他（1984）EMBO J 3:1671-1680）; Broglie, R.
他（1984）Science 224:838-843; 及びWinter, J.他（1991）Results Probl. Ce
ll Differ. 17:85-105を参照）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或い
は病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能であ
る。このような技術は、多数の一般に入手可能な文献に記載されている（例えば
、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Techno logy （1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。

【００８７】 昆虫系もＣＡＦＲＰの発現に用いられ得る。例えば、そのような１つの系では
、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫において外来遺伝子を 発現するためのベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス（
AcNPV）を用いる。ＣＡＦＲＰをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などの ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下
に置くことが可能である。ＣＡＦＲＰをコードする配列の挿入の成功により、ポ
リヘドリン遺伝子が不活性化され、コートタンパク質が欠けている組換えのウイ
ルスが生成される。次ぎに、組換えのウイルスが、例えば、ＣＡＦＲＰを発現し
得るS. frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫を感染させるのに用いられ得 る(例えば、Engelhard. E.K. 他. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci.91:3224-3227 を参照)。

【００８８】 哺乳動物宿主細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデ
ノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リ
ーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＣＡＦＲＰをコードす
る配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入
により、感染した宿主細胞にＣＡＦＲＰを発現できる生ウイルスを得ることが可
能である（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3
659を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エン
ハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能であ
る。

【００８９】 ヒト人工染色体（HACs）を用いて、プラスミドで発現し含まれているものより
大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡ
Ｃｓを作製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。

【００９０】 ＣＡＦＲＰをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開
始シグナルが利用可能である。このようなシグナルには、開始コドン及び隣接す
る配列も含まれる。ＣＡＦＲＰをコードする配列、その開始コドン、及び上流の
配列が好適な発現ベクターの中に挿入される場合、追加の転写または翻訳制御シ
グナルを必要としない。しかしながら、コーディング配列、またはその断片のみ
が挿入される場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを供給し
なければならない。さらに、全ての挿入の翻訳を確実にするために、開始コドン
が正しい読取り枠になければならない。外来の翻訳エレメント及び開始コドンに
は、天然及び合成の両方の起源をもつ様々なものが可能である。細胞系に用いる
のに好適なエンハンサーが含まれると、こ発現の効率が高まる(例えば、Scharf.
D. 他(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照)。

【００９１】 さらに、挿入した配列の発現調節能力またはタンパク質の発現を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepo」形を切断する翻訳後のプロセシングを、正しい挿入、折 りたたみ及び／または機能を高めるために用いることが可能である。修飾語の活
性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ ロセシングを確実にするために選択される。

【００９２】 組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定した発現が望
ましい。例えば、安定してＣＡＦＲＰを発現する細胞系が、発現ベクターを用い
て形質転換が可能である。この発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／また
は内在性の発現エレメントや、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝
子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜
２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を与えるととも
に、その存在により導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能
となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組
織培養技術を用いて増殖可能である。

【００９３】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において用いることが可能である(例えば、Wigler,
M. 他 (1977) Cell 11:223-232; and Lowy. I. 他(1980) Cell 22:817-823を参
照)。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして 用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、npt はアミノグリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpa
tはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランス
フェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例え
ば、Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-G
arapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14; 及び上記のMurryを参照)。さら
に選択に利用できる遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドー
ルを利用できるtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histin
ol）を利用できるhisDが文献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mullig
an（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、β グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリ
ンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Clontech,
Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマ ントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定した
タンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）
Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。

【００９４】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＣＡＦＲＰを
コードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＣＡＦＲＰをコー
ドする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定
可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＣＡＦＲ
Ｐをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答
したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【００９５】 または、ＣＡＦＲＰをコードする核酸配列を含むと共に、ＣＡＦＲＰを発現す
る宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。
これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡや、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。

【００９６】 ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＣＡＦＲＰをコード
するポリヌクレオチドのプローブや断片或いは一部を用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡま
たはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや増幅によって検出可能である。核
酸増幅に基づいたアッセイでは、ＣＡＦＲＰをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを
含む形質転換体を検出するために、ＣＡＦＲＰをコードする配列に基づいたオリ
ゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用する。

【００９７】 ＣＡＦＲＰの発現の検出及び計測のための種々のプロトコルには、当分野で周
知のタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどち
らかを用いる。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ
（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）など
がある。ＣＡＦＲＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体
を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclon
al-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもでき
る。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている
(例えば、Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, A
PS Press. St Paul, MN, Section-37-IV; 及び Maddox, D.E. 他 (1983) J. Exp
. Med. 158:1211-1216を参照)。

【００９８】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチ
ドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロー
ブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレ
ーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含
まれる。別法として、ＣＡＦＲＰをコードする配列、またはその任意の断片をｍ
ＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である
。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，ま
たはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加
によって、in vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの
方法は、例えば、Pharmacia＆Upjohn（Kalamazoo, MI）及びPromega（Madison W
I）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて
行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標
識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素
、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。

【００９９】 ＣＡＦＲＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞
培地でのこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転
換された細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用
されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＣＡＦＲＰをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってＣＡＦ
ＲＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には
理解されよう。別の作製物を用いて、ＣＡＦＲＰをコードする配列を、可溶性タ
ンパク質の精製を促すポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列と結合さ
せることも可能である。このような精製を促す領域には、固定された金属上での
精製を可能とするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプ
チド、固定された免疫グロブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａ領域、ＦＬ
ＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle WA）に用 いられる領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。精製領域と配列
をコードするＣＡＦＲＰとの間のXA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen, S
an Diego, CA)に特異的なものなどの切断可能なリンカー配列を含むものを用い て、精製が促進され得る。このような発現ベクターの１つは、ＣＡＦＲＰと、チ
オレドキシン或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコ
ードする核酸とを含む融合タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基は、固定さ
れた金属イオンアフィニティクロマトグラフィー上で精製を促進する(IMAC)（例
えば、Porath, J他（1992）; Protein Exp. Purif. 3:263-281を参照）。エンテ
ロキナーゼ切断部位が、融合タンパク質からＣＡＦＲＰを精製する手段を提供す
る(例えば、Kroll, D.J.他(1993); DNA Cell Biol. 12:441-453を参照)。

【０１００】 ＣＡＦＲＰの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプ
チド合成によって作製され得る(例えば、Creighton, T.E.(1984) Protein: Stru
ctures and Molecular Properties, pp. 55-60. W.H. Freeman and Co.,New Yor
k. NYを参照)。タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は
、例えばApplied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用い
て行うことが可能である。ＣＡＦＲＰの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結
合させて完全長分子を生成する。

【０１０１】 治療 ＣＡＦＲＰとマウス由来のＣＡＦ１タンパク質(GI 726136)とS. cerevisiae由
来のＰＯＰ２タンパク質(GI 1218463)との間に、化学的及び構造的相同性が存在
する。更に、ＣＡＦＲＰは、癌性及び炎症性、増殖細胞及び組織由来のライブラ
リにおいて発現する。従って、ＣＡＦＲＰは、細胞増殖及び炎症に関連する疾患
において一定の役割を果たすと考えられる。

【０１０２】 従って、或る実施例によれば、細胞増殖に関連する疾患の予防及び治療のため
患者にＣＡＦＲＰのアンタゴニストを投与可能である。上記の細胞増殖に関連す
る疾患には、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型
結合組織病、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原
発性血小板血症、及び腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇
形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消
化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾
液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれるが、これらに限定され
るものではない。

【０１０３】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した細胞増殖に関連する治
療または予防のために、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を
発現するベクターを患者に投与することも可能である。

【０１０４】 更に別の実施例では、ＣＡＦＲＰのアンタゴニストを、炎症に関連する疾患の
予防及び治療のために患者に投与し得る。このような疾患には、ＡＩＤＳ，副腎
機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧
血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺
炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎
、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症
候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群
、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節
炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレ
ン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、
潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス
及び細菌、真菌、寄生虫、原虫、蠕虫の感染症、外傷が含まれ得るが、これらに
限定されるものではない。

【０１０５】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した炎症に関連する治療ま
たは予防のために、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現
するベクターを患者に投与することも可能である。

【０１０６】 一実施態様によれば、ＣＡＦＲＰと特異的に結合する抗体が、直接アンタゴニ
ストとして、或いはＣＡＦＲＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的機構
或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。

【０１０７】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１０８】 ＣＡＦＲＰのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造すること
が可能である。詳しくは、精製されたＣＡＦＲＰを用いて抗体を作ったり、治療
薬のライブラリをスクリーニングしてＣＡＦＲＰと特異的に結合するものを同定
が可能である。ＣＡＦＲＰの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造するこ
とが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによ
って作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない
。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい
。

【０１０９】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、ＣＡＦＲＰまたは任意の断片、または免疫原性の特性を
備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、
種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュ
バントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルア
ジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、
油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの
界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられる
アジュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacteri um parvum が特に好ましい。

【０１１０】 ＣＡＦＲＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に
望ましいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチ
ド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の
一部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も
含む。ＣＡＦＲＰアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモ シニアン)などの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産 生され得る。

【０１１１】 ＣＡＦＲＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって
、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの
技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−
ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、
Kohler, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immu
nol. Methods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:
2026-2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１１２】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野 で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
ＣＡＦＲＰ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディ
オタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリか
ら鎖混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. N
atl. Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１１３】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、
高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、作製する
こともできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１１４】 ＣＡＦＲＰに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例
えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａ
ｂ’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって
生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法で
は、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクロー
ナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (
1989) Science 254:1275-1281を参照）。

【０１１５】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＣＡ
ＦＲＰとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性
ＣＡＦＲＰエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モ
ノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用
することができる（Maddox, 前出）。

【０１１６】 本発明の別の実施例では、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド、または
任意の断片またはその相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施
形態では、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転
写を阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、
ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することも
できる。したがって、相補的分子または断片は、ＣＡＦＲＰの活性の調節、また
は遺伝子機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野で
は周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片
が、ＣＡＦＲＰをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさ
まざまな位置から設計可能である。

【０１１７】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＣＡＦＲＰを
コードする遺伝子のポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを
作製することができる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によ
るものを参照)。

【０１１８】 ＣＡＦＲＰをコードする遺伝子は、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド
又はその断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換
することによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できない
センス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に
組み入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによっ
て機能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過
性の発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製エレメントがベクター系の一部
である場合はさらに長く持続し得る。

【０１１９】 上記した通り、遺伝子の発現は、ＣＡＦＲＰをコードする遺伝子の制御５’ま
たは調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮ
Ａ、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即
ち開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好
適である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することがで
きる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分
子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用
いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994)
In: Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, F
utura Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセ ンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲ
ＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。

【０１２０】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、ＣＡＦＲＰをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的
且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１２１】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１２２】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでＣＡＦＲＰをコードする ＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳ
Ｐ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に
組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的
に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入す
ることができる。

【０１２３】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１２４】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１２５】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１２６】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、ＣＡＦＲＰ、ＣＡＦＲＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト
、又はＣＡＦＲＰのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは
安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与
することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブド
ウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は
、単独或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１２７】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１２８】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA)に記載されている。

【０１２９】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１３０】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１３１】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１３２】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１３３】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１３４】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１３５】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１３６】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１３７】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。ＣＡＦＲＰの投与のため、このようなラベルには、
量、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１３８】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１３９】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１４０】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＣＡＦＲＰ又
はその断片、ＣＡＦＲＰの抗体、ＣＡＦＲＰのアゴニストまたはアンタゴニスト
、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、た
とえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある。）またはＬ
Ｄ５０（服用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞
培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。
治療効果と毒性効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率
で示すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養ア
ッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範
囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆
ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬
用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路にによって、この範
囲内で様々である。

【０１４１】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１４２】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１４３】 診断 別の実施例では、特異的にＣＡＦＲＰと結合する抗体が、ＣＡＦＲＰの発現に
よって特徴づけられる疾患の診断、或いはＣＡＦＲＰやＣＡＦＲＰのアゴニスト
またはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受ける患者を監視するためのアッ
セイに用いられる。診断に有益な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方
法で製剤される。ＣＡＦＲＰの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの
体液或いは細胞や組織から採取されたものにおけるＣＡＦＲＰを検出する方法が
含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分
子の共有結合か非共有結合によって標識化され得る。当分野で周知の幅広いレポ
ーター分子が用いられるが、その内の幾つかは既に記述した。

【０１４４】 ＣＡＦＲＰを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々の
プロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＣＡＦＲ
Ｐの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＣＡＦＲＰの
発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒト
である被験者から採取した体液または細胞とＣＡＦＲＰに対する抗体とを結合さ
せることによって決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得
るが、測光法（photometric）が好ましい。被験者のＣＡＦＲＰの発現の量、制 御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者と
の間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。

【０１４５】 別の実施例によれば、ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドを診断のため
に用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド
配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチ
ドを用いて、疾患と相関し得るＣＡＦＲＰを発現する生検組織における遺伝子の
発現を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＣＡＦＲＰの不在、存在
、及び過度の発現を調べ、治療中のＣＡＦＲＰレベルの制御を監視する。

【０１４６】 ある実施形態では、ＣＡＦＲＰまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼー
ションによって、ＣＡＦＲＰをコードする核酸配列を同定することが可能である
。例えば５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフ であるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブ
リダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プ
ローブがＣＡＦＲＰをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは
アレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決ま
るであろう。

【０１４７】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＣＡＦＲＰをコードする任
意の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハ
イブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２の配列、或いはＣＡＦＲＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー
、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。

【０１４８】 ＣＡＦＲＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロ
ーブの作製方法には、ＣＡＦＲＰ及びＣＡＦＲＰ誘導体をコードするポリヌクレ
オチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法
がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適な
ＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、 in vitro でＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーショ
ンプローブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／
ビオチン（biotin）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファター
ゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１４９】 ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＣＡＦＲＰの発現と
関連のある疾患の診断が可能である。細胞増殖に関連する疾患には、動脈硬化、
アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病、骨髄線維症
、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、癌には
、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、
副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、炎症に関連する疾患には、ＡＩＤＳ，副腎
機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧
血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺
炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎
、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症
候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群
、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節
炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレ
ン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、
潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、癌の合併症
；ウィルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、蠕虫感染症及び外傷が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。

【０１５０】 ＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーンブロット法やノー
ザンブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（
dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び患者から採取した体液或 いは組織を利用して変異ＣＡＦＲＰの発現の検出に用いられるマイクロアレイに
使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知
である。

【０１５１】 特定の形態において、ＣＡＦＲＰをコードするヌクレオチド配列は、関連する
疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＣＡＦＲＰ
をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼ
ーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサ
ンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し
、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制
御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＣＡＦＲＰをコー
ドするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかにな
る。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治
療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１５２】 ＣＡＦＲＰの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正
常あるいは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から
抽出された体液或いは細胞と、ＣＡＦＲＰをコードする配列或いはその断片とを
結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常
な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いら
れる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルか
ら得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標
準値と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１５３】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１５４】 癌において、個体からの生体組織における比較的多量の転写物は、疾患の発生
の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供する
ことが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或
いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能
となる。

【０１５５】 ＣＡＦＲＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診
断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的
な合成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好
ましくはＣＡＦＲＰをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＣＡＦＲＰを
コードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な
条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマー
は、やや緩い厳密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／また
は定量のため用いることが可能である。

【０１５６】 ＣＡＦＲＰの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放
射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標 準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993)
J. Immunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-2
36を参照）。多数のサンプルの定量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液
に含まれ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッ
セイを用いることによって加速された。

【０１５７】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１５８】 当分野で公知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば 、 Chee 他. (1995) PCT 出願番号 WO95/11995; Fodor, S.P.A. 他. (1995) 米 国特許第5,424,186号; Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schen
a, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他
(1995) PCT出願番号WO95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505
; Lockhart, D. J. 他 (1996) Nat. Biotech. 14:1675-1680; Heller, R.A. 他(
1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、ＣＡＦＲＰをコードする核酸配列を用いて、自
然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプロー
ブを生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングさ
れる。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト
人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）
、細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Pric
e, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet
. 7:149-154を参照） In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, R.A. (ed.) Moecular Biology and Biotechnology, VCH P
ublishers New York, NY, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は、
種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイト で見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＣＡＦＲＰをコードする遺
伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このよ
うな疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド
配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違い
を検出することもある。

【０１５９】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳類の染色体上での遺伝子の配置により、た
とえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマーカ
ーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、染
色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは別
の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値あ
る情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えばATは11q22-23という、特定の
遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの
配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表
す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580を参照）。また 、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間
の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。

【０１６０】 本発明の別の実施例では、ＣＡＦＲＰ、その触媒作用断片或いは免疫原断片ま
たはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニ
ングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或
いは細胞内に存在する。ＣＡＦＲＰとテストされる薬剤との複合体を結合するこ
とによる形成は計測されることもある。

【０１６１】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、ＣＡＦＲＰ、或いはその断片と反応して
から洗浄される。次ぎに、結合されたＣＡＦＲＰが、当分野で周知の方法で検出
される。精製されたＣＡＦＲＰはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術
に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を
用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１６２】 別の実施例では、ＣＡＦＲＰと結合可能な中和抗体がＣＡＦＲＰと結合するた
め試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いるこ
とができる。この方法では、抗体が、ＣＡＦＲＰと１つ以上の抗原決定因子を共
有するどのペプチドの存在も検出する。

【０１６３】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＣＡＦＲＰをコードするヌクレ
オチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及
び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術
を提供することができる。

【０１６４】 以下の実施例は、目的の発明を例示し、発明を限定する目的のものではない。

【０１６５】

【実施例】

１ ＰＲＯＳＴＮＯＴ１６ｃＤＮＡライブラリ作製 ＰＲＯＳＴＮＯＴ１６ＤＮＡライブラリは、６８歳の男性から得た前立腺組織
から作製された。この前立腺組織は、病理レポートでは莢膜を穿孔して前立腺周
囲の組織に至るＧｌｅａｓｏｎグレードが３＋４の腺癌と関連する前立腺組織に
沿って前立腺切除根治手術中に切除された。腫瘍の外科的な余地（遠位尿道、左
右前立腺底部、左右尖部）は否定的だった。初めに、患者の前立腺特異性抗原（
ＰＳＡ）が上昇し、後に前立腺の悪性腫瘍及び重症筋無力症と診断された。この
患者の病歴には、良性高血圧症、脳血管障害、動脈硬化性冠動脈疾患、変形性関
節症、合併症を伴わないII型糖尿病、急性心筋梗塞、飲酒がある。患者の家族の
病歴は、母親に良性高血圧症及び急性心筋梗塞の発現、高脂血症があり、兄弟に
動脈硬化性冠動脈疾患、及び急性心筋梗塞の発現がある。この凍結組織を、Brin
kmann Homogenizer Polytron PT-3000 (Brinkmann Instruments, Westbury, N J
)を用いて、グアニジニウム（guanidinium）イソチオシアネート溶液に均質化し
て溶解した。この溶解物を、Beckman L8-70M Ultracentrifuge (Beckman Instru
ments)を用いて５．７Ｍの塩化セシウムにおいて、室温で１８時間、毎分２５, ０００の回転数で遠心分離した。このＲＮＡを、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び
２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、ＲＮＡ分解酵素を含まない水に再懸
濁して、３７℃でＤＮＡ分解酵素で処理した。このＲＮＡの抽出及び沈殿を上記
のように繰返した。その後、ｍＲＮＡをQiagen Oligotex.kit(QIAGEN, Inc.. Ch
atsworth, CA)を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。

【０１６６】 このｍＲＮＡを、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis及びPlasm
id Cloning (Cat. #18248-013.Gibco/BRL)の推奨プロトコルに従って処理した。
市販のプラスミド、pSPORT 1 (Gibco/BRL)を、EcoR I制限酵素(New England Bio
labs, Beverley, MA)で消化した。クレノー酵素(New England Biolabs)及び２' −デオキシヌクレオチド５'−三リン酸(dNTPS)を用いて、端部がオーバーハング
したプラスミドで満たす。このプラスミドが自己連結し、宿主細菌である大腸菌
株JM 109に形質転換された。ＥｃｏＲ Iで消化しなかった細菌によって作られた
中間のプラスミドにより、ＥｃｏＲ I制限部位の所望の欠損が確認される。

【０１６７】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは、REAL Prep 96プラスミドキット(Catalog #26173; QIAGE
N)を用いて細胞から遊離させ、精製する。このキットによって、マルチチャンネ
ル試薬ディスペンサーを用いた９６−ウエルブロックにおける９６サンプルの同
時精製が可能になる。以下の変更点を除いて推奨プロトコルを用いた。１）細菌
は２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有する１ｍｌの
滅菌のTerrific Broth（Catalog #22711, Gibco/BRL）内で培養する。２）接種 後、その培養株を１９時間インキュベートし、インキュベーション終了時にその
細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解する。３）イソプロパノール沈殿後、プラ
スミドＤＮＡペレットを０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁する。プロトコルの最終ス
テップを終了した後、サンプルを４℃で保管するために９６−ウエルブロックに
移す。

【０１６８】 ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertow
n MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと共にHamilton Mic
ro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV)を用いて、Sanger他(1975; J Mol Biol 94:44
1f)の方法により配列決定し、読み枠も決定する。

【０１６９】 ３ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び／またはアミノ酸配列を、GenBank、SwissProt
, BLOCKS及びPima IIのデータベースにある配列と照合する。以前に同定されて 注釈が付けられた配列を含むそのデータベースを、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Al
ignment Search Tool）で相同性（類似性）領域の検索を行う。(例えば、Altsch
ul, S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; 及び Altschul 他(1990) J. MOl.
Biol. 215:403-410を参照)。

【０１７０】 ＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するためにヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列の両方のアライメントを生成する。このアライメントが局部的な性質を有する
ため、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を判定する際、或いは原核（細菌）又は真核（動
物、真菌或いは植物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。他の
アルゴリズムを、主要配列パターン及び副次的な構造の間隙の問題を取り扱う際
に用いることが可能である(例えば、 Smith, T. 他. (1992) Protein Engineeri
ng 5:35-51.を参照)。本明細書に開示している配列は、長さが少なくとも４９ヌ
クレオチドであり、ＡまたはＣ、Ｇ、ＴではなくＮが記録される不要な塩基の上
限は１２％である。

【０１７１】 このＢＬＡＳＴ法は、問合せ配列とデータベース配列との間の一致を検索し、
すべての見つかった一致配列の統計的有意性を評価し、ユーザが選択した有意性
の閾値を満足する一致のみを報告する。本明細書では、ヌクレオチドの閾値を１
０^-25、ペプチドの閾値を１０^-8に設定した。

【０１７２】 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び他
の哺乳動物（ｍａｍ）配列の場合には、GenBankデータベースに対して検索した 。次ぎに、同じクローンに由来する推定されたアミノ酸配列の相同性が、GenBan
k機能タンパク質データベース及び哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ ）、真核生物（ｅｕｋｐ）に対して検索した。

【０１７３】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,上記
, ch. 7; 及び Ausubel. F.M. 他、上記, ch. 4 及び 16.を参照)。

【０１７４】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或
いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションよ
り非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の
一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類されるかを確定すること
ができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は
通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、
それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１７５】 ノーザン分析の結果は、ＣＡＦＲＰをコードする転写物が発生するライブラリ
のリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特
定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量
をｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０１７６】 ５ ＣＡＦＲＰをコードする配列の延長 インサイト社クローン番号2229466の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド 配列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
一方のプライマーはアンチセンスポリヌクレオチドの延長を開始するために合成
し、他方のプライマーはセンスヌクレオチドの延長を開始するために合成する。
これらのプライマーを用いて既知の配列の「外側への」延長を促進し、目的の領
域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを作り出す。開始プライ
マーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６（National Biosciences, Plymouth, MN）或いは 他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる
長さで、約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配
列にアニールするようにｃＤＮＡから設計する。ヘアピン構造及びプライマー−
プライマー二量体化を生ずるようなヌクレオチドのストレッチは避ける。

【０１７７】 この配列の延長のために選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL） を用いる。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、既知領域
をさらに延長するための別のプライマーの組を設計する。

【０１７８】 ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って処理を行い、ま
た酵素と反応混合物とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅を行う
。それぞれ４０ｐｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全て
の成分とから増幅を開始する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Res
erch, Watertown MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち、 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行う。

【０１７９】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度の（約０．６〜０．８％）
アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長する
ことに成功したかを決定する。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドを選
択して、ゲルから切り出し、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc. Chatsworth, CA）を用い
て精製し、クレノウ酵素を用いて末端の延び出しを切り取って、再連結及びクロ
ーニングが容易になる平滑末端を作る。

【０１８０】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トする。（４０μｌの適切な培養液の中の）コンピテントな大腸菌細胞を、３μ
ｌの連結混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培養液で（例えば、Semb
roo、前出、Appendix A, p. 2を参照）で培養する。３７℃で１時間インキュベ ートした後、全ての形質転換した混合物を、２ｘカルベニシリンを含むLuria Be
rtani（ＬＢ）アガー（例えば、Sembrook、前出、Appendix A, p. 1を参照）上 にプレートする。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、
適切な市販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの各ウェル内に入れられた１
５０μｌの液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、それぞれ５
μｌの終夜培養した各培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に
希釈した後、各サンプルの内の５μｌをＰＣＲアレイに移す。

【０１８１】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行う。

【０１８２】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ産物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロー
ンを選択し、プラスミドに連結して、配列決定を行う。

【０１８３】 同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順と、
５′末端側の延長のために設計されたオリゴヌクレオチドと、適切なゲノムライ
ブラリーとを用いて５′調節配列を得る。

【０１８４】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用
いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤ
ＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを
、OLIGO4.06（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデ
ザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシ
ン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuP
ont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識された
オリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn
, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製する。毎分１０⁷カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI ，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤ
ＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。

【０１８５】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、フィルムに写すためにブロッ
トに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１８６】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作製するために、本発明のヌクレオ
チド配列の１つを、このヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリ
ズムを用いて調べる。それぞれについてこのアルゴリズムを用いて、その核酸配
列に独特で、ＧＣ含量がハイブリダイゼーションに適した範囲内にあり、且つハ
イブリダイゼーションを妨げるような推定上の２次構造が存在しない、決まった
長さのオリゴマーを同定する。このアルゴリズムは、それぞれの核酸配列に対応
する約２０のオリゴヌクレオチドを同定する。それぞれが配列特異的なオリゴヌ
クレオチドであるため、オリゴヌクレオチドの対は、第１のオリゴヌクレオチド
と第２のオリゴヌクレオチドが配列の中心でヌクレオチド１個違って合成される
。これらのオリゴヌクレオチドの対は、光誘導化学処理を用いて、例えばシリコ
ンチップなどの基質に配列することができる。(例えば、前出のCheeを参照) プローブ配列は、ポリペプチドを含むシグナル配列をコードする遺伝子に共通
な保存されたタンパク質モチーフを有する配列を見つけるために、種々のｃＤＮ
Ａライブラリから多数のクローンをスクリーニングして選択する。一実施例では
、例えばBlock 2 Bioanalysis Program (Incyte, Palo Alto, CA)などの好適な 分析プログラムを用いて、ｃＤＮＡライブラリから同定された配列を分析して、
保存されたタンパク質モチーフを有する遺伝子配列を同定する。Swiss-Prot Dat
abase及びPROSITEに含まれる配列情報に基づいたこのモチーフ分析プログラを用
いて、ゲノム或いはｃＤＮＡ配列から翻訳された特徴が未知のタンパク質の機能
を決定することができる。(例えば、Bairoch. A.他 (1997) Nucleic Acids Res.
25:217-221: 及びAttwood, T. K.他 (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37:4
17-424を参照)。PROSITEを用いれば、配列の極度の多様性のため保存されたモチ
ーフを用いても決定できない機能的及び構造的領域を同定することが可能である
。この方法は重量マトリクスに基づく。この方法によって同定されたモチーフは
、一致部分の分布の確率の程度を得るためにSWISS-PROTデータベースに対して較
正する。

【０１８７】 別法では、共通のモチーフ、特にコンセンサス配列を見つけ出すために、隠れ
たＭａｒｋｏｖモデル（Hidden Markov models (HMM)）を用いることが可能であ
る(例えば、Pearson, W.R. 及び D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.8
5:2444-2448; 及び Smith, T.F. and M.S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147
:195-197を参照)。HMMは当初、言語認識パターンとして開発されたが、現在は生
物学的文脈に用いて、タンパク質構造を構築するだけでなくタンパク質及び核酸
配列を分析する(例えば、Krogh, A. 他(1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531;及
びCollin, M. 他. (1993) Protein Sci. 2:305-314)。また、ＨＭＭは正式な確 率的根拠をもち、アミノ酸或いはヌクレオチドに位置−特有スコアを用いる。こ
のアルゴリズムは新しく同定された配列の情報を組み入れ続け、モチーフ分析能
力を高める。

【０１８８】 別法では、化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でオ
リゴマーを合成する（例えば、前出のBaldeschweilerを参照）。ドットブロット
法或いはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、熱、ＵＶ、化学的結合
方法を用いて基板の表面に断片或いはオリゴヌクレオチドを配列し結合させるこ
とが可能である。典型的なアレイは、手作業で、または市販の材料及び機械を用
いることによって作製することができ、任意の好適な数の要素を含み得る。ハイ
ブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキ
ャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンした画像を調べ
て、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な
量／発現レベルを決定する。

【０１８９】 別法では、完全長のｃＤＮＡ或いは発現配列タグ（ＥＳＴ：Expressed Sequen
ce Tags）が、マイクロアレイの要素を含み得る。本発明の核酸配列の１つに対 応する、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意に選択された完全
長のｃＤＮＡ或いはＥＳＴを、例えばガラススライドなどの好適な基質に整列す
る。このｃＤＮＡを、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスラ
イドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、
Schena, M. 他. (1995) Science 270:467-470; 及び Shalon,D. 他. (1996) Gen
ome Res. 6:639-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブ リダイゼーションさせるために用いる。上記した方法によってこの基質を分析す
る。

【０１９０】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＣＡＦＲＰをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、
自然発生のＣＡＦＲＰの発現の低下即ち阻害するために用られる。約１５〜約３
０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或い
はより大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法を用いることができ
る。Oligo4.06ソフトウェア及びＣＡＦＲＰのコーディング配列を用いて、適切 なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配
列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコー
ディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリ
ゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＣＡＦＲＰをコードする転写物に結合
するのを阻害する。

【０１９１】 ９ ＣＡＦＲＰの発現 ＣＡＦＲＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そ
のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって達成される。このベ
クターは、目的のｃＤＮＡと機能的に結合したクローニング部位の上流のβ−ガ
ラクトシダーゼなどの好適なプロモーターを含む(例えば、Sambrook, supra, pp
. 404-433; 及びRosenberg, M. 他 (1983) Methods Enzymol. 101:123-138を参 照)。

【０１９２】 単離されたトランスフェクト菌種を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノサイド(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside：IPTG)を用いて標準的な方
法で誘導し、初めのβガラクトシダーゼの８つの残基、約５〜１５残基のリンカ
ー、及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配
列が細菌増殖培地へのＣＡＦＲＰの分泌を誘導し、この培地は次の活性のアッセ
イにおいて直接用いることができる。

【０１９３】 １０ ＣＡＦＲＰ活性の実証 ＣＡＦＲＰの活性は、前出のLiu他によって基本的に記載されたようなに、レ ポーター遺伝子の転写を刺激する能力によって計ることができる。このアッセイ
には、大腸菌ＬａｃＺ酵素をコードする配列に融合したＬｅｘＡ ＤＮＡ転写調 節エレメント（ＬｅｘＡ_OP）からなり十分に特徴づけられたレポーター遺伝子作
成物であるＬｅｘＡ_OP−ＬａｃＺの使用が含まれる。融合遺伝子の作製及び発現
、それらの細胞への導入、ＬａｃＺ酵素活性の計測方法は、当分野では公知であ
る。ＣＡＦＲＰをコードする配列をプラスミドにクローン化して、ＣＡＦＲＰと
ＬｅｘＡ転写因子から得たＤＮＡ結合領域からなる融合タンパク質であるＬｅｘ
Ａ_OP−ＣＡＦＲＰの合成を誘導する。ＬｅｘＡ_OP−ＣＡＦＲＰ融合タンパク質を
コードする得られたプラスミドを、ＬｅｘＡ_OP−ＬａｃＺレポーター遺伝子を含
むプラスミドと共に酵母菌に導入する。調節細胞に関連し、ＬｅｘＡ_OP−ＣＡＦ
ＲＰトランスフェクション細胞と結合するＬａｃＺ酵素活性量は、ＣＡＦＲＰ遺
伝子配列によって刺激された転写量に比例する。

【０１９４】 １１ ＣＡＦＲＰに特異的な抗体の産生 ＰＡＧＥ電気泳動法(例えば、Harrington,M.G. (1990) Methods Enzymol. 182
:488-495を参照)または他の精製技術を用いて実質的に精製されたＣＡＦＲＰを 、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗体を作り出すために用いる。
ＣＡＦＲＰアミノ酸配列をDNASTARソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して
免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて
当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性
領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知で
ある(例えば、前出のAusubel他による11章を参照)。

【０１９５】 通常、このオリゴペプチドは約１５残基の長さを有するもので、Applied Bios
ystemsのペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリによ
り合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Sigma, St. Louis, MO）に結合させて、
免疫原生を高める(例えば、 Ausubel 他、前出を参照)。フロイントの完全アジ ュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。
得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチッ
クに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し
、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０１９６】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＣＡＦＲＰの精製 自然発生ＣＡＦＲＰ或いは組換えＣＡＦＲＰを、ＣＡＦＲＰに特異的な抗体を
用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノ
アフィニティーカラムは、CnBr-活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）のよ うな活性化クロマトグラフィー用レジンとＣＡＦＲＰ抗体とを共有結合させるこ
とにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロ
ックし洗浄する。

【０１９７】 ＣＡＦＲＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを
ＣＡＦＲＰを優先的に吸着できる条件下で（例えば、界面活性剤の存在下におい
て高イオン強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＣＡＦＲＰと
の結合を切るような条件下で（例えば、ｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度
の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ
、ＣＡＦＲＰを回収する。

【０１９８】 １３ ＣＡＦＲＰと相互作用する分子の同定 ＣＡＦＲＰ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（ 例えば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウ ェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＣＡＦＲＰとともに
インキュベートし、洗浄して、標識したＣＡＦＲＰ複合体を有する全てのウェル
をアッセイする。様々なＣＡＦＲＰ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子
とＣＡＦＲＰの関係、親和性、数について数値を計算する。

【０１９９】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮ
ＡＳＩＳＰＲＯ^TM（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA ）のソフトウエアを用いて作成された。

【図１Ｂ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成された。

【図１Ｃ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成された。

【図１Ｄ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成した。

【図１Ｅ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成した。

【図１Ｆ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成した。

【図１Ｇ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成した。

【図１Ｈ】 ＣＡＦ１関連タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と核酸配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の一部を示す。この配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡ
ＳＩＳ^TMソフトウエア（Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno,
CA）を用いて作成した。

【図２Ａ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した 、ＣＡＦ１関連タンパク質（インサイト社クローン番号2229466；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とマウスＣＡＦ１タンパク質（GI 726136；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。

【図２Ｂ】 ＤＮＡＳＴＡＲ^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）を用いて作成した 、ＣＡＦ１関連タンパク質（インサイト社クローン番号2229466；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とマウスＣＡＦ１タンパク質（GI 726136；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年８月３１日（２０００．８．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 ＣＡＦ１関連タンパク質

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：１の断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有す
   る実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 請求項3のポリヌクレオチドを含む組成物。
6. 【請求項６】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な単離され精製され
   たポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の断片のポリヌクレオチドを含む単離され精製されたポリヌクレ オチド。
9. 【請求項９】 請求項８のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
10. 【請求項１０】 請求項８のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 ヌクレオチドの１０８３から１１１３までを含む請求項
    ８のポリヌクレオチドの断片。
12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    １の断片の配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１２の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 細胞増殖に関連する疾患の予防及び治療が必要な患者に
    、請求項１７のアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、細胞増殖に関
    連する疾患を予防及び治療する方法。
20. 【請求項２０】 炎症に関連する疾患の予防及び治療が必要な患者に、請
    求項１７のアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、炎症に関連する疾
    患を予防及び治療する方法。
21. 【請求項２１】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出す
    る方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドを少なくとも生物学的サンプルの核酸の１
    つとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルに前記ポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドが存在することと相関性を有する、該過程とを含む
    ことを特徴とする検出方法。
22. 【請求項２２】 前記生物学的サンプルの核酸が、ハイブリダイゼーショ
    ンの前にＰＣＲ法によって増幅されることを特徴とする請求項２１に記載の方法
    。